CN109485732B

CN109485732B - 基因工程修饰的双靶点嵌合抗原受体及其用途

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Publication number: CN109485732B
Application number: CN201811567513.5A
Authority: CN
Inventors: 王永生; 李丹; 杨骐毓; 马启智
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2018-12-20
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2021-09-24
Anticipated expiration: 2038-12-20
Also published as: EP3950718A4; WO2020125277A1; US20220185893A1; CN109485732A; EP3950718A1

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种基因工程修饰的双靶点嵌合抗原受体。针对肿瘤细胞暴露于浆膜腔积液后出现的肿瘤细胞和免疫细胞的PD‑L1表达上调这一现象，本发明提供一种基因工程修饰的双靶点嵌合抗原受体及其宿主细胞。本发明的双靶点嵌合抗原受体会竞争结合到PD‑L1，将PD‑L1的抑制信号转化为激活信号，增强T细胞杀伤活性，同时在其下游引入的4‑1BB能促进T细胞增殖、存活。本发明还公开了表达上述双靶点抗原受体的宿主细胞，以及它们在预防或治疗恶性肿瘤/实体瘤中的用途。

Description

基因工程修饰的双靶点嵌合抗原受体及其用途

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种基因工程修饰的双靶点嵌合抗原受体，本发明还涉及表达所述嵌合抗原受体的免疫反应细胞，以及所述抗原受体、免疫反应细胞在制备诊断治疗恶性肿瘤或实体瘤的药物中的用途。

背景技术

2013年，Science杂志将肿瘤的免疫治疗列为年度十大科技进展之首，其中CAR-T细胞治疗与CTLA-4、PD-1/PD-L1抗体治疗被认为肿瘤免疫治疗三大进展。利用抗原抗体scFv片段，联合T细胞胞内激活、增殖信号，构建嵌合型抗原受体(Chimeric antigenreceptor，CAR)修饰的T细胞(CAR-T)，可使T细胞直接获得抗体的特异识别能力、成为不依赖HLA(人类白细胞抗原)限制的效应T细胞。获得的CAR-T细胞的杀伤活性主要依赖CAR-T细胞表面的单链受体识别抗原，具有特异的杀伤活性。临床研究证实这类CAR-T能够在体内扩增，长期存活并形成免疫记忆，即使对难治性血液肿瘤也显示出高效的抗肿瘤活性。遗憾的是，CAR-T在实体瘤的治疗中面临巨大挑战，至今在临床应用上进展缓慢。

CAR-T用于实体瘤的全身治疗，存在几大挑战：(1)多数实体瘤治疗靶点都是肿瘤相关抗原(Tumor-associated antigens,TAA)。由于TAA表达在正常组织，靶向TAA存在潜在毒性，采用CAR-T细胞靶向Her2、MART1、CAIX在临床治疗中都观察“on-target”毒性，提示针对TAA的全身CAR-T治疗需要慎重设计；(2)CAR-T细胞治疗实体肿瘤，CAR-T细胞通过血管进入实体瘤内部是发挥治疗效应的重要步骤，但是CAR-T常常难以穿过血管基底膜，影响治疗疗效；(3)实体瘤内部为抑制性的免疫抑制微环境，可分泌TGF-β，激活PD-1/PD-L1抑制信号，通过免疫抑制细胞MDSC和Treg等来抑制效应细胞活性。由此可知，将CAR-T用于全身CAR-T治疗目前还存在诸多困难。

我们认为，将CAR-T用于实体瘤的局部治疗在一定程度上可以回避上述挑战，在特定实体瘤患者的特定情况中发挥积极作用。在本研究中，我们拟将CAR-T用于浆膜腔输注(Serous cavity infusion)来预防和治疗恶性肿瘤的浆膜腔转移，探讨CAR-T在浆膜腔的抗肿瘤效应及其免疫机制。

恶性肿瘤，如肺癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、淋巴瘤等肿瘤易发生胸腔、腹腔以及心包腔的浆膜腔转移，常常造成胸腔、腹腔扩散或者进一步合并恶性浆膜腔积液，危害极大。肿瘤患者胸腹腔发生转移合并胸腔或腹腔积液，常常难以耐受全身治疗，临床上即使采用引流+灌注化疗进行治疗，疗效仍然有限，呼吸困难、肠梗阻等并发症严重影响患者生理功能及生活质量，中位生存期常常只有3-6个月。此外，部分肿瘤患者术后常常仅仅表现为浆膜腔播散，如腹膜癌扩散(Peritoneal carcinomatosis，PC)，这些患者有条件通过接受肿瘤减灭术联合腹膜内热灌注化疗来显著延长生存率。但遗憾的是，即使接受减瘤术联合腹膜内热灌注化疗的患者，治疗后三年内约80％的患者会出现腹膜内复发，其原因在于不能有效清除腹腔内的肿瘤细胞。因此，对于这些浆膜腔转移患者，尽管局部治疗是目前主要治疗手段，但疗效有限。我们的前期研究发现：肿瘤细胞一旦暴露在胸腹腔的恶性积液中，就会发生上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)，并进一步产生高频率肿瘤干细胞(Cancer stem cell,CSC)，这群细胞高表达耐药蛋白ABCB1及ABCG2，产生治疗抵抗。

研究表明，CAR-T细胞对CSC也具有有效的杀伤活性。目前已有研究探讨CAR-T的局部应用，如在靶向Mesothelin(间皮素)的MSLNCAR-T在动物实验中采用胸腔局部输注治疗肿瘤证实了局部使用的有效性和安全性。因此，采用嵌合抗原受体(CAR-T)有望成为预防和治疗恶性肿瘤/实体瘤的浆膜腔转移的有效手段，但目前国内外对浆膜腔环境下CAR-T的应用研究极为有限。

采用CAR-T浆膜腔输注治疗，具备两大优势：一是安全，全身毒性小。CAR-T对肿瘤细胞具有特异杀伤活性，完全依赖于靶向的肿瘤抗原，也会杀伤表达抗原的正常组织。CAR-T在浆膜腔发挥杀伤作用，即使大规模增殖，不易大量进入血液循环，且易于局部处理，可消除潜在毒性。二是CAR-T细胞的治疗靶点得到延伸，更多的TAA可以作为治疗靶点。由于浆膜腔主要为结缔组织包裹，与上皮来源的肿瘤细胞表达谱差异较大，大量上皮源性的抗原可能成为潜在治疗靶点；更重要的是，CAR-T发挥作用，关键依赖抗原，不依赖肿瘤来源，CAR-T因而具有广谱杀瘤活性(对表达该抗原的多种肿瘤具备杀伤活性)，临床上也因此可以将浆膜腔转移作为独立适应症来进行治疗。

在浆膜腔环境中，肿瘤细胞和免疫细胞都会上调PD-L1来逃脱免疫攻击。研究发现，阻断PD-1/PD-L1信号能够增加CAR-T治疗疗效，但临床治疗成本昂贵，肿瘤细胞经过恶性积液处理，仍然会高表达VEGFR1或HER2。

针对肿瘤细胞在浆膜腔积液暴露后出现肿瘤细胞和免疫细胞的PD-L1表达上调这一挑战，我们在前期基础上设计构建了同时靶向VEGFR1(或HER2)和PD-L1的双靶点CAR病毒载体。该发明以VEGFR1(或HER2)及PD-L1双靶向CAR-T(dual CAT-T)为例，说明包含PD-L1靶点的双靶点嵌合抗原受体能消除肿瘤细胞的免疫逃逸，解除免疫细胞的免疫抑制，预防和治疗恶性肿瘤/实体瘤，并用于临床相关预防与治疗。

发明内容

针对上述肿瘤细胞暴露于浆膜腔积液后出现的肿瘤细胞和免疫细胞的PD-L1表达上调这一现象，本发明提供一种基因工程修饰的双靶点嵌合抗原受体及其宿主细胞。

本发明要解决的第一个技术问题为：提供一种基因工程修饰的双靶点嵌合抗原受体，所述的双靶点嵌合抗原受体可结合两个不同的靶点，传递两种信号。

本发明基因工程修饰的双靶点嵌合抗原受体，所述的双靶点嵌合抗原受体由嵌合抗原受体1和能够识别PD-L1的嵌合抗原受体2通过连接肽连接而成。

其中，上述基因工程修饰的双靶点嵌合抗原受体中，所述的嵌合抗原受体2包括：PD-L1的单链抗体、跨膜区和胞内结构域。

进一步的，所述的PD-L1的单链抗体是指能够结合肿瘤细胞或免疫细胞表面PD-L1分子的PD-L1的单链抗体。

进一步的，所述跨膜区为CD8跨膜区。

进一步的，所述的胞内结构域为4-1BB胞内结构域。

其中，所述的嵌合抗原受体2组成为：人体的PD-L1的scFv、CD8跨膜区、4-1BB共刺激分子肽段。

具体的，所述的嵌合抗原受体2的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示。

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSAAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL。

进一步的，所述的嵌合抗原受体2的编码核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示：

gacatccaaatgacccagagccctagctccctgtccgctagcgtgggcgacagggtgaccatcacctgcagagccagccaggacgtgagcaccgccgtggcctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacagcgcctccttcctgtactccggcgtgccctccagatttagcggcagcggcagcggcacagacttcaccctcaccatcagctccctgcagcctgaggacttcgccacatactactgccagcagtacctctaccaccctgccaccttcggccaaggcaccaaggtggagatcaagggcggcggaggttctggcggaggcggctccggaggaggaggcagcgaagtgcagctggtggagagcggaggaggactggtgcagcctggcggaagcctgaggctgagctgtgctgccagcggcttcaccttctccgactcctggattcattgggtcaggcaggcccccggaaaaggactggagtgggtcgcctggatctccccttacggcggcagcacctactacgccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcgccgataccagcaagaacaccgcctacctgcagatgaactccctgagggctgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggaggcactggcctggcggattcgactactggggccagggcaccctggtgaccgtgtccgccgccgccgccttcgtgcctgtgtttctgcccgccaagcccaccaccacacctgctcccagacctcccacacctgcccctaccatcgctagccagcccctgagcctgagacccgaggcttgtaggcctgctgctggcggagccgtgcacacaagaggcctggacttcgcctgcgacatctacatctgggcccccctggccggaacatgtggagtgctgctgctgagcctggtgatcaccctgtactgcaaccacaggaacaggttcagcgtggtgaagaggggcaggaagaagctgctgtacatcttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcagaccacccaggaggaggatggctgcagctgcaggttccctgaagaggaggagggcggctgcgagctgtga。

其中，所述的嵌合抗原受体1包括：能够结合肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的单链抗体、跨膜区和胞内免疫受体酪氨酸活化基序。

其中，所述的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原为CD19、CD20、MUC1、EGFR、EGFRvIII、HER2、ERBB3、ERBB4、VEGFR1、VEGFR2、EpCAM、CD44或IGFR中的至少一种。

其中，所述的能够结合肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的单链抗体是指能够结合EGFR家族蛋白，包括EGFR、HER2、ERBB3、ERBB4或EGFRvIII、VEGFR1、VEGFR2、EpCAM、CD19、CD20、CD44的单链抗体。优选地，所述单链抗体为VEGFR1scFv或HER2scFv。

其中，所述的跨膜区为CD28、CD8、CD3δ、CD134、CD137、ICOS、DAP10或CD27跨膜区中的至少一种。优选的，所述嵌合抗原受体1和2的跨膜区选择不不同的跨膜区。更优选的，所述嵌合抗原受体1的跨膜区为CD28跨膜区，所述嵌合抗原受体2的跨膜区为CD8跨膜区。

其中，上述胞内免疫受体酪氨酸活化基序包含选自CD3δ或FcεRI的免疫受体酪氨酸活化基序信号链。

其中，上述嵌合抗原受体1组成为：信号肽、人体的VEGFR1的scFv、CD28跨膜区、CD3δ结合域。

所述信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：11所示：

MALPVTALLLPLALLLHAARP。

所述信号肽的核苷酸序列为SEQ ID NO：12所示：

atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccg。

进一步的，所述的嵌合抗原受体1的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示：

MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQAQVVESGGGVVQSGRSLRLSCAASGFAFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVRGRFTISRDNSENTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDHYGSGVHHYFYYGLDVWGQGTTVTVSSKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

进一步的，所述的嵌合抗原受体1的核苷酸序列为SEQ ID NO：4所示：

atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggagatcgtgctgacacagagccctggcaccctgagcctgtcccccggcgaaagagccaccctgtcctgcagagccagccagagcgtgagcagctcctatctggcctggtaccagcagaagcctggccaggcccccagactcctgatctacggcgccagcagcagagccaccggcatccccgatagattcagcggctccggcagcggaaccgactttaccctgaccatctccagactggagcccgaggactttgccgtgtactactgccagcagtacggcagcagccccctgacattcggcggcggcacaaaggtggagatcaaaggcggcggaggttctggaggaggaggaagcggaggaggaggcagccaggctcaggtggtcgaaagcggcggaggagtggtgcagagcggaaggtccctgaggctgagctgcgctgctagcggctttgccttctcctcctacggcatgcactgggtgagacaggcccctggcaagggcctggaatgggtggctgtgatctggtacgacggcagcaacaagtactacgccgacagcgtgaggggcaggttcaccatcagcagggacaacagcgaaaacaccctgtacctgcagatgaacagcctcagggccgaggataccgccgtgtattattgcgccagggatcactacggaagcggcgtgcaccattacttctattacggcctggacgtgtggggccagggcacaacagtgaccgtgtccagcaaaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc。

另一方面，上述嵌合抗原受体1组成为：信号肽、人体的HER2的scFv、CD28跨膜区、CD3δ结合域。

所述的信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：11所示。

信号肽的核苷酸序列为SEQ ID NO：12所示。

进一步的，所述的嵌合抗原受体1的氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示：

MALPVTALLLPLALLLHAARPMQVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYPFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTSTGESTFADDFKGRFDFSLETSANTAYLQINNLKSEDSATYFCARWEVYHGYVPYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSHKFLSTSVGDRVSITCKASQDVYNAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASSRYTGVPSRFTGSGSGPDFTFTISSVQAEDLAVYFCQQHFRTPFTFGSGTKLEIKKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

进一步的，所述的嵌合抗原受体1的编码核苷酸序列为SEQ ID NO：6所示：

atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgatgcaggtacaactgcagcagtcaggacctgaactgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcctctgggtatcctttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggacagggtttaaagtggatgggctggattaacacctccactggagagtcaacatttgctgatgacttcaagggacggtttgacttctctttggaaacctctgccaacactgcctatttgcagatcaacaacctcaaaagtgaagactcggctacatatttctgtgcaagatgggaggtttaccacggctacgttccttactggggccaagggaccacggtcaccgtttcctctggcggtggcggttctggtggcggtggctccggcggtggcggttctgacatccagctgacccagtctcacaaattcctgtccacttcagtaggagacagggtcagcatcacctgcaaggccagtcaggatgtgtataatgctgttgcctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaacttctgatttactcggcatcctcccggtacactggagtcccttctcgcttcactggcagtggctctgggccggatttcactttcaccatcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttatttctgtcagcaacattttcgtactccattcacgttcggctcggggacaaaattggagatcaaaaaaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa。

其中，所述的连接肽为Furin或P2A的至少一种。

连接肽P2A的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，编码连接肽P2A的核苷酸序列如SEQID NO:8所示。连接肽Furin的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，编码连接肽Furin的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示

SEQ ID NO:7连接肽P2A的氨基酸序列：

SGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP。

SEQ ID NO:8连接肽P2A的核苷酸序列：

agcggcagcggcgagggaagaggaagcctgctgacctgcggcgatgtggaggagaatcccggcccc。

SEQ ID NO：9连接肽Furin的氨基酸序列：

RRKR。

SEQ ID NO：10连接肽Furin的核苷酸序列：

aggaggaagaga。

本发明的上述嵌合抗原受体1和嵌合抗原受体2，由一个载体共同表达。

本发明还提供了一种表达载体，所述的表达载体为同时表达上述嵌合抗原受体1和嵌合抗原受体2的表达载体。进一步的，所述的表达载体为真核或原核表达载体，所述的真核表达载体为质粒；所述的原核表达载体为病毒载体，所述的病毒载体包括逆转录病毒、重组慢病毒、重组腺病毒；进一步的，所述的病毒载体为pWPXLd。

本发明还提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞。优选的，所述宿主细胞为免疫反应细胞。优选为T细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞。更优选为T细胞和自然杀伤细胞。

本发明还提供了一种上述双靶点嵌合抗原受体、含有上述嵌合抗原受体的重组载体、含有上述重组载体的宿主细胞在制备预防或治疗恶性肿瘤浆膜腔转移药物中的用途。

进一步的，上述用途中，所述的恶性肿瘤为实体瘤，尤其可以为肺癌、肝细胞癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、胰腺癌或前列腺癌中的至少一种。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明通过构建含有双靶点嵌合抗原受体表达单元的重组载体，能够在宿主细胞中同时表达两种抗原受体，其中一种抗原受体为结合肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的受体，能够产生特异性靶向的作用，另一种抗原受体为PD-L1受体，也能够有特异性结合的作用，当两者共同存在于宿主细胞时，能够达到双靶点同时结合的效果，本发明方法的双靶点特异性结合形式，能够用于制备预防和治疗恶性肿瘤浆膜腔转移的药物，为预防和治疗恶性肿瘤浆膜腔转移提供了基础。

附图说明

图1所示为本发明前合抗原受体的构架简图(其中可变区可替换为任意一单链抗体片段)；

图2所示为结合HER2与结合PD-L1双靶点CAR的具体实施方式模式图；

图3所示为测293T细胞表面CAR分子表达的流式图；

图4所示为测T细胞表面CAR分子表达的流式图；

图5所示为构建稳定细胞株的流式图；

图6所示为两种CAR-T细胞与对照组T细胞体外杀伤的IFN-γ结果；

图7所示为基因工程修饰的T细胞体外杀伤作用结果，存活的阴性细胞与阳性细胞的比例图(T包括：T,her2car-t和her2-pdl1car-t三种细胞类型；k是k562的简写，herk是k562-her2的简写，hlk是k562-her2&pdl1的简写)。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明进行详细说明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook J,RussellD.W.,2001,Molecular Cloning:A laboratory manual(3^rd ed),Spring HarborLaboratory Press中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1双靶点嵌合抗原受体的重组慢病毒载体的构建

构建双靶点嵌合抗原受体的重组载体，表达框架为：5端到3端依次为：HER2scFv-CD28跨膜区-CD3δ-Furin-P2A-PD-L1scFv-CD8跨膜区-4-1BB。

HER2的信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：11所示，HER2的信号肽的核苷酸序列为为SEQ ID NO：12所示。

HER2scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO：13所示：

MQVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYPFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTSTGESTFADDFKGRFDFSLETSANTAYLQINNLKSEDSATYFCARWEVYHGYVPYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSHKFLSTSVGDRVSITCKASQDVYNAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASSRYTGVPSRFTGSGSGPDFTFTISSVQAEDLAVYFCQQHFRTPFTFGSGTKLEIK。

HER2scFv的编码核苷酸序列为SEQ ID NO：14所示：atgcaggtacaactgcagcagtcaggacctgaactgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcctctgggtatcctttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggacagggtttaaagtggatgggctggattaacacctccactggagagtcaacatttgctgatgacttcaagggacggtttgacttctctttggaaacctctgccaacactgcctatttgcagatcaacaacctcaaaagtgaagactcggctacatatttctgtgcaagatgggaggtttaccacggctacgttccttactggggccaagggaccacggtcaccgtttcctctggcggtggcggttctggtggcggtggctccggcggtggcggttctgacatccagctgacccagtctcacaaattcctgtccacttcagtaggagacagggtcagcatcacctgcaaggccagtcaggatgtgtataatgctgttgcctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaacttctgatttactcggcatcctcccggtacactggagtcccttctcgcttcactggcagtggctctgggccggatttcactttcaccatcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttatttctgtcagcaacattttcgtactccattcacgttcggctcggggacaaaattggagatcaaa。

CD28跨膜区的氨基酸序列为SEQ ID NO：15所示：

KIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS。

CD28跨膜区的核苷酸序列为SEQ ID NO：16所示：

aaaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc。

CD3δ的氨基酸序列为为SEQ ID NO：17所示：

APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

CD3δ的核苷酸序列为SEQ ID NO：18所示：

gcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa。

Furin-P2A的氨基酸为SEQ ID NO：19所示：

RRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP。

Furin-P2A的编码核苷酸序列为为SEQ ID NO：20所示：

agcggcagcggcgagggaagaggaagcctgctgacctgcggcgatgtggaggagaatcccggccccaggaggaagaga。

PD-L1的信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：11所示：PD-L1的信号肽的核苷酸序列为SEQ ID NO：12所示。

PD-L1scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO：21所示：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA。

PD-L1scFv的编码核苷酸序列为SEQ ID NO：22所示：

gacatccaaatgacccagagccctagctccctgtccgctagcgtgggcgacagggtgaccatcacctgcagagccagccaggacgtgagcaccgccgtggcctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacagcgcctccttcctgtactccggcgtgccctccagatttagcggcagcggcagcggcacagacttcaccctcaccatcagctccctgcagcctgaggacttcgccacatactactgccagcagtacctctaccaccctgccaccttcggccaaggcaccaaggtggagatcaagggcggcggaggttctggcggaggcggctccggaggaggaggcagcgaagtgcagctggtggagagcggaggaggactggtgcagcctggcggaagcctgaggctgagctgtgctgccagcggcttcaccttctccgactcctggattcattgggtcaggcaggcccccggaaaaggactggagtgggtcgcctggatctccccttacggcggcagcacctactacgccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcgccgataccagcaagaacaccgcctacctgcagatgaactccctgagggctgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggaggcactggcctggcggattcgactactggggccagggcaccctggtgaccgtgtccgcc。

CD8跨膜区的氨基酸序列为SEQ ID NO：23所示：

AAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRFSVV。

CD8跨膜区的核苷酸序列为SEQ ID NO：24所示：

gcggccgcattcgtgccggtcttcctgccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaccacaggaaccgtttctctgttgtt。

4-1BB的氨基酸序列为为SEQ ID NO：25所示：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL。

4-1BB的核苷酸序列为SEQ ID NO：26所示：

aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg。

按上述序列合成双靶点嵌合抗原受体并插入到慢病毒pWPXLd载体(Invitrogen)BamH1-NdeI位点(见图2)，转化到大肠杆菌感受态细胞，经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，纯化步骤参照试剂盒说明书，获得重组表达载体的高品质质粒，插入的目的片段结果见图1。

实施例2重组载体转化细胞

1、293T细胞的培养和传代：

打开生物安全柜，用75％的酒精棉擦拭台面，并将移液器、移液枪、枪尖盒、15ml离心管、离心管架、10cm2新的细胞培养皿放于生物安全柜中，关闭柜门，开启生物安全柜的紫外开关，照射半小时以消毒灭菌。将含10％的胎牛血清和100U/ml青霉素链霉素的DMEM及胰酶放于37℃水浴锅中预热。打开生物安全柜，开启通风开关，将已长到80％-90％的293T细胞培养皿从37℃、5％的CO₂的培养箱中取出，放于生物安全柜。用75％的酒精消毒双手、培养基瓶瓶口、移液管筒口等。用无菌移液管吸尽培养皿中的培养基，弃于废液缸中。加入1ml胰酶简略冲洗掉平皿中残存的培养基，以中和胰酶抑制物，随后吸尽并移除。向培养皿中滴入1-2ml胰酶，镜下观察细胞，直到细胞变圆分离，吸除胰酶。向培养皿中加入6-8ml新鲜完全培养基，轻柔吹打下细胞。将细胞悬液分于其他培养皿，并添加培养基以达到每皿10ml。十字式晃动培养皿数次，摇匀细胞，镜下观察后放入37℃培养箱。24小时后观察细胞状态，待细胞长到80％-90％时进行下一次传代培养。

2、慢病毒原液的获取：

第一天:铺板。90％密度状态良好的293T细胞消化，1:5传代,约1.0x 107cells/20ml/15cm平皿，5％CO2、37℃培养过夜。24h细胞密度约50-70％(不超过70％)。第二天：转染。转染前2小时，细胞换液--预热的10％DMEM高糖培养基20ml/皿。所有试剂平衡至室温。转染：a.在50ml BD管中配制以下DNA混合物(每15cm平皿)，psPAX2(包装质粒)22.5ug；pMD.2G(包膜质粒)11.25ug；pWPXLd(慢病毒载体)22.5ug。b.加水定容至1125ul。c.2.5MCaCl2 125ul滴入DNA溶液,涡旋5s。d、将BD管置于涡旋仪上(4档)，2×BBS(1250ul)溶液逐滴加入DNA-CaCl2混合液，震荡5s。e.室温静置15分钟。将2.25ml转染混合物滴入平皿，十字交叉(各10次)轻轻摇晃混匀，3％CO2，37°培养(12-16h)。吸去培养基，10ml PBS洗一次。换液--预热的5％DMEM培养基15ml，5％CO2，37°培养至48h。第四天：转染后48hr。收细胞上清，加预热的5％FBS新鲜DMEM培养基15ml，5％CO2，37°培养；病毒上清0.45μm滤器过滤，4℃保存(最多1周)。第五天：转染后72hr，收病毒上清，0.45μm滤器过滤，4℃保存。

3、慢病毒的浓缩：

仪器：超高速离心仪，配套的转子与套筒，超速离心管，配平用天平。将套筒及天平至生物安全柜紫外仪下消毒。确保每个套筒内无液滴后，将合适的离心管放至套筒里。将用0.45um的滤器过滤的病毒悬液加至离心管内。每个装了病毒悬液的离心管严格配平，使用精度为0.001g及以上的天平,盖上套筒盖后再次用天平验证是否完全配平。将配平好的各套筒装至离心仪转子里，准备离心。离心：离心条件为：20℃，70000g,2h.待离心仪速度上升至7000g再离开。离心完毕后，将培养基倒掉，离心管倒置在灭菌滤纸上吸干剩余培养基。使用购买的PBS重悬病毒沉淀，每个离心管PBS量依据自己需要而定，一般每个离心管用100ul重悬，最后再用100ulPBS将各离心管洗一遍吸出。将重悬的病毒分装至小EP管里，-80度冰箱保存，待使用。

4、浓缩病毒液感染293T细胞后，293T细胞表面CAR分子表达的检测。

HER2-PDL1双CAR病毒上清液感染293Td细胞，6孔板铺293td细胞，收取48h病毒上清液，上清液：10％培养基＝1：1，各1ml，感染细胞，24h换2ml10％培养基，48h做流式，检测CAR的表达量(见图3)。

5、人外周血T淋巴细胞的分离：

抽取血液，绿头盖抗凝取血管，一般一次抽取15-20ml血液即可。FICOLL淋巴细胞分离液缓慢逐滴加入抽取血液中，淋巴细胞分离液与血液比例为1：1。淋巴细胞分离液与血液的混合液离心。条件是1000g,45min,32度，加/减速度为3。离心过后可以看到血液分为3层，而淋巴细胞所在层，为中间白色透明层。枪尖缓慢吸取中间白色透明层淋巴细胞，切勿吸取其余2层液体。吸取的淋巴细胞加入到20mL无血清无抗生素X-VIVO培养基中离心，500g，10min。倒掉上清，用10mL无菌裂红液重悬沉淀的淋巴细胞，裂红时间不超过5min，2-3min即可。离心500g，10min。倒掉上清，用4mL5％人胎牛血清，2.5％IL-2的X-vivo培养基，带血清和IL-2的X-VIVO培养基最好现配现用。重悬T淋巴细胞，之后进行细胞计数，根据细胞数量决定6孔板每孔加入培养基量，一般每孔的体积为3×10⁶个淋巴细胞。但具体的加入量要根据病毒的滴度以及杀伤实验细胞所用量计算得到。

病毒感染T细胞前一天，用纤维连接蛋白(RetroNectin)稀释液包被病毒感染实验中将要使用的六孔板(Retronectin使用PBS稀释，浓度为50ug/ml)，稀释好后每2ml的retronectin包被六孔板的一个孔。4℃密封过夜备用。感染当天，吸去RetroNectin稀释液，使用2％BSA(牛血清白蛋白)溶液(PBS配制)封闭六孔板30min。吸去BSA，使用PBS润洗数次。(此步骤后，该六孔板可于4℃保存一周)。每孔预备1ml慢病毒悬液，混匀，加入六孔板中，32℃，1000g，2h离心。取出六孔板，吸去上清。PBS润洗一次。各孔加入2mL浓度为1.5×10⁶cell/mL的PBMC细胞悬液，32℃，1000g，10min离心。37℃，5％CO₂细胞培养箱培养。48h后换液。慢病毒感染时，MOI值控制在4～40之间效果最佳。

6、浓缩病毒感染T细胞后，T细胞表面CAR分子表达的检测：

HER2-PDL1双CAR病毒上清液感染T细胞，6孔板铺293td细胞，收取48h病毒上清液，上清液：10％培养基＝1：1，各1mL，感染细胞，24h换2mL10％培养基，48h做流式，检测CAR的表达量(见图4)。

靶细胞筛选：通过流式抗体分子染色，筛选HER2和/或PDL1阳性的肿瘤细胞系(见图5)构建稳定的靶细胞/细胞株。

K562细胞系为HER2阴性和PDL1阴性的双阴细胞系，通过慢病毒感染方式，转入HER2和/或PDL1分子，构建稳定表达HER2和/或PDL1分子的K562细胞系(见图5)。

CAR-T细胞的培养：

淋巴细胞分离液(Fillco)密度梯度离心分离出的外周血单核细胞，细胞技术板对其进行计数，获得细胞数总量，然后以1：1比率加入同数量相同的CD3/CD28磁珠(Gibco)。在有磁力架的情况下，在50mL的BD管里加入10mL左右X-VIVO培养基，然后加入经计数计算后的实际磁珠体积，轻吹重悬后，把BD管放入磁力架中静置3-4分钟，仅剩下纯磁珠吸附在BD管壁上。向BD管中加入用X-VIVO重悬了的PBMC(外周血单核细胞)。PBMC的浓度尽量控制在1-2×10⁶/mL，用移液器吹打重悬。加入5％总培养基体积的商品化人AB血清(sigma)。控制T细胞的密度为1-2×10⁶/mL，一个六孔板的一个孔可培养最高至3×10⁶个T细胞，超过则分配到2孔中，依次类推。至少48小时换液一次，若培养基出现明显变黄的现象，可以24h换液，重新调整细胞密度。在T细胞的培养中，每24h观察一次，观察克隆形态，清楚T细胞的形态变化，凋亡衰老倾向以及是否存在真菌细菌污染。同时估算T细胞总量。每次换液的时候血清和IL-2都需要即时溶解即时配。T细胞的离心换液，离心推荐为5mLBD管作为离心管，室温下1300rpm/min，离心3min。

实施例3 HER2和PDL1的双靶向CAR-T细胞的性能测定

1、CAR-T细胞体外杀伤能力的测定。

用Cell Trace^TMCFSE Cell Proliferation Kit(Thermo)和Cell Trace^TMFar RedCell Proliferation Kit(Thermo)分别对效应细胞和靶细胞进行染色。将效应细胞(如T细胞和CAR-T细胞)和靶细胞(如SKOV3和293T细胞)按效靶比1:1，2:1，4:1，8:1加入12孔版中，靶细胞在每孔的细胞数为1*10⁶个，增设仅有效应细胞或靶细胞的对照孔。其中，SKOV3为靶细胞，293T为对照的阴性细胞，观察流式结果，靶细胞的死亡或增殖情况反应CAR-T的体外杀伤能力(见图7)。图7的结果，说明，ERBB2和PDL1的双靶向CAR-T细胞对肿瘤细胞的体外杀伤能力，明显优于ERBB2的单靶向CAR-T细胞对相同肿瘤细胞的体外杀伤能力,更优于单纯T细胞对相同肿瘤细胞的体外杀伤能力。

2、CAR-T细胞体外杀伤能力，IFN-γ分泌量的测定。

使用IFN gamma Human ELISAKit(Thermo)，通过计算并确定一次性实验所需的板条数，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃。建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，室温孵育120分钟。对于血清或血浆标本，请加入50ul样本分析缓冲液后加50ul标本,如稀释量大，请将样本与样本分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100ul。洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育60分钟。洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。加入酶结合物工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，避光室温孵育20分钟。洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温孵育20分钟。加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。结果判断:复孔的值在20％的差异范围内结果才有效，复孔的值平均后可作为测量值；每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值；手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度；若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数(见图6)。图6的结果，说明，ERBB2和PDL1的双靶向CAR-T细胞对肿瘤细胞的体外杀伤能力，明显优于单纯T细胞对相同肿瘤细胞的体外杀伤能力。

由上述试验结果可知：本发明构建了一种含有HER2和PD-L1的双靶点嵌合抗原受体，实验证明该双靶点嵌合抗原受体具有一定的体外抗肿瘤效应，且体外试验已经验证其有高效性，旨在为恶性肿瘤提供更有效的治疗方法。说明本发明的HER2和PDL1的双靶向CAR-T细胞对肿瘤细胞的体外杀伤能力，明显优于HER2的单靶向CAR-T细胞对相同肿瘤细胞的体外杀伤能力，更优于单纯T细胞对相同肿瘤细胞的体外杀伤能力。

序列表

<110> 四川大学华西医院

<120> 基因工程修饰的双靶点嵌合抗原受体及其用途

<130> A181490K

<141> 2018-12-20

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 373

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

130 135 140

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His Trp Val Arg

145 150 155 160

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Trp Ile Ser Pro Tyr

165 170 175

Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

180 185 190

Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

195 200 205

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg His Trp Pro

210 215 220

Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

225 230 235 240

Ala Ala Ala Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr

245 250 255

Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro

260 265 270

Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

275 280 285

His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

290 295 300

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

305 310 315 320

Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys

325 330 335

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

340 345 350

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

355 360 365

Gly Gly Cys Glu Leu

370

<210> 2

<211> 1122

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacatccaaa tgacccagag ccctagctcc ctgtccgcta gcgtgggcga cagggtgacc 60

atcacctgca gagccagcca ggacgtgagc accgccgtgg cctggtacca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gcctccttcc tgtactccgg cgtgccctcc 180

agatttagcg gcagcggcag cggcacagac ttcaccctca ccatcagctc cctgcagcct 240

gaggacttcg ccacatacta ctgccagcag tacctctacc accctgccac cttcggccaa 300

ggcaccaagg tggagatcaa gggcggcgga ggttctggcg gaggcggctc cggaggagga 360

ggcagcgaag tgcagctggt ggagagcgga ggaggactgg tgcagcctgg cggaagcctg 420

aggctgagct gtgctgccag cggcttcacc ttctccgact cctggattca ttgggtcagg 480

caggcccccg gaaaaggact ggagtgggtc gcctggatct ccccttacgg cggcagcacc 540

tactacgccg acagcgtgaa gggcaggttc accatcagcg ccgataccag caagaacacc 600

gcctacctgc agatgaactc cctgagggct gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccagg 660

aggcactggc ctggcggatt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgtccgcc 720

gccgccgcct tcgtgcctgt gtttctgccc gccaagccca ccaccacacc tgctcccaga 780

cctcccacac ctgcccctac catcgctagc cagcccctga gcctgagacc cgaggcttgt 840

aggcctgctg ctggcggagc cgtgcacaca agaggcctgg acttcgcctg cgacatctac 900

atctgggccc ccctggccgg aacatgtgga gtgctgctgc tgagcctggt gatcaccctg 960

tactgcaacc acaggaacag gttcagcgtg gtgaagaggg gcaggaagaa gctgctgtac 1020

atcttcaagc agcccttcat gaggcccgtg cagaccaccc aggaggagga tggctgcagc 1080

tgcaggttcc ctgaagagga ggagggcggc tgcgagctgt ga 1122

<210> 3

<211> 482

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu

20 25 30

Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile

65 70 75 80

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

115 120 125

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gln Ala Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Ser Gly Arg

145 150 155 160

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr

165 170 175

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

180 185 190

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

195 200 205

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Leu Tyr

210 215 220

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

225 230 235 240

Ala Arg Asp His Tyr Gly Ser Gly Val His His Tyr Phe Tyr Tyr Gly

245 250 255

Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Lys Ile

260 265 270

Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly

275 280 285

Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe

290 295 300

Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val

305 310 315 320

Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

325 330 335

Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met

340 345 350

Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala

355 360 365

Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

370 375 380

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

385 390 395 400

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

405 410 415

Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

420 425 430

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

435 440 445

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

450 455 460

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

465 470 475 480

Pro Arg

<210> 4

<211> 1446

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggagatcg tgctgacaca gagccctggc accctgagcc tgtcccccgg cgaaagagcc 120

accctgtcct gcagagccag ccagagcgtg agcagctcct atctggcctg gtaccagcag 180

aagcctggcc aggcccccag actcctgatc tacggcgcca gcagcagagc caccggcatc 240

cccgatagat tcagcggctc cggcagcgga accgacttta ccctgaccat ctccagactg 300

gagcccgagg actttgccgt gtactactgc cagcagtacg gcagcagccc cctgacattc 360

ggcggcggca caaaggtgga gatcaaaggc ggcggaggtt ctggaggagg aggaagcgga 420

ggaggaggca gccaggctca ggtggtcgaa agcggcggag gagtggtgca gagcggaagg 480

tccctgaggc tgagctgcgc tgctagcggc tttgccttct cctcctacgg catgcactgg 540

gtgagacagg cccctggcaa gggcctggaa tgggtggctg tgatctggta cgacggcagc 600

aacaagtact acgccgacag cgtgaggggc aggttcacca tcagcaggga caacagcgaa 660

aacaccctgt acctgcagat gaacagcctc agggccgagg ataccgccgt gtattattgc 720

gccagggatc actacggaag cggcgtgcac cattacttct attacggcct ggacgtgtgg 780

ggccagggca caacagtgac cgtgtccagc aaaattgaag ttatgtatcc tcctccttac 840

ctagacaatg agaagagcaa tggaaccatt atccatgtga aagggaaaca cctttgtcca 900

agtcccctat ttcccggacc ttctaagccc ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc 960

ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag 1020

aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc 1080

cgcaagcatt accagcccta tgccccacca cgcgacttcg cagcctatcg ctccgccccc 1140

gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag 1200

tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgcagaga 1260

aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 1320

tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 1380

cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 1440

cctcgc 1446

<210> 5

<211> 475

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Met Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu

20 25 30

Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly

35 40 45

Tyr Pro Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly

50 55 60

Gln Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Ser Thr Gly Glu Ser

65 70 75 80

Thr Phe Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Asp Phe Ser Leu Glu Thr

85 90 95

Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp

100 105 110

Ser Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Trp Glu Val Tyr His Gly Tyr Val

115 120 125

Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu

145 150 155 160

Thr Gln Ser His Lys Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser

165 170 175

Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Tyr Asn Ala Val Ala Trp Tyr

180 185 190

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser

195 200 205

Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Pro Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala

225 230 235 240

Val Tyr Phe Cys Gln Gln His Phe Arg Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro

260 265 270

Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly

275 280 285

Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe

290 295 300

Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu

305 310 315 320

Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg

325 330 335

Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro

340 345 350

Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala

355 360 365

Tyr Arg Ser Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

370 375 380

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

385 390 395 400

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn

405 410 415

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

420 425 430

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

435 440 445

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

450 455 460

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470 475

<210> 6

<211> 1428

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgatgcagg tacaactgca gcagtcagga cctgaactga agaagcctgg agagacagtc 120

aagatctcct gcaaggcctc tgggtatcct ttcacaaact atggaatgaa ctgggtgaag 180

caggctccag gacagggttt aaagtggatg ggctggatta acacctccac tggagagtca 240

acatttgctg atgacttcaa gggacggttt gacttctctt tggaaacctc tgccaacact 300

gcctatttgc agatcaacaa cctcaaaagt gaagactcgg ctacatattt ctgtgcaaga 360

tgggaggttt accacggcta cgttccttac tggggccaag ggaccacggt caccgtttcc 420

tctggcggtg gcggttctgg tggcggtggc tccggcggtg gcggttctga catccagctg 480

acccagtctc acaaattcct gtccacttca gtaggagaca gggtcagcat cacctgcaag 540

gccagtcagg atgtgtataa tgctgttgcc tggtatcaac agaaaccagg acaatctcct 600

aaacttctga tttactcggc atcctcccgg tacactggag tcccttctcg cttcactggc 660

agtggctctg ggccggattt cactttcacc atcagcagtg tgcaggctga agacctggca 720

gtttatttct gtcagcaaca ttttcgtact ccattcacgt tcggctcggg gacaaaattg 780

gagatcaaaa aaattgaagt tatgtatcct cctccttacc tagacaatga gaagagcaat 840

ggaaccatta tccatgtgaa agggaaacac ctttgtccaa gtcccctatt tcccggacct 900

tctaagccct tttgggtgct ggtggtggtt ggtggagtcc tggcttgcta tagcttgcta 960

gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt 1020

gactacatga acatgactcc ccgccgcccc gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat 1080

gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc tccgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1140

cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1200

cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1260

ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1320

ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1380

aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgctaa 1428

<210> 7

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 8

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agcggcagcg gcgagggaag aggaagcctg ctgacctgcg gcgatgtgga ggagaatccc 60

ggcccc 66

<210> 9

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Arg Arg Lys Arg

1

<210> 10

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aggaggaaga ga 12

<210> 11

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 12

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 13

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Met Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Asn

20 25 30

Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp

35 40 45

Met Gly Trp Ile Asn Thr Ser Thr Gly Glu Ser Thr Phe Ala Asp Asp

50 55 60

Phe Lys Gly Arg Phe Asp Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe

85 90 95

Cys Ala Arg Trp Glu Val Tyr His Gly Tyr Val Pro Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser His Lys

130 135 140

Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala

145 150 155 160

Ser Gln Asp Val Tyr Asn Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Thr Gly

180 185 190

Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Phe

195 200 205

Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln

210 215 220

Gln His Phe Arg Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Lys

<210> 14

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgcaggtac aactgcagca gtcaggacct gaactgaaga agcctggaga gacagtcaag 60

atctcctgca aggcctctgg gtatcctttc acaaactatg gaatgaactg ggtgaagcag 120

gctccaggac agggtttaaa gtggatgggc tggattaaca cctccactgg agagtcaaca 180

tttgctgatg acttcaaggg acggtttgac ttctctttgg aaacctctgc caacactgcc 240

tatttgcaga tcaacaacct caaaagtgaa gactcggcta catatttctg tgcaagatgg 300

gaggtttacc acggctacgt tccttactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtttcctct 360

ggcggtggcg gttctggtgg cggtggctcc ggcggtggcg gttctgacat ccagctgacc 420

cagtctcaca aattcctgtc cacttcagta ggagacaggg tcagcatcac ctgcaaggcc 480

agtcaggatg tgtataatgc tgttgcctgg tatcaacaga aaccaggaca atctcctaaa 540

cttctgattt actcggcatc ctcccggtac actggagtcc cttctcgctt cactggcagt 600

ggctctgggc cggatttcac tttcaccatc agcagtgtgc aggctgaaga cctggcagtt 660

tatttctgtc agcaacattt tcgtactcca ttcacgttcg gctcggggac aaaattggag 720

atcaaa 726

<210> 15

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser

1 5 10 15

Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro

20 25 30

Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly

35 40 45

Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile

50 55 60

Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met

65 70 75 80

Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro

85 90 95

Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

100 105

<210> 16

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aaaattgaag ttatgtatcc tcctccttac ctagacaatg agaagagcaa tggaaccatt 60

atccatgtga aagggaaaca cctttgtcca agtcccctat ttcccggacc ttctaagccc 120

ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 180

gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 240

aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 300

cgcgacttcg cagcctatcg ctcc 324

<210> 17

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

1 5 10 15

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

20 25 30

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

35 40 45

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

50 55 60

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

65 70 75 80

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

85 90 95

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100

<210> 18

<211> 315

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 60

gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 120

cagagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg 180

gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc 240

ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc 300

ctgccccctc gctaa 315

<210> 19

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Arg Arg Lys Arg Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr

1 5 10 15

Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20 25

<210> 20

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

agcggcagcg gcgagggaag aggaagcctg ctgacctgcg gcgatgtgga ggagaatccc 60

ggccccagga ggaagaga 78

<210> 21

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

130 135 140

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His Trp Val Arg

145 150 155 160

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Trp Ile Ser Pro Tyr

165 170 175

Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

180 185 190

Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

195 200 205

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg His Trp Pro

210 215 220

Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

225 230 235 240

<210> 22

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gacatccaaa tgacccagag ccctagctcc ctgtccgcta gcgtgggcga cagggtgacc 60

atcacctgca gagccagcca ggacgtgagc accgccgtgg cctggtacca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gcctccttcc tgtactccgg cgtgccctcc 180

agatttagcg gcagcggcag cggcacagac ttcaccctca ccatcagctc cctgcagcct 240

gaggacttcg ccacatacta ctgccagcag tacctctacc accctgccac cttcggccaa 300

ggcaccaagg tggagatcaa gggcggcgga ggttctggcg gaggcggctc cggaggagga 360

ggcagcgaag tgcagctggt ggagagcgga ggaggactgg tgcagcctgg cggaagcctg 420

aggctgagct gtgctgccag cggcttcacc ttctccgact cctggattca ttgggtcagg 480

caggcccccg gaaaaggact ggagtgggtc gcctggatct ccccttacgg cggcagcacc 540

tactacgccg acagcgtgaa gggcaggttc accatcagcg ccgataccag caagaacacc 600

gcctacctgc agatgaactc cctgagggct gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccagg 660

aggcactggc ctggcggatt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgtccgcc 720

<210> 23

<211> 91

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Ala Ala Ala Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr

1 5 10 15

Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro

20 25 30

Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

35 40 45

His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

50 55 60

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

65 70 75 80

Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Phe Ser Val Val

85 90

<210> 24

<211> 273

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gcggccgcat tcgtgccggt cttcctgcca gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga 60

ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 120

cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 180

atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 240

tactgcaacc acaggaaccg tttctctgtt gtt 273

<210> 25

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 26

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

Claims

1.基因工程修饰的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述的双靶点嵌合抗原受体由嵌合抗原受体1和能够识别PD-L1的嵌合抗原受体2通过连接肽连接而成；所述的嵌合抗原受体2包括：PD-L1的单链抗体、跨膜区和胞内结构域，PD-L1的单链抗体是指能够结合肿瘤细胞或免疫细胞表面PD-L1分子的PD-L1的单链抗体；跨膜区为CD8跨膜区；胞内结构域为4-1BB胞内结构域；所述的嵌合抗原受体2的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示；所述的嵌合抗原受体2的编码核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示；

所述的嵌合抗原受体1包括：能够结合肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的单链抗体、跨膜区和胞内免疫受体酪氨酸活化基序；所述的能够结合肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的单链抗体为VEGFR1 scFv或HER2scFv；

所述嵌合抗原受体1的跨膜区为CD28跨膜区；所述嵌合抗原受体1为：人体的VEGFR1的scFv、CD28跨膜区和CD3ζ结合域，氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示，编码核苷酸序列为SEQID NO：4所示；

或，所述的嵌合抗原受体1为：人体的HER2的scFv、CD28跨膜区和CD3ζ结合域，氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示，编码核苷酸序列为SEQ ID NO：6所示；

所述的连接肽为Furin或P2A的至少一种。

2.根据权利要求1所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述的嵌合抗原受体2组成为：识别人体的PD-L1的scFv、CD8跨膜区、4-1BB共刺激分子肽段。

3.根据权利要求1所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原为CD19、CD20、MUC1、EGFR、EGFRvIII、HER2、ERBB3、ERBB4、VEGFR1、VEGFR2、EpCAM、CD44或IGFR中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述的嵌合抗原受体1和嵌合抗原受体2，由一个载体共同表达。

5.同时表达权利要求1-4任一项所述的双靶点嵌合抗原受体的表达载体。

6.含有权利要求5所述的表达载体的宿主细胞。

7.权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求5所述的表达载体、权利要求6所述的宿主细胞在制备预防或治疗恶性肿瘤浆膜腔转移药物中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述的恶性肿瘤为实体瘤，为肺癌、肝细胞癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、胰腺癌或前列腺癌中的至少一种。