CN113527514B - Gstp1在制备增效型CAR-T中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Gstp1在制备增效型CAR‑T中的应用。具体公开了一种抑制T细胞活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的CAR‑T细胞、及其构建方法和应用，所述CAR‑T中的CAR包含B7H3抗原结合结构域、跨膜结构域、胞内信号结构域以及GSTP1基因，制备得到的CAR‑T不仅对表达B7H3的肿瘤细胞具有高效的杀伤能力，而且高表达GSTP1后的CAR‑T能够抑制其自身ROS的产生，进一步增强CAR‑T细胞的杀伤功能，可针对广谱的实体肿瘤，应用范围广，不但对本领域具有较高的参考价值，而且具有良好的应用潜力。

Description

Gstp1在制备增效型CAR-T中的应用

技术领域

本发明属于肿瘤免疫治疗领域，具体地，涉及一种嵌合抗原受体，其包含B7H3抗原结合结构域、跨膜结构域、胞内信号结构域以及人源GSTP1，更具体地，涉及一种降低T细胞活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的CAR-T细胞、及其构建方法和应用。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric antigen receptor T-cellimmunotherapy，CAR-T)作为一种新兴的肿瘤过继免疫疗法，其利用基因工程技术将逆转录病毒和慢病毒载体转座系统或直接将mRNA转导到T细胞内，使T细胞获得识别特异性肿瘤细胞的能力并激活T细胞杀死肿瘤细胞的嵌合抗体，通过将这些T细胞回输至患者体内使患者的免疫系统获得特异性识别和杀伤肿瘤的能力(Shi H,Sun M,Liu L,et al.Chimericantigen receptor for adoptive immunotherapy of cancer:latest research andfuture prospects[J].Molecular cancer,2014,13(1):1-8.)，CAR-T的核心作用元件是嵌合抗原受体CAR，它由T细胞受体(T cell receptor，TCR)的胞内信号转导区、跨膜区以及胞外抗原结合区组成，其胞外区负责抗原的特异性地识别(Melenhorst J J,Levine BL.Innovation and opportunity for chimeric antigen receptor targeted Tcells[J].Cytotherapy,2013,15(9):1046-1053.)，CAR-T技术因对恶性肿瘤细胞的靶向性、杀伤活性和持久性强而在癌症等恶性疾病的治疗中展示出了巨大的应用前景。

B7H3，又称CD276，是一种I型跨膜蛋白，属于B7免疫共刺激和共抑制家族，其主要形式为包含两个细胞外串联的IgV-IgC结构域(即：IgV-IgC-IgV-IgC)(Collins M,Ling V,Carreno B M.The B7 family of immune-regulatory ligands[J].Genome biology,2005,6(6):1-7.)，具有免疫抑制功能，可以减少T细胞释放的I型干扰素(IFN)、降低NK细胞的细胞毒性。B7H3 mRNA在大多数组织表达，但其蛋白在正常组织(例如前列腺、乳腺、肝脏和淋巴器官)中表达非常有限，然而B7H3蛋白在在大部分恶性肿瘤及肿瘤相关成纤维细胞表面均异常高表达。多个独立实验已经证实了在多种恶性肿瘤细胞中B7H3蛋白均显著高表达，且这种高表达与恶性肿瘤疾病的严重程度密切相关(Zang X,Allison J P.The B7family and cancer therapy:costimulation and coinhibition[J].Clinical cancerresearch,2007,13(18):5271-5279.)，并且表明了B7H3参与肿瘤的免疫逃逸过程(Hofmeyer K A,Ray A,Zang X.The contrasting role of B7-H3[J].Proceedings ofthe National Academy of Sciences,2008,105(30):10277-10278.)。

ROS是机体氧化应激产生的主要分子，一直以来被认为是肿瘤发生、发展和复发的重要因素(HARRIS I S,DENICOLA G M.The complex interplay between antioxidantsand ROS in cancer[J].Trends in cell biology,2020.)。正常细胞的氧化与抗氧化水平维持在相对平衡的状态，促氧化水平的升高或者抗氧化能力的减弱都会导致体内ROS含量的升高，从而引起一系列变化(SIES H,JONES D P.Reactive oxygen species(ROS)aspleiotropic physiological signalling agents[J].Nature Reviews Molecular CellBiology,2020,21(7):363-83.)。与正常细胞相比，肿瘤微环境ROS含量较高，处于氧化应激的状态(MOLONEY J N,COTTER T G.ROS signalling in the biology of cancer；proceedings of the Seminars in cell&developmental biology,F,2018[C].Elsevier.)。研究发现，肿瘤细胞对ROS的敏感度较正常细胞高，这一特征为三氧化二砷、吉西他滨等促氧化性药物治疗癌症提供了理论依据(BAILLY C.Regulation of PD-L1expression on cancer cells with ROS-modulating drugs[J].Life sciences,2020,246:117403.)。另有研究表明，肿瘤微环境高水平的ROS不仅能抑制T细胞分裂和功能，还能诱导T细胞凋亡和衰老(SENA L A,LI S,JAIRAMAN A,et al.Mitochondria are requiredfor antigen-specific T cell activation through reactive oxygen speciessignaling[J].Immunity,2013,38(2):225-36.)。因此，通过调节T细胞的氧化应激，控制ROS水平有望增强其抗肿瘤功能。

GSTP1是一种活性氧调节蛋白，属于谷胱甘肽S-转移酶家族(α，μ，π，θ)，它主要是通过催化许多疏水性和亲电性化合物与还原性谷胱甘肽相结合，从而达到抑制细胞活性氧产生的效果，同时可保护细胞免受破坏(KANWAL R,PANDEY M,BHASKARAN N,etal.Protection against oxidative DNA damage and stress in human prostate byglutathione S-transferase P1[J].Molecular carcinogenesis,2014,53(1):8-18.)。据报道，在黑色素瘤、前列腺癌和直肠癌中，GSTP1表达水平均较高，说明这些肿瘤细胞的发生发展可能利用了其抗氧化作用(GUO Z,WANG G,WU B,et al.DCAF1 regulates Tregsenescence via the ROS axis during immunological aging[J].The Journal ofClinical Investigation,2020,130(11).)。并且，有研究显示，在衰老的Treg中下调的DDB1和CUL4相关因子1(DCAF1)通过作用于GSTP1调节ROS水平，达到抑制Treg衰老的作用(GUO Z,WANG G,WU B,et al.DCAF1 regulates Treg senescence via the ROS axisduring immunological aging[J].J Clin Invest,2020,130(11):5893-908.)。在此基础上，有望通过调节CAR-T细胞的GSTP1表达水平，从而调节其ROS水平，达到延长CAR-T细胞的生存时间，增强细胞活性，延缓衰老等效果，从而增强CAR-T细胞的抗肿瘤免疫。

目前，针对实体瘤的CAR-T细胞治疗进展缓慢且效果不佳，缺乏安全有效的特异性肿瘤抗原靶点是重要的阻碍因素之一，鉴于此，本发明人选用B7H3作为靶点，制备靶向B7H3的CAR、及CAR-T细胞，所述CAR包含B7H3抗原结合结构域、跨膜结构域、胞内信号结构域以及人源GSTP1，制备得到的CAR-T不仅对表达B7H3的肿瘤细胞具有高效的杀伤能力，而且高表达GSTP1后的CAR-T能够抑制ROS的产生，进一步增强CAR-T细胞的杀伤功能，可针对广谱的实体肿瘤，应用范围广，不但对本领域具有较高的参考价值，而且具有良好的应用潜力。

发明内容

为了克服上述所指出的现有技术的缺陷，本发明人对本领域存在的技术缺陷进行了深入研究，在付出了大量的创造性劳动后，完成了本发明。

具体而言，本发明所要解决的技术问题是：提供一种抑制ROS的CAR-T细胞、及其构建方法和应用，以提高免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效果，进一步提高免疫细胞对实体瘤的治疗效果。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：

第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体。

进一步，所述嵌合抗原受体包括胞外结构域、跨膜结构域、胞内信号结构域和抑制ROS的结构域依次串联而成；

优选地，所述胞外结构域包括与B7H3特异性结合的抗体scFv；

更优选地，所述scFv的氨基酸序列具有(I)、(II)、(III)所示的氨基酸序列中的任意一个：

(I)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

(II)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；

(III)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；

最优选地，所述scFv的氨基酸序列为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

优选地，所述胞外结构域还包括铰链区；

更优选地，所述铰链区包含选自CD8α，CD28，4-1BB，PD-1、CD34、OX40，CD3ε、IgG1、IgG4蛋白质的铰链区；

最优选地，所述铰链区为CD8α蛋白质的铰链区；

最优选地，所述铰链区包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；

最优选地，所述铰链区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

优选地，所述胞外结构域还包括胞外信号肽；

更优选地，所述胞外信号肽包含选自CD8、CD45、CD3ζ、CD28、CD3ε、CD45、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD4、CD5、CD9、CD80、CD86、ICOS、CD154、GITR、CD134、CD137、GM-CSF、IgG6信号肽；

最优选地，所述胞外信号肽为IgG6信号肽；

最优选地，所述胞外信号肽包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或与如SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；

最优选地，所述胞外信号肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；

优选地，所述跨膜结构域包含选自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154蛋白质的跨膜结构域；

更优选地，所述跨膜结构域为CD8α的跨膜结构域；

最优选地，所述跨膜结构域包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或与如SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；

最优选地，所述跨膜结构域的氨基酸序列为如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

优选地，所述胞内信号结构域包括信号转导结构域；

更优选地，所述信号转导结构域包含选自CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10、DAP12、CD66d的功能性信号传导结构域；

最优选地，所述信号转导结构域为CD3ζ的功能性信号传导结构域；

最优选地，所述信号转导结构域包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；

最优选地，所述信号转导结构域的氨基酸序列为如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

优选地，所述胞内信号结构域还包括共刺激信号结构域；

更优选地，所述共刺激信号结构域包含选自CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、OX40、CDS、ICAM-1、4-1BB(CD137)、B7-H3、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β的功能性信号传导结构域；

最优选地，所述共刺激信号结构域为CD28的功能性信号传导结构域；

最优选地，所述共刺激信号结构域包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；

最优选地，所述共刺激信号结构域的氨基酸序列为如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；

优选地，所述抑制ROS的结构域包括编码抑制ROS的GSTP1蛋白的核酸分子；

更优选地，所述拮抗ROS的结构域为人源GSTP1；

最优选地，所述拮抗ROS的结构域包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；

最优选地，所述拮抗ROS的结构域的氨基酸序列为如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；

优选地，所述嵌合抗原受体还包括自裂解肽T2A；

更优选地，所述自裂解肽T2A包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与如SEQID NO:8所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；

最优选地，所述自裂解肽T2A的氨基酸序列为如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；

优选地，所述嵌合抗原受体由IgG6信号肽、scFv、CD8α的铰链区、CD8α的跨膜结构域、CD28的功能性信号传导结构域、CD3ζ的功能性信号传导结构域、自裂解肽T2A、人源GSTP1依次串联得到；

更优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列为如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。

第二方面，本发明提供了一种核酸分子。

进一步，所述核酸分子包括编码本发明第一方面所述嵌合抗原受体的核酸分子；

优选地，所述scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；

优选地，所述CD8α铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；

优选地，所述IgG6信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；

优选地，所述CD8α跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；

优选地，所述CD3ζ信号转导结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；

优选地，所述CD28共刺激信号结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；

优选地，所述自裂解肽T2A的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；

优选地，所述人源GSTP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；

更优选地，所述编码本发明第一方面所述嵌合抗原受体的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示。

第三方面，本发明提供了一种核酸构建物。

进一步，所述核酸构建物含有本发明第二方面所述的核酸分子；

优选地，所述核酸构建物还包含与本发明第二方面所述核酸分子操作性连接、指导本发明第一方面所述嵌合抗原受体在宿主细胞中表达的一个或多个调控序列；

更优选地，所述调控序列包括启动子序列、转录终止子序列、前导序列；

最优选地，所述启动子包括CMV启动子、EF-1α启动子、SV40早期启动子、MMTV启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子、肌酸激酶启动子、金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子、四环素启动子；

最优选地，所述转录终止子包括CYC1转录终止子、T7转录终止子、rrnBT1转录终止子、rrnBT2转录终止子、ADH1转录终止子、TIF51A转录终止子、ALG6转录终止子、AOD转录终止子、AOX1转录终止子、ARG4转录终止子、PMA1转录终止子、TEF1转录终止子、TT1转录终止子、TT2转录终止子。

第四方面，本发明提供了一种重组载体。

进一步，所述重组载体含有本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的核酸构建物；

优选地，所述载体包括克隆载体、表达载体；

优选地，所述载体包括DNA载体、RNA载体、质粒、病毒来源的载体；

更优选地，所述病毒来源的载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体。

第五方面，本发明提供了一种重组宿主细胞。

进一步，所述重组宿主细胞含有本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的核酸构建物、本发明第四方面所述的重组载体；

优选地，所述宿主细胞包括哺乳动物细胞、植物细胞、细菌、酵母细胞、真菌细胞；

优选地，所述宿主细胞包括免疫细胞；

更优选地，所述免疫细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞或其任意组合；

最优选地，所述免疫细胞为T淋巴细胞。

第六方面，本发明提供了一种重组宿主细胞群体。

进一步，所述重组宿主细胞群体包括本发明第五方面所述的重组宿主细胞；

优选地，所述宿主细胞群体还包含不包含本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的核酸构建物、本发明第四方面所述的重组载体的宿主细胞；

更优选地，所述宿主细胞包括免疫细胞；

最优选地，所述免疫细胞包括为T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞或其任意组合。

第七方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体的衍生物。

进一步，所述衍生物包括本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的核酸构建物、本发明第四方面所述的重组载体、本发明第五方面所述的重组宿主细胞、本发明第六方面所述的重组宿主细胞群体；

优选地，所述衍生物包括药物组合物、试剂盒、缀合物；

更优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或辅料；

更优选地，所述试剂盒还包括将本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的核酸构建物、本发明第四方面所述的重组载体引入到宿主细胞中的各种试剂；

更优选地，所述缀合物还包括修饰部分；

最优选地，所述修饰部分包括荧光化合物、酶、辅基、发光材料、生物发光材料、发射荧光的金属原子；

最优选地，所述荧光化合物包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白；

最优选地，所述酶包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶；

最优选地，所述辅基包括链霉亲和素、生物素、抗生物素蛋白；

最优选地，所述发光材料包括鲁米诺；

最优选地，所述生物发光材料荧光素酶、荧光素、水母发光蛋白；

最优选地，所述发射荧光的金属原子包括铕(Eu)。

第八方面，本发明提供了一种细胞注射液。

进一步，所述细胞注射液含有本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的核酸构建物、本发明第四方面所述的重组载体、本发明第五方面所述的重组宿主细胞、本发明第六方面所述的重组宿主细胞群体。

第九方面，本发明提供了如下任一种方法：

(1)一种制备本发明第五方面所述的重组宿主细胞的方法，所述方法包括如下步骤：将本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的核酸构建物、本发明第四方面所述的重组载体引入到宿主细胞中；

优选地，所述引入的方法包括物理方法、化学方法、生物方法；

更优选地，所述物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔；

更优选地，所述化学方法包括胶体分散系统、基于脂质的系统；

最优选地，所述胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；

最优选地，所述基于脂质的系统包括水包油乳剂、胶束、混合胶束、脂质体；

更优选地，所述生物方法包括DNA载体、RNA载体、慢病毒载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体；

(2)一种调节受试者体内的免疫应答的方法，所述方法包括如下步骤：向受试者施用本发明第五方面所述的重组宿主细胞、本发明第六方面所述的重组宿主细胞群体、本发明第七方面中所述的药物组合物、本发明第八方面所述的细胞注射液。

进一步，所述方法还包括一种治疗患有表达B7H3肿瘤的受试者的方法，所述方法包括如下步骤：向有需要的受试者施用本发明第五方面所述的重组宿主细胞、本发明第六方面所述的重组宿主细胞群体、本发明第七方面中所述的药物组合物、本发明第八方面所述的细胞注射液；

(3)一种筛选预防和/或治疗肿瘤的候选药物的方法，所述方法包括如下步骤：

(I)提供待测化合物以及阳性对照化合物，所述的阳性对照化合物为含有GSTP1的化合物；

(II)在测试组中，检测步骤(I)中所述待测化合物对肿瘤细胞的迁移、侵袭和增殖能力的影响，并与阳性对照组以及阴性对照组中相应的实验结果进行比较；

优选地，在步骤(II)中，将测试组与阳性对照组以及阴性对照组的实验结果进行比较，如果测试组中肿瘤细胞的迁移、侵袭和增殖能力显著低于阴性对照组，且测试组中待测化合物对肿瘤细胞的迁移、侵袭和增殖能力的抑制程度(A1)/阳性对照组中含有GSTP1的化合物对肿瘤细胞的迁移、侵袭和增殖能力的抑制程度(A2)≥80％，则提示所述待测化合物是预防和/或治疗肿瘤的候选药物；

优选地，所述方法还包括：进一步对步骤(II)筛选出的候选药物进行测定，以评价其对预防和/或治疗肿瘤的效果；

优选地，所述肿瘤细胞为表达B7H3的肿瘤细胞；

更优选地，所述肿瘤包括卵巢癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、食管癌、前列腺癌、口腔癌、胃癌、胰腺癌、子宫内膜癌、肝癌、膀胱癌、骨肉瘤、淋巴瘤、髓系白血病；

最优选地，所述肿瘤为肺癌。

第十方面，本发明提供了如下任一方面的应用：

(1)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的核酸构建物、本发明第四方面所述的重组载体、本发明第五方面所述的重组宿主细胞、本发明第六方面所述的重组宿主细胞群体在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用；

(2)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的核酸构建物、本发明第四方面所述的重组载体、本发明第五方面所述的重组宿主细胞、本发明第六方面所述的重组宿主细胞群体在制备用于制备预防和/或治疗肿瘤的免疫细胞的试剂盒中的应用；

(3)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的核酸构建物、本发明第四方面所述的重组载体、本发明第五方面所述的重组宿主细胞、本发明第六方面所述的重组宿主细胞群体在制备用于预防和/或治疗肿瘤的细胞注射液中的应用；

(4)本发明第七方面中所述的药物组合物在预防和/或治疗肿瘤中的应用；

(5)本发明第七方面中所述的试剂盒在制备用于预防和/或治疗肿瘤的免疫细胞中的应用；

(6)本发明第八方面所述的细胞注射液在预防和/或治疗肿瘤中的应用；

(7)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体在制备核酸分子、核酸构建物、重组载体、重组宿主细胞、重组宿主细胞群体中的应用；

(8)本发明第二方面所述的核酸分子在制备核酸构建物、重组载体、重组宿主细胞、重组宿主细胞群体中的应用；

(9)本发明第三方面所述的核酸构建物在制备重组载体、重组宿主细胞、重组宿主细胞群体中的应用；

(10)本发明第四方面所述的重组载体在制备重组宿主细胞、重组宿主细胞群体中的应用；

(11)本发明第五方面所述的重组宿主细胞在制备重组宿主细胞群体中的应用；

(12)GSTP1在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用；

(13)GSTP1在筛选预防和/或治疗肿瘤的候选药物中的应用；

(14)GSTP1在制备用于预防和/或治疗肿瘤的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞中的应用；

(15)GSTP1在促进预防和/或治疗肿瘤的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞增殖中的应用；

(16)GSTP1在促进预防和/或治疗肿瘤的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的杀伤作用中的应用；

优选地，所述嵌合抗原受体为本发明第一方面所述的嵌合抗原受体；

优选地，所述免疫细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞或其任意组合；

更优选地，所述免疫细胞为T淋巴细胞；

优选地，所述肿瘤为表达B7H3的肿瘤；

更优选地，所述肿瘤包括卵巢癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、食管癌、前列腺癌、口腔癌、胃癌、胰腺癌、子宫内膜癌、肝癌、膀胱癌、骨肉瘤、淋巴瘤、髓系白血病；

最优选地，所述肿瘤为肺癌。

采用上述技术方案后，本发明的有益效果是：

本发明提供了靶向B7H3的CAR、及CAR-T细胞，所述CAR包含B7H3抗原结合结构域、跨膜结构域、胞内信号结构域以及人源GSTP1，制备得到的CAR-T不仅对表达B7H3的肿瘤细胞具有高效的杀伤能力，而且高表达GSTP1后的CAR-T能够抑制细胞ROS的产生，进一步增强CAR-T细胞的杀伤功能，可针对广谱的实体肿瘤，应用范围广，不但对本领域具有较高的参考价值，而且具有良好的应用潜力。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示对制备得到的CAR-T细胞验证的结果图，其中，A图：利用流式细胞仪检测CAR-T中CAR的表达的结果图，B图：利用流式细胞仪检测CAR-T中CAR的表达的结果统计图，C图：CAR-T细胞生长曲线图，D图：Western blot检测CAR-T细胞中hGSTP1的表达的结果图；

图2显示hGSTP1高表达对CAR-T细胞活性氧水平影响的结果图，其中A：流式细胞图；B：统计图；

图3显示hGSTP1高表达的CAR-T细胞杀伤肿瘤功能影响的结果图，其中A：流式细胞图；B：统计图；

图4显示本发明制备得到的hGSTP1高表达的CAR-T对小鼠肺癌移植瘤的清除能力的结果图，其中，A：实验流程图；B：不同天数的小鼠体内的肿瘤体积的结果图；C：注射肿瘤细胞成瘤后的第51天小鼠体内的肿瘤体积的结果统计图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1 hGSTP1高表达的B7H3-CAR-T的制备

1、实验方法

(1)PBMC细胞的分离

1)采集健康志愿者外周血，室温1300g离心10分钟后弃掉血浆部分，剩余血细胞用等体积生理盐水稀释混匀；

2)将血细胞悬液缓慢加入到淋巴细胞分离液上层，室温600g离心25分钟；

3)吸取中间白膜层淋巴细胞，加入生理盐水洗涤，必要时作裂解红细胞处理，室温400g离心10分钟，弃上清，即得PBMC细胞。

(2)CAR表达载体的构建

1)合成靶向人B7H3的scFv编码序列，所述scFv包括重链VH和轻链VL，二者之间由3×G4S短肽连接；

2)将逆转录毒载体MSCV和步骤1)合成的靶向人B7H3的scFv经Nco I和Mlu I双酶切，进行片段回收，回收的目的片段用T4连接酶连接，然后转化Stbl3感受态细胞；

3)挑取单克隆进行质粒提取，经酶切鉴定后送测序确认，正确的质粒即为MSCV-B7H3-Gstp1。

上述构建方法中，重链VH的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，轻链VL的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，G4S短肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示。

(3)逆转录病毒包装

1)准备293T细胞铺板，3×10⁶/100mm培养皿；

2)第二天，观察293T细胞状态，生长良好，进行转染；

3)用1.5ml EP管准备转染试剂：30μl Genejuice+470μl IMDM，室温孵育5min；

4)将MSCV-M13B702穿梭质粒与辅助质粒pCL-Ampho按照总量10μg，比例为3：2，依次加入新的1.5mlEP管，为DNA Mix；

5)将一份转染试剂加入至DNA Mix中，轻轻混匀，室温孵育15min；

6)标记培养皿，将上步所得试剂分别加入皿中，48-72h后收取病毒上清；

7)取上清，分装于1.5ml EP管中，每管1ml，-80℃冰箱保存备用。

(4)逆转录病毒转导

1)Day-1：hCD3/CD28抗体包被24孔板；

2)Day0：复苏人PBMC，计数，L500培养基(L500+10％FBS+1％P.S.，CAR-T细胞制备期间添加细胞因子5ng/ml IL-15、10ng/ml IL-7)重悬细胞至1x10⁶/ml，弃去包被液，每孔接种细胞1ml；

3)Day1：1μg/ml Retronectin包被24孔板；

4)Day2：细胞活化48h后，进行CAR病毒感染，收集细胞至离心管，计数后按照0.5-1×10⁶个细胞每管分配，离心后弃去上清，用1ml病毒液重悬T细胞，将T细胞接种于该24孔板中，30℃1500g离心2小时，轻轻弃掉上清液，缓慢加入含有细胞因子的L500培养基。

(5)hGSTP1高表达的B7H3-CAR-T细胞的扩增

Day4-Day14根据细胞生长情况和细胞数量，补加培养基，使细胞密度维持在(0.5-1)×10⁶/ml。

(6)CAR表达效率的检测

Day4：流式检测T细胞纯度和CAR阳性率，用B7H3-Fc蛋白标记细胞，室温孵育20min后清洗，再加入PE-Anti Human IgG-Fc抗体，室温避光孵育20min后清洗，最后进行APC-CD3染色，应用流式细胞仪进行分析。

2、实验结果

实验结果见图1A-D，结果显示，本发明构建的B7H3-CAR-T细胞中含有GSTP1基因，表明了本发明成功构建了含有人GSTP1基因靶向B7H3的全人源CAR，并进一步制备成B7H3-CAR-T细胞，流式细胞仪分析的结果显示，hGSTP1高表达的B7H3-CAR-T细胞中CAR表达阳性率高达90％，GSTP1在制备的CAR-T细胞中高效表达，GSTP1的表达不但不会影响CAR表达阳性率，而且会促进B7H3-CAR-T细胞的增殖。

实施例2 hGSTP1高表达的B7H3-CAR-T细胞有效抑制细胞活性氧的产生

1、实验方法

1)将CAR-T吹打均匀收集到无菌1.5mL EP管中，1800rpm离心5min，弃上清。

2)加入1mL PBS洗涤1次，1800rpm离心5min，弃上清。

3)配制DCFH-DA工作液：500L PBS+0.5L DCFH-DA。

4)向EP管中加入50-100L DCFH-DA工作液，37℃避光孵育20-30min。

5)加入1mL PBS洗涤3次，1800rpm离心5min，弃上清。

6)加入300L PBS重悬细胞沉淀，转入流式管中，上机检测。

2、实验结果

实验结果见图2A-B，使用DCFH-DA对28ζ-CAR-T细胞(代表含有CD28共刺激结构域的CAR-T)和28ζ-hGSTP1 CAR-T细胞(代表含有CD28共刺激结构域且表达hGSTP1的CAR-T)进行标记，流式细胞术检测CAR-T细胞的活性氧水平。结果显示，相对于对照28ζ-CAR-T，28ζ-hGSTP1 CAR-T细胞的活性氧水平明显降低，说明高表达hGSTP1可有效抑制细胞活性氧的产生。

实施例3 hGSTP1高表达有效增强B7H3-CAR-T细胞抗肿瘤功能

1、实验方法

1)Day 0:细胞接种于12孔板，每孔铺A549-PCDH 50000个,待肿瘤细胞贴壁(约5h左右)，按效靶比1:1,1:2.5,1:5加入不等量的T(按阳性率加T细胞)。培养基为L500完全培养基(不含细胞因子)，铺肿瘤细胞时，先加1mL培养基，加入T细胞后每孔定容3mL。

2)Day 1-3：细胞观察：每天显微镜下观察细胞杀伤情况，根据杀伤进度，决定细胞终止时间，收取孔中细胞进行流式检测T细胞及肿瘤细胞比例。

3)Day 3：轻轻吹打每孔细胞，并将细胞上清转移至15mL离心管中；用1mL PBS洗涤一次，并将上清转移至上述15mL离心管中；加入胰酶消化剩余的肿瘤细胞，并将其转移至上述15mL离心管中；1800rpm离心5min，收集细胞；弃掉上清，加入30-50μL PBS稀释的CD3抗体，震荡混匀，4℃染色15min；加入1mL PBS洗涤1次；1800rpm离心5min，弃上清；加入活死细胞染料标记死细胞(4℃孵育30min)，1mL PBS洗涤1次，1800rpm离心5min，弃上清，加入400LPBS重悬细胞,经300目滤网过滤至流式管中，上机检测，流式分析杀伤效果。

2、实验结果

实验结果见图3A-B，将表达B7H3靶点的肺癌细胞A549细胞，同时按不同效靶比1:1、1:2.5、1:5加入相应数量的28ζ-CAR-T、28ζ-hGSTP1-CAR-T细胞。共培养杀伤结果显示：28ζ-hGSTP1-CAR-T细胞的存活率显著高于对照组。结果表明28ζ-hGSTP1-CAR-T细胞能够更强地杀伤肿瘤细胞。说明28ζ-hGSTP1-CAR-T细胞抑制活性氧产生的同时，高效杀伤肿瘤细胞，可能在实体瘤微环境中具有更好的杀伤效果。

实施例4 hGTSP1高表达的B7H3-CAR-T细胞体内抑制肺癌皮下移植瘤的验证

1、实验方法

1)4-6周龄NCG雌鼠，在小鼠右侧背部皮下注射含有5×10⁶人肺癌细胞A549的细胞悬液150μl；

2)持续观察皮下移植瘤增长情况，待瘤体逐渐增大时使用游标卡尺测量瘤体的长径(a)和短径(b)，瘤体体积为a×b²/2。

3)待瘤体大小约为100-200mm³时，随机分为5组；

4)将制备好的28ζ及28ζ-hGSTP1 CAR-T细胞，按照5×10⁶/100μl、1×10⁷/100μl的剂量分别给予荷瘤小鼠尾静脉注射治疗，PBS组作为对照；

5)每3-4天测量小鼠体重、荷瘤体积的变化及观察治疗过程中的综合情况。

2、实验结果

实验结果见图4A-C，建立肺癌NCG小鼠皮下移植瘤模型，待小鼠荷瘤体积100-200mm³时，将小鼠随机分成5组(PBS、5×10⁶28ζ、1×10⁷28ζ、5×10⁶28ζ-hGSTP1、1×10⁷28ζ-hGSTP1)，每组6只，给予28ζ或28ζ-hGSTP1 CAR-T细胞5×10⁶或者1×10⁷治疗剂量的尾静脉给药，PBS组为对照组。连续检测小鼠体重、荷瘤体积的变化及观察治疗过程中的综合情况。自皮下移植瘤形成，每三天测量并记录小鼠体重及移植瘤的大小变化，计算出移植瘤体积，按照时间轴绘制出肿瘤生长曲线。结果显示：28ζ-hGSTP1 CAR-T细胞在较低剂量的情况下即可高效杀伤肺癌移植瘤，表明28ζ-hGSTP1 CAR-T细胞杀伤肿瘤效果显著优于28ζCAR-T细胞。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110> 徐州医科大学

<120> Gstp1在制备增效型CAR-T中的应用

<141> 2021-07-07

<150> 2021107396936

<151> 2021-06-30

<150> 2021107393035

<151> 2021-06-30

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Phe Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

130 135 140

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser

145 150 155 160

Ile Ser Ile Tyr Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro

165 170 175

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser

180 185 190

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

195 200 205

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Tyr

210 215 220

Ser Thr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

225 230 235 240

<210> 2

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr

35 40 45

<210> 3

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys

<210> 4

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 5

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 6

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 7

<211> 210

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Pro Pro Tyr Thr Val Val Tyr Phe Pro Val Arg Gly Arg Cys Ala

1 5 10 15

Ala Leu Arg Met Leu Leu Ala Asp Gln Gly Gln Ser Trp Lys Glu Glu

20 25 30

Val Val Thr Val Glu Thr Trp Gln Glu Gly Ser Leu Lys Ala Ser Cys

35 40 45

Leu Tyr Gly Gln Leu Pro Lys Phe Gln Asp Gly Asp Leu Thr Leu Tyr

50 55 60

Gln Ser Asn Thr Ile Leu Arg His Leu Gly Arg Thr Leu Gly Leu Tyr

65 70 75 80

Gly Lys Asp Gln Gln Glu Ala Ala Leu Val Asp Met Val Asn Asp Gly

85 90 95

Val Glu Asp Leu Arg Cys Lys Tyr Ile Ser Leu Ile Tyr Thr Asn Tyr

100 105 110

Glu Ala Gly Lys Asp Asp Tyr Val Lys Ala Leu Pro Gly Gln Leu Lys

115 120 125

Pro Phe Glu Thr Leu Leu Ser Gln Asn Gln Gly Gly Lys Thr Phe Ile

130 135 140

Val Gly Asp Gln Ile Ser Phe Ala Asp Tyr Asn Leu Leu Asp Leu Leu

145 150 155 160

Leu Ile His Glu Val Leu Ala Pro Gly Cys Leu Asp Ala Phe Pro Leu

165 170 175

Leu Ser Ala Tyr Val Gly Arg Leu Ser Ala Arg Pro Lys Leu Lys Ala

180 185 190

Phe Leu Ala Ser Pro Glu Tyr Val Asn Leu Pro Ile Asn Gly Asn Gly

195 200 205

Lys Gln

210

<210> 8

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

1 5 10 15

Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 9

<211> 716

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Phe Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Val Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser

145 150 155 160

Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala

165 170 175

Ser Gln Ser Ile Ser Ile Tyr Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly

180 185 190

Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly

195 200 205

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

210 215 220

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln

225 230 235 240

Gln Thr Tyr Ser Thr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

245 250 255

Asp Ile Lys Thr Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

260 265 270

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys

275 280 285

Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala

290 295 300

Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu

305 310 315 320

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys Arg Ser Arg

325 330 335

Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro

340 345 350

Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala

355 360 365

Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

370 375 380

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

385 390 395 400

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

405 410 415

Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

420 425 430

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

435 440 445

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

450 455 460

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

465 470 475 480

Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr

485 490 495

Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Pro Pro Tyr Thr Val

500 505 510

Val Tyr Phe Pro Val Arg Gly Arg Cys Ala Ala Leu Arg Met Leu Leu

515 520 525

Ala Asp Gln Gly Gln Ser Trp Lys Glu Glu Val Val Thr Val Glu Thr

530 535 540

Trp Gln Glu Gly Ser Leu Lys Ala Ser Cys Leu Tyr Gly Gln Leu Pro

545 550 555 560

Lys Phe Gln Asp Gly Asp Leu Thr Leu Tyr Gln Ser Asn Thr Ile Leu

565 570 575

Arg His Leu Gly Arg Thr Leu Gly Leu Tyr Gly Lys Asp Gln Gln Glu

580 585 590

Ala Ala Leu Val Asp Met Val Asn Asp Gly Val Glu Asp Leu Arg Cys

595 600 605

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Tyr Val Lys Ala Leu Pro Gly Gln Leu Lys Pro Phe Glu Thr Leu Leu

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Ser Gln Asn Gln Gly Gly Lys Thr Phe Ile Val Gly Asp Gln Ile Ser

645 650 655

Phe Ala Asp Tyr Asn Leu Leu Asp Leu Leu Leu Ile His Glu Val Leu

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Ala Pro Gly Cys Leu Asp Ala Phe Pro Leu Leu Ser Ala Tyr Val Gly

675 680 685

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<210> 10

<211> 697

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Glu Val Gln Leu Phe Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

130 135 140

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser

145 150 155 160

Ile Ser Ile Tyr Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro

165 170 175

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser

180 185 190

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

195 200 205

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Tyr

210 215 220

Ser Thr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

225 230 235 240

Thr Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr

245 250 255

Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala

260 265 270

Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

275 280 285

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

290 295 300

Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His

305 310 315 320

Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys

325 330 335

His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

340 345 350

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

355 360 365

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

370 375 380

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

385 390 395 400

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

405 410 415

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

420 425 430

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

435 440 445

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455 460

Gly Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp

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Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Pro Pro Tyr Thr Val Val Tyr Phe

485 490 495

Pro Val Arg Gly Arg Cys Ala Ala Leu Arg Met Leu Leu Ala Asp Gln

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Gly Ser Leu Lys Ala Ser Cys Leu Tyr Gly Gln Leu Pro Lys Phe Gln

530 535 540

Asp Gly Asp Leu Thr Leu Tyr Gln Ser Asn Thr Ile Leu Arg His Leu

545 550 555 560

Gly Arg Thr Leu Gly Leu Tyr Gly Lys Asp Gln Gln Glu Ala Ala Leu

565 570 575

Val Asp Met Val Asn Asp Gly Val Glu Asp Leu Arg Cys Lys Tyr Ile

580 585 590

Ser Leu Ile Tyr Thr Asn Tyr Glu Ala Gly Lys Asp Asp Tyr Val Lys

595 600 605

Ala Leu Pro Gly Gln Leu Lys Pro Phe Glu Thr Leu Leu Ser Gln Asn

610 615 620

Gln Gly Gly Lys Thr Phe Ile Val Gly Asp Gln Ile Ser Phe Ala Asp

625 630 635 640

Tyr Asn Leu Leu Asp Leu Leu Leu Ile His Glu Val Leu Ala Pro Gly

645 650 655

Cys Leu Asp Ala Phe Pro Leu Leu Ser Ala Tyr Val Gly Arg Leu Ser

660 665 670

Ala Arg Pro Lys Leu Lys Ala Phe Leu Ala Ser Pro Glu Tyr Val Asn

675 680 685

Leu Pro Ile Asn Gly Asn Gly Lys Gln

690 695

<210> 11

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaggtgcagc tgttccagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc caggggtgtt 300

ggccggggct ttgactactg gggccagggg accacggtca ccgtctcctc aagtggcggt 360

ggctctggcg gtggtgggtc gggtggcggc ggatcagaca tccagttgac ccagtctcca 420

tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc 480

attagcatct atttaaattg gtatcggcag caaccaggga aagcccctaa gctcctgatc 540

tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg 600

acagatttca ctctcaccat cagcagtctg caacctgaag attttgcaac ttacttctgt 660

caacagactt acagtacccc tccgtggacg ttcggccaag ggaccaaagt ggatatcaaa 720

<210> 12

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgatatcta c 141

<210> 13

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggaatttg gcctgagctg gctgtttctg gtggcgattc tgaaaggcgt gcagtgc 57

<210> 14

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 60

tactgc 66

<210> 15

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 16

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 17

<211> 633

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atgccgccct acaccgtggt ctatttccca gttcgaggcc gctgcgcggc cctgcgcatg 60

ctgctggcag atcagggcca gagctggaag gaggaggtgg tgaccgtgga gacgtggcag 120

gagggctcac tcaaagcctc ctgcctatac gggcagctcc ccaagttcca ggacggagac 180

ctcaccctgt accagtccaa taccatcctg cgtcacctgg gccgcaccct tgggctctat 240

gggaaggacc agcaggaggc agccctggtg gacatggtga atgacggcgt ggaggacctc 300

cgctgcaaat acatctccct catctacacc aactatgagg cgggcaagga tgactatgtg 360

aaggcactgc ccgggcaact gaagcctttt gagaccctgc tgtcccagaa ccagggaggc 420

aagaccttca ttgtgggaga ccagatctcc ttcgctgact acaacctgct ggacttgctg 480

ctgatccatg aggtcctagc ccctggctgc ctggatgcgt tccccctgct ctcagcatat 540

gtggggcgcc tcagtgcccg gcccaagctc aaggccttcc tggcctcccc tgagtacgtg 600

aacctcccca tcaatggcaa cgggaaacag tga 633

<210> 18

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ggatctggag agggcagagg cagcctgctg acatgtggcg acgtggaaga gaaccctggc 60

ccc 63

<210> 19

<211> 2151

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atggaatttg gcctgagctg gctgtttctg gtggcgattc tgaaaggcgt gcagtgcgag 60

gtgcagctgt tccagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120

tgtgcagcct ctggattcac ctttagcagc tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 180

gggaaggggc tggagtgggt ctcagctatt agtggtagtg gtggtagcac atactacgca 240

gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300

caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgccag gggtgttggc 360

cggggctttg actactgggg ccaggggacc acggtcaccg tctcctcaag tggcggtggc 420

tctggcggtg gtgggtcggg tggcggcgga tcagacatcc agttgaccca gtctccatcc 480

tccctgtctg catctgtagg agacagagtc accatcactt gccgggcaag tcagagcatt 540

agcatctatt taaattggta tcggcagcaa ccagggaaag cccctaagct cctgatctat 600

gctgcatcca gtttgcaaag tggggtccca tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca 660

gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa cctgaagatt ttgcaactta cttctgtcaa 720

cagacttaca gtacccctcc gtggacgttc ggccaaggga ccaaagtgga tatcaaaacg 780

cgtaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 840

ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 900

ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt 960

ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt 1020

gactacatga acatgactcc ccgccgcccc gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat 1080

gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc tccagagtga agttcagcag gagcgcagac 1140

gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1200

gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1260

agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1320

gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1380

taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1440

ccccctcgcg gatccggatc tggagagggc agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg 1500

gaggagaatc ccggccctat gccgccctac accgtggtct atttcccagt tcgaggccgc 1560

tgcgcggccc tgcgcatgct gctggcagat cagggccaga gctggaagga ggaggtggtg 1620

accgtggaga cgtggcagga gggctcactc aaagcctcct gcctatacgg gcagctcccc 1680

aagttccagg acggagacct caccctgtac cagtccaata ccatcctgcg tcacctgggc 1740

cgcacccttg ggctctatgg gaaggaccag caggaggcag ccctggtgga catggtgaat 1800

gacggcgtgg aggacctccg ctgcaaatac atctccctca tctacaccaa ctatgaggcg 1860

ggcaaggatg actatgtgaa ggcactgccc gggcaactga agccttttga gaccctgctg 1920

tcccagaacc agggaggcaa gaccttcatt gtgggagacc agatctcctt cgctgactac 1980

aacctgctgg acttgctgct gatccatgag gtcctagccc ctggctgcct ggatgcgttc 2040

cccctgctct cagcatatgt ggggcgcctc agtgcccggc ccaagctcaa ggccttcctg 2100

gcctcccctg agtacgtgaa cctccccatc aatggcaacg ggaaacagtg a 2151

<210> 20

<211> 2094

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gaggtgcagc tgttccagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc caggggtgtt 300

ggccggggct ttgactactg gggccagggg accacggtca ccgtctcctc aagtggcggt 360

ggctctggcg gtggtgggtc gggtggcggc ggatcagaca tccagttgac ccagtctcca 420

tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc 480

attagcatct atttaaattg gtatcggcag caaccaggga aagcccctaa gctcctgatc 540

tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg 600

acagatttca ctctcaccat cagcagtctg caacctgaag attttgcaac ttacttctgt 660

caacagactt acagtacccc tccgtggacg ttcggccaag ggaccaaagt ggatatcaaa 720

acgcgtacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 780

cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 840

gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 900

cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaggagta agaggagcag gctcctgcac 960

agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc 1020

tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat cgctccagag tgaagttcag caggagcgca 1080

gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga 1140

agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag 1200

ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg 1260

gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc 1320

ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc 1380

ctgccccctc gcggatccgg atctggagag ggcagaggaa gtcttctaac atgcggtgac 1440

gtggaggaga atcccggccc tatgccgccc tacaccgtgg tctatttccc agttcgaggc 1500

cgctgcgcgg ccctgcgcat gctgctggca gatcagggcc agagctggaa ggaggaggtg 1560

gtgaccgtgg agacgtggca ggagggctca ctcaaagcct cctgcctata cgggcagctc 1620

cccaagttcc aggacggaga cctcaccctg taccagtcca ataccatcct gcgtcacctg 1680

ggccgcaccc ttgggctcta tgggaaggac cagcaggagg cagccctggt ggacatggtg 1740

aatgacggcg tggaggacct ccgctgcaaa tacatctccc tcatctacac caactatgag 1800

gcgggcaagg atgactatgt gaaggcactg cccgggcaac tgaagccttt tgagaccctg 1860

ctgtcccaga accagggagg caagaccttc attgtgggag accagatctc cttcgctgac 1920

tacaacctgc tggacttgct gctgatccat gaggtcctag cccctggctg cctggatgcg 1980

ttccccctgc tctcagcata tgtggggcgc ctcagtgccc ggcccaagct caaggccttc 2040

ctggcctccc ctgagtacgt gaacctcccc atcaatggca acgggaaaca gtga 2094

<210> 21

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gaggtgcagc tgttccagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc caggggtgtt 300

ggccggggct ttgactactg gggccagggg accacggtca ccgtctcctc a 351

<210> 22

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc atctatttaa attggtatcg gcagcaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttactt ctgtcaacag acttacagta cccctccgtg gacgttcggc 300

caagggacca aagtggatat caaa 324

<210> 23

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

agtggcggtg gctctggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatca 45

Claims (76)

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括胞外结构域、跨膜结构域、胞内信号结构域和抑制ROS的结构域依次串联而成；所述拮抗ROS的结构域为人源GSTP1；

所述胞外结构域包括与B7H3特异性结合的抗体scFv；

所述scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外结构域还包括铰链区。

3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区包含选自CD8α，CD28，4-1BB，PD-1、CD34、OX40，CD3ε、IgG1、IgG4蛋白质的铰链区。

4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区为CD8α蛋白质的铰链区。

5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外结构域还包括胞外信号肽。

7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外信号肽包含选自CD8、CD45、CD3ζ、CD28、CD3ε、CD45、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD4、CD5、CD9、CD80、CD86、ICOS、CD154、GITR、CD134、CD137、GM-CSF、IgG6信号肽。

8.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外信号肽为IgG6信号肽。

9.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外信号肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

10.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域包含选自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154蛋白质的跨膜结构域。

11.根据权利要求10所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域为CD8α的跨膜结构域。

12.根据权利要求11所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域的氨基酸序列为如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

13.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号结构域包括信号转导结构域。

14.根据权利要求13所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号转导结构域包含选自CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278、FcεRI、DAP10、DAP12、CD66d的功能性信号传导结构域。

15.根据权利要求14所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号转导结构域为CD3ζ的功能性信号传导结构域。

16.根据权利要求15所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号转导结构域的氨基酸序列为如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

17.根据权利要求13所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号结构域还包括共刺激信号结构域。

18.根据权利要求17所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激信号结构域包含选自CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、OX40、CDS、ICAM-1、4-1BB(CD137)、B7-H3、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β的功能性信号传导结构域。

19.根据权利要求18所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激信号结构域为4-1BB的功能性信号传导结构域。

20.根据权利要求19所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激信号结构域的氨基酸序列为如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

21.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述拮抗ROS的结构域的氨基酸序列为如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

22.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包括自裂解肽T2A。

23.根据权利要求22所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述自裂解肽T2A的氨基酸序列为如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

24.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由IgG6信号肽、scFv、CD8α的铰链区、CD8α的跨膜结构域、4-1BB的功能性信号传导结构域、CD3ζ的功能性信号传导结构域、自裂解肽T2A、人源GSTP1依次串联得到。

25.根据权利要求24所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列为如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。

26.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码权利要求1-25中任一项所述的嵌合抗原受体的核酸分子。

27.根据权利要求26所述的核酸分子，其特征在于，所述scFv的核苷酸序列如SEQ IDNO:11所示。

28.根据权利要求26所述的核酸分子，其特征在于，所述CD8α铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

29.根据权利要求26所述的核酸分子，其特征在于，所述IgG6信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。

30.根据权利要求26所述的核酸分子，其特征在于，所述CD8α跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。

31.根据权利要求26所述的核酸分子，其特征在于，所述CD3ζ信号转导结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。

32.根据权利要求26所述的核酸分子，其特征在于，所述4-1BB共刺激信号结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。

33.根据权利要求26所述的核酸分子，其特征在于，所述自裂解肽T2A的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。

34.根据权利要求26所述的核酸分子，其特征在于，所述人源GSTP1的核苷酸序列如SEQID NO:17所示。

35.根据权利要求26所述的核酸分子，其特征在于，所述编码权利要求1所述嵌合抗原受体的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示。

36.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物含有权利要求26-35中任一项所述的核酸分子。

37.根据权利要求36所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物还包含与权利要求26-35中任一项所述的核酸分子操作性连接、指导权利要求1-25中任一项所述的嵌合抗原受体在宿主细胞中表达的一个或多个调控序列。

38.根据权利要求37所述的核酸构建物，其特征在于，述调控序列包括启动子序列、转录终止子序列、前导序列。

39.根据权利要求38所述的核酸构建物，其特征在于，所述启动子包括CMV启动子、EF-1α启动子、SV40早期启动子、MMTV启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子、肌酸激酶启动子、金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子、四环素启动子。

40.根据权利要求38所述的核酸构建物，其特征在于，所述转录终止子包括CYC1转录终止子、T7转录终止子、rrnBT1转录终止子、rrnBT2转录终止子、ADH1转录终止子、TIF51A转录终止子、ALG6转录终止子、AOD转录终止子、AOX1转录终止子、ARG4转录终止子、PMA1转录终止子、TEF1转录终止子、TT1转录终止子、TT2转录终止子。

41.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求26-35中任一项所述的核酸分子、权利要求36-40中任一项所述的核酸构建物。

42.根据权利要求41所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括克隆载体、表达载体。

43.根据权利要求41所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括DNA载体、RNA载体。

44.根据权利要求43所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为病毒来源的载体。

45.根据权利要求44所述的重组载体，其特征在于，所述病毒来源的载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体。

46.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞含有权利要求26-35中任一项所述的核酸分子、权利要求36-40中任一项所述的核酸构建物、权利要求41-45中任一项所述的重组载体。

47.根据权利要求46所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞包括哺乳动物细胞、细菌、酵母细胞、真菌细胞。

48.根据权利要求47所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞包括免疫细胞。

49.根据权利要求48所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述免疫细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞或其任意组合。

50.根据权利要求49所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述免疫细胞为T淋巴细胞。

51.一种重组宿主细胞群体，其特征在于，所述重组宿主细胞群体包括权利要求46-50中任一项所述的重组宿主细胞。

52.一种嵌合抗原受体的衍生物，其特征在于，所述衍生物包括权利要求1-25中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求26-35中任一项所述的核酸分子、权利要求36-40中任一项所述的核酸构建物、权利要求41-45中任一项所述的重组载体、权利要求46-50中任一项所述的重组宿主细胞、权利要求51所述的重组宿主细胞群体；所述衍生物包括药物组合物、试剂盒、缀合物。

53.根据权利要求52所述的衍生物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

54.根据权利要求52所述的衍生物，其特征在于，所述试剂盒还包括将权利要求26-35中任一项所述的核酸分子、权利要求36-40中任一项所述的核酸构建物、权利要求41-45中任一项所述的重组载体引入到宿主细胞中的各种试剂。

55.根据权利要求52所述的衍生物，其特征在于，所述缀合物还包括修饰部分；所述修饰部分包括荧光化合物、酶、辅基、发光材料、生物发光材料、发射荧光的金属原子。

56.根据权利要求55所述的衍生物，其特征在于，所述荧光化合物包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白。

57.根据权利要求55所述的衍生物，其特征在于，所述酶包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶。

58.根据权利要求55所述的衍生物，其特征在于，所述辅基包括链霉亲和素、生物素、抗生物素蛋白。

59.根据权利要求55所述的衍生物，其特征在于，所述发光材料包括鲁米诺。

60.根据权利要求55所述的衍生物，其特征在于，所述生物发光材料荧光素酶、荧光素、水母发光蛋白。

61.根据权利要求55所述的衍生物，其特征在于，所述发射荧光的金属原子包括铕。

62.一种细胞注射液，其特征在于，所述细胞注射液含有权利要求1-25中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求26-35中任一项所述的核酸分子、权利要求36-40中任一项所述的核酸构建物、权利要求41-45中任一项所述的重组载体、权利要求46-50中任一项所述的重组宿主细胞、权利要求51所述的重组宿主细胞群体。

63.一种制备权利要求46-50中任一项所述的重组宿主细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求26-35中任一项所述的核酸分子、权利要求36-40中任一项所述的核酸构建物、权利要求41-45中任一项所述的重组载体引入到宿主细胞中。

64.根据权利要求63所述的方法，其特征在于，所述引入的方法包括物理方法、化学方法、生物方法。

65.根据权利要求64所述的方法，其特征在于，所述物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔。

66.根据权利要求64所述的方法，其特征在于，所述化学方法包括胶体分散系统、基于脂质的系统。

67.根据权利要求66所述的方法，其特征在于，所述胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠。

68.根据权利要求66所述的方法，其特征在于，所述基于脂质的系统包括水包油乳剂、胶束、混合胶束、脂质体。

69.根据权利要求64所述的方法，其特征在于，所述生物方法包括利用DNA载体、RNA载体。

70.根据权利要求69所述的方法，其特征在于，所述生物方法包括利用慢病毒载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体。

71.如下任一方面的应用，其特征在于，所述应用包括：

(1) 权利要求1-25中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求26-35中任一项所述的核酸分子、权利要求36-40中任一项所述的核酸构建物、权利要求41-45中任一项所述的重组载体、权利要求46-50中任一项所述的重组宿主细胞、权利要求51所述的重组宿主细胞群体在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用；

(2) 权利要求1-25中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求26-35中任一项所述的核酸分子、权利要求36-40中任一项所述的核酸构建物、权利要求41-45中任一项所述的重组载体、权利要求46-50中任一项所述的重组宿主细胞、权利要求51所述的重组宿主细胞群体在制备用于制备预防和/或治疗肿瘤的免疫细胞的试剂盒中的应用；

(3) 权利要求1-25中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求26-35中任一项所述的核酸分子、权利要求36-40中任一项所述的核酸构建物、权利要求41-45中任一项所述的重组载体、权利要求46-50中任一项所述的重组宿主细胞、权利要求51所述的重组宿主细胞群体在制备用于预防和/或治疗肿瘤的细胞注射液中的应用；

(4) 权利要求52中所述的药物组合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物制剂中的应用；

(5) 权利要求52中所述的试剂盒在制备用于预防和/或治疗肿瘤的免疫细胞中的应用；

(6) 权利要求62所述的细胞注射液在制备预防和/或治疗肿瘤的药物制剂中的应用；

(7) 权利要求1-25中任一项所述的嵌合抗原受体在制备核酸分子、核酸构建物、重组载体、重组宿主细胞、重组宿主细胞群体中的应用；

(8) 权利要求26-35中任一项所述的核酸分子在制备核酸构建物、重组载体、重组宿主细胞、重组宿主细胞群体中的应用；

(9) 权利要求36-40中任一项所述的核酸构建物在制备重组载体、重组宿主细胞、重组宿主细胞群体中的应用；

(10) 权利要求41-45中任一项所述的重组载体在制备重组宿主细胞、重组宿主细胞群体中的应用；

(11) 权利要求46-50中任一项所述的重组宿主细胞在制备重组宿主细胞群体中的应用。

72.根据权利要求71所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞或其任意组合。

73.根据权利要求72所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞为T淋巴细胞。

74.根据权利要求71所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为表达B7H3或CD20的肿瘤。

75.根据权利要求74所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括卵巢癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、食管癌、前列腺癌、口腔癌、胃癌、胰腺癌、子宫内膜癌、肝癌、膀胱癌、骨肉瘤。

76.根据权利要求74所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为淋巴瘤。

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