ES2553712T3 - Células adherentes de la placenta y uso de las mismas en el tratamiento de enfermedad - Google Patents

Células adherentes de la placenta y uso de las mismas en el tratamiento de enfermedad Download PDF

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    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/02—Coculture with; Conditioned medium produced by embryonic cells

Abstract

Una población de células adherentes derivadas de la placenta para el uso en el tratamiento de un defecto del músculo esquelético.

Description

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DESCRIPCION
Celulas adherentes de la placenta y uso de las mismas en el tratamiento de enfermedad Campo y fundamentos de la invencion
La presente invencion, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a celulas adherentes de la placenta para usar en el tratamiento de defectos del musculo esqueletico.
En anos recientes, una considerable actividad se ha enfocado en el potencial terapeutico de las celulas estromales mesenquimales (MSC) para diversas aplicaciones medicas que incluyen reparacion tisular de organos danados tales como el cerebro, corazon, hueso e tugado y en el apoyo de trasplantes de medula osea (BMT). MSC, una poblacion heterogenea de celulas obtenidas de por ejemplo, medula osea, tejido adiposo, placenta y sangre, son capaces de diferenciarse en diferentes tipos de celulas (por ejemplo, celulas de endotelio reticular, fibroblastos, adipocitos, celulas precursoras de osteogenesis) dependiendo de las influencias de diversos factores bioactivos. Por consiguiente, las MSC se han estudiado ampliamente en medicina regenerativa como la base para construir nuevos tejidos tales como hueso, cartflago y grasa para la reparacion de lesion o sustitucion de tejidos patologicos y como tratamiento para enfermedades geneticas y adquiridas [Fibbe y Noort, Ann N Y Acad Sci (2003) 996: 235-44; Horwitz et al., Cytotherapy (2005) 7(5): 393-5; Zimmet y Hare, Basic Res Cardiol (2005) l0o(6): 471-81]. Ademas, la capacidad multipotente de las MSC, su facil aislamiento y cultivo, ademas de su alto potencial de expansion ex vivo las hacen una herramienta terapeutica atractiva [Fibbe y Noort, supra; Minguell et al. Exp Biol Med (Maywood) (2001) 226(6): 507-20].
Un cuerpo emergente de datos indica que las MSC escapan al reconocimiento de celulas alorreactivas y se considera que estan inmunoprivilegiadas [Le Blanc et al., Exp Hematol (2003) 31(10): 890-6]. Teniendo baja inmunogenicidad, las MSC no se rechazan por el sistema inmune del paciente y por lo tanto se considera que no necesitan apareamiento con HLA.
Las MSC derivadas de placenta muestran muchos marcadores comunes a las MSC aisladas de otros tejidos, por ejemplo CD105, CD73, CD90 y CD29, y la falta de expresion de marcadores celulares espedficos hematopoyeticos, endoteliales y trofoblasticos. La diferenciacion adipogenica, osteogenica y neurogenica se han alcanzado despues de cultivar MSC derivadas de placenta bajo condiciones apropiadas [Yen et al., Stem Cells (2005) 23(1): 3-9]. Ademas, las MSC aisladas de placenta y cultivadas in vitro se ha demostrado que estan inmunoprivilegiadas de un modo similar que las MSC [Li et al., Cell Res (2005) 15(7): 539-47]. Asf, la placenta proporciona una fuente eticamente no controvertida y facilmente accesible de MSC para las aplicaciones experimentales y clmicas [Zhang et al., Exp Hematol (2004) 32(7): 657-64]. Matziolis et al. (Tissue Engineering (2006) 12(2): 361-367) presentan que las celulas derivadas de medula osea autologa pueden mejorar la resistencia muscular despues de lesion por rotura en ratas.
Compendio de la invencion
Segun un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion se proporciona poblaciones purificadas de celulas adherentes de la placenta que pueden usarse para tratar un defecto del musculo esqueletico.
Segun algunas realizaciones de la invencion, las celulas adherentes comprenden una expresion de marcador positivo seleccionada del grupo que consiste en CD73, CD90, CD29, CD105 y D7-fib; esto es, en algunas realizaciones las celulas adherentes expresan uno o mas de CD73, CD90, CD29, CD105 o D7-fib.
Segun algunas realizaciones de la invencion, las celulas adherentes comprenden una expresion de marcador negativo seleccionada del grupo que consiste en CD3, CD4, CD45, CD80, HlA-DR, CD11b, CD14, CD19, CD34, CD31, CD200, KDR y CD79; esto es, en algunas realizaciones las celulas adherentes no expresan CD3, CD4, CD45, CD80, HLA-DR, CD11b, CD14, CD19, CD34, CD31, CD200, KDR o CD79.
Segun algunas realizaciones de la invencion, las celulas adherentes se cultivan en un cultivo tridimensional (3D).
Segun algunas realizaciones de la invencion, el cultivo tridimensional (3D) comprende un biorreactor 3D.
Segun algunas realizaciones de la invencion, el cultivo de las celulas adherentes en el cultivo 3D se efectua bajo perfusion.
Segun algunas realizaciones de la invencion, el cultivo de las celulas adherentes se efectua durante al menos 3 dfas.
Segun algunas realizaciones de la invencion, el cultivo de las celulas adherentes se efectua hasta que al menos el 10% de las celulas adherentes estan proliferando.
Segun algunas realizaciones de la invencion, las celulas adherentes se cultivan en un cultivo bidimensional (2D).
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Segun algunas realizaciones de la invencion, al menos el 10% de las celulas adherentes estan en un estado proliferativo; esto es, al menos el 10% de las celulas adherentes estan proliferando.
Segun algunas realizaciones de la invencion, las celulas adherentes se destinan menos a una lmea osteogenica en comparacion con celulas adherentes de medula osea que crecen y se dejan diferenciar en las mismas condiciones.
Segun algunas realizaciones de la invencion, las celulas adherentes se destinan menos a una lmea adipogenica en comparacion con celulas adherentes de medula osea que crecen y se dejan diferenciar en las mismas condiciones.
Segun un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion se proporciona una poblacion de celulas adherentes derivadas de la placenta, en donde la poblacion comprende al menos 70% de celulas adherentes de una parte materna de la placenta.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la parte materna de la placenta comprende decidua basal, decidua parietal, o tanto decidua basal como decidua parietal.
Segun un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion se proporciona una poblacion de celulas adherentes derivadas de la placenta, en donde la poblacion comprende al menos 70% de celulas adherentes de una parte fetal de la placenta.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la parte fetal de la placenta comprende amnios.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la parte fetal de la placenta consiste en amnios.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la parte fetal de la placenta comprende vellosidad corionica.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la parte fetal de la placenta consiste en vellosidad corionica.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la poblacion de celulas es una poblacion en donde no mas del 3,5%, no mas del 3%, no mas del 2%, o no mas del 1% de la poblacion de celulas adherentes de una parte materna expresan CD200 como se mide por citometna de flujo usando un control de isotipo para definir la expresion negativa.
Segun algunas realizaciones de la invencion, las celulas adherentes comprenden un diametro celular que es menor que el de las celulas adherentes derivadas de una parte fetal de la placenta.
Segun algunas realizaciones de la invencion, las celulas adherentes comprenden una capacidad de proliferacion celular que es mayor que el de las celulas adherentes derivadas de una parte fetal de la placenta.
Segun algunas realizaciones de la invencion, las celulas adherentes son capaces de suprimir una reaccion inmune a una menor extension que las celulas adherentes de una parte fetal de la placenta cuando se ensayan en un cultivo de linfocitos mixto.
Tambien se describe un medio acondicionado aislado de un cultivo que comprende cualquiera de las poblaciones de celulas anteriores.
Tambien se describe una composicion farmaceutica que comprende como un ingrediente activo cualquiera de la poblacion de celulas descritas en esta memoria o cualquiera de los medios acondicionados descritos en esta memoria y un vehmulo farmaceuticamente aceptable.
Tambien se describe un metodo para tratar un proceso medico que puede aprovechar el trasplante de celula u organo que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapeuticamente efectiva de cualquiera de las composiciones farmaceuticas descritas en esta memoria, tratando asf al sujeto.
Segun un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion se proporciona el uso de cualquiera de la poblacion de celulas descritas en esta memoria, para la fabricacion de un medicamento para tratar un defecto de musculo esqueletico.
Se describen ademas usos para tratar un proceso seleccionado del grupo que consiste en isquemia, enfermedad arterial periferica (PAD), isquemia cntica de la pata (CLI), isquemia de la extremidad inferior, ictus, enfermedad vascular isquemica, enfermedad vascular del rinon, enfermedad coronaria isquemica, isquemia de miocardio, enfermedad arterial coronaria (CAD), enfermedad cardiovascular aterosclerotica, enfermedad de arteria coronaria principal izquierda, enfermedad oclusiva arterial, isquemia periferica, enfermedad vascular periferica, arteriosclerosis, retinopatfa, reparacion de retina, trastorno de remodelacion, smdrome de von Hippel-Lindau, enfermedad vascular telengiectasiaisquemica hemorragica hereditaria, enfermedad de Buerger, enfermedad renal isquemica, placenta isquemica, trastornos asociados con la reproduccion, enfermedad de huesped frente a injerto, trasplante de organo solido, trasplante de celulas madre hematopoyeticas, diabetes, dano en tejido conectivo, cancer, pre-cancer, cancer de hueso, osteosarcoma, metastasis osea, fractura osea, herida por quemado, defecto de cartfiago articular, herida profunda, curado de herida retrasado, curado de ulcera retrasado, quiste oseo
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subcondral, osteoporosis, osteoartritis, hueso degenerado, dano en cartflago, defecto de cartflago articular, tendones lesionados, enfermedades autoinmunes, trastornos metabolicos, psoriasis, dolor neuropatico, lesion del nervio periferico, enfermedad neurodegenerativa, soporte de trasplante de rinon y enfermedades inflamatorias.
Tambien se describen usos para tratar un proceso seleccionado del grupo que consiste en fallo cardiaco, infarto de miocardio, dolor neuropatico, ictus y enfermedad cardiaca isquemica.
Segun un aspecto de algunas realizaciones de la invencion, el uso es para el tratamiento de un defecto de musculo esqueletico que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapeuticamente efectiva de la composicion que comprende celulas estromales adherentes derivadas de la placenta, tratando asf el defecto del musculo esqueletico.
Ademas se describe un metodo para tratar el dolor neuropatico que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapeuticamente efectiva de la composicion que comprende celulas estromales adherentes derivadas de placenta, tratando asf el dolor neuropatico.
Algunas veces, el dolor neuropatico se asocia con dolor inflamatorio, polineuropatfa diabetica, neuropatfa sensorial por virus de inmunodeficiencia humano (VIH), smdromes post-ictus, isquemia o esclerosis multiple.
Ademas se describe un metodo para tratar infarto de miocardio que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapeuticamente efectiva de la composicion que comprende celulas estromales adherentes derivadas de placenta, tratando asf el infarto de miocardio.
Segun un aspecto de algunas realizaciones de la invencion se proporciona un uso de una composicion que comprende celulas estromales adherentes derivadas de placenta para la fabricacion de un medicamento para tratar un defecto del musculo esqueletico, dolor neuropatico, infarto de miocardio.
Segun un aspecto de algunas realizaciones de la invencion se proporciona una composicion farmaceutica que comprende como un ingrediente activo celulas estromales adherentes derivadas de placenta para usar en el tratamiento de defecto del musculo esqueletico.
Tambien se describe una composicion farmaceutica para tratar el dolor neuropatico que se asocia con dolor inflamatorio, polineuropatfa diabetica, neuropatfa sensorial por virus de inmunodeficiencia adquirida (VIH), smdromes post-ictus, isquemia o esclerosis multiple.
Segun algunas realizaciones de la invencion, las celulas adherentes expresan uno o mas de CD73, CD90, CD29, CD 105 o D7-fib.
Segun algunas realizaciones de la invencion, las celulas adherentes no expresan CD3, CD4, CD45, CD80, HLA-DR, CD11b, CD14, CD19, CD34, CD31, CD200, CD271, KDR o CD79.
Segun algunas realizaciones de la invencion, las celulas adherentes expresan uno o mas de beta-endorfina, dinorfina A, leu-encefalina o met-encefalina.
Segun algunas realizaciones de la invencion, las celulas adherentes suprimen la actividad de las celulas T.
Segun algunas realizaciones de la invencion, las celulas adherentes comprenden al menos 70% de celulas adherentes procedentes de una parte materna de la placenta.
Segun algunas realizaciones de la invencion, no mas del 3,5%, no mas del 3%, no mas del 2% o no mas del 1% de las celulas adherentes de una parte materna expresan CD200 como se mide por citometna de flujo usando un control de isotipo para definir la expresion negativa.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la parte materna de la placenta comprende decidua basal, decidua parietal, o tanto decidua basal como decidua parietal.
Segun algunas realizaciones de la invencion, las celulas adherentes se producen mediante cultivo usando condiciones de cultivo 3D.
Segun algunas realizaciones de la invencion, el cultivo tridimensional (3D) comprende un biorreactor 3D.
Segun un aspecto de algunas realizaciones de la invencion, el cultivo 3D se efectua bajo perfusion.
Segun un aspecto de algunas realizaciones de la invencion, el cultivo de las celulas adherentes se efectua durante al menos 3 dfas.
Segun un aspecto de algunas realizaciones de la invencion, el cultivo de las celulas adherente se efectua hasta que al menos el 10% de dichas celulas adherentes estan proliferando.
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A menos que se defina otra cosa, todos los terminos tecnicos y/o cientificos usados en esta memoria tienen el mismo significado que se entiende normalmente por un experto en la tecnica a la que pertenece la invencion. Aunque pueden usarse metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta memoria, en la practica o ensayo de realizaciones de la invencion, se describen a continuacion metodos y/o materiales ejemplares. En caso de conflicto, la memoria de patente, incluyendo definiciones, controlara. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos son solo ilustrativos y no se pretende que sean necesariamente limitantes.
Breve descripcion de los dibujos
Algunas realizaciones de la invencion se describen en esta memoria, por medio solo de ejemplo, con referencia a los dibujos de acompanamiento. Con referencia espedfica ahora a los dibujos en detalle, se subraya que los particulares se muestran en forma de ejemplo y con propositos de exposicion ilustrativa de las realizaciones de la invencion. A este respecto, la descripcion tomada con los dibujos hace evidente a los expertos en la tecnica como pueden ponerse en practica las realizaciones de la invencion.
En los dibujos:
La Figura 1 es una ilustracion esquematica de la estructura y partes de la placenta.
La Figura 2A-C son fotomicrografos que muestran la morfologfa de celulas adherentes derivadas de placenta decidua basal (A), estroma velloso (B) y membrana amniotica (C).
La Figura 3 es un grafico que muestra el diametro de la celula frente al numero de pasos de celulas de diferentes partes de placenta.
La Figura 4 es un grafico que muestra el doblaje de poblacion frente al numero de pasos de celulas de diferentes partes de placenta.
Las Figuras 5A-B son histogramas que muestran las propiedades de inmunomodulacion in vitro de las diversas partes de placenta. La Figura 5A muestra los resultados de cuatro experimentos diferentes mientras las Figura 5B muestra el promedio de resultados obtenidos en la Figura 5A que incluye desviacion estandar.
Las Figuras 6A-C son graficos de barras que muestran el efecto de medio acondicionado de celulas adherentes de varias partes de placenta en proliferacion celular endotelial.
La Figura 7 muestra los valores de fuerza de contraccion en ratas tratadas PLX ("PLX") y de control ("Sham"). "I" - trasplante inmediato despues del trauma; "DEL" - trasplante 7 dfas despues de trauma; "Ft" - fuerza de contraccion de sacudida rapida; "TET" - fuerza de contraccion titanica.
Las Figuras 8A y 8B muestran los efectos de celulas PLX en dolor inflamatorio en el ensayo de presion de pata. La Figura 8A representa el umbral de presion de pata como una funcion de tiempo en la pata inflamada. La Figura 8B muestra la misma informacion para la pata contralateral.
Las Figuras 9A y 9B muestran el volumen de pata representado como una funcion de tiempo despues de la administracion de celulas PLX en la pata inflamada (Fig. 9A) y la pata contralateral (Fig. 9B).
Las Figuras 10A y 4B ilustran los efectos de celulas PLX en sensibilidad mecanica (ensayo de von Frey) en dolor neuropatico en la pata ipsilateral (Fig. 10A) y la pata contralateral (Fig. 10B).
Las Figuras 11A y 5B representan los efectos de celulas PLX en sensibilidad termica (ensayo de Hargreaves) en dolor neuropatico en la pata ipsilateral (Fig. 11A) y la pata contralateral (Fig. 11B).
Las Figuras 12A-E representan niveles de beta-endorfina (Fig. 12A), dinorfina A (Fig. 12B), leu-encefalina (Fig. 12C), met-encefalina (Fig. 12D), y total (Fig. 12E) en 9 cargas de PLX diferentes.
Descripcion de realizaciones de la invencion
La presente invencion, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a celulas adherentes de la placenta para usar en el tratamiento de defectos del musculo esqueletico.
Antes de explicar al menos una realizacion de la invencion en detalle, se va a entender que la invencion no esta necesariamente limitada en su aplicacion a los detalles presentados en la siguiente descripcion o ejemplificada por los Ejemplos. La invencion es capaz de otras realizaciones o de ponerse en practica o llevarse a cabo de varias formas.
La placenta representa una fuente facilmente disponible de celulas dotadas con propiedades unicas inmunosupresoras o de regeneracion tisular. Las poblaciones purificadas de celulas adherentes de la placenta o acondicionadas a partir de esas celulas son valiosas en el tratamiento de procesos que pueden beneficiarse del trasplante de celula u organo.
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Ademas, el actual inventor ha ideado un metodo para aislar poblaciones celulares altamente purificadas desde diferentes partes de placenta (vease la seccion Ejemplos posterior). Sorprendentemente se descubrio que las poblaciones celulares aisladas de partes maternas de la placenta se caracterizan por propiedades morfologicas y funcionales unicas que son distintos de otras poblaciones celulares aisladas de fracciones de placenta fetal (vease seccion de Ejemplos que sigue). Estas celulas son valiosas para el tratamiento de una minada de procesos medicos.
Asf, segun un aspecto de la presente invencion se proporciona una poblacion de celulas adherentes que comprenden al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 98%, 99% o incluso 100% de celulas de una parte materna de placenta.
Segun otro aspecto de la presente invencion se proporciona una poblacion de celulas que comprenden al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 98%, 99% o incluso 100% de celulas adherentes de una parte fetal de placenta.
Segun realizaciones espedficas, la parte fetal de la placenta comprende amnios.
Segun realizaciones espedficas, la parte fetal de la placenta consiste en amnios.
Segun realizaciones espedficas, la parte fetal de la placenta comprende vellosidades corionicas.
Segun realizaciones espedficas, la parte fetal de la placenta consiste en vellosidades corionicas.
Como se usa en esta memoria el termino "placenta" se refiere al organo mairnfero que conecta el feto en desarrollo a la pared uterina. Despues del nacimiento, la placenta se expulsa (y se denomina como una placenta post-parto).
La placenta se perfunde preferiblemente durante un periodo de tiempo suficiente para eliminar celulas residuales (por ejemplo, sangre).
Como se usa en esta memoria "parte fetal de la placenta" se refiere a cualquier parte de la placenta que no es materna (vease la Figura 1 para ilustracion estructural).
Como se usa en esta memoria "parte materna de la placenta" se refiere a cualquier parte de la placenta que no es fetal (vease la Figura 1 para ilustracion estructural), por ejemplo, esas partes de la placenta que se derivan de la decidua basal o decidua parietal.
Las partes fetales de placenta incluyen el amnios, corion o vellosidades corionicas, vease la Figura 1.
Los metodos de diseccion de la placenta para obtener celulas se conocen bien en la tecnica. Algunos se describen en detalle en la seccion de Ejemplos que sigue.
Las muestras de tejido se lavan en un tampon fisiologico [por ejemplo, solucion salina tamponada con fosfato (PBS) o tampon de Hank]. Las suspensiones de celula sencilla se hacen tratando el tejido con una enzima digestiva (vease a continuacion) y/o picando y enjuagando las partes de tejido a traves de un filtro de nailon o por pipeteado suave (Falcon, Becton, Dickinson, San Jose, CA) con medio de lavado.
Las celulas adherentes aisladas de las diversas partes de placenta pueden derivarse tratando el tejido con una enzima digestiva tal como colagenasa, tripsina y/o dispasa; y/o concentraciones efectivas de hialuronidasa o ADNasa; y acido etilendiaminotetra-acetico (EDTA); a temperatura entre 25 - 50°C, durante periodos de entre 10 minutos a 3 horas. Las celulas pueden pasarse entonces a traves de un filtro de malla de nailon o estopilla de entre 20 micras a 1 mm. Las celulas se centrifugan a velocidades de entre 100 a 3000 x g durante periodos de entre 1 minuto a 1 hora a temperaturas de entre 4- 50°C (vease la Pat. de EE.UU. num. 7.078.230).
La recuperacion celular se efectua preferiblemente bajo condiciones asepticas. Una vez que se obtienen celulas aisladas, se dejan adherir a un material adherente (por ejemplo, configurado como una superficie) y asf aislar celulas adherentes.
Como se usa en esta memoria la frase "celulas adherentes" se refieren a celulas que son dependientes del anclaje, es decir, necesitan union a una superficie para crecer in vitro.
Como se usa en esta memoria "un material adherente" se refiere a un material no citotoxico (es decir, biologicamente compatible) sintetico, que se da de forma natural o una combinacion de los mismos, que tiene una estructura qmmica (por ejemplo, grupos expuestos de superficie cargada) que puede retener las celulas en una superficie.
Ejemplos de materiales adherentes que pueden usarse de acuerdo con este aspecto de la invencion incluyen, aunque no estan limitados a, un poliester, un polipropileno, un polialquileno, un polifluorocloroetileno, un poli(cloruro de vinilo), un poliestireno, una polisulfona, un acetato de celulosa, una fibra de vidrio, una partfcula ceramica, un matrigel, un componente de matriz extracelular (por ejemplo, fibronectina, vitronectina, condronectina, laminina), un colageno, un poli(acido L lactico), un dextrano y una fibra metalica inerte.
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Etapas adicionales de purificacion o enriquecimiento para celulas adherentes pueden efectuarse usando metodos que se conocen bien en la tecnica (tal como mediante FACS usando expresion de marcador, como se describe adicionalmente en esta memoria a continuacion).
Ejemplos no limitantes de medio basico util en el cultivo segun la invencion incluyen Medio de Eagle Esencial Mmimo, ADC-1, LPM (Suero Bovino libre de Albumina), F10(HAM), F12 (HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, Medio BGJ (con y sin Modificacion de Fitton-Jackson), Medio Basal de Eagle (BME-con la adicion de base salina de Earle), Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM-sin suero), Yamane, IMEM-20, Medio de Eagle con Modificacion de Glasgow (GMEM), Medio L-15 de Leibovitz, Medio 5A de McCoy, Medio M199 (M199E-con base salina de Earle), Medio M199 (M199H-con base salina de Hank), Medio Esencial Mmimo de Eagle (MEM-E-con base salina de Earle), Medio Esencial Mmimo de Eagle (MEM-H-con base salina de Hank) y Medio Esencial Mmimo de Eagle (MEM-NAA con aminoacidos no esenciales), entre muchos otros, que incluyen el medio 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, G de Williams, Neuman y Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153. Un medio preferido para el uso en la invencion es DMEM. Estos y otros medios utiles estan disponibles de GIBCO, Grand Island, N.Y., USA y Biological Industries, Bet HaEmek, Israel, entre otros. Un numero de estos medios se resumen en Methods in Enzymology, Volumen LVIII, "Cell Culture", pags. 62 72, editado por William B. Jakoby e Ira H. Pastan, publicado por Academic Press, Inc.
El medio puede suplementarse tal como con suero tal como suero fetal bovino o humano u otras especies, y opcionalmente o alternativamente, factores de crecimiento, vitaminas (por ejemplo, acido ascorbico), citoquinas, sales (por ejemplo, B-glicerofosfato), esteroides (por ejemplo, dexametasona) y hormonas, por ejemplo, hormona de crecimiento, eritropoyetina, trombopoyetina, interleuquina 3, interleuquina 6, interleuquina 7, factor estimulante de la colonia de macrofagos, factor de ligando c-kit/celula madre, ligando de osteoprotegerina, insulina, factores de crecimiento tipo insulina, factor de crecimiento epidermico, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento de nervio, factor neurotrofico ciliar, factor de crecimiento derivado de plaquetas y protema morfogenetica osea a concentraciones de entre niveles de picogramo/ml a miligramo/ml.
Se reconoce adicionalmente que pueden anadirse componentes adicionales al medio de cultivo. Dichos componentes pueden ser antibioticos, antimicoticos, albumina, aminoacidos y otros componentes conocidos en la tecnica del cultivo de celulas.
La calificacion adicional de las poblaciones celulares, es decir, celulas de placenta materna o fetal, puede efectuarse en cada etapa del proceso de purificacion. Por ejemplo, la placenta de embrion macho puede calificarse para celulas fetales o maternas basadas en analisis de cariotipo (es decir, las celulas XX son maternas mientras las celulas XY son fetales, vease la seccion de Ejemplos que sigue).
Una vez obtenidas, las celulas adherentes de la placenta pueden usarse como estan o propagarse en el cultivo. Las celulas pueden pasarse a condiciones 2D o 3D. Se apreciara sin embargo, que las celulas pueden transferirse a una matriz configurada en 3D inmediatamente despues del aislamiento o de forma alternativa, pueden pasarse a disposiciones 3D despues de condiciones 2D.
Como se usa en esta memoria la frase "cultivo bidimensional" se refiere a un cultivo en que las celulas estan predispuestas a condiciones que son compatibles con el crecimiento celular mientras se permite que las celulas crezcan en un plano. Las condiciones en el cultivo bidimensional de la invencion se disenan para permitir la expansion de las celulas adherentes.
Como se usa en esta memoria la frase "cultivo tridimensional" se refiere a un cultivo en que las celulas estan predispuestas a condiciones que son compatibles con el crecimiento celular que incluye un armazon que permite los contactos celula a celula en tres dimensiones. Se apreciara bien que el medio in situ de una celula en un organismo vivo (o un tejido) esta en una arquitectura tridimensional. Las celulas estan rodeadas por otras celulas. Estan contenidas en una red compleja de fibras en nanoescala de matriz extracelular que permite el establecimiento de diversos microambientes locales. Sus ligandos extracelulares median no solo la union a la membrana basal sino tambien el acceso a una variedad de vasos vasculares y linfaticos. Oxfgeno, hormonas y nutrientes se transportan a las celulas y los productos de desecho se eliminan. Las condiciones en el cultivo tridimensional de la invencion se disenan para emular dicho medio como se ejemplifica adicionalmente a continuacion.
Se apreciara que las condiciones del cultivo bi o tridimensional son tales que permiten la expansion de las celulas adherentes.
Como se usa en esta memoria los terminos "que expande" y "expansion" se refieren al mantenimiento de esencialmente menos diferenciacion de las celulas y finalmente al crecimiento celular, es decir, aumento de una poblacion celular (por ejemplo, al menos 2 veces) sin diferenciacion que acompane a dicho aumento.
Como se usa en esta memoria los terminos "que mantiene" y "mantenimiento" se refieren a renovacion celular esencialmente de menos diferenciacion, es decir, poblacion celular esencialmente estacionaria sin diferenciacion que acompane dicha estacionalidad.
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Para el cultivo 2D, el sembrado de celulas de placenta se efectua tipicamente a una densidad de cultivo de 3 ± 0,2 x 103 celulas/cm2. Despues del sembrado, los cultivos celulares se cultivan normalmente en una incubadora de cultivo tisular bajo condiciones humidificadas con CO2 al 5% a 37°C.
Segun una realizacion de la presente invencion, las celulas se hacen crecer en un medio de cultivo desprovisto de suplementos antibioticos desde al menos el pase 2, al menos el pase 3, o al menos el pase 4.
Segun una realizacion de la presente invencion, las celulas se hacen pasar por al menos 4 pases, al menos 5 pases, al menos 6 pases, al menos 7 pases o al menos 8 pases. Se apreciara que las celulas se hacen pasar tfpicamente cuando el cultivo alcanza aproximadamente el 70-90% de confluencia, tfpicamente despues de 3-5 dfas (por ejemplo, 1-3 doblajes).
Para el cultivo 3D, las celulas adherentes pueden transferirse a una matriz configurada en 3D inmediatamente despues del aislamiento o de forma alternativa, pueden pasarse a disposiciones tridimensionales despues de condiciones bidimensionales (2D). En algunos momentos, puede necesitarse la crioconservacion de celulas entre el cultivo 2D y el cultivo 3D.
Asf, el material adherente segun algunas realizaciones se configura para el cultivo 3D proporcionando asf una matriz de crecimiento que aumenta esencialmente la superficie de union disponible para la adherencia de las celulas para asf imitar la infraestructura del tejido (es decir, la placenta).
Para produccion a gran escala, el cultivo puede efectuarse en un biorreactor 3D.
Ejemplos de dichos biorreactores incluyen, aunque no estan limitados a, un biorreactor de flujo de piston, un biorreactor de tanque agitado continuo, un biorreactor de lecho estacionario (biorreactor de lecho empaquetado) y un biorreactor de lecho fluidizado.
El biorreactor Celligen (New Brunswick Scientific) es capaz de expansion 3D de celulas adherentes bajo condiciones controladas (por ejemplo, pH, temperatura y niveles de oxfgeno) y con perfusion en medio de crecimiento celular constante. Ademas, los cultivos celulares pueden monitorizarse para niveles de concentracion de glucosa, lactato, glutamina, glutamato y amonio. La velocidad de consumo de glucosa y la velocidad de formacion de lactato de las celulas adherentes permiten medir la velocidad de crecimiento celular y determinar el tiempo de cosechado.
Otros biorreactores 3D que pueden usarse con la invencion incluyen, aunque no estan limitados a, un biorreactor de tanque agitado en continuo, donde un medio de cultivo se alimenta de forma continua en el biorreactor y el medio usado se saca de forma continua, para mantener un estado continuo constante en el tiempo en el biorreactor. El biorreactor de tanque agitado puede usarse con lecho fluidizado (vehfculos suspendidos) o una cesta de lecho fibroso (que esta disponible por ejemplo en New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ), un biorreactor de lecho estacionario, un biorreactor de agitacion por aire, donde el aire se alimenta tfpicamente en el fondo de un tubo de aspiracion central que fluye hacia arriba mientras se forman burbujas, y que separa el gas de escape en la parte superior de la columna, un biorreactor con espumas poliactivas [como se describe en Wendt, D. et al., Biotechnol Bioeng 84: 205-214, (2003)], unos soportes porosos en un biorreactor de perfusion de flujo radial [como se describe en Kitagawa et al., Biotechnology and Bioengineering 93(5): 947-954 (2006)], un biorreactor de flujo radial con soporte o vehfculos, un biorreactor de fibra hueca y microvefuculos. Otros biorreactores que pueden usarse de acuerdo con la invencion se describen en las Patentes de EE.UU. nums. 6.277.151, 6.197.575, 6.139.578, 6.132.463, 5.902.741 y 5.629.186.
En una realizacion ejemplar se siembran un total de 200 ± 100 x 106 celulas, se siembran 3-10 x 106 celulas/gr de vehfculo, o se siembran 0,06-0,2 x 106 celulas/ml. Segun una realizacion ejemplar, el sembrado de celulas se efectua en discos FibraCel de 2000-9000 celulas/cm2.
Las celulas pueden cosecharse cuando al menos aproximadamente el 10% de celulas estan proliferando mientras se evita la diferenciacion incontrolada y la senescencia.
El cultivo se efectua durante al menos aproximadamente 2 dfas, 3 dfas, 4 dfas, 5 dfas, 6 dfas, 7 dfas, 10 dfas, 14 dfas, 20 dfas, un mes o incluso mas. Se apreciara que el cultivo en un biorreactor puede prolongar este periodo. El cultivo de las celulas adherentes en el cultivo 3D pueden efectuarse bajo un flujo continuo de un medio de cultivo. El paso puede efectuarse ademas para aumentar el numero de celulas. Se apreciara que el medio de cultivo puede cambiarse para prolongar y mejorar las condiciones de cultivo.
Segun una realizacion de la presente invencion, el cultivo celular se efectua bajo perfusion del medio de cultivo. Tfpicamente, la velocidad de perfusion se determina por la concentracion de glucosa en el medio de cultivo de las celulas adherentes. Asf, segun las presentes ensenanzas, el medio de cultivo puede cambiarse cuando la concentracion de glucosa es aproximadamente 500 mg/L, aproximadamente 550 mg/L o aproximadamente 600 mg/L.
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Las celulas adherentes de algunas realizaciones de la presente invencion comprenden al menos aproximadamente 10%, 28%, 30%, 50%, 80% o mas celulas proliferativas (como puede ensayarse por FACS que monitoriza las fases S y G2/M).
Las celulas adherentes de algunas realizaciones de la invencion pueden comprender al menos un "fenotipo de celula estromal".
Como se usa en esta memoria "un fenotipo de celula estromal" se refiere a un fenotipo estructural o funcional tfpico de una celula estromal derivada de medula osea (es decir, mesenquimal).
Asf, por ejemplo, las celulas pueden tener una forma de huso. De forma alternativa o adicional las celulas pueden expresar un marcador o una coleccion de marcadores (por ejemplo, marcador de superficie) tfpico de las celulas estromales. Ejemplos de marcadores de superficie celular estromal (positivos y negativos) incluyen aunque no estan limitados a CD105+, CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, D7-fib+, CD3", CD4", CD34-, CD45-, CD80-, CD5", CD20-, CD11b- , CD14", CD19", CD79", HLA-DR-, CD31- KDR", y FMC7".
Otros marcadores de celula estromal incluyen aunque no estan limitados a tirosina hidroxilasa, nestina y H-NF.
Segun una realizacion espedfica de la invencion, las celulas adherentes, que incluyen las derivadas tanto de una parte materna como de una parte fetal de la placenta, no expresan el marcador de celula madre CD271.
Como se usa en esta memoria la frase "celula madre" se refiere a una celula que no esta diferenciada de forma terminal.
Segun una realizacion espedfica de la invencion, las celulas adherentes derivadas de una parte fetal de la placenta (por ejemplo, que consiste en o comprende vellosidades corionicas) se caracterizan por una expresion CD200 positiva (vease la seccion de Ejemplos que sigue).
Segun una realizacion espedfica de la invencion, no mas del 3,5%, no mas del 3%, no mas del 2% o no mas del 1% de las celulas adherentes de una parte materna expresan CD200 como se mide por citometna de flujo usando un control de isotipo para definir la expresion negativa.
Ejemplos de fenotipos funcionales tfpicos de celulas estromales incluyen, aunque no estan limitados a, actividad de supresion de celula T (no estimulan las celulas T y en cambio suprimen las mismas, por ejemplo, cuando se ensaya en un cultivo de linfocito mixto) y actividad de soporte de celula madre hematopoyetica.
Segun una realizacion ejemplar, las celulas adherentes de la presente invencion estan menos comprometidas a la diferenciacion en lmeas osteogenica o adipogenica en comparacion con celulas adherentes de la medula osea que crecen y se diferencian bajo las mismas condiciones. Por ejemplo, segun una realizacion ejemplar, las celulas adherentes de la presente invencion no se diferencian en lmeas osteogenica o adipogenica cuando se hacen crecer bajo las condiciones descritas en los Ejemplos 4-7 del documento WO2010026575.
Segun una realizacion de la invencion, las celulas adherentes de la invencion son capaces de suprimir la reaccion inmune en un sujeto.
Como se usa en esta memoria la frase "que suprime la reaccion inmune en un sujeto" se refiere a la disminucion o inhibicion de la reaccion inmune que se da en un sujeto en respuesta a un antfgeno (por ejemplo, una celula extrana o una parte de la misma). La respuesta inmune que puede suprimirse mediante las celulas adherentes incluyen las respuestas inmunes humorales, y las respuestas inmunes celulares, que implican el reconocimiento espedfico de antfgenos de patogeno por medio de anticuerpos y linfocitos T (proliferacion de celulas T), respectivamente. Algunos ejemplos de metodos para determinar si las celulas adherentes suprimen una reaccion inmune se dan en los Ejemplos.
Segun una realizacion espedfica, las celulas adherentes de placenta materna son capaces de suprimir una reaccion inmune a una menor extension (por ejemplo, al menos aproximadamente 2% menos, 5% menos, 10% menos, 15% menos, 20% menos, 30% menos, 40% menos o 50% menos) que las celulas adherentes de una parte fetal de placenta. En algunas realizaciones, la supresion de una reaccion inmune se determina midiendo la capacidad de las celulas para suprimir un cultivo de linfocitos mixto. En otras realizaciones, la supresion de una reaccion inmune se determina midiendo la supresion de la formacion de blastos de celula T inducida por fitohemaglutenina (PHA) en un ensayo in vitro.
Segun una realizacion espedfica, las celulas adherentes de placenta materna comprenden un diametro celular que es menor (por ejemplo, en aproximadamente 2%, 5%, 10%, 15%, 20 o 30%) que el de las celulas adherentes derivadas de una parte fetal de la placenta.
Segun una realizacion espedfica, las celulas adherentes de placenta materna comprenden una capacidad de proliferacion celular (por ejemplo, en aproximadamente 2%, 5%, 10%, 15%, 20 o 30%) que es mayor que el de las celulas adherentes derivadas de una parte fetal de la placenta.
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Segun una realizacion espedfica las celulas pueden ser de fuente autologa, singenica, alogenica o xenogenica.
Segun otra realizacion espedfica las celulas pueden modificarse geneticamente para expresar una protema heterologa.
Segun aun otra realizacion espedfica las celulas no estan geneticamente modificadas.
Se apreciara que el medio acondicionado puede aislarse de cultivos que comprenden/consisten en las celulas.
Como se usa en esta memoria "medio acondicionado" se refiere a un medio enriquecido con factores secretados presentes en los cultivos descritos en esta memoria (es decir, que comprende/consiste en cualquiera de las poblaciones celulares anteriores) despues de un cierto periodo de cultivo.
El medio acondicionado se produce cultivando las celulas anteriores en un medio de crecimiento bajo condiciones adecuadas para producir el medio acondicionado.
El medio de crecimiento puede ser cualquier medio de crecimiento adecuado para hacer crecer las celulas de placenta adherentes de la presente invencion, como se describe anteriormente. El medio de crecimiento puede suplementarse con factores nutricionales, tales como aminoacidos, (por ejemplo, L-glutamina), anti-oxidantes (por ejemplo, beta-mercaptoetanol) y factores de crecimiento. El suero y/o sustituciones de suero se anaden a intervalos de concentracion efectivos de hasta 20%.
Las celulas se cultivan en el medio de crecimiento durante tiempo suficiente para permitir la acumulacion adecuada de factores secretados para soportar la inmunosupresion y/o angiogenesis, por ejemplo. Tfpicamente, el medio se acondiciona cultivando durante 1-5 dfas a 37°C. Sin embargo, el periodo de cultivo puede escalarse evaluando el efecto del medio acondicionado en la inmunosupresion y/o angiogenesis, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos. En algunas realizaciones, el medio se acondiciona durante 3-5 dfas para la inmunosupresion y durante 24-72 hrs para la angiogenesis.
La seleccion del aparato de cultivo para acondicionar el medio se basa en la escala y el proposito del medio acondicionado. La produccion a gran escala implica preferiblemente el uso de biorreactores como se describe anteriormente. Despues de la acumulacion de factores adecuados en el medio, el medio de crecimiento (es decir, el medio acondicionado) se separa de las celulas y se recoge. Se apreciara que las celulas pueden usarse de forma repetida para acondicionar cargas adicionales de medio durante periodos de cultivo adicionales, con tal que las celulas retengan su capacidad para acondicionar el medio.
El medio acondicionado de la presente invencion puede administrarse directamente (como se describe adicionalmente a continuacion) o extraerse para concentrar el factor efectivo tal como por filtracion de sal. Para el uso futuro, el medio acondicionado se almacena preferiblemente congelado a -80°C.
Las celulas adherentes de partes fetales pueden usarse en diversos marcos de investigacion tal como para ensayar sus propiedades biologicas (por ejemplo, morfologfa, tamano) con respecto a las partes maternas (vease por ejemplo, la seccion de Ejemplos).
Las poblaciones purificadas de celulas de la placenta descritas en esta memoria o cualquiera de los medios acondicionados descritos en esta memoria pueden usarse para tratar un defecto de musculo esqueletico.
Como se usa en esta memoria el termino "proceso" se refiere a cualquier patologfa (enfermedad, proceso, smdrome o trastorno) que puede beneficiarse del trasplante de celula (por ejemplo, celula estromal) u organo. Los ejemplos incluyen procesos isquemicos, procesos cardiovasculares, procesos del sistema nervioso, procesos de tracto gastrointestinal, procesos ortopedicos, procesos hematopoyeticos, procesos renales y procesos hepaticos, tales como aunque no limitados a, enfermedad arterial periferica (PAD), tal como isquemia de la extremidad e isquemia cntica de la extremidad (CLI), isquemia de la extremidad inferior, enfermedad vascular isquemica, ictus, enfermedad cardiaca isquemica, isquemia de miocardio, infarto de miocardio agudo (MI), enfermedad de la arteria coronaria (CAD), enfermedad cardiovascular aterosclerotica, enfermedad de la arteria coronaria principal izquierda, enfermedad oclusiva arterial, isquemia periferica, enfermedad vascular periferica, arteriosclerosis, retinopatfa, reparacion de retina, trastorno remodelador, smdrome de von Hippel-Lindau, enfermedad vascular telengiectasiaisquemica hemorragica hereditaria, enfermedad de Buerger, diabetes, enfermedad vascular del rinon, enfermedad renal isquemica, enfermedad hepatica, placenta isquemica, trastornos asociados con la reproduccion, enfermedad de injerto frente a huesped (GVHD), trasplante de organo solido, trasplante de celula madre hematopoyetica (HSCT), procesos inflamatorios del tracto gastrointestinal (GI), colitis ulcerosa, curado de heridas retrasado, curado de ulceras retrasado, cancer (por ejemplo, cancer de mama), pre-cancer, procesos caracterizados por dano del tejido conectivo tal como cancer oseo, osteosarcoma, metastasis osea, fractura osea, enfermedad degenerativa del disco, osteogenesis imperfecta (OI), quemado, herida por quemado, defecto del cartflago articular, herida profunda, curado de herida retrasado, curado de ulcera retrasado, trastornos metabolicos, psoriasis, dolor neuropatico, lesion del nervio periferico, soporte del trasplante de rinon, quiste oseo subcondrial, osteoporosis, osteoartritis (OA), hueso degenerado, dano del cartflago, defecto del cartflago articular, tendones lesionados (por ejemplo, lesiones de tendones inducidos por endurecimiento) y ligamentos lesionados.
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La enfermedad/proceso isquemico es un proceso medico en que el tejido cae en un estado isquemico debido a un reducido flujo sangumeo en la vasculatura provocado por diversos factores, tales como constriccion del lumen del vaso sangumeo, desarrollo de coagulos de sangre, oclusion del vaso sangumeo, vasculitis, estrechamiento del vaso sangumeo o un aumento en la viscosidad de la sangre. Las enfermedades isquemicas incluyen trastorno vascular periferico, enfermedad cardiaca isquemica (por ejemplo, cardiomiopatfa isquemica, infarto de miocardio, fallo cardiaco isquemico), enfermedad cerebrovascular isquemica, que incluye ictus, enfermedad isquemica del rinon, enfermedad isquemica del pulmon y enfermedades isquemicas asociadas con enfermedades infecciosas. Ejemplos no limitantes adicionales de enfermedades isquemicas (tambien denominadas en esta memoria como isquemia) se enumeran a lo largo de la solicitud.
El trastorno vascular periferico es un proceso medico en que el tejido periferico cae en un estado isquemico debido a un reducido flujo sangumeo arterial periferico provocado por, por ejemplo, constriccion del lumen del vaso sangumeo, desarrollo de coagulos de sangre, oclusion del vaso sangumeo, vasculitis, estrechamiento del vaso sangumeo o un aumento en la viscosidad de la sangre. Enfermedades asociadas con el trastorno vascular periferico incluyen enfermedades oclusivas arteriales cronicas tales como arteriosclerosis obliterante y enfermedad de Buerger y esclerosis sistemica progresiva, eritematoso sistemico, enfermedad de Raynaud, smdrome de vibracion, aneurisma y vasculitis. Ejemplos no limitantes adicionales de enfermedades isquemicas perifericas se enumeran a lo largo de la solicitud.
Segun una realizacion espedfica el proceso es defecto del musculo esqueletico.
El medio acondicionado descrito en esta memoria se usa para tratar el ictus.
Como se usa en esta memoria "ictus" o "ataque cerebrovascular agudo" se refiere a la perdida de desarrollo rapido de la(s) funcion(ones) cerebral(es) debido a la perturbacion en el suministro de sangre al cerebro. Esto puede deberse a isquemia (falta de suministro de glucosa y oxfgeno) provocada por trombosis o embolismo o debido a una hemorragia (hemorragia subaracnoide o hemorragia intracerebral).
Se apreciara que las celulas de la presente invencion son capaces de inducir la inmunosupresion y/o tolerancia y/o son capaces de inducir la angiogenesis en un sujeto. Asf, las celulas adherentes o medios acondicionados derivados de ellas pueden usarse para tratar cualquier proceso que necesite angiogenesis y/o inmunosupresion y/o tolerancia. Dichos procesos incluyen, aunque no estan limitados a, enfermedades autoinmunes y enfermedades inflamatorias (que incluyen enfermedades inflamatorias agudas y cronicas) que incluyen, aunque no estan limitadas a, enfermedades cardiovasculares, enfermedades reumatoides, enfermedades glandulares, enfermedades gastrointestinales, enfermedades cutaneas, enfermedades hepaticas, enfermedades neurologicas, enfermedades musculares, enfermedades nefnticas, enfermedades relacionadas con la reproduccion, enfermedades de tejido conectivo y enfermedades sistemicas.
Ejemplos de enfermedades cardiovasculares autoinmunes incluyen, aunque no estan limitadas a aterosclerosis (Matsuura E. et al., Lupus. 1998; 7 Supl 2:S135), infarto de miocardio (Vaarala O. Lupus. 1998; 7 Supl 2:S132), trombosis (Tincani A. et al., Lupus 1998; 7 Supl 2:S107-9), granulomatosis de Wegener, arteritis de Takayasu, smdrome de Kawasaki (Praprotnik S. et al., Wien Klin Wochenschr 25 de Agosto de 2000; 112 (15-16):660), enfermedad autoinmune anti-factor VIII (Lacroix-Desmazes S. et al., Semin Thromb Hemost. 2000; 26 (2):157), vasculitis necrotizante de los vasos sangumeos pequenos, poliangiitis microscopica, smdrome de Churg y Strauss, glomerulonefritis necrotizante y crescentica focal pauci-inmune (Noel LH. Ann Med Interne (Paris). Mayo de 2000; 151 (3):178), smdrome antifosfolipfdico (Flamholz R. et al., J Clin Apheresis 1999; 14 (4):171), fallo cardiaco inducido por anticuerpos (Wallukat G. et al., Am J Cardiol. 17 de Junio de 1999; 83 (12A):75H), purpura trombocitopenica (Moccia F. Ann Ital Med Int. Abril-Junio de 1999; 14 (2):114; Semple JW. et al., Blood 15 de Mayo de 1996; 87 (10):4245), anemia hemolttica autoinmune (Efremov dG. et al., Leuk Lymphoma Enero de 1998; 28 (3-4):285; Sallah S. et al., Ann Hematol Marzo de 1997; 74 (3):139), autoinmunidad cardiaca en enfermedad de Chagas (Cunha-Neto E. et al., J Clin Invest 15 de Octubre de 1996; 98 (8):1709) y autoinmunidad de linfocito T anti-ayudante (Caporossi AP. et al., Viral Immunol 1998; 11 (1):9).
Ejemplos de enfermedades reumatoides autoinmunes incluyen, aunque no estan limitados a artritis reumatoide (Krenn V. et al., Histol Histopathol 1 de Julio de 2000; 15 (3):791; Tisch R, McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci units S A 18 de enero de 1994; 91(2):437) y espondilitis anquilosante (Jan Voswinkel et al., Arthritis Res 2001; 3 (3): 189).
Ejemplos de enfermedades glandulares autoinmunes incluyen, aunque no estan limitados a, enfermedad pancreatica, diabetes tipo I, enfermedad de tiroides, enfermedad de Graves, tiroiditis, tiroiditis autoinmune espontanea, tiroiditis de Hashimoto, mixedema idiopatica, autoinmunidad de ovario, infertilidad anti-esperma autoinmune, prostatitits autoinmune y enfermedades de smdrome poliglandular autoinmune tipo I incluyen, aunque no estan limitadas a enfermedades autoinmunes del pancreas, diabetes tipo I (Castano L. y Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647; Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract Octubre de 1996; 34 Supl:S125), enfermedades tiroideas autoinmunes, enfermedad de Graves (Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am Junio de 2000; 29 (2):339; Sakata S. et al., Mol Cell Endocrinol Marzo de 1993; 92 (1):77), tiroiditis autoinmune espontanea (Braley-Mullen H. y Yu S, J Immunol 15 de Diciembre de 2000; 165 (12):7262), tiroiditis de Hashimoto (Toyoda N. et al., Nippon Rinsho Agosto de 1999; 57 (8):1810), mixedema idiopatica (Mitsuma T. Nippon Rinsho. Agosto de 1999; 57 (8):1759),
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autoinmunidad de ovario (Garza KM. et al., J Reprod Immunol Febrero de 1998; 37 (2):87), infertilidad anti-esperma autoinmune (Diekman AB. et al., Am J Reprod Immunol. Marzo de 2000; 43 (3):134), prostatitis autoinmune (Alexander RB. et al., Urology Diciembre de 1997; 50 (6):893) y smdrome poliglandular autoinmune tipo I (Hara T. et al., Blood. 1 de Marzo de 1991; 77 (5):1127).
Ejemplos de enfermedades gastrointestinales autoinmunes incluyen, aunque no esta limitados a, enfermedades intestinales inflamatorias cronicas (Garda Herola A. et al., Gastroenterol Hepatol. Enero de 2000; 23 (1):16), enfermedad celfaca (Landau YE. y Shoenfeld Y. Harefuah 16 de Enero de 2000; 138 (2):122), colitis, ileitis y enfermedad de Crohn.
Ejemplos de enfermedades cutaneas autoinmunes incluyen, aunque no estan limitados a, enfermedades de piel bullosa autoinmune, tales como, aunque no estan limitadas a, penfigo vulgar, penfigoide bulloso y penfigo foliaceo.
Ejemplos de enfermedades hepaticas autoinmunes incluyen, aunque no estan limitados a, hepatitis, hepatitis activa cronica autoinmune (Franco A. et al., Clin Immunol Immunopathol Marzo de 1990; 54 (3):382), cirrosis biliar primaria (Jones DE. Clin Sci (Colch) Noviembre de 1996; 91 (5):551; Strassburg CP. et al., Eur J Gastroenterol Hepatol. Junio de 1999; 11 (6):595) y hepatitis autoinmune (Manns MP. J Hepatol Agosto de 2000; 33 (2):326).
Ejemplos de enfermedades neurologicas autoinmunes incluyen, aunque no estan limitados a, esclerosis multiple (Cross AH. et al., J Neuroimmunol 1 de Enero de 2001; 112 (1-2):1), enfermedad de Alzheimer (Oron L. et al., J Neural Transm Supl. 1997; 49:77), miastenia grave (Infante Aj. y Kraig E, Int Rev Immunol 1999; 18 (1-2):83; Oshima M. et al., Eur J Immunol Diciembre de 1990; 20 (12):2563), neuropatfas, neuropatfas motoras (Kornberg AJ. J Clin Neurosci. Mayo de 2000; 7 (3):191); smdrome de Guillain-Barre y neuropatfas autoinmunes (Kusunoki S. Am J Med Sci. Abril de 2000; 319 (4):234), miastenia, smdrome miastenico de Lambert-Eaton (Takamori M. Am J Med Sci. Abril de 2000; 319 (4):204); enfermedades neurologicas paraneoplasicas, atrofia cerebelar, atrofia cerebelar paraneoplasica y smdrome de la persona ngida (Hiemstra hS. et al., Proc Natl Acad Sci units S A 27 de Marzo de 2001; 98 (7):3988); smdrome de la persona ngida no paraneoplasica, atrofias cerebelares progresivas, encefalitis, encefalitis de Rasmussen, esclerosis lateral amiotrofica, corea de Sydeham, smdrome de Gilles de la Tourette y poliendocrinopatfas autoinmunes (Antoine JC. y Honnorat J. Rev Neurol (Pans) Enero de 2000; 156 (1):23); neuropatfas disinmunes (Nobile-Orazio E. et al., Electroencephalogr Clin Neurophysiol Supl 1999; 50:419); neuromiotonia adquirida, artrogriposis multiple congenita (Vincent A. et al., Ann N Y Acad Sci. 13 de Mayo de 1998; 841:482), neuritis, neuritis optica (Soderstrom M. et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry Mayo de 1994; 57 (5):544) y enfermedades neurodegenerativas.
Ejemplos de enfermedades musculares autoinmunes incluyen, aunque no estan limitados a, miositis, miositis autoinmune y smdrome de Sjogren primario (Feist E. et al., Int Arch Allergy Immunol Septiembre de 2000; 123 (1):92) y enfermedad autoinmune de musculo liso (Zauli D. et al., Biomed Pharmacother Junio de 1999; 53 (5- 6):234).
Ejemplos de enfermedades nefricas autoinmunes incluyen, aunque no estan limitados a, nefritis y nefritis intersticial autoinmune (Kelly CJ. J Am Soc Nephrol Agosto de 1990; 1 (2):140).
Ejemplos de enfermedades autoinmunes relacionadas con la reproduccion incluyen, aunque no estan limitados a, perdida fetal repetida (Tincani A. et al., Lupus 1998; 7 Supl 2:S107-9).
Ejemplos de enfermedades de tejido conectivo autoinmunes incluyen, aunque no estan limitados a, enfermedades de ofdo, enfermedades de ofdo autoinmunes (Yoo TJ. et al., Cell Immunol Agosto de 1994; 157 (1):249) y enfermedades autoinmunes del ofdo interno (Gloddek B. et al., Ann N Y Acad Sci 29 de Diciembre de 1997, 830:266).
Ejemplos de enfermedades sistemicas autoinmunes incluyen, aunque no estan limitados a, lupus sistemico eritematoso (Erikson J. et al., Immunol Res 1998; 17 (1-2):49) y esclerosis sistemica (Renaudineau Y. et al., Clin Diagn Lab Immunol. Marzo de 1999; 6 (2):156); Chan OT. et al., Immunol Rev Junio de 1999; 169:107).
Ademas, las celulas adherentes o medios acondicionados pueden usarse para tratar enfermedades asociadas con trasplante de un injerto que incluyen, aunque no estan limitados a, rechazo de injerto, rechazo cronico de injerto, rechazo sub-agudo de injerto, rechazo hiperagudo de injerto, rechazo agudo de injerto y enfermedad de injerto frente a huesped.
Como se usa en esta memoria el termino "tratar" se refiere inhibir o frenar el desarrollo de una patologfa y/o provocar la reduccion, remision o regresion de una patologfa. Los expertos en la tecnica entenderan que varias metodologfas y ensayos pueden usarse para evaluar el desarrollo de una patologfa, y de forma similar, varias metodologfas y ensayos pueden usarse para evaluar la reduccion, remision o regresion de una patologfa. El termino "tratar" puede referirse tambien a aliviar o disminuir un smtoma asociado con la patologfa.
El sujeto tratado mediante las celulas adherentes o medios acondicionados puede ser cualquier sujeto (por ejemplo, un mamffero), tal como un sujeto humano o un animal domestico que incluyen, aunque no esta limitado a, caballos
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(es decir, equino), ternera, cabra, oveja, cerdo, perro, gato, camello, alpaca, llama y yak que se diagnostica con o sufre de la patolog^a y puede beneficiarse del trasplante de celula estromal.
Como se menciona las celulas pueden ser ingenuas o pueden modificarse geneticamente como para derivar una lmea de interes (vease Sol. Pat. de EE.UU. num. 20030219423).
Las celulas pueden ser preparados frescos o congelados (por ejemplo, crio-conservados).
Dependiendo del proceso medico, el sujeto puede administrate con farmacos qmmicos adicionales (por ejemplo, inmunomodulatorio, quimioterapia, etc.) o celulas.
Las celulas, aunque caracterizadas por actividad inmuno-supresora, pueden provocar aun respuesta inmune indeseable derivada de huesped o donante. Se han desarrollado aproximaciones para reducir la probabilidad de rechazo de celulas no autologas. Estos incluyen o bien suprimiendo el sistema inmune recipiente o encapsular las celulas no autologas en membranas semipermeables, inmunoaislantes antes del trasplante.
Las tecnicas de encapsulado se clasifican generalmente como microencapsulado, que implica pequenos vehfculos esfericos y macroencapsulado, que implica membranas mayores de lamina plana y de fibra hueca (Uludag, H. et al. Technology of mammalian cell encapsulation. Adv Drug Deliv Rev. 2000; 42: 29-64).
Los metodos para preparar microcapsulas se conocen en las tecnicas e incluyen por ejemplo los descritos por Lu MZ, et al., Cell encapsulation with alginate and alpha-phenoxycinnamylidene-acetylated poly(allylamine). Biotechnol Bioeng. 2000, 70: 479-83, Chang TM y Prakash S. Procedures for microencapsulation of enzymes, cells and genetically engineered microorganisms. Mol Biotechnol. 2001, 17: 249-60, y Lu MZ, et al., A novel cell encapsulation method using photosensitive poly(allylamine alpha-cyanocinnamylideneacetate). J Microencapsul. 2000, 17: 245-51.
Por ejemplo, las microcapsulas se preparan complejando colageno modificado con una carcasa de ter-polfmero de metilacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA), acido metacnlico (MAA) y metacrilato de metilo (MMA), que da por resultado un espesor de capsula 2-5 pm. Dichas microcapsulas pueden encapsularse adicionalmente con carcasas de ter- polfmero de 2-5 pm adicionales para impartir una superficie suave cargada de forma negativa y para minimizar la absorcion de protema en plasma (Chia, S.M. et al. Multi-layered microcapsules for cell encapsulation Biomaterials. 2002 23: 849-56).
Otras microcapsulas estan basadas en alginato, un polisacarido marino (Sambanis, A. Encapsulated islets in diabetes treatment. Diabetes Technol. Ther. 2003, 5: 665-8) o sus derivados. Por ejemplo, las microcapsulas pueden prepararse mediante la complejacion de polielectrolito entre los polianiones de alginato sodico y sulfato de celulosa sodico con el polication hidrocloruro de poli(metileno-co-guanidina) en presencia de un cloruro de calcio.
Se apreciara que la encapsulacion celular se mejora cuando se usan capsulas mas pequenas. Asf, el control de calidad, estabilidad mecanica, propiedades de difusion y actividades in vitro de celulas encapsuladas mejoraron cuando el tamano de capsula se redujo de 1 mm a 400 pm (Canaple L. et al., Improving cell encapsulation through size control. J Biomater Sci Polym Ed. 2002; 13:783-96). Ademas, las biocapsulas nanoporosas con tamano de poro bien controlado tan pequeno como 7 nm, ajustaron las qmmicas superficiales y se encontro que las microarquitecturas precisas inmunoaislaron con exito los microambientes para las celulas (Williams D. Small is beautiful: microparticle and nanoparticle technology in medical devices. Med Device Technol. 1999, 10: 6-9; Desai, T.A. Microfabrication technology for pancreatic cell encapsulation. Expert Opin Biol Ther. 2002, 2: 633-46).
Ejemplos de agentes inmunosupresores incluyen, aunque no estan limitados a, metotrexato, ciclofosfamida, ciclosporina, ciclosporina A, cloroquina, hidroxicloroquina, sulfasalazina (sulfasalazopirina), sales de oro, D- penicilamina, leflunomida, azatioprina, anakinra, infliximab (REMICADE), etanercept, alfa bloqueantes de TNF, un agente biologico que dirige una citoquina inflamatoria y Farmaco Anti-inflamatorio No Esteroideo (NSAIDs). Ejemplos de NSAID incluyen, aunque no estan limitados a acido acetilsalidlico, salicilato de magnesio colina, diflunisal, salicilato de magnesio, salsalato, salicilato sodico, diclofenac, etodolac, fenoprofeno, flurbiprofeno, indometacina, cetoprofeno, cetorolac, meclofenamato, naproxeno, nabumetona, fenilbutazona, piroxicam, sulindac, tolmetina, acetaminofeno, ibuprofeno, inhibidores de Cox-2 y tramadol.
Ademas, se apreciara que las celulas o medios acondicionados pueden administrarse o bien per se o, preferiblemente como una parte de la composicion farmaceutica que comprende ademas un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
Como se usa en esta memoria una "composicion farmaceutica" se refiere a un preparado de las celulas o medios acondicionados derivados de ellas, con otros componentes qmmicos tales como veldculos o excipientes farmaceuticamente adecuados. El proposito de una composicion farmaceutica es facilitar la administracion de las celulas a un sujeto.
En adelante, el termino "veldculo farmaceuticamente aceptable" se refiere a un vedculo o un diluyente que no provoca irritacion significativa a un sujeto y no abole la actividad biologica y propiedades del compuesto
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administrado. Los ejemplos, sin limitaciones, de vedculos son propilenglicol, solucion salina, DMSO, HSA, emulsiones y mezclas de disolventes organicos con agua.
En esta memoria el termino "excipiente" se refiere a una sustancia inerte anadida a una composicion farmaceutica para facilitar adicionalmente la administracion de un compuesto. Los ejemplos, sin limitacion, de excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azucares y tipos de almidon, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.
Las tecnicas para la formulacion y administracion de farmacos pueden encontrarse en "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, ultima edicion.
Las composiciones farmaceuticas para el uso segun la invencion pueden formularse asf de manera convencional usando uno o mas vedculos fisiologicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesado de los ingredientes activos en preparados que, pueden usarse farmaceuticamente. La formulacion apropiada es dependiente de la ruta de administracion elegida.
Para inyeccion, los ingredientes activos de la composicion farmaceutica pueden formularse en disoluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiologicamente compatibles tal como disolucion de Hank, disolucion de Ringer, tampon de sal fisiologica, o medio de congelacion que contiene crioconservantes.
La determinacion de una cantidad terapeuticamente efectiva esta bien en la capacidad de los expertos en la tecnica, especialmente a la luz de la descripcion detallada proporcionada en esta memoria.
La toxicidad y la eficacia terapeutica de los ingredientes activos descritos en esta memoria pueden determinarse mediante procedimientos farmaceuticos estandar in vitro, en cultivos celulares o animales experimentales.
Dependiendo de la gravedad y sensibilidad del proceso a tratar, la dosificacion puede ser de una unica administracion o una pluralidad de administraciones. Sin embargo, la cantidad de una composicion a administrar sera dependiente, por supuesto, del sujeto que se trata, la gravedad de la afliccion, la manera de administracion, el juicio del medico que prescribe, etc.
Despues del trasplante, una parte de las celulas de la invencion preferiblemente sobrevive en el area enferma durante un periodo de tiempo (por ejemplo, aproximadamente 2-6 semanas), de manera que se observa un efecto terapeutico.
Las composiciones que incluyen el preparado de la invencion formulada en un vedculo farmaceutico compatible pueden prepararse tambien, colocarse en un recipiente apropiado y marcarse para el tratamiento de un proceso indicado.
Las composiciones para el uso de la invencion pueden presentarse, si se desea, en un paquete o dispositivo dispensador, tal como un kit aprobado por la FDA, que puede contener una o mas formas de dosificacion unitaria que contienen el ingrediente activo. El paquete puede comprender, por ejemplo, lamina metalica o plastica, tal como un paquete de blister. El paquete o dispositivo dispensador puede estar acompanado por instrucciones para la administracion. El paquete o dispensador puede adaptarse tambien mediante una nota asociada con el recipiente en la forma recetada por una agencia gubernamental que regula la fabricacion, el uso o venta de compuestos farmaceuticos, cuya nota es reflejo de aprobacion por la agencia de la forma de las composiciones o administracion humana o veterinaria. Dicha nota, por ejemplo, puede ser de etiquetado aprobado por la Administracion de Alimentacion y Farmacos de EE.UU. para farmacos de prescripcion o de una insercion de producto aprobado.
Como se usa en esta memoria el termino "aproximadamente" se refiere a ± 10%.
Los terminos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus conjugados significa "que incluyen aunque no estan limitados a". Este termino abarca los terminos "que consisten en" y "que consisten esencialmente en".
La frase "que consiste esencialmente en" significa que la composicion o metodo puede incluir ingredientes y/o etapas adicionales, pero solo si los ingredientes y/o etapas adicionales no alteran de forma natural las caractensticas basicas y nuevas de la composicion o metodo reivindicado.
Como se usa en esta memoria, la forma singular "un", "una" y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Por ejemplo, el termino "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, que incluyen mezclas de los mismos.
A lo largo de esta solicitud, varias realizaciones de esta invencion puede presentarse en un formato de intervalo. Debena entenderse que la descripcion en formato de intervalo es meramente para conveniencia y brevedad y no debena construirse como una limitacion inflexible en el alcance de la invencion. Por consiguiente, la descripcion de un intervalo debena considerarse que ha descrito espedficamente todos los subintervalos posibles ademas de valores numericos individuales en ese intervalo. Por ejemplo, la descripcion de un intervalo tal como de 1 a 6 debena considerarse que ha descrito espedficamente subintervalos tal como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4,
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de 2 a 6, de 3 a 6, etc., ademas de numeros individuales en el intervalo, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5 y 6. Esto aplica a pesar de la anchura del intervalo.
Cuando un intervalo numerico se indica en esta memoria, significa que incluye cualquier numero citado (fraccional o integral) en el intervalo indicado. Las frases "que oscila/oscila entre" un primer numero indicado y un segundo numero indicado y "que oscila/oscila de" un primer numero indicado "a" un segundo numero indicado se usan en esta memoria de forma intercambiable y se pretende incluir el primer y segundo numeros indicados y todos los numeros fraccionales e integrales entre medias.
Como se usa en esta memoria, el termino "metodo" se refiere a las formas, medios, tecnicas y procedimientos para conseguir una tarea dada que incluyen, aunque no estan limitados a, las formas, medios, tecnicas y procedimientos o bien conocidos, o facilmente desarrollados a partir de formas, medios, tecnicas y procedimientos conocidos por los profesionales de las tecnicas qmmica, farmacologica, biologica, bioqmmica y medica.
Como se usa en esta memoria, el termino "que trata" incluye abolir, inhibir esencialmente, ralentizar o invertir la progresion de un proceso, mejorar esencialmente los smtomas clmicos o esteticos de un proceso o evitar esencialmente la aparicion de smtomas clmicos o esteticos de un proceso.
La palabra "ejemplar" se usa en esta memoria para indicar "que sirve como un ejemplo, caso o ilustracion". Cualquier realizacion descrita como "ejemplar" no se va a construir necesariamente como preferida o ventajosa sobre otras realizaciones y/o excluir la incorporacion de caractensticas de otras realizaciones.
La palabra "opcionalmente" se usa en esta memoria para indicar que "se proporciona en algunas realizaciones y no se proporciona en otras realizaciones". Cualquier realizacion particular de la invencion puede incluir una pluralidad de caractensticas "opcionales" a menos que dichas caractensticas difieran.
Se aprecia que ciertas caractensticas de la invencion, que se describen, por claridad, en el contexto de realizaciones separadas, pueden proporcionarse tambien en combinacion en una unica realizacion. Contrariamente, diversas caractensticas de la invencion, que se describen, por brevedad, en el contexto de una unica realizacion, pueden proporcionarse tambien de forma separada o en cualquier subcombinacion adecuada o como sea adecuado en cualquier otra realizacion descrita de la invencion. Ciertas caractensticas descritas en el contexto de varias realizaciones no se van a considerar caractensticas esenciales de esas realizaciones, a menos que la realizacion sea inoperativa sin esos elementos.
Varias realizaciones y aspectos de la presente invencion como se delinean anteriormente y como se reivindican en la seccion de reivindicaciones a continuacion, encuentran soporte experimental en los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Se hace referencia ahora a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores, ilustran algunas realizaciones de la invencion en un modo no limitante.
Generalmente, la nomenclatura usada en esta memoria y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invencion incluyen tecnicas de ADN moleculares, bioqmmicas, microbiologicas y recombinantes. Dichas tecnicas se explican completamente en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nueva York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologfas como se presentan en las Patentes de EE.UU. nums. 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8a Edicion), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman y Co., Nueva York (1980); inmunoensayos disponibles se describen extensamente en la patente y bibliograffa cientffica, vease, por ejemplo, las Patentes de EE.uU. nums. 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes "IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning "Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996). Otras referencias generales se proporcionan a lo largo de este documento. Los procedimientos en el se cree que se conocen bien en la tecnica y se proporcionan para la conveniencia del lector.
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Ejemplo 1
Recuperacion y procesado de celulas adherentes a partir de la placenta
Aislamiento de celulas estromales adherentes (ASC) - Las placentas humanas a termino se obtuvieron despues de cesareas de madres donantes sanas despues de consentimiento informado.
El tejido picado de la placenta se incubo durante 2-5 horas a 37°C con 0,1% de colagenasa (1 mg de colagenasa/ml de tejido). Se anadio medio celular bidimensional (2D) (Medio 2D que comprende DMEM suplementado con FBS al 10%, 0,25 |jg/ml de fungizona y 50 jg/ml de gentamicina) y el tejido digerido se filtro bruscamente a traves de un colador metalico esteril, se recogio en un vaso de precipitados esteril y se centrifugo (10 minutos, 1200 RPM, 4°C). Usando pipeteado suave, las celulas suspendidas se diluyeron entonces con medio 2D suplementado con antibioticos, se sembraron en matraces de 175 cm2 y se incubaron a 37°C en una incubadora de cultivo de tejido bajo condiciones humidificadas suplementado con 5% de CO2. Despues de 2-3 dfas, en que las celulas se dejaron adherirse a la superficie del matraz, se lavaron con PBS y se anadio medio 2D.
Crecimiento celular bidimensional (2D) - El primer pase se llevo a cabo tfpicamente despues de 7-15 dfas. Empezando en el pase 2 y continuando hasta el pase 6-8, las celulas se pasaron cuando el cultivo alcanzo el 7090% de confluencia, normalmente despues de 4-5 dfas (1,5-2 doblajes). Las celulas se separaron de los matraces usando tripsina-EDTA al 0,25% (4 minutos a 37°C) y se sembraron en una densidad de cultivo de 4 ± 0,5 x 103 celulas/cm2 A lo largo del proceso, los cultivos se hicieron crecer en una incubadora de cultivo de tejido bajo condiciones humidificadas con 5% de CO2 a 37°C. Despues de un total de 5-9 pases las celulas se recogieron y crioconservaron.
Procedimiento de crioconservacion para producto de existencias de celulas 2D - Para la crioconservacion de existencias de celulas 2D, las celulas cultivadas en 2D se recogieron bajo condiciones asepticas usando tripsina- EDTA al 0,25%. Las celulas se centrifugaron (1200 RPM, 10', 4°C), se contaron y se suspendieron de nuevo en medio 2D.
Para congelacion, las suspensiones celulares se diluyeron 1:1 con mezcla de congelacion 2D (las concentraciones finales fueron DMSO al 10%, FBS al 40% y medio 2D al 50%). Las celulas se almacenaron a una concentracion final de 10 x 106/ml en viales de polipropileno de crioconservacion de 5 ml. Los viales se etiquetaron y se transfirieron a un congelador a velocidad controlada para un proceso de reduccion de temperatura graduado (1°C/min), despues de lo cual se transfirieron a almacenaje en fase gaseosa de un congelador de nitrogeno lfquido.
Detalles adicionales que afectan al aislamiento y cultivo de ASC de placenta bajo condiciones 2D y 3D se encuentran en las siguientes referencias. El documento W02007/108003, describe condiciones de cultivo tridimensionales (3D) adecuadas para la expansion de ASC derivados de placenta. El documento WO2009/037690, ensena metodos para tratar la isquemia e inducir la regeneracion del tejido conectivo administrando al sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva de celulas adherentes de un tejido seleccionado de un grupo que consiste en una placenta y un tejido adiposo. El documento WO2010/026574 describe condiciones de cultivo bidimensionales (2D) adecuadas para la expansion de ASC derivados de placenta. El documento WO2010/026575 describe condiciones de cultivo tridimensionales (3D) que implican la perfusion que son adecuadas para la expansion de ASC derivadas de placenta.
Ejemplo 2
Aislamiento y caracterizacion de fracciones de placenta
I. Aislamiento de celulas adherentes de diferentes partes de placenta Materiales y metodos
Placenta - Las placentas humanas a termino se obtuvieron despues de cesareas de fetos macho a partir de madres donantes sanas despues del consentimiento informado.
Aislamiento celular (para ilustracion estructural vease la Figura 1)
Aislamiento celular desde la membrana amniotica - La placenta se coloco con el lado fetal mirando hacia arriba. La membrana amniotica (avascular) se separo de la membrana corionica mediante un pelado mecanico romo. La membrana amniotica se transfirio a un tubo de 50 ml que contema soluciones salinas equilibradas de Hank (HBSS). La membrana se corto en pedazos de —0,5-1 cm2 y se coloco en un nuevo tubo de 50 ml.
Aislamiento celular a partir de la parte decidua - Esta etapa se realizo despues de la eliminacion de la membrana amniotica como se detalla anteriormente. La placenta se coloco con el lado materno mirando hacia arriba. La decidua se disecciono solo desde la region central de la superficie que mira al lado materno (vease la Figura 1). Se cortaron cuadrados de ~1 cm3 de profundidad de no mas de 0,5 cm. Los trozos se colocaron en una botella de 500 ml que contema HBSS y se lavaron con HBSS.
Aislamiento celular a partir de la parte de vellosidad corionica - Esta etapa se realizo despues de la eliminacion de la parte decidua como se detalla anteriormente. La placenta se coloco de nuevo con el lado fetal mirando hacia arriba. Se cortaron cuadrados de ~4-5 cm3 entre los vasos sangumeos grandes a una profundidad de —0,5-1 cm. Cada trozo se coloco en un plato de vidrio esteril y se restrego con un escalpelo. La vellosidad (pequenos vasos 5 sangumeos) se separo y solo el tejido circundante se recogio sin la capa de membrana amniotica de corion. El tejido picado se coloco en una botella de 500 ml que contema HBSS y se lavo con HBSS.
Aislamiento de celulas adherentes - El tejido picado de las diversas regiones de placenta obtenido como se describe anteriormente se proceso como se describe para la preparacion de celulas PLX anterior.
Determinacion del origen celular - Para determinar si las celulas obtenidas de las diversas regiones de placenta 10 despues de las condiciones de aislamiento y expansion como se describe anteriormente son de origen materno o fetal, un analisis FISH se realizo en las celulas derivadas segun este protocolo de 5 placentas obtenidas de recien nacidos macho. Las celulas de origen materno son necesariamente XX (cariotipo hembra) mientras que las celulas de origen fetal son necesariamente XY (cariotipo macho). Los resultados se resumen en la Tabla 1, posterior.
Tabla 1 - Cariotipo
Carga num.
Pase numero Fuente de celulas Ensayo de FISH Fuente de celulas Ensayo de FISH Fuente de celulas Ensayo de FISH
XX
XY XX XY XX XY
P070109
4-5 70% 30% 0% 100% 20 % 81%
P190109
5 99% 1% 0% 100% 1% 99%
P150609
5 Decidua 96% 4% Vellosidad 0% 100% Amnios 10 % 90%
P290609
5 99% 1% 8% 92% 0% 100%
P050809
5 98% 2% 27 % 74% 1% 99%
15
Los resultados demuestran claramente que las celulas derivadas de decidua estan enriquecidas por celulas maternas (XX), mientras que las celulas derivadas de la vellosidad y la membrana amniotica estan enriquecidas por celulas fetales (XY).
II. Caracterizacion de celulas adherentes de diferentes partes de placenta 20 Morfologfa celular
La morfologfa y tamano (en diametro) de las celulas obtenidas de las diferentes regiones de placenta como se describe anteriormente se examino durante la expansion celular. Las celulas se cultivaron en DMEM (glucosa baja) que incluye FBS al 8% y se pasaron por cinco a siete doblajes de poblacion. Las Figuras 2A-C muestran la morfologfa de celulas derivadas de la decidua basal, vellosidad corionica y membrana amniotica de la placenta. El 25 contraste de fase a ampliacion x 40 se uso para todas las figuras. (A): La morfologfa de celulas adherentes derivadas de la decidua basal de placenta. (1): 8 dfas despues de aislamiento (pase 0), (2): 13 dfas despues de aislamiento (pase 1), (3): 20 dfas despues de aislamiento (pase 2), (4): 24 dfas despues del aislamiento (pase 3). (B): La morfologfa de celulas adherentes derivadas de la placenta de estroma velloso de la placenta. (1): 13 dfas despues de aislamiento (pase 0), (2): 17 dfas despues del aislamiento (pase 1), (3): 22 dfas despues de aislamiento 30 (pase 2), (4): 31 dfas despues del aislamiento (pase 4). (C): La morfologfa de celulas adherentes derivadas de membrana amniotica de placenta. (1): 3 dfas despues de aislamiento (pase 0), (2): 20 dfas despues de aislamiento (pase 2), (3): 29 dfas despues de aislamiento (pase 3), (4): 41 dfas despues del aislamiento (pase 5). Los micrograficos de fase mostraron diferencia en la morfologfa de celulas derivadas de decidua basal, vellosidad corionica y membrana amniotica de placenta humana a termino. Estos resultados estan de acuerdo con las medidas 35 de diametro celular (como se describe a continuacion).
Tamano celular
El tamano celular (en diametro) de las celulas que se originan de las tres partes diferentes de placenta se midio a cada pase usando el analizador celular automatizado Cedex (Roche Innovatis AG). Los resultados se presentan como diametro celular frente a numero de pases: La Figura 3 muestra el diametro celular promedio de todas las 40 cargas ensayadas entre los pases 2-5.
Los resultados muestran una diferencia significativa en el diametro celular por pase entre decidua, vellosidad y membrana amniotica. El tamano celular de celulas que se originan a partir de decidua, vellosidad y membrana amniotica era 15,5-17, 16,0-18,1 y 18,1-21 respectivamente.
Velocidad de doblaje de poblacion de las celulas
5 En cada pase las celulas se contaron y la velocidad de doblaje de poblacion por dfa se calculo segun la ecuacion 1: Ecuacion 1
Log (celulas viables totales en la cosecha/celulas viables totales en la siembra)Mas de cultivo
La velocidad de PD promedio de celulas derivadas de la decidua, membrana amniotica y vellosidad a traves de los pases 1 a 5 se presenta en la Figura 4.
10 La velocidad de proliferacion de celulas derivadas de decidua basal es significativamente mayor que la de las celulas derivadas de vellosidad corionica y membrana amniotica de placenta. La proliferacion de celulas de membrana amniotica se ralentiza dramaticamente entre los pases 2-4, mientras que mas alla del pase 4 hay una tendencia de mejora en la proliferacion celular.
Inmunofenotipo
15 Analisis FRCS de marcadores de membrana - las celulas se tintaron con anticuerpos monoclonales. Brevemente, se suspendieron 400.000-600.000 celulas en 0,1 ml de tampon de citometro de flujo en un tubo de ensayo de 5 ml y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente (TA), en la oscuridad, con cada uno de los anticuerpos monoclonales presentes en la Tabla 2, a continuacion. Las celulas se lavaron dos veces con tampon de citometro de flujo, se suspendio de nuevo en 500 pl de tampon de citometro de flujo y se analizo por citometna de flujo usando un 20 citometro de flujo FC-500 (Beckman Coulter). Los controles negativos se prepararon con moleculas de fluorescencia marcados con isotopo.
Tabla 2- Anticuerpos
Anticuerpo
Conjugado de fluorescencia Fabricante Numero de catalogo
CD45 anti-humano
FITC IQ Products IQP-124F
CD105 anti-humano
PE eBioscience 12-1057-73
CD 19 anti-humano
PE IQ Products IQP-515R
CD14 anti-humano
FITC IQ Products IQP-143R
CD29 anti-humano
FITC eBioscience 11-0297
CD73 anti-humano
PE BD Pharmigen 550257
CD90 anti-humano
PE BD Pharmigen 555596
CD200 anti-humano
PE BD Pharmigen 552475
La tabla 3 posterior, delinea los resultados de expresion de marcador.
25 Tabla 3 -Expresion de marcador de celulas adherentes de fuentes celulares diferentes.
Carga num.
Fuente de celulas Pase numero CD105 CD90 CD73 CD29 CD45 CD19 CD14 CD200
PO50809
Vellosidad 5 98,1 95,1 95,7 98,6 0,0 0,4 0,3 57,9
Decidua
5 99,7 98,4 99,8 99,5 0,1 0,0 0,0 1,2
Amnios
5 85,1 92,9 79,9 89,1 0,0 0,1 0,1 0,0
P190109
Vellosidad 5 99,43 99,9 99,6 99,7 0,1 0,1 0,0 60
Decidua
5 99,65 99,4 99,5 99,4 0,0 0,0 0,0 0
5
10
15
20
25
30
Amnios 5 98,3 99,6 99,3 99,6 0,1 0,1 0,0 44,5
P150609
Vellosidad 5 92,43 86,9 92,1 97,5 19,7 0,0 0,0 16,8
Decidua
5 99,25 81,7 99,4 99,2 0,1 0,1 0,0 0,3
Amnios
5 88,02 94,9 96,7 94,9 0,0 0,0 0,0 31,6
P290609
Vellosidad 5 99,6 90,8 98,4 94,6 0,0 0,1 0,2 17,8
Decidua
5 99,5 94,4 99,3 97,9 0,0 0,0 0,1 1,1
Amnios
5 98,0 92,0 97,3 91,6 0,3 0,1 0,0 13,0
PO70109
Vellosidad 5 96,06 99,9 96,1 99,1 0,0 0,1 0,0 57,8
Decidua
5 99,24 99,3 98,7 99,4 0,2 0,0 0,0 3,5
Amnios
4 86,8 87,0 83,7 82,0 0,6 0,0 0,3 8,6
De nota, las celulas derivadas de decidua mostraron muy baja expresion de CD200 en comparacion a celulas derivadas de vellosidad y amnios.
III. Propiedades de inmunomodulacion in vitro de las diversas partes de placenta
La celulas mononucleares derivadas humanas (MNC) se aislaron de la sangre periferica. La suspension de 200.000 MNC por 200 |jl de medio (medio de RPMI 1640 que contiene 20 FBS por 96 pocillos) se estimulo con 10 |jg de PHA/ml (SIGMA) en presencia de 40.000 celulas que se originan a partir de decidua, vellosidad y membrana amniotica durante 3 dfas bajo CO2 al 5% humidificado a 37°C. Se usaron las celulas derivadas de cuatro placentas diferentes. Tres replicas de cada grupo se sembraron en platos de 96 pocillos. Durante las ultimas 18 hrs del 3er dfa de cultivo, las celulas se pulsaron con EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina), a una concentracion final de 10 jM.
La proliferacion celular se analizo usando el kit Click it (Invitrogen) segun el manual.
Los resultados demuestran (Figura 5A) que las tres poblaciones celulares derivadas de 4 placentas diferentes inhiben la proliferacion de MNC activada por PHA.
La velocidad de inhibicion promedio (Figura 5B) sugiere un efecto anti-proliferativo mas fuerte de celulas derivadas de membrana amniotica y vellosidad en comparacion de celulas derivadas de decidua.
Ejemplo 3
Propiedades angiogenicas in vitro de medios acondicionados derivados (CM) a partir de varias partes de placenta Procedimientos experimentales
Las celulas de placenta de las diversas fracciones se sembraron en el plato de 6 pocillos (0,5 x 106 /pocillo) en 4 ml de medio DMEM suplementado con FCS al 8% durante 24 horas.
Despues de 24 h, se elimino el DMEM, los pocillos se lavaron suavemente con 1 ml de PBS y se sustituyeron con 4 ml de BIO-MPM (Biological Industries) suplementada con fungizona (0,25 jg/ml) Gentamicina-IKA (45 jg/ml) ECGS (1 mg/ml) Heparina (5 U/ml) y Glutamina (2 Mm) sin suero. Despues de 24 h se recogio el CM y se centrifugo durante 1 minuto en 4600 RPM. El CM se uso o bien fresco o se guardo a -80°C hasta el uso.
El CM derivado de placenta como se describe anteriormente se anadio a HUVEC (Celulas endoteliales de la vena umbilical humana) preparadas como sigue:
15.000 / celulas por pocillo se descongelaron y se sembraron en platos de 12 pocillos recubiertos de fibronectina con medio M-199 suplementado con FCS al 20% durante 24 horas. El medio se elimino y se sustituyo con una mezcla de 50% de BIO-MPM totalmente fresco {suplementado con fungizona (0,25 jg/ml) gentamicina-IKA (45 jg/ml) ECGS (1 mg/ml) Heparina (5 U/ml) y glutamina (2 Mm) suplementado con FCS al 10%} y 50% de CM derivado de placenta fresco o congelado como se describe anteriormente.
La proliferacion de HUVEC se evaluo 72 h despues de la adicion de CM por el contador celular Cedex automatizado.
Los resultados mostrados en las Figuras 6A-C indican claramente que el CM obtenido de las tres partes de placenta indujeron una elevacion en la proliferacion de HUVEC en comparacion con medio similar no acondicionado BIO-
MPM + medio de suero al 5% e incluso en comparacion a M199 + suero al 20% que es el medio de crecimiento estandar utilizado para la expansion de HUVEC.
Ejemplo 4
Modelos in vivo para el ensayo de la eficacia terapeutica 5 I. Regeneracion del musculo esqueletico
La insuficiente regeneracion de musculo esqueletico post-traumatica con eficiencia funcional consecutiva continua siendo un serio problema en la cirugfa ortopedica y traumatica. Se han emprendido multiples esfuerzos para transferir tecnicas de ingeniena tisular para mejorar con exito la regeneracion del defecto muscular (Li y Huard 2002; Bach, Beier et al. 2004; Kamelger, Marksteiner et al. 2004; Peng y Huard 2004). La aplicacion local de mioblastos en 10 un defecto muscular mejora la regeneracion, dando por resultado una mejora de fuerza de contraccion de aproximadamente 40% (Arcila, Ameredes et al. 1997; Irintchev, Langer et al. 1997; Saxena, Marler et al. 1999; DeRosimo, Washabaugh et al. 2000). Sin embargo, la transferencia de esta aproximacion en la rutina clmica esta limitada por morbidez del sitio donante. El trasplante de celulas precursoras del musculo autologo ha mostrado resultados alentadores en el tratamiento de trauma muscular aunque esta asociado con significativa morbidez del 15 sitio donante (Huard, Cao et al. 2003; Deasy, Li et al. 2004; Peng y Huard 2004). El trasplante de celulas derivadas de medula osea autologas en un modelo de rata de trauma romo de musculo esqueletico demostro su potencial para mejorar el resultado funcional despues de lesion de rotura de musculo esqueletico (Matziolis, Winkler et al. 2006). Sin embargo esta aproximacion sufre de las desventajas asociadas con el uso de una fuente autologa de celulas y el malestar asociado con aspiracion de BM.
20 El potencial terapeutico de la poblacion de celulas descrito en esta memoria en la regeneracion de musculo esqueletico se evaluo en un modelo de rata de trauma romo de musculo esqueletico como se describe por (Matziolis, Winkler et al. 2006).
Protocolo experimental
Animales: Ratas Sprague Dawley hembras de aproximadamente 12 semanas de edad de 140-160 g- 10 animales 25 por grupo.
Tratamiento de rata: Rotura del musculo soleo.
Celulas: Celulas de placenta dejadas crecer en cultivo 3D como se describe en el documento WO2010/026575 [en adelante "celulas PLX"].
Preparacion celular: Las celulas PLX crioconservadas se lavaron para eliminar DMSO y albumina. Las celulas se 30 suspendieron de nuevo en solucion salina y se diluyeron a la concentracion deseada (es decir, 5x106 en 40 pl).
Inyeccion celular:
Inmediatamente despues de la lesion (I)
1 semana despues de la lesion muscular (DEL)
Dosis celular: 2,5 x 106.
35 Volumen de inyeccion: 20 pl
Evaluacion funcional del musculo: 3 semanas despues del tratamiento Biopsias: 3 semanas despues del tratamiento Trauma muscular
Los animales se anestesiaron, y la pata trasera inferior se afeito (Favorita II, Aesculap, Tuttlingen, Alemania) y se 40 desinfecto con povidona-yodo. A traves de una incision longitudinal posterolateral de 2 cm de la piel y por debajo de la fascia desde la cabeza del gemelo lateral al tendon de Aquiles, el musculo soleo se movilizo y se rompio bruscamente. Para este proposito se uso una abrazadera curvada con puntas rodeada de tubos de polietileno para evitar lesiones de la fascia muscular. El musculo se sujeto con abrazaderas manualmente siete veces su longitud completa con excepcion del punto de entrada de las estructuras neurovasculares de suministro, que surgen de la 45 parte media del gemelo medio. Despues de irrigaciones multiples con solucion salina, el musculo superficial y la piel se suturaron.
Medida de resistencia muscular
Los animales se anestesiaron de nuevo. El nervio ciatico y el musculo soleo se expusieron de forma bilateral protegiendo todas las estructuras neurovasculares. En el lado tratado ademas del no lesionado, el tendon de Aquiles
se corto y la extremidad inferior se fijo en el dispositivo de medida de fuerza muscular (Fish, McKee et al. 1989; Racz, Illyes et al. 1997) (Experimetria, Budapest, Hungna). La parte distal del musculo soleo se conecto al transductor de fuerza a traves de una sutura (4-0, seda). Todos los musculos que se insertaron a traves del tendon de Aquiles, excepto el musculo soleo, se cortaron a traves de la parte mas cercana al tendon de Aquiles. El nervio 5 ciatico se estimulo posteriormente con 9 mA/75 Hz bipolar cinco veces, 0,1 s cada uno (8 periodos) con intervalos de 5 s entre los pulsos. Despues de esta estimulacion de contraccion rapida, la resistencia maxima muscular se midio usando un protocolo de estimulacion de 9 mA/75 Hz durante cinco veces, 3 s cada una con intervalos de 5 s, alcanzado la tetania en todos los casos. Despues de terminar las medidas de resistencia muscular, los animales se sacrificaron. Las fuerzas de contraccion bajo estimulacion de contraccion rapida ("FT") y tetanica ("TET") se 10 compararon para todos los musculos y se visualizaron en dos diagramas de dispersion (musculos lesionados y no lesionados). Todos los valores de fuerza se normalizaron de forma intra-individual frente a los musculos soleo de control derecho intactos.
Los resultados se muestran en la Figura 7.
Ejemplo de referencia II. Efectos de celulas expandidas de placenta humana (PLX) en el dolor inflamatorio y 15 neuropatico
El dolor neuropatico cronico es normal en la practica clrnica. Los pacientes con procesos tan diversos como polineuropatfa diabetica, neuropatfa sensorial por virus de inmunodeficiencia humana (VIH), smdromes posteriores al ictus, isquemia y esclerosis multiples, experimentan frecuentemente dolor diario que afecta enormemente su calidad de vida. La gestion del dolor cronico sigue siendo un reto a pesar de los numeros farmacos que o bien estan
20 aprobados o estan aun en desarrollo. Aparte de alivio inadecuado, hay preocupaciones sobre efectos secundarios y
adiccion (Dworkin, Backonja et al. 2003). Durante la inflamacion de tejidos perifericos, se producen numerosos mediadores mediante celulas endoteliales, celulas residentes y leucocitos que se reclutan al sitio de la lesion. Muchos de estos mediadores (por ejemplo, protones, citoquinas y factor de crecimiento del nervio) se conocen por obtener dolor mediante activacion de neuronas aferentes primarias especializadas denominadas nociceptores 25 (Rittner, Brack et al. 2008).
El potencial de la poblacion de celulas descrito en esta memoria para reducir el dolor se examina en modelos animales para el dolor:
Protocolo experimental
Celulas - Celulas de placenta dejadas crecer en cultivo 3D como se describen en el documento WO2010/026575 [en 30 adelante "celulas PlX"].
Modelos animales
1- Modelo inflamatorio cronico: Adyuvante de Freund - Ratas con inflamacion periferica inducida por inyeccion intraplantar de adyuvante de Freund completo (CFA). La administracion de adyuvante de Freund completo (CFA) a roedores produce un estado parecido a enfermedad que se cree que es lo mas parecido al proceso de artritis 35 reumatoide humana, que se caracteriza por inflamacion de la membrana que rodea las articulaciones ademas de dano al hueso y al cartflago. Cuando se administra en la base de la cola, un estado poliartntico se desarrolla en ambas patas traseras durante varios dfas con senales pico de inflamacion, deterioro de las articulaciones e hiperalgesia que se da a aproximadamente 3 semanas despues de la administracion. El estado poliartntico puede durar varias semanas (Cook y Nickerson 2005).
40 2- El dolor neuropatico cronico de Bennett (ligado parcial del nervio ciatico, modelo de lesion por opresion cronica
("CCI")) como se describe por Labuz et al. 2009 (Labuz, Schmidt et al. 2009).
Evaluacion del dolor
El dolor se evaluo midiendo la hiperalgesia y antinocicepcion mecanica y termica. Los umbrales nociceptivos mecanicos se evaluaron usando el algesiometro de presion de la pata (ensayo de Randall-Selitto modificado; Ugo 45 Basile; Brack, Rittner et al. 2004; Rittner, Labuz et al. 2006). En el dfa del ensayo, las ratas se dejaron sobre guata de papel, y se aplico presion gradual por medio de piston romo, con forma de cuna, en la superficie dorsal de la pata trasera mediante un calibrador automatizado. La presion necesaria que obtiene la retirada de la pata, el umbral de presion de la pata (PPT), se determino mediante tres ensayos consecutivos separados por intervalos de 10 s. El mismo procedimiento se realizo en la pata contralateral; la secuencia de patas se alterno entre los sujetos para 50 descartar efectos de orden. Los tratamientos se aleatorizaron, y el experimentador fue ciego al tratamiento. Una disminucion en PPT se interpreto como hiperalgesia (dolor), mientras que un aumento en PPT se interpreto como antinocicepcion (analgesia). Los umbrales nociceptivos termicos se midieron por el ensayo de Hargreaves (Rittner, Mousa et al. 2006). Los animales se aclimataron al aparato de ensayo. Se aplico calor radiante a la superficie plantar de una pata trasera desde debajo del suelo de cristal con una bombilla de alta intensidad, y la latencia de retirada de 55 la pata (PWL) se midio con un temporizador electronico (IITC Inc/Life Science, Woodland Hills, CA). La PWL fue el promedio de dos medidas tomadas con intervalos de 20 s. La intensidad del estfmulo se ajusto para dar PWL de 9 a
5
10
15
20
25
30
35
40
10 s en patas no inflamadas, y el corte fue 20 s para evitar el dano del tejido. Una disminucion en PWL se interpreto como hiperalgesia (dolor), mientras que un aumento en PWL se interpreto como antinocicepcion (analgesia).
Resultados
1. Modelo del dolor inflamatorio (ratas)
Se empleo un modelo de dolor inflamatorio en que las ratas reciben un adyuvante de Freund completo (CFA; 150 jl) en la pata trasera derecha de forma interplantar (i.pl.; en la superficie de la pata plantar). El dolor se midio con un ensayo de presion de pata para determinar los umbrales de presion de la pata (PPT), mientras que el volumen de la pata (PV, para estimar el edema) se evaluo con un pletismometro.
Dos dfas despues de la aplicacion de CFA las ratas se inyectaron i.pl. como sigue:
Grupo 1: vehmulo (100 jl) -4 ratas
Grupo 2: 1 millon de celulas PLX en 100 jl - 4 ratas
Grupo 3: 2 millones de celulas PLX en 100 jl - 4 ratas
PPT y PV se midieron inmediatamente antes de la inyeccion de CFA, despues 2 dfas despues de CFA (y justo despues las ratas recibieron celulas PLX) y despues de forma diaria, empezando el dfa 1 despues de la inyeccion de celulas PLX (es decir, 3 dfas despues de CFA) hasta el 10° dfas despues de CFA, en ambas patas traseras.
CFA inyectada i.pl. en una pata trasera disminuyo el PPT en esta pata de 2 dfas (2° CFA) hasta 10 dfas en comparacion con el PPT antes de la inyeccion de CFA (lmea base; Bas) (Fig. 8). CFA no cambio el PPT en patas contralaterales (Fig. 8). Las celulas PLX (2 x 106) inyectadas en patas inflamadas parecen invertir el PPT al nivel antes de la inyeccion de CFA (Fig. 8A). Las celulas pLx no cambiaron el PPT en patas contralaterales (Fig. 8B). Las celulas PLX no parecen alterar el edema de la pata (medido como PV) (Fig. 9A y 9b).
2. Modelo de dolor neuropatico (ratones)
Dos dfas despues de la lesion constrictiva cronica ("CCI"), los animales se trataron en el sitio de CCI (es decir, el
sitio de la lesion del nervio) segun los siguientes grupos:
Grupo 1:
vehmulo (30 jl) - 4 ratones
Grupo 2:
0,5 millones de celulas PLX en 30 jl - 4 ratones
Grupo 3:
1 millon de celulas PLX en 30 jl - 4 ratones
Las sensibilidades mecanica y termica se evaluaron inmediatamente antes de CCI (lmea base; Bas), 2 dfas despues de CCI (2d CCI; y justo despues de que los ratones recibieran las celulas PLX), despues diariamente durante 10 dfas (comenzando el dfa 1 despues de la inyeccion de celulas PLX), y despues en los dfas 14 y 21 despues de CCI, en ambas patas traseras.
CCI del nervio ciatico dio por resultado la sensibilidad mecanica (definida como umbrales de retirada de la pata disminuidos) y la sensibilidad termica (definida como latencias de retirada de la pata rebajadas) en patas enervadas por las patas lesionadas pero no en las patas contralaterales (Figs. 10 y 11). Las celulas PLX inyectadas en el sitio de lesion del nervio atenuaron ligeramente la sensibilidad tanto mecanica (Fig. 10A) como termica (Fig. 11 A). Las celulas PLX no produjeron alteraciones en las patas contralaterales (Figs. 10B y 11B).
III. Nivel de peptido opiaceo endogeno en celulas PLX
Los niveles de peptido opiaceo en celulas PLX [esto es, celulas de la placenta dejadas crecer en cultivo 3D como se describe en el documento WO2010/026575] se examinaron en un intento de evaluar si el efecto de anti-nocicepcion observado en los modelos de dolor neuropatico descritos estuvo mediado por opiaceos liberados de las celulas PLX.
Protocolo experimental
Las celulas se descongelaron, se centrifugaron para eliminar la disolucion de crioconservacion y se suspendieron de nuevo en DMEM de glucosa baja libre de suero suplementado con bestatina 130 jM, EDTA 1 mM y Comprimidos de coctel inhibidor de proteasa Roche con num. de cat. 04 693 124 001 a una concentracion final de 10*106 celulas PLX/250 jl.
La medida de contenido opiaceo se realizo en tres muestras de 10*106 celulas de cada carga de PLX.
• 0,25 jl de una disolucion madre de ionomicina 10 mM (concentracion final es 10 jM) se anadieron a la
suspension celular.
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• La suspension celular se agito durante 5 min a 600 rpm y 37°C en un bloque de calentamiento
• La suspension celular se centrifugo (350x g/4°C) y los granulos de celulas PLX y los sobrenadantes se recogieron y almacenaron a -20°C hasta el momento del analisis.
• Las cantidades de peptido opiaceo se determinaron usando kits EIA (Phoenix Laboratories, Inc. y Peninsula Laboratories) como se detalla a continuacion segun las instrucciones del fabricante.
Kits para la deteccion de peptidos opiaceos:
Encefalina-metionina - Kit RIA (Pensinsula Laboratories; num. S-2119) Encefalina-Leucina- Kit EIA fluorescente (Phoenix Laboratories Inc.; num. FEK-024-21)
Dinorfina A - Kit EIA fluorescente (Phoenix; num. FEK-021-03)
Endorfina, beta - kit EIA fluorescente (Phoenix; num. FEK-022-14)
Resultados
Las celulas PLX contienen beta-endorfina, dinorfina A, elu-encefalina y met-encefalina a diferentes niveles. El nivel de cada uno de estos opiaceos se determino usando los kits EIA fluorescentes segun el protocolo del fabricante (Phoenix Laboratories Inc.). Se examinaron 107 celulas de cada carga. Los niveles de estos opiaceos en 9 cargas de PLX diferentes se presentan en las Figuras 12A-E.
Ejemplo de referencia IV. Terapia celular para la regeneracion del miocardio en corazones sin carga: un modelo experimental de terapia con dispositivo asistido mecanico
El fallo cardiaco (HF) afecta a una poblacion de pacientes que crece rapidamente. A pesar de mejoras en el entendimiento y terapia de muchas etapas de enfermedad cardiovascular, ha habido poco progreso en el tratamiento de HF. En el fallo cardiaco en etapa final, los dispositivos de asistencia ventricular mecanica (VAD) se estan usando como puente al trasplante, como un puente a la recuperacion, o como la terapia definitiva. El efecto terapeutico de la poblacion de celulas descrito en esta memoria en el aumento de la eficacia del soporte VAD se ensaya en un modelo animal de infarto de miocardio (MI). El modelo normal para MI agudo es el raton, por ligado de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) (Kolk, Meyberg et al. 2009), que proporciona una herramienta util y conveniente para la investigacion en la enfermedad coronaria isquemica.
Protocolo experimental
Modelo de enfermedad - infarto de miocardio por ligado de LAD Cepa animal - Balb/C, macho. 6-8 semanas Numero total de ratones -15
Distribucion de ratones entre diferentes grupos experimentales
Grupo experimental temprano (dfa 3) (PLX) - 3
Grupo experimental tardfo (dfa 28) (PLX) - 6
Grupo de control tardfo (dfa 28) (infarto, solo vetffculo) - 6
Dosis de celulas/ratones -1*106
Celulas/vial -1*106
Anestesia usada - Quetamina-xilaxina
Procedimientos experimentales
Dfa 0 - ligado LAD e inyeccion de celulas en 100-150 pl de PBS (sin Ca, Mg)
Dfa 1 - 1er ecocardiograffa (los 3 grupos),
Dfa 3 - sacrificio de 3 ratones del grupo temprano (PLX) y someterlos a diseccion buscando el anffgeno nuclear humano (hNuc).
Dfa 7 - 2a ecocardiograffa (ambos grupos tardfos)
Dfa 14 - 3a ecocardiograffa (ambos grupos tardfos)
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D^a 21 - 4a ecocardiograffa (ambos grupos tardfos)
Dfa 28 - 5a ecocardiograffa (ambos grupos tardfos), MRI (ambos grupos tardfos).
Los ratones se sacrificaran al final de las cuatro semanas seguido por la escision de los corazones. Algunos de los corazones se usanan para aislamiento de ARN y otros se someteran a diseccion en parafina para la evaluacion de estructuras finas y criodiseccion para la deteccion de marcadores espedficos cardiacos.
Perfil marcador para inmunohistoqmmica:
1. Anffgeno nuclear humano (hNuc) - en la etapa temprana (dfa 3).
2. Cadena pesada de miosina cardiaca
Aunque la invencion se ha descrito en conjunto con realizaciones espedficas de la misma, es evidente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones seran evidentes para los expertos en la tecnica.
Ademas, la cita o identificacion de cualquier referencia en esta solicitud no se va a construir como una admision de que dicha referencia esta disponible como tecnica anterior a la presente invencion. En la medida en que se usan los encabezados de seccion, no se construinan como limitantes necesariamente.
Lista de referencia
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Tambien se describen los siguientes puntos:
1. Una poblacion de celulas adherentes derivadas de la placenta, en donde la poblacion comprende al menos 70% de celulas adherentes de una parte materna de la placenta.
2. La poblacion de celulas adherentes del punto 1, en donde dicha parte materna de la placenta comprende decidua basal, decidua parietal o tanto decidua basal como decidua parietal.
3. Una poblacion de celulas adherentes de la placenta, en donde la poblacion comprende al menos 70% de celulas adherentes de una parte fetal de la placenta.
4. La poblacion de celulas del punto 3, en donde dicha parte fetal de la placenta comprende amnios.
5. La poblacion de celulas del punto 3, en donde dicha parte fetal de la placenta consiste en amnios.
6. La poblacion de celulas del punto 3, en donde dicha parte fetal de la placenta comprende vellosidades corionicas.
7. La poblacion de celulas del punto 3, en donde dicha parte fetal de la placenta consiste en vellosidades corionicas.
8. La poblacion de celulas del punto 1 o 2, en donde no mas del 3,5%, no mas del 3%, no mas del 2% o no mas del 1% de la poblacion de celulas adherentes de una parte materna expresan CD200 como se mide por citometna de flujo usando un control de isotipo para definir la expresion negativa.
9. Un medio acondicionado aislado de un cultivo que comprende cualquiera de las poblaciones de celulas de los puntos 1-8.
10. Una composicion farmaceutica que comprende como un ingrediente activo la poblacion de celulas del punto 1, 2 u 8 o el medio acondicionado del punto 9 y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
11. Un metodo para tratar un proceso medico que puede aprovechar el trasplante de celula u organo que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapeuticamente efectiva de la composicion farmaceutica del punto 10, tratando asf al sujeto.
12. El uso de la poblacion de celulas del punto 1 o el medio acondicionado del punto 9, para la fabricacion de un medicamento para tratar un proceso que puede aprovechar el trasplante de celula u organo.
13. El metodo del punto 11 o el uso del punto 12, en donde el proceso se selecciona del grupo que consiste en isquemia, enfermedad arterial periferica (PAD), isquemia cntica de la extremidad (CLI), isquemia de la extremidad inferior, ictus, enfermedad vascular isquemica, enfermedad vascular del rinon, enfermedad cardiaca isquemica, isquemia de miocardio, enfermedad arterial coronaria (CAD), enfermedad cardiovascular aterosclerotica, enfermedad de la arteria coronaria principal izquierda, enfermedad oclusiva arterial, isquemia periferica, enfermedad vascular periferica, arteriosclerosis, retinopatfa, reparacion de retina, trastorno de remodelacion, smdrome de von Hippel-Lindau, enfermedad vascular telengiectasiaisquemica hemorragica hereditaria, enfermedad de Buerger, enfermedad renal isquemica, placenta isquemica, trastornos asociados con la reproduccion, enfermedad de huesped frente a injerto, trasplante de organo solido, trasplante de celulas madre hematopoyeticas, diabetes, dano en tejido conectivo, cancer, pre-cancer, cancer de hueso, osteosarcoma, metastasis osea, fractura osea, herida por quemado, defecto de cartflago articular, herida profunda, curado de herida retrasado, curado de ulcera retrasado, quiste oseo subcondral, osteoporosis, osteoartritis, hueso degenerado, dano en cartflago, defecto de cartflago articular, tendones lesionados, enfermedades autoinmunes, trastornos metabolicos, psoriasis, dolor neuropatico, lesion del nervio periferico, enfermedad neurodegenerativa, soporte de trasplante de rinon y enfermedades inflamatorias.
14. El metodo del punto 11 o el uso del punto 12, en donde el proceso es fallo cardiaco, infarto de miocardio, dolor neuropatico, defecto del musculo esqueletico, ictus o enfermedad cardiaca isquemica.
15. La poblacion de celulas del punto 1, 2 u 8, la composicion farmaceutica del punto 10, el metodo del punto 11, o el uso del punto 12, en donde dichas celulas adherentes expresan uno o mas de CD73, CD90, CD29, CD105 o D7- fib.
16. La poblacion de celulas del punto 1, 2, u 8, la composicion farmaceutica del punto 10, el metodo del punto 11, o el uso del punto 12, en donde dichas celulas adherentes no expresan CD3, cD4, CD45, CD80, HLA-Dr, CD11b, CD14, CD19, CD34, CD31, CD200, KDR, o CD79.
17. La poblacion de celulas del punto 1, 2 u 8, la composicion farmaceutica del punto 10, el metodo del punto 11, o el uso del punto 12, en donde dichas celulas adherentes suprimen una reaccion inmune a un menor grado que las celulas adherentes de una parte fetal de placenta cuando se ensayan en un cultivo de linfocitos mixto.
18. La poblacion de celulas del punto 1, 2 u 8, la composicion farmaceutica del punto 10, el metodo del punto 11, o el uso del punto 12, en donde dichas celulas adherentes se cultivan en un cultivo tridimensional (3D).
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19. La poblacion de celulas, composicion farmaceutica, metodo, o uso del punto 18, en donde dicho cultivo tridimensional (3D) comprende un biorreactor 3D.
20. La poblacion de celulas, composicion farmaceutica, metodo o uso del punto 18, en donde el cultivo de dichas celulas adherentes en dicho cultivo 3D se efectua bajo perfusion.
21. La poblacion de celulas, composicion farmaceutica, metodo o uso del punto 18, en donde el cultivo de dichas celulas adherentes se efectua durante al menos 3 dfas.
22. La poblacion de celulas, composicion farmaceutica, metodo o uso del punto 18, en donde el cultivo de dichas celulas adherentes se efectua hasta que al menos el 10% de dichas celulas adherentes estan proliferando.
23. La poblacion de celulas del punto 1, 2 u 8, la composicion farmaceutica del punto 10, el metodo del punto 11, o el uso del punto 12, en donde dichas celulas adherentes se cultivan en un cultivo bidimensional (2D).
24. La poblacion de celulas, la composicion farmaceutica, el metodo o el uso del punto 23, en donde al menos el 10% de dichas celulas adherentes estan proliferando.
25. La poblacion de celulas del punto 1, 2 u 8, la composicion farmaceutica del punto 10, el metodo del punto 11 o el uso del punto 12, en donde dichas celulas adherentes estan menos comprometidas con una lmea osteogenica en comparacion con las celulas adherentes de medula osea dejadas crecer y dejadas diferenciarse bajo las mismas condiciones.
26. La poblacion de celulas del punto 1, 2 u 8, la composicion farmaceutica del punto 10, el metodo del punto 11 o el uso del punto 12, en donde dichas celulas adherentes estan menos comprometidas con una lmea adipogenica en comparacion con las celulas adherentes de medula osea dejadas crecer y diferenciarse bajo las mismas condiciones.
27. La poblacion de celulas del punto 1, 2 u 8, la composicion farmaceutica del punto 10, el metodo del punto 11 o el uso del punto 12, en donde dichas celulas adherentes comprenden un diametro celular que es menor que el de las celulas adherentes derivadas de una parte fetal de placenta.
28. La poblacion de celulas del punto 1, 2 u 8, la composicion farmaceutica del punto 10, el metodo del punto 11 o el uso del punto 12, en donde dichas celulas adherentes comprenden una capacidad de proliferacion celular que es mayor que el de las celulas adherentes derivadas de una parte fetal de placenta.
29. Un metodo para tratar un defecto del musculo esqueletico que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapeuticamente efectiva de composicion que comprende celulas estromales adherentes derivadas de placenta, tratando asf el defecto del musculo esqueletico.
30. Un metodo para tratar dolor neuropatico que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapeuticamente efectiva de composicion que comprende celulas estromales adherentes derivadas de placenta, tratando asf el dolor neuropatico.
31. El metodo del punto 30, en donde el dolor neuropatico se asocia con dolor inflamatorio, polineuropatfa diabetica, neuropatfa sensorial por virus de inmunodeficiencia humano (VIH), smdromes post-ictus, isquemia o esclerosis multiple.
32. Un metodo para tratar el infarto de miocardio que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapeuticamente efectiva de composicion que comprende celulas estromales adherentes derivadas de placenta, tratando asf el infarto de miocardio.
33. El uso de una composicion que comprende celulas estromales adherentes derivadas de placenta para la fabricacion de un medicamento para tratar un defecto de musculo esqueletico, dolor neuropatico, infarto de miocardio.
34. Una composicion farmaceutica que comprende como un ingrediente activo celulas estromales adherentes derivadas de placenta para el uso en el tratamiento de un defecto de musculo esqueletico, dolor neuropatico o infarto de miocardio.
35. La composicion farmaceutica del punto 34, en donde el dolor neuropatico se asocia con dolor inflamatorio, polineuropatfa diabetica, neuropatfa sensorial por virus de inmunodeficiencia humana (VIH), smdromes post-ictus, isquemia o esclerosis multiple.
36. El metodo de cualquiera de los puntos 29-32, el uso del punto 33, o la composicion farmaceutica del punto 34 o 35, en donde dichas celulas adherentes expresan uno o mas de CD73, CD90, CD29, CD105 o D7-fib.
5
10
15
20
25
37. El metodo de cualquiera de los puntos 29-32, el uso del punto 33, o la composicion farmaceutica del punto 34 o 35, en donde dichas celulas adherentes no expresan CD3, CD4, CD45, CD80, HLA-DR, CD11b, CD14, CD19, CD34, CD31, CD200, CD271, KDR o CD79.
38. El metodo de cualquiera de los puntos 29-32, el uso del punto 33, o la composicion farmaceutica del punto 34 o 35, en donde dichas celulas adherentes expresan uno o mas de beta-endorfina, dinorfina A, leu-encefalina o met- encefalina.
39. El metodo de cualquiera de los puntos 29-32, el uso del punto 33, o la composicion farmaceutica del punto 34 o 35, en donde dichas celulas adherentes suprimen la actividad de la celula T.
40. El metodo de cualquiera de los puntos 29-32, el uso del punto 33, o la composicion farmaceutica del punto 34 o 35, en donde dichas celulas adherentes comprenden al menos el 70% de celulas adherentes de una parte materna de la placenta.
41. El metodo, uso o composicion farmaceutica del punto 40, en donde no mas del 3,5%, no mas del 3%, no mas del 2%, o no mas del 1% de las celulas adherentes de una parte materna expresan CD200 como se mide por citometna de flujo usando un control de isotipo para definir la expresion negativa.
42. El metodo, uso o composicion farmaceutica del punto 40, en donde dicha parte materna de la placenta comprende decidua basal, decidua parietal o tanto decidua basal como decidua parietal.
43. El metodo de cualquiera de los puntos 29-32, el uso del punto 33 o la composicion farmaceutica del punto 34 o 35, en donde dichas celulas adherentes se producen por cultivo usando condiciones de cultivo 3D.
44. El metodo, uso o composicion farmaceutica, del punto 43, en donde dicho cultivo tridimensional (3D) comprende un biorreactor 3D.
45. El metodo, uso o composicion farmaceutica, del punto 43, en donde el cultivo de dichas celulas adherentes en dicho cultivo 3D se efectua bajo perfusion.
46. El metodo, uso o composicion farmaceutica del punto 43, en donde el cultivo de dichas celulas adherentes se efectua durante al menos 3 dfas.
47. El metodo, uso o composicion farmaceutica del punto 43, en donde el cultivo de dichas celulas adherentes se efectua hasta que al menos el 10% de dichas celulas adherentes estan proliferando.

Claims (12)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    REIVINDICACIONES
    1. Una poblacion de celulas adherentes derivadas de la placenta para el uso en el tratamiento de un defecto del musculo esqueletico.
  2. 2. La poblacion de celulas adherentes para el uso segun la reivindicacion 1, en donde la poblacion de celulas adherentes comprende al menos el 70% de celulas adherentes de una parte materna de la placenta.
  3. 3. La poblacion de celulas adherentes para el uso segun la reivindicacion 2, en donde la parte materna de la placenta comprende decidua basal, decidua parietal o tanto decidua basal como decidua parietal.
  4. 4. La poblacion de celulas adherentes para el uso segun la reivindicacion 2 o 3, en donde no mas del 3,5%, no mas del 3%, no mas del 2%, o no mas del 1% de la poblacion de celulas adherentes expresan CD200 como se mide por citometna de flujo usando un control de isotipo para definir la expresion negativa.
  5. 5. La poblacion de celulas adherentes para el uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dichas celulas adherentes expresan uno o mas de CD73, CD90, CD29, CD105 o D7-fib.
  6. 6. La poblacion de celulas adherentes para el uso segun la reivindicacion 5, en donde dichas celulas adherentes expresan todo de CD73, CD90, CD29 y CD105.
  7. 7. La poblacion de celulas adherentes para el uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dichas celulas adherentes no expresan CD3, CD4, CD45, CD80, HLA-DR, CD11b, CD14, CD 19, CD34, CD31, CD200, KDR o CD79.
  8. 8. La poblacion de celulas adherentes para el uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dichas celulas adherentes muestran un diametro celular que es menor que el de las celulas adherentes derivadas de una parte fetal de la placenta.
  9. 9. La poblacion de celulas adherentes para el uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dichas celulas adherentes comprenden una capacidad de proliferacion celular que es mayor que la de las celulas adherentes derivadas de una parte fetal de la placenta.
  10. 10. La poblacion de celulas adherentes para el uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dichas celulas adherentes expresan uno o mas de beta-endorfina, dinorfina A, leu-encefalina o met-encefalina.
  11. 11. La poblacion de celulas adherentes para el uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dichas celulas adherentes se han cultivado en un cultivo tridimensional (3D).
  12. 12. La poblacion de celulas adherentes para el uso segun la reivindicacion 11, en donde dicho cultivo tridimensional (3D) comprende un biorreactor 3D.
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