KR20240034234A - 항체로부터의 결합 도메인에 융합된 조작된 t 세포 수용체 - Google Patents

항체로부터의 결합 도메인에 융합된 조작된 t 세포 수용체 Download PDF

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KR20240034234A
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2세븐티 바이오, 인코포레이티드
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Abstract

본 개시는 개선된 T 세포 수용체, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 벡터, 세포, 및 이를 사용하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 하나 이상의 추가 결합 도메인을 포함하도록 조작된 T 세포 수용체 기반 작제물, 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 결합 도메인은 TCR 가변 도메인 중 하나 또는 둘 다에 융합된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 추가 결합 도메인은 하나 이상의 폴리펩티드 링커를 사용해 TCR에 연결된다.

Description

항체로부터의 결합 도메인에 융합된 조작된 T 세포 수용체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)에 의거하여 2021년 7월 14일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/221,819호의 이익을 주장하며, 그 전체는 참조로서 본원에 통합된다.
서열 목록에 관한 진술
본 출원과 연관된 서열 목록은 종이 사본 대신에 서열 목록 XML 형식으로 제공되며, 참조로서 본 명세서에 통합된다. 서열 목록이 포함된 XML 파일의 명칭은 137080-03620_SL.xml이다. 2022년 7월 14일에 생성된 텍스트 파일은 198,833 KB이며, 본 명세서의 출원과 동시에 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출된다.
기술 분야
본 발명은 조작된 T 세포 수용체(TCR)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 하나 이상의 추가 항원 결합 도메인을 포함하도록 조작된 TCR 기반 작제물 및 복합체, 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 TCRα, TCRβ, TCRγ, 및/또는 TCRδ 가변 도메인에 연결된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 추가 항원 결합 도메인은 하나 이상의 폴리펩티드 링커를 통해 TCR 가변 도메인에 연결된다.
입양 T 세포 요법은 세포 표면 항원(키메라 항원 수용체; CAR) 또는 세포내 항원(조작 T 세포 수용체; TCR)을 표적화하도록 조작될 수 있다. CAR T 세포 활성화 및 항종양 활성은 CD3-zeta 신호 전달 도메인에 융합된 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인을 포함하는 화합물 세포내 신호 전달 영역에 표적화 모이어티를 연결함으로써 달성된다. 역으로, 조작된 TCR T 세포는 CD3 복합체 및 다른 근위 신호 전달 분자에 의해 조정된 천연 세포내 신호 전달 이벤트를 통해 활성화되어, CAR T 세포에 대한 민감도를 증가시킨다.
CAR T 세포에 대한 TCR T 세포의 반응 민감도가 바람직하지만, TCR T 세포는 다른 특성에 의해 제한된다. 예를 들어, 표적 인식이 MHC-제한에 의해 통제되기 때문에, TCR은 일반적으로 전체 모집단의 40% 미만에 존재하는 HLA 일배체형을 향해 개발된다. 이는 표적 발현 및 기타 제외 및 제한에서 기인하는 표준 절단 전에, 환자 적격성/모집을 위한 상한을 나타낸다. MHC-제한은 또한 표적 세포(예를 들어, 종양)가 유전자 돌연변이 또는 항원 처리 및 제시 기계의 억제를 통해 탈출 경로를 진화시킬 수 있는 충분한 기회를 생성한다.
따라서, 질환을 치료하기 위한 개선된 TCR 기반 작제물 및 요법에 대한 필요성이 남아 있다.
본 개시는 일반적으로 조작된 T 세포 수용체, 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 조성물, 약제 및 이의 용도에 부분적으로 관한 것이다.
일 양태에서, 조작된 T 세포 수용체(TCR)가 제공되며, 여기서 조작된 TCR 수용체는 TCR 가변 도메인 중 하나 또는 둘 다 연결된 하나 이상의 항원 결합 도메인(들)을 포함한다.
또 다른 양태에서, 조작된 T 세포 수용체(TCR)가 제공되며, 상기 조작된 T 세포 수용체(TCR)는 (a) TCRα 가변 도메인을 포함하는 TCRα 폴리펩티드; (b) TCRβ 가변 도메인을 포함하는 TCRβ 폴리펩티드; 및 (c) TCRα 가변 도메인 및/또는 TCRβ 가변 도메인에 연결된 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 조작된 T 세포 수용체(TCR)가 제공되며, 상기 조작된 T 세포 수용체는 (a) TCRγ 가변 도메인을 포함하는 TCRγ 폴리펩티드; (b) TCRδ 가변 도메인을 포함하는 TCRδ 폴리펩티드; 및 (c) TCRγ 가변 도메인 및/또는 TCRδ 가변 도메인에 연결된 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, (a) TCRβ 가변 도메인을 포함하는 TCRβ 폴리펩티드; (b) 폴리펩티드 절단 신호; 및 (c) 하나 이상의 항원 결합 도메인, 폴리펩티드 링커, 및 TCRα 가변 도메인을 포함하는 TCRα 폴리펩티드를 포함한다.
또 다른 양태에서, (a) 하나 이상의 항원 결합 도메인, 폴리펩티드 링커, 및 TCRβ 가변 도메인을 포함하는 TCRβ 폴리펩티드; (b) 폴리펩티드 절단 신호; 및 (c) TCRα 가변 도메인을 포함하는 TCRα 폴리펩티드.
또 다른 양태에서, (a) 하나 이상의 항원 결합 도메인, 폴리펩티드 링커, 및 TCRβ 가변 도메인을 포함하는 TCRβ 폴리펩티드; (b) 폴리펩티드 절단 신호; 및 (c) 하나 이상의 항원 결합 도메인, 폴리펩티드 링커, 및 TCRα 가변 도메인을 포함하는 TCRα 폴리펩티드를 포함한다.
또 다른 양태에서, (a) TCRγ 가변 도메인을 포함하는 TCRγ 폴리펩티드; (b) 폴리펩티드 절단 신호; 및 (c) 하나 이상의 항원 결합 도메인, 폴리펩티드 링커, 및 TCRδ 가변 도메인을 포함하는 TCRδ 폴리펩티드를 포함한다.
또 다른 양태에서, (a) 하나 이상의 항원 결합 도메인, 폴리펩티드 링커, 및 TCRγ 가변 도메인을 포함하는 TCRγ 폴리펩티드; (b) 폴리펩티드 절단 신호; 및 (c) TCRδ 가변 도메인을 포함하는 TCRδ 폴리펩티드를 포함한다.
또 다른 양태에서, (a) 하나 이상의 항원 결합 도메인, 폴리펩티드 링커, 및 TCRγ 가변 도메인을 포함하는 TCRγ 폴리펩티드; (b) 폴리펩티드 절단 신호; 및 (c) 하나 이상의 항원 결합 도메인, 폴리펩티드 링커, 및 TCRδ 가변 도메인을 포함하는 TCRδ 폴리펩티드를 포함한다.
다양한 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 TCRα 불변 도메인을 포함하고, TCRβ 폴리펩티드는 TCRβ 불변 도메인을 포함한다.
다양한 구현예에서, TCRγ 폴리펩티드는 TCRγ 불변 도메인을 포함하고, TCRδ 폴리펩티드는 TCRδ 불변 도메인을 포함한다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 TCRα 또는 TCRγ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 TCRβ 또는 TCRδ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 (i) TCRα 또는 TCRγ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인, 및 (ii) TCRβ 또는 TCRδ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 항원 결합 도메인은 가변 도메인의 N-말단에 연결된다. 일부 구현예에서, 제1 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이하고/하거나, 제1 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이한 표적 항원에 결합한다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 제1 항원 결합 도메인에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함한다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 TCRα 또는 TCRγ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 TCRβ 또는 TCRδ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 (i) TCRα 또는 TCRγ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인에 연결된 제2 항원 결합 도메인, 및 (ii) TCRβ 또는 TCRδ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함한다.
다양한 구현예에서, 제2 항원 결합 도메인은 제1 항원 결합 도메인의 N-말단에 연결된다. 일부 구현예에서, 제2 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이하고/하거나, 제2 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이한 표적 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이하고/하거나, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이한 표적 항원에 결합한다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 항원-결합 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 항원에 결합한다: 알파 엽산 수용체(FRα), αvβ6 인테그린, ADGRE2, BACE2, B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3 (CD276), B7-H4, B7-H6, CA19.9, 탄산 탈수 효소 IX(CAIX), CCR1, CD7, CD16, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD133, CD138, CD171, CD244, 암배아 항원(CEA), C형 렉틴-유사 분자-1(CLL-1), CD2 서브세트 1(CS-1), CLDN6, cMET, 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 4(CSPG4), CLDN18.2, 피부 T 세포 림프종 연관 항원 1(CTAGE1), DLL3, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII), EGFR806, 상피 당단백질 2(EGP2), 상피 당단백질 40(EGP40), EPHB2, ERBB4, 상피 세포 부착 분자(EPCAM), 에프린 A형 수용체 2(EPHA2), 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), Fc 수용체 유사 5(FCRL5), 태아 아세틸콜린에스테라아제 수용체(AchR), FLT3, FN, FN-EDB, FRBeta, 갱글리오시드 G2(GD2), 갱글리오시드 G3(GD3), 글리피칸-3(GPC3), ErbB2(HER2)를 포함하는 EGFR 계열, HER2p95, EGFRv3, IL-10R, IL-13Rα2, 카파, 암/고환 항원 2(LAGE-1A), K-Ras, K-Ras G12C, K-Ras G12D, K-Ras G12V, 람다, 루이스-Y(LeY), L1 세포 접착 분자(L1-CAM), LILRB2, LY6G6GD, T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원 1(MelanA 또는 MART1), 메소텔린(MSLN), MMP10, MUC1, MUC16, MHC 클래스 I 사슬 관련 단백질 A(MICA), MHC 클래스 I 사슬 관련 단백질 B(MICB), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제-유사 희귀 수용체 1(ROR1), 윤활막 육종, X 중단점 2(SSX2), 서바이빈, 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 막관통 활성제 및 CAML 상호작용자(TACI), 종양 내피 마커 1(TEM1/CD248), 종양 내피 마커 7 관련(TEM7R), TIM3, 영양아세포 당단백질(TPBG), UL16-결합 단백질(ULBP) 1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, 및 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 항원에 결합한다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 유래된 표적 폴리펩티드에 결합한다: α-태아단백질(AFP), ASCL2, B 흑색종 항원(BAGE) 패밀리 구성원, 각인 부위 조절제의 형제(BORIS), 암-고환 항원, 암-고환 항원 83(CT-83), 탄산 탈수효소 IX(CA1X), 암배아 항원(CEA), 거대세포바이러스(CMV) 항원, 세포독성 T 세포(CTL)-인식된 흑색종 항원(CAMEL), 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스(EBV) 항원, EPHB2, G 항원 1(GAGE-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, 당단백질 100(GP100), B형 간염 바이러스(HBV) 항원, C형 간염 바이러스(HCV) 비구조 단백질 3(NS3), 인간 유두종바이러스(HPV)-E6, HPV-E7, 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT), IGF2BP3/A3, IGF2BP1, K-Ras, K-Ras G12C, K-Ras G12D, K-Ras G12V, 잠재 막 단백질 2(LMP2), LY6G6D , 흑색종 항원 패밀리 A, 1(MAGE-A1), MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4 MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원(MART-1), 메소텔린(MSLN), 뮤신 1(MUC1), 뮤신 16(MUC16), 뉴욕 식도 편평 세포 암종-1(NYESO-1), P53,P 항원(PAGE) 패밀리 구성원, PAP, PIK3CA, PIK3CA H1047R, 태반-특이적 항원 1(PLAC1), 흑색종에서 우선적으로 발현되는 항원(PRAME), 전립선 특이적 항원 PSA, 서바이빈, 활막 육종 X 1(SSX1), 활막 육종 X 2(SSX2), 활막 육종 X 3(SSX3), 활막 육종 X 4(SSX4), 활막 육종 X 5(SSX5), 활막 육종 X 8(SSX8), 갑상선글로불린, TP53 R175H, 티로시나아제, 티로시나아제 관련 단백질(TRP)1, TRP2, UBD, 빌름스(Wilms) 종양 단백질(WT-1), Wnt10A, X 항원 패밀리 구성원 1(XAGE1), 및 X 항원 패밀리 구성원 2(XAGE2).
일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 CD33, CLL1, CD19, CD20, CD22, CD79A, CD79B, 또는 BCMA에 결합한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 CD19, CD20, CD22, CD33, CD79A, CD79B, B7H3, Muc16, Her2, EGFR, FN-EDB, CLDN18.2, DLL3, FLT3, CLL1, CD123, 또는 BCMA에 결합한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 서열번호 1-32 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다: 낙타 Ig, 리마 Ig, 알파카 Ig, Ig NAR, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 이중 특이적 Fab 이량체(Fab2), 삼중특이적 Fab 삼량체(Fab3), Fv, 단쇄 Fv 단백질("scFv"), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이황화물로 안정화된 Fv 단백질("dsFv"), 및 단일 도메인 항체(sdAb, 카멜리드 VHH, 나노바디). 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 하나 이상의 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 하나 이상의 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함한다. 일부 구현예에서, sdAb는 카멜리드 VHH, 나노바디, 또는 중쇄로만 구성된 항체(HcAb)이다. 일부 구현예에서, sdAb는 카멜리드 VHH이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 또는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 리간드를 포함한다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 하나 이상의 폴리펩티드 링커에 의해 TCR 가변 도메인에 연결된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 2 내지 약 25개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 4 내지 약 15개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 4 내지 약 10개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 또는 약 15개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 9 또는 약 10개 아미노산 길이의 링커를 포함한다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 링커를 포함한다: GG, GS, SG, SS, GSS, SSG, GSG, SGS, SGG, GGS, GGGS (서열번호 53), (GGGGS)1-5 폴리펩티드 (서열번호 35-39), 유대류 γμTCR로부터의 링커 (예를 들어, LEKT; 서열번호 33), 및 이들의 임의의 조합. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 서열번호 33에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는, 유대류 γμTCR로부터의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 GGGGS(서열번호 35) 링커(G4S)를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 서열번호 34에 제시된 것과 같은 유대류 γμTCR 링커 및 G4S 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 2개의 GGGGS 링커(2xG4S)(서열번호 36)를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 3개의 GGGGS 링커(3xG4S)(서열번호 37)를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 서열번호 33-53 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 제2 폴리펩티드 링커에 의해 분리된다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 약 2 내지 약 25개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 약 4 내지 약 15개 아미노산의 길이이다.
다양한 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 GG, GS, SG, SS, GSS, SSG, GSG, SGS, SGG, GGS, GGGS (서열번호 53), (GGGGS)1-5 폴리펩티드 (서열번호 35-39), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 링커를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 서열번호 33-53 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, TCR 가변 도메인은 MHC 복합체에 의해 제시된 표적 폴리펩티드에 결합한다.
다양한 구현예에서, TCR 가변 도메은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 항원에 결합한다: α-태아단백질(AFP), ASCL2, B 흑색종 항원(BAGE) 패밀리 구성원, 각인 부위 조절제의 형제(BORIS), 암-고환 항원, 암-고환 항원 83(CT-83), 탄산 탈수효소 IX(CA1X), 암배아 항원(CEA), 거대세포바이러스(CMV) 항원, 세포독성 T 세포(CTL)-인식된 흑색종 항원(CAMEL), 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스(EBV) 항원, EPHB2, G 항원 1(GAGE-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, 당단백질 100(GP100), B형 간염 바이러스(HBV) 항원, C형 간염 바이러스(HCV) 비구조 단백질 3(NS3), 인간 유두종바이러스(HPV)-E6, HPV-E7, 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT), IGF2BP3/A3, IGF2BP1, K-Ras, K-Ras G12C, K-Ras G12D, K-Ras G12V, 잠재 막 단백질 2(LMP2), LY6G6D , 흑색종 항원 패밀리 A, 1(MAGE-A1), MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4 MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원(MART-1), 메소텔린(MSLN), 뮤신 1(MUC1), 뮤신 16(MUC16), 뉴욕 식도 편평 세포 암종-1(NYESO-1), P53,P 항원(PAGE) 패밀리 구성원, PAP, PIK3CA, PIK3CA H1047R, 태반-특이적 항원 1(PLAC1), 흑색종에서 우선적으로 발현되는 항원(PRAME), 전립선 특이적 항원 PSA, 서바이빈, 활막 육종 X 1(SSX1), 활막 육종 X 2(SSX2), 활막 육종 X 3(SSX3), 활막 육종 X 4(SSX4), 활막 육종 X 5(SSX5), 활막 육종 X 8(SSX8), 갑상선글로불린, TP53 R175H, 티로시나아제, 티로시나아제 관련 단백질(TRP)1, TRP2, UBD, 빌름스(Wilms) 종양 단백질(WT-1), Wnt10A, X 항원 패밀리 구성원 1(XAGE1), 및 X 항원 패밀리 구성원 2(XAGE2). 일부 구현예에서, TCR 가변 도메인은 MAGE-A4, PRAME, K-Ras, TP53R175H, PSA, 또는 IGF2BP3으로부터 유래된 표적 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, TCR 가변 도메인은 MAGE-A4로부터 유래된 표적 폴리펩티드에 결합한다.
다양한 구현예에서, TCRα 불변 도메인은 서열번호 82 또는 88에 제시된 것과 같은 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/하거나, TCRβ 불변 도메인은 서열번호 80, 81, 86, 또는 87 중 어느 하나에 제시된 것과 같은 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, TCRγ 불변 도메인은 서열번호 83 또는 84에 제시된 것과 같은 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/하거나, TCRδ 불변 도메인은 서열번호 85 중 어느 하나에 제시된 것과 같은 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, TCRα 또는 TCRγ 폴리펩티드는 (i) 서열번호 105-111 중 어느 하나에 제시된 것과 같은 아미노산 서열, 또는 (ii) 서열번호 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 및 78 중 어느 하나에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 TCRα 또는 TCRγ 가변 도메인을 포함한다.
다양한 구현예에서, TCRβ 또는 TCRδ 폴리펩티드는 (i) 서열번호 103 또는 104에 제시된 것과 같은 아미노산 서열, 또는 (ii) 서열번호 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 및 79 중 어느 하나에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 TCRβ 또는 TCRδ 가변 도메인을 포함한다.
다양한 구현예에서, 융합 폴리펩티드의 폴리펩티드 절단 신호는 바이러스 자가 절단 펩티드 또는 리보솜 스키핑 서열이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 바이러스 2A 펩티드이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 아프토바이러스 2A 펩티드, 포티바이러스 2A 펩티드, 또는 카디오바이러스 2A 펩티드이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 2A 펩티드이다: 구제역 바이러스(FMDV) 2A 펩티드, 말 비염 A 바이러스(ERAV) 2A 펩티드, 토세아 아시그나 바이러스(TaV) 2A 펩티드, 돼지 테스코바이러스-1(PTV-1) 2A 펩티드, 테일로바이러스 2A 펩티드, 및 뇌심근염 바이러스 2A 펩티드. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 자가 절단 펩티드의 상류에 퓨린 인식 부위를 포함하되, 임의로 퓨린 인식 부위는 서열번호 112에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 113-117 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 융합 폴리펩티드의 TCRβ 또는 TCRδ 폴리펩티드는 TCRα 또는 TCRγ 폴리펩티드의 N-말단이다.
다양한 구현예에서, 융합 폴리펩티드의 TCRα 또는 TCRγ 폴리펩티드는 TCRβ 또는 TCRδ 폴리펩티드의 N-말단이다.
다양한 구현예에서, TCRα 및 TCRβ 폴리펩티드는 N-말단 신호 서열을 각각 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRγ 및 TCRδ 폴리펩티드는 N-말단 신호 서열을 각각 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 서열은 동일하거나 상이하다. 일부 구현예에서, 신호 서열은 IgK 또는 TCRα 신호 서열이다. 일부 구현예에서, 신호 서열은 CD8α 신호 서열이다.
다양한 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 91-97, 100 및 102 중 어느 하나에 제시된 아미노산 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에서 고려되는 조작된 TCR 또는 융합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
또 다른 양태에서, 본원에서 고려되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제공된다. 다른 구현예에서, 벡터는 발현 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다.
또 다른 양태에서, 본원에서 고려되는 조작된 TCR, 융합 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 벡터를 포함하는 세포가 제공된다. 일부 구현예에서, 세포는 조혈 세포이다. 다양한 구현예에서, 세포는 T 세포, αβ-T 세포, 또는 γδ-T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 CD3+, CD4+, 및/또는 CD8+ 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 면역 효과기 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 세포독성 T 림프구(CTL), 종양 침윤 림프구(TIL), 또는 헬퍼 T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 T세포, 자연 살해(NK) 세포 또는 자연 살해 T(NKT) 세포이다. 일부 구현예에서, 세포의 공급원은 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위에서 유래된 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직, 또는 종양이다. 일부 구현예에서, 세포는 단리된 비-천연 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 세포는 인간 세포이다.
또 다른 양태에서, 본원에서 고려되는 조작된 TCR, 융합 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 또는 세포를 포함하는 조성물이 제공된다.
또 다른 양태에서, 본원에서 고려되는 조작된 TCR, 융합 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 또는 세포를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
또 다른 양태에서, 대상체에게 유효량의 본원에서 고려되는 세포, 조성물 또는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 치료가 필요한 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.
또 다른 양태에서, 암, 감염성 질환, 자가면역 질환, 염증성 질환, 및 면역 결핍증, 또는 이와 관련된 병태의 적어도 하나의 증상을 치료, 예방, 또는 개선하는 방법이 제공되며, 본 발명에 고려되는 세포, 조성물 또는 약학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 고형 암을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본원에서 고려되는 세포, 조성물, 또는 약학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 구현예에서, 고형암은 폐암, 편평 세포 암종, 대장암, 췌장암, 유방암, 갑상선암, 방광암, 자궁경부암, 식도암, 난소암, 위암, 자궁내막암, 뇌암, 또는 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 고형 암은 비소세포 폐암종(NSCLC), 소세포폐암(SCLC), 두경부 편평 세포 암종, 대장암, 췌장암, 유방암, 갑상선암, 방광암, 자궁경부암, 식도암, 난소암, 위암, 자궁내막암, 신경교종, 신경아세포종, 희돌기아교종, 희돌기교종, 육종 또는 골육종이다.
또 다른 양태에서, 본원에서 고려되는 세포, 조성물 또는 약학적 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 혈액암 치료 방법. 다양한 구현예에서, 혈액암은 백혈병, 림프종, 또는 다발성 골수종이다. 일부 구현예에서, 혈액암은 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프구성 백혈병(ALL)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
도 1a는 예시적인 MAGE TCR, CD33 DARIC, 및 조작된 TCR(VHH-TCR) 작제물 설계를 도시한다.
도 1b는 TCR에 연결된 VHH를 갖는 예시적인 조작된 TCR을 도시한다.
도 2a는 면역 효과기 세포에서 VHH 발현을 보여준다.
도 2b는 A549.CD33 세포에 대한 조작된 TCR/수용체 사이토카인 반응을 보여준다.
도 2c는 A549.CD33 세포에 대한 조작된 TCR/수용체 사이토카인 반응을 보여준다.
도 3a는 면역 효과기 세포에서 조작된 TCR/수용체 발현을 보여준다.
도 3b는 A549.A2.MAGEA4 세포에 대한 조작된 TCR/수용체 사이토카인 반응을 보여준다.
도 3c는 A549.A2.MAGEA4 세포에 대한 조작된 TCR/수용체 사이토카인 반응을 보여준다.
도 4a는 MAGEA4 펩티드에 대한 조작된 TCR 사이토카인 반응을 보여준다.
도 4b 및 도 4c는 다양한 양의 CD33 mRNA로 전기천공된 세포에 대한 조작된 TCR 사이토카인 반응을 보여준다.
도 5a-5c는 HL-60, Kasumi1, 및 OCI-AML3 세포에 대한 조작된 TCR 및 DARIC 세포독성을 보여준다.
도 6은 예시적인 조작된 TCR 작제물을 도시한다.
도 7a는 면역 효과기 세포에서 VHH 발현을 보여준다.
도 7b는 A549.CD33 세포에 대한 조작된 TCR/수용체 사이토카인 반응을 보여준다.
도 7c는 A549.CD33 세포에 대한 조작된 TCR/수용체 세포독성을 보여준다.
도 8a는 면역 효과기 세포에서 VHH 발현을 보여준다.
도 8b는 A549.MAGEA4.A2 세포에 대한 조작된 TCR/수용체 사이토카인 반응을 보여준다.
도 8c는 A549.MAGEA4.A2 세포에 대한 조작된 TCR/수용체 세포독성을 보여준다.
도 9는 예시적인 조작된 TCR 작제물을 도시한다.
도 10a는 면역 효과기 세포에서 VHH 발현을 보여준다.
도 10b는 A549.CD33 세포에 대한 조작된 TCR/수용체 사이토카인 반응을 보여준다.
도 10c는 A549.CD33 세포에 대한 조작된 TCR/수용체 세포독성을 보여준다.
도 11a는 면역 효과기 세포에서 VHH 발현을 보여준다.
도 11b는 A549.MAGEA4.A2 세포에 대한 조작된 TCR 사이토카인 반응을 보여준다.
도 11c는 A549.MAGEA4.A2 세포에 대한 조작된 TCR/수용체 세포독성을 보여준다.
도 12a는 예시적인 MAGE TCR, CD33 DARIC, CLL1 DARIC, CLL1-CD33 DARIC, 및 조작된 TCR(CLL1-CD33 VHH TCR) 작제물 설계를 보여준다.
도 12b는 TCR에 연결된 2개의 VHH를 갖는 예시적인 조작된 TCR을 도시한다.
도 13a는 면역 효과기 세포에서 CD33 기반 수용체 발현을 보여준다.
도 13b는 A549.CD33 세포에 대한 조작된 TCR/수용체 사이토카인 반응을 보여준다.
도 14a는 면역 효과기 세포에서 CLL1 기반 수용체 발현을 보여준다.
도 14b는 A549.CLL1 세포에 대한 조작된 TCR/수용체 사이토카인 반응을 보여준다.
도 15a는 면역 효과기 세포에서의 TCR 발현을 보여준다.
도 15b는 A549.MAGEA4 세포에 대한 조작된 TCR/수용체 사이토카인 반응을 보여준다.
도 16은 면역 효과기 세포에서의 TCR 및 CAR 발현을 보여준다.
도 17은 A375.NLR(MAGEA4+; BCMA-) 세포에 대한 조작된 TCR 및 CAR 사이토카인 반응을 보여준다.
도 18a는 Toledo 세포에 대한 조작된 TCR 및 CAR IFNg 사이토카인 반응을 보여준다.
도 18b는 Toledo 세포에 대한 조작된 TCR 및 CAR IL-2 사이토카인 반응을 보여준다.
도 19는 조작된 TCR 및 CAR T 세포 단독에 의한 항원 비의존적 IFNg 사이토카인 반응을 보여준다.
도 20a는 예시적인 MAGEA4 TCR, scFv CAR, 및 조작된 TCR(scFv TCR) 작제물 설계를 보여준다.
도 20b는 TCR에 연결된 scFv를 갖는 예시적인 조작된 TCR을 도시한다.
도 21a는 면역 효과기 세포에서의 BCMA-기반 수용체 발현을 보여준다.
도 21b는 HT1080.BCMA, RPMI-8226, 및 Toledo 세포에 대한 조작된 TCR/수용체 IFNg 사이토카인 반응을 보여준다.
도 21c는 HT1080.BCMA, RPMI-8226, 및 Toledo 세포에 대한 조작된 TCR/수용체 IL-2 사이토카인 반응을 보여준다.
도 21d는 HT1080.BCMA, RPMI-8226, 및 Toledo 세포에 대한 조작된 TCR/수용체 TNFα 사이토카인 반응을 보여준다.
도 21e는 HT1080.BCMA 세포에 대한 조작된 TCR/수용체 세포독성을 보여준다.
도 22a는 면역 효과기 세포에서의 TCR 발현을 보여준다.
도 22b는 A375 세포에 대한 조작된 TCR/수용체 IFNg, IL2, 및 TNFα 사이토카인 반응을 보여준다.
도 23은 UTD T 세포, CD33 DARIC T 세포, MAGEA4 TCR T 세포, 또는 VHH-TCR T 세포로 치료한 NGS 전신 종양 모델에서의 HL-60.FP(CD33+ MAGEA4-) 종양 성장을 보여준다.
도 24는 UTD T 세포, CD33 DARIC T 세포, MAGEA4 TCR T 세포, 또는 VHH-TCR T 세포로 치료한 NGS 피하 종양 모델에서의 NCI-H2023(CD33- MAGEA4+) 종양 성장을 보여준다.
도 25a는 면역 효과기 세포에서 TCR/ATOMIC 발현을 보여준다.
도 25b는 RPMI-8226 세포에 대한 조작된 TCR/ATOMIC IFNg 사이토카인 반응을 보여준다.
도 25c는 K562.CD19 세포에 대한 조작된 TCR/ATOMIC IFNg 사이토카인 반응을 보여준다.
서열 식별자에 대한 간단한 설명
서열번호 1-32은 대표적인 표적 항원 결합 도메인에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 33-53은 대표적인 폴리펩티드 링커에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 54-79는 대표적인 TCR 성분(예: TCR 가변 영역)에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 80-88은 대표적인 TCR 불변 도메인에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 89는 대표적인 MAGEA4 표적화 TCR에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 90, 98, 및 99는 대표적인 DARIC 융합 단백질에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 91-97, 100, 및 102는 대표적인 조작된 TCR 작제물/ATOMIC에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 101은 대표적인 항-BCMA CAR에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 103-111은 대표적인 TRA 또는 TRB 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 112는 대표적인 퓨린 절단 부위에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 113-137은 대표적인 폴리펩티드 절단 신호(예: 자가 절단 펩티드)에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
전술한 서열에서, X가 존재하는 경우, 이는 임의의 아미노산 또는 아미노산의 부재를 지칭한다.
A. 개요
본 개시는 일반적으로, 부분적으로, 하나 이상의 추가 결합 도메인(예: 항원 결합 도메인)을 포함하도록 조작된 TCR 기반 작제물, 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다. 임의의 특정 이론에 구속되고자 함이 없이, 본 발명자들은 TCR 결합 도메인(예를 들어, TCR 가변 도메인) 및 하나 이상의 추가 항원 결합 도메인 둘 다를 포함하도록 조작된 TCR이 세포 살해에 놀랍게도 효과적이며, TCR 항원, 비-TCR 항원, 또는 둘 다를 발현하는 세포를 표적화할 수 있음을 예기치 않게 발견하였다.
TCR의 다쇄 아키텍처는 이차 결합제를 TCR 아키텍처 내로 접목시키는 데 상당한 구조적 장애물을 제기하며, 성공은 주로 scFv-CD3 사슬 융합을 공발현하거나 TCR 가변 영역을 항체 기반 결합제로 대체함으로써 달성되었다. 전반적으로, TCR 아키텍처의 복잡성 및 MHC 제한 성질은 높은 수준의 민감도 및/또는 멀티플렉싱을 달성하는 광범위하게 적용 가능한 기술의 개발을 방해하였다. 최소한, 이용 가능한 벡터(예를 들어, 렌티바이러스) 페이로드 공간의 대부분을 소비하지 않는 이러한 중요한 도전에 대한 잠재적인 해결책은 거의 없다.
따라서, 동시 TCR 표적화 및 이차 결합제 표적화를 가능하게 하는 효율적이고 효과적인 조작된/하이브리드 TCR 아키텍처가 본원에 개시된다. 구체적으로, 항원 결합 도메인(예: VHH 또는 scFv)은 TCR 기능을 보존하는 방식으로 TCR 성분, 예를 들어 TCRα, TCRβ, TCRγ, 및/또는 TCRδ 가변 도메인/사슬에 연결된다. 특정 구현예에서, 조작된 TCR은 각각의 표적화 분자(즉, TCR 성분 및 이차 항원 결합 도메인)의 기능이 보존되도록 항원 결합 도메인과 TCR 성분 사이에 링커를 포함한다. 따라서, 본 발명은 세포내 및 세포외 항원의 동시 표적화를 가능하게 한다.
다양한 구현예에서, 조작된/하이브리드 TCR은 하나 이상의 추가 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된/하이브리드 TCR은 2개 이상의 추가 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 추가 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이한 항원을 표적화한다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 항원-결합 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 낙타 Ig, 리마 Ig, 알파카 Ig, Ig NAR, Fab’ 단편, F(ab’)2 단편, 이중 특이적 Fab 이량체(Fab2), 삼중특이적 Fab 삼량체(Fab3), Fv, 단쇄 Fv 단백질(“scFv”), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이황화물로 안정화된 Fv 단백질(“dsFv”), 및 단일 도메인 항체(sdAb, 카멜리드 VHH, 나노바디). 특정 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 하나 이상의 단쇄 가변 단편(scFv) 또는 단일 도메인 항체(sdAb, 예를 들어, 카멜리드 VHH)를 포함한다.
다양한 구현예에서, 링커는 약 2 내지 약 25개 아미노산 길이의 폴리펩티드 링커이다. 일부 구현예에서, 링커는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: GG, GS, SG, SS, GSS, SSG, GSG, SGS, SGG, GGS, GGGS (서열번호 53), (GGGGS)1-5 폴리펩티드 (서열번호 35-39), 유대류 γμTCR로부터의 링커 (예를 들어, LEKT; 서열번호 33), 및 이들의 임의의 조합. 특정 구현예에서, 링커는 서열번호 33-53 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 조작된 TCR은 MHC 복합체에 의해 제시된 표적 폴리펩티드에 결합하는 하나 이상의 TCR 가변 도메인을 포함하는 하나 이상의 TCR 성분을 포함한다.
다양한 구현예에서, 조작된 TCR의 TCR 성분은 TCR 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, TCR 불변 영역은 TCRα, TCRβ, TCRγ, 또는 TCRδ 불변 영역으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, TCR 불변 도메인은 서열번호 80-88 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 기반 표적화만으로 충분한 경우, 비기능성 TCR이 사용될 수 있다.
재조합(즉, 조작된) DNA, 펩티드 및 올리고뉴클레오티드 합성, 면역검정, 조직 배양, 형질전환(예를 들어, 전기천공, 리포펙션), 효소 반응, 정제를 위한 기술 및 관련 기술과 절차는 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 것과 같이 미생물학, 분자 생물학, 생화학, 분자 유전학, 세포 생물학, 바이러스학, 및 면역학에 있어서의 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참조 문헌에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 예를 들어, Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, 2008년 7월 업데이트); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford Univ. Press USA, 1985); Current Protocols in Immunology (편집: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY); Real-Time PCR: Current Technology and Applications, Julie Logan, Kirstin Edwards 및 Nick Saunders 편집, 2009, Caister Academic Press, Norfolk, UK; Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Guthrie and Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press, New York, 1991); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait 편집, 1984); 핵산 The Hybridization (B. Hames & S. Higgins 편집, 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins 편집, 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney 편집, 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Next-Generation Genome Sequencing (Janitz, 2008 Wiley-VCH); PCR Protocols (Methods in Molecular Biology) (Park 편집, 제3판, 2010 인간a Press); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller 및 M. P. Calos 편집, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (편집: Mayer 및 Walker, Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (편집: D. M. Weir 및 CC Blackwell, 1986); Roitt, Essential Immunology, 제6판, (Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988); Current Protocols in Immunology (Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach 및 W. Strober 편집, 1991); Annual Review of Immunology; 및 Advances in Immunology과 같은 저널의 논문을 참조한다.
신규한 TCR을 생성하고 변형시키기 위한 방법 및 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, Linnemann, C. 등, Nat. Med., 19, 1534-1541 (2013); Scheper, W. 등, Nat. Med., 25, 89-94 (2019); Yossef, R. 등, JCI Insight , 3, 122467 (2018); Hu, Z. 등, Blood, 132, 1911-1921 (2018); Li, Y. 등, Nat. Biotechnol, 23, 349-354 (2005); Wagner, E. K. 등 J. Biol. Chem, 294, 5790-5804 (2019); Guo, X.-Z. J. 등, Mol. Ther. 방법 Clin. Dev , 3, 15054 (2016); Azizi, E. 등, Cell , 174, 1293-1308 (2018); Kieke, M. C. 등, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 96, 5651-5656 (1999); Smith, S. N. 등, 1319, 95-141 (Springer, 2015); Tsuji, T. 등, Cancer Immunol. Res, 6, 594-604 (2018); 및 Spindler, M.J. 등의 Nat Biotechnol , 38, 609-619 (2020)에 기술되어 있다.
B. 정의
본 개시를 보다 상세히 제시하기에 앞서, 본원에서 사용될 특정 용어의 정의를 제공하는 것이 본 개시를 이해하는 데 도움이 될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당 기술분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 특정 실시예의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 조성물, 방법 및 물질의 바람직한 실시예가 본원에 기술된다. 본 개시의 목적을 위해, 다음의 용어가 아래에 정의된다.
단수 표현(관사 “a”, “an”, 및 “the”)은 단수 표현된 문법적 객체의 하나 또는 둘 이상(즉, 적어도 하나, 또는 하나 이상)을 지칭하도록 본원에서 사용된다. 예를 들어, “일 요소”는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
대안예(예를 들어, “또는”)의 사용은 대안예 중 하나, 둘 모두, 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 “및/또는”은 대안예 중 어느 하나 또는 둘 다를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 사용되는 용어 “약” 또는 “대략”은 기준 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량, 또는 길이에 대해 많게는 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 만큼 달라지는 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량, 또는 길이를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 “약” 또는 “대략”은 기준 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량, 또는 길이에 대해 ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2%, 또는 ± 1% 범위인 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량, 또는 길이를 지칭한다.
일 구현예에서, 범위, 예를 들어, 1 내지 5, 약 1 내지 5, 약 1 내지 약 5는 그 범위에 포함되는 각각의 수치 값을 지칭한다. 예를 들어, 하나의 비제한적이고 단지 예시적인 예에서, 범위 “1 내지 5”는 다음의 표현과 동등하다: 1, 2, 3, 4, 5; 또는 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 또는 5.0; 또는 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 또는 5.0.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “약” 또는 “대략”은 기준 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량, 또는 길이와 비교해 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상인 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량, 또는 길이를 지칭한다. 일 구현예에서, “실질적으로 동일한(substantially the same)”은 기준 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량, 또는 길이와 대략 동일한 효과, 예를 들어 생리학적 효과를 생성하는 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량, 또는 길이를 지칭한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 “포함하다”, “포함한다”, 및 “포함하는”은 언급된 단계나 요소 또는 단계나 요소의 군을 포함하는 것을 의미하지만 임의의 다른 단계나 요소 또는 단계나 요소의 군을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다. “~로 이루어지는”은 “~로 이루어지는”이라는 문구와 연결되는 것을 포함하고, 이에 한정됨을 의미한다. 따라서, 문구 “~로 이루어지는”은 열거된 요소가 요구되거나 필수적이며, 다른 요소가 존재할 수 없음을 나타낸다. “~로 본질적으로 이루어지는”은, 해당 문구와 연결되어 열거된 임의의 요소를 포함하고, 열거된 요소에 대해 본 개시에서 명시된 활성 또는 작용을 방해하거나 이에 기여하지 않는 다른 요소로 제한됨을 의미한다. 따라서, 문구 “~로 본질적으로 이루어지는”은 열거된 요소가 요구되거나 필수적이지만, 열거된 요소의 활성 또는 작용에 중대하게 영향을 미치는 다른 요소는 존재하지 않음을 나타낸다.
본 명세서 전반에 걸쳐 “일 실시예”, “하나의 실시예”, “특정 실시예”, “연관된 실시예”, “소정의 실시예”, “추가의 실시예”, 또는 “추가 실시예” 또는 이들의 조합은 해당 실시예와 관련하여 기술된 특정 특징, 구조, 또는 특성이 적어도 하나의 실시예에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 위치에서 나타나는 전술한 문구 모두가 본질적으로 동일한 실시예를 지칭하는 것은 아니다. 또한, 특정 특징, 구조, 또는 특성은 하나 이상의 실시예에서 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다. 또한, 일 실시예에서 특징을 확실하게 언급하는 것(positive recitation)이 특정 구현예에서 해당 특징을 배제하기 위한 기초의 역할을 한다는 것도 이해가 될 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “TCR 복합체”는 CD3과 TCR의 연관성에 의해 형성된 복합체를 지칭한다. 예를 들어, TCR 복합체는 CD3γ 사슬, CD3δ 사슬, 2개의 CD3ε 사슬, CD3ζ의 동종이량체, TCRα 사슬, 및 TCRβ 사슬로 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 복합체는 CD3γ 사슬, CD3δ 사슬, 2개의 CD3ε 사슬, CD3ζ의 동종이량체, TCRγ 사슬, 및 TCRδ 사슬로 구성될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “TCR 복합체의 성분”은 TCR 사슬(즉, TCRα, TCRβ, TCRγ 또는 TCRδ), CD3 사슬(즉, CD3γ, CD3δ, CD3ε 또는 CD3ζ), 또는 2개 이상의 TCR 사슬 또는 CD3 사슬에 의해 생성된 복합체(예를 들어, TCRα 및 TCRβ의 복합체, TCRγ 및 TCRδ의 복합체, CD3ε 및 CD3δ의 복합체, CD3γ 및 CD3ε의 복합체, 또는 TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, 및 2개의 CD3ε 사슬의 서브-TCR 복합체)를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “결합 도메인”, “세포외 도메인”, “항원 결합 도메인”, “세포외 결합 도메인”, “세포외 항원 결합 도메인”, “항원 특이적 결합 도메인”, “세포외 항원 특이적 결합 도메인”, “결합제” 및 “항원 결합제”는 상호 교환적으로 사용되며, 관심 표적 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 가진 폴리펩티드를 제공한다. 결합 도메인은 천연, 합성, 반합성, 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다.
용어 “항체”는 항원 결정인자를 함유하는 핵산, 펩티드, 지질, 또는 다당류와 같은 항원, 예컨대 면역 세포에 의해 인식되는 항원의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하여 이에 결합하고, 적어도 하나의 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 가변 영역 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드인 결합제를 지칭한다.
용어 “항체”는 본원의 다른 곳에서 추가로 기술되는 바와 같이, 임의의 자연 발생, 재조합, 변형 또는 조작된 면역글로불린 또는 면역글로불린 유사 구조 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이의 부분, 또는 이의 유도체를 포함한다. 따라서, 이 용어는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭하며, 예를 들어, 키메라, 인간화, 완전한 인간 및 이중특이적 항체를 포함한다. 온전한 항체는 대체적으로 적어도 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 포함할 것이지만, 일부 경우, 중쇄만을 포함할 수 있는 카멜리드에서 자연적으로 발생하는 항체와 같은 보다 적은 수의 사슬을 포함할 수 있다. 항체는 단일 공급원으로부터 단독으로 유래될 수 있거나, “키메라”일 수 있다. 즉, 항체의 상이한 부분은 2개의 상이한 항체로부터 유래될 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 부분은, 하이브리도마에서, 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다.
용어 “항원 결합 단편” 또는 “항원 결합 부분”은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항원 결합 단편은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연 발생, 효소적으로 수득 가능한, 합성, 또는 유전자 조작된 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 항체의 항원 결합 부분은, 예를 들어, 항체 가변 및 선택적으로 불변 도메인을 암호화하는 DNA의 조작 및 발현에 관련하는 단백질분해성 소화 또는 재조합 유전자 조작 기술과 같은 임의의 적절한 표준 기술을 사용하여 전체 항체 분자로부터 유래될 수 있다.
“단쇄 Fv” 또는 “scFv” 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기에서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재하며 어느 한 방향(예를 들어, VL-VH 또는 VH-VL)으로 존재한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, scFv 가변 경쇄는 가변 중쇄의 c-말단에 위치된다. 일부 구현예에서, scFv 가변 중쇄는 가변 경쇄의 c-말단에 위치된다. 대체적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 예를 들어, Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315.
본원에 사용된 바와 같이 “VHH”, “VHH 항체” 또는 “VHH 도메인”은 중쇄 항체의 가변 영역의 가장 작은 알려진 항원 결합 단위를 함유하는 항체 단편을 지칭한다(Koch-Nolte 등의 문헌[FASEB J., 21: 3490-3498 (2007)]).
“단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편”은 자연 환경의 성분으로부터 식별되고 분리되고/되거나 회수된 항체 또는 항원 결합 단편을 지칭한다.
용어 “항원(Ag)”, “표적 항원” 및 “폴리펩티드 항원”은 상호교환적으로 사용되며 TCR 또는 항체 또는 단편이 특이적으로 결합하는 결합 영역(들) 내에 항원 결정기를 포함하는 임의의 분자를 광범위하게 포함한다. 특정 구현예에서, “항원(Ag)”는 동물에게 주입되거나 흡수되는 조성물(예를 들어, 암-특이적 단백질을 포함하는 조성물)을 포함하여, 동물에서 항체의 생성 또는 T 세포 반응을 자극할 수 있는 화합물, 조성물, 또는 물질을 지칭한다. 항원은, 개시된 항원과 같은 이종 항원에 의해 유도된 것들을 포함하여 특이적 체액성 또는 세포성 면역의 산물과 반응한다.
항원은 단일 단위 분자(예컨대, 단백질 단량체 또는 단편) 또는 다수의 성분으로 이루어진 복합체일 수 있다. 항원은 에피토프, 예를 들어, 분자 또는 분자의 일부, 또는 분자의 복합체 또는 분자의 일부를 제공하며, 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 및/또는 TCR를 포함함)과 같은 선택적 결합제에 의해 결합될 수 있다. 따라서, 선택적 결합제는 복합체 내의 둘 이상의 성분에 의해 형성되는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 해당 항원에 결합할 수 있는 항체를 생성하기 위해 동물에서 사용될 수 있다. 항원은 상이한 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 용어 “항원(Ag)”, “표적 항원” 및 “폴리펩티드 항원”은, 바람직한 TCR 관련 구현예에서 상호 교환적으로 사용되며, 집합적으로 약 7개 아미노산 내지 약 15개 아미노산 길이 범위의 항원성 단백질, 예를 들어 종양 연관 항원(TAA) 또는 종양 특이적 항원(TSA)의 자연적으로 처리되거나 합성적으로 생성된 부분을 지칭하고, 이는 MHC(예를 들어, HLA) 분자와 복합체를 형성하여 표적 항원:MHC(예를 들어, HLA) 복합체를 형성할 수 있다.
“표적 항원” 또는 “관심 표적 항원”은 본원에서 고려되는 결합 도메인이 결합하도록 설계된 표적 세포의 세포 표면 상에서 발현되는 분자를 지칭한다. 특정 구현예에서, 표적 항원은 암 세포의 표면 상에서 발현되는 폴리펩티드의 에피토프이다. “에피토프” 또는 “항원 결정인자”는 결합제가 결합하는 항원의 영역을 지칭한다. 에피토프는 단백질의 3차 접힘에 의해 병치된 인접 아미노산 또는 비인접 아미노산 둘 모두로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 통상적으로 변성 용매에 노출시 유지되는 반면, 3차 접힘에 의해 형성된 에피토프는 통상적으로 변성 용매로 처리시 손실된다. 에피토프는 일반적으로 적어도 3개, 보다 일반적으로 적어도 5개, 약 9개, 또는 약 8 내지 10개의 아미노산을 고유의 공간 형태로 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 “선택적 결합” 또는 “선택적으로 결합” 또는 “선택적으로 결합하는” 또는 “선택적으로 표적화”, “특이적 결합 친화도” 또는 “특이적 결합” 또는 “특이적으로 결합” 또는 “특이적으로 표적화”는 복수의 표적 외 분자의 존재 하에 하나의 분자가 표적 분자에 우선적으로 결합하는 것(표적 상에 결합)을 기술한다. 특정 구현예에서, 용어는 배경 결합보다 더 큰 결합 친화도로 항원에 대한 TCR, 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 결합을 지칭한다. 결합 도메인이, 예를 들어 약 105 M-1 이상의 친화도 또는 Ka(즉, 특정 결합 상호작용의 평형 결합 상수; 단위는 1/M임)로 항원에 결합하거나 항원과 결합하는 경우, 결합 도메인은 항원에 “특이적으로 결합”한다. 특정 구현예에서, 결합 도메인(또는 이의 융합 단백질)은 약 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1, 또는 1013 M-1이상의 Ka로 표적에 결합한다. “고 친화도(high affinity)” 결합 도메인(또는 이의 단쇄 융합 단백질)은 Ka가 적어도 107 M 1, 적어도 108 M-1, 적어도 109 M-1, 적어도 1010 M-1, 적어도 1011 M-1, 적어도 1012 M-1, 적어도 1013 M-1, 또는 그 이상인 결합 도메인들을 지칭한다.
대안적으로, 친화도는 특정 결합 상호작용의 평형 해리 상수(Kd)로서 정의될 수 있으며, 단위는 M이다(예를 들어, 10-5 M 내지 10-13 M, 또는 그 미만). 본 개시에 따른 결합 도메인 폴리펩티드 및 CAR 단백질의 친화도는 종래의 기술, 예를 들어 경쟁 ELISA(효소 결합 면역흡착 검정)에 의해, 또는 결합 연관 또는 표지된 리간드를 사용하는 변위 검정에 의하거나, Biacore T100(Biacore, Inc., Piscataway, NJ로부터 입수 가능함)과 같은 표면-플라즈몬 공명 장치, 또는 EPIC 시스템(Corning으로부터 입수 가능함)이나 EnSpire(Perkin Elmer로부터 입수 가능함)와 같은 광학 바이오센서 기술을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다(예를 들어, Scatchard 등 (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660; 및 미국 특허 제5,283,173호; 제5,468,614호, 또는 그의 등가물 참조).
일 구현예에서, 특이적 결합의 친화도는 배경 결합보다 약 2배 더 크거나, 배경 결합보다 약 5배 더 크거나, 배경 결합보다 약 10배 더 크거나, 배경 결합보다 약 20배 더 크거나, 배경 결합보다 약 50배 더 크거나, 배경 결합보다 약 100배 더 크거나, 배경 결합보다 약 1000배 더 크다.
특정 구현예에서, 조작된/하이브리드 TCR은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 조작된 TCR의 맥락에서, “항체”는 면역 세포에 의해 인식되는 것과 같은 항원 결정인자를 함유하는 펩티드, 지질, 다당류, 또는 핵산과 같은 항원의 에피토프를 특이적으로 인식하고 이에 결합하며, 적어도 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드인 결합제를 지칭한다.
당업자에 의해 이해되고 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같이, 완전한 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 각각의 중쇄는 가변 영역 및 제1, 제2 및 제3 불변 영역으로 구성되는 반면, 각각의 경쇄는 가변 영역 및 불변 영역으로 구성된다.
경쇄 및 중쇄 가변 영역은 “상보성 결정 영역” 또는 “CDR”로도 지칭되는 3개의 초가변 영역에 의해 차단된 “프레임워크” 영역을 포함한다. CDR은 종래의 방법, 예컨대 Kabat 등(Wu, TT 및 Kabat, E. A., J Exp Med. 132(2):211-50, (1970); Borden, P. 및 Kabat E. A., PNAS, 84: 2440-2443 (1987); (Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991 참조, 이는 본원에 참조로서 포함됨)에 따른 서열, 또는 Chothia 등(Chothia, C. 및 Lesk, A.M., J Mol. Biol., 196(4): 901-917 (1987), Chothia, C. 등, Nature, 342: 877 - 883 (1989))에 따른 구조에 의해 정의되거나 식별된다.
Kabat CDR과 중첩되는 CDR을 정의하는 다른 구분은 Padlan (1995) FASEB J. 9: 133-139 및 MacCallum (1996) J. Mol. Biol. 262(5): 732-45에 기술되어 있다. 또 다른 CDR 구분 정의는 본원에서의 시스템 중 하나를 엄격하게 따르지 않을 수 있지만, 그럼에도 불구하고, 이들 정의는, 특정 잔기 또는 잔기의 기 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 상당한 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험 발견을 고려하여 단축되거나 연장될 수 있으며, Kabat CDR과 중첩될 것이다. 예를 들어, 항체의 CDR은 AbM 넘버링 체계에 따라 결정될 수 있으며, 이는 Kabat CDR과 Chothia 구조 루프 간의 타협을 나타내는 AbM 초가변 영역을 지칭하며, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어(Oxford Molecular Group, Inc.)에 의해 사용된다.
또한, 항체의 CDR은 Lefranc M-P, (1999) The Immunologist 7: 132-136 및 Lefranc M-P 외, (1999) Nucleic Acids Res 27: 209-212에 기술된 바와 같은 IMGT 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다.
또 다른 CDR 결정 방법이 MacCallum R M 등, (1996) J Mol Biol 262: 732-745에 개시되어 있다. 또한, 예를 들어, Martin A. “Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains,” in Antibody Engineering, Kontermann and Dubel 편집, Chapter 31, pp. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001)을 참조한다. 본원에 기술되는 CDR 정의 중 어느 하나에 기초하여 CDR을 결정하기 위해, 당업자에게 공지된 독점적이고 공개적으로 이용 가능한 프로그램, 예를 들어, abYsis(abysis.org/abysis/) 및 IMGT/V-QUEST(imgt.org/IMGT_vquest)가 사용될 수 있다.
경쇄 CDR을 예측하기 위한 규칙의 예시적인 실시예는 다음을 포함한다: 대략 24개의 잔기에서 시작하고, Cys가 이에 선행하고, 대략 10 내지 17개의 잔기이고, Trp(일반적으로 Trp-Tyr-Gln이지만, Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln, Trp-Tyr-Leu)이 이어지는 CDRL1; CDRL1의 종료 후 약 16개의 잔기에서 시작하고, 대체적으로 Ile-Tyr, 및 Val-Tyr, Ile-Lys, Ile-Phe가 이에 선행하고, 7개의 잔기인 CDRL2; 및 CDRL2의 종료 후 약 33개의 잔기에서 시작하고, Cys가 이에 선행하고, 7개 내지 11개의 잔기이고, Phe-Gly-XXX-Gly(XXX는 임의의 아미노산임)가 이어지는 CDRL3.
중쇄 CDR을 예측하기 위한 규칙의 예시적인 실시예는 다음을 포함한다: 대략 26개의 잔기에서 시작하고, Cys-XXX-XXX-XXX가 이에 선행하고, 10개 내지 12개의 잔기이고, Trp(일반적으로 Trp-Val이지만, Trp-Ile, Trp-Ala)이 이어지는 CDRH1; CDRH1의 종료 후 약 15개의 잔기에서 시작하며, 대체적으로 Leu-Glu-Trp-Ile-Gly(서열번호 138) 또는 다수의 변이가 이에 선행하고, 16개 내지 19개의 잔기이고, Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala가 이어지고, AbM 정의는 이에 선행하는 7개의 잔기에서 종료되는 CDRH2; CDRH2의 종료 후 약 33개의 잔기에서 시작하고, Cys-XXX-XXX(일반적으로 Cys-Ala-Arg)가 이에 선행하고, 3개 내지 25개의 잔기이고, Trp-Gly-XXX-Gly가 이어지는 CDRH3.
“VH” 또는 “VH”에 대한 언급은 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 지칭하며, 항체, Fv, scFv, dsFv, Fab, 또는 본원에 개시된 것과 같은 다른 항체 단편의 중쇄 가변 영역을 포함한다. “VL” 또는 “VL”에 대한 언급은 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 지칭하며, 항체, Fv, scFv, dsFv, Fab, 또는 본원에 개시된 것과 같은 다른 항체 단편의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
추가의 정의는 본 개시 전체에 걸쳐 제시되어 있다.
C. 조작된 T세포 수용체
T 세포 수용체(TCR)는 주 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 의해 제시될 때 표적 항원의 펩티드 단편을 인식한다. 상이한 세포 구획으로부터 세포 표면으로 펩티드를 전달하는 두 가지 상이한 부류의 MHC 분자, 즉 MHC I 및 MHC II가 있다. TCR을 항원 및 MHC와 결합시키면 관련 효소, 보조수용체, 및 특수 부속 분자에 의해 매개되는 일련의 생화학적 이벤트를 통해 면역 효과기 세포가 활성화된다.
본원에서 고려되는 TCR은 TCR 알파(TCRα) 폴리펩티드/ 사슬 및 TCR 베타(TCRβ) 폴리펩티드/ 사슬을 포함하는 이종이량체 복합체; 또는 TCR 감마(TCRγ) 폴리펩티드/사슬 및 TCR 델타(TCRδ) 폴리펩티드/사슬.
인간 TCRα 유전자좌는 염색체 14(14q11.2) 상에 위치한다. 성숙한 TCRα 사슬은 가변(V) 분절 및 결합(J) 분절의 재조합으로부터 유래된 가변 도메인, 및 불변(C) 도메인을 포함한다. 용어 “가변 TCRα 영역” 또는 “TCRα 가변 영역” 또는 “가변 TCRα 사슬” 또는 “TCRα 가변 사슬” 또는 “가변 TCRα 도메인” 또는 “TCRα 가변 도메인”은 TCRα 사슬의 가변 영역을 지칭한다.
인간 TCRβ 유전자좌는 염색체 7(7q34) 상에 위치한다. 성숙한 TCRβ 사슬은 가변(V) 분절, 다양성(D) 분절, 및 결합(J) 분절의 재조합으로부터 유래된 가변 도메인, 및 2개의 불변(C) 도메인 중 하나를 포함한다. 용어 “가변 TCRβ 영역” 또는 “TCRβ 가변 영역” 또는 “가변 TCRβ 사슬” 또는 “TCRβ 가변 사슬” 또는 “가변 TCRβ 도메인” 또는 “TCRβ 가변 도메인”은 TCRβ 사슬의 가변 영역을 지칭한다.
인간 TCRγ 유전자좌는 염색체 7(7p14.1) 상에 위치한다. 성숙한 TCRγ 사슬은 가변(V) 분절 및 결합(J) 분절의 재조합으로부터 유래된 가변 도메인, 및 불변(C) 도메인을 포함한다. 용어 “가변 TCRγ 영역” 또는 “TCRγ 가변 영역” 또는 “가변 TCRγ 사슬” 또는 “TCRγ 가변 사슬” 또는 “가변 TCRγ 도메인” 또는 “TCRγ 가변 도메인”은 TCRγ 사슬의 가변 영역을 지칭한다.
인간 TCRδ 유전자좌는 염색체 14(14q11.2) 상에 위치한다. 성숙한 TCRδ 사슬은 가변(V) 분절, 다양성(D) 분절, 및 결합(J) 분절의 재조합으로부터 유래된 가변 도메인, 및 2개의 불변(C) 도메인 중 하나를 포함한다. 용어 “가변 TCRδ 영역” 또는 “TCRδ 가변 영역” 또는 “가변 TCRδ 사슬” 또는 “TCRδ 가변 사슬” 또는 “가변 TCRδ 도메인” 또는 “TCRδ 가변 도메인”은 TCRδ 사슬의 가변 영역을 지칭한다.
TCRα, TCRβ, TCRγ, 및 TCRδ 사슬 모두의 재배열된 V(D)J 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로 알려진 3개의 초가변 영역을 각각 함유한다. 비록 알파 사슬의 CDR1이 항원성 펩티드의 N-말단 부분과 상호작용하고, 베타 사슬의 CDR1은 펩티드의 C-말단 부분과 상호작용하는 것으로 밝혀졌지만, CDR3은 처리된 항원을 인식하는 주요 CDR이다. CDR2는 MHC 분자를 인식하는 것으로 여겨진다. 프레임워크 영역(FR)은 CDR 사이에 위치한다. 이들 영역은 TCR 가변 영역의 구조를 제공한다.
TCR 사슬의 불변 도메인 또는 불변 영역은 또한 TCR 구조에 기여하며, 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 짧은 세포질 도메인으로 이루어진다. TCR 구조는 TCRα 또는 TCRγ 사슬, TCRβ 사슬 또는 TCRδ 사슬 및 부속 분자 CD3γ, CD3δ, CD3ε, 및 CD3η를 포함하는 TCR 복합체의 형성을 가능하게 한다. T 세포 복합체로부터의 신호는 특이적 보조수용체에 의한 MHC 분자의 동시 결합에 의해 향상된다. CD4는 헬퍼 T 세포 상에서 발현된 MHC II 분자에 대한 공수용체이고, CD8은 세포독성 T 세포 상에서 발현된 MHC I 분자에 대한 공수용체이다. 보조-수용체는 항원에 대한 TCR의 특이성을 보장할 뿐만 아니라, 항원 제시 세포와 T 세포 간의 연장된 결합을 가능하게 하고, 활성화된 T 림프구의 신호 전달에 관여하는 세포 내에 필수 분자(예를 들어, LCK)를 동원한다.
본원에서 고려되는 조작된 TCR은 면역 효과기 세포를 표적 세포로 방향 전환시키는 데 사용될 수 있다. 또한, 본원에서 고려되는 TCR은 기능적 항원 결합 도메인을 포함하도록 조작된다. 특정 구현예에서, 조작된 TCR은 기능적 TCR 결합 도메인(예: 기능적 TCR 가변 영역) 및 TCR 폴리펩티드/사슬 중 하나 또는 둘 다에 연결된 하나 이상의 별도의 항원 결합 도메인 둘 다를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 조작된 TCR 가변 도메인 및 추가 항원 결합 도메인은 동일한 항원 또는 2개의 상이한 항원, 또는 그 이상에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 TCR은 MHC 분자 상에 제시된 세포내 항원 및 제2 항원(예를 들어, 수용체, 리간드, 또는 암 항원) 둘 모두에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 TCR은 3개의 상이한 항원에 결합할 수 있다.
본원에서 고려되는 TCR은 때때로 조작된 TCR, 하이브리드 TCR, 이중 표적화 TCR, 다중 표적화 TCR, 또는 ATOMIC(Antibody Tethered Orthogonal Multiplexing Compatible)로서 지칭되고, 하나 이상의 링커(“B” 성분)가 있거나 없는 하나 이상의 항원 결합 도메인 성분(“A” 성분) 및 하나 이상의 TCR 성분(“C” 성분)을 포함하며, 이들 각각은 아래의 하위 섹션에서 더 상세히 기술된다.
실시예의 데이터는 본원에 개시된 조작된 TCR 및 융합 단백질이 임의의 항원(들)에 특이적인 항원 결합 도메인(“A” 성분) 및/또는 TCR 성분(“C” 성분)을 포함할 수 있음을 입증한다. 당업자는, 항원 특이성 또는 임의의 특정 서열, 예를 들어 이의 가변 도메인 또는 CDR 서열에 관계없이, 항원 결합 도메인 성분 및 TCR 성분이 본원에 개시된 조작된 TCR의 특성을 충족하는 조작된 TCR 또는 융합 단백질을 생산하도록 연결될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다.
이는, 본 발명자가 하나 이상의 TCR 결합 도메인(“C” 성분)에 연결된 항원 결합 도메인(“A” 성분)을 포함하는, 개시된 조작된 TCR 및 융합 단백질이, 두 성분의 기능을 보존하는 방식으로, 동시 TCR 표적화 및 이차 항원 결합제 표적화를 가능하게 하는 효율적이고 효과적인 아키텍처를 갖는다는 것을 예기치 않게 발견하였기 때문이다. 성분의 항원 특이성뿐만 아니라 성분의 서열, 예를 들어 가변 도메인 또는 CDR 서열은 본원에 제공된 예시적인 일반 조작된 TCR 식을 사용하여 당업자에 의해 변경될 수 있다. 따라서 본 개시 및 실시예는 (i) 상이한 항원에 대한 항원 결합 도메인 성분 및 TCR 성분을 포함하는 다수의 조작된 TCR 및 융합 단백질을 제공하지만, 또한 (ii) 동일한 항원에 대해 유도된 상이한 항원 결합 도메인, 당업자는 본원에 개시되고 청구된 조작된 TCR 및 융합 단백질이 항원 특이성 또는 서열(예를 들어, 가변 영역 서열 또는 CDR 서열)에 의해 제한되어서는 안 된다는 것을 이해할 것이다.
1. 항원 결합 도메인 성분("A" 성분)
조작된 TCR, 및 관련 융합 폴리펩티드가 본원에 제공되며, 상기 융합 폴리펩티드는 다음을 포함한다: (a) TCRα 또는 TCRγ 가변 도메인을 포함하는 TCRα 또는 TCRγ 폴리펩티드; (b) TCRβ 또는 TCRδ 가변 도메인을 포함하는 TCRβ 또는 TCRδ 폴리펩티드; 및 (c) TCRα, TCRβ, TCRγ 및/또는 TCRδ 가변 도메인에 연결된 하나 이상의 항원 결합 도메인(“A” 성분).
다양한 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인(본원에서 결합제 또는 항원 결합제로도 지칭됨)은 하나 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 TCRα, TCRβ, TCRγ, 및/또는 TCRδ 가변 도메인 중 임의의 하나 이상에 연결된 하나 이상의 제1 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 TCRα 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 TCRβ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 TCRγ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 TCRδ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 (i) TCRα 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인, 및 (ii) TCRβ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 (i) TCRγ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인, 및 (ii) TCRδ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이하고/하거나, 제1 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이한 표적 항원에 결합한다.
다양한 구현예에서, 제1 항원 결합 도메인은 가변 도메인의 N-말단에 연결된다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 제1 항원 결합 도메인에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 항원 결합 도메인은 제1 항원 결합 도메인의 N-말단이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 TCRα 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 TCRβ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 TCRγ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 TCRδ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함한다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 (i) TCRα 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인에 연결된 제2 항원 결합 도메인, 및 (ii) TCRβ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함한다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 (i) TCRγ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인에 연결된 제2 항원 결합 도메인, 및 (ii) TCRδ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함한다.
다양한 구현예에서, 제2 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이하고/하거나, 제2 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이한 표적 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 제2 항원 결합 도메인은 동일하다. 일부 구현예에서, 제2 항원 결합 도메인은 상이하다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인(예를 들어, 제1 및/또는 제2 항원 결합 도메인)은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 항원에 결합한다: 알파 엽산 수용체(FRα), αv β6 인테그린, ADGRE2, BACE2, B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3 (CD276), B7-H4, B7-H6, CA19.9, 탄산 무수효소 IX(CAIX), CCR1, CD7, CD16, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a , CD79b , CD123, CD133, CD138, CD171, CD244, 암배아 항원(CEA), C형 렉틴-유사 분자-1(CLL-1), CD2 서브세트 1(CS-1), CLDN6, cMET, 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 4(CSPG4), CLDN18.2, 피부 T 세포 림프종-연관 항원 1(CTAGE1), DLL3, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII), EGFR806, 상피 당단백질 2(EGP2), 상피 당단백질 40(EGP40), EPHB2, ERBB4, 상피 세포 부착 분자(EPCAM), 에프린 A형 수용체 2(EPHA2), 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), Fc 수용체 유사 5(FCRL5), 태아 아세틸콜린에스테라아제 수용체(AchR), FLT3, FN, FN-EDB, FR베타, 강글리오시드 G2(GD2), 강글리오시드 G3(GD3), Glypican-3(GPC3), ErbB2(HER2)를 포함하는 EGFR 계열, HER2p95, EGFRv3, IL-10Rα, IL-13Rα 2, 카파, 암/고환 항원 2(LAGE-1A), K-Ras, K-Ras G12C , K-Ras G12D , K-Ras G12V , 람다, 루이스-Y(LeY), L1 세포 부착 분자(L1-CAM), LILRB2, LY6G6GD, T 세포 1(MelanA 또는 MART1)에 의해 인식되는 흑색종 항원, 메소텔린(MSLN), MMP10, MUC1, MUC16, MHC 클래스 I 사슬 관련 단백질 A(MICA), MHC 클래스 I 사슬 관련 단백질 B(MICB), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선-특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제-유사 희귀 수용체 1(ROR1), 윤활막 육종, X 중단점 2(SSX2), 서바이빈, 종양 연관 당단백질 72(TAG72), 막관통 활성제 및 CAML 상호작용기(TACI), 종양 내피 마커 1(TEM1/CD248), 종양 내피 마커 7-관련(TEM7R), TIM3, 영양아 당단백질(TPBG), UL16-결합 단백질(ULBP) 1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, 및 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2).
특정 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인(예를 들어, 제1 및/또는 제2 항원 결합 도메인)은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드의 항원성 부분에 결합한다: α-태아단백질(AFP), ASCL2, B 흑색종 항원(BAGE) 패밀리 구성원, 각인 부위 조절제의 형제(BORIS), 암-고환 항원, 암-고환 항원 83(CT-83), 탄산 탈수효소 IX(CA1X), 암배아 항원(CEA), 거대세포바이러스(CMV) 항원, 세포독성 T 세포(CTL)-인식된 흑색종 항원(CAMEL), 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스(EBV) 항원, EPHB2, G 항원 1(GAGE-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, 당단백질 100(GP100), B형 간염 바이러스(HBV) 항원, C형 간염 바이러스(HCV) 비구조 단백질 3(NS3), 인간 유두종바이러스(HPV)-E6, HPV-E7, 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT), IGF2BP3/A3, IGF2BP1, K-Ras, K-Ras G12C, K-Ras G12D, K-Ras G12V, 잠재 막 단백질 2(LMP2), LY6G6D , 흑색종 항원 패밀리 A, 1(MAGE-A1), MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4 MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원(MART-1), 메소텔린(MSLN), 뮤신 1(MUC1), 뮤신 16(MUC16), 뉴욕 식도 편평 세포 암종-1(NYESO-1), P53,P 항원(PAGE) 패밀리 구성원, PAP, PIK3CA, PIK3CA H1047R, 태반-특이적 항원 1(PLAC1), 흑색종에서 우선적으로 발현되는 항원(PRAME), 전립선 특이적 항원 PSA, 서바이빈, 활막 육종 X 1(SSX1), 활막 육종 X 2(SSX2), 활막 육종 X 3(SSX3), 활막 육종 X 4(SSX4), 활막 육종 X 5(SSX5), 활막 육종 X 8(SSX8), 갑상선글로불린, TP53 R175H, 티로시나아제, 티로시나아제 관련 단백질(TRP)1, TRP2, UBD, 빌름스(Wilms) 종양 단백질(WT-1), Wnt10A, X 항원 패밀리 구성원 1(XAGE1), 및 X 항원 패밀리 구성원 2(XAGE2).
다양한 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 CD33, CLL1, CD19, CD20, CD22, CD79A, CD79B, 또는 BCMA에 결합한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 CD19, CD20, CD22, CD33, CD79A, CD79B, B7H3, Muc16, Her2, EGFR, FN-EDB, CLDN18.2, DLL3, FLT3, CLL1, CD123, 또는 BCMA에 결합한다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 서열번호 1 내지 32 중 어느 하나에 제시된 것과 같은 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 서열번호 1 내지 32 중 어느 하나에 제시된 것과 같은 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 서열번호 1 내지 32 중 어느 하나에 제시된 것과 같은 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 서열번호 1-32 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 서열번호 1-32 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 서열번호 1-32 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 98%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 서열번호 1-32 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 서열번호 1-32 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다: 낙타 Ig, 리마 Ig, 알파카 Ig, Ig NAR, Fab’ 단편, F(ab’)2 단편, 이중 특이적 Fab 이량체(Fab2), 삼중특이적 Fab 삼량체(Fab3), Fv, 단쇄 Fv 단백질(“scFv”), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이황화물로 안정화된 Fv 단백질(“dsFv”), 및 단일 도메인 항체(sdAb, 카멜리드 VHH, 나노바디).
다양한 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 하나 이상의 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 하나 이상의 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함한다. 일부 구현예에서, sdAb는 카멜리드 VHH, 나노바디, 또는 중쇄로만 구성된 항체(HcAb)이다. 특정 구현예에서, sdAb는 카멜리드 VHH이다.
다양한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 또는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편을 수득하기 위해 다수의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체는 재조합 DNA 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 단클론 항체는 또한 공지된 방법에 따라 하이브리도마의 생성에 의해 생산될 수 있다(예를 들어, Kohler and Milstein (1975) Nature , 256: 495-499 참조). 그런 다음, 이러한 방식으로 형성된 하이브리도마는 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 및 표면 플라스몬 공명(예: OCTET 또는 BIACORE) 분석과 같은 표준 방법을 사용하여 스크리닝되어, 특정 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하나 이상의 하이브리도마를 식별한다. 명시된 항원의 임의의 형태, 예를 들어 재조합 항원, 자연 발생 형태, 임의의 변이체 또는 이의 단편뿐만 아니라 이의 항원 펩티드(예를 들어, 선형 에피토프로서 본원에 기술된 에피토프 중 어느 하나 또는 형태 에피토프로서 스캐폴드 내)가 면역원으로서 사용될 수 있다. 항체를 제조하는 하나의 예시적인 방법은 항체 또는 이의 단편(예를 들어, scFv), 예를 들어 파지 또는 리보솜 디스플레이 라이브러리를 발현하는 단백질 발현 라이브러리를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 파지 디스플레이는, 예를 들어, Ladner 등의 미국 특허 No. 5,223,409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; Clackson 등. (1991 ) Nature , 352: 624-628; Marks 등의 . (1991) J. 몰. Biol ., 222: 581-597; WO 92/18619; WO 91/17271; WO92/20791; WO92/15679; WO93/01288; WO92/01047; WO92/09690; 및 WO90/02809 참조.
일부 구현예에서, 단클론 항체는 비인간 동물로부터 수득된 다음, 적절한 재조합 DNA 기술을 사용하여 변형(예: 키메라)된다. 키메라 항체를 제조하기 위한 다양한 접근법이 기술되었다. 예를 들어, Morrison 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851, 1985; Takeda 등, Nature 314:452, 1985; Cabilly 등, 미국 특허 No. 4,816,567; Boss 등, 미국 특허 No. 4,816,397; Tanaguchi 등, 유럽 특허 공개 EP171496; 유럽 특허 공개 제0173494호; 및 영국 특허 GB 2177096B 참조.
추가 항체 생산 기술은 Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow 등, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. 본 개시는 항체의 임의의 특정 공급원, 생산 방법, 또는 다른 특별한 특성에 반드시 한정되지는 않는다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 리간드를 포함한다.
2. 링커("B" 성분)
본원에서 고려되는 바와 같이, 조작된 TCR은 다양한 도메인 사이에 링커 잔기("B" 성분)를 포함하거나 포함하지 않을 수 있으며, 예를 들어 분자의 적절한 간격 및 형태를 위해 추가될 수 있다. 특히, 조작된 TCR은 하나 이상의 항원 결합 도메인과 TCR 성분, 예를 들어 TCR 가변 도메인 사이에 링커를 포함한다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 하나 이상의 폴리펩티드 링커에 의해 TCR 성분, 예를 들어 TCR 가변 도메인에 연결된다. 일부 구현예에서, TCR은 항원 결합 도메인과 TCR 가변 도메인 사이에 2개 이상의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 TCR은 항원 결합 도메인과 TCR 성분 사이에 폴리펩티드 링커("B" 성분)를 포함하지 않는다.
"링커" 또는 "폴리펩티드 링커" 또는 "링커 폴리펩티드"는 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드의 인접한 도메인을 연결하는 아미노산 서열이다. 링커의 예시적인 예는, 글리신 중합체(G)n; 글리신-세린 중합체(G1-5S1-5)n(여기에서, n은 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5의 정수임); 글리신-알라닌 중합체; 알라닌-세린 중합체; 및 당업계에 공지된 다른 가요성 링커를 포함한다. 글리신은 심지어 알라닌보다 훨씬 더 많은 phi-psi 공간에 접근하고, 긴 측쇄를 갖는 잔기보다 훨씬 덜 제한된다(Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992) 참조). 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상의 아미노산의 길이일 수 있다.
특정 구현예에서, 조작된 TCR 및/또는 항원 결합 도메인은 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 이상의 링커를 포함한다. 링커는 TCR 가변 도메인과 항원 결합 도메인 사이, 2개 이상의 항원 결합 도메인 사이, 또는 항원 결합 도메인(예: scFv) 내의 VH 및 VL 서열 사이에 있을 수 있다. 특정 구현예에서, 링커의 길이는 약 2 내지 약 25개의 아미노산, 약 5 내지 약 20개의 아미노산, 또는 약 10 내지 약 20개의 아미노산, 또는 임의의 개재된 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상의 아미노산의 길이이다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 2 내지 약 25개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 3 내지 약 20개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 4 내지 약 15개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 4 내지 약 10개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 4개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 5개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 6개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 7개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 8개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 9개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 10개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 11개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 12개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 13개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 14개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 15개 아미노산 길이의 링커를 포함한다.
링커의 예시적인 예는, 글리신 중합체(G)n; 글리신-세린 중합체(G1-5S1-5)n(여기에서, n은 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5의 정수임); 글리신-알라닌 중합체; 알라닌-세린 중합체; 및 당업계에 공지된 다른 가요성 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체는 비교적 비구조적이므로, 본원에서 기술된 조작된/하이브리드 TCR과 같은 융합 단백질의 도메인 사이의 중립 테더로서 작용할 수 있다. 글리신은 심지어 알라닌보다 훨씬 더 많은 phi-psi 공간에 접근하고, 긴 측쇄를 갖는 잔기보다 훨씬 덜 제한된다(Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992) 참조). 당업자는, 특정 구현예에서의 조작된/하이브리드 TCR의 설계가, 원하는 TCR/하이브리드 구조를 제공하기 위해 해당 링커가 가요성 링커뿐만 아니하 덜 가요성인 구조를 부여하는 하나 이상의 부분을 포함할 수 있도록, 전부 또는 부분적으로 가요성인 링커를 포함할 수 있음을 인식할 것이다.
다른 예시적인 링커는 다음의 아미노산 서열을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: DGGGS (서열번호 40); TGEKP(서열번호 41)(예를 들어, Liu 등, PNAS 5525-5530 (1997) 참조); GGRR (서열번호 42) (Pomerantz 등 1995, 상기); (GGGGS)n (여기에서, n = 1, 2, 3, 4 또는 5임) (서열번호 35-39) (Kim 등의, PNAS 93, 1156-1160 (1996.); EGKSSGSGSESKVD (서열번호 43) (Chaudhary 등의, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1066-1070); KESGSVSSEQLAQFRSLD (서열번호 44) (Bird 등의, 1988, Science 242:423-426), GGRRGGGS (서열번호 45); LRQRDGERP (서열번호 46); LRQKDGGGSERP (서열번호 47); LRQKD(GGGS)2 ERP (서열번호 48). 대안적으로, 가요성 링커는 DNA 결합 부위 및 펩티드 자체 둘 모두를 모델링할 수 있는 컴퓨터 프로그램을 사용하거나(Desjarlalis 및 Berg, PNAS 90:2256-2260 (1993), PNAS 91:11099-11103 (1994)) 파지 디스플레이 방법에 의해 합리적으로 설계될 수 있다. 특정 구현예에서, 링커는 다음의 아미노산 서열을 포함한다: GSTSGSGKPGSGEGSTKG (서열번호 49) 또는 GSTSGSGKSSEGSGSTKG (서열번호 50) (Cooper 등의, Blood, 101(4): 1637-1644 (2003) 및 Whitlow 등의, Protein Eng., 6(8): 989-95 (1993)). Other linkers include GSTSGSGKSSEGKG (서열번호 51), GSTSGSGKPGSGEGS (서열번호 52), 또는 GGGS (서열번호 53).
다양한 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 링커를 포함한다: GG, GS, SG, SS, GSS, SSG, GSG, SGS, SGG, GGS, GGGS (서열번호 53), (GGGGS)1-5 폴리펩티드 (서열번호 35-39), 유대류 γμTCR로부터의 링커 (예를 들어, LEKT; 서열번호 33), 및 이들의 임의의 조합.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 유대류 γμTCR로부터의 링커를 포함한다. 특정 구현예에서, 유대류 γμTCR 링커는 서열번호 33에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 μLNK이다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 서열번호 34에 제시된 것과 같은 유대류 γμTCR 링커 및 G4S 링커를 포함한다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 GGGGS(서열번호 35) 링커(G4S)를 포함한다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 2개의 GGGGS 링커(2xG4S)(서열번호 36)를 포함한다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 3개의 GGGGS 링커(3xG4S)(서열번호 37)를 포함한다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 4개의 GGGGS 링커(4xG4S)(서열번호 38)를 포함한다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 5개의 GGGGS 링커(5xG4S)(서열번호 39)를 포함한다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 서열번호 33-53 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 제2 폴리펩티드 링커에 의해 분리된다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 약 2 내지 약 25개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 약 3 내지 약 20개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 약 4 내지 약 15개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 약 4 내지 약 10개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 약 4개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 약 5개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 약 6개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 약 7개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 약 8개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 약 9개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 약 10개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 약 11개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 약 12개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 약 13개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 약 14개 아미노산 길이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 약 15개 아미노산 길이의 링커를 포함한다.
다양한 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 GG, GS, SG, SS, GSS, SSG, GSG, SGS, SGG, GGS, GGGS (서열번호 53), (GGGGS)1-5 폴리펩티드 (서열번호 35-39), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 GGGGS(서열번호 35) 링커(G4S)를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 2개의 GGGGS 링커(2xG4S)(서열번호 36)를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 링커는 3개의 GGGGS 링커(3xG4S)(서열번호 37)를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 4개의 GGGGS 링커(4xG4S)(서열번호 38)를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 5개의 GGGGS 링커(5xG4S)(서열번호 39)를 포함한다.
다양한 구현예에서, 제2 폴리펩티드 링커는 서열번호 33-53 중 어느 하나에 제시된 것과 같은 아미노산 서열, 또는 이들의 조합을 포함한다.
3. T 세포 수용체 성분("C" 성분)
본원에서 고려되는 조작된 T 세포 수용체(TCR)는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 분자에 의해 제시된 폴리펩티드 항원, 우선적으로 MHC 클래스 I 분자에 의해 제시된 폴리펩티드 항원에 결합한다.
“주요 조직적합성 복합체”(MHC)는 세포 표면에 펩티드 항원을 전달하는 당단백질을 지칭한다. MHC 클래스 I 분자는 α 사슬에 걸쳐 있는 막(3개의 α 도메인을 가짐) 및 비공유 결합된 β2 마이크로글로불린을 갖는 이종이량체이다. MHC 클래스 II 분자는 2개의 막관통 당단백질인 α 및 β로 구성되며, 이들 모두는 막에 걸쳐 있다. 각 사슬에는 2개의 도메인이 있다. MHC 클래스 I 분자는 세포액에서 유래된 펩티드를 세포 표면으로 전달하며, 여기에서 펩티드:MHC 복합체는 CD8+ T 세포에 의해 인식된다. MHC 클래스 II 분자는 소포계에서 유래된 펩티드를 세포 표면으로 전달하며, 여기에서 이들은 CD4+ T 세포에 의해 인식된다. 인간 MHC는 인간 백혈구 항원(HLA)으로 지칭된다.
항원 제시 세포(APC)(예컨대 수지상 세포, 대식세포, 림프구 또는 다른 세포 유형)에 의한 항원 처리의 원리, 및 APC에 의한 T 세포에 대한 항원 제시의 원리는, 면역적합성 APC와 T 세포 사이의 주요 조직적합성 복합체(MHC)-제한적 제시(예를 들어, 항원 제시와 관련된 MHC 유전자의 적어도 하나의 대립유전자 형태 공유)를 포함하여, 양호하게 확립되어 있다(예를 들어, Murphy, Janeway’s Immunobiology (제8판) 2011 Garland Science, NY; 6, 9 및 16장). 예를 들어, 시토졸에서 기원하는 처리된 항원 펩티드(예를 들어, 종양 항원, 세포내 병원균)는 대체적으로 약 7개 아미노산 내지 약 11개 아미노산의 길이이고, 클래스 I MHC 분자와 연관되는 반면, 소포계에서 처리된 펩티드(예를 들어, 박테리아, 바이러스)는 대체적으로 약 10개 아미노산 내지 약 25개 아미노산의 길이로 변하고 클래스 II MHC 분자와 연관된다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 조작된 TCR은 종양 항원, 예를 들어, TAA 또는 TSA에 결합한다. “종양 연관 항원” 또는 “TAA”는 종양태아 항원, 과발현된 항원, 계통 제한 항원, 및 암-고환 항원을 포함하나 이에 한정되지 않는다. TAA는 상대적으로 종양 세포로 제한된다. TAA는 종양 세포 상에서 발현 수준이 상승하였지만, 건강한 세포 상에서는 보다 낮은 수준으로도 발현된다. “종양-특이적 항원” 또는 “TSA”는 신항원 및 온코바이러스 항원을 포함하나 이에 한정되지 않는다. TSA는 종양 세포에 고유성을 갖는다. TSA는 암세포에서 발현되며, 정상 세포에서는 발현되지 않는다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 조작된 TCR은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드의 항원성 부분에 결합한다: α-태아단백질(AFP), ASCL2, B 흑색종 항원(BAGE) 패밀리 구성원, 각인 부위 조절제의 형제(BORIS), 암-고환 항원, 암-고환 항원 83(CT-83), 탄산 탈수효소 IX(CA1X), 암배아 항원(CEA), 거대세포바이러스(CMV) 항원, 세포독성 T 세포(CTL)-인식된 흑색종 항원(CAMEL), 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스(EBV) 항원, EPHB2, G 항원 1(GAGE-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, 당단백질 100(GP100), B형 간염 바이러스(HBV) 항원, C형 간염 바이러스(HCV) 비구조 단백질 3(NS3), 인간 유두종바이러스(HPV)-E6, HPV-E7, 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT), IGF2BP3/A3, IGF2BP1, K-Ras, K-Ras G12C, K-Ras G12D, K-Ras G12V, 잠재 막 단백질 2(LMP2), LY6G6D , 흑색종 항원 패밀리 A, 1(MAGE-A1), MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4 MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원(MART-1), 메소텔린(MSLN), 뮤신 1(MUC1), 뮤신 16(MUC16), 뉴욕 식도 편평 세포 암종-1(NYESO-1), P53,P 항원(PAGE) 패밀리 구성원, PAP, PIK3CA, PIK3CA H1047R, 태반-특이적 항원 1(PLAC1), 흑색종에서 우선적으로 발현되는 항원(PRAME), 전립선 특이적 항원 PSA, 서바이빈, 활막 육종 X 1(SSX1), 활막 육종 X 2(SSX2), 활막 육종 X 3(SSX3), 활막 육종 X 4(SSX4), 활막 육종 X 5(SSX5), 활막 육종 X 8(SSX8), 갑상선글로불린, TP53 R175H, 티로시나아제, 티로시나아제 관련 단백질(TRP)1, TRP2, UBD, 빌름스(Wilms) 종양 단백질(WT-1), Wnt10A, X 항원 패밀리 구성원 1(XAGE1), 및 X 항원 패밀리 구성원 2(XAGE2). 일부 구현예에서, TCR 가변 도메인은 MAGE-A4, PRAME, K-Ras, TP53R175H, PSA, 또는 IGF2BP3으로부터 유래된 표적 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, TCR 가변 도메인은 MAGE-A4로부터 유래된 표적 폴리펩티드에 결합한다.
본원에서 고려되는 바와 같이, 조작된 TCR은 TCR 성분(“C” 성분)을 포함한다. 일부 구현예에서, TCR 성분은 TCRα 가변 도메인을 포함하는 TCRα 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, TCR 성분은 TCRβ 가변 도메인을 포함하는 TCRβ 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, TCR 성분은 TCRγ 가변 도메인을 포함하는 TCRγ 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, TCR 성분은 TCRδ 가변 도메인을 포함하는 TCRδ 폴리펩티드를 포함한다.
일 구현예에서, TCR 성분(“C” 성분)은 TCRα 가변 도메인을 포함하는 TCRα 폴리펩티드; 및 TCRβ 가변 도메인을 포함하는 TCRβ 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, TCR 성분은 TCRα 가변 도메인을 포함하는 TCRα 폴리펩티드; TCRβ 가변 도메인을 포함하는 TCRβ 폴리펩티드; 및 TCRγ 가변 도메인 및/또는 TCRδ 가변 도메인에 연결된 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, TCR 성분(“C” 성분)은 TCRγ 가변 도메인을 포함하는 TCRγ 폴리펩티드; 및 TCRδ 가변 도메인을 포함하는 TCRδ 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, TCR 성분은 TCRγ 가변 도메인을 포함하는 TCRγ 폴리펩티드; TCRδ 가변 도메인을 포함하는 TCRδ 폴리펩티드; 및 TCRγ 가변 도메인 및/또는 TCRδ 가변 도메인에 연결된 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다.
다양한 구현예에서, TCR 성분(“C” 성분)은 TCR 불변 도메인을 포함한다. 당업자는 주어진 TCR 가변 도메인이 여러 상이한 불변 도메인 중 어느 하나와 쌍을 이룰 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, TCRα, TCRβ, TCRγ, 또는 TCRδ 가변 도메인 중 어느 하나는 TCRα, TCRβ, TCRγ, 또는 TCRδ 불변 도메인 중 어느 하나와 쌍을 이룰 수 있다. 일부 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 TCRα 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRβ 폴리펩티드는 TCRβ 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRγ 폴리펩티드는 TCRγ 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRδ 폴리펩티드는 TCRδ 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRα 가변 도메인은 TCRγ 불변 도메인과 쌍을 이룬다. 일부 구현예에서, TCRα 가변 도메인은 TCRδ 불변 도메인과 쌍을 이룬다. 일부 구현예에서, TCRβ 가변 도메인은 TCRγ 불변 도메인과 쌍을 이룬다. 일부 구현예에서, TCRβ 가변 도메인은 TCRδ 불변 도메인과 쌍을 이룬다. 일부 구현예에서, TCRγ 가변 도메인은 TCRα 불변 도메인과 쌍을 이룬다. 일부 구현예에서, TCRγ 가변 도메인은 TCRβ 불변 도메인과 쌍을 이룬다. 일부 구현예에서, TCRδ 가변 도메인은 TCRα 불변 도메인과 쌍을 이룬다. 일부 구현예에서, TCRδ 가변 도메인은 TCRβ 불변 도메인과 쌍을 이룬다.
불변 도메인은 천연 불변 도메인으로부터 유래되거나, 발현될 때 천연 TCR과의 페어링에 비해 서로의 페어링을 향상시키거나, 안정성을 증가시키도록 돌연변이될 수 있다. 이러한 페어링 및 안정성 강화 TCR은 공지되어 있으며, 예를 들어 WO2021195503A1 및 WO2018102795A1을 참조하며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
다양한 구현예에서, TCRα 불변 도메인은 서열번호 82 또는 88에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRα 불변 도메인은 서열번호 82 또는 88에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRα 불변 도메인은 서열번호 82 또는 88에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRα 불변 도메인은 서열번호 82 또는 88에 제시된 아미노산 서열과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRα 불변 도메인은 서열번호 82 또는 88에 제시된 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRα 불변 도메인은 서열번호 82 또는 88에 제시된 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRα 불변 도메인은 서열번호 82 또는 88에 제시된 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRα 불변 도메인은 서열번호 82 또는 88에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, TCRβ 불변 도메인은 서열번호 80, 81, 86 또는 87 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRβ 불변 도메인은 서열번호 80, 81, 86 또는 87 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRβ 불변 도메인은 서열번호 80, 81, 86 또는 87 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRβ 불변 도메인은 서열번호 80, 81, 86 또는 87 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRβ 불변 도메인은 서열번호 80, 81, 86 또는 87 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRβ 불변 도메인은 서열번호 80, 81, 86 또는 87 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRβ 불변 도메인은 서열번호 80, 81, 86 또는 87 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRβ 불변 도메인은 서열번호 80, 81, 86, 또는 87 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, TCRγ 불변 도메인은 서열번호 83 또는 84에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRγ 불변 도메인은 서열번호 83 또는 84에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRγ 불변 도메인은 서열번호 83 또는 84에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRγ 불변 도메인은 서열번호 83 또는 84에 제시된 아미노산 서열과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRγ 불변 도메인은 서열번호 83 또는 84에 제시된 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRγ 불변 도메인은 서열번호 83 또는 84에 제시된 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRγ 불변 도메인은 서열번호 83 또는 84에 제시된 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRγ 불변 도메인은 서열번호 83 또는 84에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, TCRδ 불변 도메인은 서열번호 85에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRδ 불변 도메인은 서열번호 85에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRδ 불변 도메인은 서열번호 85에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRδ 불변 도메인은 서열번호 85에 제시된 아미노산 서열과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRδ 불변 도메인은 서열번호 85에 제시된 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRδ 불변 도메인은 서열번호 85에 제시된 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRδ 불변 도메인은 서열번호 85에 제시된 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRγ 불변 도메인은 서열번호 85에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 서열번호 105-111 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 서열번호 105에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 서열번호 106에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 서열번호 107에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 서열번호 108에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 서열번호 109에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 서열번호 110에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 서열번호 111에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 서열번호 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74 및 76 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 서열번호 62에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 서열번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 서열번호 66에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 서열번호 68에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 서열번호 70에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 서열번호 72에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 서열번호 74에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 서열번호 76에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, TCRγ 폴리펩티드는 서열번호 78 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, TCRβ 폴리펩티드는 서열번호 103 또는 104에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRβ 폴리펩티드는 서열번호 103에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRβ 폴리펩티드는 서열번호 104에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, TCRβ 폴리펩티드는 서열번호 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 및 77 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRβ 폴리펩티드는 서열번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRβ 폴리펩티드는 서열번호 65에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRβ 폴리펩티드는 서열번호 67에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRβ 폴리펩티드는 서열번호 69에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRβ 폴리펩티드는 서열번호 71에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRβ 폴리펩티드는 서열번호 73에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRβ 폴리펩티드는 서열번호 75에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRβ 폴리펩티드는 서열번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, TCRγ 폴리펩티드는 서열번호 79 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 논의된 바와 같이, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 TCR 성분의 TCR 가변 도메인 중 하나 또는 둘 다에 연결된다. 예를 들어, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 경우에 따라 TCRα, TCRβ, TCRγ, 또는 TCRδ 가변 도메인 중 임의의 하나 이상에 연결될 수 있다. 다양한 항원 결합 도메인/TCR 성분 구성이 본원에서 고려된다. 예를 들어, 제1 항원 결합 도메인은 TCR 폴리펩티드(예: TCRα/β 또는 TCRγ/δ 가변 영역) 중 하나 또는 둘 다의 N-말단에 연결될 수 있다. 또한, 제2 항원 결합 도메인은 제1 항원 결합 도메인의 N-말단에 연결될 수 있으므로, 직렬 항원 결합 도메인을 생성할 수 있다. 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이한 항원에 결합하도록 표적화될 수 있다. 유사하게, 다수의 제1 결합 도메인은 동일하거나 상이한 항원에 결합하도록 표적화될 수 있고, 다수의 제2 결합 도메인은 동일하거나 상이한 항원에 결합하도록 표적화될 수 있다.
다양한 구현예에서, TCR 성분은 신호 서열/펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, TCRα, TCRβ, TCRγ, 또는 TCRδ 폴리펩티드는 N-말단 신호 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 N-말단 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD8α, 또는 IgK 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 N-말단 TCRα 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 N-말단 IgK 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 N-말단 CD8α 신호 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, TCRβ 폴리펩티드는 N-말단 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD8α, 또는 IgK 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRβ 폴리펩티드는 N-말단 TCRβ 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRβ 폴리펩티드는 N-말단 IgK 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRβ 폴리펩티드는 N-말단 CD8α 신호 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, TCRγ 폴리펩티드는 N-말단 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD8α, 또는 IgK 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRγ 폴리펩티드는 N-말단 TCRγ 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRγ 폴리펩티드는 N-말단 IgK 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRγ 폴리펩티드는 N-말단 CD8α 신호 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, TCRδ 폴리펩티드는 N-말단 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD8α, 또는 IgK 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRδ 폴리펩티드는 N-말단 TCRδ 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRδ 폴리펩티드는 N-말단 IgK 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCRδ 폴리펩티드는 N-말단 CD8α 신호 서열을 포함한다.
D. 예시적인 조작된 TCR 폴리펩티드 및 복합체
다양한 조작된 TCR 폴리펩티드 및 이들의 관련 변이체 및 복합체가 본원에서 고려된다. 위에서 논의된 바와 같이, 놀랍게도 조작된 TCR은 다중 특이성, 세포내 및 세포외 표적 둘 다를 동시에 표적화하는 능력, 및 비-MHC 제시 표적에 대한 증가된 민감도를 갖는다.
조작된 TCR은 다수의 포맷으로 작제될 수 있고, 공지된 성분(예: 항원 결합 도메인, 폴리펩티드 링커, 및 TCRα 및 TCRβ 사슬) 및 기술을 사용하여 설계되고 작제될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 항원 결합 도메인(예를 들어, 하나 이상의 “A” 성분)은 표준 클로닝 기술을 사용하여 하나 이상의 폴리펩티드 링커를 갖거나 갖지 않고(예를 들어, 하나 이상의 “B” 성분과 갖거나 갖지 않고) 하나 이상의 TCR 성분(예를 들어, 하나 이상의 “C” 성분)에 연결될 수 있다. “A” 성분은 TCRα 또는 TCRβ 폴리펩티드/사슬 또는 둘 모두에 연결될 수 있고; 또는 TCRγ 또는 TCRδ 또는 둘 모두; 경우에 따라, “C” 구성 요소를 포함할 수 있다. 예시적인 조작된 TCR 화학식이 아래에 제공된다:
A - C
A - B - C
예시적인 항원 결합 도메인, 링커, 및 TCR은 아래 표 3~5에서 확인할 수 있다. 또한, 표 6은 표 3, 4, 및 5에 제공된 항원 결합 도메인, 링커, 및 TCR에 기초한 조작된 TCR/ATOMIC 폴리펩티드 및 복합체의 예시적인 목록을 제공한다(실시예 10 참조). 당업자는 당업자에게 공지되거나 당업자에 의해 새롭게 개발된 다른 항원 결합 도메인, 링커, 및 TCR을 사용하는 조합을 포함하는 다른 조합이 가능하다는 것을 이해할 것이다.
다양한 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 서열번호 105에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 서열번호 106에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 서열번호 107에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 서열번호 108에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 서열번호 109에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 서열번호 110에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRα 폴리펩티드는 서열번호 111에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, TCRβ 폴리펩티드는 서열번호 103에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, TCRβ 폴리펩티드는 서열번호 104에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
E. 폴리펩티드
TCR 폴리펩티드, TCRα 사슬 폴리펩티드, TCRβ 사슬 폴리펩티드, TCR 융합 폴리펩티드, 및 이의 단편을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드, 및 폴리펩티드 변이체가 본원에서 고려된다.
“폴리펩티드”, “펩티드”, 및 “단백질”은 반대로 명시되지 않는 한, 통상적인 의미에 따라, 즉 아미노산의 서열로서 상호 교환적으로 사용된다. 폴리펩티드는 특정 길이로 제한되지 않으며, 예를 들어, 이들은 전장 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 포함할 수 있고, 폴리펩티드의 하나 이상의 번역 후 변형, 예를 들어, 당질화, 아세틸화, 인산화 등을 비롯하여 당업계에 공지된 다른 변형을 포함할 수 있으며, 자연 발생 및 비자연 발생 변형을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 “단리된 폴리펩티드” 등은 세포 환경으로부터 및 세포의 다른 성분과의 결합된 상태로부터 시험관 내에서 합성, 단리 및/또는 정제된 펩티드 또는 폴리펩티드 분자, 즉 생체 내 물질과 유의하게 결합되지 않은 펩티드 또는 폴리펩티드 분자를 지칭한다. 특정 구현예에서, 단리된 폴리펩티드는 합성 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드, 반-합성 폴리펩티드, 또는 재조합 공급원으로부터 수득되거나 유래된 폴리펩티드이다.
폴리펩티드는 “폴리펩티드 변이체”를 포함한다. 폴리펩티드 변이체는 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 추가 및/또는 삽입되었다는 점에서 자연 발생 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 이러한 변이체는 자연적으로 발생할 수 있거나, 합성에 의해, 예를 들어 본원에서 고려되는 폴리펩티드 서열 중 하나 이상을 변형시킴으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, TCRα, TCRβ, TCRγ 및/또는 TCRδ 폴리펩티드, 가변 도메인 및/또는 불변 영역 중 어느 하나 이상에 하나 이상의 치환, 결실, 추가, 및/또는 삽입을 TCRα 사슬 및/또는 TCRβ 사슬에 도입함으로써 TCR의 결합 친화도, 안정성, 발현, 특이적 페어링, 기능적 결합능 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 본원에서 고려되는 폴리펩티드 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하며, 일반적으로 여기서 변이체는 기준 서열의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지한다.
폴리펩티드는 “폴리펩티드 단편”을 포함한다. 폴리펩티드 단편은 단량체 또는 다량체일 수 있는 폴리펩티드를 지칭하며, 이는 아미노-말단 결실, 카르복실-말단 결실, 및/또는 자연 발생 폴리펩티드 또는 재조합적으로 생성된 폴리펩티드의 내부 결실 또는 치환을 갖는다. 본원에서 사용되는 용어 “생물학적 활성 단편” 또는 “최소 생물학적 활성 단편”은 자연 발생 폴리펩티드 활성의 적어도 100%, 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 40%, 적어도 30%, 적어도 20%, 적어도 10%, 또는 적어도 5%를 보유하는 폴리펩티드 단편을 지칭한다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드 단편은 적어도 5 내지 약 500개 아미노산 길이의 아미노산 사슬을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 단편은 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 또는 450개 아미노산의 길이이다.
전술한 바와 같이, 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 아미노산 치환, 결실, 절단, 및 삽입을 포함하는 다양한 방식으로 변경될 수 있다. 이러한 조작을 위한 방법은 대체로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 기준 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 DNA에서의 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이 유발 및 뉴클레오티드 서열 변경을 위한 방법은 당 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492), Kunkel 등, (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382), 미국 특허 제4,873,192호, Watson, J. D. 등, (Molecular Biology of the Gene, 제4판, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987) 및 이에 인용된 문헌을 참조한다. 관심 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 지침은 Dayhoff 등의 모델에서 확인할 수 있다(Dayhoff 등, (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)).
특정 구현예에서, 폴리펩티드 변이체는 하나 이상의 보존적 치환을 포함한다. “보존적 치환”은 아미노산이 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환되는 것이므로, 펩티드 화학 분야의 당업자는 폴리펩티드의 이차 구조 및 소수성 성질(hydropathic nature)이 실질적으로 변하지 않을 것으로 예상하게 된다. 변형은 특정 구현예에서 고려되는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 구조의 변형일 수 있고, 변형 후에도 원하는 특성을 갖는 변이체 또는 유도체 폴리펩티드를 암호화하는 기능적 분자를 여전히 수득할 수 있다. 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경해서 동등하거나 심지어 개선된 변이체 폴리펩티드를 생성하는 것이 바람직할 경우, 당업자는 예를 들어, 표 1에 따라, 예를 들어 암호화 DNA 서열의 코돈 중 하나 이상을 바꿀 수 있다.
생물학적 활성을 손상시키지 않고 치환, 삽입, 또는 결실할 수 있는 아미노산 잔기를 결정하는 데 있어서의 지침은 당업계에 잘 알려진 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 DNASTAR, DNA Strider, Geneious, Mac Vector, 또는 Vector NTI 소프트웨어를 사용해 확인할 수 있다. 바람직하게는, 본원에 개시된 단백질 변이체에서의 아미노산 변화는 보존적 아미노산 변화,　즉　유사하게 하전되거나 하전되지 않은 아미노산의 치환이다. 보존적 아미노산 변화는 이들의 측쇄에 관련된 아미노산 군 중 하나의 치환을 포함한다. 자연 발생 아미노산은 일반적으로 다음의 4개의 군으로 나누어진다: 산성(아스파르트산염, 글루탐산염) 아미노산, 염기성(리신, 아르기닌, 히스티딘) 아미노산, 비극성(알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판) 아미노산, 및 하전되지 않은 극성(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레온, 티로신) 아미노산. 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로서 함께 분류된다. 펩티드 또는 단백질에서, 아미노산의 적절한 보존적 치환은 당 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있고, 일반적으로 생성되는 분자의 생물학적 활성을 변화시키지 않고 이루어질 수 있다. 당 기술분야의 숙련자는 일반적으로, 폴리펩티드의 비필수 영역에서의 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는다는 것을 인식한다(예를 들어, Watson　등, Molecular Biology of the Gene, 제4판, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.224 참조).
전술한 바와 같이, 아미노산 치환은 아미노산 측쇄 치환기의 상대적인 유사성, 예를 들어, 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초할 수 있다.
폴리펩티드 변이체는 글리코실화된 형태, 다른 분자와의 응집 접합체, 및 무관한 화학적 모이어티를 갖는 공유 접합체(예를 들어, 페길화된 분자)를 추가로 포함한다. 공유 변이체는 당업계에 공지된 바와 같이, 아미노산 사슬 내 또는 N-말단 또는 C-말단 잔기에서 발견되는 기에 작용기를 연결함으로써 제조될 수 있다. 변이체는 또한 대립유전자 변이체, 종 변이체, 및 돌연변이단백질(mutein)을 포함한다. 단백질의 기능적 활성에 영향을 미치지 않는 영역의 잘림 또는 결실 또한 변이체이다.
특정 구현예에서, 동일한 세포에서 TCRα 및 TCRβ 폴리펩티드, 또는 TCRγ 및 TCRδ 폴리펩티드 둘 모두의 발현이 요구된다. TCR 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이 IRES 서열에 의해 분리될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 융합 폴리펩티드가 본원에서 고려된다. 융합 폴리펩티드 및 융합 단백질은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 폴리펩티드 분절을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 융합 폴리펩티드는 일반적으로 C-말단 대 N-말단 결합이지만, C-말단 대 C-말단 결합, N-말단 대 N-말단 결합, 또는 N-말단 대 C-말단 결합일 수도 있다. 특정 구현예에서, 융합 단백질의 폴리펩티드는 임의의 순서 또는 특정 순서를 가질 수 있다.
특정 바람직한 구현예에서, TCR 폴리펩티드(즉, TCRα, TCRβ, TCRγ, 및/또는 TCRδ 폴리펩티드)는 TCR 폴리펩티드를 분리하는 하나 이상의 자가 절단 폴리펩티드 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드로서 발현될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 TCR(예를 들어, 조작된 TCR)은 TCRα 폴리펩티드, 폴리펩티드 링커(예를 들어, 자가 절단 폴리펩티드), 및 TCRβ 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드로서 발현된다. 특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 TCR(예를 들어, 조작된 TCR)은 TCRγ 폴리펩티드, 폴리펩티드 링커(예를 들어, 자가 절단 폴리펩티드), 및 TCRδ 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드로서 발현된다.
일부 구현예에서, TCR(예: 조작된 TCR)은 N-말단에서 C-말단까지 포함하는 융합 단백질, TCRα 폴리펩티드, 폴리펩티드 링커(예: 자가 절단 폴리펩티드), 및 TCRβ 폴리펩티드로서 발현된다. 일부 구현예에서, TCR(예: 조작된 TCR)은 N-말단에서 C-말단까지 포함하는 융합 단백질, TCRβ 폴리펩티드, 폴리펩티드 링커(예: 자가 절단 폴리펩티드), 및 TCRα 폴리펩티드로서 발현된다.
일부 구현예에서, TCR(예: 조작된 TCR)은 N-말단에서 C-말단까지 포함하는 융합 단백질, TCRγ 폴리펩티드, 폴리펩티드 링커(예: 자가 절단 폴리펩티드), 및 TCRδ 폴리펩티드로서 발현된다. 일부 구현예에서, TCR(예: 조작된 TCR)은 N-말단에서 C-말단까지 포함하는 융합 단백질, TCRδ 폴리펩티드, 폴리펩티드 링커(예: 자가 절단 폴리펩티드), 및 TCRγ 폴리펩티드로서 발현된다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 조작된 TCR(예를 들어, 조작된 TCR 복합체)은 다음을 포함하는 융합 폴리펩티드로서 발현된다: (a) TCRβ 가변 도메인을 포함하는 TCRβ 폴리펩티드; (b) 폴리펩티드 절단 신호; 및 (c) 하나 이상의 항원 결합 도메인, 폴리펩티드 링커, 및 TCRα 가변 도메인을 포함하는 TCRα 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 조작된 TCR(예를 들어, 조작된 TCR 복합체)은 (a) 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 TCRβ 폴리펩티드, 폴리펩티드 링커, 및 TCRβ 가변 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드로서 발현되고; (b) 폴리펩티드 절단 신호; 및 (c) TCRα 가변 도메인을 포함하는 TCRα 폴리펩티드.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 조작된 TCR(예를 들어, 조작된 TCR 복합체)은 다음을 포함하는 융합 폴리펩티드로서 발현된다: (a) 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 TCRβ 폴리펩티드, 폴리펩티드 링커, 및 TCRβ 가변 도메인; (b) 폴리펩티드 절단 신호; 및 (c) 하나 이상의 항원 결합 도메인, 폴리펩티드 링커, 및 TCRα 가변 도메인을 포함하는 TCRα 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 조작된 TCR(예를 들어, 조작된 TCR 복합체)은 다음을 포함하는 융합 폴리펩티드로서 발현된다: (a) TCRγ 가변 도메인을 포함하는 TCRγ 폴리펩티드; (b) 폴리펩티드 절단 신호; 및 (c) 하나 이상의 항원 결합 도메인, 폴리펩티드 링커, 및 TCRδ 가변 도메인을 포함하는 TCRδ 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 조작된 TCR(예를 들어, 조작된 TCR 복합체)은 (a) 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 TCRγ 폴리펩티드, 폴리펩티드 링커, 및 TCRγ 가변 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드로서 발현되고; (b) 폴리펩티드 절단 신호; 및 (c) TCRδ 가변 도메인을 포함하는 TCRδ 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 조작된 TCR(예를 들어, 조작된 TCR 복합체)은 다음을 포함하는 융합 폴리펩티드로서 발현된다: (a) 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 TCRγ 폴리펩티드, 폴리펩티드 링커, 및 TCRγ 가변 도메인; (b) 폴리펩티드 절단 신호; 및 (c) 하나 이상의 항원 결합 도메인, 폴리펩티드 링커, 및 TCRδ 가변 도메인을 포함하는 TCRδ 폴리펩티드를 포함한다.
융합 폴리펩티드는 본원에서 고려되는 TCR 폴리펩티드 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
본원에서 고려되는 융합 단백질은 또한 TCR 폴리펩티드 사이에 폴리펩티드 절단 신호를 포함한다. 폴리펩티드 절단 신호의 예시적인 예는, 프로테아제 절단 부위, 뉴클레아제 절단 부위(예를 들어, 희귀 제한 효소 인식 부위, 자가 절단 리보자임 인식 부위), 및 자가 절단 바이러스 올리고펩티드와 같은 폴리펩티드 절단 인식 부위를 포함한다(deFelipe 및 Ryan, 2004, Traffic, 5(8); 616-26 참조).
적절한 프로테아제 절단 부위 및 자가 절단 펩티드는 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, Ryan 등, 1997. J. Gener. Virol. 78, 699-722; Scymczak 등, (2004) Nature Biotech. 5, 589-594 참조). 예시적인 프로테아제 절단 부위는 포티바이러스 NIa 프로테아제(예를 들어, 담배 식각 바이러스 프로테아제), 포티바이러스 HC 프로테아제, 포티바이러스 P1 (P35) 프로테아제, 바이오바이러스(byovirus) NIa 프로테아제, 바이오바이러스 RNA-2-암호화된 프로테아제, 아프토바이러스 L 프로테아제, 엔테로바이러스 2A 프로테아제, 리노바이러스 2A 프로테아제, 피코르나 3C 프로테아제, 코모바이러스 24K 프로테아제, 네포바이러스 24K 프로테아제, RTSV(벼해충 구상 바이러스) 3C-유사 프로테아제, PYVF(파스닙 황색 얼룩 바이러스) 3C-유사 프로테아제, 헤파린, 트롬빈, 인자 Xa, 및 엔테로키나제의 절단 부위를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 높은 절단 엄격성으로 인해, 일 구현예에서는 TEV(담배 식각 바이러스) 프로테아제 절단 부위, 예를 들어, EXXYXQ(G/S), 예를 들어, ENLYFQG(서열번호 114) 및 ENLYFQS(서열번호 115)가 바람직하며, 여기에서 X는 임의의 아미노산을 나타낸다(TEV에 의한 절단은 Q와 G 사이 또는 Q와 S 사이에서 발생함).
특정 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 바이러스 자가 절단 펩티드 또는 리보솜 스키핑 서열이다.
리보솜 스키핑 서열의 예시적인 예는, 2A 또는 2A-유사 부위, 서열, 또는 도메인을 포함하나 이에 한정되지 않는다(Donnelly 등, 2001. J. Gen. Virol. 82:1027-1041).
특정 구현예에서, 바이러스 2A 펩티드는 아프토바이러스 2A 펩티드, 포티바이러스 2A 펩티드, 또는 카디오바이러스 2A 펩티드이다. 일 구현예에서, 바이러스 2A 펩티드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 구제역 바이러스(FMDV) 2A 펩티드, 말 비염 A 바이러스(ERAV) 2A 펩티드, 토세아 아시그나 바이러스(TaV) 2A 펩티드, 돼지 테스코바이러스-1(PTV-1) 2A 펩티드, 테일로바이러스 2A 펩티드, 및 뇌심근염 바이러스 2A 펩티드.
표 1은 2A 부위의 예시적인 예를 제공한다.
서열번호 116 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
서열번호 117 ATNFSLLKQAGDVEENPGP
서열번호 118 LLKQAGDVEENPGP
서열번호 119 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
서열번호 120 EGRGSLLTCGDVEENPGP
서열번호 121 LLTCGDVEENPGP
서열번호 122 GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP
서열번호 123 QCTNYALLKLAGDVESNPGP
서열번호 124 LLKLAGDVESNPGP
서열번호 125 GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
서열번호 126 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
서열번호 127 LLKLAGDVESNPGP
서열번호 128 LLNFDLLKLAGDVESNPGP
서열번호 129 TLNFDLLKLAGDVESNPGP
서열번호 130 LLKLAGDVESNPGP
서열번호 131 NFDLLKLAGDVESNPGP
서열번호 132 QLLNFDLLKLAGDVESNPGP
서열번호 133 APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
서열번호 134 VTELLYRMKRAETYCPRPLLAIHPTEARHKQKIVAPVKQT
서열번호 135 LNFDLLKLAGDVESNPGP
서열번호 136 LLAIHPTEARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
서열번호 137 EARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
특정 구현예에서, 융합 단백질은 바이러스 자가 절단 펩티드 또는 리보솜 스키핑 서열인 폴리펩티드 절단 신호를 포함한다.
특정 구현예에서, 융합 단백질은 바이러스 2A 펩티드인 폴리펩티드 절단 신호를 포함한다. 특정 구현예에서, 융합 단백질은 아프토바이러스 2A 펩티드, 포티바이러스 2A 펩티드, 또는 카디오바이러스 2A 펩티드인 폴리펩티드 절단 신호를 포함한다. 추가의 구현예에서, 융합 단백질은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 2A 펩티드인 폴리펩티드 절단 신호를 포함한다: 구제역 바이러스(FMDV) 2A 펩티드, 말 비염 A 바이러스(ERAV) 2A 펩티드, 토세아 아시그나 바이러스(TaV) 2A 펩티드, 돼지 테스코바이러스-1(PTV-1) 2A 펩티드, 테일로바이러스 2A 펩티드, 및 뇌심근염 바이러스 2A 펩티드.
특정 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 바이러스 자가 절단 펩티드 또는 리보솜 스키핑 서열이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 바이러스 2A 펩티드이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 아프토바이러스 2A 펩티드, 포티바이러스 2A 펩티드, 또는 카디오바이러스 2A 펩티드이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 2A 펩티드이다: 구제역 바이러스(FMDV) 2A 펩티드, 말 비염 A 바이러스(ERAV) 2A 펩티드, 토세아 아시그나 바이러스(TaV) 2A 펩티드, 돼지 테스코바이러스-1(PTV-1) 2A 펩티드, 테일로바이러스 2A 펩티드, 및 뇌심근염 바이러스 2A 펩티드.
다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 자가 절단 펩티드(예를 들어, 2A 펩티드) 및 2A 펩티드의 바로 상류(즉, N-말단)에 있는 GSG 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 폴리펩티드 절단 신호(예: 자가 절단 2A 펩티드)의 상류에 퓨린 인식 부위를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 퓨린 인식 부위는 서열번호 112에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 113-137 중 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 113에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 114에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 115에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 116에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 117에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 118에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 119에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 120에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 121에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 122에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 123에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 124에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 125에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 126에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 127에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 128에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 129에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 130에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 131에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 132에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 133에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 134에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 135에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 136에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 137에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, TCRβ 또는 TCRδ 폴리펩티드는 TCRα 또는 TCRγ 폴리펩티드의 N-말단이다.
다양한 구현예에서, TCRα 또는 TCRγ 폴리펩티드는 TCRβ 또는 TCRδ 폴리펩티드의 N-말단이다.
특정 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 91-97, 100, 및 102에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 91-97, 100 및 102 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 91-97, 100 및 102 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 91-97, 100 및 102 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 91-97, 100 및 102 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 96%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 91-97, 100 및 102 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 91-97, 100 및 102 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 98%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 91-97, 100 및 102 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 91-97, 100, 및 102 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 91에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 92에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 93에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 94에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 95에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 96에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 97에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 100에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 102에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
F. 폴리뉴클레오티드
특정 구현예에서, 하나 이상의 TCR 폴리펩티드, TCRα 폴리펩티드, TCRβ 폴리펩티드, TCRγ 폴리펩티드, TCRδ 폴리펩티드, TCR 융합 폴리펩티드, 및 이의 단편을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 본원에서 사용되는 용어 “폴리뉴클레오티드” 또는 “핵산”은 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 DNA/RNA 하이브리드를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 모노시스트론 또는 폴리시스트론, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고 재조합, 합성, 또는 단리된 것일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 다음을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다: 전구체 전령 RNA(pre-mRNA), 전령 RNA(mRNA), RNA, 게놈 DNA(gDNA), PCR 증폭 DNA, 상보적 DNA(cDNA), 합성 DNA, 또는 재조합 DNA. 폴리뉴클레오티드는 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 200개, 적어도 300개, 적어도 400개, 적어도 500개, 적어도 1000개, 적어도 5000개, 적어도 10000개, 또는 적어도 15000개, 또는 그 이상(모든 중간 길이도 포함함)의 뉴클레오티드(리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 어느 하나의 뉴클레오티드의 변형된 형태)로 이루어진 뉴클레오티드의 다량체 형태를 지칭한다. 이러한 맥락에서, “중간 길이” 는 인용된 값들 사이의 임의의 길이, 예컨대 6, 7, 8, 9, 등, 101, 102, 103, 등; 151, 152, 153 등; 201, 202, 203 등을 의미한다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 변이체는 기준서열에 대해 적어도 또는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%,76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
본원에서 사용되는, “단리된 폴리뉴클레오티드”는 자연 발생 상태에서 측면에 위치하는 서열로부터 정제된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 일반적으로 단편에 인접한 서열로부터 제거된 DNA 단편을 지칭한다. 특정 구현예에서, “단리된 폴리뉴클레오티드”는 또한 상보적 DNA(cDNA), 재조합 DNA, 또는 자연에서 존재하지 않고 사람의 손에 의해 만들어진 기타 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 특정 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 합성 폴리뉴클레오티드, 재조합 폴리뉴클레오티드, 반-합성 폴리뉴클레오티드, 또는 재조합 공급원으로부터 수득되거나 유래된 폴리뉴클레오티드이다.
다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에서 고려되는 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 mRNA를 포함한다. 특정 구현예에서, mRNA는 캡, 하나 이상의 뉴클레오티드, 및 폴리(A) 꼬리를 포함한다.
다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 원하는 폴리펩티드를 일시적으로 발현시키기 위해 세포 내로 도입되는 mRNA이다.
본원에서 사용되는 “일시적”은 비-통합된 이식유전자가 몇 시간, 몇 일, 또는 몇 주 동안 발현되는 것을 지칭하며, 여기서 발현 기간은 폴리뉴클레오티드가 게놈 내에 통합되거나 세포 내의 안정한 플라스미드 레플리콘 내에 함유된 경우에 이의 발현 기간보다 짧다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA는 시험관 내 전사된 mRNA이다. 본원에서 사용되는 “시험관 내 전사된 RNA”는 RNA, 바람직하게는 시험관 내에서 합성된 mRNA를 지칭한다. 일반적으로, 시험관 내 전사된 RNA는 시험관 내 전사 벡터로부터 생성된다. 시험관 내 전사 벡터는 시험관 내 전사된 RNA를 생성하는 데 사용되는 템플릿을 포함한다.
특정 구현예에서, mRNA는 5’ 캡 또는 변형된 5’ 캡 및/또는 폴리(A) 서열을 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 5’ 캡(RNA 캡, RNA 7-메틸구아노신 캡 또는 RNA m7G 캡으로도 지칭됨)은 전사의 시작 직후에 진핵생물 전령 RNA의 “전방” 또는 5’ 말단에 첨가된 변형된 구아닌 뉴클레오티드이다. 5’ 캡은 제1 전사된 뉴클레오티드에 연결되고 리보솜에 의해 인식되고 RNase로부터 보호되는 말단기를 포함한다. 캡핑 모이어티는 번역의 안정성 또는 효율과 같은 mRNA의 기능성을 조절하도록 변형될 수 있다. 특정 구현예에서, mRNA는 약 50 내지 약 5000 아데닌의 폴리(A) 서열을 포함한다. 일 구현예에서, mRNA는 약 100 내지 약 1000 염기, 약 200 내지 약 500 염기, 또는 약 300 내지 약 400 염기의 폴리(A) 서열을 포함한다. 일 구현예에서, mRNA는 약 65개 염기, 약 100개 염기, 약 200개 염기, 약 300개 염기, 약 400개 염기, 약 500개 염기, 약 600개 염기, 약 700개 염기, 약 800개 염기, 약 900개 염기, 또는 약 1000개 이상의 염기의 폴리(A) 서열을 포함한다. 폴리(A) 서열은 국소화, 안정성 또는 번역 효율과 같은 mRNA 기능을 조절하기 위해 화학적으로 또는 효소적으로 변형될 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 코돈 최적화될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 “코돈 최적화”는 폴리펩티드의 발현, 안정성, 및/또는 활성을 증가시키기 위해 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈을 치환하는 것을 지칭한다. 코돈 최적화에 영향을 미치는 인자는 다음 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다: (i) 둘 이상의 유기체 또는 유전자 간의 코돈 편향의 변동 또는 합성으로 작제된 편향 테이블; (ii) 유기체, 유전자, 또는 유전자 세트 내 코돈 편향 정도의 변동; (iii) 맥락을 포함하는 코돈의 체계적인 변동; (iv) 코돈의 복호화 tRNA에 따른 코돈의 변동; (v) 삼중항 전체에서 또는 이중 하나의 위치에서 GC 백분율(%)에 따른 코돈의 변동; (vi) 자연 발생 서열과 같은 기준 서열에 대한 유사성의 정도에 있어서의 변동; (vii) 코돈 빈도 컷오프에서의 변동; (viii) DNA 서열로부터 전사된 mRNA의 구조적 특성; (ix) 코돈 치환 세트 설계의 기초가 되는 DNA 서열의 기능에 대한 사전 지식; (x) 각각의 아미노산에 대한 코돈 세트의 체계적인 변동; 및/또는 (xi) 허위 번역 개시 부위의 단리된 제거.
본원에서 사용되는 용어 “폴리뉴클레오티드 변이체” 및 “변이체” 등은 기준 폴리뉴클레오티드 서열과 실질적인 서열 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오티드, 또는 이하에서 정의되는 엄격한 조건 하에서 기준 서열과 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이들 용어는 하나 이상의 뉴클레오티드가 추가 또는 결실되었거나, 기준 폴리뉴클레오티드에 비해 상이한 뉴클레오티드로 치환된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이와 관련하여, 돌연변이, 추가, 결실, 및 치환을 포함하는 특정 변경이 기준 폴리뉴클레오티드에 만들어질 수 있고, 이에 의해 변경된 폴리뉴클레오티드가 기준 폴리뉴클레오티드의 생물학적 기능 또는 활성을 보유한다는 것이 당업계에서 잘 이해된다.
폴리뉴클레오티드 변이체는 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 단편 또는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 “폴리뉴클레오티드 단편”은 자연 발생 폴리뉴클레오티드 활성의 적어도 100%, 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 40%, 적어도 30%, 적어도 20%, 적어도 10%, 또는 적어도 5%를 보유하는 폴리펩티드 변이체를 암호화하는, 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700 또는 그 이상 길이의 뉴클레오티드인 폴리뉴클레오티드 단편을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드 단편은, 아미노-말단 결실, 카르복실-말단 결실, 및/또는 자연 발생 또는 재조합적으로 생성된 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산의 내부 결실 또는 치환을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
본원에서 사용되는, 예를 들어 “~에 50% 동일한 서열”을 포함하는 “서열 동일성”이란 용어는 비교 윈도우 상에서 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 기반 또는 아미노산-대-아미노산 기반으로 서열이 동일한 정도를 지칭한다. 따라서, “서열 동일성의 백분율”은 비교 윈도우 상에서 최적으로 정렬된 2개의 서열을 비교하고; 동일한 핵산 염기(예를 들어 A, T, C, G, I) 또는 동일한 아미노산 잔기(예를 들어, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, GLu, Asn, Gln, Cys, 및 Met)가 양 서열에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치하는 위치의 수를 얻고; 일치된 위치의 수를 비교 윈도우 내의 위치 총수(즉, 윈도우 크기)로 나누고; 그 결과에 100을 곱해서 서열 동일성의 백분율을 얻음으로써 계산될 수 있다. 일반적으로 폴리펩티드 변이체가 기준 폴리펩티드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지하는 경우, 본원에 기술된 임의의 기준 서열 중 어느 하나와 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 및 폴리펩티드가 포함된다.
2개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이의 서열 관계를 기술하는 데 사용되는 용어는 “기준 서열”, “비교 윈도우”, “서열 동일성”, “서열 동일성의 백분율”, 및 “실질적 동일성”을 포함한다. “기준 서열”은, 뉴클레오티드 및 아미노산 잔기를 포함하여, 적어도 12개의 단량체 단위의 길이이지만, 빈번하게는 15 내지 18개, 및 종종 적어도 25개의 단량체 단위의 길이이다. 2개의 폴리뉴클레오티드는 각각 (1) 2개의 폴리뉴클레오티드들 간에 유사한 서열(즉, 완전한 폴리뉴클레오티드 서열의 단지 일부), 및 (2) 2개의 폴리뉴클레오티드들 간에 발산되는 서열을 포함할 수 있기 때문에, 2개의 (또는 그 이상의) 폴리뉴클레오티드 간의 서열 비교는 일반적으로 “비교 윈도우” 상에서 2개의 폴리뉴클레오티드의 서열을 비교하고, 서열 유사성의 국소 영역을 식별함으로써 수행된다. “비교 윈도우”는 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 연속 위치에서 하나의 서열을 기준 서열과 비교하는 개념적 구간으로서, 적어도 6개의 연속 위치, 일반적으로는 약 50 내지 약 100개의 위치, 더 일반적으로는 약 100 내지 약 150개의 위치로 이루어진 개념적 구간을 지칭한다. 비교 윈도우는 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 기준 서열(추가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교해 약 20% 이하의 추가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교 윈도우를 정렬하기 위한 최적의 서열 정렬은, 컴퓨터화된 알고리즘 구현예(575 Science Drive Madison, WI, USA 소재 Genetics Computer Group의 Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0에 포함된 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의하거나, 선택된 다양한 방법 중 어느 하나에 의해 생성된 검사 및 최상의 정렬(즉, 비교 윈도우 상에서 가장 높은 상동성 백분율을 생성함)에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어 Altschul 등, 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389에 개시된 것과 같은 BLAST 계열 프로그램을 또한 참조할 수 있다. 서열 분석에 대한 상세한 논의는 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15의 Unit 19.3에서 확인할 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 배향을 기술하는 용어는 5’ (일반적으로 유리 인산염 기를 갖는 폴리뉴클레오티드의 말단) 및 3’ (일반적으로 유리 히드록실(OH)기를 갖는 폴리뉴클레오티드의 말단)을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 5’에서 3’ 배향 또는 3’에서 5’ 배향으로 주석이 달릴 수 있다. DNA 및 mRNA의 경우, 5’에서 3’ 방향으로의 가닥은 “센스”, “플러스” 또는 “암호화” 가닥으로 지정되는데, 이는 그 서열이 전령 RNA 전구체(pre-mRNA)의 서열과 동일하기 때문이다[DNA에서는 티민(T)인 대신에 RNA에서는 우라실(U)인 것은 제외함]. DNA 및 mRNA의 경우, RNA 중합효소에 의해 전사된 가닥인 상보성 3’에서 5’ 방향으로의 가닥은 “템플릿”, “안티센스”, “마이너스” 또는 “비코딩” 가닥으로 지정된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “역방향”은 3’에서 5’ 방향으로 작성된 5’에서 3’ 방향의 서열, 또는 5’에서 3’ 방향으로 작성된 3’에서 5’ 방향의 서열을 지칭한다.
또한, 당업자는 유전자 코드 축퇴의 결과로서, 본원에 기술된 것과 같이, 폴리펩티드 또는 이의 변이체의 단편을 암호화할 수 있는 많은 뉴클레오티드 서열이 존재한다는 것을 이해할 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드 중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오티드 서열과 최소한의 상동성을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용의 차이로 인해 달라지는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 인간 및/또는 영장류 코돈 선택에 최적화된 폴리뉴클레오티드가 특정 구현예에서 구체적으로 고려된다. 또한, 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자도 사용될 수 있다. 대립유전자는 뉴클레오티드의 결실, 추가, 및/또는 치환과 같은 하나 이상의 돌연변이의 결과로 변경된 내인성 유전자이다.
본원에서 사용되는 용어 “핵산 카세트” 또는 “발현 카세트”는 RNA에 이어서 폴리펩티드를 발현할 수 있는 벡터 내의 유전자 서열을 지칭한다. 일 실시예에서, 핵산 카세트는 관심 유전자(들), 예를 들어, 관심 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 또 다른 실시예에서, 핵산 카세트는 하나 이상의 발현 조절 서열, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 폴리(A) 서열, 및 관심 유전자, 예를 들어, 관심 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 벡터는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 또는 그 이상의 핵산 카세트를 포함할 수 있다. 핵산 카세트는, 카세트 내의 핵산이 RNA로 전사될 수 있고, 필요에 따라, 단백질 또는 폴리펩티드로 번역될 수 있고, 형질변환된 세포에서의 활성에 필요한 적절한 번역 후 변형을 거칠 수 있고, 적절한 세포내 구획을 표적화함으로써 생물학적 활성 또는 세포외 구획으로의 분비에 적합한 구획에 전좌될 수 있도록 벡터 내에서 위치적으로 및 순차적으로 배향된다. 바람직하게는, 카세트는 벡터 내로 용이하게 삽입할 수 있도록 구성된 3’ 및 5’ 말단을 가지며, 예를 들어, 각 말단에서 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 핵산 카세트는 TCR의 하나 이상의 사슬을 암호화한다. 카세트는 제거될 수 있고, 단일 단위로서 플라스미드 또는 바이러스 벡터 내에 삽입될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 관심 폴리뉴클레오티드(들)를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 “관심 폴리뉴클레오티드”는 폴리펩티드, 폴리펩티드 변이체, 또는 융합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 벡터는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 관심 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 관심 폴리뉴클레오티드는 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에 치료적 효과를 제공하는 폴리펩티드를 암호화한다. 관심 폴리뉴클레오티드, 및 이로부터 암호화된 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 이의 기능적 변이체 및 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 기능적 변이체는 상응하는 야생형 기준 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는다. 소정의 구현예에서, 기능적 변이체 또는 단편은 상응하는 야생형 폴리펩티드의 생물학적 활성의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%를 갖는다.
본원에서 고려되는 폴리뉴클레오티드는, 코딩 서열 자체의 길이에 상관없이 다른 DNA 서열, 예를 들어, 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같은 또는 당업계에 알려진 것과 같은, 프로모터 및/또는 인핸서, 미번역 영역(UTR), 신호 서열, 코작 서열, 폴리아데닐화 신호, 추가 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 재조합 효소 인식 부위(예를 들어, LoxP, FRT, 및 Att 부위), 종결 코돈, 전사 종결 신호, 및 자가 절단 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 에피토프 태그와 조합될 수 있으므로, 이들의 전체 길이는 상당히 달라질 수 있다. 따라서, 거의 모든 길이의 폴리뉴클레오티드 단편이 특정 구현예에서 사용될 수 있고, 전체 길이는 바람직하게는 제조의 용이성 및 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서의 사용의 용이성에 의해 제한될 수 있는 것으로 고려된다.
폴리뉴클레오티드는, 당업계에 공지되어 있고 이용 가능한 잘 확립된 다양한 기술 중 어느 하나를 사용하여 제조, 조작 및/또는 발현될 수 있다. 원하는 폴리펩티드를 발현시키기 위해, 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 아래에서 추가로 논의되는 바와 같이 적절한 벡터 내에 삽입될 수 있다.
벡터의 예시적인 실시예는 플라스미드, 자율 복제 서열, 및 전이 요소, 예를 들어, piggyBac, Sleeping Beauty, Mos1, Tc1/mariner, Tol2, mini-Tol2, Tc3, MuA, Himar I, Frog Prince, 및 이의 유도체를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
추가적인 벡터의 예시적인 실시예는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체(예컨대 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC), 또는 P1-유래의 인공 염색체(PAC)), 박테리오파지(예컨대 람다 파지 또는 M13 파지), 및 동물 바이러스를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
벡터로서 유용한 바이러스의 예시적인 예는 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어, 단순 포진 바이러스), 수두바이러스, 바큘로바이러스, 유두종바이러스, 및 파포바바이러스(예를 들어, SV40)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
발현 벡터의 예시적인 예는 포유류 세포에서의 발현을 위한 pClneo 벡터(Promega); 포유류 세포에서의 렌티바이러스 매개 유전자 전달 및 발현을 위한 pLenti4/V5-DESTTM, pLenti6/V5-DESTTM, 및 pLenti6.2/V5-GW/lacZ(Invitrogen)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 폴리펩티드의 코딩 서열은 포유류 세포에서 폴리펩티드의 발현을 위해 이러한 발현 벡터에 결합될 수 있다.
특정 구현예에서, 벡터는 에피솜 벡터 또는 염색체외에서 유지되는 벡터이다. 본원에서 사용되는 용어 “에피솜”은 숙주의 염색체 DNA로의 통합 없이 복제할 수 있고, 분열하는 숙주 세포로부터 점진적으로 소실되지 않고 복제할 수 있는 벡터를 지칭하며, 벡터가 염색체외에서 또는 에피솜에서 복제한다는 것을 또한 의미한다.
발현 벡터에 존재하는 “조절 요소” 또는 “조절 서열”은 벡터의 비번역 영역이며 - 복제의 기원, 선택 카세트, 프로모터, 인핸서, 번역 개시 신호(Shine Dalgarno 서열 또는 코작 서열) 인트론, 폴리아데닐화 서열, 5’ 및 3’ 미번역 영역 - 이들 모두는 숙주 세포 단백질과 상호 작용하여 전사 및 번역을 수행한다. 이러한 요소는 강도 및 특이성에 있어서 다를 수 있다. 사용된 벡터 시스템 및 숙주에 따라, 유비쿼터스 프로모터 및 유도성 프로모터를 포함하는 임의의 수의 적절한 전사 및 번역 요소가 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 벡터는 발현 벡터 및 바이러스 벡터를 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 프로모터 및/또는 인핸서와 같은 외인성, 내인성 또는 이종 조절 서열을 포함할 것이다. “내인성 조절 서열”은 게놈 내의 주어진 유전자와 자연적으로 연결되는 서열이다. “외인성” 조절 서열은 유전자의 전사가 연결된 인핸서/프로모터에 의해 유도되도록 유전자 조작(즉, 분자 생물학적 기술)에 의해 해당 유전자와 나란히 배치되는 서열이다. “이종성” 조절 서열은 유전적으로 조작되는 세포와 상이한 종으로부터 유래된 외인성 서열이다.
본원에서 사용되는 용어 “프로모터”는 RNA 중합효소가 결합하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)의 인식 부위를 지칭한다. RNA 중합효소는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 개시하고 전사한다. 특정 구현예에서, 포유류 세포에서 작동하는 프로모터는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기만큼 상류에 위치한 AT-풍부 영역 및/또는 전사 시작 영역으로부터 70 내지 80개의 염기만큼 상류에 위치한 CNCAAT 영역(여기에서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있음)서 발견되는 또 다른 서열을 포함한다.
용어 “인핸서”는 전사를 강화할 수 있는 서열을 함유하는 DNA의 분절을 지칭하며, 이는 일부 경우에는 다른 조절 서열에 대한 배향과는 독립적으로 작용할 수 있다. 인핸서는 프로모터 및/또는 다른 인핸서 요소와 협력적으로 또는 부가적으로 작용할 수 있다. 용어 “프로모터/인핸서”는 프로모터 기능과 인핸서 기능 둘 모두를 제공할 수 있는 서열을 함유하는 DNA의 분절을 지칭한다.
용어 “작동 가능하게 연결된”은 기술된 성분이 의도된 방식으로 기능할 수 있게 하는 관계에 있는 병치 상태를 지칭한다. 일 실시예에서, 전술한 용어는 핵산 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서)과 제2 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 관심 폴리뉴클레오티드) 간의 기능적 연결을 지칭하며, 여기에서 발현 조절 서열은 제2 서열에 상응하는 핵산의 전사를 유도한다.
본원에서 사용되는 용어 “구성적 발현 조절 서열”은 작동 가능하게 연결된 서열의 전사를 계속하여 또는 연속적으로 가능하게 하는 프로모터, 인핸서, 또는 프로모터/인핸서를 지칭한다. 구성적 발현 조절 서열은, 매우 다양한 세포 및 조직 유형에서 발현을 가능하게 하는 “유비쿼터스” 프로모터, 인핸서, 또는 프로모터/인핸서이거나, 제한된 범위의 세포 및 조직 유형 각각에서 발현을 가능하게 하는 “세포 특이적”, “세포 유형 특이적”, “세포 계통 특이적”, 또는 “조직 특이적” 프로모터, 인핸서, 또는 프로모터/인핸서일 수 있다.
특정 구현예에서 사용하기에 적합한 예시적인 유비쿼터스 발현 조절 서열은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 사이토메갈로바이러스(CMV) 전초기 프로모터, 바이러스 유인원 바이러스 40 (SV40)(예를 들어, 조기 또는 후기), 물로니 쥣과 백혈병 바이러스(MoMLV) LTR 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR, 단순 포진 바이러스(HSV)(티미딘 키나아제) 프로모터, 우두 바이러스에서 유래된 H5, P7.5, 및 P11 프로모터, 신장 인자 1-알파(EF1a) 프로모터, 조기 성장 반응 1(EGR1), 페리틴 H (FerH), 페리틴 L (FerL), 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH), 진핵생물 번역 개시 인자 4A1(EIF4A1), 열충격 70kDa 단백질 5(HSPA5), 열충격 단백질 90kDa 베타 구성원 1(HSP90B1), 열충격 단백질 70kDa(HSP70), β-키네신(β-KIN), 인간 ROSA 26 유전자좌(Irions 등, Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482 (2007)), 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 포스포글리세레이트 키나아제-1(PGK) 프로모터, 거대세포바이러스 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터, β-액틴 프로모터 및 골수 증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 대조군 영역이 결실되고 dl587rev 프라이머 결합 부위가 치환된(MND) U3 프로모터(Haas 등, Journal of Virology. 2003;77(17): 9439-9450).
일 구현예에서, 벡터는 MNDU3 프로모터를 포함한다.
일 구현예에서, 벡터는 인간 EF1a 유전자의 제1 인트론을 포함하는 EF1a 프로모터를 포함한다.
일 구현예에서, 벡터는 인간 EF1a 유전자의 제1 인트론이 결여된 EF1a 프로모터를 포함한다.
특정 구현예에서, T 세포 특이적 프로모터로부터 조작된 TCR을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 것이 바람직할 수 있다.
본원에서 사용되는 “조건부 발현”은 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 유형의 조건부 발현을 지칭할 수 있다: 유도성 발현; 억제 가능한 발현; 특정 생리학적, 생물학적 또는 질병 상태 등을 갖는 세포 또는 조직에서의 발현. 이러한 정의는 세포 유형 또는 조직 특이적 발현을 배제하도록 의도되지 않는다. 특정 실시예는 관심 폴리뉴클레오티드의 조건부 발현을 제공하는데,예를 들어 발현은 세포, 조직, 유기체 등을 대상으로, 폴리뉴클레오티드의 발현을 유발하거나, 관심 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리뉴클레오티드의 발현의 증가 또는 감소를 유발하는 치료를 수행하거나 조건을 거치게 함으로써 조절된다.
유도성 프로모터/시스템의 예시적인 예는 스테로이드-유도성 프로모터, 예컨대 글루코코르티코이드 또는 에스트로겐 수용체를 암호화하는 유전자에 대한 프로모터(해당 호르몬으로 치료함으로써 유도 가능함), 메탈로티오닌 프로모터(다양한 중금속으로 치료함으로써 유도 가능함), MX-1 프로모터(인터페론에 의해 유도 가능함), “GeneSwitch” 미페프리스톤-조절 가능 시스템(Sirin 등, 2003, Gene, 323: 67), 큐민산염 유도성 유전자 스위치(WO2002/088346), 테트라시클린 의존성 조절 시스템 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
조건부 발현은 또한 부위 특이적 DNA 재조합효소를 사용함으로써 달성될 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 벡터는 부위 특이적 재조합효소에 의해 매개되는 재조합을 위한 적어도 하나의 (통상적으로 2개의) 부위(들)를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 “재조합효소” 또는 “부위 특이적 재조합효소”는 하나 이상의 재조합 부위(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 12, 15, 20, 30, 50개 등)와 관련된 재조합 반응에 관여하는 절제 또는 통합 단백질, 효소, 보조인자 또는 연관 단백질을 포함하며, 이는 야생형 단백질(Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993) 참조), 또는 이의 돌연변이체, 유도체(예를 들어, 재조합 단백질 서열 또는 이의 단편을 함유하는 융합 단백질), 단편 및 변이체일 수 있다. 특정 구현예에서 사용하기에 적합한 재조합효소의 예시적인 예는 Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, ΦC31, Cin, Tn3 분해제, TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1, 및 ParA를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
벡터는 매우 다양한 부위 특이적 재조합효소 중 어느 하나에 대한 하나 이상의 재조합 부위를 포함할 수 있다. 부위 특이적 재조합효소에 대한 표적 부위는 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터의 통합에 필요한 임의의 부위(들)에 추가된다는 것을 이해해야 한다. 본원에서 사용되는 용어 “재조합 서열”, “재조합 부위” 또는 “부위 특이적 재조합 부위”는 재조합효소가 인식하고 결합하는 특정 핵산 서열을 지칭한다.
예를 들어, Cre 재조합효소에 대한 하나의 재조합 부위는 8 염기쌍 코어 서열의 측면에 위치하는 (재조합효소 결합 부위로서 역할을 하는) 2개의 13 염기쌍 역위 반복을 포함하는 34 염기쌍 서열인 loxP이다(Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5:521-527 (1994)의 도 1 참조). 다른 예시적인 loxP 부위는 lox511(Hooess 등, 1996; Bethke and Sauer, 1997), lox5171(Lee 및 Saito, 1998), lox2272(Lee 및 Saito, 1998), m2(Langer 등, 2002), lox71(Albert 등, 1995), 및 lox66(Albert 등, 1995)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
FLP 재조합효소에 대한 적절한 인식 부위는 FRT(McLeod 등, 1996), F1, F2, F3(Schlake 및 Bode, 1994), F4, F5(Schlake 및 Bode, 1994), FRT(LE)(Senecoff 등, 1988), FRT(RE)(Senec 등, 1988)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
인식 서열의 다른 예는 attB, attP, attL, 및 attR 서열이며, 이는 재조합효소 효소 λ 통합효소(integrase), 예를 들어, phi-c31에 의해 인식된다. φC31 SSR은 단지 이종형 부위 attB(길이 34 bp)와 attP(아포시 길이 39 bp) 사이에서의 재조합만을 매개한다(Groth 등,2000). 박테리아 및 파지 게놈 상의 파지 통합효소에 대한 부착 부위에 대해 각각 명명된 attB 및 attP는, 둘 모두 각각 φC31 아포지다이머에 의해 결합될 가능성이 있는 불완전한 역위 반복을 함유한다(Groth 등, 2000). 생성물 부위, attL 및 attR은 추가 φC31-매개 재조합에 대해 효과적으로 불활성이어서(Belteki 등, 2003), 반응을 비가역적으로 만든다. 삽입을 촉매하기 위해, attB 보유 DNA가 게놈 attP 부위 내로 삽입되는 것이 attP 부위가 게놈 attB 부위 내로 삽입되는 것보다 보다 용이하다는 것이 밝혀졌다(Thyagarajan 등, 2001; Belteki 등, 2003). 따라서, 전형적인 전략은 attP-함유 “도킹 부위”를 정의된 유전자좌 내에 상동성 재조합으로 위치시키고, 이어서 삽입을 위해 이를 attB-함유 유입 서열과 파트너화하는 것이다.
본원에서 사용되는 “내부 리보솜 진입 부위” 또는 “IRES”는, 시스트론(단백질 암호화 영역)의 ATG와 같은 개시 코돈에 대한 직접적인 내부 리보솜 진입을 촉진하여 유전자의 캡-독립적 번역을 유도하는 요소를 지칭한다. 예를 들어, Jackson 등, 1990. Trends Biochem Sci 15(12):477-83) 및 Jackson 및 Kaminski. 1995. RNA 1(10):985-1000을 참조한다. 특정 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 복수의 폴리펩티드 각각의 효율적인 번역을 달성하기 위해, 폴리뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 IRES 서열 또는 자가 절단 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 분리될 수 있다. 일 구현예에서, 본원에서 고려되는 폴리뉴클레오티드에 사용되는 IRES는 EMCV IRES이다.
본원에서 사용되는 용어 “코작(Kozak) 서열”은 리보솜의 작은 서브유닛에 대한 mRNA의 초기 결합을 상당히 용이하게 하고 번역을 증가시키는 짧은 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 공통 코작 서열은 (GCC)RCCATGG(서열번호 139)이고, 여기에서 R은 퓨린(A 또는 G)이다(Kozak, 1986. Cell. 44(2):283-92 및 Kozak, 1987. Nucleic Acids Res. 15(20):8125-48). 특정 구현예에서, 벡터는 공통 코작 서열을 가지며 원하는 폴리펩티드, 예를 들어 TCR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
이종 핵산 전사체의 효율적인 종결 및 폴리아데닐화를 유도하는 요소는 이종 유전자 발현을 증가시킨다. 전사 종결 신호는 대체로 폴리아데닐화 신호의 하류에서 확인된다. 특정 구현예에서, 벡터는 발현될 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 폴리아데닐화 서열 3′을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 “폴리A 부위” 또는 “폴리A 서열”은 RNA 중합효소 II에 의한 초기 RNA 전사의 종결 및 폴리아데닐화 모두를 유도하는 DNA 서열을 지칭한다. 폴리아데닐화 서열은 코딩 서열의 3’ 말단에 폴리A 꼬리를 첨가함으로써 mRNA 안정성을 촉진할 수 있으므로, 번역 효율의 증가에 기여한다. 절단과 폴리아데닐화는 RNA 내의 폴리(A) 서열에 의해 유도된다. 포유류 mRNA 전구체에 대한 코어 폴리(A) 서열은 절단-폴리아데닐화 부위의 측면에 위치하는 2개의 인식 요소를 갖는다. 일반적으로, 거의 불변인 AAUAAA 육량체가 U 또는 GU 잔기가 풍부한 보다 가변적인 요소로부터 상류로 20 내지 50개의 뉴클레오티드 위치에 놓인다. 초기 전사체의 절단은 이들 두 요소 사이에서 일어나고, 5’ 절단 산물에 추가된 최대 250개의 아데노신에 결합된다. 특정 구현예에서, 코어 폴리(A) 서열은 이상적인 폴리A 서열이다(예를 들어, AATAAA, ATTAAA, AGTAAA). 특정 구현예에서, 폴리(A) 서열은 SV40 폴리A 서열, 소 성장 호르몬 폴리A 서열(BGHpA), 토끼 β-글로빈 폴리A 서열(rβgpA), 이들의 변이체, 또는 당업계에 공지된 다른 적절한 이종 또는 내인성 폴리A 서열이다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 보유하는 세포는 자살 유전자(유도성 자살 유전자 포함)를 사용해 직접 독성 및/또는 조절되지 않은 증식의 위험을 감소시킨다. 특정 양태에서, 자살 유전자는 폴리뉴클레오티드 또는 세포를 보유하는 숙주에 대해 면역원성이 아니다. 사용할 수 있는 자살 유전자의 특정 실시예는 카스파아제-9 또는 카스파아제-8 또는 시토신 탈아미노효소이다. 카스파제-9는 이량체화의 특정 화학 유도제(CID)를 사용해 활성화할 수 있다.
일부 구현예에서, TCR을 암호화하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리시스트론 폴리뉴클레오티드가 본원에서 고려된다. 특정 구현예에서, TCRα 폴리펩티드/사슬 및 TCRβ 폴리펩티드/사슬을 포함하는 TCR을 암호화하는 폴리시스트론 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, TCRγ 폴리펩티드/사슬 및 TCRδ 폴리펩티드/사슬을 포함하는 TCR을 암호화하는 폴리시스트론 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입된다.
특정 구현예에서, 폴리시스트론 폴리뉴클레오티드는 TCRβ 폴리펩티드/사슬에 대한 TCRα 폴리펩티드/사슬 5’를 포함한다. 다른 구현예에서, 폴리시스트론 폴리뉴클레오티드는 TCRα 폴리펩티드/사슬에 대한 TCRβ 폴리펩티드/사슬 5’를 포함한다. 다른 구현예에서, 폴리시스트론 폴리뉴클레오티드는 TCRγ 폴리펩티드/사슬에 대한 TCRδ 폴리펩티드/사슬 5’를 포함한다. 다른 구현예에서, 폴리시스트론 폴리뉴클레오티드는 TCRδ 폴리펩티드/사슬에 대한 TCRγ 폴리펩티드/사슬 5’를 포함한다.
G. 벡터
특정 구현예에서, TCRα 폴리펩티드/사슬 및 TCRβ 폴리펩티드/사슬을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 비-바이러스 또는 바이러스 벡터에 의해 세포(예를 들어, 면역 효과기 세포) 내로 도입된다.
용어 “벡터”는 또 다른 핵산 분자를 전달 또는 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하도록 본원에서 사용된다. 전달된 핵산은 일반적으로 벡터 핵산 분자에 연결, 예를 들어, 벡터 핵산 분자에 삽입된다. 벡터는 세포에서 자율 복제를 유도하는 서열을 포함하거나, 숙주 세포 DNA로의 통합을 허용하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 비-바이러스 벡터는 본원에서 고려되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 T 세포에 전달하는 데 사용된다.
비-바이러스 벡터의 예시적인 실시예는 mRNA, 플라스미드(예를 들어, DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드), 트랜스포존, 코스미드, 및 박테리아 인공 염색체를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 다른 비-바이러스 벡터가 위에서 논의된다.
특정 구현예에서 고려되는 폴리뉴클레오티드의 비바이러스 전달의 예시적인 방법은: 전기천공, 초음파 처리, 리포펙션, 미세주입, 바이오리스틱스(biolistics), 비로좀(virosome), 리포좀, 면역리포좀, 나노입자, 폴리양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, DEAE-덱스트란 매개 전달, 유전자총, 및 열-충격을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서 고려되는 특정 구현예에서 사용하기에 적합한 비바이러스성/폴리뉴클레오티드 전달 시스템의 예시적인 예는 Amaxa Biosystems, Maxcyte, Inc., BTX Molecular Delivery Systems, 및 Copernicus Therapeutics Inc.에 의해 제공된 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 리포펙션 시약은 상업적으로 판매된다(예를 들어, Transfectam™ 및 Lipofectin™). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체 인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, Liu 등 (2003) Gene Therapy. 10:180-187; 및 Balazs 등 (2011) Journal of Drug Delivery. 2011:1-12를 참조한다. 항체-표적화, 박테리아에 의해 유래된, 비생체 나노세포-기반 전달이 또한 특정 구현예에서 고려된다.
다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 원하는 폴리펩티드를 일시적으로 발현시키기 위해 세포 내로 도입되는 mRNA이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, “일시적”은 비-통합된 이식유전자가 몇 시간, 몇 일, 또는 몇 주 동안 발현되는 것을 지칭하며, 여기서 발현 기간은 폴리뉴클레오티드가 게놈 내에 통합되거나 세포 내의 안정한 플라스미드 레플리콘 내에 함유된 경우에 이의 발현 기간보다 짧다.
특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 본원에서 고려되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 T 세포에 전달하는 데 사용된다.
특정 구현예에서 고려되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는, 후술하는 바와 같이, 일반적으로 전신 투여(예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 또는 두개내 주입) 또는 국소 도포에 의해 개별 환자에게 투여함으로써 생체 내에서 전달될 수 있다. 대안적으로, 벡터는 개별 환자로부터 외식된 세포(예를 들어, 가동화된 말초 혈액, 림프구, 골수 흡인, 조직 생검 등) 또는 범용 공여자 조혈 줄기 세포와 같은 세포에 생체 외에서 전달될 수 있고, 이어서 해당 세포를 환자에게 재이식할 수 있다.
일 실시예에서, 뉴클레아제 변이체 및/또는 공여자 복구 템플릿을 포함하는 바이러스 벡터는 생체 내에서 세포의 형질도입을 위해 유기체에 직접 투여된다. 대안적으로, 네이키드 DNA가 투여될 수 있다. 투여는 분자를 도입하여 혈액 또는 조직 세포와 궁극적인 접촉시키는 데 일반적으로 사용되는 경로 중 어느 하나에 의해 이루어지며, 이는 주사, 주입, 국소 도포, 및 전기천공을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 핵산을 투여하는 적절한 방법이 이용 가능하고 당 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있으며, 하나 이상의 경로가 특정 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있지만, 특정 경로는 종종 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
특정 구현예에서 고려되는 특정 구현예에서 사용하기에 적합한 바이러스 벡터 시스템의 예시적인 예는 아데노-연관 바이러스(AAV), 레트로바이러스, 단순 포진 바이러스, 아데노바이러스, 및 우두 바이러스 벡터를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, TCRα 폴리펩티드/사슬 및 TCRβ 폴리펩티드/사슬을 포함하는 TCR을 암호화하는 폴리시스트론 폴리뉴클레오티드는 비-바이러스 또는 바이러스 벡터에 의해 세포 내로 도입된다. 특정 구현예에서, 폴리시스트론 폴리뉴클레오티드는 TCRβ 폴리펩티드/사슬에 대한 TCRα 폴리펩티드/사슬 5’을 포함한다. 다른 구현예에서, 폴리시스트론 폴리뉴클레오티드는 TCRα 폴리펩티드/사슬의 5’에 TCRβ 폴리펩티드/사슬을 포함한다.
특정 구현예에서, TCRα 폴리펩티드/사슬 및 TCRβ 폴리펩티드/사슬을 포함하는 TCR을 암호화하는 폴리시스트론 폴리뉴클레오티드는 비바이러스 또는 바이러스 벡터에 의해 세포 내로 도입된다. 특정 구현예에서, TCRγ 폴리펩티드/사슬 및 TCRδ 폴리펩티드/사슬을 포함하는 TCR을 암호화하는 폴리시스트론 폴리뉴클레오티드는 비바이러스 또는 바이러스 벡터에 의해 세포 내로 도입된다.
다른 구현예에서, 폴리시스트론 폴리뉴클레오티드는 TCRβ 폴리펩티드/사슬의 5’에 TCRα 폴리펩티드/사슬을 포함한다. 다른 구현예에서, 폴리시스트론 폴리뉴클레오티드는 TCRα 폴리펩티드/사슬의 5’에 TCRβ 폴리펩티드/사슬을 포함한다. 다른 구현예에서, 폴리시스트론 폴리뉴클레오티드는 TCRδ 폴리펩티드/사슬에 대한 TCRδ 폴리펩티드/사슬 5’를 포함한다. 다른 구현예에서, 폴리시스트론 폴리뉴클레오티드는 TCRδ 폴리펩티드/사슬의 5'에 TCRγ 폴리펩티드/사슬을 포함한다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)로 세포를 형질도입함으로써 면역 효과기 세포, 예를 들어 T 세포 내로 도입된다.
AAV는 작은 (약 26 nm) 복제 결함성, 주로 에피솜성, 외피가 없는 바이러스이다. AAV는 분열 세포 및 비분열 세포 모두를 감염시킬 수 있고, 스스로의 게놈을 숙주 세포의 게놈에 혼입시킬 수 있다. 재조합 AAV(rAAV)는 일반적으로 최소한 이식 유전자 및 이의 조절 서열, 및 5’ 및 3’ AAV 역위 말단 반복체(ITR)로 구성된다. ITR 서열은 길이가 약 145 bp이다. 특정 구현예에서, rAAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, 또는 AAV10으로부터 단리된 ITR 서열 및 캡시드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 rAAV가 사용되며, ITR 서열은 하나의 AAV 혈청형으로부터 단리되고 캡시드 서열은 상이한 AAV 혈청형으로부터 단리된다. 예를 들어, AAV2 유래의 ITR 서열 및 AAV6 유래의 캡시드 서열을 갖는 rAAV는 AAV2/AAV6로서 지칭된다. 특정 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV2로부터 유래된 ITR, 및 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, 또는 AAV10 중 어느 하나로부터 단리된 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, rAAV는 AAV2로부터 유래된 ITR 서열 및 AAV6으로부터 유래된 캡시드 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, rAAV는 AAV2로부터 유래된 ITR 서열 및 AAV2로부터 유래된 캡시드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 조작 및 선택 방법을 AAV 캡시드에 적용하여 이들이 관심 세포를 형질도입할 가능성을 높일 수 있다.
rAAV 벡터의 구성, 생산 및 정제는 미국 특허 제9,169,494호; 9,169,492; 9,012,224; 8,889,641; 8,809,058; 및 8,784,799호에 공개되어 있으며, 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스로 세포를 형질도입함으로써, 면역 효과기 세포, 예를 들어 T 세포 내로 도입된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “레트로바이러스”는 그의 게놈 RNA를 선형 이중-가닥 DNA 사본으로 역전사시키고, 이어서 그의 게놈 DNA를 숙주 게놈 내로 공유적으로 통합시키는 RNA 바이러스를 지칭한다. 특정 구현예에 사용하기에 적합한 예시적인 레트로바이러스는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스(M-MuLV), 몰로니 쥣과 육종 바이러스(MoMSV), 하비 쥣과 육종 바이러스(HaMuSV), 쥣과 유방 종양 바이러스(MuMTV), 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스(GaLV), 고양이과 백혈병 바이러스(FLV), 스푸마바이러스, 프렌드 쥣과 백혈병 바이러스, 쥣과 줄기 세포 바이러스(MSCV), 및 라우스 육종 바이러스(RSV), 및 렌티바이러스.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “렌티바이러스”는 복잡한 레트로바이러스로 이루어진 군(또는 속)을 지칭한다. 예시적인 렌티바이러스는 HIV(인간 면역결핍 바이러스; HIV 1형, 및 HIV 2형 포함); visna-maedi 바이러스(VMV) 바이러스; 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV); 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV); 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소 면역 결핍 바이러스(BIV); 및 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV). 일 구현예에서, HIV 기반 벡터 골격(즉, HIV 시스-작용 서열 요소)이 바람직하다.
다양한 구현예에서, 본원에서 고려되는 렌티바이러스 벡터는 하나 이상의 LTR, 및 다음의 부속 요소 중 하나 이상 또는 전부를 포함하며: cPPT/FLAP, 싸이 (ψ) 패키징 신호, 내보내기 요소, 폴리(A) 서열, 임의로 본원의 다른 곳에서 논의된 것과 같은 WPRE 또는 HPRE, 절연체 요소, 선택성 마커, 및 세포 자살 유전자를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 렌티바이러스 벡터는 통합성 또는 비통합성 또는 통합 결함 렌티바이러스일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “통합 결함 렌티바이러스” 또는 “IDLV”는 바이러스 게놈을 숙주 세포의 게놈에 통합하는 능력이 결여된 통합효소를 갖는 렌티바이러스를 지칭한다. 통합 불능 바이러스 벡터는 특허 출원 WO2006/010834에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
인테그라제 활성을 감소시키는 데 적합한 HIV-1 pol 유전자의 예시적인 돌연변이에는 다음이 포함되지만 이에 제한되지 않는다: H12N, H12C, H16C, H16V, S81 R, D41A, K42A, H51A, Q53C, D55V, D64E, D64V, E69A, K71A, E85A, E87A, D116N, D1161, D116A, N120G, N1201, N120E, E152G, E152A, D35E, K156E, K156A, E157A, K159E, K159A, K160A, R166A, D167A, E170A, H171A, K173A, K186Q, K186T, K188T, E198A, R199c, R199T, R199A, D202A, K211A, Q214L, Q216L, Q221 L, W235F, W235E, K236S, K236A, K246A, G247W, D253A, R262A, R263A, 및 K264H.
일 구현예에서, HIV-1 통합효소 결핍 폴 유전자는 D64V, D116I, D116A, E152G, 또한 E152A 돌연변이; D64V, D116I, 및 E152G 돌연변이; 또는 D64V, D116A, 및 E152A 돌연변이를 포함한다.
일 구현예에서, HIV-1 통합효소 결핍 폴 유전자는 D64V 돌연변이를 포함한다.
용어 “긴 말단 반복체(long terminal repeat, LTR)”는 레트로바이러스 DNA의 말단에 위치한 염기쌍의 도메인을 지칭하며, 이들은, 이들의 자연 서열의 맥락에서, 직접 반복체이며 U3, R, 및 U5 영역을 함유한다.
본원에서 사용되는 용어 “FLAP 요소” 또는 “cPPT/FLAP”는 레트로바이러스, 예를 들어, HIV-1 또는 HIV-2의 중앙 폴리퓨린 경로 및 중앙 종결 서열(cPPT 및 CTS)을 포함하는 서열을 갖는 핵산을 지칭한다. 적절한 FLAP 요소는 미국 특허 제6,682,907호 및 Zennou 등의 2000, Cell , 101:173에 기술되어 있다. 또 다른 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 cPPT 및/또는 CTS 요소에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 FLAP 요소를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 cPPT 또는 CTS 요소를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 cPPT 또는 CTS 요소를 포함하지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 “패키징 신호” 또는 “패키징 서열”은 레트로바이러스 게놈 내에 위치한 싸이[ψ] 서열을 지칭하며, 이는 바이러스 캡시드 또는 입자 내로 바이러스 RNA를 삽입하는 데 필요하다. 예를 들어, Clever 등, 1995. J. of Virology, Vol. 69, No. 4; pp. 2101-2109 참조.
용어 “내보내기 요소(export element)”는 세포의 핵으로부터 세포질로 RNA 전사물의 수송을 조절하는 시스-작용 전사 후 조절 요소를 지칭한다. RNA 내보내기 요소의 예는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) rev 반응 요소(RRE)(예를 들어, Cullen 등, 1991. J. Virol. 65: 1053; 및 Cullen 등, 1991. Cell 58: 423 참조), 및 B형 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(HPRE)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 바이러스 벡터에서 이종 서열의 발현은 전사 후 조절 요소, 효율적인 폴리아데닐화 부위, 및 임의로 전사 종결 신호를 벡터 내에 통합시킴으로써 증가된다. 다양한 전사후 조절 요소는 단백질에서 이종 핵산의 발현을 증가시킬 수 있는데, 예를 들어, 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE; Zufferey 등, 1999, J. Virol ., 73:2886); B형 간염 바이러스(HPRE)에 존재하는 전사후 조절 요소(Huang 등, Mol. 세포. Biol ., 5:3864); 등(Liu 등, 1995, Genes Dev ., 9:1766 참조).
렌티바이러스 벡터는 바람직하게는 LTR의 변형의 결과로서 몇 가지 안전성 강화 물질을 함유한다. “자가 불활성화(self-inactivation, SIN)” 벡터는, U3 영역으로서 알려진 우측(3’) LTR 인핸서-프로모터 영역이 1회의 바이러스 복제 이후의 과도한 바이러스 전사를 방지하기 위해 (예를 들어, 결실 또는 치환에 의해) 변형된 복제-결함 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 지칭한다. 자가 불활성화는 바람직하게는 벡터 DNA, 즉, 벡터 RNA를 생산하는 데 사용되는 DNA의 3’ LTR의 U3 영역에 결실을 도입함으로써 달성된다. 따라서, 역전사 동안, 이러한 결실은 프로바이러스 DNA의 5’ LTR로 전달된다. 특정 구현예에서, LTR의 전사 활성을 크게 감소시키거나 완전히 제거하기에 충분한 U3 서열을 제거하여, 형질도입된 세포에서 전장 벡터 RNA의 생산을 크게 감소시키거나 제거하는 것이 바람직하다. HIV 기반 렌티벡터의 경우, 이러한 벡터는 벡터 역가의 유의한 감소 없이 LTR TATA 박스의 제거(예를 들어, -418 내지 -18의 결실)를 포함하여, 유의한 U3 결실에 내성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
추가적인 안전성 강화는 5’ LTR의 U3 영역을 이종 프로모터로 치환함으로써 바이러스 입자를 생산하는 동안 바이러스 게놈의 전사를 유도함으로써 제공된다. 사용될 수 있는 이종 프로모터의 예는, 예를 들어, 바이러스 유인원 바이러스 40(SV40)(예를 들어, 조기 또는 후기), 사이토메갈로바이러스(CMV)(예를 들어, 전초기), 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스(MoMLV), 라우스 육종 바이러스(RSV), 및 단순 포진 바이러스(HSV)(티미딘 키나아제) 프로모터를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 “위형(pseudotype)” 또는 “위형화(pseudotyping)”은 바이러스 외피 단백질이 바람직한 특성을 갖는 또 다른 바이러스의 단백질과 치환된 바이러스를 지칭한다. 예를 들어, HIV는 수포성 구내염 바이러스 G-단백질(VSV-G) 외피 단백질로 위형화될 수 있는데, 이는 HIV 외피 단백질(env 유전자에 의해 암호화됨)이 CD4+ 제시 세포에 대해 바이러스를 정상적으로 표적화하기 때문에 HIV가 더 넓은 범위의 세포를 감염시킬 수 있게 한다.
특정 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 공지된 방법에 따라 생산된다. 예를 들어, Kutner 등, BMC Biotechnol. 2009;9:10. doi: 10.1186/1472-6750-9-10; Kutner 등 Nat. Protoc. 2009;4(4):495-505. doi: 10.1038/nprot.2009.22 참조.
본원에서 고려되는 특정 구현예에 따르면, 바이러스 벡터 골격 서열의 대부분 또는 전부는 렌티바이러스, 예를 들어, HIV-1 로부터 유래된다. 그러나, 레트로바이러스 및/또는 렌티바이러스 서열의 많은 상이한 공급원이 사용되거나 조합될 수 있고, 특정 렌티바이러스 서열에서의 수많은 치환 및 변경이 본원에 기술된 기능을 수행하는 전달 벡터의 능력을 손상시키지 않고도 수용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 또한, 다양한 렌티바이러스 벡터가 당업계에 공지되어 있으며, Naldini 등(1996a, 1996b, 및 1998); Zufferey 등, (1997); Dull 등, 1998, 미국 특허 제6,013,516호; 및 제5,994,136호에 기술되어 있으며, 이들 중 다수는 본원에서 고려되는 바이러스 벡터 또는 전달 플라스미드를 생산하도록 적응될 수 있다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스로 세포를 형질도입함으로써, 면역 효과기 세포 내로 도입된다.
아데노바이러스 기반 벡터는 많은 세포 유형에서 매우 높은 효율로 형질도입할 수 있으며, 세포 분열을 필요로 하지 않는다. 이러한 벡터로, 높은 역가 및 높은 수준의 발현이 수득되었다. 이러한 벡터는 비교적 간단한 시스템에서 대량으로 생산될 수 있다. 대부분의 아데노바이러스 벡터는 이식유전자가 Ad E1a, E1b 및/또는 E3 유전자를 대체하도록 조작되고; 후속하여, 복제 결함 벡터는 트랜스에서 결실된 유전자 기능을 공급하는 인간 293 세포에서 전파되는, 방법. Ad 벡터는 간, 신장, 및 근육에서 발견되는 것과 같은 비분열, 분화된 세포를 포함하여, 많은 유형의 조직을 생체내에서 형질도입할 수 있다. 종래의 Ad 벡터는 큰 담지 용량을 갖는다.
현재의 복제 결핍성 아데노바이러스 벡터의 생성 및 전파에는 293으로 지정된 고유 헬퍼 세포주가 사용될 수 있는데, 이는 Ad5 DNA 단편에 의해 인간 배아 신장 세포로부터 형질전환된 것으로서 E1 단백질을 구성적으로 발현한다(Graham 등, 1977). E3 영역은 아데노바이러스 게놈으로부터 분배될 수 있기 때문에(Jones & Shenk, 1978), 현재의 아데노바이러스 벡터는 293 세포의 도움을 받아 E1 영역, D3 영역, 또는 두 영역 모두에서 외래 DNA를 보유한다(Graham & Prevec, 1991). 아데노바이러스 벡터는 진핵생물 유전자 발현(Levrero 등, 1991; Gomez-Foix 등, 1992) 및 백신 개발(Grunhaus & Horwitz, 1992; Graham & Prevec, 1992)에 사용되어 왔다. 상이한 조직에 재조합 아데노바이러스를 투여하는 연구는 기관 점적주입(Rosenfeld 등, 1991; Rosenfeld 등, 1992), 근육 주사(Ragot 등, 1993), 말초 정맥 주사(Herz & Gerard, 1993) 및 뇌 내로의 정위 접종(Le Gal La Salle 등, 1993)을 포함한다. 임상시험에서 Ad 벡터를 사용하는 일례에는 근육내 주사에 의한 항종양 면역화를 위한 폴리뉴클레오티드 요법이 포함되었다(Sterman 등, Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)).
다양한 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단순 포진 바이러스(예를 들어, HSV-1, HSV-2)를 세포에 형질도입함으로써 면역 효과기 세포 내로 도입된다.
성숙한 HSV 비리온은 152 kb의 선형 이중 가닥 DNA 분자로 이루어진 바이러스 게놈을 가진 외피형 정이십면체 캡시드로 구성된다. 일 구현예에서, HSV 기반 바이러스 벡터는 하나 이상의 필수 또는 비필수 HSV 유전자가 결핍되어 있다. 일 구현예에서, HSV 기반 바이러스 벡터는 복제 결핍성이다. 대부분의 복제 결핍 HSV 벡터는 복제를 방지하기 위해 하나 이상의 중간-초기, 초기 또는 후기 HSV 유전자를 제거하기 위한 결실을 함유한다. 예를 들어, HSV 벡터는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 극초기 유전자가 결핍될 수 있다: ICP4, ICP22, ICP27, ICP47 및 이들의 조합 HSV 벡터의 장점은 DNA의 장기 발현을 초래할 수 있는 잠복 단계에 진입하는 능력 및 최대 25 kb의 외인성 DNA 삽입체를 수용할 수 있는 이의 큰 바이러스 DNA 게놈이다. HSV-기반 벡터는, 예를 들어, 미국 특허 제5,837,532호, 제5,846,782호, 및 제5,804,413호, 및 국제 특허 출원 WO 91/02788, WO 96/04394, WO 98/15637, 및 WO 99/06583에 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
H. 유전적으로 변형된 세포
다양한 구현예에서, 조작된 TCR을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포가 본원에서 고려된다. 일부 구현예에서, 본원에서 고려되는 바와 같은 조작된 TCR을 발현하도록 유전적으로 변형된 면역 효과기 세포는 암의 치료를 위한 의약의 제조 또는 제조에 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “유전자 조작(genetically engineered)” 또는 “유전자 변형(genetically modified)”은 DNA 또는 RNA 형태의 추가 유전 물질을 세포 내의 총 유전 물질에 첨가하는 것을 지칭한다. 용어 “유전자 변형 세포”, “변형된 세포”, 및 “재유도된 세포”는 상호 교환적으로 사용된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “유전자 요법”은 유전자의 발현의 복구, 보정, 또는 변형, 또는 조작된 TCR과 같은 치료 폴리펩티드의 발현을 목적으로, DNA 또는 RNA 형태의 추가 유전 물질을 세포 내 총 유전 물질 내로 도입하는 것을 지칭한다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 조작된 TCR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 본원에서 고려되는 조작된 TCR을 발현함으로써 면역 효과기 세포 내로 도입되고, 면역 효과기 세포를 표적 항원을 발현하는 표적 세포로 재유도한다. “면역 효과기 세포”는 면역계의 임의의 세포로서, 하나 이상의 효과기 기능(예를 들어, 세포독성 세포 사멸 활성, 사이토카인 분비, ADCC 및/또는 CDC의 유도)을 갖는다. 본원에서 고려되는 예시적인 면역 효과기 세포는, 세포독성 T 세포(CTL; CD8+ T 세포), TIL, 및 헬퍼 T 세포(HTL; CD4+ T 세포)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 T 림프구이다. 특정 구현예에서, 세포는 αβ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포는 αβ TCR을 발현하도록 변형된 γδ T 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 면역 효과기 세포는 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 면역 효과기 세포는 자연 살해 T(NKT) 세포를 포함한다.
면역 효과기 세포는 자가조직성/자가유발성(“자기(self)”) 또는 비자가조직성(“비-자기(non-self)”, 예를 들어, 동종, 동계, 또는 이종)일 수 있다. 본원에서 사용되는 “자가조직성”는 동일한 대상체 유래의 세포를 지칭한다. 본원에서 사용되는 “동종”은 비교 대상 세포와 유전적으로 상이한 동일한 종의 세포를 지칭한다. 본원에서 사용되는 “동계”는 비교 대상 세포와 유전적으로 동일한 상이한 대상체의 세포를 지칭한다. 본원에서 사용되는 “이종”은 비교 대상 세포와 상이한 종의 세포를 지칭한다. 바람직한 실시예에서, 세포는 자가조직성이다.
특정 구현예에서 고려되는 조작된 TCR과 함께 사용되는 예시적인 면역 효과기 세포는 T 림프구를 포함한다. 용어 “T 세포” 또는 “T 림프구”는 흉선세포, 미성숙 T 림프구, 성숙 T 림프구, 휴지기 T 림프구, 또는 활성화된 T 림프구를 포함하도록 의도된다. T 세포는 T 헬퍼 (Th) 세포, 예를 들어 T 헬퍼 1(Th1) 또는 T 헬퍼 2(Th2) 세포일 수 있다. T 세포는 헬퍼 T 세포(HTL; CD4+ T 세포) CD4+ T 세포, 세포독성 T 세포(CTL; CD8+ T 세포), CD4+CD8+ T 세포, CD4-CD8- T 세포, 또는 T 세포의 임의의 다른 하위 집합일 수 있다. 특정 구현예에서 사용하기에 적합한 T 세포의 다른 예시적인 집단은 미처리 T 세포(TN), T 기억 줄기 세포(TSCM), 중심 기억 T 세포(TCM), 효과기 기억 T 세포(TEM), 및 효과기 T 세포(TEFF)를 포함한다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본원에서 고려되는 조작된 TCR을 갖는 면역 효과기 세포로서 다른 세포가 또한 사용될 수 있다. 특히, 면역 효과기 세포는 또한 NK 세포, NKT 세포, 호중구, 및 대식세포를 포함한다. 면역 효과기 세포는 또한 효과기 세포의 전구 세포를 포함하며, 이러한 전구 세포는 생체 내 또는 시험관 내에서 면역 효과기 세포로 분화되도록 유도될 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 면역 효과기 세포는, 대상체에서 투여 시 성숙한 면역 효과기 세포로 분화되거나, 성숙한 면역 효과기 세포로 분화되도록 시험관 내에서 유도될 수 있는 제대혈, 골수, 또는 가동화된 말초 혈액으로부터 유래된 세포의 CD34+ 집단 내에 함유된 조혈 줄기 세포(HSC)와 같은 면역 효과기 세포의 전구 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 “ CD34+ 세포”는 그의 세포 표면 상에서 CD34 단백질을 발현하는 세포를 지칭한다. 본원에서 사용되는 “CD34”는 종종 세포-세포 부착 인자로서 작용하고 림프절 내로 T 세포의 진입에 관여하는 세포 표면 당단백질(예를 들어, 시알로뮤신 단백질)을 지칭한다. CD34+ 세포 집단은 조혈 줄기 세포(HSC)를 함유하는데, 이는 환자에게 투여 시 분화하여 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 호중구, 및 단핵구/대식세포 계통의 세포를 포함하는 모든 조혈 계통에 기여한다.
본원에서 고려되는 조작된 TCR을 발현하는 면역 효과기 세포를 만드는 방법이 특정 구현예에서 제공된다. 일 구현예에서, 방법은, 면역 효과기 세포가 본원에서 고려되는 조작된 TCR을 암호하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리시스트론 메시지 또는 본원에서 고려되는 조작된 TCR을 암호화하는 융합 단백질을 발현하도록 개체로부터 단리된 면역 효과기 세포를 형질감염시키거나 형질도입시키는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 형질도입된 세포는 대상체에게 투여되기 전에, 증식을 위해 후속하여 배양된다.
특정 구현예에서, 면역 효과기 세포는 개체로부터 단리되고, 시험관 내에서 추가 조작 없이 유전자 변형된다. 그런 다음, 이러한 세포는 개체 내로 직접 재투여될 수 있다. 추가의 실시예에서, 면역 효과기 세포는 본원에서 고려되는 조작된 TCR을 발현하도록 유전적으로 변형되기 전에 시험관 내에서 먼저 활성화되고 자극되어 증식된다. 이와 관련하여, 면역 효과기 세포는 유전적으로 변형되기 전 및/또는 후에 배양될 수 있다.
특정 구현예에서, 세포의 공급원은 본원에 기술된 면역 효과기 세포의 시험관 내 조작 또는 유전적 변형 전에 대상체로부터 수득된다. 특정 구현예에서, 변형된 면역 효과기 세포는 T 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, PBMC는 본원에서 고려되는 조작된 TCR을 암호화하는 폴리시스트론 메시지를 발현하도록 직접적으로 유전적으로 변형될 수 있다. 소정의 실시예에서, PBMC의 단리 후, T 림프구는 추가로 단리되고, 소정의 실시예에서, 세포독성 및 헬퍼 T 림프구 둘 모두는 유전자 변형 및/또는 증식 전 또는 후에 미처리, 기억, 및 효과기 T 세포 하위 모집단으로 분류될 수 있다.
T 세포와 같은 면역 효과기 세포는 공지된 방법을 사용하여 단리 후에 유전적으로 변형될 수 있거나, 면역 효과기 세포는 유전적으로 변형되기 전에 시험관 내에서 활성화되고 증식(또는 전구세포의 경우 분화)될 수 있다. 특정 구현예에서, T 세포와 같은 면역 효과 세포는 확장을 위해 활성화되고 자극된 후, 본원에서 고려되는 TCR로 유전적으로 변형된다 (예를 들어, 본원에서 고려되는 조작된 TCR을 암호화하는 폴리시스트론 메시지를 암호화하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입된다. 다양한 실시예에서, T 세포는, 예를 들어, 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 미국 특허 출원 공개 제20060121005호에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 유전자 변형 전 또는 후에 활성화되고 증식될 수 있다.
일 구현예에서, CD34+ 세포는 본원에서 고려되는 핵산 작제물로 형질도입된다. 특정 구현예에서, 형질도입된 CD34+ 세포는 대상체, 일반적으로 세포가 원래 단리된 대상체에게 투여된 후 생체 내에서 성숙한 면역 효과기 세포로 분화된다. 또 다른 구현예에서, CD34+ 세포는 다음의 사이토카인 중 하나 이상에 노출되기 전 또는 이에 의해 유전적으로 변형된 후 시험관 내에서 자극될 수 있다: 전술한 방법에 따른, Flt-3 리간드(FLT3), 줄기 세포 인자(SCF), 거대핵세포 성장 및 분화 인자(TPO), IL-3 및 IL-6(Asheuer 등, 2004; Imren 등, 2004).
특정 구현예에서, 암의 치료를 위한 변형된 면역 효과기 세포의 집단은 본원에서 고려되는 조작된 TCR을 포함한다. 예를 들어, 변형된 면역 효과기 세포의 집단은 본원에 기술된 B 세포 악성 종양으로 진단된 환자(자가 공여자)로부터 수득된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 제조된다. PBMC는 CD4+, CD8+ 또는 CD4+ 및 CD8+일 수 있는 이종 T 림프구 집단을 형성한다.
PBMC는 또한 NK 세포 또는 NKT 세포와 같은 다른 세포독성 림프구를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서 고려되는 조작된 TCR의 코딩 서열을 운반하는 발현 벡터는 인간 공여자 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포의 집단에 도입된다. 특정 구현예에서, 발현 벡터를 운반하는 성공적으로 형질도입된 T 세포는 유세포 계측법을 사용하여 분류되어 CD3 양성 T 세포를 단리한 다음, 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체 및 IL-2 또는 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같은 당 기술분야에 공지된 임의의 다른 방법을 사용하는 세포 활성화에 추가하여, T 세포를 발현하는 이들 CAR 단백질의 수를 증가시키도록 추가로 증식될 수 있다. 표준 절차는 인간 대상체에서 사용하기 위한 보관 및/또는 제조를 위한 CAR 단백질 T 세포를 발현하는 T 세포의 동결보존에 사용된다. 일 실시예에서, T 세포의 시험관 내 형질도입, 배양 및/또는 증식은 태아 송아지 혈청 및 태아 소 혈청과 같은 비인간 동물 유래 산물의 부재 하에 수행된다. PBMC의 이종 집단은 유전적으로 변형되기 때문에, 생성된 형질도입 세포는 본원에서 고려되는 것와 같이 BCMA 표적화 CAR을 포함하는 변형된 세포의 이종 집단이다.
추가의 실시예에서, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 상이한 발현 벡터의 혼합물은 면역 효과기 세포의 공여자 집단을 유전적으로 변형시키는 데 사용될 수 있으며, 여기에서 각각의 벡터는 본원에서 고려된 바와 같은 상이한 키메라 항원 수용체 단백질을 암호화한다. 생성된 변형된 면역 효과기 세포는 변형된 세포의 혼합 집단을 형성한다.
T 세포를 포함하는, 유전적으로 조작된 세포는 당 기술분야에 공지된 다양한 방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 예를 들어, 그 전체가 참조로서 본원에 통합되는 국제특허공개 WO 2016/094304호를 참조한다.
I. 조성물 및 제형
본원에서 고려되는 조성물은, 본원에서 고려되는 바와 같이, 하나 이상의 조작된 TCR 폴리펩티드, TCRα 폴리펩티드, TCRβ 폴리펩티드, TCRγ 폴리펩티드, TCRδ 폴리펩티드, TCR 융합 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터, 유전적으로 변형된 면역 효과기 세포 등을 포함할 수 있다. 조성물은 약학적 조성물을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 바람직한 구현예에서, 조성물은 본원에서 고려되는 조작된 TCR을 발현하도록 변형된 하나 이상의 세포를 포함한다.
“약학적 조성물”은 세포 또는 동물에게 단독으로 투여하거나 하나 이상의 다른 치료법과 조합하여 투여하도록 약학적으로 허용 가능한 또는 생리학적으로 허용 가능한 용액으로 제형화된 조성물을 지칭한다. 또한, 원하는 경우, 조성물은, 예를 들어, 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 저분자, 화학요법제, 전구약물, 약물, 항체, 또는 다른 다양한 약학적 활성제와 같은 다른 제제와 병용 투여될 수도 있음을 이해할 것이다. 추가 제제가 의도된 요법을 전달하는 조성물의 능력에 악영향을 미치지 않는다면, 조성물에 포함될 수도 있는 다른 성분에는 사실상 제한이 없다. 바람직한 구현예에서, 약학적 조성물은, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제, 및 본원에서 고려되는 것과 같은 조작된 TCR을 발현하도록 변형된 하나 이상의 세포를 포함한다.
“약학적으로 허용 가능한”이라는 문구는, 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제나 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여 형태를 지칭하도록 본원에서 사용된다.
본원에서 사용되는 “약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제”는 미국 식품의약국에 의해 인간 또는 가축에게 사용하기에 허용 가능한 것으로 승인된 임의의 보조제, 담체, 부형제, 활택제, 감미제, 희석제, 보존제, 염료/색소, 향미제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정화제, 등장제, 용매, 계면활성제, 또는 유화제를 제한 없이 포함한다. 예시적인 약학적으로 허용 가능한 담체는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 락토오스, 포도당 및 수크로오스와 같은 당; 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; 셀룰로오스 및 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 이의 유도체; 트라가칸스; 몰트; 젤라틴; 탈크; 코코아 버터, 왁스, 동물 및 식물성 지방, 파라핀, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 산화아연; 땅콩 오일, 목화씨 오일, 홍화유, 참기름, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 대두유와 같은 오일; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; 한천; 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄과 같은 완충제; 알긴산; 발열원이 없는 물; 등장성 식염수; 링거 용액; 에틸 알코올; 인산염 완충액; 및 약학적 제형에 사용되는 임의의 다른 상용성 물질.
특정 구현예에서, 약학적으로 허용 가능한 담체 용액의 제형은 다양한 치료 요법에서 본원에 기술된 특정 조성물을 사용하기 위한 적절한 투여 및 치료 요법의 개발하는 것과 마찬가지로 당 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있으며, 적절한 투여 및 치료 요법에는, 예를 들어, 장내 및 비경구, 예를 들어, 혈관내, 정맥내, 동맥내, 동맥내, 골내, 심실내, 뇌내, 두개내, 척수내, 경막내, 및 골수내 투여 및 제형이 포함된다. 당 기술분야의 숙련자는, 본원에서 고려되는 특정 실시예가, 약학 분야에서 잘 알려져 있고, 예를 들어, 다음 문헌에서 기술된 것들과 같은 다른 제형을 포함할 수 있음을 이해할 것이다: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, volume I and volume II. 22nd Edition. Edited by Loyd V. Allen Jr. Philadelphia, PA: Pharmaceutical Press; 2012, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
특정 구현예에서, 조성물은 본원에서 고려되는 조작된 TCR을 발현하는 면역 효과기 세포의 양을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 “양”은 임상적 결과를 포함하여 유익하거나 원하는 예방 또는 치료 결과를 달성하기 위한 유전적으로 변형된 치료 세포, 예를 들어, T 세포의 “효과적인 양” 또는 “유효량”을 지칭한다.
“예방적 유효량”은 원하는 예방적 결과를 달성하는 데 효과적인 유전적으로 변형된 치료 세포의 양을 지칭한다. 반드시 그렇지는 않지만 일반적으로, 예방적 투여량은 질환 이전에 또는 질환의 초기 단계에 대상체에게 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적다.
유전적으로 변형된 치료 세포의 “치료적 유효량”은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도하는 줄기 및 전구 세포의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료적 유효량은 또한 바이러스 또는 형질도입된 치료 세포의 임의의 독성 또는 유해 효과를 치료적으로 유익한 효과가 능가하는 양이다. 용어 “치료적 유효량”은 대상체(예를 들어, 환자)를 “치료”하는 데 효과적인 양을 포함한다. 치료량이 표시되는 경우, 투여할 조성물의 정확한 양은 한자(대상체)의 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이 정도, 및 상태에 있어서의 개별적인 차이를 고려하여 의사가 결정할 수 있다.
일반적으로, 본원에 기술된 T 세포를 포함하는 약학적 조성물은 체중 1 kg당 106 내지 1013개 세포, 바람직하게는 108 내지 1013개 세포(이들 범위 내에 있는 모든 정수 값을 포함함)의 투여량으로 투여될 수 있다. 세포의 수는 조성물뿐만 아니라 그 안에 포함된 세포 유형의 의도된 최종 용도에 따라 달라질 것이다. 본원에서 제공된 용도를 위해, 세포는 일반적으로 1 리터 이하의 부피이며, 500 mL 이하, 심지어 250 mL 또는 100 mL 이하일 수 있다. 따라서, 원하는 세포의 밀도는 일반적으로 106개 세포/ml보다 더 높고, 일반적으로 107개 세포/ml보다 높고, 일반적으로 108개 세포/ml 이상이다. 임상적으로 유연한 면역 세포의 수는 여러 번 주입하도록 나눌 수 있으며, 누적한 수는 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 또는 1013개의 세포 또는 그 이상이다. 조성물은 이들 범위 내의 투여량으로 여러 번 투여될 수 있다. 세포는 치료를 받는 환자에 대해 동종, 동계, 이종, 또는 자가일 수 있다. 원하는 경우, 치료는 면역 반응의 유도를 강화하기 위해 본원에서 고려되는 것과 같은 미토겐(예를 들어, PHA) 또는 림포카인, 사이토카인, 및/또는 케모카인(예를 들어, IFN-γ, IL-2, IL-12, TNF-알파, IL-18, 및 TNF-베타, GM-CSF, IL-4, IL-13, Flt3-L, RANTES, MIP1α 등)의 투여를 포함할 수도 있다.
일반적으로, 본원에서 고려되는 바와 같이 활성화되고 증식된 세포를 포함하는 조성물은 면역력이 손상된 개체에서 발생하는 질환의 치료 및 예방에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 조작된 TCR을 발현하도록 변형된 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물은 암의 치료에 사용된다. 변형된 면역 효과기 세포는 단독으로 투여되거나, 담체, 희석제, 부형제, 및/또는 IL-2 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집단과 같은 다른 성분과 조합된 약학적 조성물로서 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 또는 부형제와 조합된 유전적으로 변형된 T 세포의 양을 포함한다.
조작된 TCR(예를 들어, T 세포)를 발현하도록 변형된 면역 효과기 세포 집단을 포함하는 약학적 조성물은 다음을 포함할 수 있다: 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등과 같은 완충제; 포도당, 만노오스, 수크로오스 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물; 단백질; 폴리펩티드 또는 글리신과 같은 아미노산; 항산화제; EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제; 애쥬번트(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 보존제.
특정 구현예에서, 조성물은 바람직하게는 비경구 투여, 예를 들어, 혈관 내(정맥 내 또는 동맥 내) 투여용으로 제형화된다.
액체 약학적 조성물은, 용액, 현탁액 또는 다른 유사한 형태이든지 간에, 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 주사용수, 식염수, 바람직하게는 생리식염수, 링거 용액, 또는 등장성 염화나트륨과 같은 멸균 희석제, 용매 또는 현탁 매질로 작용할 수 있는 합성 모노 또는 디글리세리드, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 용매와 같은 고정 오일; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 중아황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트르산염 또는 인산염과 같은 완충제 및 염화 나트륨 또는 덱스트로스와 같은 등장성 조절을 위한 제제. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 일회용 주사기, 또는 다회 투여 바이알에 봉입될 수 있다. 주사식 약학적 조성물은 바람직하게는 멸균 상태이다.
일 구현예에서, 본원에서 고려되는 T 세포 조성물은 약학적으로 허용 가능한 세포 배양 배지에서 제형화된다. 이러한 조성물은 인간 대상체에게 투여하기에 적합하다. 특정 구현예에서, 약학적으로 허용 가능한 세포 배양 배지는 무혈청 배지이다.
무혈청 배지는 세럼 함유 배지에 비해 여러 가지 장점을 갖는데, 이에는 단순화되고 더 잘 정의된 조성물, 오염도의 감소, 감염물질의 잠재적 공급원의 제거, 및 낮은 비용이 포함된다. 다양한 실시예에서, 무혈청 배지는 무동물성이며, 임의로 무단백질일 수 있다. 임의로, 배지는 생물 약학적으로 허용가능한 재조합 단백질을 함유할 수 있다. “무동물성(animal-free)” 배지는 그 성분이 비-동물 공급원으로부터 유래된 배지를 지칭한다. 재조합 단백질은 무동물성 배지에서 천연 동물 단백질을 대체하며, 영양소는 합성, 식물, 또는 미생물 공급원으로부터 얻는다. 대조적으로, “무단백질(protein-free)” 배지는 실질적으로 단백질이 없는 것으로 정의된다.
특정 조성물에 사용된 무혈청 배지의 예시적인 실시예는 QBSF-60(Quality Biological, Inc.), StemPro-34(Life Technologies), 및 X-VIVO 10을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
바람직한 일 구현예에서, 본원에서 고려되는 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물은 PlasmaLyte A를 포함하는 용액으로 제형화된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본원에서 고려되는 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물은 동결보존제를 포함하는 용액으로 제형화된다. 예를 들어, 동결보존제가 포함된 동결 보존 배지를 사용해 해동 후 높은 세포 생존력 결과를 유지할 수 있다. 특정 조성물에 사용된 동결 보존 배지의 예시적인 실시예는 CryoStor CS10, CryoStor CS5, 및 CryoStor CS2를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
보다 바람직한 구현예에서, 본원에서 고려되는 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물은 PlasmaLyte A와 CryoStor CS10을 50:50의 비율로 포함하는 용액 중에서 제형화된다.
특정 구현예에서, 조성물은 본원에서 고려되는 조작된 TCR을 발현하도록 변형된 게놈 편집된 면역 효과기 세포의 유효량을 포함한다. 따라서, 면역 효과기 세포 조성물은 단독으로 투여되거나 방사선 요법, 화학요법, 이식, 면역요법, 호르몬 요법, 광역학 요법 등과 같은 다른 알려진 암 치료제와 병용 투여될 수 있다. 조성물은 또한 항생제와 병용 투여될 수 있다. 이러한 치료제는 본원에 기술된 바와 같은 특정 병태, 예컨대 특정 암에 대한 표준 치료제로서 당업계에서 수용될 수 있다. 특정 구현예에서 고려되는 예시적인 치료제는 사이토카인, 성장 인자, 스테로이드, NSAID, DMARD, 항염증제, 화학요법제, 방사선치료제, 치료 항체, 또는 다른 활성제 및 보조제를 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 조작된 TCR을 발현하도록 변형된 게놈 편집된 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물은 임의의 수의 화학요법제와 함께 투여될 수 있다. 다양한 다른 치료제가 본원에서 고려되는 조성물과 함께 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 조작된 TCR을 발현하는 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물은 항염증제와 함께 투여된다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 조작된 TCR을 발현하도록 변형된 면역 효과기를 포함하는 조성물은 치료 항체(예: 단일 또는 이중특이적 항체 또는 이의 단편) 및/또는 면역 세포 결합자(NK 결합자)와 함께 투여된다. 본원에서 고려된 하나 이상의 DARIC 성분을 포함하는 CAR 변형된 T 세포와의 병용 치료에 적합한 치료 항체의 예시적인 실시예는 다음을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다: 아테졸리주맙, 아벨루맙, 바비툭시맙, 베바시주맙(아바스틴), 비바투주맙, 블리나투모맙, 코나투무맙, 다라투무맙, 둘리고투맙, 다세투주맙, 달로투주맙, 더발루맙, 엘로투주맙(HuLuc63), 겜투주맙, 이브리투모맙, 인다툭시맙, 이노투주맙, 이필리무맙, 로르보투주맙, 루카투무맙, 밀라투주맙, 목세투모맙, 니볼루맙, 오카라투주맙, 오파투무맙, 펨브롤리주맙, 리툭시맙, 실툭시맙, 테프로투무맙, 및 유블리툭시맙.
A. 치료 방법
본원에서 고려되는 조작된 TCR을 발현하는 유전적으로 변형된 면역 효과기 세포는 암의 예방, 치료 및 완화에 사용하기 위한, 또는 암과 관련된 적어도 하나의 증상을 예방, 치료 또는 완화하기 위한, 개선된 입양 면역요법 방법을 제공한다.
다양한 구현예에서, 본원에 고려되는 유전적으로 변형된 면역 효과기 세포는 대상체에서의 암세포에서 세포독성을 증가시키는 데 사용되거나 대상체에서의 암세포의 수를 감소시키는 데 사용하기 위한 개선된 입양 면역요법 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 일차 면역 효과기 세포의 특이성은 본원에서 고려되는 바와 같은 조작된 TCR로 일차 면역 효과기 세포를 유전적으로 변형시킴으로써, 특정 항원을 발형하는 세포, 예를 들어, 암세포에 대해 재유도된다. 다양한 구현예에서, 바이러스 벡터는 조작된 TCR을 암호화하는 특정 폴리뉴클레오티드로 면역 효과기 세포를 유전적으로 변형시키는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 조작된 TCR은 (a) TCRα 가변 도메인을 포함하는 TCRα 폴리펩티드; (b) TCRβ 가변 도메인을 포함하는 TCRβ 폴리펩티드; 및 (c) TCRα 가변 도메인 및/또는 TCRβ 가변 도메인에 연결된 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 TCR은 (a) TCRγ 가변 도메인을 포함하는 TCRγ 폴리펩티드; (b) TCRδ 가변 도메인을 포함하는 TCRδ 폴리펩티드; 및 (c) TCRγ 가변 도메인 및/또는 TCRδ 가변 도메인에 연결된 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 폴리펩티드 링커이다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드 링커는 서열번호 33-53 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에서 고려되는 조작된 TCR을 발현하도록 T 세포가 유전적으로 변형되어 이를 필요로 하는 수용자에게 주입되는 유형의 세포 요법이 제공된다. 주입된 세포는 수용자의 질병을 일으키는 세포를 사멸시킬 수 있다. 항체 요법과는 달리, T 세포 요법은 생체 내에서 복제할 수 있기 때문에, 지속적인 암 요법으로 이어질 수 있는 장기적인 지속성을 초래한다.
일 구현예에서, 본원에서 고려되는 조작된 TCR을 발현하는 T 세포는 생체내에서 강력한 T 세포 확장을 겪을 수 있고 연장된 시간 동안 지속될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본원에서 고려되는 조작된 TCR을 발현하는 T 세포는 임의의 추가적인 종양 형성 또는 성장을 억제하기 위해 재활성화될 수 있는 특이적 기억 T 세포 또는 줄기 세포 기억 T 세포로 진화한다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 조작된 TCR을 발현하는 변형된 면역 효과기 세포는 고형 종양 또는 암의 치료에 사용된다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 변형된 면역 효과기 세포는 다음을 포함하되 이들로 한정되지 않는 고형 종양 또는 암의 치료에 사용된다: 부신암, 부신피질 암종, 항문암, 충수암, 성상세포종, 비정형 기형/횡문근 종양, 기저 세포 암종, 담관암, 방광암, 골암, 뇌/CNS 암, 유방암, 기관지 종양, 심장 종양, 자궁경부암, 담관암종, 연골육종, 척삭종, 결장암, 대장암, 두개인두종, 관상피내 암종(DCIS), 자궁내막암, 뇌실막세포종, 식도암, 좌골신경모세포종, 유잉 육종, 두개외 생식 세포 종양, 성선 외 생식 세포 종양, 안구암, 난관암, 섬유성 조직육종, 섬유육종, 담낭암, 위암, 위장 카르시노이드 종양, 위장 기질 종양(GIST), 생식 세포 종양, 신경교종, 교모세포종, 두경부암, 혈관모세포종, 간세포암, 하인두암, 안구 내 흑색종, 카포시 육종, 신장암, 후두암, 평활근육종, 구순암, 지방육종, 간암, 폐암, 비소세포 폐암, 폐 유암종, 악성 중피종, 수질 암종, 수모세포종, 수막종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중간선관 암종, 구강암, 점액육종, 골수이형성 증후군, 골수 증식성 신생물, 비강 및 부비동암, 비인두암, 신경모세포종, 희돌기아교세포종, 구암, 구강암, 구인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 췌장 섬 세포 종양, 유두 암종, 부신경절종, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 크롬친화세포종, 송과체종, 뇌하수체 종양, 흉막폐 모세포종, 원발성 복막암, 전립선암, 직장암, 망막아종, 신세포 암종, 신우암 및 요관암, 횡문근육종, 침샘암, 피지선 암종, 피부암, 연조직 육종, 편평 세포 암종, 소세포 폐암, 소장암, 위암, 땀샘 암종, 윤활막종, 고환암, 인후암, 흉선암, 갑상선암, 요도암, 자궁암, 자궁 육종, 질암, 혈관암, 외음부암, 및 빌름스 종양.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 변형된 면역 효과기 세포는 비소세포 폐암종, 두경부 편평 세포 암종, 대장암, 췌장암, 유방암, 갑상선암, 방광암, 자궁경부암, 식도암, 난소암, 위암, 자궁내막암, 신경교종, 신경아세포종, 및 희돌기아교종을 포함하되 이들로 한정되지 않는 고형 종양 또는 암의 치료에 사용된다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 변형된 면역 효과기 세포는 비소세포 폐암, 전이성 대장암, 신경아세포종, 두경부암, 췌장암, 및 유방암을 포함하되 이들로 한정되지 않는 고형 종양 또는 암의 치료에 사용된다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 변형된 면역 효과기 세포는 신경아세포종의 치료에 사용된다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 조작된 TCR을 발현하는 변형된 면역 효과기 세포는 액상암 또는 혈액암의 치료에 사용된다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 변형된 면역 효과기 세포는 백혈병, 림프종, 및 다발성 골수종을 포함하나 이에 한정되지 않는 B 세포 악성 종양의 치료에 사용된다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 변형된 면역 효과기 세포는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는 액상암의 치료에 사용된다: 백혈병, 림프종, 및 다발성 골수종: 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 골수모구성 백혈병, 전골수세포성 백혈병, 골수단핵구성 백혈병, 단핵구성 백혈병, 적백혈병, 모세포 백혈병(HCL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 및 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 골수단핵구성 백혈병(CMML) 및 진성 적혈구증가증, 호지킨 림프종, 결절성 림프구-우세 호지킨 림프종, 버킷 림프종, 소림프구성 림프종(SLL), 미만성 거대 B-세포 림프종, 여포성 림프종, 면역아구성 대세포 림프종, 전구체 B-림프모구성 림프종, 외투세포 림프종, 변연부 림프종, 균상식육종, 역형성 대세포 림프종, 세자리 증후군, 전구체 T-림프모구성 림프종, 다발성 골수종, 명백한 다발성 골수종, 아급성 다발성 골수종, 형질 세포 백혈병, 비분비성 골수종, IgD 골수종, 골경화성 골수종, 뼈 고립성 형질세포종, 및 골수외 형질세포종.
특정 구현예에서, 액상 암 또는 혈액암은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 유모 세포 백혈병(HCL), 다발성 골수종(MM), 급성 골수성 백혈병(AML), 또는 만성 골수성 백혈병(CML).
바람직한 구현예에서, 액상 암 또는 혈액암은 다발성 골수종(MM)이다.
바람직한 구현예에서, 액상 암 또는 혈액암은 재발성/불응성 다발성 골수종(MM)이다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 변형된 면역 효과기 세포는 급성 골수성 백혈병(AML)의 치료에 사용된다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 변형된 면역 효과기 세포는 림프종(예: 비호킨 림프종 또는 DLBCL)의 치료에 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 “개체” 및 “대상체”는 흔히 상호 교환적으로 사용되고, 유전자 요법 벡터, 세포 기반 치료제, 및 본원의 다른 곳에서 고려되는 방법으로 치료될 수 있는 질환, 장애, 또는 병태의 증상을 나타내는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 대상체는 유전자 요법 벡터, 세포 기반 치료제, 및 본원의 다른 곳에서 고려되는 방법으로 치료될 수 있는 암과 관련된 질환, 장애 또는 병태의 증상을 나타내는 임의의 동물을 포함한다. 적합한 대상체(예를 들어, 환자)는 실험실 동물(예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 또는 기니피그), 농장 동물, 및 가축 또는 애완동물(예를 들어, 고양이 또는 개)을 포함한다. 비인간 영장류 및 바람직하게는 인간 환자가 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 “환자”는 유전자 요법 벡터, 세포 기반 치료제, 및 본원의 다른 곳에 개시된 방법으로 치료될 수 있는 특정 질환, 장애 또는 병태로 진단된 적이 있는 대상체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 “치료” 또는 “치료하는”은 질환 또는 병리학적 병태의 증상 또는 병리에 대한 임의의 유익하거나 바람직한 효과를 포함하며, 치료 중인 질환 또는 병태의 하나 이상의 측정 가능한 마커에 있어서 아주 최소한의 감소를 포함할 수 있다. 치료는 임의로 질환 또는 병태의 감소, 또는 질환 또는 병태의 진행의 지연을 포함할 수 있다. “치료”가 반드시 질환 또는 병태, 또는 이와 관련된 증상의 완전한 근절 또는 치유를 나타내는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 “예방” 및 “예방된”, “예방하는” 등과 같은 유사한 단어는 질환 또는 병태의 발병 또는 재발 가능성을 예방, 억제, 또는 감소시키기 위한 접근법을 나타낸다. 이는 또한 질환 또는 병태의 발병 또는 재발을 지연시키거나 질환 또는 병태의 증상의 발생 또는 재발을 지연시키는 것을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, “예방” 및 유사한 단어는 또한 질환 또는 병태의 발병 또는 재발 전에 질환 또는 병태의 강도, 효과, 증상, 및/또는 부담을 감소시키는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 “적어도 하나의 증상을 완화시키는 것”은 대상체가 치료받고 있는 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 감소시키는 것을 지칭한다. 특정 구현예에서, 치료 중인 질환 또는 병태는 암이며, 여기서 완화되는 하나 이상의 증상은 허약, 피로, 호흡 곤란, 쉽게 멍들고 피나는 증상, 잦은 감염, 림프절 비대, (복부 기관 비대로 인한) 복부 팽만감 또는 복통, 뼈 또는 관절의 통증, 골절, 의도치 않은 체중 감소, 식욕 부진, 야간 발한, 지속적인 미열, 및 (신장 기능 장애로 인한) 배뇨 감소를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
“강화” 또는 “촉진” 또는 “증가” 또는 “증식”이라는 용어는 비히클 또는 대조군에 의해 야기된 반응과 비교하여 더 큰 생리학적 반응(즉, 하류 효과)을 생성, 유도, 또는 유발하는 본원에서 고려되는 조성물, 예를 들어 본원에서 고려되는 조작된 TCR을 발현하는 유전적으로 변형된 T 세포의 능력을 일반적으로 지칭한다. 측정 가능한 생리학적 반응은, 당업계에서의 이해 및 본원의 설명으로부터 명백한 것들 중에서, T 세포 증식, 활성화, 지속, 및/또는 암 세포 사멸 능력의 증가를 포함할 수 있다. “증가된” 또는 “강화된” 양은 일반적으로 “통계적으로 유의한” 양이며, 비히클 또는 대조군 조성물에 의해 생성된 반응의 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 또는 그 이상으로 (예를 들어, 500배, 1000배로) 증가된 것을 포함할 수 있다(1을 초과하는 모든 정수 값 및 정수 값들 사이의 소수점 값, 예를 들어 1.5, 1.6, 1.7, 1.8 등을 포함함).
“감소된” 또는 “더 적은”, 또는 “낮은”, 또는 “줄어든”, 또는 “적은”이라는 용어는 일반적으로 비히클 또는 대조군 분자/조성물에 의해 야기된 반응과 비교하여 보다 적은 생리학적 반응(즉, 하류 효과)을 생성, 유도, 또는 유발하는 본원에서 고려되는 조성물의 능력을 지칭한다. “감소된” 또는 “ 더 적은” 양은 통상적으로 “통계적으로 유의한” 양이며, 비히클 또는 대조군 조성물에 의해 생성된 반응(기준 반응) 또는 특정 세포 계통에서의 반응의 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 또는 그 이상으로 (예를 들어, 500배, 1000배로) 감소된 것을 포함할 수 있다(1을 초과하는 모든 정수 값 및 정수 값들 사이의 소수점 값, 예를 들어 1.5, 1.6, 1.7, 1.8 등을 포함함).
“유지”, 또는 “보존”, 또는 “지속”, 또는 “변화 없는” 또는 “실질적인 변화 없는” 또는 “실질적인 감소 없는”은 비히클 또는 대조군 분자/조성물에 의해 야기된 반응과 비교하여 유사한 생리학적 반응(즉, 하류 효과)을 생성, 유도, 또는 유발하는 본원에서 고려되는 조성물의 능력을 지칭한다. 유사한 반응은 기준 반응과 유의하게 다르거나 측정 가능한 차이가 없는 것이다.
일 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법은 본원에서 고려되는 유전적으로 변형된 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물의 유효량, 예를 들어 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 임상 시험에 의해 적절한 투여량 및 투여 일정이 결정될 수 있지만, 투여량 및 투여 빈도는 환자의 상태, 및 환자의 질환의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정된다.
일 구현예에서, 대상체에게 투여되는 조성물 중의 면역 효과기 세포, 예를 들어, 조작된 TCR을 발현하는 T 세포의 양은, 적어도 1 x 107 세포, 적어도 0.5 x 108 세포, 적어도 1 x 108개의 세포, 적어도 0.5 x 109 세포, 적어도 1 x 109개의 세포, 적어도 1 x 1010개의 세포, 적어도 1 x 1011개의 세포, 적어도 1 x 1012개의 세포, 적어도 5 x 1012개의 세포, 또는 적어도 1 x 1013개의 세포이다.
특정 구현예에서, 약 1 x 107개의 T 세포 내지 약 1 x 1013개의 T 세포, 약 1 x 108개의 T 세포 내지 약 1 x 1013개의 T 세포, 약 1 x 109개의 T 세포 내지 약 1 x 1013개의 T 세포, 약 1 x 1010개의 T 세포 내지 약 1 x 1013개의 T 세포, 약 1 x 1011개의 T 세포 내지 약 1 x 1013개의 T 세포, 또는 약 1 x 1012개의 T 세포 내지 약 1 x 1013개의 T 세포가 대상체에게 투여된다.
일 구현예에서, 대상체에게 투여되는 조성물 중, 면역 효과기 세표, 예를 들어 조작된 TCR을 발현하는 T 세포의 양은, 체중 kg 당 적어도 0.1 x 104개의 세포, 체중 kg 당 적어도 0.5 x 104개의 세포, 체중 kg 당 적어도 1 x 104개의 세포, 체중 kg 당 적어도 5 x 104개의 세포, 체중 kg 당 적어도 1 x 105개의 세포, 체중 kg 당 적어도 0.5 x 106개의 세포, 체중 kg 당 적어도 1 x 106개의 세포, 체중 kg 당 적어도 0.5 x 107개의 세포, 체중 kg 당 적어도 1 x 107개의 세포, 체중 kg 당 적어도 0.5 x 108개의 세포, 체중 kg 당 적어도 1 x 108개의 세포, 체중 kg 당 적어도 2 x 108개의 세포, 체중 kg 당 적어도 3 x 108개의 세포, 체중 kg 당 적어도 4 x 108개의 세포, 체중 kg 당 적어도 5 x 108개의 세포, 또는 체중 kg 당 적어도 1 x 109개의 세포이다.
특정 구현예에서, 체중 kg 당 약 1 x 106개의 T 세포 내지 체중 kg 당 약 1 x 108개의 T 세포, 체중 kg 당 약 2 x 106개의 T 세포 내지 체중 kg 당 약 0.9 x 108개의 T 세포, 체중 kg 당 약 3 x 106개의 T 세포 내지 체중 kg 당 약 0.8 x 108개의 T 세포, 체중 kg 당 약 4 x 106개의 T 세포 내지 체중 kg 당 약 0.7 x 108개의 T 세포, 체중 kg 당 약 5 x 106개의 T 세포 내지 체중 kg 당 약 0.6 x 108개의 T 세포, 또는 체중 kg 당 약 5 x 106개의 T 세포 내지 체중 kg 당 약 0.5 x 108개의 T 세포가 대상체에게 투여된다.
당업자는 원하는 요법에 영향을 미치기 위해 본원에서 고려되는 조성물의 다회 투여가 요구될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 조성물은 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 1년, 2년, 5년, 10년, 또는 그 이상의 기간에 걸쳐 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회, 또는 그 이상 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 활성화된 면역 효과기 세포를 대상체에게 투여한 다음 혈액을 다시 채취하고(또는 성분 채집을 수행하고), 이로부터 면역 효과기 세포를 활성화시키고, 이들 활성화되고 증식된 면역 효과기 세포 및 확장된 면역 효과기 세포를 환자에게 다시 주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 프로세스는 수 주마다 여러 번 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 면역 효과기 세포는 10 cc 내지 400 cc의 채혈로부터 활성화될 수 있다. 특정 구현예에서, 면역 효과기 세포는 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc, 100 cc, 150 cc, 200 cc, 250 cc, 300 cc, 350 cc, 또는 400cc 또는 그 이상의 채혈로부터 활성화된다. 이론에 얽매이지 않고, 이러한 여러 번의 채혈/여러 번의 재주입 프로토콜을 사용하는 것은 특정 면역 효과기 세포 집단을 선택하는 역할을 할 수 있다.
본원에서 고려되는 조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 주입 또는 이식을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 조성물은 비경구 투여된다. 본원에서 사용되는 “비경구 투여” 및 “비경구로 투여되는”이라는 문구는 일반적으로 주사에 의한 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 지칭하며, 혈관내, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 관절낭내, 안와내, 종양내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관통, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 일 구현예에서, 본원에서 고려되는 조성물은 종양, 림프절, 또는 감염 부위 내로의 직접 주사에 의해 대상체에게 투여된다.
일 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체에게 조성물의 유효량이 투여되어 대상체에서 B 세포 관련 병태에 대한 세포 면역 반응을 증가시킨다. 면역 반응은 감염된 세포를 사멸시킬 수 있는 세포독성 T 세포, 조절 T 세포, 및 헬퍼 T 세포 반응에 의해 매개되는 세포 면역 반응을 포함할 수 있다. B 세포를 활성화하여 항체 생산을 유도할 수 있는 헬퍼 T 세포에 의해 주로 매개되는 체액성 면역 반응이 또한 유도될 수 있다. 당 기술분야에 잘 기술된 조성물에 의해 유도된 면역 반응의 유형을 분석하기 위해 다양한 기술이 사용될 수 있다; 예를 들어, Current Protocols in Immunology, Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001) John Wiley & Sons, NY, N.Y
일 구현예에서, 암으로 진단된 대상체를 치료하는 방법이 제공되고, 이는, 대상체로부터 면역 효과기 세포를 수득하는 단계, 본원에서 고려되는 조작된 TCR을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 갖는 전술한 면역 효과기 세포를 유전적으로 변형시키는 단계, 이에 의해 변형된 면역 효과기 세포의 집단을 생산하는 단계, 및 변형된 면역 효과기 세포의 집단을 동일한 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 면역 효과기 세포는 T 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, 대상체에서 표적 세포 집단에 대한 면역 효과기 세포 매개 면역 조절제 반응을 자극하는 방법이 제공되며, 방법은 본원에서 고려된 조작된 TCR분자를 암호화하는 핵산 작제물을 발현하는 면역 효과기 세포 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서 고려되는 세포 조성물을 투여하는 방법은 대상체에서 본원에서 고려되는 TCR을 직접 발현하는, 생체 외에서 유전적으로 변형된 면역 효과기 세포를 재도입하거나, 대상체 내로 도입될 때 조작된 TCR을 발현하는 성숙한 면역 효과기 세포로 분화되는 면역 효과기 세포의 변형된 전구세포를 재도입하는 데 효과적인 임의의 방법을 포함한다. 하나의 방법은 본원에서 고려되는 핵산 작제물로 생체 외에서 말초 혈액 T 세포를 형질도입하는 단계 및 형질도입된 세포를 대상체에게 되돌리는 단계를 포함한다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 출원, 및 발행된 특허는 각각의 개별 간행물, 특허 출원, 또는 발행된 특허가 구체적으로 그리고 개별적으로 참조에 의해 포함되는 것으로 표시된 것처럼 본원에 참조로서 통합된다.
전술한 실시예들은 이해를 밝힐 목적으로 예시 및 실시예로서 일부 상세히 기술되었지만, 첨부된 청구범위의 사상 또는 범주로부터 벗어나지 않고도 소정의 변경 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 본원에서 고려된 교시에 비추어 당 기술분야의 숙련자에게 쉽게 명백해질 것이다. 하기 실시예들은 단지 예시로서 제공되며, 제한하기 위한 것은 아니다. 당 기술분야의 숙련자는 본질적으로 유사한 결과를 얻기 위해 변경되거나 수정될 수 있는 중요하지 않은 다양한 파라미터를 쉽게 인식할 것이다.
서열 목록
실시예
실시예 1
조작된 TCR의 평가
MAGEA4-반응성, HLA-A2-제한된 T 세포 수용체(TCR)에 인간 CD33을 표적으로 하는 VHH가 내장되어 조작된 이중-표적화 TCR("VHH-TCR")을 생성하였다(서열번호 93)(도 1a 및 도 1b) 이를 MAGEA4(서열번호 89)를 표적으로 하는 TCR 및 인간 CD33(서열번호 90)을 표적으로 하는 DARIC(Dimerizing Agent Regulated Immunoreceptor Complex, 제어 가능하고 적응 가능한 항원 인식 시스템)과 비교하여 발현 및 기능에 대해 평가되었다. "비교기")(도 1a). 이중-표적화 TCR T 세포를 G-REX® 플라스크를 사용하여 10일 공정으로 생산하였다. 간략하게, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 IL-2(CellGenix, GmbH) 및 CD3 및 CD28에 특이적인 항체(Miltenyi Biotec, Inc.). 시험 작제물을 암호화하는 렌티바이러스를 배양 개시 후 1일차에 첨가하였다. 3일차에, CAR T 세포를 24-웰 플레이트로부터 옮기고, 24 웰 G-REX 플라스크에 넣고, 여기서 세포를 10일차에 수확할 때까지 유지시켰다.
또한, 유세포 계측법을 사용하여 T 세포를 세포 표면 VHH 발현에 대해 조사하였다. iFlour488 표지된 항-카멜리드 VHH 항체(Genscript)를 사용하여 T 세포를 염색하였다. 표면 VHH 발현은 CD33 DARIC에 비해 VHH-TCR에서 더 높았다(도 2a). 또한, CD33에 대해 양성인 종양 세포주(CD33으로 안정적으로 형질도입된 부착성 A549 세포주)와의 공동 배양에서 T 세포의 생물학적 활성을 인터페론 감마 생산에 대해 평가하였다CD33. 도 2b에 도시된 바와 같이, VHH-TCR의 인터페론 감마 생성은 CD33-DARIC보다 >3배 더 크고, 이를 공동 배양 동안 1 nm 라파마이신을 포함시킴으로써 활성화시켰다. IncuCyte에 의한 생세포 영상화를 사용하여 적색 리포터로 안정적으로 형질도입된 A549.CD33의 종양 세포 성장을 분석하였다. A549 세포는 UTD T 세포 및 MAGEA4 TCR-T 세포의 존재 하에 정상적으로 성장하였다. VHH-TCR 또는 CD33-DARIC 중 하나와 공동 배양한 결과 종양 세포가 제거되었고, VHH-TCR은 DARIC보다 더 신속하게 제거를 달성하였다(도 2c).
유세포 계측법을 수행하여 MAGEA4 TCR에 비해 VHH-TCR에서 더 높은 MAGEA4 사량체/HLA-다량체 결합을 평가하였다(도 3a). 또한, T 세포의 생물학적 활성을 MAGEA4에 대해 양성인 종양 세포주(MAGEA4 및 HLA-A2로 안정적으로 형질도입된 부착성 A549 세포주)와의 공동 배양에서 인터페론 감마 생산에 대해 평가하였다. 도 3b에 도시된 바와 같이, VHH-TCR의 인터페론 감마 생산은 MAGEA4 TCR보다 약 3배 더 크다. IncuCyte에 의한 생세포 영상화를 사용하여 적색 리포터로 안정적으로 형질도입된 부착성 A549.MAGEA4.HLA-A 세포주의 종양 세포 성장을 분석하였다. A549 세포는 UTD T 세포 및 CD33-DARIC 세포의 존재 하에 정상적으로 성장하였다. MAGEA4 TCR의 공동 배양은 종양 세포의 완전한 제거를 야기한 반면, VHH-TCR은 종양 세포의 완전하고 보다 신속한 제거를 초래하였다(도 3c).
VHH-TCR의 민감도는 다양한 MAGEA4 펩티드 농도로 펄스화된, MAGEA4를 발현하지 않는 A549 세포와 공동 배양을 설정함으로써 MAGEA4 TCR과 비교하였다. 도 4a에 도시된 바와 같이, MAGEA4 TCR과 비교하여, VHH-TCR은 유사한 동역학을 나타내지만, 다양한 MAGEA4 펩티드 발현과 공동 배양에서 우수한 인터페론 감마 방출을 나타낸다. VHH-TCR의 민감도는 CD33을 발현하지 않는 A549 세포와 공동 배양을 설정하여 CD33 DARIC와 비교하고, 다양한 CD33 mRNA 농도로 전기천공하였다. 도 4b 및 도 4c, 1 nm 라파마이신으로 활성화된 CD33 DARIC와 비교했을 때, VHH-TCR은 유사한 동역학을 나타내지만, 다양한 CD33 mRNA 발현과 공동 배양에서 우수한 인터페론 감마 생성을 나타낸다. 또한, 다양한 수준의 CD33을 내인성으로 발현하는 세포주와 공동 배양물을 설정하였다; HL-60은 CD33 발현이 높고, Kasumi 1은 CD33 발현이 중간 정도이고, OCI-AML3은 CD33 발현이 낮다. 도 5a 내지 도 5c에 도시된 바와 같이, VHH-TCR은 공동 배양 시 우수한 인터페론 감마를 나타내며, 이는 낮은 수준의 CD33을 발현하는 OCI-AML3에서 가장 명백하다.
실시예 2
조작된 TCR 구성의 평가
4개의 구성을 평가하였다: 1) 유대류 뮤 링커(LEKT)(서열번호 91)에 의해 분리된 TRB(T 세포 수용체 베타 사슬)에 VHH를 첨가하고, 2) 뮤 링커 + G4S(서열번호 92)에 의해 분리된 TRB에 VHH를 첨가하고, 3) 뮤 링커(서열번호 93)에 의해 분리된 TRA(T 세포 수용체 알파 사슬)에 VHH를 첨가하고, 4) 뮤 링커 + G4S(서열번호 94)에 의해 분리된 TRA에 VHH를 첨가하였다(도 6). 실시예 1에 기술된 바와 같이 TCR T 세포를 생산하였다.
또한, 유세포 계측법을 사용하여 T 세포의 세포 표면 VHH 발현을 조사하였다. iFlour488 표지된 항-카멜리드 VHH 항체(Genscript)를 사용하여 T 세포를 염색하였다. 표면 VHH 발현은 CD33 DARIC(서열번호 90)보다 VHH-TCR에서 더 높았고, 시험된 모든 배향에서 비슷하였다(도 7a). 또한, CD33에 대해 양성인 종양 세포주(CD33으로 안정적으로 형질도입된 부착성 A549 세포주)와의 공동 배양에서 T 세포의 생물학적 활성을 인터페론 감마 생성에 대해 평가하였다. 도 7b에 도시된 바와 같이, 모든 VHH-TCR의 인터페론 감마 생성은 1 nm 라파마이신으로 활성화된 CD33-DARIC보다 >2배 더 크고, 뮤 링커 + G4S에 의해 분리된 TRA에 첨가된 VHH를 갖는 VHH-TCR은 평가된 모든 작제물을 능가하였다. IncuCyte에 의한 생세포 영상화를 사용하여 적색 리포터로 안정적으로 형질도입된 A549.CD33의 종양 세포 성장을 분석하였다. A549 세포는 UTD T 세포 및 MAGEA4 TCR-T 세포의 존재 하에 정상적으로 성장하였다. 모든 VHH-TCR 또는 활성화된 CD33-DARIC와의 공동 배양은 종양 세포 제거를 초래하였으며, VHH-TCR은 DARIC보다 더 신속하게 제거를 달성하였다(도 7c).
유세포 계측법을 수행하여 모든 VHH TCR 및 MAGEA4 TCR에서 유사한 MAGEA4 사량체/HLA-다량체 결합을 평가하였다(도 8a). 또한 T 세포의 생물학적 활성을 MAGEA4에 대해 양성인 종양 세포주(MAGEA4 및 HLA-A2로 안정적으로 형질도입된 부착성 A549 세포주)와의 공동 배양에서 인터페론 감마 생산에 대해 평가하였다. 도 8b에 도시된 바와 같이, MAGEA4 TCR과 비교하여, TRB에 내장된 VHH를 갖는 VHH-TCR의 인터페론 감마 생성은 더 낮고, VHH를 뮤 링커에 의해 분리된 TRA에 첨가했을 때 약간 더 크고, 및 뮤 링커 + G4S에 의해 분리된 TRA에 VHH를 첨가했을 때 약 3배 더 높다. IncuCyte에 의한 생세포 영상화를 사용하여 적색 리포터로 안정적으로 형질도입된 부착성 A549.MAGEA4.HLA-A 세포주의 종양 세포 성장을 분석하였다. A549 세포는 UTD T 세포 및 CD33-DARIC 세포의 존재 하에 정상적으로 성장하였다. TRB에 내장된 VHH를 갖는 TCR과의 공동 배양은 종양 세포의 불완전한 제거를 가졌다. MAGEA4 TCR과의 공동 배양은 종양 세포의 완전한 제거를 초래하였고, TRA에 내장된 VHH와의 공동 배양은 종양 세포의 완전하고 보다 신속한 제거를 초래하였다(도 8c).
실시예 3
조작된 TCR에서 링커의 추가 평가
VHH 상의 링커의 유의성은 1) VHH를 뮤 링커(LEKT) + G4S(서열번호 94)에 의해 분리된 TRA에 첨가하고, 2) VHH를 1xG4S(서열번호 95)에 의해 분리된 TRA에 첨가하고, 3) VHH를 2xG4S(서열번호 96)에 의해 분리된 TRA에 첨가하였다(도 9). 실시예 1에 기술된 바와 같이 TCR T 세포를 생산하였다.
또한, 유세포 계측법을 사용하여 T 세포의 세포 표면 CD33 발현을 조사하였다. T 세포를 His 표지된 CD33-Fc 시약(Acros)을 사용하여 염색하고, APC 표지된 스트렙타비딘으로 이차 염색을 수행하였다. 표면 CD33 발현은 평가된 세 가지 포맷 모두에서 비슷하였다(도 10a). 또한, CD33에 대해 양성인 종양 세포주(CD33으로 안정적으로 형질도입된 부착성 A549 세포주)와의 공동 배양에서 T 세포의 생물학적 활성을 인터페론 감마 생성에 대해 평가하였다. 도 10b에 도시된 바와 같이, 뮤 링커 + 1G4S 및 1G4S를 갖는 VHH-TCR의 인터페론 감마 생성은 유사하였고 2G4S를 갖는 VHH-TCR에서 가장 높았다. IncuCyte에 의한 생세포 영상화를 사용하여 적색 리포터로 안정적으로 형질도입된 A549.CD33의 종양 세포 성장을 분석하였다. A549 세포는 UTD T 세포의 존재 하에 정상적으로 성장하였다. 모든 VHH-TCR과의 공동 배양은 종양 세포 제거를 초래하였다(도 10c).
유세포 계측법을 수행하여 3가지 평가 형식 모두에서 유사한 MAGEA4 사량체/HLA-다량체 결합을 평가하였다(도 11a). 또한, T 세포의 생물학적 활성을 MAGEA4에 대해 양성인 종양 세포주(MAGEA4 및 HLA-A2로 안정적으로 형질도입된 부착성 A549 세포주)와의 공동 배양에서 인터페론 감마 생성에 대해 평가하였다. 도 11b에 도시된 바와 같이, 뮤 링커 + 1G4S 및 하나의 G4S를 갖는 VHH-TCR의 인터페론 감마 생산은 두 개의 G4S를 갖는 VHH-TCR에서 비슷하고 가장 높았다. IncuCyte에 의한 생세포 영상화를 사용하여 적색 리포터로 안정적으로 형질도입된 부착성 A549.MAGEA4.HLA-A 세포주의 종양 세포 성장을 분석하였다. A549 세포는 UTD T 세포의 존재 하에 정상적으로 성장하였다. 모든 VHH-TCR과의 공동 배양은 종양 세포를 완전히 제거했으며 2개의 G4S가 있는 VHH-TCR에서 가장 빨랐다(도 11c).
실시예 4
직렬 결합제를 갖는 조작된 다중 표적 TCR의 평가
MAGEA4-반응성, HLA-A2-제한된 T 세포 수용체(TCR)에 인간 CD33 및 CLL1(서열번호 97)을 표적으로 하는 직렬 VHH와 함께 내장되었다)(도 12a 및 12b) 이는 MAGEA4를 표적화하는 공지된 TCR 및 인간 CD33 (서열번호 90), CLL1(서열번호 98), 및 CD33및 CLL1 둘 다를 직렬로 표적화하는 DARIC(이량체화제 조절된 면역수용체 복합체, 제어 가능하고 적응 가능한 항원 인식 시스템)(서열번호 99)("비교기")(도 12a)와 비교하여 발현 및 기능에 대해 평가하였다. 이중 표적화 TCR T 세포를 실시예 1과 동일한 프로토콜을 사용하여 G-REX® 플라스크를 사용하여 10일 공정에서 생산하였다.
또한, 유세포 계측법을 사용하여 T 세포의 세포 표면 CD33 발현을 조사하였다. T 세포를 His 표지된 CD33-Fc 시약(Acros)을 사용하여 염색하고 APC 표지된 스트렙타비딘으로 이차 염색하였다. 표면 CD33 발현은 CD33-CLL1-TCR에서 CD33 DARIC 및 CD33-CLL1 DARIC에 비해 더 높았다(도 13a). 또한, CD33에 대해 양성인 종양 세포주(CD33으로 안정적으로 형질도입된 부착성 A549 세포주)와의 공동 배양에서 T 세포의 생물학적 활성을 인터페론 감마 생산에 대해 평가하였다. 도 13b에 도시된 바와 같이, CD33-CLL1-TCR의 인터페론 감마 생성은 CD33-DARIC 및 CD33-CLL1 DARIC와 유사하다(후자의 2개는 1 nm 라파마이신의 첨가에 의해 활성화됨).
또한, 유세포 계측법을 사용하여 T 세포의 세포 표면 CLL1 발현 여부를 조사했다. T 세포를 PE 표지된 CLL1-Fc 시약(Creative Biomart)을 사용하여 염색하였다. 표면 CLL1 발현은 CLL1 DARIC 및 CD33-CLL1 DARIC에 비해 CD33-CLL1-TCR에서 더 높았다(도 14a). 또한, CLL1에 대해 양성인 종양 세포주(CLL1로 안정적으로 형질도입된 부착성 A549 세포주)와의 공동 배양에서 T 세포의 생물학적 활성을 인터페론 감마 생성에 대해 평가하였다CLL1. 도 14b에 도시된 바와 같이, CD33-CLL1 TCR은 CLL1 발현 세포주와의 공동 배양에서 강력한 인터페론 감마를 생성한다.
유세포 계측법을 수행하여 MAGEA4 TCR에 비해 CD33-CLL1-TCR에서 더 높은 MAGEA4 사량체/HLA-다량체 결합을 평가하였다(도 15a). 또한, T 세포의 생물학적 활성을 MAGEA4에 대해 양성인 종양 세포주(MAGEA4 및 HLA-A2로 안정적으로 형질도입된 부착성 A549 세포주)와의 공동 배양에서 인터페론 감마 생성에 대해 평가하였다. 도 15b에 도시된 바와 같이, CD33-CLL1-TCR의 인터페론 감마 생성은 MAGEA4 TCR과 유사하다.
실시예 5
VHH-기반 조작된 TCR의 평가
2개의 조작된 TCR이 구성되었으며, 각각에는 2개의 항BCMA VHH 중 하나가 내장된 MAGEA4 반응성 HLA-A2 제한된 T세포 수용체(TCR)가 포함되어 있다. 동일한 항-BCMA VHH를 CAR 포맷으로 포맷하였다. 이들은 MAGEA4를 표적으로 하는 TCR 및 BCMA를 표적으로 하는 공지된 scFv-기반 CAR("비교제")과 비교하여 발현 및 기능에 대해 평가하였다. 실시예 1과 동일한 프로토콜을 사용하여 G-REX® 플라스크를 사용하여 10일 공정에서 T 세포를 생산하였다.
유세포 계측법을 사용하여 T 세포를 세포 표면 CAR 및 TCR 발현에 대해 조사하고, MAGEA4 사량체/HLA-다량체 결합에 대해 평가하였다. PE 표지된 BCMA Fc 시약(AcroBio)을 사용하여 T 세포를 염색하였다. 표면 BCMA 결합제 발현은 BCMA 결합제를 갖는 모든 작제물에서 검출 가능하였다(도 16). VHH TCR 둘 다는 MAGEA4 사량체에 의해 강력하게 검출되었고, MAGE-A4 TCR과 비슷하였다.
T 세포의 생물학적 활성을 MAGEA4에 대해 양성인 종양 세포주(MAGEA4 MAGEA4 및 HLA-A2를 내인성으로 발현하는 부착성 A375 세포주)와의 공동 배양에서 인터페론 감마 생성에 대해 평가하였다. 도 17에 도시된 바와 같이, VHH TCR은 매우 강력한 수준의 인터페론 감마를 발현하였고, 발현은 MAGEA4 TCR과 유사하다.
T 세포의 생물학적 활성은 또한 BCMA에 대해 양성인 종양 세포주(Toledo 현탁액 세포주는 내인성으로 낮은 수준의 BCMA를 발현함)와의 공동 배양에서 인터페론 감마 생성에 대해 평가하였다. 도 18a에 도시된 바와 같이, VHH TCR은 각각의 VHH CAR과 비슷하거나 더 큰 인터페론 감마를 생성하였다. Toledo 세포와 공동 배양 시 T 세포의 생물학적 활성을 보다 민감한 분석인 인터류킨 2(IL2) 생산에 대해 추가로 평가하였다. 도 18b에 도시된 바와 같이, VHH CAR 중 어느 것도 검출 가능한 양의 IL2를 생성하지 않은 반면, VHH TCR 둘 모두는 강력한 IL2를 생성하였다. T 세포의 항원 독립적인 신호 전달을 종양 세포주가 없는 공동 배양에서 인터페론 감마 생산에 의해 평가하였다. 도 19에 도시된 바와 같이, VHH CAR은 검출 가능한 수준의 인터페론 감마 생산을 가졌지만, VHH TCR은 종양 세포가 없을 때 검출 가능한 인터페론 감마 생산이 낮거나 없었다.
실시예 6
scFV-기반 조작된 TCR의 평가
MAGEA4-반응성, HLA-A2-제한된 T 세포 수용체(TCR)에 인간 BCMA를 표적으로 하는 scFv(서열번호 100) 및 scFv와 Va 사이의 2xG4S 링커가 내장되었다(도 20a 및 20b) 이는 MAGEA4를 표적화하는 TCR(서열번호 89) 및 인간 BCMA를 표적화하는 scFv 기반 CAR(서열번호 101)("비교기")과 비교하여 발현 및 기능에 대해 평가하였다(도 20a). 이중 표적화 TCR T 세포를 실시예 1과 동일한 방식으로 생산하였다.
또한, 유세포 계측법을 사용하여 T 세포의 세포 표면CAR 발현을 조사하였다. PE 표지된 BCMA Fc 시약(AcroBio)을 사용하여 T 세포를 염색하였다. 표면 BCMA 결합제 발현은 scFv-TCR과 항-BCMA CAR 간에 비슷하였다(도 21a). 또한, 다양한 수준의 BCMA를 발현하는 종양 세포주(높은 수준의 BCMA를 과발현하도록 조작된 HT1080, RPMI-8226: 중간 수준의 내인성 BCMA 발현, Toledo: 낮은 수준의 내인성 발현)와의 공배양에서 인터페론 감마 생성에 대한 T 세포의 생물학적 활성을 평가했다. 도 21b에 도시된 바와 같이, scFv-TCR의 인터페론 감마 생성은 높은 BCMA 발현 세포주에서 항-BCMA CAR과 유사하고, 중간 및 저발현 세포주에서 더 크다. scFv-TCR의 IL2 분비는 배지 및 저 BCMA 발현 세포주와 공동 배양 시 항-BCMA CAR보다 더 컸다(도 21c). 또 다른 민감한 검정인 종양 괴사 인자 a의 분비를 도 21d에서 평가하였으며, 이는 RPMI-8226 및 Toledo, 중간 및 저발현 BCMA 세포주에서 더 컸다. IncuCyte에 의한 생세포 영상화를 위해, 적색 리포터로 안정적으로 형질도입된 HT1080.BCMA의 종양 세포 성장을 분석하였다. HT1080.BCMA 세포는 UTD T 세포 및 MAGEA4 TCR-T 세포의 존재 하에 성장하였다. scFv-TCR 또는 항-BCMA CAR과의 공동 배양은 종양 세포 제거를 초래하였으며, scFv-TCR은 CAR보다 더 신속하게 제거를 달성하였다(도 21e).
유세포 계측법을 수행하여 scFv-TCR 및 MAGEA4 TCR에서 유사한 MAGEA4 사량체/HLA-다량체 결합을 평가하였다(도 22a). ??또한, MAGEA4에 대해 양성인 종양 세포주(MAGEA4 및 HLA-A2를 내인성으로 발현하는 부착성 A375 세포주)와 공동 배양 시 T 세포의 생물학적 활성을 인터페론 감마 생성, IL2 MAGEA4 및 종양 괴사 인자에 대해 평가하였다. 도 22b에 도시된 바와 같이, VHH-TCR의 생성은 MAGEA4 TCR과 유사하다.
실시예 7
조작된 TCR의 평가
CD33 항원 단독 양성 종양 모델에서
MAGEA4-반응성, HLA-A2-제한된 T 세포 수용체(TCR)에 인간 CD33을 표적으로 하는 VHH가 내장되어 조작된 이중-표적화 TCR("VHH-TCR")을 생성하였다(서열번호 93)(도 1a 및 도 1b) 이중 표적화 TCR T 세포를 실시예 1과 동일한 방식으로 생산하였다. 실시예 1과 동일한 방식으로 조작된 T 세포의 발현 및 시험관 내 기능에 대해 평가하였다.
VHH 항원의 존재 하에 VHH-TCR이 인식하고 기능하는 능력을 NSG 마우스에서 전신 루시페라아제 태그된 HL-60 종양 모델을 사용하여 생체 내에서 평가하였다. HL-60 모델은 CD33을 발현하지만 MAGEA4는 발현하지 않으므로, 관찰된 임의의 항종양 활성은 CD33의 VHH 인식 후 VHH-TCR 신호 전달의 결과일 것이다. 루시페라아제가 태그된 HL-60 세포를 미처리 암컷 NSG 마우스에 정맥내 이식하고 5일 동안 확립시켰다. 마우스를 연구 -1일차(D-1)에 유사한 수단을 갖는 5마리의 동물로 이루어진 군에 무작위 배정하였다. D0에, 동물에게 형질도입되지 않은 T 세포, MAGE4 TCR T 세포, CD33-DARIC T 세포, 또는 VHH-TcR T 세포를 정맥내 투여하였다. T 세포 투여량을 10E6 수용체 양성 세포/마우스로 정규화하고; 형질도입되지 않은 T 세포 투여량을 최고 총 T 세포 투여량과 일치하도록 정규화하였다. CD33-DARIC T 세포로 치료한 동물을 D0에 시작하여 월요일/수요일/금요일 0.1 mg/kg 라파마이신 일정으로 유지시켰다. 도 23에 도시된 바와 같이, 종양 성장은 형질도입되지 않은 또는 MAGEA4 TCR T 세포로 치료한 동물에서 확인되지 않고 계속된다. CD33-DARIC 및 VHH-TCR T 세포 둘 다는 유사한 종양 제어를 입증한다.
실시예 8
조작된 TCR의 평가
TCR 항원 단독 양성 종양 모델에서
MAGEA4-반응성, HLA-A2-제한된 T 세포 수용체(TCR)에 인간 CD33을 표적으로 하는 VHH가 내장되어 조작된 이중-표적화 TCR("VHH-TCR")을 생성하였다(서열번호 93)(도 1a 및 도 1b) 이중 표적화 TCR T 세포를 실시예 1과 동일한 방식으로 생산하였다. 조작된 T 세포를 실시예 1과 동일한 방식으로 발현 및 시험관 내 기능에 대해 평가하였다.
TCR 항원의 존재 하에 VHH-TCR이 인식하고 기능하는 능력을 NSG 마우스에서 피하 NCI-H2023 종양 모델을 사용하여 생체 내에서 평가하였다. NCI-H2023 모델은 MAGEA4를 발현하지만 CD33은 발현하지 않으므로, 관찰된 임의의 항종양 활성은 MAGEA4의 TCR 인식 후 VHH-TCR 신호 전달의 결과일 것이다. NCI-H2023 세포를 미처리 암컷 NSG 마우스에 피하 이식하고 21일 동안 확립시켰다. 마우스를 연구 -1일차(D-1)에 유사한 수단을 갖는 5마리의 동물로 이루어진 군에 무작위 배정하였다. D0에, 동물에게 형질도입되지 않은 T 세포, MAGE4 TCR T 세포, CD33-DARIC T 세포, 또는 VHH-TCR T 세포를 정맥내 투여하였다. T 세포 투여량을 10E6 수용체 양성 세포/마우스로 정규화하고; 형질도입되지 않은 T 세포 투여량을 최고 총 T 세포 투여량과 일치하도록 정규화하였다. CD33-DARIC T 세포로 치료한 동물을 D0에 시작하여 월요일/수요일/금요일 0.1 mg/kg 라파마이신 일정으로 유지시켰다. 도 24에 도시된 바와 같이, 종양 성장은 형질도입되지 않은 세포 또는 CD33-DARIC T 세포로 치료한 동물에서 확인되지 않고 계속된다. MAGEA4 TCR 및 VHH-TCR T 세포 둘 모두는 초기에 유사한 종양 제어를 입증한다. 종양 조절의 상실은 VHH-TCR T 세포로 치료한 동물에서 더 일찍 발생한다.
실시예 9
CD19 scFv를 포함하는 조작된 TCR 작제물의 평가
MAGEA4-반응성, HLA-A2-제한된 T 세포 수용체(TCR)에는 인간 CD19(서열번호 102)를 표적으로 하는 scFv가 내장되었다. 이를 인간 BCMA(서열번호 100)를 표적으로 하는 scFv가 내장된 MAGEA4-반응성, HLA-A2-제한된 T 세포 수용체(TCR)와 비교하여 발현 및 기능에 대해 평가하였다. 이중-표적화 TCR T 세포를 실시예 1에 기술된 바와 같이 생산하였다.
또한, 유세포 계측법을 사용하여 T 세포의 세포 표면 TCR 발현을 조사하였다. T 세포는 PE 표지된 항-TCR Vb1 항체(Miltenyi Biotech)를 사용하여 염색되었다. 조작된 작제물의 표면 발현은 비슷하였다(도 25a). 또한, 현탁 종양 세포주 RPMI-8226(내인성 BCMA 발현, 검출 불가능한 CD19 발현), 및 현탁 종양 세포주 K562.CD19(검출 불가능한 BCMA 발현, CD19로 안정적으로 형질도입됨)와의 공동 배양물에서 인터페론 감마 생성을 측정함으로써 T 세포의 생물학적 활성을 평가하였다. 도 25b 및 도 25c에 도시된 바와 같이, CD19 ScFv TCR T 세포는 표면 BCMA에 대해 양성인 종양 세포주에 반응하여 BCMA ScFv TCR T 세포에 의해 생성된 인터페론 감마와 유사한 수준으로 표면 CD19에 대해 양성인 종양 세포주에 반응하여 인터페론 감마를 생성한다.
실시예 10
예시적인 조작된 TCR 작제물
본원에서 고려되는 바와 같이, 항원 결합 도메인(본원에서 "결합제" 또는 "항원 결합제"로도 지칭됨), 폴리펩티드 링커, 및 TCR은 놀랍게도 조합되어 다중 특이성을 갖는 조작된 TCR을 생성할 수 있다. 즉, 성분은 항원 결합 도메인(들) 또는 TCR(들)의 기능을 파괴하지 않고 조합될 수 있다. 따라서, 본원에서 고려되는 조작된 TCR은 놀랍게도 (1) 다중 특이성, (2) 비-MHC 제시 표적에 대한 증가된 민감도, 및 (3) 세포내 및 세포외 표적 둘 다를 동시에 표적화하는 능력을 제공한다.
조작된 TCR은 다수의 포맷으로 작제될 수 있고, 공지된 성분(예: 항원 결합 도메인, 폴리펩티드 링커, 및 TCRα 및 TCRβ 사슬) 및 기술을 사용하여 설계되고 작제될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 항원 결합 도메인(예를 들어, 하나 이상의 “A” 성분)은 표준 클로닝 기술을 사용하여 하나 이상의 폴리펩티드 링커를 갖거나 갖지 않고(예를 들어, 하나 이상의 “B” 성분과 갖거나 갖지 않고) 하나 이상의 TCR 성분(예를 들어, 하나 이상의 “C” 성분)에 연결될 수 있다. “A” 성분은 TCRα 또는 TCRβ 폴리펩티드/사슬 또는 둘 모두에 연결될 수 있고; 또는 TCRγ 또는 TCRδ 또는 둘 모두; “C” 구성 요소를 포함한다. 예시적인 일반적인 조작된 TCR 식이 아래에 제공된다:
A - C
A - B - C
본원에서 고려되는 조작된 TCR은 공지된 성분(예: TCRα 및 TCRβ 사슬, 링커, 및 항원 결합 도메인) 및 기술을 사용하여 설계되고 작제될 수 있다. 표 3은 공지된 항원 결합 도메인의 예시적인 목록을 제공한다. 표 4는 공지된 폴리펩티드 링커의 예시적인 목록을 제공한다. 표 5는 공지된 TCR의 예시적인 목록을 제공한다. 그러나 다른 공지된 항원 결합 도메인, 링커, TCR은 문헌 전반에 걸쳐 발견될 수 있고, 예를 들어, US20120082661, WO2016014789, WO2022046730, WO2016033570, US8147832B2, WO2014026054, WO2018145649, WO2014065961, WO2020123947, WO2013049254, WO2019241685, WO2019241688, WO2016049214, WO2018236870, WO2020102240, WO2018183888, US6217866B1, WO2008119566, WO2003055917, WO2018073680, WO2014146672, WO2019200007, WO2016016859, WO2018119279, WO2020227072, WO2020227073, WO2020227071, WO2017153402, WO2007042289, WO2018028647, WO2005113595, US20180273602, WO2019067242, WO2020193767, US10538572B2, US11078252B2, WO2019140100, WO2015009606, WO2021195503, WO2007131092, US20190169260을 포함하지만 이에 한정되지 않고, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로서 통합된다. 다른 공지된 항원 결합 도메인, 링커, 및 TCR이 문헌에 잘 알려져 있기 때문에, 본 발명은 표 3 내지 표 5에 개시된 예시적인 성분으로 제한하려는 것이 아니다.
본원에서 고려되는 조작된 TCR의 일 실시예로서, 표 3의 항원 결합 도메인(예를 들어, 성분 A1로부터 선택된 항원 결합 도메인)은 표 4의 하나 이상의 폴리펩티드 링커(예를 들어, 성분 B1) 및 표 5의 TCR의 TCR 가변 도메인(예를 들어, 성분 C1) 중 하나 또는 둘 다와 조합되어 신규한 조작된 TCR 작제물(예를 들어, ATOMIC 작제물 #1; 아래 참조)을 생성할 수 있다. 또한, 본원에서 추가로 도시되고 고려되는 바와 같이, 다수의 "A" 성분이 조합되어 다중특이적 항원 결합 도메인/영역(예를 들어, 직렬 항원 결합 도메인)을 생성할 수 있고, 다수의 폴리펩티드 링커가 조합되어 기능적 링커를 생성할 수 있다.
표 6은 표 3, 4, 및 5에 제공된 항원 결합 도메인, 링커, 및 TCR에 기초한 조작된 TCR(즉, ATOMIC 작제물)의 예시적인 비제한적인 목록을 제공한다. 당업자는 당업자에게 공지되거나 당업자에 의해 새롭게 개발된 다른 항원 결합 도메인, 링커, 및 TCR을 사용하는 조합을 포함하는 다른 조합이 가능하다는 것을 이해할 것이다.
당업자에게 명백한 바와 같이, 다수의 A 및 B 성분을 포함하는 특정 조작된 TCR 작제물(ATOMIC)이 고려되고, 놀랍게도 효과적이다(실시예 2 내지 9 참조).
또한, 본원에서 고려되는 조작된 TCR(ATOMIC)은 또한 천연 또는 조작된 TCR 불변 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 불변 도메인은 천연 또는 조작된 TCRα, TCRβ, TCRγ, 또는 TCRδ 불변 도메인일 수 있다. 또한, 임의의 TCR 가변 도메인은 임의의 TCR 불변 도메인과 조합될 수 있다. 예를 들어, TCRα 가변 도메인은 TCRα, TCRβ, TCRγ, 또는 TCRδ 불변 도메인 중 어느 하나와 조합될 수 있고; TCRβ 가변 도메인은 TCRα, TCRβ, TCRγ, 또는 TCRδ 불변 도메인 중 어느 하나와 조합될 수 있고; TCRγ 가변 도메인은 TCRα, TCRβ, TCRγ, 또는 TCRδ 불변 도메인 중 어느 하나와 조합될 수 있고; 및 TCRδ 가변 도메인은 TCRα, TCRβ, TCRγ, 또는 TCRδ 불변 도메인 중 어느 하나와 조합될 수 있다. 예시적인 고유 및 페어링 향상된 TCR 불변 도메인이 아래 표 7에 제공되어 있다. TCR 불변 도메인의 다른 실시예에 대해서는 WO2021195503A1도 참조하며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
대체적으로, 다음의 청구범위에서, 사용된 용어는 청구범위를 본 명세서 및 청구범위에 개시된 특정 구현예로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되며, 이러한 청구범위가 부여되는 등가물의 전체 범위와 함께 모든 가능한 구현예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 본 개시에 의해 제한되지 않는다.

Claims (147)

  1. 조작된 T 세포 수용체(TCR)로서,
    a) TCRα 가변 도메인을 포함하는 TCRα 폴리펩티드;
    b) TCRβ 가변 도메인을 포함하는 TCRβ 폴리펩티드; 및
    c) TCRα 가변 도메인 및/또는 TCRβ 가변 도메인에 연결된 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는, 조작된 TCR.
  2. 조작된 T 세포 수용체(TCR)로서,
    a) TCR γ 가변 도메인을 포함하는 TCRγ 폴리펩티드;
    b) TCRδ 가변 도메인을 포함하는 TCRδ 폴리펩티드; 및
    c) TCRγ 가변 도메인 및/또는 TCRδ 가변 도메인에 연결된 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는, 조작된 TCR.
  3. 제1항에 있어서, TCRα 폴리펩티드는 TCRα 불변 도메인을 포함하고, TCRβ 폴리펩티드는 TCRβ 불변 도메인을 포함하는, 조작된 TCR.
  4. 제2항에 있어서, TCRγ 폴리펩티드는 TCRγ 불변 도메인을 포함하고, TCRδ 폴리펩티드는 TCRδ 불변 도메인을 포함하는, 조작된 TCR.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 TCRα 또는 TCRγ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인을 포함하는, 조작된 TCR.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 TCRβ 또는 TCRδ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인을 포함하는, 조작된 TCR.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 (i) TCRα 또는 TCRγ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인, 및 (ii) TCRβ 또는 TCRδ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인을 포함하는, 조작된 TCR.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 결합 도메인은 가변 도메인의 N-말단에 연결되는, 조작된 TCR.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이하고/하거나, 제1 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이한 표적 항원에 결합하는, 조작된 TCR.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 TCRα 또는 TCRγ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함하는, 조작된 TCR.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 TCRβ 또는 TCRδ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함하는, 조작된 TCR.
  12. 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 (i) TCRα 또는 TCRγ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인에 연결된 제2 항원 결합 도메인, 및 (ii) TCRβ 또는 TCRδ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함하는, 조작된 TCR.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 결합 도메인은 제1 항원 결합 도메인의 N-말단에 연결되는, 조작된 TCR.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 제2 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이하고/하거나, 제2 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이한 표적 항원에 결합하는, 조작된 TCR.
  15. 제5항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이하고/하거나, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이한 표적 항원에 결합하는, 조작된 TCR.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 항원에 결합하는, 조작된 TCR: 알파 엽산 수용체(FRα), αv β6 인테그린, ADGRE2, BACE2, B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3 (CD276), B7-H4, B7-H6, CA19.9, 탄산 무수효소 IX(CAIX), CCR1, CD7, CD16, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a , CD79b , CD123, CD133, CD138, CD171, CD244, 암배아 항원(CEA), C형 렉틴-유사 분자-1(CLL-1), CD2 서브세트 1(CS-1), CLDN6, cMET, 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 4(CSPG4), CLDN18.2, 피부 T 세포 림프종-연관 항원 1(CTAGE1), DLL3, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII), EGFR806, 상피 당단백질 2(EGP2), 상피 당단백질 40(EGP40), EPHB2, ERBB4, 상피 세포 부착 분자(EPCAM), 에프린 A형 수용체 2(EPHA2), 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), Fc 수용체 유사 5(FCRL5), 태아 아세틸콜린에스테라아제 수용체(AchR), FLT3, FN, FN-EDB, FR베타, 강글리오시드 G2(GD2), 강글리오시드 G3(GD3), Glypican-3(GPC3), ErbB2(HER2)를 포함하는 EGFR 계열, HER2p95, EGFRv3, IL-10Rα, IL-13Rα 2, 카파, 암/고환 항원 2(LAGE-1A), K-Ras, K-Ras G12C, K-Ras G12D , K-Ras G12V, 람다, 루이스-Y(LeY), L1 세포 부착 분자(L1-CAM), LILRB2, LY6G6GD, T 세포 1(MelanA 또는 MART1)에 의해 인식되는 흑색종 항원, 메소텔린(MSLN), MMP10, MUC1, MUC16, MHC 클래스 I 사슬 관련 단백질 A(MICA), MHC 클래스 I 사슬 관련 단백질 B(MICB), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선-특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제-유사 희귀 수용체 1(ROR1), 윤활막 육종, X 중단점 2(SSX2), 서바이빈, 종양 연관 당단백질 72(TAG72), 막관통 활성제 및 CAML 상호작용기(TACI), 종양 내피 마커 1(TEM1/CD248), 종양 내피 마커 7-관련(TEM7R), TIM3, 영양아 당단백질(TPBG), UL16 결합 단백질(ULBP) 1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, 및 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2).
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 유래된 표적 폴리펩티드에 결합하는, 조작된 TCR: α-태아단백질(AFP), ASCL2, B 흑색종 항원(BAGE) 패밀리 구성원, 각인 부위 조절제의 형제(BORIS), 암-고환 항원, 암-고환 항원 83(CT-83), 탄산 탈수효소 IX(CA1X), 암배아 항원(CEA), 거대세포바이러스(CMV) 항원, 세포독성 T 세포(CTL)-인식된 흑색종 항원(CAMEL), 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스(EBV) 항원, EPHB2, G 항원 1(GAGE-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, 당단백질 100(GP100), B형 간염 바이러스(HBV) 항원, C형 간염 바이러스(HCV) 비구조 단백질 3(NS3), 인간 유두종바이러스(HPV)-E6, HPV-E7, 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT), IGF2BP3/A3, IGF2BP1, K-Ras, K-Ras G12C, K-Ras G12D, K-Ras G12V, 잠재 막 단백질 2(LMP2), LY6G6D , 흑색종 항원 패밀리 A, 1(MAGE-A1), MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4 MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원(MART-1), 메소텔린(MSLN), 뮤신 1(MUC1), 뮤신 16(MUC16), 뉴욕 식도 편평 세포 암종-1(NYESO-1), P53,P 항원(PAGE) 패밀리 구성원, PAP, PIK3CA, PIK3CA H1047R, 태반-특이적 항원 1(PLAC1), 흑색종에서 우선적으로 발현되는 항원(PRAME), 전립선 특이적 항원 PSA, 서바이빈, 활막 육종 X 1(SSX1), 활막 육종 X 2(SSX2), 활막 육종 X 3(SSX3), 활막 육종 X 4(SSX4), 활막 육종 X 5(SSX5), 활막 육종 X 8(SSX8), 갑상선글로불린, TP53 R175H, 티로시나아제, 티로시나아제 관련 단백질(TRP)1, TRP2, UBD, 빌름스(Wilms) 종양 단백질(WT-1), Wnt10A, X 항원 패밀리 구성원 1(XAGE1), 및 X 항원 패밀리 구성원 2(XAGE2).
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 CD33, CLL1, CD19, CD20, CD22, CD79A, CD79B, 또는 BCMA에 결합하는, 조작된 TCR.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 CD19, CD20, CD22, CD33, CD79A, CD79B, B7H3, Muc16, Her2, EGFR, FN-EDB, CLDN18.2, DLL3, FLT3, CLL1, CD123, 또는 BCMA에 결합하는, 조작된 TCR.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 서열번호 1 내지 32 중 어느 하나에 제시된 것과 같은 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 TCR.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 조작된 TCR: 낙타 Ig, 리마 Ig, 알파카 Ig, Ig NAR, Fab’ 단편, F(ab’)2 단편, 이중 특이적 Fab 이량체(Fab2), 삼중특이적 Fab 삼량체(Fab3), Fv, 단쇄 Fv 단백질(“scFv”), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이황화물로 안정화된 Fv 단백질(“dsFv”), 및 단일 도메인 항체(sdAb, 카멜리드 VHH, 나노바디).
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 하나 이상의 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는, 조작된 TCR.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 하나 이상의 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함하는, 조작된 TCR.
  24. 제23항에 있어서, sdAb는 카멜리드 VHH, 나노바디, 또는 중쇄로만 구성된 항체(HcAb)인, 조작된 TCR.
  25. 제23항에 있어서, sdAb는 카멜리드 VHH인, 조작된 TCR.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 또는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 조작된 TCR.
  27. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 리간드를 포함하는, 조작된 TCR.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 하나 이상의 폴리펩티드 링커에 의해 TCR 가변 도메인에 연결되는, 조작된 TCR.
  29. 제28항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 2 내지 약 25개 아미노산 길이의 링커를 포함하는, 조작된 TCR.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 4 내지 약 15개 아미노산 길이의 링커를 포함하는, 조작된 TCR.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 4 내지 약 10개 아미노산 길이의 링커를 포함하는, 조작된 TCR.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 또는 약 15개 아미노산 길이의 링커를 포함하는, 조작된 TCR.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 9 또는 약 10개 아미노산 길이의 링커를 포함하는, 조작된 TCR.
  34. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 GG, GS, SG, SS, GSS, SSG, GSG, SGS, SGG, GGS, GGGS(서열번호 53), (GGGGS)1-5 폴리펩티드(서열번호 35-39), 유대류 γμTCR(예: LEKT; 서열번호 33), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 링커를 포함하는, 조작된 TCR.
  35. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 서열번호 33에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 유대류 γμTCR로부터의 링커를 포함하는, 조작된 TCR.
  36. 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 GGGGS(서열번호 35) 링커(G4S)를 포함하는, 조작된 TCR.
  37. 제28항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 서열번호 34에 제시된 것과 같은 유대류 γμTCR 링커 및 G4S 링커를 포함하는, 조작된 TCR.
  38. 제28항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 2개의 GGGGS 링커(2xG4S)(서열번호 36)를 포함하는, 조작된 TCR.
  39. 제28항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 3개의 GGGGS 링커(3xG4S)(서열번호 37)를 포함하는, 조작된 TCR.
  40. 제28항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 서열번호 33 내지 53 중 어느 하나에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 TCR.
  41. 제10항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 제2 폴리펩티드 링커에 의해 분리되는, 조작된 TCR.
  42. 제41항에 있어서, 제2 폴리펩티드 링커는 약 2 내지 약 25개 아미노산의 길이인, 조작된 TCR.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 제2 폴리펩티드 링커는 약 4 내지 약 15개 아미노산의 길이인, 조작된 TCR.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리펩티드 링커는 GG, GS, SG, SS, GSS, SSG, GSG, SGS, SGG, GGS, GGGS (서열번호 53), (GGGGS)1-5 폴리펩티드 (서열번호 35-39), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 링커를 포함하는, 조작된 TCR.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리펩티드 링커가 서열번호 33 내지 53 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 TCR.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 가변 도메인은 MHC 복합체에 의해 제시된 표적 폴리펩티드에 결합하는, 조작된 TCR.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 가변 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 유래된 표적 폴리펩티드에 결합하는, 조작된 TCR: α-태아단백질(AFP), ASCL2, B 흑색종 항원(BAGE) 패밀리 구성원, 각인 부위 조절제의 형제(BORIS), 암-고환 항원, 암-고환 항원 83(CT-83), 탄산 탈수효소 IX(CA1X), 암배아 항원(CEA), 거대세포바이러스(CMV) 항원, 세포독성 T 세포(CTL)-인식된 흑색종 항원(CAMEL), 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스(EBV) 항원, EPHB2, G 항원 1(GAGE-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, 당단백질 100(GP100), B형 간염 바이러스(HBV) 항원, C형 간염 바이러스(HCV) 비구조 단백질 3(NS3), 인간 유두종바이러스(HPV)-E6, HPV-E7, 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT), IGF2BP3/A3, IGF2BP1, K-Ras, K-Ras G12C, K-Ras G12D, K-Ras G12V, 잠재 막 단백질 2(LMP2), LY6G6D , 흑색종 항원 패밀리 A, 1(MAGE-A1), MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4 MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원(MART-1), 메소텔린(MSLN), 뮤신 1(MUC1), 뮤신 16(MUC16), 뉴욕 식도 편평 세포 암종-1(NYESO-1), P53,P 항원(PAGE) 패밀리 구성원, PAP, PIK3CA, PIK3CA H1047R, 태반-특이적 항원 1(PLAC1), 흑색종에서 우선적으로 발현되는 항원(PRAME), 전립선 특이적 항원 PSA, 서바이빈, 활막 육종 X 1(SSX1), 활막 육종 X 2(SSX2), 활막 육종 X 3(SSX3), 활막 육종 X 4(SSX4), 활막 육종 X 5(SSX5), 활막 육종 X 8(SSX8), 갑상선글로불린, TP53 R175H, 티로시나아제, 티로시나아제 관련 단백질(TRP)1, TRP2, UBD, 빌름스(Wilms) 종양 단백질(WT-1), Wnt10A, X 항원 패밀리 구성원 1(XAGE1), 및 X 항원 패밀리 구성원 2(XAGE2).
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 가변 도메인은 MAGE-A4, PRAME, K-Ras, TP53R175H, PSA, 또는 IGF2BP3으로부터 유래된 표적 폴리펩티드에 결합하는, 조작된 TCR.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 가변 도메인은 MAGE-A4로부터 유래된 표적 폴리펩티드에 결합하는, 조작된 TCR.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, TCRα 불변 도메인은 서열번호 82 또는 88에 제시된 것과 같은 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/하거나, TCRβ 불변 도메인은 서열번호 80, 81, 86, 또는 87 중 어느 하나에 제시된 것과 같은 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 TCR.
  51. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, TCRγ 불변 도메인은 서열번호 83 또는 84에 제시된 것과 같은 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/하거나, TCRδ 불변 도메인은 서열번호 85 중 어느 하나에 제시된 것과 같은 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 TCR.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, TCRα 또는 TCRγ 폴리펩티드는 (i) 서열번호 105 내지 111 중 어느 하나에 제시된 것과 같은 아미노산 서열, 또는 (ii) 서열번호 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 및 78 중 어느 하나에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 TCRα 또는 TCRγ 가변 도메인을 포함하는, 조작된 TCR.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, TCRβ 또는 TCRδ 폴리펩티드는 (i) 서열번호 103 또는 104에 제시된 것과 같은 아미노산 서열, 또는 (ii) 서열번호 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 및 79 중 어느 하나에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 TCRβ 또는 TCRδ 가변 도메인을 포함하는, 조작된 TCR.
  54. 융합 폴리펩티드로서,
    a) TCRβ 가변 도메인을 포함하는 TCRβ 폴리펩티드;
    b) 폴리펩티드 절단 신호; 및
    c) 하나 이상의 항원 결합 도메인, 폴리펩티드 링커, 및 TCRα 가변 도메인을 포함하는 TCRα 폴리펩티드를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  55. 융합 폴리펩티드로서,
    a) 하나 이상의 항원 결합 도메인, 폴리펩티드 링커, 및 TCRβ 가변 도메인을 포함하는 TCRβ 폴리펩티드;
    b) 폴리펩티드 절단 신호; 및
    c) TCRα 가변 도메인을 포함하는 TCRα 폴리펩티드를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  56. 융합 폴리펩티드로서,
    a) 하나 이상의 항원 결합 도메인, 폴리펩티드 링커, 및 TCRβ 가변 도메인을 포함하는 TCRβ 폴리펩티드;
    b) 폴리펩티드 절단 신호; 및
    c) 하나 이상의 항원 결합 도메인, 폴리펩티드 링커, 및 TCRα 가변 도메인을 포함하는 TCRα 폴리펩티드를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  57. 융합 폴리펩티드로서,
    a) TCRγ 가변 도메인을 포함하는 TCRγ 폴리펩티드;
    b) 폴리펩티드 절단 신호; 및
    c) 하나 이상의 항원 결합 도메인, 폴리펩티드 링커, 및 TCRδ 가변 도메인을 포함하는 TCRδ 폴리펩티드를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  58. 융합 폴리펩티드로서,
    a) 하나 이상의 항원 결합 도메인, 폴리펩티드 링커, 및 TCRγ 가변 도메인을 포함하는 TCRγ 폴리펩티드;
    b) 폴리펩티드 절단 신호; 및
    c) TCRδ 가변 도메인을 포함하는 TCRδ 폴리펩티드를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  59. 융합 폴리펩티드로서,
    a) 하나 이상의 항원 결합 도메인, 폴리펩티드 링커, 및 TCRγ 가변 도메인을 포함하는 TCRγ 폴리펩티드;
    b) 폴리펩티드 절단 신호; 및
    c) 하나 이상의 항원 결합 도메인, 폴리펩티드 링커, 및 TCRδ 가변 도메인을 포함하는 TCRδ 폴리펩티드를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  60. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, TCRβ 폴리펩티드는 TCRβ 불변 도메인을 포함하고, TCRα 폴리펩티드는 TCRα 불변 도메인을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  61. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, TCRγ 폴리펩티드는 TCRγ 불변 도메인을 포함하고, TCRδ 폴리펩티드는 TCRδ 불변 도메인을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  62. 제54항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 TCRα 또는 TCRγ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  63. 제54항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 TCRβ 또는 TCRδ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  64. 제54항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 (i) TCRα 또는 TCRγ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인, 및 (ii) TCRβ 또는 TCRδ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  65. 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 결합 도메인은 가변 도메인의 N-말단에 연결되는, 융합 폴리펩티드.
  66. 제62항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이하고/하거나, 제1 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이한 표적 항원에 결합하는, 융합 폴리펩티드.
  67. 제62항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 TCRα 또는 TCRγ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  68. 제62항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 하나 이상의 항원 결합 도메인은 TCRβ 또는 TCRδ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인에 연결되는, 융합 폴리펩티드.
  69. 제62항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 (i) TCRα 또는 TCRγ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인에 연결된 제2 항원 결합 도메인, 및 (ii) TCRβ 또는 TCRδ 가변 도메인에 연결된 제1 항원 결합 도메인에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  70. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 결합 도메인은 제1 항원 결합 도메인의 N-말단에 연결되는, 융합 폴리펩티드.
  71. 제69항 또는 제70항에 있어서, 제2 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이하고/하거나, 제2 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이한 표적 항원에 결합하는, 융합 폴리펩티드.
  72. 제67항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이하고/하거나, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이한 표적 항원에 결합하는, 융합 폴리펩티드.
  73. 제54항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 항원에 결합하는, 융합 폴리펩티드: 알파 엽산 수용체(FRα), αv β6 인테그린, ADGRE2, BACE2, B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3 (CD276), B7-H4, B7-H6, CA19.9, 탄산 무수효소 IX(CAIX), CCR1, CD7, CD16, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a , CD79b , CD123, CD133, CD138, CD171, CD244, 암배아 항원(CEA), C형 렉틴-유사 분자-1(CLL-1), CD2 서브세트 1(CS-1), CLDN6, cMET, 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 4(CSPG4), CLDN18.2, 피부 T 세포 림프종-연관 항원 1(CTAGE1), DLL3, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII), EGFR806, 상피 당단백질 2(EGP2), 상피 당단백질 40(EGP40), EPHB2, ERBB4, 상피 세포 부착 분자(EPCAM), 에프린 A형 수용체 2(EPHA2), 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), Fc 수용체 유사 5(FCRL5), 태아 아세틸콜린에스테라아제 수용체(AchR), FLT3, FN, FN-EDB, FR베타, 강글리오시드 G2(GD2), 강글리오시드 G3(GD3), Glypican-3(GPC3), ErbB2(HER2)를 포함하는 EGFR 계열, HER2p95, EGFRv3, IL-10Rα, IL-13Rα 2, 카파, 암/고환 항원 2(LAGE-1A), K-Ras, K-Ras G12C, K-Ras G12D , K-Ras G12V, 람다, 루이스-Y(LeY), L1 세포 부착 분자(L1-CAM), LILRB2, LY6G6GD, T 세포 1(MelanA 또는 MART1)에 의해 인식되는 흑색종 항원, 메소텔린(MSLN), MMP10, MUC1, MUC16, MHC 클래스 I 사슬 관련 단백질 A(MICA), MHC 클래스 I 사슬 관련 단백질 B(MICB), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선-특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제-유사 희귀 수용체 1(ROR1), 윤활막 육종, X 중단점 2(SSX2), 서바이빈, 종양 연관 당단백질 72(TAG72), 막관통 활성제 및 CAML 상호작용기(TACI), 종양 내피 마커 1(TEM1/CD248), 종양 내피 마커 7-관련(TEM7R), TIM3, 영양아 당단백질(TPBG), UL16 결합 단백질(ULBP) 1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, 및 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2).
  74. 제54항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 유래된 표적 폴리펩티드에 결합하는, 융합 폴리펩티드: α-태아단백질(AFP), ASCL2, B 흑색종 항원(BAGE) 패밀리 구성원, 각인 부위 조절제의 형제(BORIS), 암-고환 항원, 암-고환 항원 83(CT-83), 탄산 탈수효소 IX(CA1X), 암배아 항원(CEA), 거대세포바이러스(CMV) 항원, 세포독성 T 세포(CTL)-인식된 흑색종 항원(CAMEL), 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스(EBV) 항원, EPHB2, G 항원 1(GAGE-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, 당단백질 100(GP100), B형 간염 바이러스(HBV) 항원, C형 간염 바이러스(HCV) 비구조 단백질 3(NS3), 인간 유두종바이러스(HPV)-E6, HPV-E7, 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT), IGF2BP3/A3, IGF2BP1, K-Ras, K-Ras G12C, K-Ras G12D, K-Ras G12V, 잠재 막 단백질 2(LMP2), LY6G6D , 흑색종 항원 패밀리 A, 1(MAGE-A1), MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4 MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원(MART-1), 메소텔린(MSLN), 뮤신 1(MUC1), 뮤신 16(MUC16), 뉴욕 식도 편평 세포 암종-1(NYESO-1), P53,P 항원(PAGE) 패밀리 구성원, PAP, PIK3CA, PIK3CA H1047R, 태반-특이적 항원 1(PLAC1), 흑색종에서 우선적으로 발현되는 항원(PRAME), 전립선 특이적 항원 PSA, 서바이빈, 활막 육종 X 1(SSX1), 활막 육종 X 2(SSX2), 활막 육종 X 3(SSX3), 활막 육종 X 4(SSX4), 활막 육종 X 5(SSX5), 활막 육종 X 8(SSX8), 갑상선글로불린, TP53 R175H, 티로시나아제, 티로시나아제 관련 단백질(TRP)1, TRP2, UBD, 빌름스(Wilms) 종양 단백질(WT-1), Wnt10A, X 항원 패밀리 구성원 1(XAGE1), 및 X 항원 패밀리 구성원 2(XAGE2).
  75. 제54항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 CD33, CLL1, CD19, CD20, CD22, CD79A, CD79B, 또는 BCMA에 결합하는, 융합 폴리펩티드.
  76. 제54항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 CD19, CD20, CD22, CD33, CD79A, CD79B, B7H3, Muc16, Her2, EGFR, FN-EDB, CLDN18.2, DLL3, FLT3, CLL1, CD123, 또는 BCMA에 결합하는, 조작된 TCR.
  77. 제54항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 서열번호 1 내지 32 중 어느 하나에 제시된 것과 같은 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 TCR.
  78. 제54항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, 융합 폴리펩티드: 낙타 Ig, 리마 Ig, 알파카 Ig, Ig NAR, Fab’ 단편, F(ab’)2 단편, 이중 특이적 Fab 이량체(Fab2), 삼중특이적 Fab 삼량체(Fab3), Fv, 단쇄 Fv 단백질(“scFv”), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이황화물로 안정화된 Fv 단백질(“dsFv”), 및 단일 도메인 항체(sdAb, 카멜리드 VHH, 나노바디).
  79. 제54항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 하나 이상의 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  80. 제54항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 하나 이상의 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  81. 제80항에 있어서, sdAb는 카멜리드 VHH, 나노바디, 또는 중쇄로만 구성된 항체(HcAb)인, 융합 폴리펩티드.
  82. 제80항에 있어서, sdAb는 카멜리드 VHH인, 융합 폴리펩티드.
  83. 제74항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 또는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 융합 폴리펩티드.
  84. 제54항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 리간드를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  85. 제54항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 하나 이상의 폴리펩티드 링커에 의해 TCR 가변 도메인에 연결되는, 융합 폴리펩티드.
  86. 제85항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 2 내지 약 25개 아미노산 길이의 링커를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  87. 제85항 또는 제86항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 4 내지 약 15개 아미노산 길이의 링커를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  88. 제85항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 4 내지 약 10개 아미노산 길이의 링커를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  89. 제85항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 또는 약 15개 아미노산 길이의 링커를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  90. 제85항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 9개 또는 약 10개 아미노산 길이의 링커를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  91. 제85항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 GG, GS, SG, SS, GSS, SSG, GSG, SGS, SGG, GGS, GGGS(서열번호 53), (GGGGS)1-5 폴리펩티드(서열번호 35-39), 유대류 γμTCR(예: LEKT; 서열번호 33), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 링커를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  92. 제85항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 서열번호 33에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 유대류 γμTCR로부터의 링커를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  93. 제85항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 GGGGS(서열번호 35) 링커(G4S)를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  94. 제85항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 서열번호 34에 제시된 것과 같은 유대류 γμTCR 링커 및 G4S 링커를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  95. 제85항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 2개의 GGGGS 링커(2xG4S)(서열번호 36)를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  96. 제85항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 3개의 GGGGS 링커(3xG4S)(서열번호 37)를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  97. 제85항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 서열번호 33-53 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  98. 제67항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 제2 폴리펩티드 링커에 의해 분리되는, 융합 폴리펩티드.
  99. 제98항에 있어서, 제2 폴리펩티드 링커의 길이는 약 2 내지 약 25개 아미노산인, 융합 폴리펩티드.
  100. 제98항 또는 제99항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 약 4 내지 약 15개 아미노산 길이의 링커를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  101. 제98항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리펩티드 링커는 GG, GS, SG, SS, GSS, SSG, GSG, SGS, SGG, GGS, GGGS (서열번호 53), (GGGGS)1~5 폴리펩티드 (서열번호 35-39), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 링커를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  102. 제98항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리펩티드 링커는 서열번호 33-53 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  103. 제54항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 가변 도메인은 MHC 복합체에 의해 제시된 표적 폴리펩티드에 결합하는, 융합 폴리펩티드.
  104. 제54항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 가변 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 유래된 표적 폴리펩티드에 결합하는, 융합 폴리펩티드: α-태아단백질(AFP), ASCL2, B 흑색종 항원(BAGE) 패밀리 구성원, 각인 부위 조절제의 형제(BORIS), 암-고환 항원, 암-고환 항원 83(CT-83), 탄산 탈수효소 IX(CA1X), 암배아 항원(CEA), 거대세포바이러스(CMV) 항원, 세포독성 T 세포(CTL)-인식된 흑색종 항원(CAMEL), 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스(EBV) 항원, EPHB2, G 항원 1(GAGE-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, 당단백질 100(GP100), B형 간염 바이러스(HBV) 항원, C형 간염 바이러스(HCV) 비구조 단백질 3(NS3), 인간 유두종바이러스(HPV)-E6, HPV-E7, 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT), IGF2BP3/A3, IGF2BP1, K-Ras, K-Ras G12C, K-Ras G12D, K-Ras G12V, 잠재 막 단백질 2(LMP2), LY6G6D , 흑색종 항원 패밀리 A, 1(MAGE-A1), MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4 MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원(MART-1), 메소텔린(MSLN), 뮤신 1(MUC1), 뮤신 16(MUC16), 뉴욕 식도 편평 세포 암종-1(NYESO-1), P53,P 항원(PAGE) 패밀리 구성원, PAP, PIK3CA, PIK3CA H1047R, 태반-특이적 항원 1(PLAC1), 흑색종에서 우선적으로 발현되는 항원(PRAME), 전립선 특이적 항원 PSA, 서바이빈, 활막 육종 X 1(SSX1), 활막 육종 X 2(SSX2), 활막 육종 X 3(SSX3), 활막 육종 X 4(SSX4), 활막 육종 X 5(SSX5), 활막 육종 X 8(SSX8), 갑상선글로불린, TP53 R175H, 티로시나아제, 티로시나아제 관련 단백질(TRP)1, TRP2, UBD, 빌름스(Wilms) 종양 단백질(WT-1), Wnt10A, X 항원 패밀리 구성원 1(XAGE1), 및 X 항원 패밀리 구성원 2(XAGE2).
  105. 제54항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 가변 도메인은 MAGE-A4, PRAME, K-Ras, TP53R175H, PSA, 또는 IGF2BP3으로부터 유래된 표적 폴리펩티드에 결합하는, 융합 폴리펩티드.
  106. 제54항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 가변 도메인은 MAGE-A4로부터 유래된 표적 폴리펩티드에 결합하는, 융합 폴리펩티드.
  107. 제54항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, TCRα 불변 도메인은 서열번호 82 또는 88에 제시된 것과 같은 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/하거나, TCRβ 불변 도메인은 서열번호 80, 81, 86, 또는 87 중 어느 하나에 제시된 것과 같은 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 TCR.
  108. 제54항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, TCRγ 불변 도메인은 서열번호 83 또는 84에 제시된 것과 같은 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/하거나, TCRδ 불변 도메인은 서열번호 85 중 어느 하나에 제시된 것과 같은 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 TCR.
  109. 제54항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, TCRα 또는 TCRγ 폴리펩티드는 (i) 서열번호 105 내지 111 중 어느 하나에 제시된 것과 같은 아미노산 서열, 또는 (ii) 서열번호 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 및 78 중 어느 하나에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 TCRα 또는 TCRγ 가변 도메인을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  110. 제54항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, TCRβ 또는 TCRδ 폴리펩티드는 서열번호 103 또는 104 중 어느 하나에 제시된 것과 같은 아미노산 서열, 또는 (ii) 서열번호 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 및 79 중 어느 하나에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 TCRβ 또는 TCRδ 가변 도메인을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  111. 제54항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 절단 신호는 바이러스 자가 절단 펩티드 또는 리보솜 스키핑 서열인, 융합 폴리펩티드.
  112. 제54항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 절단 신호는 바이러스 2A 펩티드인, 융합 폴리펩티드.
  113. 제54항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 절단 신호는 아프토바이러스 2A 펩티드, 포티바이러스 2A 펩티드, 또는 카디오바이러스 2A 펩티드인, 융합 폴리펩티드.
  114. 제54항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 절단 신호는 구제역 바이러스(FMDV) 2A 펩티드, 말 비염 A 바이러스(ERAV) 2A 펩티드, 토세아 아시그나 바이러스(TaV) 2A 펩티드, 돼지 테스코바이러스-1(PTV-1) 2A 펩티드, 테일로바이러스 2A 펩티드, 및 뇌심근염 바이러스 2A 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스 2A 펩티드인, 융합 폴리펩티드.
  115. 제111항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 절단 신호는 자가 절단 펩티드의 상류에 있는 퓨린 인식 부위를 포함하고, 임의로 퓨린 인식 부위는 서열번호 112에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  116. 제54항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 절단 신호는 서열번호 113-137 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  117. 제54항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, TCRβ 또는 TCRδ 폴리펩티드는 TCRα 또는 TCRγ 폴리펩티드의 N-말단에 있는, 융합 폴리펩티드.
  118. 제54항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, TCRα 또는 TCRγ 폴리펩티드는 TCRβ 또는 TCRδ 폴리펩티드의 N-말단에 있는, 융합 폴리펩티드.
  119. 제54항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, TCRα 및 TCRβ 폴리펩티드는 N-말단 신호 서열을 각각 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  120. 제54항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, TCRγ 및 TCRδ 폴리펩티드는 N-말단 신호 서열을 각각 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  121. 제119항 또는 제120항에 있어서, 신호 서열은 동일하거나 상이한, 융합 폴리펩티드.
  122. 제119항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 서열은 IgK 또는 TCRα 신호 서열인, 융합 폴리펩티드.
  123. 제54항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 91 내지 97, 100 및 102 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  124. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 조작된 TCR의 TCR 폴리펩티드 또는 제54항 내지 제123항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  125. 제124항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  126. 제125항에 있어서, 벡터는 발현 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터인, 벡터.
  127. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 따른 조작된 TCR, 제54항 내지 제123항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩티드, 제124항에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는 제125항 또는 제126항에 따른 벡터를 포함하는 세포.
  128. 제127항에 있어서, 세포는 조혈 세포인, 세포.
  129. 제127항 또는 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 T 세포, αβ T 세포, 또는 γδ T 세포인, 세포.
  130. 제127항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 CD3+, CD4+, 및/또는 CD8+ 세포인, 세포.
  131. 제127항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 면역 효과기 세포인, 세포.
  132. 제127항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 세포독성 T 림프구(CTL), 종양 침윤 림프구(TIL), 또는 헬퍼 T 세포인, 세포.
  133. 제127항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 T 세포, 자연살해(NK) 세포, 또는 자연살해 T(NKT) 세포인, 세포.
  134. 제127항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 공급원은 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위에서 유래된 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직, 또는 종양인, 세포.
  135. 제127항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 단리된 비천연 세포인, 세포.
  136. 제127항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 대상체로부터 수득되는, 세포.
  137. 제127항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 인간 세포인, 세포.
  138. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 조작된 TCR, 제54항 내지 제123항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩티드, 제124항의 폴리뉴클레오티드, 제125항 또는 제126항의 벡터 또는 제127항 내지 제137항 중 어느 한 항의 세포를 포함하는 조성물.
  139. 약학적 조성물로서, 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 약학적으로 허용 가능한 담체 및 조작된 TCR, 제54항 내지 제123항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩티드, 제124항의 폴리뉴클레오티드, 제125항 또는 제126항의 벡터 또는 제127항 내지 제137항 중 어느 한 항의 세포를 포함하는, 약학적 조성물.
  140. 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 제127항 내지 제137항 중 어느 한 항의 세포, 제138항의 조성물, 또는 제139항의 약학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  141. 암, 감염성 질환, 자가면역 질환, 염증성 질환, 및 면역 결핍증, 또는 이와 관련된 병태의 적어도 하나의 증상을 치료, 예방, 또는 개선하는 방법으로서, 제127항 내지 제137항 중 어느 한 항의 세포, 제138항의 조성물, 또는 제139항의 약학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  142. 고형 암을 치료하는 방법으로서, 제127항 내지 제137항 중 어느 한 항의 세포, 제138항의 조성물, 또는 제139항의 약학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  143. 제142항에 있어서, 고형암은 폐암, 편평 세포 암종, 대장암, 췌장암, 유방암, 갑상선암, 방광암, 자궁경부암, 식도암, 난소암, 위암, 자궁내막암, 뇌암, 또는 육종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  144. 제142항에 있어서, 고형 암은 비소세포폐암종(NSCLC), 소세포폐암종(SCLC), 두경부 편평 세포 암종, 대장암, 췌장암, 유방암, 갑상선암, 방광암, 자궁경부암, 식도암, 난소암, 위암, 자궁내막암, 신경교종, 신경아세포종, 희돌기아교종, 육종 또는 골육종인, 방법.
  145. 혈액암을 치료하는 방법으로서, 제127항 내지 제137항 중 어느 한 항의 세포, 제138항의 조성물, 또는 제139항의 약학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  146. 제145항에 있어서, 혈액암은 백혈병, 림프종, 또는 다발성 골수종인, 방법.
  147. 제145항 또는 제146항에 있어서, 혈액암은 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프구성 백혈병(ALL)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.



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