JP2023514232A - Cd2活性化を伴うキメラ抗原受容体 - Google Patents
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Abstract
CD58-およびCD58low腫瘍細胞に対する機能を保持するCD2共刺激ドメインと、CD58-およびCD58low腫瘍細胞に対するCAR機能を促進するCD2共刺激受容体とを含む、キメラ抗原受容体が開示される。本開示の1つの態様は、N末端からC末端までの順に:第1の抗原結合性ドメイン;スペーサードメイン;膜貫通ドメイン;および細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)であり、ここで、細胞質シグナル伝達ドメインは、CD2シグナル伝達ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、およびCD3ζ活性化ドメインを含み、共刺激シグナル伝達ドメインはCD28シグナル伝達ドメインではない。
Description
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の下でなされた発明の権利に関する記載
本発明は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)によって付与された契約CA049605の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に関して一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)によって付与された契約CA049605の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に関して一定の権利を有する。
関連出願との相互参照
本出願は、あらゆる図を含め、それらの開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、2020年2月14日出願の米国仮特許出願第62/976,997号および2020年11月4日出願の同第63/109,831号の優先権を主張するものである。
本出願は、あらゆる図を含め、それらの開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、2020年2月14日出願の米国仮特許出願第62/976,997号および2020年11月4日出願の同第63/109,831号の優先権を主張するものである。
配列表の組込み
本出願は、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。「078430_514001WO_Sequence_Listing_ST25」という名称の添付の配列表テキストファイルは2021年2月12日に作成され、423KBである。
本出願は、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。「078430_514001WO_Sequence_Listing_ST25」という名称の添付の配列表テキストファイルは2021年2月12日に作成され、423KBである。
本開示の背景
従来の化学療法レジメンを受けた後に再燃した患者を含め、B細胞リンパ腫を有する患者に対して、免疫療法手法の極めて大きな臨床的有効性が示されている。治療抵抗性B細胞リンパ腫を有する患者111名に対する最近の第II相試験では、うち101名がCD19を標的とするCAR-T細胞(キメラ抗原受容体T細胞)治療の投与を受け、患者の40%が処置の15カ月後に疾患の完全寛解を示した(S.S. Neelapu et al., N Engl J Med (2017) 377: 2531-44)。別の試験でも同様の結果が観察され、それぞれびまん性大細胞型B細胞リンパ腫および濾胞性リンパ腫を有する患者の43%および71%に完全寛解が認められた(S.J. Schuster et al., N Engl J Med (2017) 377: 2545-54)。アキシカブタゲンシロロイセル(Axi-cel)を受けた患者のおよそ半分で完全奏効が実現され、患者のかなりの部分が疾患増悪を経験した(F.L. Locke et al., Lancet Oncol (2019) 20 (1): 31-42)。T細胞受容体(CD3)と、非自己抗原を提示するMHC(主要組織適合性抗原)タンパク質との結合によってT細胞が刺激される。T細胞応答は、4-1BBおよびCD28などの共刺激因子に起因して共刺激が生じた場合に大幅に改善される。しかし、Axi-celおよびチサゲンレクルユーセルはそれぞれ、CARに組み込まれる共刺激ドメイン(それぞれCD28および4-1BB)を有するが、それでもなお再燃および疾患増悪が起こり続ける。
従来の化学療法レジメンを受けた後に再燃した患者を含め、B細胞リンパ腫を有する患者に対して、免疫療法手法の極めて大きな臨床的有効性が示されている。治療抵抗性B細胞リンパ腫を有する患者111名に対する最近の第II相試験では、うち101名がCD19を標的とするCAR-T細胞(キメラ抗原受容体T細胞)治療の投与を受け、患者の40%が処置の15カ月後に疾患の完全寛解を示した(S.S. Neelapu et al., N Engl J Med (2017) 377: 2531-44)。別の試験でも同様の結果が観察され、それぞれびまん性大細胞型B細胞リンパ腫および濾胞性リンパ腫を有する患者の43%および71%に完全寛解が認められた(S.J. Schuster et al., N Engl J Med (2017) 377: 2545-54)。アキシカブタゲンシロロイセル(Axi-cel)を受けた患者のおよそ半分で完全奏効が実現され、患者のかなりの部分が疾患増悪を経験した(F.L. Locke et al., Lancet Oncol (2019) 20 (1): 31-42)。T細胞受容体(CD3)と、非自己抗原を提示するMHC(主要組織適合性抗原)タンパク質との結合によってT細胞が刺激される。T細胞応答は、4-1BBおよびCD28などの共刺激因子に起因して共刺激が生じた場合に大幅に改善される。しかし、Axi-celおよびチサゲンレクルユーセルはそれぞれ、CARに組み込まれる共刺激ドメイン(それぞれCD28および4-1BB)を有するが、それでもなお再燃および疾患増悪が起こり続ける。
疾患増悪の原因を同定する、および既存のCAR-T療法を使用して寛解を得ることができない患者を処置するという緊急の医学的必要性が存在する。
本開示で言及される全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたものと同じく参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において引用されているいかなる参考文献も先行技術を構成するものであるとは容認されない。参考文献の考察は、それらの著者らによる主張事項を記載するものであり、本発明者らは引用された文書の正確度および妥当性に異議を申し立てる権利を有する。多数の情報源(科学的学術論文、特許文書、および教本を含む)が本明細書で言及されるが、この参照文献は、これらの文書のいずれかが当技術分野における共通の一般的知見の一部を形成することの容認を構成するものではないことが理解されよう。
本開示の概要
CAR-T処置では再燃するまたはCAR-T処置に応答することができない患者のかなりの割合で、腫瘍組織における機能的CD58の低減または変更された発現が示される。これらの患者では、腫瘍細胞のCD58発現が低減しているかもしくは存在しない、または、CD58が、CD2に結合する能力が低下しているかもしくは存在しない変異形態で発現される。予想外に、既存のCAR-T剤は、それらの共刺激の一部を腫瘍細胞によるCD58の発現に依拠する。CAR-Tの、腫瘍により発現されるCD58への依存を克服し、CAR-T療法に対して活性および有効性を取り戻す保護方法および試薬が本発明で提供される。本開示の操作されたCAR-T細胞を使用して、対象におけるがん性細胞を、標的とされる細胞がCD58を正常なレベルで発現するのかそれとも低下したレベルで発現するのか、または変異形態もしくは不活性形態のCD58を発現するのか、またはいかなる形態のCD58も発現しないのか、にかかわらず、処置することができる。本開示の操作された細胞は、多くの場合、CAR構築物中にCD2共刺激ドメインを欠く他のCAR-T細胞よりも大きな活性を示す。
CAR-T処置では再燃するまたはCAR-T処置に応答することができない患者のかなりの割合で、腫瘍組織における機能的CD58の低減または変更された発現が示される。これらの患者では、腫瘍細胞のCD58発現が低減しているかもしくは存在しない、または、CD58が、CD2に結合する能力が低下しているかもしくは存在しない変異形態で発現される。予想外に、既存のCAR-T剤は、それらの共刺激の一部を腫瘍細胞によるCD58の発現に依拠する。CAR-Tの、腫瘍により発現されるCD58への依存を克服し、CAR-T療法に対して活性および有効性を取り戻す保護方法および試薬が本発明で提供される。本開示の操作されたCAR-T細胞を使用して、対象におけるがん性細胞を、標的とされる細胞がCD58を正常なレベルで発現するのかそれとも低下したレベルで発現するのか、または変異形態もしくは不活性形態のCD58を発現するのか、またはいかなる形態のCD58も発現しないのか、にかかわらず、処置することができる。本開示の操作された細胞は、多くの場合、CAR構築物中にCD2共刺激ドメインを欠く他のCAR-T細胞よりも大きな活性を示す。
本開示の1つの態様は、N末端からC末端までの順に:第1の抗原結合性ドメイン;スペーサードメイン;膜貫通ドメイン;および細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)であり、ここで、細胞質シグナル伝達ドメインは、CD2シグナル伝達ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、およびCD3ζ活性化ドメインを含み、共刺激シグナル伝達ドメインはCD28シグナル伝達ドメインではない。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、4-1BBシグナル伝達ドメイン、CD27シグナル伝達ドメイン、またはOX40シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、4-1BBシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、CARは、第2の抗原結合性ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、第1の抗原結合性ドメインと第2の抗原結合性ドメインは、異なる抗原に対して特異的である。一部の実施形態では、第1の抗原結合性ドメインと第2の抗原結合性ドメインは、同じ抗原の異なるエピトープに対して特異的である。
一部の実施形態では、スペーサードメインは、CD8αヒンジドメイン、CD28ヒンジドメイン、CTLA-4ヒンジドメイン、IgG1ヒンジドメイン、およびIgG4ヒンジドメインからなる群より選択される。一部の実施形態では、スペーサードメインは、CD28ヒンジドメインを含む。一部の実施形態では、スペーサードメインは、約10アミノ酸から約50アミノ酸までを有する合成ポリペプチドスペーサーである。一部の実施形態では、合成ポリペプチドスペーサーは、(GGS)n、(SGG)n、(GGGS)n、(SGGG)n、または(GGGGS)nであり、nは約1~約15である(配列番号87~91)。
一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、CD3ゼータ鎖(CD3ζ)、CD2、CD8α、CD28、CD40、CTLA4、OX40、PD-1、4-1BB(CD137)、FcERIγ、ICOS(CD278)、ILRB(CD122)、CTLA-4、およびPD-1、およびIL-2RG(CD132)の膜貫通ドメインの全部または一部からなる群より選択される。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、CD8α膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、CD28膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、CD3ζ膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、CARは、配列番号12~19のうちの1つの配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、または約100%同一のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、第1の抗原結合性ドメインは、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原に特異的に結合する。一部の実施形態では、第1の抗原結合性ドメインは、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原(CEA)、ベータ-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファ-フェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、mut HSP70-2、M-CSF、前立腺特異的抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、プロステイン(prostein)、PSMA、HER2、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、インスリン増殖因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受容体、GD2、GD3、B7-H3、GPC2、L1CAM、EGFR、メソテリン、MART-1、gp100(Pmel 17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15、CEA、p53、Ras、HER-2、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EBVA、ヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6およびE7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-カテニン、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-フェトプロテイン、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68/P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733/EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TAG72、TLP、TPS CD19、CD20、CD22、ROR1、ならびにGD2の群からの抗原に特異的に結合する。
本開示の別の態様は、CARおよび/またはTCRなどの免疫受容体を共刺激するためのキメラポリペプチドであって、ここで、CARは、第1の抗原に対して特異的な第1の抗原結合性ドメインを有し、TCRは、第2の抗原結合性ドメインを有し、キメラポリペプチドは、第3の抗原結合性ドメインを有し、ここで、キメラポリペプチドは、N末端からC末端までの順に:第1の抗原に対して特異的な第1の抗原結合性ドメイン、第2の抗原に対して特異的な第2の抗原結合性ドメイン、および第3の抗原に対して特異的な第3の抗原結合性ドメイン;スペーサードメイン;膜貫通ドメイン;および細胞質シグナル伝達ドメインを含み、ここで、細胞質シグナル伝達ドメインは、CD2シグナル伝達ドメインを含み、CD3ζ活性化ドメインを含まず、また、第2の抗原は、CD58ではない。一部の実施形態では、第1の抗原、第2の抗原、および第3の抗原は、互いに異なる。一部の実施形態では、第1の抗原、第2の抗原、および第3の抗原のうちの少なくとも2つが同じである。
一部の実施形態では、第2の抗原は、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原である。一部の実施形態では、第2の抗原は、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原(CEA)、ベータ-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファ-フェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、mut HSP70-2、M-CSF、前立腺特異的抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、プロステイン、PSMA、HER2、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、インスリン増殖因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受容体、GD2、GD3、B7-H3、GPC2、L1CAM、EGFR、メソテリン、MART-1、gp100(Pmel 17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15、p53、Ras、HER-2、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EBVA、ヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6およびE7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-カテニン、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-フェトプロテイン、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68/P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733/EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TAG72、TLP、TPS CD19、CD20、CD22、ROR1、ならびにGD2からなる群より選択される。一部の実施形態では、第2の抗原は、B7H3、BAFF-R、CD19、CD20、CD22、GD2、GD3、GPC2、IL13Rα2、およびROR1からなる群より選択される。
一部の実施形態では、第3の抗原は、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原である。一部の実施形態では、第3の抗原は、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原(CEA)、ベータ-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファ-フェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、mut HSP70-2、M-CSF、前立腺特異的抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、プロステイン、PSMA、HER2、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、インスリン増殖因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受容体、GD2、GD3、B7-H3、GPC2、L1CAM、EGFR、メソテリン、MART-1、gp100(Pmel 17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15、p53、Ras、HER-2、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EBVA、ヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6およびE7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-カテニン、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-フェトプロテイン、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68/P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733/EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TAG72、TLP、TPS CD19、CD20、CD22、ROR1、ならびにGD2からなる群より選択される。一部の実施形態では、第2の抗原は、B7H3、BAFF-R、CD19、CD20、CD22、GD2、GD3、GPC2、IL13Rα2、およびROR1からなる群より選択される。
一部の実施形態では、CD2シグナル伝達は、トランスジェニックT細胞受容体(TCR)で増強される。一部の実施形態では、トランスジェニックTCRは、第2の抗原に対して特異的な第2の抗原結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、トランスジェニックTCRは、膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、CD3ゼータ鎖(CD3ζ)、CD2、CD8α、CD28、CD40、CTLA4、OX40、PD-1、4-1BB(CD137)、FcERIγ、ICOS(CD278)、ILRB(CD122)、CTLA-4、およびPD-1、およびIL-2RG(CD132)の膜貫通ドメインの全部または一部からなる群より選択される。一部の実施形態では、トランスジェニックTCRは、細胞質シグナル伝達ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、トランスジェニックTCRの第2の抗原は、MHCクラスIまたはMHCクラスIIによって提示される腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原である。
一部の実施形態では、キメラポリペプチドは、細胞質シグナル伝達ドメインを有し、追加の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、追加の共刺激シグナル伝達ドメインは、4-1BBシグナル伝達ドメイン、CD27シグナル伝達ドメイン、CD28シグナル伝達ドメイン、またはOX40シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、追加の共刺激シグナル伝達ドメインは、4-1BBシグナル伝達ドメイン、CD27シグナル伝達ドメイン、またはOX40シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、追加の共刺激シグナル伝達ドメインは、4-1BBシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、追加の共刺激シグナル伝達ドメインは、toll様受容体シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、キメラポリペプチドは、配列番号20~29および92~112のうちの1つの配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、または約100%同一のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、CD8α、CD2、またはCD28に由来するものである。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、CD28膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、CD8α膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、CD2膜貫通ドメインである。
本開示の別の態様は、CAR、上記のキメラポリペプチド、および/またはTCRをコードする核酸である。一部の実施形態では、核酸は、配列番号41~58のうちの1つの配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、または約100%同一の配列を有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、核酸は、キメラポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、核酸は、配列番号49~58のうちの1つの配列と少なくとも約70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、または約100%同一の配列を有するポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、核酸は、キメラポリペプチド、CARおよび/またはTCRをコードする。一部の実施形態では、核酸は、配列番号72、74、76、78、82、84、または86のうちの1つの配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、または約100%同一の配列を有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、CARの抗原結合性ドメインとキメラポリペプチドの抗原結合性ドメインは、異なる抗原に対して特異的である。一部の実施形態では、CARの抗原結合性ドメインとキメラポリペプチドの抗原結合性ドメインは、同じ抗原に対して特異的である。一部の実施形態では、第1の結合性ドメインと第2の結合性ドメインは、同じ抗原の異なるエピトープに対して特異的である。一部の実施形態では、キメラポリペプチドをコードする核酸とCARをコードする核酸は、個々のプロモーターを有する。一部の実施形態では、キメラポリペプチドをコードする核酸とCARをコードする核酸は、リボソーム再進入部位(ribosomal re-entry site)によって隔てられている。一部の実施形態では、キメラポリペプチドとCARは単一のポリペプチドとしてコードされ、その場合、キメラポリペプチドとCARは自己切断性ペプチドによって隔てられている。一部の実施形態では、自己切断性ペプチドは2Aペプチドである。一部の実施形態では、CARの膜貫通ドメインとキメラポリペプチドの膜貫通ドメインは異なる。一部の実施形態では、核酸はDNAを含む。一部の実施形態では、核酸はRNAを含む。
本開示の別の態様は、プロモーターと作動可能に連結した上記の核酸のいずれかを含むベクターである。一部の実施形態では、ベクターはレンチウイルスベクターである。
本開示の別の態様は、本明細書に記載のCAR、キメラポリペプチド、および/もしくはTCR、核酸、ならびに/またはベクターを含む、操作された細胞である。一部の実施形態では、細胞は、本明細書に記載のCD2共刺激ドメインを有するCARを発現する。一部の実施形態では、細胞は、本明細書に記載のキメラポリペプチドを発現する。一部の実施形態では、細胞は、本明細書に記載のトランスジェニックTCRを発現する。
一部の実施形態では、細胞は、第1の抗原に対して特異的なCAR、および第2の抗原に対して特異的なキメラポリペプチド、および第3の抗原に対して特異的なTCRを発現する。一部の実施形態では、第1の抗原と第2の抗原は互いに異なる。一部の実施形態では、第1の抗原と第2の抗原は同じである。一部の実施形態では、第1の結合性ドメインと第2の結合性ドメインは、同じ抗原の異なるエピトープに対して特異的である。一部の実施形態では、CARの膜貫通ドメインは、キメラポリペプチドの膜貫通ドメインとは異なる。一部の実施形態では、第1の抗原、第2の抗原、および第3の抗原は、互いに異なる。一部の実施形態では、第1の抗原、第2の抗原、および第3の抗原のうちの少なくとも2つが同じである。
本開示の別の態様は、免疫細胞を提供するステップ、および免疫細胞に上記のキメラポリペプチドをコードする核酸を形質導入するステップにより、操作された細胞を作出するための方法である。一部の実施形態では、免疫細胞は、T細胞、NK細胞、NKT細胞、腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)、またはマクロファージである。一部の実施形態では、免疫細胞は、T細胞、NK細胞、NKT細胞、腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)、またはマクロファージの前駆細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞にCARをコードする核酸をさらに形質導入する。
本開示の別の態様は、免疫細胞を提供するステップ、ならびに、免疫細胞に、CARをコードする核酸ならびにキメラポリペプチドおよび/またはTCRをコードする核酸を形質導入して、第1の抗原を有する標的細胞に対して特異的なCARを有し、キメラポリペプチドをさらに含むCAR-T細胞を作製するステップにより、改善された機能的特徴を有するCAR-T細胞を作出するための方法であり、ここで、機能的特徴は、(i)CD58の発現をダウンレギュレートするかまたはCD58を実質的に発現しない標的細胞に対する有効性;(ii)選択された抗原をダウンレギュレートするかまたは選択された抗原の変異形態を発現する標的細胞に対する有効性;(iii)標的細胞に対する選択性の改善;または(iv)CAR標的抗原の喪失のレスキューである。一部の実施形態では、キメラポリペプチドは、標的細胞によって発現される抗原に対して特異的な抗原結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、トランスジェニックTCRは、標的細胞によって発現される抗原に対して特異的な抗原結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、喪失したCAR標的抗原は、CD19である。
本開示の別の態様は、CD2共刺激ドメインおよび少なくとも1つの追加の共刺激ドメインを有するCARを発現する、またはCAR、キメラポリペプチド、および/もしくはTCRを発現する操作された細胞を提供するステップ、ならびに、治療有効数の操作された細胞を投与するステップであって、操作された細胞により、対象の処置が補助される、ステップにより、少なくとも第1の抗原を有する標的細胞の増殖を特徴とする過剰増殖性障害を有する対象の処置を補助するための方法である。一部の実施形態では、CARは、CD2共刺激ドメインに加えて少なくとも2つの共刺激ドメインを有する、または、CARは、少なくとも2つの共刺激ドメインを有し、キメラポリペプチドと共に発現される。一部の実施形態では、方法は、標的細胞による機能的なCD58発現の程度を決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、操作された細胞を投与する前に標的細胞によるCD58発現の決定を提供するステップ、ならびにCD58発現の決定により、標的細胞が変異CD58を発現するかまたはCD58を閾値レベルを下回るレベルで発現することが示された場合、治療有効数の操作された細胞を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、閾値レベルは、標的細胞当たり約50,000、45,000、40,000、35,000、30,000、25,000、20,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000、10,000、9,000、8,000、7,000、6,000、5,000、4,000、3,000、2,000、1,000、または500のCD58分子である。一部の実施形態では、方法において、抗体またはその抗原結合性断片をさらに提供する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、標的細胞の微小環境におけるCD2シグナル伝達を刺激することが可能なものである。一部の実施形態では、抗体は、多重特異性抗体である。一部の実施形態では、多重特異性抗体は、抗腫瘍抗原、CD2、および/またはCD3に対して特異的である。一部の実施形態では、抗体結合性断片は、scFv、scFv-Fc、Fab、Fab’、(Fab)2、(Fab’)2、ミニボディ(minibody)、ダイアボディ(diabody)、トリアボディ(triabody)、およびdAbからなる群より選択される。一部の実施形態では、抗体結合性断片は、抗腫瘍抗原、CD2、および/またはCD3に対して特異的である。一部の実施形態では、方法において、標的細胞の微小環境において発現される腫瘍特異的抗原に応答してネイティブCD2と架橋結合することが可能な治療剤をさらに提供する。一部の実施形態では、治療剤は、分泌されるかまたは細胞表面に発現される。一部の実施形態では、治療剤は、抗CD2 scFv、抗体、Fab、DARPIN、リガンド、または抗原結合性ドメインである。
本開示の別の態様は、少なくとも第1の抗原を有する標的細胞の増殖を特徴とする過剰増殖性障害を有する対象の処置を補助するためのシステムであり、ここで、システムは、第1の抗原に対して特異的なCAR、およびCD58に対して特異的な標識された結合性作用物質を有する本開示の操作された細胞を含む。一部の実施形態では、CARは、細胞質シグナル伝達ドメインを含み、ここで、細胞質シグナル伝達ドメインは、4-1BBシグナル伝達ドメイン、CD2シグナル伝達ドメイン、およびCD3ζ活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、CARは、細胞質シグナル伝達ドメインを含み、ここで、細胞質シグナル伝達ドメインは、共シグナル伝達ドメインおよびCD3ζ活性化ドメインを含み、また、操作された細胞は、本開示のキメラポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、標識された結合性作用物質は、抗CD58抗体または抗体誘導体を含む。一部の実施形態では、操作された細胞は、本明細書に記載のトランスジェニックTCRをさらに含む。
本開示の別の態様は、少なくとも第1の抗原を有する標的細胞の増殖を特徴とする過剰増殖性障害を有する対象の処置を補助するための方法であり、ここで、標的細胞は、低下したレベルのCD58を発現し、かつ/またはCD2を活性化する能力が低下した形態のCD58を発現し、方法は、操作された細胞を提供するステップであって、操作された細胞が、第1の抗原に特異的に結合することが可能な第1の抗原結合性ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインであって、CD2シグナル伝達ドメインおよびCD3ζ活性化ドメインを含む、細胞質シグナル伝達ドメイン、を含むCARを発現する、ステップ;対象から得られた試料における機能的CD58の発現レベルを決定するステップであって、試料が、腫瘍細胞を含有する、ステップ;ならびに、機能的CD58の発現レベルが、所定の閾値レベルよりも低い場合、治療有効数の操作された細胞を投与するステップ、によるものである。一部の実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインは、追加の共刺激ドメインを含む。一部の実施形態では、追加の共刺激ドメインは、4-1BBシグナル伝達ドメイン、CD27シグナル伝達ドメイン、CD28シグナル伝達ドメイン、またはOX40シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、追加のシグナル伝達ドメインは、4-1BBシグナル伝達ドメイン、CD27シグナル伝達ドメイン、またはOX40シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、追加の共刺激ドメインは、4-1BBシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、閾値レベルは、標的細胞当たり約50,000、45,000、40,000、35,000、30,000、25,000、20,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000、10,000、9,000、8,000、7,000、6,000、5,000、4,000、3,000、2,000、1,000、または500の機能的CD58分子である。
本開示の別の態様は、本開示の核酸、本開示のベクター、および/または本開示の操作された細胞;ならびに薬学的に許容される担体を含む治療用組成物である。
本開示の別の態様は、ヒトにおける疾患を処置するための、CD2共刺激シグナル伝達ドメインを有するCAR、本開示のキメラポリペプチド、本開示のトランスジェニックTCR、本開示の核酸、本開示のベクター、本開示の操作された細胞、および/または本開示の医薬組成物の使用である。一部の実施形態では、疾患は、過剰増殖性障害である。一部の実施形態では、疾患は、がんである。
本開示の別の態様は、疾患を処置するための医薬の製造のための、CD2共刺激シグナル伝達ドメインを有するCAR、本開示のキメラポリペプチド、本開示の核酸、本開示のベクター、本開示の操作された細胞、および/または本開示の医薬組成物の使用である。
本開示の別の態様は、(i)CD2シグナル伝達ドメインを含むがCD3-ゼータドメインを含まない細胞質シグナル伝達ドメインと、(ii)抗原結合性ドメインまたは(iii)膜貫通ドメインのうちの少なくとも1つとを含むキメラシグナル伝達分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸である。一部の実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、共刺激ドメインは、4-1BBシグナル伝達ドメイン、CD27シグナル伝達ドメイン、OX40シグナル伝達ドメイン、CD28シグナル伝達ドメイン、CD278シグナル伝達ドメイン、CD40シグナル伝達ドメイン、CD40Lシグナル伝達ドメイン、toll様受容体シグナル伝達ドメイン、またはこれらの任意の組合せのうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも80%相同なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞質ドメインは、配列番号8からなる。一部の実施形態では、キメラシグナル伝達分子は、配列番号20~29および92~112からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約80%相同なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、キメラシグナル伝達分子をコードするポリヌクレオチドを含み得、ここで、キメラシグナル伝達分子は、(ii)抗原結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、抗体またはその抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、scFv、sdAb、Fab、二重特異性抗体またはその抗原結合性断片、三重特異性抗体またはその抗原結合性断片、二重特異性ダイアボディ、三重特異性トリアボディ、scFv-Fc、ミニボディ、VhHドメイン、hcIgGドメイン、V-NARドメイン、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、B細胞表面抗原に対して特異的である。一部の実施形態では、B細胞表面抗原は、HLA-DR、CD20、CD32b、CD37、CD38、CD52、CD81、CD79A、CD79B、CD138、CSI、GPRC5D、BAFF受容体、APRIL、BCMA、およびTACIからなる群より選択される。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、腫瘍関連抗原に対して特異的である。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、HLA-DR、CD20、CD32b、CD37、CD38、CD52、CD81、CD79A、CD79B、CD138、CSI、GPRC5D、BAFF受容体、APRIL、BCMA、TACI、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原(CEA)、ベータ-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファ-フェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、mut HSP70-2、M-CSF、前立腺特異的抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、プロステイン、PSMA、HER2、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、インスリン増殖因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受容体、GD2、GD3、B7-H3、GPC2、L1CAM、EGFR、メソテリン、MART-1、gp100(Pmel 17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15、p53、Ras、HER-2、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EBVA、ヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6およびE7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-カテニン、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-フェトプロテイン、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68/P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733/EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TAG72、TLP、TPS CD19、CD20、CD22、ROR1、ならびにGD2からなる群より選択される。一部の実施形態では、核酸は、キメラシグナル伝達分子をコードするポリヌクレオチドを含み、ここで、キメラシグナル伝達分子は、(iii)膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、CD3ζ、CD2、CD8α、CD28、CD40、CTLA4、OX40、PD-1、4-1BB(CD137)、FcERIγ、ICOS(CD278)、ILRB(CD122)、および」IL-2RG(CD132)の膜貫通ドメインの全てまたはこれらのうちの一部からなる群より選択される。
本開示の別の態様は、配列番号20~29および92~112からなる群より選択される配列と少なくとも約80%相同な配列を含むキメラシグナル伝達分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸である。
本開示の別の態様は、請求項1から14までのいずれか一項に記載のキメラシグナル伝達分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、追加のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸をさらに含む核酸組成物である。一部の実施形態では、追加のポリペプチドは、キメラ抗原受容体(CAR)、T細胞受容体(TCR)、またはTCR-CARを含む。一部の実施形態では、CARは、第1世代CAR、第2世代CAR、または第3世代CARを含む。一部の実施形態では、追加のポリペプチドは、CD3-ゼータドメインを含むCARを含む。一部の実施形態では、追加のポリペプチドは、抗原結合性ドメインを含むCARを含む。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、抗体またはその抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、scFv、sdAb、Fab、二重特異性抗体またはその抗原結合性断片、三重特異性抗体またはその抗原結合性断片、二重特異性ダイアボディ、三重特異性トリアボディ、scFv-Fc、ミニボディ、VhHドメイン、hcIgGドメイン、V-NARドメイン、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、B細胞表面抗原に対して特異的である。一部の実施形態では、B細胞表面抗原は、HLA-DR、CD20、CD32b、CD37、CD38、CD52、CD81、CD79A、CD79B、CD138、CSI、GPRC5D、BAFF受容体、APRIL、BCMA、およびTACIからなる群より選択される。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、腫瘍関連抗原に対して特異的である。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原(CEA)、ベータ-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファ-フェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、mut HSP70-2、M-CSF、前立腺特異的抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、プロステイン、PSMA、HER2、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、インスリン増殖因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受容体、GD2、GD3、B7-H3、GPC2、L1CAM、EGFR、メソテリン、MART-1、gp100(Pmel 17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15、p53、Ras、HER-2、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EBVA、ヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6およびE7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-カテニン、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-フェトプロテイン、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68/P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733/EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TAG72、TLP、TPS CD19、CD20、CD22、ROR1、ならびにGD2からなる群より選択される。一部の実施形態では、追加のポリペプチドは、共刺激ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、共刺激ドメインは、4-1BBシグナル伝達ドメイン、CD27シグナル伝達ドメイン、OX40シグナル伝達ドメイン、CD28シグナル伝達ドメイン、CD278シグナル伝達ドメイン、CD40シグナル伝達ドメイン、CD40Lシグナル伝達ドメイン、toll様受容体シグナル伝達ドメイン、またはこれらの任意の組合せのうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、追加のポリペプチドは、膜貫通ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、CD3ζ、CD2、CD8α、CD28、CD40、CTLA4、OX40、PD-1、4-1BB(CD137)、FcERIγ、ICOS(CD278)、ILRB(CD122)、およびIL-2RG(CD132)の膜貫通ドメインの全部または一部からなる群より選択される。
本開示の別の態様は、本明細書に提示される核酸または本明細書に提示される核酸組成物を含むベクターである。
本開示の別の態様は、本明細書に提示されるベクターを含む細胞である。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、幹細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞、またはヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は、自己または同種のものである。一部の実施形態では、細胞は、T細胞、CD8陽性T細胞、CD4陽性T細胞、調節性T細胞、細胞傷害性T細胞、または腫瘍浸潤性リンパ球である。
本開示の別の態様は、過剰増殖性障害を有する対象を処置する方法であって、対象に本明細書に記載の細胞を治療有効数で含む組成物を投与するステップを含む、方法である。本開示の別の態様は、(i)CD58の発現を欠く;(ii)低下したレベルのCD58を発現する;または(iii)CD2を活性化する能力が低下した形態のCD58を発現する標的細胞の増殖を特徴とする過剰増殖性障害を有する対象を処置する方法であって、対象に本明細書に記載の細胞を治療有効数で含む組成物を投与するステップを含む、方法である。
本開示の別の態様は、i)抗原結合性ドメイン;ii)膜貫通ドメイン;iii)CD2シグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラポリペプチドであり、ここで、抗原結合性ドメインは、配列番号1、2、3、および4からなる群より選択される配列と少なくとも約80%相同なアミノ酸配列を含み、膜貫通ドメインは、配列番号5、6、および7からなる群より選択される配列と少なくとも約80%相同なアミノ酸配列を含み、CD2シグナル伝達ドメインは、配列番号8の配列と少なくとも約80%相同なアミノ酸配列を含み、共刺激ドメインは、配列番号10および11からなる群より選択される配列と少なくとも約80%相同なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインは、CD3-ゼータ活性化ドメインを含まない。一部の実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインは、活性化ドメインを含み、ここで、活性化ドメインは、配列番号9の配列と少なくとも約80%相同なアミノ酸配列を含む。
本開示の詳細な説明
CD58(LFA-3)は、リンパ芽球様細胞(F. Sanchez-Madrid et al., Proc Natl Acad Sci USA (1982) 79: 7489-93)、B細胞、T細胞、単球、顆粒球、血小板、血管内皮、血管平滑筋、赤血球、および線維芽細胞(A.M. Krensky et al., J Immunol (1983) 131 (2): 611-16)などの抗原提示細胞に主に見いだされる細胞接着タンパク質である。CD58の喪失または変異はDLBCLにおける好ましくない予後因子であることが示唆されている(T. Menter et al., Front Oncol (2018) 8: 54)。
CD58(LFA-3)は、リンパ芽球様細胞(F. Sanchez-Madrid et al., Proc Natl Acad Sci USA (1982) 79: 7489-93)、B細胞、T細胞、単球、顆粒球、血小板、血管内皮、血管平滑筋、赤血球、および線維芽細胞(A.M. Krensky et al., J Immunol (1983) 131 (2): 611-16)などの抗原提示細胞に主に見いだされる細胞接着タンパク質である。CD58の喪失または変異はDLBCLにおける好ましくない予後因子であることが示唆されている(T. Menter et al., Front Oncol (2018) 8: 54)。
CD2(LFA-2)は、T細胞およびナチュラルキラー細胞に見いだされる細胞接着タンパク質である。CD2は、CD58がライゲーションすると、T細胞における共刺激物質として作用し(P. Selvaraj et al., Nature (1987) 326: 400-03; T.A. Springer, Nature (1990) 346: 425-34)、それにより、サイトカイン産生が増大し(B.E. Bierer et al., J Exp Med (1988) 168: 1145-56)、またアネルギーを逆転させる(V.A. Boussiotis et al., J Exp Med (1994) 180: 1665-73)。
本明細書に記載の通り、本開示は、DLBCLなどのリンパ腫および他のB細胞過剰増殖性障害の処置においてCAR-T療法が失敗する場合の理由の1つが、腫瘍細胞上のCD58の喪失、低減、または変異であることを示す。予想外に、そのような療法に使用される現行のCAR-T細胞は、患者由来のCAR-T細胞上に存在する内在性CD2を活性化するために腫瘍細胞のCD58発現に一部依拠する。CD58-CD2シグナル伝達の非存在下では、CAR-T細胞により産生されるIL-2およびIFNγの分量が減少し、その結果、同時に活性および有効性が低下する。
本開示は、一般に、CAR-Tの、腫瘍により発現されるCD58への依存を低減または排除するための方法;CD2シグナル伝達を有効に組み入れるCAR;トランス-CD2シグナル伝達キメラタンパク質によるCARの共刺激;およびそのためのシステムに関する。
A.定義
単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈によりそうでないことが明確に規定されない限り、複数の参照対象を含む。例えば、「1つの細胞(a cell)」という用語は、1つまたは複数の細胞を包含し、それらの混合物も包含される。「Aおよび/またはB」は、本明細書では、以下の選択肢:「A」、「B」、「AまたはB」、ならびに「AおよびB」が包含されるように使用される。
単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈によりそうでないことが明確に規定されない限り、複数の参照対象を含む。例えば、「1つの細胞(a cell)」という用語は、1つまたは複数の細胞を包含し、それらの混合物も包含される。「Aおよび/またはB」は、本明細書では、以下の選択肢:「A」、「B」、「AまたはB」、ならびに「AおよびB」が包含されるように使用される。
値の範囲が提示されている場合、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、下限の単位の10分の1までの間に入る値のそれぞれ、その範囲の上限と下限の間、および任意の他の明記されたまたはその明記された範囲の間に入る値が本開示に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限と下限は、そのより小さな範囲に独立に含まれ、また、明記された範囲のあらゆる具体的に除外された限度に従って本開示にも包含される。明記された範囲が限度の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか、またはその両方を除く範囲も本開示に包含される。
「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」または「相同性」は、本明細書において識別される核酸またはアミノ酸配列に関しては、あらゆる保存的置換を配列同一性の一部として考慮に入れて配列をアラインメントした後に、比較されるポリペプチド内のアミノ酸残基と同一である、候補配列内の核酸またはアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、公的に入手可能な配列比較用コンピュータプログラムALIGN-2を使用して実現することができる。ALIGN-2配列比較用コンピュータプログラムのソースコードは、U.S.Copyright Office、Washington D.C.、20559に米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されているユーザー文書で入手可能である。ALIGN-2プログラムを、デジタルUNIX(登録商標) V4.0DなどのUNIX(登録商標)オペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルすることができる。配列比較パラメータは全てALIGN-2プログラムによって設定され、変動しない。
「パーセント(%)同一性」は、本明細書において識別される核酸またはアミノ酸配列に関しては、あらゆる保存的置換を配列同一性の一部として考慮に入れて配列をアラインメントした後に、比較されるポリペプチド内のアミノ酸残基と同一である、候補配列内の核酸またはアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、公的に入手可能な配列比較用コンピュータプログラムALIGN-2を使用して実現することができる。ALIGN-2配列比較用コンピュータプログラムのソースコードは、U.S.Copyright Office、Washington D.C.、20559にU.S.Copyright Registration No.TXU510087の下で登録されているユーザー文書で入手可能である。ALIGN-2プログラムを、デジタルUNIX(登録商標) V4.0DなどのUNIX(登録商標)オペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルすることができる。配列比較パラメータは全てALIGN-2プログラムによって設定され、変動しない。
本明細書に開示される範囲は全て、ありとあらゆる可能性のある部分範囲およびその部分範囲の組合せも包含する。列挙された範囲はいずれも、同じ範囲が少なくとも等しい半分、3分の1、4分の1、5分の1、10分の1などに分解されることを十分に記載し、可能にするものと理解され得る。非限定的な例として、本明細書で考察される各範囲を下位3分の1、中位3分の1および上位3分の1などに容易に分解することができる。同じく当業者には理解される通り、例えば「最大で(up to)」、「少なくとも(at least)」、「超える(greater than)」、「未満(less than)」などの言葉は全て、記載されている数を含み、続けて上記の通り部分範囲に分解することができる範囲を指す。最後に、当業者には理解される通り、範囲は、個々のメンバーそれぞれを含む。したがって、例えば、1つ~3つの事項を有する群は、1つ、2つ、または3つの事項の群を指す。同様に、1つ~5つの事項を有する群は、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの事項を有する群を指す、などである。
明確にするために別々の実施形態に関して記載されている本開示のある特定の特色を組み合わせて単一の実施形態として提供することもできることが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態に関して記載されている本開示の種々の特色を別々にまたは任意の適切な副次的組合せで提供することもできる。本開示に関する実施形態の組合せの全てが、1つ1つの組合せが個別にかつ明確に開示されたものと全く同じように本開示に具体的に包含され、本明細書に開示される。さらに、種々の実施形態およびその要素の副次的組合せの全てもまた、そのような副次的組合せの1つ1つが個別にかつ明確に本明細書に開示されたものと全く同じように本開示に具体的に包含され、本明細書に開示される。
本明細書で使用される場合、薬剤の「治療有効量」または「治療有効数」は、疾患もしくは障害の処置もしくは管理において治療的利益をもたらすため、または疾患もしくは障害に付随する1つもしくは複数の症状を遅延させるもしくは最小限にするために十分な量または数である。薬剤の治療有効量とは、単独の、または他の治療剤と組み合わせた治療剤の、がんの処置または管理において治療的利益をもたらす量を意味する。「治療有効量」という用語は、全体的な治療を改善する、疾患もしくは障害の症状もしくは原因を低減もしくは回避する、または別の治療剤の治療有効性を増強する量を包含し得る。「有効量」の例は、疾患の1つの症状もしくは複数の症状の処置、予防、または低減に寄与するために十分な量であり、これは、「治療有効量」と称することもできる。症状の「低減」とは、症状(複数可)の重症度もしくは発生頻度を低下させること、または症状(複数可)を排除することを意味する。「治療有効量」を含む組成物の厳密な量は、処置の目的に依存し、当業者が公知の技法を使用して確かめることが可能である(例えば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms(vols. 1-3, 2010);Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (2016);Pickar, Dosage Calculations (2012);およびRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, 2012, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkinsを参照されたい)。
過剰増殖性障害には、細胞の調節されない過成長を特徴とするがんおよび過形成が含まれる。過剰増殖性障害では、遺伝学的な調節機構の喪失が頻繁に示され、ネイティブタンパク質が不適切に発現され得る(他の細胞型からのまたは発生段階でのタンパク質の発現、変異したタンパク質の発現、およびタンパク質の正常よりも高いまたは低いレベルでの発現を含む)。CD58-過剰増殖性障害は、正常なCD58発現が低減しているもしくは存在しない、またはCD58が変異形態で発現される、過剰増殖性障害である。
B細胞過剰増殖性障害としては、B細胞白血病およびリンパ腫、例えば、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、B細胞前リンパ性白血病、前駆Bリンパ芽球性白血病、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、MALTリンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、および、B系統細胞の過成長を特徴とする他の障害が挙げられる。
キメラ抗原受容体(CAR)およびT細胞受容体(TCR)などの免疫受容体は、一般に、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、およびT細胞の細胞傷害性反応を活性化する細胞質シグナル伝達ドメインを含む。CARは、抗原結合性ドメインと膜貫通ドメインの間にスペーサードメインも有する頻度が高く、スペーサードメインは、多くの場合、ヒンジドメインを含む。細胞質シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載の通り、1つまたは複数の共刺激領域をさらに含み得る。
CAR構造は、多くの場合、簡略化されて、標的抗原(または抗原結合性ドメインもしくは薬剤);必要に応じてスペーサードメイン;必要に応じて膜貫通ドメイン;ならびに細胞質シグナル伝達ドメインの共刺激および刺激ドメインが列挙される。例えば、抗CD19 scFv抗原結合性ドメイン、CD8α膜貫通ドメイン(細胞外ヒンジ領域を含み得る)、4-1BB共刺激ドメイン、およびCD3ζ活性化ドメインを有するCARはCD19-8tm-41BBzと示され得る。ドメインが一般に使用されているものである場合、さらにもっと簡略化されることも多く、したがって、CD28膜貫通ドメイン、4-1BBドメイン、およびCD3ζ活性化ドメインを有するCARは、CD19-28tm-28BBzと省略され得る。例えばCD19-28BBzのように、膜貫通ドメインの名称を省略することによってさらに簡略化されることも多い。その特異性だけではなく特定の抗原結合性ドメインを示すこと、例えば、CD22ではなくm971と示し、それにより抗原結合性ドメインがm971 scFvであることを示すことも一般的である。
B.CD2 CAR
本開示のCD2 CARは、抗原結合性ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含む。細胞質シグナル伝達ドメインは、CD2シグナル伝達(共刺激)ドメイン、第2の共刺激ドメイン(CD28以外)、およびCD3ζ活性化ドメインなどの活性化ドメインを含む。本開示のCD2 CARは、CAR-T細胞に、単独で、または他のCARと組み合わせてのいずれかで使用することができる。一部の実施形態では、本開示のCD2 CARをキメラポリペプチドおよび/またはトランスジェニックT細胞受容体(TCR)と組み合わせて使用することができる。一部の実施形態では、トランスジェニックTCRによってCD2シグナル伝達が増強される。一部の実施形態では、本開示のCD2 CARを、腫瘍微小環境において腫瘍特異的抗原に応答してネイティブCD2と架橋結合し得る1つまたは複数の追加の治療剤、例えば、抗体またはその抗原結合性断片、または分子(投与されるか、分泌されるか、または表面に発現される)などと組み合わせて使用することができる。本明細書に記載の通り、本開示のCD2 CARにより、CAR-T細胞の標的細胞によるCD58発現への依存が低減し、CAR-T細胞の治療的活性をさらに増大させることができる。
本開示のCD2 CARは、抗原結合性ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含む。細胞質シグナル伝達ドメインは、CD2シグナル伝達(共刺激)ドメイン、第2の共刺激ドメイン(CD28以外)、およびCD3ζ活性化ドメインなどの活性化ドメインを含む。本開示のCD2 CARは、CAR-T細胞に、単独で、または他のCARと組み合わせてのいずれかで使用することができる。一部の実施形態では、本開示のCD2 CARをキメラポリペプチドおよび/またはトランスジェニックT細胞受容体(TCR)と組み合わせて使用することができる。一部の実施形態では、トランスジェニックTCRによってCD2シグナル伝達が増強される。一部の実施形態では、本開示のCD2 CARを、腫瘍微小環境において腫瘍特異的抗原に応答してネイティブCD2と架橋結合し得る1つまたは複数の追加の治療剤、例えば、抗体またはその抗原結合性断片、または分子(投与されるか、分泌されるか、または表面に発現される)などと組み合わせて使用することができる。本明細書に記載の通り、本開示のCD2 CARにより、CAR-T細胞の標的細胞によるCD58発現への依存が低減し、CAR-T細胞の治療的活性をさらに増大させることができる。
一部の実施形態では、CARは、第1世代CARである。一部の実施形態では、CARは、第2世代CARである。一部の実施形態では、CARは、第3世代CARである。第1世代CARは、一般に、T細胞活性化シグナルを生じさせるために、CD3z、FcyRI、または他のITAMを含有する活性化ドメインの細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを有する。第2世代CARは、共刺激シグナル伝達ドメイン(例えば、CD28、4-1BB、またはICOSなどの、内在性T細胞共刺激受容体由来の共刺激シグナル伝達ドメイン)をさらに含む。第3世代CARは、EGAMを含有する活性化ドメイン、第1の共刺激シグナル伝達ドメインおよび第2の共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。
1.抗原結合性ドメイン
抗原結合性ドメインは、選択された抗原に十分な親和性および特異性で結合する任意の分子であり得、多くの場合、抗体または抗体誘導体、例えば、scFv、単一ドメイン抗体(sdAb)、Fab’断片、(Fab’)2断片、ナノボディ、ダイアボディなどである。あるいは、抗原結合性ドメインは、標的抗原に特異的に結合する受容体または受容体断片であり得る。抗原結合性ドメインは、下記の通り、受容体の残りの部分と直接(共有結合により)または間接的に(例えば、2つまたはそれよりも多くの結合パートナーの非共有結合性の結合を通じて)付着し得る。
抗原結合性ドメインは、選択された抗原に十分な親和性および特異性で結合する任意の分子であり得、多くの場合、抗体または抗体誘導体、例えば、scFv、単一ドメイン抗体(sdAb)、Fab’断片、(Fab’)2断片、ナノボディ、ダイアボディなどである。あるいは、抗原結合性ドメインは、標的抗原に特異的に結合する受容体または受容体断片であり得る。抗原結合性ドメインは、下記の通り、受容体の残りの部分と直接(共有結合により)または間接的に(例えば、2つまたはそれよりも多くの結合パートナーの非共有結合性の結合を通じて)付着し得る。
第1の抗原結合性ドメインは、標的抗原との特異的結合のために選択される。一般に、標的抗原は、腫瘍細胞などの標的細胞の特徴であり、他の(健康な)細胞の特徴ではないことから選択される。腫瘍抗原は、免疫応答、特にT細胞媒介性免疫応答を引き出す、腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。したがって、抗原結合性部分は、処置される特定の型のがんに基づいて選択することができる。腫瘍抗原としては、例えば、これだけに限定することなく、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原(CEA)、ベータ-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファ-フェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、mut HSP70-2、M-CSF、前立腺特異的抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、プロステイン、PSMA、HER2、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、CD22、インスリン増殖因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受容体、GD2、GD3、B7-H3、GPC2、L1CAM、EGFR、およびメソテリンが挙げられる。
腫瘍抗原はまた、腫瘍特異的抗原(TSA)または腫瘍関連抗原(TAA)であり得る。TSAは、腫瘍細胞に独特のものであり、体内の他の細胞には存在しない。TAAは腫瘍細胞に独特のものではなく、抗原に対する免疫寛容の状態を誘導することができない条件下でいくつかの正常な細胞にも発現される。腫瘍における抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することが可能になる条件下で起こり得る。TAAは、免疫系が未成熟であり応答することができない胎児発生の間には正常な細胞にも発現される抗原であり得る、または、通常正常な細胞にも低レベルで存在するが腫瘍細胞でははるかに高いレベルで発現される抗原であり得る。
TSAおよびTAAの例としては、限定することなく、分化抗原、例えば、MART-1/MelanA(MART-1)、gp100(Pmel 17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2および腫瘍特異的多系統抗原、例えば、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15;過剰発現される胎児性抗原、例えば、CEA;過剰発現される癌遺伝子および変異した腫瘍抑制因子遺伝子、例えば、p53、Ras、HER-2;染色体転座にから生じた独特の腫瘍抗原;例えば、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR;ならびにウイルス抗原、例えば、エプスタイン・バーウイルス抗原EBVAおよびヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6およびE7が挙げられる。他の大きなタンパク質に基づく抗原としては、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO-1、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、ベータ-カテニン、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、アルファ-フェトプロテイン、ベータ-hCG、BCA225、BTAA、CA125、BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68/P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733/EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TAG72、TLP、およびTPSが挙げられる。一部の実施形態では、標的抗原は、CD19、CD20、CD22、ROR1、またはGD2である。一部の実施形態では、標的抗原は、CD19、CD20、またはCD22である。ある実施形態では、標的抗原は、CD19である。ある実施形態では、標的抗原は、CD22である。
抗体誘導体は、リガンド結合の機構が抗体と似ている分子であり、それらとして、例えば、ナノボディ、デュオボディ(duobody)、ダイアボディ、トリアボディ、ミニボディ、F(ab’)2断片、Fab断片、単鎖可変性断片(ScFv)、単一ドメイン抗体(sdAb)、およびそれらの機能性断片が挙げられる。例えば、D.L. Porter et al., N Engl J Med (2011) 365 (8): 725-33(scFv);E.L. Smith et al., Mol Ther (2018) 26 (6): 1447-56(scFv);S.R. Banihashemi et al., Iran J Basic Med Sci (2018) 21 (5): 455-64(CD19ナノボディ);F. Rahbarizadeh et al., Adv Drug Deliv Rev (2019) 141: 41-46(sdAb);S.M. Kipriyanov et al., Int J Cancer (1998) 77 (5): 763-72(ダイアボディ);F. Le Gall et al., FEBS Lett (1999) 453 (1-2): 164-68(トリアボディ);M.A. Ghetie et al., Blood (1994) 83 (5): 1329-36(F(ab’)2);ならびにM.A. Ghetie et al., Clin Cancer Res (1999) 5 (12): 3920-27(F(ab’)2およびFab’)を参照されたい。抗体誘導体は、例えば、これだけに限定することなく、ナノボディ、デュオボディ、ダイアボディ、トリアボディ、ミニボディ、F(ab’)2断片、Fab断片、単鎖可変断片(scFv)、または単一ドメイン抗体(sdAb)を治療用抗体に基づいて調製することにより、治療用抗体から調製することもできる。ファージディスプレイ技法を使用して抗体誘導体を設計することもできる(例えば、E. Romao et al., Curr Pharm Des (2016) 22 (43): 6500-18を参照されたい)。
抗原結合性ドメインは、同じであっても異なってもよい複数の抗原に対する結合性ドメインを含み得る。例えば、抗原結合性ドメインは、2つの抗原に対して、または同じ抗原上の2つのエピトープに対して特異的な二重特異性(Fab’)2を含み得る。多重特異性抗原結合性ドメインにより、例えば、CARが複数の抗原を認識し、それらと反応することが可能になることによって、CARの感受性が増大し得る。
あるいは、抗原結合性ドメインをCARの残りの部分とは独立に発現させ、非共有結合性の相互作用を通じて結合させることができる。例えば、CARの細胞外部分は、独立した抗原結合性ドメインと結合する(抗原結合性ドメインによる抗原結合に干渉することなく)、特定の結合対の一方のメンバーを含み得る。例えば、CAR細胞外ドメインはストレプトアビジンを含み得、一方、独立した抗原結合性ドメインはビオチン化されている。あるいは、CAR細胞外ドメインは、独立した抗原結合性ドメインに対して特異的な抗体または抗体誘導体を含み得る。この独立した抗原結合性ドメインとCARへの分割により、新しい受容体を形質導入せずに受容体の抗原特異性を変化させることが可能になる。例えば、N.G. Minutolo et al, Front Oncol (2019) 9: 176を参照されたい。
2.膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、受容体の細胞外ドメイン(抗原結合性ドメインおよびスペーサードメイン)と細胞質ドメインを連結する働きをする。一般に、CARにおいて機能することが可能な任意の膜貫通ドメインを本開示の受容体および方法に使用することができる。膜貫通ドメインとしては、例えば、これだけに限定することなく、CD3ゼータ鎖(CD3ζ)、CD28、CD2、CD4、OX40、4-1BB(CD137)、FcERIγ、ICOS(CD278)、ILRB(CD122)、IL-2RG(CD132)、CTLA-4、PD-1、もしくはCD40の膜貫通ドメインの全部または一部、またはそのような膜貫通ドメインに由来する配列を挙げることができる。細胞質シグナル伝達ドメインは、一般に、T細胞を活性化する細胞内シグナルにリガンド結合の事象を伝達するドメインを含む。CD3ζ細胞内ドメイン/活性化ドメインが使用される頻度が高いが、他のもの、例えば、MyD88を使用することもできる。ある実施形態では、膜貫通ドメインは、CD3ζ、CD2、CD8、またはCD28由来の膜貫通ドメインである。ある実施形態では、膜貫通ドメインは、CD2またはCD28由来の膜貫通ドメインに由来するものである。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、CD3ζ、CD28、CD2、CD4、OX40、4-1BB(CD137)、FcERIγ、ICOS(CD278)、ILRB(CD122)、IL-2RG(CD132)、またはCD40膜貫通ドメインに対して約70%、75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または約100%の配列同一性を有する。
膜貫通ドメインは、受容体の細胞外ドメイン(抗原結合性ドメインおよびスペーサードメイン)と細胞質ドメインを連結する働きをする。一般に、CARにおいて機能することが可能な任意の膜貫通ドメインを本開示の受容体および方法に使用することができる。膜貫通ドメインとしては、例えば、これだけに限定することなく、CD3ゼータ鎖(CD3ζ)、CD28、CD2、CD4、OX40、4-1BB(CD137)、FcERIγ、ICOS(CD278)、ILRB(CD122)、IL-2RG(CD132)、CTLA-4、PD-1、もしくはCD40の膜貫通ドメインの全部または一部、またはそのような膜貫通ドメインに由来する配列を挙げることができる。細胞質シグナル伝達ドメインは、一般に、T細胞を活性化する細胞内シグナルにリガンド結合の事象を伝達するドメインを含む。CD3ζ細胞内ドメイン/活性化ドメインが使用される頻度が高いが、他のもの、例えば、MyD88を使用することもできる。ある実施形態では、膜貫通ドメインは、CD3ζ、CD2、CD8、またはCD28由来の膜貫通ドメインである。ある実施形態では、膜貫通ドメインは、CD2またはCD28由来の膜貫通ドメインに由来するものである。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、CD3ζ、CD28、CD2、CD4、OX40、4-1BB(CD137)、FcERIγ、ICOS(CD278)、ILRB(CD122)、IL-2RG(CD132)、またはCD40膜貫通ドメインに対して約70%、75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または約100%の配列同一性を有する。
3.スペーサードメイン
一部の実施形態では、CARは、細胞外スペーサードメインをさらに含み、細胞外スペーサードメインはヒンジドメインを含み得る。ヒンジドメインは、一般に、標的化部分と膜貫通ドメインの間に配置された柔軟なポリペプチドコネクター領域を含む。ヒンジドメイン配列は、多くの場合、IgGサブクラス(例えば、IgG1およびIgG4など)、IgD、CD28、およびCD8ドメインに由来する。一部の実施形態では、ヒンジドメインにより、隣接するポリペプチド領域に構造的な柔軟性がもたらされる。ヒンジドメインは、天然または合成ポリペプチドからなり得る。ヒンジドメインにより、抗原結合性部分によって認識される抗原の部分に対する抗原結合性部分の最適な位置付けを促進することによってCARの機能を改善することができることが当業者には理解されよう。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、最適なCAR活性に必要なものではない場合がある。一部の実施形態では、アミノ酸の短い配列を含むヒンジドメインにより、例えば、そうでなければ抗体結合カイネティクスを変更させる可能性がある立体的制約が軽減することによって抗原結合が容易になることによりCAR活性が促進される。一部の実施形態では、ヒンジドメインを抗原結合性部分の下流かつ膜貫通ドメイン連結の上流に連結する。
一部の実施形態では、CARは、細胞外スペーサードメインをさらに含み、細胞外スペーサードメインはヒンジドメインを含み得る。ヒンジドメインは、一般に、標的化部分と膜貫通ドメインの間に配置された柔軟なポリペプチドコネクター領域を含む。ヒンジドメイン配列は、多くの場合、IgGサブクラス(例えば、IgG1およびIgG4など)、IgD、CD28、およびCD8ドメインに由来する。一部の実施形態では、ヒンジドメインにより、隣接するポリペプチド領域に構造的な柔軟性がもたらされる。ヒンジドメインは、天然または合成ポリペプチドからなり得る。ヒンジドメインにより、抗原結合性部分によって認識される抗原の部分に対する抗原結合性部分の最適な位置付けを促進することによってCARの機能を改善することができることが当業者には理解されよう。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、最適なCAR活性に必要なものではない場合がある。一部の実施形態では、アミノ酸の短い配列を含むヒンジドメインにより、例えば、そうでなければ抗体結合カイネティクスを変更させる可能性がある立体的制約が軽減することによって抗原結合が容易になることによりCAR活性が促進される。一部の実施形態では、ヒンジドメインを抗原結合性部分の下流かつ膜貫通ドメイン連結の上流に連結する。
適切なヒンジドメインの非限定的な例としては、CD8α、CD28、CTLA4、CD4、PD1、IgG1、PGK、またはIgG4に由来するものが挙げられる。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ヒトCD8α(CD8aとしても公知)分子、CD28分子、および隣接する領域に柔軟性をもたらすことに関して同様の機能をもたらす任意の他の受容体に由来する領域を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示されるCARは、CD8αヒンジドメインに由来するヒンジドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書に開示されるCARは、CD28またはCD2ヒンジドメインに由来するヒンジドメインを含む。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、CD8α、CD28、CTLA4、CD4、PD1、IgG1、PGK、またはIgG4ヒンジドメインに対して約70%、75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または約100%の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、スペーサードメインは、抗原結合性ドメインと細胞外ヒンジドメインの間に位置付けられた1つまたは複数の介在アミノ酸残基を含むリンカーをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、抗原結合性ドメインの下流かつヒンジドメインの上流に位置付けられる。原理上は、リンカーの長さおよび/またはアミノ酸組成は特に限定されない。一部の実施形態では、約1~約300個のアミノ酸残基(例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、またはそれよりも多くのアミノ酸残基)を含む任意の単鎖ペプチドのいずれも、リンカーとして使用することができる。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも約5個、約6個、約7個、約8個、約9個、約10個、約11個、約12個、約15個、約20個、約25個、約30個、約35個、約40個、約45個、または約50個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは、約300個以下、約250個以下、約200個以下、約150個以下、約140個以下、約130個以下、約120個以下、約110個以下、約100個以下、約90個以下、約85個以下、約80個以下、約75個以下、約70個以下、約65個以下、約60個以下、約55個以下、約50個以下、約45個以下、約40個以下、約35個以下、または約30個以下のアミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、細胞外スペーサーの長さおよびアミノ酸組成は、CARの所望の活性が実現されるために、抗原結合性ドメインおよび細胞外ヒンジドメインの互いに対する配向および/または近接を変動させるように最適化することができる。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインおよび細胞外ヒンジドメインの互いに対する配向および/または近接を、CARの有効性を増強または低減させるための「調整」ツールまたは効果として変動させるおよび/または最適化することができる。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインおよびヒンジドメインの互いに対する配向および/または近接を、部分的に機能的なバージョンのCARが創出されるように変動させるおよび/または最適化することができる。一部の実施形態では、細胞外スペーサードメインは、IgG4ヒンジドメインおよびIgG4 CH2-CH3ドメインに対応するアミノ酸配列を含む。
あるいは、スペーサードメインは、ランダムな配列、(gly-gly-ser)n(「GGSn」)配列、またはそれらの変形形態、例えば、(SGG)n、(GGGS)n、(SGGG)n、(GSGGG)nなど(配列中、nは約1から約15までにわたり得る(配列番号87~91))を有するスペーサーなどの合成ポリペプチドスペーサーであり得る。合成ポリペプチドスペーサードメインは、CD8α、IgGなどに由来するヒンジドメインなどの天然に存在する配列も含み得る。
4.細胞質シグナル伝達ドメイン
細胞質シグナル伝達ドメインは、一般に、リン酸化されると抗原に対するT細胞反応を活性化する免疫受容活性化チロシンモチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif)(ITAM)を有する活性化ドメインを含む。リン酸化は抗原結合の結果として起こる。活性化ドメインは、CD3ζに由来するものであることが多い。
細胞質シグナル伝達ドメインは、一般に、リン酸化されると抗原に対するT細胞反応を活性化する免疫受容活性化チロシンモチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif)(ITAM)を有する活性化ドメインを含む。リン酸化は抗原結合の結果として起こる。活性化ドメインは、CD3ζに由来するものであることが多い。
本開示のCARは、CD3ζ活性化ドメイン、CD2共刺激ドメイン、ならびに、サイトカイン産生もしくは感受性を増大させるため、アネルギーを低減もしくは予防するため、ならびに/または増殖および細胞傷害活性を増大させるための1つまたは複数の追加の共刺激ドメインを含む。これらの追加の共刺激ドメインは、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CTLA-4、PD-1、CD278、CD122、CD132、B7-H2、B7-H3、PD-L1、PD-L2、B7-H4、PDCD6、BTLA、41BB(CD137)、FcERIγ、CD40L、4-1BBL、GITR、BAFF、GITR-L、BAFF-R、HVEM、CD27、LIGHT、CD27L、OX40、OX40L、CD30、CD30L、TAC1、CD40、CD244、CD84、BLAME、CD229、CRACC、CD2F-10、NTB-A、CD48、SLAM(CD150)、CD58、イカロス、CD53、インテグリンα4、CD82、インテグリンα4β1、CD90、インテグリンα4β7、CD96、LAG-3、CD160、LMIR、CRTAM、TCL1A、DAP12;TIM-1、デクチン-1、TIM-4、TSLP、EphB6、TSLP-R、およびHLA-DRなどの共刺激タンパク質に由来するものであり得る。本開示のある実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインはCD3ζ活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、1つの共刺激ドメインはCD2共刺激ドメインである。別の実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインはCD2共刺激ドメインおよび第2の共刺激ドメインを含み、第2の共刺激ドメインはCD28共刺激ドメインを含まない。ある実施形態では、第2の共刺激ドメインは41BB共刺激ドメインを含む。CD28共刺激ドメインは本明細書に記載の方法の実施においては有効ではなく、CD58の非存在下では活性化をもたらすことができない。一部の実施形態では、共刺激ドメインは、4-1BBシグナル伝達ドメイン、CD27シグナル伝達ドメイン、OX40シグナル伝達ドメイン、CD28シグナル伝達ドメイン、CD278シグナル伝達ドメイン、CD40シグナル伝達ドメイン、CD40Lシグナル伝達ドメイン、toll様受容体シグナル伝達ドメイン、またはこれらの任意の組合せのうちの少なくとも1つを含む(Weinkove R. et al., Clin Transl Immunology. 2019; 8 (5): e1049)。
5.例示的な構築物
本開示の例示的なCARとしては、これだけに限定されないが、以下のうちの任意の1つが挙げられる:CD19-CD2-z(配列番号12、41)、CD19-CD2-BBz(配列番号13、42)、CD19-BB-CD2z(配列番号14、43)、CD19-CD2-28z(配列番号15、44)、m971-CD2z(配列番号16、45)、m971-CD2-BBz(配列番号17、46)、m971-CD2-BB-CD2z(配列番号18、47)、m971-CD2-28z(配列番号19、48)、CD19-28tm-CD2(配列番号20、49)、CD19-8tm-CD2(配列番号21、50)、CD19-2tm-CD2(配列番号22、51)、m971-28tm-CD2(配列番号23、52)、m971-8tm-CD2(配列番号24、53)、HA22-28tm-CD2(配列番号25、54)、HA22-8tm-CD2(配列番号26、55)、HA22-2tm-CD2(配列番号27、56)、CD20-28tm-CD2(配列番号28、57)、CD20-8tm-CD2(配列番号29、58)、m971-BBz(配列番号59、60)、m971-28z(配列番号61、62)、CD19-28z(配列番号63、64)、CD19-BBz(配列番号65、66)、m971-BBz-CD2(配列番号67、68)、m971-BBz-2A-CD19-CD28tm-CD2(配列番号71、72)、m971-BBz-2A-CD19-CD8tm-CD2(配列番号73、74)、m971-BBz-2A-CD19-CD2tm-CD2(配列番号75、76)、m971-BBz-2A-HA22-CD28tm-CD2(配列番号81、82)、m971-BBz-2A-HA22-CD8tm-CD2(配列番号83、84)、m971-BBz-2A-HA22-2tm-CD2(配列番号85、86)、CD19-8htm-CD2-z(配列番号92、114)、CD19-8htm-CD2-BB-z(配列番号93、115)、CD19-8htm-BB-CD2-z(配列番号94、116)、CD19-8htm-CD2-28-z(配列番号95、117)、CD19-28htm-CD2-z(配列番号96、118)、m971-8htm-CD2-z(配列番号97、119)、m971-8htm-CD2-BB-z(配列番号98、120)、m971-8htm-BB-CD2-z(配列番号99、121)、m971-8htm-CD2-28-z(配列番号100、122)、CD19-28htm-CD2(配列番号101、123)、CD19-8htm-CD2(配列番号102、124)、CD19-2htm-CD2(配列番号103、125)、m971-28htm-CD2(配列番号104、126)、m971-8htm-CD2(配列番号105、127)、HA22-28htm-CD2(配列番号106、128)、HA22-8htm-CD2(配列番号107、129)、HA22-2htm-CD2(配列番号108、130)、CD20-IgG1long-28htm-CD2(配列番号109、131)、CD20-IgG1long-8htm-CD2(配列番号110、132)、CD20-IgG1long-28htm-CD2-z(配列番号111、133)、またはCD20-IgG1long-8htm-CD2-z(配列番号112、134)。
本開示の例示的なCARとしては、これだけに限定されないが、以下のうちの任意の1つが挙げられる:CD19-CD2-z(配列番号12、41)、CD19-CD2-BBz(配列番号13、42)、CD19-BB-CD2z(配列番号14、43)、CD19-CD2-28z(配列番号15、44)、m971-CD2z(配列番号16、45)、m971-CD2-BBz(配列番号17、46)、m971-CD2-BB-CD2z(配列番号18、47)、m971-CD2-28z(配列番号19、48)、CD19-28tm-CD2(配列番号20、49)、CD19-8tm-CD2(配列番号21、50)、CD19-2tm-CD2(配列番号22、51)、m971-28tm-CD2(配列番号23、52)、m971-8tm-CD2(配列番号24、53)、HA22-28tm-CD2(配列番号25、54)、HA22-8tm-CD2(配列番号26、55)、HA22-2tm-CD2(配列番号27、56)、CD20-28tm-CD2(配列番号28、57)、CD20-8tm-CD2(配列番号29、58)、m971-BBz(配列番号59、60)、m971-28z(配列番号61、62)、CD19-28z(配列番号63、64)、CD19-BBz(配列番号65、66)、m971-BBz-CD2(配列番号67、68)、m971-BBz-2A-CD19-CD28tm-CD2(配列番号71、72)、m971-BBz-2A-CD19-CD8tm-CD2(配列番号73、74)、m971-BBz-2A-CD19-CD2tm-CD2(配列番号75、76)、m971-BBz-2A-HA22-CD28tm-CD2(配列番号81、82)、m971-BBz-2A-HA22-CD8tm-CD2(配列番号83、84)、m971-BBz-2A-HA22-2tm-CD2(配列番号85、86)、CD19-8htm-CD2-z(配列番号92、114)、CD19-8htm-CD2-BB-z(配列番号93、115)、CD19-8htm-BB-CD2-z(配列番号94、116)、CD19-8htm-CD2-28-z(配列番号95、117)、CD19-28htm-CD2-z(配列番号96、118)、m971-8htm-CD2-z(配列番号97、119)、m971-8htm-CD2-BB-z(配列番号98、120)、m971-8htm-BB-CD2-z(配列番号99、121)、m971-8htm-CD2-28-z(配列番号100、122)、CD19-28htm-CD2(配列番号101、123)、CD19-8htm-CD2(配列番号102、124)、CD19-2htm-CD2(配列番号103、125)、m971-28htm-CD2(配列番号104、126)、m971-8htm-CD2(配列番号105、127)、HA22-28htm-CD2(配列番号106、128)、HA22-8htm-CD2(配列番号107、129)、HA22-2htm-CD2(配列番号108、130)、CD20-IgG1long-28htm-CD2(配列番号109、131)、CD20-IgG1long-8htm-CD2(配列番号110、132)、CD20-IgG1long-28htm-CD2-z(配列番号111、133)、またはCD20-IgG1long-8htm-CD2-z(配列番号112、134)。
一部の実施形態では、本開示のCARは、以下からなる群より選択される配列と少なくとも約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または約100%同一であるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を含み得る:CD19-CD2-z(配列番号12、41)、CD19-CD2-BBz(配列番号13、42)、CD19-BB-CD2z(配列番号14、43)、CD19-CD2-28z(配列番号15、44)、m971-CD2z(配列番号16、45)、m971-CD2-BBz(配列番号17、46)、m971-CD2-BB-CD2z(配列番号18、47)、m971-CD2-28z(配列番号19、48)、CD19-28tm-CD2(配列番号20、49)、CD19-8tm-CD2(配列番号21、50)、CD19-2tm-CD2(配列番号22、51)、m971-28tm-CD2(配列番号23、52)、m971-8tm-CD2(配列番号24、53)、HA22-28tm-CD2(配列番号25、54)、HA22-8tm-CD2(配列番号26、55)、HA22-2tm-CD2(配列番号27、56)、CD20-28tm-CD2(配列番号28、57)、CD20-8tm-CD2(配列番号29、58)、m971-BBz(配列番号59、60)、m971-28z(配列番号61、62)、CD19-28z(配列番号63、64)、CD19-BBz(配列番号65、66)、m971-BBz-CD2(配列番号67、68)、m971-BBz-2A-CD19-CD28tm-CD2(配列番号71、72)、m971-BBz-2A-CD19-CD8tm-CD2(配列番号73、74)、m971-BBz-2A-CD19-CD2tm-CD2(配列番号75、76)、m971-BBz-2A-HA22-CD28tm-CD2(配列番号81、82)、m971-BBz-2A-HA22-CD8tm-CD2(配列番号83、84)、m971-BBz-2A-HA22-2tm-CD2(配列番号85、86)、CD19-8htm-CD2-z(配列番号92、114)、CD19-8htm-CD2-BB-z(配列番号93、115)、CD19-8htm-BB-CD2-z(配列番号94、116)、CD19-8htm-CD2-28-z(配列番号95、117)、CD19-28htm-CD2-z(配列番号96、118)、m971-8htm-CD2-z(配列番号97、119)、m971-8htm-CD2-BB-z(配列番号98、120)、m971-8htm-BB-CD2-z(配列番号99、121)、m971-8htm-CD2-28-z(配列番号100、122)、CD19-28htm-CD2(配列番号101、123)、CD19-8htm-CD2(配列番号102、124)、CD19-2htm-CD2(配列番号103、125)、m971-28htm-CD2(配列番号104、126)、m971-8htm-CD2(配列番号105、127)、HA22-28htm-CD2(配列番号106、128)、HA22-8htm-CD2(配列番号107、129)、HA22-2htm-CD2(配列番号108、130)、CD20-IgG1long-28htm-CD2(配列番号109、131)、CD20-IgG1long-8htm-CD2(配列番号110、132)、CD20-IgG1long-28htm-CD2-z(配列番号111、133)、またはCD20-IgG1long-8htm-CD2-z(配列番号112、134)。
C.キメラポリペプチド
本開示の1つの態様は、CAR-T療法においてCARと共におよび/またはトランスジェニックTCRと組み合わせて使用するためのキメラポリペプチドである。本開示のキメラポリペプチドは、N末端からC末端まで、抗原結合性ドメイン、必要に応じたスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含み、ここで、細胞質シグナル伝達ドメインは、CD2シグナル伝達(共刺激)ドメインを含み、CD3ζ活性化ドメインを含まない。これらのキメラポリペプチドは、トランス-CD2シグナル伝達受容体として機能し、CD3ζ活性化ドメインまたは等価物などの活性化ドメインを欠くという点でCARとは異なる。したがって、これらのキメラポリペプチドは、T細胞を直接活性化するのではなく、CARに対する補助受容体として作用する。
本開示の1つの態様は、CAR-T療法においてCARと共におよび/またはトランスジェニックTCRと組み合わせて使用するためのキメラポリペプチドである。本開示のキメラポリペプチドは、N末端からC末端まで、抗原結合性ドメイン、必要に応じたスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含み、ここで、細胞質シグナル伝達ドメインは、CD2シグナル伝達(共刺激)ドメインを含み、CD3ζ活性化ドメインを含まない。これらのキメラポリペプチドは、トランス-CD2シグナル伝達受容体として機能し、CD3ζ活性化ドメインまたは等価物などの活性化ドメインを欠くという点でCARとは異なる。したがって、これらのキメラポリペプチドは、T細胞を直接活性化するのではなく、CARに対する補助受容体として作用する。
抗原結合性ドメインは、上記の抗原結合性ドメインのセット、上記の標的抗原、または任意の他の適切な標的から選択することができる。適切な標的は標的細胞に見いだされる抗原であり、キメラポリペプチドは、CARまたはT細胞受容体活性化の非存在下では免疫細胞活性化を誘発しないので、腫瘍特異的または腫瘍関連抗原である必要はない。しかし、腫瘍特異的または腫瘍関連抗原をキメラポリペプチド標的として使用することにより、特にCARとキメラポリペプチドが異なる標的抗原を有する場合に、操作された細胞の標的細胞に対する特異性を増大させることができる。
CARおよびキメラポリペプチドの抗原結合性ドメイン(それぞれ第1の抗原結合性ドメインおよび第2の抗原結合性ドメイン)は、同じ抗原、異なる抗原、または同じ抗原の異なるエピトープを標的とし得る。ある実施形態では、第1の抗原結合性ドメインと第2の抗原結合性ドメインは異なる抗原を標的とする。ある実施形態では、第1の抗原結合性ドメインと第2の抗原結合性ドメインは異なる抗原を標的とする。ある実施形態では、第1の抗原結合性ドメインと第2の抗原結合性ドメインは同じ抗原の異なるエピトープを標的とする。ある実施形態では、第1の抗原結合性ドメインはCD19またはCD22に対して特異的である。ある実施形態では、第2の抗原結合性ドメインはCD22またはCD19に対して特異的である。
上記の通り、キメラポリペプチドの抗原結合性ドメインは多重特異性であり得、キメラポリペプチドおよびCARは複数の異なるまたは部分的に重複する抗原を標的とし得る。
キメラポリペプチドの膜貫通ドメインは、これだけに限定することなく、CD3ゼータ鎖(CD3ζ)、CD2、CD28、OX40、4-1BB(CD137)、FcERIγ、ICOS(CD278)、ILRB(CD122)、IL-2RG(CD132)、CTLA-4、PD-1、またはCD40の膜貫通ドメインの全部または一部を含めた上記の膜貫通ドメインのいずれかを含み得る。時には、2つの異なる受容体が同一の膜貫通ドメインを有し、その結果、活性が干渉されるまたは低下することが観察される。したがって、CARおよびキメラポリペプチドに対して異なる膜貫通ドメインを選択することができる。ある実施形態では、膜貫通ドメインは、CD3ζ、CD2、CD8、またはCD28由来の膜貫通ドメインである。ある実施形態では、膜貫通ドメインは、CD2またはCD28由来の膜貫通ドメインである。ある実施形態では、膜貫通ドメインは、CD28由来の膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、CARの膜貫通ドメインとキメラポリペプチドの膜貫通ドメインは異なる。
キメラポリペプチドは、上記の通り、スペーサードメインおよび/またはヒンジドメインをさらに含み得る。ある実施形態では、キメラポリペプチドは、CD8αヒンジドメインまたはCD28ヒンジドメインまたはCD2ヒンジドメインを含む。ある実施形態では、キメラポリペプチドは、CD28ヒンジドメインを含む。
キメラポリペプチドの細胞質シグナル伝達ドメインは、CD3ζ活性化ドメインを含まないが、少なくともCD2シグナル伝達ドメインを含む。細胞質シグナル伝達ドメインは、CD28シグナル伝達ドメイン以外の追加の共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含み得る。ある実施形態では、キメラポリペプチドの細胞質シグナル伝達ドメインは、CD2を含む。ある実施形態では、キメラポリペプチドの細胞質シグナル伝達ドメインは、CD2および4-1BBを含む。ある実施形態では、キメラポリペプチドの細胞質シグナル伝達ドメインは、CD2およびOX40を含む。一部の実施形態では、共刺激ドメインは、4-1BBシグナル伝達ドメイン、CD27シグナル伝達ドメイン、OX40シグナル伝達ドメイン、CD28シグナル伝達ドメイン、CD278シグナル伝達ドメイン、CD40シグナル伝達ドメイン、CD40Lシグナル伝達ドメイン、toll様受容体シグナル伝達ドメイン、またはこれらの任意の組合せのうちの少なくとも1つを含む(Weinkove R. et al., Clin Transl Immunology. 2019; 8 (5): e1049)。
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、配列番号1、2、3、および4からなる群より選択される配列と少なくとも約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または約100%相同なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、配列番号1、2、3、および4からなる群より選択される配列と少なくとも約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または約100%同一のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号5、6、および7からなる群より選択される配列と少なくとも約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または約100%相同なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号5、6、および7からなる群より選択される配列と少なくとも約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または約100%同一のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、CD2シグナル伝達ドメインは、配列番号8の配列と少なくとも約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または約100%相同なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、CD2シグナル伝達ドメインは、配列番号8の配列と少なくとも約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または約100%同一のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号10および11からなる群より選択される配列と少なくとも約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または約100%相同なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号10および11からなる群より選択される配列と少なくとも約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または約100%同一のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、活性化ドメインは、配列番号9の配列と少なくとも約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または約100%相同なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、活性化ドメインは、配列番号9の配列と少なくとも約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または約100%同一のアミノ酸配列を含む。
D.T細胞受容体
本開示の1つの態様は、CAR-T療法においてCARと共に使用するためのトランスジェニックT細胞受容体である。TCRは、細胞の表面上にまたは可溶性の形態で見いだすことができる。一般に、TCRは、T細胞(またはTリンパ球)の表面上に見いだされ、そこで、一般に、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子と結合した抗原の認識を担う。
本開示の1つの態様は、CAR-T療法においてCARと共に使用するためのトランスジェニックT細胞受容体である。TCRは、細胞の表面上にまたは可溶性の形態で見いだすことができる。一般に、TCRは、T細胞(またはTリンパ球)の表面上に見いだされ、そこで、一般に、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子と結合した抗原の認識を担う。
T細胞受容体(TCR)は、抗原の結合に応答してT細胞の活性化に関与する免疫グロブリンスーパーファミリーのヘテロ二量体細胞表面タンパク質である。TCR複合体は、TCRα/β鎖およびCD3γ/δ/ε/ζサブユニットからなり得、これらは疎水性相互作用を通じて会合し得る。体細胞VDJ組換えにより別個のTCRα鎖およびTCRβ鎖の生成が可能になり、また、TCRαβヘテロ二量体は、一般に、ペプチド-MHC複合体に結合することによって抗原認識を担う。CD3は、TCRにより誘発されたシグナルをその細胞質尾部にある免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)を通じて伝達し得るが、一般に、抗原認識には直接関与しない。ITAMは、チロシン含有配列(YXXL/I)の縦列重複であり、CD3γ/δ/ε鎖はそれぞれ1つのITAMを含有し、一方、CD3ζ鎖は3つのITAMを含有する。TCR係合の結果として、タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)によってITAMリン酸化が誘導され得、これにより、他のエフェクター分子がTCR複合体と相互作用することが可能になる。
一部の実施形態では、TCRは、αβ形態またはγδ形態のTCRを含むインタクトなまたは全長TCRであり得る。一部の実施形態では、TCRは二量体TCR(dTCR)である。一部の実施形態では、TCRは単鎖TCR(scTCR)である。一部の実施形態では、TCRは、全長TCRより短いが、MHC分子に結合した特定のペプチドと結合する、例えば、MHC-ペプチド複合体に結合する抗原結合性部分である。一部の場合では、TCRの抗原結合性部分または断片は、全長またはインタクトなTCRの構造的ドメインの一部のみを含み得るが、それでもなお、全長TCRが結合するMHC-ペプチド複合体などのペプチドエピトープに結合することができる。一部の場合では、抗原結合性部分は、特定のMHC-ペプチド複合体に結合するための結合性部位の形成に十分であるTCRの可変ドメイン、例えば、TCRの可変α鎖および可変β鎖を含有する。一般に、TCRの可変鎖は、ペプチド、MHCおよび/またはMHC-ペプチド複合体の認識に関与する相補性決定領域を含有する。
一部の実施形態では、TCRは、定常ドメイン、膜貫通ドメインおよび/または短い細胞質尾部を含有し得る。一部の実施形態では、TCRの各鎖は、1つのN末端免疫グロブリン可変ドメイン、1つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、および、C末端の短い細胞質尾部を有し得る。一部の実施形態では、TCRは、シグナルトランスダクションの媒介に関与するCD3複合体のインバリアントタンパク質と会合する。
一部の実施形態では、TCRは、1つまたは複数の定常ドメインを含有する。例えば、所与のTCR鎖(例えば、α鎖またはβ鎖)の細胞外部分は、2つの免疫グロブリン様ドメイン、例えば、可変ドメイン(例えば、VαまたはVβ)、および、細胞膜に隣接する定常ドメイン(例えば、CαまたはCβ)を含有し得る。例えば、一部の場合では、2本の鎖によって形成されるTCRの細胞外部分は、2つの、膜の近位にある定常ドメイン、および、2つの、膜の遠位にある可変ドメインを含有し、可変ドメインはそれぞれCDRを含有する。TCRの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、それにより、TCRの2本の鎖を連結する、短い接続配列を含有し得る。一部の実施形態では、TCRは、α鎖およびβ鎖のそれぞれに追加のシステイン残基を有し得、したがって、TCRは定常ドメイン内に2つのジスルフィド結合を含有する。
一部の実施形態では、TCRは二量体TCR(dTCR)である。一部の実施形態では、dTCRは、TCRα鎖可変領域配列に対応する配列がTCRα鎖定常領域細胞外配列に対応する配列のN末端と融合した第1のポリペプチド、および、TCRβ鎖可変領域配列に対応する配列がTCRβ鎖定常領域細胞外配列に対応するN末端配列と融合した第2のポリペプチドを含有し得、ここで、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドはジスルフィド結合によって連結している。一部の実施形態では、結合は、ネイティブ二量体TCRαβ形態で存在するネイティブ鎖間ジスルフィド結合に対応し得る。一部の実施形態では、ネイティブTCR内に鎖間ジスルフィド結合は存在しない。例えば、一部の実施形態では、dTCRポリペプチド対の定常領域細胞外配列に1つまたは複数のシステインを組み入れることができる。一部の実施形態では、dTCRは、ネイティブジスルフィド結合および1つまたは複数の非ネイティブジスルフィド結合の両方を有し得る。一部の実施形態では、dTCRは、膜への係留のための膜貫通配列を含有し得る。一部の実施形態では、dTCRは、可変αドメイン、定常αドメイン、および定常αドメインのC末端に付着した第1の二量体形成モチーフを含有するTCRα鎖、ならびに可変βドメイン、定常βドメイン、および定常βドメインのC末端に付着した第1の二量体形成モチーフを含むTCRβ鎖を含有し得、ここで、第1の二量体形成モチーフと第2の二量体形成モチーフは容易に相互作用して、TCRα鎖とTCRβ鎖を連結する第1の二量体形成モチーフ内のアミノ酸と第2の二量体形成モチーフ内のアミノ酸の間の共有結合を形成する。
一部の実施形態では、TCRは単鎖TCR(scTCR)である。一部の実施形態では、scTCRは、TCR鎖の会合を容易にするための非ネイティブジスルフィド鎖間結合を含有し得る。一部の実施形態では、scTCRは、鎖の会合を容易にする異種ロイシンジッパーがC末端に融合した、非ジスルフィド連結した短縮型TCRである。一部の実施形態では、scTCRは、リンカーを介して共有結合により連結したTCRα可変ドメインとTCRβ可変ドメインを含有する。一部の実施形態では、リンカーは、単一のポリペプチド鎖を形成すると同時に、TCR結合特異性を保持することが可能である任意のリンカーであり得る。一部の実施形態では、scTCRは、α鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基とβ鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基を連結する共有結合性ジスルフィド結合を含有し得る。一部の実施形態では、ネイティブTCRに鎖間ジスルフィド結合は存在しない。例えば、一部の実施形態では、scTCRポリペプチドの第1のセグメントおよび第2のセグメントの定常領域細胞外配列に1つまたは複数のシステインを組み入れることができる。一部の実施形態では、scTCRは、ネイティブジスルフィド結合および非ネイティブジスルフィド結合の両方を含有し得る。
一部の実施形態では、TCRまたはその抗原結合性部分は、改変されたまたは操作されたものである。一部の実施形態では、TCRの抗原結合性ドメインは、多重特異性であり得る。一部の実施形態では、TCRまたはその抗原結合性部分は、結合特徴などの1つまたは複数の特性が変更された、組換えによって産生された天然のタンパク質またはその変異形態であり得る。一部の実施形態では、定向進化法を使用して、変更された特性を有する、例えば、特定のMHC-ペプチド複合体に対してより高い親和性を有する、TCRを生成する。一部の実施形態では、定向進化は、これだけに限定されないが、酵母ディスプレイを含めたディスプレイ法によって実現される。一部の実施形態では、ディスプレイ手法は、既知の親または参照TCRを操作することまたは改変することを伴い得る。例えば、一部の場合では、CDRの1つまたは複数の残基が変異した変異誘発されたTCRを作製するための鋳型として野生型TCRを使用することができ、所望の変更された特性、例えば、所望の標的抗原に対するより高い親和性などを有する変異体を選択することができる。一部の実施形態では、TCRまたは抗原結合性部分の生成における使用に適したペプチドを、目的の標的ポリペプチド内のHLA制限モチーフの存在に基づいて決定することができる。一部の実施形態では、当業者に公知のコンピュータ予測モデルを使用してペプチドを同定する。
一部の実施形態では、TCRを、実質的に全長のコード配列が容易に入手可能である既知のTCR配列、例えばVα鎖および/またはVβ鎖の配列などから生成することができる。V鎖配列を含む全長TCR配列を細胞供給源から得るための方法は周知である。一部の実施形態では、TCRをコードする核酸を、種々の供給源から、例えば、所与の細胞(複数可)内のもしくはそれから単離されたTCRコード核酸のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅、または公的に入手可能なTCR DNA配列の合成によって、得ることができる。
一部の実施形態では、TCRを、例えば、T細胞(例えば、細胞傷害性T細胞)、T細胞ハイブリドーマまたは他の公的に入手可能な供給源からなど、生物学的供給源から得る。一部の実施形態では、T細胞を、例えばヒト対象からin vivoで単離された細胞から得ることができる。一部の実施形態では、TCRは、胸腺で選択されたTCRである。一部の実施形態では、TCRは、ネオエピトープ制限TCRである。一部の実施形態では、T細胞は、培養されたT細胞ハイブリドーマまたはクローンであり得る。一部の実施形態では、TCRまたはその抗原結合性部分は、TCRの配列に関する知見から合成的に生成されたものであり得る。
一部の実施形態では、TCRを、標的ポリペプチド抗原、またはその標的T細胞エピトープに対する候補TCRのライブラリーのスクリーニングによって同定または選択されたTCRから生成する。TCRライブラリーは、PBMC、脾臓または他のリンパ器官に存在する細胞を含めた、対象から単離されたT細胞からVαおよびVβのレパートリーを増幅することによって生成することができる。一部の場合では、T細胞を腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)から増幅することができる。一部の実施形態では、TCRライブラリーを、CD4+細胞またはCD8+細胞から生成することができる。一部の実施形態では、TCRを健康な対象の正常なT細胞供給源、すなわち、正常なTCRライブラリーから増幅することができる。一部の実施形態では、TCRを病的対象のT細胞供給源、すなわち、病的TCRライブラリーから増幅することができる。一部の実施形態では、縮重プライマーを使用して、ヒトから得たT細胞などの試料において、例えばRT-PCRによってVαおよびVαの遺伝子レパートリーを増幅する。一部の実施形態では、scTvライブラリーをナイーブVαおよびVβライブラリーからアセンブルすることができ、その場合、増幅産物が、リンカーによって隔てられるようにクローニングまたはアセンブルされる。対象および細胞の供給源に応じて、ライブラリーは、HLA対立遺伝子特異的であり得る。あるいは、一部の実施形態では、TCRライブラリーを、親または足場TCR分子の変異誘発または多様化によって生成することができる。一部の態様では、TCRを、例えば、α鎖またはβ鎖の変異誘発によるものなどの定向進化に供する。一部の実施形態では、TCRのCDR内の特定の残基を変更することができる。一部の実施形態では、選択されたTCRを親和性成熟によって改変することができる。一部の実施形態では、抗原特異的T細胞を、例えばスクリーニングして、ペプチドに対するCTL活性を評価することによって選択し得る。一部の態様では、例えば抗原特異的T細胞上に存在するTCRを、例えば、結合活性、例えば抗原に対する特定の親和性または結合力によって選択することができる。
一部の実施形態では、本開示のTCRは、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原に結合する。一部の実施形態では、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原は、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原(CEA)、ベータ-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファ-フェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、mut HSP70-2、M-CSF、前立腺特異的抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、プロステイン、PSMA、HER2、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、CD22、インスリン増殖因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受容体、GD2、GD3、B7-H3、GPC2、L1CAM、EGFR、メソテリン、MART-1、gp100(Pmel 17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15、p53、Ras、HER-2、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EBVA、ヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6およびE7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO-1、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-カテニン、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-フェトプロテイン、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68/P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733/EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TAG72、TLP、TPS CD19、CD20、CD22、ROR1、ならびにGD2からなる群より選択される。
一部の実施形態では、本開示のTCRでは、CD2細胞内ドメインとCD3zのC末端を融合することができる。一部の実施形態では、CD2細胞内ドメインをCD3-イプシロンのC末端と融合することができる、またはCD2の細胞内部分でCD3-イプシロンの細胞内部分の全部または一部を置き換えることができる、CD3-イプシロンを作製することができる。一部の実施形態では、T細胞は、抗CD3 scFvおよび抗CD2 scFvを含有する、膜結合バージョンの二重特異性抗体を分泌または有し得、それにより、T細胞のネイティブCD2がTCRの近傍に位置し、したがって、TCRが係合/活性化すると細胞のネイティブCD2も活性化される。
一部の実施形態では、トランスジェニックTCRを発現するT細胞、またはex vivoで成長させたバルク腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)におけるCD2シグナル伝達をいくつかの方法によって増強することができる。次いで、TILを患者に戻すことができる。例えば、T細胞に、CD2シグナル伝達を増強する補助受容体を形質導入することができる(トランスジェニックTCRを発現させることに加えて)。細胞外リガンド結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、およびCD2シグナル伝達ドメインを含む補助受容体をウイルスベクターまたは他のベクターで転写させることができ、標的腫瘍細胞が少ないCD58を発現する、CD58を発現しない、または変異CD58を発現する場合であってもCD2シグナル伝達をトランスでもたらすことができる。補助受容体の細胞外部分は、腫瘍細胞によって発現される抗原を認識するscFvまたは目的の標的腫瘍細胞上に発現される共通の受容体のリガンドを含み得る。CAR T細胞、トランスジェニックTCR T細胞、またはバルクTILにおけるCD2シグナル伝達を増強するための別のやり方は、T細胞に対して、1つまたは複数の抗CD2 scFv、抗体、Fab、DARPIN、リガンド、または他の結合物質/抗原結合性ドメインを使用することによって細胞のネイティブCD2と架橋結合することが可能な分泌型分子を構成的に発現するように形質導入を行うことを含み得る。あるいは、分泌型分子を活性化スイッチ(activation switch)の下で発現させることができる。分泌型分子は、膜結合型であり得、リンカーによって接続された2つのscFvからなり得る:一方は、T細胞上のCD2に結合するscFv(ネイティブCD2シグナル伝達を活性化する)であり、他方は、腫瘍細胞上に発現されるタンパク質または標的を認識するscFvまたはリガンドであり、したがって、T細胞が腫瘍細胞と遭遇するとCD2が架橋結合し、活性化される。
E.核酸
本開示の1つの態様は、本開示のCD2 CAR、トランスジェニックTCR、および/またはキメラポリペプチドをコードする核酸である。
本開示の1つの態様は、本開示のCD2 CAR、トランスジェニックTCR、および/またはキメラポリペプチドをコードする核酸である。
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、cDNA、ゲノムDNA、および/または合成DNAを含む核酸分子を含むRNA分子およびDNA分子の両方、ならびに核酸類似体を含有するDNA分子またはRNA分子を指す。核酸は、DNAまたはRNAに天然には存在しない1つまたは複数の塩基および/または連結、例えば、ホスホルアミダイト連結、2’修飾リボースまたはデオキシリボース、モルホリノホスホルアミダイト、ペプチド核酸連結、ロックド核酸連結、キサンチン、7-メチルグアニン、イノシン、ジヒドロウラシル、5-メチルシトシン、5-ヒドロキシメチルシトシン、およびその他を含み得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれるC. I. E Smith et al., Ann Rev Pharmacol Toxicol (2019) 59: 605-30を参照されたい。核酸は、二本鎖または一本鎖(例えば、センス鎖またはアンチセンス鎖)であり得る。核酸は、通常とは異なるまたは修飾されたヌクレオチドを含有し得る。「ポリヌクレオチド配列」および「核酸配列」という用語は、本明細書で使用される場合、互換的に、核酸分子の配列を指す。本明細書では米国特許規則第1.822条に記載されているヌクレオチド塩基に対する命名法が使用される。
本開示の核酸は、CD2 CAR、トランスジェニックTCR、および/またはキメラポリペプチドをコードし得る。一部の実施形態では、本開示の核酸は、キメラポリペプチドとCAR(CD2 CARまたは先行技術のCARであり得る)の両方をコードし得る。一部の実施形態では、本開示の核酸は、キメラポリペプチドおよびトランスジェニックTCRの両方をコードし得る。一部の実施形態では、本開示の核酸は、CARおよびトランスジェニックTCRの両方をコードし得る。実施例9~11に示されている通り、キメラポリペプチド、CAR、および/またはトランスジェニックTCRをいずれもコードする核酸は、バイシストロニックまたはトリシストロニック核酸であり得、その場合、2つまたは3つのコード配列がIRES(配列内リボソーム進入部位)または2Aなどの自己切断性ポリペプチド配列をコードする配列によって隔てられており、これにより、各タンパク質の発現が別々にもたらされるか、または発現時に2つの別々のタンパク質への即時切断がもたらされる。2A配列の例としては、T2A、P2A、E2A、およびF2Aが挙げられる。ある実施形態では、核酸はCD2 CARをコードする。一部の実施形態では、実施例12~15に示されている通り、CARおよび/またはTCR、およびキメラポリペプチドの別々の構築物を同時形質導入する。ある実施形態では、核酸は、キメラポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、核酸は、トランスジェニックTCRをコードする。ある実施形態では、核酸は、CARおよびキメラポリペプチドをコードするバイシストロニック核酸である。ある実施形態では、CARおよびキメラポリペプチドをコードする配列は、2A配列によって隔てられている。ある実施形態では、2A配列は、P2A配列である。ある実施形態では、核酸は、CARおよびキメラポリペプチドをコードする。ある実施形態では、核酸は、CD2 CARおよびキメラポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、組換え核酸は、例えば、目的のタンパク質または調節配列(例えば、プロモーター配列)をコードする構造遺伝子などの異種核酸配列と作動可能に連結している。一部の実施形態では、組換え核酸は、発現カセットまたはベクターとさらに定義される。一部の実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターである。
本明細書に開示される一部の実施形態は、本明細書に開示される組換え核酸分子を含むベクターまたは発現カセットに関する。発現カセットは、コード配列、ならびにレシピエント細胞、in vivoおよび/またはex vivoにおけるコード配列の適当な転写および/または翻訳を方向付けるための十分な調節情報を含有する遺伝子材料の構築物である。所望の宿主細胞を標的とするために発現カセットをベクターに挿入することができる。したがって、発現カセットという用語は「発現構築物」という用語と互換的に使用され得る。
本明細書に開示されるCARおよびキメラポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子の1つまたは複数を含有するベクター、プラスミドまたはウイルスも本明細書に提示される。上記の核酸分子は、例えば、ベクターを用いて形質導入された細胞におけるそれらの発現を方向付けることが可能なベクターに含有させることができる。真核細胞における使用に適したベクターは、当技術分野で公知であり、市販されている、あるいは、当業者によって容易に調製される。追加のベクターを、例えば、Ausubel, F. M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, (Current Protocol, 1994)およびSambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 2nd Ed. (1989)においても見いだすことができる。
したがって、一部の実施形態では、本開示のCAR、TCR、および/またはキメラポリペプチドを、ベクター、一般に、発現ベクターから発現させることができる。ベクターは、宿主細胞における自律複製に有用なものであるか、または、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより、宿主ゲノムと一緒に複製されるものである(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)。発現ベクターは、それらが作動可能に連結したコード配列の発現を方向付けることが可能である。一般に、組換えDNA技法において有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミド(ベクター)の形態である。しかし、他の形態の発現ベクター、例えば、ウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス)なども包含される。
DNAベクターは、従来の形質転換またはトランスフェクション技法によって真核細胞に導入することができる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.)および他の標準の分子生物学実験マニュアルに見いだすことができる。
使用に適したベクターとして、哺乳動物細胞における使用のためのpMSXND発現ベクターが挙げられる。一部の実施形態では、そのようなベクターにおいて、主題のCARおよび/またはTCRをコードする核酸挿入物を、例えば、発現を実現させようとしている細胞型に基づいて選択されるプロモーターと作動可能に連結することができる。本開示において使用することができるウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスの、アデノウイルスの、およびアデノ随伴ベクター、ヘルペスウイルス、シミアンウイルス40(SV40)、およびウシパピローマウイルスベクターが挙げられる(例えば、Gluzman (Ed.), Eukaryotic Viral Vectors, CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照されたい)。
一部の実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクターであり得る。「ウイルスベクター」という用語は、一般には、細胞のゲノム内への核酸分子の移入、もしくは組込みを容易にするウイルス由来の核酸エレメントを含む核酸分子、または、核酸移入を媒介するウイルス粒子のいずれかを指すために広く使用されている。ウイルス粒子は、一般には、核酸に加えて、ウイルス成分を含み、時には宿主細胞成分も含む。本明細書で使用されるレトロウイルスベクターは、レトロウイルスに主に由来する構造的および機能的遺伝子エレメントまたはその一部を含有する。レトロウイルスレンチウイルスベクターは、レンチウイルス(レトロウイルスのサブタイプ)に主に由来するLTRを含めた構造的および機能的遺伝子エレメントまたはその一部を含有する。
本開示において使用することができるウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター(レンチウイルスベクターを含む)、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルス、シミアンウイルス40(SV40)、およびウシパピローマウイルスベクターが挙げられる(例えば、Gluzman (Ed.), Eukaryotic Viral Vectors, CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照されたい)。
一部の実施形態では、核酸分子を当技術分野で公知のウイルスまたは非ウイルス送達ビヒクルによって送達する。例えば、核酸分子を宿主ゲノム内に安定に組み込むことができる、または、エピソーム複製させることができる、もしくは安定なもしくは一過性発現のために組換え宿主細胞内にミニサークル発現ベクターとして存在させることができる。したがって、本明細書に開示される一部の実施形態では、核酸分子を組換え宿主細胞内でエピソーム単位として維持させ、複製させる。一部の実施形態では、核酸分子を組換え細胞のゲノム内に安定に組み込む。安定な組込みは、古典的なランダムゲノム組換え技法を使用して、またはより精密なゲノム編集技法を用いて、例えば、ガイドRNAにより方向付けられるCRISPR/Cas9、DNAによりガイドされるエンドヌクレアーゼゲノム編集NgAgo(Natronobacterium gregoryiアルゴノート(Argonaute))、もしくはTALENゲノム編集(転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ)を使用して実現することもできる。一部の実施形態では、核酸分子を安定なまたは一過性発現のために組換え宿主細胞内にミニサークル発現ベクターとして存在させる。
核酸分子をウイルスカプシドまたは脂質ナノ粒子に封入することができる。あるいは、エンドヌクレアーゼポリペプチド(複数可)を当技術分野で公知のウイルスまたは非ウイルス送達ビヒクル、例えば、電気穿孔または脂質ナノ粒子などによって送達することができる。例えば、細胞への核酸の導入は、ウイルスによる形質導入法を使用して実現することができる。非限定的な例では、アデノ随伴ウイルス(AAV)は、ウイルスによる形質導入によって核酸を標的細胞に送達するために操作することができる、エンベロープを有さないウイルスである。いくつかのAAV血清型が記載されており、公知の血清型は全て、多数の多様な組織型由来の細胞に感染し得る。AAVは、広範囲の種および組織へのin vivoにおける形質導入が可能であり、毒性のエビデンスは認められておらず、また、AAVにより生じる自然免疫および適応免疫応答は比較的軽度である。
レンチウイルス系もウイルスによる形質導入を介した核酸送達および遺伝子治療に有用である。レンチウイルスベクターは、以下を含めたいくつかの遺伝子送達ビヒクルとして魅力的な特性をもたらすものである:(i)宿主細胞のゲノム内への安定なベクター組込みによる持続的な遺伝子送達;(ii)分裂細胞および非分裂細胞のどちらにも感染できること;(iii)重要な遺伝子治療および細胞治療の標的細胞型を含む広範な組織向性;(iv)ベクター形質導入後にウイルスタンパク質が発現されないこと;(v)ポリシストロニックまたはイントロン含有配列などの複雑な遺伝子エレメントを送達することができること;(vi)潜在的により安全な組込み部位プロファイル(例えば、腫瘍形成の潜在性がわずかであるか全くない部位を組込みの標的とすることによって);および(vii)ベクター操作および作製のための比較的容易な系。
F.操作された細胞
CD2 CAR、トランスジェニックTCRおよび/またはキメラポリペプチドをコードする核酸を含有し、それを発現する、操作された細胞もまた本開示の1つの態様である。本開示の操作された細胞は、形質導入された細胞、すなわち、核酸分子、例えば、CARおよび/またはトランスジェニックTCRをコードする核酸分子が組換えDNA技法によって導入された細胞である。そのような細胞の後代も本開示の範囲内に入るとみなされる。本開示の操作された細胞は、がんなどの過剰増殖性疾患および障害の処置を補助するために有用である。
CD2 CAR、トランスジェニックTCRおよび/またはキメラポリペプチドをコードする核酸を含有し、それを発現する、操作された細胞もまた本開示の1つの態様である。本開示の操作された細胞は、形質導入された細胞、すなわち、核酸分子、例えば、CARおよび/またはトランスジェニックTCRをコードする核酸分子が組換えDNA技法によって導入された細胞である。そのような細胞の後代も本開示の範囲内に入るとみなされる。本開示の操作された細胞は、がんなどの過剰増殖性疾患および障害の処置を補助するために有用である。
本開示の操作された細胞は、本開示の特色を欠くCAR-T細胞と比較して、機能特性の改善を示し得る。例えば、CD2シグナル伝達ドメイン、トランスジェニックTCR、および/またはキメラポリペプチドを含むCARを有する本開示の操作された細胞は、CD58の発現をダウンレギュレートするかもしくはCD58を実質的に発現しない標的細胞に対する有効性の改善を示し得る;選択された抗原をダウンレギュレートするかもしくは変異形態の選択された抗原を発現する標的細胞に対する有効性の改善を示し得る;かつ/または標的細胞に対する選択性の改善を示す。ある実施形態では、操作された細胞は、腫瘍微小環境において腫瘍特異的抗原に応答してネイティブCD2と架橋結合し得る分子(分泌されるかまたは表面に発現される)を発現し得る。CD58の発現をダウンレギュレートするかまたはCD58を実質的に発現しない標的細胞に対する有効性の改善は、低下したレベルのCD58または非機能的な変異形態のCD58を発現する標的細胞を使用して本開示の操作された細胞を従来のCAR-T細胞と比較する、実験室での実験によって決定することができ、ここで、有効性の改善は、標的細胞を死滅させるまたは阻害する能力が優れていることの任意の実証であり得る。同様の実験により、選択された標的抗原の発現がダウンレギュレートされている標的細胞に対する有効性の改善を決定することができる。選択性の改善は、in vivoにおいてまたは適切なin vitroモデルにおいてオンターゲットオフ腫瘍(on-target off-tumor)活性の低下を測定することによって実証することができる。
一部の実施形態では、宿主細胞に対して、例えば、例えばウイルスベクターもしくは宿主細胞のゲノムの一部と相同な核酸配列を含む相同組換え用ベクターであり得る、または目的のポリペプチドを発現させるための発現ベクターであり得る本開示のベクター構築物を用いて、遺伝子操作(例えば、形質導入、形質転換、またはトランスフェクト)を行うことができる。宿主細胞は、形質転換されていない細胞または少なくとも1つの核酸分子を用いてすでにトランスフェクトされている細胞のいずれであってもよい。一部の実施形態では、宿主細胞は、免疫細胞、幹細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞、またはヒト細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、自己または同種のものである。一部の実施形態では、宿主細胞は、T細胞、CD8陽性T細胞、CD4陽性T細胞、調節性T細胞、細胞傷害性T細胞、または腫瘍浸潤性リンパ球である。
宿主細胞に、CD2 CARおよび/もしくはトランスジェニックTCRをコードする核酸、またはCARおよび/もしくはトランスジェニックTCRとそれに加えてキメラポリペプチドをコードする1つもしくは複数の核酸を形質導入することができる。例えば、これだけに限定することなく、宿主細胞に、CARおよび/またはトランスジェニックTCRをコードする核酸、および追加のキメラポリペプチドをコードする核酸を形質導入することができる。ある実施形態では、宿主細胞に、CARおよびキメラポリペプチドをコードするバイシストロニック核酸を形質導入する。ある実施形態では、宿主細胞に、CARおよびトランスジェニックTCRをコードするバイシストロニック核酸を形質導入する。ある実施形態では、宿主細胞に、CAR、トランスジェニックTCRおよび/またはキメラポリペプチドをコードするトリシストロニック核酸を形質導入する。一部の実施形態では、宿主細胞に、例えば、これだけに限定されないが、抗体、その抗体断片、またはCD2を刺激することが可能なタンパク質治療薬などの1つまたは複数の追加の治療剤をコードする追加の核酸をさらに形質導入する。一部の実施形態では、ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、チェックポイント阻害剤、T細胞アゴニスト抗体、化学療法、および/または二重特異性抗体をCAR T細胞または他の養子移入されるT細胞と組み合わせることができる。
一部の実施形態では、組換え細胞は、動物細胞である。一部の実施形態では、動物細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、動物細胞は、マウス細胞である。一部の実施形態では、動物細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、組換え細胞は、免疫系細胞、例えば、リンパ球(例えば、これだけに限定することなく、T細胞、ナチュラルキラー細胞もしくはNK細胞、ナチュラルキラーT細胞もしくはNKT細胞、B細胞、形質細胞、腫瘍浸潤性リンパ球(TIL))、単球もしくはマクロファージ、または樹状細胞である。一部の実施形態では、免疫系細胞は、B細胞、T細胞、単球、樹状細胞、および上皮細胞からなる群より選択される。一部の実施形態では、免疫系細胞は、Tリンパ球である。免疫細胞はまた、前駆細胞、すなわち、免疫細胞に分化することが可能な細胞であってもよい。
多種多様な上記の宿主細胞および種を形質転換するための技法は、当技術分野で公知であり、技術および科学文献に記載されている。一部の実施形態では、形質導入手順、電気穿孔手順、または微粒子銃手順によって核酸分子を宿主細胞に導入する。したがって、本明細書に開示される少なくとも1つの組換え細胞を含む細胞培養物も本出願の範囲内に入る。細胞培養物を生成し、維持するための適切な方法およびシステムは当技術分野で公知である。本開示の1つの態様は、細胞に、本開示のCD2 CARおよび/またはキメラポリペプチドをコードする核酸を、その核酸が発現されるような様式で形質導入することにより、操作された細胞を作出するための方法である。
関連する態様では、本開示の一部の実施形態は、本明細書に開示される少なくとも1つの組換え細胞を含む細胞培養物、および培養培地に関する。一般に、培養培地は、本明細書に記載の細胞培養のための適切な培養培地のいずれか1つであり得る。一部の実施形態では、組換え細胞は、本明細書に記載のCARおよび/またはキメラポリペプチドを発現する。
G.抗体
本開示の1つの態様は、CAR-T療法においてCARおよび/またはトランスジェニックTCRと共に使用するための抗体またはその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、多重特異性である。一部の実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性である。ある実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、二重特異性(例えば、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原およびCD2)である。一部の実施形態では、多重特異性抗体は、三重特異性である。ある実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、三重特異性(例えば、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原、CD2、およびCD3)である。一部の実施形態では、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原は、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原(CEA)、ベータ-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファ-フェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、mut HSP70-2、M-CSF、前立腺特異的抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、プロステイン、PSMA、HER2、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、CD22、インスリン増殖因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受容体、GD2、GD3、B7-H3、GPC2、L1CAM、EGFR、メソテリン、MART-1、gp100(Pmel 17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15、p53、Ras、HER-2、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EBVA、ヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6およびE7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO-1、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-カテニン、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-フェトプロテイン、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68/P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733/EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TAG72、TLP、TPS CD19、CD20、CD22、ROR1、およびGD2からなる群より選択される。
本開示の1つの態様は、CAR-T療法においてCARおよび/またはトランスジェニックTCRと共に使用するための抗体またはその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、多重特異性である。一部の実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性である。ある実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、二重特異性(例えば、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原およびCD2)である。一部の実施形態では、多重特異性抗体は、三重特異性である。ある実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、三重特異性(例えば、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原、CD2、およびCD3)である。一部の実施形態では、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原は、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原(CEA)、ベータ-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファ-フェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、mut HSP70-2、M-CSF、前立腺特異的抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、プロステイン、PSMA、HER2、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、CD22、インスリン増殖因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受容体、GD2、GD3、B7-H3、GPC2、L1CAM、EGFR、メソテリン、MART-1、gp100(Pmel 17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15、p53、Ras、HER-2、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EBVA、ヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6およびE7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO-1、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-カテニン、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-フェトプロテイン、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68/P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733/EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TAG72、TLP、TPS CD19、CD20、CD22、ROR1、およびGD2からなる群より選択される。
ネイティブ抗体およびネイティブ免疫グロブリン(Ig)は、2本の同一の軽鎖および2本の同一の重鎖で構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり得る。抗体は、四量体ではない可能性があるラクダ科動物(camelid)抗体をさらに指す。各軽鎖は、一般には重鎖と1つの共有結合性ジスルフィド結合によって連結され得るが、一方でジスルフィド連結の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変動し得る。各重鎖および軽鎖は、規則的に間隔が空いた鎖内ジスルフィド架橋を有し得る。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン(「VH」)、続いて多数の定常ドメイン(「CH」)を有し得る。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン(「VL」)、および他方の末端に定常ドメイン(「CL」)を有し得る;軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第1の定常ドメインと整列され得、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列され得る。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの境界面を形成し得る。
一部の場合では、抗体またはその抗原結合性断片は、単離された抗体もしくはその抗原結合性断片、精製された抗体もしくはその抗原結合性断片、組換え抗体もしくはその抗原結合性断片、改変された抗体もしくはその抗原結合性断片、または合成抗体もしくはその抗原結合性断片を含む。本明細書の抗体および抗原結合性断片は、部分的にまたは完全に合成的に作製することができる。抗体または抗原結合性断片は、抗原結合性ドメインであり得るまたは抗原結合性ドメインと相同であり得る結合性ドメインを有する、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。一部の場合では、抗体またはその抗原結合性断片を適当なin vivo動物モデルにおいて産生させ、次いで、単離および/または精製することができる。
本開示において有用な抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、脱免疫化抗体、それらの変異体、それらの融合物、それらの免疫コンジュゲート、それらの抗原結合性断片、ならびに/または、抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、および共有結合により修飾された抗体を含めた、必要な特異性の抗原認識部位を含む任意の他の修飾された構成の免疫グロブリン分子を包含し得る。
本明細書の抗体はいずれも多重特異性であり得る。ある実施形態では、多重特異性抗体は、三重特異性(例えば、抗腫瘍抗原、CD2、およびCD3)であり得る。別の実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性(例えば、抗腫瘍抗原およびCD2)であり得る。二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対する結合特異性を有し、本明細書に開示される抗体を使用して調製することができる抗体であり得る。二重特異性抗体を作出するための典型的な方法は記載されている(例えば、Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121: 210を参照されたい)。二重特異性抗体の組換えによる産生は、2本の重鎖が異なる特異性を有する、2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき得る(Millstein and Cuello, 1983, Nature, 305, 537-539)。二重特異性抗体は、一方の腕の第1の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖および他方の腕のハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第2の結合特異性をもたらす)で構成され得る。二重特異性分子の片方だけに免疫グロブリン軽鎖を有するこの非対称的な構造により、所望の二重特異性化合物の望ましくない免疫グロブリン鎖の組合せからの分離が容易になり得る。
本明細書の抗体のいずれかの機能性断片も意図されている。「抗体の抗原結合性部分」、「抗原結合性断片」、「抗原結合性ドメイン」、「抗体断片」または「抗体の機能性断片」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つまたは複数の断片を指し得る。代表的な抗原結合性断片としては、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dsFv、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、可変NARドメイン、二重特異性scFv、二重特異性Fab2、三重特異性Fab3、AVIMER(登録商標)、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、マキシボディ(maxibody)、ラクダ科動物抗体、VHH、ミニボディ、イントラボディ(intrabody)、抗体部分(例えば、ドメイン抗体)を含む融合タンパク質、および単鎖結合ポリペプチドが挙げられる。
「F(ab’)2」および「Fab’」部分は、Igをペプシンおよびパパインなどのプロテアーゼで処理することによって作製することができるものであり、免疫グロブリンを2本の重鎖のそれぞれのヒンジ領域の間に存在するジスルフィド結合付近で消化することによって生成される抗体断片が含まれる。例えば、パパインにより、IgGを2本の重鎖のそれぞれのヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の上流で切断して、VLおよびCL(軽鎖定常領域)で構成される軽鎖とVHおよび重鎖の定常領域内のCHγ1(γ1)領域)で構成される重鎖断片がそれらのC末端領域でジスルフィド結合によって接続した、2つの相同な抗体断片を生成することができる。これらの2つの相同な抗体断片それぞれをFab’と称することができる。ペプシンによりIgGを2本の重鎖のそれぞれのヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の下流で切断して、2つの上記のFab’がヒンジ領域で接続した断片よりもわずかに大きい抗体断片を生成することもできる。この抗体断片をF(ab’)2と称することができる。
Fab断片は、同様に軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)を含み得る。Fab’断片は、抗体ヒンジ領域由来の1つまたは複数のシステインを含む少数の残基が重鎖CH1ドメインのカルボキシル末端に付加されていることにより、Fab断片とは異なる。Fab’-SHは、定常ドメインのシステイン残基(複数可)が遊離のチオール基を有するFab’であり得る。F(ab’)2抗体断片は、例えば、間にヒンジシステインを有するFab’断片の対として作製することができる。抗体断片の他の化学的カップリングも使用することができる。
「Fv」は、本明細書で使用される場合、完全な抗原認識および抗原結合性部位を含有する抗体断片を指し得る。この領域は、密接な非共有結合性または共有結合性の会合での1つの重鎖可変ドメインと1つの軽鎖可変ドメインの二量体からなり得る(ジスルフィド連結したFvが記載されている。例えば、Reiter et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 1239-1245を参照されたい)。この構成では、各可変ドメインの3つのCDRが相互作用してVH-VL二量体の表面上の抗原結合性部位を規定し得る。集合的に、VH鎖およびVL鎖のそれぞれに由来し得るCDRの1つまたは複数の組合せにより、抗体に抗原結合特異性が付与される。例えば、CDRH3とCDRL3は、レシピエント抗体のVH鎖およびVL鎖またはその抗原結合性断片に移入した場合に抗体に抗原結合特異性を付与するために十分であり得、このCDRの組合せを、結合、特異性、親和性などについて、例えば、本明細書に記載の技法を使用して試験することができる。一部の場合では、単一の可変ドメイン(または抗原に対して特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分)であっても、抗原を認識し、それに結合する能力を有し得るが、第2の可変ドメインと組み合わせた場合よりも特異性または親和性が低い可能性がある。さらに、Fv断片の2つのドメイン(VLおよびVH)は別々の遺伝子によってコードされ得るが、これらを、組換え方法を使用し、例えば、VLおよびVH領域対が一価の分子を形成した単一のタンパク質鎖にすることが可能な合成リンカーによって接合することができる(単鎖Fv(scFv)として公知;Bird et al. (1988) Science 242: 423-426;Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883;およびOsbourn et al. (1998) Nat. Biotechnol. 16: 778)。そのようなscFvは、抗体の「抗原結合性部分」という用語に包含され得る。完全なIg(例えば、IgG)分子または他のアイソタイプをコードする発現ベクターを生成するために、特定のscFvの任意のVH配列およびVL配列をFc領域cDNAまたはゲノム配列と連結することができる。VHおよびVLを、タンパク質化学または組換えDNA技術を使用したFab、Fv、またはIgの他の断片の生成に使用することもできる。
「単鎖Fv」または「sFv」抗体断片は、抗体のVHドメインおよびVLドメインを含み得、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在し得る。一部の実施形態では、Fvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインの間に、sFvが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含み得る。sFvの概説については、例えば、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「dsFv」は、例えば、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のそれぞれの適切な部位にCys残基を導入し、次いで、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をジスルフィド結合によって安定化することによって得られるFv断片であり得る。各鎖内の、Cys残基を導入することができる部位は、分子モデリングによって予測されるコンフォメーションに基づいて決定することができる。本開示では、例えば、上記の抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列からコンフォメーションを予測することができ、次いで、そのような予測に基づいて、変異が導入された、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のそれぞれをコードするDNAを構築することができる。次いで、DNA構築物を適切なベクターに組み入れ、上述のベクターで形質転換することによって得られた形質転換体から調製することができる。
ダイアボディは、単鎖抗体であり得る。ダイアボディは、VHドメインおよびVLドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現し得るが、同じ鎖上の2つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それにより、これらのドメインが強制的に別の鎖の相補的なドメインと対合し、2つの抗原結合性部位が創出されるようにした、二価の二重特異性抗体であり得る(例えば、Holliger, P. , et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90: 6444-6448 (1993);およびPoljak, R. J. , et al., Structure, 2: 1121-1123 (1994)を参照されたい)。
H.処置方法
本開示の操作された細胞を、過剰増殖性障害、例えば、がんの治療を補助するために使用する。操作された細胞(または操作された細胞をin situで生成するための核酸)を、単独で、または他の作用物質(例えば、腫瘍微小環境において腫瘍特異的抗原に応答してネイティブCD2と架橋結合し得る抗体もしくはその抗原結合性断片、もしくは分子(投与されるか、分泌されるか、もしくは表面に発現される))と組み合わせて投与することにより、対象が経験する症状の数および/または重症度が低減すること、全生存または長期生存が増大すること、腫瘍細胞または他の過剰増殖細胞などの病理学的細胞が死滅すること、腫瘍量が減少すること、腫瘍細胞または他の過剰増殖細胞の成長が阻害されること、腫瘍細胞または他の過剰増殖細胞の拡散または増殖が阻害されることなどによって、処置または治療が補助される。一部の実施形態では、ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、チェックポイント阻害剤、T細胞アゴニスト抗体、化学療法、および/または二重特異性抗体をCAR T細胞または他の養子移入されるT細胞と組み合わせることができる。
本開示の操作された細胞を、過剰増殖性障害、例えば、がんの治療を補助するために使用する。操作された細胞(または操作された細胞をin situで生成するための核酸)を、単独で、または他の作用物質(例えば、腫瘍微小環境において腫瘍特異的抗原に応答してネイティブCD2と架橋結合し得る抗体もしくはその抗原結合性断片、もしくは分子(投与されるか、分泌されるか、もしくは表面に発現される))と組み合わせて投与することにより、対象が経験する症状の数および/または重症度が低減すること、全生存または長期生存が増大すること、腫瘍細胞または他の過剰増殖細胞などの病理学的細胞が死滅すること、腫瘍量が減少すること、腫瘍細胞または他の過剰増殖細胞の成長が阻害されること、腫瘍細胞または他の過剰増殖細胞の拡散または増殖が阻害されることなどによって、処置または治療が補助される。一部の実施形態では、ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、チェックポイント阻害剤、T細胞アゴニスト抗体、化学療法、および/または二重特異性抗体をCAR T細胞または他の養子移入されるT細胞と組み合わせることができる。
治療のために免疫細胞を投与するための方法が公知であり、提供される方法および組成物と併せて使用することができる。例えば、養子T細胞療法の方法がUS2003/0170238;US4690915;S.A. Rosenberg, Nat Rev Clin Oncol (2011) 8 (10): 577-85に記載されている。M. Themeli et al., Nat Biotechnol (2013) 31 (10): 928-33;およびT. Tsukahara et al., Biochem Biophys Res Commun (2013) 438 (1): 84-89も参照されたい。本開示のある態様では、方法は、本開示のCAR-T細胞を投与することを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の治療剤、例えば、キメラポリペプチドおよび/またはトランスジェニックTCRを伴う操作されたCAR-TおよびCAR-T細胞を、がんを有する、がんを有する疑いがある、またはがんが発生するリスクが高い個体を処置する方法に使用することができる。一部の実施形態では、がんは、CD58を過少発現する、またはもはやCD2とライゲーションすることができない変異形態のCD58を発現する。一部の実施形態では、がんは、白血病である。これらの場合には、白血病は、一般に、白血病の任意の型のものであり得る。一部の実施形態では、がんは、リンパ腫である。一部の実施形態では、がんは、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、B細胞前リンパ性白血病、前駆Bリンパ芽球性白血病、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、MALTリンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、またはB系統細胞の過成長を特徴とする別の障害である。
他の実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍がんである。一部の実施形態では、固形腫瘍細胞は、肺がん、肝がん、膵がん、胃がん、結腸がん、腎がん、脳がん、頭頸部がん、乳がん、皮膚がん、直腸がん、子宮がん、子宮頸がん(cervical cancer)、卵巣がん、精巣がん、皮膚がん、または食道がんである。一部の実施形態では、がんは、肉腫細胞、ラブドイドがん細胞、神経芽細胞腫細胞、網膜芽細胞腫細胞、または髄芽腫細胞を含む。一部の実施形態では、がんは、子宮癌肉腫(UCS)、脳の低グレード神経膠腫(LGG)、胸腺腫(THYM)、精巣胚細胞腫瘍(TGCT)、多形神経膠芽腫(GBM)および皮膚黒色腫(SKCM)、肝細胞癌(LIHC)、ぶどう膜黒色腫(UVM)、嫌色素性腎細胞癌(kidney chromophobe)(KICH)、甲状腺がん(THCA)、腎明細胞癌(KIRC)、乳頭状腎細胞癌(KIRP)、胃腺癌(STAD)、胆管癌(CHOL)、腺様嚢胞癌(ACC)、前立腺腺癌(PRAD)、褐色細胞腫および傍神経節腫(PCPG)、DLBC、肺腺癌(LUAD)、頭頸部扁平上皮癌(HNSC)、膵臓腺癌(PAAD)、乳がん(BRCA)、中皮腫(MESO)、結腸直腸腺癌(COAD)、直腸腺癌(READ)、食道癌(ESCA)、卵巣がん(OV)、肺扁平上皮癌(LUSC)、膀胱尿路上皮癌(BLCA)、肉腫(SARC)、または子宮体部内膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma)(UCEC)を含む。一部の実施形態では、投与された第1の治療剤により、対象におけるがんの腫瘍成長または転移が阻害される。一部の実施形態では、がんは、転移性がん細胞、多剤耐性がん細胞、または再発性がん細胞を含む。一部の実施形態では、投与された第1の治療剤により、対象におけるインターフェロンガンマ(IFNγ)および/またはインターロイキン2(IL-2)の産生の増加が付与される。一部の実施形態では、がんは、CD58の発現の低減を有する。一部の実施形態では、がんは、子宮癌肉腫(UCS)、脳の低グレード神経膠腫(LGG)、胸腺腫(THYM)、精巣胚細胞腫瘍(TGCT)、多形神経膠芽腫(GBM)、または皮膚黒色腫(SKCM)である。
本明細書に記載の操作された細胞の有効量は、意図された目標、例えば、腫瘍退縮に基づいて決定される。例えば、既存のがんが処置される場合、投与される、本明細書に開示される治療剤の量は、がんを予防するために治療剤を投与する場合よりも多くなり得る。当業者は、本開示を考慮して、投与される治療剤の量および投与の頻度を決定することができる。処置の数および用量の両方に従って投与される数量はまた、処置を受ける個体、個体の状態、および所望の保護にも依存する。治療剤の厳密な量はまた、実施者の判断にも依存し、各個体に独特のものになり得る。投与の頻度は、実施者の判断に応じて1~2日間から、2~6時間まで、6~10時間まで、1~2週間まで、またはそれより長くまでにわたり得る。
本開示のある特定の実施形態では、治療剤は、本明細書に記載の操作された細胞を含む水性組成物である。本開示の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体中に有効量の本明細書に開示される治療剤を含有する。したがって、本開示の「医薬調製物」または「医薬組成物」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張性剤ならびに吸収遅延剤などを含み得る。医薬活性物質のためのそのような媒体および作用剤の使用は当技術分野において周知である。従来の媒体または作用剤はいずれも、本明細書に開示される組換え細胞と適合しないものを除く限りでは、医薬組成物の製造におけるその使用が意図されている。補足的な活性成分を組成物に組み入れることもできる。ヒト投与に関しては、調製物は、FDA Center for Biologicsによって求められる無菌性、発熱性、一般的安全性、および純度の基準を満たすべきである。
本明細書に記載の操作された細胞を使用して、定着腫瘍を治癒すること、処置を受けた対象におけるがんの腫瘍成長または転移を、本明細書に開示される治療用組成物の1つの投与を受けていない対象における腫瘍成長または転移と比べて阻害することができる。一部の実施形態では、操作された細胞を使用して、インターフェロンガンマ(IFNγ)および/またはインターロイキン2(IL-2)、ならびに他の炎症促進性サイトカインの産生を誘導することによって腫瘍に対する免疫応答を刺激することができる。インターフェロンガンマ(IFNγ)および/またはインターロイキン2(IL-2)の産生を刺激して、本明細書に開示される治療用組成物の1つの投与を受けていない対象におけるインターフェロンガンマ(IFNγ)および/またはインターロイキン2(IL-2)の産生と比較して約20倍まで、例えば、約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、または20倍またはそれよりも大きい倍率のいずれかで産生させることができる。
本明細書で考察されている通り、操作された細胞を、例えば、化学療法薬もしくは抗がん剤もしくは抗がん治療、抗体もしくはその抗原結合性断片、または腫瘍微小環境において腫瘍特異的抗原に応答してネイティブCD2と架橋結合し得る分子(投与されるか、分泌されるか、または表面に発現される)などの1つまたは複数の追加の治療剤と組み合わせて投与することができる。1つまたは複数の追加の治療剤「と組み合わせて」投与することは、任意の順序での同時(並行)および連続的な投与を含む。一部の実施形態では、1つまたは複数の追加の治療剤、化学療法薬、抗がん剤、または抗がん治療は、化学療法、照射療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、および外科手術からなる群より選択される。「化学療法」と「抗がん剤」は本明細書では互換的に使用される。種々のクラスの抗がん剤を使用することができる。非限定的な例として、アルキル化剤、代謝拮抗薬、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ポドフィロトキシン、抗体(例えば、モノクローナルまたはポリクローナル)、チェックポイント阻害剤、免疫調節物質、サイトカイン、ナノ粒子、放射線療法、チロシンキナーゼ阻害剤(例えば、メシル酸イマチニブ)、ホルモン処置、可溶性受容体および他の抗腫瘍薬が挙げられる。一部の実施形態では、治療剤は、腫瘍微小環境において発現される腫瘍特異的抗原に応答して細胞のネイティブCD2と架橋結合することができる、分泌されるか、表面に発現されるか、または投与される分子である。一部の実施形態では、T細胞に、1つまたは複数の抗CD2 scFv、抗体、Fab、DARPIN、リガンド、または他の結合物質/抗原結合性ドメインを使用することによって細胞のネイティブCD2と架橋結合することが可能な分泌型分子を構成的に発現するように形質導入することができる。あるいは、分泌型分子を活性化スイッチの下で発現させることができる。分泌型分子は、膜結合型であり得、リンカーによって接続された2つのscFvからなり得る:一方は、T細胞上のCD2に結合するscFv(ネイティブCD2シグナル伝達を活性化する)であり、他方は、腫瘍細胞上に発現されるタンパク質または標的を認識するscFvまたはリガンドであり、したがって、T細胞が腫瘍細胞と遭遇するとCD2が架橋結合し、活性化される。
トポイソメラーゼ阻害剤は、同様に本発明において使用することができる別のクラスの抗がん剤である。トポイソメラーゼは、DNAのトポロジーを維持する必須酵素である。I型またはII型トポイソメラーゼの阻害により、適当なDNA高次コイルを混乱させることによってDNAの転写および複製の両方が妨害される。I型トポイソメラーゼ阻害剤のいくつかとして、カンプトテシン:イリノテカンおよびトポテカンが挙げられる。II型阻害剤の例としては、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、およびテニポシドが挙げられる。これらは、ポドフィルム(American Mayapple)(Podophyllum peltatum)の根に天然に存在するアルカロイドであるエピポドフィロトキシンの半合成誘導体である。
抗腫瘍薬としては、免疫抑制剤ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミドが挙げられる。抗腫瘍化合物は、一般に、細胞のDNAを化学修飾することによって働く。
アルキル化剤は、多くの求核性官能基を細胞内に存在する条件下でアルキル化することができる。シスプラチンおよびカルボプラチン、ならびにオキサリプラチンはアルキル化剤である。これらは、生物学的に重要な分子のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、およびリン酸基と共有結合を形成することによって細胞機能を損なわせる。
ビンカアルカロイドは、チューブリンの特定の部位に結合し、チューブリンの微小管へのアセンブリを阻害する(細胞周期のM期)。ビンカアルカロイドとしては、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、およびビンデシンが挙げられる。
代謝拮抗薬は、プリン(アザチオプリン、メルカプトプリン)またはピリミジンに似ており、これらの物質が細胞周期の「S」期の間にDNAに組み入れられるのを妨げ、正常な発生および分裂を停止させる。代謝拮抗薬はまた、RNA合成にも影響を及ぼす。
植物アルカロイドおよびテルペノイドは植物から得られ、微小管機能を妨げることによって細胞分裂を遮断する。微小管は細胞分裂のために極めて重要であるので、微小管がないと細胞分裂が起こり得ない。主要な例は、ビンカアルカロイドおよびタキサンである。タキサンは、パクリタキセルおよびドセタキセルを含む一群である。パクリタキセルは、元々はタキソールとして知られていた天然物であり、タイヘイヨウイチイ(Pacific Yew)木の樹皮から最初に引き出された。ドセタキセルは、パクリタキセルの半合成類似体である。タキサンは、微小管の安定性を増強し、後期の染色体の分離を妨げる。
ポドフィロトキシンは、植物由来の化合物であり、消化を助けることが報告されているだけでなく、2種の他の細胞増殖抑制薬、エトポシドおよびテニポシドを生成するために使用されている。これらは細胞がG1期(DNA複製の開始)およびDNAの複製(S期)に入るのを妨げる。
一部の実施形態では、抗がん剤は、レミケード、ドセタキセル、セレコキシブ、メルファラン、デキサメタゾン(Decadron(登録商標))、ステロイド、ゲムシタビン、シスプラチン、テモゾロミド、エトポシド、シクロホスファミド、テモダール、カルボプラチン、プロカルバジン、ギリアデル、タモキシフェン、トポテカン、メトトレキサート、ゲフィチニブ(Iressa(登録商標))、タキソール、タキソテール、フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、ゼローダ、CPT-11、インターフェロンアルファ、ペグ化インターフェロンアルファ(例えば、PEG INTRON-A)、カペシタビン、シスプラチン、チオテパ、フルダラビン、カルボプラチン、リポソームダウノルビシン、シタラビン、ドキセタキソール、パクリタキセル、ビンブラスチン、IL-2、GM-CSF、ダカルバジン、ビノレルビン、ゾレドロン酸、パルミトロネート(palmitronate)、ビアキシン(biaxin)、ブスルファン、プレドニゾン、ボルテゾミブ(Velcade(登録商標))、ビスホスホネート、三酸化ヒ素、ビンクリスチン、ドキソルビシン(Doxil(登録商標))、パクリタキセル、ガンシクロビル、アドリアマイシン、リン酸エストラムスチンナトリウム(Emcyt(登録商標))、スリンダク、エトポシド、およびこれらの任意の組合せから選択することができる。
他の実施形態では、抗がん剤は、ボルテゾミブ、シクロホスファミド、デキサメタゾン、ドキソルビシン、インターフェロン-アルファ、レナリドマイド、メルファラン、ペグ化インターフェロン-α、プレドニゾン、サリドマイド、またはビンクリスチンから選択することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の処置方法は、1つまたは複数の免疫チェックポイント分子を阻害する化合物の投与をさらに含む。一部の実施形態では、1つまたは複数の免疫チェックポイント分子には、CTLA4、PD-1、PD-L1、A2AR、B7-H3、B7-H4、TIM3、およびこれらの任意の組合せの1つまたは複数が含まれる。一部の実施形態では、1つまたは複数の免疫チェックポイント分子を阻害する化合物には、アンタゴニスト抗体が含まれる。一部の実施形態では、アンタゴニスト抗体は、イピリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、トレメリムマブ、またはアベルマブである。
一部の態様では、1つまたは複数の抗がん治療は、放射線療法である。一部の実施形態では、放射線療法は、がん性細胞を死滅させるための放射線の投与を含む。放射線は、DNAなどの細胞内の分子と相互作用して、細胞死を誘導する。放射線はまた、細胞膜および核膜ならびに他の細胞小器官に損傷を与え得る。放射線の型に応じて、DNA損傷の機構は、相対的な生物学的有効性と同様に変動し得る。例えば、重い粒子(プロトンおよび中性子)はDNAに直接損傷を与え、相対的な生物学的有効性が大きい。電磁放射線では、主に細胞内の水のイオン化によって生じる短寿命のヒドロキシルフリーラジカルを通じて作用する間接的なイオン化がもたらされる。放射線の臨床的適用は、外照射(外部供給源からの)および近接照射療法(患者に埋め込まれたまたは挿入された線源を使用する)からなる。外照射は、X線および/またはガンマ線からなり、一方、近接照射療法では、崩壊し、アルファ粒子、またはベータ粒子と一緒にガンマ線を放出する放射性核が使用される。放射線は、例えば、放射性同位元素のがん細胞への指向性送達を含むことも本明細書において意図されている。マイクロ波およびUV照射などの他の形態の、DNAに損傷を与える因子も本明細書において意図されている。
放射線は、単回線量でまたは一連の小線量を線量分割スケジュールでもたらすことができる。本明細書において意図されている放射線量は、例えば、約5~約80、約10~約50Gy、または約10Gyを含む、約1から約100Gyまでにわたる。総線量を分割レジメンで適用することができる。例えば、レジメンは、2Gyの分割された個々の線量を含み得る。放射性同位元素の投与量範囲は広範に変動し、同位元素の半減期ならび放出される放射線の強度および型に依存する。放射線が放射性同位元素の使用を含む場合、同位元素を、作用物質を標的組織(例えば、腫瘍組織)に運ぶ、治療用抗体などの標的化剤とコンジュゲートすることができる。
本明細書に記載の外科手術は、がん性組織の全部または一部を物理的に除去する、切り取る、および/または破壊する、切除術を含む。腫瘍の切除は、腫瘍の少なくとも一部の物理的な除去を指す。腫瘍の切除に加えて、外科手術による処置は、レーザー手術、冷凍外科、電気外科、および顕微鏡下手術(モース術)を含む。前癌組織または正常組織の除去も本発明で意図されている。
したがって、一部の実施形態では、本開示の方法は、個体に第2の治療剤、例えば、抗がん剤、化学療法薬、または抗がん治療などを投与することをさらに含む。一部の実施形態では、第2の抗がん剤または抗がん治療は、化学療法、照射療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、および外科手術からなる群より選択される。一部の実施形態では、第1の治療剤と第2の抗がん剤または治療を同時に投与する。一部の実施形態では、第1の治療剤と第2の抗がん剤または治療を逐次的に投与する。一部の実施形態では、第1の治療剤を、第2の抗がん剤または治療を投与する前に投与する。一部の実施形態では、第1の治療剤または治療を、第2の抗がん剤または治療の前および/またはその後に投与する。一部の実施形態では、第1の治療剤と第2の抗がん剤または治療を交代で投与する。一部の実施形態では、第1の治療剤を第2の抗がん剤または治療と同時に投与する。一部の実施形態では、第1の治療剤および第2の抗がん剤または治療を単一の製剤として一緒に投与する。
一部の実施形態では、本開示の操作された細胞を投与する前に、標的細胞(例えば、腫瘍細胞)による機能的CD58の発現を決定する。本開示の操作された細胞は、機能的CD58の低発現を有する標的細胞(例えば、CD58を少量発現するもしくは全く発現しない、または、変異しており、もはやCD2と有効にライゲーションしないCD58を発現する、標的細胞)に対して機能できることから、標的細胞がそのような特徴を示す場合に選択される治療になる。ある実施形態では、標的細胞(複数可)における機能的CD58発現レベルの決定を、操作された細胞を投与する前に提供する。決定は第3者によって提供され得る。ある実施形態では、機能的CD58発現レベルが閾値を下回る場合にのみ、操作された細胞を投与する。ある実施形態では、閾値は、標的細胞当たり約50,000、45,000、40,000、35,000、30,000、25,000、20,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000、10,000、9,000、8,000、7,000、6,000、5,000、4,000、3,000、2,000、1,000、または500の機能的CD58分子(CD2とライゲーションすることができるもの)である。機能的CD58の発現レベルは、標準の方法、例えば、フローサイトメトリーまたはマスサイトメトリーにより、CD58の機能的エピトープに対して特異的な抗体を使用して決定することができる(例えば、T.J. Dengler et al., Eur J Immunol (1992) 22 (11): 2809-17を参照されたい)。発現レベルは、T細胞活性化アッセイを使用して、例えば、CAR標的抗原を発現する標的細胞との接触に応答してCAR-T細胞によって産生されるIL-2および/またはIFNγの量を測定することによって決定することもできる(例えば、以下の実施例6を参照されたい):これらの結果を、CD58を種々の既知レベルで発現する(例えば、フローサイトメトリーによって決定される)モデル標的細胞(例えば、nalm6細胞)に対して較正することができる。この手法は、標的細胞が、CD2結合能が損なわれた変異形態のCD58を発現する場合に発現レベルを決定するために、完全に機能的なCD58の発現レベルと同等に、有用である。例えば、標的細胞により、細胞当たり11,000分子のCD58を発現するモデル細胞によって誘導される活性化とほぼ同様の程度のCAR-T細胞活性化が誘導される場合、標的細胞によって発現されるCD58分子の実数値(変異に起因して、より多くまたはより少なくCD2を活性化することができる)にかかわらず、11,000が、閾値発現を決定するための機能的CD58発現レベルになる。一部の実施形態では、CAR T処置において、CD58の喪失により、IFNγおよびIL-2産生が有意に減少し、その結果、CAR T細胞の有効性が低下する可能性がある。一部の実施形態では、本発明で提供されるCARはCD58の喪失の影響を受けないか、またはCD58喪失の影響がレスキューされる。一部の実施形態では、本発明で提供されるCARは、CD2を含み、CD58の状態にかかわらず、CD2を伴わない従来のCARよりも優れ得る。一部の実施形態では、本発明で提供されるCARでは、CD2を伴わない従来のCARと比較して腫瘍制御および生存が増強される。一部の実施形態では、本発明で提供されるCARは、細胞傷害に関して同程度の性能を示す。一部の実施形態では、CD2共刺激ドメインを4-1BB共刺激ドメインに追加することにより、CD58喪失に対するサイトカイン放出が改善される。一部の実施形態では、トランスCARおよびCD2構築物は、シスCARおよびCD2構築物よりも良好な性能を示す。一部の実施形態では、CD20を認識するCD2含有受容体と同時発現させたトランスCARは、CD58喪失に対するCAR T細胞機能をレスキューし得る。一部の実施形態では、CD20を認識するCD2含有受容体を同時発現させたトランスCARは、CD58喪失に対してCAR T細胞機能をレスキューし得、標的抗原(例えば、CD19)を喪失した細胞に対して活性を維持し得る。
I.システム
本開示の別の態様は、本開示の操作された細胞を投与することによってそれを必要とする対象の処置を補助するためのシステムである。対象は、一般に、少なくとも第1の抗原を有する標的細胞の増殖を特徴とする過剰増殖性障害を有するまたはそれを有するリスクがあると診断されている。操作された細胞は、第1の抗原に対して特異的な、CD2 CAR、またはCARとトランスジェニックTCRおよび/もしくはキメラポリペプチドの組合せを発現する。一部の実施形態では、標的細胞は、CD58の発現の低減もしくは非存在を示す、または、もはやCD2と有効にライゲーションしない変異体CD58を発現する。システムは、標的細胞上に存在するCD58の状態を決定するための、標識された結合性作用物質をさらに含む。これにより、本開示の操作された細胞の使用が別の薬剤の使用よりも好ましい場合を実施者が決定することが可能になる。本開示の操作された細胞が機能し、そして野生型CD58をわずかに発現するかまたは全く発現しない標的細胞を死滅させることができるので、特に、標的細胞が野生型CD58をわずかに発現するかまたは全く発現しないことが決定された場合にその必要性が示される。
本開示の別の態様は、本開示の操作された細胞を投与することによってそれを必要とする対象の処置を補助するためのシステムである。対象は、一般に、少なくとも第1の抗原を有する標的細胞の増殖を特徴とする過剰増殖性障害を有するまたはそれを有するリスクがあると診断されている。操作された細胞は、第1の抗原に対して特異的な、CD2 CAR、またはCARとトランスジェニックTCRおよび/もしくはキメラポリペプチドの組合せを発現する。一部の実施形態では、標的細胞は、CD58の発現の低減もしくは非存在を示す、または、もはやCD2と有効にライゲーションしない変異体CD58を発現する。システムは、標的細胞上に存在するCD58の状態を決定するための、標識された結合性作用物質をさらに含む。これにより、本開示の操作された細胞の使用が別の薬剤の使用よりも好ましい場合を実施者が決定することが可能になる。本開示の操作された細胞が機能し、そして野生型CD58をわずかに発現するかまたは全く発現しない標的細胞を死滅させることができるので、特に、標的細胞が野生型CD58をわずかに発現するかまたは全く発現しないことが決定された場合にその必要性が示される。
ある実施形態では、標識された結合性作用物質は、CD58に特異的に結合する標識された抗体もしくは抗体誘導体、または化合物を含む。ある実施形態では、CD58に対して特異的な標識された結合性作用物質は、標識された抗体を含む。ある実施形態では、標識された結合性作用物質は、可溶性CD2タンパク質である。ある実施形態では、標識は、X線撮影によってイメージングすることができる放射性原子を含む。ある実施形態では、標識は、蛍光分子を含む。ある実施形態では、標識は、発光分子を含む。ある実施形態では、標識は、比色定量分子(colorimetric molecule)を含む。ある実施形態では、標識は、別の検出可能な分子(例えば、放射性標識されたアビジンなど)と結合することが可能なビオチン、アビジン、またはストレプトアビジンなどの結合性作用物質を含む。本開示の標識された結合性作用物質をin vivoまたはex vivoで使用することができる。
本開示の実施には、別段の指定のない限り、当業者に周知の分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の従来の技法を使用する。そのような技法は、本明細書において引用されている文献において十分に説明されている。
さらなる実施形態を、実例として提示され、どのようにも本開示の範囲または特許請求の範囲を限定するものではない以下の実施例においてさらに詳細に開示する。
材料および方法
以下の方法および材料を下記の実施例において使用した。
以下の方法および材料を下記の実施例において使用した。
1.キメラ抗原受容体(CAR)およびキメラポリペプチドの合成
scFvをコードする遺伝子を遺伝子断片(gBlock、IDT DNA)、またはGeneArt(Life Technologies)により合成された、遺伝子をコードするプラスミドのいずれかとして合成し、次いで、制限クローニング(Roche)またはIn-fusionクローニング(Takara)を使用してMSGV1レトロウイルス発現ベクターにクローニングした。CD19-BBzまたはCD22-BBzを有するCARを、CD8αヒンジドメインおよびCD8α膜貫通ドメインを有するように構築した。CD19-28zを有するCARを、CD28ヒンジおよび膜貫通ドメインを有するように構築した。CD2シグナル伝達ドメインを有するCARを、CD8αヒンジおよび膜貫通ドメインを有するように構築した。
scFvをコードする遺伝子を遺伝子断片(gBlock、IDT DNA)、またはGeneArt(Life Technologies)により合成された、遺伝子をコードするプラスミドのいずれかとして合成し、次いで、制限クローニング(Roche)またはIn-fusionクローニング(Takara)を使用してMSGV1レトロウイルス発現ベクターにクローニングした。CD19-BBzまたはCD22-BBzを有するCARを、CD8αヒンジドメインおよびCD8α膜貫通ドメインを有するように構築した。CD19-28zを有するCARを、CD28ヒンジおよび膜貫通ドメインを有するように構築した。CD2シグナル伝達ドメインを有するCARを、CD8αヒンジおよび膜貫通ドメインを有するように構築した。
2.レトロウイルスベクターの作製およびT細胞形質導入
以前に記載されている通り、293GPパッケージング細胞株の一過性トランスフェクションによってレトロウイルス上清を作製した。簡単に述べると、70%コンフルエントの細胞を、150mmのポリ-D-リシン培養皿中、CARおよびRD114エンベロープタンパク質をコードするプラスミドを用い、Lipofectamine(登録商標)2000(Life Technologies)によって同時トランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後および48時間後に培地を交換した。トランスフェクションの48時間および72時間後にウイルス上清を回収し、遠心分離して細胞片を除去し、使用するまで-80℃で保管した。
以前に記載されている通り、293GPパッケージング細胞株の一過性トランスフェクションによってレトロウイルス上清を作製した。簡単に述べると、70%コンフルエントの細胞を、150mmのポリ-D-リシン培養皿中、CARおよびRD114エンベロープタンパク質をコードするプラスミドを用い、Lipofectamine(登録商標)2000(Life Technologies)によって同時トランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後および48時間後に培地を交換した。トランスフェクションの48時間および72時間後にウイルス上清を回収し、遠心分離して細胞片を除去し、使用するまで-80℃で保管した。
初代ヒトT細胞を健康なドナーからRosetteSep Human T cell Enrichment kit(Stem Cell Technologies)を使用し、Stanford Blood Centerから入手したバフィーコートを使用して単離し、製造者のプロトコールに従い、Lymphoprep(登録商標)密度勾配培地およびSepMate-50管を使用して処理した。単離されたT細胞をCryoStor CS10凍結保存培地(Stem Cell Technologies)中で凍結保存した。凍結保存したT細胞を、解凍し、5%FBS、10mMのHEPES、2mMのL-グルタミン、100U/mLのペニシリン、および100μg/mLのストレプトマイシン(Gibco)を補充し、100IU/mlの組換えIL-2(Preprotech)を伴うAIM-V培地中、Human T-Expander CD3/CD28 Dynabeads(Gibco)をビーズ:細胞の比3:1で用いて、活性化した。活性化後2日目および3日目に、T細胞にレトロウイルスベクターを用いて形質導入を行い、5日目に抗CD3/CD28ビーズを除去した。Car T細胞を、IL-2を伴うT細胞培地中、1mL当たり細胞0.3~1×106個に維持した。Dylight650で標識した可溶性、組換え、ヒトCD19またはCD22と共にインキュベートした後、CAR発現をフローサイトメトリーによって評価した。活性化後10日目にCAR-T細胞をin vitroアッセイに使用したかまたはマウスに移入した。
3.ELISA
CAR+T細胞1×105個と腫瘍細胞1×105個を完全RPMI-1640中、3連で共インキュベートすることによってサイトカイン放出をアッセイした。24時間の時点で、培養培地を収集し、IFNγおよびIL-2 MAb(BioLegend)を使用してサイトカインを測定した。
CAR+T細胞1×105個と腫瘍細胞1×105個を完全RPMI-1640中、3連で共インキュベートすることによってサイトカイン放出をアッセイした。24時間の時点で、培養培地を収集し、IFNγおよびIL-2 MAb(BioLegend)を使用してサイトカインを測定した。
4.IncuCyte(登録商標)死滅アッセイ
IncuCyte(登録商標)インキュベーター死滅アッセイのために、GPF陽性腫瘍細胞5×104個を、96ウェル平底プレートに3連でプレーティングし、CAR陽性T細胞または等価数の対照CAR T細胞と、エフェクター対標的比1:1でRPMI-1640 200μl中で共インキュベートした。2~3時間毎にIncuCyte(登録商標)ZOOM Live-Cell analysis system(Essen Bioscience)を使用してプレートのイメージングを行い、各時点で10×ズームの画像をウェル当たり4枚収集した。ウェル当たりの総GFP積分強度を生存可能なGFP陽性腫瘍細胞の定量的尺度として評価した。値を出発測定値に対して正規化し、経時的にプロットした。
IncuCyte(登録商標)インキュベーター死滅アッセイのために、GPF陽性腫瘍細胞5×104個を、96ウェル平底プレートに3連でプレーティングし、CAR陽性T細胞または等価数の対照CAR T細胞と、エフェクター対標的比1:1でRPMI-1640 200μl中で共インキュベートした。2~3時間毎にIncuCyte(登録商標)ZOOM Live-Cell analysis system(Essen Bioscience)を使用してプレートのイメージングを行い、各時点で10×ズームの画像をウェル当たり4枚収集した。ウェル当たりの総GFP積分強度を生存可能なGFP陽性腫瘍細胞の定量的尺度として評価した。値を出発測定値に対して正規化し、経時的にプロットした。
(実施例1)
CD58欠失によるCAR-Tサイトカイン放出の障害
この実験は、CD58が存在しないことのCAR-Tサイトカイン放出に対する影響を決定するために実施した。
CD58欠失によるCAR-Tサイトカイン放出の障害
この実験は、CD58が存在しないことのCAR-Tサイトカイン放出に対する影響を決定するために実施した。
標準の技法を使用して3種のCAR:CD19-28z(配列番号63、64)、CD19-BBz(配列番号65、66)、およびCD22-BBz(m971-BBz;配列番号59、60)を構築し、初代ヒトT細胞に形質導入して、CAR T細胞を提供した。CRISPR Cas9を発現するNalm6細胞(B細胞白血病株)を、CD58に対して特異的なガイドRNA(gRNA)を伴ってまたは伴わずに使用して、Nalm6の1つの群においてCD58発現をノックアウトした(Nalm6 CD58KO)、または対照Nalm6群(Nalm6 Cas9)を提供した。
各CAR群を標的Nalm6細胞100,000個と1:1の比で24時間共培養し、次いで、培養上清中のIFNγおよびIL-2をELISAによって測定した。図1に示されている通り、CD58の欠失により、3種全てのCAR T構築物におけるIFNγ産生が有意に減少し、また、CD19-28zおよびCD19-BBz CAR TにおけるIL-2産生が有意に減少した(CD22-BBzは、CD58を伴っても伴わなくても有意な量のIL-2を産生しなかった)。
(実施例2)
CD58欠失によるCD22 CAR-T細胞傷害の障害
この実験は、CD58が存在しないことのCD22 CAR-T活性に対する影響を決定するために実施した。
CD58欠失によるCD22 CAR-T細胞傷害の障害
この実験は、CD58が存在しないことのCD22 CAR-T活性に対する影響を決定するために実施した。
2種のCAR:m971-BBz(配列番号59、60)およびm971-28z(配列番号61、62)のいずれかを用い、それぞれm971抗CD22 scFv(配列番号2)を使用して、CD22 CAR T細胞を調製した。CD58発現を有するNalm6標的細胞およびCD58発現を有さないNalm6標的細胞を、GFPを発現するように操作し、それにより、GFP蛍光による腫瘍細胞死滅の定量化を可能にした。
各CAR T群を、標的細胞50,000個と共に、1:1の比で72時間インキュベートした。蛍光を経時的にIncuCyte(登録商標)Zoom Live-Cell Analysis Systemで測定した。図2に示されている通り、どちらのCAR TもCD58ノックアウト(CD58KO)細胞に対する有効性が低下した。
(実施例3)
CD58欠失によるCD19 CAR-T細胞傷害の障害
この実験は、CD58が存在しないことのCD19 CAR-T活性に対する影響を決定するために、種々のレベルのCD19発現下で実施した。in vitroでCAR-T細胞を刺激するために標的として使用した細胞株は、多くの場合、CD19などの抗原を高レベルで発現する。腫瘍細胞では標的抗原の発現がダウンレギュレートされる(および/または標的抗原発現に対する選択圧力を受ける)可能性があるので、このCD19発現のレベルは、多くの場合にリンパ腫を有する対象において見いだされるCD19の発現を必ずしも反映するものではない。このダウンレギュレーションの結果、従来のCAR-T構成ではCAR-T活性が低下する。したがって、この実施例では、臨床的な状況によりよく類似した条件下で本開示のCAR-T細胞を試験するために、Nalm6細胞株を、CD19を2つの低下した発現レベルで発現するように改変した。
CD58欠失によるCD19 CAR-T細胞傷害の障害
この実験は、CD58が存在しないことのCD19 CAR-T活性に対する影響を決定するために、種々のレベルのCD19発現下で実施した。in vitroでCAR-T細胞を刺激するために標的として使用した細胞株は、多くの場合、CD19などの抗原を高レベルで発現する。腫瘍細胞では標的抗原の発現がダウンレギュレートされる(および/または標的抗原発現に対する選択圧力を受ける)可能性があるので、このCD19発現のレベルは、多くの場合にリンパ腫を有する対象において見いだされるCD19の発現を必ずしも反映するものではない。このダウンレギュレーションの結果、従来のCAR-T構成ではCAR-T活性が低下する。したがって、この実施例では、臨床的な状況によりよく類似した条件下で本開示のCAR-T細胞を試験するために、Nalm6細胞株を、CD19を2つの低下した発現レベルで発現するように改変した。
2種のCAR:CD19-BBz(配列番号65、66)およびCD19-28z(配列番号63、64)のいずれかを用い、それぞれ抗CD19 scFv(配列番号1)を使用して、CD19 CAR T細胞を調製した。CD58発現を有するNalm6標的細胞およびCD58発現を有さないNalm6標的細胞を、GFPを発現するように操作し、それにより、GFP蛍光による腫瘍細胞死滅の定量化を可能にした。野生型Nalm6標的細胞は、細胞当たり推定45,000コピーのCD19を発現し、さらなる改変は行わなかった。追加の標的細胞を、細胞当たり6,196コピーのCD19のみ(平均)または細胞当たり963コピー(平均)を発現するように操作した。
各CAR T群を、各標的群からの標的細胞50,000個と共に、1:1の比で72時間インキュベートした。蛍光を経時的にIncuCyte(登録商標)Zoom Live-Cell Analysis Systemで測定した。図3に示されている通り、どちらのCAR-Tも45,000個のCD19/細胞ではCD58KOによる影響を受けなかったが、より低レベルのCD19発現ではどちらもCD58ノックアウト(CD58KO)細胞に対する有効性が低下した。図4および5は、CARの有効性はCD19発現がそれぞれ細胞当たり6,196個および963個のCD19分子に低減すると低下すること、CD58が存在しないことの影響が大きいことを示す。
(実施例4)
in vivoにおけるCD22 CAR-T細胞傷害の障害
この実験は、CD58発現の非存在下での従来のCD22 CAR-T細胞による処置からの腫瘍エスケープを実証するために実施した。
in vivoにおけるCD22 CAR-T細胞傷害の障害
この実験は、CD58発現の非存在下での従来のCD22 CAR-T細胞による処置からの腫瘍エスケープを実証するために実施した。
Nalm6細胞を、ルシフェラーゼを発現するように操作し、1つの群におけるCD58発現をノックアウトした。マウス(群当たりN=10)に、Nalm6 Cas9(gRNAを伴わずにCas9を電気穿孔した、CD58+)、またはNalm6-CD58KO(Cas9をCD58特異的gRNAと共に電気穿孔した、CD58-)のいずれかの細胞100万個を接種した。3日後、各群の半数がCD22-41BBz(配列番号59、60)CAR T細胞3,000,000個、またはモック(形質導入されていない)T細胞3,000,000個を受けた。総発光フラックス(腫瘍BLI)を1週間当たり1~2回測定した。
図6に示されている通り、モック形質導入T細胞(Cas9 MockおよびCD58KO Mock)を受けた全てのマウスにおいて腫瘍が急速に成長した。従来のm971-BBz CAR T細胞は、CD58+細胞(Cas9 3M CD22)の腫瘍成長を制御することができたが、CD58-細胞(CD58KO 3M CD22)については一過性の応答のみが実現された。
(実施例5)
in vivoにおけるCD19 CAR-T細胞傷害の障害
この実験は、CD58発現の非存在下での従来のCD19 CAR-T細胞による処置からの腫瘍エスケープを実証するために実施した。
in vivoにおけるCD19 CAR-T細胞傷害の障害
この実験は、CD58発現の非存在下での従来のCD19 CAR-T細胞による処置からの腫瘍エスケープを実証するために実施した。
Nalm6細胞を、ルシフェラーゼを発現するように操作し、1つの群におけるCD58発現をノックアウトした。マウス(群当たりN=10)に、Nalm6 Cas9(gRNAを伴わずにCas9を発現する、CD58+)、またはNalm6-CD58KO(CD58-)のいずれかの細胞100万個を接種した。3日後、各群の半数がCD19-28z(配列番号63、64)CAR T細胞3,000,000個、またはモック(形質導入されていない)T細胞3,000,000個のいずれかを受けた。総発光フラックス(腫瘍BLI)を1週間当たり1~2回測定した。
図7に示されている通り、モック形質導入T細胞を受けた全てのマウスにおいて腫瘍が急速に成長した。従来のCD19-28z CAR T細胞は、CD58+細胞の腫瘍成長を制御することができた(CD19-28z 対 N6 CD58+)が、CD58-細胞については一過性の応答のみが実現された(CD19-28z 対 N6 CD58 KO)。
この実験を従来のCD19-BBz(配列番号65、66)CAR-T細胞を用いて繰り返し、図8に示されている通り、結果は同様であった。
(実施例6)
CD22 CD2 CAR
この実験は、CD2ドメインを有するCD22 CARおよびCD2ドメインを有さないCD22 CARを、4-1BBドメインを有するCARおよび4-1BBドメインを有さないCARと比較するために行った。
CD22 CD2 CAR
この実験は、CD2ドメインを有するCD22 CARおよびCD2ドメインを有さないCD22 CARを、4-1BBドメインを有するCARおよび4-1BBドメインを有さないCARと比較するために行った。
抗CD22 scFv m971(配列番号2、31)およびCD8α膜貫通ドメイン(配列番号5、34)を使用して以下のCARを構築した:m971-BBz(配列番号59、60)、m971-CD2-BBz(配列番号17、46)、m971-CD2-z(配列番号16、45)、m971-BB-CD2z(配列番号18、47)、およびm971-BBz-CD2(配列番号67、68)。これらのCARを上記の通りT細胞に形質導入した。
CAR-Tのそれぞれ(細胞50,000個)を、Nalm6腫瘍細胞(GFP+、CD58+かまたはCD58-のいずれか)50,000個と一緒にIncuCyte(登録商標)インキュベーター中、72時間インキュベートした。図9に示されている通り、m971-BBz-CD2は効果がなかったが、他のCD2含有CAR(m971-CD2-BBz;m971-CD2-z;およびm971-BB-CD2-z)は全て、CD58+細胞およびCD58-細胞のどちらに対しても従来のm971-BBz CARよりも優れた性能を示した。
同様に、CAR-T細胞100,000個をNalm6 CD58+またはNalm6 CD58-細胞と一緒に24時間インキュベートし、培養上清をIL-2およびIFNγ放出についてELISAによって試験した。図10に示されている通り、m971-BBz-CD2は効果がなかったが、他のCD2含有CAR(m971-CD2-BBz;m971-CD2-z;およびm971-BB-CD2-z)は全て、CD58-細胞に対して従来のm971-BBz CARよりも優れた性能を示した。
マウス(群当たりN=5)に、ルシフェラーゼを発現するNalm6 CD58KO細胞100万個を接種した。3日後、マウスを、モック(形質導入されていない)T細胞、m971-BBz T細胞、またはm971-CD2-BBz T細胞300万個で処置した。図11に示されている通り、m971-CD2-BBz CAR-T細胞により、従来のm971-BBz CARと比較して腫瘍制御の増強および生存の増強が実証された。
(実施例7)
CD19 CD2 CARの構築
この実験は、CD2ドメインを有するCD19 CARおよびCD2ドメインを有さないCD19 CARを4-1BBドメインを有するCARおよび4-1BBドメインを有さないCARと比較するために行った。
CD19 CD2 CARの構築
この実験は、CD2ドメインを有するCD19 CARおよびCD2ドメインを有さないCD19 CARを4-1BBドメインを有するCARおよび4-1BBドメインを有さないCARと比較するために行った。
抗CD19 scFvおよびCD8α膜貫通ドメインを使用して以下のCARを構築した:CD19-BBz(配列番号65、66)、CD19-CD2-BBz(配列番号13、42)、CD19-CD2z(配列番号12、41)、およびCD19-BB-CD2z(配列番号14、43)。これらのCARを記載の通りT細胞に形質導入した。
CAR-Tのそれぞれ(細胞50,000個)を、Nalm6腫瘍細胞(GFP+、CD58+かまたはCD58-のいずれか)50,000個と一緒にIncuCyte(登録商標)インキュベーター中、72時間インキュベートした。図12に示されている通り、これらのCAR-T細胞は全て、CD58+細胞およびCD58-細胞のどちらに対しても、細胞傷害に関して同程度の性能を示した。
Nalm6細胞は、細胞当たり約45,000個のCD19分子を発現することが推定される。正常なB細胞は細胞当たりおよそ22×103個のCD19分子を発現することが報告されており、一方、白血病性B細胞による発現は有意に少ない(CLL-細胞当たり13×103個;マントル細胞リンパ腫-細胞当たり10×103個、CD19標的化治療を用いた処置前)(例えば、L Ginaldi et al., J Clin Pathol (1998) 51: 364-69を参照されたい)。ここで、腫瘍細胞における抗原の存在の減少の影響を試験するために、Nalm6細胞を操作して、CD19発現を、患者において見いだされる生理的レベルに近づいたレベルである細胞当たり約6,196個または963個のCD19分子まで低減させた。
CAR-Tのそれぞれ(細胞50,000個)を、Nalm6(6196)腫瘍細胞(GFP+、CD58+かまたはCD58-のいずれか)50,000個と一緒に、IncuCyte(登録商標)インキュベーター中、72時間インキュベートした。図13に示されている通り、CD2 CAR-Tは、CD58-細胞に対する細胞傷害に関して従来のCD19-BBz CAR-T細胞よりも優れた性能を示した。図14に示されている通り、これらのCD2 CARはまたCD58+細胞およびCD58-細胞のどちらに対しても、上記の通り24時間インキュベートした場合に、サイトカイン放出に関しても従来のCD19-BBz CAR-T細胞よりも優れた性能を示した。
(実施例8)
CD2 CARにおける共刺激ドメインの選択
この実験は、どの共刺激ドメインがCD2共刺激ドメインを含有するCARにおいて有用であるかを決定するために実施した。
CD2 CARにおける共刺激ドメインの選択
この実験は、どの共刺激ドメインがCD2共刺激ドメインを含有するCARにおいて有用であるかを決定するために実施した。
CAR m971-28z(配列番号61、62)およびm971-CD2-28z(配列番号19、48)を調製し、記載の通りT細胞に形質導入した。CAR-T細胞(100,000)を同数のNalm6 CD58+またはCD58-細胞と24時間共培養し、培養上清をELISAによってサイトカイン放出について調査した。図15に示されている通り、CD2共刺激ドメインをCD28共刺激ドメインに追加することにより、IL-2およびIFNγ放出が実際に有意に減少した。標的細胞とIncuCyte(登録商標)中で72時間共培養し、細胞傷害について調査したところ、図16に示されている通り、従来のm971-28z CAR-T細胞はm971-CD2-28z CAR-T細胞よりも良好な性能を示した。
逆に、CD2を4-1BB CARに追加することにより、特にCD58KO細胞に対する活性が改善された。CAR m971-BBz(配列番号59、60)、m971-CD2-BBz(配列番号17、46)、CD19-BBz(配列番号65、66)、およびCD19-CD2-BBz(配列番号13、42)を調製し、記載の通りT細胞に形質導入した。CAR-T細胞(100,000)を同数のNalm6 CD58+またはCD58-細胞と24時間共培養し、培養上清をELISAによってサイトカイン放出について調査した。図17に示されている通り、CD2共刺激ドメインを4-1BB共刺激ドメインに追加することにより、CD58KO細胞に対するサイトカイン放出が改善され、CD19 CARに関しては、CD2の追加は、CD58+細胞に対するサイトカイン放出も改善された。図18に示されている通り、標的細胞とIncuCyte(登録商標)中で72時間共培養し、細胞傷害について調査したところ、m971-CD2-BBz CAR-T細胞は、特にCD58KO(CD58-)細胞に対して従来のm971-BBz CAR-T細胞よりも良好な性能を示した。
(実施例9)
トランスCD2キメラポリペプチド
この実験は、トランス-CD2キメラポリペプチドの発現および有効性を実証するために実施した。
トランスCD2キメラポリペプチド
この実験は、トランス-CD2キメラポリペプチドの発現および有効性を実証するために実施した。
コードドメインが2A配列で隔てられたCAR m971-BBz(CD8α膜貫通ドメインを有する)とCD2キメラポリペプチドとを発現させるためのバイシストロニック構築物を作出した(配列番号69、70)。本実施例で使用した2A配列(P2A)を、フューリン切断配列(RKRR)ならびにP2A配列の上流のEcoRI切断部位、および下流のXhoI切断部位を含むように改変した。構築物は以下の通りであった:m971-BBz-2A-CD19-CD28tm-CD2(配列番号71、72)、m971-BBz-2A-CD19-CD8tm-CD2(配列番号73、74)、m971-BBz-2A-CD19-CD2tm-CD2(配列番号75、76)、m971-BBz-2A-CD19-CD28tm-stop(対照)(配列番号77、78)、およびm971-BBz-2A-stop(対照)(配列番号79、80)。このように構築されたCD2キメラポリペプチドは異なる膜貫通(tm)ドメイン:CD28tm、CD8tm、およびCD2tmも有した。図19は、例示的なCARとCD2-トランスキメラポリペプチドの差異を概略的に例示する。左側のパネルは、CD3ζ活性化ドメインに加えて4-1BBおよびCD2共刺激ドメインを有するCD2 CARの概略構造を示す。右側のパネルは、4-1BB共刺激ドメインを有する第2世代CARと、抗原結合性ドメインおよびCD2共刺激ドメインを有するキメラポリペプチドとを示す。キメラポリペプチドはCD3ζ活性化ドメインを欠き、したがって、トランスにのみ作用してCARを共刺激することに留意されたい。
CAR-Tのそれぞれ(細胞50,000個)を、Nalm6腫瘍細胞(GFP+、CD58+かまたはCD58-のいずれか)50,000個と一緒にIncuCyte(登録商標)インキュベーター中、72時間インキュベートした。図20に示されている通り、CD58+細胞に対しては全てのCARが同様の性能を示したが、一方、CD58KO細胞に対してはm971-BBz-2A-CD19-28tm-CD2およびm971-BBz-2A-CD19-2tm-CD2のみが十分な性能を示した。いかなる理論にも縛られることなく、これは、実質的に同じtmドメインを有する2つの受容体間の干渉に起因すると考えられる。
CAR-T細胞(100,000)を同数のNalm6 CD58+またはCD58-細胞と24時間共培養し、培養上清をELISAによってサイトカイン放出について調査した。図21に示されている通り、CARに加えてキメラポリペプチドを有するCAR-T細胞は、CD58KO細胞に対するサイトカイン放出に関して、キメラポリペプチドを有さないCAR-T細胞よりも優れた性能を示した。
(実施例10)
シスCD2キメラポリペプチド対トランスCD2キメラポリペプチド
この実験は、トランスCAR-キメラポリペプチドの組合せとCD2ドメインを含有するシスCARを比較するために実施した。
シスCD2キメラポリペプチド対トランスCD2キメラポリペプチド
この実験は、トランスCAR-キメラポリペプチドの組合せとCD2ドメインを含有するシスCARを比較するために実施した。
m971-BBz-2A-CD19-28tm-CD2(配列番号71、72)、m971-BBz-CD2z(配列番号18、47)、またはm971-CD2z(配列番号16、45)構築物を用いてCAR-T細胞を調製した。各群のCAR-T(細胞50,000個)を、Nalm6腫瘍細胞(GFP+、CD58+かまたはCD58-のいずれか)50,000個と一緒にIncuCyte(登録商標)インキュベーター中、72時間インキュベートした。図22に示されている通り、トランス構築物(m971-BBz-2A-CD19-28tm-CD2)は2つのシス構築物よりも良好な性能を示した。
CAR-T細胞(100,000)を同数のNalm6 CD58+またはCD58-細胞と24時間共培養し、培養上清をELISAによってサイトカイン放出について調査した。図23に示されている通り、再度、トランス構築物(m971-BBz-2A-CD19-28tm-CD2)は2つのシス構築物よりも良好な性能を示した。
(実施例11)
パラトープキメラポリペプチド
この実験は、CARによって標的とされるものと同じ抗原の異なるエピトープを標的とするキメラポリペプチドの影響を試験するために実施した。scFv m971とHA22はそれぞれ、CD22の異なるエピトープを標的とする。本件では、HA22をキメラポリペプチド構築物において使用し、CAR構築物内のm971と組み合わせる。
パラトープキメラポリペプチド
この実験は、CARによって標的とされるものと同じ抗原の異なるエピトープを標的とするキメラポリペプチドの影響を試験するために実施した。scFv m971とHA22はそれぞれ、CD22の異なるエピトープを標的とする。本件では、HA22をキメラポリペプチド構築物において使用し、CAR構築物内のm971と組み合わせる。
CAR-T細胞を、m971-BBz-2A-HA22-28tm-CD2(配列番号81、82)、m971-BBz-2A-HA22-8tm-CD2(配列番号83、84)、m971-BBz-2A-HA22-2tm-CD2(配列番号85、86)、m971-BBz-2A-stop(対照)(配列番号79、80)、およびm971-BBz-2A-HA22-28tm-stop(対照)(配列番号77、78)を用いて調製した。各群のCAR-T(細胞50,000個)を、Nalm6腫瘍細胞(GFP+、CD58+かまたはCD58-のいずれか)50,000個と一緒にIncuCyte(登録商標)インキュベーター中、72時間インキュベートした。図24に示されている通り、トランスCAR-キメラポリペプチドの組合せはそれぞれ、CAR単独よりも良好な性能を示した。
CAR-T細胞(群当たり100,000)を同数のNalm6 CD58+またはCD58-細胞と24時間共培養し、培養上清をELISAによってサイトカイン放出について調査した。図25に示されている通り、m971-BBz-2A-HA22-28tm-CD2は、サイトカイン放出に関してm971-BB-CD2zよりもいくらか良好な性能を示した。
(実施例12)
CD22 CD2 CARの抗腫瘍活性
この実験は、CD2シグナル伝達ドメインを有するまたは有さないCD22 CAR(m971-BBz)のCD58 KOに対する抗腫瘍活性を試験するために実施した。
CD22 CD2 CARの抗腫瘍活性
この実験は、CD2シグナル伝達ドメインを有するまたは有さないCD22 CAR(m971-BBz)のCD58 KOに対する抗腫瘍活性を試験するために実施した。
どちらも腫瘍を生物発光によって追跡するためのルシフェラーゼを発現する、示されている腫瘍株100万個をNSGマウスに接種した。接種の3日後、マウスを、CD19-TMまたはCD19-CD2を有するモック(形質導入されていない)またはm971-BBzトランス300万個で処置した。腫瘍BLIを週に1~2回測定した。
図26に示されている通り、CD19を認識するCD2シグナル伝達CAR(配列番号101、123)と一緒に発現される(同時形質導入される)m971-BBz CAR(配列番号59、60)(CD22-4-1BBz+CD19-CD2)を含むトランスCD2 CAR T細胞により、いかなるシグナル伝達ドメインも有さないCD19を認識する対照分子(配列番号113、135)と一緒に発現される(同時形質導入される)従来のm971-BBz CAR(配列番号59、60)(CD22-4-1BBz+CD19-TM)と比較して、CD58KO Nalm6に対する強力な抗腫瘍活性が実証された。
(実施例13)
CD58 KOのin vitroにおけるトランスCARおよびCD2によるレスキュー
この実験は、CD58喪失のin vitroにおけるトランスCARおよびCD2によるレスキューを試験するために実施した。
CD58 KOのin vitroにおけるトランスCARおよびCD2によるレスキュー
この実験は、CD58喪失のin vitroにおけるトランスCARおよびCD2によるレスキューを試験するために実施した。
CD20を認識するCD2含有受容体(CD8またはCD28膜貫通ドメインのいずれかを有する)(配列番号109または110)をCD22 CAR(m971-BBz;配列番号59、60)と同時発現させた。CAR T細胞100,000個を、RajiまたはNalm6腫瘍細胞株と1:1の比で24時間共培養した。上清中のIL-2レベルをELISAによって測定した。図27に示されている通り、CD20を認識するCD2含有受容体を同時発現させた(同時形質導入した)トランスCD22 CAR T細胞(m971-BBz+CD20-28tm-CD2およびm971-BBz+CD20-8tm-CD2)は、CD58 KO細胞に対するCAR T機能をレスキューすることができた。このCD58喪失に対するレスキューは、腫瘍がCD2受容体の標的(この実験ではCD20)を発現した場合にのみ生じた。
CD20を認識するCD2含有受容体(CD2を有するまたは有さないCD28ヒンジ-膜貫通ドメインを有する;配列番号111または113)をCD19 CAR(CD19-BBz;配列番号65、66)と同時発現させた。CAR T細胞100,000個を、CD58+およびCD58-Raji腫瘍細胞株と1:1の比で24時間共培養した。上清中のIL-2レベルをELISAによって測定した。図28に示されている通り、CD20を認識するCD2含有受容体を同時発現させたトランスCD19 CAR T細胞(CD19-BBz+CD20-28htm-CD2)はCD58 KO細胞に対するCAR T細胞機能をレスキューすることができた。
CD2およびCD3zエンドドメインを含有する、CD22を認識するCAR(m971-8tm-CD2-z;配列番号92)をCD19-28z CAR(配列番号63、64)とトランスに同時発現させた。CAR T細胞100,000個を、CD58+およびCD58-Nalm6腫瘍細胞株と1:1の比で24時間共培養した。上清中のIL-2レベルをELISAによって測定した。図29に示されている通り、トランスCD19-28zおよびm971-8tm-CD2-zは、CD58 KO細胞に対するCAR T機能をレスキューし得、CD19またはCD22抗原のいずれかが喪失した細胞に対する活性を維持した。
CD2およびCD3zエンドドメインを含有する、C20を認識するCAR(CD20-IgG1long-28htm-CD2-z;配列番号111、133)を、CD19-BBz CAR(配列番号65、66)とトランスに同時発現させた(同時形質導入した)。CAR T細胞100,000個を、CD58+およびCD58-Raji腫瘍細胞株と1:1の比で24時間共培養した。上清中のIL-2レベルをELISAによって測定した。図30に示されている通り、トランスCD19-BBz(配列番号65、66)およびCD20-28htm-CD2-z(CD20-IgG1long-28htm-CD2-z;配列番号111、133)はCD58 KO細胞に対するCAR T細胞機能をレスキューし得、CD19などの標的抗原が喪失した細胞に対する活性を維持した。トランスCD19-BBzおよびCD20-28htm対照受容体(配列番号113、135)は機能をレスキューすることができなかった。
(実施例14)
CD58 KOのin vivoにおけるトランスCARおよびCD2によるレスキュー
この実験は、CD58喪失のin vivoにおいてトランスCARおよびCD2によるレスキューを試験するために実施した。
CD58 KOのin vivoにおけるトランスCARおよびCD2によるレスキュー
この実験は、CD58喪失のin vivoにおいてトランスCARおよびCD2によるレスキューを試験するために実施した。
どちらも腫瘍を生物発光によって追跡するためのルシフェラーゼを発現する、示されている腫瘍株100万個をNSGマウスに接種した。腫瘍接種の3日後、マウスを、図31に示されている通りCAR T細胞300万個で処置した。腫瘍生物発光を週に1~2回測定した。群当たりN=5のマウス。図31に示されている通り、CD2シグナル伝達がトランスに組み込まれたCD19 CARまたはCD22 CAR細胞はCD58喪失を克服した。この実験では、トランスCD2を含有する受容体にはCD3ゼータも組み込まれ(CD19-28tm-CD2-z;配列番号98、118)、したがって、CD58KO細胞に対するCAR T細胞機能をレスキューすることができ、また、CD19などの標的抗原が喪失した細胞に対する活性も維持することができた。
(実施例15)
CD58およびCD19喪失のCD20 CD2 CARレスキュー
この実験は、CD58喪失およびCD19喪失におけるCD20 CD2 CARの影響を比較するために実施した。
CD58およびCD19喪失のCD20 CD2 CARレスキュー
この実験は、CD58喪失およびCD19喪失におけるCD20 CD2 CARの影響を比較するために実施した。
3種のCAR(CD19-28htm-BBz;CD20-8htm-CD2-z;CD20-28htm-CD2-z)のCAR T細胞100,000個をRaji腫瘍細胞株(CD58+;CD58-;CD19-)と1:1の比で24時間共培養した。上清中のIL-2レベルをELISAによって測定した。図32に示されている通り、CD2シグナル伝達が組み込まれた、CD20を標的とするCARは、どちらもCAR T細胞療法からの免疫エスケープの一般機構である、CD58の喪失およびCD19の喪失の両方を克服することができた。
(実施例16)
CD2シグナル伝達の増強
ex vivoで成長させたトランスジェニックTCRを発現するT細胞またはバルク腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)におけるCD2シグナル伝達をいくつかの方法によって増強することができる。次いで、TILを患者に戻すことができる。
CD2シグナル伝達の増強
ex vivoで成長させたトランスジェニックTCRを発現するT細胞またはバルク腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)におけるCD2シグナル伝達をいくつかの方法によって増強することができる。次いで、TILを患者に戻すことができる。
例えば、T細胞に、CD2シグナル伝達を増強する補助受容体を形質導入することができる(トランスジェニックTCRの発現に加えて)。細胞外リガンド結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、およびCD2シグナル伝達ドメインを含む補助受容体を、ウイルスベクターまたは他のベクターで転写させることができ、標的腫瘍細胞がCD58を低レベルで発現する、CD58を発現しない、または変異CD58を発現する場合であってもCD2シグナル伝達をトランスでもたらすことができる。補助受容体の細胞外部分は、腫瘍細胞によって発現される抗原を認識するscFvまたは目的の標的腫瘍細胞上に発現される共通の受容体のリガンドを含み得る。
CAR T細胞、トランスジェニックTCR T細胞、またはバルクTILにおけるCD2シグナル伝達を増強するための別のやり方は、T細胞に対して、1つまたは複数の抗CD2 scFv、抗体、Fab、DARPIN、リガンド、または他の結合物質/抗原結合性ドメインを使用することによって細胞のネイティブCD2と架橋結合することが可能な分泌型分子を構成的に発現するように形質導入を行うことを含み得る。あるいは、分泌型分子を活性化スイッチの下で発現させることができる。分泌型分子は、膜結合型であり得、リンカーによって接続された2つのscFvからなり得る:一方は、T細胞上のCD2に結合するscFv(ネイティブCD2シグナル伝達を活性化する)であり、他方は、腫瘍細胞上に発現されるタンパク質または標的を認識するscFvまたはリガンドであり、したがって、T細胞が腫瘍細胞と遭遇するとCD2が架橋結合し、活性化される。
Claims (151)
- (i)CD2シグナル伝達ドメインを含むがCD3-ゼータドメインを含まない細胞質シグナル伝達ドメインと、(ii)抗原結合性ドメインまたは(iii)膜貫通ドメインのうちの少なくとも1つとを含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸。
- 前記細胞質シグナル伝達ドメインが、共刺激ドメインをさらに含む、請求項1に記載の核酸。
- 前記共刺激ドメインが、4-1BBシグナル伝達ドメイン、CD27シグナル伝達ドメイン、OX40シグナル伝達ドメイン、CD28シグナル伝達ドメイン、CD278シグナル伝達ドメイン、CD40シグナル伝達ドメイン、CD40Lシグナル伝達ドメイン、toll様受容体シグナル伝達ドメイン、またはこれらの任意の組合せのうちの少なくとも1つを含む、請求項2に記載の核酸。
- 前記細胞質シグナル伝達ドメインが、配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも80%相同なアミノ酸配列を含む、請求項1から3までのいずれか一項に記載の核酸。
- 前記細胞質ドメインが、配列番号8からなる、請求項1から3までのいずれか一項に記載の核酸。
- 前記キメラポリペプチドが、配列番号20~29および92~112からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約80%相同なアミノ酸配列を含む、請求項1から5までのいずれか一項に記載の核酸。
- 前記キメラポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドを含み、前記キメラポリペプチドが、(ii)前記抗原結合性ドメインを含むものである、請求項1から6までのいずれか一項に記載の核酸。
- 前記抗原結合性ドメインが、抗体またはその抗原結合性断片を含む、請求項7に記載の核酸。
- 前記抗原結合性ドメインが、scFv、sdAb、Fab、二重特異性抗体またはその抗原結合性断片、三重特異性抗体またはその抗原結合性断片、二重特異性ダイアボディ、三重特異性トリアボディ、scFv-Fc、ミニボディ、VhHドメイン、hcIgGドメイン、V-NARドメイン、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項7に記載の核酸。
- 前記抗原結合性ドメインが、B細胞表面抗原に対して特異的である、請求項7から9までのいずれか一項に記載の核酸。
- 前記B細胞表面抗原が、HLA-DR、CD20、CD32b、CD37、CD38、CD52、CD81、CD79A、CD79B、CD138、CSI、GPRC5D、BAFF受容体、APRIL、BCMA、およびTACIからなる群より選択される、請求項10に記載の核酸。
- 前記抗原結合性ドメインが、腫瘍関連抗原に対して特異的である、請求項7から9までのいずれか一項に記載の核酸。
- 前記腫瘍関連抗原が、HLA-DR、CD20、CD32b、CD37、CD38、CD52、CD81、CD79A、CD79B、CD138、CSI、GPRC5D、BAFF受容体、APRIL、BCMA、TACI、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原(CEA)、ベータ-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファ-フェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、mut HSP70-2、M-CSF、前立腺特異的抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、プロステイン、PSMA、HER2、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、インスリン増殖因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受容体、GD2、GD3、B7-H3、GPC2、L1CAM、EGFR、メソテリン、MART-1、gp100(Pmel 17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15、p53、Ras、HER-2、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EBVA、ヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6およびE7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-カテニン、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-フェトプロテイン、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68/P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733/EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TAG72、TLP、TPS CD19、CD20、CD22、ROR1、ならびにGD2からなる群より選択される、請求項12に記載の核酸。
- 前記キメラポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドを含み、前記キメラポリペプチドが、(iii)前記膜貫通ドメインを含むものである、請求項1から13までのいずれか一項に記載の核酸。
- 前記膜貫通ドメインが、CD3ζ、CD2、CD8α、CD28、CD40、CTLA4、OX40、PD-1、4-1BB(CD137)、FcERIγ、ICOS(CD278)、ILRB(CD122)、およびIL-2RG(CD132)の膜貫通ドメインの全てまたはこれらのうちの一部からなる群より選択される、請求項14に記載の核酸。
- 配列番号20~29および92~112からなる群より選択される配列と少なくとも約80%相同な配列を含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸。
- 請求項1から16までのいずれか一項に記載の、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、追加のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸をさらに含む、核酸組成物。
- 前記追加のポリペプチドが、キメラ抗原受容体(CAR)、T細胞受容体(TCR)、またはTCR-CARを含む、請求項17に記載の核酸組成物。
- 前記CARが、第1世代CAR、第2世代CAR、または第3世代CARを含む、請求項18に記載の核酸組成物。
- 前記追加のポリペプチドが、CD3-ゼータドメインを含むCARを含む、請求項18または19に記載の核酸組成物。
- 前記追加のポリペプチドが、抗原結合性ドメインを含むCARを含む、請求項18から20までのいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 前記抗原結合性ドメインが、抗体またはその抗原結合性断片を含む、請求項21に記載の核酸組成物。
- 前記抗原結合性ドメインが、scFv、sdAb、Fab、二重特異性抗体またはその抗原結合性断片、三重特異性抗体またはその抗原結合性断片、二重特異性ダイアボディ、三重特異性トリアボディ、scFv-Fc、ミニボディ、VhHドメイン、hcIgGドメイン、V-NARドメイン、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項21に記載の核酸組成物。
- 前記抗原結合性ドメインが、B細胞表面抗原に対して特異的である、請求項17から23までのいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 前記B細胞表面抗原が、HLA-DR、CD20、CD32b、CD37、CD38、CD52、CD81、CD79A、CD79B、CD138、CSI、GPRC5D、BAFF受容体、APRIL、BCMA、およびTACIからなる群より選択される、請求項24に記載の核酸組成物。
- 前記抗原結合性ドメインが、腫瘍関連抗原に対して特異的である、請求項21から23までのいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 前記腫瘍関連抗原が、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原(CEA)、ベータ-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファ-フェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、mut HSP70-2、M-CSF、前立腺特異的抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、プロステイン、PSMA、HER2、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、インスリン増殖因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受容体、GD2、GD3、B7-H3、GPC2、L1CAM、EGFR、メソテリン、MART-1、gp100(Pmel 17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15、p53、Ras、HER-2、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EBVA、ヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6およびE7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-カテニン、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-フェトプロテイン、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68/P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733/EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TAG72、TLP、TPS CD19、CD20、CD22、ROR1、ならびにGD2からなる群より選択される、請求項24に記載の核酸組成物。
- 前記追加のポリペプチドが、共刺激ドメインをさらに含む、請求項17から27までのいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 前記共刺激ドメインが、4-1BBシグナル伝達ドメイン、CD27シグナル伝達ドメイン、OX40シグナル伝達ドメイン、CD28シグナル伝達ドメイン、CD278シグナル伝達ドメイン、CD40シグナル伝達ドメイン、CD40Lシグナル伝達ドメイン、toll様受容体シグナル伝達ドメイン、またはこれらの任意の組合せのうちの少なくとも1つを含む、請求項28に記載の核酸組成物。
- 前記追加のポリペプチドが、膜貫通ドメインをさらに含む、請求項17から29までのいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 前記膜貫通ドメインが、CD3ζ、CD2、CD8α、CD28、CD40、CTLA4、OX40、PD-1、4-1BB(CD137)、FcERIγ、ICOS(CD278)、ILRB(CD122)、およびIL-2RG(CD132)の膜貫通ドメインの全てまたはこれらのうちの一部からなる群より選択される、請求項30に記載の核酸組成物。
- 請求項1から16までのいずれか一項に記載の核酸または請求項17から31までのいずれか一項に記載の核酸組成物を含むベクター。
- 請求項32に記載のベクターを含む細胞。
- 免疫細胞、幹細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞、またはヒト細胞である、請求項33に記載の細胞。
- 自己または同種のものである、請求項33または34に記載の細胞。
- T細胞、CD8陽性T細胞、CD4陽性T細胞、調節性T細胞、細胞傷害性T細胞、または腫瘍浸潤性リンパ球である、請求項33から35までのいずれかに記載の細胞。
- 過剰増殖性障害を有する対象を処置する方法であって、前記対象に、請求項33から36までのいずれか一項に記載の細胞を治療有効数で含む組成物を投与するステップを含む、方法。
- (i)CD58の発現を欠く;(ii)低下したレベルのCD58を発現する;または(iii)CD2を活性化する能力が低下した形態のCD58を発現する標的細胞の増殖を特徴とする過剰増殖性障害を有する対象を処置する方法であって、前記対象に、請求項33から36までのいずれか一項に記載の細胞を治療有効数で含む組成物を投与するステップを含む、方法。
- (i)抗原結合性ドメイン;(ii)膜貫通ドメイン;(iii)CD2シグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラポリペプチドであって、
(i)前記抗原結合性ドメインが、配列番号1、2、3、および4からなる群より選択される配列と少なくとも約80%相同なアミノ酸配列を含み、
(ii)前記膜貫通ドメインが、配列番号5、6、および7からなる群より選択される配列と少なくとも約80%相同なアミノ酸配列を含み、
(iii)前記CD2シグナル伝達ドメインが、配列番号8の配列と少なくとも約80%相同なアミノ酸配列を含み、前記共刺激ドメインが、配列番号10および11からなる群より選択される配列と少なくとも約80%相同なアミノ酸配列を含む、
キメラポリペプチド。 - 前記細胞質シグナル伝達ドメインが、CD3-ゼータ活性化ドメインを含まない、請求項39に記載のキメラポリペプチド。
- 前記細胞質シグナル伝達ドメインが、活性化ドメインを含み、前記活性化ドメインが、配列番号9の配列と少なくとも約80%相同なアミノ酸配列を含む、請求項39に記載のキメラポリペプチド。
- N末端からC末端までの順に:
選択された抗原に対して特異的な第1の抗原結合性ドメイン;
スペーサードメイン;
膜貫通ドメイン;および
細胞質シグナル伝達ドメインであって、CD2シグナル伝達ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、およびCD3ゼータ鎖(CD3ζ)活性化ドメインを含み、前記共刺激シグナル伝達ドメインがCD28シグナル伝達ドメインではない、細胞質シグナル伝達ドメイン
を含む、キメラ抗原受容体(CAR)。 - 前記共刺激シグナル伝達ドメインが、4-1BBシグナル伝達ドメイン、CD27シグナル伝達ドメイン、またはOX40シグナル伝達ドメインを含む、請求項42に記載のCAR。
- 前記共刺激シグナル伝達ドメインが、4-1BBシグナル伝達ドメインを含む、請求項42または43に記載のCAR。
- 前記CARが、第2の抗原結合性ドメインをさらに含む、請求項42から44までのいずれか一項に記載のCAR。
- 前記第1の抗原結合性ドメインと前記第2の抗原結合性ドメインが、異なる抗原に対して特異的である、請求項42から45までのいずれか一項に記載のCAR。
- 前記第1の抗原結合性ドメインと前記第2の抗原結合性ドメインが、同じ抗原の異なるエピトープに対して特異的である、請求項42から45までのいずれか一項に記載のCAR。
- 前記スペーサードメインが、CD8αヒンジドメイン、CD28ヒンジドメイン、CTLA-4ヒンジドメイン、IgG1ヒンジドメイン、およびIgG4ヒンジドメインからなる群より選択される、請求項42から47までのいずれか一項に記載のCAR。
- 前記スペーサードメインが、CD28ヒンジドメインを含む、請求項48に記載のCAR。
- 前記スペーサードメインが、約10アミノ酸から約50アミノ酸までを有する合成ポリペプチドスペーサーである、請求項42から46までのいずれか一項に記載のCAR。
- 前記合成ポリペプチドスペーサーが、(GGS)n、(SGG)n、(GGGS)n、(SGGG)n、または(GGGGS)nであり、nが約1~約15(配列番号87~91)である、請求項50に記載のCAR。
- 前記膜貫通ドメインが、CD3ζ、CD2、CD8α、CD28、CD40、CTLA4、OX40、PD-1、4-1BB(CD137)、FcERIγ、ICOS(CD278)、ILRB(CD122)、およびIL-2RG(CD132)の膜貫通ドメインの全てまたはこれらのうちの一部からなる群より選択される、請求項42から51までのいずれか一項に記載のCAR。
- 前記膜貫通ドメインが、CD8α膜貫通ドメインを含む、請求項52に記載のCAR。
- 前記膜貫通ドメインが、CD28膜貫通ドメインを含む、請求項52に記載のCAR。
- 配列番号12~29、114~134のいずれか1つの配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、または約100%同一のアミノ酸配列を有する、請求項42に記載のCAR。
- 前記第1の抗原結合性ドメインが、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原に特異的に結合する、請求項42から54までのいずれか一項に記載のCAR。
- 前記腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原が、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原(CEA)、ベータ-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファ-フェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、mut HSP70-2、M-CSF、前立腺特異的抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、プロステイン、PSMA、HER2、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、インスリン増殖因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受容体、GD2、GD3、B7-H3、GPC2、L1CAM、EGFR、メソテリン、MART-1、gp100(Pmel 17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15、p53、Ras、HER-2、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EBVA、ヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6およびE7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-カテニン、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-フェトプロテイン、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68/P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733/EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TAG72、TLP、TPS CD19、CD20、CD22、ROR1、またはGD2の群から選択される、請求項56に記載のCAR。
- CD2シグナル伝達が、トランスジェニックT細胞受容体(TCR)で増強される、請求項42から57までのいずれか一項に記載のCAR。
- 前記トランスジェニックTCRが、第2の抗原に対して特異的な第2の抗原結合性ドメインを含む、請求項58に記載のCAR。
- 前記トランスジェニックTCRが、少なくともTCR Vα鎖CDR3および/または少なくともTCR Vβ鎖CDR3を含む、請求項58から59までのいずれか一項に記載のCAR。
- 前記トランスジェニックTCRが、膜貫通ドメインをさらに含む、請求項60に記載のCAR。
- 前記膜貫通ドメインが、CD3ζ、CD2、CD8α、CD28、CD40、CTLA4、OX40、PD-1、4-1BB(CD137)、FcERIγ、ICOS(CD278)、ILRB(CD122)、およびIL-2RG(CD132)からなる群より選択される、請求項61に記載のCAR。
- 前記トランスジェニックTCRが、細胞質シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項58から62までのいずれか一項に記載のCAR。
- 前記細胞質シグナル伝達ドメインが、CD2シグナル伝達ドメインである、請求項63に記載のCAR。
- 前記トランスジェニックTCRの前記第2の抗原が、MHCクラスIまたはMHCクラスIIによって提示される腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原である、請求項58から64までのいずれか一項に記載のCAR。
- 前記第2の抗原が、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原(CEA)、ベータ-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファ-フェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、mut HSP70-2、M-CSF、前立腺特異的抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、プロステイン、PSMA、HER2、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、インスリン増殖因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受容体、GD2、GD3、B7-H3、GPC2、L1CAM、EGFR、メソテリン、MART-1、gp100(Pmel 17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15、p53、Ras、HER-2、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EBVA、ヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6およびE7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-カテニン、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-フェトプロテイン、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68/P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733/EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TAG72、TLP、TPS CD19、CD20、CD22、ROR1、ならびにGD2からなる群より選択される、請求項65に記載のCAR。
- 免疫受容体を共刺激するためのキメラポリペプチドであって、前記免疫受容体が、CARおよび/またはトランスジェニックTCRであり、前記CARが第1の抗原に対して特異的な第1の抗原結合性ドメインを有し、前記トランスジェニックTCRが第2の抗原結合性ドメインを有し、前記キメラポリペプチドが、N末端からC末端までの順に:
第3の抗原に対して特異的な第3の抗原結合性ドメイン;
膜貫通ドメイン;および
細胞質シグナル伝達ドメイン
を含み、前記細胞質シグナル伝達ドメインが、CD2シグナル伝達ドメインを含み、かつCD3ζ活性化ドメインを含まず、前記第3の抗原が、CD58ではない、
キメラポリペプチド。 - 前記第3の抗原が、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原である、請求項67に記載のキメラポリペプチド。
- 前記第3の抗原が、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原(CEA)、ベータ-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファ-フェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、mut HSP70-2、M-CSF、前立腺特異的抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、プロステイン、PSMA、HER2、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、インスリン増殖因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受容体、GD2、GD3、B7-H3、GPC2、L1CAM、EGFR、メソテリン、MART-1、gp100(Pmel 17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15、p53、Ras、HER-2、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EBVA、ヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6およびE7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-カテニン、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-フェトプロテイン、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68/P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733/EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TAG72、TLP、TPS CD19、CD20、CD22、ROR1、ならびにGD2からなる群より選択される、請求項68に記載のキメラポリペプチド。
- 前記第3の抗原が、B7H3、BAFF-R、CD19、CD20、CD22、GD2、GD3、GPC2、IL13Rα2、およびROR1からなる群より選択される、請求項69に記載のキメラポリペプチド。
- 前記キメラポリペプチドの前記細胞質シグナル伝達ドメインが、追加の共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項67から70までのいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記追加の共刺激シグナル伝達ドメインが、4-1BBシグナル伝達ドメイン、CD27シグナル伝達ドメイン、CD28シグナル伝達ドメイン、またはOX40シグナル伝達ドメインを含む、請求項71に記載のキメラポリペプチド。
- 前記追加の共刺激シグナル伝達ドメインが、4-1BBシグナル伝達ドメイン、CD27シグナル伝達ドメイン、またはOX40シグナル伝達ドメインを含む、請求項71または72に記載のキメラポリペプチド。
- 前記CARが、配列番号20~29および114~134のいずれか1つの配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、または約100%同一のアミノ酸配列を有する、請求項67に記載のキメラポリペプチド。
- 前記キメラポリペプチドの前記膜貫通ドメインが、CD8α、CD2、またはCD28に由来するものである、請求項67から74までのいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記膜貫通ドメインが、CD28に由来するものである、請求項75に記載のキメラポリペプチド。
- 請求項42から66までのいずれか一項に記載のCAR、または請求項67から76までのいずれか一項に記載のキメラポリペプチド、またはその両方をコードする核酸。
- 請求項58から66までのいずれか一項に記載のトランスジェニックTCRをさらにコードする、請求項77に記載の核酸。
- 配列番号41~58および92~112のいずれか1つの配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、または約100%同一の配列を有するポリペプチドをコードする、請求項77に記載の核酸。
- 請求項67から76までのいずれか一項に記載のキメラポリペプチドをコードする、請求項77に記載の核酸。
- 配列番号49~58および92~112のいずれか1つの配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、または約100%同一の配列を有するポリペプチドをコードする、請求項80に記載の核酸。
- CARをさらにコードする、請求項80に記載の核酸。
- 配列番号73、75、77、79、81、83、85、および114~134のいずれか1つの配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、または約100%同一の配列を有するポリペプチドをコードする、請求項82に記載の核酸。
- トランスジェニックTCRをさらにコードする、請求項80に記載の核酸。
- 前記CARの抗原結合性ドメイン、前記トランスジェニックTCRの抗原結合性ドメイン、および前記キメラポリペプチドの抗原結合性ドメインが、異なる抗原に対して特異的である、請求項82から84までのいずれか一項に記載の核酸。
- 前記CARの抗原結合性ドメイン、前記トランスジェニックTCRの抗原結合性ドメイン、および前記キメラポリペプチドの結合性ドメインが、同じ抗原に対して特異的である、請求項82から84までのいずれか一項に記載の核酸。
- 前記第1の抗原結合性ドメイン、前記第2の抗原結合性ドメイン、および前記第3の抗原結合性ドメインが、同じ抗原の異なるエピトープに対して特異的である、請求項82から84までのいずれか一項に記載の核酸。
- 前記キメラポリペプチドをコードする核酸、前記CARをコードする核酸、および前記TCRをコードする核酸が、それぞれ個々のプロモーターを有する、請求項82から84までのいずれか一項に記載の核酸。
- 前記CARの膜貫通ドメイン、前記トランスジェニックTCRの膜貫通ドメイン、および前記キメラポリペプチドの膜貫通ドメインが、異なるものである、請求項82から88までのいずれか一項に記載の核酸。
- 前記キメラポリペプチドをコードする核酸、前記CARをコードする核酸、および前記TCRをコードする核酸が、リボソーム再進入部位によって隔てられている、請求項82から89までのいずれか一項に記載の核酸。
- 前記キメラポリペプチドと前記CARが、単一のポリペプチドとしてコードされており、前記キメラポリペプチドと前記CARが、自己切断性ペプチドによって隔てられている、請求項82に記載の核酸。
- 前記自己切断性ペプチドが、2Aペプチドである、請求項91に記載の核酸。
- DNAを含む、請求項77から92までのいずれか一項に記載の核酸。
- RNAを含む、請求項77から92までのいずれか一項に記載の核酸。
- 前記キメラポリペプチドと前記CARが、同時形質導入するための別々のポリペプチドとしてコードされている、請求項82に記載の核酸。
- プロモーターと作動可能に連結した、請求項77から93および95のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
- レンチウイルスベクターである、請求項96に記載のベクター。
- 請求項42から57までのいずれか一項に記載のCAR、請求項58から66までのいずれか一項に記載のトランスジェニックTCR、および/または請求項67から76までのいずれか一項に記載のキメラポリペプチド、請求項77から92までのいずれか一項に記載の核酸、および/または請求項95または97に記載のベクターを含む、操作された細胞。
- 請求項42から66までのいずれか一項に記載のCARを発現する、請求項98に記載の操作された細胞。
- 請求項67から76までのいずれか一項に記載のキメラポリペプチドを発現する、請求項98または99に記載の操作された細胞。
- 1つまたは複数のCARをさらに含む、請求項100に記載の操作された細胞。
- 前記第1の抗原、前記第2の抗原、および前記第3の抗原が、互いに異なる、請求項101に記載の操作された細胞。
- 前記第1の抗原、前記第2の抗原、および前記第3の抗原のうちの少なくとも2つが同じである、請求項101に記載の操作された細胞。
- 前記第1の結合性ドメイン、前記第2の結合性ドメイン、および前記第3の抗原結合性ドメインが、同じ抗原の異なるエピトープに対して特異的である、請求項101に記載の操作された細胞。
- 前記CARの膜貫通ドメインが、前記キメラポリペプチドの膜貫通ドメインとは異なる、請求項101から104までのいずれか一項に記載の操作された細胞。
- 請求項98から105までのいずれか一項に記載の操作された細胞を作出するための方法であって、
a)免疫細胞を提供するステップ、および
b)前記免疫細胞に、請求項77から95までのいずれか一項に記載の核酸を形質導入するステップ
を含む、方法。 - 前記免疫細胞が、T細胞、NK細胞、NKT細胞、マクロファージ、または腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)である、請求項106に記載の方法。
- 前記免疫細胞が、T細胞、NK細胞、NKT細胞、マクロファージ、または腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)の前駆細胞である、請求項106に記載の方法。
- 前記免疫細胞に免疫受容体をコードする核酸を形質導入するステップをさらに含み、前記免疫受容体が、CARおよび/またはトランスジェニックTCRである、請求項106から108までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸が、前記CARおよび/または前記トランスジェニックTCRをコードする、請求項106から109までのいずれか一項に記載の方法。
- 改善された機能的特徴を有するCAR-T細胞を作出するための方法であって、
a)免疫細胞を提供するステップ、ならびに
b)前記免疫細胞に、CARをコードする核酸、および請求項67から76までのいずれか一項に記載のキメラポリペプチドをコードする核酸を形質導入して、第1の抗原を有する標的細胞に対して特異的なCARを有するCAR-T細胞を作製するステップであって、前記CAR-T細胞が、請求項67から76までのいずれか一項に記載のキメラポリペプチドおよび/または請求項58から66までのいずれか一項に記載のトランスジェニックTCRをさらに含む、ステップ
を含み、前記機能的特徴が、
i.CD58の発現をダウンレギュレートするかまたはCD58を実質的に発現しない標的細胞に対する有効性;
ii.選択された抗原をダウンレギュレートするかまたは選択された抗原の変異形態を発現する標的細胞に対する有効性;
iii.前記標的細胞に対する選択性の改善;または
iv.CAR標的抗原の喪失のレスキュー
である、方法。 - 前記キメラポリペプチドが、前記標的細胞によって発現される抗原に対して特異的な抗原結合性ドメインを含む、請求項111に記載の方法。
- 前記トランスジェニックTCRが、前記標的細胞によって発現される抗原に対して特異的な抗原結合性ドメインを含む、請求項111に記載の方法。
- 前記CAR標的抗原が、CD19である、請求項111に記載の方法。
- 少なくとも第1の抗原を有する標的細胞の増殖を特徴とする過剰増殖性障害を有する対象の処置を補助するための方法であって、
a)
i)前記第1の抗原に対して特異的なCARおよび/もしくは第2の抗原に対して特異的なトランスジェニックTCRを発現する、請求項99に記載の操作された細胞;または
ii)前記第1の抗原に対して特異的なCARおよび/もしくは前記第2の抗原に対して特異的なトランスジェニックTCRを発現する、請求項101に記載の操作された細胞
を提供するステップ、ならびに
b)治療有効数の前記操作された細胞を投与するステップであって、前記操作された細胞により、前記対象の処置が補助される、ステップ
を含む、方法。 - a)請求項101に記載の操作された細胞が、少なくとも2つの共刺激ドメインを有するCARを含むか、または
b)請求項99に記載の操作された細胞が、CD2共刺激ドメインに加えて少なくとも2つの共刺激ドメインを有するCARを含む、請求項115に記載の方法。 - 前記標的細胞によるCD58発現の程度を決定するステップをさらに含む、請求項115または116に記載の方法。
- 前記操作された細胞を投与する前に前記標的細胞によるCD58発現の決定を提供するステップ、および前記CD58発現の決定により、前記標的細胞が変異CD58を発現するかまたはCD58を閾値レベルを下回るレベルで発現することが示された場合、治療有効数の前記操作された細胞を投与するステップをさらに含む、請求項115に記載の方法。
- 前記閾値レベルが、標的細胞当たり約50,000、45,000、40,000、35,000、30,000、25,000、20,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000、10,000、9,000、8,000、7,000、6,000、5,000、4,000、3,000、2,000、1,000、または500のCD58分子である、請求項118に記載の方法。
- 抗体またはその抗原結合性断片をさらに提供する、請求項115から119までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合性断片が、前記標的細胞の微小環境におけるCD2シグナル伝達を刺激することが可能なものである、請求項120に記載の方法。
- 前記抗体が、多重特異性抗体である、請求項120から121までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗体が、抗腫瘍抗原、CD2、およびCD3に対して特異的である、請求項122に記載の方法。
- 前記抗体結合性断片が、scFv、scFv-Fc、Fab、Fab’、(Fab)2、(Fab’)2、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、およびdAbからなる群より選択される、請求項120から121までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体結合性断片が、抗腫瘍抗原、CD2、およびCD3に対して特異的である、請求項124に記載の方法。
- 前記標的細胞の微小環境において発現される腫瘍特異的抗原に応答してネイティブCD2と架橋結合することが可能な治療剤をさらに提供する、請求項115から119までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記治療剤が、分泌されるかまたは細胞表面に発現される、請求項126に記載の方法。
- 前記治療剤が、抗CD2 scFv、抗体、Fab、DARPIN、リガンド、または抗原結合性ドメインである、請求項127に記載の方法。
- 少なくとも第1の抗原を有する標的細胞の増殖を特徴とする過剰増殖性障害を有する対象の処置を補助するための方法であって、前記標的細胞が、低下したレベルのCD58を発現し、かつ/またはCD2を活性化する能力が低下した形態のCD58を発現し、前記方法が、
a.操作された細胞を提供するステップであって、前記操作された細胞が、
i.前記第1の抗原に特異的に結合することが可能な第1の抗原結合性ドメイン;
ii.スペーサードメイン;
iii.膜貫通ドメイン;および
iv.細胞質シグナル伝達ドメインであって、CD2シグナル伝達ドメインおよびCD3ζ活性化ドメインを含む、細胞質シグナル伝達ドメイン;
を含むCARを発現する、ステップ、
b.前記対象から得られた試料における機能的CD58の発現レベルを決定するステップであって、前記試料が、腫瘍細胞を含有する、ステップ、ならびに
c.機能的CD58の発現レベルが、所定の閾値レベルよりも低い場合、治療有効数の操作された細胞を投与するステップ
を含む、方法。 - 前記細胞質シグナル伝達ドメインが、追加の共刺激ドメインを含む、請求項129に記載の方法。
- 前記追加のシグナル伝達ドメインが、4-1BBシグナル伝達ドメイン、CD27シグナル伝達ドメイン、CD28シグナル伝達ドメイン、またはOX40シグナル伝達ドメインを含む、請求項129または130に記載の方法。
- 前記閾値レベルが、標的細胞当たり約50,000、45,000、40,000、35,000、30,000、25,000、20,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000、10,000、9,000、8,000、7,000、6,000、5,000、4,000、3,000、2,000、1,000、または500の機能的CD58分子である、請求項129から131までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作された細胞が、第2の抗原に対して特異的な第2の抗原結合性ドメインを含むトランスジェニックTCR、ならびに/または、第3の抗原に対して特異的な第3の抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラポリペプチドをさらに含む、請求項129から132までのいずれか一項に記載の方法。
- 抗体またはその抗原結合性断片をさらに提供する、請求項129から133までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合性断片が、前記標的細胞の微小環境におけるCD2シグナル伝達を刺激することが可能なものである、請求項134に記載の方法。
- 前記抗体が、多重特異性抗体である、請求項134から135までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗体が、抗腫瘍抗原、CD2、およびCD3に対して特異的である、請求項136に記載の方法。
- 前記抗体結合性断片が、scFv、scFv-Fc、Fab、Fab’、(Fab)2、(Fab’)2、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、およびdAbからなる群より選択される、請求項134から135までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体結合性断片が、抗腫瘍抗原、CD2、およびCD3に対して特異的である、請求項138に記載の方法。
- 前記標的細胞の微小環境において発現される腫瘍特異的抗原に応答してネイティブCD2と架橋結合することが可能な治療剤をさらに提供する、請求項129から139までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記治療剤が、分泌されるかまたは細胞表面に発現される、請求項140に記載の方法。
- 少なくとも第1の抗原を有する標的細胞の増殖を特徴とする過剰増殖性障害を有する対象の処置を補助するためのシステムであって、
前記第1の抗原に対して特異的なCARを発現する、請求項98または101に記載の操作された細胞;および、
CD58に対して特異的な標識された結合性作用物質
を含む、システム。 - 前記CARが、細胞質シグナル伝達ドメインを含み、前記細胞質シグナル伝達ドメインが、4-1BBシグナル伝達ドメイン、CD2シグナル伝達ドメイン、およびCD3ζ活性化ドメインを含む、請求項142に記載のシステム。
- 前記CARが、細胞質シグナル伝達ドメインを含み、前記細胞質シグナル伝達ドメインが、共シグナル伝達ドメインおよびCD3ζ活性化ドメインを含み、前記操作された細胞が、請求項67から76までのいずれか一項に記載のキメラポリペプチドをさらに含む、請求項142に記載のシステム。
- 前記標識された結合性作用物質が、抗CD58抗体または抗体誘導体を含む、請求項142から144までのいずれか一項に記載のシステム。
- 前記操作された細胞が、第2の抗原に対して特異的な第2の抗原結合性ドメインを含むトランスジェニックTCR、ならびに/または、第3の抗原に対して特異的な第3の抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラポリペプチドをさらに含む、請求項142から145までのいずれか一項に記載のシステム。
- a.請求項77から94までのいずれか一項に記載の核酸;
b.請求項95もしくは97に記載のベクター;および/または
c.請求項98から104までのいずれか一項に記載の操作された細胞;ならびに
d.薬学的に許容される担体
を含む治療用組成物。 - 対象における疾患を処置するための、
a.請求項42から66までのいずれか一項に記載のCAR;
b.請求項67から76までのいずれか一項に記載のキメラポリペプチド;
c.請求項58から66までのいずれか一項に記載のトランスジェニックTCR;
d.請求項77から94までのいずれか一項に記載の核酸;
e.請求項95から97までのいずれか一項に記載のベクター;
f.請求項98から104までのいずれか一項に記載の操作された細胞;
g.請求項142から145までのいずれか一項に記載のシステム;および/または
h.請求項147に記載の治療用組成物
の使用。 - 対象における疾患を処置するための医薬を製造するための、
a.請求項42から66までのいずれか一項に記載のCAR;
b.請求項67から76までのいずれか一項に記載のキメラポリペプチド;
c.請求項58から66までのいずれか一項に記載のトランスジェニックTCR;
d.請求項77から94までのいずれか一項に記載の核酸;
e.請求項95から97までのいずれか一項に記載のベクター;
f.請求項98から104までのいずれか一項に記載の操作された細胞;
g.請求項142から145までのいずれか一項に記載のシステム;および/または
h.請求項147に記載の治療用組成物
の使用。 - 前記対象が、ヒトである、請求項148または149に記載の使用。
- ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、チェックポイント阻害剤、T細胞アゴニスト抗体、化学療法、および二重特異性抗体からなる群より選択される1つまたは複数と組み合わせた、請求項148または149に記載の使用。
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