CN113728091A - 用于促进干细胞来源外泌体产生和增加干性的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于促进干细胞来源外泌体(Exosomes)产生或增加干细胞的干性的组合物。在细胞培养基中培养本发明的组合物时,干细胞的干性和干细胞来源外泌体的生产量会增加,因而,可更有效地生产优质干细胞和干细胞来源外泌体,故可将其有效应用于相关的研发和产品化中。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于促进干细胞来源外泌体产生和增加干性的组合物。
背景技术
细胞外囊泡(Extracellular Vesicles)是由大小为30~1000nm的球形脂质双层(lipid-bilayer)组成的囊泡(vesicle),其包括微囊泡(Microvesicles)、外泌体(Exosome)等。
外泌体的脂质双层具有类似于起源细胞(供体细胞)的磷脂质双层结构,已知其作为细胞分泌到细胞外部的物质的构成体,发挥细胞间通讯和细胞免疫介导等功能性作用。
外泌体含有反映起源细胞(供体细胞)特有生物学功能的细胞特异性组成成分,除磷脂质、mRNA、miRNA外,还包含各种水溶性新蛋白、外源蛋白和跨膜蛋白成分等。
这种外泌体从肥大细胞、淋巴细胞、星形胶质细胞、血小板、神经细胞、内皮细胞、上皮细胞等所有动物细胞中排出,且存在于血液、尿液、粘液、唾液、胆汁液、腹水液、脑脊液等各种体液中。外泌体可通过血脑屏障(Blood-Brain Barrier;BBB),选择透过性较高,可达到透过表皮细胞和内皮细胞的细胞膜的程度,因此,其还被用于开发特定药物的纳米载体(nanocarrier),即药物递送系统(DDS,drug delivery system)。
已知间充质干细胞中分泌的外泌体和微囊泡(microvesicles)参与细胞间通讯,表现出干细胞所具备的再生医学治疗功效。
已知干细胞被移植到体内后不会长期存活,可对细胞分泌的旁分泌因子(paracrine factors)产生营养效应(trophic effect)。这种因子中的生长因子(growthfactor)、趋化因子(chemokine)、细胞因子(cytokine)等低分子借由细胞外囊泡(extracellular vesicle)(如:外泌体)分泌,这种外泌体来源于干细胞。因此,外泌体被用于证明干细胞的特性,并用于评估其治疗功效。
最近,在研究间充质干细胞对各种疾病的治疗功效方面,选择使用间充质干细胞分泌的外泌体,而非间充质干细胞本身。学术界、产业界预测其有望成为克服现有干细胞治疗法局限性的全新替代方案。
为实现这种外泌体的商业应用性,就需要大量优质的外泌体。但目前可从干细胞中获取的外泌体数量极少,且在可增加干细胞来源外泌体产量方面的开发工作仍存在不足。
一方面,已知间充质干细胞培养期变长,且经过数次继代培养后,其增殖能力和分化能力也会降低。另外,相较于早期继代(passage)的间充质干细胞,晚期继代的间充质干细胞的集落形成能力明显降低。而与间充质干细胞的老化相关的正是长期培养期内弱化的增殖能力,而非骨髓供体的年龄,其与端粒酶活性(telomerase activity)降低也存在关联。
因此,目前可从人体中获得的间充质干细胞量有限,且为了诱导以此方式获得细胞分化成特定谱系,又不可避免地面临继代培养所致的分化能力降低问题。而这些缺点对于诱导分化为准确的靶细胞及需为此确保大量合适的干细胞的临床应用而言,是不现实的。因此,就需要一种既能长时间保持增殖率,又能保持分化成多个谱系的能力的方法。
为此,需要开发一种新的方法和物质,其要既能促进干细胞来源外泌体的生产,又能长时间保持干细胞的增殖率和分化能力。
发明内容
技术问题
本发明人致力于开发一种可促进干细胞来源外泌体的生产,且可长时间保持干细胞的增殖率和分化能力的方法和物质。其结果证实,如果在干细胞中,预处理选自Exendin-4、豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)、干扰素-γ(Interferon-γ)、粉防己碱(Tetrandrine)、透明质酸(Hyaluronic acid)、物质-P(Substance P)、白藜芦醇(Resveratrol)和Lanifibranor组成的组中的一种以上时,干细胞的干性(Stemness)和增殖性(Proliferation)会增加,且干细胞来源外泌体数量、外泌体中的蛋白和RNA含量也会明显增加,借以完成了本发明。
因此,本发明的目的在于,提供一种用于促进干细胞来源外泌体产生的组合物,其包含Exendin-4。
本发明的另一个目的在于,提供一种用于增加干细胞的干性(Stemness)的组合物,其包含Exendin-4。
本发明的另一个目的在于,提供一种干细胞治疗剂,其包含用于促进上述干细胞来源外泌体产生或增加干细胞(Stemness)的干性的组合物。
本发明的另一个目的在于,提供一种经Exendin-4预处理的干细胞来源外泌体。
本发明的另一个目的在于,提供一种干细胞治疗剂,其包含上述干细胞来源外泌体。
本发明的另一个目的在于,提供一种干细胞来源外泌体的生产方法,其包括:在包含Exendin-4的细胞培养基中培养干细胞的预处理步骤。
本发明的另一个目的在于,提供一种增加干细胞的干性(Stemness)的方法,其包括:在包含Exendin-4的细胞培养基中培养干细胞的预处理步骤。
本发明的另一个目的在于,提供一种组合物的促进干细胞来源外泌体产生的用途,该组合物包含Exendin-4。
本发明的另一个目的在于,提供一种组合物的增加干细胞的干性(Stemness)的用途,该组合物包含Exendin-4。
本发明的另一个目的在于,提供一种用于促进干细胞来源外泌体产生的组合物,其包含豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)。
本发明的另一个目的在于,提供一种用于增加干细胞的干性(Stemness)的组合物,其包含豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)。
本发明的另一个目的在于,提供一种干细胞治疗剂,其包含用于促进上述干细胞来源外泌体产生或增加干细胞的干性的组合物。
本发明的另一个目的在于,提供一种经豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)预处理的干细胞来源外泌体。
本发明的另一个目的在于,提供一种干细胞治疗剂,其包含上述干细胞来源外泌体。
本发明的另一个目的在于,提供一种干细胞来源外泌体的生产方法,其包括:在包含豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)的细胞培养基中培养干细胞的预处理步骤。
本发明的另一个目的在于,提供一种增加干细胞的干性(Stemness)的方法,其包括:在包含豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)的细胞培养基中培养干细胞的预处理步骤。
本发明的另一目的在于,提供一种组合物的促进干细胞来源外泌体产生的用途,该组合物包含豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)。
本发明的另一个目的在于,提供一种组合物的增加干细胞的干性(Stemness)的用途,该组合物包含豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)。
本发明的另一个目的在于,提供一种用于促进干细胞来源外泌体产生的组合物,其包含干扰素-γ(Interferon-γ)。
本发明的另一个目的在于,提供一种用于增加干细胞的干性(Stemness)的组合物,其包含干扰素-γ(Interferon-γ)。
本发明的另一个目的在于,提供一种干细胞治疗剂,其包含用于促进上述干细胞来源外泌体产生或增加干细胞的干性的组合物。
本发明的另一个目的在于,提供一种经干扰素-γ(Interferon-γ)预处理的干细胞来源外泌体。
本发明的另一个目地在于,提供一种干细胞治疗剂,其包含上述干细胞来源外泌体。
本发明的另一目的在于,提供一种干细胞来源外泌体的生产方法,其包括:在包含干扰素-γ(Interferon-γ)的细胞培养基中培养干细胞的预处理步骤。
本发明的另一个目的在于,提供一种增加干细胞的干性(Stemness)的方法,其包括:在包含干扰素-γ(Interferon-γ)的细胞培养基中培养干细胞的预处理步骤。
本发明的另一目的在于,提供一种组合物的促进干细胞来源外泌体产生的用途,该组合物包含干扰素-γ(Interferon-γ)。
本发明的另一个目的在于,提供一种组合物的增加干细胞的干性(Stemness)的用途,该组合物包含干扰素-γ(Interferon-γ)。
本发明的另一个目的在于,提供一种用于促进干细胞来源外泌体产生的组合物,其包含粉防己碱(Tetrandrine)。
本发明的另一个目的在于,提供一种用于增加干细胞的干性(Stemness)的组合物,其包含粉防己碱(Tetrandrine)。
本发明的另一个目的在于,提供一种干细胞治疗剂,其包含用于促进上述干细胞来源外泌体产生或增加干细胞的干性的组合物。
本发明的另一个目的在于,提供一种经粉防己碱(Tetrandrine)预处理的干细胞来源外泌体。
本发明的另一个目的在于,提供一种干细胞治疗剂,其包含上述干细胞来源外泌体。
本发明的另一个目的在于,提供一种干细胞来源外泌体的生产方法,其包括:在包含粉防己碱(Tetrandrine)的细胞培养基中培养干细胞的预处理步骤。
本发明的另一个目的在于,提供一种增加干细胞的干性(Stemness)的方法,其包括:在包含粉防己碱(Tetrandrine)的细胞培养基中培养干细胞的预处理步骤。
本发明的另一目的在于,提供一种组合物的促进干细胞来源外泌体产生的用途,该组合物包含粉防己碱(Tetrandrine)。
本发明的另一个目的在于,提供一种组合物的增加干细胞的干性(Stemness)的用途,该组合物包含粉防己碱(Tetrandrine)。
本发明的另一个目的在于,提供一种用于促进干细胞来源外泌体产生的组合物,其包含透明质酸(Hyaluronic acid)。
本发明的另一个目的在于,提供一种用于增加干细胞的干性(Stemness)的组合物,其包含透明质酸(Hyaluronic acid)。
本发明的另一个目的在于,提供一种干细胞治疗剂,其包含用于促进上述干细胞来源外泌体产生或增加干细胞的干性的组合物。
本发明的另一个目的在于,提供一种经透明质酸(Hyaluronic acid)预处理的干细胞来源外泌体。
本发明的另一个目地在于,提供一种干细胞治疗剂,其包含上述干细胞来源外泌体。
本发明的另一目的在于,提供一种干细胞来源外泌体的生产方法,其包括:在包含透明质酸(Hyaluronic acid)的细胞培养基中培养干细胞的预处理步骤。
本发明的另一个目的在于,提供一种增加干细胞的干性(Stemness)的方法,其包括:在包含透明质酸(Hyaluronic acid)的细胞培养基中培养干细胞的预处理步骤。
本发明的另一目的在于,提供一种组合物的促进干细胞来源外泌体产生的用途,该组合物包含透明质酸(Hyaluronic acid)。
本发明的另一个目的在于,提供一种组合物的增加干细胞的干性(Stemness)的用途,该组合物包含透明质酸(Hyaluronic acid)。
本发明的另一个目的在于,提供一种用于促进干细胞来源外泌体产生的组合物,其包含物质-P(Substance P)。
本发明的另一个目的在于,提供一种用于增加干细胞的干性(Stemness)的组合物,其包含物质-P(Substance P)。
本发明的另一个目的在于,提供一种干细胞治疗剂,其包含用于促进上述干细胞来源外泌体产生或增加干细胞的干性的组合物。
本发明的另一个目的在于,提供一种经物质-P(Substance P)预处理的干细胞来源外泌体。
本发明的另一个目的在于,提供一种干细胞治疗剂,其包含上述干细胞来源外泌体。
本发明的另一个目的在于,提供一种干细胞来源外泌体的生产方法,其包括:在包含物质-P(Substance P)的细胞培养基中培养干细胞的预处理步骤。
本发明的另一个目的在于,提供一种增加干细胞的干性(Stemness)的方法,其包括:在包含物质-P(Substance P)的细胞培养基中培养干细胞的预处理步骤。
本发明的另一目的在于,提供一种组合物的促进干细胞来源外泌体产生的用途,该组合物包含物质-P(Substance P)。
本发明的另一个目的在于,提供一种组合物的增加干细胞的干性(Stemness)的用途,该组合物包含物质-P(Substance P)。
因此,本发明的一个目的在于,提供一种用于促进干细胞来源外泌体产生的组合物,其包含白藜芦醇(Resveratrol)。
本发明的另一个目的在于,提供一种用于增加干细胞的干性(Stemness)的组合物,其包含白藜芦醇(Resveratrol)。
本发明的另一个目的在于,提供一种干细胞治疗剂,其包含用于促进上述干细胞来源外泌体产生或增加干细胞的干性的组合物。
本发明的另一个目的在于,提供一种经白藜芦醇(Resveratrol)预处理的干细胞来源外泌体。
本发明的另一个目地在于,提供一种干细胞治疗剂,其包含上述干细胞来源外泌体。
本发明的另一目的在于,提供一种干细胞来源外泌体的生产方法,其包括:在包含白藜芦醇(Resveratrol)的细胞培养基中培养干细胞的预处理步骤。
本发明的另一个目的在于,提供一种增加干细胞的干性(Stemness)的方法,其包括:在包含白藜芦醇(Resveratrol)的细胞培养基中培养干细胞的预处理步骤。
本发明的另一目的在于,提供一种组合物的促进干细胞来源外泌体产生的用途,该组合物包含白藜芦醇(Resveratrol)。
本发明的另一个目的在于,提供一种组合物的增加干细胞的干性(Stemness)的用途,该组合物包含白藜芦醇(Resveratrol)。
本发明的另一个目的在于,提供一种用于促进干细胞来源外泌体产生的组合物,其包含Lanifibranor。
本发明的另一个目的在于,提供一种用于增加干细胞的干性(Stemness)的组合物,其包含Lanifibranor。
本发明的另一个目的在于,提供一种干细胞治疗剂,其包含用于促进上述干细胞来源外泌体产生或增加干细胞的干性的组合物。
本发明的另一个目的在于,提供一种经Lanifibranor预处理的干细胞来源外泌体。
本发明的另一个目的在于,提供一种干细胞治疗剂,其包含上述干细胞来源外泌体。
本发明的另一个目的在于,提供一种干细胞来源外泌体的生产方法,其包括:在包含Lanifibranor的细胞培养基中培养干细胞的预处理步骤。
本发明的另一个目的在于,提供一种增加干细胞的干性(Stemness)的方法,其包括:在包含Lanifibranor的细胞培养基中培养干细胞的预处理步骤。
本发明的另一目的在于,提供一种组合物的促进干细胞来源外泌体产生的用途,该组合物包含Lanifibranor。
本发明的另一个目的在于,提供一种组合物的增加干细胞的干性(Stemness)的用途,该组合物包含Lanifibranor。
技术方案
本发明人致力于开发一种可促进干细胞来源外泌体的生产,且可长时间保持干细胞的增殖率和分化能力的方法和物质。其结果证实,如果在干细胞中对选自Exendin-4、豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)、干扰素-γ(Interferon-γ)、粉防己碱(Tetrandrine)、透明质酸(Hyaluronic acid)、物质-P(Substance P)、白藜芦醇(Resveratrol)和Lanifibranor组成的组中的一种进行预处理时,干细胞的干性(Stemness)和增殖性(Proliferation)会增加,且干细胞来源外泌体数量、外泌体中的蛋白和RNA含量也会明显增加。
本发明涉及一种用于促进干细胞来源外泌体产生或增加干细胞的干性的组合物,其包含选自Exendin-4、豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)、干扰素-γ(Interferon-γ)、粉防己碱(Tetrandrine)、透明质酸(Hyaluronic acid)、物质-P(Substance P)、白藜芦醇(Resveratrol)和Lanifibranor组成的组中的一种以上;一种包含上述组合物的干细胞治疗剂;一种干细胞来源外泌体,其经选自Exendin-4、豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)、干扰素-γ(Interferon-γ)、粉防己碱(Tetrandrine)、透明质酸(Hyaluronic acid)、物质-P(Substance P)、白藜芦醇(Resveratrol)和Lanifibranor组成的组中的一种以上预处理;一种包含上述干细胞来源外泌体的干细胞治疗剂;及一种干细胞来源外泌体的生产方法和增加干细胞的干性的方法。
以下,就本发明进行详细说明。
依据本发明的一个方面,涉及一种用于促进干细胞来源外泌体产生的组合物,其包含Exendin-4。
本发明的Exendin-4是胰高血糖素样肽(glucagon-like peptide;GLP)受体的肽激动剂。已知Exendin-4可促进胰岛素分泌,在临床上一直被用于治疗2型糖尿病和帕金森病。
依据本发明的一个方面,涉及一种用于促进干细胞来源外泌体产生的组合物,其包含豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)。
已知本发明的豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA),又名12-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate;TPA),起到激活信号转导酶(signal transductionenzyme),即蛋白激酶C(protein kinase C;PKC)的作用。另外,PMA用作肿瘤促进因子,起到刺激B细胞等的分裂,诱导多个细胞活化,以产生细胞因子的作用。因此,其一直被用于研究炎症反应诱导剂等。
依据本发明的一个方面,涉及一种用于促进干细胞来源外泌体产生的组合物,其包含干扰素-γ(Interferon-γ)。
本发明的干扰素-γ(Interferon-γ)是借由活化的T细胞、NK细胞,及CD4和CD8阳性而淋巴细胞产生的细胞因子,其作为促有丝分裂因子或生长因子,参与促进各种细胞(包括T淋巴细胞在内)的活化和增殖分化,及增加抗原提呈细胞MHC的表达,在免疫和炎症反应中起重要作用。另外,干扰素-γ(Interferon-γ)在临床上一直被用于治疗感染和自身免疫。
依据本发明的一个方面,涉及一种用于促进干细胞来源外泌体产生的组合物,其包含粉防己碱(Tetrandrine)。
本发明的粉防己碱(Tetrandrine)作为钙通道阻滞剂(calcium channelbroker),可非选择性地抑制钙通道活性,并可在各种细胞类型中诱导细胞周期和细胞凋亡的G1期的G1期阻滞,从而发挥免疫抑制、抗炎、抗纤维化、抗凝作用等方面的效果,其还可增加肝细胞糖原的合成,提高葡萄糖的利用率,从而降低血浆葡萄糖浓度。另外,粉防己碱在临床上一直被用作糖尿病的同步治疗剂,并治疗心律失常、高血压,及用作镇痛和镇痉剂,肝硬化和风湿性关节炎治疗剂等。
依据本发明的一个方面,涉及一种用于促进干细胞来源外泌体产生的组合物,其包含透明质酸(Hyaluronic acid)。
本发明的透明质酸(Hyaluronic acid)是D-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid)和N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetyl-D-glucosamine)的双糖单元借由β(1→4)个体内部的糖苷键(inter linkage)连接的天然线性多糖类。已知透明质酸是构成真皮的成分之一,其生物适应性、生物降解性优异,在体内无免疫排斥且无毒性,是已知的一种优良的生物材料。另外,透明质酸作为一种具有高粘度、高弹性的天然糖胺聚糖大分子,还具有多种功能和物理化学特性,因此,其在临床上一直被用于关节炎治疗、眼科手术,用作填充剂,治疗伤口,并用作药物传递体、抗粘连剂、组织工程学和化妆品等。
依据本发明的一个方面,涉及一种用于促进干细胞来源外泌体产生的组合物,其包含物质-P(Substance P)。
本发明的物质-P(Substance P)是速激肽神经肽家族(tachykinin neuropeptidefamily)的11肽(undecapeptide),是作用于NK1受体(receptor)的神经肽,发挥神经递质和神经调质的作用。另外,已知物质-P是一种强大的血管扩张剂,可促进细胞生长,因此,其即可促进伤口(如:难于治疗的溃疡)再生,又可有效调节慢性风疹、特应性皮炎、慢性肾脏疾病、炎症和痛症。此外,其有助于皮肤细胞增殖和再生,因而被用作化妆品原料,且在临床上一直被用于治疗高血压和肝硬化等疾病。
依据本发明的一个方面,涉及一种用于促进干细胞来源外泌体产生的组合物,其包含白藜芦醇(Resveratrol)。
本发明的白藜芦醇(Resveratrol)是当植物面临霉菌或害虫等不利环境时所产生的植物抗毒素,是一种多酚类物质。其可通过激活脱乙酰酶Sirt1(Sirtuin-1)增强线粒体的功能,及增强糖代谢的流动。另外,白藜芦醇具有抗癌、抗病毒、保护神经、抗衰老、抗炎、延长寿命等功效,其还可通过增加抗氧化性和一氧化氮(NO)的产生来扩张血管,有效抑制心脏再灌注损伤额心律失常。因此,白藜芦醇(Resveratrol)作为心血管系统、脑部疾病的治疗剂而被不断研究,且在临床上也一直被用于各种领域,如:抗衰老、抗炎相关健康功能食品、改善皱纹的化妆品原料。
依据本发明的一个方面,涉及一种用于促进干细胞来源外泌体产生的组合物,其包含Lanifibranor。
本发明的Lanifibranor是一种过氧化物酶体增值物激活受体(peroxisomeproliferator-activated receptors,PPAR)激动剂(agonist),其可分别激活被称为PPARα,PPARδ和PPARγ的3种PPAR isoforms,以诱导体内的抗纤维化、抗炎和有益的代谢变化,是已知的一种小分子(small molecule)。PPAR是一种属于调节基因表达的核激素受体家族的配体激活型转录因子。PPAR在调节细胞分化、发育和肿瘤形成方面发挥必不可少的作用。已知其可通过激活调节纤维化的PPAR来减少结缔组织的异常生长。另外,Lanifibranor在临床上一直被用作全身硬化症治疗剂、特发性肺纤维化治疗剂等。
依据本发明的上述组合物,除上述成分外,还可包含公知的促进外泌体产生的物质。
在本说明书中,“外泌体(Exosome)”是细胞来源的囊泡,存在于几乎所有真核生物的体液中。外泌体的直径约为30-200nm,比LDL蛋白大,但明显小于红细胞。
上述外泌体,可在多泡体(multivesicular bodies)与细胞膜融合时从细胞中释放出来,也可直接从细胞膜中释放出来。
已知这种外泌体发挥重要的特化功能,如:凝固、细胞间信号传导。
在本说明书中,“干细胞(Stem cell)”作为一种未分化的细胞,指的是,具有自我复制能力,且具有可分化成两种以上不同类型的细胞的能力的细胞。
上述干细胞可以是自体或同种异体干细胞,也可来源于任一类型的动物(包括:人类或非人类哺乳类),上述干细胞可来源于成体或胚胎,但不限于此。
具体地,上述干细胞可以是胚胎干细胞、成体干细胞或诱导多能干细胞,但不限于此。
在本说明书中“胚胎干细胞(embryonic stem cell)”是在胚胎发生过程中提取的细胞,指的是,在受精卵在母体子宫着床前从囊胚期胚胎芽中提取出内细胞团(inner cellmass)后在体外培养的。
上述胚胎干细胞,指的是多能性(pluripotent)或全能性(totipotent)干细胞,具有自我复制能力(selfrenewal),从广义上来讲,还包括干细胞来源胚状体(embryoidbodies)。
上述胚胎干细胞,可包括所有来源(如:人类、猴子、猪、马、牛、羊、狗、猫、小鼠、兔子)的胚胎干细胞,但不限于此。
在本说明书中,“成体干细胞(adult stem cell)”是从脐带血或已成熟的成人的骨髓、血液等中提取的细胞,指的是,即将分化为特定内脏器官之细胞前的细胞,也指一种处于未分化状态的细胞,其具有必要时可发育成体内组织的能力。
上述成体干细胞,可包括:人类或动物的各种组织起源的成体干细胞,人类或动物组织来源间充质干细胞(mesenchymal stromal cell),人或动物的各种组织起源的诱导多能干细胞来源间充质干细胞和多能干细胞,但不限于此。
上述人类或动物组织,可以是脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜和/或胎盘,但不限于此。
上述人类或动物的各种组织来源干细胞,可以是例如:造血干细胞、乳腺干细胞、肠干细胞、血管内皮干细胞、神经干细胞、嗅觉神经干细胞和/或睾丸干细胞,但不限于此。
在本说明书中,“诱导万能细胞(induced pluripotent stem cell;iPSC)”是指通过人工逆分化过程,从分化的细胞中诱导出的具有多能性分化能力的细胞,其与“逆分化干细胞”含义相同。
上述人为逆分化过程,可通过使用病毒性介导(其使用逆转录病毒、慢病毒、仙台病毒)或非病毒性载体,并通过导入非病毒性介导的逆分化因子(其使用蛋白或细胞提取物等)完成,或可包括:借由干细胞提取物、化合物等完成的逆分化过程。
上述诱导万能干细胞具有与胚胎干细胞几乎相同的特性。具体地,两者具有相似的细胞形状,基因和蛋白表达相似,在体外(in vitro)和体内(In vivo)具有全能性,并形成畸胎瘤(teratoma),当插入到小鼠的囊胚(blastocyst)中时,会形成嵌合体(chimera)小鼠,并可进行基因的生殖系传递(germline transmission)。
上述诱导多能干细胞,可包括所有来源(如:人类、猴子、猪、马、牛、羊、狗、猫、小鼠、兔子)的诱导多能干细胞,但不限于此。
在本说明书中,术语“促进产生”是指,同一时间内,相较于对照组,特定物质的生产、产生和释放等会增加。
具体指,干细胞生产的外泌体数量、外泌体中的蛋白、RNA等的含量会增加。
依据本发明的另一个方面,涉及一种用于增加干细胞的干性(Stemness)的组合物,其包含Exendin-4。
依据本发明的另一个方面,涉及一种用于增加干细胞的干性(Stemness)的组合物,其包含豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)。
依据本发明的另一个方面,涉及一种用于增加干细胞的干性(Stemness)的组合物,其包含干扰素-γ(Interferon-γ)。
依据本发明的另一个方面,涉及一种用于增加干细胞的干性(Stemness)的组合物,其包含粉防己碱(Tetrandrine)。
依据本发明的另一个方面,涉及一种用于增加干细胞的干性(Stemness)的组合物,其包含透明质酸(Hyaluronic acid)。
依据本发明的另一个方面,涉及一种用于增加干细胞的干性(Stemness)的组合物,其包含物质-P(Substance P)。
依据本发明的另一方面,涉及一种用于增加干细胞的干性(Stemness)的组合物,其包含白藜芦醇(Resveratrol)。
依据本发明的另一方面,涉及一种用于增加干细胞的干性(Stemness)的组合物,其包含Lanifibranor。
在本说明书中,术语“干性”是多能性(pluripotency)(其指具有可产生所有细胞的能力)和自我复制能力(self-renewal)(其指可无限产生与自己相似的细胞的能力)的总称,在本领域中通用。
具体指,保持未分化细胞的未分化状态的同时,增加干细胞的增殖性(Proliferation),或增加端粒酶活性,或增加干细胞作用信号(stemness actingsignals)的表达,或增加细胞迁移活性,并可包括表现出这些特征中的一种以上。
本发明的上述各组合物,可作为培养基组合物用于干细胞培养,并可作为用于促进体内(in vivo)外泌体产生的药剂学组合物,与干细胞一起同时施用于体内;之前或之后施用,也可以增强干细胞的体内(in vivo)功效。
上述增强干细胞的体内(in vivo)功效是指,对特定疾病(如:关节炎、神经病)具有治疗目的(in vivo功效)的干细胞功效,借由干细胞释放的外泌体完成介导,以此作为前提,同时施用本发明的上述组合物和干细胞时,可促进干细胞的外泌体产生,从而增强干细胞的疾病治疗功效(in vivo功效)。
本发明的上述组合物为培养基组合物时,上述“培养基”则指一种包含细胞在体外(in vitro)生长、存活和增殖时所需的必需成分的组合物,其包括本领域常用的所有干细胞培养用培养基,例如:可使用DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium),MEM(Minimal Essential Medium),BME(Basal Medium Eagle),RPMI1640,DMEM/F-10(Dulbecco's Modified Eagle's Medium:Nutrient Mixture F-10),DMEM/F-12(Dulbecco's Modified Eagle's Medium:Nutrient Mixture F-12),α-MEM(α-Minimalessential Medium),G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium),IMDM(Isocove'sModified Dulbecco's Medium),KnockOut DMEM,E8(Essential 8Medium)等商业制备的培养基或人工合成的培养基,但不限于此。
通常,上述培养基组合物包含碳源、氮源和微量元素成分,还可包含氨基酸、抗生剂等。
另外,上述培养基组合物,可在现有干细胞培养用培养基中添加Exendin-4制备。
另外,上述培养基组合物,可在现有干细胞培养用培养基中添加豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)制备。
另外,上述培养基组合物,可在现有干细胞培养用培养基中添加干扰素-γ(Interferon-γ)制备。
另外,上述培养基组合物,可在现有干细胞培养用培养基中添加粉防己碱(Tetrandrine)制备。
另外,上述培养基组合物,可在现有干细胞培养用培养基中添加透明质酸(Hyaluronic acid)制备。
另外,上述培养基组合物,可在现有干细胞培养用培养基中添加物质-P(Substance P)制备。
另外,上述培养基组合物,可在现有干细胞培养用培养基中添加白藜芦醇(Resveratrol)制备。
另外,上述培养基组合物,可在现有干细胞培养用培养基中添加Lanifibranor制备。
上述本发明的组成成分Exendin-4,其添加到培养基中的浓度可以是10~1000nM,10~100nM,10~90nM,10~80nM,10~70nM,10~60nM,10~50nM,10~40nM,10~30nM或20nM,但不限于此。
上述本发明的组成成分豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA),其添加到培养基中的浓度可以是1~1000nM,1~500nM,1~100nM,1~90nM,1~80nM,1~70nM,1~60nM,1~50nM,1~40nM,1~30nM,1~20nM或10nM,但不限于此。
上述本发明的组成成分干扰素-γ(Interferon-γ),其添加到培养基中的浓度可以是1~1000ng/mL,1~500ng/mL,1~100ng/mL,1~90ng/mL,1~80ng/mL,1~70ng/mL,1~60ng/mL,1~50ng/mL,1~40ng/mL,1~30ng/mL,1~20ng/mL或10ng/mL,但不限于此。
上述本发明的组成成分粉防己碱(Tetrandrine),其添加到培养中的浓度可以是1~1000μM,1~500μM,1~100μM,1~90μM,1~80μM,1~70μM,1~60μM,1~50μM,1~40μM,1~30μM,1~20μM或10μM,但不限于此。
上述本发明的组成成分透明质酸(Hyaluronic acid),其添加到培养基中的浓度可以是1~1000ug/mL,1~500ug/mL,1~100ug/mL,1~90ug/mL,1~80ug/mL,1~70ug/mL,1~60ug/mL,1~50ug/mL,1~40ug/mL,1~30ug/mL,1~20ug/mL或10ug/mL,但不限于此。
上述本发明的组成成分物质-P(Substance P),其添加到培养基中的浓度可以是10~1000nM,10~100nM,10~90nM,10~80nM,10~70nM,10~60nM,10~50nM,10~40nM,20~40nM或30nM,但不限于此。
上述本发明的组成成分白藜芦醇(Resveratrol),其添加到培养基中的浓度可以是1~1000nM,1~500nM,1~100nM,1~90nM,1~80nM,1~70nM,1~60nM,1~50nM,1~40nM,1~30nM,1~20nM或10nM,但不限于此。
上述本发明的组成成分Lanifibranor,其添加到培养基中的浓度可以是1~1000μM,1~500μM,1~100μM,1~90μM,1~80μM,1~70μM,1~60μM,1~50μM,1~40μM,1~30μM,1~20μM或10μM,但不限于此。
本发明的上述各组合物为药剂学组合物时,本发明的药剂学组合物中可包含的药剂学上可接受的载体,通常在进行制剂时使用,其包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油等,但不限于此。除上述成分之外,本发明的药剂学组合物还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、增香剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂等。合适且在药剂学上可接受的载体和制剂在Remington'sPharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)中有详细记述。
本发明的药剂学组合物,可使用口服和非口服给药方式,如:静脉注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、局部注射、鼻腔内给药、肺内给药、直肠内给药、硬脑膜内给药、眼球给药、皮肤给药和经皮给药等。
本发明的药剂学组合物的适当给药量较为多样,主要取决于制剂方法,给药方式,患者的年龄、体重、性别、病理状况、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度和反应敏感性等因素,普通技术医师可以很容易地确定针对所需治疗或预防的有效给药量并开出相应处方。依据本发明的具体实现例,本发明的药剂学组合物的日给药量为0.0001-1000mg/kg。
本发明的药剂学组合物,根据本发明所属技术领域的普通技术人员很容易实施的方法,并利用药剂学上可接受的载体和/或赋形剂进行制剂,从而制备成单位剂型或引入到大容量容器中制备。这时,剂型可以是油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态,也可以是提取物、散剂、栓剂、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态,还可包括分散剂和稳定剂。
依据本发明的另一个方面,涉及一种经Exendin-4预处理的干细胞来源外泌体。
依据本发明的另一个方面,涉及一种经豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)预处理的干细胞来源外泌体。
依据本发明的另一个方面,涉及一种经干扰素-γ(Interferon-γ)预处理的干细胞来源外泌体。
依据本发明的另一个方面,涉及一种经粉防己碱(Tetrandrine)预处理的干细胞来源外泌体。
依据本发明的另一个方面,涉及一种经透明质酸(Hyaluronic acid)预处理的干细胞来源外泌体。
依据本发明的另一个方面,涉及一种经物质-P(Substance P)预处理的干细胞来源外泌体。
依据本发明的另一个方面,涉及一种经白藜芦醇(Resveratrol)预处理的干细胞来源外泌体。
依据本发明的另一个方面,涉及一种经Lanifibranor预处理的干细胞来源外泌体。
此处省略上述本发明的各组合物与上述干细胞来源外泌体的相同内容,以免本说明书过于繁冗。
依据本发明的另一个方面,涉及一种干细胞治疗剂,其包含:含上述Exendin-4的组合物,及经Exendin-4预处理的干细胞或经Exendin-4预处理的干细胞来源外泌体。
依据本发明的另一个方面,涉及一种干细胞治疗剂,其包含:含上述豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)的组合物;及经豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)预处理的干细胞或经豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)预处理的干细胞来源外泌体。
依据本发明的另一个方面,涉及一种干细胞治疗剂,其包含:含上述干扰素-γ(Interferon-γ)的组合物;及经干扰素-γ(Interferon-γ)预处理的干细胞或经干扰素-γ(Interferon-γ)预处理的干细胞来源外泌体。
依据本发明的另一个方面,涉及一种干细胞治疗剂,其包含:含上述粉防己碱(Tetrandrine)的组合物;及经粉防己碱(Tetrandrine)预处理的干细胞或经粉防己碱(Tetrandrine)预处理的干细胞来源外泌体。
依据本发明的另一个方面,涉及一种干细胞治疗剂,其包含:含上述透明质酸(Hyaluronic acid)的组合物;及经透明质酸(Hyaluronic acid)预处理的干细胞或经透明质酸(Hyaluronic acid)预处理的干细胞来源外泌体。
依据本发明的另一个方面,涉及一种干细胞治疗剂,其包含:含上述物质-P(Substance P)组合物;及经物质-P(Substance P)预处理的干细胞或经物质-P(SubstanceP)预处理的干细胞来源外泌体。
依据本发明的另一个方面,涉及一种干细胞治疗剂,其包含:含上述白藜芦醇(Resveratrol)组合物;及经白藜芦醇(Resveratrol)预处理的干细胞或经白藜芦醇(Resveratrol)预处理的干细胞来源外泌体。
依据本发明的另一个方面,涉及一种干细胞治疗剂,其包含:含上述Lanifibranor组合物;及经Lanifibranor预处理的干细胞或经Lanifibranor预处理的干细胞来源外泌体。
在本发明中,“细胞治疗剂”是指,为了恢复细胞和组织的功能,通过一系列行为,如:在体外增殖、挑选自体(autologous)、同种(allogenic)、异种(xenogenic)细胞或其他方法改变细胞生物特性,从而被用于治疗、诊断和预防目的的医药品。
这种细胞治疗剂大体可分为两类,第一类是用于组织再生、内脏器官功能恢复或免疫细胞功能调节的“干细胞治疗剂”,第二类是用于免疫反应调节(如:免疫反应的抑制或免疫反应的亢进)的“免疫细胞治疗剂”。
上述本发明的各组合物及其组成成分Exendin-4、豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)、干扰素-γ(Interferon-γ)、粉防己碱(Tetrandrine)、透明质酸(Hyaluronic acid)、物质-P(Substance P)、白藜芦醇(Resveratrol)和Lanifibranor可增加干细胞的干性,促进干细胞来源外泌体产生,从而有效增强干细胞治疗功效,因此,本说明书中的“细胞治疗剂”指的是“干细胞治疗剂”。
上述干细胞治疗剂可用于治疗心肌梗塞、心力衰竭等心血管疾病,肝癌、胃癌、大肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌等癌症疾病,特应性皮肤炎、关节炎、自身免疫性脑脊髓炎、全身性红斑狼疮、大肠炎和多发性硬化症等炎症性疾病,或用于治疗待治疗疾病(如:自身免疫性疾病),但不限于此。
上述干细胞治疗剂的组成成分,与上述本发明的各组合物相同,故此处省略两者的相同内容,以免本说明书过于繁冗。
依据本发明的另一个方面,涉及一种干细胞来源外泌体的生产方法,其包括以下步骤:
a)在包含Exendin-4的细胞培养基中培养干细胞。
依据本发明的另一个方面,涉及一种干细胞来源外泌体的生产方法,其包括如下步骤:
a)在包含豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)的细胞培养基中培养干细胞。
依据本发明的另一个方面,涉及一种干细胞来源外泌体的生产方法,其包括如下步骤:
a)在包含干扰素-γ(Interferon-γ)的细胞培养基中培养干细胞。
依据本发明的另一个方面,涉及一种干细胞来源外泌体的生产方法,其包括如下步骤:
a)在包含粉防己碱(Tetrandrine)的细胞培养基中培养干细胞。
依据本发明的另一个方面,涉及一种干细胞来源外泌体的生产方法,其包括如下步骤:
a)在包含透明质酸(Hyaluronic acid)的细胞培养基中培养干细胞。
依据本发明的另一个方面,涉及一种干细胞来源外泌体的生产方法,其包括如下步骤:
a)在包含物质-P(Substance P)的细胞培养基中培养干细胞。
依据本发明的另一个方面,涉及一种干细胞来源外泌体的生产方法,其包括如下步骤:
a)在包含白藜芦醇(Resveratrol)的细胞培养基中培养干细胞。
依据本发明的另一个方面,涉及一种干细胞来源外泌体的生产方法,其包括如下步骤:
a)在包含Lanifibranor的细胞培养基中培养干细胞。
上述方法还可包括以下步骤:
b)清洗培养的干细胞后,在培养基中进一步培养;及
c)分离外泌体。
以下,就本发明的干细胞来源外泌体的生产方法进行详细说明。
a)步骤
本步骤是用Exendin-4、豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)、干扰素-γ(Interferon-γ)、粉防己碱(Tetrandrine)、透明质酸(Hyaluronic acid)、物质-P(Substance P)、白藜芦醇(Resveratrol)和Lanifibranor对干细胞进行预处理后,对干细胞施加刺激的一个过程。干细胞完成本过程后,相较于未用上述物质预处理的干细胞,其生产的外泌体数量会更多,外泌体中的蛋白和RNA含量也会增加。
b)步骤
本步骤是清洗经本发明的上述物质预处理的干细胞后,清除上述预处理物质,并在新的细胞培养基中培养,从而诱导干细胞分泌或生产外泌体的过程。上述a)步骤的干细胞预处理物质(Exendin-4)通过上述b)步骤的清洗过程得以去除,清洗后,不会残留在清洗后的干细胞、干细胞生产的外泌体或培养基中。因此,在上述a)步骤中经本发明的干细胞预处理物质处理的干细胞,及干细胞生产的外泌体和培养基,不会受到上述预处理物质的残留影响,可有效应用于后续研究或疾病治疗的目的。
本步骤的细胞培养基,还可以含有去除外泌体的胎牛血清(Fetal bovineserum)。而使用去除外泌体的FBS的原因在于,常用的FBS中含大量的牛血清来源外泌体。因此,这样做旨在防止混入除细胞分泌的外泌体之外的FBS来源外泌体。
本步骤的进一步培养,可培养12小时至120小时,24小时至96小时,48小时至96小时,或60小时至84小时,最具体地,可培养72小时,但不限于此。
c)步骤
本步骤以200-400xg的条件,对上述b)步骤中进一步培养的干细胞的培养基,进行离心5至10分钟,去除剩余的细胞和细胞残留物后,取上清液,以9,000-12,000xg的条件高速离心60-80分钟后,再取上清液,以90,000-120,000xg的条件离心80-100分钟,去除上清液,便可分离出下层残留的外泌体。
依据本发明的实现例,收集经预处理物质处理的间充质干细胞培养基,以300xg的条件离心10分钟,去除剩余的细胞和细胞残留物,取上清液,用0.22μm过滤器过滤后,使用高速离心机(high speed centrifuge),以1,000xg,4℃的条件离心70分钟。再取离心后的上清液,使用高速离心机(high speed centrifuge),以100,000xg,4℃的条件离心90分钟,去除上清液,从而分离出下层残留的外泌体。
依据本发明的另一个方面,涉及一种增加干细胞的干性(Stemness)的方法,其包括以下步骤:
a)在包含Exendin-4的细胞培养基中培养干细胞。
依据本发明的另一个方面,涉及一种增加干细胞的干性(Stemness)的方法,其包括以下步骤:
a)在包含豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)的细胞培养基中培养干细胞。
依据本发明的另一个方面,涉及一种增加干细胞的干性(Stemness)的方法,其包括以下步骤:
a)在包含干扰素-γ(Interferon-γ)的细胞培养基中培养干细胞。
依据本发明的另一个方面,涉及一种增加干细胞的干性(Stemness)的方法,其包括以下步骤:
a)在包含粉防己碱(Tetrandrine)的细胞培养基中培养干细胞。
依据本发明的另一个方面,涉及一种增加干细胞的干性(Stemness)的方法,其包括以下步骤:
a)在包含透明质酸(Hyaluronic acid)的细胞培养基中培养干细胞。
依据本发明的另一个方面,涉及一种增加干细胞的干性(Stemness)的方法,其包括以下步骤:
a)在包含物质-P(Substance P)的细胞培养基中培养干细胞。
依据本发明的另一个方面,涉及一种增加干细胞的干性(Stemness)的方法,其包括以下步骤:
a)在包含白藜芦醇(Resveratrol)的细胞培养基中培养干细胞。
依据本发明的另一个方面,涉及一种增加干细胞的干性(Stemness)的方法,其包括以下步骤:
a)在包含Lanifibranor的细胞培养基中培养干细胞。
上述增加干细胞的干性的方法,其包括的各步骤与上述本发明的干细胞来源外泌体的生产方法相同,故此处省略有关两者相同内容的记述,以免本说明书过于繁冗。
依据本发明的另一个方面,涉及一种组合物的促进干细胞来源外泌体产生的用途,该组合物包含Exendin-4。
依据本发明的另一个方面,涉及一种组合物的增加干细胞的干性(Stemness)的用途,该组合物包含Exendin-4。
依据本发明的另一个方面,涉及一种组合物的促进干细胞来源外泌体产生的用途,该组合物包含豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)。
依据本发明的另一个方面,涉及一种组合物的增加干细胞的干性(Stemness)的用途,该组合物包含豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)。
依据本发明的另一个方面,涉及一种组合物的促进干细胞来源外泌体产生的用途,该组合物包含干扰素-γ(Interferon-γ)。
依据本发明的另一个方面,涉及一种组合物的增加干细胞的干性(Stemness)的用途,该组合物包含干扰素-γ(Interferon-γ)。
依据本发明的另一个方面,涉及一种组合物的促进干细胞来源外泌体产生的用途,该组合物包含粉防己碱(Tetrandrine)。
依据本发明的另一个方面,涉及一种组合物的增加干细胞的干性(Stemness)的用途,该组合物包含粉防己碱(Tetrandrine)。
依据本发明的另一个方面,涉及一种组合物的促进干细胞来源外泌体产生的用途,该组合物包含透明质酸(Hyaluronic acid)。
依据本发明的另一个方面,涉及一种组合物的增加干细胞的干性(Stemness)的用途,该组合物包含透明质酸(Hyaluronic acid)。
依据本发明的另一个方面,涉及一种组合物的促进干细胞来源外泌体产生的用途,该组合物包含物质-P(Substance P)。
依据本发明的另一个方面,涉及一种组合物的增加干细胞的干性(Stemness)的用途,该组合物包含物质-P(Substance P)。
依据本发明的另一个方面,涉及一种组合物的促进干细胞来源外泌体产生的用途,该组合物包含白藜芦醇(Resveratrol)。
依据本发明的另一个方面,涉及一种组合物的增加干细胞的干性(Stemness)的用途,该组合物包含白藜芦醇(Resveratrol)。
依据本发明的另一个方面,涉及一种组合物的促进干细胞来源外泌体产生的用途,该组合物包含白藜芦醇Lanifibranor。
依据本发明的另一个方面,涉及一种组合物的增加干细胞的干性(Stemness)的用途,该组合物包含白藜芦醇Lanifibranor。
发明的效果
本发明涉及一种用于促进干细胞来源外泌体(Exosomes)产生和增强干细胞功能的组合物,其包含选自Exendin-4、豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)、干扰素-γ(Interferon-γ)、粉防己碱(Tetrandrine)、透明质酸(Hyaluronic acid)、物质-P(Substance P)、白藜芦醇(Resveratrol)和Lanifibranor组成的组中的一种,在细胞培养基中培养本发明的组合物时,干细胞的干性和干细胞来源外泌体的生产量会增加,因而,可更有效地生产优质的干细胞和干细胞来源外泌体,故可将其有效应用于相关的研发和产品化中。
附图说明
图1是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(Exendin-4)处理后的干细胞增殖率(Proliferation)增加图。
图2a和2b是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(Exendin-4)处理后的干细胞干性(Stemness)增加图。
图3是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(Exendin-4)处理后的外泌体大小分布图。
图4是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(Exendin-4)处理后的外泌体数量增加图。
图5是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(Exendin-4)处理后的外泌体来源蛋白量增加图。
图6是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(Exendin-4)处理后的外泌体来源RNA量增加图。
图7是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA))处理后的干细胞增殖率(Proliferation)增加图。
图8a和8b是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA))处理后的干细胞干性(Stemness)增加图。
图9是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA))处理后的外泌体大小分布图。
图10是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA))处理后的外泌体数量增加图。
图11是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA))处理后的外泌体来源蛋白量增加图。
图12是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA))处理后的外泌体来源RNA量增加图。
图13是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(干扰素-γ(Interferon-γ))处理后的干细胞增殖率(Proliferation)增加图。
图14a和14b是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(干扰素-γ(Interferon-γ))处理后的干细胞干性(Stemness)增加图。
图15是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(干扰素-γ(Interferon-γ))处理后的外泌体大小分布图。
图16是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(干扰素-γ(Interferon-γ))处理后的外泌体数量增加图。
图17是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(干扰素-γ(Interferon-γ))处理后的外泌体来源蛋白量增加图。
图18是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(干扰素-γ(Interferon-γ))处理后的外泌体来源RNA量增加图。
图19是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(粉防己碱(Tetrandrine))处理后的干细胞增殖率(Proliferation)增加图。
图20a和20b是依据本发明的一个实施例确认到,经干细胞预处理物质(粉防己碱(Tetrandrine))处理后的干细胞干性(Stemness)增加图。
图21是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(粉防己碱(Tetrandrine))处理后的外泌体大小分布图。
图22是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(粉防己碱(Tetrandrine))处理后的外泌体数量增加图。
图23是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(粉防己碱(Tetrandrine))处理后的外泌体来源蛋白量增加图。
图24是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(粉防己碱(Tetrandrine))处理后的外泌体来源RNA量增加图。
图25是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(透明质酸(Hyaluronic acid))处理后的干细胞增殖率(Proliferation)增加的图。
图26a和26b是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(透明质酸(Hyaluronic acid))处理后的干细胞干性(Stemness)增加图。
图27是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(透明质酸(Hyaluronic acid))处理后的外泌体大小分布图。
图28是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(透明质酸(Hyaluronic acid))处理后的外泌体数量增加图。
图29是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(透明质酸(Hyaluronic acid))处理后的外泌体来源蛋白量增加图。
图30是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(透明质酸(Hyaluronic acid))处理后的外泌体来源RNA量增加图。
图31是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(物质-P(Substance P))处理后的干细胞增殖率(Proliferation)增加图。
图32a和32b是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(物质-P(Substance P))处理后的干细胞干性(Stemness)增加图。
图33是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(物质-P(Substance P))处理后的外泌体大小分布图。
图34是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(物质-P(Substance P))处理后的外泌体数量增加图。
图35是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(物质-P(Substance P))处理后的外泌体来源蛋白量增加图。
图36是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(物质-P(Substance P))处理后的外泌体来源RNA量增加图。
图37是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(白藜芦醇(Resveratrol))处理后的干细胞增殖率(Proliferation)增加图。
图38a和38b是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(白藜芦醇(Resveratrol))处理后的干细胞干性(Stemness)增加图。
图39是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(白藜芦醇(Resveratrol))处理后的外泌体大小分布图。
图40是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(白藜芦醇(Resveratrol))处理后的外泌体数量增加图。
图41是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(白藜芦醇(Resveratrol))处理后的外泌体来源蛋白量增加图。
图42是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(白藜芦醇(Resveratrol))处理后的外泌体来源RNA量增加图。
图43是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(Lanifibranor)处理后的干细胞增殖率(Proliferation)增加图。
图44a和44b是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(Lanifibranor)处理后的干细胞干性(Stemness)增加图。
图45是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(Lanifibranor)处理后的外泌体大小分布图。
图46是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(Lanifibranor)处理后的外泌体数量增加图。
图47是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(Lanifibranor)处理后的外泌体来源蛋白量增加图。
图48是依据本发明的一个实施例确认到的,经干细胞预处理物质(Lanifibranor)处理后的外泌体来源RNA量增加图。
最新实施方式
一种用于促进干细胞来源外泌体产生的组合物,其包含选自Exendin-4、豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)、干扰素-γ(Interferon-γ)、粉防己碱(Tetrandrine)、透明质酸(Hyaluronic acid)、物质-P(Substance P)、白藜芦醇(Resveratrol)和Lanifibranor组成的组中的一种。
具体实施方式
以下,结合下述实施例对本发明进行更详细的说明。但,这些实施例仅用于本发明的举例说明,本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例1.经Exendin-4处理后,干细胞来源外泌体得以分离
Exendin-4预处理
在包含20nM Exendin-4的培养基【high glucose DMEM(Gibco,Cat no.11995-065);10%Fetal bovine Serum(HyClone),1%MEM Non-Essential Amino AcidsSolution(100X)(Gibco,Cat no.11140-050)】中,对脐带组织来源间充质干细胞(PrimaryUmbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells,ATCC No.PCS-500-010;LotNo.63822428)培养了一周。
进一步培养
培养完毕后,清洗经Exendin-4预处理的间充质干细胞,在添加有10%的去除外泌体的胎牛血清(FBS)的培养基中,进一步培养了72小时。而使用去除外泌体的FBS的原因在于,常用的FBS中含大量的牛血清来源外泌体。因此,这样做旨在防止混入除细胞分泌的外泌体之外的FBS来源外泌体。
外泌体分离
培养72小时后,收集经预处理物质处理的间充质干细胞培养基,以300xg的条件离心10分钟,去除了剩余的细胞和细胞残留物。取上清液,用0.22μm过滤器过滤后,使用高速离心机(high speed centrifuge),以1,000xg,4℃的条件离心70分钟。再取离心后的上清液,使用高速离心机(high speed centrifuge),以100,000xg,4℃的条件离心90分钟,去除上清液。并在磷酸盐缓冲液(PBS,phosphate bufferd salin))中稀释下层残留的外泌体,用于以下实验中。
实施例2.经PMA处理后,干细胞来源外泌体得以分离
PMA预处理
在包含10nM PMA的培养基【high glucose DMEM(Gibco,Cat no.11995-065);10%Fetal bovine Serum(HyClone),1%MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100X)(Gibco,Cat no.11140-050)】中,对脐带组织来源间充质干细胞(Primary UmbilicalCord-Derived Mesenchymal Stem Cells,ATCC No.PCS-500-010;Lot No.63822428)培养了一周。
进一步培养
培养完毕后,清洗经PMA预处理的间充质干细胞,在添加有10%的去除外泌体的胎牛血清(FBS)的培养基中,进一步培养了72小时。使用去除外泌体的FBS的原因在于,常用的FBS中含大量的牛血清来源外泌体。因此,这样做旨在防止混入除细胞分泌的外泌体之外的FBS来源外泌体。
外泌体分离
培养72小时后,收集经预处理物质处理的间充质干细胞培养基,以300xg的条件离心10分钟,去除了剩余的细胞和细胞残留物。取上清液,用0.22μm过滤器过滤后,使用高速离心机(high speed centrifuge),以1,000xg,4℃的条件离心70分钟。再取离心后的上清液,使用高速离心机(high speed centrifuge),以100,000xg,4℃的条件离心90分钟,去除上清液。并在磷酸盐缓冲液(PBS,phosphate bufferd salin))中稀释下层残留的外泌体,用于以下实验中。
实施例3.经Interferon-γ处理后,干细胞来源外泌体得以分离
Interferon-γ预处理
在包含10ng/mL Interferon-γ的培养基【high glucose DMEM(Gibco,Catno.11995-065);10%Fetal bovine Serum(HyClone),1%MEM Non-Essential AminoAcids Solution(100X)(Gibco,Cat no.11140-050)】中,对对脐带组织来源间充质干细胞(Primary Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells,ATCC No.PCS-500-010;Lot No.63822428)培养了一周。
进一步培养
培养完毕后,清洗经Interferon-γ预处理的间充质干细胞,在添加有10%的去除外泌体的胎牛血清(FBS)的培养基中,进一步培养了72小时。使用去除外泌体的FBS的原因在于,常用的FBS中含大量的牛血清来源外泌体。因此,这样做旨在防止混入除细胞分泌的外泌体之外的FBS来源外泌体。
外泌体分离
培养72小时后,收集经预处理物质处理的间充质干细胞培养基,以300xg的条件离心10分钟,去除了剩余的细胞和细胞残留物。取上清液,用0.22μm过滤器过滤后,使用高速离心机(high speed centrifuge),以1,000xg,4℃的条件离心70分钟。再取离心后的上清液,使用高速离心机(high speed centrifuge),以100,000xg,4℃的条件离心90分钟,去除上清液。并在磷酸盐缓冲液(PBS,phosphate bufferd salin))中稀释下层残留的外泌体,用于以下实验中。
实施例4.经Tetrandrine处理后,干细胞来源外泌体得以分离
Tetrandrine预处理
在包含10μM Tetrandrine的培养基【high glucose DMEM(Gibco,Cat no.11995-065);10%Fetal bovine Serum(HyClone),1%MEM Non-Essential Amino AcidsSolution(100X)(Gibco,Cat no.11140-050)】中,对对脐带组织来源间充质干细胞(Primary Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells,ATCC No.PCS-500-010;Lot No.63822428)培养了一周。
进一步培养
培养完毕后,清洗经Tetrandrine预处理的间充质干细胞,在添加有10%的去除外泌体的胎牛血清(FBS)的培养基中,进一步培养了72小时。使用去除外泌体的FBS的原因在于,常用的FBS中含大量的牛血清来源外泌体。因此,这样做旨在防止混入除细胞分泌的外泌体之外的FBS来源外泌体。
外泌体分离
培养72小时后,收集经预处理物质处理的间充质干细胞培养基,以300xg的条件离心10分钟,去除了剩余的细胞和细胞残留物。取上清液,用0.22μm过滤器过滤后,使用高速离心机(high speed centrifuge),以1,000xg,4℃的条件离心70分钟。再取离心后的上清液,使用高速离心机(high speed centrifuge),以100,000xg,4℃的条件离心90分钟,去除上清液。并在磷酸盐缓冲液(PBS,phosphate bufferd salin))中稀释下层残留的外泌体,用于以下实验中。
实施例5.Hyaluronic acid处理后,干细胞来源外泌体得以分离
Hyaluronic acid预处理
在包含10ug/mL Hyaluronic acid的培养基【high glucose DMEM(Gibco,Catno.11995-065);10%Fetal bovine Serum(HyClone),1%MEM Non-Essential AminoAcids Solution(100X)(Gibco,Cat no.11140-050)】中,对脐带组织来源间充质干细胞(Primary Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells,ATCC No.PCS-500-010;Lot No.63822428)培养了一周。
进一步培养
培养完毕后,清洗经Hyaluronic acid预处理的间充质干细胞,在添加有10%的去除外泌体的胎牛血清(FBS)的培养基中,进一步培养了72小时。使用去除外泌体的FBS的原因在于,常用的FBS中含大量的牛血清来源外泌体。因此,这样做旨在防止混入除细胞分泌的外泌体之外的FBS来源外泌体。
外泌体分离
培养72小时后,收集经预处理物质处理的间充质干细胞培养基,以300xg的条件离心10分钟,去除了剩余的细胞和细胞残留物。取上清液,用0.22μm过滤器过滤后,使用高速离心机(high speed centrifuge),以1,000xg,4℃的条件离心70分钟。再取离心后的上清液,使用高速离心机(high speed centrifuge),以100,000xg,4℃的条件离心90分钟,去除上清液。并在磷酸盐缓冲液(PBS,phosphate bufferd salin))中稀释下层残留的外泌体,用于以下实验中。
实施例6.经Substance P处理后,干细胞来源外泌体得以分离
Substance P预处理
在包含30nM Substance P的培养基【high glucose DMEM(Gibco,Cat no.11995-065);10%Fetal bovine Serum(HyClone),1%MEM Non-Essential Amino AcidsSolution(100X)(Gibco,Cat no.11140-050)】中,对脐带组织来源间充质干细胞(PrimaryUmbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells,ATCC No.PCS-500-010;LotNo.63822428)培养了一周。
进一步培养
培养完毕后,清洗Substance P预处理的间充质干细胞,在添加有10%的去除外泌体的胎牛血清(FBS)的培养基中,进一步培养了72小时。使用去除外泌体的FBS的原因在于,常用的FBS中含大量的牛血清来源外泌体。因此,这样做旨在防止混入除细胞分泌的外泌体之外的FBS来源外泌体。
外泌体分离
培养72小时后,收集经预处理物质处理的间充质干细胞培养基,以300xg的条件离心10分钟,去除了剩余的细胞和细胞残留物。取上清液,用0.22μm过滤器过滤后,使用高速离心机(high speed centrifuge),以1,000xg,4℃的条件离心70分钟。再取离心后的上清液,使用高速离心机(high speed centrifuge),以100,000xg,4℃的条件离心90分钟,去除上清液。并在磷酸盐缓冲液(PBS,phosphate bufferd salin))中稀释下层残留的外泌体,用于以下实验中。
实施例7.经Resveratrol处理后,干细胞来源外泌体得以分离
Resveratrol预处理
在包含10nM Resveratrol的培养基【high glucose DMEM(Gibco,Cat no.11995-065);10%Fetal bovine Serum(HyClone),1%MEM Non-Essential Amino AcidsSolution(100X)(Gibco,Cat no.11140-050)】中,对脐带组织来源间充质干细胞(PrimaryUmbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells,ATCC No.PCS-500-010;LotNo.63822428)培养了一周。
进一步培养
培养完毕后,清洗经Resveratrol预处理的间充质干细胞,在添加有10%的去除外泌体的胎牛血清(FBS)的培养基中,进一步培养了72小时。使用去除外泌体的FBS的原因在于,常用的FBS中含大量的牛血清来源外泌体。因此,这样做旨在防止混入除细胞分泌的外泌体之外的FBS来源外泌体。
外泌体分离
培养72小时后,收集经预处理物质处理的间充质干细胞培养基,以300xg的条件离心10分钟,去除了剩余的细胞和细胞残留物。取上清液,用0.22μm过滤器过滤后,使用高速离心机(high speed centrifuge),以1,000xg,4℃的条件离心70分钟。再取离心后的上清液,使用高速离心机(high speed centrifuge),以100,000xg,4℃的条件离心90分钟,去除上清液。并在磷酸盐缓冲液(PBS,phosphate bufferd salin))中稀释下层残留的外泌体,用于以下实验中。
实施例8.经Lanifibranor处理后,干细胞来源外泌体得以分离
Lanifibranor预处理
在包含10μM LANIFIBRANOR的培养基【high glucose DMEM(Gibco,Cat no.11995-065);10%Fetal bovine Serum(HyClone),1%MEM Non-Essential Amino AcidsSolution(100X)(Gibco,Cat no.11140-050)】中,对脐带组织来源间充质干细胞(PrimaryUmbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells,ATCC No.PCS-500-010;LotNo.63822428)培养了一周。
进一步培养
培养完毕后,清洗经LANIFIBRANOR预处理的间充质干细胞,在添加有10%的去除外泌体的胎牛血清(FBS)的培养基中,进一步培养了72小时。使用去除外泌体的FBS的原因在于,常用的FBS中含大量的牛血清来源外泌体。因此,这样做旨在防止混入除细胞分泌的外泌体之外的FBS来源外泌体。
外泌体分离
培养72小时后,收集经预处理物质处理的间充质干细胞培养基,以300xg的条件离心10分钟,去除了剩余的细胞和细胞残留物。取上清液,用0.22μm过滤器过滤后,使用高速离心机(high speed centrifuge),以1,000xg,4℃的条件离心70分钟。再取离心后的上清液,使用高速离心机(high speed centrifuge),以100,000xg,4℃的条件离心90分钟,去除上清液。并在磷酸盐缓冲液(PBS,phosphate bufferd salin))中稀释下层残留的外泌体,用于以下实验中。
实验例1.经Exendin-4处理后,干细胞功能得以增强
1-1.经Exendin-4处理后,干细胞增殖率(Proliferation)增加
在含有100uL培养基[high glucose DMEM(Gibco,Cat no.11995-065),10%Fetalbovine Serum(HyClone),1%MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100X)(Gibco,Cat no.11140-050)]的96孔板中,分别接种(Seeding)间充质干细胞和经上述实施例的Exendin-4预处理的间充质干细胞,每孔接种3000个细胞后,在CO2培养箱中培养了24小时。而后,添加CCK溶液(10uL/孔)并在CO2培养箱(incubator)中培养了4小时,然后,通过测量450nm(420~480nm)波长处的吸光度,确认了增殖率。
如图1所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Exendin-4】处理的间充质干细胞的细胞增殖率约增340%从1增加到3.4。
1-2.经Exendin-4处理后,干细胞干性(Stemness)增加
在含有10mL培养基[high glucose DMEM(Gibco,Cat no.11995-065),10%Fetalbovine Serum(HyClone),1%MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100X)(Gibco,Cat no.11140-050)]的100mm细胞培养皿(dish)中,分别接种(Seeding)间充质干细胞和经上述实施例的Exendin-4预处理的间充质干细胞,每个培养皿接种1000个细胞,培养了21天。用PBS清洗两次附着有培养细胞的培养皿后,在常温下用95%甲醇固定约两分钟。用PBS清洗三次固定的细胞后,添加0.5%紫结晶溶液【crystal violet(sigma,C-3886,USA)5g,甲醇100ml】后,染色5分钟,水洗后,在室温下干燥。计算每个培养皿中由50个以上的细胞组成的集落数,并对其进行了比较。
如图2a和2b所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞(28.6个),经干细胞预处理物质【Exendin-4】预处理的间充质干细胞的细胞(185个)的CFU-F集落数约增647%。
实验例2.经Exendin-4处理后,外泌体生产效率得以提高
2-1.经Exendin-4处理后,外泌体数量增加
通过纳米粒子追踪分析(NanoSight NS300,Malvern),确认了上述实施例中分离出的外泌体数量。这时,为作比较,除未经任何物质处理的之外,对使用与实施例相同的方法分离出的外泌体数量进行了确认。其结果如下表1,及图3和图4所示。
【表1】
Yield(per 10<sup>6</sup>Cells) | MSC-Exo | Exe4-MSC-Exo |
No.of exosome particles(10<sup>9</sup>) | 2.30 | 13.45 |
(MSC:未处理的间充质干细胞,Exe4-MSC:Exendin-4处理的间充质干细胞)
如上表1和图4所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Exendin-4】处理的间充质干细胞生产的外泌体数量约高出5.85倍。
由上述结果可知,在间充质干细胞中,处理依据本发明的上述干细胞预处理物质时,间充质干细胞生产的外泌体数量会增加。
2-2.经Exendin-4处理后,外泌体来源蛋白量增加
利用外泌体蛋白分离试剂盒(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen),从上述实施例分离出的外泌体中分离出蛋白,并通过考马斯亮蓝法(bradford analysis)测量了592nm处的吸光度,并进行了蛋白定量。这时,为作比较,除未经任何物质处理的之外,从使用与实施例相同的方法分离出的外泌体中分离出蛋白,并进行了蛋白定量。其结果如下表2和图5所示。
【表2】
Yield(per 10<sup>6</sup>Cells) | MSC-Exo | Exe4-MSC-Exo |
Exosomal protein(ug) | 2.00 | 10.69 |
(MSC:未处理的间充质干细胞,Exe4-MSC:Exendin-4处理的间充质干细胞)
如上表2和图5所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Exendin-4】处理的间充质干细胞生产的外泌体来源蛋白量约高出5.4倍。
由上述结果可知,在间充质干细胞中,处理依据本发明的上述干细胞预处理物质时,不仅外泌体的数量会增加,外泌体来源蛋白(exosomal protein)的含量也会增加。
2-3.经Exendin-4处理后,外泌体来源RNA量增加
利用RNA分离用试剂盒(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen),从上述实施例分离出的外泌体中的总外泌体RNA,并利用超微量分光光度计(nanodrop)测量了RNA的浓度。这时,为作比较,除未经任何物质处理的之外,从使用与实施例相同的方法分离出的外泌体中分离出总外泌体RNA,并进行了浓度测量。其结果如下表3和图6所示。
【表3】
Yield(per 10<sup>6</sup>Cells) | MSC-Exo | Exe4-MSC-Exo |
Exosomal RNA(ng) | 31.00 | 174.34 |
(MSC:未处理的间充质干细胞,Exe4-MSC:Exendin-4处理的间充质干细胞)
如上表3和图6所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Exendin-4】处理的间充质干细胞生产的外泌体来源RNA量约高出5.6倍。
由上述结果可知,在间充质干细胞中,处理依据本发明的上述干细胞预处理物质时,不仅外泌体的数量会增加,外泌体来源RNA(exosomal RNA)的含量也会增加。
实验例3.经PMA处理后,干细胞功能得以增强
3-1.经PMA处理后,干细胞增殖率(Proliferation)增加
在含有100uL培养基[high glucose DMEM(Gibco,Cat no.11995-065),10%Fetalbovine Serum(HyClone),1%MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100X)(Gibco,Cat no.11140-050)]的96孔板中,分别接种(Seeding)间充质干细胞和经上述实施例的PMA预处理的间充质干细胞,每孔接种3000个细胞后,在CO2培养箱中培养了24小时。而后,添加CCK溶液(10uL/孔)并在CO2培养箱(incubator)中培养了4小时,然后,通过测量450nm(420~480nm)波长处的吸光度,确认了增殖率。
如图7所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【PMA】处理的间充质干细胞的细胞增殖率约增220%,从1增加到2.2。
3-2.经PMA处理后,干细胞干性(Stemness)增加
在含有10mL培养基[high glucose DMEM(Gibco,Cat no.11995-065),10%Fetalbovine Serum(HyClone),1%MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100X)(Gibco,Cat no.11140-050)]的100mm细胞培养皿(dish)中,分别接种(Seeding)间充质干细胞和经上述实施例的PMA预处理的间充质干细胞,每个培养皿接种1000个细胞,培养了21天。用PBS清洗两次附着有培养细胞的培养皿后,在常温下用95%甲醇固定约两分钟。用PBS清洗三次固定的细胞后,添加0.5%紫结晶溶液【crystal violet(sigma,C-3886,USA)5g,甲醇100ml】后,染色5分钟,水洗后,在室温下干燥。计算每个培养皿中由50个以上的细胞组成的集落数,并对其进行了比较。
如图8a和8b所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞(28.6个),经干细胞预处理物质【PMA】预处理的间充质干细胞的细胞(285.7个)的CFU-F集落数约增996.5%。
实验例4.经PMA处理后,外泌体生产效率得以提高
4-1.经PMA处理后,外泌体数量增加
通过纳米粒子追踪分析(NanoSight NS300,Malvern),确认了上述实施例中分离出的外泌体数量。这时,为作比较,除未经任何物质处理的之外,对使用与实施例相同的方法分离出的外泌体数量进行了确认。其结果如下表4,及图9和图10所示。
【表4】
Yield(per 10<sup>6</sup>Cells) | MSC-Exo | PMA MSC-Exo |
No.of exosome particles(10<sup>9</sup>) | 2.3 | 11.90 |
(MSC:未处理的间充质干细胞,PMA MSC:PMA处理的间充质干细胞)
如上表4和图10所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【PMA】处理的间充质干细胞生产的外泌体数量约高出5.2倍。
由上述结果可知,在间充质干细胞中,处理依据本发明的上述干细胞预处理物质时,间充质干细胞生产的外泌体数量会增加。
4-2.经PMA处理后,外泌体来源蛋白量增加
利用外泌体蛋白分离试剂盒(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen),从上述实施例分离出的外泌体中分离出蛋白,并通过考马斯亮蓝法(bradford analysis)测量了592nm处的吸光度,并进行了蛋白定量。这时,为作比较,除未经任何物质处理的之外,从使用与实施例相同的方法分离出的外泌体中分离出蛋白,并进行了蛋白定量。其结果如下表5和图11所示。
【表5】
Yield(per 10<sup>6</sup>Cells) | MSC-Exo | PMA MSC-Exo |
Exosomal protein(ug) | 2.0 | 10.0 |
(MSC:未处理的间充质干细胞,PMA MSC:PMA处理的间充质干细胞)
如上表5和图11所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【PMA】处理的间充质干细胞生产的外泌体来源蛋白量约高出5倍。
由上述结果可知,在间充质干细胞中,处理依据本发明的上述干细胞预处理物质时,不仅外泌体的数量会增加,外泌体来源蛋白(exosomal protein)的含量也会增加。
4-3.经PMA处理后,外泌体来源RNA量增加
利用RNA分离用试剂盒(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen),从上述实施例分离出的外泌体中的总外泌体RNA,并利用超微量分光光度计(nanodrop)测量了RNA的浓度。这时,为作比较,除未经任何物质处理的之外,从使用与实施例相同的方法分离出的外泌体中分离出总外泌体RNA,并进行了浓度测量。其结果如下表6和图12所示。
【表6】
Yield(per 10<sup>6</sup>Cells) | MSC-Exo | PMA MSC-Exo |
Exosomal RNA(ng) | 31.0 | 125.0 |
(MSC:未处理的间充质干细胞,PMA MSC:PMA处理的间充质干细胞)
如上表6和图12所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【PMA】处理的间充质干细胞生产的外泌体来源RNA量约高出4倍。
由上述结果可知,在间充质干细胞中,处理依据本发明的上述干细胞预处理物质时,不仅外泌体的数量会增加,外泌体来源RNA(exosomal RNA)的含量也会增加。
实验例5.经Interferon-γ处理后,干细胞功能得以增强
5-1.经Interferon-γ处理后,干细胞增殖率(Proliferation)增加
在含有100uL培养基[high glucose DMEM(Gibco,Cat no.11995-065),10%Fetalbovine Serum(HyClone),1%MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100X)(Gibco,Cat no.11140-050)]的96孔板中,分别接种(Seeding)间充质干细胞和经上述实施例的Interferon-γ预处理的间充质干细胞,每孔接种3000个细胞后,在CO2培养箱中培养了24小时。而后,添加CCK溶液(10uL/孔)并在CO2培养箱(incubator)中培养了4小时,然后,通过测量450nm(420~480nm)波长处的吸光度,确认了增殖率。
如图13所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Interferon-γ】处理的间充质干细胞的细胞增殖率约增242%,从1增加到2.42。
5-2.经Interferon-γ处理后,干细胞干性(Stemness)增加
在含有10mL培养基[high glucose DMEM(Gibco,Cat no.11995-065),10%Fetalbovine Serum(HyClone),1%MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100X)(Gibco,Cat no.11140-050)]的100mm细胞培养皿(dish)中,分别接种(Seeding)间充质干细胞和经上述实施例的Interferon-γ预处理的间充质干细胞,每个培养皿接种1000个细胞,培养了21天。用PBS清洗两次附着有培养细胞的培养皿后,在常温下用95%甲醇固定约两分钟。用PBS清洗三次固定的细胞后,添加0.5%紫结晶溶液【crystal violet(sigma,C-3886,USA)5g,甲醇100ml】后,染色5分钟,水洗后,在室温下干燥。计算每个培养皿中由50个以上的细胞组成的集落数,并对其进行了比较。
如图14a和14b所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞(28.6个),经干细胞预处理物质【Interferon-γ】预处理的间充质干细胞的细胞(136个)的CFU-F集落数约增476%。
实验例6.经Interferon-γ处理后,外泌体生产效率得以提高
6-1.经Interferon-γ处理后,外泌体数量增加
通过纳米粒子追踪分析(NanoSight NS300,Malvern),确认了上述实施例中分离出的外泌体数量。这时,为作比较,除未经任何物质处理的之外,对使用与实施例相同的方法分离出的外泌体数量进行了确认。其结果如下表7,及图15和图16所示。
【表7】
Yield(per 10<sup>6</sup>Cells) | MSC-Exo | IFNγMSC-Exo |
No.of exosome particles(10<sup>9</sup>) | 2.3 | 15.4 |
(MSC:未处理的间充质干细胞,IFNγMSC:Interferon-γ处理的间充质干细胞)
如上表7和图16所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Interferon-γ】处理的间充质干细胞生产的外泌体数量约高出6.7倍。
由上述结果可知,在间充质干细胞中,处理依据本发明的上述干细胞预处理物质时,间充质干细胞生产的外泌体数量会增加。
6-2.经Interferon-γ处理后,外泌体来源蛋白量增加
利用外泌体蛋白分离试剂盒(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen),从上述实施例分离出的外泌体中分离出蛋白,并通过考马斯亮蓝法(bradford analysis)测量了592nm处的吸光度,并进行了蛋白定量。这时,为作比较,除未经任何物质处理的之外,从使用与实施例相同的方法分离出的外泌体中分离出蛋白,并进行了蛋白定量。其结果如下表8和图17所示。
【表8】
Yield(per 10<sup>6</sup>Cells) | MSC-Exo | IFNγMSC-Exo |
Exosomal protein(ug) | 2.0 | 12.4 |
(MSC:未处理的间充质干细胞,IFNγMSC:Interferon-γ处理的间充质干细胞)
如上表8和图17所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Interferon-γ】处理的间充质干细胞生产的外泌体来源蛋白量约高出6.2倍。
由上述结果可知,在间充质干细胞中,处理依据本发明的上述干细胞预处理物质时,不仅外泌体的数量会增加,外泌体来源蛋白(exosomal protein)的含量也会增加。
6-3.经Interferon-γ处理后,外泌体来源RNA量增加
利用RNA分离用试剂盒(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen),从上述实施例分离出的外泌体中的总外泌体RNA,并利用超微量分光光度计(nanodrop)测量了RNA的浓度。这时,为作比较,除未经任何物质处理的之外,从使用与实施例相同的方法分离出的外泌体中分离出总外泌体RNA,并进行了浓度测量。其结果如下表9和图18所示。
【表9】
Yield(per 10<sup>6</sup>Cells) | MSC-Exo | IFNγMSC-Exo |
Exosomal RNA(ng) | 31.0 | 155.0 |
(MSC:未处理的间充质干细胞,IFNγMSC:Interferon-γ处理的间充质干细胞)
如上表9和图18所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Interferon-γ】处理的间充质干细胞生产的外泌体来源RNA量约高出5.0倍。
由上述结果可知,在间充质干细胞中,处理依据本发明的上述干细胞预处理物质时,不仅外泌体的数量会增加,外泌体来源RNA(exosomal RNA)的含量也会增加。
实验例7.经Tetrandrine处理后,干细胞功能得以增强
7-1.经Tetrandrine处理后,干细胞增殖率(Proliferation)增加
在含有100uL培养基[high glucose DMEM(Gibco,Cat no.11995-065),10%Fetalbovine Serum(HyClone),1%MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100X)(Gibco,Cat no.11140-050)]的96孔板中,分别接种(Seeding)间充质干细胞和经上述实施例的Tetrandrine预处理的间充质干细胞,每孔接种3000个细胞后,在CO2培养箱中培养了24小时。而后,添加CCK溶液(10uL/孔)并在CO2培养箱(incubator)中培养了4小时,然后,通过测量450nm(420~480nm)波长处的吸光度,确认了增殖率。
如图19所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Tetrandrine】处理的间充质干细胞的细胞增殖率约增260%,从1增加到2.6。
7-2.经Tetrandrine处理后,干细胞干性(Stemness)增加
在含有10mL培养基[high glucose DMEM(Gibco,Cat no.11995-065),10%Fetalbovine Serum(HyClone),1%MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100X)(Gibco,Cat no.11140-050)]的100mm细胞培养皿(dish)中,分别接种(Seeding)间充质干细胞和经上述实施例的Tetrandrine预处理的间充质干细胞,每个培养皿接种1000个细胞,培养了21天。用PBS清洗两次附着有培养细胞的培养皿后,在常温下用95%甲醇固定约两分钟。用PBS清洗三次固定的细胞后,添加0.5%紫结晶溶液【crystal violet(sigma,C-3886,USA)5g,甲醇100ml】后,染色5分钟,水洗后,在室温下干燥。计算每个培养皿中由50个以上的细胞组成的集落数,并对其进行了比较。
如图20a和20b所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞(28.7个),经干细胞预处理物质【Tetrandrine】预处理的间充质干细胞的细胞(121.3个)的CFU-F集落数约增423%。
实验例8.经Tetrandrine处理后,外泌体生产效率得以提高
8-1.经Tetrandrine处理后,外泌体数量增加
通过纳米粒子追踪分析(NanoSight NS300,Malvern),确认了上述实施例中分离出的外泌体数量。这时,为作比较,除未经任何物质处理的之外,对使用与实施例相同的方法分离出的外泌体数量进行了确认。其结果如下表10,及图21和图22所示。
【表10】
Yield(per 10<sup>6</sup>Cells) | MSC-Exo | Tet MSC-Exo |
No.of exosome particles(10<sup>9</sup>) | 2.3 | 9.84 |
(MSC:未处理的间充质干细胞,Tet MSC:Tetrandrine处理的间充质干细胞)
如上表10和图22所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Tetrandrine】处理的间充质干细胞生产的外泌体数量约高出4.3倍。
由上述结果可知,在间充质干细胞中,处理依据本发明的上述干细胞预处理物质时,间充质干细胞生产的外泌体数量会增加。
8-2.经Tetrandrine处理后,外泌体来源蛋白量增加
利用外泌体蛋白分离试剂盒(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen),从上述实施例分离出的外泌体中分离出蛋白,并通过考马斯亮蓝法(bradford analysis)测量了592nm处的吸光度,并进行了蛋白定量。这时,为作比较,除未经任何物质处理的之外,从使用与实施例相同的方法分离出的外泌体中分离出蛋白,并进行了蛋白定量。其结果如下表11和图23所示。
【表11】
Yield(per 10<sup>6</sup>Cells) | MSC-Exo | Tet MSC-Exo |
Exosomal protein(ug) | 2.0 | 9.42 |
(MSC:未处理的间充质干细胞,Tet MSC:Tetrandrine处理的间充质干细胞)
如上表11和图23所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Tetrandrine】处理的间充质干细胞生产的外泌体来源蛋白量约高出4.5倍。
由上述结果可知,在间充质干细胞中,处理依据本发明的上述干细胞预处理物质时,不仅外泌体的数量会增加,外泌体来源蛋白(exosomal protein)的含量也会增加。
8-3.经Tetrandrine处理后,外泌体来源RNA量增加
利用RNA分离用试剂盒(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen),从上述实施例分离出的外泌体中的总外泌体RNA,并利用超微量分光光度计(nanodrop)测量了RNA的浓度。这时,为作比较,除未经任何物质处理的之外,从使用与实施例相同的方法分离出的外泌体中分离出总外泌体RNA,并进行了浓度测量。其结果如下表12和图24所示。
【表12】
Yield(per 10<sup>6</sup>Cells) | MSC-Exo | Tet MSC-Exo |
Exosomal RNA(ng) | 31.0 | 136.0 |
(MSC:未处理的间充质干细胞,Tet MSC:Tetrandrine处理的间充质干细胞)
如上表12和24所示,可确认到,相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Tetrandrine】处理的间充质干细胞生产的外泌体来源RNA量约高出4.4倍。
由上述结果可知,在间充质干细胞中,处理依据本发明的上述干细胞预处理物质时,不仅外泌体的数量会增加,外泌体来源RNA(exosomal RNA)的含量也会增加。
实验例9.经Hyaluronic acid处理后,干细胞功能得以增强
9-1.经Hyaluronic acid处理后,干细胞增殖率(Proliferation)增加
在含有100uL培养基[high glucose DMEM(Gibco,Cat no.11995-065),10%Fetalbovine Serum(HyClone),1%MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100X)(Gibco,Cat no.11140-050)]的96孔板中,分别接种(Seeding)间充质干细胞和经上述实施例的Hyaluronic acid预处理的间充质干细胞,每孔接种3000个细胞后,在CO2培养箱中培养了24小时。而后,添加CCK溶液(10uL/孔)并在CO2培养箱(incubator)中培养了4小时,然后,通过测量450nm(420~480nm)波长处的吸光度,确认了增殖率。
如图25所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Hyaluronic acid】处理的间充质干细胞的细胞增殖率约增364%,从1增加到3.64。
9-2.经Hyaluronic acid处理后,干细胞干性(Stemness)增加
在含有10mL培养基[high glucose DMEM(Gibco,Cat no.11995-065),10%Fetalbovine Serum(HyClone),1%MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100X)(Gibco,Cat no.11140-050)]的100mm细胞培养皿(dish)中,分别接种(Seeding)间充质干细胞和经上述实施例的Hyaluronic acid预处理的间充质干细胞,每个培养皿接种1000个细胞,培养了21天。用PBS清洗两次附着有培养细胞的培养皿后,在常温下用95%甲醇固定约两分钟。用PBS清洗三次固定的细胞后,添加0.5%紫结晶溶液【crystal violet(sigma,C-3886,USA)5g,甲醇100ml】后,染色5分钟,水洗后,在室温下干燥。计算每个培养皿中由50个以上的细胞组成的集落数,并对其进行了比较。
如图26a和26b所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞(28.6个),经干细胞预处理物质【Hyaluronic acid】预处理的间充质干细胞的细胞(167.6个)的CFU-F集落数约增586%。
实验例10.经Hyaluronic acid处理后,外泌体生产效率得以提高
10-1.经Hyaluronic acid处理后,外泌体数量增加
通过纳米粒子追踪分析(NanoSight NS300,Malvern),确认了上述实施例中分离出的外泌体数量。这时,为作比较,除未经任何物质处理的之外,对使用与实施例相同的方法分离出的外泌体数量进行了确认。其结果如下表13,及图27和图28所示。
【表13】
Yield(per 10<sup>6</sup>Cells) | MSC-Exo | HA MSC-Exo |
No.of exosome particles(10<sup>9</sup>) | 2.3 | 11.93 |
(MSC:未处理的间充质干细胞,HA MSC:Hyaluronic acid处理的间充质干细胞)
如上表13和图28所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Hyaluronic acid】处理的间充质干细胞生产的外泌体数量约高出5.2倍。
由上述结果可知,在间充质干细胞中,处理依据本发明的上述干细胞预处理物质时,间充质干细胞生产的外泌体数量会增加。
10-2.经Hyaluronic acid处理后,外泌体来源蛋白量增加
利用外泌体蛋白分离试剂盒(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen),从上述实施例分离出的外泌体中分离出蛋白,并通过考马斯亮蓝法(bradford analysis)测量了592nm处的吸光度,并进行了蛋白定量。这时,为作比较,除未经任何物质处理的之外,从使用与实施例相同的方法分离出的外泌体中分离出蛋白,并进行了蛋白定量。其结果如下表14和图29所示。
【表14】
Yield(per 10<sup>6</sup>Cells) | MSC-Exo | HA MSC-Exo |
Exosomal protein(ug) | 2.0 | 11.93 |
(MSC:未处理的间充质干细胞,HA MSC:Hyaluronic acid处理的间充质干细胞)
如上表14和图29所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Hyaluronic aci】处理的间充质干细胞生产的外泌体来源蛋白量约高出5.35倍。
由上述结果可知,在间充质干细胞中,处理依据本发明的上述干细胞预处理物质时,不仅外泌体的数量会增加,外泌体来源蛋白(exosomal protein)的含量也会增加。
10-3.经Hyaluronic acid处理后,外泌体来源RNA量增加
利用RNA分离用试剂盒(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen),从上述实施例分离出的外泌体中的总外泌体RNA,并利用超微量分光光度计(nanodrop)测量了RNA的浓度。这时,为作比较,除未经任何物质处理的之外,从使用与实施例相同的方法分离出的外泌体中分离出总外泌体RNA,并进行了浓度测量。其结果如下表15和图30所示。
【表15】
Yield(per 10<sup>6</sup>Cells) | MSC-Exo | HA MSC-Exo |
Exosomal RNA(ng) | 31.0 | 165.0 |
(MSC:未处理的间充质干细胞,HA MSC:Hyaluronic acid处理的间充质干细胞)
如上表15和图30所示,可确认到,相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Hyaluronic acid】处理的间充质干细胞生产的外泌体来源RNA量约高出5.3倍。
由上述结果可知,在间充质干细胞中,处理依据本发明的上述干细胞预处理物质时,不仅外泌体的数量会增加,外泌体来源RNA(exosomal RNA)的含量也会增加。
实验例11.经Substance P处理后,干细胞功能得以增强
11-1.经Substance P处理后,干细胞增殖率(Proliferation)增加
在含有100uL培养基[high glucose DMEM(Gibco,Cat no.11995-065),10%Fetalbovine Serum(HyClone),1%MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100X)(Gibco,Cat no.11140-050)]的96孔板中,分别接种(Seeding)间充质干细胞和经上述实施例的Substance P预处理的间充质干细胞,每孔接种3000个细胞后,在CO2培养箱中培养了24小时。而后,添加CCK溶液(10uL/孔)并在CO2培养箱(incubator)中培养了4小时,然后,通过测量450nm(420~480nm)波长处的吸光度,确认了增殖率。
如图31中所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Substance P】处理的间充质干细胞的细胞增殖率约增290%,从1增加到2.9。
11-2.经Substance P处理后,干细胞干性(Stemness)增加
在含有10mL培养基[high glucose DMEM(Gibco,Cat no.11995-065),10%Fetalbovine Serum(HyClone),1%MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100X)(Gibco,Cat no.11140-050)]的100mm细胞培养皿(dish)中,分别接种(Seeding)间充质干细胞和经上述实施例的Substance P预处理的间充质干细胞,每个培养皿接种1000个细胞,培养了21天。用PBS清洗两次附着有培养细胞的培养皿后,在常温下用95%甲醇固定约两分钟。用PBS清洗三次固定的细胞后,添加0.5%紫结晶溶液【crystal violet(sigma,C-3886,USA)5g,甲醇100ml】后,染色5分钟,水洗后,在室温下干燥。计算每个培养皿中由50个以上的细胞组成的集落数,并对其进行了比较。
如图32a和32b所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞(28.7个),经干细胞预处理物质【Substance P】预处理的间充质干细胞的细胞(116个)的CFU-F集落数约增404%。
实验例12.经Substance P处理后,外泌体生产效率得以提高
12-1.经Substance P处理后,外泌体数量增加
通过纳米粒子追踪分析(NanoSight NS300,Malvern),确认了上述实施例中分离出的外泌体数量。这时,为作比较,除未经任何物质处理的之外,对使用与实施例相同的方法分离出的外泌体数量进行了确认。其结果如下表16,及图33和图34所示。
【表16】
Yield(per 10<sup>6</sup>Cells) | MSC-Exo | SubsP MSC-Exo |
No.of exosome particles(10<sup>9</sup>) | 2.3 | 9.93 |
(MSC:未处理的间充质干细胞,SubsP MSC:Substance P处理的间充质干细胞)
如上表16和图34所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Substance P】处理的间充质干细胞生产的外泌体数量约高出4.3倍。
由上述结果可知,在间充质干细胞中,处理依据本发明的上述干细胞预处理物质时,间充质干细胞生产的外泌体数量会增加。
12-2.经Substance P处理后,外泌体来源蛋白量增加
利用外泌体蛋白分离试剂盒(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen),从上述实施例分离出的外泌体中分离出蛋白,并通过考马斯亮蓝法(bradford analysis)测量了592nm处的吸光度,并进行了蛋白定量。这时,为作比较,除未经任何物质处理的之外,从使用与实施例相同的方法分离出的外泌体中分离出蛋白,并进行了蛋白定量。其结果如下表17和图35所示。
【表17】
Yield(per 10<sup>6</sup>Cells) | MSC-Exo | SubsP MSC-Exo |
Exosomal protein(ug) | 2.0 | 10.37 |
(MSC:未处理的间充质干细胞,SubsP MSC:Substance P处理的间充质干细胞)
从上表17和图35所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Substance P】处理的间充质干细胞生产的外泌体来源蛋白量约高出5.2倍。
由上述结果可知,在间充质干细胞中,处理依据本发明的上述干细胞预处理物质时,不仅外泌体的数量会增加,外泌体来源蛋白(exosomal protein)的含量也会增加。
12-3.经Substance P处理后,外泌体来源RNA量增加
利用RNA分离用试剂盒(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen),从上述实施例分离出的外泌体中的总外泌体RNA,并利用超微量分光光度计(nanodrop)测量了RNA的浓度。这时,为作比较,除未经任何物质处理的之外,从使用与实施例相同的方法分离出的外泌体中分离出总外泌体RNA,并进行了浓度测量。其结果如下表18和图36所示。
【表18】
Yield(per 10<sup>6</sup>Cells) | MSC-Exo | SubsP MSC-Exo |
Exosomal RNA(ng) | 31.0 | 150.84 |
(MSC:未处理的间充质干细胞,SubsP MSC:Substance P处理的间充质干细胞)
如上表18和图36所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Substance P】处理的间充质干细胞生产的外泌体来源RNA量约高出4.9倍。
由上述结果可知,在间充质干细胞中,处理依据本发明的上述干细胞预处理物质时,不仅外泌体的数量会增加,外泌体来源RNA(exosomal RNA)的含量也会增加。
实验例13.经Resveratrol处理后,干细胞功能得以增强
13-1.经Resveratrol处理后,干细胞增殖率(Proliferation)增加
在含有100uL培养基[high glucose DMEM(Gibco,Cat no.11995-065),10%Fetalbovine Serum(HyClone),1%MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100X)(Gibco,Cat no.11140-050)]的96孔板中,分别接种(Seeding)间充质干细胞和经上述实施例的Resveratrol预处理的间充质干细胞,每孔接种3000个细胞后,在CO2培养箱中培养了24小时。而后,添加CCK溶液(10uL/孔)并在CO2培养箱(incubator)中培养了4小时,然后,通过测量450nm(420~480nm)波长处的吸光度,确认了增殖率。
如图37所示,可确认相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Resveratrol】处理的间充质干细胞的细胞增殖率约增322%,从1增加到3.22。
13-2.经Resveratrol处理后,干细胞干性(Stemness)增加
在含有10mL培养基[high glucose DMEM(Gibco,Cat no.11995-065),10%Fetalbovine Serum(HyClone),1%MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100X)(Gibco,Cat no.11140-050)]的100mm细胞培养皿(dish)中,分别接种(Seeding)间充质干细胞和经上述实施例的Resveratrol预处理的间充质干细胞,每个培养皿接种1000个细胞,培养了21天。用PBS清洗两次附着有培养细胞的培养皿后,在常温下用95%甲醇固定约两分钟。用PBS清洗三次固定的细胞后,添加0.5%紫结晶溶液【crystal violet(sigma,C-3886,USA)5g,甲醇100ml】后,染色5分钟,水洗后,在室温下干燥。计算每个培养皿中由50个以上的细胞组成的集落数,并对其进行了比较。
如图38a和38b所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞(28.6个),经干细胞预处理物质【Resveratrol】预处理的间充质干细胞的细胞(311个)的CFU-F集落数约增1087%。
实验例14.经Resveratrol处理后,外泌体生产效率得以提高
14-1.经Resveratrol处理后,外泌体数量增加
通过纳米粒子追踪分析(NanoSight NS300,Malvern),确认了上述实施例中分离出的外泌体数量。这时,为作比较,除未经任何物质处理的之外,对使用与实施例相同的方法分离出的外泌体数量进行了确认。其结果如下表19,及图39和图40所示。
【表19】
Yield(per 10<sup>6</sup>Cells) | MSC-Exo | Resv MSC-Exo |
No.of exosome particles(10<sup>9</sup>) | 2.3 | 11.9 |
(MSC:未处理的间充质干细胞,Resv MSC:Resveratrol处理的间充质干细胞)
如上表19和图40所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Resveratrol】处理的间充质干细胞生产的外泌体数量约高出5.2倍。
由上述结果可知,在间充质干细胞中,处理依据本发明的上述干细胞预处理物质时,间充质干细胞生产的外泌体数量会增加。
14-2.经Resveratrol处理后,外泌体来源蛋白量增加
利用外泌体蛋白分离试剂盒(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen),从上述实施例分离出的外泌体中分离出蛋白,并通过考马斯亮蓝法(bradford analysis)测量了592nm处的吸光度,并进行了蛋白定量。这时,为作比较,除未经任何物质处理的之外,从使用与实施例相同的方法分离出的外泌体中分离出蛋白,并进行了蛋白定量。其结果如下表20和图41所示。
【表20】
Yield(per 10<sup>6</sup>Cells) | MSC-Exo | Resv MSC-Exo |
Exosomal protein(ug) | 2.0 | 10.78 |
(MSC:未处理的间充质干细胞,Resv MSC:Resveratrol处理的间充质干细胞)
如上表20和图41所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Resveratrol】处理的间充质干细胞生产的外泌体来源蛋白量约高出5.4倍。
由上述结果可知,在间充质干细胞中,处理依据本发明的上述干细胞预处理物质时,不仅外泌体的数量会增加,外泌体来源蛋白(exosomal protein)的含量也会增加。
14-3.经Resveratrol处理后,外泌体来源RNA量增加
利用RNA分离用试剂盒(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen),从上述实施例分离出的外泌体中分离出总外泌体RNA,并利用超微量分光光度计(nanodrop)测量了RNA的浓度。这时,为作比较,除未经任何物质处理的之外,从使用与实施例相同的方法分离出的外泌体中分离出总外泌体RNA,并进行了浓度测量。其结果如下表21和图42所示。
【表21】
Yield(per 10<sup>6</sup>Cells) | MSC-Exo | Resv MSC-Exo |
Exosomal RNA(ng) | 31.0 | 145.15 |
(MSC:未处理的间充质干细胞,Resv MSC:Resveratrol处理的间充质干细胞)
如上表21和图42所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Resveratrol】处理的间充质干细胞生产的外泌体来源RNA量约高出4.7倍。
由上述结果可知,在间充质干细胞中,处理依据本发明的上述干细胞预处理物质时,不仅外泌体的数量会增加,外泌体来源RNA(exosomal RNA)的含量也会增加。
15-1.经Lanifibranor处理后,干细胞增殖率(Proliferation)增加
在含有100uL培养基[high glucose DMEM(Gibco,Cat no.11995-065),10%Fetalbovine Serum(HyClone),1%MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100X)(Gibco,Cat no.11140-050)]的96孔板中,分别接种(Seeding)间充质干细胞和经上述实施例的Lanifibranor预处理的间充质干细胞,每孔接种3000个细胞后,在CO2培养箱中培养了24小时。而后,添加CCK溶液(10uL/孔)并在CO2培养箱(incubator)中培养了4小时,然后,通过测量450nm(420~480nm)波长处的吸光度,确认了增殖率。
如图43所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Lanifibranor】处理的间充质干细胞的细胞增殖率约增181%,从1增加到1.81。
15-2.经Lanifibranor处理后,干细胞干性(Stemness)增加
在含有10mL培养基[high glucose DMEM(Gibco,Cat no.11995-065),10%Fetalbovine Serum(HyClone),1%MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100X)(Gibco,Cat no.11140-050)]的100mm细胞培养皿(dish)中,分别接种(Seeding)间充质干细胞和经上述实施例的Lanifibranor预处理的间充质干细胞,每个培养皿接种1000个细胞,培养了21天。用PBS清洗两次附着有培养细胞的培养皿后,在常温下用95%甲醇固定约两分钟。用PBS清洗三次固定的细胞后,添加0.5%紫结晶溶液【crystal violet(sigma,C-3886,USA)5g,甲醇100ml】后,染色5分钟,水洗后,在室温下干燥。计算每个培养皿中由50个以上的细胞组成的集落数,并对其进行了比较。
如图44a和44b所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞(40个),经干细胞预处理物质【Lanifibranor】预处理的间充质干细胞的细胞(56.7个)的CFU-F集落数约增142%。
实验例16.经Lanifibranor处理后,外泌体生产效率得以提高
16-1.经Lanifibranor处理后,外泌体数量增加
通过纳米粒子追踪分析(NanoSight NS300,Malvern),确认了上述实施例中分离出的外泌体数量。这时,为作比较,除未经任何物质处理的之外,对使用与实施例相同的方法分离出的外泌体数量进行了确认。其结果如下表22,及图45和图46所示。
【表22】
Yield(per 10<sup>6</sup>Cells) | MSC-Exo | Lani-MSC-Exo |
No.of exosome particles(10<sup>9</sup>) | 2.30 | 11.4 |
(MSC:未处理的间充质干细胞,Lani-MSC-Exo:Lanifibranor处理的间充质干细胞)
如上表22和图46所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Lanifibranor】处理的间充质干细胞生产的外泌体数量约高出4.95倍。
由上述结果可知,在间充质干细胞中,处理依据本发明的上述干细胞预处理物质时,间充质干细胞生产的外泌体数量会增加。
16-2.经Lanifibranor处理后,外泌体来源蛋白量增加
利用外泌体蛋白分离试剂盒(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen),从上述实施例分离出的外泌体中分离出蛋白,并通过考马斯亮蓝法(bradford analysis)测量了592nm处的吸光度,并进行了蛋白定量。这时,为作比较,除未经任何物质处理的之外,从使用与实施例相同的方法分离出的外泌体中分离出蛋白,并进行了蛋白定量。其结果如下表23和图47所示。
【表23】
Yield(per 10<sup>6</sup>Cells) | MSC-Exo | Lani-MSC-Exo |
Exosomal protein(ug) | 2.0 | 9.2 |
(MSC:未处理的间充质干细胞,Lani-MSC-Exo:Lanifibranor处理的间充质干细胞)
如上表23和图47所示,可确认到相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Lanifibranor】处理的间充质干细胞生产的外泌体来源蛋白量约高出4.6倍。
由上述结果可知,在间充质干细胞中,处理依据本发明的上述干细胞预处理物质时,不仅外泌体的数量会增加,外泌体来源蛋白(exosomal protein)的含量也会增加。
16-3.经Lanifibranor处理后,外泌体来源RNA量增加
利用RNA分离用试剂盒(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen),从上述实施例分离出的外泌体中的总外泌体RNA,并利用超微量分光光度计(nanodrop)测量了RNA的浓度。这时,为作比较,除未经任何物质处理的之外,从使用与实施例相同的方法分离出的外泌体中分离出总外泌体RNA,并进行了浓度测量。其结果如下表24和图48所示。
【表24】
Yield(per 10<sup>6</sup>Cells) | MSC-Exo | Lani-MSC-Exo |
Exosomal RNA(ng) | 27.00 | 110.34 |
(MSC:未处理的间充质干细胞,Lani-MSC-Exo:Lanifibranor处理的间充质干细胞)
如上表24和图18所示,可确认到,相较于未经任何物质处理的间充质干细胞,经干细胞预处理物质【Lanifibranor】处理的间充质干细胞生产的外泌体来源RNA量约高出4.1倍。
由上述结果可知,在间充质干细胞中,处理依据本发明的上述干细胞预处理物质时,不仅外泌体的数量会增加,外泌体来源RNA(exosomal RNA)的含量也会增加。
小结
由此可知,在间充质干细胞中,处理依据本发明的干细胞预处理物质Exendin-4、豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)、干扰素-γ(Interferon-γ)、粉防己碱(Tetrandrine)、透明质酸(Hyaluronic acid)、物质-P(Substance P)、白藜芦醇(Resveratrol)或Lanifibranor时,干细胞的干性(Stemness)会增加。另外,在间充质干细胞中,处理依据本发明的干细胞预处理物质时,不仅外泌体的数量会增加,而且,外泌体来源蛋白(exosomal protein)的产量会增加,外泌体来源RNA(exosomal RNA)的含量也会增加。
因此,依据本发明的干细胞预处理物质Exendin-4、豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)、干扰素-γ(Interferon-γ)、粉防己碱(Tetrandrine)、透明质酸(Hyaluronic acid)、物质-P(Substance P)、白藜芦醇(Resveratrol)或Lanifibranor可增加干细胞的干性,还可促进干细胞来源外泌体产生,因此,期待其可用于生产功能优良的干细胞,并可用于外泌体的大批量生产。
工业可用性
本发明涉及一种用于促进干细胞来源外泌体产生和增加干性的组合物。
Claims (13)
1.一种用于促进干细胞来源外泌体产生的组合物,其包含选自Exendin-4、豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)、干扰素-γ(Interferon-γ)、粉防己碱(Tetrandrine)、透明质酸(Hyaluronic acid)、物质-P(Substance P)、白藜芦醇(Resveratrol)和Lanifibranor组成的组中的一种以上。
2.如权利要求1所述的组合物,所述干细胞是胚胎干细胞、成体干细胞或诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell;iPSC)。
3.如权利要求2所述的组合物,所述成体干细胞是人类或动物组织起源的成体干细胞,人类或动物组织起源的间充质干细胞(mesenchymal stromal cell),或人或动物组织起源的诱导多能干细胞来源间充质干细胞。
4.如权利要求3所述的组合物,所述人类或动物组织,选自脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜和胎盘组成的组。
5.如权利要求3所述的组合物,所述人类或动物组织起源的成体干细胞,选自造血干细胞、乳腺干细胞、肠干细胞、血管内皮干细胞、神经干细胞、嗅觉神经干细胞和睾丸干细胞组成的组。
6.一种用于增加干细胞的干性(Stemness)的组合物,其包含选自Exendin-4、豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)、干扰素-γ(Interferon-γ)、粉防己碱(Tetrandrine)、透明质酸(Hyaluronic acid)、物质-P(Substance P)、白藜芦醇(Resveratrol)和Lanifibranor组成的组中的一种以上。
7.一种干细胞治疗剂,其包含如权利要求1至6的任一项所述的组合物。
8.一种干细胞来源外泌体,其经选自Exendin-4、豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)、干扰素-γ(Interferon-γ)、粉防己碱(Tetrandrine)、透明质酸(Hyaluronic acid)、物质-P(Substance P)、白藜芦醇(Resveratrol)和Lanifibranor组成的组中的一种以上预处理。
9.一种干细胞治疗剂,其包含如权利要求8所述的干细胞来源外泌体作为有效成分。
10.一种干细胞来源外泌体的生产方法,其包括以下步骤:在包含选自Exendin-4、豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)、干扰素-γ(Interferon-γ)、粉防己碱(Tetrandrine)、透明质酸(Hyaluronic acid)、物质-P(Substance P)、白藜芦醇(Resveratrol)和Lanifibranor组成的组中的一种以上的细胞培养基中培养干细胞。
11.如权利要求10所述的方法,还包括以下步骤:清洗培养的干细胞后,在细胞培养基中进一步培养;及分离外泌体。
12.如权利要求10所述的方法,上述细胞培养基含有去除外泌体的胎牛血清(Fetalbovine serum)。
13.一种增加干细胞的干性(Stemness)的方法,还包括以下步骤:在包含选自Exendin-4、豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)、干扰素-γ(Interferon-γ)、粉防己碱(Tetrandrine)、透明质酸(Hyaluronic acid)、物质-P(Substance P)、白藜芦醇(Resveratrol)和Lanifibranor组成的组中的一种以上的细胞培养基中培养干细胞。
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