CN105708862A - 来自胎盘组织的粘附细胞及其在治疗中的用途 - Google Patents

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Abstract

公开了培养来自胎盘或脂肪组织的粘附细胞的方法。该方法包括在允许细胞扩增的三维(3D)培养条件下培养来自胎盘或脂肪组织的粘附细胞，所述条件包括灌注。

Description

来自胎盘组织的粘附细胞及其在治疗中的用途
本申请是2010年7月1日提交的题为“长效凝固因子及产生其的方法”的中国专利申请201080040296.X的分案申请。
相关申请
本申请要求2009年1月23日提交的临时专利申请61/202,050和2008年9月2日提交的临时专利申请61/136,375的优先权的益处。
所有以上文献的内容通过引用并入，如同在本文中完整呈现。
发明领域和背景
在本发明的一些实施方式中，本发明涉及胎盘组织的粘附细胞，更具体而言但不排除其它的，本发明涉及培养胎盘组织的粘附细胞和将其用于治疗的方法。
近些年以来，相当多的工作集中于间充质基质细胞(MSC)在多个医学应用包括受损器官例如脑、心脏、骨和肝脏的组织修复以及在支持骨髓移植(BMT)中的治疗潜力。MSC是获自例如骨髓、脂肪组织、胎盘和血液的异质细胞群体，其能够分化为不同类型的细胞(例如网状内皮细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、骨生成性祖细胞)，这取决于来自多个生物活性因子的影响。因此，在再生医学中已经广泛研究了MSC，作为建立新组织例如骨、软骨和脂肪的基础，以修复损伤或替换病理性组织并作为遗传性和获得性疾病的治疗[Fibbe和Noort,AnnNYAcadSci(2003)996:235-44；Horwitz等人,Cytotherapy(2005)7(5):393-5；Zimmet和Hare,BasicResCardiol(2005)100(6):471-81]。此外，MSC的多潜能的能力、其易于分离和培养以及其高度的离体扩增潜力，使其成为吸引人的治疗工具[Fibbe和Noort,见上；Minguell等人ExpBiolMed(Maywood)(2001)226(6):507-20]。
越来越多的数据表明MSC逃脱同种异体反应性细胞的识别并被认为具有免疫豁免特权(immune-privileged)[LeBlanc等人,ExpHematol(2003)31(10):890-6]。由于具有低免疫原性，所以MSC不被患者的免疫系统排斥，因此被认为不需要HLA匹配。
源自胎盘的MSC显示出具有与分离自其它组织的MSC的很多共同的标志物，例如CD105、CD73、CD90和CD29，并且显示出缺乏造血、内皮和滋养层特异性细胞标志物的表达。在适当的条件下培养源自胎盘的MSC之后，实现了脂肪生成性、骨生成性和神经生成性分化[Yen等人,StemCells(2005)23(1):3-9]。此外，已经证明分离自胎盘并在体外培养的MSC具有类似于MSC的免疫豁免特权[Li等人,CellRes(2005)15(7):539-47]。因此，胎盘提供了伦理上无争议的和容易获得的MSC来源，以用于实验和临床应用[Zhang等人,ExpHematol(2004)32(7):657-64]。另外，本发明人以前发明了适合于扩增源自胎盘的MSC的三维(3D)培养条件(WO/2007/108003)。
发明概述
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了培养来自胎盘或脂肪组织的粘附细胞的方法，所述方法包括在允许细胞扩增的三维(3D)培养条件下培养来自胎盘或脂肪组织的粘附细胞，所述条件包括灌注。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了根据以上方法产生的细胞的群体。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了包含基本上如本文描述的基因表达模式的细胞的群体。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了细胞群体在制备鉴定为用于治疗可以从细胞或器官移植中获益的病况的药物中的用途。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了在有此需要的受试者中诱导耐受和/或免疫抑制的方法，所述方法包括向所述受试者给予治疗上有效量的粘附细胞，从而在所述受试者中诱导耐受和/或免疫抑制。
根据本发明的一些实施方式，根据培养基的葡萄糖浓度调整灌注。
根据本发明的一些实施方式，将培养基维持在大约550mg/L的葡萄糖浓度。
根据本发明的一些实施方式，所述3D培养条件包括3D生物反应器。
根据本发明的一些实施方式，所述3D培养条件包含选自玻璃和塑料；聚酯、聚丙烯、聚苯乙烯、葡聚糖和胶原的粘附材料。
根据本发明的一些实施方式，进行所述3D培养条件至少3天。
根据本发明的一些实施方式，进行细胞培养直至至少10％的细胞处于增殖中。
根据本发明的一些实施方式，至少10％的粘附细胞处于增殖期。
根据本发明的一些实施方式，粘附细胞能够抑制免疫反应。
根据本发明的一些实施方式，粘附细胞包含选自CD73、CD90、CD29、CD105和D7-fib的阳性标志物表达。
根据本发明的一些实施方式，粘附细胞包含选自CD11b、CD34、HLA-DR、CD14、CD19、CD45、CD31、CD200和KDR的阴性标志物表达。
根据本发明的一些实施方式，粘附细胞包含基本上如本文描述的基因表达模式。
根据本发明的一些实施方式，与来自骨髓并在相同条件下生长和分化的粘附细胞相比，所述粘附细胞向骨生成性谱系的定向较差。
根据本发明的一些实施方式，与来自骨髓并在相同条件下生长和分化的粘附细胞相比，所述粘附细胞向脂肪生成性谱系的定向较差。
根据本发明的一些实施方式，所述病况选自局部缺血、外周动脉疾病(PAD)、临界性肢体缺血(criticallimbischemia)(CLI)、下肢远端缺血、缺血性血管疾病、肾脏的血管疾病、缺血性心脏病、心肌缺血、冠状动脉疾病(CAD)、动脉粥样硬化心血管病、冠状动脉左总干病、动脉阻塞性疾病、外周缺血、外周血管病、动脉硬化、缺血性脑部疾病、中风、脑缺血、脑血管疾病、视网膜病、视网膜修复、重塑性病症、希佩尔-林道综合征、遗传性出血性毛细血管扩张性缺血性血管病、Buerger氏病、缺血性肾病、缺血性胎盘、生殖相关的病症、移植物抗宿主病、实体器官移植、造血干细胞移植、糖尿病、结缔组织损伤、癌症、癌前、骨癌、骨肉瘤、骨转移瘤、骨折、烧伤、关节软骨缺损、创伤愈合、深伤、创伤愈合延迟、溃疡愈合延迟、软骨下骨囊肿、骨质疏松症、骨关节炎、骨退化、软骨损伤、关节软骨缺损、腱受损、自身免疫疾病、代谢病、牛皮癣、神经痛、外周神经损伤、肾移植的支撑物和炎性疾病。
根据本发明的一些实施方式，所述病况选自炎性肠病(IBD)和克罗恩病。
除非另有指明，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有本发明相关技术领域普通技术人员通常理解的相同含义。虽然相似于或等同于本文描述的那些的方法和材料可用于实施或测试本发明的实施方式，但是以下描述了示例性方法和/或材料。在出现冲突的情况下，以专利说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例仅为解释目的，不是意在必要性的限制。
附图说明
仅通过举例的方式，通过参考以下附图，本文描述了本发明的一些实施方式。现在通过详细地特别参考附图，旨在说明所显示的详细内容仅是举例方式并且是为了解释性讨论本发明的实施方式的目的。在此意义上，说明书以及附图使本领域技术人员明白可以如何实施本发明的实施方式。
在附图中：
图1是流程图，其显示了根据本文教导从胎盘产生3D粘附细胞(称作PLX-C细胞)。
图2是从TheNewBrunswickScientific网站改编而来的示例性的生物反应器的管和端口的示意图。
图3A-B显示了通过Plurix制备的3D粘附细胞(称作PLX，图3B)和通过本文教导制备的3D粘附细胞(称作PLX-C，图3A)的细胞周期分析。将细胞固定于70％的EtOHO.N，离心并重悬于碘化丙啶(PI)溶液，然后通过FACS分析。
图4A-D显示：在PLX-C上存在成纤维细胞典型性的标志物的表达，但没有内皮细胞典型性的标志物的表达。图4A显示了内皮细胞标志物CD31的阴性表达；图4B显示了内皮细胞标志物KDR的阴性表达；图4C显示了人成纤维细胞标志物(D7-FIB)的阳性表达，其中同种型IgG1(FITC)的红色柱状图代表阴性对照；蓝色柱状图代表阳性染色的细胞；图4D显示了人CD200标志物的阴性表达(同种型IgG1(PE)的粉红色柱状图代表阴性对照；绿色柱状图代表阳性染色的细胞)。
图5A-D显示了PLX-C细胞上的刺激性和共刺激分子的表达。图5A显示了PLX-C的CD80的表达；图5B显示了PLX-C的CD86的表达；图5C显示了PLX-C的CD40的表达；图5D显示了PLX-C的HLA-A/B/C的表达。以相关的同种型荧光分子制备阴性对照。值得注意的是，红色柱状图代表表达PLX-C标志物的细胞群体，蓝色柱状图代表表达骨髓(BM)标志物的细胞群体，绿色柱状图代表表达单核细胞(MNC)标志物的细胞群体。
图6A-B显示了PLX-C对于淋巴细胞增殖的抑制。图6A显示了以2x105个源自外周血(PB)的单核细胞(MNC,供体A)(其经过等量的经辐射的(3000Rad)源自PB的MNC(供体B)的刺激，然后向培养物中加入数量渐增的PLX-C细胞)进行的混合淋巴细胞反应(MLR)测试。每组一式三份接种于96孔平板。通过[3H]胸苷掺入测定增殖速率；图6B显示了以ConA(1.5mg/ml)刺激的源自外周血(PB)的MNC。向培养物中加入数量渐增的PLX-C细胞。每组一式三份接种于96孔平板。通过[3H]胸苷掺入测定增殖速率。
图7A-C显示了与外周血细胞共培养之后，PLX-C对于促炎性和抗炎性细胞因子分泌的调节。图7A-B显示了源自人的MNC(分离自外周血，经过ConA刺激)与PLX-C共培养之后，IFNγ(图7A)和TNFα(图7B)的分泌；图7C显示了源自人的MNC(分离自外周血，经过LPS刺激)与PLX-C共培养之后，IFNγ、TNFα和IL-10的分泌。收集上清液并通过ELISA分析细胞因子。
图8A-F是照片，其显示了在骨生成或脂肪生成的分化条件下，骨髓和胎盘细胞的生长。将源自骨髓的细胞(图8A-C)或源自胎盘的细胞(图8D-F)植板于包被了玻连蛋白(vitronection)和胶原的24孔板中的生长培养基(图8A和8D)、骨生成分化培养基(图8B和8E)或脂肪生成分化培养基(图8C和8F)。每3-4天更换培养基。在生长期末尾，按照以下实施例部分的详细描述将细胞固定、染色并照相。
图9A-F是照片，其显示了在修改的骨生成或脂肪生成的分化条件下，骨髓和胎盘细胞的生长。将源自骨髓的细胞(图9A-C)或源自胎盘的细胞(图9D-F)植板于包被了玻连蛋白和胶原的24孔板中的生长培养基(图9A和9D)、骨生成分化培养基(图9B和9E)或脂肪生成分化培养基(图9C和9F)。每3-4天更换培养基。在生长期末尾，按照以下实施例部分的详细描述将细胞固定、染色并照相。
图10显示了用于感染PLX-C细胞的萤光素酶表达载体。在本文中使用的是来自OmicsLink的表达载体Lv33。将萤光素酶基因克隆进入ORF。
图11显示了经感染的PLX-C细胞中萤光素酶的高度表达。以萤光素酶表达载体感染细胞，在感染后48小时通过IVIS系统显示。值得注意的是：细胞显示出高水平的萤光素酶表达。
图12A-D显示了将2x106个表达萤光素酶的PLX-C细胞注射进入SCID/Beige小鼠。一只小鼠通过IM方式注射，一只通过IV方式注射。使用IVIS系统监视经注射的小鼠，以测定PLX-C的体内生物分布。显示了第1天(图12A)、第4天(图12B)、第6天(图12C)和第22天(图12D)的IVIS结果。
本发明的具体实施方式的描述
在本发明的一些具体实施方式中，本发明涉及胎盘组织的粘附细胞，更具体而言但不排除其它的，本发明涉及培养胎盘组织的粘附细胞和将其用于治疗的方法。
通过参考附图和随附的说明书可以更好地理解本发明的原理和操作。
在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应该理解，本发明不是一定要限制在如以下描述中记载或通过实施例例示的细节上的应用。本发明具有其它实施方式或者可以以多种方式实施或进行。同样应该理解，本文使用的术语和命名是为了描述的目的，不应该被认为是限制。
在将本发明付诸实施时，本发明人发现：在包括灌注的三维(3D)培养条件下培养源自胎盘的粘附细胞，产生了大量的具有以下特征的粘附细胞：独特的基因表达模式、能够抑制免疫应答并且是高度增殖性的。因此，这些胎盘粘附细胞可用于治疗性应用。
如下文和随后的实施例部分的实施例1-8所解释，本发明人能够在3D条件下扩增源自胎盘的粘附细胞。本发明的3D条件包括生物反应器内的细胞培养基的灌注(见实施例2)。如实施例3所示，本发明的胎盘粘附细胞具有基质干细胞特性，例如，它们表达基质干细胞的典型性细胞标志物，并且具有免疫抑制特性。此外，这些细胞是高度增殖性的(28％的细胞处于S和G2/M期)并且在施用之后在体内保持数周(见实施例3和8)，这说明这些细胞可用于治疗。
另外，在其2D阶段，本发明的源自胎盘的粘附细胞不分化为骨细胞(实施例4-5)或脂肪细胞(实施例6-7)，这与骨髓粘附细胞截然相反：当在相同条件下生长时，有高比例(超过50％)的骨髓粘附细胞进行分化。
因此，根据本发明的一个方面，提供了培养来自胎盘或脂肪组织的粘附细胞的方法，所述方法包括在允许细胞扩增的三维(3D)培养条件下培养来自胎盘或脂肪组织的粘附细胞，所述条件包括灌注。
如本文使用的词语“粘附细胞”是指同质或异质的细胞群体，其是锚定依赖性的，即需要附着至表面以在体外生长。
如本文使用的词语“脂肪组织”是指包括脂肪细胞(脂细胞)的结缔组织。
如本文使用的术语“胎盘组织”是指哺乳动物器官的任何部分，其沿着子宫壁并且在妊娠过程中包被胎儿，与胎儿通过脐带连接。出生之后，胎盘被排出(其被称作产后胎盘)。在示例性的实施方式中，胎盘是指整个胎盘。
根据本文的教导，使用三维(3D)培养条件繁殖源自胎盘或脂肪组织的粘附细胞。
如本文使用的词语“三维培养物”是指这样的培养物：其中细胞被置于与细胞生长相容的条件下，所述条件包括支架，该支架允许细胞与细胞的三维接触。熟知的是，活的生物体(或组织)中的细胞的原位环境是在三维架构中。细胞被其它细胞所环绕。它们被保持在细胞外基质纳米级纤维的复杂网络中，这允许建立多个局部微环境。它们的细胞外配体不仅介导与基底膜的连接，而且介导通向多个血管和淋巴管。氧气、激素和营养物被运送至细胞；废物被排出。本发明的三维培养物的条件被设计为模拟此环境，如以下进一步所例示。
将认识到，三维培养物的条件是能够扩增粘附细胞。
如本文使用的术语“扩增(expanding)”和“扩增(expansion)”是指基本上无分化的细胞维持和最终的(ultimately)细胞生长，即细胞群体的增长(例如至少2倍)，此增长不伴随分化。
如本文使用的术语“维持(maintaining)”和“维持(maintenance)”是指基本上无分化的细胞更新，即基本上稳态的细胞群体，此稳态不伴随分化。
如上所述，本发明的这个方面的粘附细胞获自胎盘或脂肪组织。
胎盘细胞可以获自足月的或不足月的胎盘。优选地，在胎盘完成出血(exblooded)之后立即收集胎盘。优选地，将胎盘灌注足够的时间以除掉残余细胞(例如血液)。
如本文使用的术语“灌注(perfuse)”或“灌注(perfusion)”是指将流体倾倒在胎盘上或使流体流经胎盘的操作，或者在本方法的后期，将流体倾倒在培养的细胞上或使流体流经培养的细胞的操作。胎盘组织可以来自任意哺乳动物；例如，胎盘组织是人胎盘组织。胎盘组织的方便的来源是产后胎盘(例如1-6小时)，但是，胎盘组织或细胞的来源或胎盘组织的分离方法对本发明而言不是关键性的。
源自胎盘的粘附细胞可以获自胎盘的胎儿部分(即胎盘的羊膜、绒毛膜、绒毛膜绒毛或内部部分，见实施例1)和母体部分(即基蜕膜和壁蜕膜)。将组织样本在生理缓冲液[例如，磷酸盐缓冲的盐水(PBS)或Hank缓冲液]中清洗。通过以消化酶(见下文)处理组织或/和通过粉碎并经由尼龙滤器冲洗组织部分或通过以清洗介质轻轻吸液(Falcon,Becton,Dickinson,SanJose,CA)来制备单细胞悬浮液。
将认识到，可以从脂肪组织获得粘附细胞。可以通过本领域技术人员已知的多种方法分离源自脂肪组织的粘附细胞。例如，此类方法描述于美国专利号6,153,432。脂肪组织可以源自网膜/内脏的、乳腺的、性腺的或其它的脂肪组织位点。脂肪组织的一个来源是网膜的脂肪。在人类中，通常通过抽脂术分离脂肪。
来自胎盘或脂肪组织的分离的粘附细胞可以这样获得：使用消化酶例如胶原酶、胰蛋白酶和/或分散酶、和/或有效浓度的透明质酸酶或DNA酶、和乙二胺四乙酸(EDTA)处理组织，温度为25-50℃，处理时间为10分钟至3小时。然后可以使细胞通过20微米至1毫米的尼龙或粗棉布网滤器。在4-50℃的温度，100-3000xg的速度将细胞离心1分钟至1小时(见美国专利号7,078,230)。
从胎盘或脂肪组织中获取细胞优选在无菌条件下进行。一旦获得分离的细胞，允许其粘附至粘附材料(例如配置为表面)从而分离粘附细胞。
如本文使用的“粘附材料”是指合成的、天然存在的无细胞毒性(例如生物相容性)材料或其组合，所述材料具有可以将细胞保持在表面上的化学结构(例如带电的表面暴露的基团)。
可用于本发明的此方面的粘附材料的实例包括但不限于，聚酯、聚丙烯、聚烯烃、聚氯氟乙烯、聚氯乙稀、聚苯乙烯、聚砜、醋酸纤维素、玻璃纤维、陶瓷颗粒、基质胶、细胞外基质成分(例如，纤连蛋白、玻连蛋白、软骨粘连蛋白、层粘连蛋白)、胶原、聚L型乳酸、葡聚糖和惰性金属纤维。
纯化或富集基质干细胞的其它步骤可以通过本领域熟知的方法进行(例如使用基质干细胞标志物表达通过FACS进行，如下文进一步描述)。
可用于根据本发明的培养的基础培养基的非限制性实例包括：最简必需Eagle培养基、ADC-1、LPM(不含牛血清白蛋白)、F10(HAM)、F12(HAM)、DCCM1、DCCM2、RPMI1640、BGJ培养基(经过和不经过Fitton-Jackson改良)、基础Eagle培养基(添加Eagle的盐基(saltbase)的BME)、Dulbecco改良的Eagle培养基(无血清的DMEM)、Yamane、IMEM-20、Glasgow改良的Eagle培养基(GMEM)、LeibovitzL-15培养基、McCoy氏5A培养基、培养基M199(具有Eagle的盐基的M199E)、培养基M199(具有Hank的盐基的M199H)、最简必需Eagle培养基(具有Eagle的盐基的MEM-E)、最简必需Eagle培养基(具有Hank的盐基的MEM-H)和最简必需Eagle培养基(具有非必需氨基酸的MEM-NAA)，以及很多其它的，包括培养基199、CMRL1415、CMRL1969、CMRL1066、NCTC135、MB75261、MAB8713、DM145、Williams氏G、Neuman&Tytell、Higuchi、MCDB301、MCDB202、MCDB501、MCDB401、MCDB411、MDBC153。用于本发明的优选培养基是DMEM。这些和其它的有用的培养基可以从GIBCO,GrandIsland,N.Y.,USA和BiologicalIndustries,BetHaEmek,Israel等获得。很多这些培养基总结于MethodsinEnzymology,VolumeLVIII,"CellCulture",第6272页,WilliamB.Jakoby和IraH.Pastan编,AcademicPress,Inc出版。
培养基中可以补充例如血清，例如牛或人或其它物种的胎儿血清，以及任选或可替代地，补充生长因子、维生素(例如抗坏血酸)、细胞因子、盐(例如B-甘油磷酸盐)、甾类(例如地塞米松)和激素，例如生长激素、红细胞生成素、血小板生成素、白细胞介素3、白细胞介素6、白细胞介素7、巨噬细胞集落刺激因子、c-kit配体/干细胞因子、护骨蛋白配体、胰岛素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、睫状神经营养因子、血小板衍生的生长因子和骨形态发生蛋白，它们的浓度为pg/ml至mg/ml的水平。
进一步认识到，可以向培养基中添加另外的成分。此类成分可以是抗生素、抗真菌剂、白蛋白、氨基酸和本领域已知用于细胞培养的其它成分。另外，当需要时，可以添加增强分化过程的成分(进一步参见下文)。
如上所述，一旦获得了粘附细胞，可以使其传代至二维或三维环境(见以下的实施例部分的实施例1和2)。但是将认识到，虽然可以在分离后立即将细胞转移至3D配置的基质，但可替代地也可以在二维(2D)条件之后将其传代至三维环境(如上文所述)。
将认识到，在2D培养条件下，粘附细胞可以持续传代。根据本发明的实施方式，细胞可以传代至少4次，至少5次，至少6次，至少7次，或至少8次。将认识到，通常是当培养物达到大约70％-90％的汇合度时，通常为3-7天(例如3-5天，加倍1-3次)之后，将细胞传代。此外，在2D培养条件下，细胞从至少第2代、至少第3代或至少第4代可以在没有补充抗生素的培养基中生长。
因此，本发明的这个方面的粘附材料针对3D培养来配置，从而提供生长基质，所述生长基质实质上增加用于细胞粘附的可利用的附着表面，从而模拟组织(例如胎盘)的基础结构。
对于大规模生产，可以在3D生物反应器中进行培养。
此类生物反应器的实例包括但不限于，推流式生物反应器、持续搅拌槽式生物反应器、静止-床生物反应器(填充床生物反应器)和流化床生物反应器。
如实施例部分的实施例2所示，Celligen生物反应器能够在受控条件(例如pH、温度和氧水平)下并且以恒定的细胞培养基灌注进行粘附细胞的3D扩增。此外，可以就葡萄糖、乳酸盐、谷氨酰胺、谷氨酸和铵的浓度水平监视细胞培养物。粘附细胞的葡萄糖消耗速率和乳酸盐形成速率允许测定细胞生长速率并确定收获时间。
可以用于本发明的其它3D生物反应器包括但不限于，持续搅拌槽式生物反应器，其中将培养基持续加入生物反应器中并且将用过的培养基持续排出，以维持生物反应器内的时间恒定的稳定态。搅拌槽式生物反应器可以与下述一起使用：流化床(悬浮的载体)或纤维床篮(可以从例如NewBrunswickScientificCo.,Edison,NJ获得)、静止-床生物反应器、气升式生物反应器(其中通常将空气加至中央气流管的底部，气体向上流动同时形成泡沫，并且在柱的顶部释放废气)、具有Polyactive泡沫的生物反应器[如Wendt,D.等人,BiotechnolBioeng84:205-214,(2003)中所描述]、径向流灌注生物反应器中的多孔支架[如Kitagawa等人,BiotechnologyandBioengineering93(5):947-954(2006)中所描述]、具有支架或载体的径向流生物反应器、中空纤维生物反应器以及微载体。可用于本发明的其它生物反应器描述于美国专利号6,277,151、6,197,575、6,139,578、6,132,463、5,902,741和5,629,186。
在示例性实施方式中，接种总共150±50x106个细胞，接种3-7x106个细胞/gr载体，或接种0.06-0.13x106个细胞/毫升。根据示例性的实施方式，以1400-7000个细胞/cm2在FibraCel盘中进行细胞接种。
可以在至少大约10％的细胞正在增殖时收获细胞，同时避免不受控的分化和衰老。
培养持续至少大约2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、20天、1个月或更长。将认识到，在生物反应器中的培养可以超过这些时间段。3D培养物中的粘附细胞的培养可以在培养基的持续流中进行。也可以进行传代以增加细胞数目。将认识到，可以更换培养基以便延长并改善培养条件。
根据本发明的实施方式，在培养基的灌注下进行细胞培养。通常而言，灌注速率由粘附细胞的培养基中的葡萄糖浓度决定。因此，根据本教导，可以当葡萄糖浓度是大约500mg/L、大约550mg/L或大约600mg/L时更换培养基。
本发明的一些实施方式的粘附细胞包括至少大约10％、28％、30％、50％、80％或更多的增殖细胞(如可以通过FACS监视S和G2/M期而测定)。
本发明的一些实施方式的粘附细胞可包含至少一种“基质干细胞表型”。
如本文使用的“基质干细胞表型”是指源自骨髓的基质(即间充质)干细胞的典型的结构或功能表型。
如本文使用的词语“干细胞”是指不是终末分化的细胞。
因此，例如，细胞可以具有纺锤形状。可替代地或另外，细胞可以表达基质干细胞的典型的一种标志物或标志物(例如表面标志物)的集合。基质干细胞表面标志物(阳性和阴性)的实例包括但不限于：CD105+、CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、D7-fib+、CD3-、CD4-、CD34-、CD45-、CD80-、CD5-、CD20-、CD11B-、CD14-、CD19-、CD79-、HLA-DR-、CD31-、KDR-和FMC7-。其它基质干细胞标志物包括但不限于酪氨酸羟化酶、巢蛋白和H-NF。
根据本文教导产生的胎盘组织的粘附细胞具有基本上如以下实施例部分的实施例3所描述的基因表达模式。
基质干细胞的典型的功能表型的实例包括但不限于，T细胞抑制活性(它们不刺激T细胞，相反抑制T细胞)以及造血干细胞支持活性。
根据示例性的实施方式，与来自骨髓并在相同条件下生长和分化的粘附细胞相比，本发明的粘附细胞向骨生成性或脂肪生成性谱系的定向较差(分别见实施例4-5和实施例6-7)。
如以下的实施例部分的实施例3所示，发现在混合淋巴细胞反应(MLR)测试中，本发明的粘附细胞抑制人单核细胞的免疫反应，因此显示出可以有利地应用于临床的生物活性(例如T细胞抑制活性、造血干细胞支持活性)。
根据本发明的一个实施方式，本发明的粘附细胞能够抑制受试者中的免疫反应。
如本文使用的词语“抑制受试者中的免疫反应”是指降低或抑制受试者中响应于抗原(例如外来细胞或其一部分)而发生的免疫反应。可以被粘附细胞抑制的免疫应答包括体液免疫应答和细胞免疫应答，其分别涉及通过抗体和T-淋巴细胞(T细胞的增殖)的对病原体抗原的特异性识别。
根据本文教导产生的细胞群体可用于治疗可以从细胞或器官移植中获益的病况。
如本文使用的术语“病况”是指任何可以从细胞(例如干细胞)或器官移植中获益的病(疾病、病况、症状或病症)。实例包括局部缺血病况、心血管病况、神经系统病况、胃肠道病况、整形外科病况、造血病况、肾病况和肝病况，例如但不限于，外周动脉疾病(PAD)，例如肢体缺血和临界性肢体缺血(CLI)、下肢远端缺血、缺血性血管疾病、缺血性心脏病、心肌缺血、急性心肌梗塞(MI)、冠状动脉疾病(CAD)、动脉粥样硬化心血管病、冠状动脉左总干病、动脉阻塞性疾病、外周缺血、外周血管病、动脉硬化、缺血性脑部疾病、中风、脑缺血、脑血管疾病、视网膜病、视网膜修复、重塑性病症、希佩尔-林道综合征、遗传性出血性毛细血管扩张性缺血性血管病、Buerger氏病、糖尿病、肾脏的血管疾病、缺血性肾病、肝脏疾病、缺血性胎盘、再生相关的病症、移植物抗宿主病(GVHD)、实体器官移植、造血干细胞移植(HSCT)、代谢病症、胃肠(GI)道的炎性病况[例如炎性肠病(IBD)]、溃疡性大肠炎、创伤愈合延迟、溃疡愈合延迟、癌症(例如乳腺癌)、癌前、特征在于结缔组织损伤的病况，例如骨癌、骨肉瘤、骨转移瘤、骨折、退行性腰椎间盘疾病、成骨不全(OI)、烧伤(burn)、烧伤(burnwound)、关节软骨缺损、创伤愈合、深伤、创伤愈合延迟、溃疡愈合延迟、软骨下骨囊肿、骨质疏松症、骨关节炎(OA)、骨退化、软骨损伤、关节软骨缺损、腱受损(例如过劳诱导的腱损伤)和韧带损伤。
将认识到的是，本发明的粘附细胞能够诱导受试者中的免疫抑制和/或耐受。因此，所述粘附细胞可用于治疗任何需要免疫抑制和/或耐受的病况。此类病况包括但不限于，自身免疫疾病和炎性疾病(包括急性和慢性炎性疾病)，包括但不限于，心血管疾病、风湿性疾病、腺性疾病、胃肠疾病、皮肤病、肝病、神经疾病(例如神经痛、外周神经损伤)、肌肉疾病、肾病、肾移植的支持物、与生殖相关的疾病、结缔组织疾病和全身性疾病。
自身免疫性心血管疾病的实例包括但不限于，动脉粥样硬化(MatsuuraE.等人,Lupus.1998；7Suppl2:S135)、心肌梗塞(VaaralaO.Lupus.1998；7Suppl2:S132)、血栓(TincaniA.等人,Lupus1998；7Suppl2:S107-9)、韦格纳肉芽肿、Takayasu动脉炎、川崎综合征(PraprotnikS.等人,WienKlinWochenschr2000Aug25；112(15-16):660)、抗因子VIII自身免疫疾病(Lacroix-DesmazesS.等人,SeminThrombHemost.2000；26(2):157)、坏死性小血管炎、显微镜下多血管炎、Churg-Strauss综合征、少免疫病灶坏死性和新月体性肾小球性肾炎(NoelLH.AnnMedInterne(Paris).2000May；151(3):178)、抗磷脂综合征(FlamholzR.等人,JClinApheresis1999；14(4):171)、抗体诱导的心脏衰竭(WallukatG.等人,AmJCardiol.1999Jun17；83(12A):75H)、血小板减少性紫癜(MocciaF.AnnItalMedInt.1999Apr-Jun；14(2):114；SempleJW.等人,Blood1996May15；87(10):4245)、自身免疫性溶血性贫血(EfremovDG.等人,LeukLymphoma1998Jan；28(3-4):285；SallahS.等人,AnnHematol1997Mar；74(3):139)、Chagas病中的心脏自身免疫病(Cunha-NetoE.等人,JClinInvest1996Oct15；98(8):1709)和抗辅助T淋巴细胞自身免疫病(CaporossiAP.等人,ViralImmunol1998；11(1):9)。
自身免疫性风湿性疾病的实例包括但不限于，风湿性关节炎(KrennV.等人,HistolHistopathol2000Jul；15(3):791；TischR,McDevittHO.ProcNatlAcadSciunitsSA1994Jan18；91(2):437)和强直性脊柱炎(JanVoswinkel等人,ArthritisRes2001；3(3):189)。
自身免疫性腺性疾病的实例包括但不限于，胰腺疾病、I型糖尿病、甲状腺病、Graves病、甲状腺炎、自发性自身免疫性甲状腺炎、桥本甲状腺炎、特发性粘液性水肿、卵巢自身免疫病、自身免疫性抗精子不孕症、自身免疫性前列腺炎和I型自身免疫性多腺体综合征。疾病包括但不限于，胰腺的自身免疫疾病、I型糖尿病(CastanoL.和EisenbarthGS.Ann.Rev.Immunol.8:647；ZimmetP.DiabetesResClinPract1996Oct；34Suppl:S125)、自身免疫性甲状腺病、Graves病(OrgiazziJ.EndocrinolMetabClinNorthAm2000Jun；29(2):339；SakataS.等人,MolCellEndocrinol1993Mar；92(1):77)、自发性自身免疫性甲状腺炎(Braley-MullenH.和YuS,JImmunol2000Dec15；165(12):7262)、桥本甲状腺炎(ToyodaN.等人,NipponRinsho1999Aug；57(8):1810)、特发性粘液性水肿(MitsumaT.NipponRinsho.1999Aug；57(8):1759)、卵巢自身免疫病(GarzaKM.等人,JReprodImmunol1998Feb；37(2):87)、自身免疫性抗精子不孕症(DiekmanAB.等人,AmJReprodImmunol.2000Mar；43(3):134)、自身免疫性前列腺炎(AlexanderRB.等人,Urology1997Dec；50(6):893)和I型自身免疫性多腺体综合征(HaraT.等人,Blood.1991Mar1；77(5):1127)。
自身免疫性胃肠疾病包括但不限于，慢性炎性肠病(GarciaHerolaA.等人,GastroenterolHepatol.2000Jan；23(1):16)、乳糜泻(LandauYE.和ShoenfeldY.Harefuah2000Jan16；138(2):122)、结肠炎、回肠炎和克罗恩病。
自身免疫性皮肤病的实例包括但不限于，自身免疫性大疱性皮肤病，例如但不限于，寻常性天疱疮、大疱性类天疱、牛皮癣和落叶性天疱疮。
自身免疫性肝病的实例包括但不限于，肝炎、自身免疫性慢性活动性肝炎(FrancoA.等人,ClinImmunolImmunopathol1990Mar；54(3):382)、原发性胆汁性肝硬化(JonesDE.ClinSci(Colch)1996Nov；91(5):551；StrassburgCP.等人,EurJGastroenterolHepatol.1999Jun；11(6):595)和自身免疫性肝炎(MannsMP.JHepatol2000Aug；33(2):326)。
自身免疫性神经疾病的实例包括但不限于，多发性硬化(CrossAH.等人,JNeuroimmunol2001Jan1；112(1-2):1)、阿尔茨海默病(OronL.等人,JNeuralTransmSuppl.1997；49:77)、重症肌无力(InfanteAJ.和KraigE,IntRevImmunol1999；18(1-2):83；OshimaM.等人,EurJImmunol1990Dec；20(12):2563)、神经病、运动神经病(KornbergAJ.JClinNeurosci.2000May；7(3):191)；格林-巴利综合征和自身免疫性神经病(KusunokiS.AmJMedSci.2000Apr；319(4):234)、肌无力、朗伯-伊顿肌无力综合征(TakamoriM.AmJMedSci.2000Apr；319(4):204)；副肿瘤性神经疾病、小脑萎缩、副肿瘤性小脑萎缩和僵人综合征(HiemstraHS.等人,ProcNatlAcadSciunitsSA2001Mar27；98(7):3988)；非副肿瘤性僵人综合征、进行性小脑萎缩、脑炎、Rasmussen脑炎、肌萎缩性侧索硬化症、小舞蹈病、抽动秽语综合征和自身免疫性多内分泌腺病(AntoineJC.和HonnoratJ.RevNeurol(Paris)2000Jan；156(1):23)；免疫异常性神经病(Nobile-OrazioE.等人,ElectroencephalogrClinNeurophysiolSuppl1999；50:419)；获得性神经性肌强直、先天性多发性关节挛缩症(VincentA.等人,AnnNYAcadSci.1998May13；841:482)、神经炎、视觉神经炎(SoderstromM.等人,JNeurolNeurosurgPsychiatry1994May；57(5):544)和神经退行性疾病。
自身免疫性肌肉疾病的实例包括但不限于，肌炎、自身免疫性肌炎和原发性干燥综合征(FeistE.等人,IntArchAllergyImmunol2000Sep；123(1):92)和平滑肌自身免疫疾病(ZauliD.等人,BiomedPharmacother1999Jun；53(5-6):234)。
自身免疫性肾病的实例包括但不限于，肾炎和自身免疫性间质性肾炎(KellyCJ.JAmSocNephrol1990Aug；1(2):140)。
生殖相关的自身免疫性疾病的实例包括但不限于反复性胎儿丢失(repeatedfetalloss)(TincaniA.等人,Lupus1998；7Suppl2:S107-9)。
自身免疫性结缔组织疾病的实例包括但不限于，耳病、自身免疫性耳病(YooTJ.等人,CellImmunol1994Aug；157(1):249)和内耳的自身免疫疾病(GloddekB.等人,AnnNYAcadSci1997Dec29；830:266)。
自身免疫性全身性疾病的实例包括但不限于，系统性红斑狼疮(EriksonJ.等人,ImmunolRes1998；17(1-2):49)和系统性硬化症(RenaudineauY.等人,ClinDiagnLabImmunol.1999Mar；6(2):156)；ChanOT.等人,ImmunolRev1999Jun；169:107)。
此外，本发明的粘附细胞可用于治疗与移植物的移植相关的疾病，包括但不限于，移植物排斥、慢性移植物排斥、亚急性移植物排斥、超急性移植物排斥、急性移植物排斥和移植物抗宿主病。
如本文使用的术语“治疗”是指抑制或阻滞病症的发展和/或引起病症的减弱、缓解或衰退。本领域技术人员将理解，多种方法和测定法可用于测定病症的发展，类似地，多种方法和测定法可用于测定病症的减弱、缓解或衰退。术语“治疗”还可以指缓和或消除与病症相关的症状。
通过粘附细胞治疗的受试者可以是被诊断为具有病症或遭受病症并且可以从基质干细胞移植获益的任意受试者(例如哺乳动物)，例如人类受试者或驯化的动物，包括但不限于，马(horse)(即马(equine))、牛、山羊、绵羊、猪、狗、猫、骆驼、羊驼、美洲驼和牦牛。
从本发明的粘附细胞(例如基质干细胞)衍生谱系特异性细胞的方法是本领域熟知的。参见例如美国专利号5,486,359、5,942,225、5,736,396、5,908,784和5,902,741。
粘附细胞可以是幼稚的或者可以经过遗传修饰，以便衍生感兴趣的谱系(参见，美国专利申请号20030219423)。
细胞可以是自体的或者非自体的来源。非自体的来源可以是同种异基因的或异种的。细胞可以以新鲜或冷冻(例如冷冻保存)制备物来使用。
取决于医学状况，可以向受试者给予另外的化学药物(例如免疫调节性的、化疗等)或细胞。
虽然细胞的特征在于免疫抑制活性，但是它们仍然可以引发源自宿主或供体的不想要的免疫应答。已经开发了减少非自体细胞的排斥或移植物抗宿主病(GvHD)的可能性的方法。这些包括：抑制受体免疫系统或在移植之前将非自体细胞封装在免疫屏障性半透膜中。
封装技术一般分类为微封装，其包括小的球形介质；以及大封装，其包括较大的平板膜和中空纤维膜(Uludag,H.等人Technologyofmammaliancellencapsulation.AdvDrugDelivRev.2000；42:29-64)。
制备微胶囊的方法是本领域已知的，包括例如由以下公开的那些：LuMZ,等人,Cellencapsulationwithalginateandalpha-phenoxycinnamylidene-acetylatedpoly(allylamine).BiotechnolBioeng.2000,70:479-83；ChangTM和PrakashS.Proceduresformicroencapsulationofenzymes,cellsandgeneticallyengineeredmicroorganisms.MolBiotechnol.2001,17:249-60；和LuMZ等人,Anovelcellencapsulationmethodusingphotosensitivepoly(allylaminealpha-cyanocinnamylideneacetate).JMicroencapsul.2000,17:245-51。
例如，通过将修饰的胶原与甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸(MAA)和甲基丙烯酸甲酯(MMA)的三元共聚物壳复合来制备微胶囊，得到2-5μm的胶囊厚度。此微胶囊可以使用另外的2-5μm三元共聚物壳进行进一步封装，以产生带负电的平滑表面并使血浆蛋白吸附最小化(Chia,S.M.等人Multi-layeredmicrocapsulesforcellencapsulationBiomaterials.200223:849-56)。
其它微胶囊基于藻酸盐，其为一种海洋多糖(Sambanis,A.Encapsulatedisletsindiabetestreatment.DiabetesTechnol.Ther.2003,5:665-8)或其衍生物。例如，可以在存在氯化钙的情况下，通过聚阴离子性藻酸钠和硫酸纤维素钠与聚阳离子性(亚甲基-胍)共聚物盐酸盐(poly(methylene-co-guanidine)hydrochloride)之间的聚电解质复合来制备微胶囊。
将认识到，当使用较小的胶囊时会改善细胞封装。因此，当胶囊尺寸从1mm减小至400μm时，被封装细胞的质量控制、机械稳定性、扩散特性和体外活性被改善(CanapleL.等人,Improvingcellencapsulationthroughsizecontrol.JBiomaterSciPolymEd.2002；13:783-96)。此外，发现具有良好控制的孔径(小至7nm)的纳米多孔生物胶囊(具有特制表面化学和精确的微架构)是细胞的成功的免疫屏障微环境(WilliamsD.Smallisbeautiful:microparticleandnanoparticletechnologyinmedicaldevices.MedDeviceTechnol.1999,10:6-9；Desai,T.A.Microfabricationtechnologyforpancreaticcellencapsulation.ExpertOpinBiolTher.2002,2:633-46)。
免疫抑制剂的实例包括但不限于，氨甲蝶呤、环磷酰胺、环孢霉素、环孢霉素A、氯喹、羟基氯喹、柳氮磺吡啶(sulphasalazopyrine)、金盐、D-青霉胺,来氟米特、硫唑嘌呤、阿那白滞素(anakinra)、英夫利昔单抗(REMICADE),依那西普、TNFα阻滞剂、靶向炎性细胞因子的生物试剂和非甾类抗炎药(NSAID)。NSAID的实例包括但不限于，乙酰水杨酸、水杨酸胆碱镁、二氟尼柳、水杨酸镁、双水杨酯、水杨酸钠、双氯芬酸、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸盐、萘普生、萘丁美酮、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、托美丁、对乙酰氨基酚、布洛芬、Cox-2抑制剂和曲马朵。
此外，将认识到，可以给予细胞本身或优选将其作为药物组合物的一部分来给予，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
如本文使用的“药物组合物”是指本发明的粘附细胞(即粘附细胞)与其它化学成分例如药学上可接受的载体和赋形剂的制备物。药物组合物的目的是为了促进细胞向受试者的施用。
在下文中，术语“药学上可接受的载体”是指对于受试者不引起显著刺激并且不消除所给予的化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。载体的非限制性实例有丙二醇、盐水、乳液和有机溶剂与水的混合物。
本文中的术语“赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进化合物的给药的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、多种糖和多种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
配制和给予药物的技术可以见“Remington’sPharmaceuticalSciences,”MackPublishingCo.,Easton,PA,最新版，其通过引用并入本文。
因此可以按照常规方式使用一种或多种生理上可接受的载体(包括赋形剂和佐剂，其促进活性成分加工进入制备物，可在药学上使用)来配制用于本发明的药物组合物。正确的配制依赖于所选的给药途径。
对于注射而言，药物组合物的活性成分可以配制在水溶液中，优选在生理上相容的缓冲液(例如Hank溶液、Ringer溶液、生理盐缓冲液)或含有冷冻保存剂的冷冻介质中。
治疗上有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是鉴于本文提供的详细公开内容。
可以通过标准的药学程序在体外、在细胞培养物中或在实验动物中测定本文描述的活性成分的毒性和治疗功效。
取决于待治疗的病况的严重性和响应性，可以单次给药或多次给药。但是，所给予的组合物的量当然将取决于被治疗的受试者、病痛的严重性、给药方式、主诊医生的判断等。
包括配制于相容性药学载体中的本发明的制备物的组合物还可配制于、放置于合适的容器中，对其标记出所治疗的适应症。
如果需要，本发明的组合物可以以包装或分配器例如FDA批准的试剂盒来呈现，其可以包含一个或多个含有活性成分的单元剂型。所述包装可以例如包含金属或塑料箔，例如泡罩包装。所述包装或分配器可以伴有给药说明书。所述包装或分配器还可以具有与容器相关的声明，其为管理药物生产、使用或销售的政府部门所规定的形式，该声明反映该部门批准的组合物的形式或者人类或兽用给药。此声明可以是例如美国食品与药品管理局批准的用于处方药的标签，或批准的产品插页。
预期在从本申请形成的专利的有效期内，会开发出很多相关的三维培养物，并且术语“三维培养物”的范围意在包括所有此等推演出的新技术。
如本文使用的术语“大约”是指±10％。
术语"包含/包括(comprises)"、"包含/包括(comprising)"、"包括(includes)"、"包括(including)"、"具有(having)"及其变化形式意指"包括但不限于"。
术语"由……组成"意思是“包括并且限于”。
术语"基本上由……组成"意思是组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但是仅是指所述另外的成分、步骤和/或部分不对要求保护的组合物、方法或结构的基础性和新颖性特征造成本质上的改变。
除非上下文另有明确指明，否则如本文使用的单数形式"一种(a)"、"一种(an)"和"该(the)"包括复数指称。例如术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多个化合物，包括其混合物。
在本申请通篇文本中，可以以范围形式呈现本发明的多个实施方式。应该理解，以范围形成表示的说明书仅仅是为了方便和简洁，不应该被理解为本发明的范围的僵硬的限制。因此，某范围的描述应该被认为是具体公开了该范围内的所有可能的亚范围以及单个数值。例如，某范围的描述，例如1至6，应该被认为是具体公开了该范围内的亚范围，例如1至3，1至4，1至5，2至4，2至6，3至6等等，以及具体公开了该范围内的单一数值，例如1、2、3、4、5和6。不论范围有多宽，都适用这一原则。
任何情况下当在本文中提及数字范围时，意指包括该所指范围内的任意提及的数值(分数或整数)。词语“第一个指明数字和第二个指明数字之间”和“第一个指明数字至第二个指明数字”在本文中相互替换地使用，意指包括第一和第二个指明的数字和其间的所有分数和整数数字。
如本文使用的术语“方法”是指为了完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于，化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业人员已知的那些方式、手段、技术和程序，或化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业人员从已知的方式、手段、技术和程序中可以容易地开发的那些方式、手段、技术和程序。
应认识到，为了清楚起见，在单独的实施方式的上下文中描述的本发明的一些特征，也可以在单一实施方式中组合提供。反过来，为了简洁起见，在单一实施方式的上下文中描述的本发明的多个特征，也可以单独地或以任意合适的亚组合或视需要在本发明的任意其它描述的实施方式中适宜地提供。在多个实施方式的上下文中描述的某些特征不应被认为是那些实施方式的必要特征，除非该实施方式在缺少那些要素的条件下不能实施。
以上描述的和以下的权利要求书部分要求保护的本发明的多个实施方式和方面得到以下实施例的实验支持。
实施例
现在参考以下实施方式，其与以上的描述共同以非限制性方式解释本发明。
一般而言，本文使用的命名法和本发明中使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。此等技术在文献中有完善的解释。参见，例如，"MolecularCloning:AlaboratoryManual"Sambrook等人,(1989)；"CurrentProtocolsinMolecularBiology"VolumesI-IIIAusubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel等人,"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWileyandSons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"APracticalGuidetoMolecularCloning",JohnWiley&Sons,NewYork(1988)；Watson等人,"RecombinantDNA",ScientificAmericanBooks,NewYork；Birren等人(eds)"GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries",Vols.1-4,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1998)；美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中所给出的方法；"CellBiology:ALaboratoryHandbook",VolumesI-IIICellis,J.E.,ed.(1994)；"CurrentProtocolsinImmunology"VolumesI-IIIColiganJ.E.,ed.(1994)；Stites等人(eds),"BasicandClinicalImmunology"(8thEdition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi(eds),"SelectedMethodsinCellularImmunology",W.H.FreemanandCo.,NewYork(1980)；可获得的免疫测定法在专利和科学文献中有详尽描述，参见，例如美国专利号3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；"OligonucleotideSynthesis"Gait,M.J.,ed.(1984)；“NucleicAcidHybridization"Hames,B.D.,andHigginsS.J.,eds.(1985)；"TranscriptionandTranslation"Hames,B.D.,andHigginsS.J.,Eds.(1984)；"AnimalCellCulture"Freshney,R.I.,ed.(1986)；"ImmobilizedCellsandEnzymes"IRLPress,(1986)；"APracticalGuidetoMolecularCloning"Perbal,B.,(1984)和"MethodsinEnzymology"Vol.1-317,AcademicPress；"PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications",AcademicPress,SanDiego,CA(1990)；Marshak等人,"StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual"CSHLPress(1996)；以上全部通过引用并入，如同在本文中完整呈现。在遍布本文本中提供了其它一般性参考文献。相信其中的程序是本领域熟知的，为了读者方便而提供。其中包含的所有信息通过引用并入本文。
实施例1
根据WO/2007/108003的方法产生源自胎盘的粘附细胞
根据以前的描述(见WO/2007/108003)在含有3D载体(carriers)的生物反应器系统中产生粘附细胞，以产生粘附细胞(在本文中称作PLX)。
材料和实验程序
源自胎盘的粘附细胞-在无菌条件下切碎足月分娩胎盘(BneiZionmedicalcenter,Haifa,Israel)的内部部分，以Hank缓冲液清洗三次，并在37℃以0.1％的胶原酶(1mg/ml组织；Sigma-Aldrich,St.Lewis,MO)温育3小时。然后通过轻轻地吸液，以补充了10％FCS、青霉素-链霉素-制霉菌素混合物(100U/ml:100μg/ml:1.25un/ml)和2mML-谷氨酰胺的DMEM清洗悬浮细胞，接种于75cm2瓶中并在37℃在组织培养孵育箱中在加湿条件下在5％CO2中孵育。
二维(2D)细胞生长
使细胞在塑料表面粘附48-72小时，然后每3-4天更换培养基。2-3次传代后，将细胞冷冻保存，解冻，并接种于瓶子中进行次级生长。当达到60-80％汇合度时，使用0.25％胰蛋白酶-EDTA使细胞与生长瓶子脱离，并接种至新的瓶子(通常每3-5天)，再传代2-5次。然后收集培养的细胞以进行分析或用于生物反应器中的培养。
PluriXTM推流式生物反应器-向PluriXTM推流式生物反应器(Pluristem,Haifa,Israel；如以前在美国专利号6,911,201和WO/2007/108003中所描述)中装载1-100ml压缩的3Dporrosive载体(直径为4mm)，所述载体由聚酯的无纺布基质构成。这些载体能够使大量的细胞在相对小的体积内繁殖。玻璃器具由Pluristem(Pluristem,Haifa,Israel)设计并生产。将生物反应器维持在37℃的孵育箱中，通过阀门和蠕动泵控制并监视流速。生物反应器具有取样和注射点，允许连续接种细胞。从贮液库中供应pH为6.7-7.4的培养基。向贮液库中供应含有不同比例的空气/CO2/O2的经过滤的气体混合物，其比例取决于生物反应器中的细胞密度。使O2的比例适合于生物反应器出口处的溶解氧水平(根据监视器来确定)。通过硅胶管或扩散器(DeganiaBet,EmekHayarden,Israel)向贮液库提供气体混合物。使培养基通过分离容器，该分离容器能够收集循环的非粘附细胞。通过蠕动泵实现培养基的循环。该生物反应器还具备另外的取样点和用于持续培养基更换的容器。
PLX粘附细胞的产生–将按照上文所述生长的非汇合原代人粘附2D细胞培养物进行胰蛋白酶处理，清洗，重悬于补充了10％FBS、青霉素-链霉素-制霉菌素混合物(100U/ml:100μg/ml:1.25un/ml)和2mML-谷氨酰胺的DMEM中，并通过注射点接种(103-105个细胞/ml)至无菌的推流式生物反应器中的3D载体上。接种前，以PBS-Ca-Mg(BiologicalIndustries,BeitHa'emek,Israel)填充生物反应器，高压蒸汽灭菌(120℃,30min)并以含有10％热灭活的胎牛血清和青霉素-链霉素-制霉菌素混合物(100U/ml:100μg/ml:1.25un/ml)的Dulbecco生长培养基清洗。将流速控制在0.1-5ml/分钟。接种过程包括停止循环2-48小时，从而允许细胞停留在载体上。将生物反应器维持在控制的温度(37℃)和pH条件下(pH＝6.7-7.4)；视需要使用供应了无菌空气和CO2的孵育箱。每周更换生长培养基2-3次。每4小时至7天将循环培养基替换为新鲜的DMEM培养基。在1X106-1X107个细胞/ml的密度时(生长12-40天后)，从生物反应器中除掉所有的培养基，以PBS将生物反应器和载体清洗3-5次。然后使用胰蛋白酶-EDTA(BiologicalIndustries,BeitHa'emek,Israel；3-15分钟，轻微搅动，1-5次)使PLX粘附细胞与载体脱离，然后重悬于DMEM中并冷冻保存。
实施例2
产生本发明的源自胎盘的粘附细胞
根据本发明产生PLX-C粘附细胞，其显示出不同于以上描述的PLX粘附细胞的特性。
材料和实验方法
CelligenTM推流式生物反应器-通过CelligenTM产生本发明的粘附细胞(PLX-C细胞)由图1所示的数个主要步骤组成。该过程始于从足月的计划剖腹产收集胎盘。
然后从完整胎盘分离粘附细胞，生长于组织培养瓶(2D培养物)中，收获并储存于液氮中作为2D-细胞贮液(2DCS)，解冻合适数量的2DCS，清洗并接种进入生物反应器中的载体以进一步扩增为3D-培养物。在生物反应器中生长4-12天后，收获细胞并冷冻保存于液氮中的气相中，作为PLX-C。
人组织的获得
所有获得的胎盘来自产科病房，经过医疗机构的HelsinkiCommittee批准。相应地，所有的胎盘提供者签署知情同意书，并且进行供体筛选和供体测试。从供体获取胎盘之后(在剖腹产程序中)，立即将其置于无菌塑料袋中，然后置于具有冰包的保温盒中。
粘附细胞的回收和处理
为了启动该过程，在无菌条件下在层流净化柜中将胎盘组织切成片，以Hank缓冲溶液清洗并在37℃以0.1％胶原酶(1mg胶原酶/毫升组织)温育2-5小时。加入2D细胞培养基(2D-培养基含有DMEM，补充了10％FBS、0.25μg/ml两性霉素和50μg/ml庆大霉素)，将经消化的组织通过无菌金属滤网大致过滤，收集于无菌烧杯中并离心(10分钟，1200RPM,4℃)。然后通过轻轻地吸液以补充了抗生素的2D培养基稀释悬浮的细胞，接种于175cm2瓶中并在37℃在组织培养孵育箱中在加湿条件下在5％CO2中孵育。2-3天后(其中允许细胞粘附至瓶表面)，以PBS洗涤之并加入2D-培养基。
二维(2D)细胞生长
在第一次传代之前，汇集被隔离的10％总瓶中数目的生长培养基样品，并进行支原体测试(IPC2)。如果发现细胞为支原体阴性(EZ-PCR支原体试剂盒,BiologicalIndustries,Israel)，则将细胞解除隔离。使用补充了抗生素的2D-培养基再进行1-2次传代之后，将细胞转移至2D-生产洁净室(2DP)。一旦处于2DP室中，使用不含抗生素的2D-培养基使培养物继续再传代3-6次。在整个过程中，培养物在组织培养孵育箱中在加湿条件下在5％CO2中在37℃生长。经过总共6-9次传代(9-17次细胞加倍)，收集细胞并冷冻保存为2D-细胞贮液(2DCS)。
通常在7-15天后进行第一次传代。从第二次传代开始并持续至第6-9次传代，都是当培养物达到70％-90％汇合度时(通常为4-5天后，1.5-2次加倍)进行细胞传代。使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(4分钟，37℃)使细胞与瓶脱离，并以4±0.5x103个细胞/cm2的培养物密度接种。组织培养瓶的尺寸随着传代的进行增大。培养过程起始于175cm2的组织培养瓶，在500cm2(Triple瓶)中持续，最终将细胞接种于细胞工厂(CellFactory)，10个盘(6320cm2)。
在冷冻保存之前，在2DCS生长期末尾，收集生长培养基并制备样品，以送去经批准的GLP实验室进行支原体测试(IPC4)。
2D-细胞贮液产物的冷冻保存程序
对于2DCS冷冻保存，在无菌条件下使用0.25％的胰蛋白酶-EDTA收集2D-培养的细胞。将细胞离心(1200RPM,10分钟,4℃)，计数，并重悬于2D-培养基。
对于冷冻，将细胞悬浮液按照1:1稀释于2D-冷冻混合物(终浓度为10％DMSO、40％FBS和50％2D-培养基)。从一个胎盘制备大约1.5-2.5x109个细胞。将4ml细胞以10x106/ml的终浓度储存于5ml冷冻保存聚丙烯瓶中。将瓶子进行标记并转移至控速冷冻设备以进行温度逐步降低过程(1℃/分钟)，然后将其转移以储存在液氮冷冻设备中的气相中。该材料被称作2D-细胞贮液(2DCS)批。
三维(3D)培养程序的启动
为了开始3D培养，将来自2DCS的适当数量(150±50x106)的细胞在2DP室中解冻，并以3D-培养基(含有10％FBS和20MmHepes的DMEM)清洗以除掉DMSO，然后接种于事先准备好的生物反应器系统中。吸取每个2DCS瓶中的内容物并按1:9稀释于预热(37℃)的3D-培养基中。将细胞离心(1200RPM,10分钟,4℃)并再次重悬于250ml无菌瓶中的50-100ml预热(37℃)的3D-培养基中。取出样品并使用台盼蓝染色计数细胞，以确定细胞数目和存活率。在层流净化柜中将细胞悬浮液转移进入0.5L接种瓶中。通过无菌管通过引力作用将细胞悬浮液从接种瓶转移进入生物反应器。
在Celligen生物反应器中产生粘附细胞(PLX-C)
生物反应器之描述
使用如图2所示的自动化CelliGen或BIOFLO310生物反应器系统[(NewBrunswickScientific(NBS)]进行3D生长期。生物反应器系统用于培养细胞培养物，其中的条件适合于高细胞浓度。以灌注模式使用生物反应器进行培养过程。实验室规模的生物反应器由两个主系统构成—控制系统和生物反应器本身(管和附件)。通过控制台监视并控制过程的参数，所述控制台包括探测器、发动机和泵的连接器，溶解氧(DO)、pH、灌注和搅拌(具有发动机)的操纵系统、气体控制系统、用于温度控制的水循环和加热系统以及操作界面。受控的过程参数(例如温度、pH、DO等)可以显示于操作界面上并由指定的控制人员进行监视。
生物反应器中的细胞培养物生长程序
如以上的部分所述，将来自冷冻保存的2DCS的150±50x106个细胞解冻，清洗并接种于无菌生物反应器中。生物反应器含有30-50gr由聚酯和聚丙烯制成的载体(disks,NBS)和1.5±0.1L3D-培养基。生物反应器中的生长培养基保持在以下条件：37℃,70％溶解氧(DO)和pH7.3。供应由控制系统决定的经过滤的气体(空气、CO2、N2和O2)，以将DO值保持在70％，将pH值保持在7.3。对于前24个小时，以50转/分(RPM)搅拌培养基，并在第二天增大至200RPM。对于前2-3天，细胞以批式模式生长。当培养基中的葡萄糖浓度下降至低于500mg/L时启动灌注。使用无菌硅胶管将培养基从加料器泵至生物反应器。所有的管的连接都在层流净化柜中使用无菌连接器进行。每日调整灌注，以使葡萄糖浓度恒定保持在大约550±50mg/L。每1-2天取出生长培养基的样品以测定葡萄糖、乳酸盐、谷氨酰胺、谷氨酸和铵浓度(BioProfile400分析仪,NovaBiomedical)。细胞培养物的葡萄糖消耗速率和乳酸盐形成速率能够测定细胞生长速率。这些参数用于基于积累的实验数据来确定收获时间。
从生物反应器中收获3D生长的PLX-C细胞
在生长期的末尾(4-12天)开始细胞收获过程。收集生长培养基的2个样品。制备一个样品以送去经批准的GLP实验室根据USP和EU标准进行支原体测试。该培养基样品被认为是最终产物的支原体测试的一部分，结果被认为是产物释放标准的一部分。
在3DP室中在Class-100层流区收获3D-生长培养物，如下所述：
通过重力作用通过管道将生物反应器的管排空至废液容器。然后以1.5L预热的PBS(37℃)重新充满生物反应器的管。将搅拌速率增加至150RPM，持续2分钟。通过压力或重力使PBS通过管道引流进入废液瓶。清洗程序重复两次。
为了使细胞从载体上释放，将1.5L预热至37℃的胰蛋白酶-EDTA(胰蛋白酶0.25％,EDTA1mM)加入到生物反应器的管中，在37℃以150RPM将载体搅拌1-4分钟。将250mlFBS加入到生物反应器的管中，将细胞悬浮液收集到5L无菌容器中。将细胞悬浮液分装入500ml无菌离心管，离心(1200RPM,10分钟,4℃)，然后以5-30^106个细胞/毫升的浓度重悬于冷冻保存溶液。将细胞以无菌方式注入并冷冻保存，作为PLX-C。
实施例3
WO/2007/108003(PLX)的粘附细胞与本发明的粘附细胞的比较
将如以上实施例1所描述的通过WO/2007/108003产生的粘附细胞(在本文中称作PLX)与本发明的新的粘附细胞(在本文中称作PLX-C)进行比较。
材料和实验方法
细胞周期分析-将通过Celligen获得的PLX-C细胞和通过Plurix获得的PLX细胞以70％EtOHO.N固定，离心并重悬于含有2μg/mlPI(Sigma)、0.2mg/mlRnaseA(Sigma)和0.1％(v/v)Triton(Sigma)的碘化丙啶(PI)溶液中30分钟。通过FACS分析细胞周期。
基因表达阵列(微阵列)-从人足月胎盘获得粘附细胞并通过Plurix或通过Celligen扩增。从每种扩增方法获得三个不同批次的细胞，用于进一步检查。
从细胞中提取RNA(Qiagen-Rneasy微试剂盒)并应用至Affymetrix全基因组表达阵列。芯片使用HumanExon1.0STArray(Affymetrix,SantaClara,California,USA)。
膜标志物的FACS分析-按照之前的描述以单克隆抗体将细胞染色。简而言之，将400,000-600,000个细胞悬于5ml试管中的0.1ml流式细胞术缓冲液中，并在室温(RT)在黑暗中与下列单克隆抗体(MAb)中的每一种一起孵育15分钟：FITC-缀合的抗-人CD29MAb(eBioscience)、PE缀合的抗人CD73MAb(BectonDickinson)、PE缀合的抗人CD105MAb(eBioscience),PE缀合的抗人CD90MAb(BectonDickinson)、FITC-缀合的抗-人CD45MAb(IQProducts)、PE-缀合的抗-人CD19MAb(IQProducts)、PE缀合的抗人CD14MAb(IQProducts)、FITC缀合的抗人HLA-DRMAb(IQProduct)、PE缀合的抗人CD34MAb(IQProducts)、FITC缀合的抗人CD31MAb(eBioscience)、FITC缀合的抗人KDRMAb(R&Dsystems)、抗人成纤维细胞标志物(D7-FIB)MAb(ACRIS)、FITC-缀合的抗-人CD80MAb(BD)、FITC-缀合的抗-人CD86MAb(BD)、PE缀合的抗-人CD200MAb(BD)、FITC-缀合的抗-人CD40MAb(BD)、FITC-缀合的抗-人HLA-ABCMAb(BD)、FITC缀合的同种型IgG1(IQProducts)、PE缀合的同种型IgG1(IQProducts)。
使用流式细胞术缓冲液将细胞清洗2次，重悬于500μl流式细胞术缓冲液并使用FC-500流式细胞仪(BeckmanCoulter)通过流式细胞术进行分析。使用相关的同种型荧光分子制备阴性对照。
混合淋巴细胞反应(MLR)
将2x105个源自外周血(PB)的MNC(来自供体A)使用等量的经辐射(3000Rad)的源自PB的MNC(来自供体B)进行刺激。向培养物中加入数量渐增的PLX-C。将每个组一式三份接种于96孔板。将细胞培养于含有20％FBS的RPMI1640培养基中。在5-天培养期的最后18个小时使用1μC3H-胸苷对平板进行脉冲。通过纤维玻璃过滤器收获细胞，并使用闪烁计数器定量胸苷摄取量。
对于CFSE染色，在培养前将PB-MNC细胞进行CFSE(MolecularProbes)染色以测定增殖。5天后收集细胞并通过流式细胞术检测CFSE染色的强度。
ELISA
按照之前的描述进行ELISA。简而言之，在存在PLX-C的情况下，在37℃在加湿的5％CO2空气下以5μg/mlConA(Sigma)、0.5μg/mlLPS(SIGMA)或10μg/mlPHA(SIGMA)刺激MNC(分离自外周血)。收集上清液并使用针对IFNγ(DIACLONE)、TNFα(DIACLONE)和IL-10(DIACLONE)的ELISA试剂盒进行细胞因子分析。
实验结果
与使用Plurix相比，使用Celligen制备中的改变产生了数个主要差异(总结于下表1)。
表1：Plurix系统(WO/2007/108003)和Celligen系统(本发明的教导)之间的比较
生产过程中的改变导致所获得的粘附细胞的特性的改变。这些区别总结如下。
通过Plurix制备的PLX与通过Celligen制备的PLX-C的细胞周期分析之对比–将通过Celligen获得的PLX-C细胞与通过Plurix获得的PLX细胞进行比较，以检测在细胞周期的不同阶段的细胞分布。如图3A-B所清楚地显示，通过Celligen扩增的PLX-C细胞显示出典型的增殖模式(细胞周期的不同阶段的细胞分布)。具体而言，28％的细胞处于S和G2/M期(图3A)。这些结果表明细胞是在增殖过程中被收获的，并且Celligen生物反应器条件支持细胞生长。
通过Plurix和Celligen获得的细胞之间的微阵列比较-基因表达阵列能够同时监视通过Plurix(PLX)或通过Celligen(PLX-C)扩增的来自人足月胎盘的粘附细胞的整个基因组范围的表达模式。这些结果能够评估通过这些不同生长方法获得的细胞之间表型差异的分子机理(见下表2)。
表2：Plurix细胞(WO/2007/108003)和Celligen细胞(本发明的教导)的基因表达的比较
细胞标志物在PLX-C细胞上的表达–使用单克隆抗体检测PLX-C表达的表面抗原。结果显示，PLX-C细胞的特征在于以下阳性标志物：CD73、CD29和CD105；和以下阴性标志物：CD34、CD45、CD19、CD14、CD200和HLA-DR。在一些实施方式中，将免疫表型测试标准设定为：对于所有阳性标志物≥90％并且对于所有阴性标志物≤3％。
此外，如图4A-B所示，PLX-C培养物不表达内皮细胞标志物，如对于两种内皮细胞标志物CD31和KDR的阴性染色所示。但是，证明PLX-C表达成纤维细胞典型性标志物(表达D7-fib，图4C)。另外，如图4D所示，PLX-C细胞阴性地表达CD200。
PLX-C细胞的免疫原性和免疫调节特性-由于PLX-C由源自胎盘的粘附细胞组成，所以预期其表达I型HLA，I型HLA在身体的所有细胞中表达并且已知其诱导同种异体反应性免疫应答。II型HLA和其它共刺激分子通常仅在抗原呈递细胞(APC)的表面表达。
为了检测所获得的PLX-C细胞的免疫原性，进行了共刺激分子在这些细胞膜表面上的表达。FACS分析显示在PLX-C细胞膜上不存在CD80、CD86和CD40(图5A-C)。此外，PLX-C表达低水平的I类HLA，如针对HLAA/B/C的染色所检测(图5D)。刺激性和共刺激分子的表达类似于源自骨髓(BM)的MSC(如图5A-D所示)。
为了进一步研究PLX-C细胞的免疫原性以及免疫调节特性，进行了混合淋巴细胞反应(MLR)测试。如图6A-B所示，PLX-C细胞逃脱同种异体识别并减少T细胞应答，如通过胸苷掺入法所测定。此外，淋巴细胞增殖的减少(通过CPM测定来估计)随着PLX-C细胞数目的增加而增大(以剂量依赖性方式)。PLX-C还减少有丝分裂刺激物例如刀豆素A(ConA,图6B)和植物血细胞凝集素(PHA)刺激后的淋巴细胞增殖，以及抗-CD3、抗-CD28的非特异性刺激后的淋巴细胞增殖(数据未显示)。
为了研究PLX-C免疫调节淋巴细胞增殖的作用机理，并且确定该作用是否通过细胞与细胞的相互作用或细胞因子的分泌来介导，通过transwell方法(其阻止细胞与细胞的接触但使细胞因子能够在两个室之间扩散)使用PHA刺激源自PB的单核细胞(MNC)。结果显示即使当细胞与细胞的接触被抑制时，仍然维持了增殖的抑制(数据未显示)。
细胞因子分泌-如上文所显示，PLX-C减少淋巴细胞的增殖率，可能是通过可溶性因子进行。进行了关于淋巴细胞响应于PLX-C而分泌的细胞因子的进一步研究，以阐释PLX-C的作用机理。如图7A-B所示，将单核细胞与PLX-C一起培养稍许减少了促炎性细胞因子IFNγ的分泌并显著降低了TNFα的分泌(即使是在存在少量的PLX-C的情况下)。此外，以脂多糖(LPS)刺激后，在存在PLX-C的情况下，源自PB的MNC分泌的IL-10增加，而TNFα的分泌水平下降，其为剂量依赖性方式(图7C)。
实施例4
本发明的2D粘附细胞和骨髓细胞的骨细胞分化之比较
使本发明的新的粘附细胞(来自胎盘)在其2D粘附细胞阶段生长于骨细胞分化刺激条件下，与源自骨髓的细胞进行比较。
材料和实验方法
骨生成
根据Chemicon骨生成试剂盒(catno.scr028,Millipore,MA,USA)进行骨生成。
骨生成诱导培养基
使用试剂盒的成分(见下表3)，在每次更换培养基之前新鲜制备骨生成诱导培养基。
表3：骨生成培养基成分
为了获得1mM地塞米松溶液，将900μl乙醇加至100μl地塞米松10mM溶液中。将贮液与试剂盒的其余成分储存于-20℃。将50ml血清管热灭活，分成5ml的等份并保存在-20℃直至使用。
包被24孔组织培养板
通过使用1xPBS稀释玻连蛋白和胶原制备包含12μg/ml玻连蛋白和12μg/ml胶原(二者都包括在试剂盒中)的包被混合物。
然后将包被混合物加入到孔中以覆盖孔表面(制备2个平板，每个平板5个孔)。将平板在室温过夜温育。然后除掉包被混合物，并使用PBS将孔润洗1次。在临近使用前将平板中液体吸出。
细胞生长
将源自胎盘的细胞(plc11-3-1)或源自骨髓的细胞(BM108)植于(200,000个细胞/孔)1ml生长培养基中，其包含DMEM(Invitrogen,Gibco),10％FCS(Invitrogen,Gibco),2MmL-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich),45μg/ml庆大霉素-IKA(TevaMedical)和0.25μg/ml两性霉素(Invitrogen,Gibco)。使源自胎盘的细胞(2个平板，每个平板4个孔)或源自骨髓的细胞(2个平板，每个平板1个孔)生长至100％汇合度(通常是过夜)，然后启动骨生成分化。
当细胞达到100％汇合度时，吸出生长培养基并替换为1ml骨生成诱导培养基(分化第1天)。每2-3天将骨生成诱导培养基更换为新鲜培养基，总共持续14-17天。
作为对照，两个平板中的一个(对于每种细胞类型)不以骨生成分化培养基温育，而是以生长培养基(如上文所述)温育。
在第17天，将骨细胞固定并以茜素红(AlizarinRed)溶液染色，如下文详述。
染色步骤
骨细胞的染色这样进行：首先小心地将培养基从每个孔中吸出(要小心，以免吸出细胞)。然后通过将细胞在室温在冰冷的70％乙醇中温育1小时而将细胞固定。然后小心地吸出乙醇，使用水将细胞润洗2次(每次润洗5-10分钟)。然后吸出水，并将茜素红溶液(500-1000μl)加入到细胞中。然后将细胞与茜素红溶液在室温温育30分钟。除掉茜素红，以1ml水清洗细胞4次，每次清洗后吸出液体。最后，向每个孔中加入1-1.5ml水以防止细胞干燥。通过Nikon倒置显微镜镜检平板。
实验结果
源自胎盘的或源自骨髓的粘附细胞在骨生成诱导培养基中的骨细胞分化产生了50％以上的骨髓细胞的分化，如阳性茜素红染色所示(图8B)。相反，本发明的源自胎盘的细胞没有显示任何骨生成分化的迹象(见图8E和下表4)。
表4：分化总结
实施例5
本发明的2D粘附细胞和骨髓细胞在改良的生长培养基中的骨细胞分化之比较
使本发明的粘附细胞(来自胎盘，在其2D粘附细胞阶段)或源自骨髓的细胞在骨细胞分化刺激条件下生长于包含维生素D和较高浓度的地塞米松的改良的骨生成培养基中。
材料和实验方法
骨生成诱导培养基
使用下表5列出的成分以及维生素D，在每次更换培养基之前新鲜制备骨生成诱导培养基。
表5：骨生成培养基成分
将50ml血清管热灭活，分成5ml的等份并保存在-20℃直至使用。
包被48孔组织培养板
通过使用1xPBS稀释玻连蛋白和胶原制备包含12μg/ml玻连蛋白和12μg/ml胶原(二者都来自Chemicon)的包被混合物。
然后将包被混合物加入到孔中以覆盖孔表面(制备2个平板，每个平板5个孔)。将平板在室温过夜温育。然后除掉包被混合物，并使用PBS将孔润洗1次。在临近使用前将平板中液体吸出。
细胞生长
将源自胎盘的细胞(PLC8-2-1,PLC153-4-2或PLC19-4-3-1胎儿细胞)植于(100,000个细胞/孔)0.5ml生长培养基中，其包含DMEM(Invitrogen,Gibco),10％FCS(Invitrogen,Gibco),2MmL-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich),45μg/ml庆大霉素-IKA(TevaMedical)和0.25μg/ml两性霉素(Invitrogen,Gibco)(2个平板，每个平板4个孔)。将源自骨髓的细胞(BM109)植于(150,000个细胞/孔)0.5ml生长培养基(如上所述)中(2个平板，每个平板1个孔)。使细胞生长至100％汇合度(通常是过夜)，然后启动骨生成分化。
当细胞达到100％汇合度时，吸出生长培养基并替换为0.5ml骨生成诱导培养基(分化第1天)。每2-3天将骨生成诱导培养基更换为新鲜培养基，总共持续26天。
作为对照，两个平板中的一个(对于每种细胞类型)不以骨生成分化培养基温育，而是以生长培养基(如上文所述)温育。
在第26天，将骨细胞固定并以茜素红溶液染色，如下文详述。
染色步骤
骨细胞的染色这样进行：首先小心地将培养基从每个孔中吸出(要小心，以免吸出细胞)。然后通过将细胞在室温在冰冷的70％乙醇中温育1小时而将细胞固定。然后小心地吸出乙醇，使用水将细胞润洗2次(每次润洗5-10分钟)。然后吸出水，并将茜素红溶液(500-1000μl)加入到细胞中。然后将细胞与茜素红溶液在室温温育30分钟。除掉茜素红，以1ml水清洗细胞4次，每次清洗后吸出液体。最后，向每个孔中加入1-1.5ml水以防止细胞干燥。通过Nikon倒置显微镜镜检平板。
实验结果
根据以前的教导[Parloni等人(2008)StemCells26(2):300-11]，通过修改以上实施例4中描述的步骤进行源自胎盘的或源自骨髓的粘附细胞的骨生成分化。实施例4中给出的生长条件与此处给出的结果之间的主要差异在于：向分化培养基中加入了维生素D；以及较高浓度的地塞米松。如结果中可以看出，50％以上的骨髓细胞进行了向骨细胞的分化，如阳性茜素红染色所示(见图9B)。但是，本发明的源自胎盘的细胞没有显示任何骨生成分化的迹象(见图9E和上表4)。
实施例6
本发明的2D粘附细胞和骨髓细胞的脂肪细胞分化之比较
使本发明的新的粘附细胞(来自胎盘)在其2D粘附细胞阶段生长于脂肪细胞分化刺激条件下，与源自骨髓的细胞进行比较。
材料和实验方法
脂肪生成
根据Chemicon脂肪生成试剂盒(Chemicon脂肪生成试剂盒，catno.scr020,Millipore,MA,USA)进行脂肪生成。
脂肪生成诱导培养基
使用下表6和7所示的成分，在每次更换培养基之前新鲜制备脂肪生成诱导或维持培养基。
表6：脂肪生成诱导培养基成分
表7：脂肪生成维持培养基成分
成分 贮液浓度 数量 最终浓度
低葡萄糖的DMEM 4.4ml 90％
血清(热灭活的) 0.5ml 10％
胰岛素 10mg/ml 5μL 10μg/ml45 -->
青霉素和链霉素 X100 50μl X1
细胞生长
将源自胎盘的细胞(plc11-3-1)或源自骨髓的细胞(BM108)植于(200,000个细胞/孔)1ml生长培养基中，其包含DMEM(Invitrogen,Gibco),10％FCS(Invitrogen,Gibco),2MmL-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich),45μg/ml庆大霉素-IKA(TevaMedical)和0.25μg/ml两性霉素(Invitrogen,Gibco)。使源自胎盘的细胞(2个平板，每个平板4个孔)或源自骨髓的细胞(2个平板，每个平板1个孔)生长至100％汇合度(通常是过夜)，然后启动脂肪生成分化。
当细胞达到100％汇合度时，吸出生长培养基并替换为1ml脂肪生成诱导培养基(分化第1天)。每2-3天将脂肪生成诱导培养基更换为新鲜培养基，总共持续25天(如下表8所详述)。注意：单层脂肪生成细胞是极度脆弱的，并且易于与平板脱离，因此，更换培养基时要轻轻地进行，以避免破坏脂滴。
作为对照，两个平板中的一个(对于每种细胞类型)不以脂肪生成分化培养基温育，而是以生长培养基(如上文所述)温育。
表8：脂肪生成分化安排
天 培养基
1 脂肪生成诱导培养基
3 脂肪生成诱导培养基
5 脂肪生成诱导培养基
7 脂肪生成维持培养基
9 脂肪生成诱导培养基
11 脂肪生成诱导培养基
13 脂肪生成诱导培养基
15 脂肪生成维持培养基
17 脂肪生成诱导培养基
19 脂肪生成诱导培养基
21 脂肪生成诱导培养基
在第25天，将脂肪细胞固定并以油红溶液染色，如下文详述。
染色步骤
脂肪细胞的染色这样进行：首先小心地将培养基从每个孔中吸出(要小心，以免吸出细胞)。然后通过将细胞在室温在4％多聚甲醛中温育30-40分钟而将细胞固定。然后小心地吸出固定剂，使用PBS将细胞润洗3次(每次润洗5-10分钟)。然后吸出PBS，并使用水将细胞润洗2次。然后吸出水并将油红溶液(500-1000μl)加入到细胞中。将细胞与油红溶液在室温温育50分钟。除掉油红溶液，以1ml水清洗细胞4次，每次清洗后吸出液体。最后，向每个孔中加入1-1.5ml水以防止细胞干燥。通过Nikon倒置显微镜镜检平板。
油红溶液的制备
使用0.25g油红(Sigma)原料，通过在37℃浴中温育10-15分钟将其溶解于50ml异丙醇。
使用时，将30ml贮液染料与20mlDDW混合(静置10分钟，然后以咖啡滤纸过滤)。每次使用都新鲜制备油红溶液。
实验结果
源自胎盘的或源自骨髓的粘附细胞在脂肪细胞诱导培养基中的脂肪细胞分化产生了50％以上的源自骨髓的细胞的分化(见图8C)，如阳性油红染色和通过典型的形态学变化(例如，油滴在细胞质中的累积)所示。相反，本发明的源自胎盘的细胞没有分化为脂肪细胞(见图8F和上表4)。
实施例7
本发明的2D粘附细胞和骨髓细胞在改良的生长培养基中的脂肪细胞分化之比较
刺激本发明的粘附细胞(来自胎盘，在其2D粘附细胞阶段)或骨髓细胞以在包含高水平的茚甲新的改良的脂肪细胞培养基中分化为脂肪细胞。
材料和实验方法
脂肪生成诱导培养基
使用下表9所示的成分，在每次更换培养基之前新鲜制备脂肪生成诱导培养基。
表9：脂肪生成诱导培养基成分
细胞生长
将源自胎盘的细胞(PLC8-2-1、PLC153-4-2或PLC19-4-3-1胎儿细胞)植于(100,000个细胞/孔)0.5ml生长培养基中，其包含DMEM(Invitrogen,Gibco),10％FCS(Invitrogen,Gibco),2MmL-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich),45μg/ml庆大霉素-IKA(TevaMedical)和0.25μg/ml两性霉素(Invitrogen,Gibco)(2个平板，每个平板5个孔)。
将源自骨髓的细胞(BM109)植于(100,000个细胞/孔)0.5ml生长培养基，其包含DMEM(Invitrogen,Gibco),10％FCS(Invitrogen,Gibco),2MmL-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich),45μg/ml庆大霉素-IKA(TevaMedical)和0.25μg/ml两性霉素(Invitrogen,Gibco)(2个平板，每个平板4个孔)。使细胞生长至100％汇合度(通常是过夜)，然后启动脂肪生成分化。
当细胞达到100％汇合度时，吸出生长培养基并替换为0.5ml脂肪生成诱导培养基(分化第1天)。每2-3天将脂肪生成诱导培养基更换为新鲜培养基，总共持续3-4周。
作为对照，两个平板中的一个(对于每种细胞类型)不以脂肪生成分化培养基温育，而是以生长培养基(如上文所述)温育。
在第26天，将脂肪细胞固定并以油红溶液染色，如下文详述。
染色步骤
脂肪细胞的染色这样进行：首先小心地将培养基从每个孔中吸出(要小心，以免吸出细胞)。然后通过将细胞在室温在4％多聚甲醛中温育30-40分钟而将细胞固定。然后小心地吸出固定剂，使用PBS将细胞润洗3次(每次润洗5-10分钟)。然后吸出PBS，并使用水将细胞润洗2次。然后吸出水并将油红溶液(500-1000μl)加入到细胞中。将细胞与油红溶液在室温温育50分钟。除掉油红溶液，以1ml双蒸水清洗细胞4次，每次清洗后吸出液体。最后，向每个孔中加入1-1.5ml水以防止细胞干燥。通过Nikon倒置显微镜镜检平板。
油红溶液的制备
使用0.25g油红(Sigma)原料，通过在37℃浴中温育10-15分钟将其溶解于50ml异丙醇。
使用时，将30ml贮液染料与20mlDDW混合(静置10分钟，然后以咖啡滤纸过滤)。每次使用都新鲜制备油红溶液。
实验结果
根据以前的教导[Parloni等人(2007)，见上文]，通过修改以上实施例6中的步骤进行源自胎盘的或源自骨髓的粘附细胞的脂肪细胞分化。实施例6中给出的生长条件与此处给出的结果之间的主要差异在于较高浓度的茚甲新。从结果中可以看出，50％以上的源自骨髓的细胞进行了向脂肪细胞的分化(见图9C)，如阳性油红染色和通过典型的形态学变化(例如油滴在细胞质中的累积)所示。相反，本发明的源自胎盘的细胞没有显示脂肪细胞的典型的形态学变化(见图9F和上表4)。
实施例8
PLX-C的生物分布
材料和实验方法
以萤光素酶表达载体转染PLX-C细胞
使用在CMV启动子下表达萤光素酶基因的慢病毒构建体(图10)稳定感染PLX-C细胞。
感染病毒的产生
在转染之前，使293TN生产细胞在补充了血清和抗生素的DMEM培养基(Gibco)中生长2-3天(50％-70％汇合度)。将10μg包装质粒和2μg表达构建体和20μlPlusTM试剂(Invitrogen)的混合物加入至400μl不含补充物的DMEM中。将混合物在室温(RT)温育15分钟，加入LipofectamineTM(30μl稀释于400μlDMEM中)。将混合物在RT温育15分钟。清洗293TN细胞，并转移至2％血清培养基，加入转染混合物。将细胞在CO2孵育箱中在37℃温育过夜，感染后24-60小时收集培养基。在48小时后达到了病毒产量的峰值。收集培养基，在室温以3000rpm离心5分钟以使细胞碎片沉淀。离心之后，通过Millex-HV0.45μmPVDF滤器(Millipore,Cat.#SLHVR25LS)过滤上清液。
PLX-C的感染
在病毒感染前24小时，将PLX-C细胞以0.6-1x105个细胞/孔的密度接种于24孔平板中的完全培养基中。24小时后，加入0.5ml病毒悬浮液(稀释于含有终浓度为5-8μg/ml的Polybrene的完全培养基中)。将细胞温育24小时，然后将培养基替换为完全DMEM培养基，将细胞在37℃在5％CO2中温育过夜。在第4天，培养物达到汇合，按照1:3至1:5分细胞，使细胞在完全DMEM中生长48小时，然后分析细胞的萤光素酶表达。
感染有效率接近100％。使用IVISLuminaImaging系统进行活细胞和活小鼠中的荧光测评，该系统包括高度灵敏的CCD相机，其捕获萤光素酶的荧光信号。
感染后2周，将2x106个细胞以IM或IV方式注射进入SCID/Beige、NOD/SCID、SCID和Balb/C小鼠。根据所描述的IVIS系统监视经注射的细胞。
实验结果
从结果可以看出，在感染后PLX-C细胞持续分裂，生长中的细胞中的萤光素酶的表达水平保持强劲和稳定(图11)。
将PLX-C细胞注射进入Balb/C小鼠之后，检测生物分布式样。从结果可以看出，在IM注射后72小时，细胞消失(数据未显示)。然而，在体外PLX-C细胞保持恒定高水平的萤光素酶表达，持续3周以上(数据未显示)。
如图12A-D所示，经IM注射进入SCID/Beige小鼠(免疫缺陷小鼠)的细胞在注射位点处保持达5天，其后则观察不到了。经IV注射进入SCID/Beige小鼠的PLX-C细胞在24小时后迁移至肺，然后迁移至注射位点(推测是归巢至损伤位点)。其后，细胞逐渐消失，在3-4周后观测不到了。
虽然已经通过其具体实施方式描述了本发明，但是显然很多替代形式、修饰和变体对本领域技术人员是明显的。因此，意在包括落在随附的权利要求的精神和宽广范围内的所有此等替代形式、修饰和变体。
本说明书中提及的所有公开物、专利和专利申请的全部内容在此通过引用方式并入本说明书，达到如同每篇公开物、专利或专利申请都具体且单独被指明通过引用并入本文一样的程度。此外，本申请中任何参考文献的引用或提及都不应被解释为承认该文献是本发明的现有技术。虽然使用了小标题，但它们不应被解释为必要性的限制。

Claims (9)

1.来自胎盘或脂肪组织的在允许细胞扩增的三维(3D)培养条件下培养的粘附细胞在制备用于治疗外周动脉疾病(PAD)或临界性肢体缺血(CLI)的药物中的用途，所述条件包括灌注，其中根据培养基的葡萄糖浓度调整所述灌注的速率。
2.权利要求1的用途，其中所述3D培养条件包括下列之一：
(i)在生物反应器中培养所述粘附细胞的群体，所述生物反应器具有圆柱形填充床并且所述培养基流经所述填充床；
(ii)在生长期培养所述粘附细胞的群体，维持1400-1600ml的工作体积；
(iii)以0.06x106-0.13x106个细胞/ml的接种浓度接种所述细胞；或
(iv)在具有重量为30-50克的载体的生物反应器中培养所述粘附细胞的群体。
3.权利要求1的用途，其中所述3D培养条件：
(a)包含3D生物反应器；和/或
(b)包含选自玻璃、塑料、聚酯、聚丙烯、聚苯乙烯、葡聚糖和胶原的粘附材料；和/或
(c)进行至少3天。
4.权利要求1的用途，其中进行所述细胞的所述培养直至至少10％的所述细胞处于增殖中。
5.权利要求1的用途，其中所述细胞在导致骨髓细胞分化为骨细胞的条件下不分化为骨细胞。
6.根据权利要求1-5任一项中所述的3D培养条件产生的细胞群体。
7.权利要求6的细胞群体，其中通过FACS监视S和G2/M期而测定，至少10％的所述粘附细胞是增殖细胞。
8.权利要求6的细胞群体，其中所述粘附细胞能够抑制免疫反应。
9.权利要求6的细胞群体，其中所述粘附细胞包含：
(a)选自CD73、CD90、CD29、CD105和D7-fib的阳性标志物表达；和/或
(b)选自CD11b、CD34、HLA-DR、CD14、CD19、CD45、CD31、CD200和KDR的阴性标志物表达。
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