RS64925B1 - Himerni antigenski receptori koji ciljaju bcma i postupci njihove upotrebe - Google Patents

Himerni antigenski receptori koji ciljaju bcma i postupci njihove upotrebe

Info

Publication number
RS64925B1
RS64925B1 RS20231139A RSP20231139A RS64925B1 RS 64925 B1 RS64925 B1 RS 64925B1 RS 20231139 A RS20231139 A RS 20231139A RS P20231139 A RSP20231139 A RS P20231139A RS 64925 B1 RS64925 B1 RS 64925B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
domain
bcma
antibody
car
amino acid
Prior art date
Application number
RS20231139A
Other languages
English (en)
Inventor
Xiaohu Fan
Qiuchuan Zhuang
Pingyan Wang
Lin Wang
Lei Yang
Jiaying Hao
Dan Zhao
Xian He
Original Assignee
Legend Biotech Ireland Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Legend Biotech Ireland Ltd filed Critical Legend Biotech Ireland Ltd
Publication of RS64925B1 publication Critical patent/RS64925B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001116—Receptors for cytokines
    • A61K39/001117—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR] or CD30
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/421—Immunoglobulin superfamily
    • A61K40/4211—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/4214—Receptors for cytokines
    • A61K40/4215—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR], CD30
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/4221—CD20
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/4222—CD38 not IgG
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/27—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by targeting or presenting multiple antigens
    • A61K2239/29—Multispecific CARs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Opis
OBLAST OVOG PRONALASKA
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na himerne antigenske receptore koji obuhvataju antitela sa jednim domenom, i konstruisane imuna efektorske ćelije koje ciljaju BCMA, i njihove upotrebe.
POZADINA OVOG PRONALASKA
[0002] Sa razvojem imunoterapije tumora i kliničke tehnologije, imunoterapija T ćelijama himernih antigenskih receptora (CAR-T) je sada jedan od pristupa imunoterapiji tumora koja najviše obećava. Generalno, himerni antigenski receptor (CAR) obuhvata ekstracelularni antigenski vezujući domen, transmembranski domen i intracelularni signalni domen. Ekstracelularni antigenski vezujući domen može da obuhvata jednolančani varijabilni fragment (scFv) koji cilja identifikovani tumorski antigen. CAR mogu biti eksprimirani na površini T ćelija pomoću tehnika genske transfekcije. Nakon vezivanja za ciljni tumorski antigen, CAR mogu da aktiviraju T ćelije kako bi se pokrenuo konkretan anti-tumorski odgovor tako da to zavisi od antigena, bez ograničavanja na dostupnost glavnih histokompatibilnih kompleksa (MHC) specifičnih za ciljni tumorski antigen.
[0003] Antitela sa jednim domenom (sdAb) su različita od uobičajenih 4-lančanih antitela po tome što imaju jedan varijabilni domen monomernog antitelo. Na primer, kamelide i ajkule proizvode sdAb pod nazivom antitela samo teškog lanca (HcAb), kojima prirodno nedostaju laki lanci. Antigenski vezujući fragment u svakom kraku antitela samo teških lanaca kamelida ima jedan varijabilni domen teškog lanca (VHH), koji može da ima visok afinitet za antigen bez pomoći lakog lanca. Kamelidni VHH je poznat kao najmanji funkcionalni antigenski vezujući fragment molekulske mase od približno 15 kD.
[0004] Multipli mijelom (MM) je neizlečivi agresivni malignitet plazme, koji je u kategoriji neoplazije i proliferata B-ćelija u nekontrolisanom postupku u koštanoj srži, pri čemu se meša sa normalnom metaboličkom proizvodnjom krvnih zrnaca i uzrokuje bolne koštane lezije (Garfall, A.L. et al., Discovery Med.2014, 17, 37). Multipli mijelom može biti prisutan klinički sa hiperkalcemijom, renalnom insuficijencijom, anemijom, koštanim lezijama, bakterijskim infekcijama, hiperviskozitet, i amiloidozom (Robert Z. Orlowski, Cancer Cell.2013, 24(3)). Prema istraživanju i statistici, gotovo 86,000 pacijenata će svake godine biti dijagnostikovano sa mijelomom, a oko 63,000 hiljada pacijenata umire od komplikacija povezanih sa tom bolešću tokom svake godine (Becker, 2011). Zbog sve starije populacije, predviđa se da će broj slučajeva mijelom rasti iz godine u godinu. Kao mnogi kanceri, ne postoji poznati uzrok multiplog mijeloma, i nema leka. Neke terapije za multipli mijelom su slične terapijama za druge kancere, kao što je hemoterapija ili zračenje, transplantacija matičnih ćelija ili transplantacija koštane srži, ciljna terapija ili biološka terapija (George, 2014). Imunoterapije bazirane na antitelima su pokazale ključan benefit za pacijente sa hematološkim malignitetima, naročito kod nehodžkinovog limfoma B ćelija. Iako trenutne terapije za multipli mijelom često dovode do remisija, gotovo kod svih pacijenata vremenom dođe do relapsa. Postoji potreba za efektivnim imunoterapijskim agensom za lečenje multiplog mijeloma.
[0005] LCAR-B38M otkriven u trenutnom pronalasku je dvovalentno BCMA koji cilja CAR-T koje su već pokazale kliničke prednosti u smislu i bezbednosti i efikasnosti kod lečenja pacijenata sa refraktornim multiplim mijelomom ili pacijenata sa relapsom u kliničkim ispitivanju. U ranom kliničkom ispitivanju, 33 od 35 (94%) pacijenata je imalo kliničku remisiju multiplog mijeloma nakon primanja LCAR-B38M CAR-T ćelija. Većina pacijenata je imala samo blaga neželjena dejstva. Ovo ispitivanje je predstavio glavni pronalazač i na 2017 ASCO godišnji sastanak (izvod LBA3001) i na izveštavanju za medije koji je izazvao sveobuhvatno medijsko pokriće (http://www.ascopost.com/News/55713).
[0006] Sve u svemu, stopa objektivnog odgovora je bila 100%, i 33 pacijenta (94%) su imala očiglednu kliničku remisiju mijeloma (kompletan odgovor, veoma dobar delimičan odgovor, ili delimičan odgovor) tokom 2 meseca primanja CAR T ćelija. Nakon praćenja grupe tokom perioda dužeg od 4 meseca, od 19 pacijenata, 14 je postiglo stroge kriterijum potpunog odgovora, 1 pacijent je dostigao delimičan odgovor, a 4 pacijenta su postigla veoma dobre kriterijum delimične remisije u smislu efikasnosti.
WO 2016/014789 se odnosi na humanizovane molekule anti-BCMA himernog antigenskog receptora (CAR) i njihovu upotrebu u lečenju, sprečavanju, ili poboljšavanju stanja koja se odnose na B ćelije.
WO 2015/142675 se odnosi na upotrebu imunih efektorskih ćelija (npr., T ćelija, NK ćelija) konstruisanih da eksprimiraju CAR koji se vezuje za tumorski antigen kako bi se lečio kancer povezan sa eksprimiranjem pomenutog tumorskog antigena.
WO 2013/123061 se odnosi na bispecifične CAR bazirane na scFv.
[0007] Budući da je profil izvanredne efikasnosti i bezbednosti dobijen iz LCAR-B38M kliničkog ispitivanja značajno superiorniji u odnosu na nekoliko drugih BCMA CAR-T ispitivanja prijavljenih u isto vreme u ASCO, radovi su bili široko prepoznati kao "revolucionarni proboj"u polju imunoterapije. Primetno je da su svi ti BCMA CAR dizajni uobičajeni CAR u kojem se BCMA antigen vezujući domen sastoji od jednovalentnog ScFv antitela.
KRATAK SADRŽAJ OVOG PRONALASKA
[0008] Ovaj pronalazak obezbeđuje himerne antigenske receptore (CAR) koji obuhvataju VHH domene, konstruisane imune efektorske ćelije, i njihove upotrebe u imunoterapiji kancera kao što je definisano u patentnim zahtevima. Ovaj pronalazak obezbeđuje himerni antigenski receptor (CAR) koji obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigenski vezujući domen koji obuhvata prvo antitelo sa jednim domenom (sdAb) anti-B ćelijskog antigena sazrevanja (BCMA) koje obuhvata VHH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124 i drugo sdAb anti-BCMA koje obuhvata VHH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 117; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen.
[0009] U jednom načinu ostvarivanja, prvo sdAb anti-BCMA se nalazi na N-kraju ili C-kraju drugog sdAb anti-BCMA .
[0010] U jednom načinu ostvarivanja, prvo sdAb anti-BCMA i drugo sdAb anti-BCMA su međusobno spojeni peptidnim linkerom. U jednom načinu ostvarivanja, taj peptidni linker ima dužinu od najviše 50 aminokiselina.
[0011] U jednom načinu ostvarivanja, transmembranski domen je izveden iz molekula izabranog iz grupe koju čine CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U jednom načinu ostvarivanja, transmembranski domen je izveden iz CD8α ili CD28.
[0012] U jednom načinu ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije. U jednom načinu ostvarivanja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U jednom načinu ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata kostimulatorni signalni domen. U jednom načinu ostvarivanja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U jednom načinu ostvarivanja, kostimulatorni signalni domen obuhvata citoplazmatski domen CD28 i/ili citoplazmatski domen CD137.
[0013] U jednom načinu ostvarivanja, CAR dodatno obuhvata zglobni domen koji se nalazi između C-kraja ekstracelularnog antigenskog vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U jednom načinu ostvarivanja, zglobni domen je izveden iz CD8α.
[0014] U jednom načinu ostvarivanja, CAR dodatno obuhvata signalni peptid koji se nalazi na N-kraju polipeptida. U jednom načinu ostvarivanja, taj signalni peptid je izveden iz CD8α.
[0015] U jednom načinu ostvarivanja, CAR obuhvata polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 300.
[0016] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira CAR ovog pronalaska. U jednom načinu ostvarivanja, nukleinska kiselina obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 338.
[0017] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje vektor koji obuhvata izolovanu nukleinsku kiselinu ovog pronalaska. U jednom načinu ostvarivanja, vektor je lentivirusni vektor.
[0018] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje konstruisanu imunu efektorsku ćeliju koja obuhvata CAR ovog pronalaska, izolovanu nukleinsku kiselinu ovog pronalaska, ili vektor ovog pronalaska. U jednom načinu ostvarivanja, konstruisana imuna efektorska ćelija je T ćelija.
[0019] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata konstruisanu imunu efektorsku ćeliju ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0020] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje CAR ovog pronalaska ili farmaceutsku kompoziciju ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja kancera kod pojedinca. U jednom načinu ostvarivanja, taj kancer je multipli mijelom.
[0021] Predmet koji je ovde otkriven kao referenca se ne štiti.
[0022] Ovde je otkrivena referenca sdAb anti-BCMA koji obuhvata CDR regione bilo koje SEQ ID NO: 115-152.Ovde je otkrivena referenca sdAb anti-BCMA koje obuhvata bilo koje od sledećih: (1) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:39; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:77; (2) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:40; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:78; (3) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:42; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:80; (4) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:43; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:81; (5) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:82; (6) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:45; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:83; (7) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:46; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:84; (8) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:47; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:85; (9) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:11; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:49; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:87; (10) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:50; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:88; (11) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:13; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:51; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:89; (12) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:52; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:90; (13) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:91; (14) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:16; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:54; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:92; (15) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:17; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:55; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:93; (16) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:18; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:94; (17) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:57; CDR3 koji obuhvata
aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:95; (18) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:58; CDR3 koji obuhvata
aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:96; (19) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:21; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:59; CDR3 koji obuhvata
aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:97; (20) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:60; CDR3 koji obuhvata
aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:98; (21) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:61; CDR3 koji obuhvata
aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:99; (22) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:62; CDR3 koji obuhvata
aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:100; (23) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:25; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:63; CDR3 koji obuhvata
aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:101; (24) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:64; CDR3 koji obuhvata
aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:102; (25) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:65; CDR3 koji obuhvata
aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:103; (26) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:66; CDR3 koji obuhvata
aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:104; (27) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:67; CDR3 koji obuhvata
aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:105; (28) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:68; CDR3 koji obuhvata
aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:106; (29) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:69; CDR3 koji obuhvata
aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:107; (30) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:70; CDR3 koji obuhvata
aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:108; (31) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:33; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:71; CDR3 koji obuhvata
aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:109; (32) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:34; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:72; CDR3 koji obuhvata
aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:110; (33) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:35; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:73; CDR3 koji obuhvata
aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:111; (34) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:36; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:74; CDR3 koji obuhvata
aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:112; (35) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:37; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:75; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:113; ili (36) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:38; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:76; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:114. sdAb anti-BCMA uključeni u CAR pronalaska mogu da obuhvataju CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3, CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 41 i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 79 i mogu da obuhvataju CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10, CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 48 i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:86, tim redom. Ovde otkriveno kao referenca, sdAb anti-BCMA obuhvata VHH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranog iz grupe koju čine SEQ ID NO: 115, 116, 118-123, i 125-152.
[0023] Ovde je kao referenca otkriveno antitelo anti-BCMA samo teških lanaca (HCAB) ili antigen vezujući protein koji obuhvata bilo koji od prethodno opisanih sdAb anti-BCMA. Takođe otkriveni kao referenca su BCMA epitopi za koje se specifično vezuje bilo koje od prethodno opisanih sdAb anti-BCMA, i anti-BCMA antitela (kao što su sdAb anti-BCMA) koja stupaju u kompeticiju sa bilo kojim od prethodno opisanih sdAb anti-BCMA.
[0024] sdAb anti-BCMA uključena u CAR pronalaska mogu da se štite kao himerna ili humanizovana. sdAb anti-BCMA uključeno u CAR pronalaska predstavlja VHH fragment.
[0025] CAR pronalaska je BCMA himerni antigenski receptor koji obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigenski vezujući domen koji obuhvata dva sdAb anti-BCMA; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. CAR može biti opisan kao monospecifičan. CAR može biti opisan kao viševalentan. Ekstracelularni antigenski vezujući domen obuhvata najmanje dva sdAb anti-BCMA.
[0026] CAR pronalaska je viševalentni himerni antigenski receptor (CAR) koji obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigenski vezujući domen koji obuhvata prvu BCMA vezujuću grupu i drugu BCMA vezujuću grupu; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. Prva BCMA vezujuća grupa je prvi sdAb anti-BCMA, a druga BCMA vezujuća grupa je drugi sdAb anti-BCMA. Prva BCMA vezujuća grupa i druga BCMA vezujuća grupa mogu konkretno dase vezuju za isti epitop na BCMA. Alternativno, prva BCMA vezujuća grupa i druga BCMA vezujuća grupa mogu specifično da se vezuju za različite epitope na BCMA.
[0027] Ovaj pronalazak obezbeđuje viševalentni CAR kao što je definisan u patentnim zahtevima. CAR je viševalentan (kao što je dvovalentan ili trovalentan) himerni antigenski receptor koji obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigenski vezujući domen koji obuhvata prvi sdAb anti-BCMA i drugi sdAb anti-BCMA ; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. Prvo sdAb anti-BCMA i drugo sdAb anti-BCMA mogu specifično da se vezuju za isti epitop na BCMA.
Alternativno, prvo sdAb anti-BCMA i drugo sdAb anti-BCMA mogu specifično da se vezuju za različite epitope na BCMA.
[0028] U nekim načinima ostvarivanja prema viševalentnim CAR pronalaska, prvo sdAb anti-BCMA se nalazi na N-kraju drugog sdAb anti-BCMA. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb anti-BCMA se nalazi na C-kraju drugog sdAb anti-BCMA . U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb anti-BCMA i drugo sdAb anti-BCMA su direktno međusobno spojeni peptidnom vezom. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb anti-BCMA i drugo sdAb anti-BCMA su međusobno spojena peptidnim linkerom. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker ima dužinu od najviše oko 50 (kao što je najviše oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10, ili 5) aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 208-215.
[0029] U nekim načinima ostvarivanja prema CAR pronalaska, transmembranski domen je izveden iz a molekul izabranog iz grupe koju čine CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen je izveden iz CD8α ili CD28. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 193 ili 194.
[0030] U nekim načinima ostvarivanja prema CAR pronalaska, intracelularni signalni domen obuhvata primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalni domen obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 197 ili 198.
[0031] U nekim načinima ostvarivanja prema CAR pronalaska, intracelularni signalni domen obuhvata kostimulatorni signalni domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalni domen obuhvata citoplazmatski domen CD28 i/ili citoplazmatski domen CD137. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalni domen obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 195 i/ili SEQ ID NO: 196.
[0032] U nekim načinima ostvarivanja prema CAR pronalaska, CAR dodatno obuhvata zglobni domen koji se nalazi između C-kraja ekstracelularnog antigenskog vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen je izveden iz CD8α. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 192.
[0033] U nekim načinima ostvarivanja prema CAR pronalaska, CAR dodatno obuhvata signalni peptid koji se nalazi na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, signalni peptid je izveden iz molekula izabranog iz grupe koju čine CD8α, GM-CSF receptor α, i IgG1 teški lanac. U nekim načinima ostvarivanja, signalni peptid je izveden iz CD8α. U nekim načinima ostvarivanja, signalni peptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 191.
[0034] CAR pronalaska su navedeni u tabeli 5. Kao referenca je otkriveno u tabelama 4 i 5, CAR obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 216-256, 298, 299 i 306-335. Ovaj pronalazak obezbeđuje CAR koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 300-305.
[0035] Ovde otkriveno kao referenca je polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranog iz grupe koju čine SEQ ID NO: 115, 116, 118 to 123, 125 to 152, 216-256, 298, 299 i 306 do 335. Ovaj pronalazak obezbeđuje CAR koji obuhvata polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 117, 124 i 300-305.
[0036] Jedan aspekt ovog pronalaska obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sdAb anti-BCMA ili CAR pronalaska . Ovaj pronalazak obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline izabranu od SEQ ID NO: 155, 162 i 338-343. Kao referenca je otkriveno, sekvenca nukleinske kiseline je izabrana iz grupe koju čine SEQ ID NO: 153, 154, 156-161, 163-190, 257-297, 336, 337, i 344-373. U nekim načinima ostvarivanja, izolovana nukleinska kiselina dalje obuhvata prvu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira prvi CAR, pri čemu je druga sekvenca nukleinske kiseline koja kodira drugi CAR je operativno povezan sa prvom sekvencom nukleinske kiseline preko treće sekvence nukleinske kiseline koja kodira samocepajući peptid, kao što je T2A, P2A, ili F2A peptid. Pri čemu je treća sekvenca nukleinske kiseline SEQ ID NO: 385. U nekim načinima ostvarivanja, izolovana nukleinska kiselina je DNK molekul. U nekim načinima ostvarivanja, izolovana nukleinska kiselina je RNK molekul.
[0037] Jedan aspekt ovog pronalaska obezbeđuje vektor koji obuhvata izolovane nukleinske kiseline pronalaska. U nekim načinima ostvarivanja, taj vektor je ekspresioni vektor. U nekim načinima ostvarivanja, vektor predstavlja virusni vektor. U nekim načinima ostvarivanja, vektor je lentivirusni vektor. U nekim načinima ostvarivanja, taj vektor je nevirusni vektor.
[0038] Jedan aspekt ovog pronalaska obezbeđuje konstruisanu imunu efektorsku ćeliju, koja obuhvata CAR pronalaska ili bilo koje druge izolovane nukleinske kiseline pronalaska, ili bilo koji od vektora pronalaska. U nekim načinima ostvarivanja, imuna efektorska ćelija je T ćelija, NK ćelija, periferna krvna mononuklearna ćelija (PBMC), hematopoietična matična ćelija, pluripotentna matična ćelija, ili embrionska matična ćelija. U nekim načinima ostvarivanja, imuna efektorska ćelija je T ćelija.
[0039] Jedan aspekt ovog pronalaska obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata bilo koju od konstruisanih imunih efektorskih ćelija pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač. Dalje je obezbeđena farmaceutska kompozicija pronalaska za upotrebu u postupku lečenja kancera kod pojedinca. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imuna efektorska ćelija je autologna. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imuna efektorska ćelija je alogena. U nekim načinima ostvarivanja, kancer je tečni kancer. U nekim načinima ostvarivanja, kancer je multipli mijelom, akutna limfoblastična leukemija, ili hronična limfocitna leukemija. U nekim načinima ostvarivanja, taj kancer je čvrsti kancer, kao što je glioblastom. U nekim načinima ostvarivanja, taj kancer je refraktorni ili multipli mijelom sa relapsom.
[0040] Kao referenca je otkrivena farmaceutska kompozicija koja obuhvata bilo koje od prethodno opisanih sdAb anti-BCMA i farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim primerima, postoji postupak lečenja bolesti (kao što je kancer) kod pojedinca, koji obuhvata davanje pojedincu efektivne količine farmaceutske kompozicije.
[0041] Ovde su takođe obezbeđene upotrebe, komplete, i proizvodne artikle koji obuhvataju bilo koju od anti-BCMA, CAR, konstruisana Imune efektorske ćelije, izolovane nukleinske kiseline, ili vektora pronalaska.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0042]
FIG.1A-1B prikazuju rezultate in vitro ispitivanja citotoksičnosti T ćelija koje eksprimiraju primere monospecifičnih CAR koji obuhvataju razna sdAb anti-BCMA protiv RPMI8226.Luc ćelije (FIG.1A), ili U87MG.Luc ćelije (FIG.1B).
FIG.2A-2C prikazuju rezultate in vitro ispitivanja citotoksičnosti T ćelija koje eksprimiraju primere monospecifičnih CAR koji obuhvataju razna sdAb anti-BCMA protiv RPMI8226.Luc ćelije (FIG.2A), K562.BCMA.Luc ćelije (FIG.2B), ili K562.CD19.Luc ćelije (FIG.2C).
FIG.3 prikazuju rezultate in vitro ispitivanja oslobađanja IFNγ T ćelija koje eksprimiraju primere monospecifičnih CAR koji obuhvataju razna sdAb anti-BCMA protiv K562.BCMA.Luc ćelije.
FIG.4A-4C prikazuju rezultate in vitro ispitivanja citotoksičnosti T ćelija koje eksprimiraju primere viševalentnih BCMA CAR protiv RPMI8226.Luc ćelije (FIG.4A-4B) ili U87MG.Luc ćelije (FIG.4C).
FIG.5A-5E prikazuju rezultate in vitro ispitivanja citotoksičnosti T ćelija koje eksprimiraju expressing dvovalentne BCMA CAR protiv RPMI8226.Luc ćelije (FIG.5A), K562.CD19.Luc ćelije (FIG.5B), A549.Luc ćelije (FIG.5C), U87MG.Luc ćelije (FIG.5D), ili Raji.Luc ćelije (FIG.5E).
FIG.5F prikazuju rezultate in vitro ispitivanja citotoksičnosti T ćelija koje eksprimiraju dvovalentne BCMA CAR protiv K562.BCMA.Luc ćelije i K562.CD38.Luc ćelije.
FIG.6A prikazuju rezultate in vitro ispitivanja oslobađanja IFNγ T ćelija koje eksprimiraju dvovalentne BCMA CAR protiv K562.BCMA.Luc ćelije na dve različite efektorske ćelije kako bi se ciljali odnosi T ćelija.
FIG.6B prikazuju rezultate in vitro ispitivanja oslobađanja IFNγ T ćelija koje eksprimiraju dvovalentne BCMA CAR protiv RPMI8226.Luc, A549.Luc, K562.CD38.Luc i Raji.Luc ćelije.
FIG.7A-7C prikazuju vezivanje tri primera VHH fragmenta za K562.BCMA.Luc ćelije i K562.CD38.Luc ćelije (negativna kontrola).
FIG.8A prikazuje kristalnu strukturu ekstracelularnog domena BCMA. FIG.8B prikazuje BCMA peptide epitopa.
FIG.9A-9B prikazuju rezultate epitopa koji mapira ispitivanja VHH1 i VHH2.
FIG.10 prikazuju rezultate kompetetivnog ispitivanja vezivanja pomoću CHO-BCMA ćelija.
FIG.11 prikazuju in vitro citotoksičnost T ćelija izvedenih od donora koje eksprimiraju LCAR-B38M protiv RPMI8226.Luc ćelija.
FIG.12A prikazuju in vitro citotoksičnost LCAR-B38M CAR-T ćelija pripremljenih od izabranog donora protiv RPMI8226.Luc ćelija. FIG.12B-12E prikazuju in vivo anti-tumorsku aktivnost LCAR-B38M CAR-T ćelija kod mišjeg modela tumorskog ksenografta. FIG.12B prikazuje podatke o snimanju bioluminescencije kod miševa tretiranih sa LCAR-B38M CAR-T i kod miševa tretiranih netransdukovanim T ćelijama (UnT). FIG.12C prikazuje dizajn ispitivanja i snimke bioluminescencije miševa kod CAR-T grupe i UnT grupe. FIG.12D prikazuju snimke jetri od UnT-tretiranih miševa. FIG.
12E prikazuju ex vivo ispitivanja luciferaze čime se validiraju tumori u jetrama miševa tretiranih sa UnT.
FIG.13A-13F prikazuju kliničke parametre dva majmuna tretiranih sa LCAR-B38M CAR-T ćelija. U kliničke parametre koji se prate tokom ispitivanja uključuju telesnu temperaturu (FIG.13A), telesnu masu (FIG.13B), ukupan broj krvnih zrnaca (CBC, FIG.13C i 13D), kao i hemiju seruma i nivoe citokina (FIG.13E i 13F).
FIG.14A-C prikazuju in vitro ispitivanja citotoksičnosti oko LCAR-B38M CAR-T ćelija i LCAR-B27S CAR-T ćelija pripremljenih od ista tri pacijenta sa multiplim mijelomom tim redom. FIG.14A prikazuju rezultate in vitro citotoksičnosti LCAR-B38M CAR-T ćelija i LCAR-B27S CAR-T ćelija pripremljenih od pacijenta A sa multiplim mijelomom. FIG.14B prikazuje rezultate in vitro citotoksičnosti LCAR-B38M CAR-T ćelija i LCAR-B27S CAR-T ćelija pripremljenih od istog pacijenta B sa multiplim mijelomom. FIG.
14C prikazuju rezultate in vitro citotoksičnosti LCAR-B38M CAR-T ćelija i LCAR-B27S CAR-T ćelija pripremljenih od istog pacijenta C sa multiplim mijelomom.
FIG.15A upoređuje strukture CAR baziranog na VHH i uobičajenog CAR baziranog na scFv. Šematska struktura na levoj strani prikazuje primer monospecifičnog jednovalentnog CAR sa ekstracelularnim antigenskim vezujućim domenom koji obuhvata VHH domen. Šematska struktura sa desne strane prikazuje primer monospecifičnog jednovalentnog CAR sa ekstracelularnim antigenskim vezujućim domenom koji obuhvata scFv domen.
FIG.15B upoređuje strukture CAR baziran na VHH sa dva mesta vezivanja antigena i uobičajenog CAR baziranog na scFv sa dva mesta vezivanja antigena. Šematska struktura sa leve strane predstavlja primer CAR sa ekstracelularnim antigenskim vezujućim domenom koji obuhvata dva VHH domena. Ta dva VHH domena mogu biti ista ili različita. Šematska struktura sa desne strane prikazuje primer CAR sa ekstracelularnim antigenskim vezujućim domenom koji obuhvata dva scFv domena. Ta dva scFv domena mogu biti ista ili različita.
FIG.15C prikazuju šematske strukture primera dvovalentnih i bispecifičnih CAR baziranih na VHH. Šematska struktura u gornjem levom panelu prikazuje primer mono-epitopa, dvovalentnog CAR sa ekstracelularnim antigenskim vezujućim domenom koji obuhvata dva identična VHH domena, od kojih se svaki specifično vezuje za epitop 1 antigena A. Šematska struktura u gornjem desnom panelu prikazuje primer bi-epitopa, dvovalentnog CAR sa ekstracelularnim antigenskim vezujućim domenom koji obuhvata prvi VHH domen koji se specifično vezuje za epitop 1 antigena A, i drugi VHH domen koji se specifično vezuje za epitop 2 antigena A. Epitop 1 i epitop 2 antigena A mogu da se razlikuju po strukturama i/ili sekvencama. Šematska struktura u donjem levom panelu prikazuje primer bispecifičnog CAR sa ekstracelularnim antigenskim vezujućim domenom koji obuhvata prvi VHH domen koji se specifično vezuje za antigen A, i drugi VHH domen koji se specifično vezuje za antigen B. Antigen A i antigen B su različiti antigeni.
FIG.15D prikazuje šematske strukture primera CAR baziranog na VHH sa tri ili više VHH domena. CAR mogu da imaju veći broj VHH domena međusobno spojenih direktno ili putem peptidnih linkera. VHH domeni mogu biti isti ili različiti. Različiti VHH domeni mogu specifično da se vezuju za različite epitope na istom antigenu ili različitim antigenima.
FIG.15E prikazuje primere konstruisanih imunih efektorskih ćelija koje zajedno eksprimiraju dva različita CAR bazirana na VHH. Primer konstruisane imune efektorske ćelije sa leve strane panela zajednički eksprimira dva različita monospecifična, jednovalentna CAR. Primer konstruisane imune efektorske ćelije u sredini panela zajednički eksprimira monospecifičan, jednovalentan CAR i bispecifičan ili dvovalentan CAR. Primer konstruisane imune efektorske ćelije u desnom panelu zajednički eksprimira dva različita bispecifične ili dvovalentne CAR. CAR mogu da prepoznaju različite antigene.
DETALJAN OPIS OVOG PRONALASKA
[0043] Ovaj pronalazak obezbeđuje viševalentni CAR kao što je definisan u patentnim zahtevima.
Pronalazak se samim tim odnosi na himerne antigenske receptore (CAR) koji obuhvataju ekstracelularni antigenski vezujući domen koji obuhvata dva sdAb anti-BCMAs. CAR su samim tim viševalentni (kao što je dvovalentan ili trovalentan) CAR koji obuhvataju najmanje dva sdAb anti-BCMA. Ta da sdAb anti-BCMA su različita sdAb anti-BCMA . CAR i konstruisane imune ćelije koje eksprimiraju CAR ovog pronalaska su korisni agensi za lečenje kancera.
[0044] Značajno je da je ovaj pronalazak pokazao superiornu efikasnost CAR dvovalentnog epitopa pronalaska koji obuhvataju dva sdAb anti-BCMA koji ciljaju različite BCMA epitope (npr., LCAR-B38M), u lečenju multiplog mijeloma među humanim pacijentima. U prelaznoj analizi faze I/II kliničkog ispitivanja, 100% pacijenata sa relpasnim ili refraktornim multiplim mijelomom je reagovalo na lečenje LCAR-B38M CAR-T.94% pacijenata je imalo očiglednu kliničku remisiju mijeloma tokom dva meseca primanja CAR-T terapije. Pacijenti koji su postigli kriterijume potvrđene kompletne reakcije (sCR) nisu imali minimalnu preostalu bolest nakon više od godinu dana primanja terapije CAR-T. Pored toga, lečenje LCAR-B38M su pacijenti dobro podnosili jer je većina pacijenata samo imala blagi i podnošljivi sindrom oslobađanja citokina, uobičajeno neželjeno dejstvo terapije bazirane na CAR-T ćelijama. Niko od pacijenta nije imao neurološka neželjena dejstva. Poređenja radi, pilot kliničko ispitivanje jednovalentnog CAR koji obuhvata jedno sdAb anti-BCMA je pokazalo nižu stopu objektivne reakcije i stopu kompletne remisije, i veću stopu relapsa kod tretiranih pacijenata. Pre ovog pronalaska, svi BCMA CAR po kliničkim ispitivanjima su imali samo jednu BCMA vezujuću grupu u ekstracelularnom antigensomi vezujućem domenu. Poboljšana klinička efikasnost i bezbednost viševalentnih BCMA CAR ovog pronalaska su neočekivane.
[0045] Generalno, CAR pronalaska može biti opisan kao viševalentni CAR koji obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigenski vezujući domen koji obuhvata veći broj antitela sa jednim domenom (sdAb) koja se specifično vezuju za BCMA; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen.
[0046] Generalno, CAR pronalaska može biti opisan kao viševalentni CAR koji obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigenski vezujući domen koji obuhvata prvi sdAb anti-BCMA koji se specifično vezuje za prvi epitop BCMA, i drugi sdAb anti-BCMA koji se specifično vezuje za drugi epitop BCMA; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen.
[0047] Dalje otkriveni kao referenca su nova sdAb anti-BCMA i CAR koji obuhvataju jedno ili više ovde opisanih sdAb anti-BCMA.
[0048] Konstruisane imune efektorske ćelije (kao što su T ćelije) koje obuhvataju CAR pronalaska, i farmaceutske kompozicije pronalaska i farmaceutska kompozicija pronalaska za upotrebu u postupcima tretiranja kancera su takođe ovde obezbeđene.
I. Definicije
[0049] Pojam "antitelo" uključuje monoklonalna antitela (uključujući 4-lančana antitela pune dužine ili antitela samo teškim lancima pune dužine koja imaju imunoglobulinski FC region), kompozicije antitela sa poliepitopskom specifičnošću, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela, dijatela, i jednolančane molekule), kao i fragmente antitela (npr., Fab, F(ab')2, i Fv). Pojam "imunoglobulin" (Ig) se ovde koristi naizmenično sa "antitelom". Antitela koja su ovde u razmatranju uključuju antitela sa jednim domenom, kao što su antitela samo teških lanaca.
[0050] Osnovna jedinica 4-lančano antitela je heterotetramerni glikoprotein sastavljen od dva identična laka (L) lanca i dva teška (H) lanca. IgM antitelo se sastoji od 5 osnovnih heterotetramernih jedinica zajedno sa dodatnim polipeptidom pod nazivom J lanac, i sadrži 10 antigen vezujućih mesta, dok IgA antitela obuhvataju od 2-5 osnovnih 4-lančanih jedinica koje mogu da polimerizuju kako bi se obrazovali polivalentni sklopovi u kombinaciji sa J lancem. U slučaju IgG, 4-lančana jedinica je generalno oko 150,000 Daltona. Svaki L lanac je povezan sa H lancem jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok su ta dva H lanca međusobno povezana jednom ili više disulfidnih veza u zavisnosti od izotipa H lanca. Svaki H i L lanac takođe ima pravilno razmaknute intralančane disulfidne mostove. Svaki H lanac ima na N-kraju, varijabilni domen (VH) praćen sa tri konstantna domena (CH) za svaki od α i γ lanaca i četiri CHdomena za µ i ε izotipove. Svaki L lanac ima na N-kraju, varijabilni domen (VL) praćen konstantnim domenom sa njegove druge strane. VLje poravnan sa VHi CLje poravnan sa prvim konstantni domenom teškog lanca (CH1). Za određene aminokiselinske ostatke se veruje da obrazuju interfejs između lakog lanca i varijabilnih domena teških lanaca. Uparivanje VHi VLzajedno obrazuje pojedinačno antigenvezujuće mesto. Za strukturu i svojstva različitih klasa antitela, videti npr., Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr and Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, strana 71 i poglavlje 6. L lanac iz bilo koje vrste kičmenjaka može da se dodeli jednom od dva jasno različita tipa, pod nazivom kappa I lambda, bazirana na aminokiselinskim sekvencama njihovih konstantnih domena. U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena njihovih teških lanaca (CH), imunoglobulini mogu biti dodeljeni različitim klasama ili izotipovima. Postoji pet klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, sa tečkim lancima koji su označeni sa α, δ, ε, γ i µ, tim redom. γ i α klase su dalje podeljene na podklase na osnovu relativno manjih razlika u CHsekvenci i funkciji, npr., ljudi eksprimiraju sledeće podklase: IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2.
[0051] Pojam "antitelo samo teškog lanca" ili "HCAb" se odnosi na funkcionalno antitelo, koje obuhvata teške lance, ali mu nedostaju laki lanci koji se obično nalaza u 4-lančanim antitelima. Kamelidne životinje (kao što su kamile, lame, ili alpake) su poznate da proizvode HCAb.
[0052] Pojam "antitelo sa jednim domenom" ili "sdAb" se odnosi na pojedinačni antigenski vezujući polipeptid sa tri regiona za određivanje komplementarnosti (CDR). Samo sdAb može da se vezuje za antigen bez uparivanja sa odgovarajućim polipeptidom koji sadrži CDR. U nekim slučajevima, antitela sa jednim domenom su konstruisana od kamelidnih HCAb, i njihovi varijabilnih domena teških lanaca su ovde označeni kao "VHHs". Neki VHHs takođe mogu biti poznati kao nanotela. Kamelidno sdAb je jedno od najmanjih poznatih fragmenata antigen-vezujućeg antitela (videti, npr., Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-8 (1993); Greenberg et al., Nature 374:168-73 (1995); Hassanzadeh-Ghassabeh et al., Nanomedicine (Lond), 8:1013-26 (2013)). Osnovni VHH ima sledeću strukturu od N-kraja do C-kraja: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, u kojoj se FR1 do FR4 odnosi na okvirne regione 1 do 4, tim redom, i u kojima se CDR1 do CDR3 odnose na regione za određivanje komplementarnosti 1 do 3.
[0053] "Izolovano" antitelo je ono koje je identifikovano, razdvojeno i/ili oporavljeno od komponente proizvodnog okruženja (npr., prirodnog ili rekombinantnog). Poželjno, izolovani polipeptid nije u vezi sa svim drugim komponentama iz svog proizvodnog okruženja. Komponente kontaminanta proizvodnog okruženja, kao što su one koje nastaju kao rezultat rekombinantnih transfektovanih ćelija, su materijali koji se obično mešaju sa istraživanjem, dijagnostičkim ili terapeutskim upotrebama za antitelo, i mogu da uključuju enzime, hormone, i druge proteinske ili neproteinske solute. U poželjnim načinima ostvarivanja, polipeptid će biti prečišćen: (1) do više od 95 mas.% antitela ko što je određeno, na primer, Lorijevom metodom, i u nekim načinima ostvarivanja, do više od 99 mas.%; (1) do stepena dovoljnog da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminalne ili interne aminokiselinske sekvence upotrebom proteinskog sekvenatora, ili (3) do homogenosti putem SDS-PAGE u neredukujućim ili redukujućim uslovima pomoću Coomassie plave ili, poželjno, srebrne mrlje. Izolovano antitelo uključuje antitelo in situ unutar rekombinantnih T ćelija budući da najmanje jedna komponenta prirodnog okruženja antitela neće biti prisutna. Ipak obično izolovani polipeptid ili antitelo će biti pripremljeni najmanje jednom fazom prečišćavanja.
[0054] "Varijabilni region" ili "varijabilni domen" antitela se odnosi na amino-terminalne domene teškog ili lakog lanca antitela. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca mogu biti označeni sa "VH" i "VL", tim redom. Ovi domeni su generalno najvarijabilniji delovi antitela (u odnosu na druga antitela iste klase) i sadrže antigen vezujuća mesta. Antitela samo teških lanaca od kamelidnih vrsta imaju jedan varijabilni region teškog lanca, koji je označen sa "VHH". VHH je samim tim poseban tip VH.
[0055] Pojam "varijabilni" se odnosi na činjenicu da se određeni segmenti varijabilnih domena razlikuju u velikoj meri u sekvenci među antitelima. V domen posreduje u vezivanju antigena i definiše specifičnost određenog antitela za njegov određeni antigen. Međutim, varijabilnost nije jednako raspoređena preko celog luka varijabilnih domena. Umesto toga, koncentrisana je u tri segmenta pod nazivom hipervarijabilni regioni (HVR) i u varijabilnim domenima lakih lanaca i teških lanaca. Više konzervirani delovi varijabilnih domena se zovu okvirni regioni (FR). Od varijabilnih domena nativnih teških i lakih lanaca, svaki obuhvata četiri FR regiona, koji u velikoj meri usvajaju konfiguraciju betaploče, povezani sa tri HRV, koji obrazuju petlje koje povezuju a u nekim slučajevima obrazuju deo, strukture beta-ploče. HVR u svakom lancu se drže blizu na malom rastojanju FR regionima I, sa HRV iz drugog lanca, doprinose obrazovanju antigen vezujućeg mesta antitela (videti Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). Konstantni domeni nisu uključeni direktno u vezivanje antitela za antigen, već ispoljavaju efektorske funkcije, kao što je učešće antitela u ćelijskoj toksičnosti zavisnoj od antitela.
[0056] Pojam "monoklonalno antitelo" kako se ovde koristi se odnosi na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj., pojedinačna antitela koja obuhvataju tu populaciju su identična izuzev mogućih mutacija koje se javljaju prirodno i/ili post-translacionih modifikacija (npr., izomerizacija, amidacija) koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonalna antitela su izuzetno specifična, pošto su usmerena protiv pojedinačnog antigenskog mesta. Nasuprot pripremama poliklonalnog antitela koje obično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopa), svako monoklonalno antitelo je usmereno protiv pojedinačne determinante na antigen. Pored njihove specifičnosti, monoklonalna antitela su poželjna u tome što ih sintetiše hibridomska kultura ili se sintetišu rekombinanto, tako da ih nekontaminiraju drugi imunoglobulini. Modifikator "monoklonalno" označava karakter antitela kao da je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne bi trebalo da se tumači kao da mu je potrebna proizvodnja antitela bilo kojim određenim postupkom. Na primer, monoklonalna antitela koja se koriste prema ovom pronalasku mogu biti napravljena pomoću raznih tehnika, uključujući, na primer, hibridomski postupak (npr., Kohler and Milstein., Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), postupci rekombinantne DNK (videti, npr., američki pat. br.4,816,567), tehnologije prikaza faga (videti, npr., Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol.222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol.338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol.340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); and Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004), i tehnologije za proizvodnju humanih ili poput humanih antitela kod životinja koje imaju delove ili sve humane imunoglobulinske lokuse ili gene koji kodiraju humane imunoglobulinske sekvence (videti, npr., WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol.
7:33 (1993); američki pat. br.5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; i 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol.14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol.14: 826 (1996); i Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol.13: 65-93 (1995).
[0057] Pojam "golo antitelo" se odnosi na antitelo koje nije konjugovano na citotoksičnoj grupi ili radioobeležju.
[0058] Pojmovi "antitelo pune dužine", "intaktno antitelo" ili "celo antitelo" se naizmenično koriste kako bi se označilo antitelo u svojoj suštinski intaktnom obliku, nasuprot fragmenta antitela. Specifično, 4-lančana antitela pune dužine uključuju ona sa teškim i lakim lancima koja uključuju Fc region. Antitela samo teških lanaca pune dužine uključuju teški lanac (kao što je VHH) i Fc region. Konstantni domeni mogu biti konstantni domeni nativne sekvence (npr., konstantni domeni humane nativne sekvence) ili varijante njihove aminokiselinske sekvence . u nekim slučajevima, intaktno antitelo može da ima jednu ili više efektorskih funkcija.
[0059] "Fragment antitela" obuhvata deo intaktnog antitela, poželjno antigen vezujući i/ili varijabilni region intaktnog antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', F(ab')2i Fv fragmente; dijatela; linearna antitela (videti američki pat. br.5,641,870, primer 2; Zapata et al., Protein Eng.8(10): 1057-1062 [1995]); molekule jednolančanog antitela; antitela sa jednim domenom (kao što je VHH), i multispecifična antitela koja nastaju od fragmenata antitela. Digestija dva antitela papainom je proizvela dva identična antigen-vezujuća fragmenta, nazvana "Fab" fragmenti, i rezidualni "Fc" fragment, oznaku koja odražava mogućnost brze kristalizacije. Fab fragment se sastoji od čitavog L lanca zajedno sa domenom varijabilnog regiona H lanca (VH), I prvog konstantnog domena teškog lanca (CH1). Svaki Fab fragment je jednovalentan u odnosu na vezivanje antigena, tj., ima jedno antigen-vezujuće mesto.
Lečenje pepsinom antitela obezbeđuje jedan veliki F(ab')2fragment koji grubo odgovara dva disulfidno povezana Fab fragmenta sa različitim antigenski vezujućim dejstvom i dalje ima mogućnost unakrsnog povezivanja antigena. Fab' fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata po tome što imaju nekoliko dodatnih ostataka na karboksi kraju CH1 domena uključujući jedan ili više cisteina iz zglobnog regiona antitela. Fab'-SH je ovde oznaka za Fab' u kojem citeinski ostatak(ci) konstantnih domena nose slobodnu tiolsku grupu. Antitela F(ab')2fragmenta su originalno proizvedena u obliku parova Fab' fragmenta koji imaju zglobne cisteine između njih. Druga hemijska kuplovanja fragmenata antitela su takođe poznata.
[0060] Fc fragment obuhvata karboksi-terminalne delove oba H lanca koja zajedno drže disulfidi.
Efektorske funkcije antitela su određivane po sekvencama u Fc regionu, pri čemu je taj region takođe reorganizovan po Fc receptorima (FcR) pronađenim na određenim tipovima ćelija.
[0061] "Fv" je minimalni fragment antitela koji sadrži mesto potpunog prepoznavanja i vezivanja antigena. Ovaj fragment se sastoji od dimera domena varijablnog regiona jednog teškog i lakog lanca u čvrstom, nekovalentnom spoju. Od uvijanja ova dva domena proizlazi šest hipervarijabilnih petlji (po 3 petlje iz H i L lanca) koje doprinose aminokiselinskim ostacima za vezivanje antigena i daju antitelu specifičnost vezivanja antigena. Međutim, čak i jedna varijabilni domen (ili polovina Fv koja sadrži samo tri HVR specifična za antigen) ima sposobnost prepoznavanja i vezivanja antigena, iako sa nižim afinitetom od celog vezujućeg mesta.
[0062] "Jednolančani Fv" takođe skraćeno kao "sFv" ili "scFv" su fragmenti antitela koji sadrže VHi VLdomene antitela povezane u jedan polipeptidni lanac. Poželjno je da polipeptid sFv dodatno sadrži polipeptidni linker između VHi VLdomena koji omogućava sFv da obrazuje željenu strukturu za vezivanje antigena. Radi pregleda sFv, videti Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994).
[0063] "Funkcionalni fragmenti" ovde opisanih antitela sadrže deo intaktnog antitela, generalno uključujući vezivanje antigena ili varijabilni region intaktnog antitela ili Fc region antitela koje zadržava ili ima modifikovanu sposobnost vezivanja FcR. Primeri fragmenata antitela uključuju linearna antitela, jednolančane molekule antitela i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela.
[0064] Pojam "dijatela" odnosi se na male fragmente antitela pripremljene konstruisanjem fragmenata sFv (videti prethodni stav) sa kratkim linkerima (oko 5-10) ostataka) između VHi VLdomena tako da se postiže međulančano, ali ne unutarlančano uparivanje V domena, što dovodi do dvovalentnog fragmenta, tj. fragmenta koji ima dva antigen-vezujuća mesta. Bispecifična dijatela su heterodimeri dva "unakrsna" sFv fragmenta u kojima su VHi VLdomeni dva antitela prisutni na različitim polipeptidnim lancima. Dijatela su detaljnije opisana u npr., EP 404,097; WO 93/11161; Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).
[0065] Monoklonalna antitela ovde posebno uključuju "himerna" antitela (imunoglobuline) u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homologan sa odgovarajućim sekvencama u antitelima koja potiču iz određene vrste ili pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je ostatak lanca(a) identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima koja proističu iz druge vrste ili pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmentima takvih antitela, sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost (američki pat. br.4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Himerna antitela od značaja ove uključuju PRIMATTZFD<®>antitela pri čemu antigenski vezujući region antitela je izveden iz antitela proizvedenog iz, npr., imunizovanja makaki majmuna sa antigenom od značaja. Kako se ovde koristi, "humanizovano antitelo" se koristi kao podskup "himernog antitela."
[0066] "Humanizovani" oblici nehumanih (npr. štićenih) antitela su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz nehumanog imunoglobulina. U nekim načinima ostvarivanja, humanizovano antitelo je humani imunoglobulin (antitelo primaoca) u kojem su ostaci iz HVR (u nastavku definisanog) primaoca zamenjeni ostacima iz HVR nehumane vrste (antitela donora) kao što su miš, pacov, zec ili nehumani primat koji ima željenu specifičnost, afinitet i/ili kapacitet. U nekim slučajevima, okvirni ("FR") ostaci humanog imunoglobulina zamenjeni su odgovarajućim nehumanim ostacima. Dalje, humanizovana antitela mogu da sadrže ostatke koji se ne nalaze u antitelu primaoca ili u antitelu donora. Ove modifikacije mogu da se naprave za dalje poboljšanje učinka antitela, kao što je afinitet vezivanja. Generalno, humanizovano antitelo će obuhvatati uglavnom sve od najmanje jednog, a uobičajeno dva varijabilna domena, u kojima sve ili gotovo sve hipervarijabilne petlje odgovaraju onima nehumane imunoglobulinske sekvence, i sve ili uglavnom sve od FR regiona su one humane imunoglobulinske sekvence, iako FR regioni mogu da uključuju jednu ili više pojedinačnih supstitucija FR ostataka koje poboljšavaju učinak antitela, kao što je afinitet vezivanja, izomerizacija, imunogenost, itd. Broj ovih supstitucija aminokiselina u FR je obično ne više od 6 u H lancu, a u L lancu, ne više od 3.
Humanizovano antitelo će opciono takođe obuhvatati najmanje deo imunoglobulinskog konstantnog regiona (Fc), obično onog od humanog imunoglobulina. Za dodatne pojedinosti, videti, npr., Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol.
2:593-596 (1992). Videti takođe, na primer, Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech.5:428-433 (1994); i američki pat. br.6,982,321 i 7,087,409.
[0067] "Humano antitelo" je antitelo koje poseduje aminokiselinsku sekvencu koja odgovara onoj od antitela proizvedenog od strane ljudi i/ili je napravljeno pomoću bilo koje od tehnika za pravljenje humanih antitela kao što je ovde otkriveno. Ova definicija humanog antitela posebno isključuje humanizovano antitelo koje obuhvata nehumane antigen-vezujuće ostatke. Humana antitela mogu da se proizvede različitim tehnikama poznatim u ovoj oblasti, uključujući biblioteke prikaza
faga. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Za pripremu humanih monoklonalnih antitela su postupci opisani u Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Videti takođe van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Humana antitela mogu biti pripremljena primenom antigena transgenoj životinji koji je modifikovan da proizvodi takva antitela kao odgovor na antigenski izazov, ali čiji su endogeni lokusi onemogućeni, npr., imunizovani ksenomiševi (videti, npr., američki pat. br.6,075,181 i 6,150,584 vezano za XENOMOUSE<™>tehnologiju). Videti takođe, na primer, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) vezano za humana antitela koja se stvaraju putem tehnologije hibridoma humanih B-ćelija.
[0068] Pojam "hipervarijabilni region," "HVR," ili "HV," kada se ovde koristi se odnosi na regione varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i/ili obrazuju strukturno definisane petlje. Generalno, sdAb se sastoje od tri HVR (ili CDR): HVR1 (ili CDR1), HVR2 (ili CDR2) i HVR3 (ili CDR3). HVR3 prikazuje najveću raznolikost od tri HVR i veruje se da igra jedinstvenu ulogu u davanju fine specifičnosti antitelima. Videti, , Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol.3:733-736 (1996).
[0069] Pojam "region za određivanje komplementarnosti" ili "CDR" se koriste da označe hipervarijabilne regione kao što je definisano Kabatovim sistemom.Videti Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.
(1991).
[0070] Ovde je obuhvaćen određeni broj HVR delineacija koje su u upotrebi. Kabatovi regioni koji određuju komplementarnost (CDR) se baziraju na varijabilnosti sekvenci i najčešće su u upotrebi(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Chothia se umesto toga odnosi na mesto strukturnih petlji (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)). AbM HVR predstavljaju neki kompromis između Kabatovih HVR i Chothia strukturnih petlji, i koristi ih softver za modelovanje AbM antitela kompanije Oxford Molecular. "Kontaktni" HVR su bazirani na analiti dostupnih kompleksnih kristalnih struktura. Ostaci od svakog od ovih HVR su zabeleženi u tabeli 1 u nastavku.
Tabela 1. HVR delineacije.
[0071] HVR mogu da obuhvataju "produžene HVR" kao što sledi: 24-36 ili 24-34 (L1), 46-56 ili 50-56 (L2) i 89-97 ili 89-96 (L3) u VLi 26-35 (H1), 50-65 ili 49-65 (H2) i 93-102, 94-102, ili 95-102 (H3) u VH. Ostaci varijabilnog domena su numerisani prema Kabat et al., supra, za svaku od ovih definicija.
[0072] Aminokiselinski ostaci sdAb (kao što su VHH) su numerisani prema opštem numerisanju za VHdomene koje je dao Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, Md., Publication No.91), kako se primenjuju naVHH domene iz Kamelide u članku Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun.23; 240 (1-2): 185-195. Prema ovom numerisanju, FR1 od VHH uključuje aminokiselinske ostatke na položajima 1-30, CDR1 od VHH sadrži aminokiselinske ostatke na položajima 31-35, FR2 od VHH uključuje aminokiseline na položajima 36-49, CDR2 od VHH sadrži aminokiselinske ostatke na položajima 50-65, FR3 od VHH sadrži aminokiselinske ostatke na položajima 66-94, CDR3 od VHH sadrži aminokiselinske ostatke na položajima 95-102, a FR4 od VHH sadrži aminokiselinske ostatke na položajima 103-113. U tom pogledu, treba napomenuti da - kao što je dobro poznato u ovoj oblasti za VHdomene i za VHH domene - ukupan broj aminokiselinskih ostataka u svakom od CDR-ova može varirati i ne mora odgovarati ukupnom broju aminokiselinskih ostataka naznačenih Kabatovim numerisanjem (to jest, jedan ili više položaja prema Kabatovom numerisanju možda neće biti zauzeti u stvarnoj sekvenci ili stvarna sekvenca može da sadrži više aminokiselinskih ostataka od broja dopuštenog Kabatovim numerisanjem).
[0073] Ekspresija "varijabilni-domen numerisanje ostataka po sistemu Kabata" ili "numerisanje položaja aminokiselina po sistemu Kabata," i njihove varijacije, se odnosi na sistem za numerisanje koji se koristi za varijabilne domene teških lanaca ili varijabilne domene lakih lanaca kompilacije antitela kao kod Kabat et al., supra. Korišćenjem ovog sistema numerisanja, stvarna linearna sekvenca aminokiselina može da sadrži manje ili dodatne aminokiseline koje odgovaraju skraćivanju ili umetanju u FR ili HVR varijabilne domene. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može da uključuje jedno umetanje aminokiseline (ostatak 52a prema Kabatu) nakon ostatka 52 od H2 i umetnute ostatke (npr. ostatke 82a, 82b i 82c, itd. prema Kabatu) nakon FR ostatka 82 teškog lanca. Kabatovo numerisanje ostataka može da se odredi za dato antitelo poravnavanjem regiona homologije sekvence antitela sa "standardnim" Kabatovim numerisanjem sekvence.
[0074] Osim ako ovde nije drugačije naznačeno, numerisanje ostataka u teškom lancu imunoglobulina je ono za EU indeks kao kod Kabata et al., supra. "EU indeks kao kod Kabata" se odnosi na numerisanje ostataka humanog IgG1 EU antitela.
[0075] "Okvirni" ili "FR" ostaci su oni ostaci varijabilnog domena koji se razlikuju od HVR ostataka kako je ovde definisano.
[0076] "Humani konsenzusni okvir" ili "humani okvir primaoca" je okvir koji predstavlja aminokiselinske ostatke koji se najčešće pojavljuju prilikom izbora humanog imunoglobulina VLili VHokvirne sekvence. Generalno, odabir humanog imunoglobulina VLili VHsekvenci je iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Generalno, podgrupa sekvenci je podgrupa kao kod Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). Primeri uključuju za VL, podgrupa može biti podgrupa kapa I, kapa II, kapa III ili kapa IV kao kod Kabata et al., supra. Dodatno, za VH, podgrupa može biti podgrupa I, podgrupa II ili podgrupa III kao kod Kabata et al. Alternativno, ljudski konsenzusni okvir može da se izvede iz gore navedenog u kojem su određeni ostaci, kao kada se ostatak ljudskog okvira bira na osnovu njegove homologije sa okvirom donora poravnavanjem sekvence okvira donora sa kolekcijom različitih humanih okvirnih sekvenci. Humani okvir primaoca "izveden iz" humanog imunoglobulinskog okvira ili ljudskog konsenzusnog okvira može da sadrži istu njihovu aminokiselinsku sekvencu ili može da sadrži već postojeće promene aminokiselinske sekvence. U nekim načinima ostvarivanja, broj već postojećih promena aminokiselina je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje.
[0077] "Modifikacija aminokiselina" na određenom položaju, npr. Fc regiona, se odnosi na supstituciju ili brisanje specifičnog ostatka, ili umetanje najmanje jednog aminokiselinskog ostatka uz specifični ostatak. Umetanje "uz" određeni ostatak znači umetanje unutar jednog do dva njegova ostatka.
Umetanje može biti N-terminalna ili C-terminalna na konkretnom ostatku. Poželjna modifikacija aminokiseline je ovde supstitucija.
[0078] Antitelo "sazrelog afiniteta" je ono sa jednom ili više promena u jednom ili više svojih HVR koje dovode do poboljšanja afiniteta antitela za antigen, u odnosu na roditeljsko antitelo koje ne poseduje te promene. U nekim primerima, antitelo sazrelog afiniteta ima nanomolarne ili čak pikomolarne afinitete za ciljni antigen. Antitela sazrelog afiniteta proizvode se postupcima poznatim u ovoj oblasti. Na primer, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992) opisuje sazrevanje afiniteta mešanja VH- i VL-domena. Nasumičnu mutageneza HVR i/ili okvirne ostatke opisuju, na primer: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol.154(7):3310-9 (1995); i Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).
[0079] Kako se ovde koristi, pojam "specifično se vezuje," "specifično prepoznaje," ili je "specifičan za" se odnosi na merljive i reproduktivne interakcije kao što je vezivanje između cilja i antigen-vezujućeg proteina (kao što je CAR ili sdAb), koji određuje prisustvo cilja u prisustvu heterogene populacije molekula uključujući biološke molekule. Na primer, antigenski vezujući protein (kao što je CAR ili sdAb) koji specifično veže cilj (koji može biti epitop) je antigenski vezujući protein (kao što je CAR ili sdAb) koji veže ovaj cilj sa većim afinitetom, aviditetom, lakše i/ili sa dužim trajanjem nego što veže druge ciljeve. U nekim načinima ostvarivanja, stepen vezivanja antigen-vezujućeg proteina (kao što je CAR ili sdAb) za nepovezani cilj manji je od oko 10% vezivanja antigen-vezujućeg proteina (kao što je CAR ili sdAb) za cilj prema merenju, npr., radioimunom metodom (RIA). U nekim načinima ostvarivanja, antigenski vezujući protein (kao što je CAR ili sdAb) koji specifično vezuje cilj ima konstantu disocijacije (Kd) od ≦1 µM, ≦100 nM, ≦10 nM, ≦1 nM ili ≦0,1 nM . U nekim načinima ostvarivanja, antigenski vezujući protein (kao što je CAR ili sdAb) specifično vezuje epitop za protein koji je konzerviran među proteinima različitih vrsta. U nekim načinima ostvarivanja, specifično vezivanje može da uključuje, ali ne zahteva isključivo vezivanje.
[0080] Pojam "specifičnost" se odnosi na selektivno prepoznavanje antigen-vezujućeg proteina (kao što je CAR ili sdAb) za određeni epitop antigena. Prirodna antitela, na primr, su monospecifična. Pojam "multispecifičan" kako se ovde koristi označava da antigenski vezujući protein (kao što je CAR ili sdAb) ima dva ili više mesta za vezivanje antigena od kojih najmanje dva vežu različite antigene. "Bispecifičan" kako se ovde koristi označava da antigenski vezujući protein (kao što je CAR ili sdAb) ima dve različite antigen-vezujuće specifičnosti. Pojam "monospecifičan" CAR kako se ovde koristi označava antigenski vezujući protein (kao što je CAR ili sdAb) koji ima jedno ili više mesta vezivanja od kojih svako veže isti antigen.
[0081] Pojam "valentan" kako se ovde koristi označava prisustvo naznačenog broja mesta vezivanja kod antigen-vezujućeg proteina (kao što je CAR ili sdAb). Prirodno antitelo na primer ili antitelo pune dužine ima dva mesta vezivanja i dvovalentno je. Kao takvo, pojmovi "trovalentno", "četvorovalentno", "pentavalentno" i "heksavalentno" označava prisustvo dva vezujuća mesta, tri vezujuća mesta, četiri vezujuća mesta, pet vezujućih mesta, i šest vezujućih mesta, tim redom, u antigen-vezujućem proteinu (kao što je CAR ili sdAb).
[0082] "Efektorske funkcije antitela" se odnose na one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu (Fc regionu nativne sekvence ili varijanti Fc regiona aminokiselinske sekvence) antitela, i variraju sa izotipom antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: C1q vezivanje i citotoksičnost zavisnu od komplementa; vezivanje sa Fc receptorom; citotoksičnost posredovana ćelijama u zavisnosti od antitela (ADCC); fagocitoza; smanjena regulacija receptora na ćelijskoj površini (npr. B ćelijski receptori); i aktivacija B ćelija. "Smanjena ili svedena na minimum" efektorska funkcija antitela označava onu koja je smanjena za najmanje 50% (alternativno 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) iz divljeg tipa ili nemodifikovanog antitela. Stručnjak iz oblasti može lako da odredi i izmeri efektorsku funkciju antitela. U poželjnom primeru, pogođene su efektorske funkcije antitela vezivanja komplementa, citotoksičnosti zavisne od komplementa i citotoksičnosti zavisne od antitela. U nekim primerima, efektorska funkcija je eliminisana mutacijom u konstantnom regionu koja je eliminisala glikozilaciju, npr., "mutaciju bez efektora." U jednom aspektu, mutacija bez efektora je mutacija N297A ili DANA (D265A+N297A) u CH2 regionu. Shields et al., J. Biol. Chem.276 (9): 6591-6604 (2001).
Alternativno, dodatne mutacije koje rezultiraju smanjenom ili eliminiranom efektorskom funkcijom uključuju: K322A i L234A/L235A (LALA). Alternativno, efektorska funkcija može da se smanji ili eliminiše tehnikama proizvodnje, kao što je ekspresija u ćelijama domaćina koje ne glikozilišu (npr. E. coli.) ili koje dovode do promenjenog obrasca glikozilacije koji je neefektivan ili manje efektivan u promovisanju efektorske funkcije (npr., Shinkawa et al., J. Biol. Chem.278(5): 3466-3473 (2003).
[0083] "Citotoksičnost posredovana ćelijama zavisna od antitela" ili ADCC odnosi se na oblik citotoksičnosti u kojem izlučeno Ig vezano na Fc receptore (FcRs) prisutne na određenim citotoksičnim ćelijama (npr. ćelije prirodne ubice (NK), neutrofili i makrofazi) omogućavaju da se ove citotoksične efektorske ćelije specifično vezuju za ciljnu ćeliju koja nosi antigen i zatim ubijaju ciljnu ćeliju citotoksinima. Antitela "naoružavaju" citotoksične ćelije i potrebna su za ubijanje ciljnih ćelija ovim mehanizmom. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo FcyRIII, dok monociti eksprimiraju FcyRI, FcyRII i FcyRIII. Ekspresija Fc na hematopoetskim ćelijama sažeta je u tabeli 3 na strani 464 Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol.9: 457-92 (1991). Za procenu ADCC aktivnosti molekule od značaja, in vitro ADCC test, kao što je onaj opisan u američkom pat. br.5,500,362 ili 5,821,337 može da se izvede. Korisne efektorske ćelije za takva ispitivanja uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, može da se proceni ADCC aktivnost molekula od značaja in vivo, npr. u životinjskom modelu kao što je onaj otkriven u Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998).
[0084] Pojam "Fc region" se ovde koristi za definisanje C-terminalnog regiona teškog lanca imunoglobulina, uključujući prirodne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. Iako granice Fc regiona teškog lanca imunoglobulina mogu da variraju, Fc region teškog lanca humanog IgG obično se definiše da se proteže od aminokiselinskog ostatka na položaju Cys226 ili od Pro230 do njegovog karboksilnog kraja. C-terminalni lizin (ostatak 447 prema EU sistemu za numerisanje) Fc regiona može da se ukloni, na primer, tokom proizvodnje ili prečišćavanja antitela, ili rekombinantnim inženjeringom nukleinske kiseline koja kodira teški lanac antitela. Prema tome, sastav intaktnih antitela može da sadrži populacije antitela sa svim uklonjenim K447 ostacima, populacije antitela bez uklonjenih K447 ostataka i populacije antitela koje imaju mešavinu antitela sa i bez K447 ostatka. Pogodni Fc regioni nativne sekvence za upotrebu u ovde opisanim antitelima uključuju humani IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 i IgG4.
[0085] "Afinitet vezivanja" se generalno donosi na snagu ukupnog zbira nekovalentnih interakcija između jednog mesta vezivanja jednog molekula (npr. antitelo ili CAR) i njegov partner u vezivanju (npr. antigen). Osim ako nije drugačije naznačeno, kako se ovde koristi, "afinitet vezivanja" se odnosi na intrinzični afinitet vezivanja koji odražava interakciju 1:1 između članova vezujućeg para (npr. antitelo i antigen, ili CAR i antigen). Afinitet molekula X prema svom partneru Y generalno može da se prikaže konstantom disocijacije (Kd). Afinitet može da se meri uobičajenim postupcima poznatim u ovoj oblasti, uključujući one opisane ovde. Antitela sa niskim afinitetom genralno sporo vezuju antigen i imaju tendenciju da se lako odvoje, dok antitela visokog afiniteta generalno brže vezuju antigen i imaju tendenciju da ostanu duže vezana. U ovoj oblasti su poznati različiti postupci merenja afiniteta vezivanja, od kojih se svaki može koristiti. Specifični ilustrativni i primeri za merenje afiniteta vezivanja su opisani u nastavku.
[0086] "Blokirajuće" antitelo ili "antagonističko" antitelo je ono koje inhibira ili smanjuje biološku aktivnost antigena koji vezuje. U nekim primerima, blokirajuća antitela ili antagonistička antitela značajno ili potpuno inhibiraju biološku aktivnost antigena.
[0087] "Procenat (%) identičnosti sekvence aminokiselina" i "homologija" u odnosu na sekvencu peptida, polipeptida ili antitela definiše se kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidata koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u specifičnom peptidu ili polipeptidnoj sekvenci, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, kako bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, i ne uzimajući u obzir bilo kakve konzervativne supstitucije kao deo identičnosti sekvence. Poravnavanje u svrhu određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može da se postigne na različite načine koji su poznati stručnjaku iz oblasti, na primer, korišćenjem javno dostupnog računarskog softvera kao što su BLAST, BLAST-2, ALIGN ili MEGALIGN<™>(DNASTAR) softver. Stručnjaci iz oblasti mogu da odrede odgovarajuće parametre za merenje poravnanja, uključujući sve algoritme potrebne za postizanje maksimalnog poravnanja celom dužinom sekvenci koje se porede.
[0088] "Himerni antigenski receptor" ili "CAR" kako se ovde koristi se odnosi na genetski modifikovane receptore, koji mogu da se koriste za presađivanje jedne ili više specifičnosti antigena na imune efektorske ćelije, kao što su T ćelije. Neki CAR su takođe poznati kao "veštački T-ćelijski receptori", "himerni T-ćelijski receptori" ili "himerni imuni receptori". CAR obuhvata ekstracelularni antigenski vezujući domen specifičan za jedan ili više antigena (kao što su tumorski antigeni), transmembranski domen i intracelularni signalni domen T ćelije i/ili drugih receptora. "CAR-T" se odnosi na T ćeliju koja eksprimira CAR. "BCMA CAR" se odnosi na CAR koji ima ekstracelularni domen vezivanja specifičan za BCMA. "Bi-epitop CAR" se odnosi na CAR koji ima ekstracelularni domen vezivanja specifičan za dva različita epitopa na BCMA.
[0089] "Izolovani" molekul nukleinske kiseline koja kodira CAR ili ovde opisano sdAb je molekul nukleinske kiseline koji je identifikovan i odvojen od najmanje jednog kontaminiranog molekula nukleinske kiseline sa kojim je obično povezan u okruženju u kojem je proizveden. Poželjno, izolovana nukleinska kiselina nije povezana sa svim komponentama koje su povezane sa proizvodnim okruženjem. Izolovani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptide i antitela ovde su u obliku koji je različit od oblika ili okruženja u kojem se nalaze u prirodi. Izolovani molekuli nukleinske kiseline se stoga razlikuju od nukleinske kiseline koja kodira polipeptide i antitela koja ovde prirodno postoje u ćelijama.
[0090] Pojam "kontrolne sekvence" se odnosi na DNK sekvence neophodne za ekspresiju operativno povezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu domaćina. Kontrolne sekvence koje su pogodne za prokariote, na primer, uključuju promoter, opciono sekvencu operatera i vezujuće mesto ribozoma. Poznato je da eukariotske ćelije koriste promotere, poliadenilacione signale, i pojačivače.
[0091] Nukleinska kiselina je "operativno povezana" kada se postavi u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, DNK za predsekvencu ili sekretorni lider operativno povezan sa DNK za polipeptid ako se eksprimira kao predprotein koji učestvuje u izlučivanju polipeptida; promoter ili pojačivač je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju sekvence; ili je mesto vezivanja ribozoma operativno povezano sa kodirajućom sekvencom ako je postavljeno tako da olakšava translaciju. Generalno, "operativno povezan" znači da su sekvence DNK koje se povezuju susedne, a u slučaju sekretornog lidera, uzastopne i u fazi čitanja. Međutim, pojačivači ne moraju biti susedni. Povezivanje se postiže ligacijom na pogodnim restrikcionim mestima. Ako takva mesta ne postoje, koriste se sintetički oligonukleotidni adapteri ili linkeri u skladu sa uobičajenom praksom.
[0092] Pojam "vektor," kako se ovde koristi, se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji može da razmnožava drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Pojam uključuje vektor kao samoreplicirajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Određeni vektori mogu da usmeravaju ekspresiju nukleinskih kiselina za koje su operativno vezani. Takvi vektori se ovde nazivaju "ekspresioni vektori".
[0093] Kako se ovde koristi, pojam "autologni" se odnosi na bilo koji materijal izvedene iz istog pojedinca sa kojim se kasnije ponovo uvodi u pojedinca.
[0094] "Alogeni" se odnosi na kalem izveden iz različitog pojedinca iste vrste.
[0095] Pojam "transfektovan" ili "transformisan" ili "transdukovan" kako se ovde koristi se odnosi na postupak kojim se egzogena nukleinska kiselina prenosi ili uvodi u ćeliju domaćina. "Transfektovana" ili "transformisana" ili "transdukovana" ćelija je ona koja je transfektovana, transformisana ili transdukovana egzogenom nukleinskom kiselinom. Ćelija uključuje primarnu predmetnu ćeliju i njeno potomstvo.
[0096] Kako se ovde koriste, izrazi "ćelija", "ćelijska linija",i "ćelijska kultura" se naizmenično koriste i sve takve oznake uključuju potomstvo. Prema tome, reči "transfektanti" i "transfektovane ćelije" uključuju primarnu predmetnu ćeliju i kulture koje su iz nje izvedene bez obzira na broj prenosa. Takođe se podrazumeva da svo potomstvo ne mora biti potpuno identično po sadržaju DNK, zbog namernih ili nenamernih mutacija. Uključeno je varijantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je pretraženo u izvorno transformisanoj ćeliji.
[0097] Pojmovi "ćelija domaćina," "ćelijska linija domaćina," i "ćelijska kultura domaćina" se koriste naizmenično i odnose se na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćina uključuju "transformante" i "transformisane ćelije," koje uključuju primarno transformisane ćelije i potomstvo izvedeno iz njih bez obzira na broj prolaza. Potomstvo ne mora biti potpuno identično po sadržaju nukleinske kiseline roditeljskoj ćeliji, ali može da sadrži mutacije. Ovde je uključeno mutirano potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao pretraženo ili odabrano u izvorno transformisanoj ćeliji.
[0098] Kako se ovde koristi, "lečenje" ili "koji se leči" predstavlja pristup za dobijanje korisnih ili željenih rezultata uključujući kliničke rezultate. Za svrhe ovog pronalaska, korisni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali bez ograničenja na, jedan ili više od sledećih: ublažavanje jednog ili više simptoma koji nastaju od ove bolesti, smanjivanje opsega bolesti, stabilisanje bolesti (npr., sprečavanje ili odlaganje pogoršanja bolesti), sprečavanje ili odlaganje širenja (npr., metastaza) bolesti, sprečavanje ili odlaganje ponovnog vraćanja bolesti, odlaganje ili usporavanje napredovanja bolesti, poboljšavanje stope bolesti, obezbeđivanje remisije (delimične ili ukupne) bolesti, smanjenje doze jednog ili više lekova potrebnih za lečenje bolesti, odlaganje napredovanja bolesti, povećanje kvaliteta života, i/ili produžavanje preživljavanja. Takođe se pod "lečenjem" misli na smanjenje patološke posledice kancera. Upotrebe ovog pronalaska uzimaju jedan ili više aspekata lečenja.
[0099] Kako se ovde koristi, "pojedinac" ili "subjekat" se odnosi na sisara, uključujući, ali bez ograničenja na, čoveka, govedo, konja, mačku, psa, glodara ili primata. U nekim načinima ostvarivanja, taj pojedinac je čovek.
[0100] Pojam "efektivna količina" kako se ovde koristi se odnosi na količinu agensa, kao što je sdAb, konstruisana imuna efektorska ćelija, ili njihova farmaceutska kompozicija, dovoljnu da se leči naznačeni poremećaj, stanje ili bolest kao što je poboljšanje, ublažavanje, smanjenje i/ili odlaganje jednog ili više njegovih simptoma. U odnosu na kancer, efektivna količina uključuje količinu dovoljnu da izazove smanjenje tumora i/ili da smanji stopu rasta tumora (kao što je suzbijanje rasta tumora) ili da spreči ili odloži drugu neželjenu proliferaciju ćelija. U nekim načinima ostvarivanja, efektivna količina je količina dovoljna da odloži razvoj. U nekim načinima ostvarivanja, efektivna količina je količina dovoljna da spreči ili odloži ponovno pojavljivanje. Efektivna količina može da se primeni u jednoj ili više primena. Efektivna količina leka ili kompozicije može da: (i) smanji broj ćelija kancera; (ii) smanji veličinu tumora; (iii) inhibira, uspori, u određenoj meri uspori i poželjno zaustavi infiltraciju ćelija kancera u periferne organe; (iv) inhibira (tj. uspori do neke mere i poželjno zaustavi) metastazu tumora; (v) inhibira rast tumora; (vi) spreči ili odloži pojavu i/ili recidiv tumora; i/ili (vii) u određenoj meri ublaži jedan ili više simptoma povezanih sa kancerom.
[0101] "Adjuvantno okruženje" se odnosi na kliničko okruženje u kojem pojedinac u anamnezi ima kancer, i generalno (ali ne nužno) je reagovao na terapiju, što uključuje, ali nije ograničeno na, operaciju (npr. hiruršku resekciju), radioterapiju i hemoterapiju. Međutim, zbog svoje istorije kancera, za te pojedince se smatra da su u riziku od razvoja bolesti. Lečenje ili primena u "adjuvantnom okruženju" odnosi se na naknadni način lečenja. Stepen rizika (npr. kada se pojedinac u adjuvantnom okruženju smatra "visokorizičnim" ili "niskorizičnim") zavisi od nekoliko faktora, najčešće od opsega bolesti pri prvom lečenju.
[0102] "Neoadjuvantno okruženje" se odnosi na kliničko okruženje u kojem se postupak izvodi pre primarne/definitivne terapije..
[0103] Kako se ovde koristi, "odlaganje" razvoja kancera znači da se odloži, spreči, uspori, ometa, stabilizuje, i/ili odloži razvoj bolesti. Ovo odlaganje može da traje različito dugo, u zavisnosti od istorije bolesti i/ili pojedincu koji se leči. Kao što je za stručnjaka iz ove oblasti evidentno, dovoljno ili značajno odlaganje može, u stvari, da obuhvati sprečavanje, time što pojedinac ne razvij bolest. Postupak koji "odlaže" razvoj kancera je postupak koji smanjuje verovatnoću razvoja bolesti u određenom vremenskom okviru i/ili smanjuje opseg bolesti u određenom vremenskom okviru, u poređenju sa nekorišćenjem postupka. Takva poređenja se obično zasnivaju na kliničkim ispitivanjima, uz korišćenje statistički značajnog broja pojedinaca. Razvoj kancera može da se otkrije standardnim postupcima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, kompjuterizovanu aksijalnu tomografiju (CAT skeniranje), magnetsku rezonancu (MRI), ultrazvuk abdomena, testove zgrušavanja, arteriografiju ili biopsiju. Razvoj takođe može da se odnosi na napredovanje kancera koje u početku može da se otkrije i uključuje pojavu, recidiv i početak.
[0104] Pojam "farmaceutska formulacija" se odnosi na preparat koji je u takvom obliku da omogućava biološko dejstvo aktivnog sastojka da bude efektivan, i da ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za subjekata kojem se formulacija daje. Takve formulacije su sterilne. "Sterilna" formulacija je aseptična ili ne sadrži žive mikroorganizme i njihove pore.
[0105] "Nosači" kako se ovde koristi uključuje farmaceutski prihvatljive nosače, ekscipijense, ili stabilizatore koji su netoksični za ćeliju ili sisara koji je izložen dozama i koncentracijama u upotrebi.
Često je fiziološki prihvatljiv nosač vodeni pH puferisani rastvor. Primeri fiziološki prihvatljivih nosača uključuju pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidansi uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijumov hlorid; heksametonijumhlorid; benzalkonijum-hlorid, benzetonijum-hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni kao što su metil ili propil paraben; katehol; rzsorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptid male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteini, kao što su serumski albumin, želatina ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatna sredstva kao što je EDTA; šećeri kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; protuioni koji stvaraju so kao što je natrijum; metalni kompleksi (npr. Zn-proteinski kompleksi); i/ili nejonske surfaktante kao što su TWEEN<™>, polietilen glikol (PEG) i PLURONICS<™>ili polietilen glikol (PEG).
[0106] "Razblaživač" od značaja je onaj koji je farmaceutski prihvatljiv (siguran i netoksičan za davanje ljudima) i koristan je za pripremu tečne formulacije, kao što je formulacija koja se rekonstituiše nakon liofilizacije. Primeri razblaživača uključuju sterilnu vodu, bakteriostatsku vodu za injekcije (BWFI), pH puferisani rastvor (npr. fosfatno puferisani fiziološki rastvor), sterilni slani rastvor, Ringerov rastvor ili rastvor dekstroze. U alternativnom načinu ostvarivanja, razblaživači mogu da uključuju vodene rastvore soli i/ili pufere.
[0107] "Konzervans" je jedinjenje koje može da se doda u formulacije kako bi se smanjila bakterijska aktivnost. Dodavanje konzervansa može, na primer, da olakša proizvodnju formulacije za višestruku upotrebu (više doza). Primeri potencijalnih konzervansa uključuju oktadecildimetilbenzil amonijumov hlorid, heksametonijum-hlorid, benzalkonijum-hlorid (mešavina alkilbenzildimetilamonijevih hlorida u kojoj su alkilne grupe predstavljaju dugolančana jedinjenja) i benzetonijum-hlorid. Ostale vrste konzervansa uključuju aromatske alkohole kao što su fenol, butil i benzil alkohol, alkil parabene kao što su metil ili propil paraben, katehol, rezorcinol, cikloheksanol, 3-pentanol i m-krezol. Najpoželjniji konzervans ovde je benzil alkohol.
[0108] "Stabilna" formulacija je ona u kojoj protein u njoj suštinski zadržava svoju fizičku i hemijsku stabilnost i integritet nakon skladištenja. Razne analitičke tehnike za merenje stabilnosti proteina dostupne su u ovoj oblasti i pregledane su u Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev.10: 29-90 (1993). Stabilnost može da se meri izabranoj temperaturi za izabrano vremensko razdoblje. Za brzi skrining, formulacija može da se drži na 40°C tokom 2 nedelje do 1 meseca, i tokom tog vremena se meri stabilnost. Ako je potrebno da se formulacija čuva na 2-8°C, generalno bi formulacija trebalo da bude stabilna 30°C ili 40°C najmanje 1 mesec i/ili stabilna na 2-8°C najmanje 2 godine. Tamo gde je potrebno da se formulacija čuva na 30°C, generalno bi formulacija trebalo da bude stabilna najmanje 2 godine na 30°C i/ili stabilna na 40°C najmanje 6 meseci. Na primer, stepen agregacije tokom skladištenja može da se koristi kao pokazatelj stabilnosti proteina. Prema tome, "stabilna" formulacija može biti ona u kojoj je manje od oko 10%, a poželjno manje od oko 5% proteina prisutno kao agregat u formulaciji. U drugim načinima ostvarivanja, može da se odredi bilo kakvo povećanje stvaranja agregata tokom skladištenja formulacije.
[0109] "Rekonstituisana" formulacija je ona koja se priprema rastvaranjem liofilizovanog proteina ili formulacije antitela u razblaživaču tako da se protein rasprši u njemu. Rekonstituisana formulacija je pogodna za davanje (npr. supkutanom primenom) pacijentu koji bi trebalo da se leči proteinom od značaja i, u nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, može biti pogodan za parenteralnu ili intravensku primenu.
[0110] "Izotonična" formulacija je ona koja suštinski ima isti osmotski pritisak kao ljudska krv. Izotonične formulacije će generalno imati osmotski pritisak od oko 250 do 350 mOsm. Pojam "hipotoničan" opisuje formulaciju sa osmotskim pritiskom ispod ljudskog krvnog pritiska. Shodno tome, pojam "hipertoničan" se koristi za opisivanje formulacije sa osmotskim pritiskom iznad ljudskog krvnog pritiska. Izotoničnost može da se meri pomoću npr. pritiska pare ili tipa osmometra za smrzavanje leda. Formulacije ovog pronalaska su hipertonične kao rezultat dodatka soli i/ili pufera.
[0111] Podrazumeva se da načini ostvarivanja ovog pronalaska koji su ovde obezbeđeni uključuju “koji se sastoji od” i/ili "koji se suštinski sastoji od' načine ostvarivanje.
[0112] Pozivanje na "oko" vrednost ili parametar ovde uključuje (i opisuje) varijacije koje su usmerena na onu vrednost ili parametar per se. Na primer, opis koji se odnosi na "oko X" uključuje opis "X".
[0113] Kako se ovde koristi, pozivanje na "nije" vrednost ili parametar generalno znači i opisuje "osim" vrednosti ili parametra. Na primer, postupak se ne koristi za lečenje kancera tipa X znači da se taj postupak koristi za lečenje drugih vrsta kancera osim X.
[0114] Pojam "oko X-Y" koji se ovde koristi ima isto značenje kao "oko X do oko Y"
[0115] Kako se ovde koristi i u priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine "neki," "ili," i "taj" uključuju reference u množini ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije.
II. Anti-BCMA antitela sa jednim domenom
[0116] Ovde otkrivena kao referenca su izolovana antitela sa jednim domenom (ovde označena kao "sdAb anti-BCMA") koja se specifično vezuju za BCMA, kao što su humana BCMA. U nekim načinima ostvarivanja, to sdAb anti-BCMA modulira BCMA aktivnost. U nekim načinima ostvarivanja, to sdAb anti-BCMA predstavlja antitelo antagonista. Dalje otkriveni kao referenca su antigenski vezujući fragmenti izvedeni iz bilo kog od ovde opisanih sdAb anti-BCMA , i antigenski vezujućih proteina koji obuhvataju bilo koju od ovde opisanih sdAb anti-BCMA . Primeri sdAb anti-BCMA su navedeni u tabeli 2 u nastavku. (*=sdAb obuhvaćeno u CAR pronalaska. Druga sdAb su otkrivena kao referenca.)
Tabela 2. Primer sdAb anti-BCMA.
[0117] B-ćelijski zreli antigen (BCMA), takođe poznat kao CD269, član je superfamilije receptora faktora nekroze tumora, naime TNFRSF17 (Thompson et al., J. Exp. Medicine, 192 (1):129-135, 2000). Humano BCMA se gotovo isključivo eksprimira u ćelijama u plazmi i ćelijama multiplog mijeloma
(videti npr. Novak et al., Blood, 103(2): 689-694, 2004; Neri et al., Clinical Cancer Research, 73(19):5903-5909; Felix et al., Mol. Oncology, 9(7):1348-58, 2015). BCMA može da vezuje faktor aktivacije B-ćelija (BAFF) i proliferaciju uključujući ligand (APRIL) (npr. Mackay et al., 2003 and Kalled et al., Immunological Review, 204: 43-54, 2005). BCMA može biti pogodan cilj tumorskog antigena za imunoterapijske agense protiv multiplog mijeloma. Antitela visokog afiniteta mogu da blokiraju vezivanje između BCMA i njegovih nativnih liganada BAFF i APRIL. SdAb anti-BCMA mogu da se koriste u kombinaciji sa ćelijskom imunoterapijom pomoću CAR-T ćelija, na primer, za pojačavanje citotoksičnih efekata protiv tumorskih ćelija.
[0118] U CAR pronalaska, postoji sdAb anti-BCMA koje sadrži sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 117. U CAR pronalaska takođe postoji sdAb anti-BCMA koje sadrži sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 124. SdAb anti-BCMA može biti kamelidno. SdAb anti-BCMA može biti humanizovano. SdAb anti-BCMA može da sadrži humani okvir primaoca, npr., humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0119] Kao referenca je otkriveno, da postoji sdAb anti-BCMA koje obuhvata najmanje dva ili sva tri CDR odabrana između (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 1, 2, 4-9 i 11-38; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 39, 40, 42-47 i 49-76; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 77, 78, 80-85 i 87-114. U nekim primerima, sdAb anti-BCMA je kamelidno . U nekim primerima, sdAb anti-BCMA je humanizovano. U nekim primerima, sdAb anti-BCMA sadrži ljudski okvir primaoca, npr., ljudski imunoglobulinski okvir ili ljudski konsenzusni okvir. SdAb anti-BCMA uključeni u CAR pronalaska mogu da sadrže CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 ili 10, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 41 ili 48 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 79 ili 86. SdAb anti-BCMA može da bude zaštićen. SdAb anti-BCMA može biti humanizovano. SdAb anti-BCMA može da sadrži humani okvir, npr.humani imunoglobinski okvir ili humani konsenzusni okvi.
[0120] sdAb anti-BCMA uključeni u CAR pronalaska mogu da obuhvataju tri CDR koji obuhvataju: (a) CDR1 sa najmanje bilo kog od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom od SEQ ID NO: 3 i 10; (b) CDR2 sa najmanje bilo kog od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom od SEQ ID NO:41 i 48; i (c) CDR3 sa najmanje bilo kog od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom od SEQ ID NO: 79 i 86. CDR sa najmanje bilo kog od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identiteta sadrži supstitucije (npr., konzervativne supstitucije), umetanja ili brisanja u odnosu na referentnu sekvencu, već sdAb anti-BCMA koji obuhvata tu sekvencu zadržava mogućnost da se vezuje za BCMA. sdAb anti-BCMA uključena u CAR pronalaska mogu da obuhvataju tri CDR koji obuhvataju: (a) CDR1 sa bilo kojom od 1, 2, 3, ili 4 aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne supstitucije), umetanja ili brisanja aminokiselinske sekvence izabrane od SEQ ID NO:3 i 10; (b) CDR2 sa bilo kojom od 1, 2, 3, ili 4 aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne supstitucije), umetanja ili brisanja aminokiselinske sekvence izabrane od SEQ ID NO:41 i 48; i (c) CDR3 sa bilo kojom od 1, 2, 3, ili 4 aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne supstitucije), umetanja ili brisanja aminokiselinske sekvence izabrane od SEQ ID NO: 79 i 86. sdAb anti-BCMA može biti zrelog afiniteta. sdAb anti-BCMA može biti kamelidno. sdAb anti-BCMA može biti humanizovano. sdAb anti-BCMA može da obuhvata humani okvir primaoca, npr., humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0121] CAR pronalaska može da obuhvata sdAb anti-BCMA koji obuhvata tri CDR koji obuhvataju: (a) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3; (b) CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 41; i (c) CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 79. CAR pronalaska takođe može da obuhvata sdAb anti-BCMA koje obuhvata tri CDR koji obuhvataju: (a) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 48; i (c) CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 86. sdAb anti-BCMA može biti kamelidno. sdAb anti-BCMA može biti humanizovano. sdAb anti-BCMA može da obuhvata humani okvir primaoca, npr., humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0122] Ovde otkriveno kao referenca, sdAb anti-BCMA , uključujući bilo koje od prethodno opisanih Ab anti-BCMA (tj., sdAb anti-BCMA koje obuhvata specifičan CDR1, CDR2, i/ili CDR3) obuhvata VHH domen sa najmanje bilo kog od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom od SEQ ID NO: 115-152. U nekim primerima, VHH sekvenca sa najmanje bilo kog od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identiteta sadrži supstitucije (npr., konzervativne supstitucije), umetanja ili brisanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali sdAb anti-BCMA koji obuhvata tu sekvencu zadržava mogućnost da se vezuje za BCMA. U nekim primerima, ukupno 1 do 10 aminokiselina je supstituisana, umetnuta i/ili obrisana u aminokiselinskoj sekvenci izabranoj od SEQ ID NO: 115-152. U nekim primerima, supstitucije, umetanja ili brisanja se javljaju u regionima izvan CDR (tj., u FR). Opciono, sdAb anti-BCMA obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 115-152, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvenca.
[0123] U nekim načinima ostvarivanja, postoji samo izolovano sdAb anti-BCMA koje obuhvata VHH domen saaminokiselinskom sekvencom od SEQ ID NO: 117 ili 124. U nekim načinima ostvarivanja, postoji polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 117 ili 124.
[0124] U nekim primerima, funkcionalni epitopi mogu biti mapirani kombinatornim skeniranjem alanina. U ovom procesu, kombinatorna strategija skeniranja alanina može da se koristi za identifikaciju aminokiselina u BCMA proteinu koje su neophodne za interakciju sa sdAb anti-BCMA . U nekim načinima ostvarivanja, epitop je konformacioni i kristalna struktura sdAb anti-BCMA vezanog za BCMA može se koristiti za identifikaciju epitopa. U nekim načinima ostvarivanja, postoji epitop BCMA izveden iz aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 389-392. U nekim načinima ostvarivanja, postoji epitop BCMA koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 389-392.
[0125] Otkrivena kao referenca su antitela koja ulaze u kompeticiju sa bilo kojim od ovde opisanih sdAb anti-BCMA za vezivanje na BCMA. U nekim primerima, antitela ulaze u kompeticiju sa sdAb anti-BCMA za vezivanje na epitopu na BCMA. U nekim primerima, antitelo se vezuje na isti epitop kao sdAb anti-BCMA koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 115-152. U nekim primerima, antitelo se specifično vezuje za BCMA kompetetivno sa sdAb anti-BCMA koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 115-152.
[0126] Kao referenca je otkriveno, ispitivanja kompeticije mogu da se koriste za identifikovanje monoklonalnog antitela koje ulazi u kompeticiju sa sdAb anti-BCMA ovde opisanim radi vezivanja za BCMA. Kompeticiona ispitivanja mogu da se koriste za određivanje da li dva antitela vezuju isti epitope prepoznavanjem identičnih ili sterički preklapajućih epitopa ili jedno antitelo kompetetivno inhibira vezivanje drugog antitela na antigen. U određenim primerima, takvo kompetetivno antitelo se vezuje za isti epitop (npr. BCMA epitop izveden iz aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 388-394) koji je vezan ovde opisanim antitelom. Primeri kompetetivnih ispitivanja uključuju, ali bez ograničenja na, rutinska ispitivanja kao što su ona navedena Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).Detaljni primeri postupaka za mapiranje epitopa za koji se vezuje antitelo dati su u Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol.66 (Humana Press, Totowa, N.J.). U nekim primerima, kaže se da se dva antitela vezuju za isti epitop ako svako blokira vezivanje drugog za 50% ili više. U nekim primerima, antitelo koje ulazi u kompeticiju sa ovde opisanim sdAb anti-BCMA je kamelidno, himerno, humanizovano ili humano antitelo. U nekim primerima, postoji antitelo koje ulazi u kompeticiju sa kamelidnim, himernim, humanizovanim ili humanim sdAb anti-BCMA kao što je ovde opisano.
[0127] Kao referenca je otkriveno da posotji antitelo anti-BCMA ili antigenski vezujući protein koji obuhvata bilo koje od prethodno opisanih sdAb anti-BCMA. U nekim primerima, antitelo anti-BCMA je monoklonalno antitelo, uključujući kamelidno, himerno, humanizovano ili humano antitelo. U nekim primerima, antitelo anti-BCMA je fragment antitela, npr., VHH fragment. U nekim primerima, antitelo anti-BCMA predstavlja antitelo pune dužine samo teškog lanca koje obuhvata Fc region bilo koje klase antitela ili izotipa, kao što je IgG1 ili IgG4. U nekim primerima, Fc region ima smanjenu ili minimizovanu efektorsku funkciju.
[0128] Ovde otkriveno antitelo anti-BCMA (kao što je sdAb anti-BCMA ) ili antigenski vezujući protein kao referenca u svom sastavu može da sadrži bilo koju od karakteristika, pojedinačno ili u kombinaciji, kao što je opisano u odeljcima 1-7 "Karakteristike antitela" u nastavku.
[0129] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira sdAb anti-BCMA koja obuhvata CAR ovog pronalaska. U nekim načinima ostvarivanja, izolovana nukleinska kiselina koja kodira sdAb anti-BCMA je obezbeđena pri čemu nukleinska kiselina obuhvata sekvencu sa najmanje bilo kog od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 155 i 162. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 155 i-162. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je vektor (npr., ekspresioni vektor) koji obuhvata takvu nukleinsku kiselinu. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je ćelija domaćina koja obuhvata takvu nukleinsku kiselinu. Otkriven je postupak pravljenja antitela anti-BCMA, pri čemu taj postupak obuhvata kultivisanje ćelija domaćina koje obuhvataju nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo anti-BCMA , u uslovima koji su pogodni za eksprimiranje antitela anti-BCMA , i opciono oporavlja antitelo anti-BCMA iz ćelije domaćina (ili podloge domaćina ćelijske kulture). Sekvence nukleinske kiseline izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 153, 154, 156-161, i 163-190 su ovde otkrivene kao referenca.
Karakteristike antitela
1. Afinitet antitela
[0130] U nekim načinima ostvarivanja, antitelo anti-BCMA u CAR pronalaska ima konstantu sisocije (Kd) ≤ 1µM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, ili ≤ 0.001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M to 10<-13>M, npr., od 10<-9>M do 10<-13>M).
[0131] Kd može da se izmeri ispitivanjem vezivanja radioaktivno obeleženog antigena (RIA) izvedenim sa Fab verzijom ili VHH fragmentom antitela od značaja i njegovim antigenom kako je opisano sledećim ispitivanjem. Na primer, afinitet vezivanja Fab rastvora za antigen se meri dovođenjem u ravnotežu Fab sa minimalnom koncentracijom (<125>I) obeleženog antigena u prisustvu serije titracija neobeleženog antigena, zatim hvatanje vezanog antigena pločom obloženom anti-Fab antitelima (videti, npr. Chen et al., J. Mol. Biol.293:865-881 (1999)).
[0132] Kd može da se izmeri ispitivanjem površinske plazmonske rezonance pomoću BIACORE<®>-2000 ili BIACORE<®>-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) na 25°C sa imobilisanim antigenskim CMS čipovima na ~10 jedinica odgovora (RU). Ukratko, biosenzorski čipovi karboksimetilisanog dekstrana (CM5, BIACORE, Inc.) se aktiviraju sa N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohloridom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS) u skladu sa uputstvima dobavljača. Antigen se razblaži sa 10 mM natrijumacetata, pH 4,8, do 5 µg/ml (~0,2 µM) pre ubrizgavanja pri brzini protoka od 5 µl/minuta kako bi se postiglo približno 10 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon ubrizgavanja antigena, ubrizgava se 1 M etanolamina da blokira neizreagovane grupe. Za merenja kinetike, ubrizgavaju se dvostruka serijska razblaženja Fab ili VHH antitela od značaja (0,78 nM do 500 nM) u PBS sa 0,05% polisorbatom 20 (TWEEN-20).<™>) surfaktantom (PBST) na 25°C pri brzini protoka od približno 25 µl/min. Stope pridruživanja (kon) i stope disocijacije (koff) se izračunavaju pomoću jednostavnog Langmuirovog modela vezivanja jedan na jedan (BIACORE<®>Softver za procjenu verzija 3.2) simultanim prilagođavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (Kd) se izračunava kao odnos koff/kon. Videti, npr. Chen et al., J. Mol. Biol.293:865-881 (1999). Ako je stopa uključenja veća od 10<6>M<-1>s<-1>gornjim ispitivanjem površinske plazmonske rezonance, tada brzina uključivanja može da se odredi upotrebom tehnike gašenja fluorescentne svetlosti koja meri povećanje ili smanjenje intenziteta emisije fluorescencije (pobuđivanje = 295 nm; emisija = 340 nm, propusnost pojasa od 16 nm) na 25°C 20 nM antitela anti-antigena (Fab oblik) u PBS-u, pH 7,2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena izmerenih u spektrometru, kao što je izmereno u spektrofotometru, kao što je spektofotometar opremljen sa zaustavljanjem protoka (Aviv Instruments) ili 8000 -series SLM-AMINCO<™>spektrofotometrom (ThermoSpectronic) sa kivetom za umešavanje.
2. Fragmenti antitela
[0133] CAR pronalaska obuhvataju sdAb koja obuhvataju VHH domen. U nekim primerima, ovde otkriveno antitelo predstavlja fragment antitela. Fragmenti antitela uključuju, ali bez ograničenja na, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, i scFv fragmente, VHH, i druge fragmente opisane u nastavku. Radi pregleda fragmenata određenih antitela, videti Hudson et al. Nat. Med.9:129-134 (2003). Zbog pregleda scFv fragmenata, videti, npr., Pluckthün, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp.269-315 (1994); videti takođe WO 93/16185; i američki patent br.5,571,894 i 5,587,458. Radi rasprave o Fab i F(ab')2fragmenti koji sadrže ostatke epitopa koji se vezuje za receptore spašavanja i koji imaju produženi in vivo poluživot, videti američki patent br.5,869,046.
[0134] Dijatela su fragmenti antitela sa dva antigen-vezujuća mesta koja mogu biti dvovalentna ili bispecifična. Videti, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med.9:129-134 (2003); i Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su takođe opisana u Hudson et al., Nat. Med.9:129-134 (2003).
[0135] Fragmenti antitela mogu biti napravljeni raznim tehnikama, uključujući ali bez ograničenja na proteolitičku digestiju intaktnog antitela kao i proizvodnju rekombinantnim ćelijama domaćina (npr. E. coli ili fag), kao što je ovde opisano.
3. Himerna i humanizovana antitela
[0136] Antitelo može biti himerno antitelo. Određena antitela su opisana npr., u američki patent br. 4,816,567; i Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). U jednom primeru, himerno antitelo obuhvata nehumani varijabilni region (npr., varijabilni region izveden iz kamelidnih vrsta, kao što su lame) i humani konstantni region. U dodatnom primeru, himerno antitelo predstavlja antitelo "koje je isključeno iz klase" u kojem je klasa ili podklasa promenjena iz klase roditeljskog antitela. Himerna antitela uključuju njihove antigen-vezujuće fragmente.
[0137] Himerno antitelo može biti humanizovano antitelo. Obično je nehumano antitelo humanizovano kako bi se smanjila imunogenost po ljude, dok zadržava specifičnost i afinitet roditeljskog nehumanog antitela. Generalno, humanizovano antitelo obuhvata jedan ili više varijabilnih domena u kojima su HVR, npr., CDR (ili njihovi delovi) izvedeni iz nehumanog antitela, a FR (ili njihovi delovi) su izvedeni iz sekvenci humanih antitela. Humanizovano antitelo će opciono takođe obuhvatati najmanje deo humanog konstantnog regiona. Neki FR ostaci u humanizovanom antitelu mogu biti supstituisani sa odgovarajućim ostacima iz nehumanog antitela (npr., antitela iz kojeg su izvedeni HVR ostaci), npr., kako bi se povratila ili popravila specifičnost ili afinitet antitela.
[0138] Humanizovana antitela i postupci njihovog pravljenja su pregledani, npr., u Almagro
and Fransson, Front. Biosci.13:1619-1633 (2008), i dodatno su opisani, npr., u Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); američki patent br.
5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, i 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (koji opisuju SDR (a-CDR) kalemljenje); Padlan, Mol. Immunol.28:489-498 (1991) (koji opisuje "ponovno izbijanje na površinu"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (koji opisuje "FR mešanje"); i Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) i Klimka et al., br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (koji opisuje pristup “vođenog izbora” FR mešanju).
[0139] Humani okvirni regioni koji mogu da se koriste za humanizaciju uključuju ali bez ograničenja na: okvirne regione izabrane postupkom "najboljeg para" (videti, npr., Sims et al. J. Immunol.151:2296 (1993)); okvirne regione izvedene iz konsenzusne sekvence humanog antitela određene podgrupe varijabilni regiona lakog ili teškog lanca (videti, npr., Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); i Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); humane zrele (somatski mutirane) okvirne regione ili humane okvirne regione iz nasledne linije (videti, npr., Almagro and Fransson, Front. Biosci.13:1619-1633 (2008)); i okvirne regione izvedene iz skrininga FR biblioteka (videti, npr., Baca et al., J. Biol. Chem.
272:10678-10684 (1997) i Rosok et al., J. Biol. Chem.271:22611-22618 (1996)).
[0140] sdAb mogu biti modifikovana, kao što su humanizovana, bez umanjenja nativnog afiniteta domena za antigen i dok se smanjuje njegova imunogenost u odnosu na heterolognu vrstu. Na primer, aminokiselinski ostaci varijabilnog domena antitela (VHH) lame može da se odredi, a jedna ili više kamelidnih aminokiselina, na primer, u okvirnim regionima, zamenjuju se svojim humanim dvojnikom kako se nalazi u humanoj konsenzusnoj sekvenci, a da taj polipeptid ne izgubi svoj tipični karakter, tj. humanizacija ne utiče značajno na sposobnost vezivanja antigena dobijenog polipeptida. Humanizacija kamelidnih sdAb zahteva uvođenje i mutagenezu ograničene količine aminokiselina u jednom polipeptidnom lancu. Ovo je u suprotnosti sa humanizacijom scFv, Fab', (Fab')2 i IgG, koja zahteva uvođenje aminokiselinskih promena u dva lanca, laki i teški lanac i očuvanje sastava obaju lanaca.
[0141] Antitela sa jednim domenom koja obuhvataju VHH domen mogu biti humanizovana kako bi se imale sekvence nalik na humane. FR regioni VHH domena koji se ovde koristi može da sadrži najmanje bilo koju od 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili više homologije aminokiselinske sekvence sa humanim VHokvirnim regionom. Jedan primer klase humanizovanog VHH domena je okarakterisan time što VHH nose aminokiselinu iz grupe koju čine glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, tirozin, triptofan, metionin, serin, treonin, asparagin ili glutamin na položaju 45, kao što su, na primer, L45 i triptofan na poziciji 103, prema Kabat numerisanju. Kao takvi, polipeptidi koji pripadaju ovoj klasi pokazuju visoku homologiju aminokiselinske sekvence sa humanim VHokvirnim regionima i pomenuti polipeptidi mogu da se primenjuju na čoveka direktno bez očekivanja neželjenog imunog odgovora, i bez tereta dodatne humanizacije.
[0142] Još jedna primer klase humanizovanih kamelidnih sdAb opisana je u WO 03/035694 i sadrži hidrofobne FR2 ostatke koji se obično nalaze u uobičajenim antitelima humanog porekla ili drugih vrsta, ali nadoknađujući ovaj gubitak hidrofilnosti argininskim ostatkom pod nabojem na položaju 103 koji supstituiše konzervirani ostatak triptofana prisutan u VHiz dvolančanih antitela. Kao takvi, peptidi koji pripadaju ovim dvema klasama pokazuju visoku homologiju aminokiselinske sekvence sa humanim VHokvirnim regionima i pomenuti peptidi mogu da se primenjuju na čoveka direktno bez očekivanja neželjenog imunog odgovora, i bez tereta dodatne humanizacije.
4. Humana antitela
[0143] Antitelo može biti humano antitelo. Humana antitela mogu da se proizvedu različitim tehnikama poznatim u ovoj oblasti. Humana antitela su generalno opisana u van Dijk i van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol.5: 368-74 (2001) i Lonberg, Curr. Opin. Immunol.20:450-459 (2008). U ovoj oblasti su poznati transgeni miševi ili pacovi koji mogu proizvesti potpuno humane sdAb.
Videti, npr., US20090307787A1, američki pat. br.8,754,287, US20150289489A1, US20100122358A1, i WO2004049794.
[0144] Humana antitela mogu da se pripreme davanjem imunogena transgenoj životinji koja je modifikovana da proizvodi intaktna humana antitela ili intaktna antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenski izazov. Takve životinje obično sadrže sve ili deo humanih imunoglobulinskih lokusa, koji zamjenjuju endogene imunoglobulinske lokuse, ili koji su prisutni ekstrakromosomski ili nasumično integrisani u životinjske hromozome. Kod takvih transgenih miševa, endogeni imunoglobulinski lokusi su generalno neaktivisani. Za pregled postupaka za dobijanje humanih antitela iz transgenih životinja, videti Lonberg, Nat. Biotech.23:1117-1125 (2005). Videti takođe, npr., američki patent br.6,075,181 i 6,150,584 koji opisuju XENOMOUSE™ technology; američki patent br. 5,770,429 koji opisuje HUMAB® technology; američki patent br.7,041,870 koji opisuje K-M MOUSE® technology, i objava američke patentne prijave br. US 2007/0061900, koja opisuje VELOCIMOUSE® technology). Humani varijabilni regioni iz intaktnih antitela koje su stvorile takve životinje mogu dalje da se modifikuju, npr. kombinovanjem sa različitim ljudskim konstantnim regionom.
[0145] Humana antitela takođe mogu da se proizvedu postupcima zasnovanim na hibridomu. Opisane su ćelijske linije humanog mijeloma i mišje-humanog heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonalnih antitela. (Videti, npr. Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); i Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Humana antitela stvorena tehnologijom hibridoma humanih B-ćelija takođe su opisana u Li et al., Proc. Natl. Akad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Dodatni postupci uključuju one opisane, na primer, u američki patent br.7,189,826 (opisuje proizvodnju monoklonalnih humanih IgM antitela iz hibridomskih ćelijskih linija) i Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006.) (opisuje humane-humane hibridome). Tehnologija humanog hibridoma (Trioma tehnologija) je takođe opisana u Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) i Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).
[0146] Humana antitela takođe mogu da se stvaraju izolovanjem sekvenci varijabilnog domena Fv klona odabranih iz biblioteka prikaza faga koje su izvedene od ljudi. Takve sekvence varijabilnog domena mogu zatim da se kombinuju sa željenim humanim konstantnim domenom. Tehnike za odabir humanih antitela iz biblioteka antitela su opisane u nastavku.
[0147] Jedna tehnika za dobijanje VHH sekvenci usmerenih protiv određenog antigena ili cilja uključuju pogodno imunizaciju transgenog sisara koji je sposoban da eksprimira antitela teškog lanca (tj. kako bi se podigao imuni odgovor i/ili antitela teškog lanca usmerena protiv navedenog antigena ili cilja), čime se dobija odgovarajući biološki uzorak navedenog transgenog sisara koji sadrži (kodirajuće sekvence nukleinske kiseline) pomenute VHH sekvence (kao što je uzorak krvi, uzorak seruma ili uzorak B-ćelija), a zatim stvaranje VHH sekvence usmerene protiv pomenutog antigena ili cilja, počevši od pomenutog uzorka, pomoću bilo koje pogodne tehnike poznate per se (kao što je bilo koji od ovde opisanih postupaka ili tehnika hibridoma). Na primer, u tu svrhu, miševi sa ekspresijom antitela teškog lanca i dodatni postupci i tehnike opisane u WO 02/085945, WO 04/049794 i WO 06/008548 i Janssens et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.2006 Oct.10; 103(41): 15130-5 mogu da se koriste. Na primer, takvi miševi koji eksprimiraju antitela teškog lanca mogu da eksprimiraju antitela teškog lanca sa bilo kojim pogodnim (jednim) varijabilnim domenom, kao što su (pojedinačni) varijabilni domeni iz prirodnih izvora (npr. humane (pojedinačne) varijabilne domene, kamelidne (pojedinačne) varijabilne domene ili (pojedinačne) varijabilne domene morskog psa), kao i na primer sintetičke ili polusintetčke (pojedinačne) varijabilne domene.
5. Antitela izvedena iz biblioteke
[0148] Antitela se mogu izolovati pretraživanjem kombinatornih biblioteka za antitela sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Na primer, u ovoj oblasti su poznati različiti postupci za pravljenje biblioteka za prikaz faga i pretraživanje takvih biblioteka za antitela koja poseduju željene karakteristike vezivanja. Takvi postupci su pregledani, npr., u McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol.222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol.340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); i Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004). Postupci za konstruisanje biblioteka sdAb su opisani, na primer ,videti američki pat. br.7371849.
[0149] U određenim postupcima prikaza faga, repertoari VHi VLgena se odvojeno kloniraju lančanom reakcijom polimeraze (PCR) i rekombinuju se nasumično u bibliotekama faga, koje zatim mogu da se pregledaju radi fagova koji vezuju antigene, kao što je opisano u Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Fag tipično prikazuje fragmente antitela, bilo kao jednolančane Fv (scFv) fragmente ili kao Fab fragmente. Biblioteke iz imunizovanih izvora daju antitela visokog afiniteta na imunogen bez potrebe za konstruisanjem hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može da se klonira (npr. iz čoveka) kako bi se dobio jedan izvor antitela za širok raspon ne-vlastitih i vlastitih antigena bez ikakve imunizacije kako je opisano u Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993.). Konačno, naivne biblioteke takođe mogu da se naprave sintetički kloniranjem nepreuređenih segmenata V-gena iz matičnih ćelija i korišćenjem PCR prajmera koje sadrže nasumične sekvence za kodiranje vrlo varijabilnih CDR3 regiona i za postizanje preraspodele in vitro, kako je opisao Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Patentne objave koje opisuju biblioteke faga humanog antitela uključuju, na primer: američki patent br.5,750,373, i američka patentna objava br.
2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/02 92936, i 2009/0002360.
[0150] Antitela ili fragmenti antitela izolovani iz biblioteka humanih antitela se ovde smatraju humanim antitelima ili fragmentima humanih antitela.
6. Multispecifična antitela
[0151] Antitelo može biti multispecifično antitelo, npr. bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su antitela koja imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita mesta. Jedna od specifičnosti vezivanja može biti za antigen odabran iz grupe koju čine CD19, CD20, BCMA i CD38, a druga je za bilo koji drugi antigen. Bispecifična antitela mogu da se vezuju na dva različita epitopa antigena odabrana iz grupe koju čine CD19, CD20, BCMA i CD38. Bispecifična antitela takođe mogu da se koriste za lokalizaciju citotoksičnih sredstava na ćelije koje eksprimiraju antigen odabran iz grupe koju čine CD19, CD20, BCMA i CD38.
[0152] Bispecifična antitela mogu da se pripreme u obliku antitela pune dužine ili fragmenata antitela. Tehnike za pravljenje multispecifičnih antitela uključuju, ali bez ograničenja na, rekombinantno zajedničko eksprimiranje dva para teški lanac-laki lanac imunoglobulina koji imaju različite specifičnosti (videti Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, i Traunecker et al., EMBO J.10: 3655 (1991)), i konstruisanje "kvaka u rupi" (videti, npr., američki patent br.5,731,168). Multi-specifična antitela takođe mogu da budu napravljena konstruisanjem elektrostatičlih upravljačkih efekata za pravljenje Fc-heterodimernih molekula antitela (WO 2009/089004A1); umrežavanje dva ili više antitela ili fragmenata (videti, npr., američki patent br.4,676,980, i Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); pomoću leucinskih zatvarača kako bi se proizvela bispecifična antitela (videti, npr., Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); pomoću tehnologije "dijatela" za pravljenje antitela bispecifičnih fragmenata (videti, npr., Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); i pomoću jednolančanih Fv (sFv) dimera (videti, npr., Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); i pripremom trispecifičnih antitela kao što je opisano, npr., u Tutt et al. J. Immunol.147: 60 (1991); i pravljenjem polipeptida koji obuhvataju tandem antitela sa jednim domenom (videti, npr., američka patentna prijava br. 20110028695; i Conrath et al. J. Biol. Chem., 2001; 276(10):7346-50). Konstruisana antitela sa tri ili više funkcionalnih antigen vezujućih mesta, uključujući "Octopus antitela," koja su ovde takođe obuhvaćena (videti, npr., US 2006/0025576A1).
7. Varijante antitela (odeljak "7. Varijante antitela" je otkrivan kao referenca. Načini ostvarivanja otkriveni u ovom odeljku nisu načini ostvarivanja pronalaska.)
[0153] U nekim načinima ostvarivanja, ovde se u razmatranje uzimaju varijante sekvenci aminokiselina antitela. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante sekvence aminokiselina antitela mogu da se pripreme uvođenjem odgovarajućih modifikacija u sekvencu nukleinske kiseline koja kodira antitelo, ili sintezom peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, brisanja iz, i/ili umetanja u i/ili supstitucije ostataka unutar aminokiselinskih sekvenci antitela. Bilo koja kombinacija brisanja, umetanja i supstitucije može da se napravi kako bi se došlo do konačnog konstrukta, pod uslovom da konačni konstrukt poseduje željene karakteristike, npr., vezivanje antigena.
a) Supstitucija, umetanje, i varijante brisanja
[0154] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđene su varijante antitela sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija. Mesta od značaja za supstitucionu mutagenezu uključuju HVR i FR.
Konzervativne supstitucije su prikazane u tabeli 3 pod nazivom "Poželjne supstitucije". Značajnije promene su date u tabeli 3 pod nazivom "primerne supstitucije", i kao što je dalje opisano u nastavku u odnosu na klase bočnih lanaca aminokiselina. Supstitucije aminokiselina mogu da se uvedu u antitelo od značaja i proizvodi se pregledaju na željenu aktivnost, npr., zadržano/poboljšano vezivanje antigena, smanjena imunogenost ili poboljšani ADCC ili CDC.
TABELA 3. Aminokiselinske supstitucije
[0155] Aminokiseline mogu biti grupisane prema uobičajenim svojstvima bočnog lanca:
(1) hidrofobni: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) neutralni hidrofilni: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) kiseli: Asp, Glu;
(4) bazni: His, Lys, Arg;
(5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;
(6) aromatični: Trp, Tyr, Phe.
[0156] Nekonzervativne supstitucije će podrazumevati razmenu člana jedne od klasa za drugu klasu.
[0157] Jedna vrsta supstitucione varijante uključuje zamenu jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona roditeljskog antitela (npr. humanizovano ili ljudsko antitelo). Generalno, dobijena varijanta(e) odabrana za dalje istraživanje će imati modifikacije (npr. poboljšanja) u određenim biološkim svojstvima (npr. povećani afinitet, smanjena imunogenost) u odnosu na matično antitelo i/ili će značajno zadržati određena biološka svojstva roditeljskog antitela. Primer supstitucione varijante je antitelo sazrelog afiniteta, koje može pogodno da se proizvede, npr., pomoću tehnika sazrevanja afiniteta zasnovane na prikazu faga kao što su one koje su ovde opisane. Ukratko, jedan ili više HVR ostataka je mutirano i varijanta antitela je prikazana na fagu i pregledana je zbog određene biološke aktivnosti (npr. afinitet vezivanja).
[0158] Izmene (npr., supstitucije) mogu da se naprave u HVR, npr., kako bi se poboljšao afinitet antitela. Takve izmene mogu biti napravljene u HVR "gorućim tačkama," tj., ostaci koje kodiraju kodoni koji su podvrgnuti mutaciji pri visokoj frekvenciji tokom postupka somatskog sazrevanja (videti,
npr., Chowdhury, Methods Mol. Biol.207:179-196 (2008)), i/ili SDR (a-CDR), sa dobijenom varijantom VHili VLkoja je ispitivana radi afiniteta vezivanja dobijenom varijantom VHili VLkoji je ispitivan radi afiniteta vezivanja. Sazrevanje afiniteta konstruisanjem i ponovnim odabirom iz sekundarnih biblioteka je opisano, npr., u Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ur., Human Press, Totowa, NJ, (2001.)).) U nekim načinima ostvarivanja sazrevanja afiniteta, raznolikost se uvodi u varijabilne gene odabrane za sazrevanje bilo kojom od različitih postupaka (npr. PCR sklon greškama, mešanje lanaca ili mutageneza usmerena na oligonukleotide). Zatim se stvara sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim pregleda kako bi se identifikovale sve varijante antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak za uvođenje raznolikosti uključuje pristupe usmerene na HVR, u kojima je nekoliko HVR ostataka (npr.4-6 ostataka odjednom) nasumično raspoređeno. HVR ostaci uključeni u vezivanje antigena mogu specifično da se identifikuju, npr., korišćenjem mutageneze ili modelovanja skeniranjem alanina. CDR-H3 i CDR-L3 su posebno često ciljni.
[0159] U nekim načinima ostvarivanja, supstitucije, umetanja ili brisanja mogu da se javljaju unutar jednog ili više HVR toliko dugo da takve promene suštinski ne smanjuju mogućnost antitela da se vezuje za antigen. Na primer, konzervativne izmene (npr., konzervativne supstitucije kao što su ovde obezbeđene) koje suštinski ne smanjuju afinitet vezivanja mogu da se naprave u HVR. Takve promene mogu biti izvan HVR "gorućih tačaka" ili CDR. U nekim načinima ostvarivanja ovde datih varijanti VHH sekvenci, svaki HVR ili je neizmenjen, ili sadrži najviše jednu, dve ili tri aminokiselinske supstitucije.
[0160] Koristan postupak za identifikaciju ostataka ili regiona antitela koja mogu biti ciljna za mutagenezu naziva se "mutageneza skeniranja alanina", kako je opisano u Cunningham i Wells (1989) Science, 244:1081-1085. U ovom postupku, ostatak ili grupa ciljnih ostataka (npr. ostaci pod nabojem kao što su Arg, Asp, His, Lys i Glu) se identifikuju i zamenjuju neutralnom ili negativno nabijenom aminokiselinom (npr. alanin ili polialanin) kako bi se utvrdilo da li utiče na interakciju antitela sa antigenom. Dalje supstitucije mogu da se uvedu na mestima aminokiselina čime se pokazuje funkcionalna osjetljivost na početne supstitucije. Alternativno, ili dodatno, kristalna struktura kompleksa antigen-antitelo za identifikaciju kontaktnih tačaka između antitela i antigena. Takvi kontaktni ostaci i susjedni ostaci mogu biti ciljni ili eliminisani kao kandidati za zamenu. Varijante se mogu pregledati kako bi se utvrdilo da li sadrže željena svojstva.
[0161] Umetanja aminokiselinske sekvence uključuju amino- i/ili karboksil-terminalne fuzije koje su u opsegu dužine od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže sto ili više ostataka, kao i umetanja međusekvenca jednog ili više aminoksielinskih ostataka. Primeri terminalnih umetanja uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatak. Ostale varijante umetanja molekule antitela uključuju spajanje na N-ili C-kraju antitela sa enzimom (npr. za ADEPT) ili polipeptidom koji produžava poluživot antitela u serumu.
b) Varijante glikosilacije
[0162] U nekim načinima ostvarivanja, ovde obezbeđeno antitelo se menja kako bi povećalo ili smanjilo opseg do kojeg je antitelo glikosilisano. Dodavanje ili brisanje mesta glikosilacije antitelu može uobičajeno da se postigne menjanjem aminokiselinske sekvence tako da se stvori ili ukloni jedno ili više mesta glikosilacije.
[0163] Kada antitelo sadrži Fc region, ugljeni hidrat pričvršćen za njega može da biti promenjen. Nativna antitela koja proizvode ćelije sisara obično sadrže razgranati, biantenarni oligosaharid koji je generalno pričvršćen N-vezom za Asn297 CH2 domen Fc regiona. Videti, npr. Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). Oligosaharid može da uključuje različite ugljene hidrate, npr., manozu, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sijalinsku kiselinu, kao i fukozu pričvršćenu za GlcNAc u "stabljici" biantenarne oligosaharidne strukture. U nekim načinima ostvarivanja, modifikacije oligosaharida u antitelu mogu da se naprave kako bi se stvorile varijante antitela sa određenim poboljšanim svojstvima.
[0164] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđene su varijante antitela koje imaju strukturu ugljenih hidrata kojoj nedostaje fukoza pričvršćena (direktno ili indirektno) na Fc region. Na primer, količina fukoze u takvom antitelu može biti od 1% do 80%, od 1% do 65%, od 5% do 65% ili od 20% do 40%. Količina fukoze određena je izračunavanjem prosečne količine fukoze unutar lanca šećera na Asn297, u odnosu na zbroj svih glikostruktura vezanih za Asn 297 (npr. kompleksne, hibridne strukture i strukture sa visokim udelom manoze) mereno MALDI-TOF masenom spektrometrijom , kako je opisano u WO 2008/077546, na primer. Asn297 se odnosi na asparaginski ostatak koja se nalazi na otprilike poziciji 297 u Fc regionu (EU numerisanje ostataka Fc regiona); međutim, Asn297 takođe može da se nalazi na oko ± 3 aminokiseline ushodno ili nishodno od položaja 297, tj. između položaja 294 i 300, zbog manjih varijacija sekvenci u antitelima. Takve varijante fukozilacije mogu da imaju poboljšanu ADCC funkciju. Videti, npr., američka patentna objava br. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Primeri publikacija koji se odnose na varijante "defukosilisanog" ili "fukozno deficijentnog" antitela uključuju: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol.336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng.87: 614 (2004). Primeri ćelijskih linija koji mogu da proizvode defukosilisana antitela uključuju Lec13 CHO ćelije kojima nedostaje proteinska fukosilacija (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys.249:533-545 (1986); američka patentna prijava br. US 2003/0157108 A1, Presta, L; i WO 2004/056312 A1, Adams et al., posebno u primeru 11), i nokaut ćelijske linije, kao što je gen alfa-1,6-fuksiltransferaze, FUT8, nokaut CHO ćelije (videti, npr., Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng.87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); i WO2003/085107).
[0165] Varijante antitela su dalje obezbeđene sa prepolovljenim oligosaharidima, npr., u kojima je biantenarni oligosaharid pričvršćen za Fc region antitela prepolovljen GlcNAc-om. Takve varijante antitela mogu da imaju smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu ADCC funkciju. Primeri takvih varijanti antitela su opisani, npr. u WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); američki patent br.6,602,684 (Umana et al.); i US 2005/0123546 (Umana et al.). Takođe su obezbeđene varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidima pričvršćenim za Fc regionu. Takve varijante antitela mogu da imaju poboljšanu funkciju CDC. Takve varijante antitela su mogle da imaju poboljšanu CDC funkciju. Opisane su takve varijante antitela, npr., u WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); i WO 1999/22764 (Raju, S.).
c) Varijante Fc regiona
[0166] U nekim načinima ostvarivanja, jedna ili više aminokiselinskih modifikacija može da se uvede u ovde obezbeđenih Fc region antitela, čime se stvara varijanta Fc regiona. Varijanta Fc regiona može da obuhvata sekvencu humanog Fc regiona (npr., humani IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 Fc region) koji obuhvata aminokiselinsku modifikaciju (npr. supstituciju) na jednom ili više aminokiselinskih položaja.
[0167] U nekim načinima ostvarivanja, postoji varijanta antitela koja poseduje neke ali ne sve efektorske funkcije, što je čini poželjnim kandidatom za primene u kojim polu-život antitela in vivo je važna, mada su određene efektorske funkcije (kao što su komplement i ADCC) neophodne ili štetne. In vitro i/ili in vivo citotoksičnost ispitivanja može d ase izvede kako b ise potvrdila redukcija/deplecija CDC i/ili ADCC aktivnosti. Na primer, ispitivanja vezivanja Fc receptora (FcR) mogu da se izvedu kako bi se osiguralo da antitelu nedostaje vezivanje FcyR (dakle verovatno nedostaje ADCC aktivnost), ali zadržava sposobnost vezivanja FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo Fc(RIII), dok monociti eksprimiraju Fc(RI, Fc(RII i Fc(RIII). Ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama sažeta je u tabeli 3 na stranici 464 Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol.9:457-492 (1991). Neograničavajući primeri in vitro ispitivanja za procenu ADCC aktivnosti molekula od značaja opisani su u američki patentu br.
5,500,362 (videti, npr. Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) i Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (videti Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med.
166:1351-1361 (1987)). Alternativno, mogu da se koriste neradioaktivni postupci ispitivanja (videti, na primer, ACTI<™>ispitivanje neradioaktivne citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; i CytoTox 96<®>ispitivanje neradioaktivne citotoksičnosti (Promega, Madison, WI). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, može da se proceni ADCC aktivnost molekule od značaja in vivo, npr. u životinjskom modelu kao što je onaj otkriven u Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci.
USA 95:652-656 (1998). Ispitivanja C1q vezivanja takođe mogu da se izvod ekako bi se potvrdilo da antitelo ne može da se vezuje za C1q i samim tim mu nedostaje CDC aktivnost. Videti, npr. C1q i C3c vezivanje ELISA u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Za procenu aktivacije komplementa može da se izvede CDC ispitivanje (videti, na primer, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Metode 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); i Cragg, M.S. i M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004.)). FcRn vezivanje i in vivo određivanje klirensa/poluživota takođe može da se izvede postupcima poznatim u ovoj oblasti (videti, npr. Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol.18(12):1759-1769 (2006)).
[0168] Antitela sa smanjenom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (američki patent br.6,737,056). Takvi Fc mutanti uključuju Fc mutante sa supstitucijama na dve ili više položaja aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani "DANA" Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 na alanin (američki patent br. 7,332,581).
[0169] Opisane su određene varijante antitela sa poboljšanim ili umanjenim vezivanjem za FcR. (Videti, npr., američki patent br.6,737,056; WO 2004/056312, i Shields et al., J. Biol. Chem.9(2): 6591-6604 (2001).)
[0170] U nekim načinima ostvarivanja, varijanta antitela obuhvata Fc region sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija koje poboljšavaju ADCC, npr., supstitucije na položajima 298, 333, i/ili 334 Fc regiona (EU numerisanje ostatka).
[0171] U nekim načinima ostvarivanja, promene se prave u Fc regionu koje dovode do promenjenog (tj. bilo poboljšanog ili smanjenog) vezivanja C1q i/ili citotoksičnosti koja zavisi od komplementa (CDC), npr. kako je opisano u američkom patentu br.6,194,551, WO 99/51642, i Idusogie et al. J.
Immunol.164: 4178-4184 (2000).
[0172] Antitela sa produženim polu-životima i poboljšanim vezivanjem za neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za prenos majčinih IgG na fetus (Guyer et al., J. Immunol.117:587 (1976) i Kim et al., J. Immunol.24:249 (1994)), su opisani u US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Ova antitela obuhvataju Fc region sa jednom ili više supstitucija koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve Fc varijante uključuju one sa supstitucijama na jednom ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr., supstitucija ostataka Fc regiona 434 (američki patent br.7,371,826).
[0173] Videti takođe Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); američki patent br.
5,648,260; američki patent br.5,624,821; i WO 94/29351 se bave drugim primerima varijanti Fc regiona.
d) Cisteinski konstruisane varijante antitela
[0174] U nekim načinima ostvarivanja, može biti poželjno stvoriti antitela proizvedena cisteinom, npr., "tioMAb," u kojima su jedan ili više ostataka antitela supstituisani cisteinskim ostacima. U određenim načinima ostvarivanja, supstituisani ostaci se pojavljuju na dostupnim mestima antitela. Supstitucijom tih ostataka sa cisteinom, reaktivne tiolne grupe se na taj način postavljaju na dostupna mesta antitela i mogu se koristiti za konjugovanje antitela na drugim delovima, kao što su delovi leka ili delovi linker-lek, kako bi se stvorio imunokonjugat, kako je ovde dalje opisano . U nekim načinima ostvarivanja, bilo koji jedan ili više od sledećih ostataka može biti supstituisano cisteinom: A118 (EU numeracija) teškog lanca; i S400 (EU numeracija) Fc regiona teškog lanca. Antitela proizvedena cisteinskim inženjeringom mogu da se stvaraju kako je opisano, npr., u američki patentu br.7,521,541.
e) Derivati antitela
[0175] U nekim načinima ostvarivanja, ovde obezbeđeno antitelo može dalje da se modifikuje da sadrži dodatne neproteinske delove koji su poznati u ovoj oblasti i lako dostupni. Delovi pogodni za derivatizaciju antitela uključuju, ali bez ograničenja na polimere rastvorljive u vodi. Neograničavajući primeri polimera rastvorljivih u vodi uključuju, ali bez ograničenja na, polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikola/propilen glikola, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli- 1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/maleinskog anhidrida, poliaminokiseline (bilo homopolimeri ili nasumični kopolimeri) i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, homopolimeri propropilen glikola, kopolimeri prolipropilen oksida/etilen oksida, polioksietilisani polioli (npr., glicerol), polivinil alkohol i njihove mešavine. Polietilen glikol propionaldehid može da ima prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može biti bilo koje molekulske mase, i može biti razgranat ili nerazgranat. Broj polimera pričvršćenih za antitelo može da varira, a ako je vezano više od jednog polimera, to mogu biti isti ili različiti molekuli. Generalno, broj i/ili tip polimera korišćenih za derivatizaciju može da se odredi na osnovu razmatranja uključujući, ali bez ograničenja na, posebna svojstva ili funkcije antitela koje treba poboljšati, da li će se derivat antitela koristiti u terapiji pod definisanim uslovima, itd.
[0176] U nekim načinima ostvarivanja, konjugati antitela i neproteinskog dela koji se može selektivno grejati izlaganjem zračenju. U nekim načinima ostvarivanja, neproteinski deo je ugljenična nanocev (Kam et al., Proc. Natl. Akad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). Zračenje može biti bilo koje talasne dužine i uključuje, ali bez ograničenja na, talasne dužine koje ne oštećuju obične ćelije, ali koje zagrevaju neproteinski deo do temperature na kojoj su ćelije koje su najbliže neproteinskom delu antitela ubijene.
Postupci pripreme
[0177] Antitela (kao što su sdAb) opisana ovde mogu biti pripremljena pomoću postupaka poznatih u ovoj oblasti kao što je ovde opisano.
[0178] Opisani su postupci pripreme sdAb. Videti, na primer, Els Pardon et al, Nature Protocol, 2014; 9(3): 674. Antitela sa jednim domenom (kao što su VHHS) mogu da se dobiju pomoću postupaka poznatih u ovoj oblasti kao što je imunizovanjem Camelid vrsta (kao što su kamila ili lama) i dobijanjem hibridoma od njih, ili kloniranjem biblioteke sdAb pomoću tehnika molekulske biologije opisanih u ovoj oblasti i naknadnim izborom ELISA-om sa pojedinačnim klonovima neizabranih biblioteka ili pomoću prikaza faga.
[0179] Za rekombinantnu proizvodnju sdAb, nukleinske kiseline koje kodiraju sdAb su izolovane i umetnute u vektor koji može dalje da se umnožava za dalje kloniranje (amplifikacija DNK) ili za ekspresiju. DNK koja kodira sdAb lako se izoluje i sekvencira korišćenjem uobičajenih postupaka (npr., korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje se mogu specifično vezivati za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela). Mnogi vektori su dostupni. Izbor vektora delimično zavisi od ćelije domaćina koji se koristi. Generalno, poželjne ćelije domaćini su ili prokariotskog ili eukariotskog (generalno sisarskog) porekla.
1. Poliklonalna antitela
[0180] Poliklonalna antitela se generalno povećavaju kod životinja višestrukim supkutanim (sc) ili intraperitonealnim (ip) injekcijama odgovarajućeg antigena i adjuvansa. Može biti korisno da se odgovarajući antigen konjuguje sa proteinom koji je imunogen u vrsti koja je potrebno da se imunizuje, npr., hemocijanin limpetice (KLH), serumski albumin, goveđi tireoglobulin ili inhibitor tripsina iz soje, pomoću dvofunkcionalnog ili derivatizujućeg sredstva, npr., estar maleimidobenzoil sulfosukcinimida (konjugacija preko cisteinskih ostataka), N-hidroksisukcinimida (preko lizinskih ostataka), glutaraldehida, jantarni anhidrida, SOCl2, ili R<1>N=C=NR, pri čemu R i R<1>R3 nezavisno predstavljaju niže alkilne grupe. Primeri adjuvansa koji mogu da se upotrebljavaju uključuju Freundov potpuni adjuvans i MPL-TDM adjuvans (monofosforil lipid A, sintetički trehaloza dikorinomikolat).
Protokol imunizacije može da izabere stručnjak iz oblasti bez nepotrebnog eksperimentisanja.
[0181] Životinje se imunizuju protiv antigena, imunogenih konjugata ili derivata kombiniovanjem, npr., 100 µg ili 5 µg ili proteina ili konjugata (za zečeve ili miševe, tim redom) sa 3 zapremine Freundovog kompletnog adjuvansa i intradermalnim ubrizgavanjem rastvora na više mesta. Mesec dana kasnije, životinje su pojačane sa 1/5 do 1/10 originalne količine peptida ili konjugata u Freundovom potpunom adjuvansu supkutanom injekcijom na više mesta. Sedam do četrnaest dana kasnije, životinjama se uzima krv i serum se ispituje na titar antitela. Životinje su pojačane dok se ne postigne titar. Konjugati takođe mogu da se naprave u rekombinantnoj ćelijskoj kulturi kao proteinske fuzije. Takođe, sredstva za agregaciju kao što je stipsa su pogodna za jačanje imunog odgovora.
2. Monoklonalna antitela
[0182] Monoklonalna antitela se dobijaju iz populacije uglavnom homogenih antitela, tj., pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična osim mogućih prirodnih mutacija i/ili post-translacionih modifikacija (npr., izomerizacije, amidacije) koji mogu biti prisutni u manjim količinama. Prema tome, modifikator "monoklonalno" ukazuje na to da antitelo nije mešavina diskretnih antitela.
[0183] Na primer, monoklonalna antitela mogu biti napravljena pomoću postupka hibridoma koji su prvi opisali Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ili može biti napravljen postupcima rekombinantne DNK (američki pat. br.4,816,567).
[0184] Kod postupka hibridomom, miš ili druga odgovarajuća životinja domaćin, kao što je hrčak, je imunizovana kao što je ovde prethodno opisano kako bi se dobili limfociti koji proizvode ili koji mogu da proizvode antitela koja će specifično da vezuju protein koji se koristi za imunizaciju. Alternativno, limfociti mogu biti imunizovani in vitro. Limfociti se zatim spajaju sa ćelijama mijeloma koje koriste pogodan agens za spajanje, kao što je polietilen glikol, kako bi se obrazovala hibridomska ćelija (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986).
[0185] Imunizujuće sredstvo će obično uključivati antigenski protein ili njegovu fuzionu varijantu.
Generalno se koriste ili limfociti periferne krvi ("PBL") ako se žele ćelije humanog porekla, ili se koriste ćelije slezine ili ćelije limfnih čvorova ako su željeni izvori sisara nehumanog porekla. Limfociti se zatim spajaju sa besmrtnom ćelijskom linijom pomoću odgovarajućeg sredstva za spajanje, kao što je polietilen glikol, da se formira ćelija hibridoma. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), str.59-103.
[0186] Besmrtne ćelijske linije obično su transformisane ćelije sisara, posebno ćelije mijeloma glodara, goveda i ljudi. Obično se koriste ćelijske linije mijeloma pacova ili miša. Tako pripremljene hibridomske ćelije su zasađene i rastu u odgovarajućoj podlozi kulture koja poželjno sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju rast ili preživljavanje nespojenih roditeljskih ćelija mijeloma. Na primer, ako roditeljskim ćelijama mijeloma nedostaje enzim hipoksantin gvanin fosforibozil transferaza (HGPRT ili HPRT), podloga kulture za hibridome će obično uključivati hipoksantin, aminopterin i timidin (HAT podlogu), a to su stvari koje sprečavaju rast HGPRT –deficijentnih ćelija.
[0187] Poželjne besmrtne ćelije mijeloma su one koje se efikasno spajaju, podržavaju stabilan visok nivo proizvodnje antitela od strane odabranih ćelija koje proizvode antitela i osjetljive su na podlogu kao što je HAT podloga. Među njima, poželjne su linije mišjeg mijeloma, kao što su one izvedene iz MOPC-21 i MPC-11 mišjih tumora dostupnih iz Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA, i SP-2 ćelije (i njihovi derivati, npr., X63-Ag8-653) dostupne od American Type Culture Collection, Manassas, Va. USA. Ćelijske linije ljudskog mijeloma i mišje-ljudskog heteromijeloma takođe su opisane za proizvodnju ljudskih monoklonalnih antitela (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
[0188] Podloga kulture u kojoj rastu hibridomske ćelije se ispituje na proizvodnju monoklonalnih antitela usemrenih protiv antigena. Poželjno je da se specifičnost vezivanja monoklonalnih antitela proizvedenih od strane ćelija hibridoma određuje imunoprecipitacijom ili in vitro ispitivanjem vezivanja, kao što je radioimuno ispitivanje (RIA) ili imunoenzimskom probom (ELISA).
[0189] Podloga kulture u kojoj se kultivišu ćelije hibridoma može da se ispita na prisutnost monoklonalnih antitela usmerenih protiv željenog antigena. Poželjno je da afinitet vezivanja i specifičnost monoklonalnog antitela može da se odredi imunoprecipitacijom ili in vitro ispitivanjem vezivanja, kao što je radioimuno ispitivanje (RIA) ili imunoenzimskom probom (ELISA). Takve tehnike i ispitivanja su poznati u ovoj oblasti. Na primer, afinitet vezivanja može da se odredi putem the Scatchard analysis of Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
[0190] Nakon sto su identifikovane hibridomske ćelije koje proizvode antitela željene specifičnosti, afiniteta, i/ili dejstva, klonovi mogu biti podklonirani ograničavanjem postupaka razblaženja i mogu da se gaje standardnim postupcima (Goding, supra). Podloge pogodne za kulture za ovu svrhu uključuju, na primer, D-MEM ili RPMI-1640 podlogu. Pored toga, hibridomske ćelije mogu da se gaje in vivo kao tumori kod sisara.
[0191] Monoklonalna antitela koja izlučuju subklonovi su pogodno odvojena od podloge kulture, ascitne tečnosti ili seruma uobičajenim postupcima prečišćavanja imunoglobulina kao što je, na primer, protein A-sefaroze, hidroksilapatitna kromatografija, gel elektroforeza, dijaliza ili afinitetna hromatografija.
[0192] Monoklonalna antitela takođe mogu da se dobiju postupcima rekombinantne DNK poput onih opisanih u američki pat. br.4,816,567, i kao što je prethodno opisano. DNK koja kodira monoklonalna antitela se lako izoluje i sekvencira uobičajenim postupcima (npr., pomoću oligonukleotidnih sondi koje mogu specifično da se vezuju za gene koji kodiraju teške i lake lance mišjih antitela). Hibridomske ćelije služe kao poželjni izvor takve DNK. Jednom izolovana, DNK može da se stavi u ekspresione vektore, koji se zatim transfektuju u ćelije domaćina kao što su E coli ćelije, majmunske COS ćelije, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode protein imunoglobulina, kako bi se sintetisala monoklonalna antitela u takvim rekombinantnim ćelijama domaćina. Prikazani članci rekombinantne ekspresije DNK koja kodira antitelo uključuju ni članci o rekombinantnoj ekspresiji DNK koja kodira antitela u bakterijama uključuju Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) and Pliickthun, Immunol. Revs.130: 151-188 (1992).
[0193] Antitela mogu da se izoluju iz biblioteka faga antitela napravljenih pomoću tehnika opisanih u McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990.). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991.) i Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) opisuju izolaciju mišjih i humanih antitela, pomoću biblioteke faga. Naknadne publikacije opisuju proizvodnju humanih antitela visokog afiniteta (nM raspon) mešanjem u lancu (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992.)), kao i kombinatornu infekciju i in vivo rekombinaciju kao strategiju za konstruisanje vrlo velikih biblioteka faga (Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265-2266 (1993)). Stoga ove tehnike predstavljaju održive alternative tradicionalnim tehnikama hibridoma monoklonalnih antitela za izolaciju monoklonalnih antitela.
[0194] DNK takođe može da se modifikuje, na primer, zamenom kodirajuće sekvence za humane konstantne domene teškog i lakog lanca umesto homolognih mišjih sekvenci (američki pat. br.
4,816,567; Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. SAD, 81:6851 (1984)), ili kovalentnim spajanjem imunoglobulinske kodirajuće sekvence cele ili dela kodirajuće sekvence za ne-imunoglobulinski polipeptid. Obično se takvi neimunoglobulinski polipeptidi zamenjuju za konstantne domene antitela, ili se zamenjuju za varijabilne domene jednog antigen-kombinujućeg mesta antitela kako bi se napravilo himerno dvovalentno antitelo koje sadrži jedno antigen-kombinujuće mesto koje ima specifičnost za antigen i drugo mesto za spajanje antigena koje ima specifičnost za različiti antigen.
[0195] Ovde opisana monoklonalna antitela mogu biti jednovalentna, čija je priprema dobro poznata u ovoj oblasti. Na primer, jedan postupak uključuje rekombinantnu ekspresiju lakog lanca imunoglobulina i modifikovanog teškog lanca. Teški lanac je generalno skraćen na bilo kom mestu u Fc regionu tako da se spreči umrežavanje teškog lanca. Alternativno, relevantni cisteinski ostaci mogu biti supstituisani drugim aminokiselinskim ostatkom ili izbrisani kako bi se sprečilo umrežavanje. In vitro postupci su takođe pogodni za pripremu jednovalentnih antitela. Digestija antitela za proizvodnju njihovih fragmenata, posebno Fab fragmenata, može da se postigne pomoću rutinskih tehnika poznatih u ovoj oblasti.
[0196] Himerna ili hibridna antitela takođe mogu da se naprave in vitro korišćenjem poznatih postupaka u hemiji sintetičkih proteina, uključujući one koje uključuju sredstva za umrežavanje. Na primer, imunotoksini mogu da se konstruišu pomoću reakcije izmene disulfida ili stvaranjem tioetarske veze. Primeri pogodnih reagensa za ovu svrhu uključuju iminotiolat i metil-4-merkaptobutirimida.
3. Rekombinantna proizvodnja kod prokariotskih ćelija
a) Konstrukcija vektora
[0197] Polinukleotidne sekvence koje kodiraju antitela korišćena u pronalasku mogu da se dobiju pomoću standardnih rekombinantnih tehnika. Željene polinukleotidne sekvence mogu da se izoluju i sekvenciraju iz ćelija koje proizvode antitela kao što su hibridomske ćelije. Alternativno, polinukleotidi mogu da se sintetišu pomoću sintetizatora nukleotida ili PCR tehnike. Nakon što se dobiju, sekvence koje kodiraju polipeptid se umeću u rekombinantni vektor sposoban za replikaciju i ekspresiju heterolognih polinukleotida u prokariotskim domaćinima. Mnogi vektori koji su dostupni i poznati u ovoj oblasti mogu da se koriste u svrhu ovog pronalaska. Izbor pogodnog vektora će uglavnom zavisiti od veličine nukleinskih kiselina koje će se umetati u vektor i određenoj ćeliji domaćinu koja će se transformirati sa vektorom. Svaki vektor sadrži različite komponente, u zavisnosti od njegove funkcije (amplifikacija ili ekspresija heterolognog polinukleotida, ili oboje) i njegovoj kompatibilnosti sa određenom ćelijom domaćinom u kojoj se nalazi. Komponente vektora generalno uključuju, ali bez ograničenja na: poreklo replikacije, gen marker izbora, promoter, mesto vezivanja ribozoma (RBS), signalnu sekvencu, heterologno umetanje nukleinske kiseline i sekvencu za završetak transkripcije.
[0198] Generalno, plazmidni vektori koji sadrže replikon i kontrolne sekvence koje su izvedene iz vrsta kompatibilnih sa ćelijom domaćinom se koriste u vezi sa tim domaćinima. Vektor obično nosi mesto replikacije, kao i sekvence za označavanje koje su sposobne da osiguraju fenotipski izbor u transformisanim ćelijama. Na primer, E coli se obično transformiše pomoću pBR322, plazmida izvedenog iz E coli vrsta. pBR322 sadrži gene koji kodiraju otpornost na ampicilin (Amp) i tetraciklin (Tet) i na taj način osigurava jednostavan način za identifikaciju transformisanih ćelija. pBR322, njegovi derivati ili drugi mikrobni plazmidi ili bakteriofazi mogu takođe da sadrže, ili da budu modifikovani da sadrže, promotere koje mikrobni organizam može da koristi za ekspresiju endogenih proteina. Primeri derivata pBR322 koji se koriste za ekspresiju određenih antitela detaljno su opisani u Carter et al., američki pat. br. 5,648,237.
[0199] Pored toga, vektori faga koji sadrže replikon i kontrolne sekvence koje su kompatibilne sa mikroorganizmom domaćinom mogu da se koriste kao transformirajući vektori u vezi sa tim domaćinima. Na primer, bakteriofag kao što je GEM<™>-11 može da se koristi za izradu rekombinantnog vektora koji može da se koristi za transformaciju osetljivih ćelija domaćina kao što su E coli LE392.
[0200] Ekspresioni vektor može da obuhvata dva ili više parova promoter-cistron, koji kodiraju svaku od polipeptidnih komponenti. Promoter je neprevedena regulatorna sekvenca koja se nalazi ushodno (5') od cistrona koji modulira njegovu ekspresiju. Prokariotski promoteri obično spadaju u dve klase, inducibilne i konstitutivne. Inducibilni promoter je promoter koji pokreće povećane nivoe transkripcije cistrona pod svojom kontrolom kao odgovor na promene u uslovima kulture, npr. prisutnost ili odsutnost hranjivog sastojka ili promena temperature.
[0201] Dobro je poznat veliki broj promotera koje prepoznaju raznolike potencijalne ćelije domaćina. Odabrani promoter može operativno da se poveže sa cistron DNK koja kodira laki ili teški lanac uklanjanjem promotera iz izvorne DNK digestijom restrikcionog enzima i umetanjem izolovane promoterske sekvence u vektor. I nativna sekvenca promotera i mnogi heterologni promoteri mogu da se koriste za usmeravanje pojačanja i/ili ekspresije ciljnih gena. Mogu da se koriste heterologni promoteri, budući da oni generalno dopuštaju veću transkripciju i veće prinose eksprimiranog ciljnog gena u poređenju sa nativnim ciljnim polipeptidnim promoterom.
[0202] Promoteri pogodni za upotrebu sa prokariotskim domaćinima uključuju PhoA promoter, sisteme promotera galaktamaze i laktoze, sistem promotera triptofana (trp) i hibridne promotere kao što je tac ili trc promoter. Međutim, drugi promoteri koji su funkcionalni u bakterijama (kao što su drugi poznati bakterijski ili fagni promoteri) su takođe pogodni. Njihove sekvence nukleinskih kiselina su objavljene, čime je iskusnom radniku omogućeno operativno povezivanje sa cistronima koji kodiraju ciljne lake i teške lance (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269) pomoću linkera ili adaptera za snabdevanje bilo kog od traženog restrikcionog mesta.
[0203] U jednom aspektu, svaki cistron unutar rekombinantnog vektora sadrži komponentu sekvence signala sekrecije koja usmerava premeštanje eksprimiranih polipeptida preko membrane. Generalno, signalna sekvenca može biti komponenta vektora ili može biti deo DNK ciljnog polipeptida koji je umetnut u vektor. Sekvenca signala odabrana u svrhu ovog pronalaska bi trebalo da bude ona koju prepoznaju i obrađuju (tj. cepa se signalnom peptidazom) ćelije domaćina. Za prokariotske ćelije domaćina koje ne prepoznaju i ne obrađuju signalne sekvence izvorne za heterologne polipeptide, signalna sekvenca je zamenjena prokariotskom signalnom sekvencom odabranom, na primer, iz grupe koja se sastoji od alkalne fosfataze, penicilinaze, Ipp ili enterotoksina II (STII) stabilnog u smislu toplote, LamB, PhoE, PelB, OmpA i MBP. Signalne sekvence koje se koriste u oba cistrona ekspresionog sistema mogu biti STII signalne sekvence ili njihove varijante.
[0204] Proizvodnja antitela može da se javi u citoplazmi ćelije domaćina i stoga ne zahteva prisutnost signalnih sekvenci sekrecije unutar svakog cistrona. Polipeptidne komponente, kao što je polipeptid koji kodira VHdomen prvog antigen-vezujućeg antigena opciono spojen sa drugim antigenski vezujućim delom antigena, i polipeptid koji kodira VLdomen prvog antigen-vezujućeg dela po izboru spojen sa drugim antigenski vezujućim delom, mogu biti eksprimirane, savijene i sklopljene tako da obrazuju funkcionalna antitela unutar citoplazme. Određeni sojevi domaćina (npr., E coli trxB sojevi) obezbeđuju uslove citoplazme koji su povoljni za obrazovanje disulfidne veze, čime se dopušta pravilno savijanje i sastavljanje eksprimiranih proteinskih podjedinica. Proba and Pluckthun Gene, 159:203 (1995).
[0205] Ovde je otkriven ekspresioni sistem u kojem kvantitativni odnos eksprimiranih polipeptidnih komponenata može biti moduliran kako bi se maksimalno povećao prinos izlučenih i pravilno sklopljenih antitela. Takva modulacija se postiže barem delimično istovremenim moduliranjem translacionih snaga za polipeptidne komponente. Jedna tehnika za moduliranje translacione snage je otkrivena u Simmons et al., američki pat. br.5,840,523. Koristi varijante regiona inicijacije translacije (TIR) unutar cistrona. Za dati TIR, niz varijanti sekvenci aminokiselina ili nukleinskih kiselina može da se kreira sa opsegom translacionih snaga, čime se osigurava pogodan način za podešavanje ovog faktora za željeni nivo ekspresije specifičnog lanca. TIR varijante mogu da nastaju uobičajenim tehnikama mutageneze koje dovode do promena kodona koje mogu promeniti sekvencu aminokiselina, iako su poželjne tihe promene u sekvenci nukleinske kiseline. Promene u TIR-u mogu da uključuju, na primer, promene u broju ili razmaku Shine-Dalgarno sekvenci, zajedno sa promenama u signalnoj sekvenci. Jedan postupak za stvaranje mutantnih signalnih sekvenci je stvaranje "banke kodona" na početku kodirajuće sekvence koja ne menja aminokiselinsku sekvencu signalne sekvence (tj., promene su tihe). To može da se postigne promenom položaja trećeg nukleotida svakog kodona; dodatno, neke aminokiseline, kao što su leucin, serin i arginin, imaju višestruke prve i druge položaje koji mogu dodatno da otežaju stvaranje banke. Ovaj postupak mutageneze detaljno je opisan u Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol.4:151-158.
[0206] Poželjno je da se skup vektora pravi u opsegu TIR snaga za svaki cistron u njemu. Ovaj ograničeni skup pruža poređenje nivoa ekspresije svakog lanca kao i prinos željenih proteinskih proizvoda pod različitim kombinacijama TIR snage. Snage TIR mogu da se odrede kvantifikovanjem nivoa ekspresije reporterskog gena kao što je detaljno opisano u Simmons et al. američki pat. br.5,840,523. Na osnovu poređenja translacione snage, odabrani su željeni pojedinačni TIR koji će se kombinovati u ekspresionim vektorskim konstruktima ove prijave.
b) Prokariotske ćelije domaćina.
[0207] Prokariotske ćelije domaćina pogodne za ekspresiju antitela uključuju Archaebacteria i Eubacteria, kao što su gram-negativni ili gram-pozitivni organizmi. Primeri korisnih bakterija uključuju Escherichia (npr. E. coli), Bacili (npr. B. subtilis), enterobakterije, Pseudomonas vrsta (npr. P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, ili Paracoccus. U nekim načinima ostvarivanja koriste se gram-negativne ćelije. U nekim primerima, E coli ćelije se koriste kao domaćini. Primeri za sojeve E coli uključuju soj W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol.2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp.
1190-1219; ATCC broj depoa 27,325) i njihove derivate, uključujući soj 33D3 koji ima genotip W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompT A(nmpc-fepE) degP41 kan<R>(američki pat. br.5,639,635). Drugi sojevi i njihovi derivati, kao što je E coli 294 (ATCC 31,446), E coli B, E coli 1776 (ATCC 31,537) i E coli RV308 (ATCC 31,608) su takođe pogodni. Ovi primeri su ilustrativni, a ne ograničavajući. Postupci za konstruisanje derivata bilo koje od gore pomenutih bakterija koje imaju definisane genotipove poznate su u ovoj oblasti i opisane u, na primer, Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990). Generalno je potrebno da se izaberu odgovarajuće bakterije uzimajući u obzir replikaciju replikona u ćelijama bakterije. Na primer, E. coli, Serratia, ili Salmonela vrste mogu pogodno da se koriste kao domaćini kada se dobro poznati plazmidi kao što su pBR322, pBR325, pACYC177 ili pKN410 koriste za snabdevanje replikonom.
[0208] Obično, ćelija domaćina bi trebalo da luči minimalne količine proteolitičkih enzima, a dodatni inhibitori proteaze mogu poželjno da se ugrađuju u ćelijsku kulturu.
c) Proizvodnja proteina
[0209] Ćelije domaćina se transformišu sa goreopisanim ekspresionim vektorima i kultivišu se u uobičajenim hranjivim podlogama modifikovanim prema potrebi za indukovanje promotera, izbor transformanata ili pojačanje gena koji kodiraju željene sekvence. Transformacija znači uvođenje DNK u prokariotski domaćin tako da se DNK može replicirati, bilo kao ekstrakromosomski element ili kromosomski integrant. U zavisnosti od ćelije domaćina koja se koristi, transformacija se izvodi pomoću standardnih tehnika pogodnih za takve ćelije. Tretiranje kalcijumom koje koristi kalcijum-hlorid se generalno koristi za bakterijske ćelije koje sadrže suštinske barijere ćelijskih zidova. Drugi postupak za transformaciju koristi polietilen glikol/DMSO. Još jedna tehnika koja se koristi je elektroporacija.
[0210] Prokariotske ćelije koje se koriste za proizvodnju antitela uzgajaju se u podlogama poznatim u ovoj oblasti i pogodnim za kulturu odabranih ćelija domaćina. Primeri pogodnih podloga uključuju luria bujon (LB) plus potrebne hranjive dodatke. U nekim primerima, podloga takođe sadrži selekciono sredstvo, odabrano na osnovu konstrukcije ekspresionog vektora, da se selektivno omogući rast prokariotskih ćelija koje sadrže ekspresioni vektor. Na primer, ampicilin se dodaje u podlogu za rast ćelija koje eksprimiraju gen otporan na ampicilin.
[0211] Svi potrebni dodaci osim izvora ugljenika, azota i neorganskih fosfata takođe mogu biti uključeni u odgovarajućim koncentracijama uvedeni sami ili kao mešavina sa drugim dodatkom ili podlogom kao što je složeni izvor azota. Opciono, podloga kulture može da sadrži jedno ili više redukcionih sredstava izabranih iz grupe koju čine glutation, cistein, cistamin, tioglikolat, ditioeritritol i ditiotreitol.
[0212] Prokariotske ćelije domaćina se kultivišu na odgovarajućim temperaturama. Za rast E coli, na primer, poželjna temperatura je u opsegu od oko 20°C do oko 39°C, poželjnije od oko 25°C do oko 37°C, još poželjnije na oko 30°C. pH podloge može biti bilo koji pH u opsegu od oko 5 do oko 9, u zavisnosti uglavnom od organizma domaćina. Za E coli, pH je poželjno od oko 6,8 do oko 7,4, a poželjnije oko 7,0.
[0213] Ako se inducibilni promoter koristi u ekspresionom vektoru, ekspresija proteina se inducira pod uslovima pogodnim za aktivaciju promotera. U jednom aspektu PhoA promoteri se koriste za kontrolu transkripcije polipeptida. U skladu sa tim, transformisane ćelije domaćina se kultivišu u podlozi za ograničavanje fosfata za indukciju. Poželjno, podloga za ograničavanje fosfata je C.R.A.P podloga (videti, npr. Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147). Mogu se koristiti različiti drugi induktori, u skladu sa konstruktom vektora koji se koristi, kao što je poznato u ovoj oblasti.
[0214] Eksprimirana antitela se izlučuju u periplazmu ćelija domaćina i iz nje se oporavljaju. Oporavak proteina obično uključuje ometanje mikroorganizama, generalno sredstvima kao što su osmotski šok, sonikacija ili liza. Kada se ćelije poremete, ćelijski ostaci ili cele ćelije mogu da se uklone centrifugiranjem ili filtracijom. Proteini mogu dalje da se pročiste, na primer, hromatografijom na afinitetnoj smoli. Alternativno, proteini se mogu transportovati u podlogu kulture i iz nje se izolovati. Ćelije mogu da se uklone iz kulture, a supernatant kulture se filtrira i koncentruje za dalje prečišćavanje proizvedenih proteina. Eksprimirani polipeptidi mogu dalje da se izoluju i identifikuju pomoću opšte poznatih postupaka kao što je elektroforeza u poliakrilamidnom gelu (PAGE) i Western blot analiza.
[0215] Alternativno, proizvodnja proteina se izvodi u velikim količinama postupkom fermentacije. Za proizvodnju rekombinantnih proteina dostupni su različiti postupci fermentacije velikih razmera sa punjenjem. Fermentacije velikih razmera imaju najmanje 1000 litara kapaciteta, poželjno oko 1.000 do 100.000 litara kapaciteta. Ovi fermentori koriste propelere mešalice za distribuciju kiseonika i hranjivih materija, posebno glukoze (poželjni izvor ugljenika/energije). Fermentacija u malim razmerama generalno se odnosi na fermentaciju u fermentoru čiji zapreminski kapacitet nije veći od približno 100 litara, a može se kretati od oko 1 litra do oko 100 litara.
[0216] Tokom procesa fermentacije, indukcija ekspresije proteina obično se pokreće nakon što se ćelije uzgajaju u odgovarajućim uslovima do željene gustine, npr., OD550od oko 180-220, u kojoj su fazi ćelije u ranoj stacionarnoj fazi. Mogu da se koriste različiti induktori, u skladu sa korišćenim konstruktom vektora, kao što je poznato u ovoj oblasti i opisano gore. Ćelije mogu da se uzgajaju tokom kraćih perioda pre indukcije. Ćelije se obično indukuju oko 12-50 sati, iako mogu da se koriste duže ili kraće vreme indukcije.
[0217] Da bi se poboljšao proizvodni prinos i kvalitet antitela, različiti uslovi fermentacije mogu da se modifikuju. Na primer, za poboljšanje pravilnog sastavljanja i savijanja izlučenih polipeptida, dodatni vektori koji prekomerno eksprimiraju šaperonske proteine, kao što su Dsb proteini (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD i/ili DsbG) ili FkpA (peptidilprolil cis,trans-izomeraza sa šaperonskom aktivnošću ) mogu da se koriste za kotransformaciju prokariotskih ćelija domaćina. Dokazano je da proteini šaperona olakšavaju pravilno savijanje i rastvorljivost heterolognih proteina proizvedenih u bakterijskim ćelijama domaćinima. Chen et al. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605; Georgiou et al., američki pat. br.
6,083,715; Georgiou et al., američki pat. br.6,027,888; Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem.
275:17100-17105; Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem.275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol.39:199-210.
[0218] Kako bi se proteoliza eksprimiranih heterolognih proteina (posebno onih koji su proteolitički osjetljivi) svela na minimum, određeni sojevi domaćina sa nedostatkom proteolitičkih enzima mogu da se koriste za ovaj pronalazak. Na primer, sojevi ćelija domaćina mogu da se modifikuju da utiču na genetsku(e) mutaciju(e) u genima koji kodiraju poznate bakterijske proteaze kao što su Proteaza III, OmpT, DegP, Tsp, Proteaza I, Proteaza Mi, Proteaza V, Proteaza VI i njihove kombinacije. Neki E coli sojevi sa manjkom proteaze dostupni su i opisani u, na primer,, Joly et al. (1998), supra; Georgiou et al., američki pat. br.5,264,365; Georgiou et al., američki pat. br.5,508,192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).
[0219] Sojevi E. coli kojima fale proteolitičke enzime i transformisani sa plazmidima koji prekomerno eksprimiraju jedan ili više proteina šaperona mogu da se koriste kao ćelije domaćini u ekspresionom sisemu koji kodira antitela.
d) Prečišćavanje proteina
[0220] Ovde proizvedena antitela dalje se prečišćavaju kako bi se dobili preparati koji su suštinski homogeni za dalje analize i upotrebe. Mogu da se upotrebe standardni postupci prečišćavanja proteina poznati u ovoj oblasti. Sledeći postupci su primeri prikladnih postupaka prečišćavanja: frakcionisanje na imunoafinitetnim ili jonsko-izmjenjivačkim kolonama, taloženje etanolom, reverzno-fazna HPLC, hromatografija na silicijumu ili na katjonsko-izmjenjivačkoj smoli kao što je DEAE, hromatofokusiranje, SDS-PAGE, taloženje amonijum-sulfatom, i gel filtracija pomoću, na primer, Sephadex G-75.
[0221] U jednom aspektu, Protein A imobilisan na čvrstoj fazi koristi se za imunoafinitetno prečišćavanje antitela koja sadrže Fc region ove prijave. Protein A je protein ćelijskog zida 41 kD Staphylococcus aureas koji se sa visokim afinitetom veže na Fc region antitela. Lindmark et al (1983) J. Immunol. Meth.
62:1-13. Čvrsta faza na kojoj je protein A imobilisan je poželjno kolona koja sadrži površinu od stakla ili silicijuma, poželjnije staklena kolona sa kontrolisanim porama ili kolona silicijumove kiseline. U nekim je primenama kolona obložena reagensom, poput glicerola, u pokušaju da se spreči nespecifično prianjanje kontaminanata. Čvrsta faza se zatim ispere kako bi se uklonili kontaminanti nespecifično vezani za čvrstu fazu. Na kraju se antitela od značaja izdvajaju iz čvrste faze eluiranjem.
4. Rekombinantna proizvodnja u eukariotskim ćelijama
[0222] Za eukariotsku ekspresiju, komponente vektora generalno uključuju, ali bez ograničenja na, jednu ili više od sledećih, signalnu sekvencu, izvor replikacije, jedan ili više marker gena i pojačivač element, promoter i sekvencu za završetak transkripcije.
a) Komponenta signalne sekvence
[0223] Vektor za upotrebu u eukariotskom domaćinu takođe može predstavljati umetanje koje kodira signalnu sekvencu ili drugi polipeptid koji ima specifično mesto cepanja na N-kraju zrelog proteina ili polipeptida. Poželjno je da odabrana heterologna signalna sekvenca bude ona koja se prepoznaje i obrađuje (tj., cepan signalnom peptidazom) od strane ćelije domaćina. U ekspresiji ćelija sisara, dostupne su signalne sekvence sisara kao i virusni sekretorni lideri, na primer, signalni herpes simplex gD.
[0224] DNK za takav region prekursora se povezuje u okviru za očitavanje sa DNK koja kodira ta antitela.
b) Poreklo replikacije
[0225] Generalno, poreklo replikacione komponente nije potrebno za ekspresione vektore sisara (SV40 poreklo može obično da se koristi samo jer sadrži rani promoter).
c) Selekciona genska komponenta
[0226] Ekspresioni vektori i kloniranja mogu da sadrže selekcioni gen, koji se takođe naziva selektivni marker. Tipični selekcioni geni kodiraju proteine koji (a) daju otpornost na antibiotike ili druge toksine, npr., ampicilin, neomicin, metotreksat ili tetraciklin, (b) nadopunjuju auksotrofne nedostatke, ili (c) snabdevaju kritične hranjive materije koje nisu dostupne iz složenih podloga, npr., gen koji kodira D-alanin racemazu za bacile.
[0227] Jedan primer selekcione šeme koristi lek za zaustavljanje rasta ćelije domaćina. One ćelije koje su uspešno transformisane heterolognim genom proizvode protein koji daje otpornost na lekove i tako preživljavaju režim selekcije. Primeri takve dominantne selekcije koriste lekove neomicin, mikofenolnu kiselinu i higromicin.
[0228] Još jedan primer prikladnih markera koji mogu da se izaberu za ćelije sisara su oni koji omogućavaju identifikaciju ćelija kompetentnih za preuzimanje nukleinske kiseline koja kodira antitela, kao što su DHFR, timidin kinaza, metalotionein-I i -II, poželjno metalotioneinski geni primata, adenozin deaminaza, ornitin dekarboksilaze itd.
[0229] Na primer, ćelije transformisane DHFR selekcionim genom su prve identifikovane kultivisanjem svih transformanta u podlozi za kulture koja sadrži metotreksat (Mtx), kompetetivni antagonist DHFR. Prigodna ćelija domaćina kada se koristi DHFR divljeg tipa je jajna ćelijska linija kineskog hrčka (CHO) kod DHFR dejstva (npr., ATCC CRL-9096).
[0230] Alternativno, ćelije domaćina (naročito domaćini divljeg tipa koji sadrže endogeni DHFR) transformisane ili ko-transformisane sa sekvencama DNK koje kodiraju polipeptid, divljim tipom DHFR proteina i drugim selektivnim markerom kao što je aminoglikozid 3'-fosfotransferaza (APH) mogu biti izabrane po ćelijskom ratu u podlozi koja sadrži selekcioni agens za selektabilni marker kao što je aminoglikozidni antibiotik, npr., kanamicin, neomicin ili G418. Videti američki pat. br.4,965,199.
d) Komponenta promotera
[0231] Ekspresioni i klonirajući vektori obično sadrže promoter koji prepoznaje organizam domaćina i koji je operativno povezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira željene polipeptidne sekvence.
Praktično svi eukariotski geni imaju AT-bogati region smešten 25 do 30 ushodno od mesta gde je transkripcija započeta. Druga sekvenca pronađena 70 do 80 baza ushodno od početka transkripcije mnogih gena je CNCAAT region gde N može biti bilo koji nukleotid.3' kraj većine eukariota je AATAAA sekvenca koja može biti signal za dodavanje poli A repa na 3' kraj kodirajuće sekvence. Sve ove sekvence mogu da se umetnu u eukariotske ekspresione vektore.
[0232] Ostali promoteri pogodni za upotrebu sa prokariotskim domaćinima uključuju phoA promoter, sisteme promotera laktamaze i laktoze, promoter alkalne fosfataze, promoteriki sistem triptofana (trp) i hibridne promotere kao što je tac promoter. Međutim, pogodni su drugi poznati bakterijski promoteri. Promoteri za upotrebu u bakterijskim sistemima takođe će sadržati Shine-Dalgarno (S.D.) sekvencu operativno povezanu sa DNK koja kodira antitela.
[0233] Transkripciju polipeptida iz vektora u ćelijama domaćina sisara kontrolišu, na primer, promoteri dobijeni iz genoma virusa kao što su polioma virus, virus kokošijih boginja, adenovirus (kao što je adenovirus 2), goveđi papiloma virus, virus ptičjeg sarkoma, citomegalovirus, retrovirus , virus hepatitisa B i najpoželjnije Simian virus 40 (SV40), iz heterolognih promotera sisara, npr., promoter aktina ili promoter imunoglobulina, od promotera toplotnog udara, pod uslovom da su takvi promoteri kompatibilni sa sistemima ćelija domaćina.
[0234] Rani i kasni promoteri SV40 virusa se uobičajeno dobijaju u obliku SV40 restrikcionog fragmenta koji takođe sadrži SV40 virusno poreklo replikacije. Neposredni rani promoter ljudskog citomegalovirusa se uobičajeno dobija kao HindIII E restrikcioni fragment. Sistem za ekspresiju DNK u domaćinima sisarima koji koriste goveđi papiloma virus kao vektor otkriven je u američkom pat. br.4,419,446.
Modifikacija ovog sistema opisana je u američkom pat. br.4,601,978. Videti takođe Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) o ekspresiji cDNK humanog interferona u mišjim ćelijama pod kontrolom promotera timidin kinaze iz herpes simplex virusa. Alternativno, dugo terminalno ponavljanje virusa Rousovog sarkoma može da se koristi kao promoter.
e) Komponenta elementa pojačivača
[0235] Transkripcija DNK koja kodira antitela kod viših eukariota se često povećava umetanjem pojačivačke sekvence u vektor. Mnoge pojačivačke sekvence sada su poznate iz gena sisara (globin, elastaza, albumin, α-fetoprotein i insulin). Međutim, obično se koristi pojačivač iz virusa eukariotskih ćelija. Primeri uključuju SV40 pojačivač na kasnoj strani početka replikacije (bp 100-270), pojačivač ranog promotera citomegalovirusa, pojačivač polioma na kasnoj strani polazišta replikacije i pojačivače adenovirusa. Videti takođe Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) o elementima za poboljšanje aktivacije eukariotskih promotera. Pojačivač može da se spoji u vektor na položaju 5' ili 3' u odnosu na sekvencu koja kodira polipeptid, ali se poželjno nalazi na mestu 5' od promotera.
f) Terminaciona komponenta transkripcije
[0236] Ekspresioni vektori korišćeni u eukariotskim ćelijama domaćinima (kvasci, gljive, insekti, biljke, životinje, ljudi ili ćelije sa jezgrom iz drugih višećelijskih organizama) takođe će sadržati sekvence potrebne za završetak transkripcije i za stabilizaciju mRNK. Takve sekvence su obično dostupne iz 5' i, povremeno 3', neprevedenih regiona eukariotskih ili virusnih DNK ili cDNK. Ovi regioni sadrže segmente nukleotida transkribovane kao poliadenilisani fragmenti u neprevedenom delu mRNK koja kodira polipeptid. Jedna korisna komponenta završetka transkripcije je region poliadenilacije goveđeg hormona rasta. Videti WO94/11026 i ekspresioni vektor koji je tamo otkriven.
g) Izbor i transformacija ćelija domaćina
[0237] Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju DNK u vektorima ovde uključuju ćelije višeg eukariota koje su ovde opisane, uključujući ćelije domaćine kičmenjaka. Razmnožavanje ćelija kičmenjaka u kulturi (kulturi tkiva) postalo je rutinski postupak. Primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara su linija CV1 bubrega majmuna transformisana sa SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linija bubrega ljudskog embriona (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u kulturi suspenzije, Graham et al., J. Gen Virol.
36:59 (1977)); bubrežne ćelije bebe hrčka (BHK, ATCC CCL 10); ćelije jajnika kineskog hrčka/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Akad. Sci. USA 77:4216 (1980)); mišje Sertolijeve ćelije (TM4, Mather, Biol. Reprod.23:243-251 (1980)); ćelije majmunskog bubrega (CV1 ATCC CCL 70); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587); ćelije ljudskog karcinoma vrata materice (HELA, ATCC CCL 2); ćelije bubrega pasa (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre bivolskog pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ćelije ljudskih pluća (W138, ATCC CCL 75); ćelije ljudske jetre (Hep G2, HB 8065); mišji tumor dojke (MMT 060562, ATCC CCL51); TR1 ćelije (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci.383:44-68 (1982)); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i linija ljudskog hepatoma (Hep G2).
[0238] Ćelije domaćina se transformišu sa gore opisanim ekspresionim ili klonirajućim vektorima za proizvodnju antitela i kultivišu u uobičajenim hranjivim podlogama modifikovanim prema potrebi za indukovanje promotera, izbor transformanata ili pojačanje gena koji kodiraju željene sekvence.
h) Kultivisanje ćelija domaćina
[0239] Ćelije domaćina koje se koriste za proizvodnju antitela mogu da se uzgajaju u različitim podlogama. Komercijalno dostupne podloge kao što su Hamov F10 (Sigma), minimalna esencijalna podloga ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) i Dulbekova modifikaciona Eagleova podloga ((DMEM), Sigma) su pogodni za kultivisanje ćelija domaćina. Osim toga, bilo koja podloga opisana u Ham et al., Meth. Enz.58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980), američki pat. br.
4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; ili 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; ili američka pat. re. 30,985 mogu da se koriste kao podloge za kulturu ćelija domaćina. Bilo koja od ovih podloga može prema potrebama da se dopunjava hormonima i/ili drugim faktorima rasta (kao što je insulin, transferin ili epidermalni faktor rasta), solima (kao što je natrijum-hlorid, kalcijum, magnezijum i fosfat), puferima (kao što je HEPES ), nukleotidima (kao što su adenozin i timidin), antibioticima (kao što je GENTAMYCIN<™>lek), elementima u tragovima (definisani kao neorganska jedinjenja koja su obično prisutna u konačnim koncentracijama u mikromolarnom opsegu) i glukoza ili ekvivalentni izvor energije. Svi drugi potrebni dodaci takođe mogu biti uključeni u odgovarajućim koncentracijama koje bi bile poznate stručnjacima iz ove oblasti. Uslovi kulture, kao što su temperatura, pH i slično, su oni koji su prethodno korišćeni sa ćelijom domaćinom odabranom za ekspresiju, i biće očigledni običnom stručnjaku iz oblasti.
i) Prečišćavanje proteina
[0240] Pri korišćenju rekombinantnih tehnika antitela mogu biti proizvedena intracelularno, u periplazmatskom prostoru ili se direktno izlučuju u podlogu. Ako se antitelo proizvodi intracelularno, kao prvi korak, čestice otpadaka, bilo ćelija domaćina ili lizovanih fragmenata se uklanjaju, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) opisuju postupak za izolaciju antitela koja se izlučuju u periplazmatski prostor E coli. Ukratko, ćelijska pasta se otopi u prisustvu natrijum-acetata (pH 3,5), EDTA i fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF) tokom oko 30 minuta. Ostaci ćelija mogu da se uklone centrifugiranjem. Tamo gde se antitelo izlučuje u podlogu, supernatanti iz takvih ekspresionih sistema se generalno prvo koncentruju upotrebom komercijalno dostupnog filtera za koncentraciju proteina, na primer, Amicon ili Millipore Pellicon ultrafiltraciona jedinica. Inhibitor proteaze kao što je PMSF može da se uključi u bilo koji od prethodnih koraka za inhibiciju proteolize, a antibiotici mogu da se uključe kako bi se sprečio rast sporednih kontaminanata.
[0241] Sastav proteina proizvedenog od ćelija može biti prečišćen pomoću, na primer, hidroksilapatitne hromatografije, gel elektroforeze, dijalize, i afinitetne hromatografije, pri čemu je afinitetna hromatografija poželjna tehnika prečišćavanja. Pogodnost proteina A kao afinitetnog liganda zavisi od vrste i izotipa bilo kog Fc domena imunoglobulina koji je prisutan u antitelu. Protein A može da se koristi za prečišćavanje antitela koja su bazirana na humanim imunoglobulinima koji sadrže 1, 2 ili 4 teška lanca (Lindmark et al., J. Immunol. Meth.62:1-13 (1983)). Protein G se preporučuje za sve izotipove miševa i za ljude 3 (Guss et al., EMBO J.5:1567-1575 (1986.)). Matrica na koju je vezan afinitetni ligand najčešće je agaroza, ali su dostupne i druge matrice. Mehanički stabilne matrice kao što je staklo sa kontrolisanim porama ili poli(stiren-divinil)benzen omogućavaju brže protoke i kraće vreme obrade nego što se može postići sa agarozom. Kada antitelo sadrži CH3 domen, Bakerbond ABXTM smola (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) se koristi za prečišćavanje. Ostale tehnike za prečišćavanje proteina kao što je frakcionisanje na koloni za jonsku razmenu, taloženje etanolom, HPLC reverzne faze, hromatografija na silikagelu, hromatografija na heparinu SEPHAROSE<™>hromatografija na anjonskoj ili katjonskoj izmjenjivačkoj smoli (kao što je kolona poliasparaginske kiseline), hromatografsko fokusiranje, SDS-PAGE i taloženje amonijum-sulfatom su takođe dostupni u zavisnosti od antitela koje treba da se oporavi.
[0242] Nakon bilo kog preliminarnog koraka prečišćavanja, mešavina koja sadrži antitelo od značaja i kontaminante može se podvrgne hidrofobnoj interakcionoj hromatografiji sa niskom pH pomoću elucionog pufera na pH između oko 2,5-4,5, poželjno izvedeno pri niskim koncentracijama soli (npr., od oko 0-0,25 M soli).
Imunokonjugati (odeljak "Imunokonjugati" je otkriven kao referenca. Načini ostvarivanja otkriveni u ovom odeljku nisu načini ostvarivanja ovog pronalaska.)
[0243] U nekim načinima ostvarivanja takođe postoje imunokonjugati koji sadrže bilo koja od ovde opisanih antitela (kao što su sdAb) konjugovana na jednom ili više citotoksičnih sredstava, kao što su hemoterapijska sredstva ili lekovi, sredstva za inhibiciju rasta, toksini (npr., proteinski toksini, enzimatski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili njihovi fragmenti), ili radioaktivni izotopi.
[0244] U nekim načinima ostvarivanja, imunokonjugat je konjugat antitelo-lek (ADC) u kojem je antitelo konjugovano na jednom ili više lekova, uključujući ali bez ograničenja na majtanzinoid (videti američki patent br.5,208,020, 5,416,064 I evropski patent EP 0425235 B1); auristatin kao što su monometilauristatinski delovi DE i DF (MMAE i MMAF) (videti američke patente br.
5,635,483 i 5,780,588, i 7,498,298); dolastatin; kaliheamicin ili njegov derivat (videti američke patente br. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, i 5,877,296; Hinman et al., Cancer Res.53:3336-3342 (1993); i Lode et al., Cancer Res.58:2925-2928 (1998)); antraciklin kao što je daunomicin ili doksorubicin (vidjeti Kratz et al., Current Med. Chem.13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Pisma 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem.16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Akad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Pisma 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem.45:4336-4343 (2002); i američki patent br.
6,630,579); metotreksat; vindezin; taksan poput docetaksela, paklitaksela, larotaksela, tesetaksela i ortataksela; trihotecen; i CC1065.
[0245] U nekim načinima ostvarivanja, imunokonjugat obuhvata antitelo kao što je ovde opisano konjugovano na enzimatski aktivnim toksinom ili njegovim fragmentom, uključujući ali bez ograničenja na lanac difterije A, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, lanac eksotoksina A (iz Pseudomonas aeruginosa), lanac ricina A, lanac abrina A, lanac modecina A, alfa-sarcin, proteini Aleurites fordii, proteini diantin, proteini Phytolaca americana (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor momordica charantia, curcin, krotin, inhibitor sapaonaria officinalis, gelonin, mitogellin, restriktocina, fenomicina, enomicina i trikotecena.
[0246] U nekim načinima ostvarivanja, imunokonjugat obuhvata antitelo kao što je ovde opisano konjugovano na radioaktivnomm atomu kako bi se obrazovao radiokonjugat. Razni radioaktivni izotopi su dostupni za proizvodnju radiokonjugata. Primeri uključuju At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu. Kada se radiokojnugat koristi za detekciju, mogu da obuhvataju radioaktivni atom za scintigrafska ispitivanja, na primer tc99m ili I123, ili spinsko obeležavanje za snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) (takođe poznatom kao slikanje magnetnom rezonancom, mri), kao što su jod-123 ponovo, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili železo.
[0247] Konjugati antitela i citotoksičnog agensa mogu da se naprave pomoću raznih dvofunkcionalnih proteinskih agensa za spajanje kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), dvofunkcionalni derivati imidoestera (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), derivati bisdiazonija (kao što je bis-(p-diazonijbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat) i bis-aktivni jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2, 4-dinitrobenzen). Na primer, ricin imunotoksin može da se napravi kako je opisano u Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Ugljenik-14-označena 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentaoctena kiselina (MX-DTPA) je primer helatnog sredstva za konjugaciju radionukleotida na antitelo. Videti WO94/11026. Linker može biti "linker koji se može cepati" koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliji. Na primer, može da se koristi kiselinskilabilan linker, linker osetljiv na peptidazu, fotolabilni linker, dimetilni linker ili linker koji sadrži disulfid (Chari et al., Cancer Res.52: 127-131 (1992); američki patent br.5,208,020).
[0248] Imunokonjugati ili ADC koji su ovde naročito u razmatranju, ali bez ograničenja na takve konjugate pripremljene sa reagensima za umrežavanje, uključujući, ali bez ograničenja na, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC i sulfo-SMPB, i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat) koji su komercijalno dostupni (npr., od Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., SAD).
Postupci i kompozicije za dijagnostiku i detekciju (Odjeljak "Postupci i kompozicije za dijagnostiku i detekciju" je otkriven kao referenca. Načini ostvarivanja otkriveni u ovom odeljku ne predstavljaju načine ostvarivanja ovog pronalaska.)
[0249] U nekim načinima ostvarivanja, bilo koje od antitela (kao što su sdAb) koje je ovde navedeno je korisno za otkrivanje prisustvu BCMA u biološkom uzorku. Pojam "detekcija" kako se ovde koristi obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. U određenim načinima ostvarivanja, biološki uzorak je krv, serum ili drugi tekući uzorci biološkog porekla. U nekim načinima ostvarivanja, biološki uzorak sadrži ćeliju ili tkivo.
[0250] U nekim načinima ostvarivanja, antitelo anti-BCMA (kao što je bilo koje od ovde opisanih sdAb anti-BCMA ) za upotrebu u postupku dijagnoze ili detekcije. U daljem aspektu, dat je postupak detekcije prisustvu BCMA u biološkom uzorku. U nekim načinima ostvarivanja, postupak uključuje otkrivanje prisustvu BCMA proteina u biološkom uzorku. U određenim načinima ostvarivanja, BCMA je humani BCMA. U određenim načinima ostvarivanja, postupak uključuje dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa anti-BCMA antitelom kao što je ovde opisano pod uslovima koji dopuštaju vezivanje anti-BCMA antitela na BCMA, i otkrivanje ukoliko se obrazuje kompleks između anti-BCMA antitela i BCMA. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA antitelo se koristi za odabir subjekata pogodnih za terapiju anti-BCMA antitelima, npr. gde je BCMA biomarker za odabir pacijenata.
[0251] U određenim načinima ostvarivanja, obezbeđena su obeležena sdAb anti-BCMA. Obeležja uključuju, ali bez ograničenja na, oznake ili ostatke koji se direktno detektuju (kao što su fluorescentne, kromoforne, elektronske-guste, kemiluminiscentne i radioaktivne oznake), kao i ostatke, kao što su enzimi ili ligandi, koji se neposredno detektuju, npr., putem enzimske reakcije ili molekulske interakcije. Primeri oznaka uključuju, ali bez ograničenja na, radioizotope<32>P,<14>C,<125>I,<3>H<131>I, fluorofori kao što su helati retkih zemalja ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, dansil, umbeliferon, luceriferaze, npr., luciferaza svica i bakterijska luciferaza (američki patent br.4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindioni, peroksidaza rena (HRP), alkalna fosfataza, β-galaktozidaza, glukoamilaza, lizozim, saharid oksidaze, npr. glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, heterocikličke oksidaze kao što su urikaza i ksantin oksidaza, zajedno sa enzimom koji koristi vodonikperoksid za oksidaciju prekursora boje kao što je HRP, laktoperoksidaza ili mikroperoksidaza, biotin/avidin, spinska obeležavanja, bakteriofagne oznake, stabilni slobodni radikali, i slično.
III. Himerni antigenski receptori
[0252] Ovaj pronalazak obezbeđuje CAR kao što je definisan u patentnim zahtevima. Himerni antigenski receptor (CAR) može da obuhvata ekstracelularni antigenski vezujući domen koji obuhvata jedno ili više antitela sa jednim domenom (kao što su VHHS). Bilo koje od sdAb anti-BCMA opisano u Odeljku II može da se koristi u ovde opisanim CAR. Primeri struktura CAR su prikazani na FIG.15A-15D.
[0253] CAR koji cilja BCMA (ovde se takođe navodi kao "BCMA CAR") može da sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni antigenski vezujući domen koji obuhvata sdAb anti-BCMA ; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. sdAb anti-BCMA može biti kamelidno, himerno, humano ili humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata primarnu intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalni domen izveden je iz kostimulatornog molekula odabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, Ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) smešten između C-kraja ekstracelularnog domena vezivanja antigena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid se sastoji od N-kraja do C-kraja: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domeni, CD28 transmembranski domen, prvi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28 , druga kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid se sastoji od N-kraja do C-kraja: CD8α signalni peptid, ekstracelularni antigenski vezujući domen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. BCMA CAR može da se opiše kao monospecifičan.
[0254] BCMA CAR može da obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigenski vezujući domen koji sadrži sdAb anti-BCMA ; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu sdAb anti-BCMA sadrži bilo šta od sledećeg: CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 41; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 79; ili CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:10; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 48; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:86. sdAb anti-BCMA može biti kamelidno, himerno, humano ili humanizovano. sdAb anti-BCMA može da sadrži VHH domen koja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 117 i 124. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula odabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, Ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) smeštenu između C-kraja ekstracelularnog domena vezivanja antigena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid se sastoji od N-kraja do C-kraja: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, prvi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28 , drugi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid se sastoji od N-kraja do C-kraja: CD8α signalni peptid, ekstracelularni antigenski vezujući domen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA CAR je monospecifičan.
[0255] BCMA CAR može da obuhvata polipeptid sa najmanje bilo kog od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 300-305. BCMA CAR može da obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 300-305. Ovo je polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 300-305.
[0256] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira bilo koji od BCMA CAR pronalaska. Izolovana nukleinska kiselina može da ima najmanje bilo koji od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline odabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 338-343. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 338-343. Izolovana nukleinska kiselina može biti DNK. Izolovana nukleinska kiselina može biti RNK. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je vektor koji sadrži bilo koju od nukleinskih kiselina koje kodiraju gore opisane BCMA CAR. U nekim načinima ostvarivanja, vektor je ekspresioni vektor. U nekim načinima ostvarivanja, vektor je virusni vektor, kao što je lentivirusni vektor. U nekim načinima ostvarivanja, vektor je nevirusni vektor. Primeri jednovalentnih BCMA CAR prikazani su u tabeli 4 u nastavku kao referenca.
Tabela 4. Primeri jednovalentnih BCMA CAR. (otkriveno je kao referenca)
Viševalentni himerni antigenski receptori
[0257] Ovaj pronalazak obezbeđuje viševalentne CAR kako je definisano u zahtevima koji imaju prvi i drugi sdAb koji se specifično vezuju za BCMA. Viševalentni CAR može biti monospecifičan, tj., viševalentni CAR cilja jedan antigen i sadrži dva ili više vezujućih mesta za jedan antigen. Viševalentni CAR može biti multispecifičan, tj., viševalentni CAR cilja više od jednog antigena, a viševalentni CAR sadrži dva ili više vezujućih mesta za najmanje jedan antigen. Vezujuće grupe specifične za isti antigen mogu da se vezuju za isti epitop antigena (tj. "mono-epitop CAR") ili se vezuju za različite epitope (tj., "multi-epitop CAR" kao što je bi-epitop CAR ili tri-epitop CAR) antigena.
[0258] Viševalentni (kao što je dvovalentni, trovalentni ili sa većim brojem valentnosti) himerni antigenski receptor može da sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni antigen-vetujući domen koji sadrži veći broj (kao što je najmanje bilo koji od 2, 3, 4, 5, 6 ili više) vezujućih delova koji se specifično vezuju za antigen (kao što je tumorski antigen); (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. Antigen može da se izabere iz grupe koju čine CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, i glikolipid F77.
[0259] Viševalentni (kao što su dvovalentni, trovalentni, ili veći broj valentnosti) himerni antigenski receptor može da obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigenski vezujući domen koji obuhvata veći broj (kao što je najmanje oko bilo koju od 2, 3, 4, 5, 6, ili više) antitela sa jednim domenom (sdAb) koji se specifično vezuje za antigen (kao što je tumorski antigen); (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. Antigen može biti izabran iz grupe koju čine CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, i glikolipid F77.
[0260] Viševalentni (kao što je dvovalentni, trovalentni ili sa većim brojem valentnosti) himerni antigenski receptor može da sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni antigenski vezujući domen koji obuhvata prvu vezujuću grupu koja se specifično vezuje za prvi epitop antigena (kao što je tumorski antigen), i drugi vezujući deo koji se specifično vezuje za drugi epitop antigena; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu su prvi epitop i drugi epitop različiti. Antigen može da se izabere iz grupe koju čine CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO- 1, MAGE A3 i glikolipid F77. U nekim primerima, prva vezujuća grupa je sdAb, a druga vezujuća grupa je izvedena iz humanog antitela (npr., scFv). U nekim primerima, prva vezujuća grupa je sdAb, a druga vezujuća grupa je polipeptidni ligand. Prvi epitop može biti isti kao drugi epitop. Prvi epitop može da se razlikuje od drugog epitopa. Viševalentni CAR može specifično da se vezuje za dva različita epitopa na antigenu. Viševalentni CAR može specifično da se vezuje za tri ili više različitih epitopa na antigenu.
[0261] Viševalentni (kao što su dvovalentni, trovalentni, ili većeg broja valentnosti) himerni antigenski receptor može da obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigenski vezujući domen koji obuhvata prvi sdAb koji se specifično vezuje za prvi epitop antigena (kao što je tumorski antigen), i drugi sdAb koji se specifično vezuje za drugi epitop antigena; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu su prvi epitop i drugi epitop različiti. Antigen može biti izolovan iz grupe koju čine CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, i glikolipid F77.
[0262] sdAb (uključujući veći broj sdAb, ili prvo sdAb i/ili drugo sdAb) može biti kamelidno, himerno, humano, ili humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, sdAb su međusobno spojena peptidnim vezama ili peptidnim linkerima. U nekim načinima ostvarivanja, svaki peptidni linker nije veći od oko 50 (kao što je najviše oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10, ili 5) aminokiselina u dužini. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen je izabran iz grupe koju čine CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata kostimulatorni signalni domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, Ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni CAR dalje obuhvata zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-kraja ekstracelularnog antigenskog vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni CAR dalje obuhvata signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata od N-kraja do C-kraja: CD8α signalni peptid, ekstracelularni antigenski vezujući domen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni CAR je monospecifičan. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni CAR je multispecifičan, kao što je bispecifičan.
[0263] Ovde opisani viševalentni CAR mogu biti posebno prikladni za ciljanje multimernih antigena putem sinergističkog vezivanja pomoću različitih vezujućih mesta za antigen ili za povećanje afiniteta ili avidnosti vezivanja za antigen. Bilo koje od ovde opisanih sdAb anti-BCMA može da se koristi u ekstracelularnom vezujućem domenu antigena ovde opisanih viševalentnih CAR. Lista primera viševalentnih BCMA CAR, primera sekvenci, konstrukata i njihovih vektora prikazana je u tabeli 5.
[0264] Viševalentni CAR koji cilja BCMA može da sadrži: (a) ekstracelularni antigenski vezujući domen koji sadrži veći broj (kao što je najmanje oko bilo kog od 2, 3, 4 ili više) BCMA vezujuće grupe (npr. sdAb anti-BCMA); (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. Bilo koji od sdAb anti-BCMA može da se koristi za konstrukciju viševalentnog BCMA CAR. Ekstracelularni domen vezivanja antigena može specifično da se vezuje za jedan epitop BCMA, a ti CAR se ovde nazivaju mono-epitopski viševalentni BCMA CAR.
[0265] Kao referenca je otkriven viševalentni BCMA CAR koji sadrži: (a) ekstracelularni domen vezivanja antigena koji sadrži veći broj (kao što je najmanje bilo koji od 2, 3, 4 ili više) sdAb anti-BCMA; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu sdAb anti-BCMA sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39, i CDR3 koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:77.
[0266] Kao referenca otkriven je viševalentni BCMA CAR (ovde se takođe navodi kao "multiepitopni viševalentni CAR") koji sadrži: (a) ekstracelularni antigenski vezujući domen koji sadrži najmanje dve (kao što je bilo koja od 2, 3, 4 ili više) BCMA vezujućih grupa; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu se najmanje dva BCMA vezujuća dela specifično vezuju za najmanje dva različita epitopa na BCMA. U nekim primerima, ekstracelularni antigenski vezujući domen sadrži prvu BCMA vezujuću grupu i drugu BCMA vezujuću grupu. U nekim primerima, prvi BCMA vezujući deo je sdAb anti-BCMA, a drugi BCMA vezujući deo je izveden iz humanog antitela (npr. scFv). U nekim primerima, prvi BCMA vezujući deo je sdAb, a drugi BCMA vezujući deo je BCMA polipeptidni ligand. U nekim primerima, prvi anti-BCMA vezujući deo i/ili drugi BCMA vezujući deo specifično se vezuju za epitop na BCMA koji je izveden iz aminokiselinske sekvence odabrane od SEQ ID NO: 388-394. U nekim primerima, prvi BCMA vezujući deo specifično se vezuje za epitop izveden iz SEQ ID NO: 389 i/ili 390. U nekim primerima, drugi BCMA vezujući deo specifično se vezuje za epitop izveden iz SEQ ID NO: 391 i/ili 392.
[0267] Viševalentni BCMA CAR može da obuhvata: (a) ekstracelularni antigenski vezujući domen koji obuhvata prvi sdAb anti-BCMA i drugi sdAb anti-BCMA ; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu se prvo sdAb anti-BCMA i drugo sdAb anti-BCMA specifično vezuju za različite epitope na BCMA. U nekim primerima, prvo sdAb anti-BCMA i/ili drugo sdAb anti-BCMA se specifično vezuje za epitop na BCMA izveden iz aminokiselinske sekvence izabrane od SEQ ID NO: 388-394. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb anti-BCMA sadržano u CAR pronalaska se specifično vezuje za epitop izveden iz SEQ ID NO: 389 i/ili 390. U nekim načinima ostvarivanja, drugi sdAb anti-BCMA sadržan u CAR pronalaska se specifično vezuje za epitop izveden iz SEQ ID NO: 391 i/ili 392.
[0268] Ovaj pronalazak obezbeđuje viševalentni BCMA CAR kao što je definisano u patentnim zahtevima. CAR može da obuhvata: (a) ekstracelularni antigenski vezujući domen koji obuhvata prvo sdAb anti-BCMA i drugo sdAb anti-BCMA ; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu prvo sdAb anti-BCMA obuhvata CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3, CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:41, i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:79; i pri čemu drugi sdAb anti-BCMA obuhvata CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:10, CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:48, i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:86. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb anti-BCMA obuhvata VHH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 117. U nekim načinima ostvarivanja, drugo sdAb anti-BCMA obuhvata VHH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb anti-BCMA obuhvata VHH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124. U nekim načinima ostvarivanja, drugi sdAb anti-BCMA obuhvata VHH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 117.
[0269] U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb anti-BCMA se nalazi na N-kraju drugog sdAb anti-BCMA . U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb anti-BCMA se nalazi na C-kraju drugog sdAb anti-BCMA . U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb anti-BCMA i drugo sdAb anti-BCMA su međusobno spojena peptidnom vezom ili peptidnim linkerom. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker nije veći od oko 50 (kao što je najviše oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10, ili 5) aminokiselina u dužini. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata kostimulatorni signalni domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, Ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, viševalent BCMA CAR dalje obuhvata zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-kraja ekstracelularnog antigenskog vezujućeg domena i N-kraj transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni BCMA CAR dalje obuhvata signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata od N-kraja do C-kraja: CD8α signalni peptid, ekstracelularni antigenski vezujući domen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni BCMA CAR je dvovalentan. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni BCMA CAR je trovalentan. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni BCMA CAR se specifično vezuje za dva različita epitopa na BCMA. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni BCMA CAR se specifično vezuje za tri ili više različitih epitopa na BCMA.
[0270] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je viševalentni BCMA CAR koji obuhvata polipeptid sa najmanje bilo kog od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 300-305. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je viševalentni BCMA CAR koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 300-305. Takođe je obezbeđen polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 300-305.
[0271] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira bilo koje viševalentne BCMA CAR pronalaska. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina sa najmanje bilo kog od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 338-343. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 338-343. U nekim načinima ostvarivanja, izolovana nukleinska kiselina je DNK. U nekim načinima ostvarivanja, izolovana nukleinska kiselina je RNK. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je vektor koji obuhvata bilo koju od nukleinskih kiselina koja kodira viševalentne BCMA CAR pronalaska. U nekim načinima ostvarivanja, taj vektor je ekspresioni vektor. U nekim načinima ostvarivanja, vektor predstavlja virusni vektor, kao što je lentivirusni vektor. U nekim načinima ostvarivanja, taj vektor je nevirusni vektor. Primeri viševalentnih BCMA CAR su prikazani u tabeli 5 u nastavku.
(*=viševalentni BCMA CAR pronalaska. Drugi CAR su otkriveni kao referenca.)
Tabela 5 Primeri viševalentnih BCMA CAR.
Multispecifični himerni antigenski receptor (odeljak "Multispecifični himerni antigenski receptor" je otkriven kao referenca. Načini ostvarivanja otkriveni u ovom odeljku nisu načini ostvarivanja ovog pronalaska.)
[0272] Ovde su takođe otkriveni multispecifični himerni antigenski receptori koji ciljaju dva ili više (kao što je oko ili 2, 3, 4, 5, 6, ili više) različitih antigena. U nekim načinima ostvarivanja, multispecifičаn CAR ima jedno antigensko vezujuće mesto za svaki antigen. U nekim načinima ostvarivanja, multispecifični CAR ima više od dva vezujuća mesta za najmanje jedan antigen. Svako antigensko vezujuće mesto može da obuhvata sdAb. Na primer, u nekim načinima ostvarivanja, multispecifičan CAR je bispecifičan CAR koji obuhvata ekstracelularni antigenski vezujući domen koji obuhvata dva različita sdAb pri čemu se svako od njih vezuje za antigen. U nekim načinima ostvarivanja, multispecifičan CAR predstavlja trospecifičan CAR koji obuhvata ekstracelularni antigenski vezujući domen koji obuhvata tri različita sdAb od koji se svako specifično vezuje za antigen.
[0273] U nekim načinima ostvarivanja,obezbeđen je multispecifični (kao što je bispecifični) himerni antigenski receptor (CAR) koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen vezivanja antigena koji sadrži prvo antitelo sa jednim domenom (sdAb) koji se specifično vezuje za BCMA i drugo antitelo sa jednim domenom (sdAb) koji se specifično vezuje za drugi antigen (kao što je tumorski antigen); (b) transmembranski domen; i (c) intracelulrani signalni domen, pri čemu je prvi antigen različit od drugog antigena. U nekim načinima ostvarivanja, drugi antigen je odabran iz grupe koju čine CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY- ESO-1, MAGE A3 i glikolipid F77. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb i/ili drugo sdAb je kamelidno, himerno, humano ili humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb i drugo sdAb su međusobno spojeni putem peptidne veze ili peptidnog linkera. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker nije dugačak više od oko 50 (kao što je ne više od bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domeni je odabran iz grupe koju čine CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata primarnu intracelularnu signalnu domenu imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalni domen izveden je iz kostimulatornog molekula odabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, Ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, multispecifični CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) smeštenu između C-kraja ekstracelularnog domena vezivanja antigena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, multispecifični CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid se sastoji od N-kraja do C-kraja: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen vezivanja antigena, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid se sastoji od N-kraja do C-kraja: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen vezivanja antigena, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28, i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ.
Ekstracelularni antigenski vezujući domen
[0274] Ekstracelularni antigenski vezujući domen CAR pronalaska obuhvata prvi i drugi sdAb anti-BCMA kao što je definisano u patentnim zahtevima. sdAb mogu da se koriste za međusobno spajanje direktno peptidnim vezama, ili peptidnim linkerima.
1. Antitela sa jednim domenom
[0275] Prema ovom pronalasku, CAR obuhvata ekstracelularni antigenski vezujući domen koji obuhvata dva VHH sdAb. Ta sdAb mogu biti istog različitog porekla, i stih ili različitih veličina. Primeri sdAb uključuju, ali bez ograničenja na, varijabilne domene antitela samo teških lanaca (npr., VHH ili VNAR), vezujuće molekule koji prirodno ne sadrže lake lance, pojedinačne domene (kao što su VHili VL) izvedene iz uobičajenih 4-lančanih antitela, humanizovana antitela samo teških lanaca, humana sdAb koja proizvode transgeni miševi ili pacovi koji eksprimiraju segmente humanih teških lanaca, i konstruisani domeni i rešetke pojedinačnog domena pored onih izvedenih iz antitela. Bilo koja sdAb poznata u ovoj oblasti ili koje je pronalazač razvio, uključujući sdAb opisana u odeljku II ove prijave, mogu da se koriste za konstruisanje ovde opisanih CAR. SdAb mogu biti izvedena iz bilo koje vrste uključujući, ali bez ograničenja na miša, pacova, čoveka, kamilu, lamu, zmijuljicu, ribu, morskog psa, kozu, zeca i govedo. Antitela sa jednim domenom koja su ovde razmatrana takođe uključuju prirodne molekule sdAb iz vrsta koje nisu Camelidae i ajkule.
[0276] U nekim načinima ostvarivanja, sdAb je izvedeno iz antigenskog vezujućeg molekula pojedinačnog lanca koji se prirodno javlja poznatog kao antitelo teškog lanca bez lakih lanaca (ove takođe označeno kao "antitela samo teških lanaca"). Takvi molekuli sa jednim domenom otkriveni su u WO 94/04678 i Hamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448, na primer. Radi jasnoće, varijabilni domeni izvedeni iz molekule teškog lanca koji je prirodno lišen lakog lanca ovde je poznat kao VHH kako bi se razlikovao od uobičajenog VHod četiri lanca imunoglobulina. Takav VHmolekula H može da se dobije iz antitela podignutih u Camelidae vrste, na primer, kamila, lama, vikunja, dromedar, alpaka i guanako. Druge vrste osim Camelidae mogu da proizvode molekule teškog lanca koji su prirodno lišeni lakog lanca, a takvi VHH su unutar opsega ovog pronalaska.
[0277] VHH molekuli iz kamelida su oko 10 puta manji od molekula IgG. Oni su pojedinačni polipeptidi i mogu biti vrlo stabilni, otporni na ekstremne pH i temperaturne uslove. Štaviše, mogu biti otporni na delovanje proteaza što nije slučaj sa uobičajenim 4-lančanim antitelima. Dalje, in vitro pojam VHH sa proizvodi visoprinosne, pravilno savijene funkcionalne VHH. Osim toga, antitela stvorena u kamelidima mogu da prepoznaju epitope koji nisu prepoznati stvorenim antelima in vitro upotrebom biblioteke antitela ili imunizacijom sisara osim kamelida (videti, na primer, WO9749805). Kao takvi, multispecifični ili viševalentni CAR koji sadrže jedan ili više VHH domena mogu efikasnije da komuniciraju sa ciljevima multispecifičnih ili viševalentnih CAR koji sadrže fragmente za vezivanje antigena izvedene iz uobičajenih 4-lančanih antitela. Budući da je za VHpoznato da se H vezuju u 'neuobičajene' epitope kao što su šupljine ili brazde, afinitet CAR koji sadrže takve VHHs može biti prikladniji za terapijsko lečenje nego uobičajeni multispecifični polipeptidi.
[0278] sdAb može biti izvedeno iz varijabilnog regiona imunoglobulina koji se nalazi u hrskavičnim ribama. Na primer, sdAb može da se izvede iz izotipa imunoglobulina poznatog kao novi antigenski receptor (NAR) koji se nalazi u serumu morskog psa. Postupci proizvodnje molekula sa jednim domenom izvedenim iz varijabilnog regiona NAR ("IgNAR") opisani su uWO 03/014161 i Streltsov (2005) Protein Sci.14:2901-2909.
[0279] U nekim načinima ostvarivanja, sdAb je rekombinantno, CDR-nakalemljeno, humanizovano, kamelizovano, deimunizovano i/ili in vitro generisano (npr., odabrano prikazom faga). U nekim načinima ostvarivanja, aminokiselinska sekvenca okvirnih regiona može da se promeni "kamelizacijom" specifičnih aminokiselinskih ostataka u okvirnim regionima. Kamelizacija se odnosi na zamenu ili supstituciju jednog ili više aminokiselinskih ostataka u aminokiselinskok sekvenci (prirodnog) VHdomena uobičajenog 4-lančanog antitela jednim ili više aminokiselinskih ostataka koji se javljaju na odgovarajućem položaju(ima) u VHH domena antitela teškog lanca. To može da se izvede na način poznat per se, koji će biti jasan stručnjaku, na primer na osnovu daljeg ovde datog opisa. Takve "kamelizujuće" supstitucije poželjno su umetnute na položaje aminokiselina koje stvaraju i/ili su prisutne na VH-VLinterfejsu i/ili na takozvanim ostacima kamelida, kako je ovde definisano (videti na primer WO 94/04678, Davies and Riechmann FEBS Letters 339: 285-290, 1994; Davies and Riechmann Protein Engineering 9 (6): 531-537, 1996; Riechmann J. Mol. Biol.259: 957-969, 1996; i Riechmann and Muyldermans J. Immunol. Meth. 231: 25-38, 1999).
[0280] U nekim primerima, sdAb je humano sdAb koje proizvode transgeni miševi ili pacovi koji eksprimiraju segmente humanih teških lanaca. Videti, npr., US20090307787A1, američki pat. br.
8,754,287, US20150289489A1, US20100122358A1, i WO2004049794. U nekim primerima, sdAb je zrelo po afinitetu.
[0281] U nekim primerima, prirodni VHH domen protiv određenog antigena ili cilja, može da se dobije iz (naivnih ili imunih) biblioteka kamelidnih VHH sekvenci. Takvi postupci mogu ali ne moraju da uključuju pregled takve biblioteke upotrebom navedenog antigena ili cilja, ili barem jednog njegovog dela, fragmenta, antigenske determinante ili epitopa korišćenjem jedne ili više tehnika pregleda poznatih per se. Takve biblioteke i tehnike opisane su na primer u WO 99/37681, WO 01/90190, WO 03/025020 i WO 03/035694. Alternativno, poboljšane sintetičke ili polusintetičke biblioteke izvedene iz (naivnog ili imunog) VHbiblioteka mogu da se koriste, kao što su VHH biblioteke dobijene iz (naivnih ili imunih) VHH biblioteka tehnikama kao što su nasumična mutageneza i/ili mešanje CDR, kao što je na primer opisano u WO 00/43507.
[0282] U nekim primerima, sdAb nastaju iz uobičajenih četvoro-lančanih antitela. Videti, na primer, EP 0 368684, Ward et al. (Nature 1989 Oct.12; 341 (6242): 544-6), Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490; WO 06/030220; i WO 06/003388.
2. Antigeni
[0283] Antigen na koji ciljaju CAR ovog pronalaska je BCMA. Drugi antigeni su otkriveni kao referenca. Vezujuće grupe (kao što su sdAb) mogu da se izaberu kako bi se prepoznao antigen koji deluje kao marker ćelijske površine na ciljne ćelije povezane sa posebnim bolesnim stanjem. U nekim načinima ostvarivanja, tumorski antigen je povezan sa malignom B ćelijom. Tumori eksprimiraju brojne proteine koji mogu da posluže kao ciljni antigen za imuni odgovor, posebno za imuni odgovor posredovan T-ćelijama. Antigeni na koje cilja CAR mogu biti antigeni na jednoj bolesnoj ćeliji ili antigeni koji se eksprimiraju na različitim ćelijama od kojih svaka pridonosi bolesti. Antigeni na koje cilja CAR mogu biti direktno ili indirektno uključeni u bolesti.
[0284] Tumorski antigeni su proteini koje proizvode tumorske ćelije koje mogu da izazovu imuni odgovor, posebno imuni odgovor posredovan T-ćelijama. Izbor ciljnog antigena će zavisiti od određene vrste kancera koji se leči. Primeri tumorskih antigena uključuju, na primer, antigen povezan sa gliomom, karcinoembrionalni antigen (CEA), β-humani korjonski gonadotropin, alfafetoprotein (AFP), lektinreaktivni AFP, tireoglobulin, RAGE-1, MN-CAIX, reverzna transkriptaza ljudske telomeraze , RU1, RU2 (AS), intestinalna karboksil esteraza, mut hsp70-2, M-CSF, prostaza, antigen specifičan za prostatu (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, prostein, PSMA, HER2 /neu, survivin i telomeraza, tumorski antigen-1 karcinoma prostate (PCTA-1), MAGE, ELF2M, neutrofilna elastaza, efrinB2, CD22, faktor rasta insulina (IGF)-I, IGF-II, IGF-I receptor i mezotelin.
[0285] Tumorski antigen može da sadrže jedan ili više antigenskih epitopa kancera povezanih sa malignim tumorom. Maligni tumori eksprimiraju neki broj proteina koji mogu da posluže kao ciljni antigeni za imuni napad. Ovi molekuli uključuju, ali bez ograničenja na antigene specifične za tkiva kao što su MART-1, tirozinaza i gp100 u melanomu i fosfataza prostatične kiseline (PAP) i antigen spcifičan za prostatu (PSA) u kanceru prostate. Ostali ciljni molekuli pripadaju grupi transformacionih molekula kao što je onkogen HER2/Neu/ErbB-2. Još jedna grupa ciljnih antigena su onko-fetalni antigeni kao što je karcinoembrionalni antigen (CEA). U B-ćelijskom limfomu idiotip imunoglobulina specifičan za tumor čini istinski imunoglobulinski antigen specifičan za tumor koji je jedinstven za pojedinačni tumor. Antigeni diferencijacije B-ćelija kao što su CD 19, CD20 i CD37 drugi su kandidati za ciljne antigene u B-ćelijskom limfomu.
[0286] Tumorski antigen može biti antigen specifičan za tumor (TSA) ili antigen povezan sa tumorom (TAA). TSA je jedinstven za tumorske ćelije i ne javlja se na drugim ćelijama u telu. Antigen povezan sa TAA nije jedinstven za tumorsku ćeliju, već se takođe eksprimira na normalnoj ćeliji pod uslovima koji ne uspevaju da indukuju stanje imune tolerancije na antigen. Do ekspresije antigena na tumoru može da dođe u uslovima koji omogućavaju imunom sistemu da odgovori na antigen. TAA mogu biti antigeni koji se eksprimiraju na normalnim ćelijama tokom razvoja fetusa, kada je imuni sistem nezreo i ne može da odgovori ili mogu biti antigeni koji su normalno prisutni u ekstremno niskim nivoima na normalnim ćelijama, ali koji se eksprimiraju na mnogo višim nivoima na tumorskim ćelijama.
[0287] Neograničavajući primeri TSA ili TAA antigena uključuju sledeće: antigeni diferencijacije kao što su MART-1/MelanA (MART-I), gp 100 (Pmel 17), tirozinaza, TRP-1, TRP-2 i multilinijski antigeni specifični za tumor kao što je MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pl5; prekomerno izraženi embrionalni antigeni kao što je CEA; prekomerno izraženi onkogeni i mutirani tumor-supresorski geni kao što su p53, Ras, HER2/neu; jedinstveni tumorski antigeni koji su rezultat hromozomskih translokacija; kao što su BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; i virusni antigeni, kao što su antigeni Epstein Barr virusa EBVA i antigeni humanog papiloma virusa (HPV) E6 i E7. Drugi veliki, antigeni bazirani na proteinima uključuju TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, nm-23HI, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-katenin, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, alfa-fetoprotein, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27.29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO- 1, RCAS 1, SDCCAG16, TA-90\Mac-2 vezujući protein\protein povezan sa ciklofilinom C, TAAL6, TAG72, TLP, i TPS.
[0288] U nekim primerima, antigen (kao što je prvi antigen i/ili drugi antigen) su izabrani iz grupe koju čine CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, i glikolipid F77.
3. Peptidni linkeri
[0289] Različite vezujuće grupe (kao što su sdAb) u multispecifičnim ili viševalentnim CAR koje su ovde opisane mogu međusobno da se spoje peptidnim linkerima. U nekim načinima ostvarivanja, vezujuće grupe (kao što su sdAb) su direktno međusobno spojene bez bilo kakvih peptidnih linkera. Peptidni linkeri koji povezuju različite vezujuće grupe (kao što su sdAb) mogu biti isti ili različiti. Različiti domeni CAR takođe mogu biti međusobno spojeni peptidnim linkerima.
[0290] Svaki peptidni linker u CAR može da ima istu ili različitu dužinu i/ili sekvencu u zavisnosti od strukturnih i/ili funkcionalnih karakteristika sdAb i/ili različitih domena. Svaki peptidni linker može nezavisno da se izabere i optimizuje. Dužina, stupanj fleksibilnosti i/ili druga svojstva peptidnog/ih linkera koji se koristi u CAR mogu da imaju određeni uticaj na svojstva, uključujući ali bez ogrnaičenja na na afinitet, specifičnost ili avidnost za jedan ili više određenih antigena ili epitopa. Na primer, duži peptidni linkeri mogu da se izaberu kako bi se osiguralo da se dva susedna domena međusobno ne mešaju sterički. Na primer, u viševalentnom ili multispecifičnom CAR koji obuhvata sdAb usmerena protiv multimernog antigena, dužina i fleksibilnost peptidnih linkera su poželjno takve da omogućavaju svakom sdAb u viševalentnom CAR da se vezuje za antigensku determinantu na svakoj od podjedinica multimera. U nekim načinima ostvarivanja, kratki peptidni linker može biti smešten između transmembranskog domena i intracelularnog signalnog domena CAR. U nekom načinu ostvarivanja, peptidni linker sadrži fleksibilne ostatke (kao što su glicin i serin) tako da se susedni domeni mogu slobodno kretati jedna u odnosu na drugi. Na primer, dublet glicin-serina može biti pogodan peptidni linker.
[0291] Peptidni linker može imati bilo koju pogodnu dužinu. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker je najmanje bilo koje dužine od oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 ili više aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker ima dužinu od najviše oko bilo koje od 100, 75, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 ili manje aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, dužina peptidnog linkera je bilo koja od oko 1 aminokiseline do oko 10 aminokiselina, oko 1 aminokiselina do oko 20 aminokiselina, oko 1 aminokiseline do oko 30 aminokiselina, oko 5 aminokiselina do oko 15 aminokiselina, oko 10 aminokiselina do oko 25 aminokiselina, oko 5 aminokiselina do oko 30 aminokiselina, oko 10 aminokiselina do oko 30 aminokiselina u dužini, oko 30 aminokiselina do oko 50 aminokiselina, oko 50 aminokiselina do oko 100 aminokiselina, ili oko 1 aminokiseline do oko 100 aminokiselina.
[0292] Peptidni linker može da ima sekvencu koja se prirodno javlja ili sekvencu koja se ne javlja prirodno. Na primer, sekvenca izvedena iz zglobnog regiona antitela samo teškog lanca može da se koristi kao linker. Videti, na primer, WO1996/34103. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker je fleksibilni linker. Primeri fleksibilnih linkera uključuju polimere glicina (G)n, polimere glicin-serina (uključujući, na primer, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGS)n, i (GGGGS)n, gde n predstavlja ceo broj od najmanje jednog), glicin-alaninske polimere, alanin-serinske polimere, i druge fleksibilne linkere poznate u ovoj oblasti. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker sadrži aminokiselinsku sekvencu GGGGS (SEQ ID NO: 208), (GGGGS)2(SEQ ID NO: 209), (GGGS)4(SEQ ID NO: 210), GGGGSGGGGSGGGGGGSGSGGGGS (SEQ ID NO: 211), GGGGSGGGGSGGGGGGSGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 212), (GGGGS)3(SEQ ID NO: 213), (GGGGS)4(SEQ ID NO: 214), ili (GGGGS)3(SEQ ID NO: 215).
Transmembranski domen
[0293] CAR ovog pronalaska obuhvataju transmembranski domen koji može direktno ili indirektno da se spoji na ekstracelularni antigenski vezujući domen. Transmembranski domen može biti izveden ili iz prirodnog ili iz sintetičkog izvora. Kako se ovde koristi, "transmembranski domen" se odnosi na bilo koju strukturu proteina koja je termodinamički stabilna u ćelijskoj membrani, poželjno eukariotskoj ćelijskoj membrani. Transmembranski domeni kompatibilni za upotrebu u ovde opisanim CAR mogu da se dobiju iz prirodnog proteina. Alternativno, to može biti sintetički proteinski segment koji se ne pojavljuje u prirodi, npr. hidrofobni proteinski segment koji je termodinamički stabilan u ćelijskoj membrani.
[0294] Transmembranski domeni su klasifikovani na osnovu trodimenzionalne strukture transmembranskog domena. Na primer, transmembranski domeni mogu da obrazuju alfa heliks, kompleks od najviše jednog alfa heliksa, beta-barel, ili bilo koju drugu stabilnu strukturu koja može da premosti fosfolipidni dvosloj ćelije. Dalje, transmembranski domeni takođe mogu ili alternativno mogu biti klasifikovani na osnovu topologije transmembranskog domena, uključujući broj prolaza koje transmembranski domen pravi kroz membranu i orijentaciju proteina. Na primer, jednoprolazni membranski proteini prolaze ćelijsku membranu jednom, a višeprolazni membranski proteini prolaze ćelijsku membranu najmanje dva puta (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili više puta). Membranski proteini mogu da se definišu kao tip I, tip II ili tip III u zavisnosti od topologije njihovih krajeva i segmen(a)ta koji prolaze kroz membranu u odnosu na unutrašnjost i spoljašnost ćelije. Membranski proteini tipa I imaju jedan membransko-premošćujući region i usmereni su tako da je N-kraj proteina prisutan na ekstracelularnoj strani lipidnog dvosloja ćelije, C-kraj proteina je prisutan na citoplazmatskoj strani. Membranski protein tipa II takođe imaju jedan membransko-premošćujući region ali su usmereni tako da je C-kraj proteina prisutan na ekstracelularnoj strani lipidnog dvosloja ćelije, a N-kraj proteina je prisutan na citoplazmatskoj strani. Membranski proteini tipa III više membransko-premošćujućih segmenata I dodatno mogu biti podklasifikovani na osnovu broja transmembranskih segmenata i položaja N- i C-krajeva.
[0295] U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen ovde opisan CAR je izveden iz jednoprolaznog membranskog proteina tipa I. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domeni iz proteina višeprolazne membrane takođe mogu biti kompatibilni za upotrebu u ovde opisanim CAR. Proteini višeprolazne membrane mogu da obuhvataju kompleks (najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili više) alfa heliksa ili strukture beta lista. Poželjno, N-kraj i C-kraj proteina višeprolazne membrane su prisutni na suprotnim stranama lipidnog dvosloja, npr., N-kraj proteina je prisutan na citoplazmatskoj strani lipidnog dvosloja, a C-kraj proteina je prisutan na ekstracelularnoj strani.
[0296] U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen CAR obuhvata transmembranski domen izabran iz grupe transmembranskih domena koju čine alfa, beta ili zeta lanac T-ćelijskog receptora, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CDl la, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, IL-2R beta, IL-2R gama, IL-7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (taktilni), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CDIOO (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, i/ili NKG2C. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen je izveden iz molekula izabranog iz grupe koju čine CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1.
[0297] U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen je izveden iz CD28. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen je transmembranski domen CD28 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 194. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen CD28 kodira sekvenca nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 203.
[0298] U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen je izveden iz CD8α. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen je transmembranski domen CD8α koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 193. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen CD8α kodira sekvenca nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 202.
[0299] Transmembranski domeni za upotrebu u ovde opisanim CAR takođe mogu da obuhvataju najmanje deo sintetičkog, proteinskog segmenta koji se prirodno javlja. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen je sintetički, alfa heliks ili beta list koji se ne javlja prirodno. U nekim načinima ostvarivanja, proteinski segment je najmanje približno 20 aminokiselina, npr., najmanje 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, ili više aminokiselina. Primeri sintetičkih transmembranskih domena su poznati u tehnici, na prime u američki patentu br.7,052,906 B1 i PCT objavi br. WO 2000/032776 A2.
[0300] Transmembranski domen može da obuhvata transmembranski region i citoplazmatski region koji se nalazi na strani C-kraja transmembranskog domena. Citoplazmatski region transmembranskog domena može da obuhvata tri ili više aminokiselina i, u nekim načinima ostvarivanja, pomaže da se usmeri transmembranski domen u lipidnom dvosloju. U nekim načinima ostvarivanja, jedan ili više cisteinskih ostataka je prisutno u transmembranskom regionu transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, jedan ili više cisteinskih ostataka su prisutni u citoplazmatskom regionu transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, citoplazmatski region transmembranskog domena obuhvata aminokiselinu pod pozitivnim nabojem. U nekim načinima ostvarivanja, citoplazmatski region transmembranskog domena obuhvata aminokiselinski arginin, serin, i lizin.
[0301] U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski region transmembranskog domena sadrži hidrofobne aminokiselinske ostatke. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen CAR sadrži veštačku hidrofobnu sekvencu. Na primer, triplet fenilalanina, triptofana i valina može biti prisutan na C kraju transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski region sadrži uglavnom hidrofobne aminokiselinske ostatke, kao što su alanin, leucin, izoleucin, metionin, fenilalanin, triptofan ili valin. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski region je hidrofoban. U nekim načinima istraživanja, transmembranski region sadrži poli-leucin-alaninsku sekvencu. Hidropatija, ili hidrofobne ili hidrofilne karakteristike proteina ili proteinskog segmenta, mogu da se procene bilo kojim postupkom poznatim u ovoj oblasti, na primer Kyte i Doolittle analizom hidropatije.
Intracelularni signalni domen
[0302] CAR ovog pronalaska obuhvataju intracelularni signalni domen. Intracelularni signalni domen je odgovoran za aktivaciju najmanje jedne od normalnih efektorskih funkcija imune efektorske ćelije koja eksprimira CAR. Izraz "efektorska funkcija" odnosi se na specijalizovanu funkciju ćelije. Efektorska funkcija T-ćelije, na primer, može biti citolitička aktivnost ili pomoćna aktivnost uključujući izlučivanje citokina. Stoga se izraz "citoplazmatski signalnia domen" odnosi na deo proteina koji transdukuje signal efektorske funkcije i usmerava ćeliju da izvrši specijalizovanu funkciju. Iako obično može da se koristi ceo citoplazmatski signalni domen, u mnogim slučajevima nije potrebno da se koristi ceo lanac. U meri u kojoj se koristi skraćeni deo citoplazmatskog signalnog domena, takav skraćeni deo može da se koristi umesto intaktnog lanca sve dok transdukuje signal efektorske funkcije. Izraz citoplazmatski signalni domen stoga je potrebno da uključuje bilo koji skraćeni deo citoplazmatskog signalnog domena dovoljan za transdukciju signala efektorske funkcije.
[0303] U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata primarnu intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije. U nekim načinima ostvarivanja, CAR sadrži intracelularni signalni domen koji se uglavnom sastoji od primarnog intracelularnog signalnog domena imune efektorske ćelije. "Primarni intracelularni signalni domen" odnosi se na citoplazmatsku signalnu sekvencu koja deluje na stimulirajući način da indukuje imune efektorske funkcije. U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalni domen sadrži signalni motiv poznat kao aktivacioni motiv baziran na imunoreceptorskom tirozinu, ili ITAM. "ITAM", kako se ovde koristi, je konzervirani proteinski motiv koji je generalno prisutan u repnom delu signalnih molekula izraženih u mnogim imunim ćelijama. Motiv može da sadrži dva ponavljanja aminokiselinske sekvence YxxL/I odvojene sa 6-8 aminokiselina, pri čemu je svako x nezavisno bilo koja aminokiselina, stvarajući konzervirani motiv YxxL/Ix(6-8)YxxL/I. ITAM unutar signalnih molekula su važni za prenos signala unutar ćelije, koji je barem delimično posredovan fosforilacijom tirozinskih ostataka u ITAM nakon aktivacije signalnog molekula. ITAM takođe mogu funkcionirati kao mesta spajanja za druge proteine uključene u signalne puteve. Primeri primarnih citoplazmatskih signalnih sekvenci koje sadrže ITAM uključuju one izvedene iz CD3ζ, FcR gama(FCER1G), FcR beta (Fc Epsilon Rib), CD3 gama, CD3 delta, CD3 epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b i CD66d.
[0304] U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen se sastoji od citoplazmatskog signalneg domena CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalni domen je citoplazmatski signalni domen divljeg tipa CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalni domen divljeg tipa CD3ζ obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 197. U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalni domen je funkcionalni mutant citoplazmatskog signalnog domena CD3ζ koji sadrži jednu ili više mutacija, kao što su Q65K. U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalni domen mutanta CD3ζ obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 198. U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalni domen kodira sekvencu nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 206 ili 207.
Kostimulatorni signalni domen
[0305] Mnoge imune efektorske ćelije zahtevaju ko-stimulaciju, uz stimulaciju antigen-specifičnog signala, za promovisanje ćelijske proliferacije, diferencijacije i preživljavanja, kao i za aktiviranje efektorskih funkcija ćelije. U nekim načinima ostvarivanja, CAR obuhvata najmanje jednu kostimulatorni signalni domen. Izraz "kostimulatorni signalni domen," kako se ovde koristi, se odnosi najmanje na deo proteina koji posreduje u prenosu signala unutar ćelije kako bi se indukovao imuni odgovor kao što je efektorska funkcija. Ovde opisani kostimulatorni signalni domen himernog receptora može biti citoplazmatski signalni domen iz kostimulatornog proteina, koji transdukuje signal i modulira odgovore posredovane imunim ćelijama, kao što su T ćelije, NK ćelije, makrofazi, neutrofili ili eozinofila.
"Kostimulatorni signalni domen" može biti citoplazmatski deo kostimulatornog molekula. Izraz "kostimulatorni molekul" odnosi se na srodnog partnera za vezivanje na imunoj ćeliji (kao što je T ćelija) koji se specifično vezuje sa kostimulatornim ligandom, čime posreduje u kostimulatornom odgovoru imune ćelije, kao što je, ali nije ograničeno na proliferaciju i preživljavanje.
[0306] U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata jedan kostimulatorni signalni domen. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata dva ili više (kao što je oko bilo koji od 2, 3, 4, ili više) kostimulatornih signalnih domena. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata dva ili više istih kostimulatornih signalnih domena, na primer, dve kopije kostimulatornog signalneg domena CD28. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata dva ili više kostimulatornih signalnih domena iz različitih kostimulatornih proteina, kao što je dva ili više ovde opisanih kostimulatornih proteina. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata primarni intracelularni signalni domen (kao što su citoplazmatski signalni domen CD3ζ) i jedan ili više kostimulatornih signalnih domena. U nekim načinima ostvarivanja, jedan ili više kostimulatornih signalnih domena i primarni intracelularni signalni domen (kao što su citoplazmatski signalni domen CD3ζ) međusobno su spojeni opcionim peptidnim linkerima. Primarni intracelularni signalni domen, i jedan ili više kostimulatornih signalnih domena mogu biti raspoređeni bilo kojim pogodnim redom. U nekim načinima ostvarivanja, jedan ili više kostimulatornih signalnih domena se nalaze između transmembranskog domena i primarnog intracelularnog signalneg domena (kao što su citoplazmatski signalni domen CD3ζ). Višestruki kostimulatorni signalni domeni mogu da obezbede dodatne ili sinergističke efekte.
[0307] Aktivacija kostimulatornog signalnog domena u ćeliji domaćina (npr., imuna ćelija) može da indukuje ćeliju da poveća ili smanji proizvodnju i izlučivanje citokina, fagocitnih svojstava, proliferacije, diferencijacije, preživljavanja i/ili citotoksičnosti. Kostimulatorni signalni domen bilo kog kostimulatornog molekula može biti kompatibilan za upotrebu u CAR koji su ovde opisani. Tip(ovi) kostimulatornog signalnog domena je izabran na osnovu faktora kao što je vrsta imunih efektorskih ćelija u kojima bi se efektorski molekuli eksprimirali (npr., T-ćelije, NK-ćelije, makrofazi, neutrofili ili eozinofili) i željenu funkciju imunog efektora (npr., ADCC efekat). Primeri kostimulatornih signalnih domena za upotrebu u CAR mogu biti citoplazmatski signalni domeni kostimulatornih proteina, uključujući, bez ograničenja, članove porodice B7/CD28 (npr., B7-1/CD80, B7-2/CD86, B7-H1/PD-L1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, B7-H7, BTLA/CD272, CD28, CTLA-4, Gi24/VISTA/B7-H5, ICOS/CD278, PD- 1, PD-L2/B7-DC, i PDCD6); članovi TNF superporodice (npr.,4-1BB/TNFSF9/CD137, 4-1BB Ligand/TNFSF9, BAFF/BLyS/TNFSF13B, BAFF R/TNFRSF13C, CD27/TNFRSF7, CD27 Ligand/TNFSF7, CD30/TNFRSF8, CD30 Ligand/TNFSF8, CD40/TNFRSF5, CD40/TNFSF5, CD40 Ligand/TNFSF5, DR3/TNFRSF25, GITR/T`NFRSF 18, GITR Ligand/TNF SF18, HVEM/T`NFRSF 14, LIGHT/T`NF SF 14, limfotoksin-alfa/TNF-beta, OX40/TNFRSF4, OX40 Ligand/TNFSF4, RELT/TNFRSF19L, TACI/TNFRSF13B, TL1A/TNFSF15, TNF-alfa, i TNF RII/TNFRSF1B); članovi SLAM porodice (npr., 2B4/CD244/SLAMF4, BLAME/SLAMF8, CD2, CD2F-10/SLAMF9, CD48/SLAMF2, CD58/LFA-3, CD84/SLAMF5, CD229/SLAMF3, CRACC/SLAMF7, NTB-A/SLAMF6, i SLAM/CD150); i bilo koje druge kostimulatorne molekule, kao što su CD2, CD7, CD53, CD82/Kai-1, CD90/Thy1, CD96, CD160, CD200, CD300a/LMIR1, HLA Klasa I, HLA-DR, Ikaros, Integrin alfa 4/CD49d, Integrin alfa 4 beta 1, Integrin alfa 4 beta 7/LPAM-1, LAG-3, TCL1A, TCL1B, CRTAM, DAP12, Dectin-1/CLEC7A, DPPIV/CD26, EphB6, TIM-1/KIM-1/HAVCR, TIM-4, TSLP, TSLP R, limfocitna funkcija povezana sa antigenom-1 (LFA-1), i NKG2C.
[0308] U nekim načinima ostvarivanja, jedan ili više kostimulatornih signalnih domena su izabrani iz grupe koju čine CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, CD3, limfocitni antigen povezan sa funkcijom 1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 i ligandi koji se specifično vezuju sa CD83.
[0309] U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen u CAR ovog pronalaska obuhvata kostimulatorni signalni domen izvedene iz CD28. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata citoplazmatski signalni domen CD3ζ i kostimulatorni signalni domen CD28. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata kostimulatorni signalni domen CD28 koji obuhvataju aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 195. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalni domen CD28 kodira sekvenca nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 204.
[0310] U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen u CAR ovog pronalaska obuhvata kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 (tj., 4-1BB). U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata citoplazmatski signalni domen CD3ζ i kostimulatorni signalni domen CD137. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata kostimulatorni signalni domen CD137 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 196. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalni domen CD137 kodira sekvenca nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 205.
[0311] U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen u CAR ovog pronalaska obuhvata kostimulatorni signalni domen CD28 i kostimulatorni signalni domen CD137. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata citoplazmatski signalni domen CD3ζ, kostimulatorni signalni domen CD28, i kostimulatorni signalni domen CD137. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata polipeptid koji obuhvata od N-kraja do C-kraja: kostimulatorni signalni domen CD28, kostimulatorni signalni domen CD 137, i citoplazmatski signalni domen CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalni domen CD28 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 195. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalni domen CD137 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 196.
[0312] Takođe u okviru opsega ovog otkrivanja su varijante bilo koje od ovde opisanih kostimulatornih signalnih domena, tako da je kostimulatorna signalna domena sposobna da modulira imuni odgovor imune ćelije. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalni domeni sadrže do 10 varijacija aminokiselinskih ostataka (npr., 1, 2, 3, 4, 5 ili 8) u poređenju sa kopijom divljeg tipa. Takvi kostimulatorni signalni domeni koji sadrže jednu ili više varijacija aminokiselina mogu se nazvati varijantama. Mutacija aminokiselinskih ostataka kostimulatornog signalnog domena može da dovede do povećanja signalne transdukcije i pojačane stimulacije imunih odgovora u odnosu na kostimulatorne signalne domene koji ne sadrže mutaciju. Mutacija aminokiselinskih ostataka kostimulatornog signalnog domena može da dovede do smanjenja signalne transdukcije i smanjene stimulacije imunih odgovora u odnosu na kostimulatorne signalne domene koji ne sadrže mutaciju.
Zglobni region
[0313] CAR ovog pronalaska mogu da obuhvataju zglobni domen koji se nalazi između ekstracelularnog antigenskog vezujućeg domena i transmembranskog domena. Zglobni domen je aminokiselinski segment koji se generalno nalazi između dva domena proteina i može da omogući fleksibilnost proteina i kretanje jednog ili oba domena u međusobnom odnosu. Može da se koristi bilo koja aminokiselinska sekvenca koja obezbeđuje takvu fleksibilnost i kretnje ekstracelularnog antigenskog vezujućeg domena u odnosu na transmembranski domen efektorskog molekula.
[0314] Zglobni domen može da sadrži oko 10-100 aminokiselina, npr., oko bilo koju od 15-75 aminokiselina, 20-50 aminokiselina, ili 30-60 aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen može da ima dužinu bilo koju od oko 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, ili 75 aminokiselina.
[0315] U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen predstavlja zglobni domen proteina koji se prirodno javlja. Zglobni domeni bilo kog proteina poznatog u ovoj oblasti da obuhvataju zglobni domen su kompatibilni za upotrebu u ovde opisanim himernim receptorima. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen je najmanje deo zglobnog domena proteina koji se prirodno javlja i daje fleksibilnost himernom receptoru. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen je izveden iz CD8α. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen je deo zglobnog domena CD8α, npr., fragment koji sadrži najmanje 15 (npr., 20, 25, 30, 35, ili 40) uzastopnih aminokiselina zglobnog domena CD8α. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen CD8α obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 192. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen CD8α kodira sekvencu nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 201.
[0316] Zglobni domeni antitela, kao što su IgG, IgA, IgM, IgE, ili IgD antitela, su takođe kompatibilni za upotrebu u ovde opisanim sistemima himernih receptora zavisnih od pH. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen je zglobni domen koji spaja konstantne domene CH1 i CH2 antitela. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen je antitelo i obuhvata zglobni domen antitela i jedan ili više konstantnih regiona antitela. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen obuhvata zglobni domen antitela i CH3 konstantni region antitela. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen obuhvata zglobni domen antitela i CH2 i CH3 konstantni regiona antitela. U nekim načinima ostvarivanja, antitelo je IgG, IgA, IgM, IgE, ili IgD antitelo. U nekim načinima ostvarivanja, antitelo je IgG antitelo. U nekim načinima ostvarivanja, to antitelo je IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 antitelo. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni region obuhvata zglobni region i CH2 i CH3 konstantne regione IgG1 antitela. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni region obuhvata zglobni region i CH3 konstantni region IgG1 antitela.
[0317] Peptidi koji se ne javljaju prirodno takođe mogu da se koriste kao zglobni domeni za ovde opisane himerne receptore. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen između C-kraja ekstracelularnog domena vezivanja liganda Fc receptora i N-terminala transmembranskog domena je peptidni linker, kao što je (GxS)n linker, pri čemu x i n, nezavisno mogu predstavljati ceo broj između 3 i 12, uključujući3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, ili više.
Signalni peptid
[0318] CAR ovog pronalaska mogu da sadrže signalni peptid (takođe poznat kao signalna sekvenca) na N-kraju polipeptida. Generalno, signalni peptidi su peptidne sekvence koje ciljaju polipeptid na željeno mesto u ćeliji. U nekim načinima ostvarivanja, signalni peptid usmerava efektorski molekul na sekretorni put ćelije i omogućiće integraciju i usidrenje efektorskog molekula u lipidni dvosloj. Signalni peptidi uključujući signalne sekvence prirodnih proteina ili sintetičke signalne sekvence koje se ne javljaju prirodno, a koji su kompatibilni za upotrebu u ovde opisanim CAR će biti očigledni stručnjaku iz oblasti. U nekim načinima ostvarivanja, signalni peptid je izveden iz molekula odabranog iz grupe koju čine CD8α, GM-CSF receptor oc i teški lanac IgG1. U nekim načinima ostvarivanja, signalni peptid je izveden iz CD8α. U nekim načinima ostvarivanja, signalni peptid CD8α sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO: 191. U nekim načinima ostvarivanja, signalni peptid CD8α je kodiran sekvencom nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 199 ili 200.
IV. Konstruisane imune efektorske ćelije
[0319] Dalje su obezbeđene imune efektorske ćelije koje obuhvataju bilo koji od CAR pronalaska.
[0320] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je konstruisana imuna efektorska ćelija (kao što je T ćelija) koja sadrži viševalentni CAR kako je definisano u patentnim zahtevima. Prvo sdAb anti-BCMA i/ili drugo sdAb anti-BCMA može biti kamelidno, himerno, ljudsko ili humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, prvi anti-BCMA i drugi anti-BCMA spojeni su jedan sa drugim peptidnom vezom ili peptidnim linkerom. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker nije dugačak više od oko 50 (kao što je ne više od bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domeni je odabrani iz grupe koju čine CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata primarnu intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalni domen izveden je iz kostimulatornog molekula odabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni CAR dalje sadrži zglobni domeni (kao što je CD8α zglobni domeni) smeštenu između C-kraja ekstracelularnog domena vezivanja antigena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid se sastoji od N-kraja do C-kraja: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen vezivanja antigena, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imuna efektorska ćelija je T ćelija, NK ćelija, mononuklearna ćelija periferne krvi (PBMC), hematopoetska matična ćelija, pluripotentna matična ćelija ili embrionalna matična ćelija. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imuna efektorska ćelija je autologna. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imuna efektorska ćelija je alogena.
[0321] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je konstruisana imuna efektorska ćelija (kao što je T ćelija) koja obuhvata BCMA CAR pronalaska koji obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigenski vezujući domen koji obuhvata dva sdAb anti-BCMA; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu prvo sdAb anti-BCMA može da obuhvata CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:41; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:79; i drugi sdAb anti-BCMA mogu da obuhvataju CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:48; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:86. U nekim načinima ostvarivanja, ekstracelularni antigenski vezujući domen obuhvata najmanje dva sdAb anti-BCMA. U nekim načinima ostvarivanja, sdAb anti-BCMA je kamelidno, himerno, humano, ili humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, sdAb anti-BCMA obuhvata VHH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 117 i 124. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata kostimulatorni signalni domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA CAR dalje obuhvata zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-kraja ekstracelularnog antigenskog vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA CAR dalje obuhvata signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata od N-kraja do C-kraja: CD8α signalni peptid, ekstracelularni antigenski vezujući domen, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, prvi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28, drugi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata od N-kraja do C-kraja: CD8α signalni peptid, ekstracelularni antigenski vezujući domen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA CAR obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 300-305. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imuna efektorska ćelija je T ćelija, NK ćelija, periferna krvna mononuklearna ćelija (PBMC), hematopoietična matična ćelija, pluripotentna matična ćelija, ili embrionska matična ćelija. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imuna efektorska ćelija je autologna. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imuna efektorska ćelija je alogena.
[0322] Takođe su date konstruisane imune efektorske ćelije koje sadrže (ili eksprimiraju) dva ili više različitih CAR. Bilo koja dva ili više ovde opisanih CAR mogu da se izraze u kombinaciji. CAR mogu da ciljaju različite antigene, pružajući tako sinergističke ili dodatne efekte. Budući da antitela sa jednim domenom u ekstracelularnim antigenskim vezujućim domenima CAR imaju samo pojedinačne varijabilne lance antigena (kao što su teški lanci), takve ćelije koje eksprimiraju CAR nemaju problema sa pogrešnim spajanjem varijabilnog lanca, kao što se vidi u konstruisanim imunim efektorskim ćelijama koje zajedno eksprimiraju dva ili više CAR baziranih na scFv. Primeri konstruisanih imunih efektorskih ćelija koje zajedno eksprimiraju dva CAR zasnovanih na VHH su ilustrovani na FIG.15E. Stručnjak iz oblasti će prepoznati da CAR bazirani na drugim sdAb ili koji imaju druge strukture kao što je ovde opisano mogu takođe zajedno da eksprimiraju takođe u konstruisanim imunim efektorskim ćelijama. Dva ili više CAR mogu biti kodirani na istom vektoru ili različitim vektorima.
[0323] Konstruisana imuna efektorska ćelija može dalje da eksprimira jedan ili više terapeutskih proteina i/ili imunomodulatora, kao što su inhibitori imunih kontrolnih tačaka. Videti, na primer, međunarodnu patentnu prijavu br. PCT/CN2016/073489 i PCT/CN2016/087855.
Vektori
[0324] Ovaj pronalazak obezbeđuje vektore za kloniranje i eksprimiranje bilo kof od CAR pronalaska. U nekim načinima ostvarivanja, vektor je pogodan za replikaciju i integraciju eukariotskih ćelija, kao što su ćelije sisara. U nekim načinima ostvarivanja, vektor predstavlja virusni vektor. Primeri virusnih vektora uključuju, ali bez ograničenja na, adenovirusne vektore, adeno-povezane virusne vektore, lentivirusni vektor, retrovirusne vektore, vektor vakcinije, virusni vektor herpes simplex, i njihovi derivati.
Tehnologija virusnih vektora je dobro poznata u tehnici i opisana je, na primer, kod Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), i u drugim uputstvima za virusologiju i molekulsku biologiju.
[0325] Razvijen je neki broj virusnih sistema za prenos gena u ćelije sisara. Na primer, retrovirusi obezbeđuju pogodnu platformu za sisteme isporuke gena. Heterologna nukleinska kiselina može da se umetne u vektor i upakuje u retrovirusne čestice pomoću tehnika poznatih u ovoj oblasti.
Rekombinantni virus se tada može izolovati i dostaviti u ćeliju sisara proizvedenu inženjeringom in vitro ili ex vivo. Brojni retrovirusni sistemi poznati su u ovoj oblasti. U nekim načinima ostvarivanja koriste se adenovirusni vektori. Brojni adenovirusni vektori su poznati u ovoj oblasti. U nekim načinima ostvarivanja koriste se lentivirusni vektori. U nekim načinima ostvarivanja koriste se samoinaktivirajući lentivirusni vektori. Na primer, samo-inaktivirajući lentivirusni vektori koji nose kodirajuću sekvencu imunomodulatora (kao što je inhibitor imune kontrolne točke) i/ili samo-inaktivirajući lentivirusni vektori koji nose CAR mogu da se upakuju sa protokolima poznatim u ovoj oblasti. Dobijeni lentivirusni vektori mogu da se koriste za transdukciju ćelija sisara (kao što su primarne ljudske T ćelije) pomoću postupaka poznatih u ovoj oblasti. Vektori izvedeni iz retrovirusa kao što je lentivirus pogodni su alati za postizanje dugotrajnog prenosa gena, jer omogućavaju dugoročnu, stabilnu integraciju transgena i njihovo umnožavanje u ćelijama potomaka. Lentivirusni vektori takođe imaju nisku imunogenost i mogu transdukovati neproliferujuće ćelije.
[0326] U nekim načinima ostvarivanja, taj vektor je nevirusni vektor. U nekim načinima ostvarivanja, taj vektor je transpozon, kao što je transpozonski sistem uspavane lepotice (SB), ili PiggyBac transpozonski sistem. U nekim načinima ostvarivanja, vektor je nevirusni vektor baziran na polimeru, uključujući na primer, poli(mlečnu-ko-glikolnu kiselinu) (PLGA) i poli mlečnu kiselinu (PLA), poli(etilenimin) (PEI), i dendrimeri. U nekim načinima ostvarivanja, ovaj vektor je katjonski lipidni nevirusni vektor, kao što je katjonski lipozom, lipidna nanoemulzija i čvrsta lipidna nanočestica (SLN). U nekim načinima ostvarivanja, vektor je genski nevirusni vektor baziran na peptidu, kao što je poli-L-lizin. Bilo koji od poznatih nevirusnih vektora pogodnih za uređivanje genoma može da se koristi za uvođenje nukleinskih kiselina koje kodiraju CAR u konstruisane imune efektorske ćelije. Videti, na primer, Yin H. et al. Nature Rev. Genetics (2014) 15:521-555; Aronovich EL et al. "The Sleeping Beauty transposon system: a nonviral vector for gene therapy." Hum. Mol. Genet. (2011) R1: R14-20; i Zhao S. et al. "PiggyBac transposon vectors: the tools of the human gene editing." Transl. Lung Cancer Res. (2016) 5(1): 120-125. U nekim načinima ostvarivanja, bilo koja jedna ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju CAR uvodi se u konstruisane imune efektorske ćelije fizičkim postupkom, uključujući, ali ne ograničavajući se na elektroporaciju, sonoporaciju, fotoporaciju, magnetofekciju, hidroporaciju.
[0327] U nekim načinima ostvarivanja, vektor obuhvata bilo koju od nukleinskih kiselina koja kodira CAR pronalaska. Nukleinska kiselina može biti klonirana u vektor pomoću bilo kog poznatog postupka pomoću bilo kog poznatog molekulskog postupka za kloniranje u toj oblasti, uključujući, na primer, pomoću mesta restrikcione endonukleaze i jednog ili više pogodnih markera. U nekim načinima ostvarivanja, nukleinska kiselina je operativno povezana sa promoterom. Razni promoteri su ispitivani zbog eksprimiranja gena u sisarskim ćelijama, i bilo koji od promotera poznat u ovoj oblasti mogu da se koriste u ovom pronalasku. Promoteri grubo mogu biti kategorisani kao konstitutivni promoteri ili regulisani promoteri, kao što su inducibilni promoteri.
[0328] U nekim načinima ostvarivanja, nukleinska kiselina koja kodira CAR je operativno povezana sa konstitutivnim promoterom. Konstitutivni promoteri omogućavaju heterolognim genima (takođe označenim kao transgeni) da se eksprimiraju konstitutivno u ćelijama domaćina. Primeri konstitutivnih promotera koji su u ovde razmatranju uključuju, ali bez ograničenja na, promotere citomegalovirusa (CMV), humane faktore elongacije-1alfa (hEF1α), promoter ubikvitina C (UbiC), promoter fosfoglicerokinaze (PGK), rani promoter virusa majmuna 40 (SV40), i pileći promoter β-aktina spojen sa CMV ranim pojačivačem (CAGG). Efikasnosti takvih konstitutivnih promotera na promovisanje ekspresije transgena se široko porede u velikom broju ispitivanja. Na primer, Michael C. Milone et al su poredili efikasnost CMV, hEF1α, UbiC i PGK za podsticanje ekspresije CAR u primarnim ljudskim T ćelijama i zaključili da promoter hEF1α ne samo da je indukovao najviši nivo ekspresije transgena, nego se takođe optimalno održavao u CD4 i CD8 ljudskim T ćelijama (Molecular Therapy, 17(8): 1453-1464 (2009.)). U nekim načinima ostvarivanja, nukleinska kiselina koja kodira CAR je operativno povezana sa hEF1α promoterom.
[0329] U nekim načinima ostvarivanja, nukleinska kiselina koja kodira CAR je operativno povezana sa inducibilnim promoterom. Inducibilni promoteri pripadaju kategoriji regulisanih promotera. Inducibilni promoter može biti indukovan jednim ili više uslova, kao što je fizičko stanje, mikrookruženje modifikovane imune efektorske ćelije ili fiziološko stanje modifikovane imune efektorske ćelije, induktor (tj., indukujuće sredstvo), ili njihovu kombinaciju. Indukujuće stanje možda neće indukovati ekspresiju endogenih gena u ćeliji sisara proizvedenoj inženjeringom i/ili u subjektu koji prima farmaceutsku kompoziciju. Indukujuće stanje može da se izabere iz grupe koju čine: induktor, zračenja (kao što je jonizirajuće zračenje, svetlost), temperatura (kao što je toplina), redoks stanje, tumorsko okruženje i stanje aktivacije konstruisane ćelije sisara.
[0330] U nekim načinima ostvarivanja, vektor takođe sadrži pogodan genski marker ili reporterski gen za odabir ćelija koje eksprimiraju CAR iz populacije ćelija domaćina transfektovanih putem lentivirusnih vektora. Oba pogodna markera i reporterski geni mogu biti flankirani odgovarajućim regulatornim sekvencama kako bi se omogućila ekspresija u ćelijama domaćina. Na primer, vektor može da sadrži terminatore transkripcije i translacije, sekvence inicijacije, i promotere korisne za regulaciju ekspresije sekvenci nukleinske kiseline.
[0331] U nekim načinima ostvarivanja, vektor obuhvata više od jedne nukleinske kiseline koja kodira CAR. U nekim načinima ostvarivanja, vektor obuhvata nukleinsku kiselinu koja obuhvataju prvu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira prvi CAR i drugu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira drugi CAR, pri čemu prva nukleinska kiselina je operativno povezana sa drugom nukleinskom kiselinom putem treće sekvence nukleinske kiseline koja kodira samocepajući peptid. U nekim načinima ostvarivanja, samocepajući peptid je izabran iz grupe koju čine T2A, P2A i F2A. U nekim načinima ostvarivanja, T2A peptid ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 385.
Imune efektorske ćelije
[0332] "Imune efektorske ćelije" su imune ćelije koje mogu da obavljaju imune efektorske funkcije. U nekim načinima ostvarivanja, imune efektorske ćelije eksprimiraju najmanje FcγRIII i izvode ADCC efektorsku funkciju. Primeri imunih efektorskih ćelija koje posreduju ADCC uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), ćelije prirodne ubice (NK), monocite, citotoksične T ćelije, neutrofile i eozinofile.
[0333] U nekim načinima ostvarivanja, imune efektorske ćelije su T ćelije. U nekim načinima ostvarivanja, T ćelije su CD4+/CD8-, CD4-/CD8+, CD4+/CD8+, CD4-/CD8-, ili njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, T ćelije proizvode IL-2, TFN, i/ili TNF nakon eksprimiranja CAR i vezivanja za ciljane T ćelije, kao što su CD20+ ili CD19+ tumorske ćelije. U nekim načinima ostvarivanja, CD8+ T ćelije lizuju ciljane ćelije specifične za antigen nakon ekspresije CAR i vezivanja za ciljne ćelije.
[0334] U nekim načinima ostvarivanja, imune efektorske ćelije su NK ćelije. U drugim načinima ostvarivanja, imune efektorske ćelije mogu biti utvrđene ćelijske linije, na primer, NK-92 ćelije.
[0335] U nekim načinima ostvarivanja, imune efektorske ćelije su različite od matične ćelije, kao što je hematopoietična matična ćelija, pluripotentna matična ćelija, iPS, ili embrionska matična ćelija.
[0336] Konstruisana imune efektorske ćelije se pripremaju uvođenjem CAR imune efektorske ćelije, kao što suT ćelije. CAR može da se uvede u imune efektorske ćelije transfekcijom bilo koje od izolovanih nukleinskih kiselina ili bilo kojeg vektora opisanog u Odeljku III. CAR može da se uvede u imune efektorske ćelije umetanjem proteina u ćelijsku membranu dok ćelije prolaze kroz mikrofluidni sistem, kao što je CELL SQUEEZE<®>(videti, na primer, američku objavu patentne prijave br.20140287509).
[0337] Postupci uvođenja vektora ili izolovanih nukleinskih kiselina u ćelije sisara su poznati u ovoj oblasti. Opisani vektori mogu zatim da se transfektuju u imunu efektorsku ćeliju fizičkim, hemijskim, ili biološkim postupcima.
[0338] Fizički postupci za uvođenje vektora u imunu efektorsku ćeliju uključuju taloženje kalcijumfosfatom, lipofekciju, bombardovanje česticama, mikroinjekciju, elektroporaciju i slično. Postupci za proizvodnju ćelija koje sadrže vektore i/ili egzogene nukleinske kiseline dobro su poznati u ovoj oblasti. Videti, na primer, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Vektor se može uneti u ćeliju elektroporacijom.
[0339] Biološki postupci za uvođenje vektora u imunu efektorsku ćeliju uključuju upotrebu DNK i RNK vektora. Virusni vektori su postali postupak koji se najviše koristi za umetanje gena u sisarske, npr., humane ćelije.
[0340] Hemijska sredstva za uvođenje vektora u imunu efektorsku ćeliju uključuju koloidne disperzione sisteme, kao što su kompleksi makromolekula, nanokapsule, mikrosfere, zrnca i sistemi bazirani na lipidima uključujući emulzije ulje u vodi, miscele, mešane miscele i lipozome. Primer koloidalnog sitema za upotrebu u funkciji vehikuluma isporuke in vitro je lipozom (npr., vezikula sa veštačkom membranom).
[0341] RNK molekuli koji kodiraju bilo koji od ovde opisanih CAR mogu da se pripreme uobičajenim postupkom (npr., in vitro transkripcijom) a zatim se uvode u imune efektorske ćelije poznatim postupcima kao što je mRNK elektroporacijom. Videti, npr., Rabinovich et al., Human Gene Therapy 17:1027-1035.
[0342] Transdukovana ili transfektovana imuna efektorska ćelija može da se razmnožava ex vivo nakon uvođenja vektora ili izolovane nukleinske kiseline. Transdukovana ili transfektovana imuna efektorska ćelija može da se kultiviše za razmnožavanje najmanje oko bilo kojeg od 1 dana, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 10 dana, 12 dana ili 14 dana. Transdukovana ili transfektovana imuna efektorska ćelija može dalje da se procenjuje i pregleda kako bi se odabrala modifikovana ćelija sisara.
[0343] Reporterski geni mogu da se koriste za identifikaciju potencijalno transfektovanih ćelija i za procenu funkcionalnosti regulatornih sekvenci. Generalno, reporterski gen je gen koji nije prisutan u organizmu ili tkivu primaoca niti ga eksprimira i koji kodira polipeptid čija se ekspresija očitava nekim lako detektabilnim svojstvom, npr., enzimska aktivnost. Ekspresija reporterskog gena se ispituje u odgovarajuće vreme nakon što je DNK uvedena u ćelije primaoca. Prikladni reporterski geni mogu da uključuju gene koji kodiraju luciferazu, beta-galaktozidazu, kloramfenikol acetil transferazu, izlučenu alkalnu fosfatazu ili gen za zeleni fluorescentni protein (npr., Ui-Tei et al. FEBS Letters
479: 79-82 (2000)). Prikladni ekspresioni sistemi su dobro poznati i mogu da se pripreme poznatim tehnikama ili da se dobiju komercijalno.
[0344] Drugi postupci za potvrdu prisustva nukleinske kiseline koja kodira CAR u konstruisanoj imunoj efektorskoj ćeliji, uključuju, na primer, molekulska biološka ispitivanja dobro poznata stručnjacima u ovoj oblasti, kao što su Saudern i Nordern blot, RT-PCR i PCR ; biohemijska ispitivanja, kao što je detektovanje prisustvu ili odsutnosti određenog peptida, npr., imunim postupcima (kao što su ELISA ispitivanja i Western blotovi).
1. Izvori T ćelija (Odeljak "Izvori T ćelija" je otkriven kao referenca. Način ostvarivanja u ovom odeljku nisu načini ostvarivanja pronalaska.)
[0345] Pre ekspanzije i genetske modifikacije T ćelija, izvor T ćelija se dobije od pojedinca. T ćelije se mogu da se dobiju iz brojnih izvora, uključujući mononuklearne ćelije periferne krvi, koštanu srž, tkivo limfnih čvorova, krv iz pupka, tkivo timusa, tkivo sa mesta infekcije, ascites, pleuralni izliv, tkivo slezine i tumore. U nekim načinima ostvarivanja, može da se koristi bilo koji broj T ćelijskih linija dostupnih u ovoj oblasti. U nekim načinima ostvarivanja, T ćelije mogu da se dobiju iz jedinice krvi prikupljene od subjekta pomoću bilo kog broja tehnika poznatih stručnjaku, kao što je FICOLL<™>odvajanje. U nekim načinima ostvarivanja, ćelije iz krvotoka pojedinca se dobijaju se aferezom. Proizvod afereze obično sadrži limfocite, uključujući T ćelije, monocite, granulocite, B ćelije, druge bele krvne ćelije sa jezgrom, crvena krvna zrnca i trombocite. U nekim načinima ostvarivanja, ćelije prikupljene aferezom mogu da se isperu da se ukloni frakcija plazme i da se ćelije stave u odgovarajući pufer ili podlogu za sledeće korake obrade. U nekim načinima ostvarivanja, ćelije se isperu fosfatnim puferom fiziološkog rastvora (PBS). U nekim načinima ostvarivanja, rastvoru za pranje nedostaje kalcijum i može da nedostaje magnezijum ili može da nedostaje mnogo ako ne i svi dvovalentni katjoni. Opet, iznenađujuće, početne faze aktivacije u nedostatku kalcijuma dovode do pojačane aktivacije. Kao što bi stručnjaci u ovoj oblasti tehnike lako shvatili, faza ispiranja može da se postigne postupcima koji su poznati stručnjacima, kao što je upotreba poluautomatizovane "protočne" centrifuge (na primer, Cobe 2991 cell procesor, Baxter CytoMate ili Haemonetics Cell Saver 5) prema uputstvima proizvođača. Nakon ispiranja, ćelije se mogu ponovo suspendovati u različitim biokompatibilnim puferima, kao što je, na primer, Ca<2+>-slobodan, Mg<2+>-slobodan PBS, PlasmaLyte A ili drugi fiziološki rastvor sa ili bez pufera. Alternativno, nepoželjne komponente afereznog uzorka mogu da se uklone, a ćelije direktno mogu da se ponovo suspenduju u podlozi kulture.
[0346] U nekim načinima ostvarivanja, T ćelije su izolovane iz limfocita periferne krvi lizom crvenih krvnih ćelija i smanjenjem monocita, na primer, centrifugiranjem kroz PERCOLL<™>gradijent ili centrifugalnim elutricijom suprotnog protoka. Specifična subpopulacija T ćelija, kao što su CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ i CD45RO+T ćelije, može dalje da se izoluje tehnikama pozitivne ili negativne selekcije. Na primer, u nekim načinima ostvarivanja, T ćelije se izoluju inkubacijom sa anti-CD3/antiCD28 (tj.3×28)-konjugovanim kuglicama, kao što su DYNABEADS<®>M-450 CD3/CD28 T, u vremenskom razdoblju dovoljnom za pozitivnu selekciju željenih T ćelija. U nekim načinima ostvarivanja, vremenski period je oko 30 minuta. U dodatnom načinu ostvarivanja, vremenski period je u rasponu od 30 minuta do 36 sati ili duže i sve celobrojne vrednosti između. U dodatnom načinu ostvarivanja, vremenski period je najmanje 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 sati. U nekim načinima ostvarivanja, vremenski period je 10 do 24 sata. U nekim načinima ostvarivanja, vremenski period inkubacije je 24 sata. Za izolaciju T ćelija iz pacijenata sa leukemijom, korišćenje dužeg vremena inkubacije, kao što je 24 sata, može da poveća prinos ćelija. Duže vreme inkubacije može da se koristi za izolaciju T ćelija u bilo kojoj situaciji u kojoj ima malo T ćelija u poređenju sa drugim vrstama ćelija, kao što je izolacija limfocita koji infiltriraju tumor (TIL) iz tumorskog tkiva ili od pojedinaca sa oslabljenim imunitetom. Dalje, korišćenje dužeg vremena inkubacije može da poveća efikasnost hvatanja CD8+ T ćelija. Prema tome, jednostavnim skraćivanjem ili produženjem vremena u kojem se T-ćelijama omogućava vezivanje za zrnca CD3/CD28 i/ili povećanjem ili smanjenjem odnosa zrnaca i T-ćelija (kao što je ovde dalje opisano), subpopulacije T-ćelija mogu poželjno da se izaberu za ili protiv na početku kulture ili u drugim vremenskim tačkama tokom postupka. Dodatno, povećanjem ili smanjenjem odnosa anti-CD3 i/ili anti-CD28 antitela na kuglicama ili drugoj površini, subpopulacije T ćelija mogu poželjno da se izaberu za ili protiv na početku kulture ili u drugim željenim vremenskim tačkama. Stručnjak iz oblasti će prepoznati da takođe može da se koristi više krugova odabira. U nekim načinima ostvarivanja, može biti poželjno da se izvede postupak selekcije i koriste "neodabrane" ćelije u postupku aktivacije i ekspanzije. "Neodabrane" ćelije takođe mogu da se podvrgnu daljim krugovima selekcije.
[0347] Obogaćivanje populacije T ćelija negativnom selekcijom može da se postigne kombinacijom antitela usmerenih na površinske markere jedinstvene za negativno odabrane ćelije. Jedan postupak je razvrstavanje ćelija i/ili selekcija putem negativne magnetske imunoadherencije ili protočne citometrije koja koristi koktel monoklonalnih antitela usmerenih na markere ćelijske površine prisutne na negativno odabranim ćelijama. Na primer, za obogaćivanje ćelija CD4+ negativnom selekcijom, koktel monoklonalnih antitela obično uključuje antitela na CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR i CD8. U određenim načinima ostvarivanja, može biti poželjno da se obogate ili pozitivno izaberu regulatorne T ćelije koje tipično eksprimiraju CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ i FoxP3+. Alternativno, u određenim načinima ostvarivanja, T regulatorne ćelije su iscrpljene anti-C25 konjugovanim kuglicama ili drugim sličnim postupkom odabira.
[0348] Za izolaciju željene populacije ćelija pozitivnom ili negativnom selekcijom, koncentracija ćelija i površina (npr., čestice kao što su kuglice) mogu da variraju. U određenim načinima ostvarivanja, može biti poželjno značajno smanjenje zapremine u kojoj se kuglice i ćelije mešaju zajedno (tj. povećanje koncentracije ćelija), kako bi se osigurao maksimalan kontakt ćelija i kuglica. Na primer, u jednom načinu ostvarivanja koristi se koncentracija od 2 milijarde ćelija/ml. U jednom načinu ostvarivanja koristi se koncentracija od 1 milijarde ćelija/ml. U daljem načinu ostvarivanja koristi se više od 100 miliona ćelija/ml. U daljem načinu ostvarivanja, koristi se koncentracija ćelija od 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 miliona ćelija/ml. U još jednom načinu ostvarivanja, koristi se koncentracija ćelija od 75, 80, 85, 90, 95 ili 100 miliona ćelija/ml. U daljim načinima ostvarivanja mogu da se koristiti koncentracije od 125 ili 150 miliona ćelija/ml. Korišćenje visokih koncentracija može da dovede do povećanog prinosa ćelija, aktivacijom ćelija i ćelijskim širenjem. Dalje, upotreba visokih koncentracija ćelija omogućava efikasnije hvatanje ćelija koje mogu slabo da eksprimiraju ciljne antigene od značaja, kao što su CD28-negativne T ćelije, ili iz uzoraka u kojima je prisutno mnogo tumorskih ćelija (tj. leukemijska krv, tumorsko tkivo itd. ). Takve populacije ćelija mogu da imaju terapeutsku vrednost i bilo bi ih poželjno dobiti. Na primer, korišćenje visoke koncentracije ćelija omogućava efikasniju selekciju CD8+ T ćelija koje inače imaju slabiju ekspresiju CD28.
[0349] U nekim načinima ostvarivanja, može biti poželjno da se koriste niže koncentracije. Značajnim razblaživanjem mešavine T ćelija i površine (npr., čestice kao što su kuglice), interakcija između čestica i ćelija je svedena na minimum. Ovim se biraju ćelije koje eksprimiraju velike količine željenih antigena koji se vežu za čestice. Na primer, CD4+ T ćelije eksprimiraju više nivoe CD28 i efikasnije se hvataju od CD8+ T ćelija u razblaženim koncentracijama. U nekim načinima ostvarivanja, koncentracija korišćenih ćelija je 5×10<6>/ml. U nekim načinima ostvarivanja, korišćena koncentracija može biti od oko 1×10<5>/ml do 1×10<6>/ml, i bilo koja vrednost celog broja između.
[0350] U nekim načinima ostvarivanja, ćelije mogu biti inkubirane na rotatoru u različitim vremenskim trajanjima pri različitim brzinama ili na 2-10°C, ili na sobnoj temperaturi.
[0351] T ćelije za stimulaciju takođe mogu da se zamrznu nakon faza pranja. Bez želje za vezivanjem za neku teoriju, zamrzavanje i naknadna faza odmrzavanja osigurava uniformniji proizvod uklanjanjem granulocita i do neke mere monocita u populaciji ćelija. Nakon koraka ispiranja kojim se uklanjaju plazma i trombociti, ćelije mogu da se suspenduju u rastvoru za zamrzavanje. Dok su mnogi rastvori i parametri za zamrzavanje poznati u ovoj oblasti i od koristi u ovom kontekstu, jedan postupak uključuje korišćenje PBS-a koji sadrži 20% DMSO i 8% humanog serumskog albumina, ili podloge za kulturu koja sadrži 10% dekstrana 40 i 5% dekstroze, 20% ljudski serumski albumin i 7,5% DMSO, ili 31,25% PlasmaLyte-A, 31,25% dekstrozu 5%, 0,45% NaCl, 10% dekstran 40 i 5% dekstrozu, 20% ljudski serumski albumin i 7,5% DMSO ili drugu pogodnu podlogu za zamrzavanje ćelija koja sadrži na primer Hespan i PlasmaLyte A, ćelije se zatim smrzavaju na -80°C brzinom od 1° u minuti i čuvaju se u fazi pare suda za čuvanje tečnog azota. Mogu da se koriste i drugi postupci kontrolisanog zamrzavanja, kao i nekontrolisano zamrzavanje neposredno na -20°C ili u tečnom azotu.
[0352] U nekim načinima ostvarivanja, kriokonzervisane ćelije se odmrznu i isperu kako je ovde opisano i ostave se da odstoje jedan sat na sobnoj temperaturi pre aktivacije.
[0353] Kao referenca je takođe otkriveno uzimanje uzoraka krvi ili proizvoda afereze od subjekta u vremenskom periodu pre nego što bi proširene ćelije kao što je ovde opisano mogle biti potrebne. Kao takav, izvor ćelija koje bi trebalo da se prošite može da se uzme u bilo kojoj neophodnoj vremenskoj tački, a željene ćelije, kao što su T ćelije, izoluje i zamrzne za kasniju upotrebu u T ćelijskoj terapiji za bilo koji broj bolesti ili stanja koja bi imala koristi od terapija T ćelijama, poput onih koje su ovde opisane. U jednom načinu ostvarivanja uzorak krvi ili afereza se uzima od subjekta zdravog opšteg stanja. U određenim načinima ostvarivanja, uzorak krvi ili afereza se uzima od generalno zdravog subjekta koji je u opasnosti od razvoja bolesti, ali koji još nije razvio bolest, a ćelije od značaja se izoluju i zamrzavaju za kasniju upotrebu. U određenim načinima ostvarivanja, T ćelije mogu da se prošire, zamrznu i koriste kasnije. U određenim načinima ostvarivanja, uzorci se prikupljaju od pacijenata ubrzo nakon dijagnoze određene bolesti kako je ovde opisano, ali pre bilo kakve terapije. U daljem načinu ostvarivanja, ćelije se izoluju iz uzorka krvi ili afereze subjekta pre bilo kog broja relevantnih modaliteta lečenja, uključujući ali bez ograničenja na lečenje sredstvima kao što su natalizumab, efalizumab, antivirusna sredstva, hemoterapija, zračenje, imunosupresivna sredstva, kao što su ciklosporin, azatioprin, metotreksat, mikofenolat i FK506, antitela ili druga imunoablativna sredstva kao što su CAMPATH, anti-CD3 antitela, citoksan, fludarabin, ciklosporin, FK506, rapamicin, mikofenolna kiselina, steroidi, FR901228, i zračenje. Ovi lekovi inhibiraju fosfatazu kalcineurin koja zavisi od kalcijuma (ciklosporin i FK506) ili inhibiraju p70S6 kinazu koja je važna za signalizaciju indukovanu faktorom rasta (rapamicin) (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Imun.5: 763-773, 1993). U daljem načinu ostvarivanja, ćelije su izolovane za pacijenta i zamrznute za kasniju upotrebu u kombinaciji sa (npr., pre, istovremeno ili nakon) transplantacije koštane srži ili matičnih ćelija, ablativne terapije T ćelija upotrebom hemoterapijskih sredstava kao što je fludarabin, terapija spoljašnjim snopom zračenja (XRT), ciklofosfamida ili antitela kao što su OKT3 ili CAMPATH. U drugom načinu ostvarivanja, ćelije se izoluju pre i mogu da se zamrznu za kasniju upotrebu za lečenje nakon ablativne terapije B-ćelija kao što su sredstva koja reagiraju sa CD20, npr., Rituxan-om.
[0354] U nekim načinima ostvarivanja, T ćelije se dobijaju od pacijenta neposredno nakon lečenja. S tim u vezi, uočeno je da nakon određenih terapija kancera, posebno tretmana lekovima koji oštećuju imuni sistem, kratko nakon terapije tokom vremenskog perioda kada bi se pacijenti inače oporavljali od terapije, kvalitet dobijenih T ćelija može biti optimalan ili poboljšan zbog svoje sposobnosti širenja ex vivo. Slično, nakon ex vivo manipulacije upotrebom ovde opisanih postupaka, ove ćelije mogu biti u poželjnom stanju za pojačano presađivanje i in vivo širenje. Stoga se u kontekstu ovog pronalaska razmatra prikupljanje krvnih ćelija, uključujući T ćelije, dendritične ćelije ili druge ćelije hematopoetske loze, tokom ove faze oporavka. Dalje, u određenim načinima ostvarivanja, mobilizacija (na primer, mobilizacija sa GM-CSF) i režimi kondicioniranja mogu da se koriste za stvaranje stanja kod subjekta pri čemu se prednost daje repopulaciji, recirkulaciji, regeneraciji i/ili ekspanziji određenih vrsta ćelija, posebno tokom definisanog vremenskog okvira nakon terapije. Ilustrativni tipovi ćelija uključuju T ćelije, B ćelije, dendritične ćelije i druge ćelije imunog sistema.
2. Aktivacija i širenje T ćelija (Odeljak "Aktivacija i širenje T ćelija" je otkriven kao referenca. Načini ostvarivanja u ovom odeljku ne predstavljaju načine ostvarivanja ovog pronalaska.)
[0355] Bilo pre ili posle genetske modifikacije T ćelija sa ovde opisanim CAR, T ćelije mogu biti aktivirane i proširene pomoću postupaka kao što je opisano, na primer, u američki pat. br.
6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,1 72,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; i američka objava patentne prijave br.20060121005.
[0356] Generalno, T ćelije mogu da se prošire kontaktom sa površinom na koju je pričvršćen agens koji stimuliše signal povezan sa CD3/TCR kompleksom i ligand koji stimuliše kostimulatorni molekul na površini T ćelija. Određenije, populacije T ćelija mogu da se stimuliši kao što je ovde opisano, kao što je kontakt sa anti-CD3 antitelom, ili njegovim fragmentom koji se vezuje za antigen, ili anti-CD2 antitelom koje je imobilisano na površini, ili kontaktom sa C aktivatorom protein kinaze (npr., briostatinom) u kombinaciji sa kalcijumovim jonoforom. Za kostimulaciju pomoćnog molekula na površini T ćelija koristi se ligand koji vezuje pomoćni molekul. Na primer, populacija T ćelija može da se dovede u kontakt sa anti-CD3 antitelom i anti-CD28 antitelom, pod uslovima prikladnim za stimulaciju proliferacije T ćelija. Za stimulaciju proliferacije ili CD4+ T ćelija ili CD8+ T ćelija, anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo. Primeri anti-CD28 antitela uključuju 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besancon, Francuska) koji mogu da se koriste kao i drugi postupci poznati u ovoj oblasti (Berg et al., Transplant Proc.30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med.190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth.227(1-2):53-63, 1999).
[0357] U nekim načinima ostvarivanja, primarni stimulatorni signal i kostimulatorni signal za T ćeliju mogu da obezbede različiti protokoli. Na primer, sredstva koja daju svaki signal mogu biti u rastvoru ili spojena na površini. Kada se spajaju na površini, sredstva mogu da se spajaju na istoj površini (tj. u "cis" formaciji) ili na odvojenim površinama (tj. u "trans" formaciji). Alternativno, jedno sredstvo može biti spojeno na površini, a drugo sredstvo u rastvoru. U jedno načinu ostvarivanja, agens koji daje kostimulatorni signal vezan je za površinu ćelije, a agens koji daje primarni aktivacioni signal je u rastvoru spojen na površini. U određenim načinima ostvarivanja, oba sredstva mogu biti u rastvoru. U drugom načinu ostvarivanja, sredstva mogu da budu u topljivom obliku, a zatim umrežena na površini, kao što je ćelija koja eksprimira Fc receptore ili antitelo ili drugo vezivno sredstvo koje će se vezivati za sredstva. U tom smislu, videti npr. američku objavu patentne prijave br.20040101519 i 20060034810 za umetne ćelije koje predstavljaju antigen (aAPC) koje su predviđene za upotrebu u aktiviranju i širenju T ćelija u ovom pronalasku.
[0358] U nekim načinima ostvarivanja, T ćelije se kombinuju sa kuglicama obloženim sredstvom, kuglice i ćelije se zatim odvajaju, a zatim se ćelije kultivišu. U alternativnom načinu ostvarivanja, pre kulture, kuglice obložene sredstvom i ćelije se ne odvajaju, već se zajedno kultivišu. U daljem načinu ostvarivanja, zrnca i ćelije se prvo koncentruju primenom sile, kao što je magnetska sila, što dovodi do pojačane ligacije markera ćelijske površine, čime se indukuje ćelijska stimulacija.
[0359] Primera radi, proteini ćelijske površine mogu da se vezuju dopuštanjem paramagnetnim kuglicama na koje su pričvršćeni anti-CD3 i anti-CD28 (3×28 kuglica) da dođu u kontakt sa T ćelijama. U jednom načinu ostvarivanja ćelije (na primer, 10<4>do 10<9>T ćelije) i kuglice (na primer, DYNABEADS<®>M-450 CD3/CD28 T paramagnetnim kuglice u odnosu 1:1) se pomešaju u puferu, poželjno PBS (bez dvovalentnih katjona kao što su kalcijum i magnezijum). Opet, stručnjaci iz ove oblasti mogu lako da procene bilo koju koncentraciju ćelija koja može da se koristi. Na primer, ciljna ćelija može biti vrlo retka u uzorku i može da sadrži samo 0,01% uzorka ili ceo uzorak (tj.100%) može da sadrži ciljnu ćeliju od značaja. Prema tome, bilo koji broj ćelije je unutar konteksta ovog pronalaska. U određenim načinima ostvarivanja, može biti poželjno da se značajno smanji zapremina u kojoj su čestice i ćelije pomešane zajedno (tj. poveća koncentracija ćelija), kako bi se obezbedio maksimalni kontakt ćelija i čestica. Na primer, u jednom načinu ostvarivanja, koristi se koncentracija od oko 2 milijarde ćelija/ml. U drugom načinu ostvarivanja koristi se više od 100 miliona ćelija/ml. U dodatnom načinu ostvarivanja, koristi se koncentracija ćelija od 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 miliona ćelija/ml. U još jednom načinu ostvarivanja, koristi se koncentracija ćelija od 75, 80, 85, 90, 95 ili 100 miliona ćelija/ml. U daljim načinima ostvarivanja mogu da se koriste koncentracije od 125 ili 150 miliona ćelija/ml. Upotreba visokih koncentracija može da dovede do povećanog prinosa ćelija, aktivacije ćelija i ćelijskog širenja. Dalje, upotreba visokih koncentracija ćelija omogućuje efikasnije hvatanje ćelija koje mogu slabo da eksprimiraju ciljne antigene od značaja, kao što su CD28-negativne T ćelije. Takve populacije ćelija mogu da imaju terapeutsku vrednost i bilo bi poželjno da se dobiju u određenim načinima ostvarivanja. Na primer, upotreba visoke koncentracije ćelija omogućava efikasniji odabir CD8+ T ćelija koje inače imaju slabiju ekspresiju CD28.
[0360] U nekim načinima ostvarivanja, mešavina može da se uzgaja nekoliko sati (oko 3 sata) do oko 14 dana ili bilo koje okrugle satnice između. U drugom načinu ostvarivanja, mešavina može da se uzgaja 21 dan. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska kuglice i T ćelije se zajedno kultivišu oko osam dana. U drugom načinu ostvarivanja, kuglice i T ćelije se zajedno kultivišu 2-3 dana. Takođe može biti poželjno nekoliko ciklusa stimulacije tako da vreme kulture T ćelija može biti 60 dana ili više. Uslovi pogodni za kulturu T ćelija uključuju odgovarajuću podlogu (npr., minimalne esencijalne podloge ili RPMI podloge 1640 ili, X-vivo 15, (Lonza)) koji mogu da sadrže faktore potrebne za proliferaciju i održivost, uključujući serum (npr., fetalni goveđi ili ljudski serum), interleukin-2 (IL-2), insulin, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ, i TNF-a ili bilo koje druge dodatke za rast ćelija koji su poznati stručnjaku. Ostali dodaci za rast ćelija uključuju, ali bez ograničenja na, surfaktant, plazmanat i redukciona sredstva kao što su N-acetil-cistein i 2-merkaptoetanol. Podloge mogu da uključuju RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15 i X-Vivo 20, Optimizer, sa dodatim aminokiselinama, natrijumovim piruvatom i vitaminima, bilo bez seruma ili dopunjen odgovarajućom količinom seruma (ili plazme) ili definisanim skupom hormona, i/ili količinom citokina(a) dovoljnom za rast i širenje T ćelija. Antibiotici, npr., penicilin i streptomicin, uključeni su samo u pokusne kulture, ne i u kulture ćelija koje se subjektu daju infuzijom.
Ciljne ćelije se održavaju u uslovima potrebnim za podržavanje rasta, na primer, odgovarajuća temperatura (npr., 37 °C) i atmosfera (npr., zrak plus 5% CO2). T ćelije koje su bile izložene različitim vremenima stimulacije mogu da pokazuju različite karakteristike. Na primer, tipična krv ili aferizirani proizvodi mononuklearnih ćelija periferne krvi imaju populaciju pomoćnih T ćelija (TH, CD4+) koja je veća od populacije citotoksičnih ili supresorskih T ćelija (TC, CD8). Ex vivo ekspanzija T ćelija stimulacijom CD3 i CD28 receptora proizvodi populaciju T ćelija koja se pre otprilike 8-9 dana sastoji pretežno od TH ćelija, dok nakon otprilike dana 8-9, populacija T ćelija uključuje sve veću populaciju TC ćelija. Prema tome, u zavisnosti od svrhe lečenja, davanje infuzije subjektu sa populacijom T ćelija koja se pretežno sastoji od TH ćelija može biti poželjna. Slično, ako je izolovan antigenski specifičan podskup TC ćelija, može biti korisno da se ovaj podskup proširi do većeg stepena.
[0361] Dalje, pored CD4 i CD8 markera, drugi fenotipski markeri značajno variraju, ali velikim delom, reproduktivno tokom procesa ćelijskog širenja. Prema tome, takva ponovljivost daje mogućnost prilagođavanja proizvoda aktiviranih T ćelija za specifične svrhe.
V. Farmaceutske kompozicije
[0362] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje obuhvataju konstruisane imune efektorske ćelije koje obuhvataju BCMA CAR pronalaska, i farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutske kompozicije mogu biti pripremljene mešanjem većeg broja konstruisanih efektorskih ćelija sa željenim stepenom čistoće sa opcionim farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija i vodenih rastvora.
[0363] Prihvatljivi nosači, ekscipijensi ili stabilizatori su netoksični za primaoce u korišćenim dozama dozama i koncentracijama, i uključuju pufere, antioksidanse uključujući askorbinsku kiselinu, metionin, vitamin E, natrijumov metabisulfit; konzervansi, izotonicifikatori, stabilizatori, metalni kompleksi (npr. Zn-proteinski kompleksi); helatna sredstva kao što su EDTA i/ili nejonski surfaktanti.
[0364] Puferi se koriste za kontrolu pH u opsegu koji optimizuje terapijsku efikasnost, posebno ako stabilnost zavisi od pH. Puferi su poželjno prisutni u koncentracijama u opsegu od oko 50 mM do oko 250 mM. Pogodna sredstva za puferisanje za upotrebu sa ovim pronalaskom uključuju i organske i neorganske kiseline i njihove soli. Na primer, citrat, fosfat, sukcinat, tartarat, fumarat, glukonat, oksalat, laktat, acetat. Dodatno, puferi mogu da sadrže soli histidina i trimetilamina kao što je Tris.
[0365] Konzervansi se dodaju kako bi se usporio rast mikroba, a obično su prisutni u opsegu od 0,2%-1,0% (w/v). Pogodni konzervansi za upotrebu sa ovim pronalaskom uključuju oktadecildimetilbenzil amonijum-hlorid; heksametonijum-hlorid; benzalkonijumovi halidi (npr., hlorid, bromid, jodid), benzetonijum-hlorid; timerozal, fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol, 3-pentanol i m-krezol.
[0366] Sredstva za povećanje toničnosti, ponekad poznata kao "stabilizatori", prisutna su za podešavanje ili održavanje toničnosti tečnosti u kompoziciji. Kada se koriste sa velikim, nabijenim biomolekulima kao što su proteini i antitela, često se nazivaju "stabilizatorima" jer mogu da deluju u interakciji sa nabijenim grupama bočnih lanaca aminokiselina, čime se smanjuje mogućnost inter- i intramolekulskih interakcija. Sredstva za povećanje toničnosti mogu da budu prisutna u bilo kojoj količini između 0,1% do 25% mase, poželjno 1% do 5%, uzimajući u obzir relativne količine ostalih sastojaka. Poželjna sredstva za povećanje toničnosti uključuju polihidrične šećerne alkohole, poželjno trohidrične ili višešećerne alkohole, kao što su glicerin, eritritol, arabitol, ksilitol, sorbitol i manitol.
[0367] Dodatni ekscipijensi uključuju agense koji mogu služiti kao jedan ili više od sledećeg: (1) agensi za povećanje zapremine, (2) pojačivači rastvorljivosti, (3) stabilizatori i (4) agensi koji sprečavaju denaturaciju ili prianjanje na zid suda. Takvi ekscipijensi uključuju: višebazne šećerne alkohole (gore nabrojane); aminokiseline kao što su alanin, glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin, lizin, ornitin, leucin, 2-fenilalanin, glutaminska kiselina, treonin, itd.; organski šećeri ili šećerni alkoholi kao što su saharoza, laktoza, laktitol, trehaloza, stahioza, manoza, sorboza, ksiloza, riboza, ribitol, mioinizitoza, mioinizitol, galaktoza, galaktitol, glicerol, ciklitoli (npr., inozitol), polietilen glikol; redukciona sredstva koja sadrže sumpor, kao što su urea, glutation, tioktinska kiselina, natrijum tioglikolat, tioglicerol, amonotioglicerol i natrijum tio sulfat; proteini niske molekulske mase kao što su ljudski serumski albumin, goveđi serumski albumin, želatin ili drugi imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidon; monosaharidi (npr., ksiloza, manoza, fruktoza, glukoza); disaharidi (npr., laktoza, maltoza, saharoza); trisaharide kao što je rafinoza; i polisaharide kao što je dekstrin ili dekstran.
[0368] Nejonski surfaktanti ili deterdženti (takođe poznati kao "ovlaživač") prisutni su kako bi pomogli u solubilizaciji terapeutskog agensa kao i za zaštitu terapeutskog proteina od agregacije izazvane agitacijom, što takođe dopušta da formulacija bude izložena površinskom naprezanju smicanja a da se ne uzrokuje denaturacija aktivnog terapijskog proteina ili antitela. Nejonski surfaktanti prisutni su u rasponu od oko 0,05 mg/ml do oko 1,0 mg/ml, poželjno oko 0,07 mg/ml do oko 0,2 mg/ml.
[0369] Pogodni nejonski surfaktanti uključuju polisorbate (20, 40, 60, 65, 80, itd.), polioksamere (184, 188, itd.), PLURONIC<®>poliole, TRITON<®>, polioksietilen sorbitan monoetre (TWEEN<®>-20, TWEEN<®>-80, itd.), lauromakrogol 400, polioksil 40 stearat, polioksietilen hidrogenirano ricinusovo ulje 10, 50 i 60, glicerol monostearat, estar masne kiseline saharoze, metil celuloza i karboksimetil celuloza. Anjonski deterdženti koji se mogu koristiti uključuju natrijum lauril sulfat, dioktil natrijum sulfosukcinat i dioktil natrijum sulfonat. Katjonski deterdženti uključuju benzalkonijim hlorid ili benzetonijum hlorid.
[0370] Kako bi farmaceutske kompozicije mogle da se koriste za in vivo primenu, moraju biti sterilne. Farmaceutska kompozicija može da se učini sterilnim filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Farmaceutske kompozicije se ovde generalno stavljaju u sud koji ima sterilni pristupni otvor, na primer, vrećicu za intravenski rastvor koja ima zatvarač koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju.
[0371] Put primene je u skladu sa poznatim i prihvaćenim postupcima, kao što su jednokratni ili višestruki bolus ili infuzija tokom dugog vremenskog razdoblja na odgovarajući način, npr., injekcijom ili infuzijom supkutanim, intravenskim, intraperitonealnim, intramuskularnim, intraarterijskim, intralezijskim ili intraartikularnim putevima, lokalnom primenom, inhalacijom ili produženim oslobađanjem ili produženim oslobađanjem.
[0372] Mogu da se pripreme preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropusne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antagonist, a koje su matrice u obliku oblikovanih predmeta, npr. filmova ili mikrokapsula. Primeri matrica sa produženim oslobađanjem uključuju poliestre, hidrogelove (na primer, poli(2-hidroksietilmetakrilat) ili poli(vinilalkohol)), polilaktide (američki pat. br.3,773,919), kopolimere L-glutaminske kiseline i etil-L-glutamata, nerazgradivi etilen-vinil acetat, razgradivi kopolimeri mlečne kiseline i glikolne kiseline kao što je LUPRON DEPOT<™>(injektabilne mikrosfere sastavljene od kopolimera mlečne kiseline i glikolne kiseline i leuprolid acetata), i poli-D-(-)-3-hidroksimaslačne kiseline.
[0373] Farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane mogu takođe da sadrže više od jednog aktivnog jedinjenja ili sredstva prema potrebi za određenu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču nepovoljno jedno na drugo. Alternativno, ili dodatno, kompozicija može da sadrži citotoksično sredstvo, hemoterapeutsko sredstvo, citokin, imunosupresivno sredstvo ili sredstvo za inhibiciju rasta. Takvi molekuli su prikladno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efektivne za predviđenu svrhu.
[0374] Aktivni sastojci takođe mogu da budu zarobljeni u mikrokapsulama pripremljenim, na primer, tehnikama koacervacije ili međufaznom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilceluloza ili želatinske mikrokapsule odnosno poli-(metilmetacilatne) mikrokapsule, u koloidnim sistemima za isporuku leka (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su otkrivene u Remington's Pharmaceutical Sciences 18. izdanje.
VI. Upotrebe u postupcima lečenja
[0375] Ovaj pronalazak se dalje odnosi na CAR ili farmaceutsku kompoziciju za upotrebu u postupcima ćelijske imunoterapije. U nekim načinima ostvarivanja, ćelijska imunoterapija je za lečenje kancera, uključujući ali bez ograničenja na hematološke malignitete i čvrste tumore. Bilo koje od sdAb anti-BCMA, CAR i konstruisanih imunoloških efektorskih ćelija (kao što su CAR-T ćelije) koje su ovde opisane mogu da se koriste u postupku lečenja kancera. Ovde opisani CAR mogu biti korisni za lečenje tumora koji imaju mutacije izbegavanja gubitka antigena i za smanjenje otpornosti na postojeće terapije. U nekim načinima ostvarivanja, kompozicije ovog pronalaska mogu da se koriste u postupcima za lečenje drugih bolesti koje su povezane sa antigenima koje specifično prepoznaju antitela sa jednom domenom ili CAR, uključujući, na primer, autoimune bolesti.
[0376] U nekim načinima ostvarivanja, postupak je za lečenje kancera (kao što je multipli mijelom, npr., relapsni ili refraktorni multipli mijelom) kod pojedinca (kao što je čovek), koji uključuje davanje pojedincu efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži: (1) modifikovanu imunološku efektorsku ćeliju (kao što je T ćelija) koja sadrži viševalentni CAR koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni vezujući antigenski domenkoji sadrži prvo sdAb anti-BCMA koje sadrži VHH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124, i drugo sdAb anti-BCMA koje sadrži VHH domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 117; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen; i (2) farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imunološka efektorska ćelija je autologna. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imunološka efektorska ćelija je alogena. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisane imunološke efektorske ćelije su CAR-T ćelije. U nekim načinima ostvarivanja, kancer je tečni kancer, kao što je multipli mijelom, akutna limfoblastična leukemija ili hronična limfocitna leukemija. U nekim načinima ostvarivanja, kancer je refraktoran ili ima recidiv multiplog mijeloma. U nekim načinima ostvarivanja, modifikovana imunološka efektorska ćelija se primenjuje u dozi od oko 10<5>do oko 10<7>ćelija/kg, kao što je oko 3×10<5>do oko 7×10<6>ćelija/kg, ili oko 3×10<6>ćelija/kg. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imunološka efektorska ćelija se primenjuje intravenskom injekcijom. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imunološka efektorska ćelija se daje u tri podeljene doze tokom otprilike nedelju dana.
[0377] U nekim načinima ostvarivanja, postupak je za lečenje kancera (kao što je multipli mijelom, npr., relapsni ili refraktorni multipli mijelom) kod pojedinca (kao što je čovek), koji obuhvata davanje pojedincu efektivne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži: (1) modifikovanu imunološku efektorsku ćeliju (kao što je T ćelija) koja sadrži BCMA CAR pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni antigenski vezujući domen koji sadrži dva sdAb anti-BCMA; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen; i (2) farmaceutski prihvatljiv nosač, pri čemu prvo sdAb anti-BCMA može da sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 41; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 79; drugo sdAb anti-BCMA može da sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:10; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 48; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 86. Anti-BCMA sdAb može biti kamelidno, himerno, humano ili humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb anti-BCMA sadrži VHH domen koji sadrži aminokiselinu sekvencu SEQ ID NO: 124 i drugo sdAb anti-BCMA sadrži VHH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 117. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA CAR sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 300-305. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imunološka efektorska ćelija je autologna. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imunološka efektorska ćelija je alogena. U nekim načinima ostvarivanja, kancer je tečni kancer, kao što je multipli mijelom, akutna limfoblastična leukemija ili hronična limfocitna leukemija. U nekim načinima ostvarivanja, kancer je refraktoran ili ima recidiv multiplog mijeloma. U nekim načinima ostvarivanja, modifikovana imunološka efektorska ćelija se primenjuje u dozi od oko 10<5>do oko 10<7>ćelija/kg, kao što je oko 3×10<5>do oko 7×10<6>ćelija/kg, ili oko 3×10<6>ćelija/kg. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imunološka efektorska ćelija se primenjuje intravenskom injekcijom. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imunološka efektorska ćelija se daje u tri podeljene doze tokom otprilike nedelju dana.
[0378] U nekim načinima ostvarivanja, postupak je za postizanje delimične ili potpune kliničke remisije kod pojedinca koji ima multipli mijelom (npr., recidiv ili refraktorni multipli mijelom). U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imunološka efektorska jedinica je autologna. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imunološka efektorska jedinica je alogena. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisane imunološke efektorske jedinice su CAR-T ćelije. U nekim načinima ostvarivanja, kancer je tečni kancer, kao što je multipli mijelom, akutna limfoblastična leukemija ili hronična limfocitna leukemija. U nekim načinima ostvarivanja, kancer je refraktoran ili ima recidiv multiplog mijeloma. U nekim načinima ostvarivanja, modifikovana imunološka efektorska ćelija se primenjuje u dozi od oko 10<5>do oko 10<7>ćelija/kg, kao što je oko 3×10<5>do oko 7×10<6>ćelija/kg, ili oko 3×10<6>ćelija/kg. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imunološka efektorska ćelija se primenjuje intravenskom injekcijom. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imunološka efektorska ćelija se daje u tri podeljene doze tokom otprilike nedelju dana.
[0379] Kao referenca je otkriveno da postoji postupak lečenja kancera (kao što su multipli mijelom, npr., relapsni ili refraktorni multipli mijelom) kod pojedinca (kao što je humani pojedinac), koji obuhvata davanje pojedincu efektivne količine farmaceutske kompozicije koja obuhvata sdAb anti-BCMA i farmaceutski prihvatljiv nosač, pri čemu sdAb anti-BCMA obuhvata bilo koju od sledećih: (1) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:39; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:77; (2) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:40; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:78; (3) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:41; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:79; (4) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:42; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:80; (5) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:43; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:81; (6) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:82; (7) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:45; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:83; (8) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:46; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:84; (9) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:47; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:85; (10) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:10; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:48; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:86; (11) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:11; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:49; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:87; (12) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:50; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:88; (13) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:13; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:51; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:89; (14) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:52; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:90; (15) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:91; (16) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:16; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:54; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:92; (17) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:17; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:55; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:93; (18) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:18; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:94; (19) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:57; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:95; (20) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:58; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:96; (21) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:21; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:59; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:97; (22) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:60; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:98; (23) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:61; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:99; (24) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:62; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:100; (25) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:25; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:63; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:101; (26) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:64; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:102; (27) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:65; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:103; (28) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:66; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:104; (29) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:67; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:105; (30) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:68; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:106; (31) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:69; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:107; (32) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:70; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:108; (33) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:33; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:71; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:109; (34) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:34; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:72; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:110; (35) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:35; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:73; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:111; (36) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:36; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:74; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:112; (37) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:37; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:75; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:113; ili (38) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:38; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:76; CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:114. U nekim primerima, sdAb anti-BCMA je kamelidno, himerno, humano, ili humanizovano. U nekim primerima, sdAb anti-BCMA obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 115-152. U nekim primerima, kancer je tečni kancer, kao što su multipli mijelom, akutna limfoblastična leukemija, ili hronična limfocitna leukemija. U nekim primerima, kancer je refraktorni ili relapsni multipli mijelom.
[0380] Ovde opisani postupci su pogodni za lečenje raznih kancera, uključujući i čvrste i tečne kancere. Ti postupci mogu da se primenjuju na kancera svih stadijuma, uključujući rani stadijum, uznapredovali stadijum i metastatski kancer. Ovde opisani postupci mogu da se koriste kao prva terapija, druga terapija, treća terapija, ili kombinovana terapija sa drugim tipovima kancerskih terapija poznatih u ovoj oblasti, kao što su hemoterapija, hirurgija, zračenje, genska terapija, imunoterapija, transplantacija koštane srži, transplantacija matičnih ćelija, ciljna terapija, krijoterapija, terapija ultrazvukom, fotodinamična terapija, radiofrekventna ablacija ili tom sličnom, u adjuvansnom ili neadjuvansnom okruženju.
[0381] U nekim načinima ostvarivanja, kancer je multipli mijelom. U nekim načinima ostvarivanja, kancer je stadijum I, stadijum II ili stadijum III, i/ili stadijum A ili stadijum B multiplog mijeloma na osnovu Durie-Salmonov sistema stadijuma. U nekim načinima ostvarivanja, kancer je stadijum I, stadijum II ili stadijum III multiplog mijeloma na osnovu međunarodnog sistema stadijuma koji je objavila Međunarodna radna grupa za mijelom (IMWG). U nekim načinima ostvarivanja, kancer je monoklonalna gamopatija neodređenog značaja (MGUS). U nekim načinima ostvarivanja, kancer je asimptomatski (tinjajući/indolentni) mijelom. U nekim načinima ostvarivanja, kancer je simptomatski ili aktivni mijelom. U nekim načinima ostvarivanja, kancer je refraktorni multipli mijelom. U nekim načinima ostvarivanja, kancer je metastatski multipli mijelom. U nekim načinima ostvarivanja, pojedinac nije reagovao na prethodno lečenje multiplog mijeloma. U nekim načinima ostvarivanja, pojedinac ima progresivnu bolest nakon prethodnog lečenja multiplog mijeloma. U nekim načinima ostvarivanja, pojedinac je prethodno primio barem bilo koji od 2, 3, 4 ili više terapija za multipli mijelom. U nekim načinima ostvarivanja, kancer je recidiv multiplog mijeloma.
[0382] U nekim načinima ostvarivanja, pojedinac ima aktivni multipli mijelom. U nekim načinima ostvarivanja, pojedinac ima plazmatske ćelije iz koštane srži od najmanje 10%. U nekim načinima ostvarivanja, pojedinac ima biopsijom dokazan koštani ili ekstramedularni plazmocitom. U nekim načinima ostvarivanja, pojedinac ima dokaze o oštećenju krajnjeg organa koji se može pripisati osnovnom poremećaju proliferacije plazmatskih ćelija. U nekim načinima ostvarivanja, pojedinac ima hiperkalcijemiju, npr., serumski kalcijum >0,25 mmol/L (>1mg/dL) viši od gornje granice normale ili >2,75 mmol/L (>11mg/dL). U nekim načinima ostvarivanja, pojedinac ima bubrežnu insuficijenciju, npr., klirens kreatinina <40 mL po minuti ili serumski kreatinin >177µmol/L (>2mg/dL). U nekim načinima ostvarivanja, pojedinac ima anemiju, npr., vrijednost hemoglobina >20g/L ispod najniže granice normale ili vrednost hemoglobina <100g/L. U nekim načinima ostvarivanja, pojedinac ima jednu ili više koštanih lezija, npr., jedna ili više osteolitičkih lezija na radiografiji skeleta, CT-u ili PET/CT-u. U nekim načinima ostvarivanja, pojedinac ima jedan ili više od sledećih biomarkera maligniteta (MDE): (1) 60% ili više klonalnih plazmatskih ćelija na pregledu koštane srži; (2) odnos uključenog/neuključenog slobodnog lakog lanca u serumu od 100 ili veći, pod uslovom da je apsolutni nivo uključenog lakog lanca najmanje 100 mg/L; i (3) više od jedne fokalne lezije na MRI koja je veličine najmanje 5 mm ili više.
[0383] Primena farmaceutskih kompozicija može da se izvede na bilo koji pogodan način, uključujući injekcijom, gutanjem, transfuzijom, implantacijom ili transplantacijom. Kompozicije mogu da se daju pacijentu transarterijski, subkutano, intradermalno, intratumoralno, intranodalno, intramedularno, intramuskularno, intravenski ili intraperitonealno. U nekim načinima ostvarivanja, farmaceutska kompozicija se primenjuje sistemski. U nekim načinima ostvarivanja, farmaceutska kompozicija se daje e pojedincu infuzijom, kao što je intravenska infuzija. Tehnike infuzije za imunoterapiju poznate su u struci (videti, npr., Rosenberg et al., New Eng. J. of Med.319: 1676 (1988)). U nekim načinima ostvarivanja, farmaceutska kompozicija se daje pojedincu intradermalnom ili supkutanom injekcijom. U nekim načinima ostvarivanja, kompozicije se daju intravenskom injekcijom. U nekim načinima ostvarivanja, kompozicije se ubrizgavaju direktno u tumor ili limfni čvor. U nekim načinima ostvarivanja, farmaceutska kompozicija se primenjuje lokalno na mesto tumora, kao što je direktno u tumorske ćelije, ili u tkivo koje ima tumorske ćelije.
[0384] Doze i željena koncentracija leka u farmaceutskim kompozicijama ovog pronalaska mogu da variraju u zavisnosti od određene predviđene upotrebe. Određivanje odgovarajuće doze ili načina davanja je dobro poznato stručnjaku iz ove oblasti. Eksperimenti na životinjama daju pouzdane smernice za određivanje efektivnih doza za lečenje ljudi. Skaliranje među vrstama efektivnih doza može da se izvede prema načelima utvrđenim u Mordenti, J. and Chappell, W. "The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics," In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp.42-46. Unutar opsega ovog pronalaska je da će različite formulacije biti efektivne za različite terapije i različite poremećaje, i da primena namenjena lečenju specifičnog organa ili tkiva može da zahteva isporuku na način koji se razlikuje od onoga u drugi organ ili tkivo.
[0385] Otkriveno kao referenca, pri čemu farmaceutska kompozicija sadrži bilo koji od ovde opisanih sdAb, farmaceutska kompozicija se primenjuje u dozi od oko 10 ng/kg do oko 100 mg/kg telesne mase pojedinca ili više dnevno, za na primer, od oko 1 mg/kg/dan do 10 mg/kg/dan, u zavisnosti od načina primene. Smernice o određenim dozama i načinima isporuke date su u literaturi; videti, na
primer, američki pat. br.4,657,760; 5,206,344; ili 5,225,212.
[0386] U nekim načinima ostvarivanja, pri čemu farmaceutska kompozicija obuhvata bilo koju od konstruisanih imunih ćelije pronalaska, farmaceutska kompozicija se primenjuje u dozi od najmanje oko bilo koje od 10<4>, 10<5>, 10<6>, 10<7>, 10<8>, ili 10<9>ćelija/kg telesne mase pojedinca. U nekim načinima ostvarivanja, farmaceutska kompozicija se daje u bilo kojoj dozi od oko 10<4>do oko 10<5>, oko 10<5>do oko 10<6>, oko 10<6>do oko 10<7>, oko 10<7>do oko10<8>, oko 10<8>do oko 10<9>, oko 10<4>do oko 10<9>, oko 10<4>do oko 10<6>, oko 10<6>do oko 10<8>, ili oko 10<5>do oko 10<7>ćelija/kg telesne mase pojedinca. U nekim načinima ostvarivanja, farmaceutska kompozicija se daje u dozi od najmanje oko bilo kojoj od 1×10<5>, 2×10<5>, 3×10<5>, 4×10<5>, 5×10<5>, 6×10<5>, 7×10<5>, 8×10<5>, 9×10<5>, 1×10<6>2×10<6>, 3×10<6>, 4×10<6>, 5×10<6>, 6×10<6>, 7×10<6>, 8×10<6>, 9×10<6>, 1×10<7>ćelij/kg ili više. U nekim načinima ostvarivanja, farmaceutska kompozicija se daje u dozi od oko 3×10<5>do oko 7×10<6>ćelija/kg, ili oko 3×10<6>ćelija/kg.
[0387] U nekim načinima ostvarivanja, farmaceutska kompozicija se daje jednokratno. U nekim načinima ostvarivanja, farmaceutska kompozicija se daje više puta (kao što je bilo koje od 2, 3, 4, 5, 6 ili više puta). U nekim načinima ostvarivanja, farmaceutska kompozicija se daje jednom nedeljno, jednom u 2 nedelje, jednom u 3 nedelje, jednom u 4 nedelje, jednom mesečno, jednom u 2 meseca, jednom u 3 meseca, jednom u 4 meseca, jednom u 5 meseci, jednom na 6 meseci, jednom na 7 meseci, jednom na 8 meseci, jednom na 9 meseci ili jednom godišnje. U nekim načinima ostvarivanja, interval između primena je otprilike bilo koji od 1 nedelje do 2 nedelje, 2 nedelje do 1 meseca, 2 nedelje do 2 meseca, 1 meseca do 2 meseca, 1 meseca do 3 meseca, 3 meseca do 6 meseci, ili 6 meseci do godinu dana. Optimalno doziranje i režim lečenja za određenog pacijenta može lako da odredi stručnjak iz medicinske oblasti praćenjem pacijenta radi znakova bolesti i prilagođavanjem lečenja u skladu sa tim.
[0388] Štaviše, doze mogu da se primenjuju jednom ili više odvojenih primena ili kontinuiranom infuzijom. U nekim načinima ostvarivanja, farmaceutska kompozicija se daje u podeljenim dozama, kao što je bilo koja od 2, 3, 4, 5 ili više doza. U nekim načinima ostvarivanja, podeljene doze se daju tokom otprilike nedelju dana. U nekim načinima ostvarivanja, doza je jednako podeljena. U nekim načinima ostvarivanja, podeljene doze su oko 20%, oko 30% i oko 50% ukupne doze. U nekim načinima ostvarivanja, interval između uzastopnih podeljenih doza je oko 1 dan, 2 dana, 3 dana ili više. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje se nastavlja sve dok ne dođe do željene supresije simptoma bolesti. Međutim, drugi režimi doziranja mogu biti korisni.
Napredak ove terapije lako se prati uobičajenim tehnikama i ispitivanjima.
[0389] U nekim načinima ostvarivanja, količina farmaceutske kompozicije je efektivna za uzrokovanje objektivne kliničke reakcije kod pojedinca. U nekim načinima ostvarivanja, postupak je za dobijanje objektivnog kliničkog odgovora kod pojedinca koji ima multipli mijelom (npr., recidiv ili refraktorni multipli mijelom). U nekim načinima ostvarivanja, kod pojedinca se postiže strogi klinički odgovor (sCR).
[0390] U nekim načinima ostvarivanja, količina farmaceutske kompozicije je efektivna da uzrokuje remisiju bolesti (delimičnu ili potpunu) kod pojedinca. U nekim načinima ostvarivanja, postupak je za uzrokovanje remisije bolesti (delimične ili potpune) kod pojedinca sa multiplim mijelomom (npr., relapsnim ili refraktornim multiplim mijelomom). U nekim načinima ostvarivanja, klinička remisija se dobije nakon najviše bilo 6 meseci, 5 meseci, 4 meseca, 3 meseca, 2 meseca, 1 meseca ili manje nakon što pojedinac primi farmaceutsku kompoziciju.
[0391] U nekim načinima ostvarivanja, količina farmaceutske kompozicije je efektivna da spreči relaps ili napredovanje bolesti kancera kod pojedinca. U nekim načinima ostvarivanja, postupak je za sprečavanje relapsa ili napredovanja bolesti kod pojedinca sa multiplim mijelomon (npr., relapsni ili refraktorni multipli mijelom). U nekim načinima ostvarivanja, relaps ili napredovanje bolesti se sprečava za najmanje oko 6 meseci, 1 godine, 2 godine, 3 godine, 4 godine, 5 godina ili više.
[0392] U nekim načinima ostvarivanja, količina farmaceutske kompozicije je efektivna za produžavanje preživljavanja (kao što je preživljavanje bez bolesti) kod pojedinca. U nekim načinima ostvarivanja, preživljavanje se produžava za najmanje oko 2, 3, 4, 5, 6, 12, ili 24 meseca. U nekim načinima ostvarivanja, postupak za produžavanje preživljavanja pojedinca sa multiplim mijelomom (npr., relapsni ili refraktorni multipli mijelom).
[0393] U nekim načinima ostvarivanja, farmaceutska kompozicija je efektivna u poboljšanju kvaliteta života kod pojedinca. U nekim načinima ostvarivanja, taj postupak je za poboljšanje kvaliteta života pojedinca sa multiplim mijelomom (npr., relapsnim ili refraktornim multiplim mijelomom).
[0394] U nekim načinima ostvarivanja, količina farmaceutske kompozicije je efektivna da inhibira rast ili smanjenje veličine čvrstog ili limfatičnog tumora. U nekim načinima ostvarivanja, veličina čvrstog ili limfatičnog tumora je smanjena za najmanje oko 10% (uključujući na primer najmanje oko bilo 20%, 30%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili 100%). U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je postupak inhibiranja rasta ili smanjenje veličine čvrstog ili limfatičnog tumora kod pojedinca.
[0395] U nekim načinima ostvarivanja, količina farmaceutske kompozicije je efektivna da inhibira metastazu tumora kod pojedinca. U nekim načinima ostvarivanja, najmanje oko 10% (uključujući na primer najmanje oko bilo 20%, 30%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili 100%) metastaze je inhibirano. U nekim načinima ostvarivanja, postupak je za inhibiranje metastaze tumora pojedinca sa multiplim mijelomom (npr., relapsni ili refraktorni multipli mijelom). U nekim načinima ostvarivanja, postupak je za inhibiranje metastaze do limfnog čvora. U nekim načinima ostvarivanja, postupak je za inhibiranje metastaze na pluća. U nekim načinima ostvarivanja, postupak je za inhibiranje metastaze na jetru. Metastaza može da se oceni bilo kojim poznatim postupcima u ovoj oblasti, kao što su nalazi iz krvi, skeniranje kostiju, rendgenski snimci, CT skeniranje, PET skeniranje, i biopsija.
VII. Kompleti i proizvodni artikli
[0396] Ovde su dalje obezbeđeni kompleti, jedinične doze i proizvodni artikli koji sadrže bilo koji od himernih antigenskih receptora ili konstruisanih imunoloških efektorskih ćelija ovog pronalaska. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je komplet koji sadrži bilo koji od farmaceutskih kompozicija pronalaska i poželjno su obezbeđena dalja uputstva za njegovu upotrebu.
[0397] Kompleti ovog pronalaska su u prigodnom pakovanju. Prigodno pakovanje uključuje, ali nije ograničeno na, bočice, boce, tegle, fleksibilna pakovanja (npr., zatvorene Mylar ili plastične vrećice) i slično. Kompleti mogu opciono da obezbede dodatne komponente kao što su puferi i interpretativne informacije. Ovaj pronalazak samim tim obezbeđuje proizvodne artikle koji uključuju bočice (kao što su zaptivene bočice), boce, tegle, fleksibilna pakovanja i slično.
[0398] Proizvodni artikal može da sadrži sud i etiketu ili uputstvo za upotrebu na povezanom sudu. Pogodni sudovi uključuju, na primer, boce, bočice, špriceve, itd. Sudovi mogu biti napravljeni od raznih materijala kao što su staklo ili plastika. Generalno, sud sadrži kompoziciju koja je efikasna za lečenje bolesti ili poremećaja (kao što je rak) koji je ovde opisan, i može da ima sterilni pristupni otvor (na primer, sud može biti vrećica za intravenski rastvor ili bočica koja ima zatvarač koji se može probušiti iglom za potkožnu injekciju). Oznaka ili uputstvo za upotrebu pokazuje da se kompozicija koristi za lečenje određenog stanja kod pojedinca. Etiketa ili uputstvo za upotrebu dalje sadrže uputstvo za davanje kompozicije pojedincu. Oznaka može sadržavati upute za rekonstituciju i/ili upotrebu. Sud u kojem se nalazi farmaceutska kompozicija može biti višenamenska bočica, koja omogućava ponovnu primenu (npr. od 2-6 primena) rekonstituisane formulacije. Uputstvo za upotrebu se odnosi na uputstva koja se obično nalaze u komercijalnim pakovanjima terapijskih proizvoda koja sadrže informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvih terapijskih proizvoda. Dodatno, predmet proizvodnje može dalje da sadrži drugi sud koji sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fosfatno puferisani fiziološki rastvor, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Može dalje da uključuje druge materijale poželjne sa komercijalne tačke gledišta, uključujući druge pufere, razređivače, filtere, igle i špriceve.
[0399] Kompleti ili proizvodni artikal mogu da uključuju višejedinične doze farmaceutske kompozicije i uputstva za upotrebu, pakovana u količinama dovoljnim za čuvanje i upotrebu u apotekama, na primer, bolničkim apotekama i apotekama za pravljenje jedinjenja.
[0400] Primeri u nastavku su predviđeni da budu čisto primeri pronalaska i samim tim ne bi trebalo da se smatraju kao ograničenje pronalaska na bilo koji način. Sledeći primeri su dati kao ilustracija a ne kao ograničenje.
PRIMERI
[0401] Primeri o kojima će biti reči u nastavku su predviđeni da služe čisto kao primer pronalaska i ne bi trebalo da se smatraju ograničenjem pronalaska na bilo koji način. Primeri nisu predviđeni da predstavljaju primere jedinih eksperimenata koji mogu da se izvedu. Uloženi su napori da se osigura tačnost u smislu brojeva koji se koriste (na primer, količine, temperature, itd.) ali trebalo bi da se računa na neke eksperimentalne greške i odstupanja. Ukoliko nije drugačije naznačeno, delovi predstavljaju masene delove, molekulska masa je prosečna molekulska masa, temperatura je izražena u Celzijusovim stepenima, a pritisak je atmosferski, ili je blizu istog.
Primer 1. Priprema sdAb anti-BCMA
[0402] Da bi se razvila sdAb velikog afiniteta vezivanja za BCMA, lame su imunizovane rekombinantnim BCMA antigenom. Biblioteka prikaza faga je zatim konstruisana kako bise identifikovali VHH lideri.
Različiti klonovi su nasumično izabrani i klasifikovani su prema regionu za određivanje komplementarnosti teškog lanca (CDR3), regionu koji igra glavnu ulogu u vezivanu antigena. Primer protokola je opisan u nastavku. Opisani su drugi protokoli za pripremu sdAb. Videti, na primer, Els Pardon et al, Nature Protocol, 2014; 9(3): 674.
1. Imunizacija životinja i ispitivanje imunog odgovora
1.1 Imunizacija životinja
[0403] Imunogen koji obuhvata rekombinantni humani BCMA protein sa C-terminalnom Fc oznakom (ACRO Biosystems, kat br.:BC7-H5254) pomešan je sa adjuvansom ili PBS-om i ubrizgan lamama.
Životinje je imunizovao uslužni prodavac (Cedarline) sedam puta, obično sa 200 ug imunogena i CFA (kompletnog Freundovog adjuvansa) svaki put u intervalima od oko 1 do 2 nedelje. Uzorci periferne krvi su uzeti u fazi pre imunizacije i nakon 5. i 7. imunizacije. Nakon više ciklusa imunizacije, imune reakcije lama protiv ciljnog antigena su procenjene kako bi se utvrdio titar antigen-specifičnih sdAb. Limfociti su izolovani gradijentnim centrifugiranjem iz oko 100 ml periferne krvi. Ćelije su dopunjene sa RNALATER<™>i čuvane na -80°C. Serumi su dobijeni centrifugiranjem antikoagulisanih uzoraka krvi i čuvani na -80°C.
1.2 IgG frakcionisanje
[0404] Frakcionisanje podklase IgG je izvedeno prema standardnom operativnoj proceduri GenScripta.
Podklase IgG frakcionisane su iz seruma terminalnog krvarenja pomoću smola Protein G i Protein A. Uzorak seruma od 1 ml napunjen je na 1 ml HITRAP<®>Protein G HP koloni, i kolona je isprana sa 10 ml fosfatnog pufera (20 mM, pH 7,0). Frakcija IgG3 (MW 100,000 Da) eluirana je sa 0,15 M NaCl, 0,58% sirćetnom kiselinom (pH 3,5), a eluat je neutralizovan sa 1 M Tris-HCl (pH 9,0) do pH 7,4. Potom je frakcija IgG1 (MW 170,000 Da) eluirana sa 0,1 M glicin-HCl (pH 2,7), a eluat je neutralizovan sa 1 M Tris-HCl (pH 8,5) do pH 7,4. Protok HITRAP-a<®>Protein G HP kolona je zatim napunjena na 1 ml HITRAP<®>Protein A HP koloni, i kolona je isprana sa 20 ml fosfatnog pufera (20 mM, pH 7,0). Frakcija IgG2 (MW 100,000 Da) je eluirana sa 0,15 M NaCl, 0,58% sirćetnom kiselinom (pH 4,5), a eluat je neutralizovan sa 1 M Tris-HCl (pH 9,0) do pH 7,4. Koncentracije prečišćenih IgG1, IgG2 i IgG3 antitela su određene pomoću OD280, a čistoća svakog od njih procenjena je i redukcionom i neredukcionom SDS-PAGE analizom.
1.3 Ispitivanje imune reakcije
[0405] Imuni odgovor lama procenjen je ELISA-om, u kojoj su uzorci seruma i pročišćena IgG su testirani na vezivanje za imobilisane imunogene. Procenjeni serumi su uzeti pre imunizacije, nakon 5. imunizacije i pri terminalnom krvarenju. Antigen (tj., rekombinantni protein humanog antigena) je razblažen u puferu za oblaganje na 4 µg/ml. Mikrotitarska ploča je obložena razblaženim antigenom na 4°C preko noći. Ploča je zatim isprana 3 puta puferom za ispiranje nakon čega je usledilo blokiranje na sobnoj temperaturi 2 tokom sata. Ploča je zatim isprana 4 puta puferom za ispiranje. Serija razblaženih seruma ili IgG-a je dodata na ploču i inkubirana na sobnoj temperaturi 1,5 sat. Ploča je zatim isprana 4 puta puferom za pranje. HRP-konjugovano anti-lama IgG sekundarno antitelo je dodatno na ploču i inkubirano na sobnoj temperaturi 1 sat. Nakon ispiranja, TMB supstrat je dodat u svaki bunarčić i inkubiran 10 minuta pre zaustavljanja sa 1 M HCl. Da bi se kvantifikovalo vezivanje, izmerena je apsorbanca na 450 nm za svaki bunarčić pomoću MK3 spektrometra.
2. Konstrukcija biblioteke prikaza faga VHH
2.1 Ekstrakcija RNK
[0406] Ukupna RNK je ekstrahovana iz izolovanih limfocita (iz 1.1.1) pomoću reagensa TRIZOL<®>prema protokolu proizvođača. Količina i kvalitet ukupne RNK su procenjeni gel elektroforezom, a kvantifikovani merenjem apsorbance na OD260/280.
2.2 RT-PCR i VHH amplifikacija
[0407] Ukupna RNK je obrnuto transkribovana u cDNK sa oligo(dT)20prajmerom pomoću kompleta PRIMESCRIPT<™>1st Strand cDNA Synthesis Kit prema protokolu proizvođača. Šest prednjih i dva obrnuta specifična degenerisana prajmera su napravljena da pojačavaju VHH fragmente, koji su imali dva uvedena BglI restriktivna mesta. VHH fragmenti su bili pojačana prema GenScript-ovoj standardnoj operativnoj proceduri kao što je opisano u nastavku.
[0408] Varijabilni regioni imunoglobulina teških lanaca (tj., VHHS) amplifikovani su lančanom reakcijom polimeraze (PCR) u dva koraka. U prvom PCR-u, 100 ng cDNK uzorka pomešano je sa prajmerima CALL001 (SEQ ID NO: 374) i CALL002 (SEQ ID NO: 375). DNK proizvodi iz prve PCR reakcije analizirani su elektroforezom u agaroznom gelu. Nakon prečišćavanja gelom, DNK proizvodi prvog PCR au korišćeni u drugoj PCR. Drugi PCR je izveden sa prajmerima BACK-1 (SEQ ID NO: 376), BACK-2 (SEQ ID NO: 377) i PMCF (SEQ ID NO: 378). Amplifikovani drugi PCR proizvodi koji sadrže VHH PCR fragmente su prečišćeni gelom i digestovani enzimom, a zatim umetnuti u fagemidne plazmide. Rekombinantni plazmidi sa fragmentima gena VHH su elektrotransportovani u E coli ćelije kako bi se stvorio prikaz faga VHH imune biblioteke.
[0409] Postupak PCR reakcije ima početnu fazu denaturacije na 94°C tokom 7 minuta, nakon čega sledi 30 ciklusa od 94°C za 1 min, 55°C za 1 min, i 72°C za 1 min; i nakon toga je usledila faza finalnog proširenja na 72°C za 7 min.
2.3 Konstrukcija biblioteke faga
[0410] VHH PCR proizvodi dobijeni su amplifikacijom pomoću različitih parova prajmera. PCR proizvodi su zatim digestovani sa BglI i prečišćeni gelom. Fragmenti prečišćeni gelom umetnuti su u fagemidni vektor GenScript-a. Pilot biblioteka je konstruisana da optimizuje uslove vezivanja i transformacije.
Optimizovani uslovi vezivanja i transformacije korišćeni su za razvoj biblioteke fagemida. Mali deo transformisanih ćelija je razblažen i razvučen na 2 x YT ploče sa dodatkom 100 µg/ml ampicilina. Kolonije su prebrojane kako bi se izračunala veličina biblioteke. Ostatak transformisanih ćelija je razvučen na YT pločama sa dodatkom 100 ug/ml ampicilina i 2% glukoze. Travnjaci kolonija su ostrugani sa ploča. Mali alikvot ćelija je korišćen za izolaciju plazmida iz biblioteke. Ostatak je dopunjen glicerolom i čuvan na -80°C kao zaliha.
3. Pomeranje prikaza faga
3.1 Bio-pomeranje
[0411] Konstruisana VHH biblioteka faga je pomerena u osnovu na rekombinantni humani BCMA protein i CHO ćelije koje eksprimiraju humani BCMA (tj., CHO-BCMA ćelije, pripremljene u kompaniji od strane Legend Biotec) tim redom pomoću standardne procedure koju je razvio GenScript. Zaliha biblioteke je gajena do faze logovanja, a zatim je biblioteka spašena pomoćnim fagom M13KO7 i pojačana preko noći na 25°C u mešalici. Fag je tada istaložen sa PEG/NaCl, ponovno suspendovan u PBS i čuvan na -80°C. Za ispiranje čvrste faze, bunarčići mikroploče obložene su rekombinantnim humanim BCMA proteinom u PBS-u na 4°C preko noći. Za ispiranje tekuće faze, CHO-BCMA ćelije su blokirane puferom za blokiranje na sobnoj temperaturi 1 sat. Tokom faze oblaganja ili blokiranja, čestice faga su prethodno inkubirane sa puferom za blokiranje i Fc kontrolnim proteinom u bunarčićima mikroploče. Nakon predinkubacije, čestice faga dodate su u bunarčiće obložene BCMA proteinima odnosno rastvorom CHO-BCMA i inkubirane 1 sat. Nakon inkubacije, nevezani i nespecifično vezani fagovi su isprani ispiranjem bunarčića ili CHO-BCMA ćelija sa PBST-om šest puta uz dva dodatna ispiranja PBS-om. Vezane čestice faga su eluirane sa 100 mM trietilamina (TEA), a eluat je neutralizovan sa 1 M Tris-HCl (pH 7,4). Polovina eluata je zatim korišćena za infekciju eksponencijalno rastućih E coli TG1 ćelija (OD600= 0,4-0,6) za izlaznu titraciju.
3.2 ELISA faga
[0412] Izvedena je fagna ELISA za identifikaciju klonova specifičnih za ciljne antigene. Pojedinačni izlazni klonovi faga su gajeni u ploči sa 96 dubokih bunarčića i spašeni pomoćnim fagom M13KO7 preko noći. Kako bi se identifikovali klonovi koji se vezuju za proteine antigena, ELISA mikrotitarske ploče sa 96 bunarčića obložene su rekombinantnim humanim BCMA proteinom i Fc kontrolnim proteinom u puferu za oblaganje preko noći na 4°C, a ploče su zatim blokirane puferom za blokiranje. Nakon blokiranja, otprilike 50 µl po bunarčiću supernatanta faga iz ćelijske kulture preko noći dodato je pločama za 1,5-satnu inkubaciju na 4°C. Ploče su isprane četiri puta, a HRP-konjugovano anti-M13 monoklonalno antitelo je dodato pločama za 45-minutnu inkubaciju na 4°C. Ploče su opet isprane pet puta i rastvor supstrata je dodat u bunarčiće za razvijanje. Za svaki bunarčić izmerena je apsorpcija na 450 nm.
[0413] Kako bi se identifikovali klonovi koji vezuju CHO-BCMA ćelije, CHO-BCMA ćelije su blokirane puferom za blokiranje na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Nakon blokiranja, približno 20 µl po bunarčiću fagnog supernatanta iz ćelijske kulture preko noći dodato je rastvorima ćelija za 1-satnu inkubaciju na sobnoj temperaturi. Nakon što su ćelije isprane 4 puta, dodato je HRP-konjugovano anti-M13 monoklonalno antitelo za 30-minutnu inkubaciju na sobnoj temperaturi. Ćelije su isprane pet puta i zatim je dodat rastvor supstrata za razvijanje. Apsorpcija je izmerena na 450 nm. Nakon pranja, ELISA pozitivni klonovi faga su nasumično odabrani i DNK je pripremljena iz izlaznog faga pomoću opreme za ekstrakciju plazmida. Anti-BCMA VHHs u plazmidima su sekvencionisani.
Primer 2. Priprema primera jednovalentnih BCMA himernih antigenskih receptora
[0414] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira CAR glavni polipeptid koji se sastoji od N-kraja do C-kraja: CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, CD28 citoplazmatski domen, CD137 citoplazmatsk domen i CD3ζ citoplazmatski domen hemijski je sintetisana i kloniran u premodificikaciono lentivirusni vektor nizvodno i operativno povezan sa konstitutivnim hEF1α promoterom. Dobijeni glavni CAR vektor nazvan je "PLLV-hEF1α-8281373." Mesta za višestruko kloniranje (MCS) u vektoru omogućila su umetanje sekvence nukleinske kiseline koja sadrži Kozakovu sekvencu (SEQ ID NO: 379) operativno povezanu sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira CD8α signalni peptid spojen sa N-krajem VHH fragmenta u vektor PLLV-hEF1α-8281373, uzvodno i operativno povezan sa sekvencom okosnice CAR.
[0415] Da bi se konstruisao monospecifičan CAR koji ima jedan VHH domen koji koristi okosnicu PLLV-hEF1α-8281373, sekvencu nukleinske kiseline koja kodira VHH domen je operativno povezan sa 3' sekvencom nukleinske kiseline koja kodira CD8α signalni peptid. Fuziona sekvenca nukleinske kiseline je hemijski sintetisana i klonirana u okosnicu PLLV-hEF1α-8281373 CAR putem EcoRI (SEQ ID NO: 380: 5'-GAATTC-3') i SpeI (SEQ ID NO: 381: 5'-ACTAGT -3') restrikcionih mesta tehnikama molekularnog kloniranja poznatog u ovoj oblasti. U tabeli 4 navedeni su vektori koji su konstruisani za ekspresiju primernih monospecifičnih, jednovalentnih anti-BCMA CAR.
[0416] Radi lakšeg daljeg umetanja dodatnih sekvenci, kao što je nukleotid koji kodira drugi VHH, pri pravljenju monospecifičnog CAR konstrukta, restrikciona mesta uključujući HpaI (SEQ ID NO: 382: 5'-GTTAAC-3'), MluI (SEQ ID NO: 383: 5'-ACGCGT-3'), NsiI (SEQ ID NO: 384: 5'-ATGCAT-3') mesta su uključena između sekvence nukleinske kiseline signalnog peptida CD8α i VHH sekvence nukleinske kiseline.
[0417] Mešavina plazmida za pakovanje lentivirusa uključujući pCMV-ΔR-8.74 i pMD2.G (Addgene#12259) prethodno je pomešana sa vektorima PLLV-hEF1α-8281373 koji imaju VHH fragmente u unapred optimizovanom odnosu sa polieterimidom (PEI), zatim je pravilno pomešana i inkubirana na sobnoj temperaturi 5 minuta. Transfekciona mešavina se zatim u kapima dodaje u HEK293 ćelije i meša se lagano. Nakon toga, ćelije su inkubirane preko noći na 37°C i 5% CO2ćelijski inkubator. Supernatanti su sakupljeni nakon centrifugiranja na 4°C, 500 g tokom 10 minuta.
[0418] Supernatanti koji sadrže virus su filtrirani kroz 0,45 um PES filter, nakon čega je usledilo ultracentrifugiranje za koncentraciju lentivirusa. Nakon ultracentrifugiranja, supernatanti su pažljivo odbačeni, a virusne pelete se oprezno ispiraju prethodno ohlađenim DPBS-om. Virus je pravilno podeljen u alikvote, zatim se odmah čuva na -80°C. Titar virusa određen je p24 baziranog na HTRF kompleta koji razvija GenScript.
Priprema PBMC
[0419] Leukociti su prikupljeni od zdravih donora aferezom, a koncentracija ćelija je podešena na 5×10<6>ćelija/ml u podlozi R10. Leukociti su zatim pomešani sa 0,9% rastvorom NaCl u odnosu 1:1 (v/v).3 ml podloge lymphoprep je dodato u epruvetu za centrifugiranje od 15 ml, a 6 ml razblažene mešavine limfocita se polako nanosi na vrh lymphoprep podloge. Mešavina limfocita je centrifugirana na 800 g 30 minuta bez kočenja na 20°C. Limfocitni sloj istaloženih leukocita i trombocita je zatim sakupljen pipetom od 200 ul. Sakupljena frakcija razblažena je najmanje 6 puta sa 0,9% NaCl ili R10 kako bi se smanjila gustina rastvora. Sakupljena frakcija je zatim centrifugirana na 250 g 10 minuta na 20°C. Supernatant je potpuno usisan i 10 ml R10 je dodato ćelijskom peletu radi ponovne suspenzije ćelijskog peleta.
Mešavina se dalje centrifugira na 250 g 10 minuta na 20°C. Supernatant je ponovno usisan.2 ml R10 prethodno zagrejanog na 37°C sa 100 IU/ml IL-2 je dodato ćelijskom peletu, i ćelijski pelet je lagano ponovo suspendovan. Broj ćelija je određen nakon bojenja Trypan Blue, a ovaj PBMC uzorak je bio spreman za kasnije eksperimente.
Prečišćavanje T ćelija
[0420] Humane T ćelije su prečišćene iz PBMC-a pomoću kompleta za izolaciju T ćelija Miltenyi Pan (Cat#130-096-535), prema protokolu proizvođača kako je opisano u nastavku. Prvo je određen broj ćelija i ćelijska suspenzija je centrifugirana na 300 g 10 minuta. Supernatant je zatim potpuno usisan, a ćelijske pelete su ponovo suspendovane u 40 µl pufera na 10<7>ukupnih ćelija. Dodato je 10 µl Pan T Cell koktela biotin-antitela po 10<7>ukupnih ćelija, temeljno se promeša i inkubira oko 5 minuta u frižideru (2~8°C). Zatim je dodato 30 µl pufera na 10<7>ćelija. Dodato je 20 µl Pan T Cell MicroBead koktela na 10<7>ćelija. Mešavina ćelijske suspenzije je dobro promešana i inkubirana dodatnih 10 minuta u frižideru (2~8°C). Za magnetno razdvajanje potrebno je najmanje 500 µl. Za magnetno razdvajanje, LS kolona je postavljena u magnetno polje odgovarajućeg MACS separatora. Kolona je pripremljena ispiranjem sa 3 ml pufera. Suspenzija ćelija je zatim nanesena na kolonu, i sakupljen je protok koji sadrži neobeležene ćelije, koje su predstavljale obogaćene frakcije T ćelija. Dodatne T ćelije su sakupljene ispiranjem kolone sa 3 ml pufera i sakupljanjem neobeleženih ćelija koje prolaze. Ove neobeležene ćelije ponovno su predstavljale obogaćene T ćelije i kombinovane su sa protokom iz prethodne faze. Pulovane obogaćene T ćelije su zatim centrifugirane i ponovno suspendovane u R10+100 IU/ml IL-2.
[0421] Pripremljene T ćelije su naknadno prethodno aktivirane 48-96 sati sa kompletom za aktivaciju/ekspanziju humanih T ćelija (Miltenyi#130-091-441) u skladu sa protokolom proizvođača u kojem su anti-CD3/CD28 MACSiBead čestice dodate u odnosu kuglica-ćelija od 1:2.
In vitro ispitivanje citotoksičnosti
[0422] Prethodno aktivirane T ćelije su transdukovane sa zalihama lentivirusa u prisustvu 7 µg/ml polibrena sa centrifugiranjem na 1200 g, 32°C tokom 1.5 h. Transdukovane ćelije su zatim prenesene u inkubator za ćelijsku kulturu za transgeno eksprimiranje u pogodnim uslovima.
[0423] Trećeg ili sedmog dana nakon transdukcije, transdukovane T ćelija su sakupljene i zajednički inkubirane sa tumorskim ćelijama na efektoru (CAR-T) do odnosa ciljnih ćelija od 20:1 tokom 20 sati. Ciljne ćelije su bile humana ćelijska linija multiplog mijeloma RPMI8226.Luc, humana ćelijska linija K562.BCMA.Luc ćelije koje su rekombinantno eksprimirale BCMA, K562.CD19. Luc ćelijska linija koja je rekombinantno eksprimirala CD19, ili humana ćelijska linija glioblastoma U87MG.Luc ćelije. Sve su ćelijske linije projektovane u kući za ekspresiju luciferaze svitaca. Za ispitivanje citotoksičnosti CAR-T na tumorske ćelije, ONE-GLO<™>reagensi za analizu luminescentne luciferaze (Promega#E6110) pripremljeni su prema protokolu proizvođača i dodati zajednički kultivisanim ćelijama kako bi se otkrila preostala aktivnost luciferaze u bunarčiću. Budući da se luciferaza eksprimira samo u ciljnim ćelijama, preostala aktivnost luciferaze u bunarčiću je direktno u korelaciji sa brojem održivih ciljnih ćelija u bunarčiću.
Maksimalna aktivnost luciferaze dobijena je dodavanjem podloge kulture ciljnim ćelijama u odsutnosti efektorskih ćelija. Minimalna aktivnost luciferaze određena je dodavanjem Tritona X-100 u konačnoj koncentraciji od 1% u vreme kada su započeta ispitivanja citotoksičnosti. Specifična citotoksičnost izračunata je po formuli: specifična citotoksičnost%= 100% * (1-(RLUzorak-RLUmin)/(RLUmax-RLUmin)).
[0424] Odabrani su i ispitani primeri jednovalentnog CAR koji cilja BCMA (CD269) u ispitivanju citotoksičnosti. Kao što je prikazano na FIG.1A, među prvom grupom ispitanih jednovalentnih BCMA CAR, odabrani klonovi pokazali su različite nivoe citotoksičnosti protiv ćelijske linije multiplog mijeloma RPMI8226. Luc ćelija, sa više od 60% jednovalentnog VHCAR-T na bazi H koji pokazuju >50% citotoksičnosti protiv ćelija RPMI8226.Luc. Klonovi 269A37346, 269A37348, 269A37353 i 269A37355 bazirani na CAR-T odabrani su za dalje ispitivanje. Konkretno, klonovi 269A37346, 269A37348, 267A37353 i 269A37355 bazirani na CAR-T pokazali su snažnu citotoksičnost protiv ćelijske linije multiplog mijeloma RPMI8226.Luc ćelije sa više od 20%-30% povećanja ubijanja ćelija RPMI8226.
Ubijanje Luc ćelija terapijom CAR-T u upoređenju sa netransdukovanim kontrolnim T ćelijama (UnT). Usprkos tome, takvo povećanje citotoksičnosti nije se dogodilo protiv Luc ćelija humane ćelijske linije glioblastoma U87MG (videti FIG.1B). Ove jednovalentne CAR-T ćelije bazirane na VHH nisu detektovale značajna citotoksična dejstva u odnosu na U87MG Luc ćelije u poređenju sa UnT kontroloma. Gore navedeno opažanje pokazalo je da bi neki od ovih klonova mogli biti ciljano specifični i potentni protiv BCMA pozitivnih ćelija.
[0425] Procenjena je druga grupa primernih jednovalentnih BCMA CAR zbog in vitro citotoksičnosti. GSS005, CAR koji obuhvata anti-BMCA scFv, služio je kao pozitivna kontrola. GSI026, CAR koji obuhvata anti-EGFRvIII scFv, služio je kao negativna kontrola. Kao što je prikazano na FIG.2A-2B, odabrani klonovi pokazali su različite nivoe citotoksičnosti protiv ćelija multiplog mijeloma RPMI8226.Luc, i BCMA sa prekomernim eksprimiranjem stabilne ćelijske linije K562.BCMA.Luc. Nijedan klon nije pokazao jaku citotoksičnost protiv BCMA negativne ćelijske linije K562.CD19.Luc (FIG.2C). Među tim klonovima, 269B005S, 269B028S, 269B030S, 269B054S, 269B060S, 269B069S, 269B093S, 269B094S, 269B104S, 269B109S, 269B110S i 269B1 CAR-T na bazi 29S su bili najjači prema podacima o citotoksičnosti.
IFNgama oslobađanje
[0426] Pored toga, supernatanti iz in vitro ispitivanja zajedničkih kultura su sakupljeni kako bi se ocenilo oslobađanje citokina indukovanih CAR-om, npr., oslobađanje interferona gama (tj., IFNγ). Kao što je prikazano na FIG.3, T ćelije koje eksprimiraju odabrane jednovalentne BCMA CAR su oslobađale visoke nivoe IFNγ nakon zajedničkog kultivisanja sa BCMA-eksprimirajućim ciljnim T ćelijama K562.BCMA.Luc. Nespecifični CAR-T, kao što su GSI026, ili netransdukovane T ćelije (UnT) nisu indukovali oslobađanje IFNγ u zajedničkoj kulturi. Podaci o oslobađanju citokina su konzistentni sa podacima o in
vitro citotoksičnosti.
Primer 3. Priprema primernih viševalentnih BCMA himernih antigenskih receptora
[0427] Viševalentni VHCAR bazirani na H mogu da se konstruišu kloniranjem sekvence nukleinske kiseline koja kodira višestruke kopije VHH, ili više različitih VHH su spojeni jedan sa drugim peptidnim linkerima u glavni vektor CAR signalne domena. Primeri viševalentnih BCMA CAR konstrukata prikazani su u tabeli 5. Ovi konstrukti su pripremljeni spajanjem 2-3 anti-BCMA VHHs glicin-serinskim peptidnim linkerima nakon čega sledi direktno sintetisanje ove fuzione sekvence u kombinaciji sa Kozak-CD8α signalnom peptidnom sekvencom nukleinske kiseline i kloniranjem u okosnicu PLLV-hEF1α-81373 CAR preko EcoRI i SpeI restrikcionih mesta. Jednovalentni BCMA CAR konstrukti takođe su klonirani u istu okosnicu PLLV-hEF1α-81373 CAR da bi služili kao kontrole (npr., GSI5011, GSI5019 i GSI5020, tabela 4).
[0428] Lentivirusni vektori koji nose CAR gene su upakovani i titrirani su sa protokolima kako je opisano u primeru 2. Koristeći protokole opisane u primeru 2, humani PBMC su pripremljeni iz periferne krvi dobrovoljaca za dalju izolaciju primarnih humanih T ćelija upotrebom Miltenyi kompleta za izolaciju humanih PanT ćelija. Prečišćene T ćelije su prethodno aktivirane i proširene upotrebom Miltenyi anti-CD3/CD28 mikro kuglica kao što je opisano u primeru 2. Prethodno aktivirane T ćelije su zatim transdukovane sa zalihama lentivirusa u prisustvu 7 µg/ml polibrena centrifugiranjem na 1200 g, 32°C 1,5 h. Transdukovane ćelije su zatim prebačene u inkubator ćelijske kulture za ekspresiju transgena pod odgovarajućim uslovima.
Ispitivanje In vitro citotoksičnosti
[0429] Trećeg dana nakon transdukcije, transdukovane T ćelije su sakupljene i zajednički inkubirane sa tumorskim ćelijama. Za ispitivanje citotoksičnosti CAR-T na tumorske ćelije, ONE-GLO<™>reagensi za analizu luminescentne luciferaze dodati su zajednički kultivisanim ćelijama i specifična citotoksičnost za svaki CAR-T je izmerena kao što je opisano u primeru 2.
[0430] U prvom eksperimentu, jednovalenti BCMA CAR (GSI5011), dvovalentni BCMA CAR (GSI5014), i trovalentni BCMA CAR (GSI5015) koji eksprimiraju T ćelije su zajedno kultivisani sa RPMI8226.Luc ćelijama na efektoru koje ciljaju odnos od 20:1 tokom 20 sati. Sva tri CAR konstrukta obuhvataju anti-BCMA VHH domene klona 269A37346. Kao što je prikazano na FIG.4A, specifična procentualna liza od RPMI8226.Luc ćelija je iznosila 63.25±2.64% od strane GSI5011-eksprimirajućih CAR-T ćelija, 61.04±2.75% od strane GSI5014-eksprimirajućih CAR-T ćelija, i 59.57±2.64% od strane GSI5015-eksprimirajućih CAR-T ćelija, u poređenju sa 0.05%±2.33% netransdukovanim kontrolnim T ćelijama (UnT). Ispitani BCMA CAR sa različitim antigenskim vezujućim modalitetima su imali potentnu antitumorsku aktivnost protiv BCMA pozitivnih ćelija.
[0431] U drugom eksperimentu, ispitivani su primeri dvovalentnih BCMA CAR (GSI5021-GSI5026) koji imaju dve različite BCMA vezujuće grupe 269A37353 i 269A37917. Projektovane T-ćelije koje eksprimiraju svaki dvovalentni BCMA CAR su kultivisane sa ćelijama RPMI8226.Luc ćelije na efektoru da bi se ciljao odnos od 20:1 tokom 20 sati. Jednovalentni BCMA CAR, GSI5019 i GSI5020 takođe su ispitani zbog poređenja. Kao što je prikazano na FIG.4B, specifični procenat lize ćelija RPMI8226.Luc ćelija je bio 88,21±1,29% za CAR-T ćelije sa ekspresijom GSI5019, 93,84±1,13% za CAR-T ćelije sa ekspresijom GSI5020, 71,45±1,79% za CAR-T sa ekspresijom GSI5021 ćelije, 99,80±0,45% GSI5022-eksprimirane CAR-T ćelije, 97,46±0,50% GSI5023-eksprimirane CAR-T ćelije, 81,29±1,27% GSI5024-eksprimirane CAR-T ćelije, 93,50±0,47% GSI5025-eksprimirane CAR -T ćelije, 87,83±0,23% od CAR-T ćelija koje eksprimiraju GSI5026, u poređenju sa 13,49%±1,75% od netransdukovanih kontrolnih T ćelija (UnT). Takođe, kao što je prikazano na FIG.4C, specifični procenat lize BCMA-negativne ćelijske linije U87MG.Luc bio je 2,84±7,41% za CAR-T ćelije sa ekspresijom GSI5019, 15,50±2,24% za CAR-T ćelije sa ekspresijom GSI5020, 6,74±3,37% za GSI5021- ekspresijom CAR-T ćelija, 8,03±2,36% ćelijama CAR-T ekspresijom GSI5022, 9,00±1,88% ćelijama CAR-T ekspresijom GSI5023, 17,03±2,27% ćelijama CAR-T ekspresijom GSI5024, 16,81±1,98% ćelijama CAR-T ćelije koje eksprimiraju GSI5025, -11,55±5,43% CAR-T ćelije koje eksprimiraju GSI5026, u poređenju sa 12,49%±3,79% netransdukovanih kontrolnih T ćelija (UnT). Podaci ukazuju da su dvovalentni CAR sa različitim modalitetima vezivanja antigena imali snažnu antitumorsku aktivnost protiv BCMA pozitivnih ćelija, ali ne i protiv BCMA negativnih ćelija.
[0432] U trećem eksperimentu, primerni dvovalentni BCMA CAR (tj., BCAR001-BCAR008) sa dve različite vezujuće grupe BCMA su konstruisani, a inženjerski napravljene CAR-T ćelije koje eksprimiraju dvovalentne BCMA CAR su pripremljene iz primarnih T ćelija dobijenih od R/R MM pacijenta donora #13. Interno razvijene ćelijske linije koje eksprimiraju luciferazu svica, uključujući RPMI8226 (ćelijska linija ljudskog multiplog mijeloma), A549 (ćelijska linija ljudskog raka pluća), U87-MG (ćelijska linija ljudskog glioblastoma) i Raji (ćelijska linija ljudskog Burkittovog limfoma) korišćene su kao meta ćelije i zajedno su kultivisane sa svakom grupom transdukovanih T ćelija jedna pored druge (sa efektorom: ciljni ćelijski odnos 20:1 ili 5:1) 20 sati u 37°C/5% CO2ćelijskom inkubatoru. Po završetku zajedničkog kultivisanja, preostale aktivnosti luciferaze (relativna svetlosna jedinica, RLU) ispitane su sa kompletom ONE-GLO<™>za ispitivanje luminiscentne luciferaze (Promega) za procenu citotoksičnosti svakog CAR-T. Kao što je prikazano na FIG. 5A-5E, dvovalentni BCMA CAR-T imali su citotoksičnost zavisnu od doze protiv RPMI8226.Luc, K562.BCMA.Luc i Raji.Luc ćelija, ali malu citotoksičnost protiv BCMA negativnih A549.Luc i U87-MG.Luc ćelija. Podaci na FIG.5F pokazuju da je citotoksičnost dvovalentnih BCMA CAR-T ćelija protiv tumorskih ćelija specifična za BCMA budući da CAR-T ćelije nisu bile citotoksične za K562.C38.Luc ćelije koje su bile CD38<+>/BCMA-. K562.BCMA.Luc tretirane sa BCAR001-BCAR008 CAR-T ćelijama pokazale su samo ograničenu zaostalu aktivnost luciferaze (tj., vijabilne ćelije) u poređenju sa ciljnim ćelijama tretiranim UnT (2,88±0,45%, 12,84±1,67%, 2,22±0,56%, 1,77±0,14%, 2,59±0,28%, 6,58±1,19%, 2,47±0,20%, 6,61± 1,47% za BCAR001-BCAR008, u poređenju sa UnT od 100 ± 3,95%, srednja vrednost ± standardna greška). Ovi rezultati pokazuju jaku citotoksičnost dvovalentnih BCMA CAR-T ćelija protiv K562.BCMA.Luc ćelija. BCAR001-BCAR008 CAR-T ćelije nisu imale značajnu citotoksičnost protiv K562.CD38.Luc ćelija budući da nije otkriveno značajno smanjenje aktivnosti luciferaze u poređenju sa ciljnim ćelijama tretiranim UnT (111,82±5,11%, 111,72±3,43%, 104,74±0,24 %, 95,04±2,70%, 93,93±7,23%, 97,72±1,86%, 111,90±2,01%, 108,33±4,05%, za BCAR001-BCAR008 redom, u poređenju sa UnT od 100 ±6,58%, srednja vrednost ± standardna greška). Ovi podaci ukazuju da citotoksičnost dvovalentnog BCMA CAR-T zavisi od BCMA.
IFNgama oslobađanje
[0433] Dodatno, supernatanti iz in vitro ispitivanja zajedničkih kultura su prikupljeni kako bi se procenilo oslobađanje citokina indukovano CAR-om (npr., interferona gama, oslobađanje IFNγ). Kao što je prikazano na FIG.6A-6B, oslobađanje IFNγ u ispitivanjima zajedničkih kultura je bilo zavisno od CAR i specifično za BCMA, što je u skladu sa in vitro podacima o citotoksičnosti (tabela 6).
TABELA 6. IFN gama oslobađanje u ispitivanjima zajedničkih kultura dvovalentnim BCMA CAR-T
Brojevi kopija integrisanih CAR gena
[0434] Broj kopija integrisanih CAR gena za svaku transdukovanu grupu T ćelija je određen polukvantitativnim PCR (q-PCR) testom. Ukratko, genomska DNK iz svake grupe CAR-T pripremljena je sa kompletom Gentra Puregene Cell Kit (Qiagen). Koncentracija genomske DNK određena je Nanodrop-om, a uzorak genomske DNK od 10 ng obrađen je za standardizovani q-PCR test sa SYBR Green Realtime PCR Master mix plus (Toyobo) na ABI#7300 q-PCR instrument pomoću CAR specifičnih prajmera (prednji prajmer 137P2F, SEQ ID NO: 398: 5'-GTCCTTCTCCTGTCACTGGTTAT-3'; i obrnuti prajmer 137P2R, SEQ ID NO: 399: 5'-TCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCA-3'). Relativni broj kopija svakog integrisanog CAR gena izračunat je na osnovu standardne krive utvrđene pomoću ciljnih sekvenci koje sadrže plazmid.
TABELA 7. Brojevi kopija genomske integracije.
Primer 4. Mapiranje epitopa i vezivanje diferencijalnih epitopa dva VHH domena u LCAR-B38M [0436] Epitopi četiri anti-BCMA VHH domena su mapirani. Konstruisan je primerni dvovalentni BCMA CAR sa dva različita anti-BCMA VHdomena koja se specifično vezuju za različite epitope BCMA.
Dvovalentni/biepitopski CAR koji sadrži VHH1 i VHH2, nazvan LCAR-B38M CAR, predstavlja jedan viševalentni BCMA CAR naveden u tabeli 5.
Ispitivanje rezonance površinskog plazmona (SPR)
[0437] Svaka od četiri primerne anti-BCMA VHH sekvence je klonirana u vektor koji sadrži humanu sekvencu IgG1 Fc fragmenta (hIgG1Fc) kako bi se olakšala rekombinantna ekspresija BCMA VHH-hIgG1Fc. Rekombinantni proteini su dobijeni i prečišćeni zbog SPR ispitivanja.
[0438] Afinitet svakog VHH-hIgG1Fc za BCMA određen je SPR-om pomoću BIACORE-a<®>2000 analitičkog sistema (GE Healthcare). Ukratko, svaki VHProtein H-hIgG1Fc je kovalentno vezan za CM5(s) senzorski čip pomoću 4 µg/ml VHH-hIgGlFc. Rekombinantni BCMA-His protein (ACRO Biosystems, Cat#BCA-H522y) serijski je razblažen u tečnom puferu (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% Tween-20, pH 7,4) i ubrizgan pri protoku od 10 µl/min nakon čega je usledila disocijacija. Konstante brzine asocijacije i disocijacije određene su pomoću BIACORE-a<®>2000 verzija softvera za procenu 3.0 (Langmuir vezivanje, lokalno uklapanje, model vezivanja 1:1). Vezujući afiniteti četiri VHH-hIgG1Fcs su prikazani u tabeli 8.
TABELA 8. Vezujući afiniteti VHH-hIgG1Fcs za humani BCMA-His protein.
Vezivanje rekombinantnih VHH-His proteina za ciljne ćelije
[0439] Rekombinantni anti-BCMA VHH-His proteini konstruisani su spajanjem anti-BCMA VHH sekvence sa sekvencom signalnog peptida humanog albumina (N'-MKWVTFISLLFLFSSAYS-C'; SEQ ID NO: 386) na N kraju, i 6xHis-oznaku (N'-GSGHHHHHH-C'; SEQ ID NO: 387) na kraj C. Kodoni su dalje optimizovani za optimalnu ekspresiju u ćelijama domaćina sisara. Dobijene nukleotidne sekvence su zatim klonirane u ekspresioni vektor sisara pTT5 preko 5'-XbaI i 3'-HindIII restrikcionih mesta kako bi se dobili plazmidi, pTT5-LAB001 (za VHH1), pTT5-LAB002 (za VHH2) i pTT5-LAB003 (za VHH1xVHH2).
[0440] Kako bi se dobili rekombinantni BCMA VHH proteini, HEK293T ćelije su prolazno transfektovane sa plazmidima. Ukratko, 5×10<6>HEK293T ćelija su posađene u sudove za kulturu ćelija od 10 cm jedan dan pre transfekcije. Sledećeg dana, ćelije su transfektovane sa svakim plazmidom pomoću reagensa LIPOFECTAMINA<™>2000 (Thermofisher Scientific, kat. br.: 11668-019) prema uputstvima proizvođača. Četiri dana nakon transfekcije, supernatant je sakupljen i nivoi ekspresije antitela su detektovani ELISA-om pomoću HRP anti-His Taga (Biolegend, Kat. br.: 652504). Nivoi ekspresije LAB001, LAB002 i LAB003 bili su 109,31 ng/ml, 152,48 ng/ml odnosno 396,62 ng/ml.
[0441] Afiniteti vezivanja LAB001, LAB002 i LAB003 anti-BCMA VHH-H protein su određeni ispitivanjima baziranim na ćelijama. Ukratko, serijski razblaženi anti-BCMA VHH-His proteini su inkubirani sa 1×10<5>ciljnim ćelijama (bilo K562.BCMA.Luc ili K562.CD38.Luc ćelije, koje su interno razvijene ćelijske linije koje stabilno eksprimiraju BCMA ili CD39) na 4°C tokom 2 sata. Nakon toga, ćelije su centrifugirane na 300 g tokom 10 minuta, i supernatant je odbačen. Ćelijski peleti su ponovo suspendovani sa DPBS. Ćelijski peleti su isprani, centrifugirani, a supernatant je odbačen još 2 puta. Zatim su peleti ćelija naknadno ponovo suspendovani sa antitelima za detekciju (THE<™>njegova oznaka za antitelo [FITC], GenScript Cat: A01620) koji sadrži pufere 45 minuta na 4 °C tokom 2 sata. Nakon toga, ćelije su centrifugirane na 300 g tokom 10 minuta, a supernatant je odbačen. Ćelijski peleti su isprani, centrifugirani, a supernatant je odbačen još 2 puta. Afiniteti vezivanja LAB001, LAB002 i LAB003 za ćelije K562.BCMA.Luc ili K562.CD38.Luc su određeni pomoću ATTUNE<™>Nxt protočnog citometra. Podaci su uklopljeni pomoću GraphPad PRISM<™>verzija 6.0 upotrebom "One site - Specific binding with Hill slope".
[0442] Kao što je prikazano na FIG.7A-7C, LAB001, LAB002 i LAB003 specifično se vezuju za K562.BCMA.Luc ćelije u zavisnosti od doze. Afiniteti vezivanja su 0,079 nM, 0,035 nM i 0,0047 nM redom. Niti jedno od antitela nije pokazalo značajno vezivanje na BCMA negativnu ćelijsku liniju K562.CD38.Luc. Štaviše, LAB003 (VHH1xVHH2) je pokazao značajno veći afinitet vezivanja (0,0047 nM) nego bilo koji LAB001 (VHH1) ili LAB002 (VHH2).
Vezivanje epitopa
[0443] BCMA (NP_001183, UniProt#Q02223) je transmembranski protein od 184 aminokiseline. Ljudski BCMA se sastoji od ekstracelularnog domena (ECD, broj amino ostataka 1-54), transmembranskog domena (TM, broj amino ostataka 55-77) i citoplazmatskog domena (CD, broj amino ostataka 78-184). Osim toga, analiza sekvenci ukazuje da BCMA nema prepoznatljiv signalni peptid na svom N kraju (Laabi Y et al. (1992) EMBO J 11:3897-3904; Laabi Yet al. (1994) Nucleic Acids Res 22:1147-1154; Gras M P (1995) Int Immunol 7:1093-1106; Hong-Bing Shu and Holly Johnson (2000.): Proc. Natl. Akad. Sci. SAD, 10.1073).
[0444] Kao što je takođe prikazano u online bazi podataka UniProt (svetska web.uniprot.org/uniprot/Q02223), 3 disulfidne veze (Cys-Cys) se nalaze u ECD BCMA, koje su na položajima 8 ↔ 21, 24 ↔ 37 i 28 ↔ 41 (tabela 9). Sekundarna struktura BCMA ECD od N-kraja do C-kraja se sastoji od beta grane (aa12-15), zaokreta (aa16-19), beta grane (aa20-23), heliksa (aa 24 -27), beta grane (aa30-32), heliksa (aa35 - 37), zaokreta (aa38-40) i zaokreta (aa42-44). Struktura BCMA ECD prikazana je na SL.8A, koja je replicirana iz strukture iz PDB baze podataka širom sveta web.ebi.ac.uk/pdbe/entry/pdb/2kn1 /.
TABELA 9. Proteinske sekvence humanog BCMA.
[0445] Peptidi BCMA epitopa (269EP001-269EP007) su napravljeni kao što je prikazano na FIG.8B i TABELI 10, te hemijski sintetisan i biotinilisan na N-kraju. Afinitet vezivanja VHH1-hIgG1Fc ili VHH2-hIgG1Fc određeni su pomoću ELISA. Ukratko, gore opisani peptidi su obloženi na MAXISORP<™>ELISA ploča na 1 uM preko noći na 4°C. Sledeći dan, ploče su isprane sa PBST (dodato 0,5% TWEEN-20) dva puta, nakon čega je usledilo blokiranje ploče sa 0,5% BSA na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Ploče su zatim isprane sa PBST dva puta, nakon čega je usledio dodatak serijski razblaženog VHH1-hIgG1Fc ili VHH2-hIgG1Fc na 10 nM u triplikatu, zatim je inkubiran na 4 °C tokom 2 sata. Ploče su zatim isprane 3 puta hladnim PBST, nakon čega je kozji anti-Llama-HRP (1:1500, Bethyl Lab# A160) dodat u svaki bunarčić i dalje inkubiran na sobnoj temperaturi 1 sat. Ploče su zatim isprane 4 puta sa PBST, a TMB supstrati su dodati u svaki bunarčić i inkubirani na sobnoj temperaturi 10-30 minuta. Ploče su zatim očitane na TECAN<®>IM čitaču mikroploče sa apsorbancom na 450 nm.
TABELA 10. Peptidne sekvence BCMA epitop.
[0446] Kao što je prikazano na FIG.9A, VHH1 je pokazivao najjače vezivanje za 269EP005 peptid praćen 269EP004 peptidom. Ipak, vezivanje VHH1 za 269EP003 i 269EP006 je bilo relativno slabo u poređenju sa 269EP005 i 269EP004. VHH1 ima tendenciju da vezuje epitop koji se nalazi u 269EP005 peptidu (tj., aminokiselina 24-36 BCMA ECD), koji sadrži sekundarne strukture heliksa (aa24-27), beta granu (aa30-32), i heliks (aa35 - 37).
[0447] Kao što je prikazano na FIG.9B, VHH2 je pokazivao najjače vezivanje za 269EP002 peptid praćen 269EP003 peptidom. Ipak, vezivanje VHH1 za 269EP001 i 269EP004 je bilo relativno slabo u poređenju sa 269EP002 i 269EP003. Dok se prva beta grana (aa12-15) i beta grana (aa20-23) BCMA ECD uglavnom nalaze u sekvenci koji pokrivaju 269EP002 (aa8-21) i 269EP003 (aa11-23), VHH2 ima tendenciju da se vezuje za epitop koji se nalazi u prve dve beta grane.
Ispitivanje kompetetivnog vezivanja
[0448] Diferencijalno vezivanje epitopa VHH1 i VHH2 je dalje validirano ispitivanjem kompetetivnog vezivanja baziranog na ćelijama. Stabilna CHO ćelijska linija koja prekomerno eksprimira humani BCMA ("CHO-BCMA") je korišćena u ispitivanju.
[0449] Ukratko, 0,5×10<6>CHO-BCMA ćelije prethodno su inkubirane sa 12,5 ng/ml LAB001 (koji sadrži oznaku 6xHis na C kraju) na 4 °C tokom 0,5 h u duplikatima. Zatim serijski razblažen VHH2-hIgG1Fc rekombinantno antitelo je dodato u svaki bunračić ploče i dalje je inkubirano na 4 °C još 1 sat. Nakon inkubacije, ćelije su isprane sa 500 ul DPBS i centrifugirane na 300 g tokom 10 minuta. Ćelijske pelete su ponovno suspendovane sa DPBS-om koji sadrži anti-His tag-FITC (1:200, GenScript Cat: A16020), zatim su ćelije isprane sa 500 ul DPBS-a i centrifugirane na 300 g tokom 10 minuta. Ćelijske pelete su ponovno suspendovane sa DPBS-om, a zatim su podvrgnute FACS analizi na ATTUNE<™>Nxt protočnom citometru. Kao kontrola ispitivanja, serijski razblaženi VHH2-hIgGlFc se direktno inkubira sa CHO-BCMA ćelijama bez prisustva LAB001 prateći identične postupke kao prethodno jedan pored drugog. Kozja anti-humana IgG (Fc specifična)-FITC antitela (Sigma Aldrich Cat:F9512) korišćena su za otkrivanje vezivanja VHH2-hIgG1Fc za CHO-BCMA ćelije. Kao što je prikazano na FIG.10, VHH2-hIgG1Fc se sam vezuje za CHO-BCMA u zavisnosti od doze. Međutim, VHH2-hIgG1Fc nije bio u mogućnosti da se ulazi u kompeticiju sa VHH1-His vezivanje za CHO-BCMA ćelije, što ukazuje na različita mesta vezivanja VHH1 i VHH2 za BCMA.
Primer 5. In vivo efikasnost LCAR-B38M CAR-T kod mišjeg ksenografta tumora
[0450] In vivo antitumorska efikasnost LCAR-B38M CAR-T ćelija je procenjena u NCG mišjem modelu (NOD-Prkdc<em26Cd52>Il2rg<em26Cd22>/NjuCrl) sa ksenograftom tumora multiplog mijeloma. LCAR-B38M CAR predstavlja dvovalentan BCMA CAR sa dva anti-BCMA VHH domena koji ciljaju različiti BCMA epitope.
[0451] NCG mišji model je napravljen sekvencijalnim CRISPR/Cas9 uređivanjem Prkdc i Il2rg lokusa u NOD/Nju mišu, čime se obezbeđuju koizogeni za NOD/Nju. NOD/Nju miš nosi mutaciju u Sirpa (SIRP α) genu koji omogućava kalemljenje stranih matičnih ćelija sa hematopoezom. Prkdc nokaut stvara fenotip poput SCID kojima nedostaju obrazovanje T-ćelija i B-ćelija. Nokaut Il2rg gena dalje pogoršava fenotip poput SCID dok pored toga dolazi do smanjenja proizvodnje NK ćelija. Samim tim, NCG miš je "trostrukoimunodeficijentni" soj miša koji je više imunološki kompromitovan od sojeva imunološki kompromitovanih miševa koji se uobičajeno koriste uključujući SCID i gole miševe.
[0452] Prkdc i Il2rg predstavljaju deo SCID (teške kombinovane imunodeficijencije) porodice gena koji utiču na sazrevanje i obrazovanje T ćelija, B ćelija, NK ćelija i, u manjoj meri, dendritičnih
ćelija. Prkdc kodira katalitičku podjedinicu enzima protein kinaze zavisne od DNK, koja je potrebna za V(D)J rekombinaciju, proces neophodan za širenje raznolikosti antitela u sazrevajućim T i B ćelijama. Il2rg kodira zajedničku gama podjedinicu koja se nalazi u IL-2 i višestrukim IL receptorima (IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 i IL-21), koji su potrebni za indukovanje signalizacije posredovane citokinima za sazrevanje nezrelih limfocita (npr., T, B i NK ćelije) i drugih leukocita.
[0453] LCAR-B38M CAR-T ćelije su pripremljene upotrebom T ćelija različitih donora za pretraživanje izvora T ćelija čime se obezbeđuje CAR-T sa najvećom efikasnošću ubijanja RPMI8226. Luc ćelije in vitro (FIG.11). Na osnovu rezultata FIG.11, LCAR-B38M CAR-T ćelije su pripremljene korišćenjem T ćelija odabranog donora za in vivo ispitivanja na životinjama. FIG.12A prikazuje u zavisnosti od doze in vitro citotoksičnost ove serije LCAR-B38M CAR-T ćelija. Kako bi se stvorio ksenograft tumora, NCG miševima intravenski su ubrizgane RPMI8226.Luc ćelije.14 dana kasnije, miševi sa presađenim tumorom tretirani su LCAR-B38M CAR-T ćelijama ili netransdukovanim T ćelijama, nakon čega je usledilo in vivo bioluminiscentno slikanje (BLI).
[0454] Kao što je prikazano na FIG.12B-12C, LCAR-B38M CAR-T ćelije su bile efikasne u eradikaciji nakalemljenih RPMI8226.Luc tumorskih ćelija kod NCG miševa i spašavanju miševa, dok je većina miševa u kontrolnoj (UnT) grupi uginula tokom 4 nedelje. Zanimljivo je da su tokom autopsije uočeni brojni metastatski tumori u jetri svih miševa u UnT grupi. Ovo zapažanje dodatno je potvrđeno procenom ex vivo aktivnosti luciferaze iz uzoraka tumora (FIG.12D-12E). Nasuprot tome, miševi tretirani LCAR-B38M CAR-T nisu imali metastatske tumore u jetri. Ukratko, in vivo ispitivanje pokazuje potentnost LCAR-B38M CAR-T ćelija u eradikaciji ćelija multiplog mijeloma (npr., RPMI8226.Luc) iz NCG miševa.
Primer 6. Ispitivanje bezbednosti LCAR-B38M CAR-T lečenja na nehumanim primatima
[0455] In vivo sigurnost LCAR-B38M CAR-T ćelija procenjena je na modelu makaki majmuna. PBMC je dobijen iz uzoraka periferne krvi dva majmuna (NHP#120117 i NHP#120545, oba mužjaka, oko 4 kg), i pripremljen centrifugiranjem u gradijentu gustine. T ćelije makaki majmuna izolovane su iz PBMC korišćenjem kompleta za izolaciju Pan T ćelija nehumanih primata (Miltenyi#130-091-993) u skladu sa priručnikom proizvođača. Pripremljene T-ćelije majmuna prethodno su aktivirane kompletom za aktivaciju/proširivanje T-ćelija primata (Miltenyi#130-092-919), humanim IL-2 i autolognim serumom majmuna tokom 3 dana. Nakon toga, prethodno aktivirane T ćelije su transdukovane sa LCAR-B38M lentivirusom, nakon čega je usledilo proširivanje dodatnih 10 dana.
[0456] 3 dana pre infuzije autolognih CAR-T ćelija, majmuni su prethodno lečeni ciklofosfamidom u dozi od 22 mg/kg telesne mase intravenskom infuzijom. Na dan autologne infuzije, ćelije su odmrznute u vodenom kupatilu na 37°C laganim vrtloženjem i odmah date životinjama intravenski tokom 5 minuta. Majmun NHP#120117 je dobio infuziju 5×10<6>/kg CAR-T ćelija, a majmun NHP#120545 je dobio infuziju 4×10<7>/kg CAR-T ćelija.
[0457] Majmuni su nakon primene T-ćelija praćeni zbog temperature, respiratornog distresa, promene u apetitu, dijareje i gubitka težine. Uzeti su uzorci krvi pre i nakon primene i ispitani su na CBC, hemiju seruma i nivoe citokina. Kao što je prikazano na FIG.13A-13F, CAR-T ćelije nisu imale značajnu toksičnost kod majmuna.
Primer 7. Kliničko ispitivanje LCAR-B38M CAR-T kod humanih pacijenata sa refraktornim /relapsnim multiplim mijelomom
[0458] Izvedeno je jednokrako, otvoreno multicentrično, kliničko ispitivanje faze 1/2 , kako bi se utvrdila sigurnost i efikasnost LCAR-B38M CAR-T ćelija u lečenju pacijenata sa dijagnozom refraktornog ili relapsnog multiplog mijeloma ("r/ r MM"). Informacije o kliničkom ispitivanju mogu da se pronađu na svetskoj web.clinicaltrials.gov, sa identifikatorom NCT03090659.
[0459] U ispitivanju su pacijenti sa refraktornim/relapsnim multiplim mijelomom lečeni LCAR-B38M CAR-T ćelijama izvedenim iz autolognih T ćelija pacijenata. Ukupna doza 0,5×10<6>- 5×10<6>ćelija/kg telesne mase primenjena je kod svakog pacijenta intravenskom injekcijom u tri podeljene doze (20%, 30%, odnosno 50%) tokom nedelju dana (npr., na dane 0, 2 i 6). Tokom dana 1-30 ispitivanja, pacijenti su praćeni zbog neželjenih događaja, a uzorci pacijenata su uzeti za laboratorijsku procenu. Svi pacijenti su praćeni najmanje 36 meseci nakon primene CAR-T-a.
[0460] Primarni ishod ispitivanja meri pojavu neželjenih događaja povezanih sa lečenjem prema proceni Zajedničkih terminoloških kriterijuma za neželjene događaje (CTCAE) v4.0 tokom 1-30 dana nakon injekcije LCAR-B38M CAR-T ćelija. Sekundarni ishod procenjuje antimijelomske odgovore izazvane CAR-T, npr., određivanjem aberantnih nivoa imunoglobulina u serumu i broja ćelija multiplog mijeloma u koštanoj srži pacijenata pre i nakon primene LCAR-B38M CAR-T ćelija. Ciljevi efikasnosti ispitivanja uključuju patološki udeo potpunog odgovora, 3-godišnjeg preživljavanja bez bolesti, 3-godišnjeg preživljavanja bez napredovanja.
[0461] Pacijenti starosti 18-75 godina su pogodni za ispitivanje ako: (1) pacijent ima potvrđenu prethodnu dijagnozu aktivnog multiplog mijeloma kako je definisano ažuriranim kriterijima IMWG-a; (2) jasna ekspresija BCMA otkrivena je na malignim plazmatskim ćelijama iz koštane srži ili plazmacitoma protočnom citometrijom ili imunohistohemijom; i (3) pacijent ima refraktorni multipli mijelom kako je definisano tako što je primio najmanje 3 prethodna režima lečenja uključujući bortezomib, ili na drugi način identifikovan od strane kliničkih lekara; ili je pacijent imao recidiv multiplog mijeloma kako je definisano u smernicama kliničke prakse NCCN-a u Oncology: Multiple Myeloma (2016. V2).
[0462] Sledeći pacijenti su isključeni iz ispitivanja: (1) žene u reproduktivnoj dobi ili koje su trudne ili doje; (2) pacijenti koji imaju bilo koju aktivnu i nekontrolisanu infekciju: hepatitis B, hepatitis C, HIV ili drugu smrtonosnu virusnu i bakterijsku infekciju; (3) pacijenti koji su primali sistemsku terapiju kortikosteroidnim steroidima veću od 5 mg/dan prednizona ili ekvivalentnu dozu drugog kortikosteroida nije dopušteno tokom 2 nedelje pre bilo potrebne leukafereze ili početka kondicionog režima hemoterapije; (4) pacijenti sa bilo kojom nekontrolisanom interkurentnom bolešću ili ozbiljnim nekontrolisanim medicinskim poremećajem; (5) bolesnici sa CNS metastazama ili simptomatskom zahvaćenošću CNS-a (uključujući kranijalne neuropatije ili masovne lezije i kompresiju leđne moždine); (6) pacijenti sa istorijom alogene transplantacije matičnih ćelija, koji imaju aktivnu akutnu ili hroničnu bolest transplantata protiv domaćina (GVHD) ili sui m potrebni imunosupresivni lekovi za GVHD, tokom 6 meseci od ulaska u ispitivanje; ili (7) pacijenti sa aktivnim autoimunim bolestima kože kao što je psorijaza ili drugim aktivnim autoimunim bolestima kao što je reumatoidni artritis.
[0463] U privremenoj analizi u maju 2017., 35 pacijenata sa relapsom ili multiplim mijelomom otpornim na lečenje (refraktornim) primilo je terapiju LCAR-B38M CAR-T. Prvi znakovi efikasnosti lečenja pojavili su se već 10 dana nakon početne injekcije CAR-T ćelija. Sveukupno, stopa objektivnog odgovora bila je 100%, a 33 od 35 (94%) pacijenata imalo je evidentnu kliničku remisiju mijeloma (potpuni odgovor ili vrlo dobar delimičan odgovor) tokom dva meseca od primanja CAR-T ćelija.
[0464] Do vremena analize, 19 pacijenata je praćeno više od četiri meseca, što je unapred određeno vreme za potpunu procenu efikasnosti prema konsenzusnim kriterijima Međunarodne radne grupe za mijelom (IMWG). Jedan pacijent je postigao delimičan odgovor, a četiri bolesnika su postigla vrlo dobre kriterijume delimične remisije (VgPR) u efikasnosti. Nijedan pacijent koji je postigao kriterijume strogog potpunog odgovora ("sCR") nije imao recidiv. Pet pacijenata koji su bili praćeni više od godinu dana (12-14 meseci) ostali su na sCR statusu i bili su bez minimalne rezidualne bolesti (tj., nema detektabilnih ćelija kancera u koštanoj srži).
[0465] Sindrom oslobađanja citokina ("CRS") čest je i potencijalno opasan neželjeni efekat terapije CAR T-ćelijama. Samo prolazni CRS doživelo je 85% od 35 pacijenata. Simptomi CRS-a uključuju temperaturu, nizak krvni pritisak, poteškoće sa disanjem i probleme sa više organa. Kod većine bolesnika simptomi CRS-a bili su blagi i podložni su kontroli. Samo su dva pacijenta doživela teški CRS (nivo 3), ali su se oporavila nakon primanja tocilizumaba (lek za smanjenje upale koji se obično koristi za lečenje CRS-a u kliničkim ispitivanjima terapije CAR-T ćelijama). Nijedan pacijent nije iskusio neurološka neželjena dejstva, još jednu uobičajenu i ozbiljnu komplikaciju terapije CAR T-ćelijama.
[0466] Podaci prelaznog kliničkog ispitivanja su pokazali potentnu efikasnost i bezbednost LCAR-B38M CAR-T lečenja kod pacijenata sa refraktornim/relapsnim multiplim mijelomom.
[0467] U pilot kliničkom ispitivanju, 3 pacijenta su lečena autolognim T ćelijama koje eksprimiraju jednovalentni BCMA CAR, tj., LCAR-B27S CAR-T ćelije. LCAR-B27S CAR (jedan jednovalentni BCMA CAR naveden u tabeli 4) ima antigenski vezujući domen koji sadrži jedan VHH fragment koji prepoznaje jedan epitop molekula BCMA. Ovaj VHH domen je identičan drugom VHH domenu bi-epitopa/dvovalentnog LCAR-B38M CAR.
[0468] U in vitro ispitivanju citotoksičnosti, LCAR-B27S CAR-T ćelije su pripremljene od tri pacijenta sa multiplim mijelomom, a LCAR-B38M CAR-T ćelije su takođe pripremljene iz tri ista pacijenta sa multiplim mijelomom kao kontrolom. Obe CAR-T ćelije su uzgajane zajedno sa RPMI8226.Luc ćelijama u odnosu efektora i cilja (odnos E/T) od 20:1 i 5:1 tokom 20 sati. Kao što je prikazano na FIG.14A, CAR-T ćelije su pripremljene korišćenjem T ćelija pacijenta A. Procenat preostalih živih ćelija, prema proceni preostale aktivnosti luciferaze u RPMI8226. Luc ćelijama, bio je 3,97±0,75% za LCAR-B38M i 3,17 ±0,57% za LCAR-B27S, kada je odnos E/T bio 20:1. Međutim, kada je odnos E/T bio 5:1, LCAR-B38M je pokazao veću moć ubijanja RPMI8226.Luc ćelija u poređenju sa LCAR-B27S (33,37±0,75% preostalih živih ćelija za LCAR-B38M, 68,60±1,60% za LCAR- B27S). Kao što je prikazano na FIG.14B, CAR-T ćelije su pripremljene korišćenjem T ćelija pacijenta B. Procenat preostalih živih ćelija, prema proceni preostale aktivnosti luciferaze u RPMI8226.Luc ćelijama, bio je 4,45±0,57% za LCAR-B38M i 9,32 ±1,16% za LCAR-B27S, kada je odnos E/T bio 20:1. Međutim, kada je odnos E/T bio 5:1, LCAR-B38M ponovo je pokazao veću moć ubijanja RPMI8226.Luc ćelija u poređenju sa LCAR-B27S (40,92±3,00% preostalih živih ćelija za LCAR-B38M, 84,05±1,56% za LCAR -B27S). Kao što je prikazano na FIG.14C, CAR-T ćelije su pripremljene korišćenjem T ćelija pacijenta C. Procenat preostalih živih ćelija, prema proceni preostale aktivnosti luciferaze u RPMI8226.Luc ćelijama, bio je 2,56±0,88% za LCAR-B38M i 10,12 ±1,83% za LCAR-B27S, kada je odnos E/T bio 20:1. Međutim, kada je odnos E/T bio 5:1, LCAR-B38M ponovno je pokazao veću moć ubijanja RPMI8226.Luc ćelija u poređenju sa LCAR-B27S (29,99±3,13% preostalih živih ćelija za LCAR-B38M, 100,93±9,25% za LCAR -B27S).
[0469] U pilot kliničkom ispitivanu, 3 pacijenta su lečena LCAR-B27S CAR-T ćelijama, u kojima su svi protokoli predkondicioniranja, ubrizgavanja i praćenja bili identični onima u kliničkom ispitivanju sa dvovalentnim LCAR-B38M CAR. Ukupna doza 3×10<6>ćelija/kg (pacijent A), 5×10<6>ćelija/kg (pacijent B) i 7×10<6>ćelija/kg (pacijent C) telesne mase autolognih LCAR-B27S modifikovanih CAR-T ćelija primenjene su svakom pacijentu pojedinačno intravenskom injekcijom u tri podeljene doze (20%, 30%, odnosno 50%) tokom nedelju dana (npr., na dane 0, 2 i 6). Tokom dana 1-30 ispitivanja, pacijenti su praćeni zbog neželjenih događaja, a uzorci pacijenata su uzimani za laboratorijsku procenu. Svi bolesnici su praćeni najmanje 36 meseci nakon primene CAR-T.
[0470] 2 pacijenta među tri pacijenta su postigla vrlo dobar delimični odgovor (VgPR), ali oba pacijenta su doživela relaps tokom 6 meseci nakon infuzije CAR-T. Treći pacijent nije pokazao nikakav klinički odgovor. IRB je stoga prekinuo pilot ispitivanje sa LCAR-B27S bez daljeg uključivanja pacijenata.
[0471] Stopa objektivnog odgovora, stopa potpune remisije i stopa relapsa iz ovog pilot ispitivanja jednovalentnog BCMA CAR (LCAR-B27S) i ispitivanja dvovalentnog BCMA CAR (LCAR-B38M CAR-T) prikazani su u tabeli 11 u nastavku. Dvovalentni BCMA CAR-T je imao superiornu kliničku efikasnost u poređenju sa jednovalentnim BCMA CAR-T.
TABELA 11: Uporedivi klinički podaci terapija jednovalentnim i dvovalentnim/bi-epitopskim BCMA
CAR-T
A
J
B
(

Claims (25)

  1. Patentni zahtevi 1. Himerni antigenski receptor (CAR) koji obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigenski vezujući domen koji obuhvata prvo antitelo sa jednim domenom (sdAb) anti-B ćelijskog antigena sazrevanja (BCMA) koji obuhvata VHH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124 i drugo sdAb anti-BCMA koje obuhvata VHH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 117; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen.
  2. 2. CAR prema zahtevu 1, pri čemu se prvo sdAb anti-BCMA nalazi na N-kraju ili C-kraju drugog sdAb anti-BCMA .
  3. 3. CAR prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu su prvo sdAb anti-BCMA i drugo sdAb anti-BCMA međusobno spojeni peptidnim linkerom.
  4. 4. CAR prema zahtevu 3, pri čemu taj peptidni linker ima dužinu od najviše 50 aminokiselina.
  5. 5. CAR prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu je transmembranski domen izveden iz molekula izabranog iz grupe koju čine CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1.
  6. 6. CAR prema zahtevu 5, pri čemu je transmembranski domen izveden iz CD8α ili CD28.
  7. 7. CAR prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarni intracelularni signalizirajući domen imune efektorske ćelije.
  8. 8. CAR prema zahtevu 7, pri čemu je primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ.
  9. 9. CAR prema bilo kom od zahteva 1 do 8, pri čemu intracelularni signalizirajući domen obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen.
  10. 10. CAR prema zahtevu 9, pri čemu je kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije.
  11. 11. CAR prema zahtevu 10, pri čemu kostimulatorni signalizirajući domen obuhvata citoplazmatski domen CD28 i/ili citoplazmatski domen CD137.
  12. 12. CAR prema bilo kom od zahteva 1 do 11, pri čemu CAR dodatno obuhvata zglobni domen koji se nalazi između C-kraja ekstracelularnog antigenskog vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena.
  13. 13. CAR prema zahtevu 12, pri čemu je taj zglobni domen izveden iz CD8α.
  14. 14. CAR prema bilo kom od zahteva 1 do 13, pri čemu CAR dodatno obuhvata signalni peptid koji se nalazi na N-kraju polipeptida.
  15. 15. CAR prema zahtevu 14, pri čemu je signalni peptid izveden iz CD8α.
  16. 16. CAR prema bilo kom od zahteva 1 do 15 koji obuhvata polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 300.
  17. 17. Izolovana nukleinska kiselina koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira CAR prema bilo kom od zahteva 1 do 16.
  18. 18. Izolovana nukleinska kiselina prema zahtevu 17 koja obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 338.
  19. 19. Vektor koji obuhvata izolovanu nukleinsku kiselinu prema zahtevu 17 ili 18.
  20. 20. Vektor prema zahtevu 19 koji je lentivirusni vektor.
  21. 21. Konstruisana imuna efektorska ćelija koja obuhvata CAR prema bilo kom od zahteva 1 do 16, izolovanu nukleinsku kiselinu prema zahtevu 17 ili 18, ili vektor prema zahtevu 19 ili 20.
  22. 22. Konstruisana imuna efektorska ćelija prema zahtevu 21, pri čemu je ta konstruisana imuna efektorska ćelija, T ćelija.
  23. 23. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata konstruisanu imunu efektorsku ćeliju prema zahtevu 21 ili 22 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
  24. 24. CAR kao što je definisan u bilo kom od zahteva 1 do 16 ili farmaceutska kompozicija kao što je definisana u zahtevu 23 za upotrebu u postupku lečenja kancera kod pojedinca.
  25. 25. CAR ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 24, pri čemu je taj kancer multipli mijelom.
RS20231139A 2015-08-11 2017-08-10 Himerni antigenski receptori koji ciljaju bcma i postupci njihove upotrebe RS64925B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510490002 2015-08-11
PCT/CN2016/094408 WO2017025038A1 (en) 2015-08-11 2016-08-10 Chimeric antigen receptors based on single-domain antibodies and methods of use thereof
EP21166662.3A EP3896091B1 (en) 2015-08-11 2017-08-10 Chimeric antigen receptors targeting bcma and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64925B1 true RS64925B1 (sr) 2023-12-29

Family

ID=55417644

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240831A RS65866B1 (sr) 2015-08-11 2016-08-10 Himerni antigen receptori bazirani na jednodomenskim antitelima i postupci njihove upotrebe
RS20231139A RS64925B1 (sr) 2015-08-11 2017-08-10 Himerni antigenski receptori koji ciljaju bcma i postupci njihove upotrebe

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240831A RS65866B1 (sr) 2015-08-11 2016-08-10 Himerni antigen receptori bazirani na jednodomenskim antitelima i postupci njihove upotrebe

Country Status (36)

Country Link
US (6) US10934363B2 (sr)
EP (7) EP4063397B1 (sr)
JP (9) JP6859347B2 (sr)
KR (7) KR20180035918A (sr)
CN (9) CN105384825B (sr)
AU (6) AU2016305075B2 (sr)
BR (1) BR112018002844A2 (sr)
CA (3) CA2994579C (sr)
CL (4) CL2018000378A1 (sr)
CO (2) CO2018001405A2 (sr)
CR (4) CR20180153A (sr)
DK (3) DK3334765T3 (sr)
EA (2) EA201890302A1 (sr)
ES (2) ES2984851T3 (sr)
FI (3) FI4063397T3 (sr)
FR (1) FR24C1050I2 (sr)
HR (2) HRP20241057T1 (sr)
HU (3) HUE067869T2 (sr)
IL (3) IL257297B (sr)
LT (3) LT4063397T (sr)
MX (5) MX2018001739A (sr)
MY (3) MY188362A (sr)
NL (1) NL301301I2 (sr)
NO (1) NO2024054I1 (sr)
NZ (1) NZ750366A (sr)
PH (2) PH12018500295B1 (sr)
PL (2) PL4063397T3 (sr)
PT (2) PT4063397T (sr)
RS (2) RS65866B1 (sr)
SA (2) SA518390904B1 (sr)
SG (2) SG10201913485QA (sr)
SI (2) SI4063397T1 (sr)
SM (2) SMT202400311T1 (sr)
UA (2) UA125818C2 (sr)
WO (2) WO2017025038A1 (sr)
ZA (2) ZA201800703B (sr)

Families Citing this family (427)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
US9950282B2 (en) 2012-03-15 2018-04-24 Flodesign Sonics, Inc. Electronic configuration and control for acoustic standing wave generation
US9458450B2 (en) 2012-03-15 2016-10-04 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoretic separation technology using multi-dimensional standing waves
US10967298B2 (en) 2012-03-15 2021-04-06 Flodesign Sonics, Inc. Driver and control for variable impedence load
US9725710B2 (en) 2014-01-08 2017-08-08 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoresis device with dual acoustophoretic chamber
SG10201808867PA (en) 2014-04-07 2018-11-29 Minerva Biotechnologies Corp Anti-nme antibody
CN104004095B (zh) * 2014-06-04 2016-11-23 博生吉医药科技(苏州)有限公司 一种cd7纳米抗体、其编码序列及应用
US11384350B2 (en) 2014-12-15 2022-07-12 The Regents Of The University Of California Cytotoxic molecules responsive to intracellular ligands for selective T cell mediated killing
WO2016100232A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 The Regents Of The University Of California Bispecific or-gate chimeric antigen receptor responsive to cd19 and cd20
US11377651B2 (en) 2016-10-19 2022-07-05 Flodesign Sonics, Inc. Cell therapy processes utilizing acoustophoresis
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
US11021699B2 (en) 2015-04-29 2021-06-01 FioDesign Sonics, Inc. Separation using angled acoustic waves
US10434153B1 (en) 2015-05-20 2019-10-08 Kim Leslie O'Neill Use of car and bite technology coupled with an scFv from an antibody against human thymidine kinase 1 to specifically target tumors
ES2889906T3 (es) 2015-05-21 2022-01-14 Harpoon Therapeutics Inc Proteínas de unión triespecíficas y usos médicos
JP6961497B2 (ja) * 2015-06-25 2021-11-05 アイセル・ジーン・セラピューティクス・エルエルシー キメラ抗体受容体（ＣＡＲｓ）の構成およびその使用方法
US11459540B2 (en) 2015-07-28 2022-10-04 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
US11474085B2 (en) 2015-07-28 2022-10-18 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
CN105384825B (zh) * 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
US11236174B2 (en) 2016-01-12 2022-02-01 Crescendo Biologics Limited Therapeutic molecules
US20190194338A1 (en) 2016-02-17 2019-06-27 Seattle Genetics, Inc. Bcma antibodies and use of same to treat cancer and immunological disorders
CN105647946B (zh) * 2016-03-18 2019-09-20 江苏普瑞康生物医药科技有限公司 一种基于FcγRⅢa的嵌合基因及其用途
WO2017173349A1 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Kite Pharma, Inc. Bcma binding molecules and methods of use thereof
PT3436079T (pt) * 2016-04-01 2021-10-06 Kite Pharma Inc Recetores de antigénios quiméricos e de células t e métodos de uso
US11085035B2 (en) 2016-05-03 2021-08-10 Flodesign Sonics, Inc. Therapeutic cell washing, concentration, and separation utilizing acoustophoresis
US11214789B2 (en) 2016-05-03 2022-01-04 Flodesign Sonics, Inc. Concentration and washing of particles with acoustics
GB201607968D0 (en) * 2016-05-06 2016-06-22 Crescendo Biolog Ltd Chimeric antigen receptor
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
CA3024723A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Robert B. Dubridge Single domain serum albumin binding protein
WO2017223111A1 (en) 2016-06-21 2017-12-28 Teneobio, Inc. Cd3 binding antibodies
JP7114490B2 (ja) * 2016-06-24 2022-08-08 アイセル・ジーン・セラピューティクス・エルエルシー キメラ抗体受容体（ＣＡＲｓ）の構成およびその使用方法
US20190233533A1 (en) 2016-06-28 2019-08-01 Umc Utrecht Holding B.V. Treatment Of IgE-Mediated Diseases With Antibodies That Specifically Bind CD38
WO2018014039A1 (en) * 2016-07-15 2018-01-18 Poseida Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors (cars) specific for muc1 and methods for their use
KR20190057275A (ko) * 2016-07-18 2019-05-28 헬릭스 바이오파마 코포레이션 암을 치료하기 위한 암배아 항원 관련 세포 부착 분자 6에 대한 car 면역 세포
HRP20240767T1 (hr) 2016-09-14 2024-09-13 Teneoone, Inc. Cd3 vezujuća antitijela
CN108699163B (zh) * 2016-09-28 2021-11-19 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 一种多基因重组嵌合抗原受体分子及其应用
WO2018068201A1 (en) * 2016-10-11 2018-04-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against ctla-4
KR20190127655A (ko) 2016-10-19 2019-11-13 프로디자인 소닉스, 인크. 음향학에 의한 친화성 세포 추출
CN106755108A (zh) * 2016-12-05 2017-05-31 刘晓明 一种表达cd19和cd20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒载体及其制备方法
CN106701827A (zh) * 2016-12-05 2017-05-24 刘晓明 表达cd19和cd20抗体基因嵌合抗原受体t细胞的转化及扩增培养与保存方法
CN106755109A (zh) * 2016-12-05 2017-05-31 刘晓明 一种表达人cd19和cd20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体
US10799536B2 (en) 2016-12-09 2020-10-13 Onk Therapeutics Limited Method of treating multiple myeloma using natural killer cells expressing a chimeric antigen receptor for CD38
CN106822184A (zh) * 2016-12-15 2017-06-13 梁爱斌 多靶点联合的car‑t细胞制剂与制备方法
BR112019012354A2 (pt) * 2016-12-21 2019-11-26 Teneobio, Inc. anticorpos apenas de cadeia pesada anti-bcma
CN108276493B (zh) * 2016-12-30 2023-11-14 南京传奇生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体及其应用
CN106749677B (zh) * 2017-01-04 2020-06-12 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种靶向mll白血病的双特异性嵌合抗原受体基因及其应用
EP3565842A1 (en) 2017-01-06 2019-11-13 Crescendo Biologics Limited Single domain antibodies to programmed cell death (pd-1)
EP3577134A1 (en) 2017-01-31 2019-12-11 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric t cell receptor proteins having multiple specificities
CN108395482B (zh) * 2017-02-08 2021-02-05 西比曼生物科技（香港）有限公司 一种靶向cd20抗原嵌合抗原受体的构建及其工程化t细胞的活性鉴定
CN110461335A (zh) 2017-02-17 2019-11-15 弗雷德哈钦森癌症研究中心 用于治疗bcma相关癌症和自身免疫性失调的联合疗法
US11535668B2 (en) 2017-02-28 2022-12-27 Harpoon Therapeutics, Inc. Inducible monovalent antigen binding protein
SG11201909160WA (en) 2017-04-11 2019-10-30 Inhibrx Inc Multispecific polypeptide constructs having constrained cd3 binding and methods of using the same
CN108728465A (zh) * 2017-04-14 2018-11-02 深圳新诺微环生物科技有限公司 一种表达靶细胞-效应细胞桥接器的微环dna载体及其制备方法和应用
CN110741016A (zh) 2017-04-26 2020-01-31 优瑞科生物技术公司 嵌合抗体/t-细胞受体构筑体及其用途
US20200179511A1 (en) 2017-04-28 2020-06-11 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
WO2018201056A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
CA3061945A1 (en) 2017-05-01 2018-11-08 Juno Therapeutics, Inc. Combination of a cell therapy and an immunomodulatory compound
US12226479B2 (en) 2017-05-11 2025-02-18 The General Hospital Corporation Methods and compositions of use of CD8+ tumor infiltrating lymphocyte subtypes and gene signatures thereof
BR112019023855B1 (pt) 2017-05-12 2021-11-30 Harpoon Therapeutics, Inc Proteínas de ligação à mesotelina
AU2017414703B2 (en) * 2017-05-17 2025-02-06 Thunder Biotech Inc. Transgenic macrophages, chimeric antigen receptors, and associated methods
US10415017B2 (en) 2017-05-17 2019-09-17 Thunder Biotech, Inc. Transgenic macrophages, chimeric antigen receptors, and associated methods
CN107299110B (zh) 2017-05-27 2019-11-22 上海优卡迪生物医药科技有限公司 一种基于octs技术的胰腺癌、恶性间皮瘤car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN107245500B (zh) * 2017-05-27 2019-05-17 上海优卡迪生物医药科技有限公司 一种基于octs技术的淋系白血病car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN107337736B (zh) * 2017-06-06 2019-07-26 上海优卡迪生物医药科技有限公司 Octs-car双靶向嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建和应用
WO2018232195A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods targeting complement component 3 for inhibiting tumor growth
MX2019015563A (es) * 2017-06-20 2020-07-28 Teneoone Inc Anticuerpos anti-bcma unicamente de cadena pesada.
CN110891971B (zh) * 2017-06-20 2024-01-12 特尼奥生物股份有限公司 仅有重链的抗bcma抗体
EP3641768B1 (en) 2017-06-21 2025-12-31 iCell Gene Therapeutics LLC Chimeric Antigen Receptors (CARs), Compositions and Associated Methods
WO2019000223A1 (en) * 2017-06-27 2019-01-03 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. ENABLERS OF IMMUNE EFFECTOR CELLS OF CHIMERIC ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
KR20250012203A (ko) * 2017-06-30 2025-01-23 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 인간 도메인을 갖는 항-b 세포 성숙화 항원 키메라성 항원 수용체
GB201711068D0 (en) 2017-07-10 2017-08-23 Crescendo Biologics Ltd Therapeutic molecules binding PSMA
CN109232742B (zh) * 2017-07-11 2021-10-22 深圳市第二人民医院 一种嵌合抗原受体及其应用
WO2019014581A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 The Broad Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING THE ACTIVITY OF A CYTOTOXIC LYMPHOCYTE
WO2019014891A1 (zh) * 2017-07-20 2019-01-24 深圳普瑞金生物药业有限公司 一种用于治疗肿瘤的egfr单域抗体cart及其应用
WO2019018525A1 (en) * 2017-07-20 2019-01-24 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. CHIMERIC ANTIGENIC RECEPTORS BINDING TO CD123
WO2019028051A1 (en) * 2017-07-31 2019-02-07 Lentigen Technology, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING CANCER BY ANTI-CD19 / CD20 IMMUNOTHERAPY
WO2019036724A2 (en) * 2017-08-18 2019-02-21 Celdara Medical Llc CELLULAR THERAPIES TARGETING MOLECULAR MEDIATORS ASSOCIATED WITH DISEASE, FIBROUS, INFLAMMATORY, AND AUTOIMMUNE CONDITIONS
CA3070468A1 (en) * 2017-09-01 2019-03-07 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Immunogenic peptides specific to bcma and taci antigens for treatment of cancer
CA3075399A1 (en) * 2017-09-13 2019-03-21 Teneobio, Inc. Heavy chain antibodies binding to ectoenzymes
KR102403046B1 (ko) * 2017-09-29 2022-05-30 재단법인 목암생명과학연구소 Bcma에 높은 친화도를 가지는 항-bcma 항체 및 이를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물
US12043870B2 (en) 2017-10-02 2024-07-23 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for detecting and modulating an immunotherapy resistance gene signature in cancer
JP7084990B2 (ja) * 2017-10-13 2022-06-15 ハープーン セラピューティクス，インク． 三重特異性タンパク質と使用方法
IL315737A (en) * 2017-10-13 2024-11-01 Harpoon Therapeutics Inc B-cell maturation antigen-binding proteins
US11999802B2 (en) 2017-10-18 2024-06-04 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
KR102845789B1 (ko) 2017-11-01 2025-08-14 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 B 세포 성숙 항원에 특이적인 키메라 항원 수용체 및 암호화 폴리뉴클레오타이드
US12193994B2 (en) 2017-11-06 2025-01-14 Juno Therapeutics, Inc. Combination of a cell therapy and a gamma secretase inhibitor
JP7312168B2 (ja) 2017-11-13 2023-07-20 クレッシェンド、バイオロジックス、リミテッド Ｃｄ１３７に結合するシングルドメイン抗体
US12171783B2 (en) 2017-11-13 2024-12-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for targeting developmental and oncogenic programs in H3K27M gliomas
EP3710039A4 (en) 2017-11-13 2021-08-04 The Broad Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF CANCER BY TARGETING THE CLEC2D-KLRB1 PATH
SG11202004512XA (en) * 2017-11-15 2020-06-29 Novartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, cd19-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapies
CA3083949A1 (en) 2017-11-30 2020-06-06 Novartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, and uses thereof
JP2021507561A (ja) 2017-12-14 2021-02-22 フロデザイン ソニックス， インク．Ｆｌｏｄｅｓｉｇｎ Ｓｏｎｉｃｓ， Ｉｎｃ． 音響トランスデューサドライバ及びコントローラ
US20190192678A1 (en) * 2017-12-18 2019-06-27 Novather, Inc. System and method for the treatment of disease using a hyperspecific modified protein system
CN112218885B (zh) 2017-12-20 2024-06-18 波赛达治疗公司 Vcar组合物和使用方法
AU2018392080A1 (en) * 2017-12-22 2020-07-02 2Seventy Bio, Inc. Multivalent chimeric antigen receptor
CN109970860A (zh) * 2017-12-27 2019-07-05 信达生物制药(苏州)有限公司 三链抗体、其制备方法及其用途
WO2019127215A1 (en) * 2017-12-28 2019-07-04 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific chimeric receptors comprising an nkg2d domain and methods of use thereof
CN109971715A (zh) * 2017-12-28 2019-07-05 深圳华大生命科学研究院 一种扩增特异性car-t细胞的培养方法
CN109988242A (zh) * 2018-01-02 2019-07-09 武汉波睿达生物科技有限公司 联合嵌合抗原受体、表达载体、慢病毒及t细胞
CN112218651A (zh) 2018-01-08 2021-01-12 诺华公司 用于与嵌合抗原受体疗法组合的免疫增强rna
CN108285486A (zh) * 2018-01-15 2018-07-17 浙江阿思科力生物科技有限公司 以cd20为靶点的特异性抗体、car-nk细胞及其制备和应用
KR102115236B1 (ko) * 2018-01-29 2020-05-27 (주)에스엠티바이오 췌장 또는 담관계암 치료를 위한 키메라 항원 수용체
CN108341881B (zh) * 2018-01-31 2020-08-18 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 带安全开关的嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的nk细胞及应用
US20210038659A1 (en) 2018-01-31 2021-02-11 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
CN108314739B (zh) * 2018-02-05 2020-07-14 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 多信号嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的nk细胞及应用
CN110129369B (zh) * 2018-02-09 2023-10-13 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 一种嵌合抗原受体基因工程载体、免疫细胞及其应用
EP3752203A1 (en) 2018-02-13 2020-12-23 Novartis AG Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
GB201802573D0 (en) 2018-02-16 2018-04-04 Crescendo Biologics Ltd Therapeutic molecules that bind to LAG3
EP3759146A1 (en) 2018-03-02 2021-01-06 CDR-Life AG Trispecific antigen binding proteins
CN108220247A (zh) * 2018-03-20 2018-06-29 杭州史迪姆生物科技有限公司 一种双car-t细胞及其制备方法和应用
AU2019249215B2 (en) 2018-04-06 2026-02-19 The Regents Of The University Of California Methods of treating EGFRvIII expressing glioblastomas
EP3549597A1 (en) * 2018-04-06 2019-10-09 Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Synthetic signalling constructs and its use
EP3773633A4 (en) 2018-04-06 2022-01-26 The Regents of The University of California METHODS OF TREATMENT OF GLIOBLASTOMA
WO2019200022A1 (en) 2018-04-11 2019-10-17 Inhibrx, Inc. Multispecific polypeptide constructs having constrained cd3 binding and related methods and uses
CN116836297A (zh) * 2018-04-12 2023-10-03 上海赛比曼生物科技有限公司 靶向bcma的嵌合抗原受体及其制法和应用
US11957695B2 (en) 2018-04-26 2024-04-16 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions targeting glucocorticoid signaling for modulating immune responses
WO2019222283A1 (en) 2018-05-14 2019-11-21 Harpoon Therapeutics, Inc. Binding moiety for conditional activation of immunoglobulin molecules
CA3100157A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating cancers and enhancing efficacy of t cell redirecting therapeutics
WO2019232542A2 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for detecting and modulating microenvironment gene signatures from the csf of metastasis patients
US12036240B2 (en) 2018-06-14 2024-07-16 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods targeting complement component 3 for inhibiting tumor growth
CN110606893B (zh) * 2018-06-15 2022-11-15 北昊干细胞与再生医学研究院有限公司 一种靶向cd19和cd20双抗原的嵌合性抗原受体t细胞治疗肿瘤的方法
CN119529091A (zh) * 2018-06-19 2025-02-28 南京传奇生物科技有限公司 工程化的细胞及其用途
SG11202011597RA (en) * 2018-07-20 2020-12-30 Teneobio Inc Heavy chain antibodies binding to cd19
TW202035451A (zh) * 2018-07-24 2020-10-01 美商英伊布里克斯公司 含有受限cd3結合域及受體結合區之多重特異性多肽構築體及其使用方法
AU2019318135A1 (en) * 2018-08-10 2021-03-04 Sangamo Therapeutics France New car constructs comprising TNFR2 domains
GB201813178D0 (en) * 2018-08-13 2018-09-26 Autolus Ltd Cell
CN109134665B (zh) 2018-08-24 2021-06-11 上海先博生物科技有限公司 一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及应用
JP7289562B2 (ja) * 2018-08-24 2023-06-12 シェンチェン プレジーン バイオファルマ カンパニー リミテッド 抗ｂｃｍａ単一ドメイン抗体及びその適用
EP3844267B1 (en) 2018-08-31 2025-06-25 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3844265A2 (en) 2018-08-31 2021-07-07 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
CN112673022B (zh) * 2018-09-10 2024-07-09 南京传奇生物科技有限公司 针对cd33的单结构域抗体及其构建体
CN109293781A (zh) * 2018-09-12 2019-02-01 中国人民解放军总医院 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、cd19-cd20双靶向性的t细胞及其应用
US12195544B2 (en) 2018-09-21 2025-01-14 Harpoon Therapeutics, Inc. EGFR binding proteins and methods of use
CN109081870B (zh) * 2018-09-21 2021-12-03 成都阿帕克生物科技有限公司 一种抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体及核酸分子和应用
CN109265550B (zh) * 2018-09-25 2020-09-15 华东师范大学 Bcma抗体、嵌合抗原受体和药物
CN113286817B (zh) 2018-09-25 2025-01-28 哈普恩治疗公司 Dll3结合蛋白及使用方法
WO2020061796A1 (en) * 2018-09-26 2020-04-02 Hrain Biotechnology Co., Ltd. Bcma-and-cd19-targeting chimeric antigen receptor and uses thereof
WO2020072700A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Hla single allele lines
CN109503716B (zh) * 2018-10-08 2021-04-27 浙江生研生物科技有限公司 一种双特异性嵌合抗原受体分子及其在肿瘤治疗上的应用
WO2020076977A2 (en) * 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. Dll3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
WO2020081730A2 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for modulating microenvironment
MX2021004732A (es) * 2018-10-26 2021-06-04 Teneobio Inc Anticuerpos de cadena pesada que se unen a cd38.
WO2020092455A2 (en) 2018-10-29 2020-05-07 The Broad Institute, Inc. Car t cell transcriptional atlas
CA3116413A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Juno Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors specific for g protein-coupled receptor class c group 5 member d (gprc5d)
CN109504660B (zh) * 2018-11-02 2021-08-06 温州启星生物技术有限公司 一种第四代car-t细胞及其构建方法和应用
WO2020097403A1 (en) 2018-11-08 2020-05-14 Juno Therapeutics, Inc. Methods and combinations for treatment and t cell modulation
EP3876956A4 (en) 2018-11-08 2022-12-28 The Regents of The University of California SYSTEMS AND METHODS FOR TARGETING CANCER CELLS
CN110951689A (zh) * 2018-11-30 2020-04-03 北京美康基免生物科技有限公司 一种基于cd19和cd30的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其应用
CN109468283A (zh) * 2018-11-30 2019-03-15 北京美康基免生物科技有限公司 一种基于cd19和bcma的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其应用
CN120005921A (zh) * 2018-12-12 2025-05-16 凯德药业股份有限公司 嵌合抗原和t细胞受体及使用的方法
WO2020131586A2 (en) 2018-12-17 2020-06-25 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying neoantigens
CN109485732B (zh) * 2018-12-20 2021-09-24 四川大学华西医院 基因工程修饰的双靶点嵌合抗原受体及其用途
CN109651511B (zh) * 2018-12-26 2020-06-09 广州百暨基因科技有限公司 一种靶向bcma的嵌合抗原受体及其应用
EP3902838A4 (en) * 2018-12-26 2022-12-21 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Cd30-binding moieties, chimeric antigen receptors, and uses thereof
CN109652379B (zh) * 2018-12-29 2022-08-16 博生吉医药科技(苏州)有限公司 Cd7嵌合抗原受体修饰的nk-92mi细胞及其应用
CN109485734B (zh) * 2018-12-30 2020-05-12 广州百暨基因科技有限公司 一种靶向bcma和cd19的双特异性嵌合抗原受体及其应用
US11739156B2 (en) 2019-01-06 2023-08-29 The Broad Institute, Inc. Massachusetts Institute of Technology Methods and compositions for overcoming immunosuppression
JP2022524178A (ja) * 2019-01-07 2022-04-28 セルリス パルティシパソエス リミターダ タンデム受容体ｃａｒにおける二重特異性と腫瘍マイクロ環境を変調する方法
CN109678961A (zh) * 2019-01-15 2019-04-26 深圳市南科生物工程有限公司 一种基于bmca纳米抗体序列的嵌合抗原受体的构建方法及其应用
WO2020151752A1 (zh) * 2019-01-22 2020-07-30 亘喜生物科技（上海）有限公司 Cd20组合靶向的工程化免疫细胞
EP3883971A1 (en) 2019-01-22 2021-09-29 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services High affinity monoclonal antibodies targeting glypican-1 and methods of use
KR20220016802A (ko) 2019-02-04 2022-02-10 미네르바 바이오테크놀로지 코포레이션 항-nme 항체 및 암 또는 암 전이의 치료 방법
CN109734814A (zh) * 2019-02-12 2019-05-10 南京卡提医学科技有限公司 具有免疫受体的工程化t细胞治疗癌症的用途
EP3930763A1 (en) 2019-02-25 2022-01-05 Novartis AG Mesoporous silica particles compositions for viral delivery
CN121360236A (zh) 2019-03-01 2026-01-20 阿奇洛伊斯生物制药公司 在抗原特异性免疫细胞中调节cd160功能的方法及其用途
KR20210137085A (ko) 2019-03-05 2021-11-17 엔카르타, 인크. Cd19 유도된 키메라 항원 수용체 및 면역 요법에서 이의 용도
US20220154282A1 (en) 2019-03-12 2022-05-19 The Broad Institute, Inc. Detection means, compositions and methods for modulating synovial sarcoma cells
WO2020191079A1 (en) 2019-03-18 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modulating metabolic regulators of t cell pathogenicity
MA55372A (fr) 2019-03-21 2022-01-26 Regeneron Pharma Combinaison d'inhibiteurs de la voie il-4/il-13 et d'ablation de plasmocytes pour traiter une allergie
US20230074800A1 (en) 2019-03-21 2023-03-09 Novartis Ag Car-t cell therapies with enhanced efficacy
AU2020252556B2 (en) 2019-04-05 2026-02-05 Teneobio, Inc. Heavy chain antibodies binding to PSMA
US20220168389A1 (en) 2019-04-12 2022-06-02 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
AU2020261886A1 (en) * 2019-04-22 2021-11-18 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Engineered cells and uses thereof
CN109942709B (zh) * 2019-04-22 2019-12-27 广州百暨基因科技有限公司 一种抗bcma的单域抗体及其应用
EP3959320A1 (en) 2019-04-24 2022-03-02 Novartis AG Compositions and methods for selective protein degradation
CA3133333A1 (en) 2019-04-30 2020-04-30 Brian Scott GARRISON Chimeric receptors and methods of use thereof
EP3733707A1 (en) 2019-04-30 2020-11-04 Celyad S.A. Car t-cells targeting bcma and uses thereof
KR20220004750A (ko) * 2019-05-04 2022-01-11 인히브릭스, 인크. Cd33 결합 폴리펩타이드 및 이의 용도
CN113784732B (zh) 2019-05-07 2024-03-22 亘喜生物科技（上海）有限公司 靶向bcma的工程化免疫细胞及其用途
US11162079B2 (en) 2019-05-10 2021-11-02 The Regents Of The University Of California Blood type O Rh-hypo-immunogenic pluripotent cells
US12516128B2 (en) 2019-05-14 2026-01-06 Harpoon Therapeutics, Inc. EpCAM binding proteins and methods of use
WO2020236967A1 (en) 2019-05-20 2020-11-26 The Broad Institute, Inc. Random crispr-cas deletion mutant
WO2020247618A1 (en) * 2019-06-04 2020-12-10 The General Hospital Corporation Antibodies and chimeric antigen receptors that target taci
CR20210622A (es) 2019-06-14 2022-06-27 Teneobio Inc Anticuerpos multiespecíficos de cadena pesada que se unen a cd22 y cd3
BR112021026382A2 (pt) * 2019-06-27 2022-02-08 Crispr Therapeutics Ag Uso de células t de receptor de antígenos quimérico e inibidores de células nk para tratamento de câncer
US20220282333A1 (en) 2019-08-13 2022-09-08 The General Hospital Corporation Methods for predicting outcomes of checkpoint inhibition and treatment thereof
US12421557B2 (en) 2019-08-16 2025-09-23 The Broad Institute, Inc. Methods for predicting outcomes and treating colorectal cancer using a cell atlas
CN110540997B (zh) * 2019-08-29 2024-02-13 浙江煦顼技术有限公司 靶向bcma嵌合抗原受体、核酸序列、载体及应用
US20220298501A1 (en) 2019-08-30 2022-09-22 The Broad Institute, Inc. Crispr-associated mu transposase systems
EP4022091A1 (en) * 2019-08-30 2022-07-06 Janssen Biotech, Inc. B-cell maturation complex car t construct and primers
WO2021043169A1 (zh) * 2019-09-02 2021-03-11 成都盛世君联生物技术有限公司 特异性结合b细胞成熟抗原的抗体及其用途
KR20210033436A (ko) * 2019-09-18 2021-03-26 주식회사 에스엘바이젠 신규 키메라 항원 수용체 암호화 유전자가 형질도입된 유전자 변형 nk 세포주 및 그의 용도
CN112739721B (zh) * 2019-09-26 2023-01-31 苏州克睿基因生物科技有限公司 一种单域抗体及包含抗体结构的嵌合抗原受体
US12297426B2 (en) 2019-10-01 2025-05-13 The Broad Institute, Inc. DNA damage response signature guided rational design of CRISPR-based systems and therapies
US12394502B2 (en) 2019-10-02 2025-08-19 The General Hospital Corporation Method for predicting HLA-binding peptides using protein structural features
US12195725B2 (en) 2019-10-03 2025-01-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for modulating and detecting tissue specific TH17 cell pathogenicity
US11981922B2 (en) 2019-10-03 2024-05-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for the modulation of cell interactions and signaling in the tumor microenvironment
US11793787B2 (en) 2019-10-07 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for enhancing anti-tumor immunity by targeting steroidogenesis
JP2022553292A (ja) * 2019-10-21 2022-12-22 パーデュー・リサーチ・ファウンデーション 操作されたナチュラルキラー細胞、ならびに免疫療法およびオートファジー阻害技法においてそれを使用するための方法
US12552865B2 (en) 2019-10-22 2026-02-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services High affinity nanobodies targeting B7-H3 (CD276) for treating multiple solid tumors
US11844800B2 (en) 2019-10-30 2023-12-19 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for predicting and preventing relapse of acute lymphoblastic leukemia
JOP20220099A1 (ar) * 2019-11-05 2023-01-30 Janssen Biotech Inc علاج الورم النقوي المتعدد باستخدام خلايا car تائية تستهدف bcma
EP4065606A4 (en) * 2019-11-26 2023-08-02 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR FOR CARBOHYDRATES
CN114761037A (zh) 2019-11-26 2022-07-15 诺华股份有限公司 结合bcma和cd19的嵌合抗原受体及其用途
WO2021105988A1 (en) 2019-11-26 2021-06-03 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Antibodies to carbohydrate antigens
CA3160765A1 (en) * 2019-12-10 2021-06-17 Abl Bio, Inc. Anti-bcma/anti-4-1bb bispecific antibodies and uses thereof
EP4077398A4 (en) * 2019-12-16 2024-04-10 Legend Biotech Ireland Limited SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AND CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS TARGETING BCMA AND METHODS OF USE THEREOF
CN111171158B (zh) * 2020-01-17 2020-10-30 南京蓝盾生物科技有限公司 同时靶向bcma和cd38的嵌合抗原受体及其应用
CN111235113A (zh) * 2020-01-21 2020-06-05 南京北恒生物科技有限公司 包含嵌合抗原受体的免疫细胞及其用途
US12165747B2 (en) 2020-01-23 2024-12-10 The Broad Institute, Inc. Molecular spatial mapping of metastatic tumor microenvironment
KR20220148175A (ko) 2020-01-29 2022-11-04 인히브릭스, 인크. Ｃｄ28 단일 도메인 항체 및 이의 다가 및 다중특이적 구조체
CN115397973A (zh) * 2020-01-30 2022-11-25 免疫生物公司 表达car的nk细胞消除bcma阳性恶性肿瘤
CN111196858B (zh) * 2020-02-05 2021-02-09 武汉科技大学 一种治疗血液肿瘤合并hiv感染的双特异性嵌合抗原受体、基因、构建方法及其应用
US20240261329A1 (en) * 2020-02-13 2024-08-08 Sichuan University Chimeric antigen receptor and use thereof
JP2023514232A (ja) * 2020-02-14 2023-04-05 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー Ｃｄ２活性化を伴うキメラ抗原受容体
KR20220146530A (ko) 2020-02-27 2022-11-01 노파르티스 아게 키메라 항원 수용체-발현 세포의 제조 방법
BR112022016633A2 (pt) 2020-02-27 2022-12-13 Novartis Ag Métodos para produzir células que expressam receptor de antígeno quimérico
JP2023516789A (ja) * 2020-03-09 2023-04-20 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 組換えベクター核酸の統合を定量化するための組成物及び方法
CN113402612A (zh) 2020-03-17 2021-09-17 西比曼生物科技（香港）有限公司 靶向cd19和cd20的联合嵌合抗原受体及其应用
BR112022020333A2 (pt) 2020-04-10 2022-11-22 Juno Therapeutics Inc Métodos e usos relacionados à terapia celular projetada com um receptor de antígeno quimérico que alveja o antígeno de maturação de células b
IL297688A (en) 2020-04-28 2022-12-01 Juno Therapeutics Inc Combination of bcma-directed t cell therapy and an immunomodulatory compound
MX2022013453A (es) 2020-04-29 2022-11-16 Teneobio Inc Anticuerpos de cadena pesada multiespecificos con regiones constantes de cadena pesada modificadas.
WO2021223705A1 (en) * 2020-05-06 2021-11-11 Gracell Biotechnologies (Shanghai) Co., Ltd. Compositions and methods for t cell engineering
EP3915576A1 (en) * 2020-05-28 2021-12-01 Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall-Hebron Chimeric antigen receptors specific for p95her2 and uses thereof
CN111574629B (zh) * 2020-06-01 2021-07-20 宁夏医科大学 一种抗cd20的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用
CN111607565A (zh) * 2020-06-04 2020-09-01 河南大学 一种北平顶猴t细胞的体外扩增方法
US12049514B2 (en) 2020-06-08 2024-07-30 Minerva Biotechnologies Corporation Anti-NME antibody and method of treating cancer or cancer metastasis
KR20230022964A (ko) * 2020-06-08 2023-02-16 얀센 바이오테크 인코포레이티드 키메라 항원 발현 면역 세포의 시험관내 종양 살해 활성을 결정하기 위한 세포-기반 검정
KR20230024967A (ko) 2020-06-11 2023-02-21 노파르티스 아게 Zbtb32 억제제 및 이의 용도
CN116829581A (zh) * 2020-06-22 2023-09-29 莱蒂恩技术公司 用于用tslpr-cd19或tslpr-cd22免疫治疗来治疗癌症的组合物和方法
WO2021263227A2 (en) * 2020-06-26 2021-12-30 Minerva Biotechnologies Corporation Anti-nme antibody and method of treating cancer or cancer metastasis
CN114222761B (zh) * 2020-07-14 2024-02-20 浙江道尔生物科技有限公司 一种抗cld18a2的单域抗体
CA3189531A1 (en) * 2020-07-16 2022-01-20 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific chimeric antigen receptors and uses thereof
EP4182352A4 (en) * 2020-07-16 2025-03-19 Legend Biotech Ireland Limited Cd22 binding molecules and uses thereof
WO2022012683A1 (en) * 2020-07-16 2022-01-20 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Cd19 binding molecules and uses thereof
EP4182350A4 (en) * 2020-07-16 2024-12-11 Legend Biotech Ireland Limited CD20-BINDING MOLECULES AND USES THEREOF
CN111848798B (zh) * 2020-07-27 2022-05-13 源道隆（苏州）医学科技有限公司 可结合bcma的纳米抗体及其应用
WO2022020945A1 (en) * 2020-07-29 2022-02-03 National Research Council Of Canada Anti-cd22 single domain antibodies and therapeutic constructs
CN111909271B (zh) * 2020-08-12 2021-03-23 深圳市茵冠生物科技有限公司 一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及其应用
WO2022035794A1 (en) 2020-08-13 2022-02-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Igg4 hinge-containing chimeric antigen receptors targeting glypican-1 (gpc1) for treating solid tumors
US20230265181A1 (en) 2020-08-20 2023-08-24 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd. Single variable domain and antigen binding molecule binding bcma
EP4202047A4 (en) 2020-08-20 2024-09-18 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd. UNIQUE VARIABLE STRUCTURAL DOMAIN FOR BCMA BINDING AND ANTIGEN BINDING MOLECULE
WO2022040586A2 (en) 2020-08-21 2022-02-24 Novartis Ag Compositions and methods for in vivo generation of car expressing cells
CN112062864A (zh) * 2020-09-18 2020-12-11 樊克兴 靶向bcma肿瘤抗原受体修饰t细胞的制备方法和应用
CN112251412B (zh) * 2020-10-12 2023-03-28 汤朝阳 一种靶向bcma的嵌合抗原受体t细胞及其应用
CN111925451B (zh) * 2020-10-12 2021-01-29 佑仁细胞工程(浙江)有限公司 一种靶向bcma的嵌合抗原受体(car)及其应用
US20230391852A1 (en) 2020-10-26 2023-12-07 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting sars coronavirus spike protein and uses thereof
CN112028996B (zh) * 2020-10-30 2021-01-22 南京北恒生物科技有限公司 靶向bcma的单域抗体及其用途
JP2023549780A (ja) 2020-11-04 2023-11-29 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 改変されたインバリアントｃｄ３免疫グロブリンスーパーファミリー鎖遺伝子座からキメラ受容体を発現する細胞ならびに関連するポリヌクレオチドおよび方法
WO2022116086A1 (en) * 2020-12-03 2022-06-09 Janssen Biotech, Inc. Bcma-targeted car-t cell therapy for multiple myeloma
JP2023552773A (ja) 2020-12-04 2023-12-19 セルジーン コーポレーション 炎症関連可溶性因子の阻害剤と組み合わせたキメラ抗原受容体（ｃａｒ）ｔ細胞療法の使用
TW202237638A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 烏苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
TW202237639A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 鳥苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
WO2022127871A1 (en) * 2020-12-17 2022-06-23 Parasol Biotech Ltd. Gucy2c binding molecules and uses thereof
US20250171550A1 (en) * 2020-12-20 2025-05-29 Ningbo T-Maximum Biopharmaceuticals Co., Ltd. Bcma-targeting single-domain antibody
WO2022140388A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 Allogene Therapeutics, Inc. Protease-activating cd45-gate car
JP2024501971A (ja) 2020-12-31 2024-01-17 サナ バイオテクノロジー，インコーポレイテッド Ｃａｒ－ｔ活性を調節するための方法及び組成物
CN112321713B (zh) * 2020-12-31 2021-05-25 北京艺妙神州医药科技有限公司 一种抗bcma的抗体及其应用
TW202242121A (zh) 2021-01-11 2022-11-01 美商薩那生物科技公司 靶向cd8之病毒載體之用途
CN114149505B (zh) * 2021-01-12 2022-11-04 北京门罗生物科技有限公司 治疗b细胞相关疾病的免疫细胞、制备方法及其应用
EP4284836A4 (en) * 2021-01-27 2025-01-01 H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Inc. Bi-specific car t cells for b cell malignancies
EP4284918A1 (en) 2021-01-29 2023-12-06 Allogene Therapeutics, Inc. Knockdown or knockout of one or more of tap2, nlrc5, beta2m, trac, rfx5, rfxap and rfxank to mitigate t cell recognition of allogeneic cell products
CN112778427B (zh) * 2021-01-29 2022-03-15 武汉思安医疗技术有限公司 双特异性cs1-bcma car-t细胞及其应用
MX2023009497A (es) 2021-02-15 2023-08-23 Takeda Pharmaceuticals Co Composiciones y metodos de terapia celular para modular la se?alizacion del factor de crecimiento transformador-beta (tgf-beta).
WO2022183160A1 (en) * 2021-02-25 2022-09-01 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Methods for treating cd83-expressing cancer
US20240108654A1 (en) 2021-03-03 2024-04-04 Juno Therapeutics, Inc. Combination of a t cell therapy and a dgk inhibitor
CN115109156B (zh) * 2021-03-22 2024-03-08 浙江纳米抗体技术中心有限公司 一种靶向bcma的纳米抗体及其应用
AU2022255709A1 (en) * 2021-04-06 2023-09-28 Teneobio, Inc. Anti-cd19 antibodies and car-t structures
EP4323387A4 (en) * 2021-04-13 2025-04-02 Wugen, Inc. ENHANCED CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS AND THEIR USES
JP2024516098A (ja) 2021-04-15 2024-04-12 チア タイ ティエンチン ファーマシューティカル グループ カンパニー リミテッド Ｂｃｍａを標的とする多重特異性抗体
CA3214280A1 (en) 2021-04-16 2022-10-20 Julie Ann RYTLEWSKI T cell therapy in patients who have had prior stem cell transplant
CN117337303A (zh) * 2021-04-16 2024-01-02 特尼奥生物股份有限公司 抗cd20抗体及car-t结构
AU2022258832A1 (en) 2021-04-16 2023-10-19 Celgene Corporation Combination therapies with bcma-directed t cell therapy
AU2022267891A1 (en) 2021-04-27 2023-11-09 Novartis Ag Viral vector production system
US20240218055A1 (en) 2021-04-29 2024-07-04 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Lassa virus-specific nanobodies and methods of their use
WO2022228579A1 (en) * 2021-04-30 2022-11-03 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Chimeric antigen receptors targeting gpc3 and methods of use thereof
KR20240018454A (ko) 2021-05-06 2024-02-13 주노 테라퓨틱스 게엠베하 T 세포의 자극 및 형질도입 방법
AR125827A1 (es) 2021-05-11 2023-08-16 Janssen Biotech Inc Métodos para minimizar la neurotoxicidad asociada a la terapia con células t del receptor de antígeno quimérico (car)
TW202309522A (zh) 2021-05-11 2023-03-01 美商健生生物科技公司 用於監測復發性及／或難治性多發性骨髓瘤之治療的方法及組成物
IL308637A (en) 2021-05-19 2024-01-01 Sana Biotechnology Inc Primary hypoimmunogenic T cells are RHD negative
WO2022246004A1 (en) * 2021-05-19 2022-11-24 Celledit Llc Bi-specific chimeric antigen receptors and genetically engineered immune cells expressing such
US20240226164A1 (en) 2021-05-27 2024-07-11 Sana Biotechnology, Inc. Hypoimmunogenic cells comprising engineered hla-e or hla-g
CA3216228A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Cross species single domain antibodies targeting pd-l1 for treating solid tumors
US20240316102A1 (en) 2021-07-01 2024-09-26 Indapta Therapeutics, Inc. Engineered natural killer (nk) cells and related methods
KR20240034234A (ko) 2021-07-14 2024-03-13 2세븐티 바이오, 인코포레이티드 항체로부터의 결합 도메인에 융합된 조작된 t 세포 수용체
AU2022309875A1 (en) 2021-07-14 2024-01-25 Sana Biotechnology, Inc. Altered expression of y chromosome-linked antigens in hypoimmunogenic cells
TW202321457A (zh) 2021-08-04 2023-06-01 美商薩那生物科技公司 靶向ｃｄ４之病毒載體之用途
WO2023019203A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Sana Biotechnology, Inc. Inducible systems for altering gene expression in hypoimmunogenic cells
AU2022326908A1 (en) * 2021-08-12 2024-03-28 Cellogen Therapeutics Pvt. Ltd. Chimeric antigen receptors (car) for b cell malignancies
CN113651893B (zh) * 2021-08-12 2023-08-01 上海生物制品研究所有限责任公司 联合her2和meso双靶点car-t载体及其构建方法和在癌症中的应用
WO2023021477A1 (en) 2021-08-20 2023-02-23 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor–expressing cells
US11970548B2 (en) * 2021-08-27 2024-04-30 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Nanobody target GCC and uses in chimeric antigen receptor cell therapy
US11359012B1 (en) 2021-08-27 2022-06-14 Nanjing Kaedi Biotherapeutics Ltd. Specific chimeric antigen receptor cells targeting human CLDN18A2, preparation method and application thereof
CN115894704B (zh) * 2021-09-24 2023-12-26 四川大学 一种特异性靶向肿瘤EpCAM抗原的抗体及应用
US20230235092A1 (en) * 2021-09-29 2023-07-27 Modex Therapeutics Antigen binding polypeptides, antigen binding polypeptide complexes and methods of use thereof
WO2023056555A1 (en) * 2021-10-07 2023-04-13 National Research Council Of Canada Anti-bcma single domain antibodies and therapeutic constructs
EP4419117A1 (en) 2021-10-22 2024-08-28 Sana Biotechnology, Inc. Methods of engineering allogeneic t cells with a transgene in a tcr locus and associated compositions and methods
WO2023076881A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting the s2 subunit of sars-cov-2 spike protein
CN119120424A (zh) 2021-11-02 2024-12-13 辉大(上海)生物科技有限公司 一种CRISPR-Cas12i系统
KR20240112994A (ko) 2021-11-03 2024-07-19 셀진 코포레이션 골수종을 치료하는 데 사용하기 위한 b-세포 성숙 항원에 특이적인 키메라 항원 수용체
JP2024540304A (ja) 2021-11-03 2024-10-31 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｃｄ３８抗体による治療におけるコルチコステロイドの減少
WO2023077343A1 (en) 2021-11-04 2023-05-11 Janssen Biotech, Inc. Bcma-targeted car-t cell therapy for multiple myeloma
CN118510801A (zh) 2021-11-04 2024-08-16 詹森生物科技公司 用于多发性骨髓瘤的靶向bcma的car-t细胞疗法
JP2024540360A (ja) 2021-11-09 2024-10-31 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ グリピカン－３（ＧＰＣ３）を標的にするＩｇＧ４ヒンジ含有キメラ抗原受容体およびその使用
CN115466331B (zh) * 2021-11-18 2023-05-30 合源生物科技(天津)有限公司 靶向bcma的嵌合抗原受体及其应用
JP2025501461A (ja) * 2021-12-07 2025-01-22 イノベント バイオロジクス（スーチョウ）カンパニー，リミティド Ｂｃｍａに結合する抗体およびその使用
CN114195898B (zh) * 2021-12-13 2022-10-28 南京凯地医疗技术有限公司 人源化抗cd33的单域抗体及其构建体制备方法和应用
WO2023109257A1 (zh) * 2021-12-16 2023-06-22 浙江瑞加美生物科技有限公司 人源化的bcma抗体和bcma-car-t/bcma-car-dnt细胞
WO2023115041A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Sana Biotechnology, Inc. Modified paramyxoviridae attachment glycoproteins
EP4448549A2 (en) 2021-12-17 2024-10-23 Sana Biotechnology, Inc. Modified paramyxoviridae fusion glycoproteins
CN119072319A (zh) 2021-12-23 2024-12-03 萨那生物技术股份有限公司 用于治疗自身免疫性疾病的嵌合抗原受体(car)t细胞及相关方法
JP2025508298A (ja) * 2021-12-29 2025-03-26 ラトガース，ザ ステート ユニバーシティ オブ ニュー ジャージー シングルドメイン高親和性抗体及びその使用方法
EP4463135A2 (en) 2022-01-10 2024-11-20 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
CN119013393A (zh) 2022-01-28 2024-11-22 朱诺治疗学股份有限公司 制造细胞组合物的方法
WO2023150518A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Cd3-targeted lentiviral vectors and uses thereof
EP4473097A1 (en) 2022-02-02 2024-12-11 Sana Biotechnology, Inc. Methods of repeat dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
JP2025506171A (ja) 2022-02-15 2025-03-07 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ Ｇｐｃ２を標的とする、ｃｄ２８ヒンジおよび膜貫通含有キメラ抗原受容体、ならびにその使用
AU2023220128A1 (en) 2022-02-17 2024-08-22 Sana Biotechnology, Inc. Engineered cd47 proteins and uses thereof
CN118900698A (zh) 2022-02-28 2024-11-05 詹森生物科技公司 用于多发性骨髓瘤的靶向bcma的car-t细胞疗法
WO2023193015A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Sana Biotechnology, Inc. Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies
CN119546327A (zh) 2022-04-08 2025-02-28 再生元制药公司 多部分受体和信号传导复合物
CN114685664B (zh) * 2022-04-12 2023-10-20 内蒙古农业大学 抗人b淋巴细胞表面抗原cd20的单域抗体及其应用
US20250297282A1 (en) 2022-05-05 2025-09-25 Juno Therapeutics Gmbh Viral-binding protein and related reagents, articles, and methods of use
CN119212724A (zh) * 2022-05-09 2024-12-27 上海先博生物科技有限公司 工程化免疫效应细胞及其与CBL-b抑制剂联用的应用
US20250302954A1 (en) 2022-05-11 2025-10-02 Celgene Corporation Methods to overcome drug resistance by re-sensitizing cancer cells to treatment with a prior therapy via treatment with a t cell therapy
KR20250008774A (ko) 2022-05-11 2025-01-15 셀진 코포레이션 T 세포 요법 및 그의 생산과 관련된 방법 및 용도
WO2023230581A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Celgene Corporation Methods of manufacturing t cell therapies
US20250345432A1 (en) 2022-05-25 2025-11-13 Celgene Corporation Method for predicting response to a t cell therapy
KR20250021315A (ko) * 2022-05-27 2025-02-12 쑤저우 이뮤노포코 바이오테크놀로지 씨오., 엘티디 Cldn18.2 단일 도메인 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이의 응용
EP4536710A1 (en) * 2022-06-13 2025-04-16 The Regents of the University of California Humanized antibodies to human integrin avb8
US12297285B2 (en) * 2022-06-24 2025-05-13 Orna Therapeutics, Inc. Circular RNA encoding chimeric antigen receptors targeting BCMA
CN114805582B (zh) * 2022-06-29 2022-10-04 上海恒润达生生物科技股份有限公司 抗Trop2纳米抗体及其用途
CA3259982A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Indapta Therapeutics, Inc. COMBINATION OF MODIFIED NATURAL KILLER (NK) CELLS AND ANTIBODY THERAPY AND ASSOCIATED METHODS
WO2024026377A1 (en) 2022-07-27 2024-02-01 Sana Biotechnology, Inc. Methods of transduction using a viral vector and inhibitors of antiviral restriction factors
CN119654406A (zh) 2022-07-29 2025-03-18 艾洛基治疗公司 具有降低的基因表达以减轻免疫细胞识别的经工程化的细胞
WO2024026455A2 (en) * 2022-07-29 2024-02-01 Shoreline Biosciences, Inc. Methods and compositions for generating chimeric antigen receptor-monocytes/macrophages
KR20250047766A (ko) 2022-08-05 2025-04-04 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 Gprc5d 및 bcma에 특이적인 키메라 항원 수용체
WO2024041650A1 (en) * 2022-08-25 2024-02-29 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Chimeric antigen receptors targeting interleukin 13 receptor subunit alpha 2 and methods of use thereof
US20260070960A1 (en) 2022-09-01 2026-03-12 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting hpv e6/e7 oncogenic peptide/mhc complexes
CN116023495B (zh) * 2022-09-05 2023-10-03 上海百英生物科技股份有限公司 一种抗cd40纳米抗体及其制备方法与应用
EP4583876A1 (en) 2022-09-08 2025-07-16 Juno Therapeutics, Inc. Combination of a t cell therapy and continuous or intermittent dgk inhibitor dosing
WO2024064838A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Sana Biotechnology, Inc. Lipid particles comprising variant paramyxovirus attachment glycoproteins and uses thereof
CN115925947B (zh) * 2022-09-27 2023-08-22 上海百英生物科技股份有限公司 一种亲和力成熟方法及抗人pd-l1单域抗体的亲和力成熟
EP4598949A1 (en) 2022-10-07 2025-08-13 The General Hospital Corporation Methods and compositions for high-throughput discovery of peptide-mhc targeting binding proteins
EP4602174A1 (en) 2022-10-13 2025-08-20 Sana Biotechnology, Inc. Viral particles targeting hematopoietic stem cells
WO2024089639A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Novartis Ag Lentiviral formulations
CN116120465B (zh) * 2022-11-01 2023-10-13 邦恩泰(山东)生物医药科技集团股份有限公司 一种靶向bcma和/或fcrh5的嵌合抗原受体及其应用
TW202430551A (zh) * 2022-11-02 2024-08-01 美商傳奇生物科技美國公司 多發性骨髓瘤之bcma靶向car-t細胞療法
EP4611798A1 (en) 2022-11-02 2025-09-10 Celgene Corporation Methods of treatment with t cell therapy and immunomodulatory agent maintenance therapy
CR20250218A (es) * 2022-11-04 2025-08-13 Dana Farber Cancer Inst Inc Vehículos solo VH de BCMA
EP4615960A1 (en) 2022-11-09 2025-09-17 C3S2 GmbH Methods for manufacturing engineered immune cells
WO2024119157A1 (en) 2022-12-02 2024-06-06 Sana Biotechnology, Inc. Lipid particles with cofusogens and methods of producing and using the same
EP4630446A1 (en) 2022-12-06 2025-10-15 Dynamic Cell Therapies, Inc. Engineered switches for immune cell activity and methods of use thereof
CN117069842B (zh) * 2022-12-06 2024-03-29 成都赛恩吉诺生物科技有限公司 具有特定等电点的抗人bcma纳米抗体及car-t和应用
WO2024123836A1 (en) 2022-12-06 2024-06-13 Dynamic Cell Therapies, Inc. Immune-activating complexes
WO2024124044A1 (en) 2022-12-07 2024-06-13 The Brigham And Women’S Hospital, Inc. Compositions and methods targeting sat1 for enhancing anti¬ tumor immunity during tumor progression
JP2026501122A (ja) 2022-12-09 2026-01-14 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド ホログラフィックイメージングを使用して細胞表現型を予測するための機械学習方法
KR20240094169A (ko) * 2022-12-13 2024-06-25 진셀비티 주식회사 B-세포 성숙 항원을 표적화하는 신규한 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
CN115947853B (zh) * 2022-12-26 2024-06-28 河北森朗生物科技有限公司 靶向bcma的纳米抗体、嵌合抗原受体及其应用
CN121002052A (zh) 2023-02-03 2025-11-21 C3S2 有限公司 用于非病毒生产工程化免疫细胞的方法
WO2024168192A1 (en) 2023-02-10 2024-08-15 Celgene Corporation Assessment of bcma in biological samples
KR20250153811A (ko) 2023-02-22 2025-10-27 아스트라제네카 아베 B 세포 성숙 항원(bcma)에 대한 키메라 항원 수용체를 사용하여 질병을 치료하는 조성물 및 방법
CN116199781B (zh) * 2023-02-22 2025-07-18 成都优赛诺生物科技有限公司 一种靶向cd22的单域抗体、嵌合抗原受体及其应用
WO2024206209A1 (en) * 2023-03-27 2024-10-03 Modernatx, Inc. Anti-cd38, anti-bcma, anti-gprc5d, and anti-fcrh5 antibodies and uses to treat various diseases such as cancer
AU2024244733B2 (en) 2023-03-31 2025-12-11 AbelZeta Inc. Bispecific chimeric antigen receptors targeting cd20 and bcma
CN116640229B (zh) * 2023-04-10 2024-01-30 中国人民解放军总医院第五医学中心 一种低pH靶向性CAR-T细胞的构建及应用
WO2024220598A2 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Sana Biotechnology, Inc. Lentiviral vectors with two or more genomes
EP4698666A1 (en) 2023-04-18 2026-02-25 Sana Biotechnology, Inc. Universal protein g fusogens and adapter systems thereof and related lipid particles and uses
EP4698665A1 (en) 2023-04-18 2026-02-25 Sana Biotechnology, Inc. Engineered protein g fusogens and related lipid particles and methods thereof
CA3205511A1 (en) * 2023-04-19 2025-03-17 Janssen Biotech, Inc. Bcma-targeted car-t cell therapy for multiple myeloma
WO2024238346A1 (en) 2023-05-12 2024-11-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies that specifically bind the s2 subunit of sars-cov-2 spike protein and compositions and uses thereof
WO2024243340A1 (en) 2023-05-23 2024-11-28 Sana Biotechnology, Inc. Tandem fusogens and related lipid particles
WO2024240248A1 (zh) * 2023-05-24 2024-11-28 茂行制药(苏州)有限公司 用于靶向b7h3的同种异体嵌合抗原受体t细胞的给药的方法和组合物
CN117986387A (zh) * 2023-05-31 2024-05-07 四川大学华西医院 一种新型小型化car设计及制备方法和应用
CN116574181A (zh) * 2023-05-31 2023-08-11 华道(上海)生物医药有限公司 一种抗Glypican 3抗体及其应用
CN121666232A (zh) 2023-05-31 2026-03-13 开普斯坦治疗公司 脂质纳米颗粒制剂和组合物
WO2025006799A1 (en) 2023-06-27 2025-01-02 Capstan Therapeutics, Inc. Extracorporeal and ex vivo engineering of select cell populations from peripheral blood
CN116789859B (zh) * 2023-06-29 2024-02-23 徐州医科大学 一种用于评价bcma靶向car-t细胞药效的靶细胞及其应用
CN116949099B (zh) * 2023-07-12 2024-04-02 山东大学第二医院 一种靶向cd38和cs1抗原的并联嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
WO2025019228A1 (en) 2023-07-20 2025-01-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Fully human monoclonal antibodies and chimeric antigen receptors against cd276 for the treatment of solid tumors
WO2025029930A1 (en) 2023-07-31 2025-02-06 Legend Biotech Ireland Limited Cells overexpressing cd31 and methods of use thereof
WO2025043172A1 (en) 2023-08-23 2025-02-27 Sana Biotechnology, Inc. Modified cd47 proteins and their uses
GR1010884B (el) * 2023-08-30 2025-02-19 Janssen Biotech, Inc., Θεραπεια τ κυτταρων με χιμαιρικο υποδοχεα αντιγονου (car) με στοχευμενο αντιγονο ωριμανσης των β κυτταρων (bcma) για πολλαπλο μυελωμα
WO2025054202A1 (en) 2023-09-05 2025-03-13 Sana Biotechnology, Inc. Method of screening a sample comprising a transgene with a unique barcode
WO2025059162A1 (en) 2023-09-11 2025-03-20 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Car-engager containing il-2 variants to enhance the functionality of car t cells
WO2025059533A1 (en) 2023-09-13 2025-03-20 The Broad Institute, Inc. Crispr enzymes and systems
CN117024594B (zh) * 2023-09-21 2025-02-28 武汉波睿达生物科技有限公司 一种抗cd20的纳米抗体及其应用
WO2025067472A1 (en) * 2023-09-27 2025-04-03 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Methods of culturing gamma delta t cells
WO2025076113A1 (en) 2023-10-05 2025-04-10 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids with conserved spacing and lipid nanoparticles
WO2025076127A1 (en) 2023-10-05 2025-04-10 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
US20250213690A1 (en) 2023-10-05 2025-07-03 Janssen Biotech, Inc. Methods in lentiviral manufacturing for production of car-t cell drug products
WO2025096560A1 (en) 2023-10-30 2025-05-08 Allogene Therapeutics, Inc. Engineered cells
WO2025097055A2 (en) 2023-11-02 2025-05-08 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods of use of t cells in immunotherapy
WO2025096878A1 (en) 2023-11-02 2025-05-08 Capstan Therapeutics, Inc. Rna for in vivo transfection with increased expression
WO2025098446A1 (zh) * 2023-11-07 2025-05-15 赛斯尔擎生物技术（上海）有限公司 抗bcma单域抗体及其应用
GB202317065D0 (en) 2023-11-07 2023-12-20 Coding Bio Ltd BCMA binding molecules
CN120025440A (zh) * 2023-11-21 2025-05-23 南京融捷康生物科技有限公司 一种抗Nkp46的单域抗体及其用途
WO2025117544A1 (en) 2023-11-29 2025-06-05 The Broad Institute, Inc. Engineered omega guide molecule and iscb compositions, systems, and methods of use thereof
US20250332281A2 (en) 2023-12-15 2025-10-30 Capstan Therapeutics, Inc. Humanized anti-cd8 antibodies and uses thereof
WO2025130984A1 (en) * 2023-12-20 2025-06-26 Overland Therapeutics (Us) Inc. Single domain antibodies for bcma
CN117821608A (zh) * 2023-12-28 2024-04-05 华道(上海)生物医药有限公司 一种检测car细胞的引物探针组合及其应用
WO2025151838A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Sana Biotechnology, Inc. Safety switches to control in vitro and in vivo proliferation of cell therapy products
KR102869233B1 (ko) * 2024-01-24 2025-10-15 주식회사 박셀바이오 Bcma 특이적 키메라 항원 수용체를 포함하는 신규한 골수 침윤 림프구 집단 및 이의 제조방법
US20250242018A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Combination immunosuppression for inhibiting an immune response and enabling immunogen administration and re-administration
TW202540428A (zh) 2024-01-26 2025-10-16 美商雷傑納榮製藥公司 使用漿細胞耗乏劑及／或ｂ細胞耗乏劑遏制宿主抗ａａｖ抗體反應且實現ａａｖ轉導及重複給藥的方法及組成物
US20250269024A1 (en) 2024-02-05 2025-08-28 Legend Biotech Usa Inc. Bcma-targeted car-t cell therapy for multiple myeloma
WO2025171388A1 (en) 2024-02-09 2025-08-14 Dispatch Biotherapeutics, Inc. Engineered cancer antigens with modified domains and related methods and uses
WO2025171383A2 (en) 2024-02-09 2025-08-14 Dispatch Biotherapeutics, Inc. Engineered cancer antigens and related methods and uses
WO2025179294A2 (en) 2024-02-22 2025-08-28 Capstan Therapeutics, Inc. Immune engineering amplification
US20250276092A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for re-dosing aav using anti-cd40 antagonistic antibody to suppress host anti-aav antibody response
WO2025184529A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Sana Biotechnology, Inc. Viral particles with fusogen display and related compositions and methods
US20250339527A1 (en) 2024-03-12 2025-11-06 Legend Biotech Usa Inc. Bcma-targeted car-t cell therapy for multiple myeloma
CN117866904B (zh) * 2024-03-12 2024-06-07 北京贝来药业有限公司 基于单域抗体基因修饰的干细胞对于多种的疾病的制药用途
CN117866903B (zh) * 2024-03-12 2024-06-04 北京贝来药业有限公司 单域抗体修饰的干细胞及其在疾病治疗中用途
WO2025217454A2 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025217452A1 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025221781A2 (en) 2024-04-15 2025-10-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting fgfr4 and/or cd276 and use thereof for the treatment of cancer
WO2025231408A2 (en) 2024-05-03 2025-11-06 Janssen Biotech, Inc. Methods for treating multiple myeloma with car-t cells and bispecific antibodies
WO2025231372A2 (en) 2024-05-03 2025-11-06 Janssen Biotech, Inc. Methods for treating multiple myeloma with car-t cells and bispecific antibodies
WO2025232812A1 (en) * 2024-05-08 2025-11-13 Shanghai Vitalgen Biopharma Co., Ltd. Biomolecule conjugated lipid nanoparticles
WO2025235598A1 (en) 2024-05-09 2025-11-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting glypican-2 and/or cd276 and their use for treating solid tumors
WO2025240496A1 (en) 2024-05-14 2025-11-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Natural killer cells expressing a mesothelin-targeted chimeric antigen receptor and interleukin-15 for the treatment of solid tumors
WO2025255266A1 (en) 2024-06-05 2025-12-11 Dynamic Cell Therapies, Inc. Engineered polypeptides for immune cell activation
WO2026006767A1 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Dispatch Biotherapeutics, Inc. Tethered il-9/il-9r and related engineered cells and methods
WO2026025092A1 (en) 2024-07-26 2026-01-29 Juno Therapeutics, Inc. Synthetic promoters for t cell expression
WO2026035951A2 (en) 2024-08-07 2026-02-12 Legend Biotech Ireland Limited Cells overexpressing cd43 and methods of use thereof
WO2026055226A1 (en) 2024-09-03 2026-03-12 Legend Biotech Ireland Limited Cells overexpressing b3gnt2 and methods of use thereof
CN120173114B (zh) * 2025-03-24 2025-09-26 广州泽朗生物医药科技有限公司 Cart细胞及其在制备抗癌症药物中的应用

Family Cites Families (201)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US30985A (en) 1860-12-18 Thomas l
FR901228A (fr) 1943-01-16 1945-07-20 Deutsche Edelstahlwerke Ag Système d'aimant à entrefer annulaire
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4657760A (en) 1979-03-20 1987-04-14 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods and compositions using monoclonal antibody to human T cells
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
DE68925971T2 (de) 1988-09-23 1996-09-05 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
FI903489A0 (fi) 1988-11-11 1990-07-10 Medical Res Council Ligander med en enda sektion, receptorer innehaollande naemnda ligander, foerfaranden foer deras framstaellning samt anvaendning av liganderna och receptorerna.
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
ES2087997T3 (es) 1990-01-12 1996-08-01 Cell Genesys Inc Generacion de anticuerpos xenogenicos.
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5508192A (en) 1990-11-09 1996-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides
US5264365A (en) 1990-11-09 1993-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Protease-deficient bacterial strains for production of proteolytically sensitive polypeptides
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
EP0604580A1 (en) 1991-09-19 1994-07-06 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab') 2? ANTIBODIES
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
DE69333807T2 (de) 1992-02-06 2006-02-02 Chiron Corp., Emeryville Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
EP1498427B1 (en) 1992-08-21 2009-12-16 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
EP1005870B1 (en) 1992-11-13 2009-01-21 Biogen Idec Inc. Therapeutic application of chimeric antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5639635A (en) 1994-11-03 1997-06-17 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6027888A (en) 1996-04-05 2000-02-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide-bond containing eukaryotic proteins in bacterial cells
AU740043B2 (en) 1996-06-27 2001-10-25 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Recognition molecules interacting specifically with the active site or cleft of a target molecule
EP2305027B1 (en) 1996-12-03 2014-07-02 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
US6083715A (en) 1997-06-09 2000-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells
ES2244066T3 (es) 1997-06-24 2005-12-01 Genentech, Inc. Procedimiento y composiciones de glicoproteinas galactosiladas.
EP1028751B1 (en) 1997-10-31 2008-12-31 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
AU760562B2 (en) 1997-12-05 2003-05-15 Scripps Research Institute, The Humanization of murine antibody
BR9907241A (pt) 1998-01-26 2000-10-17 Unilever Nv Biblioteca de expressão, processo para preparar a mesma, uso de uma fonte não imunizada de sequências de ácido nucleico, e, processos para preparar fragmentos de anticorpos e, para preparar um anticorpo
DE69937291T2 (de) 1998-04-02 2008-07-10 Genentech, Inc., South San Francisco Antikörpervarianten und fragmente davon
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ES2434961T5 (es) 1998-04-20 2018-01-18 Roche Glycart Ag Ingeniería de glicosilación de anticuerpos para mejorar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo
MXPA01005425A (es) 1998-12-01 2002-04-24 Genentech Inc Polipeptidos de transmembrana y secretados y acidos nucleicos que codifican los mismos.
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
WO2000043507A1 (en) 1999-01-19 2000-07-27 Unilever Plc Method for producing antibody fragments
EP1176195B1 (en) 1999-04-09 2013-05-22 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
EP1171596A1 (en) 1999-04-16 2002-01-16 Celltech Therapeutics Limited Synthetic transmembrane components
AU7950400A (en) 1999-10-19 2001-04-30 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Process for producing polypeptide
WO2001044463A1 (en) 1999-12-15 2001-06-21 Genentech, Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
EP1242438B1 (en) 1999-12-29 2006-11-08 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
AU4328801A (en) 2000-02-24 2001-09-03 Xcyte Therapies Inc Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
ES2637801T3 (es) 2000-04-11 2017-10-17 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
CA2380443C (en) 2000-05-26 2013-03-12 Ginette Dubuc Single-domain antigen-binding antibody fragments derived from llama antibodies
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
CN102311986B (zh) 2000-10-06 2015-08-19 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
JP3523245B1 (ja) 2000-11-30 2004-04-26 メダレックス，インコーポレーテッド ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物
GB0110029D0 (en) 2001-04-24 2001-06-13 Grosveld Frank Transgenic animal
US20060073141A1 (en) 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
RU2321630C2 (ru) 2001-08-03 2008-04-10 Гликарт Биотекнолоджи АГ Гликозилированные антитела (варианты), обладающие повышенной антителозависимой клеточной цитотоксичностью
AU2002319544B2 (en) 2001-08-10 2008-07-10 Aberdeen University Antigen binding domains from fish
EP1433793A4 (en) 2001-09-13 2006-01-25 Inst Antibodies Co Ltd METHOD FOR CREATING A CAMEL ANTIBODY LIBRARY
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
US20030157108A1 (en) 2001-10-25 2003-08-21 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
AU2002361784A1 (en) * 2001-12-20 2003-07-09 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to trail receptors
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US7745140B2 (en) 2002-01-03 2010-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool
CN102911987B (zh) 2002-04-09 2015-09-30 协和发酵麒麟株式会社 基因组被修饰的细胞
US20040132140A1 (en) 2002-04-09 2004-07-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
AU2003236018A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
US20050031613A1 (en) 2002-04-09 2005-02-10 Kazuyasu Nakamura Therapeutic agent for patients having human FcgammaRIIIa
JP4628679B2 (ja) 2002-04-09 2011-02-09 協和発酵キリン株式会社 Ｇｄｐ−フコースの輸送に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した細胞
WO2003084569A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Drug containing antibody composition
JP4753578B2 (ja) 2002-06-03 2011-08-24 ジェネンテック， インコーポレイテッド 合成抗体ファージライブラリー
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
GB0228210D0 (en) 2002-12-03 2003-01-08 Babraham Inst Single chain antibodies
ES2347241T3 (es) 2002-12-16 2010-10-27 Genentech, Inc. Variantes de inmunoglobulina y sus utilizaciones.
US20050079574A1 (en) 2003-01-16 2005-04-14 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
US20070134759A1 (en) 2003-10-09 2007-06-14 Harue Nishiya Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
ES2672640T3 (es) 2003-11-05 2018-06-15 Roche Glycart Ag Moléculas de unión a antígeno con afinidad de unión a receptores Fc y función efectora incrementadas
CN107213469A (zh) 2003-11-06 2017-09-29 西雅图基因公司 能够与配体偶联的单甲基缬氨酸化合物
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
RU2386638C2 (ru) 2004-03-31 2010-04-20 Дженентек, Инк. Гуманизированные анти-тфр-бета-антитела
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
CN1942483B (zh) 2004-04-13 2012-09-26 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗p型选凝素抗体
WO2005118788A2 (en) 2004-05-27 2005-12-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
EP4353819A3 (en) 2004-07-22 2024-07-17 Erasmus University Medical Center Rotterdam Binding molecules
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
US7563443B2 (en) 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
KR101270829B1 (ko) 2004-09-23 2013-06-07 제넨테크, 인크. 시스테인 유전자조작 항체 및 접합체
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
EP1973951A2 (en) 2005-12-02 2008-10-01 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
TWI404727B (zh) 2006-01-25 2013-08-11 荷蘭鹿特丹Ｅｒａｓｍｕｓ大學醫學中心 對偶基因排除
WO2007134050A2 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
US20100166734A1 (en) 2006-12-20 2010-07-01 Edward Dolk Oral delivery of polypeptides
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
NZ599497A (en) * 2007-06-12 2013-11-29 Ac Immune Sa Humanized antibodies to amyloid beta
CN101970490A (zh) 2007-11-27 2011-02-09 埃博灵克斯股份有限公司 针对异二聚体细胞因子和/或其受体的氨基酸序列以及包括所述氨基酸序列的多肽
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
CN101550416B (zh) * 2008-03-18 2012-01-25 陈志南 人源化单抗Hu-ScFv18的轻、重链可变区基因和其编码多肽及其应用
US20100122358A1 (en) 2008-06-06 2010-05-13 Crescendo Biologics Limited H-Chain-only antibodies
WO2011072204A1 (en) 2009-12-10 2011-06-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice that make heavy chain antibodies
EP3613774A1 (en) * 2010-06-09 2020-02-26 Genmab A/S Antibodies against human cd38
EP3252072A3 (en) 2010-08-03 2018-03-14 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP2640750A1 (en) 2010-11-16 2013-09-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
RU2656156C2 (ru) 2011-10-17 2018-05-31 Массачусетс Инститьют Оф Текнолоджи Внутриклеточная доставка
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
EP2814846B1 (en) 2012-02-13 2020-01-08 Seattle Children's Hospital d/b/a Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
AU2013222284A1 (en) * 2012-02-22 2014-08-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of the CD2 signaling domain in second-generation chimeric antigen receptors
EA201990959A1 (ru) 2012-04-11 2020-02-10 Дзе Юнайтед Стейтс Оф Америка, Эз Репрезентед Бай Дзе Секретари, Департмент Оф Хелс Энд Хьюман Сёрвисез Химерные антигенные рецепторы, нацеленные на антиген созревания b-клеток
SG11201408787PA (en) * 2012-07-13 2015-01-29 Univ Pennsylvania Enhancing activity of car t cells by co-introducing a bispecific antibody
AR092745A1 (es) * 2012-10-01 2015-04-29 Univ Pennsylvania Composiciones que comprenden un dominio de union anti-fap y metodos para hacer blanco en celulas estromales para el tratamiento del cancer
TW201425336A (zh) 2012-12-07 2014-07-01 Amgen Inc Ｂｃｍａ抗原結合蛋白質
US9243058B2 (en) * 2012-12-07 2016-01-26 Amgen, Inc. BCMA antigen binding proteins
ES2667420T3 (es) * 2013-02-05 2018-05-10 Engmab Sàrl Anticuerpos biespecíficos contra cd3epsilon y bcma
CN104045713B (zh) * 2013-03-13 2019-02-12 江苏诺迈博生物医药科技有限公司 一种抗Blys的单克隆抗体及含有该抗体的药物组合物
ES3058841T3 (en) 2013-03-15 2026-03-13 Novartis Ag Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
TWI654206B (zh) * 2013-03-16 2019-03-21 諾華公司 使用人類化抗－ｃｄ１９嵌合抗原受體治療癌症
EP3789487A1 (en) * 2013-04-03 2021-03-10 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Effective generation of tumor-targeted t-cells derived from pluripotent stem cells
CN103421115B (zh) 2013-09-02 2015-06-03 东南大学 一种cd38纳米抗体及应用
GB201317929D0 (en) 2013-10-10 2013-11-27 Ucl Business Plc Chimeric antigen receptor
US10189908B2 (en) 2014-02-05 2019-01-29 The University Of Chicago Chimeric antigen receptors recognizing cancer-specific TN glycopeptide variants
JP2017513818A (ja) * 2014-03-15 2017-06-01 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体を使用する癌の処置
EP3119425B1 (en) 2014-03-15 2020-09-23 Novartis AG Regulatable chimeric antigen receptor
SG10201808225TA (en) 2014-03-21 2018-10-30 Regeneron Pharma Non-human animals that make single domain binding proteins
AU2015248956B2 (en) 2014-04-14 2020-06-25 Cellectis BCMA (CD269) specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy
PL3689899T3 (pl) 2014-04-25 2022-01-31 2Seventy Bio, Inc. Chimeryczne receptory antygenowe promotora mnd
DK3151672T3 (da) 2014-06-06 2021-02-01 Bluebird Bio Inc Forbedrede t-celle-sammensætninger
US10174095B2 (en) 2014-07-21 2019-01-08 Novartis Ag Nucleic acid encoding a humanized anti-BCMA chimeric antigen receptor
MX2017001079A (es) 2014-07-24 2017-09-12 Bluebird Bio Inc Receptores de antígeno quiméricos de antígeno de maduración de células b (bcma).
SMT202400235T1 (it) 2014-08-04 2024-07-09 Hoffmann La Roche Molecole bispecifiche leganti l’antigene di attivazione delle cellule t
EP3029067A1 (en) 2014-12-01 2016-06-08 Deutsches Krebsforschungszentrum Use of blocking-reagents for reducing unspecific T cell-activation
US20180334490A1 (en) * 2014-12-03 2018-11-22 Qilong H. Wu Methods for b cell preconditioning in car therapy
SMT201900596T1 (it) 2014-12-12 2019-11-13 Bluebird Bio Inc Recettori chimerici di antigene per bcma
US10961509B2 (en) 2015-07-20 2021-03-30 Angiocrine Bioscience, Inc. Engineered endothelial cells expressing an ETS transcription factor
CN105384825B (zh) 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
CN105777911B (zh) 2016-04-12 2019-07-02 上海优卡迪生物医药科技有限公司 抗bcma嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建方法和应用
CN105837693A (zh) 2016-05-30 2016-08-10 李斯文 一种基于bcma的抗原嵌合受体及其制备方法和应用
CN108395481B (zh) 2017-02-08 2021-02-05 西比曼生物科技（香港）有限公司 一种靶向cd20的car的构建及其工程化t细胞的活性鉴定
US20200399343A1 (en) 2017-04-19 2020-12-24 Allogene Therapeutics, Inc. Improved t cell compositions and methods
WO2019000223A1 (en) * 2017-06-27 2019-01-03 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. ENABLERS OF IMMUNE EFFECTOR CELLS OF CHIMERIC ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
CN109306014B (zh) 2017-07-27 2022-04-12 上海细胞治疗研究院 一种靶向间皮素的嵌合抗原受体修饰t细胞及其用途
CN119019572A (zh) 2017-12-29 2024-11-26 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 增强的嵌合抗原受体及其用途
US20210023170A1 (en) 2018-02-12 2021-01-28 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Fviii chimeric antigen receptor tregs for tolerance induction in hemophilia a
US20230085615A2 (en) 2019-08-28 2023-03-16 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Engineered t cells and methods of producing thereof
EP4022091A1 (en) 2019-08-30 2022-07-06 Janssen Biotech, Inc. B-cell maturation complex car t construct and primers
EP4077398A4 (en) 2019-12-16 2024-04-10 Legend Biotech Ireland Limited SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AND CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS TARGETING BCMA AND METHODS OF USE THEREOF
JP2023516789A (ja) 2020-03-09 2023-04-20 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 組換えベクター核酸の統合を定量化するための組成物及び方法
JP2023522400A (ja) 2020-04-24 2023-05-30 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 手書きにおける変化を記述するための神経性毒性評価方法及びシステム
KR20230022964A (ko) 2020-06-08 2023-02-16 얀센 바이오테크 인코포레이티드 키메라 항원 발현 면역 세포의 시험관내 종양 살해 활성을 결정하기 위한 세포-기반 검정

Also Published As

Publication number Publication date
ES2984851T3 (es) 2024-10-31
SMT202400311T1 (it) 2024-11-15
SG10201913485QA (en) 2020-02-27
US20220127371A1 (en) 2022-04-28
EP4282877A2 (en) 2023-11-29
FR24C1050I1 (fr) 2025-01-17
IL264607A (en) 2019-02-28
EP3475307A1 (en) 2019-05-01
NZ791176A (en) 2025-09-26
SMT202300425T1 (it) 2024-01-10
FIC20240042I1 (fi) 2024-12-11
AU2021200453C1 (en) 2023-11-16
DK4063397T3 (da) 2024-07-22
MY188362A (en) 2021-12-03
AU2016305075A1 (en) 2018-03-08
ZA201800703B (en) 2018-12-19
UA126441C2 (uk) 2022-10-05
KR20240017408A (ko) 2024-02-07
LT3896091T (lt) 2023-12-27
US20210261675A1 (en) 2021-08-26
CA3019453C (en) 2023-04-04
CR20210042A (es) 2021-02-26
AU2021200453A1 (en) 2021-02-25
CN117756941A (zh) 2024-03-26
CN109153731B (zh) 2021-04-02
EP4282878A3 (en) 2024-03-06
EP4063397B1 (en) 2024-06-19
JP6859347B2 (ja) 2021-04-14
CN113234173B (zh) 2022-03-11
CN113185616A (zh) 2021-07-30
EA201990208A1 (ru) 2019-07-31
AU2020200151C1 (en) 2022-09-08
SI3896091T1 (sl) 2024-03-29
EP3896091A1 (en) 2021-10-20
EP3334765A4 (en) 2019-05-08
US20240409654A1 (en) 2024-12-12
US20200078399A1 (en) 2020-03-12
CL2018000378A1 (es) 2018-08-17
AU2017311089B2 (en) 2020-11-19
KR20230052294A (ko) 2023-04-19
MX2022015823A (es) 2023-01-24
FI3896091T3 (fi) 2023-12-04
US20210163615A1 (en) 2021-06-03
NZ750366A (en) 2022-10-28
CO2018001405A2 (es) 2018-11-22
EP4282877A3 (en) 2024-02-21
EP3334765A1 (en) 2018-06-20
CA2994579C (en) 2023-07-11
CA3189388A1 (en) 2018-02-15
US20180230225A1 (en) 2018-08-16
KR20190065999A (ko) 2019-06-12
AU2020200151B2 (en) 2022-03-17
NL301301I2 (nl) 2025-04-09
AU2022204180A1 (en) 2022-07-07
LT4063397T (lt) 2024-09-25
KR102512934B1 (ko) 2023-03-23
MY192392A (en) 2022-08-18
EP4424376A3 (en) 2024-12-04
CN113185615A (zh) 2021-07-30
EP4424376B1 (en) 2026-02-18
JP2025159117A (ja) 2025-10-17
PH12018500295B1 (en) 2023-08-11
CR20180153A (es) 2018-08-09
IL257297A (en) 2018-03-29
DK3334765T3 (da) 2026-03-16
EA201890302A1 (ru) 2018-10-31
SA518390904B1 (ar) 2023-02-22
US11186647B2 (en) 2021-11-30
JP6851461B2 (ja) 2021-03-31
CN113234174B (zh) 2024-01-09
AU2020200151A1 (en) 2020-01-30
PL4063397T3 (pl) 2024-11-18
AU2025271439A1 (en) 2026-01-08
CN109153731A (zh) 2019-01-04
FI4063397T3 (fi) 2024-08-09
CN113185616B (zh) 2024-03-01
EP3475307A4 (en) 2020-08-19
CL2021001706A1 (es) 2022-01-28
CA3019453A1 (en) 2018-02-15
CR20190050A (es) 2019-06-11
US11535677B2 (en) 2022-12-27
ZA201807836B (en) 2019-08-28
US10934363B2 (en) 2021-03-02
BR112018002844A2 (pt) 2019-04-30
JP7168173B2 (ja) 2022-11-09
EP3896091B1 (en) 2023-09-27
EP4282878A2 (en) 2023-11-29
CN113234173A (zh) 2021-08-10
CR20210225A (es) 2021-06-24
CO2019000946A2 (es) 2019-02-08
EP3334765B1 (en) 2026-02-11
DK3896091T3 (da) 2023-12-11
HRP20241057T1 (hr) 2024-11-08
HUE067869T2 (hu) 2024-11-28
NO2024054I1 (no) 2024-12-10
PT4063397T (pt) 2024-07-29
KR20250107971A (ko) 2025-07-14
RS65866B1 (sr) 2024-09-30
IL257297B (en) 2022-08-01
WO2017025038A1 (en) 2017-02-16
PT3896091T (pt) 2023-11-29
MX2024010239A (es) 2024-09-06
JP2021087455A (ja) 2021-06-10
KR20180035918A (ko) 2018-04-06
CN113234174A (zh) 2021-08-10
LTPA2024535I1 (sr) 2024-12-27
KR20240014108A (ko) 2024-01-31
CL2019000326A1 (es) 2019-10-04
CN118085090A (zh) 2024-05-28
CA2994579A1 (en) 2017-02-16
PH12018500295A1 (en) 2021-05-10
CN109311999A (zh) 2019-02-05
EP4424376A2 (en) 2024-09-04
JP2018525033A (ja) 2018-09-06
JP7696731B2 (ja) 2025-06-23
CN105384825B (zh) 2018-06-01
CL2021001686A1 (es) 2022-01-28
EP4063397A1 (en) 2022-09-28
KR20240173368A (ko) 2024-12-11
BR112019002687A2 (pt) 2019-05-14
MX2024010240A (es) 2024-09-11
MY199874A (en) 2023-11-27
HRP20231542T1 (hr) 2024-03-15
AU2017311089A1 (en) 2019-02-21
JP2021094037A (ja) 2021-06-24
HUS2400044I1 (hu) 2025-01-28
SA519401072B1 (ar) 2024-02-01
WO2018028647A1 (en) 2018-02-15
SI4063397T1 (sl) 2024-10-30
AU2021200453B2 (en) 2023-03-30
NZ778787A (en) 2025-05-02
JP2019527557A (ja) 2019-10-03
FR24C1050I2 (fr) 2025-12-05
JP2022183283A (ja) 2022-12-08
US12351638B2 (en) 2025-07-08
MX420844B (es) 2025-02-10
DK3896091T5 (da) 2024-08-05
JP2024032975A (ja) 2024-03-12
PL3896091T3 (pl) 2024-04-29
HUE064534T2 (hu) 2024-03-28
JP2025028239A (ja) 2025-02-28
MX2019001294A (es) 2019-04-25
UA125818C2 (uk) 2022-06-15
AU2016305075B2 (en) 2019-10-10
CN105384825A (zh) 2016-03-09
MX2018001739A (es) 2018-08-15
JP2023024810A (ja) 2023-02-16
IL294683A (en) 2022-09-01
SG11201900635QA (en) 2019-02-27
PH12019500193A1 (en) 2019-07-29
ES2966992T3 (es) 2024-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7696731B2 (ja) Ｂｃｍａを標的とするキメラ抗原受容体及びその使用方法
HK40102070A (en) Chimeric antigen receptors targeting bcma and methods of use thereof
HK40102069A (en) Chimeric antigen receptors targeting bcma and methods of use thereof
HK40064472B (en) Chimeric antigen receptors targeting bcma and methods of use thereof
HK40064472A (en) Chimeric antigen receptors targeting bcma and methods of use thereof
HK40103757A (zh) 靶向bcma的嵌合抗原受体及其使用方法
HK40078340B (en) Chimeric antigen receptors based on single-domain antibodies and methods of use thereof
BR112019002687B1 (pt) Receptores de antígeno quimérico que direcionam bcma, ácido nucleico isolado, vetor, célula efetora imune engenheirada e composição farmacêutica compreendendo a célula efetora imune engenheirada
EA047388B1 (ru) Химерные антигенные рецепторы, нацеленные на bcma, и способы их применения
BR122024003787A2 (pt) Receptores de antígeno quimérico que direcionam bcma e métodos de uso dos mesmos