CN111763262B

CN111763262B - 一种靶向c-Met和PD-L1双特异性嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN111763262B
Application number: CN202010648548.2A
Authority: CN
Inventors: 蒋伟; 唐奇; 季国忠; 冯振卿; 李涛; 季劼; 王静静
Original assignee: 2nd Affiliated Hospital of Nanjing Medical University
Current assignee: 2nd Affiliated Hospital of Nanjing Medical University
Priority date: 2020-07-07
Filing date: 2020-07-07
Publication date: 2021-10-26
Anticipated expiration: 2040-07-07
Also published as: CN111763262A

Abstract

本发明公开了一种靶向c‑Met和PD‑L1双特异性嵌合抗原受体及其应用，本发明涉及的T细胞含有抗c‑Met的scFv抗体和抗PD‑L1scFv抗体的编码序列。本发明的嵌合抗原受体修饰使用了慢病毒转录技术，能成功感染人外周T淋巴细胞并可特异性的靶向识别肿瘤表面的c‑Met和PD‑L1从而特异杀伤c‑Met和PD‑L1高表达的肿瘤细胞，促进了CAR‑T细胞对肿瘤的杀伤作用。

Description

一种靶向c-Met和PD-L1双特异性嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向c-Met和PD-L1双特异性嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

在机体正常的免疫反应中，T细胞活化需要两个信号。抗原提呈细胞(APC)上的抗原肽-MHC分子复合物与T细胞受体TCR-CD3复合物特异性识别并结合，提供T细胞活化的第一信号；T细胞与抗原提呈细胞表面配对的协同刺激分子相互结合，如CD28分子与CD80/CD86结合，提供T细胞活化的第二信号。但在肿瘤细胞中，第一信号MHC分子及第二信号配体(如CD80/CD86)往往表达缺失或降低，使肿瘤细胞发生免疫逃逸，机体的免疫系统对肿瘤细胞的清除能力下降。

CAR-T细胞疗法是通过基因修饰使T细胞表达一种嵌合抗原受体(chimericantigen receptor，CAR)，这种嵌合抗原受体用肿瘤特异性单克隆抗体的单链可变区(scFv)取代TCR的可变区，并将scFv区直接和共刺激分子(如CD28)及T细胞信号传导区CD3-ζ连接。因为scFv可以以MHC非限制性方式识别并结合抗原，因此CAR与相应的肿瘤抗原结合后能以MHC非限制性方式使T细胞活化并靶向结合肿瘤细胞，通过诱导细胞凋亡、裂解性杀伤等方式杀伤肿瘤细胞。CAR主要由胞外区、跨膜区、胞内区三部分构成。胞外区为能够特异性识别并结合肿瘤抗原的单克隆抗体序列的单链可变区(scFv)，跨膜区主要起连接胞内区和胞外区、稳定CAR结构的作用，胞内区由共刺激信号(通常为CD28、CD137、CD134或ICOS)和免疫受体酪氨酸活化基序(通常为CD3ζ)构成，负责刺激CAR-T细胞活化及胞内信号转导。

迄今为止，CAR-T细胞已经经历三代发展阶段。第一代CAR的胞内区仅含有CD3ζ，形成scFv-CD3ζ结构。第一代CAR-T细胞因缺乏共刺激信号，进入机体后很快便凋亡，因此其在体内抗肿瘤活性受到了限制。第二代CAR在胞内区增加一个免疫共刺激信号分子CD28，形成scFv-CD28-CD3ζ结构。与第一代相比，第二代CAR-T细胞的抗原特异性不变，但T细胞增殖和细胞因子分泌能力提高。第三代CAR则是在胞内区再增加一个免疫共刺激信号分子CD134或CD137，形成scFv-CD28-CD134-CD3ζ或scFv-CD28-CD137-CD3ζ结构。虽然有研究认为，第三代CAR比第二代更好，但目前这方面的证据仍不充分。另外，研究者们已经开发出称为“TRUCK”的四代CAR，这种新型的CAR在正常CAR结构基础上额外添加了CAR诱导表达的“治疗蛋白”基因。在CAR结构识别并结合靶抗原的过程中，TRUCKs可以表达并分泌“治疗蛋白”，然后这些治疗蛋白可以在靶细胞部位堆积并发挥抗肿瘤活性。但目前这种新型CAR仅限于科学研究阶段。

目前CAR-T细胞疗法在治疗恶性血液性疾病上取得了良好的临床治疗效果，特别是CD19CAR-T细胞治疗急性淋巴细胞白血病。针对CAR-T细胞治疗实体瘤的临床研究也在大量开展，如抗HER2CAR-T细胞治疗乳腺癌，抗GPC3CAR-T细胞治疗肝癌等等。CAR-T细胞疗法治疗实体瘤取得一定疗效的同时也凸显出一些问题。其中最严重的毒性作用为“脱靶效应”。目前针对实体瘤的靶抗原多为肿瘤相关性抗原，导致CAR-T细胞在杀伤肿瘤细胞的同时攻击了表达相同抗原的正常组织，造成严重的毒副作用。如在一项ERBB2-CAR-T细胞治疗结肠癌的临床研究中，一名晚期结肠癌肝转移患者因CAR-T细胞攻击了表达ERBB2的肺细胞引发急性肺水肿而死亡；另一项靶向CAIX的CAR-T细胞治疗转移性肾细胞癌研究中，也因CAI-CAR-T细胞攻击胆管上皮细胞导致患者出现不同程度的肝脏毒性反应。另一大毒性作用为细胞因子释放综合征(cytokines release syndrome，CRS)即细胞因子风暴。机体在回输大量的高活性CAR-T细胞后，会产生一系列炎性细胞因子，这种现象会导致发热、低血压甚至急性呼吸窘迫综合征或多器官功能障碍综合征。目前针对CRS主要应对措施为严密监控，糖皮质激素、IL-6单抗及对症治疗。其他的毒性作用还包括神经毒性等等。因此有必要完善CAR设计，降低脱靶效应，提高CAR-T细胞临床治疗的安全性。

发明内容

基于此，我们提供一种提高靶向性的双特异性CAR及其表达基因，并提供表达所述CAR的免疫反应细胞及应用。表达双特异性CAR的T淋巴细胞可同时识别两种肿瘤相关抗原，提高杀伤肿瘤细胞的靶向性并减少对正常组织的损伤。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种靶向c-Met和PD-L1的双特异性嵌合抗原受体，该所述嵌合抗原受体为CD8αSP—c-Met Vk—c-Met Vh—PD-L1 Vh—PD-L1 Vk—CD8αHinge—CD137—CD3ζ，片段之间通过Linker片段进行连接，所述的CD8αSP—c-Met Vk—c-Met Vh—PD-L1 Vh—PD-L1 Vk—CD8αHinge—CD137—CD3ζ的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

优选的，所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示。

优选的，所述的嵌合抗原受体通过其编码的核酸序列转染到T细胞中表达。

优选的，所述转染的方式为通过病毒载体、真核表达质粒或mRNA序列中的任意一种或至少两种的组合转染到T细胞。

优选的，所述病毒载体为质粒载体和/或慢病毒载体和/或逆转录病毒载体和/或腺病毒载体。

一种重组慢病毒，包括如前述任一项方案所述的嵌合抗原受体的病毒载体与包装辅助质粒pSPAX2和pMD2G共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。

优选的，所述哺乳细胞为293细胞。

一种组合物，该所述组合物包括前述任一项方案所述的嵌合抗原受体和/或前述任一项方案所述的重组慢病毒。

前述任一项方案所述的嵌合抗原受体、前述任一项方案所述的重组慢病毒或前述任一项方案所述的组合物在制备嵌合抗原受体T细胞及其在制备肿瘤疾病治疗药物中的应用。

优选的，所述肿瘤疾病为胃癌、肺癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌或卵巢癌。

有益效果

本发明的双特异性嵌合抗原受体c-Met/PD-L1 CAR可特异性识别肿瘤细胞表面c-Met和PD-L1两种肿瘤相关抗原。c-Met/PD-L1双特异性嵌合抗原受体的T淋巴细胞，可特异性识别并杀伤同时表达c-Met、PD-L1双抗原的肿瘤细胞，减轻CAR-T细胞对单阳性非肿瘤细胞的杀伤作用，减轻脱靶效应。因此本发明的双特异性嵌合抗原受体可在实体肿瘤中得到应用，延长肿瘤患者的生存期，改善患者生存质量。

附图说明

图1为本专利实施方案CAR的结构示意图；

图2A-图2B为本专利实施方案CAR的表达载体结构示意图；

图3为本专利实施方案CAR质粒的表达验证图；

图4A～图4E为本专利实施方案不同CAR-T细胞的感染效率；

图5A～图5C为本专利实施方案不同CAR-T细胞对不同靶细胞的杀伤作用；

图6A～图6C为本专利实施方案不同CAR-T细胞对不同靶细胞的IFN-γ的分泌情况；

图7A～图7C为本专利实施方案不同CAR-T细胞对不同靶细胞的IL-2的分泌情况；

具体实施方式

下面结合具体实施方式及附图详细阐述本发明。以下实施方式用于说明本发明，不用于限制本发明的范围。本领域技术人员在不违背本发明内涵的情况下可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样在本申请所附权利要求书所限范围。

实施例1：CAR表达基因的合成

本发明提供的双特异性嵌合抗原受体，由CD8α信号肽、c-Met scFv、linker、PD-L1scFv、CD8跨膜区、CD137胞内信号区、CD3ζ胞内信号区序列来自本实验室所构建的单克隆抗体序列并进行了密码子优化，各基因序列信息如SEQ ID NO.1～20所示。

其中，CD8α信号肽(CD8αSP)的编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；c-Met抗体轻链可变区(c-Met Vk)的编码氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；Linker区的编码氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；c-Met抗体重链可变区(c-Met Vh)的编码氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；PD-L1抗体重链可变区(PD-L1Vh)的编码氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；PD-L1抗体轻链可变区(PD-L1Vk)的编码氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；CD8α跨膜区(CD8αHinge)的编码氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；CD137胞内信号区的编码氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；免疫受体络氨酸活化基序CD3ζ的编码氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；

CD8α信号肽(CD8αSP)的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；c-Met抗体轻链可变区(c-Met Vk)的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；Linker区的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；c-Met抗体重链可变区(c-Met Vh)的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；PD-L1抗体重链可变区(PD-L1Vh)的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；PD-L1抗体轻链可变区(PD-L1Vk)的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；CD8α跨膜区(CD8αHinge)的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；CD137胞内信号区的编码核苷酸序列如SEQ IDNO.19所示；免疫受体络氨酸活化基序CD3ζ的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。

实施例2：CAR质粒的构建

采用overlap PCR分别完成实施例1中CAR的核苷酸序列各结构拼接，获得CAR1_c-Met、CAR2_PD-L1、CAR3_c-Met/PD-L1(CP1)、CAR4_c-Met/PD-L1(CP2)、CAR5_PD-L1/c-Met(PC1)、CAR6_PD-L1/c-Met(PC2)及对照CAR_CD19，如图1所示。

分别在CAR结构的5’端添加Xba I酶切位点，3’端添加Not I酶切位点。将pCDH-CMV-MCS-EF1a-CopGFP载体用Xba I/Not I双酶切，采用In-fusion PCR方式分别将CAR1_c-Met片段、CAR2_PD-L1片段、CP1片段、CP2片段、PC1片段、PC2片段及对照CAR_CD19片段与pCDH-CMV-MCS-EF1a-CopGFP载体连接。

连接产物转化E.coli(DH5α)感受态，挑取单克隆培养并提取质粒测序，获得pCDH-CAR1_c-Met、pCDH-CAR2_PD-L1、CP1、CP2、PC1、PC2及pCDH-CAR_CD19质粒。慢病毒表达载体质粒信息见图2A和图2B。图2A为c-Met/PD-L1CAR的质粒图谱；图2B为质粒电泳构成图：M:DL10000Marker；1:c-Met scFv；2:PD-L1 scFv；3:CD137-CD3；4:c-Met/PD-L1 CAR；5:Xba I/Not I双酶切慢病毒载体；6:c-Met/PD-L1 CAR重组质粒；7:c-Met/PD-L1 CAR重组质粒NotI单酶切；8:c-Met/PD-L1 CAR重组质粒Xba I/Not I双酶切，从两幅图中可以看出：双特异性CAR的慢病毒表达载体质粒构建成功。

实施例3：双特异性CAR的结合能力与外源性CD3ζ表达鉴定。

利用蛋白质分析软件ProtParam对4种双特异性c-Met/PD-L1scFv-Fc融合蛋白的蛋白质特性进行分析(表1)。氨基酸数目、相对分子质量、正负电荷残基数、等电位、亲水性等理化性质没有变化，半衰期和失稳指数在4种组合中发生明显变化。不同于CP1、PC1和PC2，CP2的半衰期和失稳指数都展现出了最优指数，上述结果提示CP2的结构更加稳定。因此，即选择以CAR4_c-Met/PD-L1(CP2)的组合进行后续的研究。

表1

取对数生长期的X-293T细胞，接种于10cm细胞培养皿，待细胞密度达60～80％时进行转染。分别将pCDH-CAR1_c-Met、pCDH-CAR2_PD-L1、CP2及pCDH-CAR_CD19质粒转染至X-293T细胞。转染48小时后收集X-293T细胞提取总蛋白，western blot法检测外源性CD3ζ表达。结果见图3，如图所示，各CAR质粒均有外源性CD3ζ表达。

实施例4：慢病毒的包装、浓缩与滴度测定

取对数生长期的X-293T细胞，接种于10cm细胞培养皿，待细胞密度达60～80％时进行转染。向X-293T细胞中共转染慢病毒表达载体质粒(pCDH-CAR1_c-Met、pCDH-CAR2_PD-L1、CP2及pCDH-CAR_CD19质粒)和包装质粒pSPAX2、pMD2G。分别于转染后48小时和72小时收集X-293培养上清，使用PEG8000浓缩病毒并检测病毒滴度。

实施例5：T细胞的分离培养及慢病毒转导

采用Ficoll密度梯度离心法获得人PBMC细胞。将PBMC细胞置于CD3/CD28抗体预包被的24孔板37℃，5％CO₂过夜培养。然后加入IL-2继续培养。培养48小时后，将慢病毒浓缩液按MOI＝10感染T细胞。感染5天后通过流式检测T细胞表面GFP的表达来检测病毒感染效率。如图4所示，慢病毒的感染效率约为50％。其中，图4A为c-Met/PD-L1 CAR-T细胞的感染效率；图4B为c-Met CAR-T细胞的感染效率；图4C为PD-L1 CAR-T细胞的感染效率；图4D为Unrelated CAR-T细胞的感染效率；图4E为活化的T细胞。

实施例6：CAR-T细胞体外杀伤活性

分别将肝癌细胞c-Met和PD-L1高表达的HepG2、c-Met敲低的HepG2稳定株(HepG2^lo)植于96孔板，2×10⁴/孔，设3个复孔，待细胞贴壁后按效靶比为10：1，5:1和2:1分别加入CAR-T细胞。共培养18小时后，将96孔板1500rpm离心5分钟，收集上清，采用LDH释放法检测CAR-T细胞特异性杀伤作用，结果见图5。其中，图5A为各组CAR-T细胞或活化的T细胞对MHCC97肝癌细胞的杀伤效率；图5B为各组CAR-T细胞或活化的T细胞对HepG2肝癌细胞的杀伤效率；图5C为各组CAR-T细胞或活化的T细胞对HepG2^lo肝癌细胞的杀伤效率。结果表明，CP2CAR-T可以特异性杀伤HepG2和HepG2^lo细胞，且杀伤效果高于CAR1_c-Met-T细胞。而CD19CAR-T细胞对HepG2、HepG2^lo细胞均没有特异性杀伤作用。说明CP2 CAR-T细胞可以靶向c-Met/PD-L1双阳性肝癌细胞。

1.准备效应细胞(E)：取制备好的CAR-T细胞，1500rpm离心5min，弃上清，新鲜无双抗培养基(RPMI1604+10％FBS)重悬细胞并计数，调整细胞密度分别为1×10⁶个/ml、0.5×10⁶个/ml和0.2×10⁶个/ml；

2.制备靶细胞(T)：取对数生长期的肿瘤细胞，胰酶消化，800rpm离心5min，弃上清，新鲜无双抗培养基(RPMI1604+10％FBS)重悬细胞并计数，调整细胞密度分别为1×10⁵个/ml；

3.按如下表格分组，每组各设4个复孔；

4.第1-5组，靶细胞以100ul/孔接种至96孔板，第6-8组以100ul/孔加入无双抗培养基(RPMI1604+10％FBS)，第9-10组以200ul/孔加入无双抗培养基(RPMI1604+10％FBS)，将96孔板置于5％CO₂、37℃培养箱培养；

5.待细胞贴壁后，第1-3组和第6-8组按对应E：T加入100ul效应细胞，置于5％CO₂、37℃培养箱继续培养18h；

6. 96孔板250g离心2min；

7.从每孔中吸取100ul上清至新的96孔板；

8.每孔各加100ul working solution，避光室温孵育30min；

9.每孔加入50ul stop solution，立刻用酶标仪测定490nm的吸光度。

杀伤率计算：细胞毒性(％)＝[(1/2/3组OD值-10组OD值)-(6/7/8组OD值-10组OD值)-(5组OD值-10组OD值)]/[(4组OD值-9组OD值)-(5组OD值-10组OD值)]×100％。

实施例7：CAR-T细胞IFN-γ和IL-2分泌量测定

HepG2细胞以10⁵个/孔接种于24孔板，待细胞贴壁后以效靶比为10：1分别加入各组CAR-T细胞。共培养48小时后，收取共培养上清，采用ELISA法加测各组上清中IFN-γ、IL-2含量。结果分别见图6A～图6C和图7A～图7C。其中，图6A为各组CAR-T细胞或活化的T细胞与MHCC97肝癌细胞共培养后的IFN-γ细胞因子分泌水平；图6B为各组CAR-T细胞或活化的T细胞与HepG2肝癌细胞共培养后的IFN-γ细胞因子分泌水平；图6C为各组CAR-T细胞或活化的T细胞与HepG2肝癌细胞共培养后的IFN-γ细胞因子分泌水平；

图7A为各组CAR-T细胞或活化的T细胞与MHCC97肝癌细胞共培养后的IL-2细胞因子分泌水平；图7B为各组CAR-T细胞或活化的T细胞与HepG2肝癌细胞共培养后的IL-2细胞因子分泌水平；图7C为各组CAR-T细胞或活化的T细胞与HepG2肝癌细胞共培养后的IL-2细胞因子分泌水平；

结果表明，与c-Met、PD-L1高表达的HepG2细胞共培养后CP2CAR-T细胞能大量分泌IFN-γ、IL-2，且分泌量高于与c-Met敲低的HepG2稳定株共培养时的IFN-γ、IL-2分泌量。说明相对于c-Met单阳性细胞，CP2CAR-T细胞可以更好地被c-Met和PD-L1双阳性肿瘤细胞激活。

1.准备效应细胞(E)：取制备好的CAR-T细胞，1500rpm离心5min，弃上清，新鲜无双抗培养基(RPMI1604+10％FBS)重悬细胞并计数，调整细胞密度分别为1×10⁶个/ml；

2.制备靶细胞(T)：取对数生长期的肿瘤细胞，胰酶消化，800rpm离心5min，弃上清，新鲜无双抗培养基(RPMI1604+10％FBS)重悬细胞并计数，调整细胞密度分别为1×10⁵个/ml，将靶细胞按100ul/孔接种于96孔板中，设4个复孔，96孔板置于5％CO₂、37℃培养箱培养；

3.待细胞贴壁后,弃培养基，效应细胞以100ul/孔加入96孔板。置于5％CO₂、37℃培养箱继续培养24h；

4.收上清，5000rpm/min离心5min，取上清至EP管；

5.ELISA操作步骤：

1)1×coating buffer稀释capture antibody，100ul/孔加入96孔板，保鲜膜封口，4℃过夜；

2)wash buffer以250ul/孔加入96孔板，浸泡1min，弃上清并用吸水纸吸干上清，共漂洗3次；

3)DW稀释5×ELISA ELISPOT Diulent至1×，以200ul/孔加入96孔板，室温1h；

4)吸尽diulent，用wash buffer清洗至少1遍；

5)溶解冻干的标准品，轻轻摇晃充分溶解；

6)1×diulent稀释液稀释标准品，100ul加入第一个孔，倍比稀释加满8个孔；

7)待测样品以100ul/孔加入96孔板，做3个复孔。封闭板子室温孵育2h；

8)重复第2)步；

9)1×diulent溶解detection antibody,100ul/孔，孵育1h；

10)重复第2)步；

11)1×diulent溶解Avidin-HRP 100ul/孔加入96孔板，室温孵育30min；

12)重复第2)步，每次浸泡1-2min，洗5-7次；

13)1×TMB以100ul/孔加入96孔板，室温15min；

14)Stop solution以50ul/孔加入96孔板；

15)酶标仪450nm检测OD值。

综上所述，当c-Met、PD-L1两种抗原同时存在时，c-Met/PD-L1双特异性CAR-T细胞可被有效激活并发挥特异性肿瘤杀伤作用，而对于仅表达c-Met一种抗原的细胞，c-Met/PD-L1双特异性CAR-T细胞的激活效果和杀伤效果均下降。说明本发明设计的双特异性CAR-T细胞可在第一信号和第二信号同时存在的肿瘤环境中大量增殖并特异性杀伤肿瘤细胞，而对于表达第一信号的正常细胞只会出现轻度无伤，大大降低了CAR-T细胞的“脱靶效应”，提高了安全性。

说明书所涉及的核酸序列如下所示：

SEQ ID NO.1双特异型嵌合抗原受体氨基酸序列为：

MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSLLSASTGDRVTISCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPHTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDNWGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO.2双特异型嵌合抗原受体CD8α信号肽(CD8αSP)的氨基酸序列为：

MALPVTALLLPLALLLHAARP

SEQ ID NO.3双特异型嵌合抗原受体c-Met scFv Vk的氨基酸序列为：

DIQMTQSPSLLSASTGDRVTISCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPHTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO.4编码的双特异型嵌合抗原受体linker的氨基酸序列为：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO.5双特异型嵌合抗原受体中c-Met scFv Vh的氨基酸残基序列为：

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDNWGFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO.6双特异型嵌合抗原受体中PD-L1 scFv Vh的氨基酸序列为：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO.7双特异型嵌合抗原受体中PD-L1 scFv Vk的氨基酸残基序列为：

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL

SEQ ID NO.8双特异型嵌合抗原受体中CD8α跨膜区(CD8αHinge)的氨基酸序列为：FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS

SEQ ID NO.9编码的双特异型嵌合抗原受体编码CD137胞内信号区的氨基酸序列为：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

SEQ ID NO.10双特异型嵌合抗原受体中CD3ζ的氨基酸序列为：

RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO.11编码的双特异型嵌合抗原受体核苷酸序列为：

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTTACTCTCTGCATCTACAGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGTCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCTCACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAAGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATAACTGGGGATTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGAGGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACATCATGATGTGGGTGCGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCTCCATCTACCCCTCCGGCGGCATCACCTTCTACGCCGACACCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGATCAAGCTGGGCACCGTGACCACCGTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCGCAGTCCGCCCTGACCCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGCTCCCCTGGCCAGTCCATCACCATCAGCTGCACCGGCACCTCCAGCGACGTGGGCGGCTACAACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCACCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGATGATCTACGACGTGTCCAACCGGCCCTCCGGCGTGTCCAACAGATTCTCCGGCTCCAAGTCCGGCAACACCGCCTCCCTGACCATCAGCGGACTGCAGGCAGAGGACGAGGCCGACTACTACTGCTCCTCCTACACCTCCTCCAGCACCAGAGTGTTCGGCACCGGCACAAAAGTGACCGTGCTGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC

SEQ ID NO.12编码的双特异型嵌合抗原受体CD8α信号肽(CD8αSP)的核苷酸序列为：ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG

SEQ ID NO.13编码的双特异型嵌合抗原受体c-Met scFv Vk的核苷酸序列为：GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTTACTCTCTGCATCTACAGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGTCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCTCACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA

SEQ ID NO.14编码的双特异型嵌合抗原受体linker的核苷酸序列为：

GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCC

SEQ ID NO.15编码的双特异型嵌合抗原受体c-Met scFv Vh的核苷酸序列为：CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATAACTGGGGATTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCT

SEQ ID NO.16编码的双特异型嵌合抗原受体PD-L1 scFv Vh的核苷酸序列为：GAGGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACATCATGATGTGGGTGCGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCTCCATCTACCCCTCCGGCGGCATCACCTTCTACGCCGACACCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGATCAAGCTGGGCACCGTGACCACCGTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCC

SEQ ID NO.17编码的双特异型嵌合抗原受体PD-L1 scFv Vk的核苷酸序列为：

CAGTCCGCCCTGACCCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGCTCCCCTGGCCAGTCCATCACCATCAGCTGCACCGGCACCTCCAGCGACGTGGGCGGCTACAACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCACCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGATGATCTACGACGTGTCCAACCGGCCCTCCGGCGTGTCCAACAGATTCTCCGGCTCCAAGTCCGGCAACACCGCCTCCCTGACCATCAGCGGACTGCAGGCAGAGGACGAGGCCGACTACTACTGCTCCTCCTACACCTCCTCCAGCACCAGAGTGTTCGGCACCGGCACAAAAGTGACCGTGCTG

SEQ ID NO.18编码的双特异型嵌合抗原受体CD8跨膜区的核苷酸序列为：

TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC

SEQ ID NO.19编码的双特异型嵌合抗原受体CD137胞内信号区的核苷酸序列为：

AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG

SEQ ID NO.20编码的双特异型嵌合抗原受体CD3ζ胞内信号区的核苷酸序列为：

AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC

SEQUENCE LISTING

<110> 南京医科大学第二附属医院

<120> 一种靶向c-Met和PD-L1双特异性嵌合抗原受体及其应用

<130> 20200706

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Thr Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

50 55 60

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser

100 105 110

Tyr Ser Thr Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val

145 150 155 160

Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

165 170 175

Phe Ser Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

180 185 190

Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr

195 200 205

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

210 215 220

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

225 230 235 240

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

245 250 255

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu

275 280 285

Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu

290 295 300

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ile Met Met Trp

305 310 315 320

Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Tyr

325 330 335

Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe

340 345 350

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn

355 360 365

Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Lys

370 375 380

Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

385 390 395 400

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

405 410 415

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala

420 425 430

Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly

435 440 445

Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln

450 455 460

His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg

465 470 475 480

Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr

485 490 495

Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

500 505 510

Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly

515 520 525

Thr Lys Val Thr Val Leu Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val

530 535 540

Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

545 550 555 560

Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met

565 570 575

Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala

580 585 590

Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys

595 600 605

Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr

610 615 620

Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly

625 630 635 640

Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

645 650 655

Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

660 665 670

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

675 680 685

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

690 695 700

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

705 710 715 720

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

725 730 735

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

740 745 750

Leu Pro Pro Arg

755

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 3

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Thr Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro His

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 5

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 5

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asn Trp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 6

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 7

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 7

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 8

<211> 68

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 8

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

20 25 30

Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

35 40 45

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

50 55 60

Ala Tyr Arg Ser

65

<210> 9

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 9

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 10

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 10

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 11

<211> 2268

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggatatcc agatgaccca gtctccatcc ttactctctg catctacagg agacagagtc 120

accatcagtt gtcgggcaag tcagagcatt agcagctatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagggaaag cccctaagct cctgatctat gctgcatcca gtttgcaaag tggggtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa 300

cctgaagatt ttgcaactta ctactgtcaa cagagttaca gtacccctca cacttttggc 360

caggggacca agctggagat caaaggtggt ggtggttctg gtggtggtgg ttctggcggc 420

ggcggctccg gtggtggtgg atcccaggtg cagctggtgg agtctggggg aggcgtggtc 480

cagcctggga ggtccctgag actctcctgt gcagcctctg gattcacctt cagtagctat 540

gctatgcact gggtccgcca ggctccaggc aaggggctgg agtgggtggc agttatatgg 600

tatgatggaa gtaataaata ctatgcagac tccgtgaagg gccgattcac catctccaga 660

gacaattcca agaacacgct gtatctgcaa atgaacagcc tgagagccga ggacacggct 720

gtgtattact gtgcgagaga taactgggga tttgactact ggggccaggg caccctggtc 780

accgtctcct ctggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt 840

ggtggtggat ccgaggtgca gctgctggaa tccggcggag gactggtgca gcctggcggc 900

tccctgagac tgtcttgcgc cgcctccggc ttcaccttct ccagctacat catgatgtgg 960

gtgcgacagg cccctggcaa gggcctggaa tgggtgtcct ccatctaccc ctccggcggc 1020

atcaccttct acgccgacac cgtgaagggc cggttcacca tctcccggga caactccaag 1080

aacaccctgt acctgcagat gaactccctg cgggccgagg acaccgccgt gtactactgc 1140

gcccggatca agctgggcac cgtgaccacc gtggactact ggggccaggg caccctggtg 1200

acagtgtcct ccggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt 1260

ggtggtggtt cgcagtccgc cctgacccag cctgcctccg tgtctggctc ccctggccag 1320

tccatcacca tcagctgcac cggcacctcc agcgacgtgg gcggctacaa ctacgtgtcc 1380

tggtatcagc agcaccccgg caaggccccc aagctgatga tctacgacgt gtccaaccgg 1440

ccctccggcg tgtccaacag attctccggc tccaagtccg gcaacaccgc ctccctgacc 1500

atcagcggac tgcaggcaga ggacgaggcc gactactact gctcctccta cacctcctcc 1560

agcaccagag tgttcggcac cggcacaaaa gtgaccgtgc tgttttgggt gctggtggtg 1620

gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg ctagtaacag tggcctttat tattttctgg 1680

gtgaggagta agaggagcag gctcctgcac agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc 1740

cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat 1800

cgctccaaac ggggcagaaa gaaactcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca 1860

gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt agctgccgat ttccagaaga agaagaagga 1920

ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc 1980

cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 2040

aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 2100

ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 2160

aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 2220

accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgc 2268

<210> 12

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 13

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

gatatccaga tgacccagtc tccatcctta ctctctgcat ctacaggaga cagagtcacc 60

atcagttgtc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctcacac ttttggccag 300

gggaccaagc tggagatcaa a 321

<210> 14

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc 60

<210> 15

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagataac 300

tggggatttg actactgggg ccagggcacc ctggtcaccg tctcctct 348

<210> 16

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

gaggtgcagc tgctggaatc cggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 60

tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agctacatca tgatgtgggt gcgacaggcc 120

cctggcaagg gcctggaatg ggtgtcctcc atctacccct ccggcggcat caccttctac 180

gccgacaccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggatcaag 300

ctgggcaccg tgaccaccgt ggactactgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 360

<210> 17

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

cagtccgccc tgacccagcc tgcctccgtg tctggctccc ctggccagtc catcaccatc 60

agctgcaccg gcacctccag cgacgtgggc ggctacaact acgtgtcctg gtatcagcag 120

caccccggca aggcccccaa gctgatgatc tacgacgtgt ccaaccggcc ctccggcgtg 180

tccaacagat tctccggctc caagtccggc aacaccgcct ccctgaccat cagcggactg 240

caggcagagg acgaggccga ctactactgc tcctcctaca cctcctccag caccagagtg 300

ttcggcaccg gcacaaaagt gaccgtgctg 330

<210> 18

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 120

aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 180

cgcgacttcg cagcctatcg ctcc 204

<210> 19

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 20

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

Claims

1.一种靶向c-Met和PD-L1的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为CD8αSP—c-Met Vk—c-Met Vh—PD-L1 Vh—PD-L1 Vk—CD8αHinge—CD137—CD3ζ，所述的CD8αSP—c-Met Vk—c-Met Vh—PD-L1 Vh—PD-L1 Vk—CD8αHinge—CD137—CD3ζ的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，编码所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示。

3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体通过将编码其的核苷酸序列转染到T细胞中表达。

4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述转染的方式为通过病毒载体、真核表达质粒或mRNA序列中的任意一种或至少两种的组合转染到T细胞。

5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述病毒载体为质粒载体和/或慢病毒载体和/或逆转录病毒载体和/或腺病毒载体。

6.一种重组慢病毒，其特征在于，包括如权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体的病毒载体与包装辅助质粒pSPAX2和pMD2G共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。

7.根据权利要求6所述的重组慢病毒，其特征在于，所述哺乳细胞为293细胞。

8.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体和/或如权利要求6或7任一项所述的重组慢病毒。

9.权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求6或7所述的重组慢病毒或如权利要求8所述的组合物在制备嵌合抗原受体T细胞中的应用。

10.权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求6或7所述的重组慢病毒或如权利要求8所述的组合物在制备肿瘤疾病治疗药物中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述肿瘤疾病为胃癌、肺癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌或卵巢癌。