CN104313054A - 表达人外源胰岛素原的人造血干细胞及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医学分子生物学领域，具体涉及一种表达人外源胰岛素原的人造血干细胞及其制备方法和应用。本发明的表达人外源胰岛素原的人造血干细胞是采用DNA重组技术，将人胰岛素原基因克隆至慢病毒表达载体中，获得能够表达人胰岛素原基因的慢病毒表达载体，将该表达载体和慢病毒包装质粒共同转染至293FT细胞，包装慢病毒颗粒，收集含病毒的细胞培养液上清，感染新分离的UCB HSCs，获得表达人外源胰岛素原的人造血干细胞，该人造血干细胞在体外能够扩增，扩增细胞经细胞移植，在体内能够进行正常的自我更新和多向分化，分泌的proinsulin能够激活insulin受体及其下游靶基因，移植到NOD/SCID/Diabetes I小鼠能够显著减低I型糖尿病小鼠的血糖，提高小鼠存活率。

Description

表达人外源胰岛素原的人造血干细胞及其应用

技术领域

本发明属于医学分子生物学领域，具体涉及一种表达人外源胰岛素原的人造血干细胞及其制备方法和应用。 

背景技术

糖尿病是严重危害人类健康的主要疾病之一，已经成为继心血管疾病和肿瘤之后的第三大疾病。近年来，糖尿病的发病率不断上升，而且发病更趋年轻化。 

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病病人由于产生胰岛素障碍或胰岛素不能发挥生理作用引起糖代谢紊乱导致微血管病变，引起肢体坏死、失明和肾功能衰竭等一系列严重的并发症。目前尚无根治糖尿病的方法，但通过多种治疗手段可以控制好糖尿病，胰岛素治疗是其中一种有效的方法。虽然采用胰岛素治疗在一定程度上能够改善病人的糖代谢紊乱，然而长期的胰岛素注射不仅在治疗上给病人带来不便，并且这种方法并不能有效地防止或逆转糖尿病引起的微血管病变及其并发症。 

细胞移植是将在体外建立的功能性细胞移植到体内替代功能缺陷的细胞，以达到治疗疾病的目的。近年来，许多研究者致力于利用现代基因工程技术改造或新建各种可分泌胰岛素的细胞系，主要有胰岛细胞系、胰岛干细胞系和非胰岛细胞系。 

相当数量的生物因子在胰岛β细胞产生、发育、分裂这一过程当中起着调节的作用。所有基因的启动与关闭，所有蛋白质的激活和失活，都是由一个复杂的过程来调控的。基于这个观点，研究人员把胰岛β细胞产生、发育、分裂 这一过程所必须的生物因子转入体内，用来促使胰岛β细胞成熟。 

研究人员于本世纪初，初次选用胰岛发育因子神经元素胰腺十二指肠同源异型盒基因1(pancreatic duodenal homeobox-1,PDX-1)等促使非内分泌细胞转变为胰岛细胞或者β细胞显型来取代胰岛移植进行1型糖尿病治疗的研究。PDX-1蛋白可以参与调控insulin基因的转录。PDX-1蛋白还可以促进胰腺的发育、维持胰岛β细胞特异基因的表达。胰腺中的全部细胞在器官形成时均有PDX-1基因的表达，而在成体后，PDX-1基因则局限表达于胰岛β细胞。利用PDX-1对非β细胞进行直接或间接修饰将会成为糖尿病基因治疗中一个极具潜力的发展方向。Raikwar等将PDX-1基因转入小鼠的胚胎干细胞使其大部分分化为胰岛素产生细胞。Talebi等将以慢病毒为载体的PDX-1基因导入骨髓间充质干细胞，同时标记表达神经素3和GLUT2，并且确定之一系列因子的表达并不会对insulin基因的表达产生影响。在对此细胞蛋白质的免疫分析中发现，PDX-1基因和insulin基因均有表达。将这种PDX1⁺的骨髓间充质干细胞注入1型糖尿病大鼠后，大鼠血糖水平在三天内从485mg/L下降到正常水平。该研究数据显示，PDX-1+的骨髓间充质干细胞具有基因治疗1型糖尿病的潜能。 

多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS cells)是当前干细胞研究的热点。iPS细胞在修复与重建受损器官，治愈疾病等方面都拥有潜在的研究价值。许多研究人员认为，iPS将会被大范围应用于糖尿病的胰岛细胞移植和各类受损、缺陷器官的自体移植等领域。Deng等成功地用表皮生长因子等诱导人多潜能干细胞分化为胰岛素分泌型细胞，其中可以正常分泌胰岛素的细胞超约有25％，这一研究成果在用人iPS治疗糖尿病的领域获得了非常大的突破。Zhou等将携带有PDX1、Ngn3和Mafa等三个与胰腺发育有关的转录因子的腺病毒载体注入缺少胰岛β细胞的小鼠胰腺，选择性的转染胰腺外分泌细胞。结果显示，超过两成的外分泌型细胞转化为了胰岛β细胞。虽然有研究表明iPS移植可能产生免疫排斥，但是，最近的两个实验则证实了将同基因的iPS细胞所分化的细胞进行移植并不会产生免疫反应或排斥，而先前的研究结果可能是使用了逆转录病毒感染的iPS细胞导致的。 

申请号为200710100326.1的发明专利公开了一种应用编码多种外源基因的慢病毒载体制备分泌胰岛素的干细胞系的方法，该方法是将多种胰岛素调控基因克隆至复制缺陷型慢病毒载体pWPST，转染293T细胞进行包装后，收集病毒颗粒并浓缩后转染人胚胎胰腺干细胞，这种含有多种胰岛素调控基因的慢病毒载体在转染干细胞后，可以使干细胞合成胰岛素的能力大幅度提高，并在葡萄糖的刺激时产生明显的胰岛素释放，该专利中仅仅介绍了体外培养可以提高胰岛素的分泌，但将细胞系移植入动物模型体内效果如何不得而知。 

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种重组慢病毒表达载体，其携带有人胰岛素原基因(preproinsulin)；本发明的目的之二在于提供一种重组慢病毒颗粒，其是由所述的重组慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒共同转染宿主细胞后包装得到；本发明的目的之三在于提供一种表达人外源胰岛素原的人造血干细胞，这种表达人外源胰岛素原的人造血干细胞能够分泌有生物活性的人胰岛素原并且保持造血干细胞自我更新和多向分化的特性；本发明的目的之四在于提供一种表达人外源胰岛素原的人造血干细胞的体外扩增方法，在单独使用CHIR99021或者LiCl，不需要其他细胞因子的条件下，表达人外源胰岛素原的人造血干细胞能够有效扩增，扩增细胞保持造血干细胞的特性。 

为实现上述目的，本发明的技术方案为： 

一种重组慢病毒表达载体，所述重组慢病毒表达载体是在慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro的多克隆位点插入序列如SEQ ID NO：1所示的人胰岛素原的基因序列，获得含有人胰岛素原基因的重组慢病毒表达载体；所述人胰岛素原的基因序列插入慢病毒载体EcoR1和BamH1位点之间。 

胰岛素本身并不是胰岛素基因控制合成的直接产物，其直接产物是前胰岛素原(preproinsulin)。它由NH2-末端信号序列(称为信号肽)，B链、C肽(又叫连接肽，connecting piptide)和具COOH-末端的A链等部分组成的单链由N端至C端的连接顺序为S-B-ARG-Arg-C-Lys-Arg-A，其中S为信号肽，C代表C-肽，由35个氨基酸残基组成，A和B分别为胰岛素的A链和B链。全长119个氨基酸残基。信号肽由24个氨基酸残基组成，富含疏水氨基酸。在信号肽的作用下，正在合成的肽链进入内质网腔，经过信号肽酶的切割作用，移去信号肽，形成胰岛素原。胰岛素原分子发生折叠，使其2个末断片段A和B之间形成正确的二硫键，并最终包装成分泌颗粒的形式储藏在高尔基体中。当机体需要时，高尔基体中的转换酶(convertase)PC3和PC2—一类与枯草蛋白酶相关的内切蛋白酶—便会分别对胰岛素原分子中的B/C和C/A连接点发生切割作用，再在羧肽酶的作用下的分别切去Arg-Arg和Arg-Lys碱性二肽，从而移走了一段长度为31个氨基酸的C肽，成为成熟的胰岛素。 

一种重组慢病毒颗粒，将上述得到的重组慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒共同转染宿主细胞后得到的包装体即为重组慢病毒颗粒。慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。 

对于载体的选择，本发明选用慢病毒载体，慢病毒(lentivirus)是基因转染的工具之一，可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并且转染效率高，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。所以，在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒[1]己经成为表达外源基因或外源shRNA的常用载体形式之一，并且正在获得越来越广泛的应用。慢病毒是一种无包膜的双链DNA病毒，二十面体对称，蛋白外壳主要由240个六邻体和12个五邻体组成。五邻体是顶角壳粒，由基部和纤维组成，纤维的节区是 慢病毒与其相应的细胞表面受体CAR结合的部位，介导慢病毒与受体细胞的接触。人类慢病毒共有51个血清型，目前应用的慢病毒载体主要是在人慢病毒亚群的Ad2和Ads的基础上构建的。慢病毒基因组长36kb.基因组两端各有长100bp-150bp的末端反向重复序列ITR，是病毒DNA复制的起始点，亦是复制包装必需的顺式作用元件。病毒体进入细胞后，基因组以病毒DNA是否开始复制为界限，分为早期和晚期基因表达两个时期。早期基因(Ei-Ea)编码不同的基因表达调节因子，调控病毒基因表达。晚期基因编码病毒结构蛋白，由晚期主要启动子MLP启动表达。野生型慢病毒最大外源基因容量约为2kb，将病毒非必需基因组缺失，则可增加携带外源基因容量，又不影响病毒在包装细胞中复制增殖。理论上除慢病毒基因组两端约500bp的顺式结构是复制和包装所必需的结构外，其他结构均可被替换成外源基因。慢病毒源性载体最主要的优点是安全性与稳定性好，易于制备、纯化；病毒滴度高，插入的外源基因片段长，宿主细胞种类广泛；可感染处于不同周期的细胞，转导效率较高，且无致突变的危险，本发明选用载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro。 

优选的，所述宿主细胞为293FT。 

一种表达人外源胰岛素原的人造血干细胞，所述表达人外源胰岛素原的人造血干细胞是转染有重组慢病毒颗粒的人造血干细胞，所述的人造血干细胞为人脐带血造血干细胞。 

优选的，所述干细胞为人脐带血造血干细胞CD34+；和其他来源的造血干细胞相比，脐带血造血干细胞具有造血活性高、免疫原性低和采集容易等优点。在本发明中，我们分离人脐带血造血干细胞(UCB CD34+)，再利用携带人胰岛素原的慢病毒颗粒感染UCB CD34+，利用GFP体内体外容易跟踪监测的优点和puromycin筛选标志，筛选获得表达人胰岛素原的UCB CD34+细胞(UCB CD34+/proinsulin)，从而获得一种表达人外源胰岛素原的人造血干细胞。 

本发明还提供了一种表达人外源胰岛素原的人造血干细胞的体外扩增方法，该方法在单独使用CHIR99021或者LiCl，不需要其他细胞因子的条件下，培养7天，表达人外源胰岛素原的人造血干细胞(UCB HSCs/proinsulin)数量扩 增约10倍，扩增细胞保持原始细胞的生物学特性，确保1份脐带血来源的造血干细胞，通过扩增能够用于1-3次标准的造血干细胞移植，用于糖尿病治疗；所述CHIR99021浓度为3uM-5uM，所述LiCl浓度为4mM-10mM。本发明中，通过建立了LiCl代替细胞因子扩增UCB CD34+/proinsulin的方案，LiCl是获准临床应用的制剂，无需进一步临床试验。 

本发明还提供了一种重组慢病毒表达载体的制备方法，包括如下进行的步骤： 

(1)Insert DNA的制备 

将GenBank NO.NM_000207人胰岛素原的基因序列人工合成至pMD18-T simple载体中，得到包含人胰岛素原基因序列的pMD18-T simple质粒，将包含人胰岛素原基因序列的pMD18-T simple质粒使用EcoRⅠ和BamHⅠ进行酶切得到345bp的DNA片段，命名为Insert DNA； 

(2)Vector DNA的制备 

将慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro使用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行酶切得到8.2Kbp的DNA片段，命名为Vector DNA； 

(3)重组慢病毒表达载体的制备 

将步骤(1)中得到的Insert DNA和步骤(2)中得到的Vector DNA采用SolutionⅠ进行连接，获得含有人胰岛素原基因的重组慢病毒表达载体pCDH-CMV-insulin-EF1-GFP-T2A-Puro。 

本发明所述的表达人外源胰岛素原的人造血干细胞在制备用于治疗糖尿病制剂中的应用。以人脐带血造血干细胞为例，将本发明成功获得的表达人proinsulin的UCB HSCs，在体外进行扩增，扩增后的细胞移植入免疫缺陷型小鼠(NOD/SCID)造血干细胞移植模型中，表达proinsulin的UCB HSCs在体内能够进行正常的自我更新和多向分化，UCB HSCs分泌的proinsulin能够激活insulin受体及其下游靶基因，移植到小鼠的UCB HSCs约6周后能够显著减低I型糖尿病小鼠的血糖，在观察6个月期间维持降低血糖的活性。 

附图说明

图1FACS分析人脐带血造血干细胞(CD34+)感染pCDH-CMV-insulin-EF1-GFP-T2A-Puro慢病毒后第2天GFP的表达结果。 

图2western blotting分析UCBCD34+细胞人proinsulin的表达(其中1：感染pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro慢病毒的UCBCD34+；2：感染pCDH-CMV-insulin-EF1-GFP-T2A-Puro慢病毒的UCB CD34+)。 

图3Real-time PCR检测胰岛素受体IR及其靶基因Glut1的表达(其中，A为UCBCD34+/control；B为UCBCD34+/proinsulin)。 

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。 

以下实施例中，人源胰岛素原(preproinsulin)基因序列如SEQ ID NO：1所示。 

实施例1 重组慢病毒表达载体的构建 

(1)Insert DNA的制备 

根据GenBank提供的人胰岛素原基因mRNA序列(GenBank NO.NM_000207)，由TaKaRa公司在其序列5’端加EcoR I的序列(5’-GAATTC-3’)，3’端加BamHI的序列(5’-GGATCC-3’)，共12个核苷酸，人工合成的人胰岛素原基因包括酶切位点，共345bp，将该人工合成的人胰岛素原基因合成至pMD18-T simple载体中，得到包含人胰岛素原基因序列的pMD18-T simple质粒，通过DNA序列分析，证实合成preproinsulin的序列完全正确。 

将包含人胰岛素原基因序列的pMD18-T simple质粒使用EcoRⅠ/BamHⅠ进行酶切，步骤如下： 

1)按照表1所示，于1.5ml离心管中在冰上配制酶切反应体系(50μl体 系)； 

表1 酶切反应体系(50μl体系) 

2)混匀反应体系后，将离心管置于适当的支持物上，37℃水浴4小时，使酶切反应完全。 

3)取5μl酶切产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测目的片段(约345bp的目的DNA片段)。 

使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)切胶回收约345bp的DNA片段，命名为Insert DNA，具体步骤如下： 

1)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，吸水纸吸干凝胶表面液体，将凝胶块切碎，计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积(100mg＝100μl体积)； 

2)向凝胶块中加入三倍凝胶体积的DR-I Buffer(胶块融化剂)，混合均匀，75℃加热融化得混合溶液。此时间断震荡混合(每2-3min一次)，直到凝胶块完全融化(约6-8min)； 

3)加入0.5倍DR-I Buffer体积的DR-ⅡBuffer于胶块融化液中充分混匀。因为目的DNA片段小于400bp，所以还需加入1倍凝胶体积的异丙醇(加DR-ⅡBuffer后混合物颜色变为黄色，充分混匀以保证形成均匀黄色溶液)； 

4)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上，将步骤2)中的混合溶液转移至Spin Column中，室温12000rpm离心1min，弃去滤液；向Spin Column中加入500μl RinseA，室温12000rpm离心30s，弃滤液；向Spin Column中加入700μl Rinse B(Rinse B在第一次使用前加入一定体积的无水乙醇)，室温12000rpm离心30s，弃去滤液；重复加入Rinse B的操作步骤一次，然后将Spin Column安置于Collection Tube上室温12000rpm离心 1min洗脱DNA即为Insert DNA。 

(2)Vector DNA的制备 

1)冰上于1.5ml离心管中配制酶切反应体系，将慢病毒载体质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro使用EcoR1/BamH1进行酶切，酶切反应体系如表2所示。 

表2 慢病毒载体质粒的酶切反应体系(50μl体系) 

2)混匀反应体系后，将离心管置于适当的支持物上，37℃水浴4小时，使酶切反应完全。 

3)取5μl酶切产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测目的片段(约8.2Kbp的DNA片段)。使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(CodeNo.DV805A)切胶回收约8.2Kbp的DNA片段，命名为Vector DNA。 

(3)重组慢病毒表达载体的制备 

1)连接 

将4.5μl Insert DNA和0.5μl Vector DNA片段混合均匀，向混合溶液中加入5μl的Solution Ⅰ(TaKaRa DNA Ligation Kit中的Solution Ⅰ)，恒温水浴箱中16℃反应30min。 

2)转化 

将步骤1)中得到的连接产物2μl冰上预冷，加入到100ul感受态中(-80℃取出后立即置于冰上)，轻轻混匀，冰上放置40min，42℃热激90s后，冰上放置2min，加入500μl LB液体培养基，37℃热循环仪上放置1h，然后取200μl均匀涂布于LB固体培养基上，待菌液干后，37℃恒温培养箱倒置培养12-16h。 

3)鉴定(挑取单菌落进行PCR检测，筛选阳性克隆) 

在超净工作台中分别向10支无菌的50μl离心管中加入10μl无菌水，标号1-10，用枪头随机挑选步骤2)中10个转化平板上的单菌落于1-10号离心管中，使其均匀溶于水中，冰上配制PCR反应体系后于PCR仪中设定条件进行PCR，PCR条件为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，进行35个循环；42℃10min；4℃保藏。取5μlPCR反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果筛选大小正确的阳性克隆。 

4)提取质粒及测序 

将步骤3)选定的含有阳性克隆的单菌落进行植菌，提取质粒即得到重组慢病毒表达载体，设计并合成引物PCDH P1：5’-TTG ACT CAC GGG GAT TTC-3’对质粒进行测序。 

实施例2 重组慢病毒颗粒的包装 

(1)293FT细胞培养 

1)培养基的配制：向DMEM基础培养基中加入终浓度为10％的FBS和1％的青链霉素混匀后，37℃水浴锅内预热。 

2)待细胞丰度为70-80％时取出细胞，轻轻倒掉旧培养基，37℃预热的HBSS清洗细胞，加入适量胰酶/EDTA，消化细胞。 

3)显微镜下观察，若细胞分离成单个状态，则马上加入两倍体积的培养基，轻轻吹打混匀以终止消化。 

4)将细胞悬液加入15ml离心管中，室温，800rpm离心3min，弃去上清液。 

5)加入适量培养基轻轻吹打制成细胞悬液。 

6)取1/3细胞悬液于培养瓶中，补足培养基至培养瓶的最适容量，37℃、5％CO₂培养箱中培养，每3天左右传一代。 

(2)重组慢病毒颗粒的包装 

1)293FT细胞铺板 

①传代培养的293FT细胞生长至细胞丰度50-60％时，加入1.5ml含EDTA的胰酶消化。 

②镜下观察，当细胞分离成单个状态时即可以DMEM+10％小牛血清1.5ml 中和，并轻轻吹打，将贴壁细胞吹下。 

③将上述细胞悬液移入试管，800rpm/min离心3分钟，弃上清，加入4mlD-Hanks液重悬，800rpm/min离心3分钟后去上清。 

④完全培养基重悬细胞，加入6孔板中，3×10⁵/孔，放入37℃细胞培养箱内培养。 

2)包病毒，转细胞 

①上述培养的293FT细胞生长至细胞丰度60-70％时进行转染；转染前1h加入25μM的氯喹2μl(1μl/1m培养基)。 

②在10ml无菌离心管中依次加入以设计好的表3中所示的三种质粒，并用special water添加到体积为328.5μl，并混匀。 

表3 三种质粒 

③加入46.5μl2M的CaCl₂，混匀。 

④快速滴加2×HBS375μl，期间剧烈震荡(震荡不充分会形成较大颗粒，影响细胞吞噬，该步骤很重要)。 

⑤上述液体出现白色浑浊后逐滴均匀地分别加入293FT生长的6孔平板中，培养箱内孵育8-12h(滴加轻柔，防止将细胞冲起)。 

⑥8h后将培养皿内的培养液轻轻吸出，每孔轻轻加入37℃预热的DMEM+10％小牛血清2ml(滴加时液滴沿平板壁滴入，否则将冲下贴壁细胞)，放入37℃细胞培养箱内孵育，24小时后荧光显微镜下观察，大致观察阳性细胞率。 

3)收病毒，收细胞 

①48小时后收集上清。 

②12000rpm离心5分钟，收集上清液，分装到1.5mlEP管中，-70℃保存 备用。 

实施例3 表达人外源胰岛素原的人造血干细胞(proinsulin UCB CD34+细胞)的构建 

(1)经医院伦理委员会和产妇共同签字同意，按标准程序采集新生儿脐带血(umbilical cord blood，UCB)。按Ficoll-Plaque方法，分离脐带血单核细胞，再利用Miltenyi提供的试剂盒(CD34 microbeads kit)并按照说明书从单核细胞中分离获得CD34+细胞(UCBCD34+)，按标准人造血干细胞体外培养的方法，培养UCBCD34+细胞。 

(2)按慢病毒感染的标准方法，用制备的pCDH-CMV-insulin-EF1-GFP-T2A-Puro重组慢病毒颗粒感染UCBCD34+细胞，感染后第2天，利用细胞流式技术检测绿色荧光素蛋白(GFP)阳性细胞的比例，结果如图1所示。人脐带血CD34+细胞按ROI10:1的比例感染pCDH-CMV-insulin-EF1-GFP-T2A-Puro慢病毒颗粒，1天后(感染后第2天)FACS检测GFP的表达。结果显示，感染proinsulin的慢病毒颗粒的UCBCD34细胞GFP阳性细胞的比例为5.2％。 

证实感染成功后，按puromycin(puro，嘌呤霉素)筛选的标准方法，用puromycin(puro)双重筛选既表达GFP，又具有puro抗性的UCB CD34+细胞。 

(3)分别取感染pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro慢病毒和pCDH-CMV-preproinsulin-EF1-GFP-T2A-Puro慢病毒的UCB CD34+细胞裂解液，通过western-blotting，ELISA定性和RIA定量鉴定具有双重筛选标志UCBCD34+细胞内部和培养上清中表达proinsulin的及其表达量，结果如图2所示，结果显示UCBCD34+/proinsulin细胞表达proinsulin。 

(4)取等体积分别来自UCBCD34+/control(A)和UCBCD34+/proinsulin(B)细胞培养上清，刺激MEF细胞，real-time PCR分析胰岛素受体(IR)和葡萄糖转运蛋白1(Glut1)mRNA的表达，结果显示，UCBCD34+/proinsulin细胞上清显著上调IR和Glut1，结果如图3所示。 

(5)通过系列分析和鉴定，获得表达人外源胰岛素原的人造血干细胞(表 达人源性proinsulin的UCBCD34+细胞)，命名为UCBCD34+/proinsulin。 

结果：经GFP+和puromycine双重筛选，获得稳定表达proinsulin的UCB CD34+细胞，western-blotting分析证实，细胞裂解物和细胞培养上清有proinsulin的表达。RIA分析发现，UCB CD34+/proinsulin培养上清中，proinsulin的含量为4.5ng/ml。 

UCB CD34+/proinsulin细胞培养上清加入到MEF细胞，导致MEF细胞IR磷酸化、IR下游基因表达升高以及细胞摄取葡萄糖增加，证实UCB CD34+/proinsulin所表达proinsulin具有激活insulin receptor及其下游信号的活性。 

实施例4 UCB CD34+/proinsulin体外扩增 

(1)通过优化培养基组分和培养条件，筛选和优化体外扩增UCBCD34+/proinsulin细胞的条件。 

(2)通过FACS鉴定扩增细胞的表型，通过ELISA鉴定扩增细胞分泌proinsulin的量。 

(3)按标准方法，通过集落形成实验鉴定UCBCD34+/proinsulin细胞的集落形成能力，观察表达的proinsulin对UCBCD34+的自我更新能力和多向分化能力的影响。 

结果：扩增UCBCD34+/proinsulin最佳条件：在无细胞因子的条件下，在2uM至10uM LiCl的作用下，经7天的培养，UCBCD34+/proinsulin的数目扩增约10倍。 

扩增UCB CD34+/proinsulin的生物学特性：在细胞表面标志、细胞聚落形成能力等生物学特性方面，扩增的UCB CD34+/proinsulin细胞与原始细胞(未扩增)相比，没有明显的差别。 

实施例5 UCB CD34+/proinsulin细胞移植 

(1)按标准方法，通过亚致死剂量X-射线照射，形成免疫缺陷型小鼠(NOD/SCID)造血干细胞移植模型。 

(2)按标准方法，移植不同剂量未扩增、扩增的UCB CD34+/proinsulin 至上面制备的NOD/SCID造血干细胞移植模型，观察UCB CD34+/proinsulin细胞造血重建能力。 

(3)将扩增的UCB CD34+/proinsulin、UCB CD34+/control(对照)分别移植到经亚致死剂量X射线照射的免疫缺陷小鼠，通过GFP阳性细胞的比例以及GFP阳性细胞的表面标志，分析两种细胞的血液重建能力。 

结果表明，UCB CD34+/proinsulin的血液重建能力明显高于对照组。 

实施例6 UCB CD34+/proinsulin细胞移植，减低血糖的研究 

(1)用streptozotocin(链脲霉素)处理，制备NOD/SCID小鼠I型糖尿病模型(NOD/SCID/Diabetes I)。 

(2)再通过亚致死剂量X-射线照射，形成NOD/SCID/Diabetes I造血干细胞移植模型。 

(3)将扩增的UCB CD34+/proinsulin、UCB CD34+/control(对照)分别移植到经亚致死剂量X射线照射的NOD/SCID/Diabetes I小鼠，连续观察小鼠的存活率、血糖的变化以及GFP阳性细胞的比例以及GFP阳性细胞的表面标志。 

结果表明，与对照细胞相比，UCB CD34+/proinsulin细胞能够显著降低血糖水平、提高小鼠存活率。 

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。 

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>表达人外源胰岛素原的人造血干细胞及其应用

<160>1

 

 

<210>1

<211>333

<212>DNA

<213>智人

<220> homo sapiens

<223>人proinsulin的序列

<400>1  

atggccctgt ggatgcgcct cctgcccctg ctggcgctgc tggccctctg gggacctgac     1-60

ccagccgcag cctttgtgaa ccaacacctg tgcggctcac acctggtgga agctctctac     61-120

ctagtgtgcg gggaacgagg cttcttctac acacccaaga cccgccggga ggcagaggac   121-180

ctgcaggtgg ggcaggtgga gctgggcggg ggccctggtg caggcagcct gcagcccttg  181-240

gccctggagg ggtccctgca gaagcgtggc attgtggaac aatgctgtac cagcatctgc    241-300

tccctctacc agctggagaa ctactgcaac tag                             301-333

 

Claims (7)

1.一种重组慢病毒表达载体，其特征在于：所述重组慢病毒表达载体是在慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro的多克隆位点插入序列如SEQID NO：1所示的人胰岛素原的基因序列，获得含有人胰岛素原基因的重组慢病毒表达载体；所述人胰岛素原的基因序列插入慢病毒载体EcoR1和BamH1位点之间。

2.一种重组慢病毒颗粒，其特征在于：将权利要求1所述的重组慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒共同转染宿主细胞后得到的包装体即为重组慢病毒颗粒。

3.根据权利要求2所述的一种重组慢病毒颗粒，其特征在于，所述宿主细胞为293FT。

4.一种表达人外源胰岛素原的人造血干细胞，其特征在于，所述表达人外源胰岛素原的人造血干细胞是转染有权利要求2或3所述的重组慢病毒颗粒的人造血干细胞，所述的人造血干细胞为人脐带血造血干细胞。

5.权利要求4所述的表达人外源胰岛素原的人造血干细胞的体外扩增方法，其特征在于，在单独使用CHIR99021或者LiCl，不需要其他细胞因子的条件下，培养7天，UCB HSCs/proinsulin数量扩增10倍，扩增细胞保持原始细胞的生物学特性；所述CHIR99021浓度为3uM-5uM，所述LiCl浓度为4mM-10mM。

6.权利要求1所述的重组慢病毒表达载体的制备方法，其特征在于，包括如下进行的步骤：

(1)Insert DNA的制备

将GenBank NO.NM_000207人胰岛素原的基因序列人工合成至pMD18-Tsimple载体中，得到包含人胰岛素原基因序列的pMD18-T simple质粒，将包含人胰岛素原基因序列的pMD18-T simple质粒使用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行酶切得到345bp的DNA片段，命名为Insert DNA；

(2)Vector DNA的制备

将慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro使用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行酶切得到8.2Kbp的DNA片段，命名为Vector DNA；

(3)重组慢病毒表达载体的制备

将步骤(1)中得到的Insert DNA和步骤(2)中得到的Vector DNA采用SolutionⅠ进行连接，获得含有人胰岛素原基因的重组慢病毒表达载体pCDH-CMV-insulin-EF1-GFP-T2A-Puro。

7.权利要求4所述的表达人外源胰岛素原的人造血干细胞在制备用于治疗糖尿病制剂中的应用。