KR102386464B1 - 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 전구세포로부터 유래된 엑소좀을 포함하는 비알콜성 지방간염의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 전구세포로부터 유래된 엑소좀을 포함하는 비알콜성 지방간염의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 전처리 물질로 전처리 하거나 또는 전처리 하지 않은 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 엑소좀은 기존 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀에 비하여 보다 개선된 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료 효과를 나타내는 바, 이를 관련 연구개발 및 제품화에 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 전처리 물질로 전처리 하거나 또는 전처리 하지 않은 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 전구세포로부터 분화된 중간엽 줄기세포로부터 유래된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
중간엽 줄기세포는 다분화능을 가진 기질세포로서 조골세포, 연골세포, 근육세포, 지방세포 등을 포함하는 다양한 세포로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 중간엽 줄기세포는 연골이나 골조직, 인대, 골수 기질 등 다양한 결합조직으로 분화할 수 있으므로 관절염이나, 외상, 화상등에 의해 생긴 연부조직 결손을 치료하는 등 다양한 질환에 대한 치료 용도로 연구되고 있다.
최근에는 중간엽 줄기세포 자체를 사용하지 않고 중간엽 줄기세포가 분비하는 엑소좀을 이용하여 다양한 질환의 치료효과에 대한 연구가 활발하게 진행 중이다. 이러한 엑소좀을 상업적으로 이용하기 위해서는 다량의, 그리고 양질의 엑소좀이 필요하다. 그러나 중간엽 줄기세포로부터 얻을 수 있는 엑소좀의 양은 매우 소량에 불과하고, 중간엽 줄기세포의 기능과 증식능력 또한 계대가 반복될수록 감소하기 때문에, 중간엽 줄기세포와 동등하거나 그보다 우수한 기능성을 가지면서도 증식능력이 우수한 세포를 확립하는 기술 개발의 필요성이 대두되었다.
한편, 비알콜성 지방간은 과도한 알콜 섭취 없이 간 세포에 중성지방인 트리글리세라이드가 축적되는 것이 특징이다. 비알콜성 지방간은 현대인의 고지방 및 고탄수화물 섭취와 관련된 영양 과다에 따라 계속 증가하고 있다. 비만, 당뇨인 경우 비알콜성 지방간이 흔히 관찰되지만, 다앙한 인자가 비알콜성 지방간과 관련된 것으로 알려져 있다. 비알콜성 지방간을 지닌 성인의 80%가 인슐린 저항성 당뇨병 및 심장질환 등 대사이상 질환으로 발전된다고 보고되고 있다.
비알콜성 지방간은 비알콜성 단순 지방간 (non-alcoholic simple steatosis)과 염증을 동반한 비알콜성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis; NASH)으로 분류되는데, 장기간 방치 시, 간염, 간섬유, 간경변 등의 심각한 간 질환으로 이행될 수 있다. 비알콜성 지방간은 간 세포 (hepatocyte)에서 지방의 축적 (지방 침윤)을 갖는 것을 특징으로 한다.
비알콜성 단순 지방간은 비알콜성 지방간염으로 진행할 수 있는데, 비알콜성 지방간염에서 지방 축적은 다양한 정도의 간의 염증 및 흉터와 관련되고, 많은 경우에 인슐린 저항성, 이상지질혈증 및 고혈압과 연관된다고 알려져 있다. 비알콜성 지방간염은 과체중, 높은 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 수치, 및/또는 인슐린 저항성을 갖는 사람들에서 종종 발생한다.
최근, 비만 인구의 증가와 더불어 비알콜성 지방간염 환자가 증가하면서, 비알콜성 지방간염 치료제 시장은 막대한 시장규모로 발전하였고, 비알콜성 지방간염의 발생 원인 및 기작이 밝혀지면서 비알콜성 지방간염의 치료제 개발에 많은 관심이 집중되고 있다. 그러나 안전하고 장기 복용이 가능한 비알콜성 지방간염의 치료제의 개발은 아직 미미한 수준이다.
일반적으로 비알콜성 지방간염의 치료를 위하여 비만치료제, 인슐린저항치료제, 고지혈증치료제, 간세포 보호제, 항산화제 등이 사용된다. 그러나 이들 약물들은 비알콜성 지방간염의 본질적인 치료제가 아닌 증상 개선제로 이용되는 약물이며 장기 복용시 부작용이 있다.
따라서, 보다 안전하고 장기 복용이 가능하여 만성 질환인 비알콜성 지방간염의 치료에 적합한 새로운 치료용 조성물의 개발에 대한 요구는 커지고 있는 상황이다.
본 발명자들은 중간엽 줄기세포의 엑소좀을 이용한 비알콜성 지방간염 치료제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC)에서 유래한 중간엽 줄기세포보다 미분화 단계에 있는 중간엽 줄기세포의 전구세포에서 분화된 중간엽 줄기세포를 확립하고, 전처리 물질로 전처리 하거나 또는 전처리 하지 않은 상기 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 전구세포에서 분화된 중간엽 줄기세포로부터 유래된 엑소좀이 우수한 비알콜성 지방간염의 예방 또는 치료 효과를 나타냄을 규명하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC)-유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell; MSC)로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis; NASH)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포포로부터 분리된 엑소좀을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전처리 물질로 전처리된, 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell; MSC)로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전처리 물질로 전처리된, 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 중간엽 줄기세포의 엑소좀을 이용한 비알콜성 지방간염 치료제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC)에서 유래한 중간엽 줄기세포보다 미분화 단계에 있는 중간엽 줄기세포의 전구세포에서 분화된 중간엽 줄기세포를 확립하고, 전처리 물질로 전처리 하거나 또는 전처리 하지 않은 상기 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 유래된 엑소좀이 우수한 비알콜성 지방간염의 예방 또는 치료 효과를 나타냄을 규명하였다.
본 발명은 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포의 전구세포에서 분화된 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀 및 이를 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 및 전처리 물질로 전처리된, 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀 및 이를 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC)-유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell; MSC)로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간염의 예방, 완화, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 명세서 상의 용어 “비알콜성 지방간염”은 비알코올 지방간질환 (nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)의 하나로 지방간과 함께 염증 혹은 섬유화를 동반하는 것을 특징으로 하는 진행성 간질환이며, 간경변이나 간암을 유발하는 전구질환을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "줄기세포"는 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "유도만능줄기세포"는 체세포와 같은 이미 분화된 세포에 역분화 (dedifferentiation)를 유도하여 초기의 미분화된 상태로 돌아가, 전분화능 (pluripotency)을 가지게 된 세포를 의미한다.
상기 역분화는 특정 유전자 (예를 들어, Sox2, c-Myc, Klf4, Oct-4 등)를 도입하여 발현시키거나 상기 특정 유전자가 도입된 세포에서 만들어진 역분화 유도 단백질을 주입하여 유도될 수 있다.
상기 전분화능은 생체를 구성하는 3가지 배엽 (germ layer), 즉 내배엽 (endoderm), 중배엽 (mesoderm) 및 외배엽 (ectoderm) 기원의 조직 또는 기관으로 분화할 수 있는 능력을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "중간엽 줄기세포"는 다분화능을 가진 세포로서 조골세포, 연골세포, 근육세포, 지방세포 등을 포함하는 다양한 세포로 분화할 수 있는 줄기세포를 말한다. 상기 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포가 가장 흔히 사용되나, 골수 외에도 제대 또는 제대혈, 지방조직, 양수, 어금니의 치아 돌기 (tooth bud)로부터 유래할 수 있다. 중간엽 줄기세포는 기질세포 (stromal cell)이라는 용어로도 불리운다.
상기 중간엽 줄기세포의 전구세포는 일반적인 중간엽 줄기세포가 아닌, [본 발명자들이 개발한] 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPSC)에서 유래한 중간엽 줄기세포의 전구세포이다.
본 발명에 있어서, 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포는 SSEA-4 (stage-specific embryonic antigen 4) 단백질을 발현하지 않는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포는 SSEA-4 (stage-specific embryonic antigen 4) 단백질을 발현하지 않는 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포로부터 분화된 것일 수 있다.
상기 "유도만능줄기세포"는 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 일컫는 말로서 역분화 줄기세포 라고도 한다.
상기 인위적인 역분화 과정은 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 센다이바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터 이용, 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 역분화 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기세포 추출물, 화합물 등에 의한 역분화 과정을 포함한다.
상기 유도만능줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가지며, 구체적으로는 비슷한 세포 모양을 보여주고, 유전자 및 단백질 발현 패턴이 유사하며, in vitro 및 in vivo에서 전분화능을 가지고, 테라토마 (teratoma)를 형성하며, 생쥐의 배반포 (blastocyst)에 삽입시켰을 때 키메라 (chimera) 생쥐를 형성하고, 유전자의 생식선 전이 (germline transmission)가 가능하다.
본 발명의 유도만능줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등 모든 포유동물 유래의 유도만능줄기세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 유도만능줄기세포이다.
또한, 본 발명의 상기 유도만능줄기세포가 역분화 되기 전의 체세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 양수 또는 태반 등으로부터 유래된 체세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
구체적으로 상기 체세포는 섬유아세포 (fibroblast), 간세포 (hepatocyte), 지방세포 (adipose cell), 상피세포 (epithelial cell), 표피세포 (epidermal cell), 연골세포 (chondrocyte), 근세포 (muscle cell), 심근세포 (cardiac muscle cell), 멜라노사이트 (melaonocyte), 신경세포 (neural cell), 교세포 (glial cell), 성상교세포 (astroglial cell), 단핵구 (monocyte), 대식세포 (macrophage) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 본 발명의 중간엽 줄기세포는 동등한 수의 다른 중간엽 줄기세포에 비하여 ANKRD1, CPE, NKAIN4, LCP1, CCDC3, MAMDC2, CLSTN2, SFTA1P, EPB41L3, PDE1C, EMILIN2, SULT1C4, TRIM58, DENND2A, CADM4, AIF1L, NTM, SHISA2, RASSF4, 및 ACKR3로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 유전자를 더 높은 수준으로 발현한다.
또한, 본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 본 발명의 중간엽 줄기세포는 동등한 수의 다른 중간엽 줄기세포에 비하여 DHRS3, BMPER, IFI6, PRSS12, RDH10, 및 KCNE4로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 유전자를 더 낮은 수준으로 발현한다.
상기 중간엽 줄기세포 및 동등한 수의 다른 중간엽 줄기세포는 동종조직 유래이다. 보다 구체적으로는, 상기 중간엽 줄기세포는 유도만능줄기세포에서 유래한 중간엽 줄기세포의 전구세포이다.
본 발명의 일 실시예에서 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대 조직 유래의 유도만능줄기세포에서 유래한 중간엽 줄기세포이고, 이와 비교되는 동등한 수의 다른 중간엽 줄기세포는 제대 조직 유래의 중간엽 줄기세포이다.
본 발명자들은 상기 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포로부터 분화된 중간엽 줄기세포를 BxC (brexogen stem cell)로 명명하였다. 본 명세서에서 상기 "유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 (BxC)"는 "유도만능줄기세포 유래 중간엽세포"로도 표현된다.
본 명세서 상의 용어 “유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포”는 유도만능줄기세포에서 중간엽 줄기세포로 완전히 분화되기 직전 단계의 세포이고, 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 한 일종으로 볼 수 있으며, SSEA-4 단백질을 발현하지 않고, 추가 배양을 통해 완전한 중간엽 줄기세포의 성질을 갖게 되는 세포를 의미한다.
본 발명의 동일한 조직 유래 (e.g. 제대 조직)의 유도만능줄기세포의 중간엽 줄기세포 (BxC)는 동일한 조직 유래 (e.g. 제대 조직)의 중간엽 줄기세포 (MSC)와 비교하여 염색체 핵형에 있어서 이상이 없고, 증식능력이 우수하다. 구체적으로, 본 발명의 BxC는 계대를 9번 이상 거듭할 경우 동일 조직 유래의 중간엽 줄기세포(MSC)와 비교하여 10배 이상 증식능의 차이가 나타나며, 12 번 이상의 횟수로 계대를 하여도 증식능의 감소가 관찰되지 않는다. 또한, BxC는 MSC에 비하여 세포 증식능과 관련된 마커인 Ki67의 발현량도 2배 이상 높게 나타난다.
상기 유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 (BxC)는 Endostatin, Endothelin-1, VEGF-A, Thrombospondin-2, PlGF, PDGF-AA, beta-NGF, 및 HB-EGF 등의 기능성 단백질을 동등한 수의 중간엽 줄기세포와 비교하여 다량 분비한다.
본 명세서에서 상기 Endostatin은 자연적으로 생성되는 type XVIII 콜라겐에서 유래한 20 kDa C-터미널 단편으로, 항-신생혈관제제로 보고되어 있다.
본 명세서에서 상기 endothelin-1은 preproendothelin-1(PPET1)으로도 알려져 있으며, EDN1 유전자에 의해 인코딩되는 단백질로서 혈관 내피세포에서 생산된다. endothelin-1은 강력한 혈관수축제로 알려져 있다.
본 명세서에서 상기 VEGF-A (vascular endothelial growth factor A)는 VEGFA 유전자가 인코딩하는 단백질로서 혈관 내피세포의 VEGFR1 및 VEGFR2와 상호작용을 통해 혈관의 성장을 유도하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 상기 Thrombospondin-2는 THBS2 유전자에 의해 인코딩되는 단백질로서, 세포-세포 상호작용 또는 세포-기질 상호작용을 매개하는 것으로 알려져 있다. Thrombospondin-2의 암에 대한 역할은 논란의 여지가 있으나, 중간엽 줄기세포의 세포 표면 특성을 조절하는 것으로 보고되어 있으며 세포 부착 및 세포 이동에 관여한다고 알려져 있다.
본 명세서에서 상기 PlGF (placental growth factor)는 PGF 유전자에 의해 인코딩되는 단백질로서 VEGF sub-family의 멤버로서 배아발생기에서 혈관신생에 주된 역할을 하는 단백질로 알려져 있다.
본 명세서에서 상기 PDGF-AA (platelet-derived growth factor)는 세포의 성장 및 분열을 조절하는 성장인자로서 혈관의 생성 및 성장, 및 중간엽 줄기세포의 증식, 화학주성, 및 이동에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 NGF (Nerve growth factor)는 신경친화성 인자 및 뉴로펩타이드로서, 신경의 성장, 유지, 증식 및 생존에 주로 관여한다. NGF는 alpha-, beta-, 및 gamma-NGF가 약 2:1:2의 비율로 발현되는 세 가지 단백질의 복합체로서, 여기에서 gamma-NGF는 세린 프로테아제로 작용하고, beta-NGF의 N-터미널을 절단하여 NGF를 활성화시킨다고 알려져 있다.
본 명세서에서 상기 HB-EGF (heparin-binding EGF-like growth factor)는 HBEGF 유전자에 의해 인코딩되는 EGF family 단백질의 멤버이다. HB-EGF는 심장의 발달 및 혈관분포에 중요한 역할을 한다고 알려져 있고, 표피 창상의 치유에서 상피화 과정에 필수적인 단백질로 알려져 있다.
본 명세서에서 용어 "엑소좀 (exosome)"이란 세포가 세포 외로 분비하거나, 세포 내에 존재하는 지질-이중층으로 구성된 막 구조를 갖는 소낭(membrane vesicle)으로, 거의 모든 진핵 생물의 체액에 존재한다. 엑소좀의 직경은 30-1000 nm 정도이며, 다중소포체 (multivesicular bodies)가 세포막과 융합될 때 세포로부터 방출되거나, 세포막으로부터 곧바로 방출된다. 엑소좀이 응고, 세포-세포간 커뮤니케이션 및 세포성 면역을 중재하는 기능적 역할을 수행하기 위해, 세포 내의 생체분자인 단백질, 생체활성 지질 및 RNA (miRNA)를 수송하는 역할을 하는 것은 잘 알려져 있다.
상기 엑소좀은 미세소포체 (microvesicle)를 포괄하는 개념이다. 엑소좀의 마커 단백질로는 CD63, CD81 등이 알려져 있고, 그 외에는 EGFR과 같은 세포 표면의 수용체, 신호전달에 관련 분자, 세포 부착 관련 단백질, MSC 연관 항원, 열충격단백질 (heat shock protein), 소포 형성과 관련된 Alix 등의 단백질이 알려져 있다.
본 발명에서 상기 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀은 상술한 유도만능줄기세포-유래 중간엽줄기세포 (BxC) 내에 존재하거나, BxC로부터 분비된 엑소좀을 의미한다.
본 발명에 있어서 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀은 SSEA-4 (stage-specific embryonic antigen 4) 단백질을 발현하지 않는 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포로부터 분화된 중간엽 줄기세포로부터 분리된 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, '유효성분으로 포함하는'이란 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀이 비알콜성 지방간염의 예방 또는 치료 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서 약제학적 조성물은 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀을 엑소좀 단백질 기준 1 내지 10000 μg, 1 내지 1000 μg, 10 내지 10000 μg, 10 내지 1000 μg, 100 내지 10000 μg, 100 내지 1000 μg, 50 내지 10000 μg, 50 내지 1000 μg 또는 50 내지 500 μg 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 비알콜성 지방간염을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"는 (a) 비알콜성 지방간염의 발전의 억제; (b) 비알콜성 지방간염의 경감; 및 (c) 비알콜성 지방간염의 제거를 의미한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여 (예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효량은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약제학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀에 관한 것이다.
본 발명의 상기 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포의 전구세포에서 분화된 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀 (BxC-e)은 종래의 엑소좀으로서의 특성을 가진 엑소좀이다. 본 발명의 실시예에서 입증한 바와 같이, 상기 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포의 전구세포로부터 분리된 엑소좀의 지방분화 억제 효과가 우수함을 확인하였다(도 2). 또한, 본 발명의 BxC-e는 지방증 (Steatosis)이 유도된 간세포에서 지방형성을 억제하고, 염증을 억제할 뿐만 아니라, 소포체 스트레스를 억제함을 확인하였다 (도 5 내지 도 7).
본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비알콜성 지방간염 치료방법에 관한 것이다.
상기 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 마우스 (mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀의 비알콜성 지방간염 치료 용도에 관한 것이다.
상기 비알콜성 지방간염 치료방법 및 치료용도는 상술한 본 발명의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀 및 이를 포함하는 약제학적 조성물과 구성성분을 공통으로 하기 때문에, 이들 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 전처리 물질로 전처리된, 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPSC)-유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell, MSC)로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포는 SSEA-4 (stage-specific embryonic antigen 4) 단백질을 발현하지 않는 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포로부터 분화된 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "전처리"란 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포의 전구세포의 배양 과정에서 전처리 물질이 첨가된 세포배양 배지를 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포의 전구세포에 접촉시키는 과정을 의미한다.
상기 전처리는 상기 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포를 전처리 물질을 포함하는 세포배양 배지에서 배양하는 방법에 의해 수행될 수 있다.
상기 세포배양 배지는 동물세포 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며, 예를 들어, DMEM(Dulbecco's modification of Eagle's medium), DMEM과 F12의 혼합물, Eagles's MEM(Eagle's minimum essential medium), α-MEM, Iscove's MEM, 199 배지, CMRL 1066, RPMI 1640, F12, F10, Way-mouth's MB752/1, McCoy's 5A 및 MCDB 시리즈 등이 이용될 수 있다.
상기 배양은 6 내지 48시간 동안 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 배양은 6 내지 42시간, 6 내지 36시간, 6 내지 30시간, 6 내지 27시간, 12 내지 48시간, 12 내지 42시간, 12 내지 36시간, 12 내지 30시간, 12 내지 27시간, 18 내지 48시간, 18 내지 42시간, 18 내지 36시간, 18 내지 30시간, 18 내지 27시간, 21 내지 48시간, 21 내지 42시간, 21 내지 36시간, 21 내지 30시간 또는 21 내지 27시간 수행될 수 있다.
상기 전처리 물질은 1-(벤조시아졸일설포닐)-5-클로로-1수소-인돌-2부탄산[1-(6-benzothiazolylsulfonyl)-5-chloro-1H-indole-2-butanoic acid] 또는 엑센딘-4(Exendin-4)일 수 있다.
상기 1-(벤조시아졸일설포닐)-5-클로로-1수소-인돌-2부탄산[1-(6-benzothiazolylsulfonyl)-5-chloro-1H-indole-2-butanoic acid]은 "Lanifibranor"라는 명칭으로 사용될 수 있으며, 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체(peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)의 아고니스트이다.
상기 Lanifibranor는 세포배양 배지 내 1 내지 100 μM의 농도로 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 Lanifibranor는 세포배양 배지 내 1 내지 90 μM, 1 내지 80 μM, 1 내지 70 μM, 1 내지 60 μM, 1 내지 50 μM, 1 내지 40 μM, 1 내지 30 μM, 10 내지 90 μM, 10 내지 80 μM, 10 내지 70 μM, 10 내지 60 μM, 10 내지 50 μM, 10 내지 40 μM 및 10 내지 30 μM의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, Lanifibranor는 배지 내에 1 내지 1000μM, 1 내지 500μM, 1 내지 100μM, 1 내지 90μM, 1 내지 80μM, 1 내지 70μM, 1 내지 60μM, 1 내지 50μM, 1 내지 40μM, 1 내지 30μM, 1 내지 20μM 또는 10μM의 농도로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 엑소좀은 1-(벤조시아졸일설포닐)-5-클로로-1수소-인돌-2부탄산이 1000μM, 1 내지 500μM, 1 내지 100μM, 1 내지 90μM, 1 내지 80μM, 1 내지 70μM, 1 내지 60μM, 1 내지 50μM, 1 내지 40μM, 1 내지 30μM, 1 내지 20μM, 10 내지 90 μM, 10 내지 80 μM, 10 내지 70 μM, 10 내지 60 μM, 10 내지 50 μM, 10 내지 40 μM 및 10 내지 30 μM 또는 10μM의 농도로 첨가된 배지에서 배양된 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포의 전구세포로부터 분리된 엑소좀일 수 있다.
본 발명의 엑센딘-4는 글루카곤 유사 펩타이드 (glucagon-like peptide; GLP) 수용체의 펩타이드 아고니스트이다. 엑센딘-4는 인슐린 분비를 촉진하는 것으로 알려져 있으며, 2형 당뇨 및 파킨슨 질환 치료 용도로서 임상적으로 사용되어 왔다.
상기 엑센딘-4는 세포배양 배지 내 1 내지 100 nM의 농도로 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 엑센딘-4는 세포배양 배지 내 1 내지 90 nM, 1 내지 80 nM, 1 내지 70 nM, 1 내지 60 nM, 1 내지 50 nM, 1 내지 40 nM, 1 내지 30 nM, 10 내지 90 nM, 10 내지 80 nM, 10 내지 70 nM, 10 내지 60 nM, 10 내지 50 nM, 10 내지 40 nM, 10 내지 30 nM 또는 20nM의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 엑소좀은 엑센딘-4가 1 내지 90 nM, 1 내지 80 nM, 1 내지 70 nM, 1 내지 60 nM, 1 내지 50 nM, 1 내지 40 nM, 1 내지 30 nM, 10 내지 90 nM, 10 내지 80 nM, 10 내지 70 nM, 10 내지 60 nM, 10 내지 50 nM, 10 내지 40 nM, 10 내지 30 nM 또는 20nM의 농도로 첨가된 배지에서 배양된 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 약제학적 조성물은 1-(벤조시아졸일설포닐)-5-클로로-1수소-인돌-2부탄산으로 전처리된 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포의 전구세포로부터 분리된 엑소좀을 엑소좀 단백질 기준 1 내지 10000 μg, 1 내지 1000 μg, 10 내지 10000 μg, 10 내지 1000 μg, 100 내지 10000 μg, 100 내지 1000 μg, 50 내지 10000 μg, 50 내지 1000 μg 또는 50 내지 500 μg 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 약제학적 조성물은 엑센딘-4로 전처리된 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포의 전구세포로부터 분리된 엑소좀을 엑소좀 단백질 기준 1 내지 10000 μg, 1 내지 1000 μg, 10 내지 10000 μg, 10 내지 1000 μg, 100 내지 10000 μg, 100 내지 1000 μg, 50 내지 10000 μg, 50 내지 1000 μg 또는 50 내지 500 μg 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 전처리 물질로 전처리된, 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀에 관한 것이다.
본 발명의 상기 전처리 물질로 전처리된, 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀(BxC-V37e 및 BxC-G63e)은 종래의 엑소좀으로서의 특성을 가진 엑소좀이다. 본 발명의 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 BxC-V37e 및 BxC-G63e는 지방증(Steatosis)이 유도된 간세포에서 지방형성을 억제하고, 염증을 억제할 뿐만 아니라, 소포체 스트레스를 억제함을 확인하였다(도 5 내지 도 10).
본 발명의 또 다른 일 양태는 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀을 포함하는 비알콜성 지방간염의 완화, 억제 또는 개선용 식품조성물이다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 전처리 물질로 전처리된, 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀을 포함하는 비알콜성 지방간염의 완화, 억제 또는 개선용 식품조성물이다.
본 발명에 따른 식품조성물은 상술한 본 발명의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀 및 이를 포함하는 약제학적 조성물과 구성성분을 공통으로 하기 때문에, 이들 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 식품 조성물에 포함될 수 있는 탄수화물로는 포도당 과당 등의 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스, 올리고당 등의 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 폴리사카라이드 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 식품 조성물에 포함될 수 있는 향미제는 타우마틴, 스테비아 추출물 등의 천연 향미제 및 사카린, 아스파탐 등의 합성 향미제를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 전처리 물질로 전처리된, 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비알콜성 지방간염 치료방법에 관한 것이다.
상기 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 마우스(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 전처리 물질로 전처리된, 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀의 비알콜성 지방간염 치료 용도에 관한 것이다.
상기 비알콜성 지방간염 치료방법 및 치료용도는 상술한 본 발명의 전처리 물질로 전처리된, 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀 및 이를 포함하는 약제학적 조성물과 구성성분을 공통으로 하기 때문에, 이들 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명은 전처리 물질로 전처리 하거나 또는 전처리 하지 않은 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 엑소좀은 기존 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀에 비하여 보다 개선된 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료 효과를 나타내는 바, 이를 관련 연구개발 및 제품화에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1a는 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-e)의 평균 크기와 분포를 나타낸 도이다.
도 1b는 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-e)의 전자현미경 사진이다.
도 2은 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-e)의 지방분화 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 3a는 LANIFIBRANOR 전처리의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-V37e)의 평균 크기와 분포를 나타낸 도이다.
도 3b는 LANIFIBRANOR 전처리의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-V37e)의 전자현미경 사진이다.
도 4a는 Exendin-4 전처리의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-G63e)의 평균 크기와 분포를 나타낸 도이다.
도 4b는 Exendin-4 전처리의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-G63e)의 전자현미경 사진이다.
도 5는 지방증 (Steatosis)이 유도된 간세포에서 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-e) 및 LANIFIBRANOR 전처리의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-V37e)에 의한 지방형성 (Lipogenesis) 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 6a 및 6b는 지방증 (Steatosis)이 유도된 간세포에서 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-e) 및 LANIFIBRANOR 전처리의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-V37e)에 의한 염증 (Inflammation) 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 7은 지방증 (Steatosis)이 유도된 간세포에서 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-e) 및 LANIFIBRANOR 전처리의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-V37e)에 의한 소포체 스트레스 (ER Stress) 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 8a 내지 8c는 지방증 (Steatosis)이 유도된 간세포에서 Exendin-4 및 Exendin-4 전처리의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-G63e)에 의한 지방형성 (Lipogenesis) 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 9a 및 9b는 지방증 (Steatosis)이 유도된 간세포에서 Exendin-4 및 Exendin-4 전처리의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-G63e)에 의한 염증 (Inflammation) 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 10은 지방증 (Steatosis)이 유도된 간세포에서 Exendin-4 및 Exendin-4 전처리의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-G63e)에 의한 소포체 스트레스 (ER Stress) 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 11a는 지방증이 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (MCD-PBS) 및 BxC-V37e를 처리한 BxC-V37e 처리 군 (MCD-V37e)의 헤마톡실린&에오신 (Hematoxylin&Eosin; H&E) 염색결과를 나타낸 사진이다.
도 11b는 지방증이 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (MCD-PBS) 및 BxC-V37e를 처리한 BxC-V37e 처리 군 (MCD-V37e)의 오일 레드 오 (oil red O) 염색결과를 나타낸 사진이다.
도 12a는 지방증이 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (MCD-PBS) 및 BxC-G63e를 처리한 BxC-G63e 처리 군 (MCD-G63e)의 헤마톡실린&에오신 염색결과 (Hematoxylin&Eosin; H&E)를 나타낸 사진이다.
도 12b는 지방증이 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (MCD-PBS) 및 BxC-G63e를 처리한 BxC-G63e 처리 군 (MCD-G63e)의 오일 레드 오 (oil red O) 염색결과를 나타낸 사진이다.
도 13a는 지방증이 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (MCD-PBS) 및 BxC-V37e를 처리한 BxC-V37e (MCD-V37e) 처리 군의 NAS 점수를 나타낸 그래프이다.
도 13b는 지방증이 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (MCD-PBS) 및 BxC-G63e를 처리한 BxC-G63e (MCD-V63e)처리 군의 NAS 점수를 나타낸 그래프이다.
도 14a는 지방증이 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (MCD-PBS) 및 BxC-V37e를 처리한 BxC-V37e 처리 군 (MCD-V37e)의 면역조직화학염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 14b는 지방증이 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (MCD-PBS) 및 BxC-G63e를 처리한 BxC-G63e 처리 군 (MCD-G63e)의 면역조직화학염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 15a는 섬유화가 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (TAA-PBS) 및 BxC-V37e를 처리한 BxC-V37e (TAA-V37e)처리 군의 간조직을 나타내는 사진이다.
도 15b는 섬유화가 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (TAA-PBS) 및 BxC-G63e를 처리한 BxC-G63e (TAA-G63e)처리 군의 간조직을 나타낸 사진이다.
도 16a는 섬유화가 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (TAA-PBS) 및 BxC-V37e를 처리한 BxC-V37e (TAA-V37e)처리 군의 헤마톡실린&에오신 염색결과를 나타내는 사진이다.
도 16b는 섬유화가 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (TAA-PBS) 및 BxC-G63e를 처리한 BxC-G63e (TAA-G63e)처리 군의 헤마톡실린&에오신 염색결과를 나타내는 사진이다.
도 17a는 섬유화가 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (TAA-PBS) 및 BxC-V37e를 처리한 BxC-V37e (TAA-V37e)처리 군의 피크로시리우스 레드 (picrosirius red) 염색결과를 나타내는 사진이다.
도 17b는 섬유화가 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (TAA-PBS) 및 BxC-G63e를 처리한 BxC-G63e (TAA-G63e)처리 군의 피크로시리우스 레드 (picrosirius red) 염색결과를 나타내는 사진이다.
도 1b는 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-e)의 전자현미경 사진이다.
도 2은 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-e)의 지방분화 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 3a는 LANIFIBRANOR 전처리의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-V37e)의 평균 크기와 분포를 나타낸 도이다.
도 3b는 LANIFIBRANOR 전처리의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-V37e)의 전자현미경 사진이다.
도 4a는 Exendin-4 전처리의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-G63e)의 평균 크기와 분포를 나타낸 도이다.
도 4b는 Exendin-4 전처리의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-G63e)의 전자현미경 사진이다.
도 5는 지방증 (Steatosis)이 유도된 간세포에서 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-e) 및 LANIFIBRANOR 전처리의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-V37e)에 의한 지방형성 (Lipogenesis) 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 6a 및 6b는 지방증 (Steatosis)이 유도된 간세포에서 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-e) 및 LANIFIBRANOR 전처리의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-V37e)에 의한 염증 (Inflammation) 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 7은 지방증 (Steatosis)이 유도된 간세포에서 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-e) 및 LANIFIBRANOR 전처리의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-V37e)에 의한 소포체 스트레스 (ER Stress) 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 8a 내지 8c는 지방증 (Steatosis)이 유도된 간세포에서 Exendin-4 및 Exendin-4 전처리의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-G63e)에 의한 지방형성 (Lipogenesis) 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 9a 및 9b는 지방증 (Steatosis)이 유도된 간세포에서 Exendin-4 및 Exendin-4 전처리의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-G63e)에 의한 염증 (Inflammation) 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 10은 지방증 (Steatosis)이 유도된 간세포에서 Exendin-4 및 Exendin-4 전처리의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀 (BxC-G63e)에 의한 소포체 스트레스 (ER Stress) 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 11a는 지방증이 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (MCD-PBS) 및 BxC-V37e를 처리한 BxC-V37e 처리 군 (MCD-V37e)의 헤마톡실린&에오신 (Hematoxylin&Eosin; H&E) 염색결과를 나타낸 사진이다.
도 11b는 지방증이 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (MCD-PBS) 및 BxC-V37e를 처리한 BxC-V37e 처리 군 (MCD-V37e)의 오일 레드 오 (oil red O) 염색결과를 나타낸 사진이다.
도 12a는 지방증이 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (MCD-PBS) 및 BxC-G63e를 처리한 BxC-G63e 처리 군 (MCD-G63e)의 헤마톡실린&에오신 염색결과 (Hematoxylin&Eosin; H&E)를 나타낸 사진이다.
도 12b는 지방증이 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (MCD-PBS) 및 BxC-G63e를 처리한 BxC-G63e 처리 군 (MCD-G63e)의 오일 레드 오 (oil red O) 염색결과를 나타낸 사진이다.
도 13a는 지방증이 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (MCD-PBS) 및 BxC-V37e를 처리한 BxC-V37e (MCD-V37e) 처리 군의 NAS 점수를 나타낸 그래프이다.
도 13b는 지방증이 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (MCD-PBS) 및 BxC-G63e를 처리한 BxC-G63e (MCD-V63e)처리 군의 NAS 점수를 나타낸 그래프이다.
도 14a는 지방증이 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (MCD-PBS) 및 BxC-V37e를 처리한 BxC-V37e 처리 군 (MCD-V37e)의 면역조직화학염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 14b는 지방증이 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (MCD-PBS) 및 BxC-G63e를 처리한 BxC-G63e 처리 군 (MCD-G63e)의 면역조직화학염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 15a는 섬유화가 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (TAA-PBS) 및 BxC-V37e를 처리한 BxC-V37e (TAA-V37e)처리 군의 간조직을 나타내는 사진이다.
도 15b는 섬유화가 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (TAA-PBS) 및 BxC-G63e를 처리한 BxC-G63e (TAA-G63e)처리 군의 간조직을 나타낸 사진이다.
도 16a는 섬유화가 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (TAA-PBS) 및 BxC-V37e를 처리한 BxC-V37e (TAA-V37e)처리 군의 헤마톡실린&에오신 염색결과를 나타내는 사진이다.
도 16b는 섬유화가 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (TAA-PBS) 및 BxC-G63e를 처리한 BxC-G63e (TAA-G63e)처리 군의 헤마톡실린&에오신 염색결과를 나타내는 사진이다.
도 17a는 섬유화가 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (TAA-PBS) 및 BxC-V37e를 처리한 BxC-V37e (TAA-V37e)처리 군의 피크로시리우스 레드 (picrosirius red) 염색결과를 나타내는 사진이다.
도 17b는 섬유화가 유도된 마우스의 간세포에 물질을 처리하지 않은 노말 군 (Normal), PBS를 처리한 대조군 (TAA-PBS) 및 BxC-G63e를 처리한 BxC-G63e (TAA-G63e)처리 군의 피크로시리우스 레드 (picrosirius red) 염색결과를 나타내는 사진이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 ““는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
제조예: 유도만능줄기세포 (iPSC)-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)의 분리 및 배양
먼저 유도만능줄기세포 (iPSC)를 10%의 FBS 및 10 ng/ml의 bFGF를 첨가한 DMEM에서 7일간 배양하였다. 다음으로, 배양된 유도만능줄기세포에서 FACS를 통하여 세포 표면에 SSEA-4 (stage-specific embryonic antigen 4) 단백질을 발현하지 않는 SSEA-4 (-) 세포를 분리하여 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포의 전구세포를 수득하였다. 또한 분리된 SSEA-4 (-) 세포를 계대하여 상기와 동일한 배지에서 7일간 추가 배양하여, 본 발명의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포를 제작하였다. 본 발명자들은 상기 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포를 BxC (brexogen stem cell)로 명명하였다.
BxC로 명명된 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포를 배양배지[high glucose DMEM (Gibco, Cat no.11995-065), 10% Fetal bovine Serum (HyClone), 1% MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) (Gibco, Cat no.11140-050)]에서 추가 배양하였다.
실시예 1: 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC) 유래 엑소좀 (BxC-e) 분리
상기 제조예에서 배양된 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (이하, BxC) 배양배지를 수거하여 300xg에서 10분간 원심분리하여 남아있는 세포와 세포잔여물을 제거하였다. 상층액을 취하여 0.22μm 필터를 이용하여 여과한 다음, 고속원심분리기 (high speed centrifuge)를 이용하여 10,000xg, 4℃에서 70분간 원심분리하였다. 원심분리된 상층액을 다시 취하여 초원심분리기 (ultracentrifuge)를 이용하여 100,000xg, 4℃에서 90분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 하층에 남아있는 엑소좀을 PBS (phosphate bufferd salin)에 희석하여 이하의 실험에 사용하였다.
실험예 1: 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀 (BxC-e) 특성 확인
상기 실시예 1에서 분리된 엑소좀 (이하, BxC-e)에 대하여, nanoparticle tracking assay (NanoSight NS300, Malvern)를 이용하여 엑소좀의 크기 분포를 확인하고, 전자 현미경을 이용하여 엑소좀의 형태를 확인하였다.
도 1a 및 1b에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 BxC로부터 유래한 엑소좀은 엑소좀으로서의 특성을 가짐을 알 수 있다.
실험예 2: 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀 (BxC-e)의 지방세포 분화 억제 효과 확인
상기 실시예 1에서 분리된 엑소좀에 대하여, 지방분화 억제 효과를 확인하였다.
인간 지방세포 (primary human adipocyte, ATCC, USA)를 6-웰 플레이트에 분주하고 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 10% CS가 첨가된 DMEM 배지 (Gibco, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 콘플루언트 (confluent) 한 상태로 자랄 때까지 (최대 6일) 배양시켰다.
지방세포를 6일 배양한 후, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지 (Gibco, USA)에 지방 분화 배지[34μM 판토텐산염 (pantothenate, Sigma), 66μM 비오틴 (biotin, Sigma), 0.5mM 인슐린 (Sigma), 1mM 덱사메타손 (dexamethasone, Sigma) 및 0.05M IBMX (Sigma)]가 첨가된 기본 배지에서 5일간 배양하였다. 그 다음, DMEM 배지 (Gibco, USA)에 지방 분화 배지[34μM 판토텐산염 (pantothenate, Sigma), 66μM 비오틴 (biotin, Sigma), 0.5mM 인슐린 (Sigma) 및 1mM 덱사메타손 (dexamethasone, Sigma)]가 첨가된 배지에서 추가적으로 9일간 배양하였다.
이때, Negative Control은 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 14일간 배양한 지방세포, Vehicle control은 BxC-e를 처리하지 않고 지방분화 조건에서 14일간 배양된 지방세포이며, BxC-e 처리군은 BxC-e가 포함된 지방분화 조건에서 14일간 배양된 지방세포이다.
배양액을 완전히 제거한 후, PBS로 두 번 세척하고 10% 포르말린 용액을 400 ul/well로 첨가하여 세포를 1시간 동안 고정시켰다. PBS로 세척하고 Oil-red O working solution을 400 ul/well당 첨가하여 2시간동안 분화된 지방세포내의 지방을 염색시켰다. 그 다음, Oil-red O working solution을 제거하고 2차 증류수를 사용하여 웰의 기벽에 묻어 있는 Oil-red O working solution을 완전히 제거한 후, 건조기에 넣고 5분간 건조시킨 후 아이소프로필 알코올 (isopropyl alcohol)을 500 ul/well이 되도록 웰에 첨가하였다.
마이크로 플레이트 리더 (Model 680 microplate reader, Bio-Rad, USA)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하여 지방의 양을 비교하였다.
도 2에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 BxC로부터 유래한 엑소좀 (BxC-e)은 지방세포의 지방형성 (lipogenesis)을 억제하는 효과가 뛰어난 것을 알 수 있었다.
실시예 2: 전처리 물질의 처리에 따른 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀 분리
2-1. LANIFIBRANOR 처리에 따른 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀 (BxC-V37e)
LANIFIBRANOR 10μM이 포함된 배양배지[high glucose DMEM (Gibco, Cat no.11995-065); 10% Fetal bovine Serum (HyClone), 1% MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) (Gibco, Cat no.11140-050)]에서 상기 제조예에서 제조된 유도만능줄기세포 (iPSC)-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)를 24시간 배양하였다.
배양을 완료한 후 LANIFIBRANOR이 전처리 된 BxC를 세척하고 엑소좀이 제거된 우태아혈청 (FBS)을 10% 첨가한 배양배지에서 추가적으로 72시간 배양하였다. 엑소좀이 제거된 FBS를 사용하는 이유는 일반적으로 사용하는 FBS에는 소 혈청유래의 엑소좀이 매우 많이 포함되어 있기 때문에, 세포가 분비하는 엑소좀 외에 FBS 유래 엑소좀이 혼입되는 것을 방지하기 위함이다.
72시간 배양 후 전처리 물질이 처리된 BxC 배양배지를 수거하여 300xg에서 10분간 원심분리하여 남아있는 세포와 세포잔여물을 제거하였다. 상층액을 취하여 0.22μm 필터를 이용하여 여과한 다음, 고속원심분리기 (high speed centrifuge)를 이용하여 10,000xg, 4℃에서 70분간 원심분리하였다. 원심분리된 상층액을 다시 취하여 초원심분리기 (ultracentrifuge)를 이용하여 100,000xg, 4℃에서 90분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 하층에 남아있는 엑소좀을 PBS (phosphate bufferd salin)에 희석하여 이하의 실험에 사용하였다.
2-2. Exendin-4 처리에 따른 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀 (BxC-G63e)
상기 실시예 2-1의 LANIFIBRANOR 대신 Exendin-4 (20nM)를 처리한 것을 제외하고, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 엑소좀을 분리하였다.
실험예 3: 전처리 물질의 처리에 따른 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀 특성 확인
상기 실시예 2에서 분리된 각각의 엑소좀 (BxC-V37e 및 BxC-G63e)에 대하여, nanoparticle tracking assay (NanoSight NS300, Malvern)를 이용하여 엑소좀의 크기 분포를 확인하고, 전자 현미경을 이용하여 엑소좀의 형태를 확인하였다.
도 3a 내지 4b에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 IVA337 처리에 따른 BxC 유래 엑소좀 (도 3a 및 3b) 및 Exendin-4 처리에 따른 BxC 유래 엑소좀 (도 4a 및 4b) 모두 엑소좀으로서의 특성을 가짐을 알 수 있다.
실험예 4: LANIFIBRANOR 처리에 따른 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀 (BxC-V37e)의 비알콜성 지방간염 치료 활성 평가
상기 실시예 1에서 분리된 엑소좀 (BxC-e) 및 상기 실시예 2-1에서 분리된 엑소좀 (BxC-V37e)에 대하여, 하기와 같이 실험하였다.
4-1. 지방증 (Steatosis) 유도
재료 및 시약
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지는 Hyclone (Pittsburgh, PA, USA)사에서, FBS (fetal bovine serum)는 Gibco (Grand Island, NY, USA)사에서 구입하였다. 유리지방산이 포함되지 않은 BSA (Fatty acid-free bovine serum albumin), 팔미트산염 (palmitate) 및 올레산염 (oleate)은 Sigma (St.Louis, MO, USA)사에서 구입하였다.
인간간세포주 (HepG2) 배양
인간간세포주 (HepG2, ATTC)는 10% FBS (Gibco), 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에서 37℃에서, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 배양된 세포는 6-웰 플레이트에 일정한 수 (5x 105 cells/1000㎕ well)로 분주한 후, 세포가 웰에 완전히 붙어 세포의 모양을 갖춘 후 세포가 95%의 포화도에 도달했을 때 사용하였다.
유리지방산 (Free Fatty Acid; FFA) 제조
(1) 1M palmitate 및 1M oleate 저장용액의 제조
60℃에서 70% 에탄올과 3차 증류수 (ddH2O)를 용매로 이용하여 제조하고, 0.2μm의 필터를 이용하여 여과한 후, 멸균하였다.
(2) 유리지방산이 포함되지 않은 1% (w/v)의 BSA 용액의 제조
3차 증류수를 용매로 이용하여 제조한 후 멸균하고, 4℃냉장보관 하였다.
(3) palmitate 및 oleate의 농도가 100mM이 되도록 혼합한 혼합지방산 제조
상기 (2)에서 제조한 유리지방산이 포함되지 않은 1% (w/v)의 BSA 용액을 용매로 이용하여, 상기 (1)에서 제조한 지방산의 농도가 100mM이 되도록 제조하였다. [상기 (1)에서 제조한 1M palmitate 10μl + 1% (w/v)의 BSA 290μl (33mM)] 및 [상기 (1)에서 제조한 1M oleate 10μl + 1% (w/v)의 BSA 140μl (66mM)]를 1:1 볼륨으로 70℃heatblock에서 섞어주었다.
(4) 최종농도 1mM의 혼합 유리지방산 (FFA) 제조.
무균 환경에서 상기 (3)에서 제조한 혼합지방산 100mM 용액 10μl(1% (w/v)의 BSA를 포함하는 oleate 및 palmitate가 2:1의 농도비로 혼합)를 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 serum-free DMEM 배지 990μl에 혼합하여 FFA의 최종농도가 1mM이 되도록 제조하였다.
(5) BSA 대조용액의 제조
상기 (2)에서 제조한 1% (w/v)의 BSA를 대조용액으로 사용하였다.
지방증 (Steatosis) 유도
상기 95% 포화도에 도달한 HepG2 세포의 배지를 버리고 PBS로 1회 세척해준 뒤, 상기 (4)에서 제조한 1mM 혼합 유리지방산을 6-웰에 각 웰당 1ml씩 넣어주었다. Vehicle Control은 vehicle이 동량 처리된 serum-free 배지를 넣어주었다. 모든 처리는 overnight (16시간) 해주었다.
4-2. 비알콜성 지방간염 치료 활성 평가
상기 16시간 처리된 HepG2 세포를 PBS로 1회 세척하고, 상기 실시예에서 분리된 BxC-e 100μg 및 상기 실시예 2에서 분리된 BxC-V37e 100μg을 각각 1ml serum-free 배지에 24시간 동안 처리해준 후, 하기 각 실험을 진행하였다.
① 지방형성 (Lipogenesis) 억제 효과
6-웰 플레이트의 웰당 트리졸 용액 1ml를 첨가하여 인간 간세포를 분해한 후 클로로포름 (chloroform) 200μl를 첨가하고 볼텍스 (vortex)한 뒤, 4℃, 12,000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상층액을 새 튜브로 옮긴 후 이소프로판올 (isoprophanol) 500μl와 섞어주었다. 50회 업&다운해준 뒤, 5분 동안 아이스에 방치한 후, 12,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리시켜 상층액을 제거하였다. 남은 침전물에 70% 에탄올 1 ml를 가한 후, 12,000rpm, 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 에탄올을 제거한 후 RNA 침전물이 담긴 튜브를 실온에서 보이지 않을 동안 건조시키고, nuclease free water를 사용하여 RNA 펠렛을 용해시켰다. Nanodrop을 이용하여 260 nm 및 280 nm 파장에서 추출된 RNA 시료의 농도를 측정하고 RT premix를 사용하여 cDNA를 합성하였다.
합성한 cDNA와 제작한 프라이머 (코스모진텍) (하기 표 1 참조)를 사용하여 Real time PCR (Real time-polymerase chain reaction)를 이용하여 FABP4의 mRNA 발현 변화를 확인하였다.
| 유전자 | 프라이머 | 서열 (5’-3’) |
| FABP4 | F | GCATGGCCAAACCTAACATG (서열번호 1) |
| R | CCTGGCCCAGTATGAAGGAA (서열번호 2) |
도 5에서 확인할 수 있듯이, 인간 간세포에 지방증 (steatosis)을 유도하고 BxC-V37e를 처리한 군에서 지방형성에 관련하는 FABP4 유전자 발현이 처리하지 않은 군보다 감소되었다. 이를 통해, BxC-V37e의 지방형성 억제 기능이 매우 뛰어남을 확인할 수 있었다.
② 염증 (Inflammation) 억제 효과
상기 실시예 4-①과 동일한 방법을 이용하여, TNF-α 및 MCP1의 mRNA 발현 변화를 확인하였다. 사용한 유전자의 프라이머는 하기 표 2에 나타내었다.
| 유전자 | 프라이머 | 서열 (5’-3’) |
| TNF-α | F | GAGCTGAACAATAGGCTGTTCCCA (서열번호 3) |
| R | AGAGGCTCAGCAATGAGTGACAGT (서열번호 4) | |
| MCP1 | F | TCTGTGCCTGCTGCTCATAG (서열번호 5) |
| R | GGGCATTGATTGCATCTGGC (서열번호 6) |
도 6a 및 6b에서 확인할 수 있듯이, 인간 간세포에 지방증 (steatosis)을 유도하고 BxC-V37e를 처리한 군에서 염증 유도 시 발현되는 TNF-α와 MCP-1의 발현이 처리하지 않은 군보다 현저히 감소되었다. 이를 통해, 지방형성에 의해 유도된 염증환경에서 BxC-V37e의 염증 억제 기능이 매우 뛰어남을 확인할 수 있었다.
③ 소포체 스트레스 (ER Stress) 억제 효과
상기 실시예 4-①과 동일한 방법을 이용하여, CHOP의 mRNA 발현 변화를 확인하였다. 사용한 유전자의 프라이머는 하기 표 3에 나타내었다.
| 유전자 | 프라이머 | 서열 (5’-3’) |
| CHOP | F | AGGGAGAACCAGGAAACGGAAACA (서열번호 7) |
| R | TCCTGCTTGAGCCGTTCATTCTCT (서열번호 8) |
도 7에서 확인할 수 있듯이, 인간 간세포에 지방증 (steatosis)을 유도하고 BxC-V37e를 처리한 군에서 소포체 스트레스에 관련되는 CHOP 유전자 발현이 처리하지 않은 군보다 현저히 감소되었다. 이를 통해, BxC-V37e의 지방형성에 의해 유도된 소포체 스트레스 억제 기능이 매우 뛰어남을 확인할 수 있었다.
실험예 5: Exendin-4 처리에 따른 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀 (BxC-G63e)의 비알콜성 지방간염 치료 활성 평가
Exendin-4 및 상기 실시예 2-2에서 분리된 엑소좀 (BxC-G63e)에 대하여, 하기와 같이 실험하였다.
5-1. 지방증 (Steatosis) 유도
재료 및 시약
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지는 Hyclone (Pittsburgh, PA, USA)사에서, FBS (fetal bovine serum)는 Gibco (Grand Island, NY, USA)사에서 구입하였다. 유리지방산이 포함되지 않은 BSA (Fatty acid-free bovine serum albumin), 팔미트산염 (palmitate) 및 올레산염 (oleate)은 Sigma (St.Louis, MO, USA)사에서 구입하였다.
인간간세포주 (HepG2) 배양
인간간세포주 (HepG2, ATTC)는 10% FBS (Gibco), 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에서 37℃에서, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 배양된 세포는 6-웰 플레이트에 일정한 수 (5x 105 cells/1000㎕ well)로 분주한 후, 세포가 웰에 완전히 붙어 세포의 모양을 갖춘 후 세포가 95%의 포화도에 도달했을 때 사용하였다.
유리지방산 (Free Fatty Acid; FFA) 제조
(1) 1M palmitate 및 1M oleate 저장용액의 제조
60℃에서 70% 에탄올과 3차 증류수 (ddH2O)를 용매로 이용하여 제조하고, 0.2μm의 필터를 이용하여 여과한 후, 멸균하였다.
(2) 유리지방산이 포함되지 않은 1% (w/v)의 BSA 용액의 제조
3차 증류수를 용매로 이용하여 제조한 후 멸균하고, 4℃냉장보관 하였다.
(3) palmitate 및 oleate의 농도가 100mM이 되도록 혼합한 혼합지방산 제조
상기 (2)에서 제조한 유리지방산이 포함되지 않은 1% (w/v)의 BSA 용액을 용매로 이용하여, 상기 (1)에서 제조한 지방산의 농도가 100mM이 되도록 제조하였다. [상기 (1)에서 제조한 1M palmitate 10μl + 1% (w/v)의 BSA 290μl (33mM)] 및 [상기 (1)에서 제조한 1M oleate 10μl + 1% (w/v)의 BSA 140μl (66mM)]를 1:1 볼륨으로 70℃heatblock에서 섞어주었다.
(4) 최종농도 1mM의 혼합 유리지방산 (FFA) 제조.
무균 환경에서 상기 (3)에서 제조한 혼합지방산 100mM 용액 10μl (1% (w/v)의 BSA를 포함하는 oleate 및 palmitate가 2:1의 농도비로 혼합)를 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 serum-free DMEM 배지 990μl에 혼합하여 FFA의 최종농도가 1mM이 되도록 제조하였다.
(5) BSA 대조용액의 제조
상기 (2)에서 제조한 1% (w/v)의 BSA를 대조용액으로 사용하였다.
지방증 (Steatosis) 유도
상기 95% 포화도에 도달한 HepG2 세포의 배지를 버리고 PBS로 1회 세척해준 뒤, 상기 (4)에서 제조한 1mM 혼합 유리지방산을 6-웰에 각 웰당 1ml씩 넣어주었다. Vehicle Control은 vehicle이 동량 처리된 serum-free 배지를 넣어주었다. 모든 처리는 overnight (16시간) 해주었다.
5-2. 비알콜성 지방간염 치료 활성 평가
상기 16시간 처리된 HepG2 세포를 PBS로 1회 세척하고, 20nM Exendin-4 100μg 또는 상기 실시예 2에서 분리된 BxC-G63e 100μg을 1ml serum-free 배지에 24시간 동안 처리해준 후, 하기 각 실험을 진행하였다.
① 지방형성 (Lipogenesis) 억제 효과
6-웰 플레이트 웰당 트리졸 용액 1ml를 첨가하여 인간 간세포를 분해한 후 클로로포름 (chloroform) 200μl를 첨가하고 볼텍스 (vortex)한 뒤, 4℃, 12,000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상층액을 새 튜브로 옮긴 후 이소프로판올 (isoprophanol) 500μl와 섞어주었다. 50회 업&다운해준 뒤, 5분 동안 아이스에 방치한 후, 12,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리시켜 상층액을 제거하였다. 남은 침전물에 70% 에탄올 1 ml를 가한 후, 12,000rpm, 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 에탄올을 제거한 후 RNA 침전물이 담긴 튜브를 실온에서 보이지 않을 동안 건조시키고, nuclease free water를 사용하여 RNA 펠렛을 용해시켰다. Nanodrop을 이용하여 260 nm 및 280 nm 파장에서 추출된 RNA 시료의 농도를 측정하고 RT premix를 사용하여 cDNA를 합성하였다.
합성한 cDNA와 제작한 프라이머 (코스모진텍) (하기 표 4 참조)를 사용하여 Real time PCR (Real time-polymerase chain reaction)를 이용하여 FABP4, ACC1 및 SREBP1의 mRNA 발현 변화를 확인하였다.
| 유전자 | 프라이머 | 서열 (5’-3’) |
| FABP4 | F | GCATGGCCAAACCTAACATG (서열번호 1) |
| R | CCTGGCCCAGTATGAAGGAA (서열번호 2) | |
| ACC1 | F | GCTCCTTGTCACCTGCTTCT (서열번호 9) |
| R | CAAGGCCAAGCCATCCTGTA (서열번호 10) | |
| SREBP1 | F | GGAGGGGTAGGGGCCAACGC (서열번호 11) |
| R | CATGTCTTCGAAAGTGCAAT (서열번호 12) |
도 8a 내지 8c에서 확인할 수 있듯이, 인간 간세포에 지방증 (steatosis)을 유도하고 BxC-G63e를 처리한 군에서 지방형성에 관련하는 FABP4, ACC1, SREBP1 유전자 발현이 처리하지 않은 군보다 감소되었다. 이를 통해, BxC-G63e의 지방형성 억제 기능이 매우 뛰어남을 확인할 수 있었다.
② 염증 (Inflammation) 억제 효과
상기 실시예 5-①과 동일한 방법을 이용하여, TNF-α 및 IL-10의 mRNA 발현 변화를 확인하였다. 사용한 유전자의 프라이머는 하기 표 5에 나타내었다.
| 유전자 | 프라이머 | 서열 (5’-3’) |
| TNF-α | F | GAGCTGAACAATAGGCTGTTCCCA (서열번호 3) |
| R | AGAGGCTCAGCAATGAGTGACAGT (서열번호 4) | |
| IL-10 | F | TGAAAACAAGAGCAAGGCCG (서열번호 13) |
| R | GCCACCCTGATGTCTCAGTT (서열번호 14) |
도 9a 및 9b에서 확인할 수 있듯이, 인간 간세포에 지방증 (steatosis)을 유도하고 BxC-G63e를 처리한 군에서 TNF-α와 IL-10의 발현을 확인한 결과 pro-inflammation 기능을 하는 TNF-α의 발현은 현저히 감소하였으며, anti- inflammation 기능을 하는 IL-10의 발현은 대조군에 비하여 현저히 증가하였다. 이를 통해, 지방형성에 의해 유도된 염증환경에서 BxC-G63e의 염증 억제 기능이 매우 뛰어남을 확인할 수 있었다.
③ 소포체 스트레스 (ER Stress) 억제 효과
상기 실시예 5-①과 동일한 방법을 이용하여, CHOP의 mRNA 발현 변화를 확인하였다. 사용한 유전자의 프라이머는 상기 표 3에 나타내었다.
도 10에서 확인할 수 있듯이, 인간 간세포에 지방증 (steatosis)을 유도하고 BxC-G63e를 처리한 군에서 소포체 스트레스에 관련되는 CHOP 유전자 발현이 처리하지 않은 군보다 현저히 감소되었다. 이를 통해, BxC-G63e의 지방형성에 의해 유도된 소포체 스트레스를 억제 기능이 매우 뛰어남을 확인할 수 있었다.
실험예 6: MCD-diet 마우스 모델을 이용한 BxC-V37e 및 BxC-G63e의 비알콜성 지방간염 치료 활성 평가
상기 실시예 2-1에서 분리된 엑소좀 (BxC-V37e) 및 상기 실시예 2-2에서 분리된 엑소좀 (BxC-G63e)에 대하여, 하기와 같이 실험하였다.
6-1. MCD-diet 마우스의 지방증 유도
MCD diet 마우스 사육환경
C57BL/6NHsd 수컷 마우스를 온도 23±3 ℃, 상대습도 55±15 %, 환기횟수 10∼20 회/hr, 조명시간 12 시간 (오전 8 시 점등∼오후 8 시 소등) 및 조도 150∼300 Lux로 설정한 환경에서 사육하면서, 환경조건을 정기적으로 측정하였다.
MCD diet 급여
6주령 된 C57BL/6NHsd 수컷 마우스에 MCD diet를 5 일간 공급하고 이후 2 일간은 정상사료를 공급하는 방식으로 12주 동안 MCD diet 및 정상사료를 번갈아가며 자유롭게 섭취하도록 하였다.
투여시험물질의 조제 및 투여
BxC-G63e 또는 BxC-V37e를 PBS에 희석하여 각각의 시험물질을 조제하였다. 시험물질의 단백질양 100μg/head 내지 400μg/head을 1 일 1 회, 주 3 회, 4 주간 정맥투여 하였으며, 시험물질 투여 시, 6주령 C57BL/6NHsd 수컷 마우스를 보정틀에 넣어 고정하고, 26 gauge 주사 바늘이 장착된 주사기를 이용하여 미정맥을 통해 1 mL/min 이내의 속도로 천천히 주입하였다.
6-2. 비알콜성 지방간염 치료 활성 평가
상기 시험물질이 투여된 C57BL/6NHsd 수컷 마우스의 간을 적출하여 사진촬영 한 후 중량을 측정하고, 간의 우엽은 10 % 중성완충포르말린용액에 고정하였으며, 간의 좌엽은 액체질소를 이용하여 급속 냉동시켜, 이하의 실험에 사용하였다.
① 지방형성 (Lipogenesis) 억제 효과
조직병리학적 검사
고정된 간 조직을 삭정, 탈수, 파라핀 포매, 박절 등 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 조직병리학적 검사를 위한 검체를 제작한 뒤, 헤마톡실린 (Hematoxylin&Eosin; H&E) 및 오일 레드 오 (oil red O) 염색을 실시하고, 광학 현미경 (Olympus BX53, Japan)을 이용하여 조직병리학적 변화를 관찰하였다.
NAS scoring
미세공포성 지방증 (Microvesicular steatosis), 거대공포성 지방증 (Macrovesicular steatosis), 간세포 비대 (hypertrophy)에 대하여 40 배율 또는 100 배율의 현미경 시야로 관찰하여 관찰대상 면적에서 차지하는 면적에 따라 0-3 점을 각각 부여하였으며, 염증은 100 배율 시야에서 무작위로 5 부위를 선택하여 0-3 점으로 점수화한 뒤 군간 비교하였다.
도 11a 내지 11b와 도 12a 내지 12b에서 확인할 수 있듯이, MCD diet을 통해 지방증 (steatosis)을 유도하고 BxC-G63e 또는 BxC-V37e를 처리한 군에서 lipid droplet의 크기와 수가 시험물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 월등이 감소된 것이 관찰되었다.
또한, 도 13a 또는 도 13b를 통해 알 수 있듯이, 미세공포성 지방증 (Microvesicular steatosis), 거대공포성 지방증 (Macrovesicular steatosis), 간세포 비대(hypertrophy)의 NAS score가 모두 감소하였다. 이를 통해, BxC-G63e 또는 BxC-V37e의 지방형성 억제 기능이 매우 뛰어남을 확인하였다.
② 염증 (Inflammation) 억제 효과
고정된 간 조직을 삭정, 탈수, 파라핀 포매, 박절 등 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 면역조직화학염색을 위한 검체를 제작한 뒤, 1차 항체로 항-TNF-α (anti-TNF-α)로 반응시킨 후, 이에 특이적인 2차 항체와 다시 반응시킨 후, TNF-α protein 발현 변화를 관찰하였다.
실험결과, 도 14a와 도 14b에서 관찰할 수 있듯이, MCD diet을 통해 염증 (inflammation)을 유도하고 BxC-G63e 또는 BxC-V37e를 처리한 군이 PBS를 처리한 대조군에 비해 TNF-α protein 발현이 월등히 감소된 것을 확인하였다. 또한, 도 13a에서 확인할 수 있듯이, BxC-V37e를 처리한 군에서 inflammation score가 감소된 것을 확인하였다. 따라서, BxC-G63e 또는 BxC-V37e의 염증 억제 기능이 매우 뛰어남을 확인하였다.
실험예 7: 3.
TAA 마우스 모델을 이용한 BxC-V37e 및 BxC-G63e의 비알콜성 지방간염 치료 활성 평가
상기 실시예 2-1에서 분리된 엑소좀 (BxC-V37e) 및 상기 실시예 2-2에서 분리된 엑소좀 (BxC-G63e)에 대하여, 하기와 같이 실험하였다.
7-1. TAA 마우스의 섬유화 유도
TAA diet 마우스 사육환경
C57BL/6 수컷 마우스를 온도 23±3 ℃, 상대습도 55±15 %, 환기횟수 10∼20 회/hr, 조명시간 12 시간 (오전 8 시 점등∼오후 8 시 소등) 및 조도 150∼300 Lux로 설정한 환경에서 사육하면서, 환경조건을 정기적으로 측정하였다.
TAA 약물 투여
6주령 된 C57BL/6 수컷 마우스에 200mg/kg 농도의 TAA를 1 일 1 회, 주 3 회, 12 주 동안 투여하였다.
투여시험물질의 조제 및 투여
BxC-G63e 또는 BxC-V37e를 PBS에 희석하여 각각의 시험물질을 조제하였다. 시험물질을 400μg/head 씩 1 일 1 회, 주 3 회, 4 주간 피하투여 하였으며, 동시에 200mg/kg 농도의 TAA를 1일 1회, 주 2 회, 4 주간 투여하였다. 시험물질 투여 시, 투여부위를 70 % 알코올로 소독하고, 엄지와 검지로 오른쪽 마우스 대퇴부의 피부를 잡아당겨 피부와 근육 사이에 공간을 만든 후 동물의 전방으로부터 엄지와 검지사이의 피하공간에 인슐린 시린지를 이용하여 찔러 넣고 그대로 투여하였다.
7-2. 비알콜성 지방간염 치료 활성 평가
상기 시험물질이 투여된 C57BL/6 수컷 마우스의 간을 적출하여 사진촬영 한 후 중량을 측정하고, 간의 우엽은 10 % 중성완충포르말린용액에 고정하였으며, 간의 좌엽은 액체질소를 이용하여 급속 냉동시켜, 이하의 실험에 사용하였다.
① 섬유증 (Fibrosis) 억제 효과
조직병리학적 검사
고정된 조직은 삭정, 탈수, 파라핀 포매, 박절 등 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 조직병리학적 검사를 위한 검체를 제작한 뒤, 헤마톡실린&에오신 (Hematoxylin&Eosin; H&E) 및 피크로시리우스 레드 (picrosirius red 염색을 실시하였고, 광학 현미경 (Olympus BX43, Japan)을 이용하여 조직병리학적 변화를 관찰하였다.
도 15a 내지 도 15b에서 확인할 수 있듯이 아무처리도 하지 않은 Nomal 군에 비해 TAA-PBS 군의 간조직 표면이 매끄럽지 않은 것을 확인할 수 있었고, BxC-G63e 또는 BxC-V37e를 처리해 주었을 때는 간조직이 상당히 회복된 것을 관찰할 수 있었다.
또한 도 16a 내지 도 16b를 통해 확인할 수 있듯이, H&E 염색결과, TAA에 의해 손상된 간조직이 BxC-G63e 또는 BxC-V37e에 의해 눈에 띄게 회복된 것을 관찰할 수 있었다.
그리고, 도 17a 내지 도 17b에서 확인할 수 있듯이, 피크로시리우스 레드 염색결과, TAA에 의한 간조직 내 축적된 콜라겐 양이 BxC-G63e 또는 BxC-V37e에 의해 훨씬 감소한 것을 확인할 수 있었다.
종합해봤을 때, BxC-G63e 또는 BxC-V37e의 섬유화 억제 기능이 매우 뛰어남을 확인할 수 있었다
소결
상기 내용을 종합해 보면, 본 발명의 BxC-e, BxC-V37e 및 BxC-G63e는 지방증(Steatosis)이 유도된 간세포에서 지방형성을 억제하고, 염증을 억제할 뿐만 아니라, 소포체 스트레스를 억제시키므로 비알콜성 지방간염의 예방 또는 치료 효능이 탁월함을 알 수 있다.
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- 전처리 물질로 전처리된, 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPSC)-유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell, MSC)로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하고,
상기 전처리 물질은 1-(벤조시아졸일설포닐)-5-클로로-1수소-인돌-2부탄산[1-(6-benzothiazolylsulfonyl)-5-chloro-1H-indole-2-butanoic acid] 및 엑센딘-4 (Exendin-4)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인,
비알콜성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis)의 예방, 완화, 억제 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포는 SSEA-4 (stage-specific embryonic antigen 4) 단백질을 발현하지 않는 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포로부터 분화된 것인, 조성물.
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- 제6항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포는 인간 유래의 유도만능줄기세포인 것인, 조성물.
- 전처리 물질로 전처리된, 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC)-유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell; MSC)로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하고,
상기 전처리 물질은 1-(벤조시아졸일설포닐)-5-클로로-1수소-인돌-2부탄산[1-(6-benzothiazolylsulfonyl)-5-chloro-1H-indole-2-butanoic acid] 및 엑센딘-4 (Exendin-4)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인,
비알콜성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis)의 완화, 억제 또는 개선용 식품 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포는 SSEA-4 (stage-specific embryonic antigen 4) 단백질을 발현하지 않는 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포로부터 분화된 것인, 조성물
- 제10항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포는 인간 유래의 유도만능줄기세포인 것인, 조성물.
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