CN104127884A - 一种治疗类风湿性关节炎的微囊及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗类风湿性关节炎的微囊及其制备方法,属于基因治疗领域。本发明治疗类风湿性关节炎的微囊,为包裹转IL-1Ra基因的骨髓间充质干细胞的海藻酸-聚赖氨酸-海藻酸微囊,其直径在200μm左右。本发明微囊的选择通透性膜可以使小分子营养物质和代谢产物及生物活性物质可以自由出入,使微囊内的细胞能长期存活,并将持续表达IL-1Ra蛋白分泌到微囊外,且可以隔离具有杀伤性的抗体,避免机体对囊内细胞的免疫反应起到免疫隔离作用,提高基因治疗类风湿性关节炎的效果。
Description
技术领域
本发明属于基因治疗领域,涉及一种治疗类风湿性关节炎的微囊及其制备方法。
背景技术
类风湿性关节炎(Rheumatoidarthritis,RA)是以对称性多关节炎为主要临床表现的自身免疫性疾病,其病理主要表现为滑膜炎,即滑膜的增生、血管翳的形成以及免疫细胞浸润。可导致关节内软骨和骨的破坏,关节功能障碍,甚至残废。其病因及病理机制比较复杂,至今尚未完全明确。研究表明,IL-1在RA的发病机制中起着重要作用,是导致炎性反应的持续发生和软骨破坏的重要促炎性细胞因子。
IL-1Ra最早在上世纪80年代被发现,体内自然存在的IL-1Ra是具有22-26kDa的糖蛋白,其可以牢固的结合Ⅰ型IL-1受体,使IL-1完全丧失对其受体的激活功能而自己本身并不激活细胞。正常状态下IL-1与IL-1受体结合而引起的生理效应很大程度上受到IL-1Ra与IL-1受体结合状态的调控。在发生关节炎动物的滑膜组织内虽然可以产生IL-1Ra,但是由于其数量有限,不能完全抵消IL-1的作用,因此单纯依靠体内天然产生的IL-1Ra不足以抑制疾病的发展。在胶原诱导关节炎大鼠模型的研究也发现随着疾病的发展滑膜中IL-1/IL-1Ra比例也会持续升高,而且其与关节炎指数的升高呈正相关。IL-1Ra基因敲除小鼠会发生严重关节炎也进一步表明了IL-1/IL-1Ra平衡在维持体内关节正常生理过程及免疫系统内环境稳定中的重要意义。基于体内IL-1/IL-1Ra的动态平衡,通过导入外源性IL-1Ra恢复在类风湿关节炎发病中遭到破坏的相互制约关系已经成为该病治疗中的重要指导思想之一。
目前应用IL-1Ra治疗类风湿关节炎在动物模型和病人体内都取得了很好的疗效。有文献研究表明,在免疫复合物诱导小鼠关节炎模型和兔抗原诱导关节炎模型中应用IL-1Ra可以明显抑制炎症的发展,减轻骨和软骨的破坏。同时也发现过度表达IL-1Ra的转基因鼠很少发生胶原诱导性关节炎。对类风湿关节炎患者静脉注射IL-1Ra不但可以抑制白细胞向滑膜部位浸润及关节软骨蛋白多糖合成减少而且还可以降低破骨细胞活化及金属基质蛋白酶的释放,从而对骨和软骨起到保护作用。
已经有对应IL-1Ra的商品药物应用临床,anakerin是最重要的制剂之一。动物实验结果显示,anakerin可以抑制胶原诱导关节炎小鼠对Ⅱ型胶原的抗体反应,保护骨和关节免受进一步破坏。长期多中心临床应用疗效评估结果表明,应用皮下注射anakerin可以明显延缓类风湿关节炎患者受累关节的破坏速度和程度,减轻疼痛,相应的VAS评分指数明显降低。但是由于皮下注射药物伴有较多的副作用,主要是皮注射部位反应,以至于有一部分患者放弃这一疗法,通过其他途径应用IL-1Ra治疗类风湿关节炎的研究也在进行当中。
随着基因重组技术的迅速发展,人们开始尝试基因治疗,即利用重组细胞的代谢产物调节机体生理功能,治疗相关疾病。目前导入基因治疗疾病的技术也日渐成熟,已经可以通过各种转染方式将编码IL-1Ra基因的质粒或腺病毒导入到类风湿关节炎动物模型体内使IL-1Ra蛋白持续表达并取得了较好的疗效,其中以病毒载体效率最高。但是由于病毒为载体的基因治疗应用可以激发机体的针对病毒载体的免疫反应。因此如何减少病毒载体的免疫反应成为基因治疗的一个研究热点。
抗IL-1药物在临床上治疗RA有明显的效果,然而这种治疗不良反应大,较昂贵需反复注射,因此受到了限制。基因治疗将具有治疗作用的基因重组到真核表达载体,转移至人体细胞,表达出具有治疗作用的多肽或蛋白质,从而达到治疗目的。IL-1Ra可减轻和阻断RA的进展。移植携带IL-1Ra基因的细胞可抑制疾病进展。转基因细胞移植可诱发免疫反应且不利细胞生存。
80年代以后,微囊化技术开始和组织细胞移植相结合,广泛应用于一些神经内分泌疾病治疗的研究,最典型的是1980年加拿大多伦多大学的Sun和Lim发明了海藻酸-聚赖氨酸-海藻酸(APA)微胶囊,把猪的胰岛细胞微囊化,形成人工细胞植入糖尿病大鼠体内,结果表明该人工细胞成功地降低了血糖水平[17]。之后细胞微囊化技术在骨科得到广泛应用。Isobe等人将重组人骨形成蛋白(rhBMP)包裹于乳酸-乙醇酸微囊内并植到大鼠皮下,组织检测发现随着骨形成蛋白的释放,在微囊周围出现具有碱性磷酸酶活性的骨诱导细胞,并且在异位骨诱导形成过程中转化为成骨细胞。早在上世纪80年代,KatoT等用乙基纤维素包裹丝裂霉素C做成微囊,经DSA放在骨肿瘤滋养血管处,起到对肿瘤的持续化疗作用。HuangYY等将庆大霉素做成微囊,对术后骨髓炎起到预防作用。其它生物医学领域也得到比较广泛的应用,如肝细胞微囊化为急性肝衰竭提供暂时性代谢支持,肾上腺髓质嗜铬细胞微囊化治疗帕金森氏病,甲状旁腺细胞微囊化治疗甲状腺机能低下等。在骨科领域中也有通过微胶囊包裹生长因子或药物治疗骨或软骨的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种治疗类风湿性关节炎的微囊及其制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种治疗类风湿性关节炎的微囊,为包裹转IL-1Ra基因的骨髓间充质干细胞的海藻酸-聚赖氨酸-海藻酸微囊。
所述的微囊的直径在200μm左右。
所述的骨髓间充质干细胞优选来源于大鼠。
所述的转IL-1Ra基因的骨髓间充质干细胞优选为将逆转录病毒载体PLXRN-IL-1Ra转染到骨髓间充质干细胞得到。逆转录病毒载体PLXRN-IL-1Ra的构建见参考文献“人IL-1受体拮抗蛋白重组逆转录病毒载体的构建、鉴定及在骨关节炎软骨细胞中的表达”(芮云峰,王友,张晓玲等,《中国修复重建外科杂志》2008年第5期)。
上述治疗类风湿性关节炎的微囊的制备方法,包括如下步骤:
(1)利用PT67细胞株包装重组PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒。
(2)从大鼠骨髓分离培养间充质干细胞。
(3)重组PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒转染骨髓间充质干细胞。
(4)利用高压静电法制作包裹PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒转染骨髓间充质干细胞的微囊。
优选的,步骤(4)为:
1)将转染PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒的骨髓间充质干细胞与海藻酸钠混合制成细胞悬液,细胞终浓度为3×106/mL,海藻酸钠浓度终为1.75%的溶液;溶剂为0.9%NaCl。
2)于电压为3kV,液面距25mm,推进速度30mm/h的高压静电场成囊装置中,将该混合液滴入100mmol/L CaCl2溶液中并反应10min,用0.9%NaCl洗涤两次。
(3)再与0.05%聚赖氨酸溶液反应使微粒外包裹一层聚赖氨酸并反应5min,0.9%NaCl洗涤两次。
(4)加入0.15%海藻酸钠溶液中和微粒表面电荷,0.9%NaCl洗涤两次。
(5)最后用55mmol/L柠檬酸钠溶液置换出微粒核心中的钙离子得到微囊,0.9%NaCl洗涤两次。
本发明相对于现有技术具有如下优点和效果:
本发明制备的包裹PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒转染骨髓间充质干细胞的微囊形态大小基本一致,直径基本在200μm左右,其选择通透性膜可以使小分子营养物质和代谢产物及生物活性物质可以自由出入,使微囊内的细胞能长期存活,并将持续表达IL-1Ra蛋白分泌到微囊外,且可以隔离具有杀伤性的抗体,避免机体对囊内细胞的免疫反应起到免疫隔离作用,提高基因治疗类风湿性关节炎的效果。
附图说明
图1是大鼠骨髓间充质干细胞40倍显微镜下视野图。
图2是PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒转染骨髓间充质干细胞后在荧光显微镜下视野图(100×)。
图3是本发明包裹PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒转染骨髓间充质干细胞的海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠微囊的形态图。
图4是本发明微囊培养1周和4周在荧光显微镜下的生长情况图,A:1周,B:4周。
图5是本发明微囊培养过程中IL-1Ra的分泌情况图,横坐标为培养时间(天),纵坐标为IL-1Ra分泌量(ng)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 重组PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒的包装
(1)细胞PT67通过G418筛选
G418药物敏感性实验:待转染PT67细胞常规传代培养。在24孔板中每孔接种1×104个细胞,等细胞贴壁后加入G418,使其终浓度分别为0、50、100、200、300、400、500、800mg/L。每个浓度做三个平行孔。每三天换一次液,每2天检查一次培养皿中细胞活性。约5天左右开始出现大量细胞死亡,14天细胞全部死亡的最低浓度为最佳筛选浓度400mg/L。
(2)病毒包装
根据LipofectAMINE2000转染试剂说明书:六孔板每孔1×106个细胞,转染时细胞汇合度90-95%。转染前两小时换液。将4μg的质粒DNA加至250μL无血清培养液中,混均。将10μL的LipofectAMINE2000加至另外250μL无血清培养液中,轻轻混均,室温静置5分钟。将DNA悬液和LipofectAMINE2000悬液混合轻轻混均,室温静置20分钟。分别将合适量的空逆转录病毒载体PLXRN、逆转录病毒载体PLXRN-IL-1Ra转染试剂加入6孔板中,混均,置于培养箱中培养。4-6小时后更换含有血清的培养液;48小时荧光显微镜下可见包装成功的细胞,后加入G418至终浓度为200mg/L,培养4周后阳性克隆形成。
逆转录病毒载体PLXRN-IL-1Ra的构建见参考文献“人IL-1受体拮抗蛋白重组逆转录病毒载体的构建、鉴定及在骨关节炎软骨细胞中的表达”(芮云峰,王友,张晓玲等,《中国修复重建外科杂志》2008年第5期)。
(3)选择稳定的产病毒细胞株、收集病毒
1)在所获的克隆中随机挑选3-4个大而健康的克隆,移至单独的培养皿进行扩增培养(用含10%血清的DMEM+G418200mg/L培养基),常规培养,传代直至细胞培养达到实验需要的培养体积。
2)保留一皿行连续培养。
3)平铺培养于需要数目的培养皿中,细胞密度在60-80%即可。具体做法为:以1×106/瓶接种于250mL的玻璃培养瓶中,各用8mL含血清含G418的DMEM培养液于37℃、5%CO2条件下培养24小时。
4)更换新培养液(含FBS、青-链霉素的DMEM培养液),继续培养24h后,收集培养基上清液,病毒上清每隔24h收获一次,直到细胞没有活力为止。
5)用0.22μm微孔滤器除去细胞和杂质,该培养液中就含有复制缺陷型逆转录病毒颗粒和被分泌于培养液中的目的基因的蛋白质产物。
(3)病毒的浓缩和保存
1)收集好病毒上清,500×g10min短暂离心样品去除细胞碎片。
2)4℃下高速离心机50000×g离心90min,使病毒片状沉淀,去除上清液。
3)0.5-1%的原始体积TNE重悬病毒,4℃过夜孵育。
4)等分清洁的上清液,装入单个一次性的试管,避免反复冻融。
5)-80℃保存试管,不需要冷冻保护剂。
实施例2 骨髓间充质干细胞的分离培养、转染及微囊化包裹
(1)骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外分离与培养
取体重300g左右雄性SD大鼠(由中国科学院上海实验动物中心提供),氯胺酮腹腔麻醉(60mg/kg)。在严格的无菌条件下分离出双侧股骨,用咬骨钳截除其远近端。用10mLαMEM完全培养基冲洗出骨髓组织,接种于100mm培养皿,每皿10mL,置于37℃、5%CO2培养箱孵育。
初接种的细胞种类较多,倒置显微镜下可见满视野圆形且折光性较强的细胞,其中多数为红细胞不贴壁,3d后半量换液后,由于红细胞减少,可见少量的贴壁细胞,呈棒状或纺锤状。7d后全量换液,瓶内见多个细胞克隆形成,细胞多伸展为长梭形。10d后,克隆增大与其他克隆逐渐融合。随着换液次数的增加悬浮不贴壁的细胞逐渐被清除,少数夹杂生长。以后3d换一次培养液。到第14天,贴壁细胞几乎80%汇合,骨髓间充质干细胞外形如梭(图1)。
(2)传代培养
1)胰酶消化:a.小心吸出旧培养液,用PBS清洗(冲洗)2次,加入适量胰酶消化液,注意消化液的量以盖住细胞最好,最佳消化温度是37℃。b.倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,消化到细胞之间不再连接成片。c.加入10mLPBS洗掉胰酶消化液,加入新鲜的培养液。
2)吹打分散细胞:a.用滴管将已经消化的细胞吹打成细胞悬液。b.将细胞悬液吸入10mL离心管中。c.平衡后将离心管放入台式离心机中,以1200rpm离心4min。d.弃去上清液,加入2mL培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
3)分装稀释细胞:a.将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶盖。b.倒置显微镜下观察细胞量,必要时计数,最后做好标记。
4)继续培养:用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。
传代细胞培养注意严格的无菌操作及适度消化,消化过程中应该注意培养细胞形态的变化,一旦胞质回缩,连接变松散或有成片浮起的迹象,立即终止消化。
(3)PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒转染骨髓间充质干细胞
75cm的培养瓶细胞贴壁生长面积为70%时进行感染实验为宜:
1)感染前6小时对细胞进行换液处理,每瓶细胞使用6mL无血清培养基,换液后正常条件培养6小时;
2)每瓶添加实施例1得到的病毒液500μL,轻晃培养瓶,使之分布均匀,正常条件培养12小时;
3)每瓶补加8mL的含10%FBS的完全培养基,轻晃培养瓶,使之分布均匀,正常条件培养12小时;
4)对细胞进行换液处理,使用15mL含10%FBS的完全培养基,正常条件培养24小时;
5)荧光显微镜下观察细胞转染情况,骨髓间充质干细胞48小时后可见有荧光蛋白表达,转染效率在80%左右(图2)。
(4)转染PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒的骨髓间充质干细胞微囊化包裹
参照文献中方法制备(丁惠锋,汤亭亭,刘荣等.包裹骨形态发生蛋白-2基因转染干细胞的微囊化方法和蛋白释放效应[J].中华实验外科杂志.2007,24(1):69-71.)包裹骨髓间充质干细胞的海藻酸-聚赖氨酸-海藻酸(APA)微囊。主要步骤如下:
(1)将转染PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒的骨髓间充质干细胞悬液与一定浓度的海藻酸钠溶液混合制成细胞悬液,细胞终浓度为3×106/mL,海藻酸钠浓度终为1.75%的溶液。
(2)于电压为3kV,液面距25mm,推进速度30mm/h的高压静电场成囊装置(上海理工大学研制)中,将该混合液滴入100mmol/L CaCl2溶液中并反应10min并用0.9%NaCl洗涤两次。
(3)再与0.05%聚赖氨酸溶液反应使微粒外包裹一层聚赖氨酸并反应5min后0.9%NaCl洗涤两次。
(4)加入0.15%海藻酸钠溶液中和微粒表面电荷,0.9%NaCl洗涤两次。
(5)最后用55mmol/L柠檬酸钠溶液置换出微粒核心中的钙离子得到微囊,0.9%NaCl洗涤两次;
(6)所得微囊置无菌培养皿中,加入DMEM培养液10mL,于37℃、5%CO2培养箱中培养待用。
注意事项:(1)细胞悬液用0.9%NaCl洗涤两次;(2)细胞终浓度为3×106/mL,海藻酸钠浓度终为1.75%的溶液;(3)微囊制备中每步的反应时间为5-10min左右;(4)每步反应后用0.9%NaCl洗涤两次。
利用高压静电装置制造的海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠微囊形态大小基本一致,直径基本在200μm左右(图3)。微囊长时间培养后,其包裹的细胞成活率仍很高,图4是微囊培养1周和4周在荧光显微镜下的生长情况。
实施例3包裹IL-1Ra转染的骨髓间充质干细胞的微囊体外蛋白释放
取实施例2得到的包裹IL-1Ra转染的骨髓间充质干细胞的微囊(微囊内细胞总量约2.5×106/组),于15mLαMEM(含15%小牛血清)中培养。每隔2天换培养液,换液时取上清,留作ELISA法测IL-1Ra的含量。
实验操作严格按照IL-1RaImmunoassay试剂盒(R&D公司)的操作程序进行:首先将标准品进行溶解并倍比稀释;在已用抗IL-1Ra单抗包被的微孔板内加RDl~19检测稀释液100μL,再分别加入标准品、样品各50μL,每个标准品、样品设两个重复孔;用不含标准品及样品的测定稀释液RD1~19作为零对照。室温下静置2h,洗涤3次。然后,加200μL的酶标抗体(偶联辣根过氧化物酶的抗IL-1Ra单克隆抗体),室温下静置2h,洗涤3次。再加200μL的底物溶液(过氧化氢和四甲基联苯胺),室温下避光静置30min后加入50μL终止液停止反应,30min内用酶标仪测光密度OD值(测定波长450nm),求出标准曲线,计算出样品含量。试剂盒的最低检测质量浓度约为31pg/mL。
IL-1Ra分泌情况如图5所示,表明骨髓间充质干细胞转染IL-1Ra基因并微囊化后可以持续表达IL-1Ra蛋白,这说明本发明制备的微囊即能使细胞在囊内长期存活,同时也保障蛋白的释放。
实施例4包裹IL-1Ra转染的骨髓间充质干细胞的微囊的免疫隔离作用
在96孔板内加入100μL实施例2得到的包裹IL-1Ra转染的骨髓间充质干细胞的微囊,再加入100μL0.05%(w/v)红色荧光IgG,轻轻摇晃后放入培养箱中,静止1小时,再在激光共聚焦显微镜下观察微囊的通透性。观察发现微囊呈现黑色,微囊外面为红色的荧光,即红色荧光IgG不能进入微囊内。说明本发明微囊能有效的避免抗体对囊内细胞的攻击。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种治疗类风湿性关节炎的微囊,其特征在于:为包裹转IL-1Ra基因的骨髓间充质干细胞的海藻酸-聚赖氨酸-海藻酸微囊。
2.根据权利要求1所述的治疗类风湿性关节炎的微囊,其特征在于:直径为200μm。
3.根据权利要求1所述的治疗类风湿性关节炎的微囊,其特征在于:所述的骨髓间充质干细胞来源于大鼠。
4.根据权利要求1所述的治疗类风湿性关节炎的微囊,其特征在于:所述的转IL-1Ra基因的骨髓间充质干细胞为将逆转录病毒载体PLXRN-IL-1Ra转染到骨髓间充质干细胞得到。
5.权利要求1所述的治疗类风湿性关节炎的微囊的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)利用PT67细胞株包装重组PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒;
(2)从大鼠骨髓分离培养间充质干细胞;
(3)重组PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒转染骨髓间充质干细胞;
(4)利用高压静电法制作包裹PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒转染骨髓间充质干细胞的微囊。
6.根据权利要求5所述的治疗类风湿性关节炎的微囊的制备方法,其特征在于步骤(4)为:
1)将转染PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒的骨髓间充质干细胞与海藻酸钠混合制成细胞悬液,细胞终浓度为3×106/mL,海藻酸钠浓度终为1.75%的溶液;溶剂为0.9%NaCl;
2)于电压为3kV,液面距25mm,推进速度30mm/h的高压静电场成囊装置中,将该混合液滴入100mmol/L CaCl2溶液中并反应10min,用0.9%NaCl洗涤两次;
(3)再与0.05%聚赖氨酸溶液反应使微粒外包裹一层聚赖氨酸并反应5min,0.9%NaCl洗涤两次;
(4)加入0.15%海藻酸钠溶液中和微粒表面电荷,0.9%NaCl洗涤两次;
(5)最后用55mmol/L柠檬酸钠溶液置换出微粒核心中的钙离子得到微囊,0.9%NaCl洗涤两次。
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
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Application publication date: 20141105 |
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |