BR112020019116A2

BR112020019116A2 - Proteínas de ligação, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, método de produção, proteína de ligação, composição farmacêutica e kit

Info

Publication number: BR112020019116A2
Application number: BR112020019116-7A
Authority: BR
Inventors: Alfredo Nicosia; Nicola Zambrano; Emanuele SASSO; Claudia De Lorenzo
Original assignee: Keires Ag
Priority date: 2018-03-22
Filing date: 2019-03-22
Publication date: 2021-01-12
Also published as: JP7430924B2; CA3093186A1; WO2019180201A2; JP2024031993A; KR20200135447A; AU2019237212A1; SG11202008802QA; CN112004830A; RU2020131241A; JP2021518168A; US20200407447A1; MX2020009550A; WO2019180201A3; EP3768713A2; IL277519A

Abstract

a presente invenção refere-se a proteínas de ligação ao antígeno antagonistas, um ácido nucleico que codifica a proteína de ligação antagonista, um vetor de expressão recombinante compreendendo a molécula de ácido nucleico, uma célula hospedeira compreendendo o vetor, um método para preparar a proteína de ligação ao antígeno antagonista, uma proteína de ligação antagonista produzida pelo método e uma composição farmacêutica compreendendo a proteína de ligação antagonista, o ácido nucleico ou o vetor. a presente invenção refere-se ainda a um kit compreendendo a composição farmacêutica e o uso da proteína de ligação antagonista no tratamento do câncer e/ou de doenças infecciosas crônicas.

Description

“PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO DE PRODUÇÃO, PROTEÍNA DE LIGAÇÃO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E KIT”

[001] A presente invenção refere-se a proteínas de ligação ao antígeno antagonistas, um ácido nucleico que codifica a proteína de ligação antagonista, um vetor de expressão recombinante compreendendo a molécula de ácido nucleico, uma célula hospedeira compreendendo o vetor, um método para preparar a proteína de ligação ao antígeno antagonista, uma proteína de ligação antagonista produzida pelo método e uma composição farmacêutica compreendendo a proteína de ligação antagonista, o ácido nucleico ou o vetor.

A presente invenção refere-se ainda a um kit compreendendo a composição farmacêutica e o uso da proteína de ligação antagonista no tratamento do câncer e/ou de doenças infecciosas crônicas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A ativação e proliferação de células imunes envolvidas em respostas antitumorais é regulada por múltiplas vias estimulatórias e inibitórias que podem ser direcionadas por anticorpos monoclonais (mAbs) que inibem os receptores imunossupressores ou ativam moduladores coestimuladores expressos na superfície dos linfócitos T e B ou células NK (chamados coletivamente de pontos de verificação imunológicos (Immune Checkpoints)) para aumentar suas respostas específicas contra o tumor.

[003] A tradução desse conceito para a clínica levou ao desenvolvimento de novas imunoterapias eficazes. Até o momento, três classes de anticorpos monoclonais humanos ou humanizados direcionados para receptores imunossupressores, como CTLA4 (Ipilimumabe), PD-1 (Nivolumabe e Pembrolizumabe) e PD-L1 (Atezolizumabe, Durvalumabe e Avelumabe) foram aprovadas para o tratamento de diversos tumores incluindo o melanoma, NSCLC, RCC, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, Linfoma de Hodgkin, carcinoma urotelial, MSI CRC e carcinoma de células de Merkell.

[004] Estimulados pelo notável sucesso dessas imunoterapias, muitos outros anticorpos contra outros receptores imunomoduladores foram trazidos para a clínica com a expectativa de encontrar tratamentos mais eficazes visando novas vias imunológicas. Na verdade, apesar de seu sucesso, os anticorpos atualmente aprovados contra pontos de verificação imunológicos (portanto, coletivamente chamados de inibidores de ponto de verificação; CI (acrônimo do inglês Checkpoint Inhibitors)) são eficazes em apenas cerca de 20% -30% dos pacientes. Entre os novos alvos estão os receptores coinibitórios, como o gene de ativação de linfócitos 3 (LAG3), um receptor imunossupressor expresso em linfócitos T ativados e linfócitos T reguladores, imunoglobulina 3 de células T (TIM-3), imunoglobulina de células T e domínio ITIM (TIGIT) que são expressos em células T CD8+ exauridas em câncer.

Além de melhorar a função de células T CD8, espera-se que o bloqueio de Lag-3, TIM-3 e TIGIT afete as células Treg do tecido tumoral e as células Tr1 produtoras de IL-10. O atenuador de linfócitos B e T (BTLA) é outro receptor coinibitório cuja expressão é induzida durante a ativação de células T levando à inibição de células T CD8+ humanas câncer-específicas. BTLA interage com um homólogo B7, B7H4, mas ao contrário de PD-1 e CTLA-4, BTLA exibe inibição de células T via interação com receptores da família de necrose tumoral (TNF-R), não apenas a família B7 de receptores de superfície celular.

[005] Da mesma forma, os anticorpos agonísticos que reconhecem os receptores coestimuladores atingiram o estágio clínico, como OX40, uma molécula de ponto de verificação imunológico coestimuladora secundária que evita a morte prematura de linfócitos ativados e 41BB expresso em linfócitos T CD4 e CD8 ativados. Outras proteínas coestimuladoras que são consideradas bons alvos para a imunoterapia mediada por anticorpos são: o coestimulador de células T indutíveis (ICOS), que é uma proteína de ponto de verificação imunológico pertencente à superfamília de CD28; e CD27, um membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral.

[006] A imunoterapia contra o câncer baseada em anticorpos imunomoduladores está se tornando um dos pilares da oncologia moderna. Os inibidores de ponto de verificação (ou seja: anti-PD-1, anti-PD-L1 e anti-CTLA4) demonstraram atingir eficácia sem precedentes com benefício clínico de longa duração. Talvez o mais importante, esses anticorpos têm uma gama extremamente ampla de aplicações, com os atualmente aprovados usados para o tratamento de vários tumores. Apesar disso, a eficácia de tratamento com IC ainda é limitada a 20% -30% da população e não pode ser demonstrada em tipos de câncer de alta prevalência, como câncer de cólon e reto, câncer de mama e câncer de próstata. Entretanto, o recente enriquecimento do arsenal de anticorpos monoclonais contra novos alvos com atividade agonística ou antagonística para receptores coestimuladores ou inibidores, respectivamente, permite projetar novas terapias combinadas para aumentar o potencial da terapia contra o câncer baseada na imunologia.

[007] Os anticorpos contra diferentes receptores de ponto de verificação imunológico também podem ser combinados para atingir atividade aditiva ou sinérgica, potencialmente traduzindo em uma melhor eficácia. A prova de conceito para esta abordagem foi fornecida pela descoberta de um aumento da eficácia da combinação de ipilimumabe e nivolumabe versus monoterapia no tratamento do melanoma metastático.

[008] Atualmente, mais de 1 mil ensaios clínicos com anticorpos já aprovados ou novos imunomoduladores contra receptores utilizados em monoterapia ou em combinação com outros agentes biológicos ou moléculas pequenas estão sendo realizados. Como grandes conjuntos de anticorpos contra os diferentes pontos de verificação imunológicos não estão disponíveis em um único laboratório, a maioria desses ensaios está sendo desenvolvida sem comparação pré-clínica direta para permitir a previsão dos tratamentos mais eficazes.

[009] Os presentes inventores geraram um grande repertório de mAbs totalmente humanos contra vários pontos de verificação imunorreguladores, usando uma estratégia para rastreio rápido e paralelo de bibliotecas de anticorpos apresentadas por fago através da seleção direta de linfócitos humanos ativados. Foi demonstrado que os mAbs assim selecionados são dotados de alta afinidade de ligação para os seus alvos e atividade funcional melhorada em linfócitos.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[010] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD- 1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compete pela ligação à PD-1 com um anticorpo; (i) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; ou (ii) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

[011] Em um segundo aspecto, a presente invenção diz respeito a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compete pela ligação ao PD-L1 com um anticorpo; (i) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; ou (ii) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; (iii) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84; ou (iv) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93; ou (v) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 101; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 102.

[012] Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compete pela ligação à LAG-3 com um anticorpo; (i) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; (ii) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; (iii) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57; (iv) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; ou (v) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75.

[013] Em um quarto aspecto, a presente invenção refere-se a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende; (i) uma combinação de um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de combinações consistindo em: um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2; um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11; (ii) uma combinação de uma região determinante de complementaridade 3 de cadeia pesada (CDRH3) e uma região determinante de complementaridade 3 de cadeia leve (CDRL3) selecionada a partir do grupo de combinações que consistem em: uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.

[014] Em um quinto aspecto, a presente invenção refere-se a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende; (i) uma combinação de um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de combinações consistindo em: um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 21; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 20;

um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 30; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 29;

um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 84; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 83;

um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 93; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 92;

um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 102; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 101; (ii) uma combinação de uma região determinante de complementaridade 3 de cadeia pesada (CDRH3) e uma região determinante de complementaridade 3 de cadeia leve (CDRL3) selecionada a partir do grupo de combinações que consistem em: uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 98; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108.

[015] Em um sexto aspecto, a presente invenção refere-se a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende (i) uma combinação de um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de combinações consistindo em:

um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 39; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 38;

um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47;

um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56;

um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 66; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 65;

um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 75; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 74;

(ii) uma combinação de uma região determinante de complementaridade 3 de cadeia pesada (CDRH3) e uma região determinante de complementaridade 3 de cadeia leve

(CDRL3) selecionada a partir do grupo de combinações que consistem em:

uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45;

uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54;

uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63;

uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72;

uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 81.

[016] Em um sétimo aspecto, a presente invenção refere-se a um ácido nucleico que codifica a proteína de ligação ao antígeno antagonista de qualquer um dos aspectos de 1 a 6 da presente invenção.

[017] Em um oitavo aspecto, a presente invenção refere-se a um vetor de expressão recombinante que compreende uma molécula de ácido nucleico de acordo com o sétimo aspecto.

[018] Em um nono aspecto, a presente invenção diz respeito a uma célula hospedeira que compreende o vetor do oitavo aspecto da presente invenção.

[019] Em um décimo aspecto, a presente invenção refere-se a um método para preparar a proteína de ligação ao antígeno antagonista de qualquer um dos aspectos de 1 a 6 da presente invenção, compreendendo a etapa de preparação da referida proteína de ligação ao antígeno a partir de uma célula hospedeira que expressa a referida proteína de ligação ao antígeno.

[020] Em um décimo primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista produzida pela expressão de DNA recombinante na célula hospedeira do nono aspecto da presente invenção.

[021] Em um décimo segundo aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos uma proteína de ligação ao antígeno antagonista de acordo com qualquer um dos aspectos de 1 a 6 da presente invenção, o ácido nucleico de acordo com o sétimo aspecto da presente invenção ou o vetor de acordo com o oitavo aspecto da presente invenção e um transportador farmaceuticamente aceitável.

[022] Em um décimo terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a um kit que compreende a composição farmacêutica de acordo com o décimo segundo aspecto da presente invenção e, opcionalmente, pelo menos outro agente ativo.

[023] Em um décimo quarto aspecto, a presente invenção refere- se à proteína de ligação ao antígeno antagonista de acordo com qualquer um dos aspectos de 1 a 6 da presente invenção, o ácido nucleico do sétimo aspecto da presente invenção, o vetor do oitavo aspecto da presente invenção ou a composição farmacêutica do décimo segundo aspecto da presente invenção para uso no tratamento do câncer e/ou doença infecciosa crônica.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[024] A seguir, é descrito o conteúdo das figuras compreendidas neste relatório descritivo. Neste contexto, consulte também a descrição detalhada da invenção acima e/ou abaixo.

[025] Figura 1: Rastreio imunológico. O procedimento de triagem/rastreio começou a partir de um ciclo universal, comum aos diferentes alvos, realizado por processo de isolamento e seleção (denominado panning) da biblioteca não selecionada em PBMCs ativados (círculo interno). Cada setor circular divergente descreve os perfis de enriquecimento para os dez melhores clones de scFv dos alvos indicados, pontuados de acordo com suas contagens por milhão. As linhas dentro de cada setor conectam os enriquecimentos individuais, obtidos após o ciclo 2 (pequenos círculos) e o ciclo 3 (grandes círculos). Os ciclos 2 e 3 foram ambos realizados nas proteínas recombinantes.

[026] Figura 2: Afinidade de ligação dos anticorpos selecionados para linfócitos. Os ensaios ELISA foram realizados com mAbs usados em concentrações crescentes (7,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM) em hPBMCs ativados (curvas pretas) ou hPBMCs não tratados (curvas cinzas). Os anticorpos foram testados por ensaios ELISA em concentrações crescentes também em cada proteína/Fc recombinante e os valores Kd são relatados nas tabelas.

[027] Figura 3: Proliferação de hPBMCs após estimulação com

PHA a 2,5 μg/mL na ausência ou presença de anticorpos imunomoduladores.

O aumento (em vezes) da proliferação de células T CD3 determinado pelos anticorpos selecionados indicados foi medido em relação à ativação de hPBMCs com PHA a 2,5 μg/mL na ausência de anticorpos ou na presença de uma IgG4 não relacionada.

[028] Figura 4: Efeitos de anticorpos anti-PD-1 e anti-PD-L1 na proliferação de linfócitos induzida por células tumorais. Aumento em vezes da proliferação de hPBMCs conforme determinado por valores de absorbância normalizados obtidos por ELISA com anticorpos anti-BrdU em amostras de hPBMCs cocultivadas com células tumorais MDA-MB-231 (A) ou MCF-7 (B) na ausência (barra branca) ou na presença de concentrações crescentes (50 nM e 200 nM) de anticorpos PD-L1_ A (barras cinza claro) ou PD-1_A (barras cinza) por 72 horas a 37ºC. O nivolumabe foi utilizado, em ambos os experimentos, como controle positivo (barras pretas).

[029] Figura 5: Efeitos dos novos anticorpos imunomoduladores na secreção de citocinas por células T estimuladas. Valores para IL-2 e IFNγ obtidos por ensaios ELISA com sobrenadantes de hPBMCs estimuladas com PHA (2,5 μg/mL) ou SEB (50 ng/ml) na ausência ou na presença dos anticorpos LAG-3_A, PD -1_A, PD-1_B, PD-L1_A, PD-L1_B por 18-66 horas a 37ºC. O nivolumabe e um anticorpo não relacionado foram usados como controle positivo e negativo, respectivamente.

[030] Figura 6: Atividades antitumorais in vivo de anticorpos PD- 1_A e PD-L1_A. Crescimento tumoral em camundongos inoculados com células CT26 no dia 0 e tratados com PD-1_A, PD-L1_A ou anticorpos de controle positivo reagindo contra PD-1 e PD-L1 murino (α_mPD-1, α-mPD-L1) no dia 3, 6 e 10. É mostrado o volume tumoral 21 dias após o desafio tumoral.

[031] Figura 7: Ligação dos anticorpos anti-PD-L1 aos linfócitos.

Para avaliar se os anticorpos PD-L1_C, PD-L1_D e PD-L1_E foram capazes de ligar à proteína PD-L1 em comparação com PD-L1_A, foram geradas curvas de ligação de todos estes mAbs para linfócitos humanos ativados. PBMCs humanos isolados de doadores saudáveis foram ativados com esferas anti- CD3/CD28 para estimular a expressão de PD-L1. Em seguida, os anticorpos PD-L1_A, PD-L1_C, PD-L1_D, PD-L1_E foram adicionados em uma ampla gama de concentrações e analisados por citometria de fluxo (citômetro de fluxo CytoFLEX, Beckman Coulter). A intensidade média de fluorescência de linfócitos ligantes ao PD-L1 foi representada graficamente contra a concentração de anticorpo (Fig.7 A, B).

[032] Figura 8: Efeitos dos anticorpos anti-PD-L1 sobre a secreção de citocinas por células T estimuladas. Valores para IL-2 e IFNγ obtidos por ensaios ELISA com sobrenadantes de hPBMCs estimuladas com PHA (2,5 μg/mL) ou SEB (50 ng/ml) na ausência ou na presença dos anticorpos PD-L1_A, PD-L1_C e PD-L1_D por 18-66 horas a 37ºC. O nivolumabe e um anticorpo não relacionado foram usados como controle positivo e negativo, respectivamente.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS - SEQ ID NO: 1 Sequência de aminoácido de PD-1_A - SEQ ID NO: 2 Sequência de aminoácido de PD-1_A; VH - SEQ ID NO: 3 Sequência de aminoácido de PD-1_A; VL - SEQ ID NO: 4 Sequência de aminoácido de PD-1_A; CDRH1 - SEQ ID NO: 5 Sequência de aminoácido de PD-1_A; CDRL1 - SEQ ID NO: 6 Sequência de aminoácido de PD-1_A; CDRH2 - SEQ ID NO: 7 Sequência de aminoácido de PD-1_A; CDRL2 - SEQ ID NO: 8 Sequência de aminoácido de PD-1_A; CDRH3

- SEQ ID NO: 9 Sequência de aminoácido de PD-1_A; CDRL3

- SEQ ID NO: 10 Sequência de aminoácido de PD-1_B

- SEQ ID NO: 11 Sequência de aminoácido de PD-1_B; VH

- SEQ ID NO: 12 Sequência de aminoácido de PD-1_B; VL

- SEQ ID NO: 13 Sequência de aminoácido de PD-1_B;

CDRH1

- SEQ ID NO: 14 Sequência de aminoácido de PD-1_B; CDRL1

- SEQ ID NO: 15 Sequência de aminoácido de PD-1_B;

CDRH2

- SEQ ID NO: 16 Sequência de aminoácido de PD-1_B; CDRL2

- SEQ ID NO: 17 Sequência de aminoácido de PD-1_B;

CDRH3

- SEQ ID NO: 18 Sequência de aminoácido de PD-1_B; CDRL3

- SEQ ID NO: 19 Sequência de aminoácido de PD-L1_A

- SEQ ID NO: 20 Sequência de aminoácido de PD-L1_A; VH

- SEQ ID NO: 21 Sequência de aminoácido de PD-L1_A; VL

- SEQ ID NO: 22 Sequência de aminoácido de PD-L1_A;

CDRH1

- SEQ ID NO: 23 Sequência de aminoácido de PD-L1_A;

CDRL1

- SEQ ID NO: 24 Sequência de aminoácido de PD-L1_A;

CDRH2

- SEQ ID NO: 25 Sequência de aminoácido de PD-L1_A;

CDRL2

- SEQ ID NO: 26 Sequência de aminoácido de PD-L1_A;

CDRH3 - SEQ ID NO: 27 Sequência de aminoácido de PD-L1_A;

CDRL3

- SEQ ID NO: 28 Sequência de aminoácido de PD-L1_B

- SEQ ID NO: 29 Sequência de aminoácido de PD-L1_B; VH

- SEQ ID NO: 30 Sequência de aminoácido de PD-L1_B; VL

- SEQ ID NO: 31 Sequência de aminoácido de PD-L1_B;

CDRH1

- SEQ ID NO: 32 Sequência de aminoácido de PD-L1_B;

CDRL1

- SEQ ID NO: 33 Sequência de aminoácido de PD-L1_B;

CDRH2

- SEQ ID NO: 34 Sequência de aminoácido de PD-L1_B;

CDRL2

- SEQ ID NO: 35 Sequência de aminoácido de PD-L1_B;

CDRH3

- SEQ ID NO: 36 Sequência de aminoácido de PD-L1_B;

CDRL3

- SEQ ID NO: 37 Sequência de aminoácido de LAG-3_A

- SEQ ID NO: 38 Sequência de aminoácido de LAG-3_A; VH

- SEQ ID NO: 39 Sequência de aminoácido de LAG-3_A; VL

- SEQ ID NO: 40 Sequência de aminoácido de LAG-3_A;

CDRH1

- SEQ ID NO: 41 Sequência de aminoácido de LAG-3_A;

CDRL1

- SEQ ID NO: 42 Sequência de aminoácido de LAG-3_A;

CDRH2

- SEQ ID NO: 43 Sequência de aminoácido de LAG-3_A;

CDRL2 - SEQ ID NO: 44 Sequência de aminoácido de LAG-3_A;

CDRH3

- SEQ ID NO: 45 Sequência de aminoácido de LAG-3_A;

CDRL3

- SEQ ID NO: 46 Sequência de aminoácido de LAG-3_C

- SEQ ID NO: 47 Sequência de aminoácido de LAG-3_C; VH

- SEQ ID NO: 48 Sequência de aminoácido de LAG-3_C; VL

- SEQ ID NO: 49 Sequência de aminoácido de LAG-3_C;

CDRH1

- SEQ ID NO: 50 Sequência de aminoácido de LAG-3_C;

CDRL1

- SEQ ID NO: 51 Sequência de aminoácido de LAG-3_C;

CDRH2

- SEQ ID NO: 52 Sequência de aminoácido de LAG-3_C;

CDRL2

- SEQ ID NO: 53 Sequência de aminoácido de LAG-3_C;

CDRH3

- SEQ ID NO: 54 Sequência de aminoácido de LAG-3_C;

CDRL3

- SEQ ID NO: 55 Sequência de aminoácido de LAG-3_D

- SEQ ID NO: 56 Sequência de aminoácido de LAG-3_D; VH

- SEQ ID NO: 57 Sequência de aminoácido de LAG-3_D; VL

- SEQ ID NO: 58 Sequência de aminoácido de LAG-3_D;

CDRH1

- SEQ ID NO: 59 Sequência de aminoácido de LAG-3_D;

CDRL1

- SEQ ID NO: 60 Sequência de aminoácido de LAG-3_D;

CDRH2 - SEQ ID NO: 61 Sequência de aminoácido de LAG-3_D;

CDRL2

- SEQ ID NO: 62 Sequência de aminoácido de LAG-3_D;

CDRH3

- SEQ ID NO: 63 Sequência de aminoácido de LAG-3_D;

CDRL3

- SEQ ID NO: 64 Sequência de aminoácido de LAG-3_B

- SEQ ID NO: 65 Sequência de aminoácido de LAG-3_B; VH

- SEQ ID NO: 66 Sequência de aminoácido de LAG-3_B; VL

- SEQ ID NO: 67 Sequência de aminoácido de LAG-3_B;

CDRH1

- SEQ ID NO: 68 Sequência de aminoácido de LAG-3_B;

CDRL1

- SEQ ID NO: 69 Sequência de aminoácido de LAG-3_B;

CDRH2

- SEQ ID NO: 70 Sequência de aminoácido de LAG-3_B;

CDRL2

- SEQ ID NO: 71 Sequência de aminoácido de LAG-3_B;

CDRH3

- SEQ ID NO: 72 Sequência de aminoácido de LAG-3_B;

CDRL3

- SEQ ID NO: 73 Sequência de aminoácido de LAG-3_E

- SEQ ID NO: 74 Sequência de aminoácido de LAG-3_E; VH

- SEQ ID NO: 75 Sequência de aminoácido de LAG-3_E; VL

- SEQ ID NO: 76 Sequência de aminoácido de LAG-3_E;

CDRH1

- SEQ ID NO: 77 Sequência de aminoácido de LAG-3_E;

CDRL1 - SEQ ID NO: 78 Sequência de aminoácido de LAG-3_E;

CDRH2

- SEQ ID NO: 79 Sequência de aminoácido de LAG-3_E;

CDRL2

- SEQ ID NO: 80 Sequência de aminoácido de LAG-3_E;

CDRH3

- SEQ ID NO: 81 Sequência de aminoácido de LAG-3_E;

CDRL3

- SEQ ID NO: 82 Sequência de aminoácido de PD-L1_C

- SEQ ID NO: 83 Sequência de aminoácido de PD-L1_C; VH

- SEQ ID NO: 84 Sequência de aminoácido de PD-L1_C; VL

- SEQ ID NO: 85 Sequência de aminoácido de PD-L1_C;

CDRH1

- SEQ ID NO: 86 Sequência de aminoácido de PD-L1_C;

CDRL1

- SEQ ID NO: 87 Sequência de aminoácido de PD-L1_C;

CDRH2

- SEQ ID NO: 88 Sequência de aminoácido de PD-L1_C;

CDRL2

- SEQ ID NO: 89 Sequência de aminoácido de PD-L1_C;

CDRH3

- SEQ ID NO: 90 Sequência de aminoácido de PD-L1_C;

CDRL3

- SEQ ID NO: 91 Sequência de aminoácido de PD-L1_D

- SEQ ID NO: 92 Sequência de aminoácido de PD-L1_D; VH

- SEQ ID NO: 93 Sequência de aminoácido de PD-L1_D; VL

- SEQ ID NO: 94 Sequência de aminoácido de PD-L1_D;

CDRH1 - SEQ ID NO: 95 Sequência de aminoácido de PD-L1_D;

CDRL1

- SEQ ID NO: 96 Sequência de aminoácido de PD-L1_D; CDRH2 - SEQ ID NO: 97 Sequência de aminoácido de PD-L1_D; CDRL2 - SEQ ID NO: 98 Sequência de aminoácido de PD-L1_D; CDRH3 - SEQ ID NO: 99 Sequência de aminoácido de PD-L1_D; CDRL3 - SEQ ID NO: 100 Sequência de aminoácido de PD-L1_E - SEQ ID NO: 101 Sequência de aminoácido de PD-L1_E; VH - SEQ ID NO: 102 Sequência de aminoácido de PD-L1_E; VL - SEQ ID NO: 103 Sequência de aminoácido de PD-L1_E; CDRH1 - SEQ ID NO: 104 Sequência de aminoácido de PD-L1_E; CDRL1 - SEQ ID NO: 105 Sequência de aminoácido de PD-L1_E; CDRH2 - SEQ ID NO: 106 Sequência de aminoácido de PD-L1_E; CDRL2 - SEQ ID NO: 107 Sequência de aminoácido de PD-L1_E; CDRH3 - SEQ ID NO: 108 Sequência de aminoácido de PD-L1_E; CDRL3

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[033] Antes de a presente invenção ser descrita em detalhes abaixo, deve ser entendido que a presente invenção não está limitada à metodologia, protocolos e reagentes específicos aqui descritos, pois estes podem variar. Também é preciso entender que a terminologia utilizada no presente é utilizada apenas para o propósito de descrever exemplos de realizações específicos, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que será limitada apenas pelas reivindicações anexas. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente têm o mesmo significado que é comumente compreendido por um técnico hábil no assunto.

[034] Preferencialmente, os termos aqui utilizados são definidos como descrito em “A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)”, Leuenberger H.G.W., Nagel B. e Kölbl H., Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basil, Suíça (1995).

[035] Ao longo do relatório descritivo e reivindicações a seguir, e a menos que o contexto dite o contrário, a palavra “compreender” e variações gramaticais como “compreendendo” e “compreendido”, será entendida por implicar a inclusão de um inteiro ou etapa ou grupo de inteiros ou etapas declarados, mas não a exclusão de qualquer outro inteiro ou etapa ou grupo de inteiros ou etapas. Nas passagens seguintes, diferentes aspectos da invenção são definidos em mais detalhes. Cada aspecto assim definido pode ser combinado com qualquer outro aspecto ou aspectos, a menos que seja declaradamente indicado de outra forma. Em particular, qualquer característica indicada como opcional, preferida ou vantajosa pode ser combinada com qualquer outra característica ou características indicadas como opcionais, preferidas ou vantajosas.

[036] Vários documentos são citados ao longo do presente relatório descritivo. Cada um dos documentos aqui citado (incluindo todas as patentes, pedidos de patentes, publicações científicas, especificações de fabricantes, instruções etc.), seja supra ou infra citados, é integralmente incorporado ao presente pela referência. Nada na presente descrição deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não tem direito a antedatar tal divulgação em virtude de invenção anterior. Alguns dos documentos citados no presente são caracterizados como sendo “incorporados pela referência”. No caso de um conflito entre as definições ou ensinamentos de tais referências incorporadas e definições ou ensinamentos citados no presente relatório descritivo, o texto do presente relatório descritivo prevalecerá.

[037] A seguir, serão descritos os elementos da presente invenção. Estes elementos estão listados com exemplos de realização específicos, no entanto, deve ser compreendido que eles podem ser combinados de qualquer maneira e em qualquer número para criar exemplos de realização adicionais. Os diversos exemplos descritos e os exemplos de realização preferidos não devem ser interpretados como realizações que limitam a presente invenção apenas às formas explicitamente descritas. Esta descrição deve ser entendida para suportar e abranger exemplos de realização que combinam os exemplos de realização explicitamente descritos com qualquer número de elementos divulgados e/ou preferidos. Além disso, quaisquer permutações e combinações de todos os elementos descritos neste pedido devem ser consideradas divulgadas pela descrição do presente pedido, a menos que o contexto indique de outra forma.

DEFINIÇÕES

[038] A seguir, são fornecidas algumas definições de termos frequentemente usados neste relatório descritivo. Esses termos terão, em cada caso de seu uso, no restante do relatório descritivo, o significado e os significados preferidos definidos respectivamente.

[039] Tal como utilizado no relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um, uma" e "o, a" abrangem os referentes no plural, a menos que o contexto expresse claramente de outra maneira.

[040] O termo “antagonista”, tal como utilizado na presente invenção, refere-se a qualquer molécula ou parte de uma molécula que bloqueia ou reduz uma resposta biológica ao se ligar e bloquear uma segunda molécula que normalmente fornece a referida resposta biológica. O termo “antagonista” inclui “antagonistas competitivos”, “antagonistas não competitivos”, agonistas parciais” e “agonistas inversos”.

[041] O termo “PD-1”, tal como utilizado na presente invenção, refere-se à proteína 1 de morte celular programada, também conhecida como CD279.

[042] O termo “PD-L1”, tal como utilizado na presente invenção, refere-se ao ligante de morte programada 1, também conhecido como CD274 ou homólogo 1 de B7 (B7-H1).

[043] O termo “LAG-3”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se ao gene de ativação de linfócitos 3, também conhecido como CD223.

[044] O termo “proteína de ligação ao antígeno”, utilizado na presente invenção, refere-se a qualquer molécula ou parte de uma molécula que pode se ligar especificamente a uma molécula alvo ou epítopo alvo. As proteínas de ligação preferidas no contexto do presente pedido são (a) anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos; (b) oligonucleotídeos; (c) proteínas semelhantes a anticorpos; ou (d) peptideomiméticos.

[045] Tal como utilizado na presente invenção, um primeiro composto (por exemplo, um anticorpo) é considerado como um composto que se “liga” a um segundo composto (por exemplo, um antígeno, tal como uma proteína alvo), se ele tiver uma constante de dissociação K d para o referido segundo composto de 1 mM ou menos, preferencialmente de 100 μM ou menos, preferencialmente de 50 μM ou menos, preferencialmente de 30 μM ou menos, preferencialmente de 20 μM ou menos, preferencialmente de 10 μM ou menos, preferencialmente de 5 µM ou menos, mais preferencialmente de 1 µM ou menos, mais preferencialmente de 900 nM ou menos, mais preferencialmente de 800 nM ou menos, mais preferencialmente de 700 nM ou menos, mais preferencialmente de 600 nM ou menos, mais preferencialmente de 500 nM ou menos, mais preferencialmente de 400 nM ou menos, mais preferencialmente de 300 nM ou menos, mais preferencialmente de 200 nM ou menos, ainda mais preferencialmente de 100 nM ou menos, ainda mais preferencialmente de 90 nM ou menos, ainda mais preferencialmente de 80 nM ou menos, ainda mais preferencialmente de 70 nM ou menos, ainda mais preferencialmente de 60 nM ou menos, ainda mais preferencialmente de 50 nM ou menos, mesmo mais preferencialmente de 40 nM ou menos, ainda mais preferencialmente de 30 nM ou menos, ainda mais preferencialmente de 20 nM ou menos, e mais preferencialmente ainda de 10 nM ou menos.

[046] Normalmente, um primeiro composto (por exemplo, um anticorpo) é considerado como se “ligando” a um segundo composto (por exemplo, um antígeno, como uma proteína alvo), se tiver uma constante de dissociação Kd para o referido segundo composto entre 10 nM e 1 mM, 10 nM e 100 μM, 10 nM e 50 μM, 10 nM e 1 µM, preferencialmente 10 nM e 900 nM, 10 nM e 800 nM, 10 nM e 700 nM, 10 nM e 600 nM, mais preferencialmente 10 nM e 500 nM, 10 nM e 400 nM, 10 nM e 300 nM, 10 nM e 200 nM, 10 nM e 100 nM, tal como 10 nM e 90 nM, 10nM e 80 nM, 10 nM e 70 nM, 10nM e 60 nM, 10 nM e 50 nM, 10 nM e 40 nM, 10nM e 30 nM, 10 nM e 20 nM. O termo “ligação” de acordo com a invenção refere-se preferencialmente a uma ligação específica. “Ligação específica” significa que uma proteína de ligação (por exemplo, um anticorpo) se liga mais forte a um alvo, tal como um epítopo para o qual a proteína é específica, em comparação com a ligação a outro alvo. Uma proteína de ligação liga-se mais forte a um primeiro alvo em comparação com um segundo alvo se ela se ligar ao primeiro alvo com uma constante de dissociação (Kd) menor que a constante de dissociação para o segundo alvo.

Preferencialmente, a constante de dissociação (Kd) para o alvo ao qual a proteína de ligação liga-se especificamente é mais de 10 vezes, preferivelmente mais de 20 vezes, mais preferencialmente mais de 50 vezes, ainda mais preferivelmente mais de 100 vezes, 200 vezes , 500 vezes ou 1000 vezes inferior à constante de dissociação (Kd) para o alvo ao qual a proteína de ligação não se liga especificamente.

[047] Por exemplo, a constante de dissociação (K d) para o alvo ao qual a proteína de ligação se liga especificamente está em um intervalo de 10 vezes a 1000 vezes menor do que a constante de dissociação (Kd) para o alvo ao qual a proteína de ligação não se liga especificamente, tal como entre 20 vezes e 1000 vezes, 50 vezes e 1000 vezes, 100 vezes e 1000 vezes, 200 vezes e 1000 vezes, 300 vezes e 1000 vezes, 400 vezes e 1000 vezes, 500 vezes e 1000 vezes menor do que a constante de dissociação (K d) para o alvo ao qual a proteína de ligação não se liga especificamente

[048] Assim, o termo “Kd” (medido em “mol/L”, às vezes abreviado como “M”) refere-se à constante de equilíbrio de dissociação da interação particular entre uma porção de ligação (por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo) e uma molécula alvo (por exemplo, um antígeno ou epítopo deste). Os métodos para determinar as afinidades de ligação dos compostos, ou seja, para determinar a constante de dissociação KD, são conhecidos por uma pessoa versada na técnica e podem ser selecionados, por exemplo, a partir dos seguintes métodos conhecidos no estado da técnica: tecnologia baseada na ressonância plasmônica de superfície (SPR), interferometria de biocamada (BLI), ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), citometria de fluxo, calorimetria de titulação isotérmica (ITC), ultracentrifugação analítica, radioimunoensaio (RIA ou IRMA) e quimioluminescência aprimorada (ECL). No contexto do presente pedido, o valor “Kd” é determinado por espectroscopia de ressonância plasmônica de superfície (Biacore™) à temperatura ambiente (25ºC). Por exemplo, as análises de ressonância plasmônica de superfície foram realizadas a 25ºC tipicamente em um instrumento Biacore X100 (GE Healthcare), equipado, por exemplo, com chips sensores CM5 (GE Healthcare), em que um tampão HBS- EP (Hepes 10 mM, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM e tensoativo P20 a 0,05% em pH 7,4) foi usado como tampão de execução (GE Healthcare).

[049] O valor “IC50” refere-se à metade da concentração inibitória máxima de uma substância e é, portanto, uma medida da eficácia de uma substância em inibir uma função biológica ou bioquímica específica. Os valores são tipicamente expressos como concentração molar. O IC 50 de um fármaco pode ser determinado em ensaios antagônicos funcionais, construindo uma curva dose-resposta e examinando o efeito inibidor da substância examinada a diferentes concentrações. Alternativamente, podem ser realizados ensaios de ligação de competição para determinar o valor de IC50. Tipicamente, os anticorpos inibidores da presente invenção exibem um valor de IC 50 entre 50 nM - 1 pM, mais preferencialmente de 10 nM a 10 pM, e ainda mais preferencialmente entre 1 nM e 50 pM, ou seja, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM ou 1 pM.

[050] A proliferação celular é aceita como um meio confiável de monitorar a ativação de linfócitos T. A proliferação de linfócitos T é monitorada eficazmente usando o éster de succinimidil carboxifluoresceína (CFSE) como descrito em Nat. Prot. 2007; 2 (9): 2049-56.

[051] A secreção de IL-2 ou IFN-γ é outro meio confiável de monitorar a ativação de linfócitos T. A detecção de proteínas citocinas secretadas é de longe o tipo de análise mais amplamente utilizado. Como a proteína secretada é a porção biologicamente relevante, sua detecção é a representação mais próxima possível de que as células estão respondendo. A proteína secretada é normalmente medida por ELISA. Aqui, hPBMCs (1x106 células) foram cultivadas e estimuladas com 2,5 μg/mL de PHA-L ou 50 ng/mL de enterotoxina B de estafilococos (SEB) por 18, 42 e 66 horas, na ausência ou na presença de mAbs anti-LAG-3, anti-PD-L1 e anti-PD-1 selecionados (20 μg/mL) ou de um anticorpo de controle isotípico, usado como controle negativo.

O nivolumabe foi testado como controle positivo em ensaios paralelos, nas mesmas condições. As concentrações de IL-2 ou IFN-γ em sobrenadantes de cultura celular foram determinadas por ensaios ELISA (DuoSet ELISA, R&D Systems), em comparação com uma curva padrão de acordo com as recomendações do fabricante. Os valores de concentração foram relatados como a média de pelo menos três determinações (desvio padrão ≤ 5%).

[052] Em estudos com animais, o tamanho do tumor é usado para avaliar as respostas à terapia anticâncer. A técnica padrão atual para a determinação do volume tumoral de tumores xenoenxertados por via subcutânea in vivo é pelo uso de um paquímetro externo, onde o volume do tumor é calculado pelo uso da fórmula elipsoide modificada 1/2(Comprimento × Largura2).

[053] O termo “competir” quando utilizado no contexto de proteínas de ligação ao antígeno que competem pelo mesmo epítopo significa a competição entre proteínas de ligação ao antígeno, conforme determinado por um ensaio em que a proteína de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo ou seu fragmento imunologicamente funcional) a ser testada previne ou inibe (por exemplo, reduz) a ligação específica de uma proteína de ligação ao antígeno de referência (por exemplo, um ligante, ou anticorpo de referência) a um antígeno comum (por exemplo, PD-1, PD-L1 e/ou LAG-3 ou um fragmento deste). Diversos tipos de ensaios de ligação competitiva podem ser usados para determinar se uma proteína de ligação ao antígeno compete com outra, por exemplo: radioimunoensaio (RIA) direto ou indireto em fase sólida,

ensaio imunoenzimático direto ou indireto (EIA), (vide, por exemplo, Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology. 9:242-253); EIA de biotina-avidina direto em fase sólida (vide, por exemplo, Kirkland et al., 1986, J.

Immunol. 137:3614-

3619) ensaio de marcação direto em fase sólida, ensaio sanduíche marcado em fase sólida (vide, por exemplo, Harlow e Lane, 1988, Antibodies, A

Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA com marcação direta em fase sólida utilizando o marcador 125I (vide, por exemplo, Morel et al., 1988,

Molec.

Immunol. 25:7-15); EIA de biotina-avidina direto em fase sólida (vide,

por exemplo, Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552); e RIA com marcação direta (Moldenhauer et al., 1990, Scand.

J.

Immunol. 32:77-82). Tipicamente,

tal ensaio envolve o uso de antígeno purificado ligado a uma superfie sólida ou células contendo qualquer uma dentre, uma proteína de ligação ao antígeno de teste não marcada e uma proteína de ligação ao antígeno de referência marcada.

A inibição competitiva é mediada pela determinação da quantidade de marcador ligado à superfície sólida ou células na presença da proteína de ligação ao antígeno de teste.

Normalmente, a proteína de ligação ao antígeno de teste está presente em excesso.

As proteínas de ligação ao antígeno identificadas pelo ensaio de competição (competição de proteínas de ligação ao antígeno) incluem proteínas de ligação ao antígeno que se ligam ao mesmo epítopo das proteínas de ligação ao antígeno de referência e proteínas de ligação ao antígeno que se ligam a um epítopo adjacente suficientemente próximo ao epítopo ligado pela proteína de ligação ao antígeno de referência para que um impedimento estérico ocorra.

Normalmente, quando uma proteína de ligação ao antígeno competidora está presente em excesso, ela inibirá (por exemplo, reduzirá) a ligação específica de uma proteína de ligação a PD-1, PD- L1 e/ou LAG-3 ou um fragmento extracelular deste em pelo menos 40-45%, 45-

50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% ou 70-75%, tal como cerca de 75% ou mais. Em alguns casos, a ligação é inibida em cerca de pelo menos 80-85%, 85-90%, 90-95% ou 95-97%, tal como cerca de 97% ou mais.

[054] Um “epítopo”, também conhecido como determinante antigênico, é a parte de uma macromolécula reconhecida pelo sistema imunológico, especificamente por anticorpos, células B ou células T. Tal como utilizado na presente invenção, um “epítopo” é a parte de uma macromolécula capaz de se ligar a uma proteína de ligação (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo), conforme descrito neste documento. Neste contexto, o termo “ligação” refere-se preferencialmente a uma ligação específica. Os epítopos geralmente consistem de agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e, geralmente possuem características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Os epítopos conformacionais e não conformacionais são distinguidos pelo fato de que a ligação ao primeiro, mas não ao último é perdida na presença de solventes desnaturantes.

[055] Conforme utilizado na presente invenção, um “epítopo conformacional” refere-se a um epítopo de uma macromolécula linear (por exemplo, um polipeptídeo) que é formado pela estrutura tridimensional da referida macromolécula. No contexto do presente pedido, um “epítopo conformacional” é um “epítopo descontínuo”, ou seja, o epítopo conformacional na macromolécula (por exemplo, um polipeptídeo) que é formado a partir de pelo menos duas regiões separadas na sequência primária da macromolécula (por exemplo, a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo). Em outras palavras, um epítopo é considerado um “epítopo conformacional” no contexto da presente invenção, se o epítopo consistir em pelo menos duas regiões separadas na sequência primária à qual uma proteína de ligação da invenção (por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno) se liga simultaneamente, de modo que estas pelo menos duas regiões separadas são interrompidas por mais uma regiões na sequência primária à qual a proteína de ligação da invenção não se liga. Preferencialmente, tal “epítopo conformacional” está presente em um polipeptídeo e as duas regiões separadas na sequência primária são duas sequências de aminoácidos separadas às quais uma proteína de ligação da invenção (por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno) se liga, de modo que estas pelo menos duas sequências de aminoácidos separadas são interrompidas por mais uma sequência de aminoácidos na sequência primária à qual a proteína de ligação da invenção não se liga. Preferencialmente, a sequência de aminoácidos de interrupção é uma sequência de aminoácidos contígua compreendendo dois ou mais aminoácidos aos quais a proteína de ligação não se liga. As (pelo menos) duas sequências de aminoácidos separadas às quais uma proteína de ligação da invenção se liga não são particularmente limitadas em relação ao seu comprimento. Tal sequência de aminoácidos separada pode consistir apenas de um aminoácido desde que o número total de aminoácidos dentro da referida pelo menos duas sequências de aminoácidos separadas seja suficientemente grande para efetuar a ligação específica entre a proteína de ligação e o epítopo conformacional.

[056] Um “parátopo” é a parte de um anticorpo que reconhece o epítopo. No contexto da presente invenção, um “parátopo” é a parte de uma porção de ligação (por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno), conforme descrito na presente invenção, que reconhece o epítopo.

[057] O termo “anticorpo” normalmente refere-se a uma glicoproteína que compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto ou uma porção de ligação ao antígeno das mesmas. O termo “anticorpo” também inclui todas as formas recombinantes de anticorpos, em particular dos anticorpos descritos na presente invenção, por exemplo, anticorpos expressos em procariotos, anticorpos não glicosilados e quaisquer fragmentos de anticorpos de ligação ao antígeno e derivados conforme descrito abaixo. Cada cadeia pesada é composta por uma região variável de cadeia pesada (abreviada no presente pedido como VH ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. Cada cadeia leve é composta por uma região variável de cadeia leve (abreviada no presente pedido como VL ou VL) e uma região constante de cadeia leve. As regiões VH e VL podem ainda ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de arcabouço ou regiões estruturais (FR - do inglês framework). Cada VH e VL é composto por três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir da extremidade amino-terminal para a extremidade carboxi-terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis de cadeia pesada e leve contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes de anticorpos podem mediar a ligação de imunoglobulina a tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo vias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (C1q) do sistema complemento clássico.

[058] O termo “fragmento de ligação ao antígeno” de um anticorpo (ou simplesmente “porção de ligação”), conforme utilizado na presente invenção, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno. Foi demonstrado que a função de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo inteiro. Exemplos de fragmentos de ligação englobados no termo “porção de ligação ao antígeno” de um anticorpo incluem (i) fragmentos Fab, fragmentos monovalentes que consistem nos domínios VL, VH, CL e CH; (ii) fragmentos F(ab′)2, fragmentos bivalentes compreendendo dois fragmentos Fab alinhados por uma ligação de dissulfeto na região de dobradiça; (iii) fragmentos Fd consistindo nos domínios VH e CH; (iv) fragmentos Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) fragmentos dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consistem em um domínio VH; (vi) regiões determinantes de complementaridade isoladas (CDR) e (vii) combinações de duas ou mais CDRs isoladas que podem ser opcionalmente unidas por um ligante sintético. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite que sejam feitos como uma cadeia única de proteína na qual as regiões VL e VH sejam pareadas para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); consulte, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; e Huston et al. (1988) Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Esses anticorpos de cadeia única também se destinam a ser abrangidos pelo termo “fragmento de ligação ao antígeno” de um anticorpo. Outro exemplo é uma proteína de fusão do domínio de ligação de imunoglobulina compreendendo (i) um polipeptídeo do domínio de ligação que é fundido a um polipeptídeo da região de dobradiça de imunoglobulina, (ii) uma região constante CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida à região de dobradiça, e (iii) uma região constante CH3 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida com a região constante CH2. O polipeptídeo do domínio de ligação pode ser uma região variável de cadeia pesada ou uma região variável de cadeia leve. As proteínas de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação são divulgadas nas publicações US 2003/0118592 e US 2003/0133939. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos utilizando técnicas convencionais conhecidas pelos especialistas na técnica e os fragmentos são rastreados quanto à utilidade da mesma maneira que os anticorpos intactos. Outros exemplos de “fragmentos de ligação ao antígeno”

são os chamados microanticorpos, que são derivados de CDRs únicas. Por exemplo, Heap et al., 2005, descreveram um microanticorpo com 17 resíduos de aminoácidos derivado da CDR3 da cadeia pesada de um anticorpo direcionado contra a glicoproteína do envelope gp120 do HIV-1. Outros exemplos incluem pequenos miméticos de anticorpos que compreendem duas ou mais regiões CDRs que são fundidas entre si, de preferência por regiões estruturais cognatas. Esse pequeno anticorpo mimético compreendendo V H CDR1 e VL CDR3 ligadas pelo cognato VH FR2 foi descrito por Qiu et al., 2007.

[059] As moléculas de imunoglobulinas da invenção podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) ou classe (por exemplo, IgG1, IgG2, preferencialmente IgG2a e IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina.

[060] Os anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno utilizáveis na invenção podem ser de qualquer origem animal, incluindo pássaros e mamíferos. De preferência, os anticorpos ou fragmentos são de origem humana, chimpanzé, roedor (por exemplo, camundongo, rato, porquinho da índia ou coelho), frango, peru, porco, ovelha, cabra, camelo, vaca, cavalo, burro, gato ou cão. É particularmente preferido que os anticorpos sejam de origem humana ou murina. Os anticorpos da invenção também incluem moléculas quiméricas nas quais uma região constante de anticorpo derivada de uma espécie, preferencialmente humana, é combinada com o sítio de ligação ao antígeno derivado de outra espécie, por exemplo, camundongo.

Além disso, os anticorpos da invenção incluem moléculas humanizadas nas quais os sítios de ligação ao antígeno de um anticorpo derivado de uma espécie não humana (por exemplo, de camundongo) são combinados com regiões constantes e estruturais de origem humana.

[061] Conforme exemplificado na presente invenção, os anticorpos da invenção podem ser obtidos diretamente de hibridomas que expressam o anticorpo, ou podem ser clonados e expressos de forma recombinante em uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula CHO ou uma célula linfocítica). Outros exemplos de células hospedeiras são microrganismos, como E. coli, e fungos, como levedura. Alternativamente, eles podem ser produzidos de forma recombinante em um animal não humano ou planta transgênica.

[062] O termo “anticorpo quimérico” refere-se àqueles anticorpos em que uma porção de cada uma das sequências de aminoácidos das cadeias pesada e leve é homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe particular, enquanto o segmento restante da cadeia é homóloga às sequências correspondentes de outra espécie ou classe. Tipicamente, a região variável de ambas as cadeias leve e pesada mimetiza as regiões variáveis de anticorpos derivados de uma espécie de mamíferos, enquanto as porções constantes são homólogas a sequências de anticorpos derivados de outra. Uma clara vantagem para tais formas quiméricas é que a região variável pode ser convenientemente derivada de fontes presentemente conhecidas utilizando células B prontamente disponíveis ou hibridomas de organismos hospedeiros não humanos em combinação com regiões constantes derivadas de, por exemplo, preparações de células humanas. Embora a região variável tem a vantagem da facilidade de preparação e a especificidade não afetada pela fonte, a região constante sendo humana tem uma menor probabilidade de induzir uma resposta imune a partir de um sujeito humano quando os anticorpos são injetados do que a região constante de uma fonte não humana.

No entanto, a definição não está limitada a este exemplo específico.

[063] O termo “anticorpo humanizado” refere-se a uma molécula possuindo um sítio de ligação ao antígeno que é substancialmente derivada de uma imunoglobulina de uma espécie não humana, em que a estrutura de imunoglobulina remanescente da molécula é baseada na estrutura e/ou sequência de uma imunoglobulina humana. O sítio de ligação ao antígeno pode compreender domínios variáveis completos fundidos em domínios constantes ou apenas as regiões determinantes de complementaridade (CDR) enxertadas em regiões estruturais apropriadas nos domínios variáveis. Os sítios de ligação ao antígeno podem ser do tipo selvagem ou modificados por uma ou mais substituições de aminoácidos, por exemplo, modificados para se assemelharem mais as imunoglobulinas humanas. Algumas formas de anticorpos humanizados preservam todas as sequências de CDR (por exemplo, um anticorpo de camundongo humanizado que contém todas as seis CDR do anticorpo de camundongo). Outras formas têm uma ou mais CDRs que são alteradas em relação ao anticorpo original.

[064] Diferentes métodos para humanizar anticorpos são conhecidos pelos especialistas, como revisto por Almagro & Fransson, 2008, cujo conteúdo é incorporado ao presente pela referência em sua totalidade. O artigo de revisão por Almagro & Fransson é brevemente resumido a seguir.

Almagro & Fransson distinguem entre abordagens racionais e abordagens empíricas. Abordagens racionais são caracterizadas por gerar poucas variantes do anticorpo manipulado e avaliar sua ligação ou qualquer outra propriedade de interesse. Se as variantes projetadas não produzirem os resultados esperados, um novo ciclo de projeto e avaliação de ligação é iniciado. As abordagens racionais incluem enxerto de CDR, resurfacing, Super- humanização e Otimização do conteúdo de sequência humana (Human String Content Optimization). Em contraste, abordagens empíricas são baseadas na geração de grandes bibliotecas de variantes humanizadas e seleção dos melhores clones usando tecnologias de enriquecimento ou triagem de alto rendimento. Consequentemente, as abordagens empíricas dependem de um sistema confiável de seleção e/ou triagem que seja capaz de pesquisar através de um vasto espaço de variantes de anticorpos. As tecnologias de apresentação in vitro, tais como apresentação em fagos e apresentação em ribossomo cumprem estes requisitos e são bem conhecidas pelo técnico hábil no assunto. As abordagens empíricas incluem bibliotecas de FR, seleção guiada, embaralhamento de FR e humanização.

ENXERTO DE CDR

[065] Um protocolo de enxerto de CDR normalmente compreende três pontos de tomada de decisão: (1) definição de regiões determinantes da especificidade do anticorpo doador, ou seja, o alvo para enxerto, (2) identificação de uma fonte de sequências humanas a serem utilizadas como doadores de FR, e (3) seleção de resíduos fora da região que define a especificidade, ou seja, determinação das posições dos aminoácidos que são alvos para a mutação reversa para restaurar ou melhorar a afinidade do anticorpo humanizado.

[066] (1) Regiões determinantes da especificidade do anticorpo

[067] A estrutura experimental do anticorpo não humano em complexo com o antígeno fornece um mapa detalhado dos resíduos em contato com o antígeno e, portanto, dos responsáveis por determinar sua especificidade. A informação estrutural pode ser complementada com mutagênese de varredura de alanina e/ou mutagênese combinatória para identificar os resíduos que mais contribuem para a energia de ligação ou para o parátopo funcional. Uma vez que o parátopo funcional é um subconjunto dos resíduos em contato, enxertar apenas o parátopo funcional reduziria o número de resíduos não humanos no produto humanizado. No entanto, apenas em casos raros a estrutura experimental do complexo antígeno-anticorpo e/ou o parátopo funcional estão disponíveis no início de um protocolo de humanização. Na ausência de uma definição precisa dos resíduos responsáveis por uma determinada especificidade de anticorpo, as CDRs são frequentemente empregadas como regiões que definem a especificidade.

Também é possível usar uma combinação de CDR e alça HV como alvos para enxerto. Para reduzir o número de resíduos que serão enxertados nas FRs humanas, foi descrito o enxerto de SDR, isto é, o enxerto de resíduos determinantes de especificidade (SDRs).

[068] (2) Fonte de FRs humanas

[069] A segunda etapa em um protocolo de enxerto de CDR típico é identificar doadores de FR humanas. Os trabalhos iniciais utilizaram FRs de anticorpos humanos de estrutura conhecida, independentemente de sua homologia com o anticorpo não humano. Esta abordagem é conhecida como “método de FR fixa”. Trabalhos posteriores usaram sequências humanas com a maior homologia com o anticorpo não humano. Essa abordagem foi denominada “Melhor Ajuste” (Best Fit). Embora as estratégias de “melhor ajuste” tendam a resultar em anticorpos com maior afinidade, outros parâmetros, como baixa imunogenicidade e rendimentos de produção, também devem ser levados em consideração ao escolher uma FR para humanização.

Assim, combinações de “melhor ajuste” e “FR fixa” também são possíveis. Por exemplo, a parte VL pode ser humanizada de acordo com o método de FR fixa e a parte VH pode ser humanizada de acordo com o método de melhor ajuste, ou vice-versa.

[070] Duas fontes de sequências humanas foram utilizadas: sequências maduras e germinativas. As sequências maduras, que são produtos de respostas imunes, carregam mutações somáticas geradas por processos aleatórios e não estão sob a seleção de espécies, resultando em potenciais resíduos imunogênicos. Assim, para evitar resíduos imunogênicos, os genes da linha germinativa humana têm sido cada vez mais utilizados como fonte de doadores de FR. As sequências nucleotídicas das FRs da linhagem germinativa humana são divulgadas, por exemplo, nos apêndices A e B do artigo de Dall'Acqua et al, 2005. Além disso, os anticorpos baseados no gene de linhagem germinativa tendem a ser mais flexíveis em comparação com os anticorpos maduros. Acredita-se que esta maior flexibilidade acomode melhor as diversas CDRs com menos ou nenhuma mutação reversa na FR para restaurar a afinidade do anticorpo humanizado.

[071] (3) Mutações reversas (back mutations) para restaurar ou aumentar a afinidade

[072] Comumente, a afinidade diminui após enxerto de CDR como consequência de incompatibilidades entre CDRs não humanas e FRs humanas. Portanto, a terceira etapa em um protocolo de enxerto de CDR típico é definir mutações que restaurariam ou evitariam perdas de afinidade. As mutações reversas devem ser cuidadosamente projetadas com base na estrutura ou modelo do anticorpo humanizado e testadas experimentalmente.

Um site para modelagem automatizada de anticorpos chamado WAM pode ser encontrado em URL http://antibody.bath.ac.uk. O software para modelagem da estrutura de proteínas pode ser baixado dos sites http://salilab.org/modeller/modeller.html (Modeller) e http://spdbv.vital-it.ch (Swiss PdbViewer).

RESURFACING

[073] A técnica de resurfacing é semelhante ao enxerto de CDR e compartilha os dois primeiros pontos de tomada de decisão. Em contraste ao enxerto de CDR, o resurfacing retém os resíduos não expostos do anticorpo não humano. Apenas os resíduos da superfície (expostos) no anticorpo não humano são alterados para resíduos humanos.

SUPER-HUMANIZAÇÃO

[074] Enquanto o enxerto de CDR baseia-se na comparação de FR entre as sequências não humanas e humanas, a super-humanização é baseada em uma comparação de CDR, de modo que a homologia da FR é irrelevante. A abordagem inclui uma comparação da sequência não humana com o repertório de genes da linhagem germinativa humana funcional. Os genes que codificam as mesmas estruturas canônicas ou estruturas canônicas intimamente relacionadas às sequências murinas são então selecionados. Em seguida, dentro dos genes que compartilham as estruturas canônicas com o anticorpo não humano, aqueles com maior homologia dentro das CDRs são escolhidos como doadores da FR. Finalmente, as CDRs não humanas são enxertadas nesses FRs.

OTIMIZAÇÃO DO CONTEÚDO DE SEQUÊNCIA HUMANA (HUMAN STRING CONTENT OPTIMIZATION)

[075] Esta abordagem é baseada em uma métrica de “humanidade” do anticorpo, denominada Otimização do Conteúdo de Sequência Humana (HSC do inglês Human String Content). Em suma, esta abordagem compara a sequência do camundongo com o repertório de genes da linhagem germinativa humana. As diferenças são pontuadas como HSC. A sequência alvo é humanizada maximizando suas HSCs em vez de usar uma medida de identidade global para gerar diversas variantes humanizadas.

BIBLIOTECAS DE REGIÃO ESTRUTURAL (ABREVIADA COMO: BIBLIOTECAS FR)

[076] Na abordagem da biblioteca FR, uma coleção de variantes de resíduos é introduzida em posições específicas na FR seguida pelo panning da biblioteca para selecionar a FR que melhor suporta a CDR enxertada.

Assim, esta abordagem se assemelha ao enxerto de CDR, mas em vez de criar algumas mutações reversas na FR, é construída uma biblioteca combinatória com tipicamente mais de 100 variantes mutacionais.

SELEÇÃO ORIENTADA

[077] Esta abordagem inclui a combinação do domínio V H ou VL de um determinado anticorpo não humano específico para um determinado antígeno com uma biblioteca VH e VL humana. Subsequentemente, os domínios V humanos específicos são selecionados contra o antígeno de interesse. Por exemplo, um anticorpo não humano pode ser humanizado combinando primeiro a VH não humana com uma biblioteca de cadeias leves humanas. A biblioteca é então selecionada contra o antígeno alvo por exibição de fago e a VL selecionada é clonada em uma biblioteca de cadeias V H humanas e selecionada contra o antígeno alvo. Também é possível começar combinando a VL não humana com uma biblioteca de cadeias pesadas humanas. A biblioteca é então selecionada contra o antígeno alvo por exibição de fago e a VH selecionada é clonada em uma biblioteca de cadeias V L humanas e selecionada contra o antígeno alvo. Como resultado, um anticorpo totalmente humano com afinidade semelhante ao anticorpo não humano pode ser isolado. Para evitar a ocorrência de um desvio de epítopo, é possível implementar um ELISA de inibição, que permite a seleção de clones que reconhecem o mesmo epítopo do anticorpo parental. Alternativamente, a retenção da CDR pode ser aplicada para evitar um desvio de epítopo. Na retenção de CDR, uma ou mais CDRs não humanas são retidas, de preferência a CDR3 de cadeia pesada, uma vez que esta CDR está no centro do sítio de ligação ao antígeno.

EMBARALHAMENTO (SHUFFLING) DA REGIÃO ESTRUTURAL (ABREVIADO COMO: FR SHUFFLING)

[078] Na abordagem de FR shuffling, as FRs inteiras são combinadas com as CDRs não humanas. Usando a abordagem de FR shuffling, Dall'Acqua e colaboradores humanizaram um anticorpo murino.

Todas as seis CDRs do anticorpo murino foram clonadas em uma biblioteca contendo todos as FRs do gene da linhagem germinativa humana (Dall'Acqua et al., 2005). As bibliotecas foram pesquisadas quanto à ligação de um processo de seleção em duas etapas, primeiro humanizando a VL, seguido da

VH. Em um estudo posterior, um processo de embaralhamento da FR de uma etapa foi usado com sucesso (Damschroder et al., 2007). As sequências oligonucleotídicas que codificam todas as regiões estruturais de cadeia leve de linhagem germinal humana conhecidas (k) são reveladas em Dall'Acqua et al., 2005, no Apêndice A. As sequências oligonucleotídicas que codificam todas as regiões estruturais de cadeia pesada de linhagem germinal humana conhecidas são reveladas em Dall'Acqua et al., 2005, no Apêndice B.

HUMANO-ENGENHARIA DE ANTICORPOS (HUMANEERING)

[079] A humaneering permite o isolamento de anticorpos que são 91-96% homólogos aos anticorpos do gene da linhagem germinativa humana.

O método é baseado na identificação experimental de determinantes de especificidade mínima essencial (MSDs) e na substituição sequencial de fragmentos não humanos em bibliotecas de FRs humanas e avaliação da ligação. A abordagem inicia-se com as regiões de CDR3 de cadeias VH e VL não humanas e progressivamente substitui outras regiões do anticorpo não humano nas FRs humanas, incluindo a CDR1 e CDR2 de ambas as cadeias, VH e VL.

[080] Os métodos para humanização de anticorpos explicados acima são preferidos ao gerar anticorpos humanizados que se ligam especificamente aos epítopos conformacionais descritos na presente invenção.

Entretanto, a presente invenção não está limitada aos métodos mencionados acima para humanizar anticorpos.

[081] Alguns dos métodos de humanização mencionados acima podem ser realizados sem informações sobre as sequências FR no anticorpo doador, a saber, o “Método de FR fixa” (uma variante do enxerto de CDR), super-humanização, framework-shuffling e Humaneering. Variações do “método de RF fixo” foram realizadas com sucesso por Qin et al., 2007 e Chang et al., 2007. Em particular, Qin et al. construiu um fragmento de anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada humana na qual as três regiões da CDR foram substituídas por peptídeos antigênicos, que foram derivados das sequências CDR de um anticorpo murino. Chang et al.

continuou estes experimentos e construiu um fragmento scFv, no qual todas as CDRs da parte VH e CDR3 da parte VL foram substituídas por peptídeos antigênicos, os quais foram derivados das sequências CDR de um anticorpo murino.

[082] Como aqui utilizado, “anticorpos humanos” incluem anticorpos possuindo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio-específica in vitro ou por mutação somática in vivo). Os anticorpos humanos da invenção incluem anticorpos isolados a partir de bibliotecas de imunoglobulina humana ou de animais transgênicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas e que não expressam imunoglobulinas endógenas, conforme descrito, por exemplo, na Patente US 5.939.598 de Kucherlapati & Jakobovits.

[083] O termo “anticorpo monoclonal”, conforme utilizado no presente, refere-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Um anticorpo monoclonal exibe uma especificidade e afinidade de ligação única para um epítopo particular. Em um exemplo de realização, os anticorpos monoclonais são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida a partir de um animal não humano, por exemplo, camundongo, fundido a uma célula imortalizada.

[084] O termo “anticorpo recombinante”, conforme utilizado na presente invenção, inclui todos os anticorpos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados a partir de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico com relação aos genes de imunoglobulina ou hibridoma preparado a partir do mesmo, (b) anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, por exemplo, de um transfectoma, (c) anticorpos isolados a partir de uma biblioteca de anticorpos combinatórios recombinantes e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva o processamento de sequências de genes de imunoglobulina para outras sequências de DNA.

[085] O termo “transfectoma”, tal como utilizado na presente invenção, inclui células hospedeiras eucarióticas recombinantes que expressam um anticorpo, como células CHO, células NS/0, células HEK293, células HEK293T, células vegetais ou fungos, incluindo células de levedura.

[086] Conforme usado no presente documento, um “anticorpo heterólogo” é definido em relação a um organismo transgênico que produz tal anticorpo. Este termo refere-se a um anticorpo possuindo uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácido nucleico codificante correspondente àquela encontrada em um organismo que não consiste no organismo transgênico, e sendo geralmente derivado de uma espécie diferente do organismo transgênico.

[087] Tal como utilizado na presente invenção, um “anticorpo hetero-híbrido” refere-se a um anticorpo com cadeias leves e pesadas de diferentes origens organismais. Por exemplo, um anticorpo possuindo uma cadeia pesada humana associada a uma cadeia leve murina é um anticorpo hetero-híbrido.

[088] Assim, “anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos” adequados para uso na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, anticorpo policlonal, monoclonal, monovalente, biespecífico, heteroconjugado, multiespecífico, recombinante, heterólogo, hetero-híbrido,

quimérico, humanizado (em particular CDR-enxertado), desimunizado ou anticorpos humanos, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab') 2, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, Fd, Fv, Fvs ligados por dissulfeto (dsFv), anticorpos de cadeia única (por exemplo, scFv), diacorpos (diabodies) ou tetracorpos (tetrabodies) (Holliger P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (14), 6444-6448), nanocorpos (nanobodies) (também conhecidos como anticorpos de domínio único), anticorpos anti- idiotípicos (anticorpos anti-Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-Id para os anticorpos da invenção) e fragmentos de ligação ao epítopo de qualquer um dos citados acima.

[089] Os anticorpos descritos na presente invenção são preferencialmente isolados. Um “anticorpo isolado”, conforme utilizado no presente, pretende referir-se a um anticorpo que está substancialmente isento de outros anticorpos com especificidades antigênicas diferentes.

[090] O termo “ocorrência natural”, conforme utilizado na presente invenção, quando aplicado a um objeto, refere-se ao fato de que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, um polipeptídeo ou polinucleotídeo que está presente em um organismo (incluindo um vírus) e pode ser isolado a partir de uma fonte na natureza e que não tenha sido intencionalmente modificado pelo homem no laboratório é ‘natural’ ou de ‘ocorrência natural’.

[091] Tal como utilizado na presente invenção, o termo “aptâmero de ácido nucleico” refere-se a uma molécula de ácido nucleico que foi projetada através de rodadas repetidas de seleção in vitro ou SELEX (evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial) para se ligar a uma molécula alvo (para uma revisão, consulte: Brody E.N. e Gold L. (2000), Aptamers as therapeutic and diagnostic agents. J. Biotechnol. 74 (1): 5-13). O aptâmero de ácido nucleico pode ser uma molécula de DNA ou RNA. Os aptâmeros podem conter modificações, por exemplo, nucleotídeos modificados, como pirimidinas substituídas com 2'-flúor.

[092] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “proteína semelhante a anticorpo” refere-se a uma proteína que foi modificada (por exemplo, por mutagênese de alças) para se ligar especificamente a uma molécula alvo. Tipicamente, tal proteína semelhante a anticorpo compreende pelo menos uma alça peptídica variável presa em ambas as extremidades a uma proteína arcabouço (scaffold protein). Esta dupla restrição estrutural aumenta grandemente a afinidade de ligação da proteína semelhante a anticorpo a níveis comparáveis aos de um anticorpo. O comprimento da alça peptídica variável consiste tipicamente em 10 a 20 aminoácidos. A proteína arcabouço pode ser qualquer proteína com boas propriedades de solubilidade.

De preferência, a proteína scaffold é uma pequena proteína globular. As proteínas do tipo anticorpo incluem, sem limitação, afibodies, anticalinas e proteínas de repetições de anquirina (para revisão veja: Binz HK et al. (2005) Engineering novel binding proteins from nonimmunoglobulin domains. Nat.

Biotechnol. 23 (10): 1257-1268). As proteínas semelhantes a anticorpos podem ser derivadas de grandes bibliotecas de mutantes, por exemplo, podem ser pesquisadas a partir de grandes bibliotecas de exibição em fagos e podem ser isoladas em analogia com anticorpos regulares. Além disso, proteínas de ligação semelhantes a anticorpos podem ser obtidas por mutagênese combinatória de resíduos expostos na superfície em proteínas globulares. Às vezes, as proteínas semelhantes a anticorpos são chamadas de “aptâmeros peptídicos”.

[093] Conforme usado na presente invenção, um “peptídeo mimético” ou “peptideomimético” é uma pequena cadeia semelhante à proteína projetada para mimetizar um peptídeo. Os peptideosmiméticos surgem tipicamente da modificação de um peptídeo existente para alterar as propriedades da molécula. Por exemplo, eles podem surgir a partir de modificações para alterar a estabilidade ou atividade biológica da molécula.

Isto pode ter um papel no desenvolvimento de compostos semelhantes a fármacos a partir de peptídeos existentes. Estas modificações envolvem alterações no peptídeo que não ocorrerão naturalmente (tais como estruturas principais alteradas e a incorporação de aminoácidos não naturais).

[094] A “porcentagem da identidade de sequência” é determinada pela comparação de duas sequências otimamente alinhadas ao longo de uma janela de comparação, em que a porção da sequência na janela de comparação pode conter adições ou deleções (ou seja, lacunas ou “gaps”) quando comparada com a sequência de referência (que não possui as adições ou deleções) para o alinhamento ótimo das duas sequências. A porcentagem é calculada pela determinação do número de posições em que a mesma base de ácido nucleico ou de resíduos de aminoácido ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100 para dar a percentagem de identidade das seqüências.

[095] O termo “idêntico” é utilizado na presente invenção no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências polipeptídicas para referir-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas, ou seja, que compreendem a mesma sequência de nucleotídeos ou aminoácidos. As sequências são “substancialmente idênticas” umas às outras se elas tiverem uma percentagem específica de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos iguais (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade sobre uma região especificada), quando comparadas e alinhadas para a correspondência máxima em uma janela de comparação, ou região designada, medida usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequência ou pelo alinhamento manual e inspeção visual. Estas definições também se aplicam para o complemento de uma sequência teste. Consequentemente, o termo “pelo menos 80% de identidade de sequência” é utilizado ao longo do relatório descritivo para se referir as comparações de sequências de polipeptídeos e polinucleotídeos. Esta expressão refere-se preferencialmente a uma identidade de sequência de pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos, 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% para o respectivo polipeptídeo de referência ou para o respectivo polinucleotídeo de referência.

[096] O termo “comparação de sequência” é utilizado na presente invenção para referir-se ao processo em que uma sequência atua como uma sequência de referência, à qual as sequências de teste são comparadas. Quando se utiliza um algoritmo de comparação de sequência, as sequências teste e de referência são introduzidas em um computador, se necessário as coordenadas de subsequência são designadas e os parâmetros do programa do algoritmo de sequência são designados. Os parâmetros de programa pré-carregados ou padrão (default) são comumente usados ou podem ser designados parâmetros alternativos. O algoritmo de comparação de sequências calcula então as percentagens de identidades ou similaridades de sequência para as sequências de teste relativas à sequência de referência,

com base nos parâmetros do programa. No caso em que duas sequências são comparadas e a sequência de referência não é especificada em comparação com a qual a porcentagem de identidade de sequência deve ser calculada, a identidade de sequência deve ser calculada com referência a sequência mais longa dentre as duas sequências a serem comparadas, se não especificamente indicado de outra forma. Se a sequência de referência for indicada, a identidade de sequência é determinada com base no comprimento total da sequência de referência indicada pela SEQ ID, se não especificamente indicado de outra forma.

[097] Em um alinhamento de sequência, o termo “janela de comparação” refere-se àquelas extensões de posições contíguas de uma sequência que são comparadas com uma extensão de referência de posições contíguas de uma sequência que tem o mesmo número de posições. O número de posições contíguas selecionadas pode variar de 4 a 1000, ou seja, pode compreender 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ou 1000 posições contíguas. Normalmente, o número de posições contíguas varia de cerca de 20 a 800 posições contíguas, de cerca de 20 a 600 posições contíguas, de cerca de 50 a 400 posições contíguas, de cerca de 50 a cerca de 200 posições contíguas, de cerca de 100 a cerca de 150 posições contíguas.

[098] Os métodos de alinhamento de sequências para a comparação são bem conhecidos no estado da técnica. O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser realizado, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1970), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), pelo método de procura por similaridade de Pearson e Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (por exemplo, GAP,

BESTFIT, FASTA e TFASTA no Pacote de programas Wisconsin Genetics

Software Package, Genetics Computer Group, Madison, Wis.), ou por alinhamento manual e inspeção visual (vide, por exemplo, Ausubel et al.,

Current Protocols in Molecular Biology (suplemento de 1995)). Algoritmos adequados para determinar o percentual de identidade da sequência e a similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al. (Nuc.

Acids Res. 25:3389-402, 1977) e Altschul et al. (J.

Mol.

Biol. 215:403-10, 1990), respectivamente.

O programa de computador para a realização de análises BLAST está disponível ao público através do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve primeiro a identificação de pares de sequências com alta pontuação (HSPs) através da identificação de palavras curtas de comprimento W na sequência de consulta, que corresponde ou satisfaz alguns limiares de escore T com valores positivos quando alinhados com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência do banco de dados.

T é referido como o limite de pontuação da palavra vizinha (Altschul, et al, supra). Essas palavras coincidentes (words hits) vizinhas iniciais funcionam como sementes para iniciar buscas para encontrar HSPs maiores que as contenham.

As palavras coincidentes (word hits) são estendidas em ambas as direções ao longo de cada sequência a medida em que a pontuação cumulativa do alinhamento pode ser aumentada.

As pontuações (escores)

cumulativas são calculadas usando, sequências de nucleotídeos, parâmetros

M (pontuação de recompensa por um par de resíduos correspondente, sempre

> 0) e N (penalidade de pontuação por resíduos não correspondentes, sempre

< 0). Para as sequências de aminoácidos, uma matriz de pontuação é usada para calcular a pontuação acumulada.

A extensão das palavras coincidentes (word hits) em cada direção são interrompidas quando a pontuação cumulativa de alinhamento cai pela quantidade X de seu valor máximo atingido; a pontuação cumulativa vai a zero ou abaixo devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos com resíduos de pontuação negativa; ou quando a extremidade de uma sequência é alcançada. Os parâmetros W, T e X do algoritmo BLAST determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa como padrão um comprimento de palavra – wordlength (W) de 11, uma esperança matemática – expectation (E) de 10, M=5, N=-4, e uma comparação das duas fitas. Para as sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrão um comprimento de palavra – wordlength (W) de 3, uma esperança matemática – expectation (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (vide Henikoff & Henikoff, Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989) alinhamentos (B) de 50, expectation (E) de 10, M=5, N=-4, e uma comparação de ambas fitas. O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (vide, por exemplo, Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-87, 1993). Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade da menor soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pelo qual uma correspondência entre duas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos ocorre por acaso. Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico teste é considerada semelhante a uma sequência de referência se a probabilidade da menor soma em uma comparação do ácido nucleico teste com o ácido nucleico de referência é inferior a cerca de 0,2, tipicamente menor do que cerca de 0,01, e mais tipicamente menor do que cerca de 0,001.

[099] “Substituições conservadoras” podem ser feitas, por exemplo, com base na similaridade na polaridade, carga, tamanho, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou a natureza anfipática dos resíduos de aminoácidos envolvidos. Os aminoácidos podem ser agrupados nos seguintes seis grupos de aminoácidos padrão:

(1) Hidrofóbico: Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácido: Asp, Glu (4) básico: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam na orientação das cadeias: Gly, Pro; e (6) aromático: Trp, Tyr, Phe.

[100] Conforme utilizado na presente invenção, “substituições conservadoras” são definidas como trocas de um aminoácido por outro aminoácido listado dentro do mesmo grupo dos seis grupos de aminoácidos padrão mostrados acima. Por exemplo, a troca de Asp por Glu retém uma carga negativa no polipeptídeo modificado. Além disso, a glicina e a prolina podem ser substituídas uma pela outra com base em suas capacidades de distribuir α-hélices. Algumas das substituições conservadoras preferidas dentro dos seis grupos acima são trocas dentro dos seguintes subgrupos: (i) Ala, Val, Leu e Ile; (ii) Ser e Thr; (ii) Asn e Gln; (iv) Lys e Arg; e (v) Tyr e Phe. Dado o código genético conhecido e as técnicas de DNA recombinante e sintético, o cientista experiente pode facilmente construir DNAs que codificam variantes de aminoácidos conservadoras.

[101] Conforme utilizado na presente invenção, “substituições não conservadoras” ou “trocas de aminoácidos não conservadoras” são definidas como trocas de um aminoácido por outro aminoácido listado em um grupo diferente dos seis grupos de aminoácidos padrão de (1) a (6) mostrados acima.

[102] O termo “ácido nucleico” e “molécula de ácido nucleico” são utilizados como sinônimos e são entendidos como oligo- ou polímeros de fita simples ou fita dupla de bases de desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos ou ambos. Os monômeros de nucleotídeos são compostos por uma nucleobase, um açúcar de cinco carbonos (como, entre outros, ribose ou 2'-desoxirribose) e de um a três grupos fosfato. Tipicamente, um ácido nucleico é formado através de ligações fosfodiéster entre os monômeros de nucleotídeos individuais. No contexto da presente invenção, o termo ácido nucleico inclui, mas não está limitado a moléculas de ácido ribonucleico (RNA) e ácido desoxirribonucleico (DNA), e inclui também moléculas sintéticas.

(Science 254:1497-1500, 1991). Tipicamente, os ácidos nucleicos são moléculas de fita simples ou dupla e são compostos de nucleotídeos que ocorrem naturalmente. A representação de um ácido nucleico de fita simples também define (pelo menos parcialmente) a sequência de fita complementar. O ácido nucleico pode ser de fita simples ou dupla, ou pode conter porções de sequências de fita dupla e fita simples. Moléculas de ácido nucleico de fita dupla exemplares podem ter extremidades 3' ou 5' e, como tal, não são necessárias ou assumidas como sendo completamente de fita dupla ao longo de todo o seu comprimento. O ácido nucleico pode ser obtido por métodos de síntese biológica, bioquímica ou química ou qualquer um dos métodos conhecidos no estado da técnica, incluindo, mas não se limitando a, métodos de amplificação e transcrição reversa de RNA. O termo ácido nucleico compreende cromossomos ou segmentos cromossômicos, vetores (por exemplo, vetores de expressão), cassetes de expressão, DNA nu ou RNA polimérico, iniciadores (primers), sondas, cDNA, DNA genômico, DNA recombinante, cRNA, mRNA, tRNA, microRNA (miRNA) ou RNA interferente pequeno (siRNA). Um ácido nucleico pode ser, por exemplo, de fita simples, fita dupla ou cadeia fita tripla e não está limitado a qualquer comprimento particular. Salvo se indicado de outra forma, uma sequência de ácido nucleico particular compreende ou codifica sequências complementares, além de qualquer sequência explicitamente indicada.

[103] Os ácidos nucleicos podem ser degradados por endonucleases ou exonucleases, em particular por DNases e RNases que podem ser encontradas na célula. Por esse motivo, pode ser vantajoso modificar os ácidos nucleicos da invenção de modo a estabilizá-los contra a degradação, assegurando assim que uma elevada concentração do ácido nucleico seja mantida na célula durante um longo período de tempo.

Normalmente, tal estabilização pode ser obtida pela introdução de um ou mais grupos de fósforo internucleotídicos ou pela introdução de um ou mais internucleotídeos não fósforo. Consequentemente, os ácidos nucleicos podem ser compostos de nucleotídeos de ocorrência não natural e/ou modificações em nucleotídeos de ocorrência natural e/ou alterações na estrutura da molécula. Os radicais fosfato internucleotídeos modificados e/ou pontes não fósforo em um ácido nucleico incluem, mas não estão limitados a, fosfonato de metila, fosforotioato, fosforamidato, fosforoditioato e/ou ésteres de fosfato, enquanto que internucleotídeos não fósforos análogos incluem, mas não estão limitados a, pontes de siloxano, pontes de carbonato, ésteres de carboximetila, pontes de acetamidato e/ou pontes de tioéter. Exemplos adicionais de modificações de nucleotídeos incluem, mas não estão limitados a: fosforilação de nucleotídeos 5' ou 3' para permitir a ligação ou prevenção da degradação de exonuclease/extensão de polimerase, respectivamente; modificações de amino, tiol, alcino ou biotinila para ligações covalentes e quase covalentes; fluoróforos e quenchers; e bases modificadas, como desoxiInosina (dI), 5- Bromo-desoxiuridina (5-Bromo-dU), desoxiUridina, 2-Aminopurina, 2,6- Diaminopurina, dT invertido, Dideoxi-T invertido, didesoxicitidina (ddC 5-metil desoxiCitidina (5-metil dC), ácidos nucleicos bloqueados (LNA's), 5-nitroindol, bases Iso-dC e –dG, bases de RNA 2'-O-metil, hidroximetil dC, 5-hidroxibutin- 2'-desoxiuridina, 8-aza -7-deazaguanosina e Bases Modificadas por Flúor. Assim, o ácido nucleico também pode ser um ácido nucleico artificial que inclui, mas não se limita a, poliamida ou ácido nucleico peptídico (PNA), morfolino e ácido nucleico bloqueado (LNA), bem como ácido nucleico glicol (GNA) e ácido nucleico treose (TNA).

[104] Um ácido nucleico está “operacionalmente ligado” quando ele é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor ou facilitador/acentuador (enhancer) está operacionalmente ligado a uma sequência codificante se ele afetar a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação ao ribossomo está operacionalmente ligado a uma sequência codificante se ele estiver posicionado de modo a facilitar a tradução.

[105] O termo “polinucleotídeo” quando utilizado no contexto da presente invenção, refere-se a um ácido nucleico com mais de 50 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, 51 ou mais nucleotídeos de comprimento.

[106] Os polipeptídeos da invenção são preparados por qualquer método adequado, incluindo, mas não se limitado a, isolamento de uma sequência existente ou natural, replicação ou amplificação de DNA, transcrição reversa, clonagem e digestão de restrição de sequências apropriadas, ou síntese química direta por um método como o método de fosfotriéster de Narang et al. (Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979); o método fosfodiéster de Brown et al. (Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979); o método dietilfosforamidito de Beaucage et al. (Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981); o método do triéster de Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981); métodos automatizados de síntese; ou o método de suporte sólido da Patente US

4.458.066, ou outros métodos conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto.

[107] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “vetor” refere-se a uma proteína ou um polinucleotídeo ou uma mistura destes que é capaz de ser introduzido ou introduzir proteínas e/ou ácidos nucleicos compreendidos no mesmo em uma célula. Exemplos de vetores incluem, mas não se limitam a, plasmídeos, cosmídeos, fagos, vírus ou cromossomos artificiais. Em particular, utiliza-se um vetor para transportar um produto gênico de interesse, tal como, por exemplo, DNA estranho ou heterólogo em uma célula hospedeira adequada. Os vetores podem conter sequências polinucleotídicas “replicons” que facilitam a replicação autônoma do vetor em uma célula hospedeira. O DNA estranho é definido como DNA heterólogo, que é o DNA não encontrado naturalmente na célula hospedeira, que, por exemplo, replica a molécula do vetor, codifica um marcador selecionável ou rastreável, ou codifica um transgene. Uma vez na célula hospedeira, o vetor pode se replicar independentemente ou de maneira coincidente com o DNA cromossômico do hospedeiro, e várias cópias do vetor e seu DNA inserido podem ser geradas. Adicionalmente, o vetor também pode conter elementos necessários que permitem a transcrição do DNA inserido em uma molécula de mRNA ou, de outro modo, causar a replicação do DNA inserido em múltiplas cópias de RNA. Os vetores podem incluir ainda “sequências de controle de expressão” que regulam a expressão do gene de interesse. Tipicamente, as sequências de controle da expressão são polipeptídeos ou polinucleotídeos, como, mas não se limitando a, promotores, facilitadores/acentuadores (enhancers), silenciadores, isoladores ou repressores. Em um vetor compreendendo mais do que um polinucleotídeo codificante de um ou mais produtos gênicos de interesse, a expressão pode ser controlada em conjunto ou separadamente por uma ou mais sequências de controle da expressão.

Mais especificamente, cada polinucleotídeo compreendido no vetor pode ser controlado por uma sequência de controle de expressão separada ou todos os polinucleotídeos compreendidos no vetor podem ser controlados por uma única sequência de controle de expressão. Os polinucleotídeos compreendidos em um único vetor controlado por uma única sequência de controle de expressão podem formar um quadro de leitura aberto. Alguns vetores de expressão contêm adicionalmente elementos de sequência adjacentes ao DNA inserido que aumentam a meia-vida do mRNA expresso e/ou permitem a tradução do mRNA em uma molécula de proteína. Muitas moléculas de mRNA e polipeptídeos codificados pelo DNA inserido podem, desse modo, ser rapidamente sintetizados.

[108] O termo “célula hospedeira” refere-se a uma célula que abriga um vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus). Tal célula hospedeira pode ser uma célula procariótica (por exemplo, uma célula bacteriana) ou célula eucariótica (por exemplo, uma célula fúngica, vegetal ou animal). As células hospedeiras incluem tanto procariontes unicelulares como organismos eucariontes (por exemplo, bactérias, leveduras e actinomicetos), bem como células isoladas de plantas ou animais de ordem superior, quando cultivadas em cultura de células. O termo “célula hospedeira recombinante”, conforme utilizado no presente, refere-se a uma célula hospedeira que compreende um polinucleotídeo que codifica um fragmento polipeptídico de interesse, ou seja, o fragmento da subunidade PA viral ou variantes deste de acordo com a invenção. Este polinucleotídeo pode ser encontrado dentro da célula hospedeira (i) livremente dispersa como tal, (ii) incorporada em um vetor recombinante ou (iii) integrada no genoma da célula hospedeira ou DNA mitocondrial. A célula recombinante pode ser utilizada para expressão de um polinucleotídeo de interesse ou para amplificação do polinucleotídeo ou vetor recombinante da invenção. O termo “célula hospedeira recombinante” inclui a progênie da célula original que foi transformada, transfectada ou infectada com o polinucleotídeo ou com o vetor recombinante da invenção. Uma célula hospedeira recombinante pode ser uma célula bacteriana, tal como uma célula de E. coli, uma célula de levedura, tal como Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris, uma célula vegetal, uma célula de inseto, tal como células SF9 ou High Five ou uma célula de mamífero. Exemplos preferidos de células de mamífero são células de ovário de hamster chinês (CHO), células de rim de macaco verde africano (COS), células de rim embrionário humano (HEK293), células HELA e semelhantes.

[109] O termo “agente ativo”, tal como utilizado na presente invenção, refere-se a qualquer atividade terapêutica que um agente pode exibir.

[110] “Farmaceuticamente aceitável” significa aprovado por uma agência reguladora do Governo Federal ou de um governo estadual ou inscrita na Farmacopeia Norte-Americana ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais, e mais especificamente para uso em seres humanos.

[111] O termo “transportador”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o agente terapêutico é administrado. Esses veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, como soluções salinas em água e óleos, incluindo aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. Uma solução salina é um veículo preferido quando a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. As soluções salinas e soluções de dextrose aquosa e de glicerol também podem ser empregadas como veículos líquidos, especialmente para soluções injetáveis. Os excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, carbonato de cálcio, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado em pó, glicerol, propileno glicol, água, etanol e etc. A composição, se desejado, também pode conter quantidades menores de agentes umectantes ou agente emulsificantes, ou agentes de tamponamento de pH. Estas composições podem tomar a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, drágeas, cápsulas, pós, formulações de liberação controlada e etc. A composição pode ser formulada como um supositório, com ligantes e veículos tradicionais, como os triglicerídeos. Os compostos da invenção podem ser formulados como formas neutras ou salinas. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles formados com grupos amino livres, tais como os derivados de ácidos clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., e aqueles formados por grupos carboxila livre, tais como os derivados de sódio, potássio, amônio, cálcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2- etilaminoetanol, histidina, procaína e etc. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são descritos em “Remington's Pharmaceutical Sciences” por E.W.

Martin. Essas composições conterão uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto, preferencialmente na forma purificada, juntamente com uma quantidade adequada de veículo, de modo a fornecer a forma para administração adequada ao paciente. A formulação deve adequar-se ao modo de administração.

[112] Métodos geralmente conhecidos e praticados nos campos da biologia molecular, biologia celular, química de proteínas e técnicas de anticorpos são totalmente descritos nas publicações continuamente atualizadas “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, (Sambrook et al., Cold Spring Harbor); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. Eds., Wiley & Sons); Current Protocols in Protein Science (J. E. Colligan et al. eds., Wiley & Sons); Current Protocols in Cell Biology (J. S. Bonifacino et al., Wiley & Sons) e Current Protocols in Immunology (J. E. Colligan et al., Eds., Wiley & Sons). As técnicas conhecidas relacionadas com cultura de células e meios são descritas em “Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al., Curr. Opin., Biotechnol. 8: 148, 1997); “Serum free Media” (K. Kitano, Biotechnol. 17:73, 1991); e “Suspension Culture of Mammalian Cells” (Birch et al. Bioprocess Technol. 19: 251, 1990).

EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO

[113] A seguir, diferentes aspectos da invenção são definidos em mais detalhes. Cada aspecto assim definido pode ser combinado com qualquer outro aspecto ou aspectos, a menos que seja declaradamente indicado de outra forma. Em particular, qualquer característica indicada como preferida ou vantajosa pode ser combinada com qualquer outra característica ou características indicadas como preferidas ou vantajosas.

[114] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD- 1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compete pela ligação à PD-1 com um anticorpo; (i) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; ou (ii) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

[115] Preferencialmente, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD- 1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compete pela ligação à PD-1 com um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e uma região variável de cadeia leve com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

[116] Em um exemplo de realização preferido do primeiro aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1 é um anticorpo, uma proteína semelhante a um anticorpo ou um fragmento dos mesmos. Preferencialmente, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, um anticorpo monoclonal, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo recombinante, um fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno, um anticorpo de cadeia única, um fragmento de cadeia variável de única de anticorpo, um diacorpo (diabody), um fragmento Fab, um fragmento F(ab)2, um anticorpo mimético, um anticorpo IgG1, um anticorpo IgG2, um anticorpo IgG3 e um anticorpo IgG4.

[117] Em outro exemplo de realização preferido do primeiro aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1 liga-se à PD-1 com uma Kd inferior a 100 nM, inferior a 50 nM, inferior a 10 nM, inferior de 1 nM, inferior a 100 pM, inferior a 10 pM ou inferior a 5 pM. Por exemplo, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1 liga-se à PD-1 com uma Kd entre 5 pM e 100 nM, 5 pM e 50 nM, 5 pM e 10 nM, 5 pM e 1 nM, 5 pM e 100 pM, tal como entre 5 pM e 10 pM.

[118] Em outro exemplo de realização preferido do primeiro aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1 pode bloquear a ligação de um ligante à PD-1 com um IC50 inferior a 10 nM, inferior a 1 nM ou inferior 200 pM. Por exemplo, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD- 1 pode bloquear a ligação de um ligante à PD-1 com um IC50 entre 200 pM e 10 nM, tal como entre 200 pM e 1 nM.

[119] Em outro exemplo de realização preferido do primeiro aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1 estimula a proliferação de células T.

[120] Em outro exemplo de realização preferido do primeiro aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1 induz a proliferação de linfócitos.

[121] Em outro exemplo de realização preferido do primeiro aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1 induz a secreção de IL-2 e/ou IFNγ.

[122] Em outro exemplo de realização preferido do primeiro aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1 reduz o volume do tumor em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% em comparação com o valor basal.

[123] Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compete pela ligação ao PD-L1 com um anticorpo; (i) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; ou (ii) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; ou (iii) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84; ou (iv) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93; ou (v) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 101; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 102.

[124] Preferencialmente, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compete pela ligação ao PD-L1 com um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; e uma região variável de cadeia leve com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.

[125] Em um exemplo de realização preferido do segundo aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1 é um anticorpo, uma proteína semelhante a um anticorpo ou um fragmento dos mesmos. Preferencialmente, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, um anticorpo monoclonal, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo recombinante, um fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno, um anticorpo de cadeia única, um fragmento de cadeia variável de única de anticorpo, um diacorpo (diabody), um fragmento Fab, um fragmento F(ab)2, um anticorpo mimético, um anticorpo IgG1, um anticorpo IgG2, um anticorpo IgG3 e um anticorpo IgG4.

[126] Em outro exemplo de realização preferido do segundo aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1 liga-se ao PD-L1 com uma Kd inferior a 100 nM, inferior a 50 nM, inferior a 10 nM, inferior de 1 nM, inferior a 100 pM, inferior a 10 pM ou inferior a 5 pM. Por exemplo, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1 liga-se ao PD-L1 com uma Kd entre 5 pM e 100 nM, 5 pM e 50 nM, 5 pM e 10 nM, 5 pM e 1 nM, 5 pM e 100 pM, tal como entre 5 pM e 10 pM.

[127] Em outro exemplo de realização preferido do segundo aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1 pode bloquear a ligação de um ligante ao PD-L1 com um IC50 inferior a 10 nM, inferior a 1 nM ou inferior 200 pM.

[128] Por exemplo, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1 pode bloquear a ligação de um ligante ao PD-L1 com um IC50 entre 200 pM e 10 nM, tal como entre 200 pM e 1 nM.

[129] Em outro exemplo de realização preferido do segundo aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1 estimula a proliferação de células T.

[130] Em outro exemplo de realização preferido do segundo aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1 induz a proliferação de linfócitos.

[131] Em outro exemplo de realização preferido do segundo aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1 induz a secreção de IL-2 e/ou IFNγ.

[132] Em outro exemplo de realização preferido do segundo aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1 reduz o volume do tumor em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% em comparação com o valor basal.

[133] Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compete pela ligação à LAG-3 com um anticorpo; (i) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; (ii) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; (iii) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57; (iv) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; ou (v) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75.

[134] Preferencialmente, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compete pela ligação à LAG-3 com um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; e uma região variável de cadeia leve com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39.

[135] Em outro exemplo de realização preferido, a presente invenção provê uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compete pela ligação à LAG-3 com um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47; e uma região variável de cadeia leve com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48.

[136] Em um exemplo de realização preferido do terceiro aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3 é um anticorpo, uma proteína semelhante a um anticorpo ou um fragmento dos mesmos. Preferencialmente, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, um anticorpo monoclonal, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo recombinante, um fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno, um anticorpo de cadeia única, um fragmento de cadeia variável de única de anticorpo, um diacorpo (diabody), um fragmento Fab, um fragmento F(ab)2, um anticorpo mimético, um anticorpo IgG1, um anticorpo IgG2, um anticorpo IgG3 e um anticorpo IgG4.

[137] Em outro exemplo de realização preferido do terceiro aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3 liga-se à LAG-3 com uma Kd inferior a 100 nM, inferior a 50 nM, inferior a 10 nM, inferior de 1 nM, inferior a 100 pM, inferior a 10 pM ou inferior a 5 pM. Por exemplo, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3 liga-se à LAG-3 com uma Kd entre 5 pM e 100 nM, 5 pM e 50 nM, 5 pM e 10 nM, 5 pM e 1 nM, 5 pM e 100 pM, tal como entre 5 pM e 10 pM.

[138] Em outro exemplo de realização preferido do terceiro aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3 pode bloquear a ligação de um ligante à LAG-3 com um IC50 inferior a 10 nM, inferior a 1 nM ou inferior 200 pM. Por exemplo, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3 pode bloquear a ligação de um ligante à LAG-3 com um IC50 entre 200 pM e 10 nM, tal como entre 200 pM e 1 nM.

[139] Em outro exemplo de realização preferido do terceiro aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3 estimula a proliferação de células T.

[140] Em outro exemplo de realização preferido do terceiro aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3 induz a proliferação de linfócitos.

[141] Em outro exemplo de realização preferido do terceiro aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3 induz a secreção de IL-2 e/ou IFNγ.

[142] Em outro exemplo de realização preferido do terceiro aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3 reduz o volume do tumor em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% em comparação com o valor basal.

[143] Em um quarto aspecto, a presente invenção refere-se a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende; (i) uma combinação de um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de combinações consistindo em: um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2; um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11; (ii) uma combinação de uma região determinante de complementaridade 3 de cadeia pesada (CDRH3) e uma região determinante de complementaridade 3 de cadeia leve (CDRL3) selecionada a partir do grupo de combinações que consistem em: uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.

[144] Em um exemplo de realização preferido, a presente invenção refere-se a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de um domínio variável de cadeia leve tendo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 e um domínio variável de cadeia pesada tendo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2.

[145] Em outro exemplo de realização preferido, a presente invenção se refere a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

[146] Em um exemplo de realização preferido do quarto aspecto da presente invenção, a proteína de ligação ao antígeno antagonista liga-se especificamente à PD-1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada selecionado a partir do grupo de combinações que consistem em: - um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2; um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11.

[147] Em um exemplo de realização preferido adicional, a presente invenção refere-se a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de um domínio variável de cadeia leve tendo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 e um domínio variável de cadeia pesada tendo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2.

[148] Em um exemplo de realização preferido adicional do quarto aspecto da presente invenção, a proteína de ligação ao antígeno antagonista liga-se especificamente à PD-1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada selecionado a partir do grupo de combinações que consistem em: um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2; um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11.

[149] Em um exemplo de realização preferido adicional, a presente invenção refere-se a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de um domínio variável de cadeia leve tendo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 e um domínio variável de cadeia pesada tendo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2.

[150] Em um exemplo de realização preferido adicional do quarto aspecto da presente invenção, a proteína de ligação ao antígeno antagonista liga-se especificamente à PD-1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de uma região determinante de complementaridade 3 de cadeia pesada (CDRH3) e uma região determinante de complementaridade 3 de cadeia leve (CDRL3) selecionada a partir do grupo de combinações que consistem em: uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.

[151] Em outro exemplo de realização preferido, a presente invenção se refere a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

Preferencialmente, a proteína de ligação ao antígeno antagonista liga-se especificamente à PD-1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende ainda um ou mais elementos selecionados a partir do grupo que consiste em uma CDRH1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 4 ou 13, um CDRH2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 6 ou 15, CDRL1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 5 ou 14 e uma CDRL2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 7 ou 16.

[152] Por exemplo, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; uma CDRH1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; e; uma CDRL1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; uma CDRH2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; e; uma CDRL2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. Preferencialmente, também dentro do escopo da presente invenção está a proteína de ligação ao antígeno antagonista conforme especificada acima, compreendendo uma troca de aminoácidos na CDRH1, CDRL1, CDRH2 ou CDRL2.

[153] Por exemplo, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; uma CDRH1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; e; uma CDRL1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; uma CDRH2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e; uma CDRL2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. Preferencialmente, também dentro do escopo da presente invenção está a proteína de ligação ao antígeno antagonista conforme especificada acima, compreendendo uma troca de aminoácidos na CDRH1, CDRL1, CDRH2 ou CDRL2.

[154] Em outro exemplo de realização preferido do quarto aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1 é um anticorpo, uma proteína semelhante a um anticorpo ou um fragmento dos mesmos. Preferencialmente, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, um anticorpo monoclonal, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo recombinante, um fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno, um anticorpo de cadeia única, um fragmento de cadeia variável de única de anticorpo, um diacorpo (diabody), um fragmento Fab, um fragmento F(ab)2, um anticorpo mimético, um anticorpo IgG1, um anticorpo IgG2, um anticorpo IgG3 e um anticorpo IgG4.

[155] Em outro exemplo de realização preferido do quarto aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1 liga-se à PD-1 com uma Kd inferior a 100 nM, inferior a 50 nM, inferior a 10 nM, inferior de 1 nM, inferior a 100 pM, inferior a 10 pM ou inferior a 5 pM. Por exemplo, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1 liga-se à PD-1 com uma Kd entre 5 pM e 100 nM, 5 pM e 50 nM, 5 pM e 10 nM, 5 pM e 1 nM, 5 pM e 100 pM, tal como entre 5 pM e 10 pM.

[156] Em outro exemplo de realização preferido do quarto aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1 pode bloquear a ligação de um ligante à PD-1 com um IC50 inferior a 10 nM, inferior a 1 nM ou inferior 200 pM. Por exemplo, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD- 1 pode bloquear a ligação de um ligante à PD-1 com um IC50 entre 200 pM e 10 nM, tal como entre 200 pM e 1 nM.

[157] Em outro exemplo de realização preferido do quarto aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1 estimula a proliferação de células T.

[158] Em outro exemplo de realização preferido do quarto aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1 induz a proliferação de linfócitos.

[159] Em outro exemplo de realização preferido do quarto aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1 induz a secreção de IL-2 e/ou IFNγ.

[160] Em outro exemplo de realização preferido do quarto aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1 reduz o volume do tumor em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% em comparação com o valor basal.

[161] Em um quinto aspecto, a presente invenção refere-se a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende; (i) uma combinação de um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de combinações consistindo em:

um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 21; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 20;

[162] Em um exemplo de realização preferido, a presente invenção refere-se a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de um domínio variável de cadeia leve tendo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 30 e um domínio variável de cadeia pesada tendo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 29.

[163] Em outro exemplo de realização preferido, a presente invenção se refere a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

36.

[164] Em um exemplo de realização preferido do quinto aspecto da presente invenção, a proteína de ligação ao antígeno antagonista liga-se especificamente ao PD-L1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada selecionado a partir do grupo de combinações que consistem em: um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 21; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 20; um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 30; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 29; um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 84; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 83; um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 93; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 92; um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 102; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 101.

[165] Em um exemplo de realização preferido adicional, a presente invenção refere-se a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de um domínio variável de cadeia leve tendo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 30 e um domínio variável de cadeia pesada tendo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID

NO: 29.

[166] Em um exemplo de realização preferido adicional do quinto aspecto da presente invenção, a proteína de ligação ao antígeno antagonista liga-se especificamente ao PD-L1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada selecionado a partir do grupo de combinações que consistem em: um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 21; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 20; um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 30; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 29; um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 84; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 83; um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 93; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 92; um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 102; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 101.

[167] Em um exemplo de realização preferido, a presente invenção refere-se a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de um domínio variável de cadeia leve tendo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 30 e um domínio variável de cadeia pesada tendo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 29.

[168] Em um exemplo de realização preferido adicional do quinto aspecto da presente invenção, a proteína de ligação ao antígeno antagonista liga-se especificamente ao PD-L1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de uma região determinante de complementaridade 3 de cadeia pesada (CDRH3) e uma região determinante de complementaridade 3 de cadeia leve (CDRL3) selecionada a partir do grupo de combinações que consistem em: uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 98; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108.

[169] Em outro exemplo de realização preferido, a presente invenção se refere a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

36.

[170] Preferencialmente, a proteína de ligação ao antígeno antagonista liga-se especificamente ao PD-L1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende ainda um ou mais elementos selecionados a partir do grupo que consiste em uma CDRH1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 22 ou 31, um CDRH2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs:

24 ou 33, CDRL1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 23 ou 32 e uma CDRL2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 25 ou 34.

[171] Por exemplo, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27; uma CDRH1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; e; uma CDRL1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; uma CDRH2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; e; uma CDRL2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.

[172] Preferencialmente, também dentro do escopo da presente invenção está a proteína de ligação ao antígeno antagonista conforme especificada acima, compreendendo uma troca de aminoácidos na CDRH1, CDRL1, CDRH2 ou CDRL2.

[173] Por exemplo, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; uma CDRH1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; e; uma CDRL1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; uma CDRH2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; e; uma CDRL2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.

[174] Preferencialmente, também dentro do escopo da presente invenção está a proteína de ligação ao antígeno antagonista conforme especificada acima, compreendendo uma troca de aminoácidos na CDRH1, CDRL1, CDRH2 ou CDRL2.

[175] Por exemplo, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90; uma CDRH1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85; e; uma CDRL1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86; uma CDRH2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 87; e; uma CDRL2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 88.

[176] Preferencialmente, também dentro do escopo da presente invenção está a proteína de ligação ao antígeno antagonista conforme especificada acima, compreendendo uma troca de aminoácidos na CDRH1, CDRL1, CDRH2 ou CDRL2.

[177] Por exemplo, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 98; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99; uma CDRH1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94; e; uma CDRL1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95; uma CDRH2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 96; e; uma CDRL2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 97.

[178] Preferencialmente, também dentro do escopo da presente invenção está a proteína de ligação ao antígeno antagonista conforme especificada acima, compreendendo uma troca de aminoácidos na CDRH1, CDRL1, CDRH2 ou CDRL2.

[179] Por exemplo, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108; uma CDRH1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103; e; uma CDRL1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104; uma CDRH2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105; e; uma CDRL2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 106.

[180] Preferencialmente, também dentro do escopo da presente invenção está a proteína de ligação ao antígeno antagonista conforme especificada acima, compreendendo uma troca de aminoácidos na CDRH1, CDRL1, CDRH2 ou CDRL2.

[181] Em outro exemplo de realização preferido do quinto aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1 é um anticorpo, uma proteína semelhante a um anticorpo ou um fragmento dos mesmos. Preferencialmente, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, um anticorpo monoclonal, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo recombinante, um fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno, um anticorpo de cadeia única, um fragmento de cadeia variável de única de anticorpo, um diacorpo (diabody), um fragmento Fab, um fragmento F(ab)2, um anticorpo mimético, um anticorpo IgG1, um anticorpo IgG2, um anticorpo IgG3 e um anticorpo IgG4.

[182] Em outro exemplo de realização preferido do quinto aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1 liga-se ao PD-L1 com uma Kd inferior a 100 nM, inferior a 50 nM, inferior a 10 nM, inferior de 1 nM, inferior a 100 pM, inferior a 10 pM ou inferior a 5 pM. Por exemplo, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1 liga-se ao PD-L1 com uma Kd entre 5 pM e 100 nM, 5 pM e 50 nM, 5 pM e 10 nM, 5 pM e 1 nM, 5 pM e 100 pM, tal como entre 5 pM e 10 pM.

[183] Em outro exemplo de realização preferido do quinto aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1 pode bloquear a ligação de um ligante ao PD-L1 com um IC50 inferior a 10 nM, inferior a 1 nM ou inferior 200 pM. Por exemplo, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1 pode bloquear a ligação de um ligante ao PD-L1 com um IC50 entre 200 pM e 10 nM, tal como entre 200 pM e 1 nM.

[184] Em outro exemplo de realização preferido do quinto aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1 estimula a proliferação de células T.

[185] Em outro exemplo de realização preferido do quinto aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1 induz a proliferação de linfócitos.

[186] Em outro exemplo de realização preferido do quinto aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1 induz a secreção de IL-2 e/ou IFNγ.

[187] Em outro exemplo de realização preferido do quinto aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1 reduz o volume do tumor em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% em comparação com o valor basal.

[188] Em um sexto aspecto, a presente invenção refere-se a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende (i) uma combinação de um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de combinações consistindo em: um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 39; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 38; um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47; um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56;

(CDRL3) selecionada a partir do grupo de combinações que consistem em:

uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 81.

[189] Em um exemplo de realização preferido, a presente invenção refere-se a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de um domínio variável de cadeia leve tendo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 39 e um domínio variável de cadeia pesada tendo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 38.

[190] Em outro exemplo de realização preferido, a presente invenção se refere a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

45.

[191] Em um exemplo de realização preferido adicional, a presente invenção refere-se a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de um domínio variável de cadeia leve tendo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 e um domínio variável de cadeia pesada tendo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47.

[192] Em outro exemplo de realização preferido, a presente invenção se refere a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53 e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

54.

[193] Em um exemplo de realização preferido do sexto aspecto da presente invenção, a proteína de ligação ao antígeno antagonista liga-se especificamente à LAG-3, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada selecionado a partir do grupo de combinações que consistem em: um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 39; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 38; um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47; um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56; um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 66; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 65; um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 75; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 74.

[194] Em um exemplo de realização preferido adicional, a presente invenção refere-se a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de um domínio variável de cadeia leve tendo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 39 e um domínio variável de cadeia pesada tendo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 38.

[195] Em um exemplo de realização preferido adicional, a presente invenção refere-se a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de um domínio variável de cadeia leve tendo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 e um domínio variável de cadeia pesada tendo uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47.

[196] Em um exemplo de realização preferido adicional do sexto aspecto da presente invenção, a proteína de ligação ao antígeno antagonista liga-se especificamente à LAG-3, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada selecionado a partir do grupo de combinações que consistem em: um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 39; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 38; um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47; um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 57; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56; um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 66; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 65; um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 75; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 74.

[197] Em um exemplo de realização preferido adicional, a presente invenção refere-se a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de um domínio variável de cadeia leve tendo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 39 e um domínio variável de cadeia pesada tendo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 38.

[198] Em um exemplo de realização preferido adicional, a presente invenção refere-se a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de um domínio variável de cadeia leve tendo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 e um domínio variável de cadeia pesada tendo uma sequência com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47.

[199] Em um exemplo de realização preferido adicional do sexto aspecto da presente invenção, a proteína de ligação ao antígeno antagonista liga-se especificamente à LAG-3, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de uma região determinante de complementaridade 3 de cadeia pesada (CDRH3) e uma região determinante de complementaridade 3 de cadeia leve (CDRL3) selecionada a partir do grupo de combinações que consistem em: uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 81.

[200] Em outro exemplo de realização preferido, a presente invenção se refere a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

45.

[201] Em outro exemplo de realização preferido, a presente invenção se refere a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53 e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

54.

[202] Preferencialmente, a proteína de ligação ao antígeno antagonista liga-se especificamente à LAG-3, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende ainda um ou mais elementos selecionados a partir do grupo que consiste em uma CDRH1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 40, 49, 58, 67 ou 76, um CDRH2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 42, 51, 60, 69 ou 78, CDRL1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 41, 50, 59, 68 ou 77 e uma CDRL2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 43, 52, 61, 70 ou 79.

[203] Por exemplo, a proteína de ligação ao antígeno antagonista liga-se especificamente à LAG-3, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45; uma CDRH1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; e; uma CDRL1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; uma CDRH2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; e; uma CDRL2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43.

[204] Preferencialmente, também dentro do escopo da presente invenção está a proteína de ligação ao antígeno antagonista conforme especificada acima, compreendendo uma troca de aminoácidos na CDRH1, CDRL1, CDRH2 ou CDRL2.

[205] Por exemplo, a proteína de ligação ao antígeno antagonista liga-se especificamente à LAG-3, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; uma CDRH1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49; e; uma CDRL1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; uma CDRH2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51; e; uma CDRL2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

[206] Preferencialmente, também dentro do escopo da presente invenção está a proteína de ligação ao antígeno antagonista conforme especificada acima, compreendendo uma troca de aminoácidos na CDRH1, CDRL1, CDRH2 ou CDRL2.

[207] Por exemplo, a proteína de ligação ao antígeno antagonista liga-se especificamente à LAG-3, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; uma CDRH1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; e; uma CDRL1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59; uma CDRH2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; e; uma CDRL2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61.

[208] Preferencialmente, também dentro do escopo da presente invenção está a proteína de ligação ao antígeno antagonista conforme especificada acima, compreendendo uma troca de aminoácidos na CDRH1, CDRL1, CDRH2 ou CDRL2.

[209] Por exemplo, a proteína de ligação ao antígeno antagonista liga-se especificamente à LAG-3, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72; uma CDRH1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67; e; uma CDRL1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; uma CDRH2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69; e; uma CDRL2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70.

[210] Preferencialmente, também dentro do escopo da presente invenção está a proteína de ligação ao antígeno antagonista conforme especificada acima, compreendendo uma troca de aminoácidos na CDRH1, CDRL1, CDRH2 ou CDRL2.

[211] Por exemplo, a proteína de ligação ao antígeno antagonista liga-se especificamente à LAG-3, em que a referida proteína de ligação ao antígeno compreende; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 81; uma CDRH1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76; e; uma CDRL1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77; uma CDRH2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; e; uma CDRL2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79.

[212] Preferencialmente, também dentro do escopo da presente invenção está a proteína de ligação ao antígeno antagonista conforme especificada acima, compreendendo uma troca de aminoácidos na CDRH1, CDRL1, CDRH2 ou CDRL2.

[213] Em outro exemplo de realização preferido do sexto aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3 é um anticorpo, uma proteína semelhante a um anticorpo ou um fragmento dos mesmos. Preferencialmente, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, um anticorpo monoclonal, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo recombinante, um fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno, um anticorpo de cadeia única, um fragmento de cadeia variável de única de anticorpo, um diacorpo (diabody), um fragmento Fab, um fragmento F(ab)2, um anticorpo mimético, um anticorpo IgG1, um anticorpo IgG2, um anticorpo IgG3 e um anticorpo IgG4.

[214] Em outro exemplo de realização preferido do sexto aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3 liga-se à LAG-3 com uma Kd inferior a 100 nM, inferior a 50 nM, inferior a 10 nM, inferior de 1 nM, inferior a 100 pM, inferior a 10 pM ou inferior a 5 pM. Por exemplo, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3 liga-se à LAG-3 com uma Kd entre 5 pM e 100 nM, 5 pM e 50 nM, 5 pM e 10 nM, 5 pM e 1 nM, 5 pM e 100 pM, tal como entre 5 pM e 10 pM.

[215] Em outro exemplo de realização preferido do sexto aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3 pode bloquear a ligação de um ligante à LAG-3 com um IC50 inferior a 10 nM, inferior a 1 nM ou inferior 200 pM. Por exemplo, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3 pode bloquear a ligação de um ligante à LAG-3 com um IC50 entre 200 pM e 10 nM, tal como entre 200 pM e 1 nM.

[216] Em outro exemplo de realização preferido do sexto aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3 estimula a proliferação de células T.

[217] Em outro exemplo de realização preferido do sexto aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3 induz a proliferação de linfócitos.

[218] Em outro exemplo de realização preferido do sexto aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3 induz a secreção de IL-2 e/ou IFNγ.

[219] Em outro exemplo de realização preferido do sexto aspecto, a proteína de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3 reduz o volume do tumor em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% em comparação com o valor basal.

[220] Em um sétimo aspecto, a presente invenção refere-se a um ácido nucleico que codifica a proteína de ligação ao antígeno antagonista de qualquer um dos aspectos de 1 a 6 da presente invenção.

[221] Em um oitavo aspecto, a presente invenção refere-se a um vetor de expressão recombinante compreendendo uma molécula de ácido nucleico do sétimo aspecto.

[222] Em um nono aspecto, a presente invenção diz respeito a uma célula hospedeira que compreende o vetor do oitavo aspecto da presente invenção.

[223] Em um décimo aspecto, a presente invenção refere-se a um método para preparar a proteína de ligação ao antígeno antagonista de qualquer um dos aspectos de 1 a 6 da presente invenção, compreendendo a etapa de preparação da referida proteína de ligação ao antígeno a partir de uma célula hospedeira que expressa a referida proteína de ligação ao antígeno.

[224] Em um décimo primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma proteína de ligação ao antígeno antagonista produzida pela expressão de DNA recombinante na célula hospedeira do nono aspecto da presente invenção.

[225] Em um décimo segundo aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos uma proteína de ligação ao antígeno antagonista de acordo com qualquer um dos aspectos de 1 a 6 da presente invenção, o ácido nucleico de acordo com o sétimo aspecto da presente invenção ou o vetor de acordo com o oitavo aspecto da presente invenção e um transportador farmaceuticamente aceitável.

[226] Em um exemplo de realização preferido do décimo segundo aspecto, a composição farmacêutica é adaptada para a administração parenteral. As composições farmacêuticas adaptadas para administração parenteral incluem soluções ou suspensões injetáveis estéreis aquosas e não aquosas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam as composições substancialmente isotônicas com o sangue de um receptor pretendido. Outros componentes que podem estar presentes em tais composições incluem água, alcoóis, polióis, glicerina e óleos vegetais, por exemplo. As composições adaptadas para administração parenteral podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou multidose, por exemplo, ampolas e frascos selados, e podem ser armazenadas em uma condição liofilizada necessitando apenas da adição de um veículo líquido estéril, por exemplo, solução salina estéril de injeções, imediatamente antes do uso. As soluções e suspensões para injeção extemporânea podem ser preparadas a partir de pó, grânulos e comprimidos estéreis.

[227] Em um exemplo de realização preferido, a composição é formulada de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a seres humanos.

Normalmente, composições para a administração intravenosa são soluções em tampão isotônico estéril aquoso. Quando necessário, a composição também pode incluir um agente solubilizante e um anestésico local como a lidocaína para aliviar a dor no local da injeção. Geralmente, os ingredientes são fornecidos separadamente ou misturados na forma de dosagem unitária, por exemplo, na forma de pó liofilizado ou um concentrado sem água em um recipiente hermeticamente fechado, como uma ampola ou sachette indicando a quantidade de agente ativo. Quando a composição deve ser administrada por infusão, pode ser dispensado com uma garrafa de infusão contendo água grau farmacêutico ou salina estéril. Quando a composição é administrada por injeção, uma ampola de água esterilizada para injeção ou solução salina estéril pode ser fornecida para que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

[228] Em um exemplo de realização preferido do décimo segundo aspecto da presente invenção, a composição farmacêutica compreende pelo menos outro agente ativo. Preferencialmente, o pelo menos um agente ativo adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em outra proteína de ligação ao antígeno antagonista de acordo com qualquer um dos aspectos de 1 a 6 da presente invenção, um inibidor de ponto de verificação, um medicamento quimioterápico, um medicamento radioterápico, um agente antiangiogênico, uma vacina contra o câncer e um vírus oncolítico.

Por exemplo, o pelo menos um agente ativo adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em carboplatina-paclitaxel, trastuzumabe, pertuzumabe, erlotinibe, lapatinibe, imatinibe, vemurafenibe, dabrafenibe, trametinibe, bevacizumabe, sunitinibe e pazopanibe.

[229] Em um décimo terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a um kit que compreende a composição farmacêutica de acordo com o décimo segundo aspecto da presente invenção e, opcionalmente, pelo menos outro agente ativo. Preferencialmente, o pelo menos um agente ativo adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em outra proteína de ligação ao antígeno antagonista de acordo com qualquer um dos aspectos de 1 a 6 da presente invenção, um inibidor de ponto de verificação, um medicamento quimioterápico, um medicamento radioterápico, um agente antiangiogênico, uma vacina contra o câncer e um vírus oncolítico. Por exemplo, o pelo menos um agente ativo adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em carboplatina-paclitaxel, trastuzumabe, pertuzumabe, erlotinibe, lapatinibe, imatinibe, vemurafenibe, dabrafenibe, trametinibe, bevacizumabe, sunitinibe e pazopanibe.

[230] Em um décimo quarto aspecto, a presente invenção refere- se à proteína de ligação ao antígeno antagonista de acordo com qualquer um dos aspectos de 1 a 6 da presente invenção, o ácido nucleico do sétimo aspecto da presente invenção, o vetor do oitavo aspecto da presente invenção ou a composição farmacêutica do décimo segundo aspecto da presente invenção para uso no tratamento do câncer e/ou doença infecciosa crônica.

[231] Em um exemplo de realização preferido do décimo quarto aspecto da presente invenção, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) Neoplasias malignas do lábio, cavidade oral e faringe; e/ou (b) Neoplasias malignas dos órgãos digestivos; e/ou (c) Neoplasias malignas de órgãos respiratórios e intratorácicos; e/ou (d) Neoplasias malignas do osso e cartilagem articular; e/ou (e) Melanoma e outras neoplasias malignas da pele; e/ou (f) Neoplasias malignas de tecidos mesoteliais e moles; e/ou (g) Neoplasia maligna da mama; e/ou (h) Neoplasias malignas dos órgãos genitais femininos; e/ou (i) Neoplasias malignas dos órgãos genitais masculinos; e/ou (j) Neoplasias malignas do trato urinário; e/ou (k) Neoplasias malignas do olho, cérebro e outras partes do sistema nervoso central; e/ou (l) Neoplasias malignas da tireoide e outras glândulas endócrinas; e/ou (m) Neoplasias malignas de tecido linfoide, hematopoiético e tecidos relacionados.

[232] Preferencialmente, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em NSCLC (câncer de pulmão de células não pequenas), melanoma, MSI (câncer associado à instabilidade de microssatélites), câncer de bexiga, câncer renal, câncer de cabeça e pescoço, linfoma de Hodgkin,

carcinoma hepatocelular (HCC) e câncer gástrico.

[233] Em outro exemplo de realização preferido do décimo quarto aspecto da presente invenção, a doença infecciosa crônica é selecionada a partir do grupo que consiste em HBV, HCV, HIV, HSV, HPV, EBV, CMV e Chlamydia. Preferencialmente, a doença infecciosa crônica é causada por HBV, HCV, HIV e HPV.

[234] Em outro exemplo de realização preferido do décimo quarto aspecto da presente invenção, o pelo menos outro agente ativo é administrado ao sujeito com tal necessidade. Preferencialmente, o pelo menos outro agente ativo e a proteína de ligação antagonista de qualquer um dos aspectos de 1 a 6 da presente invenção, o ácido nucleico do sétimo aspecto da presente invenção, o vetor do oitavo aspecto da presente invenção ou as composições farmacêuticas do décimo segundo aspecto da presente invenção são administrados de maneira simultânea ou sequencial ou uma combinação das mesmas.

[235] Os exemplos a seguir são meramente ilustrativos da presente invenção e não devem ser interpretados de forma alguma como limitantes do escopo da invenção conforme indicado pelas reivindicações anexas.

EXEMPLOS MATERIAIS E MÉTODOS ANTICORPOS E PROTEÍNAS RECOMBINANTES HUMANAS

[236] Foram utilizados os seguintes anticorpos: anticorpo monoclonal anti-His conjugado com peroxidase de rábano (HRP) (Qiagen, Hilden, Alemanha); Anticorpo monoclonal de camundongo anti-M13 conjugado com HRP (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Reino Unido); anticorpo monoclonal de camundongo anti-LAG-3 humano (R&D Systems, Minneapolis, EUA); anticorpo monoclonal humano anti-PD-1 humano Nivolumabe (Opdivo®,

Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ, EUA); anticorpo monoclonal humano anti- PD-L1 humano (G&P Biosciences, Santa Clara, CA, EUA); anti-IgG humana conjugado com (HRP) (Promega Madison, WI, EUA); anticorpo monoclonal de camundongo anti-CD2 humano - PE (BioLegend Inc., San Diego, CA, EUA); anticorpo de camundongo anti-CD3 humano - PE; anticorpo monoclonal de camundongo anti-CD4 humano - APC; anticorpo monoclonal de camundongo anti-CD8 humano - PerCP (todos da BD Biosciences, San Jose, CA, EUA); anticorpo monoclonal de cabra anti-(Fab')2 de IgG humana conjugado com (HRP) (Abcam, Cambridge, UK); anticorpo de camundongo anti-Fc de IgG humana - APC; anticorpo de camundongo anti-CD366 (TIM3) humano - APC/Cy7; anticorpo de camundongo anti-CD272 (BTLA) humano APC; anticorpo de camundongo anti-CD137 (4-1BB) humano - APC; anticorpo de camundongo anti-CD134 (OX40) humano - PE; anticorpo de hamster anti- CD27 de camundongo/rato/humano - Brilliant Violet 510™; anticorpo de hamster anti-CD278 (ICOS) de humano/camundongo/rato - APC (todos da BioLegend); anticorpo de camundongo anti-TIGIT humano - FITC (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Foram utilizadas as seguintes proteínas quiméricas recombinantes: LAG-3/Fc humana; PD-1/Fc humano; PD-L1/Fc humano; TIM3/Fc; BTLA/Fc; TIGIT/Fc; OX40/Fc; 4-1BB/Fc; CD27/Fc e ICOS/Fc; IgG1-Fc humana (todos da R&D Systems).

CULTURAS DE CÉLULAS

[237] As células MDA-MB-231 foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco DMEM, Thermo Fisher Scientific). As células MCF7 foram cultivadas em meio de Eagle modificado (Gibco MEM, Thermo Fisher Scientific). Os meios foram suplementados com 10% (vol/vol) de soro bovino fetal inativado pelo calor (SBF, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), 50 IU mL-1 de penicilina, 50 µg.mL-1 de estreptomicina, 2 nM de L-glutamina (todos da Gibco®, Thermo Fisher Scientific). As linhagens de células foram adquiridas da Coleção Norte-America American Type Culture Collection (ATCC) e cultivadas em atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 a 37ºC.

ISOLAMENTO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DO SANGUE PERIFÉRICO HUMANO (HPBMCS)

[238] As células mononucleares de sangue periférico humano (hPBMCs) foram isoladas de sangue de doadores saudáveis usando ACCUSPIN® System-Histopaque®-1077 (Sigma-Aldrich) seguindo as instruções do fabricante e congeladas em uma solução contendo 90% de SBF e 10% de DMSO até o uso. Os frascos de células criopreservadas foram suavemente descongelados usando meio RPMI 1640 (Gibco®, Thermo Fisher Scientific) suplementado com 1% de L-glutamina, 1% de CTL-Wash® (Cellular Technology Limited, Cleveland, OH, EUA) e 100 U/mL Benzonase (Merck Millipore, Billerica, MA, EUA). As hPBMCs coletadas foram então lavadas por centrifugação, semeadas e incubadas durante a noite a 37ºC em meio R10 consistindo em RPMI 1640 (Gibco®, Thermo Fisher Scientific) suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado (FBS, Sigma-Aldrich), 1% de L- glutamina, 50 U mL-1 de penicilina, 50 μg mL-1 de estreptomicina e 1% de HEPES (todos da Gibco®, Thermo Fisher Scientific). Após um repouso noturno, as hPBMCs foram coletadas em PBS, contadas usando o analisador Muse® Cell Analyzer (Merck Millipore), e ressuspensas a uma densidade de 1x10 6 células/mL.

ANÁLISE FACS DOS NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE PONTOS DE VERIFICAÇÃO IMUNOLÓGICOS EM HPBMCS

[239] As células mononucleares de sangue periférico humano resgatadas e contadas (hPBMCs) foram ativadas com Dynabeads® Human T- Activator CD3/CD28 a uma concentração de 1x103 esferas/mL (Gibco®, Thermo Fisher Scientific). Após 24-96 horas de ativação, as células foram semeadas em uma placa de 96 poços de fundo redondo (1x10 6 células/poço) e então centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos para remover o sobrenadante.

Anticorpos primários anti-LAG-3, anti-PD-1 (Nivolumabe) ou anti-PD-L1 não marcados foram adicionados a cada poço a uma concentração de 10 μg/mL e incubados por 90 minutos em temperatura ambiente por agitação suave. Após lavagens extensas, as células foram coradas com 100 μL de anticorpo anti-Fc IgG humana APC em tampão FACS (PBS, 1% de SBF) e com 10 μg/mL de anticorpo anti-CD2 humano PE (BioLegend) por 45 minutos em temperatura ambiente com agitação suave. Os anticorpos anti-CD366 (TIM3) humano marcados com APC/Cy 7, anti-CD272 (BTLA) humano - APC, anti-CD137 (4- 1BB) humano - APC, anti-CD134 (OX40) humano - PE, anti-CD27 de camundongo/rato/humano - Brilliant Violet 510®, anti-CD278 (ICOS) humano/camundongo/rato - APC, anti-TIGIT humano - FICT foram adicionados a cada poço a uma concentração de 10 μg/mL e incubados por 90 minutos em temperatura ambiente agitando suavemente. Após duas lavagens com tampão FACS, as células foram ressuspensas em PBS, transferidas para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL (BD Biosciences) e analisadas em um citômetro CytoFLEX Flow Cytometer (Beckman Coulter, Brea, CA, EUA).

ENSAIOS DE LIGAÇÃO POR CITOMETRIA DE FLUXO DE MABS PARA HPBMCS

[240] As células mononucleares do sangue periférico humano (hPBMCs) isoladas de doadores saudáveis foram descongeladas em meio RPMI 1640 (Gibco), suplementado com 2mM de L-glutamina, suplemento de lavagem CTL a 10% (v/v) (CTL, Shaker Heights, Ohio, EUA), 100 U/ml Benzonase (Merck Millipore, B urlington, Massachusetts, Estados Unidos).

Após a centrifugação a 1200 rpm por 10 min, elas foram ressuspensas em meio RPMI completo suplementado com 10% (v/v) de soro bovino fetal inativado por calor (SBF, Sigma), 2mM de L-glutamina, 100U/ml de penicilina e 100 μg/mL estreptomicina (Gibco), HEPES 10 mM (Gibco). Após descansarem por 16h a 37ºC em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2, as hPBMCs foram contadas, ressuspensas a uma concentração de 10 6 células viáveis/mL em meio RPMI completo (como acima) e ativadas com Dynabeads Human T- Activator CD3/CD28 (Gibco), 25 μL de esferas/106 células viáveis. 24h após a ativação, as células foram centrifugadas e plaqueadas a uma densidade de 4x105 células/poço em PBS em uma placa de 96 poços de fundos redondos.

Após uma lavagem em PBS, as células foram incubadas com 50 μL de corante LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain (Invitrogen) por 30 min a + 4ºC e lavadas novamente. Os mAbs, diluídos em 100 μL de PBS nas concentrações de 48 pM e 9,6 pM, foram adicionados às células e incubados por 1h e 30 min em temperatura ambiente no escuro com agitação suave. As células foram lavadas duas vezes como antes e depois incubadas com 5 μL de anti-CD2 humano conjugado com PE (BD Biosciences) e 1:2000 anti-IgG humano conjugado com APC, anticorpo específico de Fcγ (Jackson immunoresearch), diluído em 100 μL de tampão FACS (PBS1X 1% (v/v) SBF). Após 45 min de incubação nas mesmas condições, foram realizadas duas lavagens com tampão FACS e as células foram ressuspensas em 150 μL de PBS1X para a aquisição no citômetro de fluxo CytoFLEX (Beckman Coulter).

SELEÇÃO DE CLONES DE FAGO-SCFV

[241] Partículas de fagomídeo foram recuperadas a partir da biblioteca utilizando o fago auxiliar M13-K07 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific), como anteriormente descrito (De Lorenzo C, Clinical Cancer Research, 2002). Para cada rodada de seleção os fagos (1013 cfu) foram bloqueados com 5% (p/v) de leite em pó desnatado (Fluka analítica, Sigma- Aldrich) em PBS. Para a primeira rodada de seleção, os fagos bloqueados foram submetidos a uma rodada de seleção realizada incubando-os com linfócitos ativados (1x106) durante a noite a 4ºC em rotação. Após extensas lavagens com PBS, os fagos ligados foram eluídos de linfócitos ativados com ácido cítrico 76 mM (pH 2,5) em PBS por 5 minutos e depois neutralizados com

Tris HCl 1M (pH 8,0). Os fagos recuperados foram amplificados por infecção de células E. coli TG1 para preparar fagos para as próximas rodadas de seleção na proteína quimérica purificada. Para isso, tubos de polipropileno Nunc™ (Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific) foram revestidos com proteína quimérica recombinante selecionada a uma concentração de 20 μg/mL em solução de NaHCO3 a 0,05 M, por 72 horas a 4ºC. Os fagos bloqueados foram submetidos a duas rodadas seguintes de seleção negativa incubando-os nos tubos revestidos com a proteína rhIgG1-Fc por 2 horas a 4ºC com rotação. Os fagos não ligados, recuperados no sobrenadante, foram então incubados nos tubos revestidos, preparados como descrito acima para seleção positiva, durante a noite a 4ºC com rotação, e eluídos conforme descrito acima.

Alternativamente, tripsina foi usada para a eluição. Resumidamente, após lavagens extensas com PBS, os fagos ligados foram incubados com tampão Tris HCl 50 mM (pH 8,0) contendo CaCl2 1 mM por 1 hora a 4ºC em rotação e, em seguida, eluídos a partir das proteínas quiméricas com tripsina (1μg/mL) e incubados por mais 15 minutos a 25ºC agitando suavemente. A reação foi então bloqueada usando inibidores de protease (coquetel inibidor de protease sem EDTA cOmplete™, Sigma-Aldrich). Os fagos foram então coletados e armazenados a 4ºC até o uso.

PREPARAÇÃO DE FRAGMENTO DE DNA E SEQUENCIAMENTO DE ALTO RENDIMENTO

[242] Para cada sub-biblioteca, os DNAs de fita dupla de fagomídeos contendo o scFvs foram purificados a partir de culturas de células E. coli TG1 superinfectadas usando o kit Endo free Plasmid Maxi Kit (Qiagen).

Os scFvs de comprimento total foram excisados com as enzimas de restrição BamHI e HindIII (New England Biolabs) e purificados com gel Wizard® SV e PCR Clean-Up System (Promega) a partir de gel de agarose 1,2%. Uma segunda excisão enzimática foi realizada com NcoI e XhoI (New England Biolabs) para isolar as VHs a partir do material previamente purificado e, em seguida, extraídas a partir de um gel de agarose a 1,4%. As preparações da biblioteca para NGS, sequenciamento e análise bioinformática preliminar dos dados foram realizadas no Center for Translational Genomics and Bioinformatics, Hospital San Raffaele, Milão, Itália. As VHs extraídas das sub- bibliotecas foram codificadas usando o kit TruSeq ChIP sample prep (Ilumina).

Um esquema complementar para código de barras foi implementado para obter um sequenciamento profundo e adequado de misturas VH de vários sub ciclos.

Os subciclos 2 e 3 para cada alvo foram misturados em uma execução dedicada. O primeiro ciclo universal 1 foi sequenciado separadamente para cobrir a maior complexidade. As amostras com código de barras foram diluídas para uma concentração final de 10 pM e sequenciadas com kit 2 × 300 nt SBS v3 em um aparelho Illumina MiSeq.

RECUPERAÇÃO DE SCFV

[243] Os clones de interesse foram isolados da sub-biblioteca no ciclo 3 do alvo correspondente. Para clones de alto nível, o kit de mutagênese sítio-dirigida QuickChange II XL Site-Directed Mutagenesis (Agilent Technologies) foi usado para realizar cópias de clones com primers sobrepostos, projetados dentro das regiões HCDR3 correspondentes, de acordo com o procedimento descrito anteriormente 26. Resumidamente, as reações de extensão foram montadas da seguinte forma: 50–250 ng de molde (template); 2/5 μL de reagente QuickSolution; 1 μL de Pfu de DNA polimerase Ultra High Fidelity DNA polimerase (2,5 U/μL); 5 μL de tampão de reação 10x; 1 μL de dNTPmix; 125 ng de iniciador (primer) direto; 125 ng de iniciador reverso; H2O para um volume final de 50 μL. O DNA molde foi removido por restrição com 1 μL da enzima DpnI, conforme sugerido pelo fornecedor do kit.

Uma quantidade apropriada de reação foi usada para transformar células ultracompetentes XL10-GOLD (Agilent Technologies) e depois plaqueadas em placas de ágar/LB contendo 100 μg/mL de ampicilina. Algumas colônias foram coletadas e avaliadas por dupla digestão e sequenciamento. Para clones de baixa classificação, as amostras de DNA foram isoladas do ciclo 3 por PCR de sobreposição. Resumidamente, a polimerase de DNA Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Fisher Scientific) foi usada para realizar duas reações de PCR para obter fragmentos VH e VL separadamente, usando iniciadores projetados dentro das regiões HCDR3 correspondentes e na região constante do plasmídeo a montante e a jusante de VH e VL. Em uma segunda etapa, os fragmentos da PCR, correspondentes a cada clone foram misturados e estendidos para obter os scFvs completos. As reações foram montadas da seguinte forma: 150 ng de molde para amplificação de fragmentos VH e VL e 10 ng de molde (fragmentos VH e VL) para amplificação de scFv completo; 0,5μL de DNA Polimerase Phusion (0,02 U/μL); 10 μL de tampão Phusion HF 5x; 1 μL de dNTP mix; iniciador direto 0,5 μM; iniciador reverso 0,5 μM; 1,5 μL de DMSO; H2O para um volume final de 50μL.

PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS

[244] Os scFvs de interesse foram convertidos em anticorpos IgG4 inteiros por clonagem dos cDNAs VH e VL correspondentes nos vetores pEU 8.2VH e 4.2VL, expressando, respectivamente, as cadeias pesadas e leves constantes do anticorpo (Paciello R, J Gen Virol., 2016). Resumidamente, as VHs e VLs foram amplificadas por CloneAmp HiFi PCR Premix em condições padrão com iniciadores específicos e purificadas com Wizard® SV Gel e PCR Clean-Up System (Promega) a partir de gel de agarose a 1,3%. O kit de clonagem In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Mountain View, CA, EUA) foi usado para clonar as VHs nos sítios BamHI e BssHII (New England Biolabs) do vetor pEU8.2VH linearizado e as VLs nos sítios ApaLI e AvrII (New England Biolabs) do vetor pEU4.2VL linearizado. As células competentes Stellar (Clontech Laboratories, Inc, MountainView, CA, EUA) foram transformadas com os vetores obtidos e as colônias foram rastreadas por digestão e análise de sequência. As preparações corretas foram cotransfectadas em HEK293-EBNA usando o reagente Lipofectamine Transfection (Life Technologies, Inc.) e cultivadas por cerca de 10 dias a 37ºC em meio CD CHO quimicamente definido (Gibco, Life Technologies, Inc.) suplementado com 5 mL de L-glutamina a 200mM (Gibco, Life Technologies), 5 mL de penicilina-estreptomicina a 10.000 U/mL-10 mg/mL (Sigma-Aldirch) em placas de 6 poços ou em placas de cultura Corning ® de 150 mm tratadas para cultura de tecidos. Os meios condicionados foram coletados e os anticorpos foram purificados usando Protein A HP SpinTrap (GE Healthcare Life Sciences, New York, USA). A pureza dos produtos finais foi avaliada por SDS-PAGE NuPAGE™ 4-12% em géis Bis-Tris Protein Gels, 1,0 mm, 10 poços (Thermo Fisher Scientific) seguido pela coloração com solução de azul de Coomassie (Biorad) por 20 minutos e descoradas com 7% de CH3COOH e 20% de Et-OH.

ENSAIO DE IMUNOADSORÇÃO ENZIMÁTICA (ELISA)

[245] Para confirmar a especificidade de ligação dos mAbs purificados, ensaios de ELISA foram realizados em proteínas quiméricas (revestidas a 5 μg/mL), células tumorais (células MDA-MB-231 de câncer de mama positivas para PD-L1 ou células MCF7 de câncer de mama negativas para PD-L1), e hPBMCs não tratados ou ativados. Os ensaios de ELISA em proteína quimérica revestida foram realizados revestindo placas de 96 poços de fundo plano Nunc™ (Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific) com 5 μg/mL de proteínas recombinantes rhPD-1, rhPD-1 e rhLAG-3 em uma solução de 0,05 M de NaHCO3 durante 72 horas a 37ºC. Após o bloqueio das placas de 96 poços revestidas com 5% de leite em pó desnatado em PBS por 1 hora a 37ºC, os mAbs purificados foram adicionados em concentrações crescentes (10-200 nM) às placas em 2,5% de leite em pó desnatado em PBS e incubadas durante 2 horas em temperatura ambiente sob agitação suave. Após lavagens extensas com PBS, as placas foram incubadas com anticorpo monoclonal de cabra anti-IgG humana (Fab')2 conjugado com (HRP) (Abcam, Cambridge, Reino Unido) por 1 hora, lavadas novamente e incubadas com reagente TMB por 10 min antes extinção com um volume igual de HCl 1N.

[246] Os ensaios de ELISA com células foram realizados semeando as células em placas de 96 poços de fundos redondos (2x10 5 células ou 2x105 linfócitos para cada poço) e as placas foram incubadas com concentrações crescentes (0,5-200 nM) de mAbs em 2,5% de leite desnatado liofilizado por 2 horas em temperatura ambiente com agitação suave. As placas foram então centrifugadas, os sedimentos celulares foram lavados com PBS e incubados com anticorpo policlonal de cabra anti-IgG humana conjugado com HRP por 1 hora em temperatura ambiente. Após lavagens adicionais em PBS 1X, o reagente TMB foi adicionado por 10 min antes da extinção com um volume igual de HCl 1N. A absorbância a 450 nm foi medida pelo leitor de placas Envision (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA).

ENSAIO DE ELISA COMPETITIVO

[247] Para determinar se os novos mAbs anti-PD-1 reconhecem epítopos diferentes de Nivolumabe, foram realizados ensaios de ELISA competitivos com proteína quimérica PD-1/Fc revestida (5 µg/mL). Após o bloqueio com 5% de leite em pó desnatado em PBS, a placa de 96 poços revestida foi pré-incubada por 2 horas com concentrações saturantes de cada mAb não marcado (400nM) em 2,5% de leite em pó desnatado em PBS em agitação em temperatura ambiente. Após extensas lavagens com PBS, concentrações crescentes de mAb Nivolumabe biotinilado foram adicionadas.

Para a detecção da ligação, a placa foi incubada com Estreptavidina conjugada com HRP (Biorad) durante 30 minutos em agitação em temperatura ambiente, lavada novamente e analisada conforme descrito acima.

ANÁLISE DE LIGAÇÃO DE ANTICORPOS ÀS HPBMCS POR FACS

[248] As células mononucleares de sangue periférico humano

(hPBMCs) foram resgatadas no dia após o descongelamento, contadas e, em seguida, ativadas com Dynabeads® human T-Activator CD3/CD28 a uma concentração de 1 x 103 esferas/mL (Gibco™ Thermo Fisher Scientific). Após 24-96 horas de ativação, as células foram semeadas em uma placa de 96 poços de fundos redondos (4x105 células/poço) e então centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos para remover o sobrenadante. Os mAbs anti-PD-L1 (PD- L1_A e PD-L1_C) foram adicionados a uma concentração de 10 μg/mL e incubados durante 90 minutos à temperatura ambiente agitando suavemente.

Após lavagens extensas, as células foram coradas com 100 μL do anticorpo anti-Fc IgG humana APC em tampão FACS (PBS, 1% de SBF) e com 10 μg/mL de anticorpo anti-CD2 humano PE (BioLegend) por 45 minutos em temperatura ambiente com agitação suave. Após duas lavagens com tampão FACS, as células foram ressuspensas em PBS, transferidas para um tubo de fundo redondo de poliestireno (BD Biosciences) e analisadas em um citômetro CytoFLEX Flow Cytometer (Beckman Coulter).

ENSAIOS DE PROLIFERAÇÃO DE LINFÓCITOS

[249] Os ensaios de proliferação de linfócitos foram realizados usando hPBMCs, contadas como descrito acima e resuspensas a uma densidade de 2x106 células/mL em solução pré-aquecido de BSA/PBS a 0,1%.

Para a coloração, solução pré-aquecida de 0,1% BSA/PBS contendo CFDA-SE (Vybrant® Cell Tracer Kit, Invitrogen™, Thermo Fisher Scientific) a uma concentração de 10 μM foi usada para ressuspender as hPBMCs a uma densidade de 1x106 células/mL, que foram incubadas a 37ºC durante 10 minutos. Então, foi utilizado o meio R10 gelado para permeabilizar as células por incubação em gelo por mais 5 min. Em seguida, as células foram lavadas por três vezes com PBS. Entre a segunda e a terceira lavagem, as células foram incubadas a 37ºC durante 5 minutos para permitir a remoção completa do excesso de CFDA-SE. Após a última lavagem e centrifugação a 1200 rpm por 10 minutos, as células foram ressuspensas a uma densidade de 1×106 células/mL em R10 e plaqueadas em uma placa de 48 poços (1x10 6 células/poço). Os Ensaios de Proliferação de Linfócitos foram realizados incubando os linfócitos plaqueados com 2,5 µg/mL de Fitohemaglutinina-L (PHA-L, Roche), na ausência ou na presença dos mAbs anti-LAG-3 selecionados (10 µg/mL). As placas foram incubadas a 37ºC por 5 dias. No final do tratamento, cada amostra foi recuperada, ressuspensa em 100 µL de PBS e transferida para uma placa de 96 poços de fundo redondo. Primeiro, as células foram incubadas com solução violeta LIVE/DEAD (Thermo Fisher Scientific) por 30 minutos a 4ºC. Após várias lavagens, as amostras foram incubadas ainda com os anticorpos anti-CD3 humano (APC), anti-CD4 (PE) e anti-CD8 (PerCP) (10 μL/amostra) por 1 hora a 4ºC. Finalmente, as células foram extensivamente lavadas, ressuspensas em 200 μL de PBS e transferidas para tubos de poliestireno de fundo redondo de 5 mL (BD Biosciences) para a aquisição por citometria em um citômetro de fluxo CytoFLEX (Beckman Coulter).

EXEMPLO 1

SELEÇÃO DE SCFVS EM LINFÓCITOS T HUMANOS ATIVADOS

[250] Nosso objetivo era a geração de repertórios de anticorpos humanos contra pontos de verificação imunológicos (IC). Uma vez que muitos IC são expressos na superfície dos linfócitos T e sua expressão é aumentada quando as células T são expostas a estímulos dependentes ou independentes de antígeno, procuramos usar células mononucleares de sangue periférico humano não fracionado (hPBMCs) para rastrear bibliotecas de fragmentos de anticorpos de cadeia única humanos (scFvs). Para otimizar o processo de seleção, primeiro avaliamos a cinética e o nível de expressão de dez IC diferentes (indicados na Tabela 1) após a ativação in vitro com esferas anti- CD3/CD28. Conforme mostrado na Tabela 1, a expressão de pico medida por análise de citometria de fluxo variou entre os diferentes imunomoduladores, no entanto, a maioria deles atingiu níveis máximos de exibição após 96 horas de estimulação (consulte a Tabela 1). Após 96 horas de estimulação, todos os IC foram bem expressos em mais de 50% da população gated, exceto BTLA, que manteve os mesmos níveis de exibição de superfície entre hPBMCs não tratadas e ativadas, e TIGIT, que aumentou apenas ligeiramente seus níveis de expressão. Com base nesta análise, escolhemos 96h como o ponto de tempo para a ativação de linfócitos a serem usados para a seleção da biblioteca de scFv humano.

TABELA 1

PORCENTAGEM DE EXPRESSÃO DE CADA ALVO EM LINFÓCITOS HUMANOS NÃO TRATADOS OU ATIVADOS EM DIFERENTES INTERVALOS DE TEMPO. Níveis de expressão (%) de cada alvo em linfócitos humanos Moduladores de ponto HPBMCs não HPBMCs ativadas HPBMCs ativadas de verificação ativadas (24h) (96h) imunológico LAG-3 1 53 59 PD-L1 7 90 99 PD-1 11 52 95 TIM3 0,8 20 65 BTLA 47 33 40 TIGIT 11 17,5 21 OX40 2 67 86 4-1BB 1 53,5 70 CD27 36 28 60 ICOS 3 32 90

[251] Cerca de um milhão de partículas de fago foram selecionadas por panning da biblioteca em hPBMCs ativadas conforme descrito na Seção de Procedimentos Experimentais (ciclo de seleção 1). Este pool de fagos potencialmente representou uma grande coleção de ligantes para muitos IC diferentes, doravante referidos como 'Biblioteca de Imunoma’.

Para facilitar a identificação de ligantes para ICs específicos, usamos proteínas recombinantes de fusão com Fc em processos de isolamento e amplificação (denominados panning) sucessivos para realizar dez seleções paralelas diferentes da Biblioteca de Imunoma levando a repertórios específicos para ICs.

EXEMPLO 2

IDENTIFICAÇÃO DE LIGANTES SCFV POR SEQUENCIAMENTO DE PRÓXIMA GERAÇÃO

[252] Para identificar clones de fago individuais selecionados pela abordagem combinada ex vivo/in vitro, sequenciamos as regiões VH dos Repertórios específicos de IC por sequenciamento paralelo maciço na plataforma MiSeq Illumina (consulte a Seção de Materiais e Métodos para obter detalhes). Para garantir o enriquecimento eficiente do fago alvo-específico, a partir da biblioteca de imunoma (ciclo 1), realizamos dois ciclos subsequentes de seleção em proteínas recombinantes de fusão Fc (ciclos 2 e 3). A análise de sequência de todo o conjunto de seleções revelou que os enriquecimentos ocorreram já após o ciclo 2, mas que níveis significativamente mais elevados de enriquecimento (ou seja : pelo menos 10 vezes) foram obtidos após o terceiro ciclo (Figura 1). A análise dos dados de sequenciamento paralelo nos permitiu remover as sequências VH comuns a todas as seleções e, provavelmente, devido ao enriquecimento de ligantes Fc compartilhados pelas 10 iscas bioquímicas. De forma similar, os clones não específicos, biologicamente enriquecidos, contendo códons de parada na sequência codificante de scFv, foram retirados da lista de potenciais ligantes. A fim de obter os clones específicos mais relevantes para cada alvo, finalmente definimos um limite de 85 contagens por milhão para a lista dos diferentes ciclos de seleção 3. Dessa forma, capturamos um instantâneo detalhado dos melhores ligantes potenciais para 9 de 10 alvos, que é mostrado na Figura 1. A seleção TIGIT foi realmente removida da análise, uma vez que não exibiu enriquecimento significativo de sequências, possivelmente devido à sua baixa expressão em hPBMCs ativadas (consulte a Tabela 1).

[253] Os ligantes específicos para três alvos, ou seja, LAG-3, PD-1 e PD-L1, foram escolhidos para estudos adicionais, uma vez que anticorpos específicos para eles, como o anti-PD-1 Nivolumabe, foram desenvolvidos anteriormente e são amplamente utilizados na clínica demonstrando benefícios terapêuticos e, portanto, podem ser usados para comparação em ensaios biológicos. Resgatamos os melhores scFvs dos repertórios IC-específicos para LAG-3, PD-1 e PD-L1 , para conversão em IgG4 totalmente humana, com o objetivo de levar em consideração, para caracterizações adicionais, pelo menos 5 anticorpos eficazes para cada um dos três alvos.

EXEMPLO 3

IGGS HUMANAS GERADOS A PARTIR DE LIGANTES SELECIONADOS MOSTRAM ALTA AFINIDADE DE LIGAÇÃO E ATIVIDADE COMPETITIVA RECEPTOR/LIGANTE

[254] Os anticorpos IgG4 humanos gerados a partir dos ligantes LAG-3, PD-1 e PD-L1 de melhor classificação foram confirmados por reconhecerem PBMCs ativadas e proteínas recombinantes com afinidade nanomolar baixa ou subnanomolar (Figura 2 e suas tabelas). Em particular, alguns mAbs anti-PD-1 (ou seja : PD-1_ A e PD-1_ B) mostraram afinidade aparente comparável ou melhor em comparação com o Nivolumabe clinicamente validado. A maioria dos anticorpos anti-PD-1 e anti-PD-L1, incluindo Nivolumabe, exibiram ligação mais forte à proteína recombinante em comparação com as hPBMCs ativadas, enquanto o inverso foi verdadeiro para os anticorpos anti-LAG3. Como os anticorpos anti-PD-L1 demonstraram proporcionar benefícios clínicos ao bloquear a interação entre PD-L1 expressa em células cancerosas e PD-1 exibida por células T, testamos se os anticorpos anti-PD-L1 também reconheceriam seus alvos na superfície das células cancerosas. Todos os anticorpos anti-PD-L1 mostraram alta afinidade também para células tumorais que expressam PD-L1, como células tumorais mamárias MDA-MB-231, no entanto, a hierarquia da atividade de ligação às células tumorais foi diferente daquela observada com hPBMCs ativadas (Tabela na Figura 2). Além disso, mostramos que o mAb PD-L1_A e PD-L1_B foram capazes de interferir no reconhecimento de PD-L1 por seus dois receptores PD-1 e B7.1 em ensaios de ELISA competitivo.

[255] Além disso, os anticorpos selecionados também foram testados quanto à ligação ao ortólogo murino. Diferentemente do Nivolumabe, um dos anticorpos anti-DP-1 foi encontrado por ser reativo com PD-L1 murino.

Portanto, é provável que PD-1_A reconheça um epítopo diferente do Nivolumabe, pois também é evidenciado a partir de ensaios de ELISA competitivos realizados medindo a ligação à PD-1 de Nivolumabe biotinilado na ausência ou presença de concentrações saturantes de mAb PD-1_A não marcado. A ligação simultânea de PD-1_A e Nivolumabe revelou que os dois mAbs não interferiram em suas interações com o receptor.

EXEMPLO 4

IGGS DE ALTA AFINIDADE CONTRA MOLÉCULAS DE PONTO DE VERIFICAÇÃO IMUNOLÓGICO EXIBEM ATIVIDADE IMUNOESTIMULADORA DE CÉLULAS T E FUNÇÕES EFETORAS

[256] Relatórios anteriores mostraram que células primárias em repouso CD3-positivas em hPBMCs não fracionados podem ser induzidas a proliferar in vitro usando Enterotoxina B estafilocócica (SEB) ou Fitohemaglutinina (PHA) e que esta atividade é modulada por CI (Maçon- Lemaître L, Immunology, 2005; Wang C, Cancer Immunol Res., 2014; Selby MJ, Plos One, 2016) Portanto, usamos o ensaio de proliferação de linfócitos descrito acima para testar se os anticorpos selecionados contra LAG-3, PD-1 ou PD-L1 eram capazes de aumentar a divisão celular. Linfócitos marcados com CFDA-SE foram estimulados com PHA e incubados na ausência ou na presença de anticorpos para induzir a proliferação de células T específicas para o antígeno. Neste ensaio, o nivolumabe levou consistentemente a um aumento de 50% na atividade proliferativa e os anticorpos anti-PD-1 PD-1_A e PD-1_B também foram capazes de estimular de forma eficiente a proliferação de células T, com o primeiro mostrando atividade mais alta do que o Nivolumabe clinicamente ativo (Figura 3). Da mesma forma, todos os três anticorpos contra PD-L1 e um dos três anticorpos LAG-3 também induziram vários graus de proliferação. A capacidade de estimular a proliferação nem sempre se correlacionou com a potência de ligação, sugerindo que os diferentes anticorpos podem ter modos distintos de interação com seus alvos.

[257] Curiosamente, os anticorpos PD-1_A e PD-L1_A, que foram os melhores anticorpos ativadores em linfócitos humanos, confirmaram essa capacidade também em linfócitos murinos, sugerindo assim que eles apresentam reatividade cruzada com PD-1 e PD-L1 de camundongo.

Aproveitamos as vantagens das células tumorais de mama MDA-MB-231 expressando altos níveis de PD-L1 em sua superfície, para testar a capacidade dos anticorpos anti-PD-L1 e anti PD-1 em suprimir a ação inibitória da interação PD-1/PD-L1 na proliferação de linfócitos quando os dois tipos de células são cocultivados. Como mostrado na Figura 4, os mAbs PD-L1_A e PD-1_A induziram a proliferação de linfócitos de uma maneira dose-dependente, enquanto apenas um ligeiro efeito foi detectado em linfócitos tratados com mAbs PD-L1_B e PD-1_B. Também neste ensaio, o mAb PD-L1_A e PD-1_A exibiram atividade mais alta do que Nivolumabe, enquanto nenhum efeito sobre a proliferação de linfócitos foi observado quando células tumorais MCF7 negativas para PD-L1 foram usadas. Curiosamente, em alguns casos, a capacidade de estimular a proliferação não se correlacionou com a afinidade aparente mais elevada, como no caso dos mAbs LAG3_ A e LAG3_C (Figura 2 e Tabela na Figura 2).

[258] Três anticorpos anti PD-L1 adicionais foram identificadas e caracterizadas no que diz respeito ao PD-L1_A. Os três anticorpos, PD-L1_C, PD-L1_D e PD-L1_E foram avaliados quanto à sua ligação às PBMCs humanas, previamente ativados para induzir a expressão de PD-L1 na superfície. Uma maior porcentagem de linfócitos foi corada com três anticorpos em relação ao PD-L1_ A (consulte a Figura 7).

EXEMPLO 5

EFEITOS DE NOVOS ANTICORPOS NA PRODUÇÃO DE CITOCINAS POR HPBMCS ESTIMULADAS

[259] As hPBMCs (1x106 células) foram cultivadas e estimuladas com 2,5 μg/mL de PHA-L ou 50 ng/mL de enterotoxina B de estafilococos (SEB, Sigma-Aldrich) por 18, 42 e 66 horas, na ausência ou na presença de mAbs anti-LAG-3, anti-PD-L1 e anti-PD-1 selecionados (20 μg/mL) ou de um anticorpo de controle isotípico, usado como controle negativo. O nivolumabe foi testado como controle positivo em ensaios paralelos, nas mesmas condições.

Os níveis concentrações de IL-2 ou IFN-γ nos sobrenadantes de cultura celular foram mensurados por ensaios ELISA (DuoSet ELISA, R&D Systems) de acordo com as recomendações do fabricante.

[260] Anticorpos imunomoduladores, como Nivolumabe e Ipilimumabe, mostraram melhorar as funções efetoras de células T e esta propriedade potencialmente aumenta seu benefício clínico (Maçon-Lemaître L, Immunology, 2005; Wang C, Cancer Immunol Res., 2014; Selby MJ, Plos One, 2016). Portanto, testamos cinco anticorpos entre aqueles com a maior capacidade de induzir a proliferação de células T (LAG-3_A, PD-1_A, PD-1_B, PD-L1_A e PD-L1_B) em um ensaio de secreção de citocinas previamente relatado para a caracterização do Nivolumabe (Wang C, Cancer Immunol Res.,

2014). Conforme mostrado na Figura 5, todos os anticorpos testados foram capazes de aumentar a secreção de IL-2 e IFNγ por hPBMCs estimulados com PHA ou SEB. A secreção de citocinas aumentou ao longo do tempo após a adição dos diferentes anticorpos à mistura da cultura de células. O mAb PD- 1_1 pareceu ser consistentemente mais potente do que todos os outros anticorpos testados em sua capacidade de estimular a secreção de ambas as citocinas. Também neste ensaio, os anticorpos recém-identificados foram comparados favoravelmente com o Nivolumabe, apoiando ainda mais a conclusão de que a Biblioteca de Imunoma que geramos é enriquecida em ligantes com bom potencial para ser desenvolvida para uso clínico.

[261] Dois dos anticorpos anti-PD-L1 adicionais (PD-L1_C e PD- L1_D) que foram identificados e caracterizados em relação ao PD-L1_A, também foram avaliados no ensaio de secreção de citocina descrito em comparação com Nivolumabe. Conforme mostrado na Figura 8, todos os anticorpos testados foram capazes de aumentar a secreção de IL-2 e IFNγ por hPBMCs estimulados com PHA ou SEB.

EXEMPLO 6

ATIVIDADE ANTITUMORAL IN VIVO

[262] Camundongos BalBC fêmeas com seis semanas de idade (Envigo) foram usados para estudos in vivo. Os camundongos foram implantados subcutaneamente no flanco direito com 2x10 5 células (dia 0) e, em seguida, tratados intraperitonealmente com 200 μg de α-mPD-L1 (BioXcell, clone 10F.9G2), α-mPD-1 (BioXcell, clone RMP114), PD-1_A ou PD-L1_A no dia 3, 6, 10. O crescimento do tumor foi medido por um paquímetro a cada 3-4 dias usando a fórmula LxW2/2 (L como o maior e W o menor diâmetro do tumor). Os animais foram sacrificados assim que surgiram sinais de angústia ou um volume tumoral acima de 2.000 mm3.

[263] Os dois anticorpos PD-1_A e PD-L1_A, dada sua reatividade cruzada com PD-1 e PD-L1 de camundongo, também foram testados in vivo no modelo de câncer de cólon CT26. Os camundongos foram implantados com células CT-26 (dia 0) e, em seguida, tratados com anticorpos PD-1_A e PD-L1 (dia 3, 6, 10). Dois anticorpos disponíveis comercialmente reagindo contra PD-1 e PD-L1 murino (α-mPD-1 e α-mPD-L1) e previamente validados in vivo (ref) foram usados como controles positivos. Enquanto a taxa de crescimento tumoral em camundongos não tratados foi muito rápida e descontrolada, com a maioria dos tumores atingindo tamanhos de > 650 mm 3 no dia 21, uma redução no volume tumoral foi encontrada nos camundongos tratados com PD-1_A (p = 0,03). A atividade do anticorpo anti-PD-1 de reação cruzada é comparável à do anticorpo comercial contra PD-1 murino. Uma tendência de atividade comparável também foi observada para os dois anticorpos anti-PD-L1 (Fig. 6). Os camundongos tratados apresentam consistentemente uma dicotomia na resposta ao bloqueio PD-1 e PD-L1 com dois resultados de tratamento distintos, camundongos respondedores e não respondentes, bem descritos para este e outros modelos de câncer. Assim, as atividades biológicas e funcionais dos dois novos mAbs também foram confirmadas em um modelo in vivo relevante.

RESUMO EXPERIMENTAL

[264] Os presentes inventores adaptaram a tecnologia de exibição de fago para permitir a identificação rápida de grandes conjuntos de anticorpos que reconhecem vários ICs diferentes. Para este fim hPBMCs ativadas foram escolhidas como seletores para a geração de uma biblioteca imparcial de ligantes de IC, a Biblioteca de Imunoma, a partir da qual scFvs que reconhecem especificamente um determinado receptor poderiam ser retirados por subsequentes ciclos de seleção de afinidade usando proteínas recombinantes ou peptídeos, ou outras iscas alvo-específicas. A justificativa para o uso de hPBMCs como ponto de partida do processo de seleção também foi garantir a seleção de anticorpos capazes de reconhecer o receptor nativo com a modificação pós-tradução correta, conforme exibido por células humanas vivas. Consistentemente com esta hipótese de trabalho, a IgG4 humana gerada usando os scFvs selecionados foi capaz de reconhecer os receptores exibidos nas células com afinidade aparente na faixa nanomolar baixa até 0,1 nM. Esta afinidade de ligação é igual ou melhor do que a afinidade de ligação mostrada para anticorpos específicos para ponto de verificação clinicamente ativo e é superior à do mAb anti-PD-1 Nivolumabe aprovado para o tratamento de muitos tipos de câncer (Wang C, Cancer Immunol Res., 2014). Para melhorar a eficiência da seleção em hPBMCs, aumentamos o nível de expressão do IC alvo por reticulação anti-CD3 das células T.

[265] Para facilitar a identificação de ligantes que reconhecem receptores específicos, usamos um painel de dez proteínas recombinantes para selecionar por afinidade adicional a Biblioteca de Imunoma. Com o objetivo de desenvolver um protocolo universal para a seleção de anticorpos para proteínas exibidas na superfície celular, realizamos dois ciclos subsequentes de seleção em proteínas de fusão-Fc recombinantes. Esta estratégia representou um compromisso entre a eficiência de seleção e geração de repertórios IC-específicos com diversidade significativa para permitir a identificação de anticorpos que se ligam a diferentes regiões do IC alvo e com diferentes atividades biológicas.

[266] Todas as seleções alcançaram níveis de enriquecimento entre 100 e 1000 vezes com quatro deles (PD-1, 4-1BB, CD27 e OX40) atingindo um enriquecimento ainda maior. A análise da sequência comparativa dos diferentes ciclos de seleção confirmou que na maioria das seleções (ou seja, sete de nove) houve uma melhora significativa de enriquecimento clones após o segundo ciclo (ou seja, de pelo menos dez vezes) enquanto a seleção com LAG-3 e OX40 não pareceu melhorar além do segundo ciclo.

[267] Nossos resultados suportam a conclusão de que a abordagem de seleção combinada ex vivo/in vitro usada no contexto da presente invenção é mais rápida e eficiente do que a combinação de seleção em células vivas e identificação de ligantes específicos por triagem direta no alvo de escolha que adotamos anteriormente (Monaci P, Plos One, 2008). No geral, das dezesseis IgGs com ligação confirmada (cinco anti-LAG3, cinco anti- PD-L1 e seis anti-PD-1), onze exibiram afinidade aparente na faixa nanomolar baixa para seu receptor cognato expresso em hPBMCs, e três delas (PD- L1_2, PD-1_1 e PD-1_2) tinham afinidade aparente subnanomolar e eram bem comparáveis com a do Nivolumabe. Entre eles, pelo menos 2-3 dos 5 anticorpos convertidos para cada alvo foram considerados altamente específicos para ambos os alvos purificados recombinantes e linfócitos ativados, sem ligação significativa a linfócitos não tratados ou Fc, e, portanto, eles foram escolhidos para ensaios biológicos e funcionais adicionais.

[268] Quando testado quanto à capacidade de estimular a proliferação de células T, seis dos oito anticorpos (GAL-3_A, PD-L1_A, PD- L1_B, PD-1_A e PD-1_B) mostraram atividade biológica que foi melhorada em comparação com o Nivolumabe. PD-1_A também apresentou atividade significativa na promoção da proliferação de células T em coculturas com a linhagem de células tumorais MDA-MB-231 expressando níveis altos de PD-L1.

Neste ensaio, o mAb PD-L1_A também quase que triplicou proliferação de células T, de forma consistente com a sua capacidade de interferir com a interação PD-L1/PD. Os anticorpos mais ativos nem sempre correspondem aos com a ligação mais forte, tal como o mAb GAL-3_A que tem menor afinidade aparente que o mAb GAL-3_C para a ligação às hPBMCs e ainda foi capaz de estimular a proliferação de células T, enquanto esse último não. Estes resultados também sugerem indiretamente que os anticorpos selecionados reconhecem diferentes epítopos na proteína alvo. Nós pudemos demonstrar que alguns dos anticorpos identificados neste trabalho podem estimular células T a secretar IL2 e IFN-γ. O mAb PD-1_1 mostrou consistentemente a atividade mais elevada na estimulação da secreção de citocinas e estendeu a observação de que alguns dos anticorpos identificados neste trabalho exibem afinidades de ligação e propriedades biológicas semelhantes ao do Nivolumabe clinicamente validado. De fato, alguns dos novos anticorpos mostraram atividades ainda maiores em comparação com o Nivolumabe quando testados em ensaios baseados em coculturas de linfócitos com APCs ou células tumorais. Esses ensaios podem representar melhor as condições in vivo, pois reproduzem não apenas o efeito negativo da interação entre os receptores e seu ligante (ou seja: PD-1/PD-L1), mas também outros efeitos biológicos potenciais que os novos anticorpos podem ser capazes de antagonizar. Isso poderia explicar por que os novos anticorpos anti-PD-1 e anti-PD-L1 mostram efeitos mais fortes na proliferação de células T e estimulação da secreção de citocinas do que aqueles exercidos por Nivolumabe, cuja atividade pode ser principalmente dependente da inibição de PD-1 e Interação de PD-L1. Esta hipótese também é apoiada pela descoberta interessante de que o novo anticorpo anti-PD-1 reconhece um epítopo diferente do Nivolumabe e, portanto, poderia atuar com um mecanismo de ação diferente. Na verdade, PD-1_A foi capaz de reagir de forma cruzada com linfócitos de camundongo de uma forma semelhante ao PD-L1_A, o que diferencia PD-1_A do Nivolumabe. Devido a esta propriedade, estes dois novos anticorpos foram testados também in vivo em ratos portadores de carcinoma do cólon CT26 e verificou-se que eles foram capazes de controlar eficazmente o crescimento do tumor.

[269] No geral, os dados apresentados neste trabalho suportam a conclusão de que o procedimento de seleção empregado permite a geração de anticorpos que reconhecem especificamente seu receptor alvo em sua conformação nativa e com alta afinidade, sem a necessidade da maturação de afinidade adicional, levando a anticorpos que se ligam especificamente aos inibidores de pontos de verificação imunológicos com propriedades superiores aos anticorpos da técnica anterior.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. PROTEÍNA DE LIGAÇÃO ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1, caracterizada por competir pela ligação à PD-1 com um anticorpo; (i) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; ou (ii) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

2. PROTEÍNA DE LIGAÇÃO ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1, caracterizada por competir pela ligação ao PD- L1 com um anticorpo; (i) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; ou (ii) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; (iii) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84; ou (iv) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93; ou (v) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 101; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 102.

3. PROTEÍNA DE LIGAÇÃO ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3, caracterizada por competir pela ligação à LAG-3 com um anticorpo; (i) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; (ii) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; (iii) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57; (iv) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; ou (v) compreendendo uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74; e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75.

4. PROTEÍNA de ligação ao antígeno antagonista que se liga especificamente à PD-1, caracterizada por compreender; (i) uma combinação de um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de combinações consistindo em: um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2; um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11; (ii) uma combinação de uma região determinante de complementaridade 3 de cadeia pesada (CDRH3) e uma região determinante de complementaridade 3 de cadeia leve (CDRL3) selecionada a partir do grupo de combinações que consistem em: uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9;

uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; de preferência compreendendo ainda um ou mais elementos selecionados a partir do grupo que consiste em uma CDRH1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 4 ou 13, um CDRH2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 6 ou 15, CDRL1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 5 ou 14 e uma CDRL2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 7 ou 16.

5. PROTEÍNA DE LIGAÇÃO ao antígeno antagonista que se liga especificamente ao PD-L1, caracterizada por compreender; (i) uma combinação de um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de combinações consistindo em: um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 21; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 20; um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 30; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 29;

um domínio variável de cadeia leve possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 102; e um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma sequência com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 101;

(CDRL3) selecionada a partir do grupo de combinações que consistem em:

uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27;

uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 98; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99; uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108; de preferência compreendendo ainda um ou mais elementos selecionados a partir do grupo que consiste em uma CDRH1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 22, 31, 85, 94 ou 103, um CDRH2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 24, 33, 87, 96 ou 105, CDRL1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 23, 32, 86, 95 ou 104, e uma CDRL2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 25, 34, 88, 97 ou 106.

6. PROTEÍNA DE LIGAÇÃO ao antígeno antagonista que se liga especificamente à LAG-3, caracterizada por compreender; (i) uma combinação de um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de combinações consistindo em:

(CDRL3) selecionada a partir do grupo de combinações que consistem em:

uma CDRH3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; e uma CDRL3 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 81;

de preferência compreendendo ainda um ou mais elementos selecionados a partir do grupo que consiste em uma CDRH1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 40, 49, 58, 67, ou 76, um CDRH2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 42, 51, 60, 69, ou 78, CDRL1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 41, 50, 59, 68, ou 77, e uma CDRL2 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 43, 52, 61, 70, ou 79.

7. PROTEÍNA DE LIGAÇÃO ao antígeno antagonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada; (a) pela proteína de ligação ao antígeno ser um anticorpo, proteína semelhante a um anticorpo ou um fragmento dos mesmos, em que, preferencialmente, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, um anticorpo monoclonal, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo recombinante, um fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno, um anticorpo de cadeia única, um fragmento de cadeia variável de única de anticorpo, um diacorpo (diabody), um fragmento Fab, um fragmento F(ab)2, um anticorpo mimético, um anticorpo IgG1, um anticorpo IgG2, um anticorpo IgG3 e um anticorpo IgG4; e/ou (b) pela proteína de ligação ao antígeno ter pelo menos uma das seguintes características: (i) liga-se à PD-1, PD-L1 ou LAG-3 com um valor de Kd menor que 100 nM, menor que 50 nM, menor que 10 nM, menor que 1 nM, menor que 100 pM, menor que 10 pM, ou menor que 5 pM;

(ii) pode bloquear a ligação de um ligante à PD-1, PD-L1 ou LAG-3 com um IC50 inferior a 10 nM, inferior a 1 nM ou inferior a 200 pM; (iii) estimula a proliferação de células T; (iv) induz a proliferação de linfócitos; (v) induz a secreção de IL-2 e/ou IFNγ; e/ou (vi) reduz o volume do tumor em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% em relação ao valor basal.

8. ÁCIDO NUCLEICO, caracterizado por codificar uma proteína de ligação ao antígeno antagonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.

9. VETOR de expressão recombinante, caracterizado por compreender uma molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação

8.

10. CÉLULA HOSPEDEIRA, compreendendo o vetor da reivindicação 9.

11. MÉTODO DE PRODUÇÃO da proteína de ligação ao antígeno antagonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado por compreender a etapa de preparação da referida proteína de ligação ao antígeno a partir de uma célula hospedeira que expressa a referida proteína de ligação ao antígeno.

12. PROTEÍNA DE LIGAÇÃO ao antígeno antagonista, caracterizada por ser produzida pela expressão de DNA recombinante na célula hospedeira da reivindicação 11.

13. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreende pelo menos uma proteína de ligação ao antígeno antagonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7 ou 12, o ácido nucleico,

de acordo com a reivindicação 8, ou o vetor, de acordo com a reivindicação 9 e um transportado/veículo farmaceuticamente aceitável, e preferencialmente a composição compreende pelo menos outro agente ativo.

14. KIT, caracterizado por compreender a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13 e, opcionalmente, pelo menos outro agente ativo.

15. PROTEÍNA DE LIGAÇÃO ao antígeno antagonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7 ou 12, o ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 8, o vetor, de acordo com a reivindicação 9, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por ser para uso no tratamento do câncer e/ou de doenças infecciosas crônicas; em que preferencialmente: (i) o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) Neoplasias malignas do lábio, cavidade oral e faringe; e/ou (b) Neoplasias malignas dos órgãos digestivos; e/ou (c) Neoplasias malignas de órgãos respiratórios e intratorácicos; e/ou (d) Neoplasias malignas do osso e cartilagem articular; e/ou (e) Melanoma e outras neoplasias malignas da pele; e/ou (f) Neoplasias malignas de tecidos mesoteliais e moles; e/ou (g) Neoplasia maligna da mama; e/ou (h) Neoplasias malignas dos órgãos genitais femininos; e/ou (i) Neoplasias malignas dos órgãos genitais masculinos; e/ou (j) Neoplasias malignas do trato urinário; e/ou (k) Neoplasias malignas do olho, cérebro e outras partes do sistema nervoso central; e/ou

(l) Neoplasias malignas da tireoide e outras glândulas endócrinas; e/ou

(m) Neoplasias malignas de tecido linfoide, hematopoiético e tecidos relacionados; e/ou

(ii) a doença infecciosa crônica é selecionada a partir do grupo que consiste em HBV, HCV, HIV, HSV, HPV, EBV, CMV e

Chlamydia; e/ou

(iii) pelo menos outro agente ativo é administrado ao sujeito com tal necessidade, de preferência, em que o pelo menos outro agente ativo e a proteína de ligação ao antígeno antagonista de qualquer uma das reivindicações de 1 a 7 ou 12, o ácido nucleico da reivindicação 8, o vetor da reivindicação 9 ou a composição farmacêutica da reivindicação 13 são administrados simultaneamente ou sequencialmente ou uma combinação dos mesmos.