KR20190063453A

KR20190063453A - 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR20190063453A
Application number: KR1020190005323A
Authority: KR
Inventors: 김수; 오연목; 이슬기
Original assignee: 재단법인 아산사회복지재단
Priority date: 2019-01-15
Filing date: 2019-01-15
Publication date: 2019-06-07

Abstract

본 발명은 피오글리타존(pioglitazone), 메트포르민(metformin) 및 AICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물 및 이를 이용한 중간엽줄기세포 유래 엑소좀의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀 생성촉진용 조성물을 줄기세포 배양에 이용하는 경우, 줄기세포 유래 엑소좀의 생산량 및 엑소좀 내 단백질과 RNA의 함량이 증가되므로 종래 알려진 방법에 비하여 보다 효율적으로 양질의 엑소좀을 대량 생산할 수 있으며, 따라서 관련 연구개발 및 제품화에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물{Composition For Promoting Production of Stem Cell-derived Exosomes}

본 발명은 피오글리타존(pioglitazone), 메트포르민(metformin) 및 AICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물 및 이를 이용한 줄기세포 유래 엑소좀의 생산 방법에 관한 것이다.

미세소포체 (Extracellular Vesicles)는 Microvesicles, Exosome 등을 포함하는 30~1000 nm 크기의 구형 지질이중층(lipid-bilayer)으로 구성된 소포체(vesicle)이다. 엑소좀의 지질이중층은 기원 세포(공여세포)와 같은 인지질 이중막 구조로 되어 있으며, 세포가 세포외로 분비하는 물질의 구성체로 세포-세포간의 커뮤니케이션 및 세포성 면역 중재 등의 기능적인 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 기원 세포(공여세포) 특유의 생물학적 기능을 반영하는 세포특이적 구성 성분을 함유하며, 인지질, mRNA, miRNA 외에도 다양한 수용성 단백질, 외재성 단백질 및 막관통 단백질 성분 등을 포함한다. 엑소좀의 마커 단백질로는 CD63, CD81 등이 잘 알려져 있으며, 여기에는 주로 EGFR과 같은 세포 표면의 수용체, 신호전달에 관여하는 분자, 세포의 부착(adhesion)에 관여하는 단백질, hsp(heat shock protein), 소포체 형성과 관련하는 Alix 등 단백질들이 포함되는 것으로 알려져 있다. 이러한 엑소좀은 비만세포, 림프구, 성상세포, 혈소판, 신경세포, 내피세포, 상피세포 등 모든 동물 세포에서 배출되며 혈액, 소변, 점액, 타액, 담즙액, 복수액, 뇌척수액 등의 다양한 체액에서 발견된다. 엑소좀은 뇌혈관 장벽(Blood-Brain Barrier, BBB)도 통과할 수 있으며, 표피 세포와 내피세포의 세포막 투과가 가능할 정도로 선택적 투과성이 높아 특정 약물의 나노캐리어(nanocarrier)인 DDS(drug delivery system) 개발에도 활용되고 있다.

중간엽 줄기세포에서 분비하는 엑소좀 및 미세소포체(microvesicle)는 세포-세포간 커뮤니케이션(cell-to-cell communication)에 관여하며 줄기세포가 가지는 재생의학적인 치료 효능을 보인다고 알려져 있다. 줄기세포를 체내에 이식한 후에 장기간의 생존 없이 세포에서 분비되는 파라크린 인자(paracrine factors)에 트로픽 효과(trophic effect)를 가져오는 것이 알려져 있고, 이러한 인자에는 성장인자(growth factor), 케모카인(chemokine), 사이토카인(cytokine) 등과 같은 저분자가 엑소좀과 같은 세포외 소포체(extracellular vesicle)에 의하여 분비되며, 이러한 엑소좀은 줄기세포에서 유래한다. 따라서 엑소좀은 줄기세포의 특성을 규명하고 이의 치료적 효능을 평가하는데 활용되고 있다.

최근에는 중간엽 줄기세포 자체를 사용하지 않고 중간엽 줄기세포가 분비하는 엑소좀을 이용하여 다양한 질환의 치료효과에 대한 연구가 활발하게 진행 중이며, 학계 및 산업계에서는 이를 통해 기존의 줄기세포 치료법의 한계를 극복할 수 있는 새로운 대안이 될 수 있을 것으로 예상한다. 이러한 엑소좀을 상업적으로 이용하기 위해서는 다량의, 그리고 양질의 엑소좀이 필요하다. 그러나 현재 줄기세포로부터 얻을 수 있는 엑소좀의 양은 매우 소량에 불과하고, 줄기세포 유래 엑소좀의 생산량을 증가시킬 수 있는 물질에 대한 개발도 아직까지 미비한 실정이다. 이에 따라 줄기세포 유래 엑소좀의 생산을 촉진하는 신규한 방법 및 물질 개발에 대한 필요성이 제기되었다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

대한민국 등록특허공보 제10-1643825호

본 발명자들은 줄기세포 유래 엑소좀의 생산을 촉진하는 방법 및 물질을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 피오글리타존, 메트포르민, 및 AICAR를 줄기세포에 전처리하는 경우에 줄기세포 유래 엑소좀의 수 뿐만 아니라, 엑소좀 내 단백질 및 RNA의 함량이 크게 증가하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 피오글리타존(pioglitazone), 메트포르민(metformin) 및 AICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 피오글리타존(pioglitazone), 메트포르민(metformin) 및 AICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질로 전처리된 줄기세포에서 유래한 엑소좀을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물을 포함하는 줄기세포 치료제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기줄기세포에서 유래한 엑소좀을 포함하는 줄기세포 치료제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 피오글리타존(pioglitazone), 메트포르민(metformin) 및 AICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질을 포함하는 세포배양 배지에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀의 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 피오글리타존(pioglitazone), 메트포르민(metformin) 및 AICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 조성물의 구성성분 중 하나인 피오글리타존은 티아졸리디네디온(thiazolidinedione, TZD) 계열의 혈당 강하 효과를 가진 당뇨병 치료약이다. 혈당 강하 효과가 있으나 심혈관 질환에 대한 효과는 통계적으로 유의성 있는 결과가 보고되지는 않았다.

본 발명의 상기 조성물의 구성성분 중 다른 하나인 메트포르민(metformin)은 바이구아니드계(biguanides) 경구용 당뇨병치료제이다. 메트포르민 또한 혈당 개선효과가 있으나 심혈관질환을 예방하는 효과는 증거가 아직 제한적이다. 작용기전의 하나로 간에서 AMP-activated protein kinase (AMPK)를 활성화함으로써 포도당신생합성을 막고, 세포에 포도당이 흡수되는 것을 촉진하고, 대사증후군을 억제한다. 이러한 메트포르민의 작용기전은 정확하게 밝혀지지는 않았으나, 1) 미토콘드리아에서 일어나는 세포호흡을 억제하고 2) AMPK를 활성화시키며, 3) 글루카곤에 의해 유도되는 cAMP(Cyclic adenosine monophosphate)의 농도 상승을 막아 결과적으로 PKA(Protein kinase A)의 활성을 억제하고 4) 장내의 정상세균총(gut flora)에도 영향을 준다고 알려져 있다.

본 발명의 상기 조성물의 성분 중 또 다른 하나인 AICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide)는 이노신 모노포스페이트(inosine monophosphate)의 생성과정의 중간체이다. AICAR는 AMP의 유사체로서 AMP-의존적 단백질 키나아제(AMPK)를 자극하는 것으로 알려져 있으며, 심장 허혈성 손상을 치료 및 보호하는 용도로서 임상적으로 사용되어 왔다.

본 발명에 따른 상기 조성물은 상술한 성분 이외에 공지된 엑소좀 생성 촉진 물질을 더 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 “엑소좀(Exosome)은 세포 유래성 소포체로, 거의 모든 진핵 생물의 체액에 존재한다. 엑소좀의 직경은 30-100 nm 정도이며, 이는 LDL 단백질보다는 크지만, 적혈구보다는 훨씬 작다. 엑소좀은 다중소포체(multivesicular bodies)가 세포막과 융합될 때 세포로부터 방출되거나, 세포막으로부터 곧바로 방출된다. 엑소좀이 응고, 세포간 신호전달 등과 같은 중요하면서도 특화된 기능을 수행한다는 점은 잘 알려져 있다.

본 명세서에서 용어 "줄기세포"는 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 줄기세포는 배아 줄기세포, 유도만능줄기세포 또는 성체 줄기세포를 포함하며, 구체적으로는 유도만능 줄기세포 또는 성체 줄기세포이다.

본 명세서에서 용어, '배아줄기세포'란, 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것으로서, 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(多能性, pluripotent)이거나 전능성(全能性, totipotent)이 있는 자가재생산능(self-renewal)을 갖는 세포를 의미하며, 넓은 의미로는 배아줄기세포로부터 유래한 배아체(embryoid bodies)도 포함한다. 본 발명의 배아줄기세포로는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 배아줄기세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 배아줄기세포이다.

본 명세서에서 용어, '유도만능줄기세포'란, 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 일컫는 말로서 역분화줄기세포 (iPSC: induced pluripotent stem cells)이라고도 한다. 인위적인 역분화 과정은 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터 이용, 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 역분화 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기세포 추출물, 화합물 등에 의한 역분화 과정을 포함한다. 유도만능줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가지며, 구체적으로는 비슷한 세포 모양을 보여주고, 유전자, 단백질 발현 패턴이 유사하며, in vitro 및 in vivo에서 전분화능을 가지고, 테라토마 (teratoma)를 형성하며, 생쥐의 배반포 (blastocyst)에 삽입시켰을 때, 키메라 (chimera) 생쥐를 형성하고, 유전자의 생식선 전이 (germline transmission)가 가능하다. 본 발명의 유도만능줄기세포로는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 유도만능줄기 세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 유도만능줄기세포이다.

상기 성체 줄기세포는 인간 또는 동물의 다양한 조직 기원의 줄기세포(예컨대 조혈모세포, 유선 줄기세포, 장 줄기세포, 혈관내피 줄기세포, 신경 줄기세포, 후각신경 줄기세포, 정소 줄기세포 등)와, 인간 또는 동물 조직 유래 중간엽 줄기세포(mesenchymal stromal cell), 인간 또는 동물의 다양한 조직 기원의 유도만능줄기세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 등일 수 있으며, 구체적으로는 인간 또는 동물 조직 유래의 중간엽 줄기세포 또는 유도만능줄기세포 유래의 중간엽 줄기세포이나, 이에 한정되지 않는다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반 등으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 “생성 촉진”이란 대조군에 비하여 특정물질의 생산, 생성, 방출 등이 동일한 시간 내에서 증가되는 것을 말한다. 구체적으로 본 발명에서는 줄기세포로부터 엑소좀이 생산되는 수량과, 엑소좀 내 단백질, RNA 등의 함량이 증가되는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 배지조성물로서 줄기세포 배양에 사용될 수 있고, 생체 내(in vivo) 엑소좀 생성 촉진용도의 약제학적 조성물로서 줄기세포와 함께 생체 내로 병행 투여되거나, 선행 또는 후행적으로 투여되어 줄기세포의 in vivo 효능을 강화할 수 있다. 상기 줄기세포의 in vivo 효능 강화란, 관절염이나 신경병증 등 특정 질환에 대한 치료목적(in vivo 효능)을 가진 줄기세포의 효능이 줄기세포가 방출하는 엑소좀에 의해 매개됨을 전제로, 본 발명의 상기 조성물을 줄기세포 투여와 함께 투여시 줄기세포로부터 엑소좀의 생성이 촉진되는 결과 줄기세포의 질환 치료 효과(in vivo 효능)를 강화시키는 용도를 의미한다.

본 발명의 상기 조성물이 약제학적 조성물인 경우, 본 발명의 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 및 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 비강 내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 경막 내 투여, 안구 투여, 피부 투여 및 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-1000 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에서 "배지조성물"는 생체 외(in vitro)에서 세포의 성장과 생존 및 증식에 필요한 필수성분을 포함하는 조성물을 의미하는 것으로, 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 줄기세포 배양용 배지를 모두 포함하며, 예를 들어 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), KnockOut DMEM 등의 상업적으로 제조된 배지 또는 인위적으로 합성한 배지를 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 배지조성물은 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함하며, 아미노산, 항생제 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 배지조성물은 본 발명의 구성성분[피오글리타존(pioglitazone), 메트포르민(metformin), AICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide)]을 종래의 줄기세포 배양용 배지 내에 첨가하여 제조될 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 피오글리타존은 배지 내에 0.01~100 μM, 0.01~10 μM, 0.01~5 μM, 0.1~50 μM, 0.1~25 μM, 0.1~10 μM의 농도로 첨가될 수 있으며, 보다 구체적으로는 0.1~10 μM, 1~10 μM, 1~8 μM, 1~5μM, 3~5 μM, 가장 구체적으로는 4 μM의 농도로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 메트포르민(metformin)은 배지 내에 0.01~100 mM, 0.01~10 mM, 0.01~5 mM, 0.1~50 mM, 0.1~25 mM, 0.1~10 mM의 농도로 첨가될 수 있으며, 보다 구체적으로는 0.1~10 mM, 1~10 mM, 1~8 mM, 1~5 mM, 3~5 mM, 가장 구체적으로는 4 mM의 농도로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 AICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide)는 배지 내에 1~1000 μM, 1~800 μM, 1~700 μM, 1~600 μM, 1~500 μM, 1~400 μM, 1~300 μM, 1~200 μM, 1~100 μM, 10~1000 μM, 10~800 μM, 10~700 μM, 10~600 μM, 10~500 μM, 10~400 μM, 10~300 μM, 10~200 μM, 10~100 μM, 50~500 μM, 50~400 μM, 50~300 μM, 50~200 μM, 50~100 μM의 농도로 첨가될 수 있고, 가장 구체적으로는 100 1~1000 μM, 1~800 μM, 1~700 μM, 1~600 μM, 1~500 μM, 1~400 μM, 1~300 μM, 1~200 μM, 1~100 μM의 농도로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 피오글리타존(pioglitazone), 메트포르민(metformin) 및 AICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질로 전처리된 줄기세포에서 유래한 엑소좀을 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀의 생산 방법을 제공한다:

(a) 피오글리타존(pioglitazone), 메트포르민(metformin) 및 AICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질을 포함하는 세포배양 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 생산 방법은 다음 단계를 더 포함할 수 있다: (b) 배양된 줄기세포를 세척한 후 세포배양 배지에서 추가로 배양하는 단계 및 (c) 상기 세포배양 배지로부터 엑소좀을 분리하는 단계.

상기 (a) 단계는 줄기세포를 피오글리타존(pioglitazone), 메트포르민(metformin) 및 AICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질로 전처리하여 줄기세포에 자극을 가하는 과정이다. 본 과정에 의해 줄기세포는 상기 물질로 전처리 되지 않은 줄기세포에 비하여 더 많은 수의 엑소좀을 생산하고, 엑소좀 내 단백질 및 RNA의 함량도 증가된다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 (b) 단계의 세포배양 배지는 엑소좀이 제거된 우태아혈청(Fetal bovine serum)을 추가적으로 포함한다. 상기 세포배양 배지에 엑소좀을 제거한 FBS를 사용하는 이유는 일반적으로 사용하는 FBS에는 소 혈청유래의 엑소좀이 매우 많이 포함되어 있기 때문에, 줄기세포가 분비하는 엑소좀 외에 FBS에서 유래된 엑소좀이 혼입되는 것을 방지하기 위함이다.

상기 (b) 단계는 본 발명에 따른 상기 물질로 전처리 된 줄기세포를 세척하여 상기 전처리 물질을 제거하고, 새로운 세포배양 배지에서 배양함으로써 줄기세포로부터 엑소좀의 분비 또는 생산을 유도하는 과정이다. 상기 (a) 단계의 줄기세포 전처리 물질(피오글리타존, 메트포르민, AICAR)은 상기 (b) 단계의 세척과정에 의해 제거되고, 세척 이후의 줄기세포, 줄기세포에서 생산된 엑소좀 또는 배양배지 내에 잔류하지 않는다. 따라서 상기 (a) 단계에서 본 발명의 줄기세포 전처리 물질(피오글리타존, 메트포르민, AICAR)로 처리된 줄기세포와 줄기세포에서 생산된 엑소좀 및 배양배지는 상술한 전처리 물질의 잔류에 의한 영향 없이 후속적 연구 또는 질병의 치료 목적으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 (b) 단계의 추가 배양은 12시간 내지 120 시간, 24시간 내지 96시간, 48시간 내지 96시간, 또는 60시간 내지 84시간, 가장 구체적으로는 72시간 동안 배양될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 (c) 단계의 세포배양 배지로부터 엑소좀을 분리하는 단계는 상기 (b) 단계에서 추가배양한 줄기세포의 배양 배지를 200-400 x g에서 5 내지 20분간 원심분리하여 남아있는 세포와 세포 잔여물을 제거한 뒤, 상층액을 취하여 9,000-12,000 x g로 60-80분간 고속원심분리한 후, 다시 상층액을 취하여 90,000-120,000 x g로 80-100분간 원심분리하고 상층액을 제거함으로써 하층에 남아 있는 엑소좀을 얻을 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 중간엽줄기세포 배양 배지를 수거하여 300 x g에서 10분간 원심분리하여 남아있는 세포와 세포잔여물을 제거하고, 상층액을 취하여 0.22 μm 필터를 이용하여 여과한 다음, 고속원심분리기(high speed centrifuge)를 이용하여 10,000 x g, 4 ℃에서 70분간 원심분리한다. 원심분리 된 상층액을 다시 취하여 초원심분리기 (ultracentrifuge)를 이용하여 100,000 x g, 4 ℃에서 90분간 원심분리하여 상층액을 제거함으로써 하층에 남아있는 엑소좀을 분리하였다.

하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명에 따른 상기 전처리 물질로 줄기세포를 전처리 하는 경우 전처리하지 않은 줄기세포와 비교하여 생산되는 엑소좀의 수량 뿐만 아니라 엑소좀 내 단백질 및 RNA의 함량이 증가된다. 따라서, 본 발명의 엑소좀 생성 촉진용 조성물로 전처리된 줄기세포에서 유래한 엑소좀은 종래의 일반적인 줄기세포 또는 본 발명의 엑소좀 생성 촉진용 조성물로 전처리 되지 않은 줄기세포로부터 유래한 엑소좀과 달리 단백질 함량 및 RNA의 함량이 월등하게 향상되었다는 점에서 실질적으로 상이하다. 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물은 추가적인 연구가 필요하겠으나, 단순히 줄기세포가 생성하는 엑소좀의 숫자만을 증가시키는 것이 아니라 엑소좀 내 존재하는 단백질과 RNA의 함량 또한 증가시키므로 우수한 기능성을 가진 엑소좀을 대량으로 생산할 수 있는 것으로 추정된다.

또한, 본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 피오글리타존(pioglitazone), 메트포르민(metformin) 및 AICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질 또는 이를 포함하는 조성물 및 줄기세포를 포함하는 줄기세포 치료제를 제공한다.

본 발명에서 상기 '세포 치료제'란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식ㆍ선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다. 이러한 세포치료제는 크게 두 가지로 분류할 수 있으며 그 첫 번째는 조직재생, 장기기능 회복 또는 면역세포의 기능조절을 위한 "줄기세포 치료제"이며, 두 번째는 생체 내 면역반응의 억제 혹은 면역반응의 항진 등 면역반응 조절을 위한 “면역세포 치료제”이다. 본 발명의 조성물 및 이의 구성성분은 줄기세포 유래 엑소좀의 생성을 촉진하며, 이를 통해 줄기세포의 치료적 효능을 강화시키는 효과를 가지므로, 본 명세서 내에서 “세포치료제”는 “줄기세포 치료제”를 의미한다.

상기 줄기세포 치료제는 심근경색, 심부전 등의 심혈관 질환, 간암, 위암, 대장암, 전립선암, 방광암, 폐암 등의 암 질환, 아토피성 피부염, 관절염, 자가면역성 뇌척수염, 전신성 홍반성 루푸스, 대장염 및 다발성 경화증과 같은 염증성 질환, 또는 자가면역성 질환 등의 치료대상 질병을 치료하는 용도로 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 줄기세포 치료제는 상술한 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물과 구성성분을 공통으로 하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

또한, 본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 피오글리타존(pioglitazone), 메트포르민(metformin) 및 AICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질(또는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물)로 전처리된 줄기세포로부터 유래한 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 치료제를 제공한다.

상기 줄기세포 치료제는 상술한 피오글리타존(pioglitazone), 메트포르민(metformin) 및 AICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질로 전처리된 줄기세포에서 유래한 엑소좀과 구성성분을 공통으로 하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 피오글리타존(pioglitazone), 메트포르민(metformin) 및 AICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물 및 이를 이용한 중간엽줄기세포 유래 엑소좀의 생성 촉진 방법에 관한 것이다.

(b) 본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀 생성촉진용 조성물을 줄기세포 배양에 이용하는 경우, 줄기세포 유래 엑소좀의 생산량 및 엑소좀에서 분리되는 단백질과 RNA의 함량이 증가되므로 종래 알려진 방법에 비하여 보다 효율적으로 양질의 엑소좀을 대량 생산할 수 있으며, 이를 관련 연구개발 및 제품화에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 구성성분인 피오글리타존(Pioglitazone), AICAR, 메트포르민(Metformin)을 처리한 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀(미세소포체)의 전자현미경 이미지를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 구성성분인 피오글리타존(Pioglitazone), AICAR, 메트포르민(Metformin)을 처리한 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀(미세소포체)의 크기 및 분포를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 구성성분인 피오글리타존(Pioglitazone), AICAR, 메트포르민(Metformin)을 처리한 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀(미세소포체)의 단백질 마커를 확인한 도이다.
도 4는 본 발명의 구성성분인 피오글리타존(Pioglitazone), AICAR, 메트포르민(Metformin)을 처리한 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀(미세소포체)의 수를 상기 물질을 미처리한 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀의 수와 비교하여 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 구성성분인 피오글리타존(Pioglitazone), AICAR, 메트포르민(Metformin)을 처리한 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀(미세소포체) 내에서 분리되는 단백질의 양을 상기 물질을 미처리한 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀 내 단백질의 양과 비교하여 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 구성성분인 피오글리타존(Pioglitazone), AICAR, 메트포르민(Metformin)을 처리한 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀(미세소포체) 내에서 분리되는 RNA의 함량을 상기 물질을 미처리한 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀 내 RNA의 함량과 비교하여 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1. 피오글리타존 ( pioglitazone ), 메트포르민( metformin ), AICAR (5- Aminoimidazole -4- carboxamide ribonucleotide) 처리에 따른 줄기세포 유래 엑소좀 분리

피오글리타존(pioglitazone) 4 μM, 메트포르민(metformin) 4 mM, 또는 AICAR 100 μM이 포함된 배양배지[high glucose DMEM (Gibco, Cat no.11995-065), 10% Fetal bovine Serum (HyClone), 1% MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) (Gibco, Cat no.11140-050)]에서 제대조직 유래 중간엽 줄기세포를 1주일간 배양하였다. 제대조직 유래 중간엽줄기세포는 서울아산병원 줄기세포센터에서 태아의 제대조직을 자체적으로 분리하여 수립한 제대 조직 유래 중간엽줄기세포이다. 배양을 완료한 후 상기 각각의 전처리 물질[피오글리타존(pioglitazone) 4 μM, 메트포르민(metformin) 4 mM, AICAR 100 μM]이 전처리 된 중간엽줄기세포를 세척하고 엑소좀이 제거된 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)를 10% 첨가한 배양배지에서 추가적으로 72시간 배양하였다. 엑소좀이 제거된 FBS를 사용하는 이유는 일반적으로 사용하는 FBS에는 소 혈청유래의 엑소좀이 매우 많이 포함되어 있기 때문에, 세포가 분비하는 엑소좀 외에 FBS 유래 엑소좀이 혼입되는 것을 방지하기 위함이다. 72시간 배양 후 각각의 전처리 물질이 처리된 중간엽줄기세포 배양배지를 수거하여 300 x g에서 10분간 원심분리하여 남아있는 세포와 세포잔여물을 제거하였다. 상층액을 취하여 0.22 μm 필터를 이용하여 여과한 다음, 고속원심분리기(high speed centrifuge)를 이용하여 10,000 x g, 4 ℃에서 70분간 원심분리하였다. 원심분리 된 상층액을 다시 취하여 초원심분리기 (ultracentrifuge)를 이용하여 100,000 x g, 4 ℃에서 90분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 하층에 남아있는 엑소좀을 PBS(phosphate bufferd salin)에 희석하여 이하의 실험에 사용하였다.

실시예 2. 피오글리타존 ( pioglitazone ), 메트포르민( metformin ), AICAR (5- Aminoimidazole -4- carboxamide ribonucleotide) 처리에 따른 줄기세포 유래 엑소좀 확인

상기 실시예 1에서와 같이 피오글리타존(pioglitazone) 4 μM, 메트포르민(metformin) 4 mM 또는 AICAR 100 μM를 처리한 중간엽줄기세포 배양액에서 엑소좀을 분리하고 nanoparticle tracking assay (NanoSight NS300, Malvern)를 통해 각각의 엑소좀의 크기를 확인하였다(도 2). 전자 현미경을 이용하여 엑소좀의 형태를 확인하였으며(도 1), 웨스턴 블랏으로 엑소좀 특이적 항원인 CD9과 CD63에 대한 항체를 이용하여 CD9과 CD63의 발현을 확인하였다(도 3).

실시예 3. 피오글리타존 ( pioglitazone ), 메트포르민( metformin ), AICAR (5- Aminoimidazole -4- carboxamide ribonucleotide) 처리에 따른 엑소좀 생산 효율 증가

3-1. 피오글리타존 ( pioglitazone ), 메트포르민( metformin ), AICAR (5- Aminoimidazole -4- carboxamide ribonucleotide) 처리에 따른 엑소좀 수 증가 비교

줄기세포 전처리 물질[피오글리타존(pioglitazone) 4 μM, 메트포르민(metformin) 4 mM, AICAR 100 μM]을 처리한 중간엽줄기세포 배양액에서 엑소좀을 분리하여 각각 nanoparticle tracking assay (NanoSight NS300, Malvern)를 통해 동일 중간엽줄기세포 유래 엑소좀 수를 비교하였다.

결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 아무 물질도 처리하지 않은 중간엽 줄기세포에 비하여, 줄기세포 전처리 물질[피오글리타존(pioglitazone) 4 μM, 메트포르민(metformin) 4 mM, AICAR 100 μM]을 전처리한 중간엽 줄기세포에서 적게는 약 22%에서 많게는 약 61% 많은 수의 엑소좀을 생산하였음을 확인하였다. 상기 결과로부터 본 발명에 따른 상기 줄기세포 전처리 물질을 중간엽 줄기세포에 처리시, 중간엽 줄기세포가 생산하는 엑소좀의 수가 증가함을 알 수 있다.

3-2. 피오글리타존 ( pioglitazone ), 메트포르민( metformin ), AICAR (5- Aminoimidazole -4- carboxamide ribonucleotide) 처리에 따른 엑소좀 유래 단백질 함량 비교

줄기세포 전처리 물질[피오글리타존(pioglitazone) 4 μM, 메트포르민(metformin) 4 mM, AICAR 100 μM]을 처리한 중간엽 줄기세포 배양액에서 분리한 엑소좀에서 엑소좀 단백질 분리 킷트 (Total exosome RNA and protein isolation kit, Invitrogen)를 이용하여 단백질을 분리하고 bradford analysis를 통해 595 nm에서 흡광도를 측정하여 단백질을 정량하여 비교하였다.

결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 아무 물질도 처리하지 않은 중간엽 줄기세포에 비하여, 줄기세포 전처리 물질[피오글리타존(pioglitazone) 4 μM, 메트포르민(metformin) 4 mM, AICAR 100 μM]을 전처리한 중간엽 줄기세포에서 약 3.4 배에서 약 4.6 배 많은 량의 엑소좀 유래 단백질을 생산하였음을 확인하였다. 이로부터 상기 줄기세포 전처리 물질을 중간엽 줄기세포에 처리시 엑소좀의 수 뿐만 아니라 엑소좀 유래 단백질(exosomal protein)의 함량 또한 증가함을 알 수 있다.

3-3. 피오글리타존 ( pioglitazone ), 메트포르민( metformin ), AICAR (5- Aminoimidazole -4- carboxamide ribonucleotide) 처리에 따른 엑소좀 유래 RNA 함량 비교

줄기세포 전처리 물질[피오글리타존(pioglitazone) 4 μM, 메트포르민(metformin) 4 mM, AICAR 100 μM]를 처리한 중간엽줄기세포 배양액에서 분리한 엑소좀에서 RNA 분리용 킷트 (Total exosome RNA and protein isolation kit, Invitrogen)를 이용하여 전체 엑소좀 RNA를 분리하고 nanodrop을 이용하여 RNA의 농도를 측정하여 비교하였다.

결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 아무 물질도 처리하지 않은 중간엽 줄기세포에 비하여, 줄기세포 전처리 물질[피오글리타존(pioglitazone) 4 μM, 메트포르민(metformin) 4 mM, AICAR 100 μM]을 전처리한 중간엽 줄기세포에서 약 3.2 배에서 약 4.3 배 많은 량의 엑소좀 유래 RNA가 생산되었음을 확인하였다.

3-4. 소결

상기 실시예 3-1 내지 3-3의 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

(MSC: 미처리 중간엽 줄기세포, Pio-MSC: 피오글리타존-처리 중간엽 줄기세포, AICAR-MSC: AICAR-처리 중간엽 줄기세포, Met-MSC: 메트포르민-처리 중간엽 줄기세포)

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 줄기세포 전처리 물질(피오글리타존, 메트포르민, AICAR)을 중간엽 줄기세포에 처리시 엑소좀의 수 뿐만 아니라 엑소좀 유래 단백질(exosomal protein)의 생산량 또한 증가하며, 엑소좀 유래 RNA(exosomal RNA)의 함량도 증가함을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물은 추가적인 연구가 필요하겠지만 단순히 줄기세포가 생성하는 엑소좀의 숫자만을 증가시키는 것이 아니라, 엑소좀 내 존재하는 단백질과 RNA의 함량 또한 증가시키므로 우수한 기능성을 가진 엑소좀을 대량으로 생산할 수 있는 것으로 추정된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

피오글리타존(pioglitazone), 메트포르민(metformin) 및 AICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포 또는 유도만능줄기세포(iPS, induced pluripotent stem cell)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 인간 또는 동물 조직 기원의 성체 줄기세포, 인간 또는 동물 조직 유래 중간엽 줄기세포(mesenchymal stromal cell)이거나, 또는 인간 또는 동물 조직 기원의 유도만능줄기세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직 유래인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 인간 또는 동물 조직 기원의 성체 줄기세포는 조혈모세포, 유선 줄기세포, 장 줄기세포, 혈관내피 줄기세포, 신경 줄기세포, 후각신경 줄기세포 및 정소 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 엑소좀의 수, 엑소좀 유래 단백질 및 엑소좀 유래 RNA의 함량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
피오글리타존(pioglitazone), 메트포르민(metformin) 및 AICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질로 전처리된 줄기세포에서 유래한 엑소좀.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 줄기세포 치료제.
제 7 항의 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 치료제.
다음 단계를 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀의 생산 방법:
(a) 피오글리타존(pioglitazone), 메트포르민(metformin) 및 AICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질을 포함하는 세포배양 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계.
제 10 항에 있어서, (b) 배양된 줄기세포를 세척한 후 세포배양 배지에서 추가로 배양하는 단계; 및 (c) 상기 세포배양 배지로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 세포배양 배지는 엑소좀이 제거된 우태아혈청(Fetal bovine serum)이 함유된 것을 특징으로 하는 방법.