JP2023075261A - 幹細胞由来エクソソーム生成促進及び幹細胞能増強用組成物 - Google Patents
幹細胞由来エクソソーム生成促進及び幹細胞能増強用組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023075261A JP2023075261A JP2023039190A JP2023039190A JP2023075261A JP 2023075261 A JP2023075261 A JP 2023075261A JP 2023039190 A JP2023039190 A JP 2023039190A JP 2023039190 A JP2023039190 A JP 2023039190A JP 2023075261 A JP2023075261 A JP 2023075261A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- stem cells
- stem cell
- derived
- exosomes
- present
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 525
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 438
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 111
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 68
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 title claims abstract description 45
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 66
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 66
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 58
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 58
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 40
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 22
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 11
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004966 intestinal stem cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000002381 testicular Effects 0.000 claims description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims description 2
- OQDQIFQRNZIEEJ-UHFFFAOYSA-N 4-[1-(1,3-benzothiazol-6-ylsulfonyl)-5-chloroindol-2-yl]butanoic acid Chemical compound C1=C2N=CSC2=CC(S(=O)(=O)N2C3=CC=C(Cl)C=C3C=C2CCCC(=O)O)=C1 OQDQIFQRNZIEEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 8
- 229940126032 IVA-337 Drugs 0.000 abstract description 8
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 236
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 156
- WVTKBKWTSCPRNU-KYJUHHDHSA-N (+)-Tetrandrine Chemical compound C([C@H]1C=2C=C(C(=CC=2CCN1C)OC)O1)C(C=C2)=CC=C2OC(=C2)C(OC)=CC=C2C[C@@H]2N(C)CCC3=CC(OC)=C(OC)C1=C23 WVTKBKWTSCPRNU-KYJUHHDHSA-N 0.000 description 120
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 110
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 109
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 86
- PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N Cocarcinogen A1 Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1C(C)C2(O)C3C=C(C)C(=O)C3(O)CC(CO)=CC2C2C1(OC(C)=O)C2(C)C PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 75
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 75
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 68
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 66
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 65
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 64
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 64
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 64
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 63
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 63
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 63
- WVTKBKWTSCPRNU-UHFFFAOYSA-N rac-Tetrandrin Natural products O1C(C(=CC=2CCN3C)OC)=CC=2C3CC(C=C2)=CC=C2OC(=C2)C(OC)=CC=C2CC2N(C)CCC3=CC(OC)=C(OC)C1=C23 WVTKBKWTSCPRNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 63
- 108010011459 Exenatide Proteins 0.000 description 61
- JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N chembl1210015 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@]3(O[C@@H](C[C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C3)C(O)=O)O2)O)[C@@H](CO)O1)NC(C)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N 0.000 description 61
- 229960001519 exenatide Drugs 0.000 description 61
- QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N (2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-1-[(2R)-2-amino-5-carbamimidamidopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-N-[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-amino-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]pentanediamide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N 0.000 description 56
- 102100024304 Protachykinin-1 Human genes 0.000 description 56
- 101800003906 Substance P Proteins 0.000 description 56
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 53
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 50
- QNVSXXGDAPORNA-UHFFFAOYSA-N Resveratrol Natural products OC1=CC=CC(C=CC=2C=C(O)C(O)=CC=2)=C1 QNVSXXGDAPORNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 49
- LUKBXSAWLPMMSZ-OWOJBTEDSA-N Trans-resveratrol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1\C=C\C1=CC(O)=CC(O)=C1 LUKBXSAWLPMMSZ-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 49
- 235000021283 resveratrol Nutrition 0.000 description 49
- 229940016667 resveratrol Drugs 0.000 description 49
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 42
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 39
- 239000000463 material Substances 0.000 description 38
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 38
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 35
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 32
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 32
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 31
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 30
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 27
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 26
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 26
- XLCISDOVNFLSGO-VONOSFMSSA-N phorbol-12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(O)C1(C)C XLCISDOVNFLSGO-VONOSFMSSA-N 0.000 description 25
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 24
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 19
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 19
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 16
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 16
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 16
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 15
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 14
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 14
- LUKBXSAWLPMMSZ-UHFFFAOYSA-N resveratrol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C=CC1=CC(O)=CC(O)=C1 LUKBXSAWLPMMSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 13
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 12
- ADNPLDHMAVUMIW-CUZNLEPHSA-N substance P Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N)C1=CC=CC=C1 ADNPLDHMAVUMIW-CUZNLEPHSA-N 0.000 description 11
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 10
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 9
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 8
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 8
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- CWWARWOPSKGELM-SARDKLJWSA-N methyl (2s)-2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-5-amino-2-[[(2s)-5-amino-2-[[(2s)-1-[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-1-[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5 Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)OC)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N)C1=CC=CC=C1 CWWARWOPSKGELM-SARDKLJWSA-N 0.000 description 7
- 102000003728 Peroxisome Proliferator-Activated Receptors Human genes 0.000 description 6
- 108090000029 Peroxisome Proliferator-Activated Receptors Proteins 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- OWFJMIVZYSDULZ-PXOLEDIWSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6s,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,6,10,11,12a-hexahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3[C@H](O)[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O OWFJMIVZYSDULZ-PXOLEDIWSA-N 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 239000006147 Glasgow's Minimal Essential Medium Substances 0.000 description 2
- 108010088406 Glucagon-Like Peptides Proteins 0.000 description 2
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 2
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 2
- 102000000344 Sirtuin 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010041191 Sirtuin 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 230000006793 arrhythmia Effects 0.000 description 2
- 206010003119 arrhythmia Diseases 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 2
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 230000008568 cell cell communication Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 238000009168 stem cell therapy Methods 0.000 description 2
- 238000009580 stem-cell therapy Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- -1 tissue engineering Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- FXEDIXLHKQINFP-UHFFFAOYSA-N 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1CC2(O)C(C=C(CO)CC3(O)C2C=C(C)C3=O)C4C(C)(C)C14OC(=O)C FXEDIXLHKQINFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 235000006491 Acacia senegal Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- PYIXHKGTJKCVBJ-UHFFFAOYSA-N Astraciceran Natural products C1OC2=CC(O)=CC=C2CC1C1=CC(OCO2)=C2C=C1OC PYIXHKGTJKCVBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- NDVRQFZUJRMKKP-UHFFFAOYSA-N Betavulgarin Natural products O=C1C=2C(OC)=C3OCOC3=CC=2OC=C1C1=CC=CC=C1O NDVRQFZUJRMKKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004366 CD4-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108090000312 Calcium Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000003922 Calcium Channels Human genes 0.000 description 1
- 229940127291 Calcium channel antagonist Drugs 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 201000009794 Idiopathic Pulmonary Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000002002 Neurokinin-1 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010040718 Neurokinin-1 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000003797 Neuropeptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000023984 PPAR alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010015181 PPAR delta Proteins 0.000 description 1
- 108010016731 PPAR gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000000536 PPAR gamma Human genes 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 229940122985 Peptide agonist Drugs 0.000 description 1
- IHPVFYLOGNNZLA-UHFFFAOYSA-N Phytoalexin Natural products COC1=CC=CC=C1C1OC(C=C2C(OCO2)=C2OC)=C2C(=O)C1 IHPVFYLOGNNZLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 description 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 201000009594 Systemic Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 206010042953 Systemic sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 102000003141 Tachykinin Human genes 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010052568 Urticaria chronic Diseases 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003510 anti-fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 229940124575 antispasmodic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000003012 bilayer membrane Substances 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 210000000625 blastula Anatomy 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000000480 calcium channel blocker Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001714 calcium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000378 calcium silicate Substances 0.000 description 1
- 229910052918 calcium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003340 calcium silicate Drugs 0.000 description 1
- 235000012241 calcium silicate Nutrition 0.000 description 1
- OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N calcium;dioxido(oxo)silane Chemical compound [Ca+2].[O-][Si]([O-])=O OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000000812 cholinergic antagonist Substances 0.000 description 1
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 208000024376 chronic urticaria Diseases 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000008406 cosmetic ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000003583 cytomorphological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 125000000600 disaccharide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035990 intercellular signaling Effects 0.000 description 1
- 208000036971 interstitial lung disease 2 Diseases 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004066 metabolic change Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 230000004898 mitochondrial function Effects 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000002487 multivesicular body Anatomy 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 108091008725 peroxisome proliferator-activated receptors alpha Proteins 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000280 phytoalexin Substances 0.000 description 1
- 150000001857 phytoalexin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 108060008037 tachykinin Proteins 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000717 tumor promoter Substances 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 229940124549 vasodilator Drugs 0.000 description 1
- 239000003071 vasodilator agent Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/51—Umbilical cord; Umbilical cord blood; Umbilical stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
- A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/35—Polyols, e.g. glycerin, inositol
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/24—Interferons [IFN]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/335—Glucagon; Glucagon-like peptide [GLP]; Exendin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/405—Cell cycle regulated proteins, e.g. cyclins, cyclin-dependant kinases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/80—Neurotransmitters; Neurohormones
- C12N2501/83—Tachykinins, e.g. substance P
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/90—Polysaccharides
- C12N2501/905—Hyaluronic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
Abstract
【課題】幹細胞由来エクソソーム生成促進又は幹細胞の幹細胞能増強用組成物を提供する。【解決手段】ラニフィブラノール(Lanifibranor)を含むことを特徴とする幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物を提供する。また、ラニフィブラノールを含むことを特徴とする幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用組成物を提供する。【選択図】図47
Description
本発明は、幹細胞由来エクソソーム生成促進及び幹細胞能増強用組成物に関する。
細胞外小胞体(Extracellular Vesicles)は、微小小胞体(Microvesicles)、エクソソーム(Exosome)などを含む30~1000nmサイズの球形脂質二重層(lipid-bilayer)で構成された小胞体(vesicle)である。
エクソソームの脂質二重層は、起源細胞(供与細胞)のようなリン脂質二重膜構造となっており、細胞が細胞外に分泌する物質の構成体であって、細胞-細胞間のコミュニケーション及び細胞性免疫調節などの機能的な役割を担うものと知られている。
エクソソームは、起源細胞(供与細胞)特有の生物学的機能を反映する細胞特異的構成成分を含有し、リン脂質、mRNA、miRNAの他にも様々な水溶性タンパク質、外在性タンパク質、及び膜貫通タンパク質成分などを含む。
このようなエクソソームは、肥満細胞、リンパ球、星状細胞、血小板、神経細胞、内皮細胞、上皮細胞などのあらゆる動物細胞から排出され、血液、尿、粘液、唾液、胆汁、腹水、脳脊髓液などの様々な体液から発見される。エクソソームは、血液脳関門(Blood-Brain Barrier;BBB)も通過でき、表皮細胞及び内皮細胞の細胞膜透過が可能な程度に選択的透過性が高いことから、特定薬物のナノキャリア(nanocarrier)であるDDS(drug delivery system)の開発にも活用されている。
間葉系幹細胞から分泌するエクソソーム及び微小小胞体(microvesicle)は、細胞-細胞間コミュニケーション(cell-to-cell communication)に関与し、幹細胞が有する再生医学的な治療効能を示すものと知られている。
エクソソームは、長期間生存せずに生体内に移植された幹細胞から分泌されるパラクリン因子(paracrine factors)にトロフィック効果(trophic effect)をもたらすことが知られている。分泌されるそのような因子は、エクソソームのような細胞外小胞体によって分泌される、成長因子(growth factor)、ケモカイン(chemokine)、サイトカイン(cytokine)などの低分子であり、そのようなエクソソームは幹細胞に由来する。このため、エクソソームは、幹細胞の特性を究明し、その治療効能を評価するのに活用されている。
最近では、間葉系幹細胞自体を使用せず、間葉系幹細胞が分泌するエクソソームを用いて様々な疾患の治療効果に対する研究が活発に行われており、学界及び産業界では、それが既存の幹細胞治療法の限界を克服できる新しい代案になり得ると期待されている。
このようなエクソソームを商業的に用いるためには、多量の、そして良質のエクソソームが必要である。しかし、現在、幹細胞から得られるエクソソームの量は極めて少量であり、幹細胞由来エクソソームの生産量を増加させ得る物質の開発も不十分である。
一方、間葉系幹細胞は、培養期間が長くなると同時に、数回の継代培養を経ることで、増殖能力と様々な系統への分化能力とが減少することが知られている。また、初期継代(passage)の間葉系幹細胞に比べて、後期継代の間葉系幹細胞においてコロニー形成能力が顕著に減少することが知られている。間葉系幹細胞の老化は、骨髄供与者の年齢ではなく、長い培養期間によって弱化した増殖能力と関連があり、テロメラーゼ活性(telomeraseactivity)の減少とも関連があると考えられる。
このように、現在、ヒトから得られる間葉系幹細胞の量は制限されており、得られた細胞を特定系統へと分化誘導するうえで、継代培養に伴う分化能力の減少のような不都合は避けられない。このような不都合は、正確なターゲット細胞への分化誘導及びそのための適切な幹細胞の大量確保が要求される臨床適用においては非現実的である。このため、長い期間にわたって増殖率を維持し、様々な系統への分化能力を維持できる方法の必要性が台頭している。
そこで、幹細胞由来エクソソームの生産を促進する他、幹細胞の増殖率及び分化能を長期間維持できる新規の方法及び物質の開発に対する必要性が提起された。
本発明者らは、幹細胞由来エクソソームの生産を促進するだけでなく、幹細胞の増殖率及び分化能を長期間維持できる方法及び物質を開発しようと努力した。その結果、エキセンジン-4(Exendin-4)、ホルボール12-ミリステート13-酢酸(Phorbol 12-myristate 13-acetate;PMA)、インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)、テトランドリン(Tetrandrine)、ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)、P物質(Substance P)、レスベラトロール(Resveratrol)、及びラニフィブラノール(Lanifibranor)からなる群から選ばれる一つ以上を幹細胞に前処理する場合、幹細胞の幹細胞能(Stemness)及び増殖能(Proliferation)が増強するだけでなく、幹細胞由来エクソソームの数、エクソソーム内のタンパク質及びRNAの含有量が大きく増加することを究明し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、エキセンジン-4(Exendin-4)を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、エキセンジン-4(Exendin-4)を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記幹細胞由来エクソソーム生成促進又は幹細胞の幹細胞能増強用組成物を含む幹細胞治療剤を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、エキセンジン-4(Exendin-4)で前処理された幹細胞由来エクソソームを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、エキセンジン-4(Exendin-4)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞由来エクソソームの生産方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、エキセンジン-4(Exendin-4)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)を増強させる方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、エキセンジン-4(Exendin-4)を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、エキセンジン-4(Exendin-4)を含む組成物の幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用途を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ホルボール12-ミリステート13-酢酸(PMA)を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ホルボール12-ミリステート13-酢酸(PMA)を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記幹細胞由来エクソソーム生成促進又は幹細胞の幹細胞能増強用組成物を含む幹細胞治療剤を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ホルボール12-ミリステート13-酢酸(PMA)で前処理された幹細胞由来エクソソームを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ホルボール12-ミリステート13-酢酸(PMA)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞由来エクソソームの生産方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ホルボール12-ミリステート13-酢酸(PMA)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)を増強させる方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ホルボール12-ミリステート13-酢酸(PMA)を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ホルボール12-ミリステート13-酢酸(PMA)を含む組成物の幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用途を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記幹細胞由来エクソソーム生成促進又は幹細胞の幹細胞能増強用組成物を含む幹細胞治療剤を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)で前処理された幹細胞由来エクソソームを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞由来エクソソームの生産方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)を増強させる方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)を含む組成物の幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用途を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、テトランドリン(Tetrandrine)を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、テトランドリン(Tetrandrine)を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記幹細胞由来エクソソーム生成促進又は幹細胞の幹細胞能増強用組成物を含む幹細胞治療剤を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、テトランドリン(Tetrandrine)で前処理された幹細胞由来エクソソームを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、テトランドリン(Tetrandrine)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞由来エクソソームの生産方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、テトランドリン(Tetrandrine)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)を増強させる方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、テトランドリン(Tetrandrine)を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、テトランドリン(Tetrandrine)を含む組成物の幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用途を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記幹細胞由来エクソソーム生成促進又は幹細胞の幹細胞能増強用組成物を含む幹細胞治療剤を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)で前処理された幹細胞由来エクソソームを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞由来エクソソームの生産方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)を増強させる方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)を含む組成物の幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用途を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、P物質(Substance P)を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、P物質(Substance P)を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記幹細胞由来エクソソーム生成促進又は幹細胞の幹細胞能増強用組成物を含む幹細胞治療剤を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、P物質(Substance P)で前処理された幹細胞由来エクソソームを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、P物質(Substance P)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞由来エクソソームの生産方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、P物質(Substance P)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)を増強させる方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、P物質(Substance P)を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、P物質(Substance P)を含む組成物の幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用途を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、レスベラトロール(Resveratrol)を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、レスベラトロール(Resveratrol)を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記幹細胞由来エクソソーム生成促進又は幹細胞の幹細胞能増強用組成物を含む幹細胞治療剤を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、レスベラトロール(Resveratrol)で前処理された幹細胞由来エクソソームを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、レスベラトロール(Resveratrol)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞由来エクソソームの生産方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、レスベラトロール(Resveratrol)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)を増強させる方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、レスベラトロール(Resveratrol)を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、レスベラトロール(Resveratrol)を含む組成物の幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用途を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ラニフィブラノール(Lanifibranor)を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ラニフィブラノールを含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用幹細胞治療剤を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ラニフィブラノールを含む幹細胞の幹細胞能(stemness)増強用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ラニフィブラノールを含む幹細胞の幹細胞能増強用幹細胞治療剤を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ラニフィブラノールで前処理された幹細胞由来エクソソームを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ラニフィブラノールで前処理された幹細胞由来エクソソームを有効成分として含む幹細胞治療剤を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ラニフィブラノールを含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞由来エクソソームの生産方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ラニフィブラノールを含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞の幹細胞能を増強させる方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ラニフィブラノールを含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ラニフィブラノールを含む組成物の幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用途を提供することである。
本発明者らは、幹細胞由来エクソソームの生産を促進するだけでなく、幹細胞の増殖率及び分化能を長期間維持できる方法及び物質を開発しようと努力した。その結果、エキセンジン-4(Exendin-4)、ホルボール12-ミリステート13-酢酸(Phorbol 12-myristate 13-acetate;PMA)、インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)、テトランドリン(Tetrandrine)、ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)、P物質(Substance P)、レスベラトロール(Resveratrol)、及びラニフィブラノール(Lanifibranor)からなる群から選ばれる一つ以上を幹細胞に前処理する場合、幹細胞の幹細胞能(Stemness)及び増殖能(Proliferation)が増強する他にも、幹細胞由来エクソソームの数、エクソソーム内のタンパク質及びRNAの含有量が大きく増加することを究明した。
本発明は、エキセンジン-4(Exendin-4)、ホルボール12-ミリステート13-酢酸(Phorbol 12-myristate 13-acetate;PMA)、インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)、テトランドリン(Tetrandrine)、ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)、P物質(Substance P)、レスベラトロール(Resveratrol)、及びラニフィブラノール(Lanifibranor)からなる群から選ばれる一つ以上を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進又は幹細胞の幹細胞能増強用組成物、前記組成物を含む幹細胞治療剤、エキセンジン-4(Exendin-4)、ホルボール12-ミリステート13-酢酸(Phorbol 12-myristate 13-acetate;PMA)、インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)、テトランドリン(Tetrandrine)、ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)、P物質(Substance P)、レスベラトロール(Resveratrol)、及びラニフィブラノール(Lanifibranor)からなる群から選ばれる一つ以上で前処理された幹細胞由来エクソソーム、前記幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤、幹細胞由来エクソソームの生産方法、及び幹細胞の幹細胞能を増強させる方法に関する。
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明の一態様は、エキセンジン-4(Exendin-4)を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物に関する。
本発明のエキセンジン-4(Exendin-4)は、グルカゴン様ペプチド(glucagon-like peptide;GLP)受容体のペプチドアゴニストである。エキセンジン-4は、インスリン分泌を促進するものと知られており、2型糖尿病及びパーキンソン病治療用途として臨床的に用いられてきた。
本発明の一態様は、ホルボール12-ミリステート13-酢酸(Phorbol 12-myristate 13-acetate;PMA)を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物に関する。
本発明のホルボール12-ミリステート13-酢酸(PMA)は、12-0-テトラデカノイルホルボール-13-酢酸(12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate;TPA)などとも知られており、シグナル変換酵素(signal transduction enzyme)であるタンパク質リン酸化酵素C(protein kinase C;PKC)を活性化させる役割を担う。また、PMAは、腫瘍プロモーターとして用いられ、B細胞などの分裂を刺激し、様々な細胞で活性化を誘導してサイトカインを生産する役割を担う。このことから、炎症反応誘導剤などの研究に用いられてきた。
本発明の一態様は、インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物に関する。
本発明のインターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)は、活性化されたT細胞やNK細胞、CD4及びCD8陽性リンパ球によって生成されるサイトカインであり、分裂促進因子又は成長因子としてTリンパ球をはじめとする様々な細胞の活性化と増殖分化、抗原提示細胞上のMHCの発現を高める作用に関与し、免疫及び炎症反応において重要な役割を担う。また、インターフェロン-ガンマは、感染及び自己免疫治療用途として臨床的に用いられてきた。
本発明の一態様は、テトランドリン(Tetrandrine)を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物に関する。
本発明のテトランドリン(Tetrandrine)は、カルシウムチャネル遮断剤(calcium channel broker)であって、カルシウムチャネル活性を非選択的に抑制し、様々な細胞類型において細胞周期及び細胞死滅のG1段階のG1遮断を誘導し、免疫抑制、抗炎症、抗線維化、抗凝固作用などの効果があり、肝細胞グリコーゲン合成を増加させてブドウ糖の利用を増加させ、血漿のブドウ糖濃度を下げたりすることもある。また、テトランドリンは、糖尿病の併用治療剤、高血圧、不整脈、鎮痛と鎮痙剤、肝硬化及びリウマチ性関節炎治療剤などの用途として臨床的に用いられてきた。
本発明の一態様は、ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物に関する。
本発明のヒアルロン酸(Hyaluronic acid)は、D-グルクロン酸(D-glucuronic acid)及びN-アセチル-D-グルコサミン(N-acetyl-D-グルコサミン)の二糖類単位体がβ(1→4)グリコシド間結合(inter glycosidic linkage)によって連結された天然線形多糖類である。ヒアルロン酸は、真皮を構成する成分の一つとして知られており、生体適合性及び生分解性に優れ、体内で免疫拒絶反応及び毒性がない、優れた生体材料として知られている。また、ヒアルロン酸は、高粘度且つ高弾性の天然グリコサミノグリカン巨大分子であって、種々の機能及び物理化学的な性質を有していることから、関節炎治療、眼科手術、フィラー、傷治療、薬物伝達体、癒着防止剤、組織工学、及び化粧品などの用途として臨床的に用いられてきた。
本発明の一態様は、P物質(Substance P)を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物に関する。
本発明のP物質(Substance P)は、タキキニン神経ペプチドファミリー(tachykinin neuropeptide family)のウンデカペプチド(undecapeptide)で、NK1レセプター(receptor)に作用する神経ペプチドであって、神経伝達物質及び神経調節物質として作用する。また、P物質は、強力な血管拡張剤であって、細胞成長を促進するものと知られており、治療し難い潰瘍などの治癒を促進する他、慢性蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、慢性腎臓疾患、及び炎症や疼痛調節にも効果があると知られている。さらに、P物質(Substance P)は、皮膚細胞増殖及び再生にも役立ち、化粧品の原料としても使用され、高血圧及び肝硬変疾患などの治療用途として臨床的に用いられてきた。
本発明の一態様は、レスベラトロール(Resveratrol)を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物に関する。
本発明のレスベラトロール(Resveratrol)は、植物がカビや害虫のような有害な環境に直面した際に生成するファイトアレキシン(phytoalexin)であって、ポリフェノール系物質である。脱アセチル酵素であるSirt1(Sirtuin-1)を活性化させてミトコンドリアの機能を増進させ、糖代謝の流れを増進させることができる。また、レスベラトロールは、抗癌、抗ウイルス、神経保護、抗老化、抗炎症、及び延命効果などを含む抗疾患効果がある。また、レスベラトロールは、抗酸化作用を示し、窒素酸化物(NO)生成を刺激して血管を拡張させることにより、再灌流障害からの保護と不整脈を抑制する効果がある。これにより、レスベラトロールは、心血管や脳の疾患などの治療剤として研究し続けられており、抗老化、抗癌関連健康機能食品、及びシワ改善化粧品原料などの様々な分野に臨床的に用いられてきた。
本発明の一態様は、ラニフィブラノールを含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物である。
本発明のラニフィブラノールは、PPAR(peroxisome proliferator-activated receptors )作用剤(agonist)であって、PPARα、PPARδ、及びPPARγと知られた3つのPPARアイソフォームをそれぞれ活性化させ、身体内で抗線維化、抗炎症そして有益な代謝変化を誘導するものと知られている小分子(small molecule)である。PPARは、遺伝子の発現を調節する核ホルモン受容体ファミリーに属するリガンド活性化転写因子である。PPARは、細胞分化、発達、及び腫瘍形成の調節に必須な役割を担う。ラニフィブラノールは、繊維症を調節するPPARを活性化させて、結合組織の異常成長を減少させることが知られている。また、ラニフィブラノールは、全身性硬化症治療剤、特発性肺線維症治療剤などの用途として臨床的に用いられてきた。
本発明に係る前記組成物は、上述した成分に加えて、公知のエクソソーム生成促進物質をさらに含むことができる。
本明細書において“エクソソーム(Exosome)”は、細胞由来性小胞体であり、殆どの真核生物の体液に存在する。エクソソームの直径は、30~200nm程度であり、これはLDLタンパク質よりは大きいが、赤血球よりは遥かに小さい。
前記エクソソームは、多重小胞体(multivesicular bodies)が細胞膜と融合する際に細胞から放出されるか、或いは細胞膜から直ちに放出され得る。
このようなエクソソームが凝固、細胞間信号伝達などのような重要ながらも特化した機能を担うという点は、よく知られている。
本明細書において“幹細胞(Stem cell)”は未分化な細胞であって、自己複製能力を有する上に、2つ以上の異なる種類の細胞に分化する能力を有する細胞のことを指す。
前記幹細胞は、自己又は同種由来幹細胞でよく、ヒト及び非ヒト哺乳類を含む任意類型の動物由来であり得、前記幹細胞が成体から由来したものであれ、胚から由来したものであれ、それに限定されない。
具体的に、前記幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、又は人工多能性幹細胞であり得るが、これに制限されるものではない。
本明細書において“胚性幹細胞(embryonic stem cell)”は、胚の発生過程で抽出した細胞であり、受精卵が母体の子宮に着床する直前である胞胚期の胚から内部細胞塊(inner cell mass)を抽出して体外で培養したものを意味する。
前記胚性幹細胞は、個体のあらゆる組織の細胞に分化できる多能性(pluripotent)であるか、全能性(totipotent)の自己複製能(selfrenewal)を有する細胞を意味し、広義には、胚性幹細胞から由来した胚様体(embryoid bodies)も含む。
前記胚性幹細胞は、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ウサギなどのあらゆる由来の胚性幹細胞を含むことができるが、これに制限されるものではない。
本明細書において“成体幹細胞(adult stem cell)”は、臍帯血又は成体骨髄、血液などから抽出される細胞であって、具体的な臓器の細胞に分化する直前の細胞を意味し、必要時に身体内組織に発達できる能力を保有した未分化状態の細胞を意味する。
前記成体幹細胞は、ヒト又は動物の様々な組織起源の成体幹細胞、ヒト又は動物組織由来の間葉系幹細胞(mesenchymal stromal cell)、ヒト又は動物の様々な組織起源の人工多能性幹細胞から由来した間葉系幹細胞及び多分化能幹細胞を含むことができるが、これに制限されるものではない。
前記ヒト又は動物組織は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜及び/又は胎盤であってよいが、これに制限されるものではない。
前記ヒト又は動物の様々な組織起源の幹細胞は、例えば、造血幹細胞、乳腺幹細胞、腸幹細胞、血管内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚神経幹細胞及び/又は精巣幹細胞であってよいが、これに制限されるものではない。
本明細書において“人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell;iPSC)”は、分化した細胞から人為的な逆分化過程によって多能性分化能を有するように誘導された細胞を意味し、“逆分化幹細胞”と同じ意味で使われてもよい。
前記人為的な逆分化過程は、レトロウイルス、レンチウイルス、及びセンダイウイルスを用いたウイルス媒介又は非ウイルス性ベクターの利用、タンパク質及び細胞抽出物などを用いる非ウイルス媒介逆分化因子の導入によって行われるか、或いは幹細胞抽出物、化合物などによる逆分化過程を含むことができる。
前記人工多能性幹細胞は、胚性幹細胞とほぼ同じ性質を示す。具体的には、それらは、細胞形態学的類似性、類似の遺伝子及びタンパク質発現パターン、in vitroおよびin vivoでの全能性、テラトーマ(teratoma)形成、マウス胚盤胞への挿入時のキメラ(chimera)マウスの作製、並びに遺伝子の生殖細胞系伝達(germline transmission)を含む側面において共通している。
前記人工多能性幹細胞は、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ウサギなどのあらゆる由来の人工多能性幹細胞を含むことができるが、これに制限されるものではない。
本明細書において用語“生成促進”とは、対照群に比べて特定物質の生産、生成、放出などが同一時間内で増加することを意味する。
具体的には、幹細胞からエクソソームが生産される数量と、エクソソーム内タンパク質、RNAなどの含有量が増加することを意味する。
本発明の他の態様は、エキセンジン-4(Exendin-4)を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用組成物に関する。
本発明の他の態様は、ホルボール12-ミリステート13-酢酸(PMA)を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用組成物に関する。
本発明の他の態様は、インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用組成物に関する。
本発明の他の態様は、テトランドリン(Tetrandrine)を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用組成物に関する。
本発明の他の態様は、ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用組成物に関する。
本発明の他の態様は、P物質(Substance P)を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用組成物に関する。
本発明の他の態様は、レスベラトロール(Resveratrol)を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用組成物に関する。
本発明の他の態様は、ラニフィブラノール(Lanifibranor)を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用組成物に関する。
本明細書において用語“幹細胞能”とは、全てのタイプの細胞に分化する多能性(pluripotency)、及び無限に分裂してより多くの同じ幹細胞を産生する自己複製能(self-renewal)を総称する意味で当業界に通用されている。
具体的には、未分化細胞を、未分化状態を維持しながら幹細胞の増殖能(Proliferation)を増強させたり、テロメラーゼ活性を向上させたり、幹細胞性因子(stemness acting signals)の発現を向上させたり、細胞運動性を向上させたりすることを指し、それら特徴の一つ以上が現れることを含むことができる。
本発明の前記各組成物は、培地組成物として幹細胞培養に用いられてよく、生体内(in vivo)エクソソーム生成促進用途の薬剤学的組成物として幹細胞と共に生体内に併用投与されたり、先行又は後行して投与されたりすることで、幹細胞のin vivo効能を強化させることができる。
前記幹細胞のin vivo効能強化とは、関節炎、抹消神経障害などの特定の疾患の治療のための幹細胞の効能(in vivo効能)が、幹細胞によって分泌されるエクソソームによって媒介されるという仮定の下で、本開示の組成物と幹細胞との同時投与は、幹細胞からのエクソソームの産生を促進し、その結果、疾患に対する幹細胞の治療効果(in vivo効能)を強化することを意味する。
本発明の前記各組成物が培地組成物である場合、前記“培地組成物”は、生体外(in vitro)で細胞の成長、生存、及び増殖に必要な必須成分を含む組成物を意味するものであり、当該分野で通常用いられる幹細胞培養用培地をいずれも含み、例えば、DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)、MEM(Minimal Essential Medium)、BME(Basal Medium Eagle)、RPMI 1640、DMEM/F-10(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium:Nutrient Mixture F-10)、DMEM/F-12(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium:Nutrient Mixture F-12)、α-MEM(α-Minimal essential Medium)、G-MEM(Glasgow’s Minimal Essential Medium)、IMDM(Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium)、KnockOut DMEM、E8(Essential8Medium)などの商業的に製造された培地又は人為的に合成した培地を用いることができるが、これに制限されるものではない。
前記培地組成物は、一般に、炭素源、窒素源及び微量元素成分を含み、アミノ酸、抗生剤などをさらに含むことができる。
また、前記培地組成物は、本発明の構成成分エキセンジン-4(Exendin-4)を従来の幹細胞培養用培地内に添加して製造できる。
また、前記培地組成物は、本発明の構成成分ホルボール12-ミリステート13-酢酸(PMA)を従来の幹細胞培養用培地内に添加して製造できる。
また、前記培地組成物は、本発明の構成成分インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)を従来の幹細胞培養用培地内に添加して製造できる。
また、前記培地組成物は、本発明の構成成分テトランドリン(Tetrandrine)を従来の幹細胞培養用培地内に添加して製造できる。
また、前記培地組成物は、本発明の構成成分ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)を従来の幹細胞培養用培地内に添加して製造できる。
また、前記培地組成物は、本発明の構成成分P物質(Substance P)を従来の幹細胞培養用培地内に添加して製造できる。
また、前記培地組成物は、本発明の構成成分レスベラトロール(Resveratrol)を従来の幹細胞培養用培地内に添加して製造できる。
また、前記培地組成物は、本発明の構成成分ラニフィブラノール(Lanifibranor)を従来の幹細胞培養用培地内に添加して製造できる。
前記本発明の構成成分エキセンジン-4(Exendin-4)は、培地内に10~1000nM、10~100nM、10~90nM、10~80nM、10~70nM、10~60nM、10~50nM、10~40nM、10~30nM、又は20nMの濃度で添加されてよいが、これに制限されるものではない。
前記本発明の構成成分ホルボール12-ミリステート13-酢酸(PMA)は、培地内に1~1000nM、1~500nM、1~100nM、1~90nM、1~80nM、1~70nM、1~60nM、1~50nM、1~40nM、1~30nM、1~20nM、又は10nMの濃度で添加されてよいが、これに制限されるものではない。
前記本発明の構成成分インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)は、培地内に1~1000ng/mL、1~500ng/mL、1~100ng/mL、1~90ng/mL、1~80ng/mL、1~70ng/mL、1~60ng/mL、1~50ng/mL、1~40ng/mL、1~30ng/mL、1~20ng/mL、又は10ng/mLの濃度で添加されてよいが、これに制限されるものではない。
前記本発明の構成成分テトランドリン(Tetrandrine)は、培地内に1~1000μM、1~500μM、1~100μM、1~90μM、1~80μM、1~70μM、1~60μM、1~50μM、1~40μM、1~30μM、1~20μM、又は10μMの濃度で添加されてよいが、これに制限されるものではない。
前記本発明の構成成分ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)は、培地内に1~1000μg/mL、1~500μg/mL、1~100μg/mL、1~90μg/mL、1~80μg/mL、1~70μg/mL、1~60μg/mL、1~50μg/mL、1~40μg/mL、1~30μg/mL、1~20μg/mL、又は10μg/mLの濃度で添加されてよいが、これに制限されるものではない。
前記本発明の構成成分P物質(Substance P)は、培地内に10~1000nM、10~100nM、10~90nM、10~80nM、10~70nM、10~60nM、10~50nM、10~40nM、20~40nM、又は30nMの濃度で添加されてよいが、これに制限されるものではない。
前記本発明の構成成分レスベラトロール(Resveratrol)は、培地内に1~1000nM、1~500nM、1~100nM、1~90nM、1~80nM、1~70nM、1~60nM、1~50nM、1~40nM、1~30nM、1~20nM、又は10nMの濃度で添加されてよいが、これに制限されるものではない。
前記本発明の構成成分ラニフィブラノール(Lanifibranor)は、培地内に1~1000μM、1~500μM、1~100μM、1~90μM、1~80μM、1~70μM、1~60μM、1~50μM、1~40μM、1~30μM、1~20μM、又は10μMの濃度で添加されてよいが、これに制限されるものではない。
本発明の前記各組成物が薬剤学的組成物である場合、本発明の薬剤学的組成物に含まれてよい薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。好適な薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)に詳細に記載されている。
本発明の薬剤学的組成物は、経口及び非経口で投与でき、例えば、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与、硬膜内投与、眼球投与、皮膚投与、及び経皮投与などで投与できる。
本発明の薬剤学的組成物の適度の投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び応答感度のような要因によって様々であり、熟練した通常の医師は、所望する治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方できる。本発明の一実施形態によれば、本発明の薬剤学的組成物の1日投与量は、0.0001~1000mg/kgである。
本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び/又は賦形剤を用いて処方され得る。本開示の組成物は、単位容量の形態に調製され得るか、或いは、複数回投与容器に含まれ得る。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。
本発明のさらに他の態様は、エキセンジン-4(Exendin-4)で前処理された幹細胞由来エクソソームに関する。
本発明のさらに他の態様は、ホルボール12-ミリステート13-酢酸(PMA)で前処理された幹細胞由来エクソソームに関する。
本発明のさらに他の態様は、インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)で前処理された幹細胞由来エクソソームに関する。
本発明のさらに他の態様は、テトランドリン(Tetrandrine)で前処理された幹細胞由来エクソソームに関する。
本発明のさらに他の態様は、ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)で前処理された幹細胞由来エクソソームに関する。
本発明のさらに他の態様は、P物質(Substance P)で前処理された幹細胞由来エクソソームに関する。
本発明のさらに他の態様は、レスベラトロール(Resveratrol)で前処理された幹細胞由来エクソソームに関する。
本発明のさらに他の態様は、ラニフィブラノール(Lanifibranor)で前処理された幹細胞由来エクソソームに関する。
前記本発明の各組成物及び前記幹細胞由来エクソソームに共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
本発明のさらに他の態様は、上述したエキセンジン-4(Exendin-4)を含む組成物、エキセンジン-4(Exendin-4)で前処理された幹細胞又はエキセンジン-4(Exendin-4)で前処理された幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤に関する。
本発明のさらに他の態様は、上述したホルボール12-ミリステート13-酢酸(PMA)を含む組成物、ホルボール12-ミリステート13-酢酸(PMA)で前処理された幹細胞又はホルボール12-ミリステート13-酢酸(PMA)で前処理された幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤に関する。
本発明のさらに他の態様は、上述したインターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)を含む組成物、インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)で前処理された幹細胞又はインターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)で前処理された幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤に関する。
本発明のさらに他の態様は、上述したテトランドリン(Tetrandrine)を含む組成物、テトランドリン(Tetrandrine)で前処理された幹細胞又はテトランドリン(Tetrandrine)で前処理された幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤に関する。
本発明のさらに他の態様は、上述したヒアルロン酸(Hyaluronic acid)を含む組成物、ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)で前処理された幹細胞又はヒアルロン酸(Hyaluronic acid)で前処理された幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤に関する。
本発明のさらに他の態様は、上述したP物質(Substance P)を含む組成物、P物質(Substance P)で前処理された幹細胞又はP物質(Substance P)で前処理された幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤に関する。
本発明のさらに他の態様は、上述したレスベラトロール(Resveratrol)を含む組成物、レスベラトロール(Resveratrol)で前処理された幹細胞又はレスベラトロール(Resveratrol)で前処理された幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤に関する。
本発明のさらに他の態様は、上述したラニフィブラノール(Lanifibranor)を含む組成物、ラニフィブラノール(Lanifibranor)で前処理された幹細胞又はラニフィブラノール(Lanifibranor)で前処理された幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤に関する。
本発明において“細胞治療剤”とは、細胞と組織の機能を復元させるために、生きている自家(autologous)、同種(allogenic)、異種(xenogenic)細胞を体外で増殖・選別したり、その他の方法で細胞の生物学的特性を変化させたりするなどの一連の行為により、治療、診断、及び予防の目的に用いられる医薬品を意味する。
このような細胞治療剤は、2種類に大別でき、その第一は、組織再生、臓器機能回復、又は免疫細胞の機能調節のための“幹細胞治療剤”であり、第二は、生体内免疫反応の抑制或いは免疫反応の亢進などの免疫反応調節のための“免疫細胞治療剤”である。
前記本発明の各組成物及びその構成成分エキセンジン-4(Exendin-4)、ホルボール12-ミリステート13-酢酸(Phorbol 12-myristate 13-acetate;PMA)、インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)、テトランドリン(Tetrandrine)、ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)、P物質(Substance P)、レスベラトロール(Resveratrol)又はラニフィブラノール(Lanifibranor)は、幹細胞の幹細胞能を増強させ、幹細胞由来エクソソームの生成を促進し、これにより、幹細胞の治療効能を強化させる効果を有するので、本明細書でいう“細胞治療剤”は、“幹細胞治療剤”を意味する。
前記幹細胞治療剤は、心筋梗塞、心不全などの循環器疾患、肝臓癌、胃癌、大腸癌、前立腺癌、膀胱癌、肺癌などの癌疾患、アトピー性皮膚炎、関節炎、自己免疫性脳脊髓炎、全身性エリテマトーデス、大腸炎、及び多発性硬化症のような炎症性疾患、並びに自己免疫性疾患などのそれを必要とする対象の疾患を治療する用途に用いられてよいが、これに制限されない。
前記幹細胞治療剤は、上述した本発明の各組成物と構成成分を共通とするので、これら両者に共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
本発明のさらに他の態様は、次の段階を含む幹細胞由来エクソソームの生産方法に関する。
a)エキセンジン-4(Exendin-4)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。
本発明のさらに他の態様は、次の段階を含む幹細胞由来エクソソームの生産方法に関する。
a)ホルボール12-ミリステート13-酢酸(PMA)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。
本発明のさらに他の態様は、次の段階を含む幹細胞由来エクソソームの生産方法に関する。
a)インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。
本発明のさらに他の態様は、次の段階を含む幹細胞由来エクソソームの生産方法に関する。
a)テトランドリン(Tetrandrine)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。
本発明のさらに他の態様は、次の段階を含む幹細胞由来エクソソームの生産方法に関する。
a)ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。
本発明のさらに他の態様は、次の段階を含む幹細胞由来エクソソームの生産方法に関する。
a)P物質(Substance P)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。
本発明のさらに他の態様は、次の段階を含む幹細胞由来エクソソームの生産方法に関する。
a)レスベラトロール(Resveratrol)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。
本発明のさらに他の態様は、次の段階を含む幹細胞由来エクソソームの生産方法に関する。
a)ラニフィブラノール(Lanifibranor)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。
前記方法は、次の段階をさらに含むことができる。
b)培養された幹細胞を洗浄した後、細胞培養培地でさらに培養する段階;及び
c)エクソソームを分離する段階。
以下、本発明の幹細胞由来エクソソームの生産方法について詳しく説明する。
a)段階
本段階は、幹細胞をエキセンジン-4(Exendin-4)、ホルボール12-ミリステート13-酢酸(PMA)、インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)、テトランドリン(Tetrandrine)、ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)、P物質(Substance P)、レスベラトロール(Resveratrol)又はラニフィブラノール(Lanifibranor)で前処理して幹細胞に刺激を加える過程である。本過程によって、幹細胞は、前記物質で前処理されていない幹細胞に比べてより多い数のエクソソームを生産し、エクソソーム内タンパク質及びRNAの含有量も増加する。
b)段階
本段階は、本発明に係る前記物質で前処理された幹細胞を洗浄して前記前処理物質を除去し、新しい細胞培養培地で培養することにより、幹細胞からエクソソームの分泌又は生産を誘導する過程である。前記a)段階の幹細胞前処理物質(エキセンジン-4)は、前記b)段階の洗浄過程によって除去され、洗浄後の幹細胞、幹細胞で生産されたエクソソーム又は培養培地内に残留しない。したがって、前記a)段階において本発明の幹細胞前処理物質で処理された幹細胞と幹細胞で生産されたエクソソーム及び培養培地は、上述した前処理物質の残留による影響無しで後続の研究又は疾病の治療目的に有用に利用可能である。
本段階の細胞培養培地は、エクソソームが除去されたウシ胎児血清(Fetal bovine serum)をさらに含む。前記細胞培養培地にエクソソームを除去したFBSを使用する理由は、通常使用するFBSにはウシ血清由来のエクソソームが非常に多く含まれているので、幹細胞が分泌するエクソソームの他にFBS由来エクソソームが混入することを防止するためである。
本段階の追加培養は、12時間~120時間、24時間~96時間、48時間~96時間、又は60時間~84時間、最も具体的には72時間培養されてよいが、これに制限されるものではない。
c)段階
本段階は、前記b)段階で追加培養した幹細胞の培養培地を、200~400×gで5~20分間遠心分離し、残っている細胞及び細胞残余物を除去した後、上清液を取って9,000~12,000×gで60~80分間高速遠心分離した後、再び上清液を取って90,000~120,000×gで80~100分間遠心分離し上清液を除去することにより、下層に残っているエクソソームを得ることができる。
本発明の具体例によれば、間葉系幹細胞培養培地を回収し、300×gで10分間遠心分離して残っている細胞及び細胞残余物を除去し、上清液を取って0.22μmフィルターを用いて濾過した後、高速遠心分離機(high speed centrifuge)を用いて10,000×g、4℃で70分間遠心分離する。遠心分離された上清液を再び取り、超遠心分離機(ultracentrifuge)を用いて100,000×g、4℃で90分間遠心分離して上清液を除去することにより、下層に残っているエクソソームを分離した。
本発明のさらに他の態様は、次の段階を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)を増強させる方法に関する。
a)エキセンジン-4(Exendin-4)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。
本発明のさらに他の態様は、次の段階を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)を増強させる方法に関する。
a)ホルボール12-ミリステート13-酢酸(PMA)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。
本発明のさらに他の態様は、次の段階を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)を増強させる方法に関する。
a)インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。
本発明のさらに他の態様は、次の段階を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)を増強させる方法に関する。
a)テトランドリン(Tetrandrine)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。
本発明のさらに他の態様は、次の段階を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)を増強させる方法に関する。
a)ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。
本発明のさらに他の態様は、次の段階を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)を増強させる方法に関する。
a)P物質(Substance P)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。
本発明のさらに他の態様は、次の段階を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)を増強させる方法に関する。
a)レスベラトロール(Resveratrol)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。
本発明のさらに他の態様は、次の段階を含む幹細胞の幹細胞能(Stemness)を増強させる方法に関する。
a)ラニフィブラノール(Lanifibranor)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。
前記幹細胞の幹細胞能を増強させる方法は、上述した本発明の幹細胞由来エクソソームの生産方法と共通の段階を有し、これら両者に共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
本発明のさらに他の態様は、エキセンジン-4(Exendin-4)を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途である。
本発明のさらに他の態様は、エキセンジン-4(Exendin-4)を含む組成物の幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用途である。
本発明のさらに他の態様は、ホルボール12-ミリステート13-酢酸(PMA)を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途である。
本発明のさらに他の態様は、ホルボール12-ミリステート13-酢酸(PMA)を含む組成物の幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用途である。
本発明のさらに他の態様は、インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途である。
本発明のさらに他の態様は、インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)を含む組成物の幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用途である。
本発明のさらに他の態様は、テトランドリン(Tetrandrine)を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途である。
本発明のさらに他の態様は、テトランドリン(Tetrandrine)を含む組成物の幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用途である。
本発明のさらに他の態様は、ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途である。
本発明のさらに他の態様は、ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)を含む組成物の幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用途である。
本発明のさらに他の態様は、P物質(Substance P)を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途である。
本発明のさらに他の態様は、P物質(Substance P)を含む組成物の幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用途である。
本発明のさらに他の態様は、レスベラトロール(Resveratrol)を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途である。
本発明のさらに他の態様は、レスベラトロール(Resveratrol)を含む組成物の幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用途である。
本発明のさらに他の態様は、ラニフィブラノール(Lanifibranor)含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途である。
本発明のさらに他の態様は、ラニフィブラノール(Lanifibranor)含む組成物の幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用途である。
本発明は、エキセンジン-4(Exendin-4)、ホルボール12-ミリステート13-酢酸(Phorbol 12-myristate 13-acetate;PMA)、インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)、テトランドリン(Tetrandrine)、ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)、P物質(Substance P)、レスベラトロール(Resveratrol)、及びラニフィブラノール(Lanifibranor)から選ばれる一つを含む幹細胞由来エクソソーム(Exosomes)生成促進及び幹細胞の機能強化用組成物に関する。本発明の組成物を幹細胞培養に用いる場合、幹細胞の幹細胞能及び幹細胞由来エクソソームの生産量が増加するので、より効率的に良質の幹細胞及び幹細胞由来エクソソームを生産できるところ、これを関連研究開発及び製品化に有用に用いることができる。
エキセンジン-4(Exendin-4)、ホルボール12-ミリステート13-酢酸(Phorbol 12-myristate 13-acetate;PMA)、インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)、テトランドリン(Tetrandrine)、ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)、P物質(Substance P)、レスベラトロール(Resveratrol)、及びラニフィブラノール(Lanifibranor)からなる群から選ばれる一つ以上を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物。
以下、本発明を下記の実施例によってより詳細に説明する。ただし、これらの実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例1.エキセンジン-4(Exendin-4)処理による幹細胞由来エクソソーム分離
エキセンジン-4前処理
エキセンジン-4 20nMが含まれた培養培地[高グルコースDMEM(Gibco,Cat no.11995-065);10%ウシ胎児血清(HyClone)、1% MEM非必須アミノ酸溶液(100×)(Gibco,Cat no.11140-050)]で、臍帯組織由来間葉系幹細胞(Primary Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells,ATCC No.PCS-500-010;Lot No.63822428)を1週間培養した。
追加培養
培養を完了した後、エキセンジン-4が前処理された間葉系幹細胞を洗浄し、エクソソームが除去されたウシ胎児血清(FBS)を10%添加した培養培地でさらに72時間培養した。エクソソームが除去されたFBSを使用する理由は、通常使用するFBSにはウシ血清由来のエクソソームが非常に多く含まれていることから、細胞が分泌するエクソソームの他にFBS由来エクソソームが混入することを防止するためである。
エクソソーム分離
72時間培養後に、前処理物質が処理された間葉系幹細胞培養培地を回収して300×gで10分間遠心分離し、残っている細胞及び細胞残余物を除去した。上清液を取って0.22μmフィルターを用いて濾過した後、高速遠心分離機(high speed centrifuge)を用いて10,000×g、4℃で70分間遠心分離した。遠心分離された上清液を再び取り、超遠心分離機(ultracentrifuge)を用いて100,000×g、4℃で90分間遠心分離し、上清液を除去した。下層に残っているエクソソームをPBS(phosphate bufferd salin)に希釈し、以降の実験に使用した。
実施例2.PMA処理による幹細胞由来エクソソーム分離
PMA前処理
PMA 10nMが含まれた培養培地[高グルコースDMEM(Gibco,Cat no.11995-065);10%ウシ胎児血清(HyClone)、1% MEM非必須アミノ酸溶液(100×)(Gibco,Cat no.11140-050)]で、臍帯組織由来間葉系幹細胞(Primary Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells,ATCC No.PCS-500-010;Lot No.63822428)を1週間培養した。
追加培養
培養を完了した後、PMAが前処理された間葉系幹細胞を洗浄し、エクソソームが除去されたウシ胎児血清(FBS)を10%添加した培養培地でさらに72時間培養した。エクソソームが除去されたFBSを使用する理由は、通常使用するFBSにはウシ血清由来のエクソソームが非常に多く含まれていることから、細胞が分泌するエクソソームの他にFBS由来エクソソームが混入することを防止するためである。
エクソソーム分離
72時間培養後に、前処理物質が処理された間葉系幹細胞培養培地を回収して300×gで10分間遠心分離し、残っている細胞及び細胞残余物を除去した。上清液を取って0.22μmフィルターを用いて濾過した後、高速遠心分離機(high speed centrifuge)を用いて10,000×g、4℃で70分間遠心分離した。遠心分離された上清液を再び取り、超遠心分離機(ultracentrifuge)を用いて100,000×g、4℃で90分間遠心分離し、上清液を除去した。下層に残っているエクソソームをPBS(phosphate bufferd salin)に希釈し、以降の実験に使用した。
実施例3.インターフェロン-γ(Interferon-γ)処理による幹細胞由来エクソソーム分離
インターフェロン-γ前処理
インターフェロン-γ 10ng/mLが含まれた培養培地[高グルコースDMEM(Gibco,Cat no.11995-065);10%ウシ胎児血清(HyClone)、1% MEM非必須アミノ酸溶液(100×)(Gibco,Cat no.11140-050)]で、臍帯組織由来間葉系幹細胞(Primary Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells,ATCC No.PCS-500-010;Lot No.63822428)を1週間培養した。
追加培養
培養を完了した後、インターフェロン-γが前処理された間葉系幹細胞を洗浄し、エクソソームが除去されたウシ胎児血清(FBS)を10%添加した培養培地でさらに72時間培養した。エクソソームが除去されたFBSを使用する理由は、通常使用するFBSにはウシ血清由来のエクソソームが非常に多く含まれていることから、細胞が分泌するエクソソームの他にFBS由来エクソソームが混入することを防止するためである。
エクソソーム分離
72時間培養後に、前処理物質が処理された間葉系幹細胞培養培地を回収して300×gで10分間遠心分離し、残っている細胞及び細胞残余物を除去した。上清液を取って0.22μmフィルターを用いて濾過した後、高速遠心分離機(high speed centrifuge)を用いて10,000×g、4℃で70分間遠心分離した。遠心分離された上清液を再び取り、超遠心分離機(ultracentrifuge)を用いて100,000×g、4℃で90分間遠心分離し、上清液を除去した。下層に残っているエクソソームをPBS(phosphate bufferd salin)に希釈し、以降の実験に使用した。
実施例4.テトランドリン(Tetrandrine)処理による幹細胞由来エクソソーム分離
テトランドリン前処理
テトランドリン10μMが含まれた培養培地[高グルコースDMEM(Gibco,Cat no.11995-065);10%ウシ胎児血清(HyClone)、1% MEM非必須アミノ酸溶液(100×)(Gibco,Cat no.11140-050)]で、臍帯組織由来間葉系幹細胞(Primary Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells,ATCC No.PCS-500-010;Lot No.63822428)を1週間培養した。
追加培養
培養を完了した後、テトランドリンが前処理された間葉系幹細胞を洗浄し、エクソソームが除去されたウシ胎児血清(FBS)を10%添加した培養培地でさらに72時間培養した。エクソソームが除去されたFBSを使用する理由は、通常使用するFBSにはウシ血清由来のエクソソームが非常に多く含まれていることから、細胞が分泌するエクソソームの他にFBS由来エクソソームが混入することを防止するためである。
エクソソーム分離
72時間培養後に、前処理物質が処理された間葉系幹細胞培養培地を回収して300×gで10分間遠心分離し、残っている細胞及び細胞残余物を除去した。上清液を取って0.22μmフィルターを用いて濾過した後、高速遠心分離機(high speed centrifuge)を用いて10,000×g、4℃で70分間遠心分離した。遠心分離された上清液を再び取り、超遠心分離機(ultracentrifuge)を用いて100,000×g、4℃で90分間遠心分離し、上清液を除去した。下層に残っているエクソソームをPBS(phosphate bufferd salin)に希釈し、以降の実験に使用した。
実施例5.ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)処理による幹細胞由来エクソソーム分離
ヒアルロン酸前処理
ヒアルロン酸10ug/mLが含まれた培養培地[高グルコースDMEM(Gibco,Cat no.11995-065);10%ウシ胎児血清(HyClone)、1% MEM非必須アミノ酸溶液(100×)(Gibco,Cat no.11140-050)]で、臍帯組織由来間葉系幹細胞(Primary Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells,ATCC No.PCS-500-010;Lot No.63822428)を1週間培養した。
追加培養
培養を完了した後、ヒアルロン酸が前処理された間葉系幹細胞を洗浄し、エクソソームが除去されたウシ胎児血清(FBS)を10%添加した培養培地でさらに72時間培養した。エクソソームが除去されたFBSを使用する理由は、通常使用するFBSにはウシ血清由来のエクソソームが非常に多く含まれていることから、細胞が分泌するエクソソームの他にFBS由来エクソソームが混入することを防止するためである。
エクソソーム分離
72時間培養後に、前処理物質が処理された間葉系幹細胞培養培地を回収して300×gで10分間遠心分離し、残っている細胞及び細胞残余物を除去した。上清液を取って0.22μmフィルターを用いて濾過した後、高速遠心分離機(high speed centrifuge)を用いて10,000×g、4℃で70分間遠心分離した。遠心分離された上清液を再び取り、超遠心分離機(ultracentrifuge)を用いて100,000×g、4℃で90分間遠心分離し、上清液を除去した。下層に残っているエクソソームをPBS(phosphate bufferd salin)に希釈し、以降の実験に使用した。
実施例6.P物質(Substance P)処理による幹細胞由来エクソソーム分離
P物質前処理
P物質30nMが含まれた培養培地[高グルコースDMEM(Gibco,Cat no.11995-065);10%ウシ胎児血清(HyClone)、1% MEM非必須アミノ酸溶液(100×)(Gibco,Cat no.11140-050)]で、臍帯組織由来間葉系幹細胞(Primary Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells,ATCC No.PCS-500-010;Lot No.63822428)を1週間培養した。
追加培養
培養を完了した後、P物質が前処理された間葉系幹細胞を洗浄し、エクソソームが除去されたウシ胎児血清(FBS)を10%添加した培養培地でさらに72時間培養した。エクソソームが除去されたFBSを使用する理由は、通常使用するFBSにはウシ血清由来のエクソソームが非常に多く含まれていることから、細胞が分泌するエクソソームの他にFBS由来エクソソームが混入することを防止するためである。
エクソソーム分離
72時間培養後に、前処理物質が処理された間葉系幹細胞培養培地を回収して300×gで10分間遠心分離し、残っている細胞及び細胞残余物を除去した。上清液を取って0.22μmフィルターを用いて濾過した後、高速遠心分離機(high speed centrifuge)を用いて10,000×g、4℃で70分間遠心分離した。遠心分離された上清液を再び取り、超遠心分離機(ultracentrifuge)を用いて100,000×g、4℃で90分間遠心分離し、上清液を除去した。下層に残っているエクソソームをPBS(phosphate bufferd salin)に希釈し、以降の実験に使用した。
実施例7.レスベラトロール(Resveratrol)処理による幹細胞由来エクソソーム分離
レスベラトロール前処理
レスベラトロール10nMが含まれた培養培地[高グルコースDMEM(Gibco,Cat no.11995-065);10%ウシ胎児血清(HyClone)、1% MEM非必須アミノ酸溶液(100×)(Gibco,Cat no.11140-050)]で、臍帯組織由来間葉系幹細胞(Primary Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells,ATCC No.PCS-500-010;Lot No.63822428)を1週間培養した。
追加培養
培養を完了した後、レスベラトロールが前処理された間葉系幹細胞を洗浄し、エクソソームが除去されたウシ胎児血清(FBS)を10%添加した培養培地でさらに72時間培養した。エクソソームが除去されたFBSを使用する理由は、通常使用するFBSにはウシ血清由来のエクソソームが非常に多く含まれていることから、細胞が分泌するエクソソームの他にFBS由来エクソソームが混入することを防止するためである。
エクソソーム分離
72時間培養後に、前処理物質が処理された間葉系幹細胞培養培地を回収して300×gで10分間遠心分離し、残っている細胞及び細胞残余物を除去した。上清液を取って0.22μmフィルターを用いて濾過した後、高速遠心分離機(high speed centrifuge)を用いて10,000×g、4℃で70分間遠心分離した。遠心分離された上清液を再び取り、超遠心分離機(ultracentrifuge)を用いて100,000×g、4℃で90分間遠心分離し、上清液を除去した。下層に残っているエクソソームをPBS(phosphate bufferd salin)に希釈し、以降の実験に使用した。
実施例8.ラニフィブラノール(Lanifibranor)処理による幹細胞由来エクソソーム分離
ラニフィブラノール前処理
ラニフィブラノール10μMが含まれた培養培地[高グルコースDMEM(Gibco,Cat no.11995-065);10%ウシ胎児血清(HyClone)、1% MEM非必須アミノ酸溶液(100×)(Gibco,Cat no.11140-050)]で、臍帯組織由来間葉系幹細胞(Primary Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells,ATCC No.PCS-500-010;Lot No.63822428)を1週間培養した。
追加培養
培養を完了した後、ラニフィブラノールが前処理された間葉系幹細胞を洗浄し、エクソソームが除去されたウシ胎児血清(FBS)を10%添加した培養培地でさらに72時間培養した。エクソソームが除去されたFBSを使用する理由は、通常使用するFBSにはウシ血清由来のエクソソームが非常に多く含まれていることから、細胞が分泌するエクソソームの他にFBS由来エクソソームが混入することを防止するためである。
エクソソーム分離
72時間培養後に、前処理物質が処理された間葉系幹細胞培養培地を回収して300×gで10分間遠心分離し、残っている細胞及び細胞残余物を除去した。上清液を取って0.22μmフィルターを用いて濾過した後、高速遠心分離機(high speed centrifuge)を用いて10,000×g、4℃で70分間遠心分離した。遠心分離された上清液を再び取り、超遠心分離機(ultracentrifuge)を用いて100,000×g、4℃で90分間遠心分離し、上清液を除去した。下層に残っているエクソソームをPBS(phosphate bufferd salin)に希釈し、以降の実験に使用した。
実験例1.エキセンジン-4処理による幹細胞機能強化
1-1.エキセンジン-4処理による幹細胞増殖率(Proliferation)の増加
100uL培養培地[高グルコースDMEM(Gibco,Cat no.11995-065)、10%ウシ胎児血清(HyClone)、1% MEM非必須アミノ酸溶液(100×)(Gibco,Cat no.11140-050)]が含まれた96ウェルプレートに、間葉系幹細胞及び前記実施例のエキセンジン-4で前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、ウェル当たりに3000細胞ずつ播種(seeding)した後、24時間、CO2培養器で培養した。その後、CCK溶液(10uL/ウェル)を添加し、CO2培養器(incubator)で4時間培養した後、450nm(420~480nm)波長で吸光度を測定し、増殖率を確認した。
図1から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[エキセンジン-4]を前処理した間葉系幹細胞の細胞増殖率が、1から3.4へと約340%増加した。
1-2.エキセンジン-4処理による幹細胞の幹細胞能(Stemness)の増強
10mL培養培地[高グルコースDMEM(Gibco,Cat no.11995-065)、10%ウシ胎児血清(HyClone)、1% MEM非必須アミノ酸溶液(100×)(Gibco,Cat no.11140-050)]が含まれた100mm細胞培養皿(dish)に、間葉系幹細胞及び前記実施例のエキセンジン-4で前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、皿当たりに1000細胞ずつ播種し、21日間培養した。培養された細胞が付着した皿をPBSで2回洗浄し、常温で、約2分間95%メタノールで固定した。固定された細胞をPBSで3回洗浄した後、0.5%クリスタルバイオレット溶液[crystal violet(sigma,C-3886,USA)5g、メタノール100ml]を添加して5分間染色し、水で洗浄後に室温で乾燥させた。各皿で50個以上の細胞で構成されたコロニーの数を計数して比較した。
図2A及び図2Bから確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞(28.6個)に比べて、幹細胞前処理物質[エキセンジン-4]を前処理した間葉系幹細胞の細胞(185個)のCFU-Fコロニー数が約647%増加した。
実験例2.エキセンジン-4処理によるエクソソーム生産効率の増加
2-1.エキセンジン-4処理によるエクソソーム数の増加
ナノパーティクルトラッキングアッセイ(NanoSight NS300,Malvern)により、前記実施例で分離されたエクソソーム数を確認した。このとき、比較のために、何ら前処理物質も処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームの数を確認した。結果を、下記の表1、図3及び図4に示す。
(MSC:未処理間葉系幹細胞、Exe4-MSC:エキセンジン-4処理間葉系幹細胞)
前記表1及び図4から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[エキセンジン-4]を前処理した間葉系幹細胞において約5.85倍多い数のエクソソームが生産された。
前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、間葉系幹細胞が生産するエクソソームの数が増加することが分かる。
2-2.エキセンジン-4処理によるエクソソーム由来タンパク質量の増加
エクソソームタンパク質分離キット(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen)を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームからタンパク質を分離し、ブラッドフォード分析(bradford analysis)を用いて595nmで吸光度を測定し、タンパク質を定量した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームからタンパク質を分離して定量した。結果を、下記の表2及び図5に示す。
(MSC:未処理間葉系幹細胞、Exe4-MSC:エキセンジン-4処理間葉系幹細胞)
前記表2及び図5から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[エキセンジン-4]を前処理した間葉系幹細胞において約5.4倍多い量のエクソソーム由来タンパク質が生産された。
前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、エクソソームの数の他に、エクソソーム由来タンパク質(exosomal protein)の含有量も増加することが分かる。
2-3.エキセンジン-4処理によるエクソソーム由来RNA量の増加
RNA分離用キット(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen)を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームから全エクソソームRNAを分離し、ナノドロップ(nanodrop)を用いてRNAの濃度を測定した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームから全エクソソームRNAを分離して濃度を測定した。結果を、下記の表3及び図6に示す。
(MSC:未処理間葉系幹細胞、Exe4-MSC:エキセンジン-4処理間葉系幹細胞)
前記表3及び図6から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[エキセンジン-4]を前処理した間葉系幹細胞において約5.6倍多い量のエクソソーム由来RNAが生産された。
前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、エクソソームの数の他に、エクソソーム由来RNA(exosomal RNA)の含有量も増加することが分かる。
実験例3.PMA処理による幹細胞機能強化
3-1.PMA処理による幹細胞増殖率(Proliferation)の増加
100uL培養培地[高グルコースDMEM(Gibco,Cat no.11995-065)、10%ウシ胎児血清(HyClone)、1% MEM非必須アミノ酸溶液(100×)(Gibco,Cat no.11140-050)]が含まれた96ウェルプレートに、間葉系幹細胞及び前記実施例のPMAで前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、ウェル当たりに3000細胞ずつ播種(seeding)した後、24時間、CO2培養器で培養した。その後、CCK溶液(10uL/ウェル)を添加し、CO2培養器(incubator)で4時間培養した後、450nm(420~480nm)波長で吸光度を測定し、増殖率を確認した。
図7から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[PMA]を前処理した間葉系幹細胞の細胞増殖率が、1から2.2へと約220%増加した。
3-2.PMA処理による幹細胞の幹細胞能(Stemness)の増強
10mL培養培地[高グルコースDMEM(Gibco,Cat no.11995-065)、10%ウシ胎児血清(HyClone)、1% MEM非必須アミノ酸溶液(100×)(Gibco,Cat no.11140-050)]が含まれた100mm細胞培養皿(dish)に、間葉系幹細胞及び前記実施例のPMAで前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、皿当たりに1000細胞ずつ播種して21日間培養した。培養された細胞が付着した皿をPBSで2回洗浄し、常温で、約2分間95%メタノールで固定した。固定された細胞をPBSで3回洗浄した後、0.5%クリスタルバイオレット溶液[crystal violet(sigma,C-3886,USA)5g、メタノール100ml]を添加して5分間染色し、水で洗浄後に室温で乾燥させた。各皿で50個以上の細胞で構成されたコロニーの数を計数して比較した。
図8A及び図8Bから確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞(28.6個)に比べて、幹細胞前処理物質[PMA]を前処理した間葉系幹細胞の細胞(285.7個)のCFU-Fコロニー数が約996.5%増加した。
実験例4.PMA処理によるエクソソーム生産効率の増加
4-1.PMA処理によるエクソソーム数の増加
ナノパーティクルトラッキングアッセイ(NanoSight NS300,Malvern)により、前記実施例で分離されたエクソソーム数を確認した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームの数を確認した。結果を、下記の表4、図9及び図10に示す。
(MSC:未処理間葉系幹細胞、PMA MSC:PMA処理間葉系幹細胞)
前記表4及び図10から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[PMA]を前処理した間葉系幹細胞において約5.2倍多い数のエクソソームが生産された。
前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、間葉系幹細胞が生産するエクソソームの数が増加することが分かる。
4-2.PMA処理によるエクソソーム由来タンパク質量の増加
エクソソームタンパク質分離キット(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen)を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームからタンパク質を分離し、ブラッドフォード分析(bradford analysis)を用いて595nmで吸光度を測定し、タンパク質を定量した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームからタンパク質を分離して定量した。結果を、下記の表5及び図11に示す。
(MSC:未処理間葉系幹細胞、PMA MSC:PMA処理間葉系幹細胞)
前記表5及び図11から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[PMA]を前処理した間葉系幹細胞において約5倍多い量のエクソソーム由来タンパク質が生産された。
前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、エクソソームの数の他に、エクソソーム由来タンパク質(exosomal protein)の含有量も増加することが分かる。
4-3.PMA処理によるエクソソーム由来RNA量の増加
RNA分離用キット(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen)を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームから全エクソソームRNAを分離し、ナノドロップ(nanodrop)を用いてRNAの濃度を測定した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームから全エクソソームRNAを分離して濃度を測定した。結果を、下記の表6及び図12に示す。
(MSC:未処理間葉系幹細胞、PMA MSC:PMA処理間葉系幹細胞)
前記表6及び図12から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[PMA]を前処理した間葉系幹細胞において約4倍多い量のエクソソーム由来RNAが生産された。
前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、エクソソームの数の他に、エクソソーム由来RNA(exosomal RNA)の含有量も増加することが分かる。
実験例5.インターフェロン-γ処理による幹細胞機能強化
5-1.インターフェロン-γ処理による幹細胞増殖率(Proliferation)の増加
100uL培養培地[高グルコースDMEM(Gibco,Cat no.11995-065)、10%ウシ胎児血清(HyClone)、1% MEM非必須アミノ酸溶液(100×)(Gibco,Cat no.11140-050)]が含まれた96ウェルプレートに、間葉系幹細胞及び前記実施例のインターフェロン-γで前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、ウェル当たりに3000細胞ずつ播種(seeding)した後、24時間、CO2培養器で培養した。その後、CCK溶液(10uL/ウェル)を添加し、CO2培養器(incubator)で4時間培養した後、450nm(420~480nm)波長で吸光度を測定し、増殖率を確認した。
図13から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[インターフェロン-γ]を前処理した間葉系幹細胞の細胞増殖率が、1から2.42へと約242%増加した。
5-2.インターフェロン-γ処理による幹細胞の幹細胞能(Stemness)の増強
10mL培養培地[高グルコースDMEM(Gibco,Cat no.11995-065)、10%ウシ胎児血清(HyClone)、1% MEM非必須アミノ酸溶液(100×)(Gibco,Cat no.11140-050)]が含まれた100mm細胞培養皿(dish)に、間葉系幹細胞及び前記実施例のインターフェロン-γで前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、皿当たりに1000細胞ずつ播種して21日間培養した。培養された細胞が付着した皿をPBSで2回洗浄し、常温で、約2分間95%メタノールで固定した。固定された細胞をPBSで3回洗浄した後、0.5%クリスタルバイオレット溶液[crystal violet(sigma,C-3886,USA)5g、メタノール100ml]を添加して5分間染色し、水で洗浄後に室温で乾燥させた。各皿で50個以上の細胞で構成されたコロニーの数を計数して比較した。
図14A及び図14Bから確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞(28.6個)に比べて、幹細胞前処理物質[インターフェロン-γ]を前処理した間葉系幹細胞の細胞(136個)のCFU-Fコロニー数が約476%増加した。
実験例6.インターフェロン-γ処理によるエクソソーム生産効率の増加
6-1.インターフェロン-γ処理によるエクソソーム数の増加
ナノパーティクルトラッキングアッセイ(NanoSight NS300,Malvern)により、前記実施例で分離されたエクソソーム数を確認した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームの数を確認した。結果を、下記の表7、図15及び図16に示す。
(MSC:未処理間葉系幹細胞、IFNγ MSC:インターフェロン-γ処理間葉系幹細胞)
前記表7及び図16から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[インターフェロン-γ]を前処理した間葉系幹細胞において約6.7倍多い数のエクソソームが生産された。
前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、間葉系幹細胞が生産するエクソソームの数が増加することが分かる。
6-2.インターフェロン-γ処理によるエクソソーム由来タンパク質量の増加
エクソソームタンパク質分離キット(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen)を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームからタンパク質を分離し、ブラッドフォード分析(bradford analysis)を用いて595nmで吸光度を測定し、タンパク質を定量した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームからタンパク質を分離して定量した。結果を、下記の表8及び図17に示す。
(MSC:未処理間葉系幹細胞、IFNγ MSC:インターフェロン-γ処理間葉系幹細胞)
前記表8及び図17から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[インターフェロン-γ]を前処理した間葉系幹細胞において約6.2倍多い量のエクソソーム由来タンパク質が生産された。
前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、エクソソームの数の他に、エクソソーム由来タンパク質(exosomal protein)の含有量も増加することが分かる。
6-3.インターフェロン-γ処理によるエクソソーム由来RNA量の増加
RNA分離用キット(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen)を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームから全エクソソームRNAを分離し、ナノドロップ(nanodrop)を用いてRNAの濃度を測定した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームから全エクソソームRNAを分離して濃度を測定した。結果を、下記の表9及び図18に示す。
(MSC:未処理間葉系幹細胞、IFNγ MSC:インターフェロン-γ処理間葉系幹細胞)
前記表9及び図18から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[インターフェロン-γ]を前処理した間葉系幹細胞において約5.0倍多い量のエクソソーム由来RNAが生産された。
前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞処理すると、エクソソームの数の他に、エクソソーム由来RNA(exosomal RNA)の含有量も増加することが分かる。
実験例7.テトランドリン処理による幹細胞機能強化
7-1.テトランドリン処理による幹細胞増殖率(Proliferation)の増加
100uL培養培地[高グルコースDMEM(Gibco,Cat no.11995-065)、10%ウシ胎児血清(HyClone)、1% MEM非必須アミノ酸溶液(100×)(Gibco,Cat no.11140-050)]が含まれた96ウェルプレートに、間葉系幹細胞及び前記実施例のテトランドリンで前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、ウェル当たりに3000細胞ずつ播種(seeding)した後、24時間、CO2培養器で培養した。その後、CCK溶液(10uL/ウェル)を添加し、CO2培養器(incubator)で4時間培養した後、450nm(420~480nm)波長で吸光度を測定し、増殖率を確認した。
図19から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[テトランドリン]を前処理した間葉系幹細胞の細胞増殖率が、1から2.6へと約260%増加した。
7-2.テトランドリン処理による幹細胞の幹細胞能(Stemness)の増強
10mL培養培地[高グルコースDMEM(Gibco,Cat no.11995-065)、10%ウシ胎児血清(HyClone)、1% MEM非必須アミノ酸溶液(100×)(Gibco,Cat no.11140-050)]が含まれた100mm細胞培養皿(dish)に、間葉系幹細胞及び前記実施例のテトランドリンで前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、皿当たりに1000細胞ずつ接種して21日間培養した。培養された細胞が付着した皿をPBSで2回洗浄し、常温で、約2分間95%メタノールで固定した。固定された細胞をPBSで3回洗浄した後、0.5%クリスタルバイオレット溶液[crystal violet(sigma,C-3886,USA)5g、メタノール100ml]を添加して5分間染色し、水で洗浄後に室温で乾燥させた。各皿で50個以上の細胞で構成されたコロニーの数を計数して比較した。
図20A及び図20Bから確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞(28.7個)に比べて、幹細胞前処理物質[テトランドリン]を前処理した間葉系幹細胞の細胞(121.3個)のCFU-Fコロニー数が約423%増加した。
実験例8.テトランドリン処理によるエクソソーム生産効率の増加
8-1.テトランドリン処理によるエクソソーム数の増加
ナノパーティクルトラッキングアッセイ(NanoSight NS300,Malvern)により、前記実施例で分離されたエクソソーム数を確認した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームの数を確認した。結果を、下記の表10、図21及び図22に示す。
(MSC:未処理間葉系幹細胞、Tet MSC:テトランドリン処理間葉系幹細胞)
前記表10及び図22から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[テトランドリン]を前処理した間葉系幹細胞において約4.3倍多い数のエクソソームが生産された。
前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、間葉系幹細胞が生産するエクソソームの数が増加することが分かる。
8-2.テトランドリン処理によるエクソソーム由来タンパク質量の増加
エクソソームタンパク質分離キット(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen)を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームからタンパク質を分離し、ブラッドフォード分析(bradford analysis)を用いて595nmで吸光度を測定し、タンパク質を定量した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームからタンパク質を分離して定量した。結果を、下記の表11及び図23に示す。
(MSC:未処理間葉系幹細胞、Tet MSC:テトランドリン処理間葉系幹細胞)
前記表11及び図23から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[テトランドリン]を前処理した間葉系幹細胞において約4.5倍多い量のエクソソーム由来タンパク質が生産された。
前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、エクソソームの数の他に、エクソソーム由来タンパク質(exosomal protein)の含有量も増加することが分かる。
8-3.テトランドリン処理によるエクソソーム由来RNA量の増加
RNA分離用キット(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen)を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームから全エクソソームRNAを分離し、ナノドロップ(nanodrop)を用いてRNAの濃度を測定した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームから全エクソソームRNAを分離して濃度を測定した。結果を、下記の表12及び図24に示す。
(MSC:未処理間葉系幹細胞、Tet MSC:テトランドリン処理間葉系幹細胞)
前記表12及び図24から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[テトランドリン]を前処理した間葉系幹細胞において約4.4倍多い量のエクソソーム由来RNAが生産された。
前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、エクソソームの数の他に、エクソソーム由来RNA(exosomal RNA)の含有量も増加することが分かる。
実験例9.ヒアルロン酸処理による幹細胞機能強化
9-1.ヒアルロン酸処理による幹細胞増殖率(Proliferation)の増加
100uL培養培地[高グルコースDMEM(Gibco,Cat no.11995-065)、10%ウシ胎児血清(HyClone)、1% MEM非必須アミノ酸溶液(100×)(Gibco,Cat no.11140-050)]が含まれた96ウェルプレートに、間葉系幹細胞及び前記実施例のヒアルロン酸で前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、ウェル当たりに3000細胞ずつ播種(seeding)した後、24時間、CO2培養器で培養した。その後、CCK溶液(10uL/ウェル)を添加し、CO2培養器(incubator)で4時間培養した後、450nm(420~480nm)波長で吸光度を測定し、増殖率を確認した。
図25から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[ヒアルロン酸]を前処理した間葉系幹細胞の細胞増殖率が、1から3.6へと約364%増加した。
9-2.ヒアルロン酸処理による幹細胞の幹細胞能(Stemness)の増強
10mL培養培地[高グルコースDMEM(Gibco,Cat no.11995-065)、10%ウシ胎児血清(HyClone)、1% MEM非必須アミノ酸溶液(100×)(Gibco,Cat no.11140-050)]が含まれた100mm細胞培養皿(dish)に、間葉系幹細胞及び前記実施例のヒアルロン酸で前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、皿当たりに1000細胞ずつ播種して21日間培養した。培養された細胞が付着した皿をPBSで2回洗浄し、常温で、約2分間95%メタノールで固定した。固定された細胞をPBSで3回洗浄した後、0.5%クリスタルバイオレット溶液[crystal violet(sigma,C-3886,USA)5g、メタノール100ml]を添加して5分間染色し、水で洗浄後に室温で乾燥させた。各皿で50個以上の細胞で構成されたコロニーの数を計数して比較した。
図26A及び図26Bから確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞(28.6個)に比べて、幹細胞前処理物質[ヒアルロン酸]を前処理した間葉系幹細胞の細胞(167.6個)のCFU-Fコロニー数が約586%増加した。
実験例10.ヒアルロン酸処理によるエクソソーム生産効率の増加
10-1.ヒアルロン酸処理によるエクソソーム数の増加
ナノパーティクルトラッキングアッセイ(NanoSight NS300,Malvern)により、前記実施例で分離されたエクソソーム数を確認した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームの数を確認した。結果を、下記の表13、図27及び図28に示す。
(MSC:未処理間葉系幹細胞、HA MSC:ヒアルロン酸処理間葉系幹細胞)
前記表13及び図28から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[ヒアルロン酸]を前処理した間葉系幹細胞において約5.2倍多い数のエクソソームが生産された。
前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理時に、間葉系幹細胞が生産するエクソソームの数が増加することが分かる。
10-2.ヒアルロン酸処理によるエクソソーム由来タンパク質量の増加
エクソソームタンパク質分離キット(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen)を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームからタンパク質を分離し、ブラッドフォード分析(bradford analysis)を用いて595nmで吸光度を測定し、タンパク質を定量した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームからタンパク質を分離して定量した。結果を、下記の表14及び図29に示す。
(MSC:未処理間葉系幹細胞、HA MSC:ヒアルロン酸処理間葉系幹細胞)
前記表14及び図29から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[ヒアルロン酸]を前処理した間葉系幹細胞において約5.35倍多い量のエクソソーム由来タンパク質が生産された。
前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、エクソソームの数の他に、エクソソーム由来タンパク質(exosomal protein)の含有量も増加することが分かる。
10-3.ヒアルロン酸処理によるエクソソーム由来RNA量の増加
RNA分離用キット(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen)を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームから全エクソソームRNAを分離し、ナノドロップ(nanodrop)を用いてRNAの濃度を測定した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームから全エクソソームRNAを分離して濃度を測定した。結果を、下記の表15及び図30に示す。
(MSC:未処理間葉系幹細胞、HA MSC:ヒアルロン酸処理間葉系幹細胞)
前記表15及び図30から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[ヒアルロン酸]を前処理した間葉系幹細胞において約5.3倍多い量のエクソソーム由来RNAが生産された。
前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、エクソソームの数の他に、エクソソーム由来RNA(exosomal RNA)の含有量も増加することが分かる。
実験例11.P物質処理による幹細胞機能強化
11-1.P物質処理による幹細胞増殖率(Proliferation)の増加
100uL培養培地[高グルコースDMEM(Gibco,Cat no.11995-065)、10%ウシ胎児血清(HyClone)、1% MEM非必須アミノ酸溶液(100×)(Gibco,Cat no.11140-050)]が含まれた96ウェルプレートに、間葉系幹細胞及び前記実施例のP物質で前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、ウェル当たりに3000細胞ずつ播種(seeding)した後、24時間、CO2培養器で培養した。その後、CCK溶液(10uL/ウェル)を添加し、CO2培養器(incubator)で4時間培養した後、450nm(420~480nm)波長で吸光度を測定し、増殖率を確認した。
図31から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[P物質]を前処理した間葉系幹細胞の細胞増殖率が、1から2.9へと約290%増加した。
11-2.P物質処理による幹細胞の幹細胞能(Stemness)の増強
10mL培養培地[高グルコースDMEM(Gibco,Cat no.11995-065)、10%ウシ胎児血清(HyClone)、1% MEM非必須アミノ酸溶液(100×)(Gibco,Cat no.11140-050)]が含まれた100mm細胞培養皿(dish)に、間葉系幹細胞及び前記実施例のP物質で前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、皿当たりに1000細胞ずつ播種して21日間培養した。培養された細胞が付着した皿をPBSで2回洗浄し、常温で、約2分間95%メタノールで固定した。固定された細胞をPBSで3回洗浄した後、0.5%クリスタルバイオレット溶液[crystal violet(sigma,C-3886,USA)5g、メタノール100ml]を添加して5分間染色し、水で洗浄後に室温で乾燥させた。各皿で50個以上の細胞で構成されたコロニーの数を計数して比較した。
図32A及び図32Bから確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞(28.7個)に比べて、幹細胞前処理物質[P物質]を前処理した間葉系幹細胞の細胞(116個)のCFU-Fコロニー数が約404%増加した。
実験例12.P物質処理によるエクソソーム生産効率の増加
12-1.P物質処理によるエクソソーム数の増加
ナノパーティクルトラッキングアッセイ(NanoSight NS300,Malvern)により、前記実施例で分離されたエクソソーム数を確認した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームの数を確認した。結果を、下記の表16、図33及び図34に示す。
(MSC:未処理間葉系幹細胞、SubsP MSC:P物質処理間葉系幹細胞)
前記表16及び図34から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[P物質]を前処理した間葉系幹細胞において約4.3倍多い数のエクソソームが生産された。
前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、間葉系幹細胞が生産するエクソソームの数が増加することが分かる。
12-2.P物質処理によるエクソソーム由来タンパク質量の増加
エクソソームタンパク質分離キット(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen)を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームからタンパク質を分離し、ブラッドフォード分析(bradford analysis)を用いて595nmで吸光度を測定し、タンパク質を定量した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームからタンパク質を分離して定量した。結果を、下記の表17及び図35に示す。
(MSC:未処理間葉系幹細胞、SubsP MSC:P物質処理間葉系幹細胞)
前記表17及び図35から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[P物質]を前処理した間葉系幹細胞において約5.2倍多い量のエクソソーム由来タンパク質が生産された。
前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、エクソソームの数の他に、エクソソーム由来タンパク質(exosomal protein)の含有量も増加することが分かる。
12-3.P物質処理によるエクソソーム由来RNA量の増加
RNA分離用キット(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen)を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームから全エクソソームRNAを分離し、ナノドロップ(nanodrop)を用いてRNAの濃度を測定した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームから全エクソソームRNAを分離して濃度を測定した。結果を、下記の表18及び図36に示す。
(MSC:未処理間葉系幹細胞、SubsP MSC:P物質処理間葉系幹細胞)
前記表18及び図36から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[P物質]を前処理した間葉系幹細胞において約4.9倍多い量のエクソソーム由来RNAが生産された。
前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、エクソソームの数の他に、エクソソーム由来RNA(exosomal RNA)の含有量も増加することが分かる。
実験例13.レスベラトロール処理による幹細胞機能強化
13-1.レスベラトロール処理による幹細胞増殖率(Proliferation)の増加
100uL培養培地[高グルコースDMEM(Gibco,Cat no.11995-065)、10%ウシ胎児血清(HyClone)、1% MEM非必須アミノ酸溶液(100×)(Gibco,Cat no.11140-050)]が含まれた96ウェルプレートに、間葉系幹細胞及び前記実施例のレスベラトロールで前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、ウェル当たりに3000細胞ずつ播種(seeding)した後、24時間、CO2培養器で培養した。その後、CCK溶液(10uL/ウェル)を添加し、CO2培養器(incubator)で4時間培養した後、450nm(420~480nm)波長で吸光度を測定し、増殖率を確認した。
図37から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[レスベラトロール]を前処理した間葉系幹細胞の細胞増殖率が、1から3.22へと約322%増加した。
13-2.レスベラトロール処理による幹細胞の幹細胞能(Stemness)の増強
10mL培養培地[高グルコースDMEM(Gibco,Cat no.11995-065)、10%ウシ胎児血清(HyClone)、1% MEM非必須アミノ酸溶液(100×)(Gibco,Cat no.11140-050)]が含まれた100mm細胞培養皿(dish)に、間葉系幹細胞及び前記実施例のレスベラトロールで前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、皿当たりに1000細胞ずつ播種して21日間培養した。培養された細胞が付着した皿をPBSで2回洗浄し、常温で、約2分間95%メタノールで固定した。固定された細胞をPBSで3回洗浄した後、0.5%クリスタルバイオレット溶液[crystal violet(sigma,C-3886,USA)5g、メタノール100ml]を添加して5分間染色し、水で洗浄後に室温で乾燥させた。各皿で50個以上の細胞で構成されたコロニーの数を計数して比較した。
図38A及び図38Bから確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞(28.6個)に比べて、幹細胞前処理物質[レスベラトロール]を前処理した間葉系幹細胞の細胞(311個)のCFU-Fコロニー数が約1087%増加した。
実験例14.レスベラトロール処理によるエクソソーム生産効率の増加
14-1.レスベラトロール処理によるエクソソーム数の増加
ナノパーティクルトラッキングアッセイ(NanoSight NS300,Malvern)により、前記実施例で分離されたエクソソーム数を確認した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームの数を確認した。結果を、下記の表19、図39及び図40に示す。
(MSC:未処理間葉系幹細胞、Resv MSC:レスベラトロール処理間葉系幹細胞)
前記表19及び図40から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[レスベラトロール]を前処理した間葉系幹細胞において約5.2倍多い数のエクソソームが生産された。
前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、間葉系幹細胞が生産するエクソソームの数が増加することが分かる。
14-2.レスベラトロール処理によるエクソソーム由来タンパク質量の増加
エクソソームタンパク質分離キット(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen)を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームからタンパク質を分離し、ブラッドフォード分析(bradford analysis)を用いて595nmで吸光度を測定し、タンパク質を定量した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームからタンパク質を分離して定量した。結果を、下記の表20及び図41に示す。
(MSC:未処理間葉系幹細胞、Resv MSC:レスベラトロール処理間葉系幹細胞)
前記表20及び図41から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[レスベラトロール]を前処理した間葉系幹細胞において約5.4倍多い量のエクソソーム由来タンパク質が生産された。
前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、エクソソームの数の他に、エクソソーム由来タンパク質(exosomal protein)の含有量も増加することが分かる。
14-3.レスベラトロール処理によるエクソソーム由来RNA量の増加
RNA分離用キット(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen)を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームから全エクソソームRNAを分離し、ナノドロップ(nanodrop)を用いてRNAの濃度を測定した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームから全エクソソームRNAを分離して濃度を測定した。結果を、下記の表21及び図42に示す。
(MSC:未処理間葉系幹細胞、Resv MSC:レスベラトロール処理間葉系幹細胞)
前記表21及び図42から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[レスベラトロール]を前処理した間葉系幹細胞において約4.7倍多い量のエクソソーム由来RNAが生産された。
前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、エクソソームの数の他に、エクソソーム由来RNA(exosomal RNA)の含有量も増加することが分かる。
実験例15.ラニフィブラノール処理による幹細胞機能強化
15-1.ラニフィブラノール処理による幹細胞増殖率(Proliferation)の増加
100uL培養培地[高グルコースDMEM(Gibco,Cat no.11995-065)、10%ウシ胎児血清(HyClone)、1% MEM非必須アミノ酸溶液(100×)(Gibco,Cat no.11140-050)]が含まれた96ウェルプレートに、間葉系幹細胞及び前記実施例のラニフィブラノールで前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、ウェル当たりに3000細胞ずつ播種(seeding)した後、24時間、CO2培養器で培養した。その後、CCK溶液(10uL/ウェル)を添加し、CO2培養器(incubator)で4時間培養した後、450nm(420~480nm)波長で吸光度を測定し、増殖率を確認した。
図43から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[ラニフィブラノール]を前処理した間葉系幹細胞の細胞増殖率が、1から1.81へと約181%増加した。
15-2.ラニフィブラノール処理による幹細胞の幹細胞能(Stemness)の増強
10mL培養培地[高グルコースDMEM(Gibco,Cat no.11995-065)、10%ウシ胎児血清(HyClone)、1% MEM非必須アミノ酸溶液(100×)(Gibco,Cat no.11140-050)]が含まれた100mm細胞培養皿(dish)に、間葉系幹細胞及び前記実施例のラニフィブラノールで前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、皿当たりに1000細胞ずつ播種して21日間培養した。培養された細胞が付着した皿をPBSで2回洗浄し、常温で、約2分間95%メタノールで固定した。固定された細胞をPBSで3回洗浄した後、0.5%クリスタルバイオレット溶液[crystal violet(sigma,C-3886,USA)5g、メタノール100ml]を添加して5分間染色し、水で洗浄後に室温で乾燥させた。各皿で50個以上の細胞で構成されたコロニーの数を計数して比較した。
図44A及び図44Bから確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞(40個)に比べて、幹細胞前処理物質[ラニフィブラノール]を前処理した間葉系幹細胞の細胞(56.7個)のCFU-Fコロニー数が約142%増加した。
実験例16.ラニフィブラノール処理によるエクソソーム生産効率の増加
16-1.ラニフィブラノール処理によるエクソソーム数の増加
ナノパーティクルトラッキングアッセイ(NanoSight NS300,Malvern)により、前記実施例で分離されたエクソソーム数を確認した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームの数を確認した。結果を、下記の表22、図45及び図46に示す。
(MSC:未処理間葉系幹細胞、Lani-MSC-Exo:ラニフィブラノール処理間葉系幹細胞)
前記表22及び図46から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[ラニフィブラノール]を前処理した間葉系幹細胞において約4.95倍多い数のエクソソームが生産された。
前記表22及び図46から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[ラニフィブラノール]を前処理した間葉系幹細胞において約4.95倍多い数のエクソソームが生産された。
前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、間葉系幹細胞が生産するエクソソームの数が増加することが分かる。
16-2.ラニフィブラノール処理によるエクソソーム由来タンパク質量の増加
エクソソームタンパク質分離キット(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen)を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームからタンパク質を分離し、ブラッドフォード分析(bradford analysis)を用いて595nmで吸光度を測定し、タンパク質を定量した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームからタンパク質を分離して定量した。結果を、下記の表23及び図47に示す。
(MSC:未処理間葉系幹細胞、Lani-MSC-Exo:ラニフィブラノール処理間葉系幹細胞)
前記表23及び図47から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質[ラニフィブラノール]を前処理した間葉系幹細胞において約4.6倍多い量のエクソソーム由来タンパク質が生産された。
前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、エクソソームの数の他に、エクソソーム由来タンパク質(exosomal protein)の含有量も増加することが分かる。
16-3.ラニフィブラノール処理によるエクソソーム由来RNA量の増加
RNA分離用キット(Total exosome RNA and protein isolation kit,Invitrogen)を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームから全エクソソームRNAを分離し、ナノドロップ(nanodrop)を用いてRNAの濃度を測定した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームから全エクソソームRNAを分離して濃度を測定した。結果を、下記の表24及び図48に示す。
(MSC:未処理間葉系幹細胞、Lani-MSC-Exo:ラニフィブラノール処理間葉系幹細胞)
前記表24及び図48から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質(ラニフィブラノール)を前処理した間葉系幹細胞において約4.1倍多い量のエクソソーム由来RNAが生産された。
前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、エクソソームの数の他に、エクソソーム由来RNA(exosomal RNA)の含有量も増加することが分かる。
結び
本発明に係る幹細胞前処理物質(エキセンジン-4(Exendin-4)、ホルボール12-ミリステート13-酢酸(Phorbol 12-myristate 13-acetate;PMA)、インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)、テトランドリン(Tetrandrine)、ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)、P物質(Substance P)、レスベラトロール(Resveratrol)又はラニフィブラノール(Lanifibranor))を間葉系幹細胞に処理すると、幹細胞の幹細胞能(Stemness)が増加することが分かる。また、本発明に係る幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、エクソソームの数の他に、エクソソーム由来タンパク質(exosomal protein)の生産量も、エクソソーム由来RNA(exosomal RNA)の含有量も増加することが分かる。
したがって、本発明に係る幹細胞前処理物質(エキセンジン-4(Exendin-4)、ホルボール12-ミリステート13-酢酸(Phorbol 12-myristate 13-acetate;PMA)、インターフェロン-ガンマ(Interferon-γ)、テトランドリン(Tetrandrine)、ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)、P物質(Substance P)、レスベラトロール(Resveratrol)又はラニフィブラノール(Lanifibranor))は、幹細胞の幹細胞能を増強させる他に、幹細胞由来エクソソーム生成も促進させるので、優れた機能性を有する幹細胞の生産及びエクソソームの大量生産用途への使用が期待される。
本発明は、幹細胞由来エクソソーム生成促進及び幹細胞能増強用組成物に関する。
Claims (12)
- ラニフィブラノール(Lanifibranor)を含むことを特徴とする幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物。
- 前記幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、又は人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell;iPSC)である、請求項1に記載の幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物。
- 前記成体幹細胞は、ヒト若しくは動物組織起源の成体幹細胞、ヒト若しくは動物組織由来の間葉系幹細胞(mesenchymal stromal cell)、又はヒト若しくは動物組織起源の人工多能性幹細胞から由来した間葉系幹細胞である、請求項2に記載の幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物。
- 前記ヒト若しくは動物組織は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、及び胎盤からなる群から選ばれる、請求項3に記載の幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物。
- 前記ヒト若しくは動物組織起源の成体幹細胞は、造血幹細胞、乳腺幹細胞、腸幹細胞、血管内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚神経幹細胞、及び精巣幹細胞からなる群から選ばれる、請求項3に記載の幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物。
- ラニフィブラノール(Lanifibranor)を含むことを特徴とする幹細胞の幹細胞能(Stemness)増強用組成物。
- ラニフィブラノール(Lanifibranor)で前処理されたことを特徴とする幹細胞由来エクソソーム。
- 次の段階を含むことを特徴とする幹細胞由来エクソソームの生産方法:
ラニフィブラノール(Lanifibranor)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。 - 次の段階をさらに含む、請求項8に記載の幹細胞由来エクソソームの生産方法:
培養された幹細胞を洗浄した後、細胞培養培地でさらに培養する段階;及び
エクソソームを分離する段階。 - 前記細胞培養培地は、エクソソームが除去されたウシ胎児血清(Fetal bovine serum)を含む、請求項8に記載の幹細胞由来エクソソームの生産方法。
- 次の段階を含むことを特徴とする幹細胞の幹細胞能(Stemness)を増強させる方法:
ラニフィブラノール(Lanifibranor)を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。 - 前記幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、又は人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell;iPSC)である、請求項8に記載の幹細胞由来エクソソームの生産方法。
Applications Claiming Priority (18)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2019-0068042 | 2019-06-10 | ||
KR1020190068042A KR102135036B1 (ko) | 2019-06-10 | 2019-06-10 | 엑센딘-4를 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 및 줄기세포능 증가용 조성물 |
KR1020190068929A KR102123268B1 (ko) | 2019-06-11 | 2019-06-11 | 히알루론산을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 및 줄기세포능 증가용 조성물 |
KR10-2019-0068929 | 2019-06-11 | ||
KR1020190068915A KR102168751B1 (ko) | 2019-06-11 | 2019-06-11 | Pma를 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 및 줄기세포능 증가용 조성물 |
KR10-2019-0068915 | 2019-06-11 | ||
KR10-2019-0069590 | 2019-06-12 | ||
KR10-2019-0069585 | 2019-06-12 | ||
KR1020190069582A KR102199636B1 (ko) | 2019-06-12 | 2019-06-12 | 인터페론-감마를 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 및 줄기세포능 증가용 조성물 |
KR10-2019-0069582 | 2019-06-12 | ||
KR1020190069585A KR102130501B1 (ko) | 2019-06-12 | 2019-06-12 | 테트란드린을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 및 줄기세포능 증가용 조성물 |
KR10-2019-0069586 | 2019-06-12 | ||
KR1020190069586A KR102130502B1 (ko) | 2019-06-12 | 2019-06-12 | P 물질을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 및 줄기세포능 증가용 조성물 |
KR1020190069590A KR102120329B1 (ko) | 2019-06-12 | 2019-06-12 | 레스베라트롤을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 및 줄기세포능 증가용 조성물 |
KR1020200001518A KR102199640B1 (ko) | 2020-01-06 | 2020-01-06 | 라니피브라노르를 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 및 줄기세포기능 강화용 조성물 |
KR10-2020-0001518 | 2020-01-06 | ||
PCT/KR2020/006574 WO2020251181A1 (ko) | 2019-06-10 | 2020-05-20 | 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 및 줄기세포능 증가용 조성물 |
JP2022515458A JP7246569B2 (ja) | 2019-06-10 | 2020-05-20 | 幹細胞由来エクソソーム生成促進及び幹細胞能増強用組成物 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022515458A Division JP7246569B2 (ja) | 2019-06-10 | 2020-05-20 | 幹細胞由来エクソソーム生成促進及び幹細胞能増強用組成物 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2023075261A true JP2023075261A (ja) | 2023-05-30 |
Family
ID=73782043
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022515458A Active JP7246569B2 (ja) | 2019-06-10 | 2020-05-20 | 幹細胞由来エクソソーム生成促進及び幹細胞能増強用組成物 |
JP2023039189A Pending JP2023075260A (ja) | 2019-06-10 | 2023-03-14 | 幹細胞由来エクソソーム生成促進及び幹細胞能増強用組成物 |
JP2023039190A Pending JP2023075261A (ja) | 2019-06-10 | 2023-03-14 | 幹細胞由来エクソソーム生成促進及び幹細胞能増強用組成物 |
JP2023039188A Pending JP2023078272A (ja) | 2019-06-10 | 2023-03-14 | 幹細胞由来エクソソーム生成促進及び幹細胞能増強用組成物 |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022515458A Active JP7246569B2 (ja) | 2019-06-10 | 2020-05-20 | 幹細胞由来エクソソーム生成促進及び幹細胞能増強用組成物 |
JP2023039189A Pending JP2023075260A (ja) | 2019-06-10 | 2023-03-14 | 幹細胞由来エクソソーム生成促進及び幹細胞能増強用組成物 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023039188A Pending JP2023078272A (ja) | 2019-06-10 | 2023-03-14 | 幹細胞由来エクソソーム生成促進及び幹細胞能増強用組成物 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220195384A1 (ja) |
EP (2) | EP3981871A4 (ja) |
JP (4) | JP7246569B2 (ja) |
CN (4) | CN113728091B (ja) |
WO (1) | WO2020251181A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20220387509A1 (en) * | 2019-11-12 | 2022-12-08 | Brexogen Inc. | Composition for preventing or treating renal diseases, comprising exosomes derived from precursor cells of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells |
US20230190817A1 (en) * | 2020-07-29 | 2023-06-22 | Brexogen Inc. | Composition including stem cell-derived exosome, and method for producing same |
CN113943700B (zh) * | 2021-10-21 | 2023-10-27 | 艾一生命科技(广东)有限公司 | 一种牛血清外泌体用于干细胞培养的方法 |
CN115044543A (zh) * | 2022-08-17 | 2022-09-13 | 山东卓东生物科技有限公司 | 一种提高衰老人体来源肌肉干细胞活性的方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101859499B1 (ko) * | 2010-11-30 | 2018-05-21 | (주)아모레퍼시픽 | 세포외기질을 모사한 지방유래 줄기세포의 줄기세포성 증진용 조성물 |
WO2013150303A1 (en) * | 2012-04-03 | 2013-10-10 | Reneuron Limited | Stem cell microparticles |
US20170121685A1 (en) * | 2015-11-02 | 2017-05-04 | Tigenix S.A.U. | Mesenchymal stem cell-derived exosomes and their uses |
IL259470B (en) * | 2015-11-18 | 2022-08-01 | Univ Georgia | Extracellular vesicles of nerve cells |
CN107475187A (zh) * | 2017-09-05 | 2017-12-15 | 山东艾克韦生物技术有限公司 | 培养液及大量获得脐带间充质干细胞外泌体的生产工艺 |
-
2020
- 2020-05-20 CN CN202080029413.6A patent/CN113728091B/zh active Active
- 2020-05-20 WO PCT/KR2020/006574 patent/WO2020251181A1/ko unknown
- 2020-05-20 EP EP20823509.3A patent/EP3981871A4/en active Pending
- 2020-05-20 EP EP23157455.9A patent/EP4219686A1/en active Pending
- 2020-05-20 JP JP2022515458A patent/JP7246569B2/ja active Active
- 2020-05-20 US US17/601,775 patent/US20220195384A1/en active Pending
- 2020-05-20 CN CN202311353128.1A patent/CN117384828A/zh active Pending
- 2020-05-20 CN CN202311353123.9A patent/CN117384827A/zh active Pending
- 2020-05-20 CN CN202311353132.8A patent/CN117384829A/zh active Pending
-
2023
- 2023-03-14 JP JP2023039189A patent/JP2023075260A/ja active Pending
- 2023-03-14 JP JP2023039190A patent/JP2023075261A/ja active Pending
- 2023-03-14 JP JP2023039188A patent/JP2023078272A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113728091A (zh) | 2021-11-30 |
EP3981871A1 (en) | 2022-04-13 |
CN117384827A (zh) | 2024-01-12 |
EP4219686A1 (en) | 2023-08-02 |
CN117384828A (zh) | 2024-01-12 |
CN117384829A (zh) | 2024-01-12 |
US20220195384A1 (en) | 2022-06-23 |
WO2020251181A1 (ko) | 2020-12-17 |
EP3981871A4 (en) | 2022-08-10 |
JP2023075260A (ja) | 2023-05-30 |
JP2023078272A (ja) | 2023-06-06 |
JP7246569B2 (ja) | 2023-03-27 |
JP2022533277A (ja) | 2022-07-21 |
CN113728091B (zh) | 2024-04-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7246569B2 (ja) | 幹細胞由来エクソソーム生成促進及び幹細胞能増強用組成物 | |
US10406180B2 (en) | Composition including stem cell-derived microvesicles for promoting neurogenesis | |
KR101980453B1 (ko) | 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물 | |
KR102135036B1 (ko) | 엑센딘-4를 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 및 줄기세포능 증가용 조성물 | |
JP6977051B2 (ja) | Hla−gタンパク質を常に分泌発現する細胞株及びその製造方法 | |
KR20190063453A (ko) | 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물 | |
JP6235795B2 (ja) | 細胞のリプログラミングのための組成物 | |
EP4019027A1 (en) | Composition comprising exosomes derived from induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cell precursor for prevention or treatment of non-alcoholic steatohepatitis | |
KR102386464B1 (ko) | 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 전구세포로부터 유래된 엑소좀을 포함하는 비알콜성 지방간염의 예방 또는 치료용 조성물 | |
KR102123268B1 (ko) | 히알루론산을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 및 줄기세포능 증가용 조성물 | |
KR102120329B1 (ko) | 레스베라트롤을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 및 줄기세포능 증가용 조성물 | |
KR102199636B1 (ko) | 인터페론-감마를 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 및 줄기세포능 증가용 조성물 | |
JP2018057301A (ja) | 幹細胞の未分化状態維持剤及び増殖促進剤 | |
KR102199640B1 (ko) | 라니피브라노르를 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 및 줄기세포기능 강화용 조성물 | |
KR102232670B1 (ko) | Pma를 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 및 줄기세포능 증가용 조성물 | |
KR102130502B1 (ko) | P 물질을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 및 줄기세포능 증가용 조성물 | |
KR102168751B1 (ko) | Pma를 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 및 줄기세포능 증가용 조성물 | |
JP6411778B2 (ja) | 幹細胞の未分化状態維持剤及び増殖促進剤 | |
JP2017085923A (ja) | アイヌワカメを用いた幹細胞の未分化状態維持剤及び増殖促進剤 | |
JP6615589B2 (ja) | 幹細胞の未分化状態維持剤及び増殖促進剤 | |
KR102130501B1 (ko) | 테트란드린을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 및 줄기세포능 증가용 조성물 | |
JP2017086020A (ja) | 幹細胞の未分化状態維持剤及び増殖促進剤 | |
JP2018011557A (ja) | 幹細胞の未分化状態維持剤及び増殖促進剤 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230314 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20240213 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240416 |