CN113462651B

CN113462651B - 一种b7h3特异性抗性的car-nk细胞

Info

Publication number: CN113462651B
Application number: CN202110736533.6A
Authority: CN
Inventors: 李慧忠; 郑骏年; 王刚; 曹培育
Original assignee: Xuzhou Medical University
Current assignee: Xuzhou Medical University
Priority date: 2021-06-30
Filing date: 2021-06-30
Publication date: 2022-03-01
Anticipated expiration: 2041-06-30
Also published as: CN113462651A

Abstract

本发明提供了一种CAR‑NK细胞，所述CAR‑NK细胞能够地提高肿瘤细胞的杀伤效率和临床治疗的安全性、有效性；同时，本发明还提供了所述一种CAR‑NK在制备药物中的应用，从而提供了一种具有应用前景的安全、可靠、高效肿瘤治疗的新手段。

Description

一种B7H3特异性抗性的CAR-NK细胞

技术领域

本发明属于免疫治疗领域，涉及一种B7H3特异性抗性的CAR-NK细胞。

背景技术

(1)B7H3简介

B7同源物3(B7H3，B7-H3)是由CD276基因编码的蛋白质，其在许多不同类型的癌症中高表达，包括神经胶质瘤、肝癌、胰腺癌、肺癌、黑色素瘤、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、宫颈癌、卵巢癌等，其表达水平与患者预后不良密切相关。B7H3(CD276)是B7家族的一个免疫关卡抑制剂，与CTLA4、PD-1和CD28等许多免疫相关因子相互作用。在非恶性组织中，B7-H3主要对适应性免疫具有抑制作用，可抑制T细胞活化和增殖。在恶性组织中，B7-H3是抑制肿瘤抗原特异性免疫反应的免疫检查分子。B7-H3还具有非免疫原性致瘤功能，如促进迁移、侵袭、血管生成、化学抗性、上皮向间充质转化以及影响肿瘤细胞代谢。由于其在实体瘤上的选择性表达，B7-H3已成为几种抗癌药的靶标，例如依诺妥珠单抗(MGA271)、omburtamab、MGD009、MGC018、DS-7300a和CAR-T细胞。

(2)免疫细胞简介

使用免疫细胞(包括T细胞、NK细胞)来治疗癌症是近年来的新趋势，经过CAR修饰后的免疫细胞，能够高效的识别肿瘤细胞，并通过释放杀伤介质、诱导靶细胞凋亡等多种手段杀伤肿瘤细胞。这种新疗法有望为对传统手术、化疗和放疗无效的肿瘤提供新的治愈希望。

嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR-T)技术的不断发展，目前CAR-T主要可划分为三代。近些年发展的第三代CAR-T细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-CD137-ITAM或scFv-TM-CD28-CD134-ITAM，进一步提高了CAR-T在体内的存活周期和其抗肿瘤效果。

(3)NK细胞简介

自然杀伤(natural killer，缩写NK)细胞是非特异性免疫系统的重要组成部分，是先天免疫系统反应的关键性介质细胞。NK细胞是一种广谱免疫细胞，具有快速发现和摧毁异常细胞(如癌症或病毒感染的细胞)的特异功能，而且不需要提前致敏或HLA配型，即可展示强大的溶解异常细胞的活性。正是因为NK细胞在抗肿瘤领域扮演着重要的角色，因此CAR技术的发展也催生了CAR-NK的诞生。经过CAR结构修饰后的NK细胞，理论上也能够高效的识别肿瘤细胞，并通过释放杀伤介质、诱导靶细胞凋亡等多种手段杀伤肿瘤细胞。

相对于CAR-T，由于NK细胞的天然特性，CAR-NK的治疗过程中不会产生严重的细胞因子风暴，因此在临床使用中，安全性可能较CAR-T更高。其次，由于NK细胞在体内的存活时间较T细胞更短，导致CAR-NK在体内的存活时间较CAR-T更短。这一特性或许会导致CAR-NK细胞疗效不如CAR-T，但是从安全性的角度来说，这种特性反而避免了经过基因修饰的免疫细胞长期存在于人体可能导致的一系列未知的风险。

目前，CAR-NK中所用到的CAR的结构模式基本沿用的是CAR-T的设计。

发明内容

本发明提供了一种CAR-NK细胞，所述CAR-NK细胞能够提高肿瘤细胞的杀伤效率和临床治疗的安全性、有效性；同时，本发明还提供了所述一种CAR-NK在制备药物中的应用，从而提供了一种具有应用前景的安全、可靠、高效肿瘤治疗的新手段。

第一方面，本发明提供了一种CAR-NK细胞，所述CAR-NK细胞的CAR包含抗B7H3的特异性抗体。

优选地，所述抗B7H3的特异性抗体包含重链可变区和轻链可变区。

优选地，所述重链可变区的氨基酸序列包括VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3中的一个或多个。

优选地，所述轻链可变区的氨基酸序列包括VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3中的一个或多个。

优选地，所述VH-CDR1如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述VH-CDR2如SEQ ID NO:2所示。

优选地，所述VH-CDR3如SEQ ID NO:3所示。

优选地，所述VL-CDR1如SEQ ID NO:4所示。

优选地，所述VL-CDR2如SEQ ID NO:5所示。

优选地，所述VL-CDR3如SEQ ID NO:6所示。

优选地，所述重链可变区的氨基酸序列完整序列如SEQ ID NO:7所示。

优选地，所述重链可变区的核酸序列是编码SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的核酸分子序列。

优选地，所述重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:9所示。

优选地，所述轻链可变区的氨基酸序列完整序列如SEQ ID NO:8所示。

优选地，所述轻链可变区的核酸序列是编码SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的核酸分子序列。

优选地，所述轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:10所示。

优选地，所述重链可变区可在轻链可变区的N端(氨基端)或C端(羟基端)；

优选地，所述重链可变区和轻链可变区之间由接头(linker)连接；

优选地，所述linker由G(Gly，甘氨酸)和/或S(Ser，丝氨酸)组成；

优选地，所述linker还可以包括其他氨基酸；

优选地，所述linker可以是将SEQ ID NO:11所示序列中的一个或几个氨基酸进行置换、缺失或添加得到的序列；

优选地，所述linker如SEQ ID NO:11所示；

优选地，所述linker的核酸序列如SEQ ID NO:12所示；

优选地，所述抗B7H3的特异性抗体的完整氨基酸序列选自以下任一一种：

1)SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；

2)与SEQ ID NO:13所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；

3)与SEQ ID NO:13所示的序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。

优选地，所述抗B7H3的特异性抗体的完整氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。

优选地，所述抗B7H3的特异性抗体的核酸序列是能编码如SEQ ID NO:13所示氨基酸的核酸分子序列。

优选地，所述抗B7H3的特异性抗体的核酸序列如SEQ ID NO:14所示。

优选地，所述CAR-NK细胞的CAR，还包含铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域中的至少一种。

优选地，所述铰链区包括CD8α铰链区、CD28铰链区、CD4铰链区、CD5铰链区、CD134铰链区、CD137铰链区、ICOS铰链区；

优选地，所述铰链区选用CD8α铰链区；

优选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示；

优选地，所述CD8α铰链区的核酸序列如SEQ ID NO.26所示；

优选地，所述跨膜结构域包括蛋白质的跨膜结构域，所述蛋白质包括：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8α，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD123，CD134，CD137和CD154；

优选地，所述跨膜结构域选用CD8α跨膜结构域；

优选地，所述CD8α跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示；

优选地，所述CD8α跨膜结构域的核酸序列如SEQ ID NO.28所示；

优选地，所述共刺激结构域包括CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、DaplO、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-1、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CD244(2B4)、DAP10、DAP12的胞内结构域或其组合；

优选地，所述共刺激结构域选用CD137的胞内结构域；

优选地，所述CD137的胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示；

优选地，所述CD137的胞内结构域的核酸序列如SEQ ID NO.30所示；

优选地，所述胞内信号传导结构域包括CD3ζ(CD3 zeta)、CD79b、DAP10、FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcEpsilon R1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a和DAP12的含有ITAM的细胞质信号传导序列；

优选地，所述胞内信号传导结构域选用CD3ζ的胞内信号传导结构域；

优选地，所述CD3ζ的胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示；

优选地，所述CD3ζ的胞内信号传导结构域的核酸序列如SEQ ID NO.32所示；

优选地，所述铰链区、跨膜结构域、胞内信号传导结构域和共刺激结构域是人为合成的或天然存在的。

优选地，所述CAR的完整结构的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；

优选地，所述CAR的完整结构的核酸序列如SEQ ID NO.18所示；

优选地，所述CAR可以包含一个或多个合成的氨基酸；

优选地，所述合成的氨基酸包括但不限于氨基环己羧酸、正亮氨酸、α-氨基n-癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨甲基-半胱氨酸、反式-3-和反式-4-羟脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、吲哚啉-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N’-苯甲基-N’-甲基-赖氨酸、N’,N’-二苄基-赖氨酸、6-羟赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸以及α-叔丁基甘氨酸。

优选地，所述CAR还可以与信号肽相连；

优选地，所述信号肽连接在CAR的N端；

优选地，所述信号肽包括lgG6信号肽、CD8信号肽、CD28信号肽和CD4信号肽。

优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示；

优选地，所述信号肽的核酸序列如SEQ ID NO.24所示；

优选地，所述信号肽和CAR连接后的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；

优选地，所述信号肽和CAR连接后的核酸序列如SEQ ID NO.17所示；

优选地，所述CAR-NK细胞的CAR还与IL-15连接；

优选地，所述CAR-NK细胞的CAR和IL-15之间还连接有自我剪切序列；

优选地，所述IL-15连接在CAR的N端或C端；

优选地，所述IL-15连接在CAR的C端；

优选地，所述IL-15可以是野生型IL-15序列长度的至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％。

优选地，所述IL-15的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；

优选地，所述IL-15的核酸序列如SEQ ID NO:22所示；

优选地，所述自我剪切序列是2A肽(又称2A自剪切肽，2A self-cleavingpeptides)；

优选地，所述2A肽包括P2A，E2A，F2A和T2A；

优选地，所述2A肽选用T2A；

优选地，所述T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；

优选地，所述T2A的核酸序列如SEQ ID NO:20所示；

另一方面，本发明还提供了一种经改造的NK细胞，所述细胞包含编码前述CAR的核酸分子或其所在的载体；

优选地，所述载体上还包括有信号肽、自我剪切序列和IL-15中一种或多种的核酸序列；

优选地，所述载体上还有信号肽、T2A或IL-15的核酸序列；

优选地，所述核酸分子的结构是信号肽-CAR-T2A-IL-15；

优选地，所述信号肽-CAR-T2A-IL-15的核酸序列如SEQ ID NO.33所示；

优选地，所述载体是成熟的商品化载体或根据需求自行构建的载体；

优选地，所述载体包含DNA载体、RNA载体；

优选地，所述载体包含慢病毒表达载体(慢病毒载体)、逆转录病毒表达载体(逆转录病毒载体)、腺病毒表达载体(腺病毒载体)；

优选地，所述载体是逆转录病毒载体；

优选地，所述逆转录病毒载体包括但不限于以下成熟商品化载体：MSCV、MSCV-NWU ER、MSCV-N SM、MSCV IRES hCD4、mscv2.2、pMSCVII、pMSCVpuroATT、pMSCV_puro_41584、pMSCV_puro_41585、pMSCVII-LO、pMSCV_puro_41589、pMSCVII-AM、HOXA10-MSCV、HOXB4-NA-MSCV、HOXB6-NA-MSCV、HOXB6-WG-MSCV、HOXD4-WV-MSCV、PRRX2-MSCV、MEIS1B-MSCV、MSCVJMJD3、MSCV FLIP FF、MSCV P2Gm FF、pMSCV-FlagBcl10、MSCV-N GFP和MSCV-CGFP；

优选地，所述逆转录病毒载体是MSCV。

另一方面，本发明还提供了一种制备前述CAR-NK细胞或经改造的NK细胞的方法，所述方法包括将编码前述CAR的完整结构的核酸分子所在的载体引入NK细胞；

优选地，所述引入是指病毒转染；

优选地，所述病毒转染包括使用慢病毒或逆转录病毒；

优选地，所述病毒转染使用的是逆转录病毒；

在一种实施方式中，所述方法还包括对病毒进行包装的步骤；

优选地，所述对病毒进行包装使用人类细胞株或非人细胞株；

优选地，所述人类细胞株包括293细胞、293T细胞、293FT细胞、293LTV细胞、293EBNA细胞及其他的从293细胞分离的克隆；SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、C8166细胞、MT-4细胞、Molt-4细胞、HeLa细胞、HT1080细胞、TE671细胞；

优选地，所述人类细胞株是293T细胞；

在一种实施方式中，所述方法还包括制备NK细胞的步骤；

优选地，所述NK细胞是由人源的NK细胞或是商品化的NK细胞系所制备得到的；

优选地，所述NK细胞系包括NK-92、NKG、YT、NK-YS、HANK-1和NKL；

优选地，所述人源的细胞来自于人体脐带血或外周血；

优选地，所述人源的细胞来自于人体脐带血；

优选地，所述人源的细胞是自体的或异体的；

在一种实施方式中，所述方法还包括检测CAR-NK细胞上CAR表达效率的步骤；优选地，所述检测可以是免疫法或分子的实验方法。

在一种实施方式中，所述方法还包括扩增CAR-NK细胞的步骤；优选地，所述扩增是在体外进行的。

另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含前述CAR-NK细胞和/或经改造的NK细胞；

所述药物组合物包括健康权威机构审批的高标准的药物组合物以及具有较低的审批要求或根本不需要具有特定审批的药物组合物，例如所谓的医疗装置或营养制品。

优选地，所述药物组合物还包括能够作为多颗粒剂型、包含丸粒的片剂、微片剂、胶囊、囊剂、泡腾片剂或用于口服悬浮液的干粉剂的成分的任何活性药用物质；

优选地，所述药用物质包括减体重剂(食欲抑制剂、减肥剂)、抗酸剂(anti-acidosis agents)、抗缺氧药、镇痛药(抗风湿药)、抗蠕虫药、抗过敏药、抗贫血药、抗心律失常剂，抗生素类(抗感染药)、抗痴呆药剂(促智药)、抗糖尿病药、解毒剂、止吐药(抗眩晕试剂)、抗癫痫药、抗出血药试剂(抗纤维蛋白溶解药和其它止血剂)、抗高血压药、抗低血糖药剂、抗低血压药剂、抗凝药、抗真菌药、抗寄生虫药剂、抗炎药、止咳药(祛痰药)、抗动脉硬化剂、浴疗剂和热疗剂、β-受体阻断剂、钙通道阻断剂和肾素-血管紧张素-醛甾酮体系抑制剂，支气管药(止喘药)、利胆药和胆道治疗剂、胆碱能药物、肾上腺皮质激素类、皮肤药、消毒剂(抗菌药)、饮食剂(营养剂)、诊断剂和准备诊断的药剂、利尿药、促进血液循环的药剂、脱瘾剂(用于治疗成瘾的药剂)、酶抑制剂、用于酶缺陷的制剂、转运蛋白、纤溶剂、老年病药、抗痛风制剂、感冒和流感药和咳嗽和喷嚏药、妇科药、痔疮药(直肠药)、肝脏药、催眠药(镇静药)、脑下垂体激素类、下丘脑激素类和其它调节性肽及其抑制剂、免疫调节剂、输注和标准注射液、器官灌流液、心脏药、防龋剂、牙周变性药和其它牙科制剂、冠脉制剂、轻泻药、降脂药、局部麻醉药(神经治疗剂)、胃肠药、偏头痛药物、矿物质制剂、口服和咽喉药、肌肉松弛药、麻醉药、神经病制剂和其它亲神经性药剂、眼药、抗骨质疏松剂(钙-和骨代谢调节剂)、耳科药剂、抗帕金森药剂和其它用于锥体外束障碍的药、精神病药物、鼻科药物(窦药剂)、强壮药(补药)、甲状腺制剂、血清、免疫球蛋白和疫苗、性激素类及其抑制剂、解痉药(抗胆碱能药)、血小板凝集抑制剂、结核药、情绪改变药剂、泌尿药、用于静脉病症的药剂、维生素类、创伤和疤痕治疗剂、细胞生长抑制剂和其它抗肿瘤药剂和保护剂、生物材料、医药合成剂。

另一方面，本发明还提供了前述CAR-NK细胞和组合物在制备治疗疾病的药物中的应用；

优选地，所述疾病是与CD276(B7H3)的表达相关的疾病；

优选地，所述疾病是与CD276的表达相关的癌症；

优选地，所述与CD276的表达相关的癌症包括原发性癌症、转移性癌症、复发性癌症、对治疗敏感的癌症、难治性癌症(例如，化疗难治性癌症)。

优选地，所述与CD276的表达相关的癌症包括血液癌、肺癌、脑癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肾癌、胃癌、子宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、睾丸癌、垂体癌、食道癌、脾癌、皮肤癌、胰腺癌、骨癌等(例如B细胞淋巴瘤或黑素瘤)。

优选地，所述与CD276的表达相关的癌症包括肺癌、乳腺癌和卵巢癌。

优选地，所述肺癌是非小细胞肺癌；

优选地，所述卵巢癌是卵巢腺癌。

附图说明

图1为培养不同天数NK细胞纯度检测流式代表图。ABCD图分别为第0天、第7天、第10天、第14天的检测图，其横坐标为Alexa Fluor488的荧光强度，纵坐标为APC的荧光强度；E图也是第14天的检测图，其横坐标为APC的荧光强度，纵坐标为PerCP/Cy5.5的荧光强度。

图2为CAR-NK转染效率检测流式代表图，左图是空白对照，中图是表达不包含IL-15的CAR的NK细胞，右图是包含IL-15的CAR的NK细胞。

图3为CAR-NK转染效率统计图。

图4为RTCA技术分析CAR-NK细胞杀伤乳腺癌细胞MCF-7的动态曲线，上图是表达不包含IL-15的CAR的NK细胞，下图是包含IL-15的CAR的NK细胞。

具体实施方式

下面将参考附图并结合实例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例是为了举例，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1全人源CD276 CAR-NK细胞的制备方法

一、步骤

1、制备脐带血NK细胞；

1)分离CBMCs：收集脐带血，加等量生理盐水稀释，将淋巴细胞分离液与稀释脐带血按1:2比例加入离心管中，2000rpm/min离心20分钟，收集白膜层细胞，生理盐水清洗两次，1500rpm/min离心8分钟，获得脐带血单个核细胞CBMCs。

2)诱导NK细胞：用NK细胞培养基(X-VIVO15+5％FBS+1％P/S+Glutamin)重悬CBMCs细胞，调整细胞密度至1～2×10⁶/mL，转移至CD16 Ab预包被板(加1μg/ml CD16 Ab抗体溶液，4℃过夜，使用前弃去包被液，PBS清洗2次)；加入活化因子组合：50ng/mL 4-1BBL、0.01KE/mL OK432、1000U/mL IL-2，置于37℃5％CO₂培养箱中培养3天。离心收集细胞，用新鲜NK细胞培养基重悬并添加1000U/mL IL-2，转移至普通培养瓶，置于37℃5％CO₂培养箱进行扩增2周。每日观察细胞状态，隔天半量换液。

3)NK纯度检测：培养第7、10、14天，取2×10⁵细胞，清洗后加入Alexa Fluor488CD3、APC CD56、PerCP/Cy5.5 NKG2D抗体4℃避光孵育30分钟，清洗后上机检测。

2、构建含有CAR结构的穿梭质粒：所述CAR结构有包含IL-15和不包含IL-15两种，不包含IL-15的CAR的核酸序列如SEQ ID NO:17所示，包含IL-15的CAR的核酸序列如SEQ IDNO:33所示；合成以上序列，并连接到逆转录病毒载体MSCV上，然后转化Stbl3感受态细胞，挑取单克隆进行质粒提取，经酶切鉴定后送测序确认。

3、包装病毒

将含有CAR结构的穿梭质粒6μg，、辅助质粒pCL-Ampho 4μg混合在300μl opti-MEM培养基中，在另一300μl opti-MEM培养基中逐滴加入30μl PEI试剂，震荡混匀，室温静置5分钟，将含有PEI试剂的混合物逐滴加入到质粒混合物中，震荡混匀，室温静置15分钟，然后将PEI与质粒混合物逐滴加入预先铺好的293T细胞培养皿中，轻摇混匀，48-72小时后，收集上清，经0.45μm针头滤器过滤，超低温冰箱保存备用。

4、病毒感染NK细胞

将CD276-CAR病毒液加入10μM HEPES和6-8μg/ml polybrene，混匀，接着用该病毒液重悬活化的NK细胞，然后加入RetroNectin包被过的24孔板中，1500g、30℃离心2小时后去上清，补加含有5％胎牛血清、200U/ml IL-2、10ng/ml IL-21和5ng/ml IL-15的X-Vivo培养基，继续培养扩增，即可。

5、CAR-NK细胞检测

待病毒感染后72小时，取2×10⁵细胞进行染色，首先加入1μg/mL B7H3-Fc蛋白4℃孵育30分钟，清洗细胞再加入AF647 anti-human IgG Fc抗体4℃避光孵育30分钟，清洗细胞最后加入Alexa Fluor488 CD3、APC CD56抗体4℃避光孵育30分钟，清洗后上机检测。

二、结果

图1为培养不同天数NK细胞纯度检测流式代表图，结果显示本发明制备得到的NK细胞纯度大于95％，且高表达NKG2D；图2为CAR-NK转染效率检测流式代表图；图3为CAR-NK转染效率统计图，结果显示利用逆转录病毒介导的CAR体系能够高效感染诱导的NK细胞，CAR阳性率达60-85％。

实施例2利用RTCA实时无标记动态细胞分析技术检测CAR-NK细胞对肿瘤细胞MCF- 7的杀伤效果

一、步骤

首先在xCELLigence细胞功能分析仪的E-Plate检测板中加入50μL DMEM完全培养基，测定背景阻抗值；收集处于对数期的靶细胞MCF-7，调整细胞悬液浓度至1×105/mL，向E-Plate检测板中加入100μL细胞悬液，室温静置30分钟后置于检测台上；实时动态观察待靶细胞增殖状态，24h后实验孔按照效靶比5:1、2.5:1、1:1加入50μL效应细胞，设置单独肿瘤细胞为Blank组，实时观察B7H3.CAR-NK细胞介导的杀伤效应曲线。

二、结果

图4为RTCA技术分析CAR-NK细胞杀伤乳腺癌细胞MCF-7的动态曲线。结果显示本发明制备的B7H3.CAR-NK细胞能高效杀伤乳腺癌细胞MCF-7，效靶比越高杀伤活性越强。

需要说明的是，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本领域技术人员理解的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 徐州医科大学

<120> 一种B7H3特异性抗性的CAR-NK细胞

<141> 2021-06-30

<160> 33

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Arg Gly Val Gly Arg Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Ser Ile Ser Ile Tyr

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ala Ala Ser

1

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Gln Thr Tyr Ser Thr Pro Pro Trp Thr

1 5 10

<210> 7

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Glu Val Gln Leu Phe Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ile Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Thr Pro Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaggtgcagc tgttccagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc caggggtgtt 300

ggccggggct ttgactactg gggccagggg accacggtca ccgtctcctc a 351

<210> 10

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc atctatttaa attggtatcg gcagcaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttactt ctgtcaacag acttacagta cccctccgtg gacgttcggc 300

caagggacca aagtggatat caaa 324

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agtggcggtg gctctggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatca 45

<210> 13

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Glu Val Gln Leu Phe Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

130 135 140

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser

145 150 155 160

Ile Ser Ile Tyr Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro

165 170 175

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser

180 185 190

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

195 200 205

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Tyr

210 215 220

Ser Thr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

225 230 235 240

<210> 14

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gaggtgcagc tgttccagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc caggggtgtt 300

ggccggggct ttgactactg gggccagggg accacggtca ccgtctcctc aagtggcggt 360

ggctctggcg gtggtgggtc gggtggcggc ggatcagaca tccagttgac ccagtctcca 420

tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc 480

attagcatct atttaaattg gtatcggcag caaccaggga aagcccctaa gctcctgatc 540

tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg 600

acagatttca ctctcaccat cagcagtctg caacctgaag attttgcaac ttacttctgt 660

caacagactt acagtacccc tccgtggacg ttcggccaag ggaccaaagt ggatatcaaa 720

<210> 15

<211> 490

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Phe Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Val Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser

145 150 155 160

Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala

165 170 175

Ser Gln Ser Ile Ser Ile Tyr Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly

180 185 190

Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly

195 200 205

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

210 215 220

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln

225 230 235 240

Gln Thr Tyr Ser Thr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

245 250 255

Asp Ile Lys Thr Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

260 265 270

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys

275 280 285

Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala

290 295 300

Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu

305 310 315 320

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe Ser Val Val Lys

325 330 335

Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg

340 345 350

Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro

355 360 365

Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg

370 375 380

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

385 390 395 400

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

405 410 415

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

420 425 430

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

435 440 445

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

450 455 460

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

465 470 475 480

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 16

<211> 471

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Glu Val Gln Leu Phe Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

130 135 140

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser

145 150 155 160

Ile Ser Ile Tyr Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro

165 170 175

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser

180 185 190

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

195 200 205

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Tyr

210 215 220

Ser Thr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

225 230 235 240

Thr Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr

245 250 255

Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala

260 265 270

Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

275 280 285

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

290 295 300

Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg

305 310 315 320

Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln

325 330 335

Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu

340 345 350

Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

355 360 365

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

370 375 380

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

385 390 395 400

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

405 410 415

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

420 425 430

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

435 440 445

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

450 455 460

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470

<210> 17

<211> 1470

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atggaatttg gcctgagctg gctgtttctg gtggcgattc tgaaaggcgt gcagtgcgag 60

gtgcagctgt tccagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120

tgtgcagcct ctggattcac ctttagcagc tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 180

gggaaggggc tggagtgggt ctcagctatt agtggtagtg gtggtagcac atactacgca 240

gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300

caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgccag gggtgttggc 360

cggggctttg actactgggg ccaggggacc acggtcaccg tctcctcaag tggcggtggc 420

tctggcggtg gtgggtcggg tggcggcgga tcagacatcc agttgaccca gtctccatcc 480

tccctgtctg catctgtagg agacagagtc accatcactt gccgggcaag tcagagcatt 540

agcatctatt taaattggta tcggcagcaa ccagggaaag cccctaagct cctgatctat 600

gctgcatcca gtttgcaaag tggggtccca tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca 660

gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa cctgaagatt ttgcaactta cttctgtcaa 720

cagacttaca gtacccctcc gtggacgttc ggccaaggga ccaaagtgga tatcaaaacg 780

cgtaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 840

ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 900

ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt 960

ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc aggttcagtg tcgtgaagag aggccggaag 1020

aagctgctgt acatcttcaa gcagcctttc atgaggcccg tgcagactac ccaggaggaa 1080

gatggatgca gctgtagatt ccctgaagag gaggaaggag gctgtgagct gagaagagtg 1140

aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1200

gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1260

cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1320

cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1380

ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1440

gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1470

<210> 18

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gaggtgcagc tgttccagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc caggggtgtt 300

ggccggggct ttgactactg gggccagggg accacggtca ccgtctcctc aagtggcggt 360

ggctctggcg gtggtgggtc gggtggcggc ggatcagaca tccagttgac ccagtctcca 420

tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc 480

attagcatct atttaaattg gtatcggcag caaccaggga aagcccctaa gctcctgatc 540

tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg 600

acagatttca ctctcaccat cagcagtctg caacctgaag attttgcaac ttacttctgt 660

caacagactt acagtacccc tccgtggacg ttcggccaag ggaccaaagt ggatatcaaa 720

acgcgtacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 780

cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 840

gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 900

cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaggttca gtgtcgtgaa gagaggccgg 960

aagaagctgc tgtacatctt caagcagcct ttcatgaggc ccgtgcagac tacccaggag 1020

gaagatggat gcagctgtag attccctgaa gaggaggaag gaggctgtga gctgagaaga 1080

gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 1140

aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1200

gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1260

ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1320

aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1380

gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgc 1413

<210> 19

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

1 5 10 15

Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 20

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggatctggag agggcagagg cagcctgctg acatgtggcg acgtggaaga gaaccctggc 60

ccc 63

<210> 21

<211> 162

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr

1 5 10 15

Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His

20 25 30

Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala

35 40 45

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

50 55 60

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

65 70 75 80

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

85 90 95

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

100 105 110

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

115 120 125

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

130 135 140

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

145 150 155 160

Thr Ser

<210> 22

<211> 489

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atgagaattt cgaaaccaca tttgagaagt atttccatcc agtgctactt gtgtttactt 60

ctaaacagtc attttctaac tgaagctggc attcatgtct tcattttggg ctgtttcagt 120

gcagggcttc ctaaaacaga agccaactgg gtgaatgtaa taagtgattt gaaaaaaatt 180

gaagacctta ttcaatctat gcatattgat gctactttat atacggaaag tgatgttcac 240

cccagttgca aagtaacagc aatgaagtgc tttctcttgg agttacaagt tatttcactt 300

gagtccggag atgcaagtat tcatgataca gtagaaaatc tgatcatcct agcaaacaac 360

agtttgtctt ctaatgggaa tgtaacagaa tctggatgca aagaatgtga ggaactggag 420

gaaaaaaata ttaaagaatt tttgcagagt tttgtacata ttgtccaaat gttcatcaac 480

acttcttga 489

<210> 23

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys

<210> 24

<211> 2013

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

atggaatttg gcctgagctg gctgtttctg gtggcgattc tgaaaggcgt gcagtgcgag 60

gtgcagctgt tccagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120

tgtgcagcct ctggattcac ctttagcagc tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 180

gggaaggggc tggagtgggt ctcagctatt agtggtagtg gtggtagcac atactacgca 240

gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300

caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgccag gggtgttggc 360

cggggctttg actactgggg ccaggggacc acggtcaccg tctcctcaag tggcggtggc 420

tctggcggtg gtgggtcggg tggcggcgga tcagacatcc agttgaccca gtctccatcc 480

tccctgtctg catctgtagg agacagagtc accatcactt gccgggcaag tcagagcatt 540

agcatctatt taaattggta tcggcagcaa ccagggaaag cccctaagct cctgatctat 600

gctgcatcca gtttgcaaag tggggtccca tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca 660

gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa cctgaagatt ttgcaactta cttctgtcaa 720

cagacttaca gtacccctcc gtggacgttc ggccaaggga ccaaagtgga tatcaaaacg 780

cgtaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 840

ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 900

ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt 960

ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt 1020

gactacatga acatgactcc ccgccgcccc gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat 1080

gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc tccagagtga agttcagcag gagcgcagac 1140

gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1200

gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1260

agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1320

gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1380

taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1440

ccccctcgcg catgcggatc tggagagggc agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg 1500

gaggagaatc ccggccctcg tacgatgaga atttcgaaac cacatttgag aagtatttcc 1560

atccagtgct acttgtgttt acttctaaac agtcattttc taactgaagc tggcattcat 1620

gtcttcattt tgggctgttt cagtgcaggg cttcctaaaa cagaagccaa ctgggtgaat 1680

gtaataagtg atttgaaaaa aattgaagac cttattcaat ctatgcatat tgatgctact 1740

ttatatacgg aaagtgatgt tcaccccagt tgcaaagtaa cagcaatgaa gtgctttctc 1800

ttggagttac aagttatttc acttgagtcc ggagatgcaa gtattcatga tacagtagaa 1860

aatctgatca tcctagcaaa caacagtttg tcttctaatg ggaatgtaac agaatctgga 1920

tgcaaagaat gtgaggaact ggaggaaaaa aatattaaag aatttttgca gagttttgta 1980

catattgtcc aaatgttcat caacacttct tga 2013

<210> 25

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr

35 40 45

<210> 26

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgatatcta c 141

<210> 27

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 28

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 60

tactgc 66

<210> 29

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

1 5 10 15

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

20 25 30

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

35 40 45

<210> 30

<211> 144

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

aggttcagtg tcgtgaagag aggccggaag aagctgctgt acatcttcaa gcagcctttc 60

atgaggcccg tgcagactac ccaggaggaa gatggatgca gctgtagatt ccctgaagag 120

gaggaaggag gctgtgagct gaga 144

<210> 31

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 32

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 33

<211> 2013

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

atggaatttg gcctgagctg gctgtttctg gtggcgattc tgaaaggcgt gcagtgcgag 60

gtgcagctgt tccagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120

tgtgcagcct ctggattcac ctttagcagc tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 180

gggaaggggc tggagtgggt ctcagctatt agtggtagtg gtggtagcac atactacgca 240

gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300

caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgccag gggtgttggc 360

cggggctttg actactgggg ccaggggacc acggtcaccg tctcctcaag tggcggtggc 420

tctggcggtg gtgggtcggg tggcggcgga tcagacatcc agttgaccca gtctccatcc 480

tccctgtctg catctgtagg agacagagtc accatcactt gccgggcaag tcagagcatt 540

agcatctatt taaattggta tcggcagcaa ccagggaaag cccctaagct cctgatctat 600

gctgcatcca gtttgcaaag tggggtccca tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca 660

gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa cctgaagatt ttgcaactta cttctgtcaa 720

cagacttaca gtacccctcc gtggacgttc ggccaaggga ccaaagtgga tatcaaaacg 780

cgtaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 840

ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 900

ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt 960

ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt 1020

gactacatga acatgactcc ccgccgcccc gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat 1080

gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc tccagagtga agttcagcag gagcgcagac 1140

gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1200

gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1260

agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1320

gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1380

taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1440

ccccctcgcg catgcggatc tggagagggc agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg 1500

gaggagaatc ccggccctcg tacgatgaga atttcgaaac cacatttgag aagtatttcc 1560

atccagtgct acttgtgttt acttctaaac agtcattttc taactgaagc tggcattcat 1620

gtcttcattt tgggctgttt cagtgcaggg cttcctaaaa cagaagccaa ctgggtgaat 1680

gtaataagtg atttgaaaaa aattgaagac cttattcaat ctatgcatat tgatgctact 1740

ttatatacgg aaagtgatgt tcaccccagt tgcaaagtaa cagcaatgaa gtgctttctc 1800

ttggagttac aagttatttc acttgagtcc ggagatgcaa gtattcatga tacagtagaa 1860

aatctgatca tcctagcaaa caacagtttg tcttctaatg ggaatgtaac agaatctgga 1920

tgcaaagaat gtgaggaact ggaggaaaaa aatattaaag aatttttgca gagttttgta 1980

catattgtcc aaatgttcat caacacttct tga 2013

Claims

1.一种CAR-NK细胞，所述CAR-NK细胞的CAR包含抗CD276的全人源特异性抗体；所述抗CD276的全人源特异性抗体包含重链可变区和轻链可变区；

所述重链可变区的氨基酸序列包括VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3；

所述轻链可变区的氨基酸序列包括VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3；

所述VH-CDR1如SEQ ID NO:1所示；

所述VH-CDR2如SEQ ID NO:2所示；

所述VH-CDR3如SEQ ID NO:3所示；

所述VL-CDR1如SEQ ID NO:4所示；

所述VL-CDR2如SEQ ID NO:5所示；

所述VL-CDR3如SEQ ID NO:6所示。

2.如权利要求1所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列完整序列如SEQ ID NO:7所示。

3.如权利要求1所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述重链可变区的核酸序列如SEQ IDNO:9所示。

4.如权利要求1所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列完整序列如SEQ ID NO:8所示。

5.如权利要求1所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述轻链可变区的核酸序列如SEQ IDNO:10所示。

6.如权利要求1所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述重链可变区和轻链可变区之间由接头连接。

7.如权利要求6所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。

8.如权利要求6所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述接头的核酸序列如SEQ ID NO:12所示。

9. 如权利要求1所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述抗CD276的全人源特异性抗体的完整氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。

10. 如权利要求1所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述抗CD276的全人源特异性抗体的核酸序列如SEQ ID NO:14所示。

11.如权利要求1所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述CAR-NK细胞的CAR还包含铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域中的至少一种。

12.如权利要求11所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述铰链区选用CD8α铰链区。

13.如权利要求11所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述跨膜结构域选用CD8α跨膜结构域。

14.如权利要求11所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述共刺激结构域选用CD137的胞内结构域。

15.如权利要求11所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述胞内信号传导结构域选用CD3ζ的胞内信号传导结构域。

16.如权利要求11所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述CAR的完整结构的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

17.如权利要求11所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述CAR的完整结构的核酸序列如SEQ ID NO.18所示。

18.如权利要求1所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述CAR还与信号肽相连。

19.如权利要求18所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述信号肽连接在CAR的N端。

20.如权利要求18所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.23所示。

21.如权利要求18所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ IDNO.24所示。

22. 如权利要求18所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述信号肽和CAR连接后的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。

23. 如权利要求18所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述信号肽和CAR连接后的核酸序列如SEQ ID NO.17所示。

24.如权利要求11所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述CAR-NK细胞的CAR还与IL-15连接。

25.如权利要求24所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述CAR-NK细胞的CAR和IL-15之间还连接有自我剪切序列。

26.如权利要求24所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述IL-15的氨基酸序列如SEQ IDNO:21所示。

27. 如权利要求24所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述IL-15的核酸序列如SEQ IDNO:22所示。

28.如权利要求25所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述自我剪切序列是2A肽。

29.如权利要求28所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述2A肽选用T2A。

30.如权利要求29所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述T2A的氨基酸序列如SEQ IDNO:19所示。

31. 如权利要求29所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述T2A的核酸序列如SEQ ID NO:20所示。

32.一种经改造的NK细胞，所述细胞包含编码权利要求1所述CAR-NK细胞中CAR的核酸分子或其所在的载体。

33.如权利要求32所述的NK细胞，其特征在于，所述载体上还有与权利要求1所述CAR-NK细胞中的CAR相连的信号肽、T2A或IL-15的核酸序列。

34.如权利要求33所述的NK细胞，其特征在于，所述载体上CAR、信号肽、T2A或IL-15的核酸序列的连接顺序是信号肽-CAR-T2A-IL-15。

35.如权利要求34所述的NK细胞，其特征在于，所述信号肽-CAR-T2A-IL-15的核酸序列如SEQ ID NO.33所示。

36.如权利要求32所述的NK细胞，其特征在于，所述载体是逆转录病毒载体。

37.如权利要求36所述的NK细胞，其特征在于，所述逆转录病毒载体是MSCV。

38.一种制备权利要求1所述CAR-NK细胞或权利要求32所述的经改造的NK细胞的方法，其特征在于，所述方法包括将编码权利要求1所述CAR-NK细胞中CAR的核酸分子所在的载体引入NK细胞。

39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述引入是指病毒转染。

40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述病毒转染使用的是逆转录病毒。

41.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对病毒进行包装的步骤。

42.权利要求38所述的方法，其特征在于，所述方法还包括制备NK细胞的步骤。

43.权利要求38所述的方法，其特征在于，所述方法还包括检测CAR-NK细胞上CAR表达效率的步骤。

44.权利要求38所述的方法，其特征在于，所述方法还包括扩增CAR-NK细胞的步骤。

45.权利要求44所述的方法，其特征在于，所述扩增是在体外进行的。

46.一种组合物，所述组合物包含权利要求1所述的CAR-NK细胞和/或权利要求32所述的经改造的NK细胞。

47.权利要求46所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括能够作为多颗粒剂型、微片剂、泡腾片剂或用于口服悬浮液的干粉剂的成分的任何活性药用物质。

48.权利要求1所述的CAR-NK细胞、权利要求32所述的经改造的NK细胞或权利要求46所述的组合物在制备治疗CD276的表达相关的癌症的药物中的应用。

49.如权利要求48所述的应用，其特征在于，所述与CD276的表达相关的癌症包括肺癌、脑癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肾癌、胃癌、子宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、睾丸癌、垂体癌、食道癌、皮肤癌、胰腺癌、骨癌。

50.如权利要求49所述的应用，其特征在于，所述与CD276的表达相关的癌症包括肺癌、乳腺癌和卵巢癌。

51.如权利要求50所述的应用，其特征在于，所述肺癌是非小细胞肺癌。

52.如权利要求50所述的应用，其特征在于，所述卵巢癌是卵巢腺癌。