CN108904799A - 一种抗肿瘤制剂及制备的方法 - Google Patents

一种抗肿瘤制剂及制备的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108904799A
CN108904799A CN201810742763.1A CN201810742763A CN108904799A CN 108904799 A CN108904799 A CN 108904799A CN 201810742763 A CN201810742763 A CN 201810742763A CN 108904799 A CN108904799 A CN 108904799A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
virus
tumor agent
preparation
stem cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810742763.1A
Other languages
English (en)
Inventor
夏荣木
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201810742763.1A priority Critical patent/CN108904799A/zh
Publication of CN108904799A publication Critical patent/CN108904799A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/50—Placenta; Placental stem cells; Amniotic fluid; Amnion; Amniotic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0605—Cells from extra-embryonic tissues, e.g. placenta, amnion, yolk sac, Wharton's jelly
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Abstract

本发明属于医药学技术领域，公开了一种抗肿瘤制剂及制备的方法，抗肿瘤制剂为搭载有anti‑PD‑L1/PD‑1人源化抗体的干细胞；制备方法包括：通过限制性内切酶和连接酶将上述片段连接进入商业化慢病毒或者腺病毒表达载体中；通过培养293T细胞包装含有anti‑PD‑L1/PD‑1人源化基因的目的病毒，检测滴度；用病毒感染上述羊膜干细胞；通过挑选单克隆获取稳定表达anti‑PD‑L1/PD‑1人源化抗体的细胞株，测序检测目的基因插入位置，并检测目的蛋白表达位置并将目的蛋白表达于细胞膜上。本发明anti‑PD‑L1/PD‑1人源化抗体可以通过干细胞靶向递送至肿瘤组织，减少全身用药导致的副作用。

Description

一种抗肿瘤制剂及制备的方法
技术领域
本发明属于医药学技术领域，尤其涉及一种抗肿瘤制剂及制备的方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：
基于免疫检查点的广谱抗肿瘤治疗是现代抗肿瘤药物研发以及基础分析的 突破性进展，被Science杂志评为抗肿瘤分析的历史性突破。在肿瘤微环境中， 免疫细胞虽然能够浸润到肿瘤组织内，但是由于肿瘤细胞能够通过高表达细胞 表面的PD-L1而与免疫细胞膜表面的PD-1结合，从而抑制免疫细胞发挥肿瘤杀 伤作用，达到免疫逃逸的目的。近年的分析通过制备PD-L1/PD-1的特异性抗体， 在体内阻断PD-L1与PD-1结合，避免了肿瘤细胞诱导的免疫耐受，使得肿瘤患 者受益。在不久的将来，免疫疗法必将是肿瘤治疗的首选方法，目前也有大量 的分析将抗PD-L1/PD-1为代表的免疫疗法与其他治疗方法结合起来共同抗肿 瘤，并取得了相当积极的结果。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)现有的抗PD-1/PD-L1制品主要为小分子化合物或者人源化单克隆抗 体，但是上述药物并不具有肿瘤靶向性，给药之后药物分布于全身各处，因此 会产生严重副作用，包括医源性糖尿病，严重的致死性心肌炎以及其他免疫性 疾病。
(2)单克隆抗体治疗费用昂贵，治疗周期长，部分限制了免疫检查点抗肿 瘤治疗的广泛应用。
(3)现有的抗PD-1/PD-L1制品并非对所有患者都能起作用，未经选择的 患者临床有效性只有20％，即使经过筛选后，也只有60％的患者能从中受益，这 可能与药物浓度不集中有一定关系。
解决上述技术问题的难度和意义：
(1)如果能够将抗PD-1/PD-L1制品局限在肿瘤区域，使之不在全身发生 反应，将会极大减轻药物副作用并提升患者的生活质量和依从性，减少药物相 关死亡率，增加药物的使用范围。但现有技术很难解决。
(2)该制剂制备相对更简单，制备成本低，有助于降低患者的医疗成本。
(3)羊膜干细胞本身具有免疫调节能力，因此不仅其携带的抗体能够调节 肿瘤区域的免疫微环境，干细胞本身也能够与肿瘤区域的微环境发生作用，可 能使患者获得双重疗效。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种抗肿瘤制剂及制备的方法。
本发明是这样实现的，一种抗肿瘤制剂，所述抗肿瘤制剂为搭载有 anti-PD-L1/PD-1人源化抗体的干细胞。
本发明的另一目的在于提供一种抗肿瘤制剂的制备方法包括：
通过文献以及数据库查找anti-PD-L1/PD-1人源化基因序列并合成(或者 使用纯化的PD-L1/PD-1蛋白免疫人源化小鼠，采用二氧化碳气体处死小鼠，无 菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓 瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇 作用下，促进淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。用HAT选择性培 养基进行选择培养，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转 移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤- 鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合 的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，并具有 骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。采用有限 稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法， 筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面 鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗 原的表位及其分子量后，及时进行冻存。再提取上述单克隆细胞总RNA，使用抗 体的恒定区特异性引物进行PCR扩增，所得产物即为单克隆抗体基因序列。通 过琼脂糖凝胶电泳分离核算片段并切胶回收，搜集抗体的基因片段)。
通过限制性内切酶和连接酶将上述片段连接进入商业化慢病毒或者腺病毒 表达载体中(购买商业化慢病毒或者腺病毒真核表达载体之后，通过限制性内 切酶将质粒切开，与上述抗体核酸片段以及购买的跨膜区基因序列混匀，加入 连接酶，使之两两组合链接，实验结束后通过琼脂糖凝胶分离所得核酸并对含 有目的序列的区域进行切胶回收，保存)。
通过培养293T细胞包装含有anti-PD-L1/PD-1人源化基因的目的病毒，检 测滴度(上述质粒既含有目的序列，又具有包装慢病毒或者腺病毒的能力，因 此将病毒包装辅助质粒与上述质粒共同混匀之后，使用转染试剂将之共转染进 入293T细胞，使之包装成具有一次感染能力的假病毒，假病毒存在于细胞培养 上清中。通过PCR试剂盒检测病毒滴度并-20℃保存病毒)。
用上述病毒感染上述羊膜干细胞(上述病毒搜集之后，按照一定比例混合 病毒和病毒感染增强试剂，使病毒顺利感染进入上述羊膜干细胞中。通过测序 检测目的序列在上述羊膜干细胞中的插入位置。同时通过抗抗体检测细胞总蛋 白提取液中anti-PD-L1/PD-1的表达量是否增加，通过细胞免疫组化或者免疫 荧光检测anti-PD-L1/PD-1的表达位置。通过抗原抗体结合实验检测该表达抗 体与抗原的亲和力)。
由于上述病毒感染的方法只能将目的片段无序的插入细胞基因组当中，因 此其插入位点可能会打乱细胞正常的生理活动，但是目前的基因编辑技术 CRISPR-cas9等系统能够通过sgRNA的引导将目的片段插入细胞中的固定位点， 改位点可以选择为目前已知与细胞生理活动无关的基因区域，这就可以避免干 细胞的形状发生变化。这可能是将来该方法应用时所选择的方法。
通过有限稀释法挑选表达anti-PD-L1/PD-1抗体的单克隆细胞株，通过筛 选获取稳定表达高亲和力的anti-PD-L1/PD-1人源化抗体的单克隆细胞株，冻 存以及大量扩增使之达到一定数量以便用于动物实验验证其抗肿瘤效果。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述抗肿瘤制剂制备的抗肿瘤药物。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
目前的单克隆抗体会在静脉给药后到达全身组织，对全身组织系统都会有 影响，但是以干细胞作为载体，可以利用干细胞定向迁移到肿瘤组织的特性， 携带anti-PD-L1/PD-1到达肿瘤组织而不会进入全身组织，使得药物具有靶向 性，减少副作用，提升疗效和患者的生活质量。
anti-PD-L1/PD-1人源化抗体可以通过干细胞靶向递送至肿瘤组织，减少全 身用药导致的副作用；
羊膜表皮干细胞和间充质干细胞的归巢特性可以靶向递送 anti-PD-L1/PD-1人源化抗体至肿瘤组织；
能够减少常规anti-PD-L1/PD-1疗法全身给药的副作用。
附图说明
图1是本发明实施例提供的抗肿瘤制剂的制备的方法流程图。
图2是本发明实施例提供的羊膜间充质干细胞的分离与培养图。
图3是本发明实施例提供的羊膜间充质干细胞的成骨成脂成软骨分化检测 图。
图4是本发明实施例提供的羊膜间充质干细胞羊膜间充质干细胞注射后， 在正常组织中停留较少，在肿瘤组织中大量聚集图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供的抗肿瘤制剂，所述抗肿瘤制剂为搭载有 anti-PD-L1/PD-1人源化抗体的干细胞。
图1，本发明实施例提供的抗肿瘤制剂的制备的方法，包括：
S101：通过文献以及数据库查找anti-PD-L1/PD-1人源化基因序列并合成；
S102：通过限制性内切酶和连接酶将上述片段连接进入商业化慢病毒或者 腺病毒表达载体中；
S103：通过培养293T细胞包装含有anti-PD-L1/PD-1人源化基因的目的病 毒，检测滴度；
S104：用上述病毒感染上述羊膜干细胞；
S105：通过挑选单克隆获取稳定表达anti-PD-L1/PD-1人源化抗体的细胞 株，测序检测目的基因插入位置，并检测目的蛋白表达位置并将目的蛋白表达 于细胞膜上。
通过有限稀释法挑选表达anti-PD-L1/PD-1抗体的单克隆细胞株，通过筛 选获取稳定表达高亲和力的anti-PD-L1/PD-1人源化抗体的单克隆细胞株或者 购买已经筛选合格的单克隆细胞株，冻存以及大量扩增使之达到1×106-1×108数量级。单克隆细胞株可采用专利(《一种抗PD1单克隆抗体、其药物组合物 及其用途的制作方法》中的抗PD1单克隆抗体细胞株。
下面结合具体实施例对本发明做进一步描述。
本发明实施例提供的抗肿瘤制剂的制备的方法，包括：
1.获取人胎盘
2.获取人羊膜
3.获取间充质干细胞和人羊膜表皮干细胞
4.人羊膜干细胞的培养
5.人羊膜干细胞的鉴定和功能检测
人羊膜表皮干细胞和间充质干细胞具有成骨成脂以及成软骨分化的能力，表 明其确实是干细胞，这已经得到大量的科学分析的证实。此外其还具有干细胞 的归巢特性，即静脉注射上述细胞之后，上述细胞可以定向迁移至肿瘤组织内， 具有肿瘤靶向性。最后，因为上述细胞来源于胎盘，因此具有较弱或者不具有 免疫原性，该特性为该细胞的通用性提供了绝佳的方便。与现在的胚胎干细胞 以及IPS不同的是，上述细胞也不具备致瘤性，因此其应用的安全性也在可控 范围内。
6.通过文献以及数据库查找anti-PD-L1/PD-1人源化基因序列并合成。
7.通过限制性内切酶和连接酶将上述片段连接进入商业化慢病毒或者 腺病毒表达载体中。
8.通过培养293T细胞包装含有anti-PD-L1/PD-1人源化基因的目的病 毒，检测滴度。
9.用上述病毒感染上述羊膜干细胞。
10.通过挑选单克隆获取稳定表达anti-PD-L1/PD-1人源化抗体的细胞 株，测序检测目的基因插入位置，并检测目的蛋白表达位置(通过设计使之表 达于细胞膜上)。
11.再次对筛选后的羊膜细胞进行鉴定和归巢实验验证，并观察其生长状 态是否与原来的细胞相似。
12.为了验证该携带有anti-PD-L1/PD-1人源化抗体基因的抗肿瘤效应， 进行小鼠荷瘤实验。
13.小鼠荷瘤之后，用不同的药物和本发明制备的细胞处理。
14.通过检测小鼠的无病生存期，总生存期，肿瘤体积以及其他指标验证 其抗肿瘤效果。
本发明主要利用了干细胞归巢特性，使其携带的药物具有肿瘤靶向性，降 低免疫疗法的副作用。先前的anti-PD-L1/PD-1人源化抗体以及小分子药物的 抗肿瘤效果已经得到公认，在降低副作用的目标之下，达到了目的。
所述抗肿瘤制剂的制备方法进一步包括：或者使用纯化的PD-L1/PD-1蛋白 免疫人源化小鼠，采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内 挤压研磨，制备脾细胞悬液；将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定 比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇；在聚乙二醇作用下，促进淋巴细胞与骨 髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞；用HAT选择性培养基进行选择培养；
采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养；采用灵敏、快速、特异的 免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩 增；
经过全面鉴定分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、 识别抗原的表位及其分子量后，进行冻存；
再提取所述单克隆细胞总RNA，使用抗体的恒定区特异性引物进行PCR扩增， 所得产物为单克隆抗体基因序列；通过琼脂糖凝胶电泳分离核算片段并切胶回 收，搜集抗体的基因片段。
本发明购买商业化慢病毒或者腺病毒真核表达载体之后，通过限制性内切 酶将质粒切开，与抗体核酸片段以及购买的跨膜区基因序列混匀，加入连接酶， 使之两两组合链接；再通过琼脂糖凝胶分离所得核酸并对含有目的序列的区域 进行切胶回收，保存。
本发明所述述质粒既含有目的序列，又具有包装慢病毒或者腺病毒的能力； 将病毒包装辅助质粒与质粒共同混匀之后，使用转染试剂将之共转染进入293T 细胞，包装成具有一次感染能力的假病毒，假病毒存在于细胞培养上清中；通 过PCR试剂盒检测病毒滴度并-20℃保存病毒。
本发明病毒搜集之后，按照一定比例混合病毒和病毒感染增强试剂，使病 毒感染进入羊膜干细胞中；通过测序检测目的序列在羊膜干细胞中的插入位置； 同时通过抗抗体检测细胞总蛋白提取液中anti-PD-L1/PD-1的表达量是否增加， 通过细胞免疫组化或者免疫荧光检测anti-PD-L1/PD-1的表达位置；通过抗原 抗体检测该表达抗体与抗原的亲和力。
下面结合具体分析对本发明作进一步描述。
本发明将干细胞与anti-PD-L1/PD-1人源化抗体结合起来制作抗肿瘤制剂， 干细胞目前的主要分析方向为定向分化治疗疾病以及旁分泌作用促进组织修复 等，也有部分分析者应用其归巢特性携带某些药物或者基因进入疾病区域达到 治疗目的，目前尚未有分析者应用干细胞携带anti-PD-L1/PD-1人源化抗体治 疗肿瘤；
本发明利用anti-PD-L1/PD-1人源化抗体结合干细胞的肿瘤定向迁移能力， 使药物靶向肿瘤组织并发挥作用。干细胞的归巢特性目前虽然机制并未明确， 但该特性已经得到公认(归巢效应如图4结果所示)，因此如果应用干细胞携 带药物，可以将药物富集到受损或者肿瘤区域，一方面可以增加局部药物浓度， 增加药效，另一方面也可以使正常组织免受药物影响，降低副作用；
本发明利用干细胞表达anti-PD-L1/PD-1人源化抗体于细胞膜上，特异性 阻断PD-L1/PD-1信号，激活抗肿瘤免疫。免疫疗法是目前肿瘤免疫检查点治疗 的热点，被认为是最有可能治愈癌症的手段，因此将其进行改造可能有助于肿 瘤的治疗，丰富该免疫检查点给药手段；
本发明通过病毒包装将anti-PD-L1/PD-1人源化抗体表达于干细胞表面， 这是目前尚未有分析者设想或者执行过的，而进一步设想使用CRISPR-cas9系 统来定点插入抗体基因片段目前也尚未有人执行，因此该发明方法是首次提出 该设想；
本发明将羊膜表皮干细胞和间充质干细胞的归巢特性与anti-PD-L1/PD-1 抗肿瘤疗法联合在一起；
发明的实验结果：
羊膜间充质干细胞的分离与培养；如图2.
羊膜间充质干细胞的成骨成脂成软骨分化检测如图3。
羊膜间充质干细胞羊膜间充质干细胞注射后，在正常组织中停留较少，在 肿瘤组织中大量聚集。如图4。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种抗肿瘤制剂，其特征在于，所述抗肿瘤制剂为搭载有anti-PD-L1/PD-1人源化抗体的干细胞。
2.一种如权利要求1所述抗肿瘤制剂的制备方法，其特征在于，所述抗肿瘤制剂的制备方法包括：
通过文献以及数据库查找anti-PD-L1/PD-1人源化基因序列并合成(anti PD-1LC:http://www.addgene.org/105200/；anti PD-1 HC:http://www.addgene.org/105194/；anti-PD-L1需要自己构建)；
通过限制性内切酶和连接酶将上述片段连接进入商业化慢病毒或者腺病毒表达载体中；
通过培养293T细胞包装含有anti-PD-L1/PD-1人源化基因的目的病毒，检测滴度；
用上述病毒感染羊膜干细胞；
通过有限稀释法挑选表达anti-PD-L1/PD-1抗体的单克隆细胞株，通过筛选获取稳定表达高亲和力的anti-PD-L1/PD-1人源化抗体的单克隆细胞株，冻存以及大量扩增使之达到1×106-1×108数量级。
3.如权利要求2所述抗肿瘤制剂的制备方法，其特征在于，所述抗肿瘤制剂的制备方法进一步包括：或者使用纯化的PD-L1/PD-1蛋白免疫人源化小鼠，采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液；将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇；在聚乙二醇作用下，促进淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞；用HAT选择性培养基进行选择培养。
4.如权利要求2所述抗肿瘤制剂的制备方法，其特征在于，购买商业化慢病毒或者腺病毒真核表达载体之后，通过限制性内切酶将质粒切开，与抗体核酸片段以及购买的跨膜区基因序列混匀，加入连接酶，使之两两组合链接；再通过琼脂糖凝胶分离所得核酸并对含有目的序列的区域进行切胶回收，保存。
5.如权利要求4所述抗肿瘤制剂的制备方法，其特征在于，所述述质粒既含有目的序列，又具有包装慢病毒或者腺病毒的能力；将病毒包装辅助质粒与质粒共同混匀之后，使用转染试剂将之共转染进入293T细胞，包装成具有一次感染能力的假病毒，假病毒存在于细胞培养上清中；通过PCR试剂盒检测病毒滴度并-20℃保存病毒。
6.如权利要求4所述抗肿瘤制剂的制备方法，其特征在于，病毒搜集之后，体积上按照病毒：病毒感染增强试剂＝1000:1，使病毒感染进入羊膜干细胞中；通过测序检测目的序列在羊膜干细胞中的插入位置；同时通过抗抗体检测细胞总蛋白提取液中anti-PD-L1/PD-1的表达量是否增加，通过细胞免疫组化或者免疫荧光检测anti-PD-L1/PD-1的表达位置；通过抗原抗体检测该表达抗体与抗原的亲和力。
7.一种利用权利要求1所述抗肿瘤制剂制备的抗肿瘤药物。
CN201810742763.1A 2018-07-09 2018-07-09 一种抗肿瘤制剂及制备的方法 Pending CN108904799A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810742763.1A CN108904799A (zh) 2018-07-09 2018-07-09 一种抗肿瘤制剂及制备的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810742763.1A CN108904799A (zh) 2018-07-09 2018-07-09 一种抗肿瘤制剂及制备的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108904799A true CN108904799A (zh) 2018-11-30

Family

ID=64424523

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810742763.1A Pending CN108904799A (zh) 2018-07-09 2018-07-09 一种抗肿瘤制剂及制备的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108904799A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101720354A (zh) * 2006-08-04 2010-06-02 人类起源公司 利用胎盘干细胞抑制肿瘤
CN102639692A (zh) * 2009-11-30 2012-08-15 普拉里斯坦有限公司 来源于胎盘的贴壁细胞及其在疾病治疗中的应用
CN103403150A (zh) * 2010-12-17 2013-11-20 人类起源公司 利用羊膜来源贴壁细胞治疗与免疫相关的疾病和紊乱
CN104488850A (zh) * 2014-11-28 2015-04-08 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法
CN107699541A (zh) * 2010-04-07 2018-02-16 人类起源公司 使用胎盘干细胞的血管生成

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101720354A (zh) * 2006-08-04 2010-06-02 人类起源公司 利用胎盘干细胞抑制肿瘤
CN102639692A (zh) * 2009-11-30 2012-08-15 普拉里斯坦有限公司 来源于胎盘的贴壁细胞及其在疾病治疗中的应用
CN107699541A (zh) * 2010-04-07 2018-02-16 人类起源公司 使用胎盘干细胞的血管生成
CN103403150A (zh) * 2010-12-17 2013-11-20 人类起源公司 利用羊膜来源贴壁细胞治疗与免疫相关的疾病和紊乱
CN104488850A (zh) * 2014-11-28 2015-04-08 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
程慧等: "人羊膜细胞的干细胞特性及其在妇产科临床的应用", 《中华妇产科杂志》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mitra et al. Hybridoma technology; advancements, clinical significance, and future aspects
Leggat et al. Vaccination induces HIV broadly neutralizing antibody precursors in humans
Saunders et al. Targeted selection of HIV-specific antibody mutations by engineering B cell maturation
Lamers et al. Immune responses to transgene and retroviral vector in patients treated with ex vivo–engineered T cells
JP4716350B2 (ja) 潜伏期膜タンパク質に対する抗体およびそれらの使用
US8512703B2 (en) Idiotypic vaccine
CN105461808A (zh) 单克隆抗体及其应用
ES2718399T3 (es) Moléculas que se acoplan a anticuerpos EGFRVIII biespecíficas humanas
AU2013271428B2 (en) Human bispecific EGFRvIII antibody engaging molecules
Durso et al. A novel alphavirus vaccine encoding prostate-specific membrane antigen elicits potent cellular and humoral immune responses
CN111944054B (zh) 抗bcma的car及其表达载体和应用
CN110418839A (zh) 用于临床的修饰的NK-92 haNK003细胞
CN109776678A (zh) 一种人源化pd-l1单克隆抗体、其制备方法和应用
US20120027763A1 (en) Antibody for Targeted induction of Apoptosis, CDC and ADCC mediated killing of Cancer cells, TBL-CLN1
CN101679485B (zh) 骨桥蛋白的功能表位、针对该单位的单克隆抗体及它们的应用
Papież et al. Biological therapies in the treatment of cancer—Update and new directions
CN110114674A (zh) 确定肿瘤样品中存在靶抗原的方法
US20220265847A1 (en) Methods and compositions for treating non-small cell lung cancer
De Bousser et al. T cell engaging immunotherapies, highlighting chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy
BR112020019116A2 (pt) Proteínas de ligação, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, método de produção, proteína de ligação, composição farmacêutica e kit
Ahmad et al. Therapeutic protein-based vaccines
US20230014398A1 (en) Anti-b7-h3 monoclonal antibody and methods of use thereof
He et al. Immunotherapy and CRISPR cas systems: potential cure of COVID-19?
Xie et al. mRNA-LNP HIV-1 trimer boosters elicit precursors to broad neutralizing antibodies
CN108904799A (zh) 一种抗肿瘤制剂及制备的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20181130

RJ01 Rejection of invention patent application after publication