ES2966992T3

ES2966992T3 - Receptores de antígeno quimérico dirigido al BCMA y métodos de uso de los mismos

Info

Publication number: ES2966992T3
Application number: ES21166662T
Authority: ES
Inventors: Xiaohu Fan; Qiuchuan Zhuang; Pingyan Wang; Lin Wang; Lei Yang; Jiaying Hao; Dan Zhao; Xian He
Original assignee: Legend Biotech Ireland Ltd
Current assignee: Legend Biotech Ireland Ltd
Priority date: 2015-08-11
Filing date: 2017-08-10
Publication date: 2024-04-25
Anticipated expiration: 2037-08-10
Also published as: PH12019500193A1; HUE064534T2; AU2020200151C1; IL294683A; CN113234173A; EP3334765A4; US20210261675A1; CN113234174B; SG10201913485QA; CA2994579C; CA3189388A1; CN113234174A; AU2021200453B2; CN105384825A; CN109153731B; SI3896091T1; JP2024032975A; MY188362A; JP2022183283A; PH12018500295A1

Abstract

En el presente documento se proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un polipéptido que comprende (a) un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende un primer anticuerpo de dominio único (sdAb) anti-antígeno de maduración de células B (BCMA) que comprende las tres CDR de un dominio VHH que comprende el secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 124 y un segundo sdAb anti-BCMA, en donde cada uno del primer y segundo sdAb anti-BCMA es un dominio VHH; (b) un dominio transmembrana; y (c) un dominio de señalización intracelular. Además se proporcionan en el presente documento: un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho CAR; un vector que comprende dicho ácido nucleico aislado; una célula efectora inmune diseñada que comprende dicho CAR, dicho ácido nucleico aislado o dicho vector; y una composición farmacéutica que comprende dicha célula efectora inmune diseñada y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También se proporciona en el presente documento un CAR o una composición farmacéutica de la invención para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un individuo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Receptores de antígeno quimérico dirigido al BCMA y métodos de uso de los mismos

Campo de la presente invención

La presente invención se refiere a receptores de antígenos quiméricos que comprenden anticuerpos de dominio único y células efectoras inmunitarias diseñadas que se dirigen a BCMA, y a sus usos.

Antecedentes de la presente invención

Con el desarrollo de la inmunoterapia tumoral y la tecnología clínica, la inmunoterapia de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR-T) es ahora uno de los enfoques de inmunoterapia tumoral más prometedores. Generalmente, un receptor de antígeno quimérico (CAR) comprende un dominio de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular. El dominio de unión al antígeno extracelular puede comprender un fragmento variable de cadena única (scFv) dirigido a un antígeno tumoral identificado. Los CAR se pueden expresar en la superficie de las células T usando técnicas de transfección genética. Al unirse al antígeno tumoral diana, los CAR pueden activar las células T para lanzar una respuesta antitumoral específica de manera dependiente del antígeno sin estar limitados por la disponibilidad de complejos mayores de histocompatibilidad (MHC) específicos del antígeno tumoral diana.

Los anticuerpos de dominio único (sdAb) se diferencian de los anticuerpos convencionales de 4 cadenas por tener un único dominio variable de anticuerpo monomérico. Por ejemplo, los camélidos y los tiburones producen sdAb llamados anticuerpos de solo cadena pesada (HcAb), que naturalmente carecen de cadenas ligeras. El fragmento de unión al antígeno en cada brazo de los anticuerpos de solo cadena pesada de camélido tiene un único dominio variable de cadena pesada (V<h>H), que puede tener alta afinidad por un antígeno sin la ayuda de una cadena ligera. El V<h>H de camélido se conoce como el fragmento de unión a antígeno funcional más pequeño con un peso molecular de aproximadamente 15 kD.

El mieloma múltiple (MM) es una neoplasia maligna plasmática agresiva incurable, que se clasifica como una neoplasia de células B y prolifera de manera incontrolable en la médula ósea, interfiriendo con la producción metabólica normal de las células sanguíneas y causando lesiones óseas dolorosas (Garfall, A.L. et al., Discovery Med. 2014, 17, 37). El mieloma múltiple puede presentarse clínicamente con hipercalcemia, insuficiencia renal, anemia, lesiones óseas, infecciones bacterianas, hiperviscosidad y amiloidosis (Robert Z. Orlowski, Cancer Cell. 2013, 24(3)). Según investigaciones y estadísticas, cada año se diagnosticará mieloma a casi 86.000 pacientes, y mientras alrededor de 63.000 pacientes mueren cada año por complicaciones relacionadas con la enfermedad (Becker, 2011). Debido al envejecimiento de la población, se predice que el número de casos de mieloma aumentará año tras año. Como muchos cánceres, no existe una causa conocida del mieloma múltiple, y no hay cura. Algunos tratamientos para el mieloma múltiple son similares a los tratamientos para otros cánceres, como la quimioterapia o la radioterapia, el trasplante de células madre o trasplante de médula ósea, la terapia dirigida o la terapia biológica (George, 2014). Las inmunoterapias celulares basadas en anticuerpos han demostrado un beneficio clínico sustancial para pacientes con neoplasias hematológicas, en particular en el linfoma no de Hodgkin de células B. Aunque las terapias actuales para el mieloma múltiple a menudo conducen a remisiones, casi todos los pacientes eventualmente recaen. Existe la necesidad de un agente inmunoterapéutico eficaz para el tratamiento del mieloma múltiple.

El LCAR-B38M descrito en la presente invención es un BCMA bivalente dirigido a CAR-T que ya ha mostrado ventajas clínicas en términos tanto de seguridad como de eficacia en el tratamiento de pacientes con mieloma múltiple refractario o recidivante en un ensayo clínico. En un ensayo clínico inicial, 33 de 35 (94 %) pacientes tuvieron la remisión clínica del mieloma múltiple al recibir células CAR-T LCAR-B38M. La mayoría de los pacientes sólo tuvieron efectos secundarios leves. El estudio fue presentado por el principal inventor tanto en la reunión anual de la ASCO de 2017 (Resumen LBA3001) como en la rueda de prensa que contó con una amplia cobertura mediática. (http://www.ascopost.com/News/55713).

En general, la tasa de respuesta objetiva fue del 100 %, y 33 pacientes (94 %) tuvieron una remisión clínica evidente del mieloma (respuesta completa, respuesta parcial muy buena o respuesta parcial) dentro del periodo de los 2 meses posteriores a la recepción de células CAR T. Después de seguir al grupo durante un período de más de 4 meses, de los 19 pacientes, 14 alcanzaron criterios estrictos de respuesta completa, 1 paciente alcanzó una respuesta parcial y 4 pacientes alcanzaron muy buenos criterios de remisión parcial en eficacia.

La patente internacional WO 2016/014789 está relacionada con moléculas del receptor de antígeno quimérico (CAR) anti-BCMA humanizado y su uso en el tratamiento, prevención o mejora de condiciones relacionadas con las células B.

La patente internacional WO 2015/142675 está relacionada con el uso de células efectoras inmunes (p. ej., células T, células NK) diseñadas para expresar un CAR que se une a un antígeno tumoral para tratar el cáncer asociado con la expresión de dicho antígeno tumoral.

La patente internacional WO 2013/123061 está relacionada con CAR biespecíficos basados en scFv.

Dado que el excelente perfil de eficacia y seguridad obtenido del ensayo clínico LCAR-B38M es significativamente superior al de algunos otros ensayos BCM<a>CAR-T presentados al mismo tiempo en la ASCO, los trabajos han sido ampliamente reconocidos como un "avance revolucionado" en el campo de la inmunoterapia. Es de destacar que todos estos diseños de BCMA CAR son CAR convencionales en los que el dominio de unión al antígeno BCMA está compuesto por un anticuerpo ScFv monovalente.

Breve resumen de la presente invención

La presente invención proporciona receptores de antígenos quiméricos (CAR) que comprenden dominios V<h>H, células efectoras inmunes diseñadas y usos de los mismos en inmunoterapia contra el cáncer como se define en las reivindicaciones. La presente invención proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un polipéptido que comprende: (a) un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende un primer anticuerpo de dominio único (sdAb) anti-antígeno de maduración de células B (BCMA) que comprende un dominio V<h>H que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 124 y un segundo sdAb anti-BCMA que comprende un dominio V<h>H que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; (b) un dominio transmembrana; y (c) un dominio de señalización intracelular.

En una realización, el primer sdAb anti-BCMA está ubicado en el extremo N o el extremo C del segundo sdAb anti-BCMA.

En una realización, el primer sdAb anti-BCMA y el segundo sdAb anti-BCMA están fusionados entre sí a través de un conector peptídico. En una realización, el conector peptídico no tiene más de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud.

En una realización, el dominio transmembrana deriva de una molécula seleccionada del grupo que consiste en CD8a, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 y PD1. En una realización, el dominio transmembrana deriva de CD8a o CD28.

En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular primario de una célula efectora inmunitaria. En una realización, el dominio de señalización intracelular primario deriva de CD3Z En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización coestimulador. En una realización, el dominio de señalización coestimulador deriva de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandos de CD83 y combinaciones de los mismos. En una realización, el dominio de señalización coestimulador comprende un dominio citoplasmático de CD28 y/o un dominio citoplasmático de CD137.

En una realización, el CAR comprende además un dominio bisagra ubicado entre el extremo C del dominio de unión al antígeno extracelular y el extremo N del dominio transmembrana. En una realización, el dominio bisagra deriva de CD8a.

En una realización, el CAR comprende además un péptido señal ubicado en el extremo N del polipéptido. En una realización, el péptido señal deriva de CD8a.

En una realización, el CAR comprende un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 300.

La presente invención también proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el CAR de la presente invención. En una realización, el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 338.

La presente invención también proporciona un vector que comprende el ácido nucleico aislado de la presente invención. En una realización, el vector es un vector lentiviral.

La presente invención también proporciona una célula efectora inmunitaria diseñada que comprende el CAR de la presente invención, el ácido nucleico aislado de la presente invención o el vector de la presente invención. En una realización, la célula efectora inmune diseñada es una célula T.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende la célula efectora inmunitaria diseñada de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también proporciona un CAR de la presente invención o una composición farmacéutica de la presente invención para uso en un método de tratamiento del cáncer en un individuo. En una realización, el cáncer es mieloma múltiple.

No se reivindica el tema descrito como referencia en la presente memoria.

En la presente memoria se describe como referencia un sdAb anti-BCMA que comprende las regiones CDR de cualquiera de las SEQ ID NO: 115-152. Se describe en la presente memoria como referencia el sdAb anti-BCMA que comprende cualquiera de los siguientes: (1) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:77; (2) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:78; (3) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:80; (4) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:81; (5) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:82; (6) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:45; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:83; (7) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:84; (8) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:47; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:85; (9) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:49; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:87; (10) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:88; (11) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:89; (12) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:14; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:90; (13) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:15; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:91; (14) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:92; (15) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:55; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:93; (16) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:56; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:94; (17) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:57; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:95; (18) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:58; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:96; (19) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:59; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:97; (20) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:60; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:98; (21) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:23; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:61; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:99; (22) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:24; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:62; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:100; (23) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:63; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:101; (24) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:64; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:102; (25) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:65; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:103; (26) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:66; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:104; (27) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:67; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:105; (28) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106; (29) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:69; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:107; (30) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:70; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:108; (31) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:71; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:109; (32) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:72; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:110; (33) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:73; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:111; (34) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:74; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:112; (35) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:75; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:113; o (36) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:76; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:114. Los sdAb anti-BCMA incluidos en los CAR de la invención pueden comprender una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 y puede comprender una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86, respectivamente. Descrito en la presente memoria como referencia, el sdAb anti-BCMA comprende un dominio V<h>H que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 115, 116, 118-123 y 125-152.

Se describe como referencia un anticuerpo anti-BCMA de cadena pesada únicamente (HCAB) o una proteína de unión a antígeno que comprende cualquiera de los sdAb anti-BCMA descritos anteriormente. También se describen como referencia epítopos de BCMA a los que se une específicamente cualquiera de los sdAb anti-BCMA descritos anteriormente, y anticuerpos anti-BCMA (tales como sdAb anti-BCMA) que compiten con cualquiera de los sdAb anti-BCMA descritos anteriormente.

Los sdAb anti-BCMA incluidos en los CAR de la invención pueden ser quiméricos de camélido o humanizados. El sdAb anti-BCMA incluido en los CAR de la invención es un fragmento V<h>H.

El CAR de la invención es un receptor de antígeno quimérico BCMA que comprende un polipéptido que comprende: (a) un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende dos sdAb anti-BCMA; (b) un dominio transmembrana; y (c) un dominio de señalización intracelular. El CAR puede describirse como monoespecífico. El CAR puede describirse como multivalente. El dominio de unión al antígeno extracelular comprende al menos dos sdAb anti-BCMA.

El CAR de la invención es un receptor de antígeno quimérico (CAR) multivalente que comprende un polipéptido que comprende: (a) un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende un primer resto de unión a BCMA y un segundo resto de unión a BCMA; (b) un dominio transmembrana; y (c) un dominio de señalización intracelular. El primer resto de unión a BCMA es un primer sdAb anti-BCMA y el segundo resto de unión a BCMA es un segundo sdAb anti-BCMA. El primer resto de unión a BCMA y el segundo resto de unión a BCMA pueden unirse específicamente al mismo epítopo en BCMA. Alternativamente, el primer resto de unión a BCMA y el segundo resto de unión a BCMA pueden unirse específicamente a diferentes epítopos en BCMA.

La presente invención proporciona un CAR multivalente como se define en las reivindicaciones. El CAR es un receptor de antígeno quimérico multivalente (tal como bivalente o trivalente) que comprende un polipéptido que comprende: (a) un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende un primer sdAb anti-BCMA y un segundo sdAb anti-BCMA; (b) un dominio transmembrana; y (c) un dominio de señalización intracelular. El primer sdAb anti-BCMA y el segundo sdAb anti-BCMA pueden unirse específicamente al mismo epítopo en BCMA. Alternativamente, el primer sdAb anti-BCMA y el segundo sdAb anti-BCMA pueden unirse específicamente a diferentes epítopos en BCMA.

En algunas realizaciones según los CAR multivalentes de la invención, el primer sdAb anti-BCMA está ubicado en el extremo N del segundo sdAb anti-BCMA. En algunas realizaciones, el primer sdAb anti-BCMA está ubicado en el extremo C del segundo sdAb anti-BCMA. En algunas realizaciones, el primer sdAb anti-BCMA y el segundo sdAb anti-BCMA se fusionan directamente entre sí mediante un enlace peptídico. En algunas realizaciones, el primer sdAb anti-BCMA y el segundo sdAb anti-BCMA se fusionan entre sí mediante un conector peptídico. En algunas realizaciones, el conector peptídico no tiene más de aproximadamente 50 (tal como no más de aproximadamente cualquiera de 35, 25, 20, 15, 10 o 5) aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el conector peptídico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 208-215.

En algunas realizaciones según los CAR de la invención, el dominio transmembrana deriva de una molécula seleccionada del grupo que consiste en CD8a, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 y PD1. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana deriva de CD8a o CD28. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 193 o 194.

En algunas realizaciones según los CAR de la invención, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular primario de una célula efectora inmunitaria (tal como una célula T). En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular primario deriva de CD3Z. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular primario comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 197 o 198.

En algunas realizaciones según los CAR de la invención, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización coestimulador. En algunas realizaciones, el dominio de señalización coestimulador deriva de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, Ligandos de CD83 y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el dominio de señalización coestimulador comprende un dominio citoplasmático de CD28 y/o un dominio citoplasmático de CD137. En algunas realizaciones, el dominio de señalización coestimulador comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195 y/o SEQ ID NO: 196.

En algunas realizaciones según los CAR de la invención, el CAR comprende además un dominio bisagra ubicado entre el extremo C del dominio de unión al antígeno extracelular y el extremo N del dominio transmembrana. En algunas realizaciones, el dominio bisagra deriva de CD8a. En algunas realizaciones, el dominio bisagra comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 192.

En algunas realizaciones según los CAR de la invención, el CAR comprende además un péptido señal ubicado en el extremo N del polipéptido. En algunas realizaciones, el péptido señal deriva de una molécula seleccionada del grupo que consiste en CD8a, receptor a de GM-CSF y cadena pesada de IgG1. En algunas realizaciones, el péptido señal deriva de CD8a. En algunas realizaciones, el péptido señal comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 191.

Los CAR de la invención se enumeran en la Tabla 5. Descrito como referencia en las Tablas 4 y 5, el CAR comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 216-256, 298, 299 y 306-335. La presente invención proporciona un CAR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 300-305.

En la presente memoria se describe como referencia un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 115, 116, 118 a 123, 125 a 152, 216-256, 298, 299 y 306 a 335. La presente invención proporciona un CAR que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 117, 124 y 300-305.

Un aspecto de la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica los sdAb anti-BCMA o CAR de la invención. La presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de ácido nucleico seleccionada de SEQ ID NO: 155, 162 y 338-343. Descrita como referencia, la secuencia de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 153, 154, 156 161, 163-190, 257-297, 336, 337 y 344-373. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado comprende además una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un primer CAR, en donde la segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un segundo CAR está operativamente unida a la primera secuencia de ácido nucleico a través de una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de autoescisión, tal como un péptido T2A, P2A o F2A. En donde la tercera secuencia de ácido nucleico es SEQ ID NO: 385. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado es una molécula de ADN. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado es una molécula de ARN.

Un aspecto de la presente invención proporciona un vector que comprende los ácidos nucleicos aislados de la invención. En algunas realizaciones, el vector es un vector de expresión. En algunas realizaciones, el vector es un vector viral. En algunas realizaciones, el vector es un vector lentiviral. En algunas realizaciones, el vector es un vector no viral.

Un aspecto de la presente invención proporciona una célula efectora inmunitaria diseñada, que comprende los CAR de la invención o cualquiera de los ácidos nucleicos aislados de la invención, o cualquiera de los vectores de la invención. En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria es una célula T, una célula NK, una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC), una célula madre hematopoyética, una célula madre pluripotente o una célula madre embrionaria. En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria es una célula T.

Un aspecto de la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de las células efectoras inmunitarias diseñadas de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Además se proporciona la composición farmacéutica de la invención para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un individuo. En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria diseñada es autóloga. En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria diseñada es alogénica. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer líquido. En algunas realizaciones, el cáncer es mieloma múltiple, leucemia linfoblástica aguda o leucemia linfocítica crónica. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer sólido, tal como glioblastoma. En algunas realizaciones, el cáncer es mieloma múltiple refractario o recidivante.

Se describe como referencia una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los sdAb anti-BCMA descritos anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunos ejemplos, existe un método para tratar una enfermedad (tal como cáncer) en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica.

También se proporcionan usos, kits y artículos de fabricación que comprenden cualquiera de los anti-BCMA, CAR, células efectoras inmunitarias diseñadas, ácidos nucleicos aislados o vectores de la invención.

Breve descripción de los dibujos

Las FIGs. 1A-1B muestran los resultados de un ensayo de citotoxicidadin vitrode células T que expresan CAR monoespecíficos ejemplares que comprenden diversos sdAb anti-BCMA contra células RPMI8226.Luc (FIG. 1A) o células U87MG.Luc (FIG. 1B).

Las FIGs. 2A-2C muestran los resultados de un ensayo de citotoxicidadin vitrode células T que expresan CAR monoespecíficos ejemplares que comprenden diversos sdAb anti-BCMA contra células RPMI8226.Luc (FIG. 2A), células K562.BCMA.Luc (FIG. 2B) o células K562.CD19.Luc (FIG. 2C).

La FIG. 3 muestra los resultados de un ensayo de liberación de IFNyin vitrode células T que expresan CAR monoespecíficos ejemplares que comprenden varios sdAb anti-BCMA contra células K562.BCMA.Luc.

Las FIGs. 4A-4C muestran los resultados de un ensayo de citotoxicidadin vitrode células T que expresan BCMA CAR multivalentes ejemplares contra células RPMI8226.Luc (FIGs. 4A-4B) o células U87MG.Luc (FIG. 4C).

Las FIGs. 5A-5E muestran los resultados de un ensayo de citotoxicidadin vitrode células T que expresan BCMA CAR bivalentes ejemplares contra células RPMI8226.Luc (FIG. 5A), células K562.CD19.Luc (FIG. 5B), células A549.Luc (FIG. 5C), células U87MG.Luc (FIG. 5D), o células Raji.Luc (FIG. 5E).

La FIG. 5F muestra los resultados de un ensayo de citotoxicidadin vitrode células T que expresan BCMA CAR bivalentes ejemplares contra células K562.BCMA.Luc y células K562.CD38.Luc.

La FIG. 6A muestra los resultados de un ensayo de liberación de IFN<y>in vitrode células T que expresan BCMA CAR bivalentes ejemplares contra células K562.BCMA.Luc en dos relaciones diferentes de células efectoras a células diana.

La FIG. 6B muestra los resultados de un ensayo de liberación de IFN<y>in vitrode células T que expresan BCMA CAR bivalentes ejemplares contra células RPMI8226.Luc, A549.Luc, K562.CD38.Luc y Raji.Luc.

Las FIGs. 7A-7C muestran la unión de tres fragmentos VHH ejemplares a células K562.BCMA.Luc y células K562.CD38.Luc (control negativo).

La FIG. 8A muestra una estructura cristalina del dominio extracelular de BCMA. La FIG. 8B muestra péptidos epítopos de BCMA.

Las FIGs. 9A-9B muestran los resultados de ensayos de mapeo de epítopos de VHH1 y VHH2.

La FIG. 10 muestra los resultados de un ensayo de unión competitivo usando células CHO-BCMA.

La FIG. 11 muestra la citotoxicidadin vitrode células T derivadas de donantes que expresan LCAR-B38M contra células RPMI8226.Luc.

La FIG. 12A muestra la citotoxicidadin vitrode células LCAR-B38M CAR-T preparadas a partir de un donante seleccionado contra células RPMI8226.Luc. las FIGs. 12B-12E muestran la actividad antitumoralin vivode células LCAR-B38M CAR-T en modelo de ratones con xenoinjerto tumoral. La FIG. 12B muestra datos de imágenes de bioluminiscencia en ratones tratados con LCAR-B38M CAR-T y ratones tratados con células T no transducidas (UnT). La FIG. 12C muestra el diseño del estudio y las imágenes de bioluminiscencia de ratones en el grupo CAR-T y el grupo UnT. La FIG. 12D muestra imágenes de hígados de ratones tratados con UnT. La FIG. 12E muestra un ensayo de luciferasaex vivoque valida los tumores en los hígados de ratones tratados con UnT.

Las FIGs. 13A-13F muestran parámetros clínicos de dos monos tratados con células CAR-T LCAR-B38M. Los parámetros clínicos monitorizados en el estudio incluyen temperatura corporal (FIG. 13A), peso corporal (FIG. 13B), recuento sanguíneo completo (CBC, FIGs. 13C y 13D), así como la química sérica y los niveles de citoquinas (FIGs.

13E y 13F).

Las FIGs. 14A-C muestran los ensayos de citotoxicidadin vitrosobre células CAR-T LCAR-B38M y células CAR-T LCAR-B27S preparadas a partir de los mismos tres pacientes con mieloma múltiple, respectivamente. La FIG.14A muestra los resultados de citotoxicidadin vitrode células CAR-T LCAR-B38M y células CAR-T LCAR-B27S preparadas a partir del paciente A con mieloma múltiple. La FIG. 14B muestra los resultados de citotoxicidadin vitrode células CAR-T LCAR-B38M y células CAR-T LCAR-B27S preparadas a partir del paciente B con mieloma múltiple. La FIG. 14C muestra los resultados de citotoxicidadin vitrode células CAR-T LCAR-B38M y células CAR-T L<c>A<r>-B27S preparadas a partir del paciente C con mieloma múltiple.

FIG. 15A compara las estructuras de un CAR basado en V<h>H y un CAR convencional basado en scFv. La estructura esquemática de la izquierda muestra un CAR monovalente monoespecífico ejemplar que tiene un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende un dominio VHH. La estructura esquemática de la derecha muestra un CAR monovalente monoespecífico ejemplar que tiene un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende un dominio scFv.

FIG. 15B compara las estructuras de un CAR basado en V<h>H que tiene dos sitios de unión a antígeno y un CAR basado en scFv convencional que tiene dos sitios de unión a antígeno. La estructura esquemática de la izquierda es un CAR ejemplar que tiene un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende dos dominios V<h>H. Los dos dominios V<h>H pueden ser iguales o diferentes. La estructura esquemática de la derecha muestra un CAR ejemplar que tiene un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende dos dominios scFv. Los dos dominios scFv pueden ser iguales o diferentes.

La FIG. 15C muestra estructuras esquemáticas de CAR bivalentes y biespecíficos ejemplares basados en V<h>H. La estructura esquemática en el panel superior izquierdo muestra un c Ar monoepítopo bivalente ejemplar que tiene un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende dos dominios V<h>H idénticos, cada uno de los cuales se une específicamente al epítopo 1 del antígeno A. La estructura esquemática en el panel superior derecho muestra un CAR biepítopo bivalente ejemplar, que tiene un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende un primer dominio V<h>H que se une específicamente al epítopo 1 del antígeno A y un segundo dominio V<h>H se une específicamente al epítopo 2 del antígeno A. El epítopo 1 y el epítopo 2 del antígeno A pueden ser diferentes en sus estructuras y/o secuencias. La estructura esquemática en el panel inferior izquierdo muestra un CAR biespecífico ejemplar que tiene un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende un primer dominio V<h>H que se une específicamente al antígeno A y un segundo dominio V<h>H que se une específicamente al antígeno B. El antígeno A y el antígeno B son antígenos diferentes.

La FIG. 15D muestra estructuras esquemáticas de CAR ejemplares basados en V<h>H que tienen tres o más dominios V<h>H. Los CAR podrán tener una pluralidad de dominios V<h>H fusionados entre sí directamente o mediante conectores peptídicos. Los dominios V<h>H pueden ser iguales o diferentes. Los dominios V<h>H diferentes pueden unirse específicamente a diferentes epítopos del mismo antígeno o de diferentes antígenos.

La FIG. 15E muestra células efectoras inmunitarias diseñadas ejemplares que coexpresan dos CAR basados en V<h>H diferentes. La célula efectora inmunitaria diseñada ejemplarmente en el panel izquierdo coexpresa dos CAR monovalentes monoespecíficos diferentes. La célula efectora inmunitaria diseñada ejemplarmente en el panel central coexpresa un CAR monoespecífico monovalente y un CAR biespecífico o bivalente. La célula efectora inmunitaria diseñada ejemplarmente en el panel derecho coexpresa dos c A r biespecíficos o bivalentes diferentes. Los CAR pueden reconocer diferentes antígenos.

Descripción detallada de la presente invención

La presente invención proporciona un CAR multivalente como se define en las reivindicaciones. Por tanto, la invención se refiere a receptores de antígenos quiméricos (CAR) que comprenden un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende dos sdAb anti-BCMA. Por lo tanto, los CAR son CAR multivalentes (tales como bivalentes o trivalentes) que comprenden al menos dos sdAb anti-BCMA. Los dos sdAb anti-BCMA son sdAb anti-BCMA diferentes. Los CAR y las células inmunitarias diseñadas que expresan CAR de la presente invención son agentes útiles para el tratamiento del cáncer.

En particular, la presente invención ha demostrado una eficacia superior de los CAR biepítopos bivalentes de la invención que comprenden dos sdAb anti-BCMA dirigidos a diferentes epítopos de BCMA (p. ej., LCAR-B38M), en el tratamiento del mieloma múltiple entre pacientes humanos. En un análisis intermedio de un ensayo clínico de fase I/II, el 100 % de los pacientes con mieloma múltiple recidivante o refractario respondieron al tratamiento LCAR-B38M CAR-T. El 94 % de los pacientes tuvo una remisión clínica evidente del mieloma en el periodo de dos meses posteriores a recibir el tratamiento CAR-T. Los pacientes que alcanzaron los criterios de respuesta completa estricta (sCR) permanecieron libres de enfermedad residual mínima después de más de un año de recibir el tratamiento CAR-T. Además, los pacientes toleraron bien el tratamiento con LCAR-B38M CAR-T, ya que la mayoría de los pacientes solo experimentó un síndrome de liberación de citoquinas leve y manejable, un efecto secundario común de la terapia basada en células CAR-T. Ningún paciente experimentó efectos secundarios neurológicos. En comparación, un estudio clínico piloto de un CAR monovalente que comprende un único sdAb anti-BCMA mostró una tasa de respuesta objetiva y una tasa de remisión completa más bajas, y una tasa de recaída más alta entre los pacientes tratados. Antes de esta invención, todos los BCMA CAR bajo estudios clínicos tenían solo un resto de unión a BCMA en el dominio de unión al antígeno extracelular. La eficacia clínica mejorada y la seguridad de los BCMA CAR multivalentes de la presente invención son inesperadas.

En términos generales, el CAR de la invención puede describirse como un CAR multivalente que comprende un polipéptido que comprende: (a) un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende una pluralidad de un anticuerpo de dominio único (sdAb) que se une específicamente a BCMA; (b) un dominio transmembrana; y (c) un dominio de señalización intracelular.

En términos generales, el CAR de la invención puede describirse como un CAR multivalente que comprende un polipéptido que comprende: (a) un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende un primer sdAb anti-BCMA que se une específicamente a un primer epítopo de BCMA, y un segundo sdAb anti-BCMA se une específicamente a un segundo epítopo de BCMA; (b) un dominio transmembrana; y (c) un dominio de señalización intracelular.

Además se describen como referencia nuevos sdAb anti-BCMA y CAR que comprenden uno cualquiera o más de los sdAb anti-BCMA descritos en la presente memoria.

También se proporcionan en la presente memoria células efectoras inmunitarias diseñadas (tales como células T) que comprenden los CAR de la invención, y composiciones farmacéuticas de la invención y la composición farmacéutica de la invención para el uso en métodos de tratamiento del cáncer.

I. Definiciones

El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales (incluidos anticuerpos de 4 cadenas de longitud completa o anticuerpos solo de cadena pesada de longitud completa que tienen una región Fc de inmunoglobulina), composiciones de anticuerpos con especificidad poliepitópica, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos, diacuerpos y moléculas de cadena individual), así como fragmentos de anticuerpos (p. ej., Fab, F(ab')2 y Fv). El término "inmunoglobulina" (Ig) se usa en la presente memoria de manera intercambiable con "anticuerpo". Los anticuerpos contemplados en la presente memoria incluyen anticuerpos de dominio único, tales como anticuerpos solo de cadena pesada.

La unidad básica del anticuerpo de 4 cadenas es una glicoproteína heterotetramérica compuesta por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Un anticuerpo IgM consiste en 5 de las unidades heterotetrámeras básicas junto con un polipéptido adicional llamado cadena J, y contiene 10 sitios de unión al antígeno, mientras que los anticuerpos IgA comprenden de 2 a 5 de las unidades básicas de 4 cadenas que pueden polimerizarse para formar conjuntos polivalentes en combinación con la cadena J. En el caso de las IgG, la unidad de 4 cadenas es generalmente de aproximadamente 150.000 Dalton. Cada cadena L está unida a una cadena H mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H están unidas entre sí mediante uno o más enlaces disulfuro según el isotipo de la cadena H. Cada cadena H y L también tiene puentes disulfuro intracadena regularmente espaciados. Cada cadena H tiene en el extremo N, un dominio variable (V<h>) seguido de tres dominios constantes (C<h>) para cada una de las cadenas a y y y cuatro dominios C<h>para los isotipos p y £. Cada cadena L tiene en el extremo N, un dominio variable (V<l>) seguido de un dominio constante en su otro extremo. La V<l>está alineada con la V<h>y la C<l>está alineada con el primer dominio constante de la cadena pesada (C<h>1). Se cree que residuos de aminoácidos particulares forman una interfase entre los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada. El emparejamiento de una V<h>y V<l>juntos forman un único sitio de unión al antígeno. Para conocer la estructura y propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, véase p. ej., Basic and Clinical Immunology, octava edición, Daniel P. Sties, Abba I. Terr y Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, página 71 y capítulo 6. La cadena L de cualquier especie de vertebrado se puede asignar a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa y lambda, según las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (C<h>), las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases o isotipos. Hay cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que tienen cadenas pesadas denominadas a, 8, £,<y>y P, respectivamente. Las clases<y>y a se dividen en subclases sobre la base de diferencias relativamente menores en el secuencia y función C<h>, p. ej., los humanos expresan las siguientes subclases: IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2.

El término "anticuerpo de sólo cadena pesada" o "HCAb" se refiere a un anticuerpo funcional, que comprende cadenas pesadas, pero carece de las cadenas ligeras que normalmente se encuentran en los anticuerpos de 4 cadenas. Se sabe que los animales camélidos (como camellos, llamas o alpacas) producen HCAb.

El término "anticuerpo de dominio único" o "sdAb" se refiere a un polipéptido de unión a antígeno único que tiene tres regiones determinantes de complementariedad (CDR). El sdAb solo es capaz de unirse al antígeno sin emparejarse con un polipéptido que contiene CDR correspondiente. En algunos casos, los anticuerpos de dominio único se diseñan a partir de HCAb de camélidos, y sus dominios variables de cadena pesada se denominan en la presente memoria "V<h>H". Algunos V<h>H también pueden conocerse como nanocuerpos. El sdAb de camélido es uno de los fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno más pequeños conocidos (véase, p. ej., Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-8 (1993); Greenberg et al., Nature 374:168-73 (1995); Hassanzadeh-Ghassabeh et al., Nanomedicine (Lond), 8:1013-26 (2013)). Una V<h>H básica tiene la siguiente estructura desde el extremo N hasta el extremo C: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en las que CDR1 a CDR3 se refiere a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3.

Un anticuerpo "aislado" es aquel que ha sido identificado, separado y/o recuperado de un componente de su entorno de producción (p. ej., natural o recombinante). Preferiblemente, el polipéptido aislado está libre de asociación con todos los demás componentes de su entorno de producción. Los componentes contaminantes de su entorno de producción, como los resultantes de células transfectadas recombinantes, son materiales que normalmente interferirían con los usos de investigación, diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el polipéptido se purificará: (1) a más del 95 % en peso de anticuerpo según se determina, por ejemplo, mediante el método de Lowry, y en algunas realizaciones, a más del 99 % en peso; (1) en un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinte plateado. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, normalmente se preparará un polipéptido o anticuerpo aislado mediante al menos una etapa de purificación.

La "región variable" o "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios amino terminales de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera pueden denominarse "V<h>" y “V<l>", respectivamente. Estos dominios son generalmente las partes más variables del anticuerpo (en relación con otros anticuerpos de la misma clase) y contienen los sitios de unión al antígeno. Los anticuerpos de solo cadena pesada de las especies de camélidos tienen una única región variable de cadena pesada, que se conoce como "V<h>H". V<h>H es, por tanto, un tipo especial de V<h>.

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertos segmentos de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre los anticuerpos. El dominio V media la unión del antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente en todo el espectro de los dominios variables. En cambio, se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables (HVR), tanto en el dominio variable de la cadena ligera como en el de la cadena pesada. Las porciones más conservadas de los dominios variables se denominan regiones marco (FR). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración beta laminar, conectadas por tres HVR, que forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura beta laminar. Los HVR de cada cadena se mantienen unidos en estrecha proximidad mediante las regiones FR y, con los HVR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, quinta edición, Instituto Nacional de Salud, Bethesda, Md. (1991)). Los dominios constantes no participan directamente en la unión del anticuerpo a un antígeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que componen la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que existen de forma natural y/o modificaciones posteriores a la traducción (p. ej., isomerizaciones, amidaciones) que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, dirigiéndose contra un único sitio antigénico. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante del antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales tienen la ventaja de que se sintetizan mediante cultivo de hibridoma o de forma recombinante, sin estar contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo se obtiene a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo mediante ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar mediante una variedad de técnicas, incluyendo, por ejemplo, el método del hibridoma (p. ej., Kohler y Milstein., Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de ADN recombinante (véase, p. ej., la patente de EE.UU. núm.

4.816.567), tecnologías de presentación de fagos (véase, p. ej., Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004), y tecnologías para producir anticuerpos humanos o similares a los humanos en animales que tienen partes o todos los loci de inmunoglobulina humana o genes que codifican secuencias de inmunoglobulina humana (véase, p. ej., patentes internacionales WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); Patentes de e E.UU. núms. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856 859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).

El término "anticuerpo desnudo" se refiere a un anticuerpo que no está conjugado con un resto citotóxico o radioetiqueta.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" o "anticuerpo completo" se usan indistintamente para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, a diferencia de un fragmento de anticuerpo. Específicamente, los anticuerpos de 4 cadenas de longitud completa incluyen aquellos con cadenas pesadas y ligeras que incluyen una región Fc. Los anticuerpos solo de cadena pesada de longitud completa incluyen la cadena pesada (como V<h>H) y una región Fc. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (p. ej., dominios constantes de secuencia nativa humana) o variantes de secuencia de aminoácidos de los mismos. En algunos casos, el anticuerpo intacto puede tener una o más funciones efectoras.

Un "fragmento de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente la unión al antígeno y/o la región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (véase la patente de EE.UU. núm. 5.641.870, Ejemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); moléculas de anticuerpos monocatenarios; anticuerpos de dominio único (como V<h>H), y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. La digestión con papaína de los anticuerpos produjo dos fragmentos idénticos de unión al antígeno, llamados fragmentos "Fab", y un fragmento residual "Fc", una designación que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El fragmento Fab consiste en una cadena L completa junto con el dominio de la región variable de la cadena H (V<h>), y el primer dominio constante de una cadena pesada (C<h>1). Cada fragmento Fab es monovalente con respecto a la unión al antígeno, es decir, tiene un único sitio de unión al antígeno. El tratamiento con pepsina de un anticuerpo produce un único fragmento F(ab') 2 grande que corresponde aproximadamente a dos fragmentos Fab unidos por disulfuro que tienen diferente actividad de unión al antígeno y todavía es capaz de reticular el antígeno. Los fragmentos Fab' se diferencian de los fragmentos Fab por tener algunos residuos adicionales en el extremo carboxi del dominio C<h>1 que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente memoria para Fab' en el que el (los) residuo(s) de cisteína de los dominios constantes porta(n) un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

El fragmento Fc comprende las porciones carboxi-terminales de ambas cadenas H unidas por disulfuros. Las funciones efectoras de los anticuerpos están determinadas por secuencias en la región Fc, región que también es reconocida por los receptores Fc (FcR) que se encuentran en ciertos tipos de células.

"Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio completo de unión y reconocimiento de antígeno. Este fragmento consiste en un dímero de un dominio de región variable de cadena pesada y otro de cadena ligera en asociación estrecha y no covalente. Del plegamiento de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles cada uno de la cadena H y L) que aportan los residuos de aminoácidos para la unión al antígeno y confieren especificidad de unión al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres HVR específicos para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.

"Fv monocatenario" también abreviado como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpos que comprenden los dominios de anticuerpos V<h>y V<l>conectados en una única cadena polipeptídica. Preferiblemente, el polipéptido sFv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios V<h>y V<l>que permiten que el sFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión del sFv, véase Pluckthun en The Pharmacology f Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994).

Los "fragmentos funcionales" de los anticuerpos descritos en la presente memoria comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que generalmente incluye la unión al antígeno o la región variable del anticuerpo intacto o la región Fc de un anticuerpo que retiene o tiene la capacidad de unión a FcR modificada. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos preparados mediante la construcción de fragmentos sFv (véase el párrafo anterior) con conectores cortos (aproximadamente 5-10 residuos) entre los dominios V<h>y V<l>de manera que se logra el emparejamiento entre cadenas pero no dentro de la cadena de los dominios V, dando como resultado de este modo un fragmento bivalente, es decir, un fragmento que tiene dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos biespecíficos son heterodímeros de dos fragmentos sFv "híbridos" en los que los dominios V<h>y V<l>de los dos anticuerpos están presentes en diferentes cadenas polipeptídicas. Los diacuerpos se describen con mayor detalle en, por ejemplo, la patente europea EP 404.097; la patente internacional WO 93/11161; Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).

Los anticuerpos monoclonales en la presente memoria incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es(son) idéntica(s) u homóloga(s) a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (Patente de EE.UU. núm. 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente memoria incluyen anticuerpos PRIMATTZFD® en donde la región de unión al antígeno del anticuerpo deriva de un anticuerpo producido por, p. ej., inmunizando monos macacos con un antígeno de interés. Como se usa en la presente memoria, "anticuerpo humanizado" se usa como un subconjunto de "anticuerpos quiméricos".

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (p. ej., camélidos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la que los residuos de un HVR (definido a continuación) del receptor se reemplazan por residuos de un HVR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tenga la especificidad, afinidad y/o capacidad deseada. En algunos casos, los residuos marco ("FR") de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se pueden realizar para refinar aún más el rendimiento del anticuerpo, como la afinidad de unión. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una secuencia de inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana, aunque las regiones FR pueden incluir una o más sustituciones de residuos de FR individuales que mejoran el rendimiento del anticuerpo, tales como afinidad de unión, isomerización, inmunogenicidad, etc. El número de estas sustituciones de aminoácidos en la FR es típicamente no más de 6 en la cadena H, y en la cadena L, no más de 3. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para obtener más detalles, véase, p. ej., Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Véase también, por ejemplo, Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Inmunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transctions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); y patentes de EE.UU núms. 6.982.321 y 7.087.409.

Un "anticuerpo humano" es un anticuerpo que posee una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o se ha elaborado usando cualquiera de las técnicas para producir anticuerpos humanos como se describe en la presente memoria. Esta definición de anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluidas bibliotecas de presentación en fagos. Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). También están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos los métodos descritos en Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991).). Véase también van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Los anticuerpos humanos se pueden preparar administrando el antígeno a un animal transgénico que ha sido modificado para producir dichos anticuerpos en respuesta al desafío antigénico, pero cuyos loci endógenos han sido desactivados, p. ej., xenorratones inmunizados (véanse, p. ej., las patentes de EE.UU. núms. 6.075.181 y 6.150.584 respecto a tecnología XENOMOUSE™). Véase también, por ejemplo, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 103:3557-3562 (2006) respecto a anticuerpos humanos generados mediante una tecnología de hibridoma de células B humanas.

El término "región hipervariable", "HVR" o "HV", cuando se usa en la presente memoria, se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos. Generalmente, los sdAb comprenden tres HVR (o CDR): HVR1 (o CDR1), HVR2 (o CDR2) y HVR3 (o CDR3). HVR3 muestra la mayor diversidad de los tres HVR y se cree que desempeña un papel único al conferir una buena especificidad a los anticuerpos. Véase, p. ej., Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996).

El término "Región Determinante de Complementariedad" o "CDR" se usa para referirse a regiones hipervariables tal como las define el sistema Kabat. Véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland (1991).

Se usan varias delineaciones de HVR y se incluyen en la presente memoria. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de Kabat se basan en la variabilidad de secuencia y son las usadas más habitualmente (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland (1991)). Chothia se refiere en cambio a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Los AbM HVR representan un compromiso entre los HVR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y se usan por el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Los HVR de "contacto" se basan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los residuos de cada uno de estos HVR se indican a continuación en la Tabla 1.

Tabla 1. Delineaciones de HVR.

Bucle kabat AbM Chothia Contacto

L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36

L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55

L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96

H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B

(Numeración Kabat)

H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35

(Numeración de Chothia)

Los HVR pueden comprender "HVR extendidos" de la siguiente manera: 24-36 o 24-34 (L1), 46-56 o 50-56 (L2) y 89 97 o 89-96 (L3) en el V<l>y 26-35 (H1), 50-65 o 49-65 (H2) y 93-102, 94-102 o 95-102 (H3) en el V<h>. Los residuos del dominio variable están numerados según Kabat et al., supra, para cada una de estas definiciones.

Los residuos de aminoácidos de un sdAb (como V<h>H) están numerados según la numeración general para dominios V<h>dados por Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interesf', Servicios de Salud Pública de EE. UU., NIH Bethesda, Md., Publicación núm. 91), como se aplica a los dominios V<h>H de camélidos en el artículo de Riechmann y Muyldermans, J. Immunol. Methods 23 de junio de 2000; 240 (1-2): 185-195. Según esta numeración, FR1 de un V<h>H comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 1-30, CDR1 de un V<h>H comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 31-35, FR2 de un V<h>H comprende los aminoácidos en las posiciones 36-49, CDR2 de un V<h>H comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 50-65, FR3 de un V<h>H comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 66-94, CDR3 de un V<h>H comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 95 102 y FR4 de un V<h>H comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 103-113. A este respecto, cabe señalar que, como es bien conocido en la técnica para dominios V<h>y para dominios V<h>H: el número total de residuos de aminoácidos en cada una de las CDR puede variar y puede no corresponder al número total de residuos de aminoácidos indicados por la numeración de Kabat (es decir, una o más posiciones según la numeración de Kabat pueden no estar ocupadas en la secuencia real, o la secuencia real puede contener más residuos de aminoácidos que el número permitido por la numeración de Kabat).

La expresión "numeración de residuos de dominio variable como en Kabat" o "numeración de posiciones de aminoácidos como en Kabat", y sus variaciones, se refiere al sistema de numeración usado para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera de la recopilación de anticuerpos en Kabat et al., supra. Usando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento o inserción en un FR o HVR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir una inserción de un solo aminoácido (residuo 52a según Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (p. ej., residuos 82a, 82b y 82c, etc. según Kabat) después del residuo 82 del FR de la cadena pesada. La numeración Kabat de los residuos se puede determinar para un anticuerpo dado mediante alineamiento en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada Kabat "estándar".

A menos que se indique lo contrario en la presente memoria, la numeración de los residuos en una cadena pesada de inmunoglobulina es la del índice EU como en Kabat et al., supra. El "índice EU como en Kabat" se refiere a la numeración de residuos del anticuerpo EU IgG1 humano.

Los residuos "marco" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable distintos de los residuos HVR como se definen en la presente memoria.

Un "marco de consenso humano" o "marco humano aceptor" es un marco que representa los residuos de aminoácidos que aparecen más comúnmente en una selección de secuencias marco V<l>o V<h>de inmunoglobulina humana. Generalmente, la selección de secuencias V<l>o V<h>de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. Generalmente, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md. (1991). Los ejemplos incluyen para la V<l>, el subgrupo puede ser el subgrupo kappa I, kappa II, kappa III o kappa IV como en Kabat et al., supra. Además, para el VH, el subgrupo puede ser el subgrupo I, el subgrupo II o el subgrupo III como en Kabat et al. Alternativamente, se puede derivar un marco de consenso humano a partir de lo anterior en el que residuos particulares, tal como cuando se selecciona un residuo del marco humano en base a su homología con el marco donante alineando la secuencia del marco donante con una colección de diversas secuencias del marco humano. Un marco humano aceptor "derivado de" un marco de inmunoglobulina humana o un marco de consenso humano puede comprender la misma secuencia de aminoácidos del mismo, o puede contener cambios de secuencia de aminoácidos preexistentes. En algunas realizaciones, el número de cambios de aminoácidos preexistentes es 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos.

Una "modificación de aminoácidos" en una posición específica, p. ej. de la región Fc, se refiere a la sustitución o eliminación del residuo especificado, o la inserción de al menos un residuo de aminoácido adyacente al residuo especificado. La inserción "adyacente" a un residuo específico significa inserción dentro de uno o dos residuos del mismo. La inserción puede ser N-terminal o C-terminal con respecto al residuo especificado. La modificación de aminoácidos preferida en la presente memoria es una sustitución.

Un anticuerpo "madurado por afinidad" es uno con una o más alteraciones en uno o más HVR del mismo que dan como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo parental que no posee esa(s) alteración(ones). En algunos ejemplos, un anticuerpo madurado por afinidad tiene afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antígeno diana. Los anticuerpos madurados por afinidad se producen mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración por afinidad mediante la mezcla de dominios V<h>y V<l>. La mutagénesis aleatoria de residuos de HVR y/o el marco se describe, por ejemplo, por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol.

154(7):3310-9 (1995); y Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

Como se usa en la presente memoria, el término "se une específicamente", "reconoce específicamente" o es "específico para" se refiere a interacciones medibles y reproducibles tales como la unión entre una diana y una proteína de unión a antígeno (tal como un CAR o un sdAb), que es determinante de la presencia de la diana en presencia de una población heterogénea de moléculas, incluidas moléculas biológicas. Por ejemplo, una proteína de unión a antígeno (tal como un CAR o un sdAb) que se une específicamente a una diana (que puede ser un epítopo) es una proteína de unión a antígeno (tal como un CAR o un sdAb) que se une a esta diana con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que a otras dianas. En algunas realizaciones, el grado de unión de una proteína de unión a antígeno (tal como un CAR o un sdAb) a una diana no relacionada es menos de aproximadamente el 10 % de la unión de la proteína de unión a antígeno (tal como un CAR o un sdAb) a la diana como se mide, p. ej., mediante un radioinmunoensayo (RIA). En algunas realizaciones, una proteína de unión a antígeno (tal como un CAR o un sdAb) que se une específicamente a una diana tiene una constante de disociación (Kd) de ^1 j M, ^100 nM, ^10 nM, ^1 nM o ^0,1 nM. En algunas realizaciones, una proteína de unión a antígeno (tal como un CAR o un sdAb) se une específicamente a un epítopo de una proteína que se conserva entre las proteínas de diferentes especies. En algunas realizaciones, la unión específica puede incluir, pero no requiere, unión exclusiva.

El término "especificidad" se refiere al reconocimiento selectivo de una proteína de unión a antígeno (tal como un CAR o un sdAb) para un epítopo particular de un antígeno. Los anticuerpos naturales, por ejemplo, son monoespecíficos. El término "multiespecífico" como se usa en la presente memoria denota que una proteína de unión a antígeno (tal como un CAR o un sdAb) tiene dos o más sitios de unión a antígeno de los cuales al menos dos se unen a antígenos diferentes. "Biespecífico", tal como se usa en la presente memoria, denota que una proteína de unión a antígeno (tal como un CAR o un sdAb) tiene dos especificidades de unión a antígeno diferentes. El término CAR "monoespecífico" como se usa en la presente memoria denota una proteína de unión a antígeno (tal como un CAR o un sdAb) que tiene uno o más sitios de unión, cada uno de los cuales se une al mismo antígeno.

El término "valente", tal como se usa en la presente memoria, denota la presencia de un número específico de sitios de unión en una proteína de unión a antígeno (tal como un CAR o un sdAb). Un anticuerpo natural, por ejemplo, o un anticuerpo de longitud completa, tienen dos sitios de unión y es bivalente. Como tal, los términos "trivalente", "tetravalente", "pentavalente" y "hexavalente" denotan la presencia de dos sitios de unión, tres sitios de unión, cuatro sitios de unión, cinco sitios de unión y seis sitios de unión, respectivamente, en una proteína de unión a antígeno (como un CAR o un sdAb).

Las "funciones efectoras del anticuerpo" se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia nativa o una región Fc variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo, y varían con el isotipo del anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento; unión al receptor Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación a la baja de los receptores de la superficie celular (p. ej., receptores de células B); y activación de células B. Función efectora de anticuerpo "reducida o minimizada" significa aquella que se reduce al menos en un 50 % (alternativamente 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %) del anticuerpo de tipo salvaje o no modificado. La determinación de la función efectora del anticuerpo es fácilmente determinable y medible por un experto en la técnica. En un ejemplo preferido, se ven afectadas las funciones efectoras del anticuerpo de unión al complemento, citotoxicidad dependiente del complemento y citotoxicidad dependiente del anticuerpo. En algunos ejemplos, la función efectora se elimina mediante una mutación en la región constante que eliminó la glicosilación, p. ej., "mutación sin efector". En un aspecto, la mutación sin efector es una mutación N297A o DANA (D265A+N297A) en la región C<h>2. Shields et al., J. Biol. Chem. 276 (9): 6591-6604 (2001). Alternativamente, las mutaciones adicionales que dan como resultado una función efectora reducida o eliminada incluyen: K322A y L234A/L235A (LALA). Alternativamente, la función efectora se puede reducir o eliminar mediante técnicas de producción, como la expresión en células huésped que no glicosilan (p. ej.,E. coli.)o en los que dan por resultado un patrón de glicosilación alterado que es ineficaz o menos eficaz para promover la función efectora (p. ej., Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278(5): 3466-3473 (2003).

"Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" o ADCC se refiere a una forma de citotoxicidad en la que la Ig secretada unida a receptores Fc (FcR) presentes en ciertas células citotóxicas (p. ej., células asesinas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) permiten que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana portadora de antígeno y posteriormente maten a la célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos "arman" a las células citotóxicas y son necesarios para matar la célula diana mediante este mecanismo. Las células primarias para mediar ADCC, las células NK, expresan únicamente FcyRIII, mientras que los monocitos expresan F<cy>RI, F<cy>RII y F<cy>RIII. La expresión de Fc en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés, puede realizarse un ensayo de ADCCin vitro,como el descrito en las patentes de EE.UU. núms. 5.500.362 o 5.821.337. Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK). Alternativa o adicionalmente, se puede evaluar la actividad ADCC de la molécula de interés invivo,p. ej., en un modelo animal como el descrito en Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998).

El término "región Fc" en la presente memoria se usa para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluidas regiones Fc de secuencia nativa y regiones Fc variantes. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana generalmente se define para extenderse desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, hasta su extremo carboxilo. La lisina C-terminal (residuo 447 según el sistema de numeración EU) de la región Fc se puede eliminar, por ejemplo, durante la producción o purificación del anticuerpo, o mediante ingeniería recombinante del ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. Por consiguiente, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpos a las que se les han eliminado todos los residuos K447, poblaciones de anticuerpos a las que no se les ha eliminado ningún residuo K447 y poblaciones de anticuerpos que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo K447. Las regiones Fc de secuencia nativa adecuadas para su uso en los anticuerpos descritos en la presente memoria incluyen IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 e IgG4 humanas.

"Afinidad de unión" generalmente se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (p. ej., un anticuerpo o un CAR) y su compañero de unión (p. ej., un antígeno). A menos que se indique lo contrario, como se usa en la presente memoria, "afinidad de unión" se refiere a una afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (p. ej., anticuerpo y antígeno, o CAR y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañera Y generalmente puede representarse mediante la constante de disociación (Kd). La afinidad se puede medir mediante métodos comunes conocidos en la técnica, incluidos los descritos en la presente memoria. Los anticuerpos de baja afinidad generalmente se unen al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad generalmente se unen al antígeno más rápido y tienden a permanecer unidos por más tiempo. En la técnica se conocen diversos métodos para medir la afinidad de unión, cualquiera de los cuales puede usarse. A continuación se describen ejemplos ilustrativos y ejemplares específicos para medir la afinidad de unión.

Un anticuerpo "de bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es aquel que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une. En algunos ejemplos, los anticuerpos de bloqueo o los anticuerpos antagonistas inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno.

El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" y la "homología" con respecto a una secuencia de péptido, polipéptido o anticuerpo se definen como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de aminoácidos en la secuencia peptídica o polipeptídica, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos se puede lograr de diversas maneras que están dentro de los conocimientos técnicos en la técnica, por ejemplo, usando software informático disponible públicamente tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN o MEGAL<i>G<n>™ (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluido cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima en toda la longitud de las secuencias que se comparan.

"Receptor de antígeno quimérico" o "CAR" como se usa en la presente memoria se refiere a receptores diseñados genéticamente, que pueden usarse para injertar una o más especificidades de antígeno en células efectoras inmunitarias, tales como células T. Algunos CAR también se conocen como "receptores de células T artificiales", "receptores de células T quiméricos" o "receptores inmunitarios quiméricos". El CAR comprende un dominio de unión a antígeno extracelular específico para uno o más antígenos (tales como antígenos tumorales), un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular de una célula T y/u otros receptores. "CAR-T" se refiere a una célula T que expresa un CAR. "BCMA CAR" se refiere a un CAR que tiene un dominio de unión extracelular específico para BCMA. "CAR biepítopo" se refiere a un CAR que tiene un dominio de unión extracelular específico para dos epítopos diferentes en BCMA.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" que codifica un CAR o un sdAb descrito en la presente memoria es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que normalmente está asociada en el entorno en el que se produjo. Preferiblemente, el ácido nucleico aislado está libre de asociación con todos los componentes asociados con el entorno de producción. Las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican los polipéptidos y anticuerpos de la presente memoria se encuentran en una forma distinta a la forma o configuración en la que se encuentran en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen del ácido nucleico que codifica los polipéptidos y anticuerpos de la presente memoria presentes de forma natural en las células.

El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión a ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

El ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder secretor está operativamente unido al ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está operativamente unido a una secuencia codificante si está colocado de manera que facilite la traducción. Generalmente, "unidas operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se logra mediante ligadura en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, los adaptadores o conectores de oligonucleótidos sintéticos se usan de acuerdo con la práctica convencional.

El término "vector", como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al que está unido. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en la presente memoria como "vectores de expresión".

Tal como se usa en la presente memoria, el término "autólogo" pretende referirse a cualquier material derivado del mismo individuo al que posteriormente se le reintroducirá en el individuo.

"Alogénico" se refiere a un injerto derivado de un individuo diferente de la misma especie.

El término "transfectado" o "transformado" o "transducido" como se usa en la presente memoria se refiere a un proceso mediante el cual se transfiere o introduce ácido nucleico exógeno en la célula huésped. Una célula "transfectada" o "transformada" o "transducida" es aquella que ha sido transfectada, transformada o transducida con ácido nucleico exógeno. La célula incluye la célula sujeto primaria y su progenie.

Tal como se usan en la presente memoria, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se usan indistintamente y todas esas designaciones incluyen la progenie. Por lo tanto, las palabras "transfectantes" y "células transfectadas" incluyen la célula sujeto primaria y los cultivos derivados de ella sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie variante que tiene la misma función o actividad biológica que la detectada en la célula originalmente transformada.

Los términos "célula huésped", "línea celular huésped" y "cultivo de células huésped" se usan indistintamente y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluida la progenie de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada primaria y la progenie derivada de la misma sin tener en cuenta el número de pases. La progenie puede no ser completamente idéntica en el contenido de ácido nucleico a una célula parental, sino que puede contener mutaciones. Se incluye en la presente memoria la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la detectada o seleccionada en la célula originalmente transformada.

Como se usa en la presente memoria, "tratamiento" o "que trata" es un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluidos los resultados clínicos. Para los fines de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: aliviar uno o más síntomas resultantes de la enfermedad, disminuir la extensión de la enfermedad, estabilizar la enfermedad (p. ej., prevenir o retrasar el empeoramiento de la enfermedad), prevenir o retrasar la propagación (p. ej., metástasis) de la enfermedad, prevenir o retrasar la recurrencia de la enfermedad, retrasar o ralentizar la progresión de la enfermedad, mejorar el estado de la enfermedad, proporcionar una remisión (parcial o total) de la enfermedad, disminuir la dosis de uno o más fármacos diferentes necesarios para tratar la enfermedad, retrasar la progresión de la enfermedad, aumentar la calidad de vida y/o prolongar la supervivencia. También se incluye en el término "tratamiento" la reducción de las consecuencias patológicas del cáncer. Los usos de la presente invención contemplan uno cualquiera o más de estos aspectos del tratamiento.

Como se usa en la presente memoria, un "individuo" o un "sujeto" se refiere a un mamífero, que incluye, pero no se limita a, seres humanos, bovinos, caballos, felinos, caninos, roedores o primates. En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano.

El término "cantidad eficaz" usado en la presente memoria se refiere a una cantidad de un agente, tal como un sdAb, una célula efectora inmunitaria diseñada, o una composición farmacéutica de la misma, suficiente para tratar un trastorno, condición o enfermedad específica tal como mejorar, paliar, disminuir y/o retrasar uno o más de sus síntomas. En referencia al cáncer, una cantidad eficaz comprende una cantidad suficiente para hacer que un tumor se reduzca y/o disminuir la velocidad de crecimiento del tumor (tal como suprimir el crecimiento del tumor) o para prevenir o retrasar otra proliferación celular no deseada. En algunas realizaciones, una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para retrasar el desarrollo. En algunas realizaciones, una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para prevenir o retrasar la recurrencia. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones. La cantidad eficaz del fármaco o composición puede: (i) reducir el número de células cancerosas; (ii) reducir el tamaño del tumor; (iii) inhibir, retardar, ralentizar hasta cierto punto y preferiblemente detener la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; (iv) inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y preferiblemente detener) la metástasis tumoral; (v) inhibir el crecimiento tumoral; (vi) prevenir o retrasar la aparición y/o recurrencia del tumor; y/o (vii) aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el cáncer.

"Entorno adyuvante" se refiere a un entorno clínico en el que un individuo ha tenido antecedentes de cáncer y generalmente (pero no necesariamente) ha respondido a la terapia, que incluye, pero no se limita a, cirugía (p. ej., resección quirúrgica), radioterapia y quimioterapia. Sin embargo, debido a sus antecedentes de cáncer, se considera que estas personas corren el riesgo de desarrollar la enfermedad. El tratamiento o la administración en el "entorno adyuvante" se refieren a un modo de tratamiento posterior. El grado de riesgo (p. ej., cuando un individuo en el entorno adyuvante se considera de "alto riesgo" o "bajo riesgo") depende de varios factores, generalmente la extensión de la enfermedad cuando se trató por primera vez.

"Entorno neoadyuvante" se refiere a un entorno clínico en el que el método se lleva a cabo antes de la terapia primaria/definitiva.

Como se usa en la presente memoria, "retrasar" el desarrollo del cáncer significa diferir, obstaculizar, ralentizar, retardar, estabilizar y/o posponer el desarrollo de la enfermedad. Este retraso puede ser de diferentes duraciones, dependiendo de los antecedentes de la enfermedad y/o del individuo que está siendo tratado. Como resulta evidente para un experto en la técnica, un retraso suficiente o significativo puede, de hecho, abarcar la prevención, en el sentido de que el individuo no desarrolla la enfermedad. Un método que "retrasa" el desarrollo del cáncer es un método que reduce la probabilidad de desarrollo de la enfermedad en un período de tiempo determinado y/o reduce la extensión de la enfermedad en un período de tiempo determinado, en comparación con no usar el método. Estas comparaciones suelen basarse en estudios clínicos que usan un número estadísticamente significativo de individuos. El desarrollo del cáncer puede detectarse mediante métodos estándar, que incluyen, pero no se limitan a, tomografía axial computarizada (TAC), imágenes por resonancia magnética (IRM), ecografía abdominal, pruebas de coagulación, arteriografía o biopsia. El desarrollo también puede referirse a la progresión del cáncer que puede ser inicialmente indetectable e incluye aparición, recurrencia y aparición.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica del ingrediente activo sea eficaz y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le administraría la formulación. Dichas formulaciones son estériles. Una formulación "estéril" es aséptica o está libre de todos los microorganismos vivos y sus esporas.

Los "vehículos", tal como se usan en la presente memoria, incluyen vehículos, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos para la célula o el mamífero que se expone a los mismos en las dosis y concentraciones empleadas. A menudo, el vehículo fisiológicamente aceptable es una disolución acuosa tamponada con el pH. Ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptido de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluidos glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (p. ej., complejos de proteína-Zn); y/o tensioactivos no iónicos como TWEEN™, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

El "diluyente" de interés en la presente memoria es uno que sea farmacéuticamente aceptable (seguro y no tóxico para su administración a un ser humano) y que sea útil para la preparación de una formulación líquida, tal como una formulación reconstituida después de la liofilización. Los diluyentes ejemplares incluyen agua estéril, agua bacteriostática para inyección (BWFI), una disolución tamponada de pH (p. ej., solución salina tamponada con fosfato), solución salina estéril, disolución de Ringer o disolución de dextrosa. En una realización alternativa, los diluyentes pueden incluir disoluciones acuosas de sales y/o tampones.

Un "conservante" es un compuesto que se puede añadir a las formulaciones de la presente memoria para reducir la actividad bacteriana. La adición de un conservante puede, por ejemplo, facilitar la producción de una formulación de usos múltiples (dosis múltiples). Ejemplos de conservantes potenciales incluyen cloruro de octadecildimetilbencilamonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio en los que los grupos alquilo son compuestos de cadena larga) y cloruro de bencetonio. Otros tipos de conservantes incluyen alcoholes aromáticos como fenol, alcohol butílico y bencílico, alquilparabenos como metil o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol y m-cresol. El conservante más preferido en la presente memoria es el alcohol bencílico.

Una formulación "estable" es aquella en la que la proteína que contiene esencialmente conserva su estabilidad e integridad física y química durante el almacenamiento. Varias técnicas analíticas para medir la estabilidad de las proteínas están disponibles en la técnica y se revisan en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., Pubs. (1991) y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). La estabilidad se puede medir a una temperatura seleccionada durante un período de tiempo seleccionado. Para una revisión rápida, la formulación se puede mantener a 40 °C durante 2 semanas a 1 mes, momento en el cual se mide la estabilidad. Cuando la formulación se va a almacenar a 2-8 °C, generalmente la formulación debe ser estable a 30 °C o 40 °C durante al menos 1 mes y/o estable a 2-8 °C durante al menos 2 años. Cuando la formulación se va a almacenar a 30°C, generalmente la formulación debe ser estable durante al menos 2 años a 30 °C y/o estable a 40 °C durante al menos 6 meses. Por ejemplo, el grado de agregación durante el almacenamiento se puede usar como indicador de la estabilidad de las proteínas. Por tanto, una formulación "estable" puede ser aquella en la que menos de aproximadamente el 10 % y preferiblemente menos de aproximadamente el 5 % de la proteína están presentes como un agregado en la formulación. En otras realizaciones, se puede determinar cualquier aumento en la formación de agregados durante el almacenamiento de la formulación.

Una formulación "reconstituida" es aquella que se ha preparado disolviendo una formulación de proteína o anticuerpo liofilizada en un diluyente de manera que la proteína esté dispersa por todas partes. La formulación reconstituida es adecuada para la administración (p. ej. administración subcutánea) a un paciente que va a ser tratado con la proteína de interés y, en algunas realizaciones de la presente invención, puede ser una que sea adecuada para administración parenteral o intravenosa.

Una formulación "isotónica" es aquella que tiene esencialmente la misma presión osmótica que la sangre humana. Las formulaciones isotónicas generalmente tendrán una presión osmótica de aproximadamente 250 a 350 mOsm. El término "hipotónico" describe una formulación con una presión osmótica inferior a la de la sangre humana. De manera correspondiente, el término "hipertónico" se usa para describir una formulación con una presión osmótica superior a la de la sangre humana. La isotonicidad se puede medir usando, por ejemplo, un osmómetro de presión de vapor o de congelación de hielo. Las formulaciones de la presente invención son hipertónicas como resultado de la adición de sal y/o tampón.

Se entiende que las realizaciones de la presente invención proporcionadas en la presente memoria incluyen realizaciones "que consisten" y/o "que consisten esencialmente en".

La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en la presente memoria incluye (y describe) variaciones que están dirigidas a ese valor o parámetroper se.Por ejemplo, la descripción que hace referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".

Tal como se usa en la presente memoria, la referencia a "no" un valor o parámetro generalmente significa y describe "distinto de" un valor o parámetro. Por ejemplo, el método no se usa para tratar el cáncer de tipo X significa que el método se usa para tratar el cáncer de tipos distintos de X.

El término "aproximadamente X-Y" usado en la presente memoria tiene el mismo significado que "aproximadamente X a aproximadamente Y".

Tal como se usa en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un/una", "o" y "el/la" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

II. Anticuerpos BCMA de dominio único

En la presente memoria se describen como referencia anticuerpos aislados de dominio único (denominados en la presente memoria como "sdAb anti-BCMA") que se unen específicamente a BCMA, tal como BCMA humano. En algunas realizaciones, el sdAb anti-BCMA modula la actividad de BCMA. En algunas realizaciones, el sdAb anti-BCMA es un anticuerpo antagonista. Además se describen como referencia fragmentos de unión a antígeno derivados de cualquiera de los sdAb anti-BCMA descritos en la presente memoria, y proteínas de unión a antígeno que comprenden cualquiera de los sdAb anti-BCMA descritos en la presente memoria. En la Tabla 2 siguiente se enumeran ejemplos de sdAb anti-BCMA. (*=sdAb comprendido en el CAR de la invención. Otros sdAb se describen como referencia).

Tabla 2. sdAb anti-BCMA ejemplares.

El antígeno maduro de células B (BCMA), también conocido como CD269, es un miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, concretamente TNFRSF17 (Thompson et al., J. Exp. Medicine, 192 (1):129-135, 2000). El BCMA humano se expresa casi exclusivamente en células plasmáticas y células de mieloma múltiple (véase p. ej. Novak et al., Blood, 103(2): 689-694, 2004; Neri et al., Clinical Cancer Research, 73(19):5903-5909; Félix et al., Mol. Oncology, 9(7):1348-58, 2015). El BCMA puede unirse al factor activador de células B (BAFF) y a un ligando que incluye proliferación (APRIL) (p. ej. Mackay et al., 2003 y Kalled et al., Immunological Review, 204: 43-54, 2005). El BCMA puede ser una diana de antígeno tumoral adecuado para agentes inmunoterapéuticos contra el mieloma múltiple. Los anticuerpos de alta afinidad pueden bloquear la unión entre BCMA y sus ligandos nativos BAFF y APRIL. Los sdAb anti-BCMA se pueden usar en combinación con inmunoterapia celular usando células CAR-T, por ejemplo, para mejorar los efectos citotóxicos contra las células tumorales.

En el CAR de la invención, hay un sdAb anti-BCMA que comprende las tres CDR de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117. En el CAR de la invención, también hay un sdAb anti-BCMA que comprende las tres CDR de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 124. El sdAb anti-BCMA puede ser camélido. El sdAb anti-BCMA puede estar humanizado. El sdAb anti-BCMA puede comprender un marco humano aceptor, p. ej., un marco de inmunoglobulina humana o un marco de consenso humano.

Se describe como referencia un sdAb anti-BCMA que comprende al menos una, al menos dos o las tres CDR seleccionadas de (a) una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1,2, 4 9 y 11-38; (b) una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 39, 40, 42-47 y 49-76; y (c) una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 77, 78, 80-85 y 87-114. En algunos ejemplos, el sdAb anti-BCMA es un camélido. En algunos ejemplos, el sdAb anti-BCMA está humanizado. En algunos ejemplos, el sdAb anti-BCMA comprende un marco humano aceptor, p. ej., un marco de inmunoglobulina humana o un marco de consenso humano. Los sdAb anti-BCMA incluidos en los CAR de la invención pueden comprender una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o 10, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 o 48 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 u 86 respectivamente. El sdAb anti-BCMA puede ser un camélido. El sdAb anti-BCMA puede estar humanizado. El sdAb anti-BCMA puede comprender un marco humano, p. ej., un marco de inmunoglobina humana o un marco de consenso humano.

Los sdAb anti-BCMA incluidos en los CAR de la invención pueden comprender tres CDR que comprenden: (a) una CDR1 que tiene al menos aproximadamente cualquiera de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 3 y 10; (b) una CDR2 que tiene al menos aproximadamente cualquiera de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:41 y 48; y (c) una CDR3 que tiene al menos aproximadamente cualquiera de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 79 y 86. Una CDR que tiene al menos aproximadamente cualquiera de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (p. ej., sustituciones conservadoras), inserciones o eliminaciones en relación con la secuencia de referencia, pero el sdAb anti-BCMA que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse a BCMA. Los sdAb anti-BCMA incluidos en los CAR de la invención pueden comprender tres CDR que comprenden: (a) una CDR1 que tiene aproximadamente una cualquiera de 1, 2, 3 o 4 sustituciones (p. ej., sustituciones conservadoras), inserciones o eliminaciones de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 3 y 10; (b) una CDR2 que tiene aproximadamente una cualquiera de 1, 2, 3 o 4 sustituciones (p. ej., sustituciones conservadoras), inserciones o eliminaciones de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 41 y 48; y (c) una CDR3 que tiene aproximadamente una cualquiera de 1, 2, 3 o 4 sustituciones (p. ej., sustituciones conservadoras), inserciones o eliminaciones de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 79 y 86. El sdAb anti-BCMA puede madurar por afinidad. El sdAb anti-BCMA puede ser un camélido. El sdAb anti-BCMA puede estar humanizado. El sdAb anti-BCMA puede comprender un marco humano aceptor, p. ej., un marco de inmunoglobulina humana o un marco de consenso humano.

El CAR de la invención puede comprender un sdAb anti-BCMA que comprende tres CDR que comprenden: (a) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (b) una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; y (c) una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79. El CAR de la invención también puede comprender un sdAb anti-BCMA que comprende tres CDR que comprende: (a) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; (b) una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; y (c) una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86. El sdAb anti-BCMA puede ser un camélido. El sdAb anti-BCMA puede estar humanizado. El sdAb anti-BCMA puede comprender un marco humano aceptor, p. ej., un marco de inmunoglobulina humana o un marco de consenso humano.

Se describe en la presente memoria como referencia, el sdAb anti-BCMA, que incluye cualquiera de los sdAb anti-BCMA descritos anteriormente (es decir, sdAb anti-BCMA que comprende CDR1, CDR2 y/o CDR3 específicos) comprende un dominio V<h>H que tiene al menos aproximadamente cualquiera de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 115-152. En algunos ejemplos, una secuencia V<h>H que tiene al menos aproximadamente cualquiera de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99% de identidad contiene sustituciones (p. ej., sustituciones conservadoras), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero el sdAb anti-BCMA que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse a BCMA. En algunos ejemplos, se han sustituido, insertado y/o eliminado un total de 1 a 10 aminoácidos en una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 115-152. En algunos ejemplos, se producen sustituciones, inserciones o eliminaciones en regiones fuera de las CDR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el sdAb anti-BCMA comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 115-152, que incluye modificaciones postraduccionales de esa secuencia.

En algunas realizaciones, hay un sdAb anti-BCMA aislado que comprende un dominio V<h>H que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117 o 124. En algunas realizaciones, hay un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117 o 124.

En algunos ejemplos, los epítopos funcionales se pueden mapear mediante barrido combinatorio de alanina. En este proceso, se puede usar una estrategia combinatoria de barrido de alanina para identificar los aminoácidos en la proteína BCMa que son necesarios para la interacción con los sdAb anti-BCMA. En algunas realizaciones, el epítopo es conformacional y se puede emplear la estructura cristalina del sdAb anti-BCMA unido a BCMA para identificar los epítopos. En algunas realizaciones, hay un epítopo de BCMA derivado de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 389-392. En algunas realizaciones, hay un epítopo de BCMA que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 389-392.

Se describen como referencia anticuerpos que compiten con cualquiera de los sdAb anti-BCMA descritos en la presente memoria para unirse a BCMA. En algunos ejemplos, los anticuerpos compiten con los sdAb anti-BCMA por unirse a un epítopo en el BCMA. En algunos ejemplos, un anticuerpo se une al mismo epítopo que un sdAb anti-BCMA que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 115-152. En algunos ejemplos, un anticuerpo se une específicamente a BCMA de manera competitiva con un sdAb anti-BCMA que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 115-152.

Descritos como referencia, se pueden usar ensayos de competencia para identificar un anticuerpo monoclonal que compita con un sdAb anti-BCMA descrito en la presente memoria por unirse a BCMA. Se pueden usar ensayos de competición para determinar si dos anticuerpos se unen al mismo epítopo reconociendo epítopos idénticos o estéricamente superpuestos o si un anticuerpo inhibe competitivamente la unión de otro anticuerpo al antígeno. En ciertos ejemplos, dicho anticuerpo competitivo se une al mismo epítopo (p. ej., un epítopo de BCMA derivado de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 388-394) que está unido por un anticuerpo descrito en la presente memoria. Los ensayos de competición ejemplares incluyen, pero no se limitan a, ensayos rutinarios tales como los proporcionados en Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Se proporcionan métodos ejemplares detallados para mapear un epítopo al que se une un anticuerpo en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, N.J.). En algunos ejemplos, se dice que dos anticuerpos se unen al mismo epítopo si cada uno bloquea la unión del otro en un 50 % o más. En algunos ejemplos, el anticuerpo que compite con un sdAb anti-BCMA descrito en la presente memoria es un anticuerpo de camélido, quimérico, humanizado o humano. En algunos ejemplos, hay un anticuerpo que compite con un sdAb anti-BCMA de camélido, quimérico, humanizado o humano como se describe en la presente memoria.

Se describe como referencia un anticuerpo anti-BCMA o una proteína de unión a antígeno que comprende cualquiera de los sdAb anti-BCMA descritos anteriormente. En algunos ejemplos, el anticuerpo anti-BCMA es un anticuerpo monoclonal, que incluye un anticuerpo de camélido, quimérico, humanizado o humano. En algunos ejemplos, el anticuerpo anti-BCMA es un fragmento de anticuerpo, p. ej., un fragmento V<h>H. En algunos ejemplos, el anticuerpo anti-BCMA es un anticuerpo solo de cadena pesada de longitud completa que comprende una región Fc de cualquier clase o isotipo de anticuerpo, tal como IgG1 o IgG4. En algunos ejemplos, la región Fc tiene una función efectora reducida o minimizada.

Un anticuerpo anti-BCMA (tal como sdAb anti-BCMA) o una proteína de unión a antígeno descritos en la presente memoria como referencia pueden incorporar cualquiera de las características, solas o en combinación, como se describe en las Secciones 1-7 de "Características de los anticuerpos" a continuación.

En algunas realizaciones, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica los sdAb anti-BCMA comprendidos en el CAR de la invención. En algunas realizaciones, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un sdAb anti-BCMA en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que tiene al menos aproximadamente cualquiera de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 155 y 162. En algunas realizaciones, se proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 155 y 162. En algunas realizaciones, se proporciona un vector (p. ej., vector de expresión) que comprende dicho ácido nucleico. En algunas realizaciones, se proporciona una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico. Se describe un método para elaborar un anticuerpo anti-BCMA, en el que el método comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-BCMA, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo anti-BCMA, y opcionalmente recuperar el anticuerpo anti-BCMA de la célula huésped (o medio de cultivo de la célula huésped). Las secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 153, 154, 156-161 y 163-190 se describen en la presente memoria como referencia.

Características de los anticuerpos.

1. Afinidad del anticuerpo

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-BCMA en el CAR de la invención tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 |jM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (p. ej. 10<' 8>M o menos, p. ej. de 10<' 8>M a 10‘<13>M, p. ej., de 10<‘ 9>M a 10<‘ 13>M).

Kd se puede medir mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab o fragmento V<h>H de un anticuerpo de interés y su antígeno como se describe mediante el siguiente ensayo. Por ejemplo, la afinidad de unión de la disolución de Fabs por el antígeno se mide equilibrando Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (<125>I) en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado, y luego capturando el antígeno unido con una placa recubierta de anticuerpo anti-Fab (véase, p. ej., Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)).

Kd se puede medir usando ensayos de resonancia de plasmón superficial usando un BIACORE®-2000 o un BIACo Re®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (RU). Brevemente, los chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) se activan con hidrocloruro de W-etil-W'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) según las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, a 5 jg/m l (~0,2<j>M) antes de la inyección a un caudal de 5 jl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de la inyección del antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos que no han reaccionado. Para las medidas cinéticas, se inyectan diluciones en serie al doble de Fab o VHH del anticuerpo de interés (0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo de polisorbato 20 al 0,05 % (TWEEN-20™) (PBST) a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 jl/min. Las velocidades de asociación (kon) y velocidades de disociación (koff) se calculan utilizando un modelo de unión de Langmuir uno a uno sencillo (Software de evaluación BIACORE® versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calcula como la relación de koff/kon. Véase, p. ej., Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la velocidad de activación supera los 10<6>M<_1>s<_1>mediante el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces la velocidad de activación se puede determinar utilizando una técnica de desactivación fluorescente que mide el aumento o disminución en la intensidad de la emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo antiantígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medidas en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con parada de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.

2. Fragmentos de anticuerpos

Los CAR de la invención comprenden sdAb que comprenden un dominio VHH. En algunos ejemplos, un anticuerpo descrito en la presente memoria es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv y scFv, V<h>H, y otros fragmentos que se describen a continuación. Para una revisión de ciertos fragmentos de anticuerpos, véase Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, p. ej., Pluckthün, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York), págs. 269-315 (1994); véanse también la patente internacional WO 93/16185; y las patentes de EE.UU. núms. 5.571.894 y 5.587.458. Para la discusión sobre los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos de epítopos de unión al receptor de rescate y que tienen una vida media in vivo aumentada, véase la patente de EE.UU. núm. 5.869.046.

Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Los tricuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

Los fragmentos de anticuerpo se pueden preparar mediante diversas técnicas, que incluyen, pero no se limitan a, la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción mediante células huésped recombinantes (p. ej. E.colio fago), como se describe en la presente memoria.

3. Anticuerpos quiméricos y humanizados

Un anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico. Se describen ciertos anticuerpos quiméricos, p. ej., en la patente de EE.UU. núm. 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (p. ej., una región variable derivada de una especie de camélido, como la llama) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "de clase cambiada" en el que la clase o subclase ha sido cambiada con respecto a la del anticuerpo parental. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

Un anticuerpo quimérico puede ser un anticuerpo humanizado. Normalmente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad en seres humanos, conservando al mismo tiempo la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano parental. Generalmente, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que HVR, p. ej., las CDR (o porciones de las mismas) se derivan de un anticuerpo no humano, y las FR (o porciones de las mismas) se derivan de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante humana. Algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado pueden sustituirse con residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (p. ej., el anticuerpo del que se derivan los residuos de HVR), p. ej., para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.

Se revisan los anticuerpos humanizados y los métodos para producirlos. p. ej., en Almagro y Fransson, Front. Biosci.

13:1619-1633 (2008), y se describen con más detalle, p. ej., en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); las patentes de EE.UU. núms. 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321, y 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (que describe el injerto de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describe "rejuvenecimiento"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (que describe "mezcla de FR"); y Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (que describe el enfoque de "selección guiada" para la mezcla FR).

Las regiones marco humanas que pueden usarse para la humanización incluyen, pero no se limitan a: regiones del marco seleccionadas usando el método de "mejor ajuste" (véase, p. ej., Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); regiones marco derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada (véase, p. ej., Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); y Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiones marco humanas maduras (somáticamente mutadas) o regiones marco de la línea germinal humana (véase, p. ej., Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); y regiones marco derivadas de la selección de bibliotecas FR (véase, p. ej., Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).

Los sdAb pueden modificarse, como humanizarse, sin disminuir la afinidad nativa del dominio por el antígeno y reduciendo al mismo tiempo su inmunogenicidad con respecto a una especie heteróloga. Por ejemplo, se pueden determinar los residuos de aminoácidos del dominio variable del anticuerpo (V<h>H) de un anticuerpo de llama, y uno o más de los aminoácidos de camélido, por ejemplo, en las regiones marco, se reemplazan por su homólogo humano tal como se encuentra en la secuencia consenso humana, sin que ese polipéptido pierda su carácter típico, es decir la humanización no afecta significativamente la capacidad de unión al antígeno del polipéptido resultante. La humanización de los sdAb de camélidos requiere la introducción y mutagénesis de una cantidad limitada de aminoácidos en una única cadena polipeptídica. Esto contrasta con la humanización de scFv, Fab', (Fab')2 e IgG, que requiere la introducción de cambios de aminoácidos en dos cadenas, la ligera y la pesada, y la preservación del ensamblaje de ambas cadenas.

Anticuerpos de dominio único que comprenden un dominio V<h>H se puede humanizar para que tenga secuencias similares a las humanas. Las regiones<f>R del dominio V<h>H usado en la presente memoria puede comprender al menos aproximadamente cualquiera de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más de homología de secuencia de aminoácidos con regiones marco V<h>humanas. Una clase ejemplar de dominios V<h>H humanizados se caracterizan porque los V<h>H llevan en la posición 45 un aminoácido del grupo formado por glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptófano, metionina, serina, treonina, asparagina o glutamina, como por ejemplo L45 y un triptófano en la posición 103, según la numeración de Kabat. Como tales, los polipéptidos que pertenecen a esta clase muestran una alta homología de secuencia de aminoácidos con la V<h>humana las regiones marco y dichos polipéptidos podrían administrarse a un ser humano directamente sin esperar una respuesta inmunitaria no deseada por parte de los mismos, y sin la carga de una mayor humanización.

Otra clase ejemplar de sdAb de camélidos humanizados se ha descrito en la patente internacional WO 03/035694 y contiene residuos hidrófobos de FR2 que normalmente se encuentran en anticuerpos convencionales de origen humano o de otras especies, pero compensando esta pérdida de hidrofilicidad por el residuo de arginina cargado en la posición 103 que sustituye al residuo de triptófano conservado presente en V<h>de anticuerpos de doble cadena. Como tales, los péptidos que pertenecen a estas dos clases muestran una alta homología de secuencia de aminoácidos con las regiones marco V<h>humanos y dichos péptidos podrían administrarse a un ser humano directamente sin esperar una respuesta inmunológica no deseada por parte de las mismas, y sin la carga de una humanización adicional.

4. Anticuerpos humanos

Un anticuerpo puede ser un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen generalmente en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin Pharmacol. 5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008). Se conocen en la técnica ratones o ratas transgénicos capaces de producir sdAb completamente humanos. Véase, p. ej., US20090307787A1, las patentes de EE.UU. núms. 8.754.287, US20150289489A1, US20100122358A1, y la patente internacional WO2004049794.

Los anticuerpos humanos se pueden preparar administrando un inmunógeno a un animal transgénico que ha sido modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta al desafío antigénico. Dichos animales contienen típicamente todos o una porción de los loci de inmunoglobulina humana, que reemplazan a los loci de inmunoglobulina endógena, o que están presentes extracromosómicamente o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En dichos ratones transgénicos, los loci de inmunoglobulina endógena generalmente han sido inactivados. Para una revisión de los métodos para obtener anticuerpos humanos a partir de animales transgénicos, véase Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Véase también, p. ej., las patentes de EE.UU. núms. 6.075.181 y 6.150.584 que describe la tecnología XENOMOUSE™; patente de EE.UU. núm. 5.770.429 que describe la tecnología HUMa B®; patente de EE.UU. núm.

7.041.870 que describe la tecnología K-M MOUSE® y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. Núm. US 2007/0061900, que describe la tecnología VELOCIMOUSE®). Las regiones variables humanas a partir de anticuerpos intactos generados por dichos animales pueden modificarse aún más, p. ej., combinándolo con una región constante humana diferente.

Los anticuerpos humanos también se pueden producir mediante métodos basados en hibridomas. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Véase, p. ej., Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984).); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)) Los anticuerpos humanos generados mediante tecnología de hibridoma de células B humanas también se describen en Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Los métodos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente de EE.UU. núm. 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos monoclonales IgM humanos a partir de líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (que describe hibridomas humano-humano). La tecnología de hibridoma humano (tecnología Trioma) también se describe en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27 (3): 185-91 (2005).

Los anticuerpos humanos también pueden generarse aislando secuencias del dominio variable del clon Fv seleccionadas de bibliotecas de presentación en fagos derivadas de humanos. A continuación, dichas secuencias de dominio variable pueden combinarse con un dominio constante humano deseado. A continuación se describen técnicas para seleccionar anticuerpos humanos a partir de bibliotecas de anticuerpos.

Una técnica para obtener secuencias V<h>H dirigidas contra un antígeno o diana particular implican inmunizar adecuadamente un mamífero transgénico que sea capaz de expresar anticuerpos de cadena pesada (es decir, para generar una respuesta inmune y/o anticuerpos de cadena pesada dirigidos contra dicho antígeno o diana), obtener una muestra biológica adecuada de dicho mamífero transgénico que contiene (secuencias de ácido nucleico que codifican) dichas secuencias V<h>H (como una muestra de sangre, muestra de suero o muestra de células B) y luego generar secuencias V<h>H dirigidas contra dicho antígeno o diana, a partir de dicha muestra, usando cualquier técnica adecuada conocida per se (tal como cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria o una técnica de hibridoma). Por ejemplo, para este fin, pueden usarse los ratones que expresan anticuerpos de cadena pesada y los métodos y técnicas adicionales descritos en las patentes internacionales WO 02/085945, WO 04/049794 y WO 06/008548 y Janssens et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 10 de octubre de 2006; 103(41): 15130-5. Por ejemplo, dichos ratones que expresan anticuerpos de cadena pesada pueden expresar anticuerpos de cadena pesada con cualquier dominio variable (único) adecuado, tal como dominios variables (únicos) de fuentes naturales (p. ej. dominios variables humanos (simples), dominios variables (simples) de camélidos o dominios variables (simples) de tiburón), así como, por ejemplo, dominios variables (simples) sintéticos o semisintéticos.

5. Anticuerpos derivados de bibliotecas

Los anticuerpos se pueden aislar mediante el análisis de bibliotecas combinatorias en busca de anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, se conocen en la técnica una variedad de métodos para generar bibliotecas de presentación en fagos y analizar dichas bibliotecas en busca de anticuerpos que posean las características de unión deseadas. Estos métodos se revisan, p. ej., en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa,<n>J, 2001) y descrito adicionalmente, p. ej.., en el McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581597 (1992); Marks y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004). Se han descrito métodos para construir bibliotecas de sdAb, por ejemplo, véase la patente de EE.UU. núm. 7371849.

En ciertos métodos de presentación de fagos, los repertorios de los genes V<h>y V<l>se clonan por separado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en bibliotecas de fagos, que luego pueden analizarse en busca de fagos de unión al antígeno como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Los fagos suelen presentar fragmentos de anticuerpos, ya sea como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o como fragmentos Fab. Las bibliotecas de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad contra el inmunógeno sin la necesidad de construir hibridomas. Alternativamente, el repertorio virgen puede clonarse (p. ej., desde el ser humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos para una amplia gama de antígenos no propios y también propios sin ninguna inmunización como se describe en Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, también se pueden crear bibliotecas vírgenes de forma sintética mediante la clonación de segmentos del gen V no reordenados a partir de células madre y el uso de cebadores de PCR que contengan una secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y lograr el reordenamientoin vitro,como lo describe Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Las publicaciones de patente que describen bibliotecas de fagos de anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: los documentos patente de EE.UU. núm.

5.750.373, y las publicaciones de patente de EE.UU. núms. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, y 2009/0002360.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de bibliotecas de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpos humanos en la presente memoria.

6. Anticuerpos multiespecíficos

Un anticuerpo puede ser un anticuerpo multiespecífico, p. ej. un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes. Una de las especificidades de unión puede ser para un antígeno seleccionado del grupo que consiste en CD19, CD20, BCMA y<c>D38, y la otra es para cualquier otro antígeno. Los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos epítopos diferentes de un antígeno seleccionado del grupo que consiste en CD19, CD20, BCMA y CD38. También se pueden usar anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos en células que expresan un antígeno seleccionado del grupo que consiste en Cd 19, CD20, BCMA y CD38.

Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos. Las técnicas para producir anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, la coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades (véase Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983)), patente internacional WO 93/08829, y Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), y la ingeniería "perilla en el agujero" (véase, por ejemplo, Patente de EE.UU. núm.

5.731.168). También se pueden producir anticuerpos multiespecíficos diseñando efectos de dirección electrostática para producir moléculas heterodiméricas Fc de anticuerpo (patente internacional WO 2009/089004A1); reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, p. ej., la patente de EE.UU. núm. 4.676.980, y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); usando cremalleras de leucina para producir anticuerpos biespecíficos (véase, p. ej., Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); utilizando la tecnología de "diacuerpos" para producir fragmentos de anticuerpos biespecíficos (véase, p. ej., Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa , 90:6444-6448 (1993)); y usando dímeros Fv (sFv) monocatenarios (véase, p. ej., Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); y preparar anticuerpos triespecíficos como se describe, p. ej., en Tutt et al. J. Inmunol. 147: 60 (1991); y creando polipéptidos que comprenden anticuerpos de dominio único en tándem (véase, p. ej., la solicitud de patente de EE.UU. núm. 20110028695; y Conrath et al. J. Biol. Chem., 2001; 276(10):7346-50). Los anticuerpos diseñados con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, incluidos los "anticuerpos pulpo", también se incluyen en la presente memoria (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576A1).

7. Variantes de anticuerpo (La sección "7. Variantes de anticuerpos" se describe como referencia. Las realizaciones descritas en esta sección no son realizaciones de la invención).

En algunas realizaciones, se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos proporcionados en la presente memoria. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo, o mediante síntesis de péptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, eliminaciones y/o inserciones y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede realizar cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución para llegar al constructo final, siempre que el constructo final posea las características deseadas. p. ej. unión a antígeno.

a) variantes de sustitución, inserción y eliminación

En algunas realizaciones, se proporcionan variantes de anticuerpos que tienen una o más sustituciones de aminoácidos. Los sitios de interés para la mutagénesis sustitutiva incluyen los HVR y los FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 3 bajo el título "Sustituciones preferidas". Se proporcionan cambios más sustanciales en la Tabla 3 bajo el título de "sustituciones ejemplares" y como se describe más adelante en referencia a las clases de cadenas laterales de aminoácidos. Se pueden introducir sustituciones de aminoácidos en un anticuerpo de interés y analizar los productos para una actividad deseada. p. ej., unión de antígeno retenida/mejorada, inmunogenicidad disminuida o ADCC o CDC mejoradas.

TABLA 3. Sustituciones de aminoácidos

Los aminoácidos se pueden agrupar según las propiedades comunes de las cadenas laterales:

(1) hidrofóbicos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrófilo neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácido: Asp, Glu;

(4) básico: His, Lys, Arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras implicarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

Un tipo de variante sustitucional implica la sustitución de uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (p. ej., un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para estudios posteriores tendrá(n) modificaciones (p. ej., mejoras) en ciertas propiedades biológicas (p. ej., afinidad aumentada, inmunogenicidad reducida) en relación con el anticuerpo parental y/o habrá conservado sustancialmente ciertas propiedades biológicas del anticuerpo parental. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo madurado por afinidad, que puede generarse convenientemente, p. ej.., usando técnicas de maduración de afinidad basadas en presentación en fagos como las descritas en la presente memoria. Brevemente, se mutan uno o más residuos de HVR y los anticuerpos variantes se muestran en fagos y se analizan para detectar una actividad biológica particular (p. ej., afinidad de unión).

Pueden realizarse alteraciones (p. ej., sustituciones) en HVR, p. ej., para mejorar la afinidad de los anticuerpos. Dichas alteraciones pueden realizarse en los "puntos calientes" del h Vr , es decir, residuos codificados por codones que experimentan mutaciones con alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, p. ej., Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), y/o SDR (a-CDR), probándose la variante resultante V<h>o V<l>para determinar la afinidad de unión. Se ha descrito la maduración de la afinidad mediante la construcción y reselección de bibliotecas secundarias. p. ej., en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) En algunas realizaciones de maduración de la afinidad, se introduce diversidad en los genes variables elegidos para la maduración mediante cualquiera de una variedad de métodos (p. ej., PCR propensa a errores, mezcla de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). Luego se crea una biblioteca secundaria. Luego se analiza la biblioteca para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad implica enfoques dirigidos por HVR, en los que se aleatorizan varios residuos de HVR (p. ej., 4-6 residuos a la vez). Los residuos de HVR implicados en la unión a antígenos pueden identificarse específicamente, p. ej., usando mutagénesis o modelado de barrido de alanina. A menudo se fijan como objetivo especialmente CDR-H3 y CDR-L3.

En algunas realizaciones, pueden ocurrir sustituciones, inserciones o eliminaciones dentro de uno o más HVR siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno. Por ejemplo, se pueden realizar alteraciones conservadoras (p. ej., sustituciones conservadoras como se proporciona en la presente memoria) que no reducen sustancialmente la afinidad de unión en los HVR. Dichas alteraciones pueden estar fuera de los "puntos calientes" de HVR o CDR. En algunas realizaciones de las secuencias V<h>H variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR está inalterada o no contiene más de una, dos o tres sustituciones de aminoácidos.

Un método útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que puede ser el objetivo de la mutagénesis se denomina "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este método, un residuo o grupo de residuos diana (p. ej., residuos cargados como Arg, Asp, His, Lys y Glu) se identifican y reemplazan por un aminoácido neutro o con carga negativa (p. ej., alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Pueden introducirse más sustituciones en las ubicaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De forma alternativa, o adicional, una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos vecinos pueden seleccionarse o eliminarse como candidatos para la sustitución. Se pueden analizar las variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.

Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones en los extremos amino y/o carboxilo que varían en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos individuales o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionilo N-terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo con una enzima (p. ej., por ADEPT) o un polipéptido que aumenta la vida media sérica del anticuerpo.

b) variantes de glicosilación

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente memoria se altera para aumentar o disminuir el grado en que el anticuerpo está glicosilado. La adición o eliminación de sitios de glicosilación a un anticuerpo se puede lograr convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de manera que se creen o eliminen uno o más sitios de glicosilación.

Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, el carbohidrato unido a ella puede alterarse. Los anticuerpos nativos producidos por células de mamíferos normalmente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que generalmente está unido mediante un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, p. ej., Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir varios carbohidratos, p. ej., manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa unida a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura del oligosacárido biantenario. En algunas realizaciones, se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo para crear variantes de anticuerpo con ciertas propiedades mejoradas.

En algunas realizaciones, se proporcionan variantes de anticuerpos que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fc. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en dicho anticuerpo puede ser del 1 % al 80 %, del 1 % al 65 %, del 5 % al 65 % o del 20 % al 40 %. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad media de fucosa dentro de la cadena de azúcar en Asn297, en relación con la suma de todas las glicoestructuras unidas a Asn297 (p. ej., estructuras complejas, híbridas y con alto contenido de manosa) como se mide por espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe en la patente internacional WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo de asparagina ubicado aproximadamente en la posición 297 en la región Fc (numeración EU de residuos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también puede estar ubicado aproximadamente ± 3 aminoácidos más arriba o más abajo de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones menores de secuencia en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden haber mejorado la función ADCC. Véase, p. ej., Publicaciones de patentes de EE.UU. núms. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpos "desfucosilados" o "deficientes en fucosa" incluyen: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos defucosilados incluyen células Lec13 CHO deficientes en fucosilación de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Solicitud de patente de EE.UU. núm. US 2003/0157108 A1, Presta, L; y patente internacional WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente en el Ejemplo 11), y líneas celulares inactivadas, tales como el gen de la alfa-1,6-fucosiltransferasa,FUT8,células CHO desactivadas (véase, p. ej., Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); y patente internacional WO2003/085107).

Las variantes de anticuerpos se proporcionan además con oligosacáridos divididos en dos, p. ej., en los que GlcNAc divide en dos un oligosacárido biantenario unido a la región Fc del anticuerpo. Dichas variantes de anticuerpos pueden tener una fucosilación reducida y/o una función ADCC mejorada. Ejemplos de dichas variantes de anticuerpos se describen, p. ej., en la patente internacional WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); patente de EE.UU. núm. 6.602.684 (Umana et al.); y el documento US 2005/0123546 (Umana et al.). También se proporcionan variantes de anticuerpos con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpos pueden haber mejorado la función de los CDC. Dichas variantes de anticuerpos se describen, p. ej., en las patentes internacionales WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.).

C) variantes de la región fc

En algunas realizaciones, se pueden introducir una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en la presente memoria, generando así una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (p. ej., una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácidos (p. ej. una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos.

En algunas realizaciones, existe una variante de anticuerpo que posee algunas, pero no todas, las funciones efectoras, lo que la convierte en un candidato deseable para aplicaciones en las que la vida media del anticuerpoin vivoes importante, pero ciertas funciones efectoras (como el complemento y la ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad invitroy/o invivopara confirmar la reducción/agotamiento de las actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de unión al receptor Fc (FcR) para garantizar que el anticuerpo carezca de unión a F<cy>R (por lo tanto, probablemente carezca de actividad ADCC), pero conserve la capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar ADCC, las células NK, expresan Fc(RIII únicamente, mientras que los monocitos expresan Fc(RI, Fc(RII y Fc(RIII). La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Ejemplos no limitativos de ensayosin vitropara evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés se describen en la patente de EE.UU. núm. 5.500.362 (véase, p ej. Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83: 7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. Us a 82:1499-1502 (1985); 5.821.337 (véase Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternativamente, se pueden emplear métodos de ensayos no radiactivos (véase, por ejemplo ACTI™ ensayo de citotoxicidad no radiactiva para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y CytoTox 96® ensayo de citotoxicidad no radiactiva (Promega, Madison, WI). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK). Alternativa o adicionalmente, se puede evaluar la actividad ADCC de la molécula de interésin vivo,p. ej., en un modelo animal como el descrito en Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). También se pueden realizar ensayos de unión de C1q para confirmar que el anticuerpo no puede unirse a C1q y, por tanto, carece de actividad CDC. Véase, p. ej., ELISA de unión de C1q y C3c en las patentes internacionales WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo CDC (véase por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragg, MS. y M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). Las determinaciones de unión a FcRn y aclaramiento/vida media invivotambién se pueden realizar usando métodos conocidos en la técnica (véase, p. ej., Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)).

Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (la patente de EE.UU. 6.737.056). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, incluido el denominado mutante de Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (la patente de EE.UU. núm. 7.332.581).

Se describen ciertas variantes de anticuerpos con unión mejorada o disminuida a los FcR. (Véase, p. ej., la patente de EE.UU. núm. 6.737.056; patente internacional WO 2004/056312, y Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).)

En algunas realizaciones, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran la ADCC, p. ej., sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración EU de residuos).

En algunas realizaciones, se realizan alteraciones en la región Fc que dan como resultado unión de C1q y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) alterados (es decir, ya sea mejorado o disminuido), p. ej., como se describe en la patente de EE.UU. núm. 6.194.551, patente internacional WO 99/51642, y Idusogie et al. J. Immunol.

164: 4178-4184 (2000).

Los anticuerpos con vidas medias aumentadas y unión mejorada al receptor Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), se describen en el documento US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Esos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Dichas variantes de Fc incluyen aquellas con sustituciones en uno o más residuos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, p. ej., sustitución del residuo 434 de la región Fc (patente de EE.UU. núm. 7.371.826).

Véase también Duncan y Winter, Nature 322:738-40 (1988); Patente de EE.UU. núm. 5.648.260; patente de EE.UU. núm. 5.624.821; y WO 94/29351 con respecto a otros ejemplos de variantes de la región Fc.

d) variantes de anticuerpos diseñados con cisteína

En algunas realizaciones, puede ser deseable crear anticuerpos diseñados con cisteína, p. ej., "tioMAb", en los que uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen por residuos de cisteína. En realizaciones particulares, los residuos sustituidos aparecen en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir esos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos se colocan en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo con otros restos, tales como restos de fármaco o restos de fármaco conector, para crear un inmunoconjugado, como se describe más adelante en la presente memoria. En algunas realizaciones, uno cualquiera o más de los siguientes residuos pueden sustituirse con cisteína: A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fc de cadena pesada. Los anticuerpos diseñados con cisteína pueden generarse como se describe, p. ej., en la patente de EE.UU. núm. 7.521.541.

e) derivados de anticuerpos

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente memoria puede modificarse adicionalmente para contener restos no proteicos adicionales que se conocen en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polímeros solubles en agua. Los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (ya sean homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (p. ej., glicerol), alcohol polivinílico y mezclas de los mismos. El propionaldehído de polietilenglicol puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede tener cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. La cantidad de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y, si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización se puede determinar basándose en consideraciones que incluyen, pero no se limitan a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo a mejorar, si el derivado de anticuerpo se usará en una terapia bajo condiciones definidas, etc.

En algunas realizaciones, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un resto no proteico que pueden calentarse selectivamente mediante exposición a radiación. En algunas realizaciones, el resto no proteico es un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan las células ordinarias, pero que calientan el resto no proteico a una temperatura a la que mueren las células próximas al resto no proteico del anticuerpo.

Métodos de preparación

Los anticuerpos (tales como sdAb) descritos en la presente memoria se pueden preparar usando cualquier método conocido en la técnica o como se describe en la presente memoria.

Se han descrito métodos de preparación de sdAb. Véase, por ejemplo, Els Pardon et al, Nature Protocol, 2014; 9(3): 674. Los anticuerpos de dominio único (como V<h>H) se pueden obtener usando métodos conocidos en la técnica, tales como inmunizando una especie camélido (tales como camello o llama) y obteniendo hibridomas a partir de las mismas, o clonando una biblioteca de sdAb usando técnicas de biología molecular conocidas en la técnica y selección posterior mediante ELISA con clones individuales de bibliotecas no seleccionadas o usando presentación en fagos.

Para la producción recombinante de los sdAb, los ácidos nucleicos que codifican los sdAb se aíslan y se insertan en un vector replicable para su posterior clonación (amplificación del a Dn ) o para su expresión. El ADN que codifica el sdAb se aísla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (p. ej., mediante el uso de sondas oligonucleotídicas que sean capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Hay muchos vectores disponibles. La elección del vector depende en parte de la célula huésped que se va a usar. Generalmente, las células huésped preferidas son de origen procariota o eucariota (generalmente de mamífero).

1. Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlonales generalmente se generan en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede resultar útil conjugar el antígeno relevante con una proteína que sea inmunogénica en la especie que se va a inmunizar, p. ej., hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina sérica, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja, usando un agente bifuncional o derivatizante, p. ej., éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCb, o R1N=C=NR, donde R y R1 son independientemente grupos alquilo inferiores. Ejemplos de adyuvantes que pueden emplearse incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante MPL-TDM (monofosforil lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintético). El protocolo de inmunización puede seleccionarse por un experto en la técnica sin experimentación indebida.

Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados combinando, p. ej., 100 |jg o 5 |jg o la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la disolución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes después, los animales se estimulan con 1/5 a l / l0 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a catorce días después, se sangra a los animales y se analiza el título de anticuerpos en el suero. Los animales se estimulan hasta que el título se estabiliza. También se pueden preparar conjugados en cultivos celulares recombinantes como fusiones de proteínas. Además, los agentes agregantes como el alumbre son adecuados para potenciar la respuesta inmunitaria.

2. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales se obtienen a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que componen la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se dan de forma natural y/o modificaciones postraduccionales (p. ej., isomerizaciones, amidaciones) que pueden estar presentes en cantidades menores. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo no es una mezcla de anticuerpos discretos.

Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o puede elaborarse mediante métodos de ADN recombinante (Patente de EE.UU. núm. 4.816.567).

En el método del hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, como se describió anteriormente para provocar linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Luego, los linfocitos se fusionan con células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986).

El agente de inmunización normalmente incluirá la proteína antigénica o una variante de fusión de la misma. Generalmente se usan linfocitos de sangre periférica ("PBL") si se desean células de origen humano, o se usan células de bazo o células de ganglios linfáticos si se desean fuentes de mamíferos no humanos. Luego, los linfocitos se fusionan con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), págs. 59 103.

Las líneas celulares inmortalizadas suelen ser células de mamíferos transformadas, particularmente células de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Normalmente se emplean líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma así preparadas se siembran y se cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas normalmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), que son sustancias que evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Las células de mieloma inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan una producción estable de alto nivel de anticuerpos por parte de las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre estas, se prefieren líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EE.UU., y células SP-2 (y derivados de las mismas, p. ej., X63-Ag8-653) disponible en el American Type Culture Collection, Manassas, Va. EE.UU. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma humano-ratón para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).

Se analiza el medio de cultivo en el que crecen las células de hibridoma para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma se puede analizar para determinar la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno deseado. Preferiblemente, la afinidad de unión y la especificidad del anticuerpo monoclonal se pueden determinar mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo ligado a enzimas (ELISA). Dichas técnicas y ensayos se conocen en la técnica. Por ejemplo, la afinidad de unión puede determinarse mediante el análisis de Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem, 107:220 (1980).

Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse mediante métodos estándar (Goding, supra). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, el líquido ascítico o el suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales también se pueden producir mediante métodos de ADN recombinante, como los descritos en patente de EE.UU. núm. 4.816.567, y como se describe anteriormente. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (p. ej., mediante el uso de sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma sirven como fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que luego se transfectan a células huésped como célulasE. coli,células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, con el fin de sintetizar anticuerpos monoclonales en dichas células huésped recombinantes. Los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias del ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) y Pliickthun, Immunol. Revs. 130: 151-188 (1992).

Los anticuerpos se pueden aislar a partir de bibliotecas de fagos de anticuerpos generadas usando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango nM) mediante mezcla de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como la infección combinatoria y la recombinación in vivo como estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265-2266 (1993)). Por tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridoma de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera humanas en lugar de las secuencias murinas homólogas (patente de EE.UU. núm.

4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido que no es de inmunoglobulina. Normalmente, dichos polipéptidos que no son de inmunoglobulina se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación de antígenos que tiene especificidad por un antígeno diferente.

Los anticuerpos monoclonales descritos en la presente memoria pueden ser monovalentes, cuya preparación es bien conocida en la técnica. Por ejemplo, un método implica la expresión recombinante de una cadena ligera de inmunoglobulina y una cadena pesada modificada. La cadena pesada generalmente se trunca en cualquier punto de la región Fc para evitar la reticulación de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisteína relevantes pueden sustituirse con otro residuo de aminoácido o eliminarse para evitar la reticulación. Los métodos in vitro también son adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente fragmentos Fab, se puede lograr usando técnicas rutinarias conocidas en la técnica.

También se pueden preparar anticuerpos quiméricos o híbridos in vitro usando métodos conocidos en química de proteínas sintéticas, incluidos aquellos que implican agentes reticulantes. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden construirse usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este fin incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato.

3. Producción recombinante en células procariotas.

a) Construcción de vectores

Las secuencias de polinucleótidos que codifican los anticuerpos usados en la invención se pueden obtener usando técnicas recombinantes estándar. Las secuencias de polinucleótidos deseadas pueden aislarse y secuenciarse a partir de células productoras de anticuerpos tales como células de hibridoma. Alternativamente, los polinucleótidos se pueden sintetizar usando un sintetizador de nucleótidos o técnicas de PCR. Una vez obtenidos, las secuencias que codifican los polipéptidos se insertan en un vector recombinante capaz de replicar y expresar polinucleótidos heterólogos en huéspedes procariotas. Para los fines de la presente invención se pueden usar muchos vectores que están disponibles y son conocidos en la técnica. La selección de un vector apropiado dependerá principalmente del tamaño de los ácidos nucleicos a insertar en el vector y de la célula huésped particular a transformar con el vector. Cada vector contiene varios componentes, dependiendo de su función (amplificación o expresión de polinucleótido heterólogo, o ambas) y su compatibilidad con la célula huésped particular en la que reside. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a: un origen de replicación, un gen marcador de selección, un promotor, un sitio de unión a ribosoma (RBS), una secuencia señal, el inserto de ácido nucleico heterólogo y una secuencia de terminación de la transcripción.

En general, en relación con estos huéspedes se usan vectores plasmídicos que contienen replicón y secuencias de control que se derivan de especies compatibles con la célula huésped. El vector normalmente lleva un sitio de replicación, así como secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo,E. colinormalmente se transforma usando pBR322, un plásmido derivado de una especie de E.coli.pBR322 contiene genes que codifican la resistencia a ampicilina (Amp) y tetraciclina (Tet) y, por tanto, proporciona un medio sencillo para identificar células transformadas. pBR322, sus derivados u otros plásmidos microbianos o bacteriófagos también pueden contener, o modificarse para contener, promotores que pueden ser usados por el organismo microbiano para la expresión de proteínas endógenas. Ejemplos de derivados de pBR322 usados para la expresión de anticuerpos particulares se describen en detalle en Carter et al., patente de EE.UU. núm.

5.648.237.

Además, como vectores de transformación en relación con estos huéspedes se pueden usar vectores de fagos que contienen replicones y secuencias de control que son compatibles con el microorganismo huésped. Por ejemplo, bacteriófagos como GEM™-11 puede utilizarse para fabricar un vector recombinante que puede usarse para transformar células huésped susceptibles tales como E.coliLE392.

El vector de expresión puede comprender dos o más pares promotor-cistrón, que codifican cada uno de los componentes polipeptídicos. Un promotor es una secuencia reguladora no traducida ubicada más arriba (5') de un cistrón que modula su expresión. Los promotores procariotas normalmente se dividen en dos clases, inducibles y constitutivos. El promotor inducible es un promotor que inicia niveles aumentados de transcripción del cistrón bajo su control en respuesta a cambios en las condiciones del cultivo, p. ej. la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura.

Son bien conocidos un gran número de promotores reconocidos por una variedad de células huésped potenciales. El promotor seleccionado puede unirse operativamente al ADN del cistrón que codifica la cadena ligera o pesada eliminando el promotor del ADN fuente mediante digestión con enzimas de restricción e insertando la secuencia del promotor aislada en el vector. Se puede usar tanto la secuencia del promotor nativo como muchos promotores heterólogos para dirigir la amplificación y/o expresión de los genes diana. Se pueden utilizar promotores heterólogos, ya que generalmente permiten una mayor transcripción y mayores rendimientos del gen diana expresado en comparación con el promotor del polipéptido diana nativo.

Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procariotas incluyen el promotor PhoA, los sistemas promotores de galactamasa y lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac o trc. Sin embargo, también son adecuados otros promotores que son funcionales en bacterias (tales como otros promotores bacterianos o de fagos conocidos). Sus secuencias de ácido nucleico han sido publicadas, lo que permite a un trabajador cualificado ligarlas operativamente a cistrones que codifican las cadenas ligeras y pesadas diana (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269) usando conectores o adaptadores para suministrar los sitios de restricción necesarios.

En un aspecto, cada cistrón dentro del vector recombinante comprende un componente de secuencia señal de secreción que dirige la translocación de los polipéptidos expresados a través de una membrana. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser parte del ADN polipeptídico diana que se inserta en el vector. La secuencia de señales seleccionada para los fines de esta invención debe ser una que sea reconocida y procesada (es decir escindida por una señal peptidasa) por la célula huésped. Para las células huésped procariotas que no reconocen ni procesan las secuencias señal nativas de los polipéptidos heterólogos, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo que consiste en fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o líderes de enterotoxina II (STII) termoestables, LamB, PhoE, PelB, OmpA y MBP. Las secuencias señal usadas en ambos cistrones del sistema de expresión pueden ser secuencias señal STII o variantes de las mismas.

La producción de anticuerpos puede ocurrir en el citoplasma de la célula huésped y, por lo tanto, no requiere la presencia de secuencias señal de secreción dentro de cada cistrón. Componentes polipeptídicos, como el polipéptido que codifica el dominio V<h>de la primera porción de unión a antígeno opcionalmente fusionado a la segunda porción de unión a antígeno, y el polipéptido que codifica el dominio V<l>de la primera porción de unión a antígeno, opcionalmente fusionado a la segunda porción de unión a antígeno, puede expresarse, plegarse y ensamblarse para formar anticuerpos funcionales dentro del citoplasma. Ciertas cepas huésped (p. ej., las cepas trxB- de E.coli)proporcionan condiciones citoplasmáticas que son favorables para la formación de enlaces disulfuro, permitiendo así el plegamiento y ensamblaje adecuados de las subunidades de proteínas expresadas. Proba y Pluckthun Gene, 159:203 (1995).

Se describe un sistema de expresión en el que la relación cuantitativa de los componentes polipeptídicos expresados se puede modular para maximizar el rendimiento de los anticuerpos secretados y ensamblados adecuadamente. Dicha modulación se logra al menos en parte modulando simultáneamente las fuerzas de traducción de los componentes polipeptídicos. Una técnica para modular la fuerza de traducción se describe en Simmons et al., patente de EE.UU. núm. 5.840.523. Utiliza variantes de la región de iniciación de la traducción (TIR) dentro de un cistrón. Para un TIR determinado, se puede crear una serie de variantes de secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos con una variedad de fuerzas de traducción, proporcionando así un medio conveniente mediante el cual ajustar este factor para el nivel de expresión deseado de la cadena específica. Las variantes de TIR pueden generarse mediante técnicas de mutagénesis convencionales que dan como resultado cambios de codones que pueden alterar la secuencia de aminoácidos, aunque se prefieren cambios silenciosos en la secuencia de ácidos nucleicos. Las alteraciones en la TIR pueden incluir, por ejemplo, alteraciones en el número o espaciado de las secuencias de Shine-Dalgarno, junto con alteraciones en la secuencia señal. Un método para generar secuencias señal mutantes es la generación de un "banco de codones" al comienzo de una secuencia codificante que no cambia la secuencia de aminoácidos de la secuencia señal (es decir, los cambios son silenciosos). Esto se puede lograr cambiando la posición del tercer nucleótido de cada codón; además, algunos aminoácidos, como la leucina, la serina y la arginina, tienen múltiples primeras y segundas posiciones que pueden añadir complejidad a la hora de formar el banco. Este método de mutagénesis se describe en detalle en Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158.

Preferiblemente, se genera un conjunto de vectores con una variedad de fuerzas de TIR para cada cistrón en el mismo. Este conjunto limitado proporciona una comparación de los niveles de expresión de cada cadena, así como el rendimiento de los productos proteicos deseados bajo varias combinaciones de fuerza de TIR. Las fuerzas de TIR se pueden determinar cuantificando el nivel de expresión de un gen reportero como se describe en detalle en Simmons et al. patente de EE.UU. núm. 5.840.523. En base a la comparación de la fuerza de traducción, se seleccionan las TIR individuales deseadas para combinarlas en los constructos de vectores de expresión de la presente solicitud.

b) Células huésped procariotas.

Las células huésped procarióticas adecuadas para expresar los anticuerpos incluyen arqueobacterias y eubacterias, tales como organismos gram-negativos o gram-positivos. Ejemplos de bacterias útiles incluyenEscherichia(p. ej., E.coli), Bacilli(p. ej.,B. subtilis),enterobacterias, especiePseudomonas(p. ej.,P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serrada marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla,oParacoccus.En algunas realizaciones, se usan células gram-negativas. En algunos ejemplos, las célulasE. colise usan como huéspedes. Ejemplos de cepas deE. coliincluyen la cepa W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: Sociedad Americana de Microbiología, 1987), págs. 1190-1219; Depósito ATCC No. 27.325) y derivados de las mismas, incluida la cepa 33D3 que tiene el genotipo W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompT A( nmpc-fepE) degP41 kanR (patente de EE.UU. núm. 5.639.635). Otras cepas y derivados de las mismas, tales comoE. coli294 (ATCC 31.446),E. coliB,E. coli1776 (ATCC 31.537) yE. coliRV308 (ATCC 31.608) también son adecuadas. Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes. Los métodos para construir derivados de cualquiera de las bacterias mencionadas anteriormente que tienen genotipos definidos se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990). Generalmente es necesario seleccionar las bacterias apropiadas teniendo en cuenta la replicabilidad del replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo, las especiesE. coli, Serratia,oSalmonellapueden usarse adecuadamente como huésped cuando se usan plásmidos bien conocidos tales como pBR322, pBR325, pACYC177 o pKN410 para suministrar el replicón.

Normalmente, la célula huésped debería secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas, y es deseable incorporar inhibidores de proteasa adicionales al cultivo celular.

c) Producción de proteínas

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión descritos anteriormente y se cultivan en medios nutritivos convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. La transformación significa introducir ADN en el huésped procariota para que el ADN sea replicable, ya sea como elemento extracromosómico o como integrante cromosómico. Dependiendo de la célula huésped usada, la transformación se realiza usando técnicas estándar apropiadas para dichas células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio se usa generalmente para células bacterianas que contienen barreras sustanciales de pared celular. Otro método de transformación emplea polietilenglicol/DMSO. Otra técnica más usada es la electroporación.

Las células procariotas usadas para producir los anticuerpos se cultivan en medios conocidos en la técnica y adecuados para el cultivo de las células huésped seleccionadas. Ejemplos de medios adecuados incluyen caldo luria (LB) más los suplementos nutricionales necesarios. En algunos ejemplos, el medio también contiene un agente de selección, elegido en función de la construcción del vector de expresión, para permitir selectivamente el crecimiento de células procariotas que contienen el vector de expresión. Por ejemplo, se añade ampicilina a los medios para el crecimiento de células que expresan el gen resistente a la ampicilina.

Cualquier suplemento necesario además de las fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato inorgánico también puede incluirse en concentraciones apropiadas introducidas solas o como una mezcla con otro suplemento o medio tal como una fuente de nitrógeno compleja. Opcionalmente, el medio de cultivo puede contener uno o más agentes reductores seleccionados del grupo que consiste en glutatión, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol y ditiotreitol.

Las células huésped procariotas se cultivan a temperaturas adecuadas. Para el crecimiento deE. coli,por ejemplo, la temperatura preferida varía de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 39 °C, más preferiblemente de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 37 °C, incluso más preferiblemente a aproximadamente 30 °C. El pH del medio puede ser cualquier pH que varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 9, dependiendo principalmente del organismo huésped. Para E.coli,el pH es preferiblemente de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,4, y más preferiblemente aproximadamente 7,0.

Si se usa un promotor inducible en el vector de expresión, la expresión de la proteína se induce en condiciones adecuadas para la activación del promotor. En un aspecto, se usan promotores PhoA para controlar la transcripción de los polipéptidos. Por consiguiente, las células huésped transformadas se cultivan en un medio limitante de fosfato para la inducción. Preferiblemente, el medio limitante de fosfato es el medio C.R.A.P (véase, p. ej., Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147). Se puede usar una variedad de otros inductores, según el constructo de vector empleado, como se conoce en la técnica.

Los anticuerpos expresados se secretan y se recuperan del periplasma de las células huésped. La recuperación de proteínas implica típicamente alterar el microorganismo, generalmente por medios tales como choque osmótico, sonicación o lisis. Una vez que las células se rompen, los restos celulares o las células enteras pueden eliminarse mediante centrifugación o filtración. Las proteínas pueden purificarse adicionalmente, por ejemplo, mediante cromatografía de resina de afinidad. Alternativamente, las proteínas pueden transportarse al medio de cultivo y aislarse allí. Las células pueden retirarse del cultivo y el sobrenadante del cultivo puede filtrarse y concentrarse para una purificación adicional de las proteínas producidas. Los polipéptidos expresados se pueden aislar e identificar adicionalmente usando métodos comúnmente conocidos tales como electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y ensayo de transferencia Western.

Alternativamente, la producción de proteínas en grandes cantidades se realiza mediante un proceso de fermentación. Están disponibles varios procedimientos de fermentación por lotes a gran escala para la producción de proteínas recombinantes. Las fermentaciones a gran escala tienen al menos 1.000 litros de capacidad, preferiblemente entre I . 000 y 100.000 litros de capacidad. Estos fermentadores utilizan impulsores agitadores para distribuir oxígeno y nutrientes, especialmente glucosa (la fuente preferida de carbono/energía). La fermentación a pequeña escala se refiere generalmente a la fermentación en un fermentador que no tiene más de aproximadamente 100 litros de capacidad volumétrica, y puede variar de aproximadamente 1 litro a aproximadamente 100 litros.

Durante el proceso de fermentación, la inducción de la expresión de proteínas normalmente se inicia después de que las células se hayan cultivado en condiciones adecuadas hasta una densidad deseada.p. ej.,un OD550 de aproximadamente 180-220, etapa en la que las células se encuentran en la fase estacionaria temprana. Se pueden usar diversos inductores, según el constructo de vector empleado, como se conoce en la técnica y se describe anteriormente. Las células pueden cultivarse durante períodos más cortos antes de la inducción. Las células normalmente se inducen durante aproximadamente 12 a 50 horas, aunque se puede usar un tiempo de inducción más largo o más corto.

Para mejorar el rendimiento de producción y la calidad de los anticuerpos, se pueden modificar diversas condiciones de fermentación. Por ejemplo, para mejorar el ensamblaje y plegamiento apropiado de los polipéptidos secretados, se pueden usar vectores adicionales que sobreexpresen proteínas chaperonas, tales como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD y/o DsbG) o FkpA (una peptidilprolil cis,trans-isomerasa con actividad chaperona) se puede usar para cotransformar las células procariotas huésped. Se ha demostrado que las proteínas chaperonas facilitan el plegamiento y la solubilidad adecuados de proteínas heterólogas producidas en células bacterianas huésped. Chen et al. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605; Georgiou et al., patente de EE.UU. núm. 6.083.715; Georgiou et al., patente de EE.UU. núm. 6.027.888; Bothmann y Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm y Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210.

Para minimizar la proteólisis de proteínas heterólogas expresadas (especialmente aquellas que son proteolíticamente sensibles), se pueden usar para la presente invención ciertas cepas huésped deficientes en enzimas proteolíticas. Por ejemplo, las cepas de células huésped pueden modificarse para efectuar mutación(ones) genética(s) en los genes que codifican proteasas bacterianas conocidas tales como Proteasa III, OmpT, DegP, Tsp, Proteasa I, Proteasa Mi, Proteasa V, Proteasa VI y combinaciones de las mismas. Algunas cepas de E.colideficientes en proteasa están disponibles y se describen, por ejemplo, en Joly et al. (1998), supra; Georgiou et al., patente de EE.UU. núm.

5.264.365; Georgiou et al., patente de Ee .UU. núm. 5.508.192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).

Se pueden usar cepas de E.colideficientes en enzimas proteolíticas y transformadas con plásmidos que sobreexpresan una o más proteínas chaperonas como células huésped en el sistema de expresión que codifica los anticuerpos.

d) Purificación de proteínas

Los anticuerpos producidos en la presente memoria se purifican adicionalmente para obtener preparaciones que son sustancialmente homogéneas para ensayos y usos adicionales. Se pueden emplear métodos de purificación de proteínas estándar conocidos en la técnica. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico tal como DEAE, cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitación con sulfato de amonio, y filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75.

En un aspecto, la proteína A inmovilizada en una fase sólida se usa para la purificación por inmunoafinidad de los anticuerpos que comprenden una región Fc de la presente solicitud. La proteína A es una proteína de la pared celular de 41 kD deStaphylococcus aureasque se une con alta afinidad a la región Fc de los anticuerpos. Lindmark et al. (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. La fase sólida en la que se inmoviliza la Proteína A es preferiblemente una columna que comprende una superficie de vidrio o sílice, más preferiblemente una columna de vidrio de poro controlado o una columna de ácido silícico. En algunas aplicaciones, la columna se ha recubierto con un reactivo, como glicerol, en un intento de evitar la adherencia inespecífica de contaminantes. Luego se lava la fase sólida para eliminar los contaminantes unidos no específicamente a la fase sólida. Finalmente los anticuerpos de interés se recuperan de la fase sólida mediante elución.

4. Producción recombinante en células eucariotas

Para la expresión eucariota, los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores y un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.

a) Componente de secuencia señal

Un vector para uso en un huésped eucariota también puede ser un inserto que codifica una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína o polipéptido maduro. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferentemente es una que se reconoce y procesa (es decir, se escinde por una peptidasa señal) por la célula huésped. En la expresión de células de mamíferos, están disponibles secuencias señal de mamíferos así como líderes secretores virales, por ejemplo, la señal gD del herpes simple.

El ADN de dicha región precursora se liga en el marco de lectura al ADN que codifica los anticuerpos.

b) Origen de replicación

Generalmente, el componente de origen de replicación no es necesario para los vectores de expresión de mamíferos (el origen SV40 normalmente puede usarse sólo porque contiene el promotor temprano).

c) Componente del gen de selección

Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, p. ej., ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) deficiencias auxotróficas del complemento, o (c) suministran nutrientes críticos que no están disponibles en medios complejos, p. ej., el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilli.

Un ejemplo de esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que se transforman con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a los medicamentos y, por lo tanto, sobreviven al régimen de selección. Ejemplos de esta selección dominante usan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos son aquellos que permiten la identificación de células competentes para captar ácido nucleico que codifica los anticuerpos, tales como DHFR, timidina quinasa, metalotioneína-I y II, preferiblemente genes de metalotioneína de primates, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección de DHFR se identifican primero cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR de tipo salvaje es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad de DHFR (p. ej., ATCC CRL-9096).

Alternativamente, las células huésped (particularmente huéspedes de tipo salvaje que contienen DHFR endógeno) transformadas o cotransformadas con las secuencias de ADN que codifican el polipéptido, la proteína DHFR de tipo salvaje y otro marcador seleccionable tal como aminoglicósido 3'-fosfotransferasa (APH) pueden seleccionarse mediante crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglicosídico, p. ej., kanamicina, neomicina o G418. Véase la patente de EE.UU. núm. 4.965.199.

d) Componente Promotor

Los vectores de expresión y clonación normalmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está unido operativamente al ácido nucleico que codifica las secuencias polipeptídicas deseadas. Prácticamente todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT ubicada aproximadamente entre 25 y 30 bases situada más arriba del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia que se encuentra entre 70 y 80 bases situada más arriba desde el inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT donde N puede ser cualquier nucleótido. A en el extremo 3' de la mayoría de los eucariotas es una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias pueden insertarse en vectores de expresión eucarióticos.

Otros promotores adecuados para su uso con huéspedes procariotas incluyen el promotor phoA, sistemas promotores de lactamasa y lactosa, un promotor de fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica los anticuerpos.

La transcripción de polipéptidos de vectores en células huésped de mamíferos se controla, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus tales como virus del polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y más preferiblemente virus de simio 40 (SV40), de promotores de mamíferos heterólogos, p. ej., el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de la célula huésped.

Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación viral de SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para expresar ADN en huéspedes mamíferos usando el virus del papiloma bovino como vector se describe en patente de EE.UU. núm.

4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la patente de EE.UU. núm. 4.601.978. Véase también Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) sobre la expresión del ADNc del interferón humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina quinasa del virus del herpes simple. Alternativamente, se puede utilizar como promotor la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous.

e) Componente del elemento potenciador

La transcripción de un ADN que codifica los anticuerpos por parte de eucariotas superiores a menudo se aumenta insertando una secuencia potenciadora en el vector. Actualmente se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina). Sin embargo, normalmente se usará un potenciador de un virus de células eucariotas. Los ejemplos incluyen el potenciador SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) sobre elementos potenciadores para la activación de promotores eucariotas. El potenciador se puede unir en el vector en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia que codifica el polipéptido, pero preferiblemente se localiza en un sitio 5' del promotor.

f) Componente de terminación de la transcripción

Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanos o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias están comúnmente disponibles en las regiones 5' y, ocasionalmente 3', no traducidas de ADN o ADNc eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica el polipéptido. Un componente útil de terminación de la transcripción es la región de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino. Véase la patente internacional WO94/11026 y el vector de expresión descrito en el mismo.

g) Selección y transformación de células huésped

Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores de la presente memoria incluyen células eucariotas superiores descritas en la presente memoria, incluidas células huésped de vertebrados. La propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (Co S-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (293 o 293 células subclonadas para su crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 At Cc c Cl 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma de cuello de útero humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TR1 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci.

383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción de anticuerpos y se cultivan en medios nutritivos convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

h) Cultivo de las células huésped

Las células huésped usadas para producir los anticuerpos se pueden cultivar en diversos medios. Los medios disponibles comercialmente tales como F10 de Ham (Sigma), Medio esencial mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem.

102:255 (1980), patentes de EE.UU. núms. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; patentes internacionales WO 90/03430; WO 87/00195; o Revisión de patente de EE.UU. núm. 30.985 pueden usarse como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede suplementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (como HEPES), nucleótidos (como adenosina y timidina), antibióticos (como fármaco GENTAMICYN™), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos generalmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También se pueden incluir cualquier otro suplemento necesario en concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las usadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el experto habitual en la técnica.

i) Purificación de proteínas

Cuando se utilizan técnicas recombinantes, los anticuerpos pueden producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico o secretarse directamente al medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como primera etapa, los restos de partículas, ya sean células huésped o fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan en el espacio periplásmico deE. coli.Brevemente, la pasta celular se descongela en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDT<a>y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 minutos. Los restos celulares se pueden eliminar mediante centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta en el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión generalmente se concentran primero usando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios.

La composición proteica preparada a partir de las células se puede purificar usando, por ejemplo, cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La proteína A se puede utilizar para purificar los anticuerpos que se basan en inmunoglobulinas humanas que contienen 1, 2 o 4 cadenas pesadas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para humanos 3 (Guss et al., EMBO J. 5:1567-1575 (1986)). La matriz a la que se une el ligando de afinidad suele ser agarosa, pero hay otras matrices disponibles. Las matrices mecánicamente estables, como el vidrio de poro controlado o el poli(estireno-divinil)benceno, permiten caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con la agarosa. Cuando el anticuerpo comprende una dominio C<h>3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, la precipitación con etanol, la HPLC de fase inversa, la cromatografía sobre sílice, la cromatografía sobre heparina SEPHAROSE™, cromatografía en una resina de intercambio aniónico o catiónico (como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio también están disponibles según el anticuerpo que se va a recuperar.

Después de cualquier etapa(s) de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes se puede someter a cromatografía de interacción hidrófoba de bajo pH usando un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2,5 y 4,5, preferiblemente realizada a bajas concentraciones de sal (p. ej., de aproximadamente 0-0,25 M de sal).

Inmunoconjugados (La sección "Inmunoconjugados" se describe como referencia. Las realizaciones descritas en esta sección no son realizaciones de la invención).

En algunas realizaciones, también hay inmunoconjugados que comprenden cualquiera de los anticuerpos (tales como sdAb) descritos en la presente memoria conjugados con uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes o fármacos quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (p. ej., toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas), o isótopos radiactivos.

En algunas realizaciones, un inmunoconjugado es un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) en el que un anticuerpo se conjuga con uno o más fármacos, incluido, pero no se limitan a, un maitansinoide (véanse las patentes de EE.UU. núms. 5.208.020, 5.416.064 y patente europea EP 0425235 B1); una auristatina como los restos farmacológicos de monometilauristatina DE y DF (MMAE y MMAF) (véanse patentes de EE.UU. núms. 5.635.483 y 5.780.588, y 7.498.298); una dolastatina; una caliqueamicina o un derivado de la misma (véanse las patentes de EE.UU. núms.

5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, y 5.877.296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); y Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); una antraciclina como daunomicina o doxorrubicina (véase Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med.. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem.

45:4336-4343 (2002); y patente de EE.UU. núms. 6.630.579); metotrexato; vindesina; un taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.

En algunas realizaciones, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en la presente memoria conjugado con una toxina enzimáticamente activa o fragmento de la misma, que incluye, pero no se limita a, cadena A de difteria, fragmentos activos no vinculantes de toxina diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y tricotecenos.

En algunas realizaciones, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en la presente memoria, conjugado con un átomo radiactivo para formar un radioconjugado. Se encuentran disponibles una variedad de isótopos radiactivos para la producción de radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu. Cuando el radioconjugado se usa para la detección, puede comprender un átomo radiactivo para estudios gammagráficos, por ejemplo tc99m o I123, o una etiqueta de espín para imágenes por resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como imágenes por resonancia magnética, mri), tal como yodo-123 nuevamente, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Se pueden preparar conjugados de un anticuerpo y un agente citotóxico usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometilo)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como HCl de dimetil adipimidato), ésteres activos (como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (como bis(p-azidobenzoilo) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bisactivos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación de radionucleótido al anticuerpo. Véase la patente internacional WO94/11026. El conector puede ser un "conector escindible" que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede usarse un conector lábil al ácido, un conector sensible a peptidasa, un conector fotolábil, un conector dimetilo o un conector que contiene disulfuro (Chari et al., Cancer Res. 52: 127-131 (1992); patente de EE.UU. núm. 5.208.020).

Los inmunoconjugados o ADC en la presente memoria se contemplan expresamente, pero no se limitan a, dichos conjugados preparados con reactivos reticulantes que incluyen, pero no se limitan a, b Mp S, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que están comercialmente disponibles (p. ej., de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE.UU.).

Métodos y composiciones para diagnóstico y detección. (La sección "Métodos y composiciones para diagnóstico y detección" se describe como referencia. Las realizaciones descritas en esta sección no son realizaciones de la invención).

En algunas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos (tales como sdAb) proporcionados en la presente memoria es útil para detectar la presencia de BCMA en una muestra biológica. El término "detectar", como se usa en la presente memoria, abarca la detección cuantitativa o cualitativa. En determinadas realizaciones, una muestra biológica es sangre, suero u otras muestras líquidas de origen biológico. En algunas realizaciones, una muestra biológica comprende una célula o tejido.

En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo anti-BCMA (tal como cualquiera de los sdAb anti-BCMA descritos en la presente memoria) para usar en un método de diagnóstico o detección. En un aspecto adicional, se proporciona un método para detectar la presencia de BCMA en una muestra biológica. En determinadas realizaciones, el método comprende detectar la presencia de proteína BCMA en una muestra biológica. En determinadas realizaciones, BCMA es BCMA humano. En determinadas realizaciones, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-BCMA como se describe en la presente memoria en condiciones que permitan la unión del anticuerpo anti-BCMA a BCMA, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-BCMA y BCMA. Tal método puede ser un método invitrooin vivo.En algunas realizaciones, se usa un anticuerpo anti-BCMA para seleccionar sujetos elegibles para terapia con un anticuerpo anti-BCMA. p. ej. donde BCMA es un biomarcador para la selección de pacientes.

En determinadas realizaciones, se proporcionan sdAb anti-BCMA marcados. Las etiquetas incluyen, pero no se limitan a, etiquetas o restos que se detectan directamente (tales como etiquetas fluorescentes, cromóforas, densas en electrones, quimioluminiscentes y radiactivas), así como restos, como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente. p. ej., mediante una reacción enzimática o interacción molecular. Las etiquetas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3Mano 131I, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansil, umbeliferona, luceriferasas, p. ej., luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente de EE.UU. núm. 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinadionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas, p. ej., glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de colorante tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, etiquetas de espín, etiquetas de bacteriófagos, radicales libres estables y similares.

III. Receptores de antígenos quiméricos

La presente invención proporciona un CAR como se define en las reivindicaciones. Un receptor de antígeno quimérico (CAR) puede comprender un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende uno o más anticuerpos de dominio único (tales como V<h>H). Cualquiera de los sdAb anti-BCMA descritos en la Sección II se puede utilizar en los CAR descritos en la presente memoria. En las FIGS. 15A-15D se muestran estructuras ejemplares de CAR.

Un CAR dirigido a BCMA (también denominado en la presente memoria "BCMA CAR") puede comprender un polipéptido que comprende: (a) un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende un sdAb anti-BCMA; (b) un dominio transmembrana; y (c) un dominio de señalización intracelular. El sdAb anti-BCMA puede ser camélido, quimérico, humano o humanizado. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular primario de una célula efectora inmune (tal como una célula T). En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular primario deriva de CD3Z. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización coestimulador. En algunas realizaciones, el dominio de señalización coestimulador se deriva de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, Ligandos de CD83 y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el BCMA CAR comprende además un dominio bisagra (tal como un dominio bisagra CD8a) ubicado entre el extremo C del dominio de unión al antígeno extracelular y el extremo N del dominio transmembrana. En algunas realizaciones, el BCMA CAR comprende además un péptido señal (tal como un péptido señal CD8a) ubicado en el extremo N del polipéptido. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende desde el extremo N al extremo C: un péptido señal CD8a, el dominio de unión al antígeno extracelular, un dominio bisagra CD8a, un dominio transmembrana CD28, un primer dominio de señalización coestimulador derivado de CD28, un segundo dominio de señalización coestimulador derivado de CD137 y un dominio de señalización intracelular primario derivado de CD3Z En algunas realizaciones, el polipéptido comprende desde el extremo N al extremo C: un péptido señal CD8a, el dominio de unión al antígeno extracelular, un dominio bisagra CD8a, un dominio transmembrana CD8a, un dominio de señalización coestimulador derivado de CD137, y un dominio de señalización intracelular primario derivado de CD3Z El BCMA CAR puede describirse como monoespecífico.

Un BCMA CAR puede comprender un polipéptido que comprende: (a) un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende un sdAb anti-BCMA; (b) un dominio transmembrana; y (c) un dominio de señalización intracelular, en el que el sdAb anti-BCMA comprende cualquiera de los siguientes: una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:79; o una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:86. El sdAb anti-BCMA puede ser camélido, quimérico, humano o humanizado. El sdAb anti-BCMA puede comprender un dominio V<h>H que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en s Eq ID NO: 117 y 124. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular primario de una célula efectora inmune (tal como célula T). En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular primario deriva de CD3Z. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización coestimulador. En algunas realizaciones, el dominio de señalización coestimulador se deriva de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandos de CD83 y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el BCMA CAR comprende además un dominio bisagra (tal como un dominio bisagra CD8a) ubicado entre el extremo C del dominio de unión al antígeno extracelular y el extremo N del dominio transmembrana. En algunas realizaciones, el BCMA CAR comprende además un péptido señal (tal como un péptido señal CD8a) ubicado en el extremo N del polipéptido. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende desde el extremo N al extremo C: un péptido señal CD8a, el dominio de unión al antígeno extracelular, un dominio bisagra CD8a, un dominio transmembrana CD28, un primer dominio de señalización coestimulador derivado de CD28, un segundo dominio de señalización coestimulador derivado de CD137 y un dominio de señalización intracelular primario derivado de CD3Z En algunas realizaciones, el polipéptido comprende desde el extremo N al extremo C: un péptido señal CD8a, el dominio de unión al antígeno extracelular, un dominio bisagra CD8a, un dominio transmembrana CD8a, un dominio de señalización coestimulador derivado de CD137, y un dominio de señalización intracelular primario derivado de CD3Z En algunas realizaciones, el BCMA CAR es monoespecífico.

Un BCMA CAR puede comprender un polipéptido que tiene al menos aproximadamente cualquiera de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 300-305. Un BCMA CAR puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 300-305. Este es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 300-305.

En algunas realizaciones, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los BCMA CAR de la invención. Un ácido nucleico aislado puede tener al menos aproximadamente cualquiera de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 338-343. En algunas realizaciones, se proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 338-343. El ácido nucleico aislado puede ser un ADN. El ácido nucleico aislado puede ser un ARN. En algunas realizaciones, se proporciona un vector que comprende cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican los BCMA CAR descritos anteriormente. En algunas realizaciones, el vector es un vector de expresión. En algunas realizaciones, el vector es un vector viral, tal como un vector lentiviral. En algunas realizaciones, el vector es un vector no viral. En la Tabla 4 a continuación se muestran ejemplos de BCMA CAR monovalentes como referencia.

Tabla 4. BCMA CAR monovalentes de ejemplo. (descrito como referencia)

Receptores de antígenos quiméricos multivalentes

La presente invención proporciona CAR multivalentes como se define en las reivindicaciones que tienen un primer y un segundo sdAb que se unen específicamente a BCMA. El CAR multivalente puede ser monoespecífico, es decir, el CAR multivalente se dirige a un único antígeno y comprende dos o más sitios de unión para el antígeno individual. El CAR multivalente puede ser multiespecífico, es decir, el CAR multivalente se dirige a más de un antígeno, y el CAR multivalente comprende dos o más sitios de unión para al menos un antígeno. Los restos de unión específicos para el mismo antígeno pueden unirse al mismo epítopo del antígeno (es decir, " CAR monoepítopo") o unirse a diferentes epítopos (es decir, "CAR multiepítopo" tal como CAR biepítopo o CAR triepítopo) del antígeno.

Un receptor de antígeno quimérico multivalente (tal como bivalente, trivalente o de mayor número de valencias) puede comprender un polipéptido que comprende: (a) un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende una pluralidad (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2, 3, 4, 5, 6 o más) de restos de unión que se unen específicamente a un antígeno (tal como un antígeno tumoral); (b) un dominio transmembrana; y (c) un dominio de señalización intracelular. El antígeno se puede seleccionar del grupo que consiste en CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO- 1, MAGE A3 y glicolípido F77.

Un receptor de antígeno quimérico multivalente (tal como bivalente, trivalente o de mayor número de valencias) puede comprender un polipéptido que comprende: (a) un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende una pluralidad (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2, 3, 4, 5, 6 o más) de anticuerpos de dominio único (sdAb) que se unen específicamente a un antígeno (tal como un antígeno tumoral); (b) un dominio transmembrana; y (c) un dominio de señalización intracelular. El antígeno se puede seleccionar del grupo que consiste en CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO- 1, MAGE A3 y glicolípido F77.

Un receptor de antígeno quimérico multivalente (tal como bivalente, trivalente o de mayor número de valencias) puede comprender un polipéptido que comprende: (a) un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende un primer resto de unión que se une específicamente a un primer epítopo de un antígeno (tal como un antígeno tumoral), y un segundo resto de unión que se une específicamente a un segundo epítopo del antígeno; (b) un dominio transmembrana; y (c) un dominio de señalización intracelular, en donde el primer epítopo y el segundo epítopo son diferentes. El antígeno se puede seleccionar del grupo que consiste en CD19, CD20, CD22, CD33, C<d>38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 y glicolípido F77. En algunos ejemplos, el primer resto de unión es un sdAb y el segundo resto de unión deriva de un anticuerpo humano (p. ej., un scFv). En algunos ejemplos, el primer resto de unión es un sdAb y el segundo resto de unión es un ligando polipeptídico. El primer epítopo puede ser el mismo que el segundo epítopo. El primer epítopo puede ser diferente del segundo epítopo. El CAR multivalente puede unirse específicamente a dos epítopos diferentes en un antígeno. El CAR multivalente puede unirse específicamente a tres o más epítopos diferentes en un antígeno.

Un receptor de antígeno quimérico multivalente (tal como bivalente, trivalente o de mayor número de valencias) puede comprender un polipéptido que comprende: (a) un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende un primer sdAb que se une específicamente a un primer epítopo de un antígeno (tal como un antígeno tumoral), y un segundo sdAb que se une específicamente a un segundo epítopo del antígeno; (b) un dominio transmembrana; y (c) un dominio de señalización intracelular, en donde el primer epítopo y el segundo epítopo son diferentes. El antígeno se puede seleccionar del grupo que consiste en CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 y glicolípido F77.

Los sdAb (incluyendo la pluralidad de sdAb, o el primer sdAb y/o el segundo sdAb) pueden ser camélidos, quiméricos, humanos o humanizados. En algunas realizaciones, los sdAb se fusionan entre sí mediante enlaces peptídicos o conectores peptídicos. En algunas realizaciones, cada conector peptídico no tiene más de aproximadamente 50 (tal como no más de aproximadamente uno cualquiera de 35, 25, 20, 15, 10 o 5) aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana se selecciona del grupo que consiste en CD8a, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 y PD1. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular primario de una célula efectora inmunitaria (tal como una célula T). En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular primario deriva de CD3Z. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización coestimulador. En algunas realizaciones, el dominio de señalización coestimulador deriva de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandos de CD83 y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el CAR multivalente comprende además un dominio bisagra (tal como un dominio bisagra CD8a) ubicado entre el extremo C del dominio de unión al antígeno extracelular y el extremo N del dominio transmembrana. En algunas realizaciones, el CAR multivalente comprende además un péptido señal (tal como un péptido señal CD8a) ubicado en el extremo N del polipéptido. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende desde el extremo N al extremo C: un péptido señal CD8a, el dominio de unión al antígeno extracelular, un dominio bisagra CD8a, un dominio transmembrana CD8a, un dominio de señalización coestimulador derivado de CD137, y un dominio de señalización intracelular primario derivado de CD3Z En algunas realizaciones, el CAR multivalente es monoespecífico. En algunas realizaciones, el CAR multivalente es multiespecífico, tal como biespecífico.

Los CAR multivalentes descritos en la presente memoria pueden ser especialmente adecuados para dirigirse a antígenos multiméricos mediante unión sinérgica por los diferentes sitios de unión al antígeno, o para mejorar la afinidad de unión o avidez al antígeno. Cualquiera de los sdAb anti-BCMA descritos en la presente memoria se puede usar en el dominio de unión al antígeno extracelular de los CAR multivalentes descritos en la presente memoria. En la Tabla 5 se muestra una lista de BCMA CAR multivalentes ejemplares, secuencias ejemplares, constructos y vectores de los mismos.

Un BCMA dirigido a CAR multivalente puede comprender: (a) un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende una pluralidad (tal como al menos aproximadamente uno cualquiera de 2, 3, 4 o más) de un resto de unión a BCMA (p. ej., un sdAb anti-BCMA); (b) un dominio transmembrana; y (c) un dominio de señalización intracelular. Cualquiera de los sdAb anti-BCMA se puede usar para construir el BCMA CAR multivalente. El dominio de unión al antígeno extracelular puede unirse específicamente a un único epítopo de BCMA, y estos CAR se denominan en la presente memoria como BCMA CAR multivalentes monoepítopos.

Se describe como referencia un BCMA CAR multivalente que comprende: (a) un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende una pluralidad (tal como al menos aproximadamente uno cualquiera de 2, 3, 4 o más) de un sdAb anti-BCMA; (b) un dominio transmembrana; y (c) un dominio de señalización intracelular, en donde el sdAb anti-BCMA comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:77.

Se describe como referencia un BCMA CAR multivalente (también denominado en la presente memoria como "CAR multiepítopo multivalente") que comprende: (a) un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende al menos dos (tal como uno cualquiera de 2, 3, 4 o más) restos de unión a BCMA; (b) un dominio transmembrana; y (c) un dominio de señalización intracelular, en donde al menos dos restos de unión a BCMA se unen específicamente a al menos dos epítopos diferentes en BCMA. En algunos ejemplos, el dominio de unión a antígeno extracelular comprende un primer resto de unión a BCMA y un segundo resto de unión a BCMA. En algunos ejemplos, el primer resto de unión a BCMA es un sdAb anti-BCMA y el segundo resto de unión a BCMA deriva de un anticuerpo humano (p. ej., un scFv). En algunos ejemplos, el primer resto de unión a BCMA es un sdAb y el segundo resto de unión a BCMA es un ligando polipeptídico de BCMA. En algunos ejemplos, el primer resto de unión anti-BCMA y/o el segundo resto de unión a BCM<a>se une específicamente a un epítopo en BCMA derivado de una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 388-394. En algunos ejemplos, el primer resto de unión a BCMA se une específicamente a un epítopo derivado de SEQ ID NO: 389 y/o 390. En algunos ejemplos, el segundo resto de unión a BCMA se une específicamente a un epítopo derivado de Se Q ID NO: 391 y/o 392.

Un BCMA CAR multivalente puede comprender: (a) un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende un primer sdAb anti-BCMA y un segundo sdAb anti-BCMA; (b) un dominio transmembrana; y (c) un dominio de señalización intracelular, en donde el primer sdAb anti-BCMA y el segundo sdAb anti-BCMA se unen específicamente a diferentes epítopos en BCMA. En algunos ejemplos, el primer sdAb anti-BCMA y/o el segundo sdAb anti-BCMA se une específicamente a un epítopo en BCMA derivado de una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 388-394. En algunas realizaciones, el primer sdAb anti-BCMA comprendido en los CAR de la invención se une específicamente a un epítopo derivado de SEQ ID NO: 389 y/o 390. En algunas realizaciones, el segundo sdAb anti-BCMA comprendido en los CAR de la invención se une específicamente a un epítopo derivado de SEQ ID NO: 391 y/o 392.

La presente invención proporciona un BCMA CAR multivalente como se define en las reivindicaciones. El CAR puede comprender: (a) un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende un primer sdAb anti-BCMA y un segundo sdAb anti-BCMA; (b) un dominio transmembrana; y (c) un dominio de señalización intracelular, en donde el primer sdAb anti-BCMA comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:79; y en donde el segundo sdAb anti-BCMA comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:86. En algunas realizaciones, el primer sdAb anti-BCMA comprende un dominio V<h>H que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:117. En algunas realizaciones, el segundo sdAb anti-BCMA comprende un dominio V<h>H que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:124. En algunas realizaciones, el primer sdAb anti-BCMA comprende un dominio V<h>H que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:124. En algunas realizaciones, el segundo sdAb anti-BCMA comprende un dominio V<h>H que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:117.

En algunas realizaciones, el primer sdAb anti-BCMA está ubicado en el extremo N del segundo sdAb anti-BCMA. En algunas realizaciones, el primer sdAb anti-BCMA está ubicado en el extremo C del segundo sdAb anti-BCMA. En algunas realizaciones, el primer sdAb anti-BCMA y el segundo sdAb anti-BCMA se fusionan entre sí mediante un enlace peptídico o un conector peptídico. En algunas realizaciones, el conector peptídico no tiene más de aproximadamente 50 (tal como no más de aproximadamente uno cualquiera de 35, 25, 20, 15, 10 o 5) aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular primario de una célula efectora inmunitaria (tal como una célula T). En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular primario deriva de CD3Z. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización coestimulador. En algunas realizaciones, el dominio de señalización coestimulador deriva de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandos de CD83 y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el BCMA CAR multivalente comprende además un dominio bisagra (tal como un dominio bisagra CD8a) ubicado entre el extremo C del dominio de unión al antígeno extracelular y el extremo N del dominio transmembrana. En algunas realizaciones, el BCMA CAR multivalente comprende además un péptido señal (tal como un péptido señal CD8a) ubicado en el extremo N del polipéptido. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende desde el extremo N al extremo C: un péptido señal CD8a, el dominio de unión al antígeno extracelular, un dominio bisagra CD8a, un dominio transmembrana CD8a, un dominio de señalización coestimulador derivado de CD137, y un dominio de señalización intracelular primario derivado de CD3Z En algunas realizaciones, el BCMA CAR multivalente es bivalente. En algunas realizaciones, el BCMA CAR multivalente es trivalente. En algunas realizaciones, el BCMA CAR multivalente se une específicamente a dos epítopos diferentes en BCMA. En algunas realizaciones, el BCMA CAR multivalente se une específicamente a tres o más epítopos diferentes en BCMA.

En algunas realizaciones, se proporciona un BCMA CAR multivalente que comprende un polipéptido que tiene al menos aproximadamente uno cualquiera de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:300-305. En algunas realizaciones, se proporciona un BCMA CAR multivalente que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 300-305. También se proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:300-305.

En algunas realizaciones, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los BCMA CAR multivalentes de la invención. En algunas realizaciones, se proporciona un ácido nucleico aislado que tiene al menos aproximadamente cualquiera de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:338-343. En algunas realizaciones, se proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:338-343. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado es un ADN. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado es un ARN. En algunas realizaciones, se proporciona un vector que comprende cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican los BCMA CAR multivalentes de la invención. En algunas realizaciones, el vector es un vector de expresión. En algunas realizaciones, el vector es un vector viral, tal como un vector lentiviral. En algunas realizaciones, el vector es un vector no viral. En la Tabla 5 posterior se muestran ejemplos de BCMA CAR multivalentes. (*=BCMA CAR multivalentes de la invención. Otros CAR se describen como referencia).

Receptor de antígeno quimérico multiespecífico (La sección "Receptor de antígeno quimérico multiespecífico" se describe como referencia. Las realizaciones descritas en esta sección no son realizaciones de la invención).

También se describen receptores de antígenos quiméricos multiespecíficos que se dirigen a dos o más (tal como aproximadamente uno cualquiera de 2, 3, 4, 5, 6 o más) antígenos diferentes. En algunas realizaciones, el CAR multiespecífico tiene un sitio de unión a antígeno para cada antígeno. En algunas realizaciones, el CAR multiespecífico tiene más de dos sitios de unión para al menos un antígeno. Cada sitio de unión a antígeno puede comprender un sdAb. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el CAR multiespecífico es un CAR biespecífico que comprende un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende dos sdAb diferentes, cada uno de los cuales se une específicamente a un antígeno. En algunas realizaciones, el CAR multiespecífico es un CAR triespecífico que comprende un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende tres sdAb diferentes, cada uno de los cuales se une específicamente a un antígeno.

En algunas realizaciones, se proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) multiespecífico (tal como biespecífico) que comprende un polipéptido que comprende: (a) un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende un primer anticuerpo de dominio único (sdAb) que se une específicamente a BCMA y un segundo anticuerpo de dominio único (sdAb) que se une específicamente a un segundo antígeno (tal como un antígeno tumoral); (b) un dominio transmembrana; y (c) un dominio de señalización intracelular, en donde el primer antígeno es diferente del segundo antígeno. En algunas realizaciones, el segundo antígeno se selecciona del grupo que consiste en CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 y glicolípido F77. En algunas realizaciones, el primer sdAb y/o el segundo sdAb son camélido, quimérico, humano o humanizado. En algunas realizaciones, el primer sdAb y el segundo sdAb se fusionan entre sí mediante un enlace peptídico o un conector peptídico. En algunas realizaciones, el conector peptídico no tiene más de aproximadamente 50 (tal como no más de aproximadamente uno cualquiera de 35, 25, 20, 15, 10 o 5) aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana se selecciona del grupo que consiste en CD8a, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 y PD1. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular primario de una célula efectora inmunitaria (tal como una célula T). En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular primario deriva de CD3Z. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización coestimulador. En algunas realizaciones, el dominio de señalización coestimulador deriva de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandos de CD83 y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el CAR multiespecífico comprende además un dominio bisagra (tal como un dominio bisagra CD8a) ubicado entre el extremo C del dominio de unión al antígeno extracelular y el extremo N del dominio transmembrana. En algunas realizaciones, el CAR multiespecífico comprende además un péptido señal (tal como un péptido señal CD8a) ubicado en el extremo N del polipéptido. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende desde el extremo N al extremo C: un péptido señal CD8a, el dominio de unión al antígeno extracelular, un dominio bisagra CD8a, un dominio transmembrana CD8a, un dominio de señalización coestimulador derivado de CD137, y un dominio de señalización intracelular primario derivado de CD3Z. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende desde el extremo N al extremo C: un péptido señal CD8a, el dominio de unión al antígeno extracelular, un dominio bisagra CD8a, un dominio transmembrana CD28, un dominio de señalización coestimulador derivado de CD28, y un dominio de señalización intracelular primario derivado de CD3Z

Dominio de unión al antígeno extracelular

El dominio de unión a antígeno extracelular de los CAR de la invención comprende un primer y un segundo sdAb anti-BCMA como se define en las reivindicaciones. Los sdAb se pueden fusionar entre sí directamente mediante enlaces peptídicos o mediante conectores peptídicos.

1. Anticuerpos de dominio único

Según la invención, el CAR comprende un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende dos sdAb VHH. Los sdAb pueden ser de orígenes iguales o diferentes y de iguales o diferentes tamaños. Los sdAb ejemplares incluyen, pero no se limitan a, dominios variables de cadena pesada de anticuerpos de cadena pesada solamente (p. ej., V<h>H o V<nar>), moléculas de unión naturalmente desprovistas de cadenas ligeras, dominios únicos (tal como V<h>o V<l>) derivados de anticuerpos convencionales de 4 cadenas, anticuerpos humanizados de cadena pesada únicamente, sdAb humanos producidos por ratones o ratas transgénicos que expresan segmentos de cadena pesada humana, y dominios diseñados y estructuras de dominio único distintas de las derivadas de anticuerpos. Cualquier sdAb conocido en la técnica o desarrollado por los inventores, incluidos los sdAb descritos en la Sección II de la presente solicitud, puede usarse para construir los CAR descritos en la presente memoria. Los sdAb pueden derivar de cualquier especie, que incluyen, pero no se limitan a, ratón, rata, ser humano, camello, llama, lamprea, pez, tiburón, cabra, conejo y bovino. Los anticuerpos de dominio único contemplados en la presente memoria también incluyen moléculas sdAb que existen de forma natural de especies distintas deCamelidaey tiburones.

En algunas realizaciones, el sdAb se deriva de una molécula de unión a antígeno de dominio único que existe de forma natural conocida como anticuerpo de cadena pesada desprovisto de cadenas ligeras (también denominado en la presente memoria "anticuerpos de cadena pesada únicamente"). Dichas moléculas de dominio único se describen en la patente internacional w O 94/04678 y Hamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448, por ejemplo. Por razones de claridad, el dominio variable derivado de una molécula de cadena pesada naturalmente desprovista de cadena ligera se conoce en la presente memoria como una V<h>H para distinguirlo de la V<h>convencional de inmunoglobulinas de cuatro cadenas. Dicha molécula V<h>H puede derivar de anticuerpos generados en especiesCamelidae,por ejemplo, camello, llama, vicuña, dromedario, alpaca y guanaco. Otras especies además deCamelidaepueden producir moléculas de cadena pesada que naturalmente carecen de cadena ligera, y dichas V<h>H están dentro del alcance de la presente invención.

Las moléculas V<h>H de los camélidos son aproximadamente 10 veces más pequeñas que las moléculas de IgG. Son polipéptidos únicos y pueden ser muy estables, resistiendo condiciones extremas de pH y temperatura. Además, pueden ser resistentes a la acción de proteasas, lo que no es el caso para los anticuerpos convencionales de 4 cadenas. Además, la expresiónin vitrode V<h>H produce V<h>H funcionales correctamente plegadas y de alto rendimiento. Además, los anticuerpos generados en camélidos pueden reconocer epítopos distintos de los reconocidos por los anticuerpos generadosin vitromediante el uso de bibliotecas de anticuerpos o mediante la inmunización de mamíferos distintos de los camélidos (véase, por ejemplo, la patente internacional WO9749805). Como tal, los CAR multiespecíficos o multivalentes que comprenden uno o más dominios V<h>H pueden interactuar más eficientemente con objetivos que los CAR multiespecíficos o multivalentes que comprenden fragmentos de unión a antígeno derivados de anticuerpos convencionales de 4 cadenas. Desde que se sabe que los V<h>H se unen a epítopos "inusuales", como cavidades o surcos, la afinidad de los CAR que comprenden dichos V<h>H puede ser más adecuada para el tratamiento terapéutico que los polipéptidos multiespecíficos convencionales.

El sdAb puede derivar de una región variable de la inmunoglobulina que se encuentra en los peces cartilaginosos. Por ejemplo, el sdAb puede derivar del isotipo de inmunoglobulina conocido como nuevo receptor de antígeno (NAR) que se encuentra en el suero del tiburón. Los métodos para producir moléculas de dominio único derivadas de una región variable de NAR ("IgNAR") se describen en la patente internacional WO 03/014161 y Streltsov (2005) Protein Sci.

14:2901-2909.

En algunas realizaciones, el sdAb es recombinante, injertado con CDR, humanizado, camelizado, desinmunizado y/o generado invitro(p. ej., seleccionado por presentación de fagos). En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de las regiones marco puede alterarse mediante "camelización" de residuos de aminoácidos específicos en las regiones marco. La camelización se refiere al reemplazo o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un dominio V<h>(que existe de forma natural) de un anticuerpo convencional de 4 cadenas por uno o más de los residuos de aminoácidos que se dan en la(s) posición(ones) correspondiente(s) en un dominio V<h>H de un anticuerpo de cadena pesada. Esto se puede realizar de una manera conocida per se, que quedará clara para el experto, por ejemplo en base a la descripción adicional en la presente memoria. Dichas sustituciones "camelizantes" se insertan preferiblemente en posiciones de aminoácidos que forman y/o están presentes en la interfase V<h>-V<l>, y/o en los denominados residuos distintivos deCamelidae,como se define en la presente memoria (véase por ejemplo la patente internacional WO 94/04678, Davies y Riechmann FEBS Letters 339: 285-290, 1994; Davies y Riechmann Protein Engineering 9 (6): 531-537, 1996; Riechmann J. Mol. Biol. 259: 957-969, 1996; y Riechmann y Muyldermans J. Immunol. Meth. 231: 25-38, 1999).

En algunos ejemplos, el sdAb es un sdAb humano producido por ratones o ratas transgénicas que expresan segmentos de cadena pesada humana. Véase, p. ej., los documentos US20090307787A1, patente de E<e>.UU. núm. 8.754.287, US20150289489A1, US20100122358A1, y la patente internacional WO2004049794. En algunos ejemplos, el sdAb se madura por afinidad.

En algunos ejemplos, los dominios V<h>H que existen de forma natural contra un antígeno o diana particular se pueden obtener a partir de bibliotecas (vírgenes o inmunitarias) de secuencias V<h>H de camélidos. Dichos métodos pueden implicar o no el análisis de dicha biblioteca usando dicho antígeno o diana, o al menos una parte, fragmento, determinante antigénico o epítopo del mismo usando una o más técnicas de análisis conocidas per se. Dichas bibliotecas y técnicas se describen, por ejemplo, en las patentes internacionales WO 99/37681, WO 01/90190, WO 03/025020 y WO 03/035694. Alternativamente, pueden usarse bibliotecas sintéticas o semisintéticas mejoradas derivadas de bibliotecas de V<h>H (vírgenes o inmunitarios), tales como bibliotecas V<h>H obtenidas de bibliotecas V<h>H (vírgenes o inmunitarias) mediante técnicas tales como mutagénesis aleatoria y/o mezcla de CDR, como se describe por ejemplo en la patente internacional WO 00/43507.

En algunos ejemplos, los sdAb se generan a partir de anticuerpos convencionales de cuatro cadenas. Véase, por ejemplo, la patente europea EP 0368684, Ward et al. (Nature 12 de octubre de 1989; 341 (6242): 544-6), Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490; patentes internacionales WO 06/030220; y WO 06/003388.

2. Antígenos

El antígeno al que se dirigen los CAR de la presente invención es BCMA. Otros antígenos se describen como referencia. Los restos de unión (tales como sdAb) pueden elegirse para reconocer un antígeno que actúa como marcador de superficie celular en células diana asociadas con un estado patológico especial. En algunas realizaciones, el antígeno tumoral está asociado con una neoplasia maligna de células B. Los tumores expresan una serie de proteínas que pueden servir como antígeno diana para una respuesta inmunitaria, en particular respuestas inmunitarias mediadas por células T. Los antígenos a los que se dirige el CAR pueden ser antígenos de una sola célula enferma o antígenos que se expresan en diferentes células y cada una de las cuales contribuye a la enfermedad. Los antígenos a los que se dirige el CAR pueden estar implicados directa o indirectamente en las enfermedades.

Los antígenos tumorales son proteínas producidas por células tumorales que pueden provocar una respuesta inmunitaria, en particular respuestas inmunitarias mediadas por células T. La selección del antígeno fijado como objetivo dependerá del tipo particular de cáncer a tratar. Los antígenos tumorales ejemplares incluyen, por ejemplo, un antígeno asociado a glioma, antígeno carcinoembrionario (CEA), gonadotropina coriónica humana p, alfafetoproteína (AFP), AFP reactiva a lectina, tiroglobulina, RAGE-1, MN-CAIX, transcriptasa inversa de telomerasa humana, RU1, RU2 (AS), carboxilesterasa intestinal, mut hsp70-2, M-CSF, prostasa, antígeno prostático específico (PSA), PAP, NY-E<s>O-1, LAGE-la, p53, prosteina, PSMA, HER2/neu, survivina y telomerasa, antígeno tumoral 1 del carcinoma de próstata (PCTA-1), MAGE, ELF2M, elastasa de neutrófilos, efrinaB2, CD22, factor de crecimiento insulínico (IGF)-I, IGF-II, receptor de IGF-I y mesotelina.

El antígeno tumoral puede comprender uno o más epítopos antigénicos de cáncer asociados con un tumor maligno. Los tumores malignos expresan una serie de proteínas que pueden servir como antígenos diana para un ataque inmunológico. Estas moléculas incluyen, pero no se limitan a, antígenos específicos de tejido como MART-1, tirosinasa y gp100 en melanoma y fosfatasa ácida prostática (PAP) y antígeno prostático específico (PSA) en cáncer de próstata. Otras moléculas diana pertenecen al grupo de moléculas relacionadas con la transformación, como el oncogén HER2/Neu/ErbB-2. Otro grupo más de antígenos diana son los antígenos oncofetales tales como el antígeno carcinoembrionario (CEA). En el linfoma de células B, la inmunoglobulina idiotipo específica del tumor constituye un antígeno de inmunoglobulina verdaderamente específico del tumor que es exclusivo de cada tumor individual. Los antígenos de diferenciación de células B, como CD19, CD20 y CD37, son otros candidatos para antígenos diana en el linfoma de células B.

El antígeno tumoral puede ser un antígeno específico de tumor (TSA) o un antígeno asociado a tumor (TAA). Una TSA es exclusiva de las células tumorales y no ocurre en otras células del cuerpo. Un antígeno asociado a TAA no es exclusivo de una célula tumoral y, en cambio, también se expresa en una célula normal en condiciones que no logran inducir un estado de tolerancia inmunológica al antígeno. La expresión del antígeno en el tumor puede ocurrir en condiciones que permitan que el sistema inmunológico responda al antígeno. Los TAA pueden ser antígenos que se expresan en células normales durante el desarrollo fetal, cuando el sistema inmunológico está inmaduro y no puede responder, o pueden ser antígenos que normalmente están presentes en niveles extremadamente bajos en células normales, pero que se expresan en niveles mucho más altos en las células tumorales.

Ejemplos no limitantes de antígenos TSA o TAA incluyen los siguientes: Antígenos de diferenciación tales como MART-1/MelanA (MART-I), gp 100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2 y antígenos multilinaje específicos de tumores. tales como MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pl5; antígenos embrionarios sobreexpresados tales como CEA; oncogenes sobreexpresados y genes supresores de tumores mutados tales como p53, Ras, HER2/neu; antígenos tumorales únicos resultantes de translocaciones cromosómicas; tales como BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; y antígenos virales, tales como los antígenos del virus de Epstein Barr EBVA y los antígenos del virus del papiloma humano (VPH) E6 y E7. Otros antígenos grandes basados en proteínas incluyen TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, nm-23HI, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-Catenina, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, alfa-fetoproteína, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27.29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS 1, SDCCAG16, TA-90\Proteína de unión Mac-2\proteína asociada a ciclofilina C, TAAL6, TAG72, TLP y TPS.

En algunos ejemplos, el antígeno (tal como el primer antígeno y/o el segundo antígeno) se selecciona del grupo que consiste en CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvlII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 y glicolípido F77.

3. Conectores peptídicos

Los diversos restos de unión (tales como sdAb) en los CAR multiespecíficos o multivalentes descritos en la presente memoria pueden fusionarse entre sí mediante conectores peptídicos. En algunas realizaciones, los restos de unión (tales como sdAb) se fusionan directamente entre sí sin ningún conector peptídico. Los conectores peptídicos que conectan diferentes restos de unión (como los sdAb) pueden ser iguales o diferentes. También se pueden fusionar diferentes dominios de los CAR entre sí mediante conectores peptídicos.

Cada conector peptídico en un CAR puede tener la misma o diferente longitud y/o secuencia dependiendo de las características estructurales y/o funcionales de los sdAb y/o los diversos dominios. Cada conector peptídico puede seleccionarse y optimizarse de forma independiente. La longitud, el grado de flexibilidad y/u otras propiedades del (de los) conector(es) peptídico(s) usado(s) en los CAR pueden tener alguna influencia en las propiedades, que incluyen, pero no se limitan a, la afinidad, especificidad o avidez por uno o más antígenos o epítopos particulares. Por ejemplo, pueden seleccionarse conectores peptídicos más largos para asegurar que dos dominios adyacentes no interfieran estéricamente entre sí. Por ejemplo, en un CAR multivalente o multiespecífico que comprende sdAb dirigidos contra un antígeno multimérico, la longitud y flexibilidad de los conectores peptídicos son preferiblemente tales que permite que cada sdAb en el CAR multivalente se una al determinante antigénico en cada una de las subunidades del multímero. En algunas realizaciones, se puede disponer un conector peptídico corto entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular de un CAR. En alguna realización, un conector peptídico comprende residuos flexibles (tales como glicina y serina) de modo que los dominios adyacentes puedan moverse libremente entre sí. Por ejemplo, un doblete de glicina-serina puede ser un conector peptídico adecuado.

El conector peptídico puede tener cualquier longitud adecuada. En algunas realizaciones, el conector peptídico tiene al menos aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 o más aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el conector peptídico no tiene más que aproximadamente cualquiera de 100, 75, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 o menos aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, la longitud del conector peptídico es cualquiera de aproximadamente 1 aminoácido a aproximadamente 10 aminoácidos, aproximadamente 1 aminoácido a aproximadamente 20 aminoácidos, aproximadamente 1 aminoácido a aproximadamente 30 aminoácidos, aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 15 aminoácidos, aproximadamente 10 aminoácidos a aproximadamente 25 aminoácidos, aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 30 aminoácidos, aproximadamente 10 aminoácidos a aproximadamente 30 aminoácidos de longitud, aproximadamente 30 aminoácidos a aproximadamente 50 aminoácidos, aproximadamente 50 aminoácidos a aproximadamente 100 aminoácidos, o aproximadamente 1 aminoácido a aproximadamente 100 aminoácidos.

El conector peptídico puede tener una secuencia que existe de forma natural o una secuencia que no existe de forma natural. Por ejemplo, se puede usar como conector una secuencia derivada de la región bisagra de anticuerpos de cadena pesada únicamente. Véase, por ejemplo, la patente internacional WO1996/34103. En algunas realizaciones, el conector peptídico es un conector flexible. Los conectores flexibles ejemplares incluyen polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-serina (que incluyen, por ejemplo, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGS)n, y (GGGGS)n, donde n es un número entero de al menos uno), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina y otros conectores flexibles conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, el conector peptídico comprende la secuencia de aminoácidos GGGGS (SEQ ID NO: 208), (GGGGS)2 (SEQ ID NO: 209), (GGGS)<4>(SEQ ID NO: 210), GGGGSGGGGSGGGGGGSGSGGGGS (SEQ ID NO: 211), GGGGSGGGGSGGGGGGSGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 212), (GGGGS)a (SEQ ID NO: 213), (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 214), o (GGGGS)a (SEQ ID NO: 215).

Dominio transmembrana

Los CAR de la presente invención comprenden un dominio transmembrana que puede fusionarse directa o indirectamente al dominio de unión al antígeno extracelular. El dominio transmembrana puede derivarse de una fuente natural o sintética. Como se usa en la presente memoria, un "dominio transmembrana" se refiere a cualquier estructura proteica que sea termodinámicamente estable en una membrana celular, preferiblemente una membrana de una célula eucariota. Los dominios transmembrana compatibles para su uso en los CAR descritos en la presente memoria pueden obtenerse a partir de una proteína que existe de forma natural. Alternativamente, puede ser un segmento proteico sintético, que no existe de forma natural, por ejemplo, un segmento proteico hidrófobo que es termodinámicamente estable en una membrana celular.

Los dominios transmembrana se clasifican según la estructura tridimensional del dominio transmembrana. Por ejemplo, los dominios transmembrana pueden formar una hélice alfa, un complejo de más de una hélice alfa, un barril beta o cualquier otra estructura estable capaz de abarcar la bicapa de fosfolípidos de una célula. Además, los dominios transmembrana pueden clasificarse, también o alternativamente, en base a la topología del dominio transmembrana, que incluye el número de pases que realiza el dominio transmembrana a través de la membrana y la orientación de la proteína. Por ejemplo, las proteínas de membrana de pase único cruzan la membrana celular una vez, y las proteínas de membrana de pases múltiples cruzan la membrana celular al menos dos veces(p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más veces). Las proteínas de membrana se pueden definir como Tipo I, Tipo II o Tipo III dependiendo de la topología de sus extremos y segmento(s) que pasan por la membrana en relación con el interior y el exterior de la célula. Las proteínas de membrana de tipo I tienen una única región que atraviesa la membrana y están orientadas de manera que el extremo N de la proteína está presente en el lado extracelular de la bicapa lipídica de la célula y el extremo C de la proteína está presente en el lado citoplasmático. Las proteínas de membrana de tipo II también tienen una única región que atraviesa la membrana, pero están orientadas de manera que el extremo C de la proteína está presente en el lado extracelular de la bicapa lipídica de la célula y el extremo N de la proteína está presente en el lado citoplasmático. Las proteínas de membrana de tipo III tienen múltiples segmentos que atraviesan la membrana y pueden subclasificarse adicionalmente en base al número de segmentos transmembrana y la ubicación de los extremos N y C.

En algunas realizaciones, el dominio transmembrana del CAR descrito en la presente memoria deriva de una proteína de membrana de pase único de Tipo I. En algunas realizaciones, los dominios transmembrana de proteínas de membrana de múltiples pases también pueden ser compatibles para su uso en los CAR descritos en la presente memoria. Las proteínas de membrana de múltiples pases pueden comprender un complejo (al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más) hélices alfa o una estructura de lámina beta. Preferiblemente, el extremo N y el extremo C de una proteína de membrana de múltiples pases están presentes en lados opuestos de la bicapa lipídica, p. ej., el extremo N de la proteína está presente en el lado citoplasmático de la bicapa lipídica y el extremo C de la proteína está presente en el lado extracelular.

En algunas realizaciones, el dominio transmembrana del CAR comprende un dominio transmembrana elegido entre el dominio transmembrana de una cadena alfa, beta o zeta de un receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD1 1a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1 1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD1 1a, LFA-1, ITGAM, CD1 1b, ITGAX, CD1 1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (táctil), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CDIOO (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D y/o NKG2C. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana deriva de una molécula seleccionada del grupo que consiste en CD8a, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 y PD1.

En algunas realizaciones, el dominio transmembrana deriva de CD28. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD28 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 194. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana de CD28 está codificado por la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 203.

En algunas realizaciones, el dominio transmembrana deriva de CD8a. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD8a que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 193. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana de CD8a está codificado por la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 202.

Los dominios transmembrana para uso en los CAR descritos en la presente memoria también pueden comprender al menos una porción de un segmento proteico sintético, que no existe de forma natural. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana es una hélice alfa o una lámina beta sintética, que no existe de forma natural. En algunas realizaciones, el segmento proteico tiene al menos aproximadamente 20 aminoácidos, p. ej., al menos 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más aminoácidos. Se conocen en la técnica ejemplos de dominios transmembrana sintéticos, por ejemplo en la patente de EE.UU. núm. 7.052.906 B1 y la publicación Pc T núm. WO 2000/032776 A2.

El dominio transmembrana puede comprender una región transmembrana y una región citoplasmática ubicada en el lado C-terminal del dominio transmembrana. La región citoplasmática del dominio transmembrana puede comprender tres o más aminoácidos y, en algunas realizaciones, ayuda a orientar el dominio transmembrana en la bicapa lipídica. En algunas realizaciones, uno o más residuos de cisteína están presentes en la región transmembrana del dominio transmembrana. En algunas realizaciones, uno o más residuos de cisteína están presentes en la región citoplasmática del dominio transmembrana. En algunas realizaciones, la región citoplasmática del dominio transmembrana comprende aminoácidos cargados positivamente. En algunas realizaciones, la región citoplasmática del dominio transmembrana comprende los aminoácidos arginina, serina y lisina.

En algunas realizaciones, la región transmembrana del dominio transmembrana comprende residuos de aminoácidos hidrófobos. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana del CAR comprende una secuencia hidrófoba artificial. Por ejemplo, puede estar presente un triplete de fenilalanina, triptófano y valina en el extremo C del dominio transmembrana. En algunas realizaciones, la región transmembrana comprende principalmente residuos de aminoácidos hidrófobos, tales como alanina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptófano o valina. En algunas realizaciones, la región transmembrana es hidrófoba. En algunas realizaciones, la región transmembrana comprende una secuencia de polileucina-alanina. La hidropatía, o las características hidrófobas o hidrófilas de una proteína o segmento de proteína, pueden evaluarse mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo el análisis de hidropatía de Kyte y Doolittle.

Dominio de señalización intracelular

Los CAR de la presente invención comprenden un dominio de señalización intracelular. El dominio de señalización intracelular es responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula efectora inmunitaria que expresa los CAR. El término "función efectora" se refiere a una función especializada de una célula. La función efectora de una célula T, por ejemplo, puede ser una actividad citolítica o una actividad auxiliar que incluye la secreción de citoquinas. Por tanto, el término "dominio de señalización citoplasmático" se refiere a la porción de una proteína que transduce la señal de la función efectora y dirige a la célula para que realice una función especializada. Aunque normalmente se puede emplear todo el dominio de señalización citoplásmico, en muchos casos no es necesario usar la cadena completa. En la medida en que se use una porción truncada del dominio de señalización citoplasmático, dicha porción truncada puede usarse en lugar de la cadena intacta siempre que transduzca la señal de la función efectora. Por lo tanto, se pretende que el término dominio de señalización citoplásmico incluya cualquier porción truncada del dominio de señalización citoplasmático suficiente para transducir la señal de la función efectora.

En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular primario de una célula efectora inmunitaria. En algunas realizaciones, el CAR comprende un dominio de señalización intracelular que consiste esencialmente en un dominio de señalización intracelular primario de una célula efectora inmunitaria. "Dominio de señalización intracelular primario" se refiere a una secuencia de señalización citoplasmática que actúa de manera estimuladora para inducir funciones efectoras inmunitarias. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular primario contiene un motivo de señalización conocido como motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor, o ITAM. Un "ITAM", como se usa en la presente memoria, es un motivo proteico conservado que generalmente está presente en la porción de la cola de las moléculas de señalización expresadas en muchas células inmunitarias. El motivo puede comprender dos repeticiones de la secuencia de aminoácidos YxxL/I separadas por 6-8 aminoácidos, en donde cada x es independientemente cualquier aminoácido, produciendo el motivo conservado YxxL/Ix(6-8)YxxL/I. Los ITAM dentro de las moléculas de señalización son importantes para la transducción de señales dentro de la célula, que está mediada al menos en parte por la fosforilación de residuos de tirosina en el ITAM después de la activación de la molécula de señalización. Los ITAM también pueden funcionar como sitios de acoplamiento para otras proteínas involucradas en las vías de señalización. Las secuencias de señalización citoplasmática primaria que contienen ITAM ejemplares incluyen aquellas derivadas de CD3Z, FcR gamma (FCER1G), FcR beta (Fc épsilon Rib), CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, Cd 5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d.

En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular primario deriva de CD3Z. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular consiste en el dominio de señalización citoplásmico de CD3Z En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular primario es un dominio de señalización citoplásmico de CD3Z de tipo salvaje. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular primario de CD3Z de tipo salvaje comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 197. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular primario es un mutante funcional del dominio de señalización citoplasmático de CD3Z que contiene una o más mutaciones, tal como Q65K. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular primario de CD3Z mutante comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 198. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular primario está codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 206 o 207.

Dominio de señalización coestimuladora

Muchas células efectoras inmunitarias requieren coestimulación, además de la estimulación de una señal específica de antígeno, para promover la proliferación, diferenciación y supervivencia celular, así como para activar funciones efectoras de la célula. En algunas realizaciones, el CAR comprende al menos un dominio de señalización coestimulador. El término "dominio de señalización coestimulador", como se usa en la presente memoria, se refiere a al menos una porción de una proteína que media la transducción de señales dentro de una célula para inducir una respuesta inmune tal como una función efectora. El dominio de señalización coestimulador del receptor quimérico descrito en la presente memoria puede ser un dominio de señalización citoplasmático de una proteína coestimuladora, que transduce una señal y modula las respuestas mediadas por células inmunitarias, tales como células T, células N<k>, macrófagos, neutrófilos o eosinófilos. El "dominio de señalización coestimulador" puede ser la porción citoplasmática de una molécula coestimuladora. El término "molécula coestimuladora" se refiere a una pareja de unión afín en una célula inmunitaria (tal como una célula T) que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando de este modo una respuesta coestimuladora por parte de la célula inmunitaria, tal como, pero no limitado a la proliferación y la supervivencia.

En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un único dominio de señalización coestimulador. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende dos o más (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 3, 4 o más) dominios de señalización coestimuladores. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende dos o más de los mismos dominios de señalización coestimuladora, por ejemplo, dos copias del dominio de señalización coestimulador de CD28. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende dos o más dominios de señalización coestimuladores de diferentes proteínas coestimuladoras, tales como dos o más proteínas coestimuladoras cualesquiera descritas en la presente memoria. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular primario (tal como el dominio de señalización citoplasmático de CD3Z) y uno o más dominios de señalización coestimuladores. En algunas realizaciones, el uno o más dominios de señalización coestimuladores y el dominio de señalización intracelular primario (tal como el dominio de señalización citoplasmático de CD3Z) se fusionan entre sí mediante conectores peptídicos opcionales. El dominio de señalización intracelular primario y el uno o más dominios de señalización coestimuladores pueden disponerse en cualquier orden adecuado. En algunas realizaciones, el uno o más dominios de señalización coestimuladores están ubicados entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular primario (tal como el dominio de señalización citoplasmático de CD3Z). Múltiples dominios de señalización coestimuladores pueden proporcionar efectos estimulantes aditivos o sinérgicos.

La activación de un dominio de señalización coestimulador en una célula huésped (p. ej., una célula inmune) puede inducir a la célula a aumentar o disminuir la producción y secreción de citoquinas, propiedades fagocíticas, proliferación, diferenciación, supervivencia y/o citotoxicidad. El dominio de señalización coestimulador de cualquier molécula coestimuladora puede ser compatible para su uso en los CAR descritos en la presente memoria. El (los) tipo(s) de dominio de señalización coestimulador se seleccionan en base a factores tales como el tipo de células efectoras inmunes en las que se expresarían las moléculas efectoras (p. ej., células T, células NK, macrófagos, neutrófilos o eosinófilos) y la función efectora inmunitaria deseada (p. ej., efecto ADCC). Ejemplos de dominios de señalización coestimuladores para uso en los CAR pueden ser el dominio de señalización citoplasmático de proteínas coestimuladoras, incluidos, sin limitación, miembros de la familia B7/CD28 (p. ej., B7-1/CD80, B7-2/CD86, B7-H1/PD-L1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, B7-H7, BTLA/CD272, CD28, CTLA-4, Gi24/VISTA/B7-H5, ICOS/CD278, PD-1, PD-L2/B7-DC y PDCD6); miembros de la superfamilia TNF (p. ej., 4-1BB/TNFSF9/CD137, Ligando 4-1BB/TNFSF9, BAFF/BLyS/TNFSF13B, BAFF R/TNFRSF13C, CD27/TNFRSF7, Ligando CD27/TNFSF7, CD30/TNFRSF8, Ligando CD30/TNFSF8, CD40/TNFRSF5, CD40/TNFSF5, Ligando CD40/TNFSF5, DR3/TNFRSF25, GITR/TNFRSF18, Ligando GITR/TNFSF18, HVEM/TNFRSF14, LIGHT/TNFSF14, Linfotoxina-alfa/TNF-beta, OX40/TNFRSF4, ligando OX40/TNFSF4, RELT/TNFRSF19L, TACI/TNFRSF13B, TL1A/TNFSF15, TNF-alfa y TNF RII/TNFRSF1B); miembros de la familia SLAM (p. ej., 2B4/CD244/SLAMF4, BLAME/SLAMF8, CD2, CD2F-10/SLAMF9, CD48/SLAMF2, CD58/LFA-3, CD84/SLAMF5, CD229/SLAMF3, CRACC/SLAMF7, NTB-A/SLAMF6 y SLAM/CD150); y cualquier otra molécula coestimuladora, tal como CD2, CD7, CD53, CD82/Kai-1, CD90/Thy1, CD96, CD160, CD200, CD300a/LMIR1, HLA Clase I, HLA-DR, Ikaros, Integrin alfa 4/ CD49d, integrina alfa 4 beta 1, integrina alfa 4 beta 7/LPAM-1, LAG-3, TCL1A, TCL1B, CRTAM, DAP12, Dectina-1/CLEC7A, DPPIV/CD26, EphB6, TIM-1/KIM-1/ HAVCR, TIM-4, TSLP, TSLP R, antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1) y NKG2C.

En algunas realizaciones, el uno o más dominios de señalización coestimuladores se seleccionan del grupo que consiste en CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, CD3, antígeno 1 asociado a la función de linfocitos (LfA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 y ligandos que se unen especialmente a CD83.

En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular en el CAR de la presente invención comprende un dominio de señalización coestimulador derivado de CD28. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización citoplasmático de CD3Z y un dominio de señalización coestimulador de CD28. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización coestimulador de CD28 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195. En algunas realizaciones, el dominio de señalización coestimulador de CD28 está codificado por la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 204.

En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular en el CAR de la presente invención comprende un dominio de señalización coestimulador derivado de CD137 (es decir, 4-1BB). En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización citoplasmático de CD3Z y un dominio de señalización coestimulador de CD137. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización coestimulador de CD137 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 196. En algunas realizaciones, el dominio de señalización coestimulador de CD137 está codificado por la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 205.

En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular en el CAR de la presente invención comprende un dominio de señalización coestimulador de CD28 y un dominio de señalización coestimulador de CD137. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización citoplasmático de CD3Z, un dominio de señalización coestimulador de CD28 y un dominio de señalización coestimulador de CD137. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un polipéptido que comprende desde el extremo N al extremo C: un dominio de señalización coestimulador de CD28, un dominio de señalización coestimulador de CD137 y un dominio de señalización citoplasmático de CD3Z. En algunas realizaciones, el dominio de señalización coestimulador de CD28 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195. En algunas realizaciones, el dominio de señalización coestimulador de CD137 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 196.

También están dentro del alcance de la presente descripción o variantes de cualquiera de los dominios de señalización coestimuladores descritos en la presente memoria, de modo que el dominio de señalización coestimulador sea capaz de modular la respuesta inmunitaria de la célula inmunitaria. En algunas realizaciones, los dominios de señalización coestimuladores comprenden hasta 10 variaciones de residuos de aminoácidos (p. ej., 1,2, 3, 4, 5 u 8) en comparación con un homólogo de tipo salvaje. Dichos dominios de señalización coestimuladores que comprenden una o más variaciones de aminoácidos pueden denominarse como variantes. La mutación de los residuos de aminoácidos del dominio de señalización coestimulador puede dar como resultado un aumento en la transducción de señales y una mayor estimulación de las respuestas inmunitarias en relación con los dominios de señalización coestimuladores que no comprenden la mutación. La mutación de los residuos de aminoácidos del dominio de señalización coestimulador puede dar como resultado una disminución en la transducción de señales y una estimulación reducida de las respuestas inmunitarias en relación con los dominios de señalización coestimuladores que no comprenden la mutación.

Región bisagra

Los CAR de la presente invención pueden comprender un dominio bisagra que está ubicado entre el dominio de unión al antígeno extracelular y el dominio transmembrana. Un dominio bisagra es un segmento de aminoácido que generalmente se encuentra entre dos dominios de una proteína y puede permitir la flexibilidad de la proteína y el movimiento de uno o ambos dominios entre sí. Puede usarse cualquier secuencia de aminoácidos que proporcione dicha flexibilidad y movimiento del dominio de unión al antígeno extracelular con respecto al dominio transmembrana de la molécula efectora.

El dominio bisagra puede contener aproximadamente 10-100 aminoácidos, p. ej., aproximadamente cualquiera de 15 a 75 aminoácidos, 20 a 50 aminoácidos o 30 a 60 aminoácidos. En algunas realizaciones, el dominio bisagra puede ser al menos aproximadamente uno cualquiera de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 o 75 aminoácidos de longitud.

En algunas realizaciones, el dominio bisagra es un dominio bisagra de una proteína que existe de forma natural. Los dominios bisagra de cualquier proteína conocida en la técnica que comprende un dominio bisagra son compatibles para su uso en los receptores quiméricos descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, el dominio bisagra es al menos una porción de un dominio bisagra de una proteína que existe de forma natural y confiere flexibilidad al receptor quimérico. En algunas realizaciones, el dominio bisagra deriva de CD8a. En algunas realizaciones, el dominio bisagra es una porción del dominio bisagra de CD8a, p. ej., un fragmento que contiene al menos 15 (p. ej., 20, 25, 30, 35 o 40) aminoácidos consecutivos del dominio bisagra de CD8a. En algunas realizaciones, el dominio bisagra de CD8a comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 192. En algunas realizaciones, el dominio bisagra de CD8a está codificado por la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 201.

Los dominios bisagra de anticuerpos, tales como anticuerpos IgG, IgA, IgM, IgE o IgD, también son compatibles para su uso en los sistemas receptores quiméricos dependientes de pH descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, el dominio bisagra es el dominio bisagra que une los dominios constantes CH1 y CH2 de un anticuerpo. En algunas realizaciones, el dominio bisagra es de un anticuerpo y comprende el dominio bisagra del anticuerpo y una o más regiones constantes del anticuerpo. En algunas realizaciones, el dominio bisagra comprende el dominio bisagra de un anticuerpo y la región constante CH3 del anticuerpo. En algunas realizaciones, el dominio bisagra comprende el dominio bisagra de un anticuerpo y las regiones constantes CH2 y CH3 del anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgG, IgA, IgM, IgE o IgD. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En algunas realizaciones, la región bisagra comprende la región bisagra y las regiones constantes CH2 y CH3 de un anticuerpo IgG1. En algunas realizaciones, la región bisagra comprende la región bisagra y la región constante CH3 de un anticuerpo IgG1.

También se pueden usar péptidos que no existen de forma natural como dominios bisagra para los receptores quiméricos descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, el dominio bisagra entre el extremo C del dominio de unión al ligando extracelular de un receptor Fc y el extremo N del dominio transmembrana es un conector peptídico, tal como un conector (GxS)n, en donde x y n, independientemente pueden ser un número entero entre 3 y 12, incluidos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más.

Péptido señal

Los CAR de la presente invención pueden comprender un péptido señal (también conocido como secuencia señal) en el extremo N del polipéptido. En general, los péptidos señal son secuencias peptídicas que dirigen un polipéptido al sitio deseado en una célula. En algunas realizaciones, el péptido señal dirige la molécula efectora a la vía secretora de la célula y permitirá la integración y el anclaje de la molécula efectora en la bicapa lipídica. Los péptidos señal que incluyen secuencias señal de proteínas que existen de forma natural o secuencias señal sintéticas, que no existen de forma natural, que son compatibles para su uso en los CAR descritos en la presente memoria, serán evidentes para un experto en la técnica. En algunas realizaciones, el péptido señal deriva de una molécula seleccionada del grupo que consiste en CD8a, receptor a de GM-CSF y cadena pesada de IgG1. En algunas realizaciones, el péptido señal deriva de CD8a. En algunas realizaciones, el péptido señal de CD8a comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 191. En algunas realizaciones, el péptido señal de CD8a está codificado por la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 199 o 200.

IV. Células efectoras inmunitarias diseñadas

Se proporcionan adicionalmente células efectoras inmunitarias que comprenden cualquiera de los CAR de la invención.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula efectora inmunitaria diseñada (tal como una célula T) que comprende un CAR multivalente como se define en las reivindicaciones. El primer sdAb anti-BCMA y/o el segundo sdAb anti-BCMA pueden ser camélidos, quiméricos, humanos o humanizados. En algunas realizaciones, el primer anti-BCMA y el segundo anti-BCMA se fusionan entre sí mediante un enlace peptídico o un conector peptídico. En algunas realizaciones, el conector peptídico no tiene más de aproximadamente 50 (tal como no más de aproximadamente uno cualquiera de 35, 25, 20, 15, 10 o 5) aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana se selecciona del grupo que consiste en CD8a, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 y PD1. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular primario de una célula efectora inmunitaria (tal como una célula T). En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular primario deriva de CD3Z. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización coestimulador. En algunas realizaciones, el dominio de señalización coestimulador deriva de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandos de CD83 y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el CAR multivalente comprende además un dominio bisagra (tal como un dominio bisagra CD8a) ubicado entre el extremo C del dominio de unión al antígeno extracelular y el extremo N del dominio transmembrana. En algunas realizaciones, el CAR multivalente comprende además un péptido señal (tal como un péptido señal CD8a) ubicado en el extremo N del polipéptido. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende desde el extremo N al extremo C: un péptido señal CD8a, el dominio de unión al antígeno extracelular, un dominio bisagra CD8a, un dominio transmembrana CD8a, un dominio de señalización coestimulador derivado de CD137, y un dominio de señalización intracelular primario derivado de CD3Z En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria diseñada es una célula T, una célula NK, una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC), una célula madre hematopoyética, una célula madre pluripotente o una célula madre embrionaria. En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria diseñada es autóloga. En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria diseñada es alogénica.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula efectora inmunitaria diseñada (tal como célula T) que comprende un BCMA CAR de la invención que comprende un polipéptido que comprende: (a) un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende dos sdAb anti-BCMA; (b) un dominio transmembrana; y (c) un dominio de señalización intracelular, en donde el primer sdAb anti-BCMA puede comprender una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:79; y el segundo sdAb anti-BCMA puede comprender una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:86. En algunas realizaciones, el dominio de unión al antígeno extracelular comprende al menos dos sdAb anti-BCMA. En algunas realizaciones, el sdAb anti-BCMA es camélido, quimérico, humano o humanizado. En algunas realizaciones, el sdAb anti-BCMA comprende un dominio V<h>H que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 117 y 124. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular primario de una célula efectora inmunitaria (tal como una célula T). En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular primario deriva de CD3Z. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización coestimulador. En algunas realizaciones, el dominio de señalización coestimulador deriva de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandos de CD83 y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el BCMA CAR comprende además un dominio bisagra (tal como un dominio bisagra CD8a) ubicado entre el extremo C del dominio de unión al antígeno extracelular y el extremo N del dominio transmembrana. En algunas realizaciones, el BCMA CAR comprende además un péptido señal (tal como un péptido señal CD8a) ubicado en el extremo N del polipéptido. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende desde el extremo N al extremo C: un péptido señal CD8a, el dominio de unión al antígeno extracelular, un dominio bisagra CD8a, un dominio transmembrana CD28, un primer dominio de señalización coestimulador derivado de CD28, un segundo dominio de señalización coestimulador derivado de CD137 y un dominio de señalización intracelular primario derivado de CD3Z. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende desde el extremo N al extremo C: un péptido señal CD8a, el dominio de unión al antígeno extracelular, un dominio bisagra CD8a, un dominio transmembrana CD8a, un dominio de señalización coestimulador derivado de CD137, y un dominio de señalización intracelular primario derivado de CD3Z En algunas realizaciones, el BCMA CAR comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 300-305. En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria diseñada es una célula T, una célula NK, una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC), una célula madre hematopoyética, una célula madre pluripotente o una célula madre embrionaria. En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria diseñada es autóloga. En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria diseñada es alogénica.

También se proporcionan células efectoras inmunitarias diseñadas que comprenden (o expresan) dos o más CAR diferentes. Dos o más de los CAR cualquiera descritos en la presente memoria pueden expresarse en combinación. Los CAR pueden apuntar a diferentes antígenos, proporcionando así efectos sinérgicos o aditivos. Como los anticuerpos de dominio único en los dominios de unión al antígeno extracelular de los CAR tienen solo cadenas variables de antígeno único (tal como cadenas pesadas), dichas células que expresan CAR no tienen problemas de desapareamiento de cadenas variables, como se observa en las células efectoras inmunitarias diseñadas que coexpresan dos o más CAR basados en scFv. Se ilustran células efectoras inmunitarias diseñadas ejemplares en la FIG. 15E. Un experto en la técnica reconocería que los CAR basados en otros sdAb o que tienen otras estructuras como se describe en la presente memoria pueden coexpresarse en las células efectoras inmunitarias diseñadas. Los dos o más CAR pueden estar codificados en el mismo vector o en vectores diferentes.

La célula efectora inmunitaria diseñada puede expresar además una o más proteínas terapéuticas y/o inmunomoduladores, tales como inhibidores de puntos de control inmunitarios. Véanse, por ejemplo, las solicitudes de patente internacional núms. PCT/CN2016/073489 y PCT/CN2016/087855.

Vectores

La presente invención proporciona vectores para clonar y expresar cualquiera de los CAR de la invención. En algunas realizaciones, el vector es adecuado para la replicación e integración en células eucariotas, tales como células de mamíferos. En algunas realizaciones, el vector es un vector viral. Los ejemplos de vectores virales incluyen, pero no se limitan a, vectores adenovirales, vectores de virus adenoasociados, vectores lentivirales, vectores retrovirales, vector de vaccinia, vector viral del herpes simple y derivados de los mismos. La tecnología de vectores virales es bien conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York), y en otros manuales de virología y biología molecular.

Se han desarrollado varios sistemas virales para la transferencia de genes a células de mamíferos. Por ejemplo, los retrovirus proporcionan una plataforma conveniente para los sistemas de administración de genes. El ácido nucleico heterólogo puede insertarse en un vector y empaquetarse en partículas retrovirales usando técnicas conocidas en la técnica. Luego, el virus recombinante se puede aislar y administrar a la célula de mamífero diseñadain vitro oex vivo. En la técnica se conocen varios sistemas retrovirales. En algunas realizaciones, se usan vectores de adenovirus. En la técnica se conocen varios vectores de adenovirus. En algunas realizaciones, se usan vectores de lentivirus. En algunas realizaciones, se usan vectores lentivirales autoinactivantes. Por ejemplo, los vectores lentivirales autoinactivantes que portan la secuencia codificante del inmunomodulador (tal como un inhibidor del punto de control inmunitario) y/o los vectores lentivirales autoinactivantes que portan los CAR se pueden empaquetar con protocolos conocidos en la técnica. Los vectores lentivirales resultantes se pueden usar para transducir una célula de mamífero (tal como células T humanas primarias) usando métodos conocidos en la técnica. Los vectores derivados de retrovirus como los lentivirus son herramientas adecuadas para lograr la transferencia de genes a largo plazo, porque permiten la integración estable a largo plazo de un transgén y su propagación en células de progenie. Los vectores lentivirales también tienen baja inmunogenicidad y pueden transducir células no proliferativas.

En algunas realizaciones, el vector es un vector no viral. En algunas realizaciones, el vector es un transposón, tal como un sistema de transposones de La Bella Durmiente (SB) o un sistema de transposones PiggyBac. En algunas realizaciones, el vector es un vector no viral basado en polímero, que incluye, por ejemplo, poli(ácido láctico-coglicólico) (PLGA) y ácido poliláctico (PLA), poli(etilenimina) (PEI) y dendrímeros. En algunas realizaciones, el vector es un vector no viral basado en lípidos catiónicos, tal como liposoma catiónico, nanoemulsión lipídica y nanopartícula lipídica sólida (SLN). En algunas realizaciones, el vector es un vector no viral de un gen basado en péptidos, tal como poli-L-lisina. Cualquiera de los vectores no virales conocidos adecuados para la edición del genoma se puede usar para introducir los ácidos nucleicos que codifican CAR en las células efectoras inmunitarias diseñadas. Véase, por ejemplo, Yin H. et al. Nature Rev. Genetics (2014) 15:521-555; Aronovich EL et al. "The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy". Hum. Mol. Genet. (2011) R1: R14-20; y Zhao S. et al. "PiggyBac transposon vectors: the tolos of the human gene editing". Transl. Lung Cancer Res. (2016) 5(1): 120-125. En algunas realizaciones, uno o más de los ácidos nucleicos cualquiera que codifica un CAR se introduce en las células efectoras inmunes diseñadas mediante un método físico, que incluye, pero no se limita a, electroporación, sonoporación, fotoporación, magnetofección e hidroporación.

En algunas realizaciones, el vector comprende cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican un CAR de la invención. El ácido nucleico se puede clonar en el vector usando cualquier método de clonación molecular conocido en la técnica, incluido, por ejemplo, el uso de sitios de endonucleasa de restricción y uno o más marcadores seleccionables. En algunas realizaciones, el ácido nucleico está unido operativamente a un promotor. Se han explorado variedades de promotores para la expresión génica en células de mamíferos, y cualquiera de los promotores conocidos en la técnica puede usarse en la presente invención. Los promotores pueden clasificarse a grandes rasgos como promotores constitutivos o promotores regulados, como los promotores inducibles.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el CAR está operativamente unido a un promotor constitutivo. Los promotores constitutivos permiten que genes heterólogos (también denominados como transgenes) se expresen de forma constitutiva en las células huésped. Los promotores constitutivos ejemplares contemplados en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, promotores de citomegalovirus (CMV), factores de elongación humanos-1alfa (hEF1a), promotor de ubiquitina C (UbiC), promotor de fosfogliceroquinasa (PGK), promotor temprano del virus de simio 40 (SV40), y promotor de p-actina de pollo acoplado al potenciador temprano de CMV (CAGG). Las eficacias de dichos promotores constitutivos para impulsar la expresión transgénica han sido comparadas ampliamente en una gran cantidad de estudios. Por ejemplo, Michael C. Milone etalcomparó las eficacias de CMV, hEF1a, UbiC y PGK para impulsar la expresión de CAR en células T humanas primarias, y concluyó que el promotor hEF1a no solo indujo el nivel más alto de expresión transgénica, sino que también se mantuvo de manera óptima en las células T humanas CD4 y CD8 (Molecular Therapy, 17(8): 1453-1464 (2009)). En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el CAR está operativamente unido a un promotor hEF1a.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el CAR está operativamente unido a un promotor inducible. Los promotores inducibles pertenecen a la categoría de promotores regulados. El promotor inducible puede ser inducido por una o más condiciones, tales como una condición física, el microambiente de la célula efectora inmunitaria diseñada o el estado fisiológico de la célula efectora inmunitaria diseñada, un inductor (es decir, un agente inductor), o una combinación de los mismos. La condición inductora puede no inducir la expresión de genes endógenos en la célula de mamífero diseñada y/o en el sujeto que recibe la composición farmacéutica. La condición inductora se puede seleccionar del grupo que consiste en: inductor, irradiación (tal como radiación ionizante, luz), temperatura (tal como calor), estado redox, ambiente tumoral y el estado de activación de la célula de mamífero diseñada.

En algunas realizaciones, el vector también contiene un gen marcador seleccionable o un gen reportero para seleccionar células que expresan el CAR desde la población de células huésped transfectadas a través de vectores lentivirales. Tanto los marcadores seleccionables como los genes reporteros pueden estar flanqueados por secuencias reguladoras apropiadas para permitir la expresión en las células huésped. Por ejemplo, el vector puede contener terminadores de transcripción y traducción, secuencias de iniciación y promotores útiles para la regulación de la expresión de las secuencias de ácido nucleico.

En algunas realizaciones, el vector comprende más de un ácido nucleico que codifica CAR. En algunas realizaciones, el vector comprende un ácido nucleico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un primer CAR y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un segundo CAR, en donde el primer ácido nucleico está unido operativamente al segundo ácido nucleico a través de una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido autoescindible. En algunas realizaciones, el péptido autoescindible se selecciona del grupo que consiste en T2A, P2A y F2A. En algunas realizaciones, el péptido T2A tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 385.

Células efectoras inmunitarias

Las "células efectoras inmunitarias" son células inmunitarias que pueden realizar funciones efectoras inmunitarias. En algunas realizaciones, las células efectoras inmunitarias expresan al menos FcyRIII y realizan la función efectora ADCC. Ejemplos de células efectoras inmunitarias que median en ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células asesinas naturales (NK), monocitos, células T citotóxicas, neutrófilos y eosinófilos.

En algunas realizaciones, las células efectoras inmunitarias son células T. En algunas realizaciones, las células T son CD4+/CD8-, CD4-/CD8+, CD4+/CD8+, CD4-/CD8-, o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, las células T producen IL-2, TFN y/o TNF tras expresar el CAR y unirse a las células diana, tales como células tumorales CD20+ o CD19+. En algunas realizaciones, las células T CD8+ lisan células diana específicas de antígeno tras expresar el CAR y unirse a las células diana.

En algunas realizaciones, las células efectoras inmunitarias son células NK. En otras realizaciones, las células efectoras inmunitarias pueden ser líneas celulares establecidas, por ejemplo, células NK-92.

En algunas realizaciones, las células efectoras inmunitarias se diferencian de una célula madre, tal como una célula madre hematopoyética, una célula madre pluripotente, una iPS o una célula madre embrionaria.

Las células efectoras inmunitarias diseñadas se preparan introduciendo los CAR en las células efectoras inmunitarias, como las células T. El CAR puede introducirse en las células efectoras inmunitarias transfectando cualquiera de los ácidos nucleicos aislados o cualquiera de los vectores descritos en la Sección III. El CAR se puede introducir en las células efectoras inmunitarias insertando proteínas en la membrana celular mientras las células pasan a través de un sistema de microfluidos, como CELL SQUEEZE® (véase, por ejemplo, la publicación de patente de EE.UU. núm.

20140287509).

Se conocen en la técnica métodos para introducir vectores o ácidos nucleicos aislados en una célula de mamífero. Los vectores descritos pueden transferirse a una célula efectora inmunitaria mediante métodos físicos, químicos o biológicos.

Los métodos físicos para introducir el vector en una célula efectora inmunitaria incluyen precipitación con fosfato cálcico, lipofección, bombardeo de partículas, microinyección, electroporación y similares. Los métodos para producir células que comprenden vectores y/o ácidos nucleicos exógenos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York. El vector puede introducirse en la célula mediante electroporación.

Los métodos biológicos para introducir el vector en una célula efectora inmunitaria incluyen el uso de vectores de ADN y ARN. Los vectores virales se han convertido en el método más usado para insertar genes en mamíferos, p. ej., células humanas.

Los medios químicos para introducir el vector en una célula efectora inmunitaria incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal ejemplar para su uso como vehículo de administraciónin vitroes un liposoma (p. ej., una vesícula de membrana artificial).

Las moléculas de ARN que codifican cualquiera de los CAR descritos en la presente memoria se pueden preparar mediante un método convencional (p. ej., transcripciónin vitro)y luego se introducen en las células efectoras inmunitarias mediante métodos conocidos como la electroporación de ARNm. Véase, p. ej., Rabinovich et al., Human Gene Therapy 17:1027-1035.

La célula efectora inmunitaria transducida o transfectada se puede propagar ex vivo después de la introducción del vector o ácido nucleico aislado. La célula efectora inmunitaria transducida o transfectada puede cultivarse para propagarse durante al menos aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 10 días, 12 días o 14 días. La célula efectora inmunitaria transducida o transfectada se puede evaluar o cribar adicionalmente para seleccionar la célula de mamífero diseñada.

Pueden usarse genes reporteros para identificar células potencialmente transfectadas y para evaluar la funcionalidad de secuencias reguladoras. En general, un gen reportero es un gen que no está presente ni expresado por el organismo o tejido receptor y que codifica un polipéptido cuya expresión se manifiesta mediante alguna propiedad fácilmente detectable, p. ej., actividad enzimática. La expresión del gen reportero se analiza en un momento adecuado después de que el ADN se haya introducido en las células receptoras. Los genes reporteros adecuados pueden incluir genes que codifican luciferasa, beta-galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa, fosfatasa alcalina secretada o el gen de la proteína verde fluorescente (p. ej., Ui-Tei et al. FEBS Letters 479: 79-82 (2000)). Los sistemas de expresión adecuados son bien conocidos y pueden prepararse usando técnicas conocidas u obtenerse comercialmente.

Otros métodos para confirmar la presencia del ácido nucleico que codifica los CAR en la célula efectora inmunitaria diseñada incluyen, por ejemplo, ensayos de biología molecular bien conocidos por los expertos en la técnica, tales como transferencia Southern y Northern, RT-PCR y PCR; ensayos bioquímicos, como detectar la presencia o ausencia de un péptido particular, p. ej., mediante métodos inmunológicos (como ELISA y transferencia Western).

1. Fuentes de células T (La sección "Fuentes de células T" se describe como referencia. La realización en esta sección no son realizaciones de la invención).

Antes de la expansión y modificación genética de las células T, se obtiene una fuente de células T de un individuo. Las células T se pueden obtener de diversas fuentes, incluidas células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. En algunas realizaciones, se puede usar cualquier número de líneas de células T disponibles en la técnica. En algunas realizaciones, las células T se pueden obtener a partir de una unidad de sangre extraída de un sujeto usando cualquier número de técnicas conocidas por el experto, tales como separación FICOLL™. En algunas realizaciones, las células de la sangre circulante de un individuo se obtienen mediante aféresis. El producto de aféresis normalmente contiene linfocitos, incluyendo células T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. En algunas realizaciones, las células recogidas mediante aféresis se pueden lavar para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio apropiado para las etapas de procesamiento posteriores. En algunas realizaciones, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En algunas realizaciones, la disolución de lavado carece de calcio y puede carecer de magnesio o puede carecer de muchos, sino de todos, los cationes divalentes. De nuevo, sorprendentemente, las etapas de activación iniciales en ausencia de calcio conducen a una activación magnificada. Como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica, una etapa de lavado se puede realizar mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como mediante el uso de una centrífuga de "flujo continuo" semiautomática (por ejemplo, el procesador celular Cobe 2991, Baxter CytoMate o Haemonetics Cell Saver 5) según las instrucciones del fabricante. Después del lavado, las células se pueden resuspender en una variedad de tampones biocompatibles, tales como, por ejemplo, PBS libre de Ca2+, libre de Mg2+, PlasmaLyte A u otra solución salina con o sin tampón. Alternativamente, se pueden eliminar los componentes indeseables de la muestra de aféresis y resuspender las células directamente en medios de cultivo.

En algunas realizaciones, las células T se aíslan de los linfocitos de sangre periférica lisando los glóbulos rojos y agotando los monocitos, por ejemplo, mediante centrifugación a través de un gradiente PERCOLL™ o por elutriación centrífuga a contraflujo. Una subpoblación específica de células T, tales como células T CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ y CD45RO+, se puede aislar adicionalmente mediante técnicas de selección positiva o negativa. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las células T se aíslan mediante incubación con perlas conjugadas con anti-CD3/anti-CD28 (es decir, 3 x 28), tales como DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T, durante un período de tiempo suficiente para la selección positiva de las células T deseadas. En algunas realizaciones, el período de tiempo es de aproximadamente 30 minutos. En una realización adicional, el período de tiempo varía de 30 minutos a 36 horas o más y todos los valores enteros entre ellos. En una realización adicional, el período de tiempo es al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 horas. En algunas realizaciones, el período de tiempo es de 10 a 24 horas. En algunas realizaciones, el período de incubación es de 24 horas. Para el aislamiento de células T de pacientes con leucemia, el uso de tiempos de incubación más largos, como 24 horas, puede aumentar el rendimiento celular. Se pueden usar tiempos de incubación más prolongados para aislar células T en cualquier situación en la que haya pocas células T en comparación con otros tipos de células, como al aislar linfocitos de infiltración en tumores (TIL) procedentes de tejido tumoral o de individuos inmunocomprometidos. Además, el uso de tiempos de incubación más prolongados puede aumentar la eficacia de captura de células T CD8+. Por lo tanto, simplemente acortando o alargando el tiempo en que se permite que las células T se unan a las perlas CD3/CD28 y/o aumentando o disminuyendo la relación de perlas a células T (como se describe más adelante en la presente memoria), se pueden seleccionar preferentemente subpoblaciones de células T a favor o en contra al inicio del cultivo o en otros momentos durante el proceso. Además, al aumentar o disminuir la relación de anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28 en las perlas u otra superficie, se pueden seleccionar subpoblaciones de células T preferentemente a favor o en contra al inicio del cultivo o en otros puntos temporales deseados. El experto reconocerá que también se pueden usar múltiples rondas de selección. En algunas realizaciones, puede ser deseable realizar el procedimiento de selección y usar las células "no seleccionadas" en el proceso de activación y expansión. Las células "no seleccionadas" también pueden someterse a rondas de selección adicionales.

El enriquecimiento de una población de células T mediante selección negativa se puede lograr con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores de superficie exclusivos de las células seleccionadas negativamente. Un método es la clasificación y/o selección de células mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que usa un cóctel de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de la superficie celular presentes en las células seleccionadas negativamente. Por ejemplo, para enriquecer células CD4+ mediante selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales normalmente incluye anticuerpos contra CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8. En determinadas realizaciones, puede ser deseable enriquecer o seleccionar positivamente células T reguladoras que normalmente expresan CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ y FoxP3+. Alternativamente, en determinadas realizaciones, las células T reguladoras se agotan mediante perlas conjugadas anti-C25 u otro método de selección similar.

Para el aislamiento de una población deseada de células mediante selección positiva o negativa, la concentración de células y la superficie (p. ej., partículas como perlas) se pueden variar. En determinadas realizaciones, puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el que se mezclan las perlas y las células (es decir, aumentar la concentración de células), para garantizar el máximo contacto de las células y las perlas. Por ejemplo, en una realización, se usa una concentración de 2 mil millones de células/ml. En una realización, se usa una concentración de mil millones de células/ml. En una realización adicional, se usan más de 100 millones de células/ml. En una realización adicional, se usa una concentración de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 millones de células/ml. En otra realización más, se usa una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/ml. En realizaciones adicionales, se pueden usar concentraciones de 125 o 150 millones de células/ml. El uso de altas concentraciones puede dar como resultado un aumento del rendimiento celular, la activación celular y la expansión celular. Además, el uso de altas concentraciones celulares permite una captura más eficaz de células que pueden expresar débilmente antígenos diana de interés, como células T CD28 negativas, o de muestras en las que hay muchas células tumorales presentes (es decir, sangre leucémica, tejido tumoral, etc.). Tales poblaciones de células pueden tener valor terapéutico y sería deseable obtenerlas. Por ejemplo, el uso de una alta concentración de células permite una selección más eficaz de células T CD8+ que normalmente tienen una expresión de CD28 más débil.

En algunas realizaciones, puede ser deseable utilizar concentraciones más bajas de células. Al diluir significativamente la mezcla de células T y de superficie (p. ej., partículas como perlas), se minimizan las interacciones entre las partículas y las células. Esto selecciona células que expresan grandes cantidades de antígenos deseados para unirse a las partículas. Por ejemplo, las células T<c>D4+ expresan niveles más altos de CD28 y se capturan más eficazmente que las células T<c>D8+ en concentraciones diluidas. En algunas realizaciones, la concentración de células usadas es 5x106/ml. En algunas realizaciones, la concentración usada puede ser de aproximadamente 1x105/ml a 1*106/ml y cualquier valor entero intermedio.

En algunas realizaciones, las células se pueden incubar en un rotador durante períodos de tiempo variables a velocidades variables, ya sea entre 2 y 10 °C o a temperatura ambiente.

Las células T para estimulación también se pueden congelar después de una etapa de lavado. Sin querer limitarse a ninguna teoría, la etapa de congelación y descongelación posterior proporciona un producto más uniforme al eliminar los granulocitos y, en cierta medida, los monocitos de la población celular. Después de la etapa de lavado que elimina el plasma y las plaquetas, las células pueden suspenderse en una disolución de congelación. Si bien se conocen en la técnica muchas disoluciones y parámetros de congelación que serán útiles en este contexto, un método implica usar PBS que contiene 20 % de DMSO y 8 % de albúmina sérica humana, o medios de cultivo que contienen 10 % de dextrano 40 y 5 % de dextrosa, 20 % de albúmina sérica humana y 7,5 % de DMSO, o 31,25 % de plasmalyte A, 31,25 % de dextrosa al 5 %, 0,45 % de NaCl, 10 % de dextrano 40 y 5 % de dextrosa, 20 % de albúmina sérica humana y 7,5 % de DMSO u otro medio de congelación celular adecuado que contienen, por ejemplo, Hespan y PlasmaLyte A, las células luego se congelan a -80 °C a una velocidad de 1° por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido. Se pueden usar otros métodos de congelación controlada, así como la congelación incontrolada inmediatamente a -20 °C o en nitrógeno líquido.

En algunas realizaciones, las células criopreservadas se descongelan y se lavan como se describe en la presente memoria y se dejan reposar durante una hora a temperatura ambiente antes de la activación.

También se describe como referencia la recolección de muestras de sangre o producto de aféresis de un sujeto en un período de tiempo anterior al momento en que podrían necesitarse las células expandidas como se describe en la presente memoria. Como tal, la fuente de las células que se van a expandir se puede recolectar en cualquier momento necesario, y las células deseadas, como las células T, se pueden aislar y congelar para su uso posterior en la terapia con células T para cualquier número de enfermedades o afecciones que se beneficiarían de terapia con células T, como las descritas en la presente memoria. En una realización, se toma una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto generalmente sano. En determinadas realizaciones, se toma una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto generalmente sano que está en riesgo de desarrollar una enfermedad, pero que aún no ha desarrollado una enfermedad, y las células de interés se aíslan y se congelan para su uso posterior. En determinadas realizaciones, las células T se pueden expandir, congelar y usar en un momento posterior. En determinadas realizaciones, las muestras se recogen de un paciente poco después del diagnóstico de una enfermedad particular como se describe en la presente memoria, pero antes de cualquier tratamiento. En una realización adicional, las células se aíslan de una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto antes de cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes, que incluyen, pero no se limitan a, tratamiento con agentes tales como natalizumab, efalizumab, agentes antivirales, quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3, citoxano, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228 e irradiación. Estos fármacos inhiben la fosfatasa calcineurina dependiente del calcio (ciclosporina y FK506) o inhiben la quinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por el factor de crecimiento (rapamicina) (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). En una realización adicional, las células se aíslan para un paciente y se congelan para su uso posterior junto con (p. ej., antes, simultáneamente o después) de un trasplante de médula ósea o de células madre, terapia ablativa de células T usando agentes quimioterapéuticos tales como fludarabina, radioterapia de haz externo (XRT), ciclofosfamida o anticuerpos como OKT3 o CAMPATH. En otra realización, las células se aíslan antes y se pueden congelar para su uso posterior para el tratamiento después de la terapia ablativa de células B, tal como agentes que reaccionan con CD20, p. ej., Rituxán.

En algunas realizaciones, las células T se obtienen de un paciente directamente después del tratamiento. En este sentido, se ha observado que después de determinados tratamientos contra el cáncer, en particular tratamientos con fármacos que dañan el sistema inmunitario, poco después del tratamiento durante el período en el que los pacientes normalmente se estarían recuperando del tratamiento, la calidad de las células T obtenidas puede ser óptima o mejorada por su capacidad de expandirse ex vivo. Asimismo, después de la manipulación ex vivo usando los métodos descritos en la presente memoria, estas células pueden estar en un estado preferido para un injerto mejorado y una expansión in vivo. Por lo tanto, se contempla dentro del contexto de la presente invención recolectar células sanguíneas, incluidas células T, células dendríticas u otras células del linaje hematopoyético, durante esta fase de recuperación. Además, en ciertas realizaciones, se pueden usar regímenes de movilización (por ejemplo, movilización con GM-CSF) y acondicionamiento para crear una condición en un sujeto en donde se favorece la repoblación, recirculación, regeneración y/o expansión de tipos de células particulares, especialmente durante una ventana de tiempo definida después de la terapia. Los tipos de células ilustrativos incluyen células T, células B, células dendríticas y otras células del sistema inmunitario.

2. Activación y expansión de células T. (La sección "Activación y expansión de células T" se describe como referencia. Las realizaciones en esta sección no son realizaciones de la invención).

Ya sea antes o después de la modificación genética de las células T con los CAR descritos en la presente memoria, las células T pueden activarse y expandirse generalmente usando métodos como se describe, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. núm. 6.352.694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681; 7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566; 7.175.843; 5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; y la publicación de solicitud de patente de EE.UU. núm. 20060121005.

Generalmente, las células T se pueden expandir por contacto con una superficie que tiene unido a la misma un agente que estimula una señal asociada al complejo CD3/TCR y un ligando que estimula una molécula coestimuladora en la superficie de las células T. En particular, las poblaciones de células T pueden estimularse como se describe en la presente memoria, tal como mediante contacto con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado en una superficie, o mediante contacto con un activador de proteína quinasa C (p. ej., briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesoria en la superficie de las células T, se usa un ligando que se une a la molécula accesoria. Por ejemplo, se puede poner en contacto una población de células T con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones apropiadas para estimular la proliferación de las células T. Para estimular la proliferación de células T CD4+ o de células T CD8+, se usan un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. Los ejemplos de un anticuerpo anti-CD28 incluyen 9.3, B-T3, se puede usar XR-CD28 (Diaclone, Besancon, Francia), al igual que otros métodos comúnmente conocidos en la técnica (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).

En algunas realizaciones, la señal estimuladora primaria y la señal coestimuladora para la célula T pueden proporcionarse mediante protocolos diferentes. Por ejemplo, los agentes que proporcionan cada señal pueden estar en disolución o acoplados a una superficie. Cuando se acoplan a una superficie, los agentes pueden acoplarse a la misma superficie (es decir, en formación "cis") o a superficies separadas (es decir, en formación "trans"). Alternativamente, un agente puede acoplarse a una superficie y el otro agente estar en disolución. En una realización, el agente que proporciona la señal coestimuladora está unido a una superficie celular y el agente que proporciona la señal de activación primaria está en disolución o acoplado a una superficie. En determinadas realizaciones, ambos agentes pueden estar en disolución. En otra realización, los agentes pueden estar en forma soluble y luego reticularse a una superficie, tal como una célula que expresa receptores Fc o un anticuerpo u otro agente de unión que se unirá a los agentes. En este sentido, véanse por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. núms.

20040101519 y 20060034810 para células presentadoras de antígenos artificiales (aAPC) que se contemplan para su uso en la activación y expansión de células T en la presente invención.

En algunas realizaciones, las células T se combinan con perlas recubiertas de agente, las perlas y las células se separan posteriormente y luego se cultivan las células. En una realización alternativa, antes del cultivo, las células y perlas recubiertas con el agente no se separan sino que se cultivan juntas. En una realización adicional, las perlas y las células se concentran primero mediante la aplicación de una fuerza, tal como una fuerza magnética, lo que da como resultado una mayor ligadura de los marcadores de la superficie celular, induciendo así la estimulación celular.

A modo de ejemplo, se pueden ligar proteínas de la superficie celular permitiendo que las perlas paramagnéticas a las que están unidos anti-CD3 y anti-CD28 (3 x 28 perlas) entren en contacto con las células T. En una realización las células (por ejemplo, 104 a 109 células T) y perlas (por ejemplo, perlas paramagnéticas DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T en una relación de 1:1) se combinan en un tampón, preferiblemente PBS (sin cationes divalentes tales como calcio y magnesio). Nuevamente, los expertos en la técnica podrán apreciar fácilmente que se puede usar cualquier concentración celular. Por ejemplo, la célula diana puede ser muy rara en la muestra y comprender sólo el 0,01 % de la muestra o la muestra completa (es decir, el 100 %) puede comprender la célula diana de interés. Por consiguiente, cualquier número celular está dentro del contexto de la presente invención. En ciertas realizaciones, puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el que se mezclan las partículas y las células (es decir, aumentar la concentración de las células), para asegurar el máximo contacto de las células y las partículas. Por ejemplo, en una realización, se usa una concentración de aproximadamente 2 mil millones de células/ml. En otra realización, se usan más de 100 millones de células/ml. En una realización adicional, se usa una concentración de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 millones de células/ml. En otra realización más, se usa una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/ml. En realizaciones adicionales, se pueden usar concentraciones de 125 o 150 millones de células/ml. El uso de altas concentraciones puede dar como resultado un aumento del rendimiento celular, la activación celular y la expansión celular. Además, el uso de altas concentraciones celulares permite una captura más eficaz de células que pueden expresar débilmente antígenos diana de interés, como las células T CD28 negativas. Dichas poblaciones de células pueden tener valor terapéutico y sería deseable obtenerlas en determinadas realizaciones. Por ejemplo, el uso de una alta concentración de células permite una selección más eficaz de células T CD8+ que normalmente tienen una expresión de CD28 más débil.

En algunas realizaciones, la mezcla se puede cultivar durante varias horas (aproximadamente 3 horas) hasta aproximadamente 14 días o cualquier valor entero de horas entre esos valores. En otra realización, la mezcla se puede cultivar durante 21 días. En una realización de la invención, las perlas y las células T se cultivan juntas durante aproximadamente ocho días. En otra realización, las perlas y las células T se cultivan juntas durante 2-3 días. También pueden desearse varios ciclos de estimulación de modo que el tiempo de cultivo de células T pueda ser de 60 días o más. Las condiciones apropiadas para el cultivo de células T incluyen un medio apropiado (p. ej., medio esencial mínimo o medio RPMI 1640 o, X-vivo 15, (Lonza)) que pueden contener factores necesarios para la proliferación y viabilidad, incluido el suero (p. ej., suero fetal bovino o humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-<y>, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFp, y TNF-a o cualquier otro aditivo para el crecimiento de células conocido por el experto en la técnica. Otros aditivos para el crecimiento de células incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos, plasmanato y agentes reductores tales como N-acetilcisteína y 2-mercaptoetanol. Los medios pueden incluir RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos añadidos, piruvato de sodio y vitaminas, ya sea sin suero o suplementado con una cantidad apropiada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citoquina(s) suficiente para el crecimiento y expansión de las células T. Se incluyen antibióticos, p. ej., penicilina y estreptomicina, sólo en cultivos experimentales, no en cultivos de células que se van a infundir a un sujeto. Las células diana se mantienen en las condiciones necesarias para favorecer el crecimiento, por ejemplo, una temperatura (p. ej., 37 °C) y atmósfera (p. ej., aire más 5 % de CO2) apropiadas. Las células T que han sido expuestas a distintos tiempos de estimulación pueden presentar características diferentes. Por ejemplo, los productos de células mononucleares sanguíneas o de sangre periférica obtenida por aféresis típicos tienen una población de células T auxiliares (TH, CD4+) que es mayor que la población de células T citotóxicas o supresoras (TC, CD8). La expansión ex vivo de las células T mediante la estimulación de los receptores CD3 y CD28 produce una población de células T que antes de aproximadamente los días 8-9 consiste predominantemente en células TH, mientras que después de aproximadamente los días 8-9, la población de células T comprende una población cada vez mayor de células TC. Por consiguiente, dependiendo del propósito del tratamiento, puede ser ventajoso infundir a un sujeto una población de células T que comprende predominantemente células TH. De manera similar, si se ha aislado un subconjunto de células TC específico de antígeno, puede ser beneficioso expandir este subconjunto en mayor grado.

Adicionalmente, además de los marcadores CD4 y CD8, otros marcadores fenotípicos varían significativamente, pero en gran parte, de manera reproducible durante el curso del proceso de expansión celular. Por tanto, dicha reproducibilidad permite la capacidad de adaptar un producto de células T activadas para fines específicos.

V. Composiciones farmacéuticas

La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden las células efectoras inmunitarias diseñadas que comprenden los BCMA CAR de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar mezclando una pluralidad de células efectoras inmunitarias diseñadas que tienen el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas.

Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas e incluyen tampones, antioxidantes que incluyen ácido ascórbico, metionina, vitamina E, metabisulfito de sodio; conservantes, isotonificantes, estabilizantes, complejos metálicos (p. ej. complejos de Znproteína); agentes quelantes tales como EDTA y/o tensioactivos no iónicos.

Los tampones se usan para controlar el pH en un intervalo que optimiza la eficacia terapéutica, especialmente si la estabilidad depende del pH. Los tampones están preferiblemente presentes en concentraciones que oscilan de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 250 mM. Los agentes tampón adecuados para usar con la presente invención incluyen ácidos tanto orgánicos como inorgánicos y sus sales. Por ejemplo, citrato, fosfato, succinato, tartrato, fumarato, gluconato, oxalato, lactato, acetato. Además, los tampones pueden comprender sales de histidina y trimetilamina tales como Tris.

Se añaden conservantes para retrasar el crecimiento microbiano y normalmente están presentes en un intervalo de 0,2 %-1,0 % (p/v). Los conservantes adecuados para su uso con la presente invención incluyen cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; haluros de benzalconio (p. ej., cloruro, bromuro, yoduro), cloruro de bencetonio; timerosal, fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol, 3-pentanol y m-cresol.

Los agentes de tonicidad, a veces conocidos como "estabilizantes", están presentes para ajustar o mantener la tonicidad del líquido en una composición. Cuando se usan con biomoléculas grandes y cargadas, como proteínas y anticuerpos, a menudo se les denomina "estabilizantes" porque pueden interactuar con los grupos cargados de las cadenas laterales de los aminoácidos, disminuyendo así el potencial de interacciones inter e intramoleculares. Los agentes de tonicidad pueden estar presentes en cualquier cantidad entre 0,1 % y 25 % en peso, preferiblemente entre 1 % y 5 %, teniendo en cuenta las cantidades relativas de los demás ingredientes. Los agentes de tonicidad preferidos incluyen alcoholes de azúcares polihídricos, preferiblemente alcoholes de azúcares trihídricos o superiores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol.

Los excipientes adicionales incluyen agentes que pueden servir como uno o más de los siguientes: (1) agentes de carga, (2) potenciadores de la solubilidad, (3) estabilizantes y (4) agentes que previenen la desnaturalización o la adherencia a la pared del recipiente. Dichos excipientes incluyen: alcoholes de azúcares polihídricos (enumerados anteriormente); aminoácidos tales como alanina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, lisina, ornitina, leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc.; azúcares orgánicos o alcoholes de azúcares tales como sacarosa, lactosa, lactitol, trehalosa, estaquiosa, manosa, sorbosa, xilosa, ribosa, ribitol, mioinisitosa, mioinisitol, galactosa, galactitol, glicerol, ciclitoles (p. ej., inositol), polietilenglicol; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutatión, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, a-monotioglicerol y tiosulfato de sodio; proteínas de bajo peso molecular tales como albúmina sérica humana, albúmina sérica bovina, gelatina u otras inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; monosacáridos (p. ej., xilosa, manosa, fructosa, glucosa); disacáridos (p. ej., lactosa, maltosa, sacarosa); trisacáridos tales como rafinosa; y polisacáridos tales como dextrina o dextrano.

Los tensioactivos o detergentes no iónicos (también conocidos como "agentes humectantes") están presentes para ayudar a solubilizar el agente terapéutico así como para proteger la proteína terapéutica contra la agregación inducida por la agitación, lo que también permite que la formulación se exponga a tensiones superficiales de cizallamiento sin provocar la desnaturalización de la proteína o anticuerpo terapéutico activo. Los tensioactivos no iónicos están presentes en un intervalo de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, preferiblemente aproximadamente 0,07 mg/ml a aproximadamente 0,2 mg/ml.

Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen polisorbatos (20, 40, 60, 65, 80, etc.), polioxámeros (184, 188, etc.), polioles PLURONIC®, TRITON®, monoéteres de polioxietilensorbitán (TWEEN®-20, t WEe N®-80, etc.), lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, aceite de ricino hidrogenado de polioxietileno 10, 50 y 60, monoestearato de glicerol, éster de ácido graso de sacarosa, metilcelulosa y carboximetilcelulosa. Los detergentes aniónicos que pueden usarse incluyen laurilsulfato de sodio, sulfosuccinato de dioctilsodio y sulfonato de dioctilsodio. Los detergentes catiónicos incluyen cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio.

Para que las composiciones farmacéuticas puedan usarse para administración in vivo, deben ser estériles. La composición farmacéutica puede esterilizarse mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Las composiciones farmacéuticas de la presente memoria generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de disolución intravenosa que tiene un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica.

La vía de administración está de acuerdo con métodos conocidos y aceptados, tales como bolos únicos o múltiples o infusión durante un largo período de tiempo de una manera adecuada, p. ej., inyección o infusión por vías subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intralesional o intraarticular, administración tópica, inhalación o por medio de liberación sostenida o de liberación prolongada.

Se pueden preparar preparados de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el antagonista, matrices que están en forma de artículos moldeados, p. ej. películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente de EE.UU. núm. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de etilo, etilenoacetato de vinilo no degradables, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria también pueden contener más de un compuesto o agente activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferiblemente aquellas con actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí. Alternativamente, o además, la composición puede comprender un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, una citoquina, un agente inmunosupresor o un agente inhibidor del crecimiento. Dichas moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que sean efectivas para el fin previsto.

Los ingredientes activos también pueden quedar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coascervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 18a edición.

VI. Usos en métodos de tratamiento

La presente invención se refiere además a un CAR o una composición farmacéutica de la invención para el uso en métodos de inmunoterapia celular. En algunas realizaciones, la inmunoterapia celular es para tratar el cáncer, que incluye, pero no se limita a, neoplasias malignas hematológicas y tumores sólidos. Cualquiera de los sdAb anti-BCMA, CAR y células efectoras inmunitarias diseñadas (tales como células CAR-T) descritos en la presente memoria se pueden usar en el método de tratamiento del cáncer. Los CAR descritos en la presente memoria pueden ser útiles para tratar tumores que tienen mutaciones de escape de pérdida de antígeno y para reducir la resistencia a las terapias existentes. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención se pueden usar en métodos para tratar otras enfermedades que están asociadas con los antígenos específicamente reconocidos por los anticuerpos de dominio único o CAR, que incluyen, por ejemplo, enfermedades autoinmunes.

En algunas realizaciones, el método es para tratar un cáncer (tal como mieloma múltiple, p. ej., mieloma múltiple recidivante o refractario) en un individuo (tal como un individuo humano), que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende: (1) una célula efectora inmunitaria diseñada (tal como una célula T) que comprende un CAR multivalente que comprende un polipéptido que comprende: (a) un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende un primer sdAb anti-BCMA que comprende un dominio V<h>H que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ iD NO: 124, y un segundo sdAb anti-BCMA que comprende un dominio V<h>H que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; (b) un dominio transmembrana; y (c) un dominio de señalización intracelular; y (2) un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria diseñada es autóloga. En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria diseñada es alogénica. En algunas realizaciones, las células efectoras inmunitarias diseñadas son células CAR-T. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer líquido, tal como mieloma múltiple, leucemia linfoblástica aguda o leucemia linfocítica crónica. En algunas realizaciones, el cáncer es mieloma múltiple refractario o recidivante. En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria diseñada se administra en una dosis de aproximadamente 105 a aproximadamente 107 células/kg, como aproximadamente 3*105 a aproximadamente 7*106 células/kg, o aproximadamente 3*106 células/kg. En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria diseñada se administra mediante inyección intravenosa. En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria diseñada se administra en tres dosis divididas durante aproximadamente una semana.

En algunas realizaciones, el método es para tratar un cáncer (tal como mieloma múltiple, p. ej., mieloma múltiple recidivante o refractario) en un individuo (tal como un individuo humano), que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende: (1) una célula efectora inmunitaria diseñada (tal como una célula T) que comprende un BCMA CAR de la invención que comprende un polipéptido que comprende: (a) un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende dos sdAb anti-BCMA; (b) un dominio transmembrana; y (c) un dominio de señalización intracelular; y (2) un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde el primer sdAb anti-BCMA puede comprender una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:79; y el segundo sdAb anti-BCMA puede comprender una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:86. El sdAb anti-BCMA puede ser camélido, quimérico, humano o humanizado. En algunas realizaciones, un primer sdAb anti-BCMA comprende un dominio V<h>H que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 124 y un segundo sdAb anti-BCMA comprende un dominio V<h>H que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117. En algunas realizaciones, BCMA CAR comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 300-305. En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria diseñada es autóloga. En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria diseñada es alogénica. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer líquido, tal como mieloma múltiple, leucemia linfoblástica aguda o leucemia linfocítica crónica. En algunas realizaciones, el cáncer es mieloma múltiple refractario o recidivante. En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria diseñada se administra en una dosis de aproximadamente 105 a aproximadamente 107 células/kg, tal como aproximadamente 3*105 a aproximadamente 7*106 células/kg, o aproximadamente 3*106 células/kg. En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria diseñada se administra mediante inyección intravenosa. En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria diseñada se administra en tres dosis divididas durante aproximadamente una semana.

En algunas realizaciones, el método es para obtener una remisión clínica parcial o completa en un individuo que tiene mieloma múltiple (p. ej., mieloma múltiple recidivante o refractario). En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria diseñada es autóloga. En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria diseñada es alogénica. En algunas realizaciones, las células efectoras inmunitarias diseñadas son células CAR-T. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer líquido, tal como mieloma múltiple, leucemia linfoblástica aguda o leucemia linfocítica crónica. En algunas realizaciones, el cáncer es mieloma múltiple refractario o recidivante. En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria diseñada se administra en una dosis de aproximadamente 105 a aproximadamente 107 células/kg, como aproximadamente 3*105 a aproximadamente 7*106 células/kg, o aproximadamente 3*106 células/kg. En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria diseñada se administra mediante inyección intravenosa. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune diseñada se administra en tres dosis divididas durante aproximadamente una semana.

Se describe como referencia un método para tratar un cáncer (como el mieloma múltiple, p. ej., mieloma múltiple recidivante o refractario) en un individuo (tal como un individuo humano), que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un sdAb anti-BCMA y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde el sdAb anti-BCMA comprende cualquiera de los siguientes: (1) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:77; (2) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:78; (3) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:79; (4) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:80; (5) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:81; (6) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:82; (7) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:45; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:83; (8) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:84; (9) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:47; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:85; (10) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:86; (11) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:49; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:87; (12) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:88; (13) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:89; (14) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:14; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:90; (15) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:15; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:91; (16) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:92; (17) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:55; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:93; (18) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:56; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:94; (19) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:57; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:95; (20) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:58; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:96; (21) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:59; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:97; (22) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:60; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:98; (23) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:23; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:61; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:99; (24) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:24; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:62; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:100; (25) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:63; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:101; (26) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:64; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:102; (27) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:65; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:103; (28) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:66; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:104; (29) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:67; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:105; (30) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106; (31) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:69; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:107; (32) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:70; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:108; (33) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:71; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:109; (34) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:72; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:110; (35) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:73; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:111; (36) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:74; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:112; (37) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:75; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:113; o (38) una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:76; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:114. En algunos ejemplos, el sdAb anti-BCMA es camélido, quimérico, humano o humanizado. En algunos ejemplos, el sdAb anti-BCMA comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID<n>O: 115-152. En algunos ejemplos, el cáncer es un cáncer líquido, como el mieloma múltiple, la leucemia linfoblástica aguda o la leucemia linfocítica crónica. En algunos ejemplos, el cáncer es mieloma múltiple refractario o recidivante.

Los métodos descritos en la presente memoria son adecuados para tratar diversos cánceres, incluidos tanto el cáncer sólido como el cáncer líquido. Los métodos son aplicables a cánceres de todas las etapas, incluido el cáncer en etapa temprana, etapa avanzada y metastásico. Los métodos descritos en la presente memoria se pueden usar como primera terapia, segunda terapia, tercera terapia o terapia de combinación con otros tipos de terapias contra el cáncer conocidas en la técnica, tales como quimioterapia, cirugía, radiación, terapia génica, inmunoterapia, trasplante de médula ósea, trasplante de células madre, terapia dirigida, crioterapia, terapia con ultrasonido, terapia fotodinámica, ablación por radiofrecuencia o similares, en un entorno adyuvante o en un entorno neoadyuvante.

En algunas realizaciones, el cáncer es mieloma múltiple. En algunas realizaciones, el cáncer es mieloma múltiple en estadio I, estadio II o estadio III y/o estadio A o estadio B según el sistema de estadificación Durie-Salmon. En algunas realizaciones, el cáncer es mieloma múltiple en estadio I, estadio II o estadio III en base al sistema de estadificación internacional publicado por el Grupo de Trabajo Internacional de Mieloma (IMWG). En algunas realizaciones, el cáncer es gammapatía monoclonal de significado indeterminado (MGUS). En algunas realizaciones, el cáncer es mieloma asintomático (latente/indolente). En algunas realizaciones, el cáncer es mieloma sintomático o activo. En algunas realizaciones, el cáncer es mieloma múltiple refractario. En algunas realizaciones, el cáncer es mieloma múltiple metastásico. En algunas realizaciones, el individuo no respondió a un tratamiento previo para el mieloma múltiple. En algunas realizaciones, el individuo tiene una enfermedad progresiva después de un tratamiento previo de mieloma múltiple. En algunas realizaciones, el individuo ha recibido previamente al menos aproximadamente uno cualquiera de 2, 3, 4 o más tratamientos para el mieloma múltiple. En algunas realizaciones, el cáncer es mieloma múltiple recidivante.

En algunas realizaciones, el individuo tiene mieloma múltiple activo. En algunas realizaciones, el individuo tiene células plasmáticas clonales de médula ósea de al menos un 10 %. En algunas realizaciones, el individuo tiene un plasmocitoma óseo o extramedular comprobado mediante biopsia. En algunas realizaciones, el individuo tiene evidencia de daño en órganos terminales que puede atribuirse al trastorno proliferativo de células plasmáticas subyacente. En algunas realizaciones, el individuo tiene hipercalcemia, p. ej., calcio sérico >0,25 mmol/L (>1 mg/dL) superior al límite superior normal o >2,75 mmol/L (>11 mg/dL). En algunas realizaciones, el individuo tiene insuficiencia renal, p. ej., aclaramiento de creatinina <40 ml por minuto o creatinina sérica >177 pmol/L (>2 mg/dL). En algunas realizaciones, el individuo tiene anemia, p. ej., valor de hemoglobina de >20 g/L por debajo del límite inferior normal, o un valor de hemoglobina <100 g/L. En algunas realizaciones, el individuo tiene una o más lesiones óseas, p. ej., una o más lesiones osteolíticas en radiografía esquelética, TC o PET/CT. En algunas realizaciones, el individuo tiene uno o más de los siguientes biomarcadores de malignidad (MDE): (1) 60 % o más de células plasmáticas clonales en el examen de médula ósea; (2) relación de cadena ligera libre involucrada/no involucrada en suero de 100 o mayor, siempre que el nivel absoluto de la cadena ligera involucrada sea al menos 100 mg/l; y (3) más de una lesión focal en la resonancia magnética (MRI) que tenga un tamaño de al menos 5 mm o más.

La administración de las composiciones farmacéuticas se puede realizar de cualquier manera conveniente, incluyendo mediante inyección, ingestión, transfusión, implantación o trasplante. Las composiciones se pueden administrar a un paciente por vía transarterial, subcutánea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, intravenosa o intraperitoneal. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra sistémicamente. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra a un individuo mediante infusión, tal como infusión intravenosa. Las técnicas de infusión para inmunoterapia se conocen en la técnica (véase, p. ej., Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676 (1988)). En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra a un individuo mediante inyección intradérmica o subcutánea. En algunas realizaciones, las composiciones se administran mediante inyección intravenosa. En algunas realizaciones, las composiciones se inyectan directamente en un tumor o un ganglio linfático. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra localmente en un sitio de tumor, tal como directamente en células tumorales, o en un tejido que tiene células tumorales.

Las dosis y la concentración de fármaco deseada de las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar dependiendo del uso particular previsto. La determinación de la dosis o vía de administración apropiada está dentro de la habilidad de un experto común. Los experimentos con animales proporcionan una guía fiable para la determinación de dosis eficaces para la terapia humana. El escalado entre especies de dosis eficaces se puede realizar siguiendo los principios establecidos por Mordenti, J. y Chappell, W. "The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics", en Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, Nueva York 1989, págs. 42-46. Está dentro del alcance de la presente invención que diferentes formulaciones serán eficaces para diferentes tratamientos y diferentes trastornos, y que la administración prevista para tratar un órgano o tejido específico puede requerir la administración de una manera diferente a la de otro órgano o tejido.

Descrita como referencia, en donde la composición farmacéutica comprende cualquiera de los sdAb descritos en la presente memoria, la composición farmacéutica se administra en una dosis de aproximadamente 10 ng/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal del individuo o más por día, por ejemplo, de aproximadamente 1 mg/kg/día a 10 mg/kg/día, dependiendo de la vía de administración. En la bibliografía se proporciona orientación sobre dosis y métodos de administración particulares; véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. núms. 4.657.760; 5.206.344; o 5.225.212.

En algunas realizaciones, en donde la composición farmacéutica comprende cualquiera de las células inmunitarias diseñadas de la invención, la composición farmacéutica se administra en una dosis de al menos aproximadamente cualquiera de 104, 105, 106, 107, 108, o 109 células/kg de peso corporal del individuo. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra en una dosis de cualquiera de aproximadamente 104 a aproximadamente 105, aproximadamente 105 a aproximadamente 106, aproximadamente 106 a aproximadamente 107, aproximadamente 107 a aproximadamente 108, aproximadamente 108 a aproximadamente 109, aproximadamente 104 a aproximadamente 109, aproximadamente 104 a aproximadamente 106, aproximadamente 106 a aproximadamente 108, o aproximadamente de 105 a aproximadamente 107 células/kg de peso corporal del individuo. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra en una dosis de al menos aproximadamente cualquiera de 1 x 105, 2* 105, 3*105, 4*105, 5*105, 6*105, 7*105, 8*105, 9*105, 1*10® 2*10® 3*10® 4*10® 5*10® 6*10® 7*10® 8*10® 9*10® 1*107 células/kg o más. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra en una dosis de aproximadamente 3x105 a aproximadamente 7*106 células/kg, o aproximadamente 3*106 células/kg.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra una sola vez. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra múltiples veces (tal como cualquiera de 2, 3, 4, 5, 6 o más veces). En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra una vez a la semana, una vez cada 2 semanas, una vez cada 3 semanas, una vez cada 4 semanas, una vez al mes, una vez cada 2 meses, una vez cada 3 meses, una vez cada 4 meses, una vez cada 5 meses, una vez cada 6 meses, una vez cada 7 meses, una vez cada 8 meses, una vez cada 9 meses o una vez al año. En algunas realizaciones, el intervalo entre administraciones es aproximadamente cualquiera de 1 semana a 2 semanas, 2 semanas a 1 mes, 2 semanas a 2 meses, 1 mes a 2 meses, 1 mes a 3 meses, 3 meses a 6 meses, o 6 meses a un año. Un experto en la técnica de la medicina puede determinar fácilmente la dosis y el régimen de tratamiento óptimos para un paciente particular monitorizando al paciente para detectar signos de enfermedad y ajustando el tratamiento en consecuencia.

Además, las dosis pueden administrarse mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra en dosis divididas, como aproximadamente una cualquiera de 2, 3, 4, 5 o más dosis. En algunas realizaciones, las dosis divididas se administran durante aproximadamente una semana. En algunas realizaciones, la dosis se divide en partes iguales. En algunas realizaciones, las dosis divididas son aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 % y aproximadamente el 50 % de la dosis total. En algunas realizaciones, el intervalo entre dosis divididas consecutivas es aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días o más. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se mantiene hasta que se produce la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden resultar útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

En algunas realizaciones, la cantidad de la composición farmacéutica es eficaz para provocar una respuesta clínica objetiva en el individuo. En algunas realizaciones, el método es para obtener una respuesta clínica objetiva en un individuo que tiene mieloma múltiple (p. ej., mieloma múltiple recidivante o refractario). En algunas realizaciones, se obtiene una respuesta clínica estricta (sCR) en el individuo.

En algunas realizaciones, la cantidad de la composición farmacéutica es eficaz para provocar la remisión de la enfermedad (parcial o completa) en el individuo. En algunas realizaciones, el método es para provocar la remisión de la enfermedad (parcial o completa) en un individuo que tiene mieloma múltiple (p. ej., mieloma múltiple recidivante o refractario). En algunas realizaciones, la remisión clínica se obtiene después de no más de aproximadamente 6 meses, 5 meses, 4 meses, 3 meses, 2 meses, 1 mes o menos después de que el individuo recibe la composición farmacéutica.

En algunas realizaciones, la cantidad de la composición farmacéutica es eficaz para prevenir la recaída o la progresión de la enfermedad del cáncer en el individuo. En algunas realizaciones, el método es para prevenir la recaída o la progresión de la enfermedad en un individuo que tiene mieloma múltiple (p. ej., mieloma múltiple recidivante o refractario). En algunas realizaciones, la recaída o progresión de la enfermedad se previene durante al menos aproximadamente 6 meses, 1 año, 2 años, 3 años, 4 años, 5 años o más.

En algunas realizaciones, la cantidad de la composición farmacéutica es eficaz para prolongar la supervivencia (tal como la supervivencia libre de enfermedad) en el individuo. En algunas realizaciones, la supervivencia se prolonga durante al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 12 o 24 meses. En algunas realizaciones, el método es para prolongar la supervivencia de un individuo que tiene mieloma múltiple (p. ej., mieloma múltiple recidivante o refractario).

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es eficaz para mejorar la calidad de vida del individuo. En algunas realizaciones, el método es para mejorar la calidad de vida de un individuo que tiene mieloma múltiple (p. ej., mieloma múltiple recidivante o refractario).

En algunas realizaciones, la cantidad de la composición farmacéutica es eficaz para inhibir el crecimiento o reducir el tamaño de un tumor sólido o linfático. En algunas realizaciones, el tamaño del tumor sólido o linfático se reduce al menos aproximadamente un 10 % (incluido, por ejemplo, al menos aproximadamente cualquiera de 20 %, 30 %, 40 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100%). En algunas realizaciones, se proporciona un método para inhibir el crecimiento o reducir el tamaño de un tumor sólido o linfático en un individuo.

En algunas realizaciones, la cantidad de la composición farmacéutica es eficaz para inhibir la metástasis tumoral en el individuo. En algunas realizaciones, se inhibe al menos aproximadamente el 10 % (incluido, por ejemplo, al menos aproximadamente cualquiera del 20 %, 30 %, 40 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %). En algunas realizaciones, el método es para inhibir la metástasis tumoral de un individuo que tiene mieloma múltiple (p. ej., mieloma múltiple recidivante o refractario). En algunas realizaciones, el método es para inhibir la metástasis a los ganglios linfáticos. En algunas realizaciones, el método es para inhibir la metástasis al pulmón. En algunas realizaciones, el método es para inhibir la metástasis al hígado. La metástasis se puede evaluar mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como mediante análisis de sangre, gammagrafías óseas, exploraciones por rayos X, exploraciones por TC, exploraciones por PET y biopsia.

VII. Kits y artículos de fabricación

Además se proporcionan kits, dosis unitarias y artículos de fabricación que comprenden cualquiera de los receptores de antígenos quiméricos o las células efectoras inmunitarias diseñadas de la invención. En algunas realizaciones, se proporciona un kit que contiene cualquiera de las composiciones farmacéuticas de la invención y preferiblemente proporciona instrucciones para su uso.

Los kits de la presente invención se encuentran en un envase adecuado. Los envases adecuados incluyen, pero no se limitan a, viales, botellas, frascos, envases flexibles (p. ej., bolsas de plástico o Mylar selladas) y similares. Opcionalmente, los kits pueden proporcionar componentes adicionales, tal como tampones e información interpretativa. Por lo tanto, la presente invención también proporciona artículos de fabricación, que incluyen viales (tales como viales sellados), botellas, frascos, envases flexibles y similares.

El artículo de fabricación puede comprender un recipiente y una etiqueta o prospecto en el recipiente o asociado con él. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden estar formados a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. Generalmente, el recipiente contiene una composición que es eficaz para tratar una enfermedad o trastorno (tal como cáncer) descrito en la presente memoria, y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de disolución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica). La etiqueta o el prospecto indica que la composición se usa para tratar la condición particular de un individuo. La etiqueta o prospecto comprenderá además instrucciones para administrar la composición al individuo. La etiqueta puede indicar instrucciones de reconstitución y/o uso. El recipiente que contiene la composición farmacéutica puede ser un vial de usos múltiples, que permite administraciones repetidas (p. ej. de 2 a 6 administraciones) de la formulación reconstituida. El prospecto se refiere a las instrucciones habitualmente incluidas en los envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones y/o advertencias relativas al uso de dichos productos terapéuticos. Además, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, disolución de Ringer y disolución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluidos otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

Los kits o artículo de fabricación pueden incluir múltiples dosis unitarias de la composición farmacéutica e instrucciones de uso, envasadas en cantidades suficientes para su almacenamiento y uso en farmacias, por ejemplo, farmacias de hospitales y farmacias de preparación de fórmulas magistrales.

Los siguientes ejemplos pretenden ser puramente ejemplares de la invención y, por lo tanto, no deben considerarse limitativos de la invención de ninguna manera. Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Ejemplos

Los ejemplos discutidos a continuación pretenden ser puramente ejemplares de la invención y no deben considerarse limitantes de la invención de ninguna manera. Los ejemplos no pretenden representar que los experimentos siguientes sean todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en peso, la temperatura está en grados centígrados y la presión es atmosférica o cercana.

Ejemplo 1. Preparación de sdAb anti-BCMA

Para desarrollar sdAb con alta afinidad de unión al BCMA, se inmunizaron llamas con un antígeno BCMA recombinante. Luego se construyó una biblioteca de presentación de fagos para identificar ejemplos de V<h>H. Se tomaron clones distintos al azar y se clasificaron según la región 3 determinante de la complementariedad de la cadena pesada (CDR3), una región que puede desempeñar un papel importante en la unión al antígeno. A continuación se describe un protocolo ejemplar. Se han descrito otros protocolos para preparar sdAb. Véase, por ejemplo, Els Pardon et al, Nature Protocol, 2014; 9(3): 674.

1. Ensayo de inmunización animal y respuesta inmune

1.1 Inmunización animal

Se mezcló un inmunógeno que comprendía una proteína BCMA humana recombinante que tenía una etiqueta Fc C-terminal (ACRO Biosystems, núm. de catálogo: BC7-H5254) con adyuvante o PBS y se inyectó a las llamas. Los animales fueron inmunizados por el proveedor de servicios (Cedarline) siete veces, típicamente con 200 |jg de inmunógeno y CFA (adyuvante completo de Freund) cada vez en intervalos de aproximadamente 1 semana a 2 semanas. Se recogieron muestras de sangre periférica en la etapa previa a la inmunización y después de la quinta y séptima inmunización. Después de múltiples rondas de inmunización, se evaluaron las reacciones inmunes de las llamas contra el antígeno diana para confirmar el título de sdAb específicos del antígeno. Se aislaron linfocitos mediante centrifugación en gradiente a partir de aproximadamente 100 ml de sangre periférica. Las células se suplementaron con RNALATER™ y se almacenaron a -80 °C. Los sueros se obtuvieron mediante centrifugación de muestras de sangre anticoagulada y se almacenaron a -80 °C.

1.2 fraccionamiento de IgG

El fraccionamiento de las subclases de IgG se llevó a cabo según el procedimiento operativo estándar de GenScript. Las subclases de IgG se fraccionaron a partir del suero de sangrado terminal utilizando resinas de proteína G y proteína A. La muestra de suero de 1 ml se cargó en una columna HP de proteína G HITRAP® de 1 ml, y la columna se lavó con 10 ml de tampón fosfato (20 mM, pH 7,0). La fracción de IgG3 (PM 100.000 Da) se eluyó con NaCl 0,15 M, ácido acético al 0,58 % (pH 3,5) y el eluato se neutralizó con Tris-HCl 1 M (pH 9,0) hasta pH 7,4. Posteriormente, la fracción de IgG1 (PM 170.000 Da) se eluyó con glicina-HCl 0,1 M (pH 2,7) y el eluato se neutralizó con Tris-HCl 1 M (pH 8,5) hasta pH 7,4. El flujo continuo de la columna HP de proteína G HITRAP® se cargó después en una columna HP de Proteína A HITRAP® de 1 ml, y la columna se lavó con 20 ml de tampón fosfato (20 mM, pH 7,0). La fracción de IgG2 (PM 100.000 Da) se eluyó con NaCl 0,15 M, ácido acético al 0,58 % (pH 4,5) y el eluato se neutralizó con Tris-HCl 1 M (pH 9,0) hasta pH 7,4. Las concentraciones de los anticuerpos IgG1, IgG2 e IgG3 purificados se determinaron mediante OD280, y la pureza de cada uno se evaluó mediante análisis SDS-PAGE tanto reductor como no reductor.

1.3 Ensayo de respuesta inmune

La respuesta inmune de las llamas se evaluó mediante ELISA, en el que se analizó la unión de las muestras de suero y las IgG purificadas a inmunógenos inmovilizados. Se evaluaron los sueros recolectados antes de la inmunización, después de la quinta inmunización y en el momento del sangrado terminal. El antígeno (es decir, proteína de antígeno humano recombinante) se diluyó en tampón de recubrimiento a 4 jg/ml. La placa de microtitulación se recubrió con antígeno diluido a 4 °C durante la noche. Luego se lavó la placa 3 veces con tampón de lavado seguido de bloqueo a temperatura ambiente durante 2 horas. Posteriormente la placa se lavó 4 veces con tampón de lavado. Se añadió a la placa una serie de sueros o IgG diluidos y se incubó a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Luego se lavó la placa 4 veces con tampón de lavado. Se añadió a la placa el anticuerpo secundario IgG anti-llama conjugado con HRP y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después del lavado, se añadió el sustrato TMB a cada pocillo y se incubó durante 10 minutos antes de detenerlo con HCl 1 M. Para cuantificar la unión, se midió la absorbancia a 450 nm para cada pocillo utilizando un espectrómetro MK3.

2. Construcción de la biblioteca de presentación de fagos V<h>H

2.1 Extracción de ARN

El ARN total se extrajo de los linfocitos aislados (de 1.1.1) usando reactivo TRIZOL® según protocolo del fabricante. La cantidad y calidad del ARN total se evaluaron mediante electroforesis en gel y se cuantificaron midiendo la absorbancia a OD260/280.

2.2 RT-PCR y amplificación de V<h>H

El ARN total se transcribió inversamente en ADNc con un cebador oligo(dT)2o usando el kit de síntesis de ADNc de 1a hebra PRIMESCRIPT™ según el protocolo del fabricante. Se diseñaron seis cebadores degenerados específicos directos y dos inversos para amplificar los fragmentos de V<h>H, en los que se habían introducido dos sitios de restricción Bg11. Los fragmentos V<h>H se amplificaron según el procedimiento operativo estándar de GenScript como se describe a continuación.

Las regiones variables de las inmunoglobulinas de cadena pesada (es decir, V<h>H) se amplificaron usando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de dos etapas. En la primera PCR, se mezclaron 100 ng de plantilla de ADNc con los cebadores CALL001 (SEQ ID NO: 374) y CALL002 (SEQ ID NO: 375). Los productos de ADN de la primera reacción de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Después de la purificación en gel, los productos de ADN de la primera PCR se usaron como plantillas en la segunda PCR. La segunda PCR se realizó con los cebadores BACK-1 (SEQ ID NO: 376), BACK-2 (SEQ ID NO: 377) y PMCF (SEQ ID NO: 378). Los productos de la segunda PCR amplificados que contienen fragmentos de V<h>H de PCR se purificaron en gel y se digirieron con enzimas, y luego se insertaron en plásmidos fagémidos. Los plásmidos recombinantes con fragmentos del gen V<h>H fueron electrotransferidos a célulasE. colipara generar la biblioteca inmunitaria de V<h>H de presentación de fagos.

El procedimiento de la reacción de PCR tiene un paso de desnaturalización inicial a 94 °C durante 7 min, seguido de 30 ciclos de 94 °C durante 1 min, 55 °C durante 1 min y 72 °C durante 1 min; y seguido de una etapa de extensión final a 72 °C durante 7 min.

2.3 Construcción de biblioteca de fagos

Los productos de V<h>H de PCR se obtuvieron mediante amplificación usando diferentes pares de cebadores. Después los productos de la PCR se digirieron con Bg11 y se purificaron en gel. Los fragmentos purificados en gel se insertaron en el vector fagémido interno de GenScript. Se construyó una biblioteca piloto para optimizar las condiciones de ligadura y transformación. Se emplearon las condiciones optimizadas de ligadura y transformación para desarrollar la biblioteca de fagémidos. Una pequeña porción de las células transformadas se diluyó y se extendió en placas 2X YT suplementadas con 100 pg/ml de ampicilina. Se contaron las colonias para calcular el tamaño de la biblioteca. Los clones positivos se cogieron aleatoriamente y se secuenciaron para evaluar la calidad de la biblioteca. El resto de las células transformadas se extendió en placas YT suplementadas con 100 pg/ml de ampicilina y glucosa al 2 %. Se rasparon los céspedes de las colonias de las placas. Se usó una pequeña alícuota de las células para el aislamiento del plásmido de la biblioteca. El resto se complementó con glicerol y se almacenó a -80 °C como existencias.

3. Selección de visualización de fagos

3.1 Bioselección

La biblioteca de fagos de V<h>H construida se cribó frente a la proteína BCMA humana recombinante y células CHO que expresan BCMA humana (es decir, células CHO-BCMA, preparadas internamente por Legend Biotec) respectivamente usando un procedimiento estándar desarrollado por GenScript. Las existencias de la biblioteca se cultivó hasta la fase logarítmica y luego la biblioteca se rescató con el fago auxiliar M13KO7 y se amplificó durante la noche a 25 °C en un agitador. Luego se precipitó el fago con PEG/NaCl, se resuspendió en PBS y se almacenó a -80 °C. Para el cribado en fase sólida, los pocillos de la microplaca se recubrieron con proteína BCMA humana recombinante en PBS a 4 °C durante la noche. Para el cribado en fase líquida, las células CHO-BCMA se bloquearon con tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 hora. Durante la etapa de recubrimiento o bloqueo, las partículas de fagos se preincubaron con el tampón de bloqueo y la proteína de control Fc en pocillos de microplacas. Después de la preincubación, se añadieron partículas de fagos a los pocillos recubiertos con proteínas BCMA o disolución de CHO-BCMA respectivamente y se incubaron durante 1 hora. Después de la incubación, los fagos no unidos y unidos de manera no específica se lavaron enjuagando los pocillos o las células CHO-BCMA con PBST seis veces suplementado con dos lavados adicionales de<p>B<s>. Las partículas de fago unidas se eluyeron con trietilamina (TEA) 100 mM y el eluato se neutralizó con Tris-HCl 1 M (pH 7,4). Luego se usó la mitad del eluato para infectar célulasE. coliTG1 en crecimiento exponencial (OD600 = 0,4-0,6) para titulación de salida.

3.2 ELISA de fagos

Se realizó ELISA en fagos para identificar clones específicos de los antígenos diana. Los clones de fagos de salida individuales se cultivaron en placas de 96 pocillos profundos y se rescataron con el fago auxiliar M13KO7 durante la noche. Para identificar los clones que se unen a proteínas antigénicas, se recubrieron placas de microtitulación ELISA de 96 pocillos con proteína BCMA humana recombinante y proteína de control Fc respectivamente en tampón de recubrimiento durante la noche a 4 °C, y luego las placas se bloquearon con tampón de bloqueo. Después del bloqueo, se añadieron a las placas aproximadamente 50 pl por pocillo de sobrenadante de fagos del cultivo celular realizado durante la noche durante 1,5 horas de incubación a 4 °C. Las placas se lavaron cuatro veces y se añadió a las placas el anticuerpo monoclonal anti-M13 conjugado con HRP para una incubación de 45 minutos a 4 °C. Las placas se lavaron nuevamente cinco veces y se añadió disolución de sustrato a los pocillos para el revelado. Se midió la absorción a 450 nm para cada pocillo.

Para identificar clones que se unen a células CHO-BCMA, las células CHO-BCMA se bloquearon con tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 hora. Después del bloqueo, se añadieron aproximadamente 20 pl por pocillo de sobrenadante de fagos del cultivo celular realizado durante la noche a las disoluciones celulares durante 1 hora de incubación a temperatura ambiente. Después de que las células se lavaron 4 veces, se añadió el anticuerpo monoclonal anti-M13 conjugado con HRP durante 30 minutos de incubación a temperatura ambiente. Las células se lavaron cinco veces y luego se añadió disolución de sustrato para el desarrollo. La absorción se midió a 450 nm. Después del cribado, se seleccionaron aleatoriamente clones de fagos positivos para ELISA y se preparó ADN a partir de los fagos resultantes usando un kit de extracción de plásmidos. Los V<h>H anti-BCMA se secuenciaron en los plásmidos.

Ejemplo 2. Preparación de receptores de antígeno quimérico BCMA monovalentes ejemplares

Una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido estructural de CAR que comprende desde el extremo N al extremo C: un dominio bisagra CD8a, un dominio transmembrana CD28, un dominio citoplasmático CD28, un dominio citoplasmático CD137 y un dominio citoplasmático CD3Z, se sintetizó químicamente y se clonó en un vector lentiviral premodificado situado más abajo y unido operativamente a un promotor constitutivo hEF1a. El vector estructural de CAR resultante se denominó "PLLV-hEF1a-8281373". Los sitios de clonación múltiple (MCS) en el vector permitieron la inserción de una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de Kozak (SEQ ID NO: 379) unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal CD8a fusionado al extremo N de un fragmento V<h>H en el vector PLLV-hEF1a-8281373, situado más arriba y unido operativamente a la secuencia estructural del CAR.

Para construir un CAR monoespecífico que tenga un único dominio V<h>H usando la estructura PLLV-hEF1a-8281373, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio V<h>H estaba operativamente unido al extremo 3' de la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido señal CD8a. La secuencia de ácido nucleico de fusión se sintetizó químicamente y se clonó en la estructura del CAR PLLV-hEF1a-8281373 mediante los sitios de restricción EcoRI (SEQ ID NO: 380: 5'-GAATTC-3') y SpeI (SEQ ID NO: 381: 5'-ACTAGT-3') mediante técnicas de clonación molecular conocidas en la técnica. La Tabla 4 enumera los vectores que se construyeron para expresar los CAR anti-BCMA monoespecíficos y monovalentes ejemplares.

Para facilitar la inserción adicional de secuencias adicionales, como un nucleótido que codifica una segunda V<h>H, al diseñar un constructo CAR monoespecífico, los sitios de restricción que incluyen HpaI (SEQ ID NO: 382: 5-GTTAAC-3'), MluI (SEQ ID NO: 383: 5-ACGCGT-3'), NsiI (SEQ ID NO: 384: 5-ATGCAT-3') se incluyeron sitios entre la secuencia de ácido nucleico del péptido señal CD8a y la secuencia de ácido nucleico V<h>H.

La mezcla de plásmidos de empaquetado de lentivirus que incluye pCMV-AR-8.74 y pMD2.G (Addgene núm. 12259) se premezcló con los vectores PLLV-hEF1a-8281373 que tenían fragmentos de V<h>H en una relación previamente optimizada con polieterimida (PEI), luego se mezclaron adecuadamente y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego se añadió gota a gota la mezcla de transfección a las células HEK293 y se mezcló suavemente. Posteriormente, las células se incubaron durante la noche en una incubadora de células a 37 ° C y 5 % de CO2. Los sobrenadantes se recogieron después de centrifugación a 4 °C, 500 g durante 10 min.

Los sobrenadantes que contenían virus se filtraron a través de un filtro de PES de 0,45 pm, seguido de una ultracentrifugación para la concentración de lentivirus. Después de la ultracentrifugación, los sobrenadantes se descartaron cuidadosamente y los gránulos de virus se enjuagaron cuidadosamente con DPBS previamente enfriado. Se dividieron alícuotas del virus correctamente y luego se almacenaron inmediatamente a -80 °C. El título del virus se determinó mediante p24 basándose en el kit de HTRF desarrollado por GenScript.

Preparación de PBMC

Se recogieron leucocitos de donantes sanos mediante aféresis y la concentración celular se ajustó a 5*10<6>células/ml en medio R10. Luego se mezclaron los leucocitos con una disolución de NaCl al 0,9 % en una relación de 1:1 (v/v).

Se añadieron 3 ml de medio lymphoprep a un tubo de centrífuga de 15 ml y se colocaron lentamente 6 ml de mezcla de linfocitos diluidos sobre el medio lymphoprep. La mezcla de linfocitos se centrifugó a 800 g durante 30 minutos sin frenos a 20 °C. Luego se recogió la capa leucocitaria de linfocitos con una pipeta de 200 pl. La fracción recolectada se diluyó al menos 6 veces con NaCl al 0,9 % o R10 para reducir la densidad de la disolución. Luego la fracción recolectada se centrifugó a 250 g durante 10 minutos a 20 °C. El sobrenadante se aspiró completamente y se añadieron 10 ml de R10 al granulado celular para resuspender el granulado celular. La mezcla se centrifugó adicionalmente a 250 g durante 10 minutos a 20 °C. Se aspiró nuevamente el sobrenadante. Se añadieron 2 ml de R10 precalentado a 37 °C con 100 lU/ml de IL-2 al granulado celular y el granulado celular se resuspendió suavemente. El número de células se determinó después de la tinción con azul tripano y esta muestra de PBM<c>estuvo lista para experimentos posteriores.

Purificación de células T

Las células T humanas se purificaron a partir de PBMC usando el kit de aislamiento de células T Miltenyi Pan (n° de cat. 130-096-535), siguiendo el protocolo del fabricante como se describe a continuación. Primero se determinó el número de células y la suspensión celular se centrifugó a 300 g durante 10 minutos. Luego se aspiró completamente el sobrenadante y los granulados celulares se resuspendieron en 40 pl de tampón por 107 células totales. Se añadieron 10 pl de cóctel de biotina-anticuerpo de células T Pan por cada 107 células totales, se mezclaron bien y se incubaron durante aproximadamente 5 minutos en el refrigerador (2~8 °C). Luego se añadieron 30 pl de tampón cada 107 células. Se añadieron 20 pl de cóctel de microperlas de células T Pan por cada 107 células. La mezcla de suspensión celular se mezcló bien y se incubó durante 10 minutos adicionales en el refrigerador (2~8 °C). Se requiere un mínimo de 500 pl para la separación magnética. Para la separación magnética, se colocó una columna LS en el campo magnético de un separador MACS adecuado. La columna se preparó enjuagando con 3 ml de tampón. Luego se aplicó la suspensión celular sobre la columna y se recogió el flujo continuo que contenía las células no marcadas, que representaban las fracciones de células T enriquecidas. Se recogieron células T adicionales lavando la columna con 3 ml de tampón y recogiendo las células no marcadas que la atravesaron. Estas células no marcadas representaron nuevamente las células T enriquecidas y se combinaron con el flujo continuo de la etapa anterior. A continuación, las células T enriquecidas agrupadas se centrifugaron y se resuspendieron en R10 100 lU/ml de IL-2.

Posteriormente, las células T preparadas se preactivaron durante 48-96 horas con un kit de activación/expansión de células T humanas (Miltenyi núm. 130-091-441) de acuerdo con el protocolo del fabricante en el que se añadieron partículas MACSiBead anti-CD3/CD28 en una relación de perla a célula de 1:2.

Ensayo de citotoxicidadin vitro

Las células T preactivadas se transdujeron con las existencias de lentivirus en presencia de 7 pg/ml de polibreno con centrifugación a 1200 g, 32 °C durante 1,5 h. Luego, las células transducidas se transfirieron a la incubadora de cultivos celulares para la expresión del transgén en condiciones adecuadas.

El día 3 o el día 7 después de la transducción, las células T transducidas se recolectaron y se incubaron conjuntamente con células tumorales en una relación de células efectoras (CAR-T) a células diana de 20:1 durante 20 horas. Las células diana eran la línea celular de mieloma múltiple humano RPMI8226.Luc, células de la línea celular humana K562.BCMA.Luc que expresaban de forma recombinante BCMA, línea celular K562.CD19.Luc que expresaba CD19 de forma recombinante, o células de la línea celular de glioblastoma humano U87MG.Luc. Todas las líneas celulares fueron diseñadas internamente para expresar luciferasa de luciérnaga. Para analizar la citotoxicidad de CAR-T en células tumorales, se prepararon reactivos de ensayo de luciferasa luminiscente ONE-GLO™ (Promega núm. E6110) según el protocolo del fabricante y se añadieron a las células cocultivadas para detectar la actividad de luciferasa restante en el pocillo. Dado que la luciferasa se expresa sólo en las células diana, la actividad de luciferasa restante en el pocillo se correlaciona directamente con el número de células diana viables en el pocillo. La actividad luciferasa máxima se obtuvo añadiendo medio de cultivo a las células diana en ausencia de células efectoras. La actividad mínima de luciferasa se determinó añadiendo Triton X-100 a una concentración final del 1 % en el momento en que se iniciaron los ensayos de citotoxicidad. La citotoxicidad específica se calculó mediante la fórmula: % de citotoxicidad específica = 100 % * (1-(RLUmuestra-RLUmin)/(RLUmáx-RLUmin)).

Se seleccionaron CAR monovalentes dirigidos a BCMA (CD269) ejemplares y se probaron en el ensayo de citotoxicidad. Como se muestra en la FIG. 1A, entre un primer grupo de BCMA CAR monovalentes probados, los clones seleccionados exhibieron diferentes niveles de citotoxicidad contra las células de la línea celular de mieloma múltiple RPMI8226.Luc, con más del 60 % de CAR-T basados en V<h>H monovalente que muestran >50 % de citotoxicidad contra células RPMI8226.Luc. Se seleccionaron los clones CAR-T basados en 269A37346, 269A37348, 269A37353 y 269A37355 para pruebas adicionales. En particular, los clones CAR-T basados en 269A37346, 269A37348, 267A37353 y 269A37355 exhibieron una potente citotoxicidad contra las células de la línea celular de mieloma múltiple RPMI8226.Luc con un aumento de más del 20 % -30 % en la destrucción de células RPMI8226.Luc mediante el tratamiento con CAR-T en comparación con células T de control no transducidas (UnT). Sin embargo, dicho aumento de citotoxicidad no se produjo contra las células de la línea celular de glioblastoma humano U87MG.Luc (véase la FIG. 1B). No se detectaron efectos de citotoxicidad significativos contra U87MG.Luc por estas células CAR-T basadas en V<h>H monovalentes en comparación con los controles UnT. La observación anterior indicó que algunos de estos clones podrían ser específicos de diana y potentes contra células positivas de BCMA.

Se evaluó un segundo grupo de BCMA CAR monovalentes ejemplares para determinar la citotoxicidadin vitro.GSS005, un CAR que comprende un scFv anti-BMCA, sirvió como control positivo. GSI026, un CAR que comprende un scFv anti-EGFRvIII, sirvió como control negativo. Como se muestra en las FIGs. 2A-2B, los clones seleccionados exhibieron diferentes niveles de citotoxicidad contra las células de mieloma múltiple RPMI8226.Luc y la línea celular estable que sobreexpresa BCMA K562.BCMA.Luc. Ningún clon mostró citotoxicidad potente contra la línea celular BCMA negativa K562.CD19.Luc (FIG. 2C). Entre estos clones, los CAR-T basados en 269B005S, 269B028S, 269B030S, 269B054S, 269B060S, 269B069S, 269B093S, 269B094S, 269B104S,269B109S,269B110Sy269B129S fueron los más potentes según los datos de citotoxicidad.

Liberación de IFNgamma

Además, se recogieron los sobrenadantes de los ensayos de cocultivoin vitropara evaluar la liberación de citoquinas inducida por CAR, p. ej., liberación de interferón gamma (es decir, IFNy). Como se muestra en la FIG. 3, las células T que expresan BCMA CAR monovalentes seleccionados liberaron altos niveles de IFN<y>al cocultivar con células diana que expresan BCMA K562.BCMA.Luc. Los CAR-T no específicos, como GSI026, o las células T no transducidas (UnT) no indujeron la liberación de IFNy en el cocultivo. Los datos de liberación de citoquinas son coherentes con los datos de citotoxicidadin vitro.

Ejemplo 3. Preparación de receptores de antígeno quimérico BCMA multivalentes ejemplares

Los CAR basados en V<h>H multivalentes se pueden construir clonando una secuencia de ácido nucleico que codifica múltiples copias de un V<h>H, o múltiples V<h>H diferentes fusionados entre sí mediante conectores peptídicos en un vector estructural del dominio señal de CAR. En la Tabla 5 se muestran constructos de BCMA CAR multivalentes ejemplares. Estos constructos se prepararon fusionando 2-3 V<h>H anti-BCMA mediante conectores peptídicos de glicina-serina, seguido de la síntesis directa de esta secuencia de fusión en combinación con una secuencia de ácido nucleico del péptido señal Kozak-CD8a, y la clonación en la estructura de CAR PLLV-hEF1a-81373 a través de los sitios de restricción EcoRI y SpeI. También se clonaron constructos monovalentes de BCMA CAR en la misma estructura de CAR PLLV-hEFla-81373 para que sirvieran como controles (p. ej., GSI5011, GSI5019 y GSI5020, Tabla 4).

Se empaquetaron vectores lentivirales que portaban genes CAR y se titularon con protocolos como se describe en el Ejemplo 2. Usando los protocolos descritos en el Ejemplo 2, se prepararon PBMC humanas a partir de sangre periférica de voluntarios para un aislamiento adicional de células T humanas primarias usando kits de aislamiento de células PanT humanas de Miltenyi. Las células T purificadas se preactivaron y expandieron usando microperlas anti-CD3/CD28 de Miltenyi como se describe en el Ejemplo 2. Las células T preactivadas se transdujeron luego con existencias de lentivirus en presencia de 7 pg/ml de polibreno mediante centrifugación a 1200 g, 32 °C durante 1,5 h. Luego, las células transducidas se transfirieron a la incubadora de cultivos celulares para la expresión del transgén en condiciones adecuadas.

Ensayo de citotoxicidadin vitro

El día 3 después de la transducción, se recolectaron células T transducidas y se incubaron conjuntamente con células tumorales. Para analizar la citotoxicidad de CAR-T en células tumorales, se añadieron reactivos de ensayo de luciferasa luminiscente ONE-GLO™ a las células cocultivadas y se midió la citotoxicidad específica para cada CAR-T como se describe en el Ejemplo 2.

En un primer experimento, se cultivaron conjuntamente células T que expresaban BCMA CAR monovalente (GSI5011), BCMA CAR bivalente (GSI5014) y BCMA CAR trivalente (GSI5015) con células RPMI8226.Luc en una relación efector a diana de 20:1 durante 20 horas. Los tres constructos CAR comprenden dominios VHH anti-BCMA del clon 269A37346. Como se muestra en la FIG. 4A, el porcentaje de lisis específico de las células RPMI8226.Luc fue 63,25 ± 2,64 % para las células CAR-T que expresan GSI5011, 61,04 ± 2,75 % para las células CAR-T que expresan GSI5014 y 59,57 ± 2,64 % para las células CAR-T que expresan GSI5015, en comparación con el 0,05 % ± 2,33 % de las células T de control no transducidas (UnT). Los BCMA CAR probados que tenían diferentes modalidades de unión a antígeno tenían una potente actividad antitumoral contra las células BCMA positivas.

En un segundo experimento, se probaron BCMA CAR bivalentes ejemplares (GSI5021-GSI5026) que tenían dos restos de unión a BCMA diferentes, 269A37353 y 269A37917. Se cultivaron conjuntamente células T diseñadas que expresaban cada BCMA CAR bivalente con células RPMI8226.Luc en una relación efector a diana de 20:1 durante 20 horas. También se probaron BCMA CAR monovalentes, GSI5019 y GSI5020, para comparar. Como se muestra en la FIG. 4B, el porcentaje específico de lisis de las células RPMI8226.Luc fue del 88,21 ± 1,29 % por las células CAR-T que expresan GSI5019, del 93,84 ± 1,13 % por las células CAR-T que expresan GSI5020, del 71,45 ± 1,79 % por las células CAR-T que expresan GSI5021, 99,80 ± 0,45 % por células Ca R-T que expresan GSI5022, 97,46 ± 0,50 % por células CAR-T que expresan GSI5023, 81,29 ± 1,27 % por células CAR-T que expresan GSI5024, 93,50 ± 0,47 % por células CAR-T que expresan GSI5025, 87,83 ± 0,23 % por células CAR-T que expresan GSI5026, respectivamente, en comparación con 13,49 % ± 1,75 % por células T de control no transducidas (UnT). Además, como se representa en la FIG. 4C, el porcentaje específico de lisis de la línea celular BCMA negativa U87MG.Luc fue de 2,84 ± 7,41 % por las células CAR-T que expresan GSI5019, 15,50 ± 2,24 % por las células CAR-T que expresan GSI5020, 6,74 ± 3,37%por las células CAR-T que expresan GSI5021, 8,03 ± 2,36%por células CAR-T que expresan GSI5022, 9,00 ± 1,88 % por células CAR-T que expresan GSI5023, 17,03 ± 2,27 % por células CAR-T que expresan GSI5024, 16,81 ± 1,98 % por células CAR-T que expresan GSI5025, -11,55 ± 5,43 % por las células c Ar -T que expresan GSI5026, en comparación con 12,49 % ± 3,79 % para las células T de control no transducidas (UnT). Los datos sugieren que los CAR bivalentes con diferentes modalidades de unión a antígeno tenían una potente actividad antitumoral contra las células BCMA positivas, pero no contra las células BCMA negativas.

En un tercer experimento, se construyeron BCMA CAR bivalentes ejemplares (es decir, BCAR001-BCAR008) que tenían dos restos de unión a BCMA diferentes, y se prepararon células c Ar -T diseñadas que expresaban los Bc Ma CAR bivalentes a partir de células T primarias obtenidas del paciente donante núm. 13 de R/R MM. Se usaron líneas celulares que expresaban luciferasa de luciérnaga desarrolladas internamente, que incluían RPMI8226 (línea celular de mieloma múltiple humano), A549 (línea celular de cáncer de pulmón humano), U87-MG (línea celular de glioblastoma humano) y Raji (línea celular de linfoma de Burkitt humano) como células diana y se cocultivaron con cada grupo de células T transducidas una al lado de la otra (con una relación de células efectoras: diana de 20:1 o 5:1) durante 20 horas en una incubadora celular a 37 °C/5 % de CO2. Una vez finalizado el cocultivo, las actividades de luciferasa que permanecían (unidades de luz relativas, RLU) se analizaron con el kit de ensayo de luciferasa luminiscente ONE-GLO™ (Promega) para evaluar la citotoxicidad de cada CAR-T. Como se muestra en las FIGs. 5A-5E, los BCMA CAR-T bivalentes tenían citotoxicidad dependiente de la dosis contra las células RPMI8226.Luc, K562.BCMA.Luc y Raji.Luc, pero poca citotoxicidad contra las células BCMA negativas A549.Luc y U87-MG.Luc. Los datos en la FIG. 5F demuestran que la citotoxicidad de las células BCMA CAR-T bivalentes contra las células tumorales es específica de BCMA ya que las células CAR-T no fueron citotóxicas contra las células K562.C38.Luc que eran CD38+/BCMA' . El K562.BCMA.Luc tratado con células CAR-T BCAR001-BCAR008 solo mostró actividades residuales limitadas de luciferasa (es decir, células viables) en comparación con las células diana tratadas con UnT (2,88 ± 0,45 %, 12,84 ± 1,67 %, 2,22 ± 0,56 %, 1,77 ± 0,14 %, 2,59 ± 0,28 %, 6,58 ± 1,19 %, 2,47 ± 0,20 %, 6,61 ± 1,47% para BCAR001-BCAR008 respectivamente, en comparación con UnT de 100 ± 3,95 %, media ± error estándar). Estos resultados demuestran una potente citotoxicidad de las células BCMA CAR-T bivalentes contra las células K562.BCMA.Luc. Las células Ca R-T BCAR001-BCAR008 no tuvieron una citotoxicidad significativa contra las células K562.CD38.Luc ya que no se detectó una disminución significativa en la actividad de luciferasa en comparación con las células diana tratadas con UnT (111,82 ± 5,11 %, 111,72 ± 3,43 %, 104,74 ± 0,24 %, 95,04 ± 2,70 %, 93,93 ± 7,23 %, 97,72 ± 1,86 %, 111,90 ± 2,01 %, 108,33 ± 4,05 %, para BCAR001-BCAR008 respectivamente, en comparación con UnT de 100 ± 6,58 %, media ± error estándar). Estos datos sugirieron que la citotoxicidad del BCMA CAR-T bivalente es dependiente de BCMA.

Liberación de IFNgamma

Además, se recogieron los sobrenadantes de ensayos de cocultivoin vitropara evaluar la liberación de citoquinas inducida por CAR (p. ej., interferón gamma, liberación de IFN<y>). Como se muestra en las FIGs. 6A-6B, la liberación de IFN<y>en los ensayos de cocultivo fue dependiente de CAR y específica de BCMA, lo que es coherente con los datos de citotoxicidadin vitro(Tabla 6).

TABLA 6. Liberación de IFN gamma en ensayos de cocultivo mediante BCMA CAR-T bivalente

RPMI8226.Luc A549.Luc K562.CD38.Luc Raji.Luc Media, pg/ml e.e. Media, pg/ml e.e. Media, pg/ml e.e. Media, pg/ml e.e.

BCAR001 1097,23 61,87 89,18 42,19 135,81 5,87 795,87 7,29 BCAR002 4651,22 1,13 503,63 130,73 361,87 49,68 3613,30 34,04 BCAR003 3569,84 108,19 243,82 1,31 265,08 3,24 3348,66 49,80 BCAR004 3077,41 110,82 161,70 12,97 128,50 17,08 2931,11 120,31 BCAR005 2850,34 20,16 170,90 8,27 141,20 17,54 2976,27 67,22 BCAR006 2023,71 37,61 223,96 6,21 215,00 17,87 1588,54 77,96 BCAR007 1912,98 2,28 239,43 1,93 289,72 1,94 1472,87 49,76 BCAR008 1798,90 76,85 258,71 19,39 171,89 6,51 1526,93 66,70 UnT 281,75 20,55 143,70 10,46 85,65 1,98 328,61 6,69

Números de copias de genes CAR integrados

Los números de copias de los genes CAR integrados para cada grupo de células T transducidas se determinó mediante un ensayo de PCR semicuantitativa (q-PCR). Brevemente, el ADN genómico de cada grupo de CAR-T se preparó con el kit celular Gentra Puregene (Qiagen). La concentración de ADN genómico se determinó mediante Nanodrop y se procesaron 10 ng de muestra de ADN genómico para un ensayo de q-PCR estandarizado con mezcla maestra para PCR a tiempo real SYBR Green plus (Toyobo) en un instrumento de q-PCR ABI núm. 7300 usando cebadores específicos de CAR (cebador directo 137P2F, SEQ ID NO: 398: 5'-GTCCTTCTCCTGTCACTGGTTAT-3' y cebador inverso 137P2R, SEQ ID NO: 399: 5'- TCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCA-3'). El número de copias relativo de cada gen CAR integrado se calculó basándose en una curva estándar establecida utilizando plásmidos que contienen secuencias diana.

Como se muestra en la Tabla 7, se integró un número elevado de copias del vector CAR en el genoma de las células T en cada preparación de CAR-T.

TABLA 7. Números de copias de integración del genoma

Ejemplo 4. Mapeo de epítopos y unión diferencial de epítopos de dos dominios V<h>H en LCAR-B38M

Se mapearon los epítopos de los cuatro dominios anti-BCMA V<h>H. Se construyó un BCMA CAR bivalente ejemplar que tiene dos dominios anti-BCMA V<h>H diferentes que se unen específicamente a diferentes epítopos de BCMA. El C<a r>bivalente/biepítopo que comprende V<h>H1 y V<h>H2, denominado LCAR-B38M CAR, es un BCMA CAR multivalente enumerado en la Tabla 5.

Ensayo de resonancia de plasmón superficial (SPR)

Cada una de las cuatro secuencias anti-BCMA V<h>H ejemplares se clonó en un vector que contenía una secuencia del fragmento Fc de IgG1 humana (hIgG1Fc) para facilitar la expresión recombinante de BCMA VHH-hIgG1Fc. Se obtuvieron y purificaron proteínas recombinantes para ensayos de SPR.

La afinidad de cada VHH-hIgG1Fc por BCMA se determinó mediante SPR usando un sistema analítico BIACORE® 2000 (GE Healthcare). Brevemente, cada proteína VHH-hIgG1Fc se acopló covalentemente a un chip sensor CM5(s) usando 4 pg/ml de VHH-hIgG1Fc. La proteína BCMA-His recombinante (ACRO Biosystems, núm. de cat. BCA-H522y) se diluyó en serie en tampón de ejecución (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, Tween-20 al 0,05 %, pH 7,4) y se inyectó a un caudal de 10 pl/min seguido de disociación. Las constantes de velocidad de asociación y disociación se determinaron utilizando el software de evaluación BIACORE® 2000 versión 3.0 (unión de Langmuir, ajuste local, modelo de unión 1:1). Las afinidades de unión de las cuatro VHH-hIgG1Fc se muestran en la Tabla 8.

TABLA 8. Afinidades de unión de las VHH-hIgG1Fc a la proteína BCMA-His humana

Ligando ka (1/Ms)kd(1/s) kD (M)

VHH1-hIgG1Fc 5,5E+04 <1,0E-05* <1,8E-10*

VHH2-hIgG1Fc 1,9E+06 1,5E-02 7,8E-09

VHH3-hIgG1Fc 3,4E+04 1,7E-04 5,1E-09

VHH4-hIgGlFc 2,1E+06 9,4E-04 4,6E-10

Unión de proteínas V<h>H-Hís recombinantes con células diana

Se construyeron proteínas Anti-BCMA V<h>H-Hís recombinantes fusionando la secuencia anti-BCMA V<h>H a una secuencia de péptido señal de albúmina humana (N'-MKWVTFISLLFLFSSAYS-C'; SEQ ID NO: 386) en el extremo N, y una etiqueta 6xHis (N'-GSGHHHHHH-C'; SEQ ID NO: 387) en el extremo C. Los codones se optimizaron aún más para una expresión óptima en células huésped de mamíferos. Las secuencias de nucleótidos obtenidas se clonaron luego en un vector de expresión de mamífero pTT5 a través de los sitios de restricción 5'-XbaI y 3'-HindIII para proporcionar plásmidos, pTT5-LAB001 (para V<h>H1), pTT5-LAB002 (para V<h>H2) y pTT5-LAB003 (para V<h>H1<x>V<h>H2).

Para obtener proteínas BCMA V<h>H recombinantes, se transfectaron transitoriamente células HEK293T con los plásmidos. Brevemente, se sembraron 5*106 células HEK293T en placas de cultivo celular de 10 cm un día antes de la transfección. Al día siguiente, las células se transfectaron con cada plásmido usando reactivo LIPOFECTAMINA™ 2000 (Thermofisher Scientific, núm. de cat.: 11668-019) siguiendo el manual del fabricante. Cuatro días después de la transfección, se recolectó el sobrenadante y los niveles de expresión de los anticuerpos se detectaron mediante ELISA usando etiqueta anti-His HRP (Biolegend, núm. cat.: 652504). Los niveles de expresión de LAB001, LAB002 y LAB003 fueron 109,31 ng/ml, 152,48 ng/ml y 396,62 ng/ml respectivamente.

Afinidades de unión de las proteínas anti-BCMA V<h>H-Hís LAB001, LAB002 y LAB003 se determinaron usando ensayos basados en células. Brevemente, las proteínas anti-BCMA V<h>H-H<ís>diluidas en serie se incubaron con 1*105 células diana (ya sea células K562.BCMA.Luc o K562.CD38.Luc, que eran líneas celulares desarrolladas internamente que expresaban de manera estable BCMA o CD39 respectivamente) a 4 °C durante 2 horas. Posteriormente, las células se centrifugaron a 300 g durante 10 min y se descartó el sobrenadante. Los gránulos celulares se resuspendieron con DPBS. Los gránulos celulares se lavaron, se centrifugaron y el sobrenadante se descartó 2 veces más. Luego los gránulos celulares se resuspendieron posteriormente con el anticuerpo de detección (Anticuerpo de etiqueta His THE™ [FITC], Cat GenScript: A01620) que contiene tampones durante 45 min a 4 °C durante 2 horas. Posteriormente, las células se centrifugaron a 300 g durante 10 min y se descartó el sobrenadante. Los gránulos celulares se lavaron, se centrifugaron y el sobrenadante se descartó 2 veces más. Las afinidades de unión de LAB001, LAB002 y LAB003 a las células K562.BCMA.Luc o K562.CD38.Luc se determinaron utilizando un citómetro de flujo ATTUn E™ Nxt. Los datos se ajustaron por GraphPad PRISM™ versión 6.0 usando una "una unión específica en un sitio con pendiente de colina".

Como se muestra en la FIG. 7A-7C, LAB001, LAB002 y LAB003 se unen específicamente a células K562.BCMA.Luc de una manera dependiente de la dosis. Las afinidades de unión son 0,079 nM, 0,035 nM y 0,0047 nM respectivamente. Ninguno de los anticuerpos mostró una unión significativa a la línea celular BCMA negativa K562.CD38.Luc. Además, LAB003 (V<h>H1xV<h>H2) mostró una afinidad de unión significativamente mayor (0,0047 nM) que cualquiera de los LAB001 (V<h>H1) o LAB002 (V<h>H2).

Unión de epítopos

BCMA (NP_001183, UniProt núm. Q02223) es una proteína transmembrana de 184 aminoácidos de longitud. El BCMA humano consiste en un dominio extracelular (ECD, residuo amino número 1-54), un dominio transmembrana (TM, residuo amino número 55-77) y un dominio citoplasmático (CD, residuo amino número 78-184). Además, el análisis de secuencia sugiere que BCM<a>no tiene ningún péptido señal reconocible en su extremo N (Laabi Y et al. (1992) EMBO J 11:3897-3904; Laabi Y et al. (1994) Nucleic Acids Res 22:1147-1154; Gras MP (1995) Int Immunol 7:1093-1106; Hong-Bing Shu y Holly Johnson (2000): Proc. Natl. Acad. Sci. USA 10.1073).

Como también lo ilustra la base de datos en línea UniProt (worldwide web.uniprot.org/uniprot/Q02223), en el ECD de BCMA se encuentran 3 enlaces disulfuro (Cys-Cys), que están en las posiciones 8 ^ 21,24 ^ 37 y 28. ^ 41 (Tabla 9). La estructura secundaria del BCMA ECD desde el extremo N hasta el extremo C consiste en una hebra beta (aa 12-15), un giro (aa 16-19), una hebra beta (aa 20-23), una hélice (aa 24 -27), una hebra beta (aa 30-32), una hélice (aa 35 - 37), un giro (aa 38-40) y un giro (aa 42-44). Una estructura de, BC<n>A ECD se muestra en la FIG. 8A, que se replica a partir de la estructura de la base de datos mundial PDB web.ebi.ac.uk/pdbe/entry/pdb/2kn1/.

TABLA 9. Secuencias de proteínas de BCMA humana

Se diseñaron péptidos epítopos de BCMA (269EP001-269EP007) como se muestra en la FIG. 8B y la tabla 10, y se sintetizaron químicamente y se biotinilaron en el extremo N-terminal. Las afinidades de unión de VHH1-hIgG1Fc o VHH2-hIgG1Fc se determinaron mediante ELISA. Brevemente, los péptidos descritos anteriormente se recubrieron en una placa ELISA MAXISORP™ a 1 pM durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, las placas se lavaron con PBST (añadir TWEEN-20 al 0,5 %) dos veces, seguido de bloqueo de la placa con BSA al 0,5 % a temperatura ambiente durante 1 h. Luego, las placas se lavaron con PBST dos veces, seguido de la adición de VHH1-hIgG1Fc o V<h>H2-hIgG1Fc diluido en serie a 10 nM por triplicado, luego se incubó a 4 °C durante 2 h. Luego, las placas se lavaron 3 veces con PBST frío, después de lo cual se añadió anti-Llama-HRP de cabra (1:1500, Bethyl Lab núm. A160) a cada pocillo y se incubaron adicionalmente a temperatura ambiente durante 1 h. Luego, las placas se lavaron 4 veces con PBST y se añadieron sustratos de TMB a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 a 30 minutos. Luego se leyeron las placas en el lector de microplacas TECAN® 10M con absorbancia a 450 nm.

TABLA 10. Secuencias peptídicas del epítopo BCMA

Como se muestra en la FIG. 9A, V<h>H1 mostró la unión más fuerte al péptido 269EP005 seguido del péptido 269EP004. Sin embargo, la unión de V<h>H1 a 269EP003 y 269EP006 fue relativamente débil en comparación con 269EP005 y 269EP004. V<h>H1 tiende a unirse a un epítopo ubicado en el péptido 269EP005 (es decir, aminoácido 24-36 de BC<m>A ECD), que contiene las estructuras secundarias de una hélice (aa 24-27), una hebra beta (aa 30-32) y una hélice (aa 35 - 37).

Como se muestra en la FIG. 9B, V<h>H2 mostró la unión más fuerte al péptido 269EP002 seguido del péptido 269EP003. Sin embargo, la unión de V<h>H1 a 269EP001 y 269EP004 fue relativamente débil en comparación con 269EP002 y 269EP003. Mientras que la primera hebra beta (aa 12-15) y la hebra beta (aa 20-23) del BCMA ECD se ubican principalmente en la secuencia cubierta por 269EP002 (aa 8-21) y 269EP003 (aa 11-23), V<h>H2 tiende a unirse a un epítopo ubicado en las dos primeras hebras beta.

Ensayo de unión competitiva

Unión diferencial de epítopos de V<h>H1 y V<h>H2 se validó además mediante un ensayo de unión competitiva basado en células. En el ensayo se usó una línea celular CHO estable que sobreexpresa BCMA humano ("CHO-BCMA").

Brevemente, se preincubaron 0,5*106 células CHO-BCMA con 12,5 ng/ml de LAB001 (que contiene la etiqueta 6xHis en el extremo C) a 4 °C durante 0,5 h por duplicado. Luego se añadió anticuerpo recombinante VHH2-hIgG1 Fc diluido en serie a cada pocillo de la placa y se incubó adicionalmente a 4 °C durante 1 h más. Después de la incubación, las células se lavaron con 500 pl de DPBS y se centrifugaron a 300 g durante 10 min. Los gránulos celulares se resuspendieron con DPBS que contenía anti-etiqueta His-FITC (1:200, Cat. GenScript: A16020), luego las células se lavaron con 500 pl de DPBS y se centrifugaron a 300 g durante 10 min. Los gránulos celulares se resuspendieron con DPBS y luego se sometieron a análisis FACS en un citómetro de flujo ATTUNE™ Nxt. Como control del ensayo, se incubó VHH2-hIgGlFc diluido en serie directamente con células CHO-BCMA sin la presencia de LAB001 siguiendo procedimientos idénticos a los anteriores, uno al lado del otro. Se usó anticuerpo FITC anti-IgG humana (específico de Fc) de cabra (Cat. Sigma Aldrich:F9512) para detectar la unión de VHH2-hIgG1Fc a las células CHO-BCMA. Como se muestra en la FIG. 10, VHH2-hIgG1Fc solo se une a CHO-BCMA de manera dependiente con la dosis. Sin embargo, VHH2-hIgG1Fc no pudo competir con la unión de V<h>H1-Hís con las células CHO-BCMA, lo que indica diferentes sitios de unión de V<h>H1 y V<h>H2 en BCMA.

Ejemplo 5. Eficacia invivode LCAR-B38M CAR-T en ratones con xenoinjerto tumoral

La eficacia antitumoralin vivode las células LCAR-B38M CAR-T se evaluó en un modelo de ratón NCG (NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/NjuCrl) que tiene un xenoinjerto de tumor de mieloma múltiple. LCAR-B38M CAR es un BCMA CAR bivalente que tiene dos dominios V<h>H anti-BCMA que se dirigen a diferentes epítopos de BCMA.

El modelo de ratón NCG se creó mediante edición secuencial CRISPR/Cas9 de los loci Prkdc e Il2rg en el ratón NOD/Nju, proporcionando un ratón coisogénico para NOD/Nju. El ratón NOD/Nju porta una mutación en el gen Sirpa (SIRP a) que permite el injerto de células madre hematopoyéticas extrañas. La desactivación de Prkdc genera un fenotipo similar a SCID que carece de una formación adecuada de células T y B. La desactivación del gen Il2rg exacerba aún más el fenotipo similar a SCID mientras además da por resultado una disminución de la producción de células NK. Por lo tanto, el ratón NCG es una cepa de ratón "triple inmunodeficiente" que está más inmunocomprometida que las cepas de ratón inmunodeficientes comúnmente usadas, incluidas SCID y ratones desnudos.

PrkdceIl2rgson parte de la familia de genes SCID (inmunodeficiencia combinada grave) que afectan la maduración y formación de células T, células B, células NK y, en menor grado, células dendríticas.Prkdccodifica la subunidad catalítica de la enzima proteína quinasa dependiente de ADN, que es necesaria para la recombinación V(D)J, un proceso necesario para propagar la diversidad de anticuerpos en células T y B en maduración.Il2rgcodifica la subunidad gamma común que se encuentra en la IL-2 y múltiples receptores de IL (IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21), que son necesarios para inducir la señalización mediada por citoquinas para la maduración de linfocitos inmaduros. (p. ej., células T, B y NK) y otros leucocitos.

Las células LCAR-B38M CAR-T se prepararon usando células T de varios donantes para analizar la fuente de células T, lo que produjo CAR-T con la mayor eficacia para matar células RPMI8226.Luc.in vitro(FIG. 11). Basado en los resultados de la FIG. 11, se prepararon células LCAR-B38M CAR-T usando células T del donante seleccionado para ensayosin vivocon animales. La FIG. 12A muestra la citotoxicidad dependiente de la dosisin vitrode este lote de células LCAR-B38M CAR-T. Para crear el xenoinjerto tumoral, se inyectó a los ratones NCG por vía intravenosa células RPMI8226.Luc. 14 días después, los ratones con injertos de tumores se trataron con células LCAR-B38M CAR-T o células T no transducidas, seguido de formación de imágenesin vivopor bioluminiscencia (BLI).

Como se muestra en las FIGs. 12B-12C, las células LCAR-B38M CAR-T fueron eficaces para erradicar las células tumorales RPMI8226.Luc injertadas en ratones NCG y rescatar a los ratones, mientras que la mayoría de los ratones en el grupo de control (UnT) murieron en un periodo de 4 semanas. Curiosamente, durante la autopsia se observaron numerosos tumores metastásicos en el hígado de todos los ratones del grupo UnT. Esta observación fue validada aún más al evaluar las actividadesex-vivode luciferasa de las muestras de tumores (FIGs. 12D-12E). Por el contrario, los ratones tratados con LCAR-B38M CAR-T no tenían tumores metastásicos en los hígados. En resumen, el estudioin vivodemuestra la potencia de las células LCAR-B38M CAR-T en la erradicación de las células de mieloma múltiple (p. ej., RPMI8226.Luc) de ratones NCG.

Ejemplo 6. Estudio de seguridad del tratamiento LCAR-B38M CAR -T en primates no humanos

La seguridad invivode las células LCAR-B38M CAR-T se evaluó en un modelo de mono cynomolgus. Las PBMC se obtuvieron de muestras de sangre periférica de dos monos (NHP núm. 120117 y NHP núm. 120545, ambos machos, de alrededor de 4 kg), y se prepararon mediante centrifugación en gradiente de densidad. Se aislaron células T de mono Cynomolgus a partir de PBMC usando el kit de aislamiento de células T Pan de primates no humanos (Miltenyi núm. 130-091-993) según el manual del fabricante. Las células T de mono preparadas se preactivaron con el kit de activación/expansión de células T de primates no humanos (Miltenyi núm. 130-092-919), IL-2 humana y suero de mono autólogo durante 3 días. Posteriormente, las células T preactivadas se transdujeron con el lentivirus LCAR-B38M, seguido de expansión durante 10 días adicionales.

3 Días antes de la infusión de células CAR-T autólogas, los monos fueron pretratados con ciclofosfamida a una dosis de 22 mg/kg de peso corporal mediante infusión intravenosa. El día de la infusión autóloga, las células se descongelaron en un baño de agua a 37 °C mediante agitación suave y se infundieron inmediatamente a los animales por vía intravenosa en un periodo de 5 minutos. Al mono NHP núm.120117 se le infundieron 5*106/kg de células CAR-T, y al mono NHP núm. 120545 se le infundieron 4*107/kg de células CAR-T.

Los monos fueron monitoreados después de la administración de células T para detectar fiebre, dificultad respiratoria, cambios en el apetito, diarrea y pérdida de peso. Se obtuvieron muestras de sangre antes y después de la administración y se examinaron para determinar el hemograma, la química sérica y los niveles de citoquinas. Como se muestra en las FIGs. 13A-13F, las células CAR-T no tuvieron toxicidad significativa en los monos.

Ejemplo 7. Un estudio clínico de LCAR-B38M CAR-T en pacientes humanos con mieloma múltiple refractario/recidivante

Se llevó a cabo un estudio clínico de fase 1/2, multicéntrico, abierto a inspección y de un solo grupo para determinar la seguridad y eficacia de las células LCAR-B38M CAR-T en el tratamiento de pacientes humanos diagnosticados con mieloma múltiple refractario o recidivante ("r/r MM"). La información del ensayo clínico se puede encontrar en la web mundial.clinicaltrials.gov, con el identificador NCT03090659.

En el estudio, los pacientes con mieloma múltiple refractario/recidivante fueron tratados con células LCAR-B38M CAR-T derivadas de células T autólogas de los pacientes. se administró una dosis total de 0,5*106 - 5*106 células/kg de peso corporal a cada paciente mediante inyección intravenosa en tres dosis divididas (20 %, 30 % y 50 % respectivamente) durante una semana (p. ej., los días 0, 2 y 6). Durante los días 1 a 30 del estudio, se monitorizó a los pacientes para detectar eventos adversos y se obtuvieron muestras de los pacientes para evaluación de laboratorio. Todos los pacientes son seguidos durante al menos 36 meses después de la administración de CAR-T.

El resultado principal del estudio mide la aparición de eventos adversos relacionados con el tratamiento según lo evaluado por los Criterios terminológicos comunes para eventos adversos (CTCAE) v4.0 dentro de 1 a 30 días después de la inyección de las células LCAR-B38M CAR-T. El resultado secundario evalúa las respuestas antimieloma inducidas por CAR-T, p. ej., determinando niveles aberrantes de inmunoglobulinas en el suero y el número de células de mieloma múltiple en la médula ósea de los pacientes antes y después de la administración de las células LCAR-B38M CAR-T. Los objetivos de eficacia del estudio incluyen proporción de respuesta completa patológica, supervivencia libre de enfermedad a los 3 años, supervivencia libre de progresión a los 3 años.

Los pacientes de 18 a 75 años son elegibles para el estudio si: (1) el paciente tiene un diagnóstico previo confirmado de mieloma múltiple activo según lo definido por los criterios actualizados del IMWG; (2) Se detecta una expresión clara de BCMA en células plasmáticas malignas de médula ósea o de un plasmocitoma mediante citometría de flujo o inmunohistoquímica; y (3) el paciente tiene mieloma múltiple refractario según lo definido por haber recibido al menos 3 regímenes de tratamiento previos, incluido bortezomib, o identificado de otro modo por los médicos clínicos; o el paciente ha recaído en mieloma múltiple según lo definido en las pautas de práctica clínica de la NCCN en Oncology: Multiple Myeloma (2016 V2).

Los siguientes pacientes están excluidos del estudio: (1) mujeres en edad fértil o que estén embarazadas o amamantando; (2) pacientes que tienen alguna infección activa y no controlada: hepatitis B, hepatitis C, VIH u otra infección viral y bacteriana fatal; (3) los pacientes que han recibido una terapia con esteroides con corticosteroides sistémicos de más de 5 mg/día de prednisona o una dosis equivalente de otro corticosteroide no están permitidos dentro del periodo de las 2 semanas previas a la leucoféresis requerida o al inicio del régimen de quimioterapia de acondicionamiento; (4) pacientes con cualquier enfermedad intercurrente no controlada o trastorno médico grave no controlado; (5) pacientes con metástasis en el SNC o afectación sintomática del SNC (incluidas neuropatías craneales o lesiones masivas y compresión de la médula espinal); (6) pacientes con antecedentes de alotrasplante de células madre, que tienen enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) aguda o crónica activa, o que requieren medicamentos inmunosupresores para la GVHD, en el periodo de los 6 meses posteriores a la inscripción; o (7) pacientes con enfermedades cutáneas autoinmunes activas tales como psoriasis u otras enfermedades autoinmunes activas tales como artritis reumatoide.

En un análisis provisional realizado en mayo de 2017, 35 pacientes con mieloma múltiple recidivante o resistente al tratamiento (refractario) recibieron tratamiento de LCAR-B38M CAR-T. Los primeros signos de eficacia del tratamiento aparecieron ya a los 10 días después de la inyección inicial de células CAR-T. En general, la tasa de respuesta objetiva fue del 100 % y 33 de 35 (94 %) pacientes tuvieron una remisión clínica evidente del mieloma (respuesta completa o respuesta parcial muy buena) en el periodo de los dos meses posteriores a la recepción de las células CAR-T.

En el momento del análisis, 19 pacientes fueron seguidos durante más de cuatro meses, un tiempo preestablecido para una evaluación completa de la eficacia según los criterios de consenso del Grupo de Trabajo Internacional sobre Mieloma (IMWG). Un paciente alcanzó una respuesta parcial y cuatro pacientes alcanzaron muy buenos criterios de remisión parcial (VgPR) en eficacia. Ningún paciente que alcanzó los criterios de Respuesta Completa Estricta ("sCR") recayó. Cinco pacientes que habían sido seguidos durante más de un año (12-14 meses) permanecieron en el estado de sCR y estaban libres de enfermedad residual mínima (es decir, no hay células cancerosas detectables en la médula ósea).

El síndrome de liberación de citoquinas ("CRS") es un efecto secundario común y potencialmente peligroso de la terapia con células CAR T. Sólo el 85% de los 35 pacientes experimentaron CRS transitorio. Los síntomas del CRS incluyen fiebre, presión arterial baja, dificultad para respirar y problemas con múltiples órganos. En la mayoría de los pacientes, los síntomas del CRS fueron leves y manejables. Sólo dos pacientes experimentaron CRS grave (grado 3), pero se recuperaron al recibir tocilizumab (un tratamiento reductor de la inflamación usado normalmente para controlar el CRS en ensayos clínicos de terapia con células CAR-T). Ningún paciente experimentó efectos secundarios neurológicos, otra complicación común y grave de la terapia con células CAR T.

Los datos provisionales del ensayo clínico demuestran una potente eficacia y seguridad del tratamiento LCAR-B38M CAR-T en pacientes con mieloma múltiple refractario/recidivante.

En un estudio clínico piloto, 3 pacientes fueron tratados con células T autólogas que expresaban un BCMA CAR monovalente, es decir, células LCAR-B27S CAR-T. El LCAR-B27S CAR (un BCMA CAR monovalente enumerado en la Tabla 4) tiene un dominio de unión a antígeno que contiene un único fragmento V<h>H que reconoce un único epítopo de la molécula BCMA. Este dominio V<h>H es idéntico al segundo dominio V<h>H del LCAR-B38M c A r biepítopo/bivalente.

En un ensayo de citotoxicidad in vitro, se prepararon células LCAR-B27S CAR-T a partir de tres pacientes con mieloma múltiple respectivamente, y también se prepararon células LCAR-B38M CAR-T respectivamente a partir de los mismos tres pacientes con mieloma múltiple como control. Ambas células CAR-T se cultivaron conjuntamente con células RPMI8226.Luc en una relación efector a diana (relación E/T) de 20:1 y 5:1 durante 20 horas. Como se muestra en la FIG. 14A, las células CAR-T se prepararon usando células T del paciente A. El porcentaje de células viables restantes, según se evaluó por la actividad de luciferasa restante en células RPMI8226.Luc, fue de 3,97 ± 0,75 % para LCAR-B38M y 3,17 % ± 0,57 % para LCAR-B27S, cuando la relación E/T era 20:1. Sin embargo, cuando la relación E/T era 5:1, LCAR-B38M mostró mayores potencias para matar células RPMI8226.Luc en comparación con LCAR-B27S (33,37 ± 0,75 % de células viables restantes para LCAR-B38M, 68,60 ± 1,60 % para LCAR- B27S). Como se muestra en la FIG. 14B, las células CAR-T se prepararon usando células T del paciente B. El porcentaje de células viables restantes, según se evaluó por la actividad de luciferasa restante en células RPMI8226.Luc, fue 4,45 ± 0,57 % para LCAR-B38M y 9,32 ±1,16 % para LCAR-B27S, cuando la relación E/T era 20:1. Sin embargo, cuando la relación E/T fue 5:1, LCAR-B38M nuevamente mostró mayores potencias de destrucción de células RPMI8226.Luc en comparación con LCAR-B27S (40,92 ± 3,00 % de células viables restantes para LCAR-B38M, 84,05 ± 1,56 % para LCAR-B27S). Como se muestra en la FIG. 14C, las células CAR-T se prepararon usando células T del paciente C. El porcentaje de células viables restantes, según se evaluó por la actividad de luciferasa restante en las células RPMI8226.Luc, fue 2,56 ± 0,88 % para LCAR-B38M y 10,12 ± 1,83 % para LCAR-B27S, cuando la relación E/T era 20:1. Sin embargo, cuando la relación E/T fue de 5:1, LCAR-B38M nuevamente mostró mayores potencias de destrucción de células RPMI8226.Luc en comparación con LCAR-B27S (29,99 ± 3,13 % de células viables restantes para LCAR-B38M, 100,93 ± 9,25 % para LCAR -B27S).

En el estudio clínico piloto, 3 pacientes fueron tratados con las células LCAR-B27S CAR-T, en el que todos los protocolos de preacondicionamiento, inyección y seguimiento fueron idénticos a los del estudio clínico con el LCAR-B38M CAR bivalente. Se administró una dosis total de 3*106 células/kg (paciente A), 5*106 células/kg (paciente B) y 7*106 células/kg de peso corporal (paciente C) de células CAR-T modificadas por LCAR-B27S autólogas a cada paciente, respectivamente, mediante inyección intravenosa en tres dosis divididas (20 %, 30 % y 50 % respectivamente) durante una semana (p. ej., los días 0, 2 y 6). Durante los días 1 a 30 del estudio, se monitorizó a los pacientes para detectar eventos adversos y se obtuvieron muestras de los pacientes para evaluación de laboratorio. Todos los pacientes fueron seguidos durante al menos 36 meses después de la administración de CAR-T.

2 pacientes de los tres alcanzaron una respuesta parcial muy buena (VgPR), pero ambos pacientes recayeron en el periodo de los 6 meses posteriores a la infusión de CAR-T. El tercer paciente no mostró ninguna respuesta clínica. En consecuencia, el IRB finalizó el estudio piloto con LCAR-B27S sin inscribir más pacientes.

La tasa de respuesta objetiva, la tasa de remisión completa y la tasa de recaída de este estudio piloto de BCMA CAR monovalente (LCAR-B27s ) y el estudio de BCMA CAR bivalente (LCAR-B38M CAR-T) se muestran en la Tabla 11 a continuación. El BCMA CAR-T bivalente tuvo una eficacia clínica superior en comparación con el BCMA CAR-T monovalente.

TABLA 11: Datos clínicos comparables de terapias con BCMA CAR-T monovalentes y bivalentes/biepítopos

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un polipéptido que comprende:

(a) un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende un primer anticuerpo de dominio único (sdAb) antiantígeno de maduración de células B (BCMA) que comprende un dominio V<h>H que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 124 y un segundo sdAb anti-BCMA que comprende un dominio V<h>H que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117;

(b) un dominio transmembrana; y

(c) un dominio de señalización intracelular.

2. El CAR según la reivindicación 1, en donde el primer sdAb anti-BCMA está ubicado en el extremo N o C del segundo sdAb anti-BCMA.

3. El CAR según la reivindicación 1 o 2, en donde el primer sdAb anti-BCMA y el segundo sdAb anti-BCMA están fusionados entre sí a través de un conector peptídico.

4. El CAR según la reivindicación 3, en donde el conector peptídico no tiene más de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud.

5. El CAR según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el dominio transmembrana deriva de una molécula seleccionada del grupo que consiste en CD8a, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 y PD1.

6. El CAR según la reivindicación 5, en donde el dominio transmembrana deriva de CD8a o CD28.

7. El CAR según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular primario de una célula efectora inmunitaria.

8. El CAR según la reivindicación 7, en donde el dominio de señalización intracelular primario deriva de CD3Z.

9. El CAR según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización coestimulador.

10. El CAR según la reivindicación 9, en donde el dominio de señalización coestimulador deriva de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandos de CD83 y combinaciones de los mismos.

11. El CAR según la reivindicación 10, en donde el dominio de señalización coestimulador comprende un dominio citoplasmático de CD28 y/o un dominio citoplasmático de CD137.

12. El CAR según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el CAR comprende además un dominio bisagra ubicado entre el extremo C del dominio de unión al antígeno extracelular y el extremo N del dominio transmembrana.

13. El CAR según la reivindicación 12, en donde el dominio bisagra deriva de CD8a.

14. El CAR según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el CAR comprende además un péptido señal ubicado en el extremo N del polipéptido.

15. El CAR según la reivindicación 14, en donde el péptido señal deriva de CD8a.

16. El CAR según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que comprende un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 300.

17. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el CAR según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

18. El ácido nucleico aislado según la reivindicación 17 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 338.

19. Un vector que comprende el ácido nucleico aislado según la reivindicación 17 o 18.

20. El vector según la reivindicación 19, que es un vector lentiviral.

21. Una célula efectora inmunitaria diseñada que comprende el CAR según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, el ácido nucleico aislado según la reivindicación 17 o 18, o el vector según la reivindicación 19 o 20.

22. La célula efectora inmunitaria diseñada según la reivindicación 21, en donde la célula efectora inmunitaria diseñada es una célula T.

23. Una composición farmacéutica que comprende la célula efectora inmunitaria diseñada según la reivindicación 21 o 22 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

24. Un CAR según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 o una composición farmacéutica según se define en la reivindicación 23 para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un individuo.

25. El CAR o la composición farmacéutica para uso según la reivindicación 24, en donde el cáncer es mieloma múltiple.