KR102512934B1 - Bcma를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 및 이들의 이용 방법 - Google Patents

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Abstract

BCMA를 표적으로 하는 단일-도메인 항체, 그리고 하나 또는 그 이상의 항-BCMA 단일-도메인 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체 (가령, 일가 CAR, 그리고 이중-에피토프 CAR를 비롯한 다가 CAR)이 제공된다. 이들 키메라 항원 수용체를 포함하는 가공된 면역 작동체 세포 (가령, T 세포)가 더욱 제공된다. 암을 치료하는 제약학적 조성물, 키트 및 방법 역시 제공된다.

Description

BCMA를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 및 이들의 이용 방법
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2016년 8월 10일자 제출된 국제 특허 출원 번호 PCT/CN2016/094408에 우선권을 주장하고, 이것의 내용은 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다.
ASCII 텍스트 파일 형태에서 서열 목록의 제출
ASCII 텍스트 파일 형태에서 제출된 다음의 내용물은 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다: 서열 목록 (파일 명칭: 761422000640SEQLISTING.txt, 기록된 일자: 2017년 8월 10일, 크기: 520 KB)의 컴퓨터 판독가능한 형태 (CRF).
본 출원의 분야
본 발명은 BCMA를 표적으로 하는 단일-도메인 항체, 키메라 항원 수용체 및 가공된 면역 작동체, 그리고 이들의 이용 방법에 관계한다.
본 출원의 배경
종양 면역요법 및 임상적 기술의 발달로, 키메라 항원 수용체 T 세포 (CAR-T) 면역요법은 현재, 가장 유망한 종양 면역요법 접근법 중에서 한 가지이다. 일반적으로, 키메라 항원 수용체 (CAR)는 세포외 항원 결합 도메인, 막경유 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 세포외 항원 결합 도메인은 확인된 종양 항원을 표적으로 하는 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 포함할 수 있다. CARs는 유전자 형질감염 기술을 이용하여 T 세포의 표면 상에서 발현될 수 있다. 표적 종양 항원에 결합 시에, CARs는 표적 종양 항원에 특정한 주요 조직적합성 복합체 (MHC)의 이용가능성에 의해 제한됨 없이, 특정한 항종양 반응을 항원-의존성 방식으로 착수하도록 T 세포를 활성화시킬 수 있다.
단일-도메인 항체 (sdAbs)는 단일 단위체성 항체 가변 도메인을 가짐으로써 전통적인 4-사슬 항체와 상이하다. 가령, 낙타 및 상어는 경쇄를 자연적으로 결여하는, 중쇄-단독 항체 (HcAbs)로 명명된 sdAbs를 생산한다. 낙타 중쇄 단독 항체의 각 팔에서 항원 결합 단편은 단일 중쇄 가변 도메인 (VHH)을 갖는데, 이것은 경쇄의 보조 없이 항원에 대한 높은 친화성을 가질 수 있다. 낙타 VHH는 거의 15 kD의 분자량을 갖는 가장 작은 기능적 항원-결합 단편으로서 알려져 있다.
다발성 골수종 (MM)은 불치의 공격적인 혈장 악성인데, 이것은 B-세포 신생물로서 분류되고 골수에서 통제할 수 없는 방법으로 증식하고, 혈액 세포의 정상적인 물질대사 생산을 간섭하고, 고통스러운 뼈 병변을 유발한다 (Garfall, A.L. et al., Discovery Med. 2014, 17, 37). 다발성 골수종은 고칼슘혈증, 신장 부전증, 빈혈, 뼈 병변, 세균 감염, 과다점도 및 아밀로이드증이 임상적으로 나타날 수 있다 (Robert Z. Orlowski, Cancer Cell. 2013, 24(3)). 조사 및 통계에 따르면, 거의 86,000명 환자가 매년 골수종으로 진단될 것이고, 그리고 약 63,000명 환자가 상기 질환-관련된 합병증으로 매년 사망한다 (Becker, 2011). 노화 인구 때문에, 골수종의 사례의 숫자는 해마다 증가할 것으로 예측된다. 많은 암과 유사하게, 다발성 골수종의 공지된 원인이 없고, 그리고 치료법도 없다. 다발성 골수종에 대한 일부 치료법은 다른 암에 대한 치료법, 예를 들면, 화학요법 또는 방사선 요법, 줄기 세포 이식 또는 골수 이식, 표적화된 요법 또는 생물학적 요법과 유사하다 (George, 2014). 항체-기초된 세포 면역요법은 혈액학적 악성, 특히 B 세포 비호지킨 림프종을 앓는 환자에 대한 실제적인 임상적 유익성을 증명하였다. 비록 다발성 골수종에 대한 현재 요법이 관해를 종종 야기하긴 하지만, 거의 모든 환자가 궁극적으로 재발한다. 다발성 골수종을 치료하기 위한 효과적인 면역치료적 작용제가 요구된다.
본 발명에서 개시된 LCAR-B38M은 임상 시험에서 난치성 또는 재발성 다발성 골수종 환자를 치료하는데 있어서 안전성 및 효력 둘 모두의 면에서 이미 입증된 임상적 이점을 갖는 이가 BCMA 표적화 CAR-T이다. 초기 임상 시험에서, 35명의 환자 중에서 33명 (94%)이 LCAR-B38M CAR-T 세포를 제공받을 시에 다발성 골수종의 임상적 관해를 가졌다. 대부분의 환자는 단지 경미한 부작용만을 가졌다. 상기 연구는 2017 ASCO 연례 회의 (Abstract LBA3001) 및 광범위한 범위의 언론 매체가 모인 언론 브리핑 (http://www.ascopost.com/News/55713) 둘 모두에서 주요 발명자에 의해 발표되었다.
전반적으로, 객관적 반응률은 100%이었고, 그리고 33명의 환자 (94%)는 CAR T 세포를 제공받은 지 2 개월 이내에 골수종의 분명한 임상적 관해 (완전한 반응, 매우 우수한 부분적인 반응, 또는 부분적인 반응)를 보였다. 4 개월 이상의 기간 동안 상기 군을 추적한 후, 19명 환자 중에서 14명은 엄격한 완전한 반응 기준에 도달하였고, 1명 환자는 부분적인 반응에 도달하였고, 그리고 4명 환자는 효력에서 매우 우수한 부분적인 관해 기준을 달성하였다.
LCAR-B38M 임상 시험으로부터 획득된 탁월한 효력 및 안전성 프로필이 ASCO에서 동일한 시점에서 보고된 몇몇 다른 BCMA CAR-T 시험보다 훨씬 우수하기 때문에, 이들 작업은 면역요법 분야에서 "혁신적인 돌파구"로서 폭넓게 인식되었다. 이들 모든 BCMA CAR 설계가 BCMA 항원 결합 도메인이 일가 ScFv 항체로 구성되는 전통적인 CAR이라는 것은 주목할 만하다.
본원에서 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 공개된 특허 출원의 개시는 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다.
본 출원의 짧은 요약
본 출원은 항-BCMA 단일-도메인 항체 (sdAb), 하나 또는 그 이상의 항-BCMA sdAbs (가령, VHH 단편)을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CARs), 가공된 면역 작동체 세포, 그리고 암 면역요법에서 이들의 이용 방법을 제공한다.
본 출원의 한 가지 양상은 서열 번호: 115-152 중에서 한 가지의 CDR 영역을 포함하는 항-BCMA sdAb를 제공한다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 다음 중에서 한 가지를 포함한다: (1) 서열 번호:1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (2) 서열 번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (3) 서열 번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (4) 서열 번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:80의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (5) 서열 번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:81의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (6) 서열 번호:6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:82의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (7) 서열 번호:7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:83의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (8) 서열 번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:84의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (9) 서열 번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:85의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (10) 서열 번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:86의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (11) 서열 번호:11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:87의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (12) 서열 번호:12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:88의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (13) 서열 번호:13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (14) 서열 번호:14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:90의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (15) 서열 번호:15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:91의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (16) 서열 번호:16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:92의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (17) 서열 번호:17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (18) 서열 번호:18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:94의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (19) 서열 번호:19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:57의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:95의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (20) 서열 번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:96의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (21) 서열 번호:21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:97의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (22) 서열 번호:22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:98의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (23) 서열 번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:99의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (24) 서열 번호:24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (25) 서열 번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:101의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (26) 서열 번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:102의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (27) 서열 번호:27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (28) 서열 번호:28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:66의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:104의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (29) 서열 번호:29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:105의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (30) 서열 번호:30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:106의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (31) 서열 번호:31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:69의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:107의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (32) 서열 번호:32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:70의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:108의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (33) 서열 번호:33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:71의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:109의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (34) 서열 번호:34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:110의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (35) 서열 번호:35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (36) 서열 번호:36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:112의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (37) 서열 번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:75의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 (38) 서열 번호:38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:76의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 115-152로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VHH 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 앞서 설명된 항-BCMA sdAbs 중에서 한 가지를 포함하는 항-BCMA 중쇄 단독 항체 (HCAB) 또는 항원 결합 단백질이 제공된다. 앞서 설명된 항-BCMA sdAbs 중에서 한 가지가 특이적으로 결합하는 BCMA 에피토프, 그리고 앞서 설명된 항-BCMA sdAbs 중에서 한 가지와 경쟁하는 항-BCMA 항체 (가령, 항-BCMA sdAbs) 역시 제공된다.
앞서 설명된 항-BCMA sdAbs 중에서 한 가지에 따른 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 낙타 항체이다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 키메라 항체이다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 인간화이다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 VHH 단편이다.
본 출원의 한 가지 양상은 (a) 항-BCMA sdAb (가령, 앞서 설명된 항-BCMA sdAbs 중에서 한 가지)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 BCMA 키메라 항원 수용체를 제공한다. 일부 구체예에서, CAR은 단일특이적이다. 일부 구체예에서, CAR은 일가이다. 일부 구체예에서, CAR은 다가 (가령, 이가 또는 삼가)이다. 일부 구체예에서, CAR은 다중특이적 (가령, 이중특이적)이다. 일부 구체예에서, 세포외 항원 결합 도메인은 최소한 2개의 항-BCMA sdAbs (가령, 앞서 설명된 항-BCMA sdAbs 중에서 한 가지 또는 그 이상)를 포함한다.
본 출원의 한 가지 양상은 (a) 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 및 두 번째 BCMA 결합 모이어티를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 다가 키메라 항원 수용체 (CAR)를 제공한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 및 두 번째 BCMA 결합 모이어티 중에서 하나 또는 그 이상은 항-BCMA sdAb이다. 일부 구체예에서, 첫 번째 BCMA 결합 모이어티는 첫 번째 항-BCMA sdAb이고, 그리고 두 번째 BCMA 결합 모이어티는 두 번째 항-BCMA sdAb이다. 일부 구체예에서, 첫 번째 BCMA 결합 모이어티는 항-BCMA sdAb이고, 그리고 두 번째 BCMA 결합 모이어티는 인간 항체로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 첫 번째 BCMA 결합 모이어티는 항-BCMA sdAb이고, 그리고 두 번째 BCMA 결합 모이어티는 BCMA의 폴리펩티드 리간드이다. 일부 구체예에서, 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 및 두 번째 BCMA 결합 모이어티는 BCMA 상에서 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 및 두 번째 BCMA 결합 모이어티는 BCMA 상에서 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 및/또는 두 번째 BCMA 결합 모이어티는 서열 번호: 388-394에서 선택되는 아미노산 서열로부터 유래된 BCMA 상에서 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 BCMA 결합 모이어티는 서열 번호: 389 및/또는 390으로부터 유래된 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 두 번째 BCMA 결합 모이어티는 서열 번호: 391 및/또는 392로부터 유래된 에피토프에 특이적으로 결합한다.
본 출원의 한 가지 양상은 (a) 첫 번째 항-BCMA sdAb (가령, 앞서 설명된 항-BCMA sdAbs 중에서 한 가지) 및 두 번째 항-BCMA sdAb (가령, 앞서 설명된 항-BCMA sdAbs 중에서 한 가지)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 다가 (가령, 이가 또는 삼가) 키메라 항원 수용체를 제공한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 항-BCMA sdAb 및 두 번째 항-BCMA sdAb는 BCMA 상에서 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 항-BCMA sdAb 및 두 번째 항-BCMA sdAb는 BCMA 상에서 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 항-BCMA sdAb 및/또는 두 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 388-394에서 선택되는 아미노산 서열로부터 유래된 BCMA 상에서 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 389 및/또는 390으로부터 유래된 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 두 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 391 및/또는 392로부터 유래된 에피토프에 특이적으로 결합한다.
앞서 제공된 다가 CARs 중에서 한 가지에 따른 일부 구체예에서, 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 첫 번째 항-BCMA sdAb)는 두 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 두 번째 항-BCMA sdAb)의 N 말단에서 위치된다. 일부 구체예에서, 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 첫 번째 항-BCMA sdAb)는 두 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 두 번째 항-BCMA sdAb)의 C 말단에서 위치된다. 일부 구체예에서, 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 첫 번째 항-BCMA sdAb) 및 두 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 두 번째 항-BCMA sdAb)는 펩티드 결합을 통해 서로에 직접적으로 융합된다. 일부 구체예에서, 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 첫 번째 항-BCMA sdAb) 및 두 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 두 번째 항-BCMA sdAb)는 펩티드 링커를 통해 서로에 융합된다. 일부 구체예에서, 펩티드 링커는 약 50개 이내 (가령, 약 35, 25, 20, 15, 10, 또는 5개 이내)의 아미노산 길이이다. 일부 구체예에서, 펩티드 링커는 서열 번호: 208-215에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
앞서 설명된 CARs (다가 CARs 포함) 중에서 한 가지에 따른 일부 구체예에서, 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택되는 분자로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 막경유 도메인은 CD8α 또는 CD28로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 막경유 도메인은 서열 번호: 193 또는 194의 아미노산 서열을 포함한다.
앞서 설명된 CARs (다가 CARs 포함) 중에서 한 가지에 따른 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포 (가령, T 세포)의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 일차 세포내 신호전달 도메인은 서열 번호: 197 또는 198의 아미노산 서열을 포함한다.
앞서 설명된 CARs (다가 CARs 포함) 중에서 한 가지에 따른 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 동시자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 동시자극성 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 동시자극성 분자로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 동시자극성 신호전달 도메인은 CD28의 세포질 도메인 및/또는 CD137의 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 동시자극성 신호전달 도메인은 서열 번호: 서열 번호: 195 및/또는 서열 번호: 196의 아미노산 서열을 포함한다.
앞서 설명된 CARs (다가 CARs 포함) 중에서 한 가지에 따른 일부 구체예에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 C 말단 및 막경유 도메인의 N 말단 사이에 위치된 힌지 도메인을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 힌지 도메인은 서열 번호: 192의 아미노산 서열을 포함한다.
앞서 설명된 CARs (다가 CARs 포함) 중에서 한 가지에 따른 일부 구체예에서, CAR은 폴리펩티드의 N 말단에서 위치된 신호 펩티드를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 신호 펩티드는 CD8α, GM-CSF 수용체 α 및 IgG1 중쇄로 구성된 군에서 선택되는 분자로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 신호 펩티드는 CD8α로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 신호 펩티드는 서열 번호: 191의 아미노산 서열을 포함한다.
본 출원의 한 가지 양상은 표 4와 5에서 열거된 바와 같은 CAR을 제공한다. 일부 구체예에서, CAR은 서열 번호: 216-256 및 298-335로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 출원의 한 가지 양상은 서열 번호: 115-152, 216-256 및 298-335로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
본 출원의 한 가지 양상은 앞서 설명된 항-BCMA sdAbs 또는 CARs (다가 CARs 포함) 중에서 한 가지를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 구체예에서, 핵산 서열은 서열 번호: 153-190, 257-297 및 336-373으로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 단리된 핵산은 첫 번째 CAR을 인코딩하는 첫 번째 핵산 서열을 더욱 포함하고, 여기서 두 번째 CAR을 인코딩하는 두 번째 핵산 서열은 자가-개열 펩티드, 예를 들면, T2A, P2A 또는 F2A 펩티드를 인코딩하는 세 번째 핵산 서열을 통해 첫 번째 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 여기서 세 번째 핵산 서열은 서열 번호: 385이다. 일부 구체예에서, 단리된 핵산은 DNA 분자이다. 일부 구체예에서, 단리된 핵산은 RNA 분자이다.
본 출원의 한 가지 양상은 앞서 설명된 단리된 핵산 중에서 한 가지를 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 구체예에서, 벡터는 발현 벡터이다. 일부 구체예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 구체예에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 구체예에서, 벡터는 비바이러스 벡터이다.
본 출원의 한 가지 양상은 앞서 제공된 CARs (다가 CARs 포함) 중에서 한 가지, 또는 앞서 설명된 단리된 핵산 중에서 한 가지, 또는 앞서 설명된 벡터 중에서 한 가지를 포함하는 가공된 면역 작동체 세포를 제공한다. 일부 구체예에서, 면역 작동체 세포는 T 세포, NK 세포, 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 조혈 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 또는 배아 줄기 세포이다. 일부 구체예에서, 면역 작동체 세포는 T 세포이다.
본 출원의 한 가지 양상은 앞서 설명된 가공된 면역 작동체 세포 중에서 한 가지 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다. 개체에서 암을 치료하는 방법이 더욱 제공되고, 상기 방법은 앞서 설명된 제약학적 조성물 중에서 한 가지의 효과량을 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 가공된 면역 작동체 세포는 자가이다. 일부 구체예에서, 가공된 면역 작동체 세포는 동종이계이다. 일부 구체예에서, 암은 액상암이다. 일부 구체예에서, 암은 다발성 골수종, 급성 림프모구성 백혈병, 또는 만성 림프성 백혈병이다. 일부 구체예에서, 암은 고형암, 예를 들면, 교모세포종이다. 일부 구체예에서, 암은 난치성 또는 재발성 다발성 골수종이다.
본 출원의 한 가지 양상은 앞서 설명된 항-BCMA sdAbs 중에서 한 가지 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 개체에서 질환 (가령, 암)을 치료하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 제약학적 조성물의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
앞서 설명된 항-BCMA sdAbs, CARs (다가 CARs 포함), 가공된 면역 작동체 세포, 단리된 핵산, 또는 벡터 중에서 한 가지를 포함하는 이용 방법, 키트 및 제조 물품 역시 제공된다.
도면의 간단한 설명
도면 1a-1b는 RPMI8226.Luc 세포 (도면 1a), 또는 U87MG.Luc 세포 (도면 1b)에 대한 다양한 항-BCMA sdAbs를 포함하는 예시적인 단일특이적 CARs를 발현하는 T 세포의 시험관내 세포독성 검정의 결과를 보여준다.
도면 2a-2c는 RPMI8226.Luc 세포 (도면 2a), K562.BCMA.Luc 세포 (도면 2b), 또는 K562.CD19.Luc 세포 (도면 2c)에 대한 다양한 항-BCMA sdAbs를 포함하는 예시적인 단일특이적 CARs를 발현하는 T 세포의 시험관내 세포독성 검정의 결과를 보여준다.
도면 3은 K562.BCMA.Luc 세포에 대한 다양한 항-BCMA sdAbs를 포함하는 예시적인 단일특이적 CARs를 발현하는 T 세포의 시험관내 IFNγ 방출 검정의 결과를 보여준다.
도면 4a-4c는 RPMI8226.Luc 세포 (도면 4a-4b), 또는 U87MG.Luc 세포 (도면 4c)에 대한 예시적인 다가 BCMA CARs를 발현하는 T 세포의 시험관내 세포독성 검정의 결과를 보여준다.
도면 5a-5e는 RPMI8226.Luc 세포 (도면 5a), K562.CD19.Luc 세포 (도면 5b), A549.Luc 세포 (도면 5c), U87MG.Luc 세포 (도면 5d), 또는 Raji.Luc 세포 (도면 5e)에 대한 예시적인 이가 BCMA CARs를 발현하는 T 세포의 시험관내 세포독성 검정의 결과를 보여준다.
도면 5f는 K562.BCMA.Luc 세포 및 K562.CD38.Luc 세포에 대한 예시적인 이가 BCMA CARs를 발현하는 T 세포의 시험관내 세포독성 검정의 결과를 보여준다.
도면 6a는 2개의 상이한 작동체 세포에서 K562.BCMA.Luc 세포에 대한 예시적인 이가 BCMA CARs를 표적 세포 비율로 발현하는 T 세포의 시험관내 IFNγ 방출 검정의 결과를 보여준다.
도면 6b는 RPMI8226.Luc, A549.Luc, K562.CD38.Luc 및 Raji.Luc 세포에 대한 예시적인 이가 BCMA CARs를 발현하는 T 세포의 시험관내 IFNγ 방출 검정의 결과를 보여준다.
도면 7a-7c는 K562.BCMA.Luc 세포 및 K562.CD38.Luc 세포 (음성 대조)에 3개의 예시적인 VHH 단편의 결합을 보여준다.
도면 8a는 BCMA의 세포외 도메인의 결정 구조를 보여준다. 도면 8b는 BCMA 에피토프 펩티드를 보여준다.
도면 9a-9b는 VHH1 및 VHH2의 에피토프 지도화 검정의 결과를 보여준다.
도면 10은 CHO-BCMA 세포를 이용한 경쟁적 결합 검정의 결과를 보여준다.
도면 11은 RPMI8226.Luc 세포에 대한 LCAR-B38M을 발현하는 공여자-유래된 T 세포의 시험관내 세포독성을 보여준다.
도면 12a는 RPMI8226.Luc 세포에 대한 선별된 공여자로부터 준비된 LCAR-B38M CAR-T 세포의 시험관내 세포독성을 보여준다. 도면 12b-12e는 종양 이종이식 생쥐 모형에서 LCAR-B38M CAR-T 세포의 생체내 항종양 활성을 보여준다. 도면 12b는 LCAR-B38M CAR-T 처리된 생쥐 및 형질도입되지 않은 T 세포 (UnT) 처리된 생쥐에서 생물발광 영상 데이터를 보여준다. 도면 12c는 CAR-T 군 및 UnT 군에서 생쥐의 연구 설계 및 생물발광 이미지를 보여준다. 도면 12d는 UnT-처리된 생쥐로부터 간의 이미지를 보여준다. 도면 12e는 UnT-처리된 생쥐의 간에서 종양을 검증하는 탈체 루시페라아제 검정을 보여준다.
도면 13a-13f는 LCAR-B38M CAR-T 세포로 처리된 2마리 원숭이의 임상적 파라미터를 보여준다. 연구 동안 모니터링된 임상적 파라미터는 체온 (도면 13a), 체중 (도면 13b), 전체 혈구 계산 (CBC, 도면 13c와 13d)뿐만 아니라 혈청 화학 및 사이토킨 수준 (도면 13e와 13f)을 포함한다.
도면 14a-c는 동일한 3명의 다발성 골수종 환자 각각으로부터 준비된 LCAR-B38M CAR-T 세포 및 LCAR-B27S CAR-T 세포에 관한 시험관내 세포독성 검정을 보여준다. 도면 14a는 다발성 골수종 환자 A로부터 준비된 LCAR-B38M CAR-T 세포 및 LCAR-B27S CAR-T 세포의 시험관내 세포독성 결과를 보여준다. 도면 14b는 다발성 골수종 환자 B로부터 준비된 LCAR-B38M CAR-T 세포 및 LCAR-B27S CAR-T 세포의 시험관내 세포독성 결과를 보여준다. 도면 14c는 다발성 골수종 환자 C로부터 준비된 LCAR-B38M CAR-T 세포 및 LCAR-B27S CAR-T 세포의 시험관내 세포독성 결과를 보여준다.
도면 15a는 VHH-기초된 CAR 및 전통적인 scFv-기초된 CAR의 구조를 비교한다. 왼쪽에 계통도 구조는 VHH 도메인을 포함하는 세포외 항원 결합 도메인을 갖는 예시적인 단일특이적 일가 CAR을 보여준다. 오른쪽에 계통도 구조는 scFv 도메인을 포함하는 세포외 항원 결합 도메인을 갖는 예시적인 단일특이적 일가 CAR을 보여준다.
도면 15b는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 VHH-기초된 CAR 및 2개의 항원 결합 부위를 갖는 전통적인 scFv-기초된 CAR의 구조를 비교한다. 왼쪽에 계통도 구조는 2개의 VHH 도메인을 포함하는 세포외 항원 결합 도메인을 갖는 예시적인 CAR이다. 2개의 VHH 도메인은 동일하거나 상이할 수 있다. 오른쪽에 계통도 구조는 2개의 scFv 도메인을 포함하는 세포외 항원 결합 도메인을 갖는 예시적인 CAR을 보여준다. 2개의 scFv 도메인은 동일하거나 상이할 수 있다.
도면 15c는 예시적인 이가 및 이중특이적 VHH-기초된 CARs의 계통도 구조를 보여준다. 왼쪽 위 패널에서 계통도 구조는 2개의 동일한 VHH 도메인을 포함하는 세포외 항원 결합 도메인을 갖는 예시적인 단일-에피토프, 이가 CAR을 보여주는데, 이들은 각각, 항원 A의 에피토프 1에 특이적으로 결합한다. 오른쪽 위 패널에서 계통도 구조는 항원 A의 에피토프 1에 특이적으로 결합하는 첫 번째 VHH 도메인 및 항원 A의 에피토프 2에 특이적으로 결합하는 두 번째 VHH 도메인을 포함하는 세포외 항원 결합 도메인을 갖는 예시적인 이중-에피토프, 이가 CAR을 보여준다. 항원 A의 에피토프 1 및 에피토프 2는 그들의 구조 및/또는 서열에서 상이할 수 있다. 왼쪽 아래 패널에서 계통도 구조는 항원 A에 특이적으로 결합하는 첫 번째 VHH 도메인 및 항원 B에 특이적으로 결합하는 두 번째 VHH 도메인을 포함하는 세포외 항원 결합 도메인을 갖는 예시적인 이중특이적 CAR을 보여준다. 항원 A 및 항원 B는 상이한 항원이다.
도면 15d는 3개 또는 그 이상의 VHH 도메인을 갖는 예시적인 VHH-기초된 CARs의 계통도 구조를 보여준다. 이들 CARs는 직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해 서로 융합된 복수의 VHH 도메인을 가질 수 있다. 이들 VHH 도메인은 동일하거나 상이할 수 있다. 상이한 VHH 도메인은 동일한 항원 상에서 상이한 에피토프에 또는 상이한 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
도면 15e는 2개의 상이한 VHH-기초된 CARs를 공동발현하는 예시적인 가공된 면역 작동체 세포를 보여준다. 왼쪽 패널에서 예시적인 가공된 면역 작동체 세포는 2개의 상이한 단일특이적, 일가 CARs를 공동발현한다. 중앙 패널에서 예시적인 가공된 면역 작동체 세포는 단일특이적, 일가 CAR 및 이중특이적 또는 이가 CAR을 공동발현한다. 오른쪽 패널에서 예시적인 가공된 면역 작동체 세포는 2개의 상이한 이중특이적 또는 이가 CARs를 공동발현한다. 이들 CARs는 상이한 항원을 인식할 수 있다.
본 출원의 상세한 설명
본 출원은 항-BCMA 단일-도메인 항체 (sdAb), 그리고 하나 또는 그 이상의 BCMA 결합 모이어티 (가령, 항-BCMA sdAbs)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CARs)를 제공한다. 단일 항원에 특이적으로 결합하는 최소한 2개의 결합 모이어티 (가령, sdAbs)를 포함하는 다가 CARs 역시 제공된다. 일부 구체예에서, 본 출원은 최소한 2개의 항-BCMA sdAbs를 포함하는 다가 (가령, 이가 또는 삼가) CARs를 제공한다. 일부 구체예에서, 최소한 2개의 항-BCMA sdAbs는 BCMA 상에서 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 상이한 항-BCMA sdAbs이다. 본 출원에서 설명된 항-BCMA sdAbs, CARs 및 CARs를 발현하는 가공된 면역 세포는 암 치료에 유용한 작용제이다.
특히, 본 출원은 인간 환자 사이에서 다발성 골수종을 치료하는데 있어서, 상이한 BCMA 에피토프 (가령, LCAR-B38M)를 표적으로 하는 2개의 항-BCMA sdAbs를 포함하는 이가 이중-에피토프 CARs의 우수한 효력을 증명하였다. I/II 단계 임상 시험의 중간 분석에서, 재발성 또는 난치성 다발성 골수종을 앓는 환자 100%가 LCAR-B38M CAR-T 치료에 반응하였다. 이들 환자 중에서 94%는 CAR-T 치료를 제공받고 2 개월 이내에 골수종의 분명한 임상적 관해를 가졌다. 엄격한 완전한 반응 (sCR) 기준에 도달한 환자는 CAR-T 치료를 제공받은 후 1년 이상 최소 잔존 질환이 없는 상태로 남아있었다. 추가적으로, LCAR-B38M CAR-T 치료는 환자에 의해 충분히 용인되었는데, 그 이유는 대부분의 환자가 CAR-T 세포-기초된 요법의 통상적인 부작용인 경미하고 관리가능한 사이토킨 방출 증후군만을 경험하였기 때문이다. 어떤 환자도 신경학적 부작용을 경험하지 않았다. 대조적으로, 단일 항-BCMA sdAb를 포함하는 일가 CAR의 예비 임상 연구는 치료된 환자 사이에서 더욱 낮은 객관적 반응률과 완전 관해 비율, 그리고 더욱 높은 재발률을 보여주었다. 본 출원에 앞서, 임상 연구 중인 모든 BCMA CARs는 세포외 항원 결합 도메인에서 단지 하나의 BCMA 결합 모이어티만을 가졌다. 본 출원의 다가 BCMA CARs의 향상된 임상 효능과 안전성은 예상치 못한 것이다.
따라서, 본 출원의 한 가지 양상은 (a) BCMA에 특이적으로 결합하는 복수의 단일-도메인 항체 (sdAb)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 다가 CAR을 제공한다.
다른 양상에서, (a) BCMA의 첫 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 첫 번째 항-BCMA sdAb) 및 BCMA의 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 두 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 두 번째 항-BCMA sdAb)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 다가 CAR이 제공되는데, 여기서 첫 번째 에피토프는 두 번째 에피토프와 상이하다.
신규한 항-BCMA sdAbs 및 본원에서 설명된 항-BCMA sdAbs 중에서 한 가지 또는 그 이상을 포함하는 CARs가 더욱 제공된다.
이들 CARs를 포함하는 가공된 면역 작동체 세포 (가령, T 세포), 제약학적 조성물, 키트, 제조 물품, 그리고 이들 가공된 면역 작동체 세포 또는 sdAbs를 이용하여 암을 치료하는 방법 역시 본원에서 설명된다.
I. 정의
용어 "항체"는 단일클론 항체 (면역글로불린 Fc 영역을 갖는 전장 4-사슬 항체 또는 전장 중쇄 단독 항체 포함), 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 다중특이적 항체 (가령, 이중특이적 항체, 디아바디 및 단일 사슬 분자)뿐만 아니라 항체 단편 (가령, Fab, F(ab')2 및 Fv)을 포함한다. 용어 "면역글로불린" (Ig)은 본원에서 "항체"와 교체가능하게 이용된다. 본원에서 예기된 항체는 단일-도메인 항체, 예를 들면, 중쇄 단독 항체를 포함한다.
기본 4-사슬 항체 단위는 2개의 동일한 가벼운 (L) 사슬 및 2개의 동일한 무거운 (H) 사슬로 구성된 헤테로사합체성 당단백질이다. IgM 항체는 J 사슬로 불리는 추가 폴리펩티드와 함께 5개의 기본 헤테로사합체 단위로 구성되고 10개의 항원 결합 부위를 내포하고, 반면 IgA 항체는 중합하여 J 사슬과 조합으로 다가 기계조립을 형성할 수 있는 2-5개의 기본 4-사슬 단위를 포함한다. IgG의 경우에, 4-사슬 단위는 일반적으로, 약 150,000 달톤이다. 각 L 사슬은 하나의 공유 이황화 결합에 의해 H 사슬에 연결되고, 반면 2개의 H 사슬은 H 사슬 아이소타입에 따라, 하나 또는 그 이상의 이황화 결합에 의해 서로 연결된다. 각 H와 L 사슬은 또한, 규칙적으로 이격된 사슬내 이황화 다리를 갖는다. 각 H 사슬은 N 말단에서, 가변 도메인 (VH), 그 이후에 α와 γ 사슬 각각에 대해 3개의 불변 도메인 (CH) 및 μ와 ε 아이소타입에 대해 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각 L 사슬은 N 말단에서, 가변 도메인 (VL), 그 이후에 이의 다른 단부에서 불변 도메인을 갖는다. VL은 VH에 맞추어 정렬되고, 그리고 CL은 중쇄의 첫 번째 불변 도메인 (CH1)에 맞추어 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이에 인터페이스를 형성하는 것으로 생각된다. VH와 VL의 짝짓기는 단일 항원 결합 부위를 함께 형성한다. 항체의 상이한 부류의 구조와 성질에 대해, 가령 Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr and Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71 및 Chapter 6을 참조한다. 임의의 척추동물 종으로부터 L 사슬은 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여, 카파와 람다로 불리는 2가지 명확하게 상이한 유형 중에서 한 가지에 배정될 수 있다. 중쇄의 불변 도메인 (CH)의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류 또는 아이소타입에 배정될 수 있다. 5가지 부류의 면역글로불린이 있다: 각각, α, δ, ε, γ 및 μ로서 지정된 중쇄를 갖는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. γ와 α 부류는 CH 서열과 기능에서 상대적으로 작은 차이에 근거하여 하위부류로 더욱 나눠진다, 가령, 인간은 다음의 하위부류를 발현한다: IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2.
용어 "중쇄-단독 항체" 또는 "HCAb"는 중쇄를 포함하지만, 4-사슬 항체에서 통상적으로 발견되는 경쇄를 결여하는 기능적 항체를 지칭한다. 낙타 동물 (가령, 낙타, 라마 또는 알파카)는 HCAbs를 생산하는 것으로 알려져 있다.
용어 "단일-도메인 항체" 또는 "sdAb"는 3개의 상보성 결정 영역 (CDRs)을 갖는 단일 항원 결합 폴리펩티드를 지칭한다. sdAb 단독은 상응하는 CDR-내포 폴리펩티드와의 짝짓기 없이 항원에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 단일-도메인 항체는 낙타 HCAbs로부터 가공되고, 그리고 이들의 중쇄 가변 도메인은 본원에서 "VHHs"로서 지칭된다. 일부 VHHs는 또한, 나노바디로서 알려져 있을 수 있다. 낙타 sdAb는 가장 작은 공지된 항원 결합 항체 단편 중에서 한 가지이다 (가령, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-8 (1993); Greenberg et al., Nature 374:168-73 (1995); Hassanzadeh-Ghassabeh et al., Nanomedicine (Lond), 8:1013-26 (2013)을 참조한다). 기본 VHH는 N 말단으로부터 C 말단까지 다음의 구조를 갖는다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, 여기서 FR1 내지 FR4는 각각, 프레임워크 영역 1 내지 4를 지칭하고, 그리고 여기서 CDR1 내지 CDR3은 상보성 결정 영역 1 내지 3을 지칭한다.
"단리된" 항체는 생산 환경 (가령, 자연 또는 재조합)의 성분으로부터 확인되고, 분리되고 및/또는 회수된 것이다. 바람직하게는, 단리된 폴리펩티드는 이의 생산 환경으로부터 모든 다른 성분과의 연관이 없다. 생산 환경의 오염체 성분, 예를 들면, 재조합 형질감염된 세포로부터 발생하는 것은 상기 항체에 대한 연구, 진단적 이용 또는 치료적 이용을 전형적으로 간섭하는 물질이고, 그리고 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드는 (1) 예로서, 로리법에 의해 결정될 때 항체의 중량으로 95%보다 크게, 그리고 일부 구체예에서, 중량으로 99%보다 크게; (1) 회전 컵 배열결정장치의 이용에 의해 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 최소한 15개 잔기를 획득하는데 충분한 정도까지, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는, 은 염색을 이용하여 비환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질성까지 정제될 것이다. 단리된 항체는 재조합 세포 내에서 원지에서 항체를 포함하는데, 그 이유는 항체의 자연 환경의 최소한 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 하지만, 통상적으로, 단리된 폴리펩티드 또는 항체는 최소한 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노 말단 도메인을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각, "VH" 및 "VL"로서 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로, 항체의 최대 가변적 부분 (동일한 부류의 다른 항체에 비하여)이고 항원 결합 부위를 내포한다. 낙타 종으로부터 중쇄 단독 항체는 단일 중쇄 가변 영역을 갖는데, 이것은 "VHH"로서 지칭된다. VHH는 따라서, VH의 특수한 유형이다.
용어 "가변적"은 가변 도메인의 일정한 분절이 항체 사이에서 서열에서 광범위하게 다르다는 사실을 지칭한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고, 그리고 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 규정한다. 하지만, 가변성은 가변 도메인의 전체 스팬에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 그 대신에, 이것은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두에서 초가변 영역 (HVRs)으로 불리는 3개의 분절에서 농축된다. 가변 도메인의 더욱 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 불린다. 선천적 중쇄와 경쇄의 가변 도메인은 각각, 3개의 HVRs에 의해 연결된, 베타-시트 형상을 주로 채택하는 4개의 FR 영역을 포함하고, 이들은 루프 연결을 형성하고, 그리고 일부 경우에, 베타-시트 구조의 일부를 형성한다. 각 사슬에서 HVRs는 FR 영역에 의해 매우 근접하여 결합되고, 그리고 다른 사슬로부터 HVRs와 함께, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md (1991)를 참조한다). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는데 직접적으로 관련되지 않지만, 다양한 작동체 기능, 예를 들면, 항체 의존성 세포 세포독성에서 항체의 참여를 전시한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"는 실제적으로 균질한 항체의 개체군으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 다시 말하면, 상기 개체군을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생 돌연변이 및/또는 번역후 변형 (가령, 이성화, 아미드화)을 제외하고 동일하다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이고 단일 항원성 부위에 대해 지향된다. 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다중클론 항체 제조물과 대조적으로, 각 단일클론 항체는 항원 상에서 단일 결정인자에 대해 지향된다. 단일클론 항체는 그들의 특이성에 더하여, 하이브리도마 배양에 의해 또는 재조합적으로 합성되고, 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어 "단일클론"은 항체의 실제적으로 균질한 개체군으로부터 획득되는 것으로서 항체의 특징을 지시하고, 그리고 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 가령, 본 발명에 따라서 이용되는 단일클론 항체는 예로서, 하이브리도마 방법 (가령, Kohler and Milstein., Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), 재조합 DNA 방법 (가령, U.S. 특허 번호 4,816,567을 참조한다), 파지 전시 기술 (가령, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)를 참조한다), 그리고 인간 면역글로불린 서열을 인코딩하는 인간 면역글로불린 좌위 또는 유전자 중에서 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하기 위한 기술 (가령, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); U.S. 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)를 참조한다)를 비롯한 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있다.
용어 "나신 항체"는 세포독성 모이어티 또는 방사성 표지에 접합되지 않는 항체를 지칭한다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 또는 "전체 항체"는 항체 단편과는 대조적으로, 실제적으로 무손상 형태에서 항체를 지칭하기 위해 교체가능하게 이용된다. 구체적으로, 전장 4-사슬 항체는 Fc 영역을 포함하는 중쇄와 경쇄를 갖는 것들을 포함한다. 전장 중쇄 단독 항체는 중쇄 (가령, VHH) 및 Fc 영역을 포함한다. 불변 도메인은 선천적 서열 불변 도메인 (가령, 인간 선천적 서열 불변 도메인) 또는 이들의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 일부 경우에, 무손상 항체는 하나 또는 그 이상의 작동체 기능을 가질 수 있다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 부분, 바람직하게는 무손상 항체의 항원 결합 및/또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 실례는 Fab, Fab′, F(ab′)2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체 (U.S. 특허 번호 5,641,870, 실시예 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]를 참조한다); 단일 사슬 항체 분자; 단일-도메인 항체 (가령, VHH), 그리고 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 그리고 쉽게 결정화하는 능력을 반영하는 명칭인 잔여 "Fc" 단편을 생산한다. Fab 단편은 H 사슬의 가변 영역 도메인 (VH), 그리고 중쇄의 첫 번째 불변 도메인 (CH1)과 함께, 전체 L 사슬로 구성된다. 각 Fab 단편은 항원 결합에 대하여 일가이다, 다시 말하면, 이것은 단일 항원 결합 부위를 갖는다. 항체의 펩신 처리는 상이한 항원 결합 활성을 갖는 2개의 이황화 연결된 Fab 단편에 거의 상응하고 항원을 여전히 교차 연결할 수 있는 단일 큰 F(ab')2 단편을 산출한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 또는 그 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 소수의 추가 잔기를 가짐으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab′-SH는 본원에서, 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 Fab' 단편의 쌍으로서 최초 생산되었는데, 이들은 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는다. 항체 단편의 다른 화학적 연계 역시 알려져 있다.
Fc 단편은 이황화물에 의해 묶인 양쪽 H 사슬의 카르복시 말단 부분을 포함한다. 항체의 작동체 기능은 Fc 영역 내에 서열에 의해 결정되는데, 이러한 영역은 또한, 일정한 유형의 세포 상에서 발견되는 Fc 수용체 (FcR)에 의해 인식된다.
"Fv"는 완전 항원-인식 및 -결합 부위를 내포하는 최소 항체 단편이다. 이러한 단편은 단단한, 비공유 연관에서 하나의 중쇄와 하나의 경쇄 가변 영역 도메인의 이합체로 구성된다. 이들 두 도메인의 접힘으로부터, 항원 결합을 위한 아미노산 잔기에 기여하고 항원 결합 특이성을 항체에 부여하는 6개의 초가변 루프 (H와 L 사슬 각각으로부터 3개의 루프)가 발산된다. 하지만, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특정한 단지 3개의 HVRs만을 포함하는 Fv의 절반)도 비록 전체 결합 부위보다 친화성이 낮긴 하지만, 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 갖는다.
또한 "sFv" 또는 "scFv"로서 약칭되는 "단일 사슬 Fv"는 단일 폴리펩티드 사슬 내로 연결된 VH와 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩티드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더욱 포함하는데, 이것은 sFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 한다. sFv의 리뷰를 위해, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)를 참조한다.
본원에서 설명된 항체의 "기능적 단편"은 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역, 또는 변형된 FcR 결합 능력을 유지하거나 또는 갖는 항체의 Fc 영역을 일반적으로 포함하는 무손상 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 실례는 선형 항체, 단일 사슬 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
용어 "디아바디"는 V 도메인의 사슬내가 아닌 사슬간 대합이 달성되어 이가 단편, 다시 말하면, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 단편이 산출되도록, VH와 VL 도메인 사이에 짧은 링커 (약 5-10 잔기)로 sFv 단편 (선행하는 단락 참조)을 작제함으로써 제조된 작은 항체 단편을 지칭한다. 이중특이적 디아바디는 2개의 "교배" sFv 단편의 이형이합체인데, 여기서 이들 두 항체의 VH와 VL 도메인은 상이한 폴리펩티드 사슬 상에 존재한다. 디아바디는 예로서, EP 404,097; WO 93/11161; Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)에서 더욱 상세하게 설명된다.
본원에서 단일클론 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 또는 이들 서열과 상동하고, 반면 사슬(들)의 나머지 부분이 다른 종으로부터 유래되거나 또는 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 또는 이들 서열에 상동한 "키메라" 항체뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 전시하기만 하면, 이런 항체의 단편을 특정적으로 포함한다 (U.S. 특허 번호 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). 본원에서 관심되는 키메라 항체는 PRIMATTZFD® 항체를 포함하는데, 여기서 상기 항체의 항원 결합 영역은 예로서, 마카크 원숭이를 관심되는 항원으로 면역화함으로써 생산된 항체로부터 유래된다. 본원에서 이용된 바와 같이, "인간화 항체"는 "키메라 항체"의 부분집합으로서 이용된다.
비인간 (가령, 낙타) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 내포하는 키메라 항체이다. 일부 구체예에서, 인간화 항체는 수용자의 HVR (아래에 규정됨)로부터 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및/또는 수용력을 갖는, 비인간 종 (공여자 항체), 예를 들면, 생쥐, 쥐, 토끼 또는 비인간 영장류의 HVR로부터 잔기에 의해 대체되는 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 ("FR") 잔기가 상응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다. 게다가, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능, 예를 들면, 결합 친화성을 더욱 정밀화하기 위해 만들어질 수 있다. 일반적으로, 비록 FR 영역이 항체 성과, 예를 들면, 결합 친화성, 이성화, 면역원성 등을 향상시키는 하나 또는 그 이상의 개별 FR 잔기 치환을 포함할 수 있긴 하지만, 인간화 항체는 최소한 하나, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실제적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 초가변 루프의 전부 또는 실제적으로 전부가 비인간 면역글로불린 서열의 것들에 상응하고, 그리고 FR 영역의 전부 또는 실제적으로 전부가 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. FR에서 이들 아미노산 치환의 숫자는 전형적으로, H 사슬에서 6개 이내이고 L 사슬에서 3개 이내이다. 인간화 항체는 임의선택적으로 또한, 전형적으로 인간 면역글로불린의 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 최소한 일부를 포함할 것이다. 추가 상세를 위해, 가령 Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)을 참조한다. 또한, 예로서 Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); 및 U.S. 특허 번호 6,982,321 및 7,087,409를 참조한다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 소유하고 및/또는 본원에서 개시된 바와 같은 인간 항체를 만들기 위한 기술 중에서 한 가지를 이용하여 만들어진 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특정적으로 배제한다. 인간 항체는 파지 전시 라이브러리를 비롯하여, 당해 분야에서 공지된 다양한 기술을 이용하여 생산될 수 있다. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). 인간 단일클론 항체의 제조를 위해, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)에서 설명된 방법 역시 가용하다. 또한, van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)를 참조한다. 인간 항체는 항원 공격에 대한 응답으로 이런 항체를 생산하도록 변형되지만, 내인성 좌위에 장애가 있는 유전자도입 동물, 예를 들면, 면역화된 제노마우스에 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다 (가령, XENOMOUSE™ 기술에 관하여 U.S. 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584를 참조한다). 또한, 인간 B-세포 하이브리도마 기법을 통해 산출된 인간 항체에 관하여, 예로서 Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)를 참조한다.
본원에서 이용될 때, 용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"는 서열에서 초가변성이고 및/또는 구조적으로 규정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, sdAbs는 3개의 HVRs (또는 CDRs): HVR1 (또는 CDR1), HVR2 (또는 CDR2) 및 HVR3 (또는 CDR3)을 포함한다. HVR3은 3개의 HVRs 중에서 최대 다양성을 전시하고, 그리고 충분한 특이성을 항체에 부여하는데 있어서 독특한 역할을 수행하는 것으로 생각된다. 가령, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)을 참조한다.
용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 Kabat 시스템에 의해 규정된 바와 같은 초가변 영역을 지칭하는데 이용된다. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)을 참조한다.
다수의 HVR 묘사가 본원에서 이용되고 포괄된다. Kabat 상보성 결정 영역 (CDRs)은 서열 가변성에 근거되고, 그리고 가장 흔히 이용되는 것이다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Chothia는 그 대신에, 구조적 루프의 위치를 지칭한다 (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). AbM HVRs는 Kabat HVRs 및 Chothia 구조적 루프 사이에 타협을 나타내고, 그리고 Oxford Molecular의 AbM 항체 모형화 소프트웨어에 의해 이용된다. "접촉" HVRs는 가용한 복합 결정 구조의 분석에 근거된다. 이들 HVRs 각각으로부터 잔기는 아래의 표 1에서 제시된다.
표 1. HVR 묘사
루프 Kabat AbM Chothia 접촉
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B
(Kabat 넘버링)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
(Chothia 넘버링)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
HVRs는 아래와 같이 "연장된 HVRs"를 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3), 그리고 VH에서 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 이들 정의 각각에 대해 Kabat et al., 위와 같음에 따라 넘버링된다.
sdAb (가령, VHH)의 아미노산 잔기는 Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun. 23; 240 (1-2): 185-195의 논문에서 낙타로부터 VHH 도메인에 적용된 바와 같이, Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, Md., Publication No. 91)에 의해 제공된 VH 도메인에 대한 일반적인 넘버링에 따라 넘버링된다. 이러한 넘버링에 따라, VHH의 FR1은 위치 1-30에서 아미노산 잔기를 포함하고, VHH의 CDR1은 위치 31-35에서 아미노산 잔기를 포함하고, VHH의 FR2는 위치 36-49에서 아미노산을 포함하고, VHH의 CDR2는 위치 50-65에서 아미노산 잔기를 포함하고, VHH의 FR3은 위치 66-94에서 아미노산 잔기를 포함하고, VHH의 CDR3은 위치 95-102에서 아미노산 잔기를 포함하고, 그리고 VHH의 FR4는 위치 103-113에서 아미노산 잔기를 포함한다. 이점에 관하여, 주목해야 할 것은 -VH 도메인 및 VHH 도메인에 대해 당해 분야에서 널리 공지된 바와 같이- 각 CDR에서 아미노산 잔기의 총수가 변할 수 있고, 그리고 Kabat 넘버링에 의해 지시된 아미노산 잔기의 총수에 상응하지 않을 수 있다는 점이다 (다시 말하면, Kabat 넘버링에 따른 하나 또는 그 이상의 위치가 실제 서열에서 점유되지 않을 수 있거나, 또는 실제 서열이 Kabat 넘버링에 의해 허용된 숫자보다 더욱 많은 아미노산 잔기를 내포할 수 있다).
표현 "Kabat에서처럼 가변적-도메인 잔기-넘버링" 또는 "Kabat에서처럼 아미노산-위치 넘버링" 및 이들의 변이는 Kabat et al., 위와 같음에서 항체의 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 이용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축, 또는 이것 내로 삽입에 상응하는 더욱 적은 또는 추가 아미노산을 내포할 수 있다. 가령, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 뒤에 단일 아미노산 삽입물 (Kabat에 따라 잔기 52a), 그리고 중쇄 FR 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기 (가령, Kabat에 따라 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 Kabat 넘버링은 항체의 서열과 "표준" Kabat 넘버링된 서열의 상동성의 영역에서 정렬에 의해 소정의 항체에 대해 결정될 수 있다.
본원에서 달리 지시되지 않으면, 면역글로불린 중쇄에서 잔기의 넘버링은 Kabat et al., 위와 같음에서처럼 EU 지수의 넘버링이다. "Kabat에서처럼 EU 지수"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 번호를 지칭한다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 규정된 바와 같은 HVR 잔기 이외에 가변-도메인 잔기이다.
"인간 공통 프레임워크" 또는 "수용자 인간 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선별에서 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 선별된다. 일반적으로, 서열의 하위군은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)에서와 같은 하위군이다. 가령, VL의 경우에, 하위군은 Kabat et al., 위와 같음에서처럼 하위군 카파 I, 카파 II, 카파 III 또는 카파 IV일 수 있다. 추가적으로, VH의 경우에, 하위군은 Kabat et al.에서처럼 하위군 I, 하위군 II 또는 하위군 III일 수 있다. 대안으로, 인간 공통 프레임워크가 상기로부터 유래될 수 있는데, 여기서 특정 잔기, 예를 들면, 인간 프레임워크 잔기는 공여자 프레임워크 서열을 다양한 인간 프레임워크 서열의 수집물과 함께 정렬함으로써 공여자 프레임워크에 대한 상동성에 근거하여 선별된다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 이것은 기존 아미노산 서열 변화를 내포할 수 있다. 일부 구체예에서, 기존 아미노산 변화의 숫자는 10 또는 그 이하, 9 또는 그 이하, 8 또는 그 이하, 7 또는 그 이하, 6 또는 그 이하, 5 또는 그 이하, 4 또는 그 이하, 3 또는 그 이하, 또는 2 또는 그 이하이다.
가령, Fc 영역의 특정된 위치에서 "아미노산 변형"은 특정된 잔기의 치환 또는 결실, 또는 특정된 잔기에 인접한 최소한 하나의 아미노산 잔기의 삽입을 지칭한다. 특정된 잔기에 "인접한" 삽입은 이들의 1 내지 2개 잔기 이내에 삽입을 의미한다. 삽입은 특정된 잔기의 N 말단 또는 C 말단일 수 있다. 본원에서 바람직한 아미노산 변형은 치환이다.
"친화성 성숙된" 항체는 변경(들)을 소유하지 않는 부모 항체와 비교하여, 항원에 대한 항체의 친화성에서 향상을 유발하는, 하나 또는 그 이상의 HVRs에서 하나 또는 그 이상의 변경을 갖는 것이다. 일부 구체예에서, 친화성 성숙된 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰 친화성을 갖는다. 친화성 성숙된 항체는 당해 분야에서 공지된 절차에 의해 생산된다. 가령, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)은 VH- 및 VL -도메인 뒤섞음에 의한 친화성 성숙을 설명한다. HVR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 예로서, Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); 및 Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)에 의해 설명된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합한다", "특이적으로 인식한다" 또는 "특이적이다"는 계측가능하고 재현가능한 상호작용, 예를 들면, 표적 및 항원 결합 단백질 (가령, CAR 또는 sdAb) 사이에 결합을 지칭하는데, 이것은 생물학적 분자를 비롯한 분자의 이질성 개체군의 존재에서 표적의 존재를 결정한다. 가령, 표적 (이것은 에피토프일 수 있다)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질 (가령, CAR 또는 sdAb)은 이것이 다른 표적에 결합하는 것보다 더욱 큰 친화성으로, 결합능으로, 더욱 쉽게 및/또는 더욱 큰 지속 기간에서 이러한 표적에 결합하는 항원 결합 단백질 (가령, CAR 또는 sdAb)이다. 일부 구체예에서, 관련 없는 표적에 항원 결합 단백질 (가령, CAR 또는 sdAb)의 결합의 정도는 예로서, 방사면역검정 (RIA)에 의해 계측될 때 표적에 대한 항원 결합 단백질 (가령, CAR 또는 sdAb)의 결합의 약 10%보다 적다. 일부 구체예에서, 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질 (가령, CAR 또는 sdAb)은
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1 μM,
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100 nM,
Figure 112019006570822-pct00003
10 nM,
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1 nM, 또는
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0.1 nM의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질 (가령, CAR 또는 sdAb)은 상이한 종으로부터 단백질 사이에서 보존되는 단백질 상에 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 특이적 결합은 배타적 결합을 포함할 수 있지만, 이를 필요로 하지는 않는다.
용어 "특이성"은 항원의 특정 에피토프에 대한 항원 결합 단백질 (가령, CAR 또는 sdAb)의 선택적 인식을 지칭한다. 자연 항체는 예로서, 단일특이적이다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "다중특이적"은 항원 결합 단백질 (가령, CAR 또는 sdAb)이 2개 또는 그 이상의 항원 결합 부위를 갖고, 이들 중에서 최소한 2개가 상이한 항원에 결합한다는 것을 표시한다. 본원에서 이용된 바와 같이, "이중특이적"은 항원 결합 단백질 (가령, CAR 또는 sdAb)이 2가지 상이한 항원 결합 특이성을 갖는다는 것을 표시한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "단일특이적" CAR은 하나 또는 그 이상의 결합 부위를 갖고, 이들 각각이 동일한 항원에 결합하는 항원 결합 단백질 (가령, CAR 또는 sdAb)을 표시한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "가 (valent)"는 항원 결합 단백질 (가령, CAR 또는 sdAb) 내에 특정된 숫자의 결합 부위의 존재를 표시한다. 예로서, 자연 항체 또는 전장 항체는 2개의 결합 부위를 갖고 이가이다. 따라서, 용어 "삼가", "사가", "오가" 및 "육가"는 항원 결합 단백질 (가령, CAR 또는 sdAb) 내에 각각, 2개의 결합 부위, 3개의 결합 부위, 4개의 결합 부위, 5개의 결합 부위 및 6개의 결합 부위의 존재를 표시한다.
"항체 작동체 기능"은 항체의 Fc 영역 (선천적 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인한 생물학적 활성을 지칭하고, 그리고 항체 아이소타입에 따라 변한다. 항체 작동체 기능의 실례는 다음을 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체 (가령, B 세포 수용체)의 하향조절; 그리고 B 세포 활성화. "감소된 또는 최소화된" 항체 작동체 기능은 이것이 야생형 또는 변형되지 않은 항체로부터 최소한 50% (대안으로 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 감소된다는 것을 의미한다. 항체 작동체 기능의 결정은 당업자에 의해 쉽게 결정가능하고 계측가능하다. 바람직한 구체예에서, 보체 결합, 보체 의존성 세포독성 및 항체 의존성 세포독성의 항체 작동체 기능이 영향을 받는다. 일부 구체예에서, 작동체 기능은 글리코실화를 제거하는 불변 영역에서 돌연변이, 예를 들면, "작동체-없는 돌연변이"를 통해 제거된다. 한 양상에서, 작동체-없는 돌연변이는 CH2 영역에서 N297A 또는 DANA 돌연변이 (D265A+N297A)이다. Shields et al., J. Biol. Chem. 276 (9): 6591-6604 (2001). 대안으로, 감소된 또는 제거된 작동체 기능을 유발하는 추가 돌연변이는 다음을 포함한다: K322A 및 L234A/L235A (LALA). 대안으로, 작동체 기능은 생산 기술, 예를 들면, 글리코실화되지 않거나 (가령, 대장균 (E. coli)), 또는 작동체 기능을 증진하는데 무효하거나 또는 덜 효과적인 변경된 글리코실화 패턴을 유발하는 숙주 세포에서 발현을 통해 감소되거나 또는 제거될 수 있다 (가령, Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278(5): 3466-3473 (2003).
"항체 의존성 세포 매개된 세포독성" 또는 ADCC는 일정한 세포독성 세포 (가령, 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcRs) 위에 결합된 분비된 Ig가 이들 세포독성 작동체 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하고, 그리고 차후에, 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성의 한 형태를 지칭한다. 이들 항체는 세포독성 세포를 "무장시키고", 그리고 이러한 기전에 의한 표적 세포의 사멸을 위해 절대적으로 필요하다. ADCC를 매개하기 위한 일차 세포, NK 세포는 단지 FcγRIII만을 발현하고, 반면 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서 Fc 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991)의 464 페이지 상에 표 3에서 요약된다. 관심되는 분자의 ADCC 활성을 사정하기 위해, 시험관내 ADCC 검정, 예를 들면, US 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에서 설명된 것이 수행될 수 있다. 이런 검정을 위한 유용한 작동체 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안으로, 또는 부가적으로, 관심되는 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들면, 동물 모형, 예를 들면, Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998)에서 개시된 것에서 사정될 수 있다.
용어 "Fc 영역"은 선천적-서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 비롯하여, 면역글로불린 중쇄의 C 말단 영역을 규정하는데 이용된다. 비록 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 변할 수도 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 위치 Cys226에서 아미노산 잔기로부터, 또는 Pro230으로부터 이들의 카르복실 말단까지 뻗어 있는 것으로 통상적으로 규정된다. Fc 영역의 C 말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따라 잔기 447)은 예로서, 항체의 생산 또는 정제 동안, 또는 항체의 중쇄를 인코딩하는 핵산을 재조합적으로 가공함으로써 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 개체군, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 개체군, 그리고 K447 잔기가 있고 없는 항체의 혼합물을 갖는 항체 개체군을 포함할 수 있다. 본원에서 설명된 항체에서 이용을 위한 적합한 선천적-서열 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 및 IgG4를 포함한다.
"결합 친화성"은 일반적으로, 분자 (가령, 항체 또는 CAR)의 단일 결합 부위 및 이의 결합 상대 (가령, 항원) 사이에 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않으면, 본원에서 이용된 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원 (가령, 항체와 항원, 또는 CAR과 항원) 사이에 1:1 상호작용을 반영하는 내재성 결합 친화성을 지칭한다. 상대 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로, 해리 상수 (Kd)에 의해 표현될 수 있다. 친화성은 본원에서 설명된 것들을 비롯한 당해 분야에서 공지된 통상적인 방법에 의해 계측될 수 있다. 낮은 친화성 항체는 일반적으로, 항원에 천천히 결합하고 쉽게 해리하는 경향이 있고, 반면 높은 친화성 항체는 일반적으로, 항원에 더욱 빨리 결합하고 더욱 길게 결합된 상태로 남아있는 경향이 있다. 결합 친화성을 계측하는 다양한 방법이 당해 분야에서 공지되는데, 이들 중에서 한 가지가 본 출원을 위해 이용될 수 있다. 결합 친화성을 계측하기 위한 특정한 예시적이고 전형적인 구체예는 다음에서 설명된다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 자신이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 저해하거나 또는 감소시키는 항체이다. 일부 구체예에서, 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실제적으로 또는 완전하게 저해한다.
펩티드, 폴리펩티드 또는 항체 서열에 대하여 "아미노산 서열 동일성 퍼센트 (%)" 및 "상동성"은 최고 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요하면, 갭을 도입한 후에, 그리고 임의의 보존성 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 특정한 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 내에 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열 내에 아미노산 잔기의 백분율로서 규정된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하는 목적을 위한 정렬은 당해 분야의 기술 범위 안에 있는 다양한 방식으로, 예를 들면, 공개적으로 가용한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGN™ (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여, 정렬을 계측하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 유전적으로 가공된 수용체를 지칭하는데, 이것은 하나 또는 그 이상의 항원 특이성을 면역 작동체 세포, 예를 들면, T 세포 위에 합체시키는데 이용될 수 있다. 일부 CARs는 "인공 T 세포 수용체", "키메라 T 세포 수용체" 또는 "키메라 면역 수용체"로서 또한 알려져 있다. 일부 구체예에서, CAR은 하나 또는 그 이상의 항원 (가령, 종양 항원)에 특정한 세포외 항원 결합 도메인, 막경유 도메인, 그리고 T 세포 및/또는 다른 수용체의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. "CAR-T"는 CAR을 발현하는 T 세포를 지칭한다. "BCMA CAR"은 BCMA에 특이적인 세포외 결합 도메인을 갖는 CAR을 지칭한다. "이중-에피토프 CAR"은 BCMA 상에서 2개의 상이한 에피토프에 특이적인 세포외 결합 도메인을 갖는 CAR을 지칭한다.
본원에서 설명된 CAR 또는 sdAb를 인코딩하는 "단리된" 핵산 분자는 이것이 생산되었던 환경에서 이것이 통상적으로 연관되는 최소한 하나의 오염체 핵산 분자로부터 확인되고 분리된 핵산 분자이다. 바람직하게는, 단리된 핵산은 생산 환경과 연관된 모든 다른 성분과의 연관이 없다. 본원에서 폴리펩티드 및 항체를 인코딩하는 단리된 핵산 분자는 이것이 자연에서 발견되는 형태 또는 세팅 이외의 형태이다. 단리된 핵산 분자는 이런 이유로, 세포에서 자연적으로 존재하는 본원에서 폴리펩티드 및 항체를 인코딩하는 핵산과 구별된다.
용어 "제어 서열"은 특정 숙주 생명체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현을 위해 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열은 예로서, 프로모터, 임의선택적으로 오퍼레이터 서열, 그리고 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 그리고 인핸서를 활용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에서 배치될 때 "작동가능하게 연결된다". 가령, 프리서열 또는 분비성 리더에 대한 DNA가 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구단백질로서 발현되면, 이것은 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결된다; 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 주면, 이것은 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다; 또는 리보솜 결합 부위가 번역을 용이하게 하기 위해 배치되면, 이것은 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접하고, 그리고, 분비성 리더의 경우에, 인접하고 판독 시기에 있다는 것을 의미한다. 하지만, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 편의한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성된다. 만약 이런 부위가 존재하지 않으면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 전통적인 관례에 따라서 이용된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 자신이 연관되는 다른 핵산을 증식할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조로서 벡터뿐만 아니라 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 함입된 벡터를 포함한다. 일정한 벡터는 그들이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현을 주동할 수 있다. 이런 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "자가"는 추후에 개체 내로 재도입되는, 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭하는 것으로 의미된다.
"동종이계"는 동일한 종의 상이한 개체로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포 내로 이전되거나 또는 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염된, 형질전환된 또는 형질도입된 것이다. 세포는 일차 개체 세포 및 이의 자손을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양액"은 교체가능하게 이용되고, 그리고 이와 같은 모든 지정은 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질감염체" 및 "형질감염된 세포"는 이전의 횟수에 상관없이, 일차 개체 세포 및 이로부터 유래된 배양액을 포함한다. 모든 자손은 축중성 또는 우연한 돌연변이로 인해, DNA 함량에서 정확하게 동일하지 않을 수도 있는 것으로 또한 이해된다. 최초 형질전환된 세포에서 선별검사된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손이 포함된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양액"은 교체가능하게 이용되고, 그리고 외인성 핵산이 도입된 세포 및 이런 세포의 자손을 지칭한다. 숙주 세포에는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"가 포함되는데, 이들은 계대 (passage)의 횟수에 상관없이, 일차 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에서 부모 세포와 완전히 동일하지 않고, 돌연변이를 내포할 수도 있다. 최초 형질전환된 세포에서 선별검사되거나 또는 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손은 여기에 포함된다.
본원에서 이용된 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는"는 임상적 결과를 비롯한 유익한 또는 원하는 결과를 획득하기 위한 접근법이다. 본 발명을 위해, 유익한 또는 원하는 임상적 결과는 다음 중에서 하나 또는 그 이상을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 질환으로부터 발생하는 하나 또는 그 이상의 증상을 경감하고, 질환의 정도를 축소하고, 질환을 안정시키고 (가령, 질환을 예방하거나 또는 질환의 악화를 지연시키는), 질환의 확산 (가령, 전이)를 예방하거나 또는 지연시키고, 질환의 재발을 예방하거나 또는 지연시키고, 질환의 진행을 지연시키거나 또는 늦추고, 질환 상태를 개선하고, 질환의 관해 (부분적인 또는 전체)를 제공하고, 질환을 치료하는데 필요한 하나 또는 그 이상의 다른 약제의 용량을 감소시키고, 질환의 진행을 지연시키고, 삶의 질을 증가시키고 및/또는 생존을 연장한다. 암의 병리학적 결과의 감소 역시 "치료"에 의해 포괄된다. 본 출원의 방법은 치료의 이들 양상 중에서 한 가지 또는 그 이상을 예기한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "개체" 또는 "피험자"는 인간, 소, 말, 고양이, 개, 설치류 또는 영장류를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 포유동물을 지칭한다. 일부 구체예에서, 개체는 인간이다.
본원에서 이용된 용어 "효과량"은 특정된 장애, 상태 또는 질환을 치료하는데, 예를 들면, 이의 증상 중에서 하나 또는 그 이상을 개선하고, 완화시키고, 줄이고 및/또는 지연시키는데 충분한 작용제, 예를 들면, sdAb, 가공된 면역 작동체 세포, 또는 이들의 제약학적 조성물의 양을 지칭한다. 암에 관하여, 효과량은 종양이 수축하도록 유발하고 및/또는 종양의 성장률을 감소시키거나 (가령, 종양 성장을 억제하거나) 또는 다른 원치 않는 세포 증식을 예방하거나 또는 지연시키는데 충분한 양을 포함한다. 일부 구체예에서, 효과량은 발달을 지연시키는데 충분한 양이다. 일부 구체예에서, 효과량은 재발을 예방하거나 또는 지연시키는데 충분한 양이다. 효과량은 1회 또는 그 이상의 투여에서 투여될 수 있다. 약물 또는 조성물의 효과량은 (i) 암 세포의 숫자를 감소시키고; (ii) 종양 크기를 감소시키고; (iii) 말초 장기 내로 암 세포 침윤을 저해하고, 지연시키고, 얼마간 늦추고, 그리고 바람직하게는 중단시키고; (iv) 종양 전이를 저해하고 (즉, 얼마간 늦추고, 바람직하게는 중단시키고); (v) 종양 성장을 저해하고; (vi) 종양의 발생 및/또는 재발을 예방하거나 또는 지연시키고; 및/또는 (vii) 암과 연관된 증상 중에서 하나 또는 그 이상을 얼마간 완화시킬 수 있다.
"어쥬번트 세팅"은 개체가 암의 병력을 갖고, 그리고 일반적으로 (반드시 그러한 것은 아니지만), 수술 (가령, 수술 적출), 방사선 요법 및 화학요법을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 요법에 반응성인 임상적 세팅을 지칭한다. 하지만, 암의 병력 때문에, 이들 개체는 질환의 발달의 위험에 처해있는 것으로 고려된다. "어쥬번트 세팅"에서 치료 또는 투여는 치료의 차후 방식을 지칭한다. 위험의 정도 (가령, 어쥬번트 세팅에서 개체가 "높은 위험" 또는 "낮은 위험"인 것으로 고려될 때)는 여러 인자, 가장 통상적으로는 처음 치료될 때 질환의 정도에 의존한다.
"네오어쥬번트 세팅"은 상기 방법이 일차/결정적 요법 전에 실행되는 임상적 세팅을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 암의 발달을 "지연시키는" 것은 상기 질환의 발달을 미루고, 방해하고, 늦추고, 지연시키고, 안정시키고 및/또는 늦추는 것을 의미한다. 이러한 지연은 질환의 병력 및/또는 치료되는 개체에 따라 시간 길이가 변할 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 충분한 또는 유의미한 지연은 개체에서 질환이 발달하지 않는다는 점에서, 실제로 예방을 포괄할 수 있다. 암의 발달을 "지연" 시키는 방법은 이러한 방법을 이용하지 않는 것과 비교할 때, 소정의 시간 프레임에서 상기 질환이 발달하는 확률을 감소시키고 및/또는 소정의 시간 프레임에서 상기 질환의 정도를 감소시키는 방법이다. 이런 비교는 전형적으로, 통계학적으로 유의한 숫자의 개체를 이용한 임상 연구에 근거된다. 암 발달은 전산화 축 단층촬영술 (CAT Scan), 자기 공명 영상법 (MRI), 복부 초음파, 응고 시험, 동맥조영술, 또는 생검을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 표준 방법을 이용하여 검출가능할 수 있다. 발달은 또한, 초기에 검출할 수 없고, 그리고 발생, 재발 및 개시를 포함하는 암 진행을 지칭할 수 있다.
용어 "제약학적 제제"는 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하고, 그리고 이러한 제제가 투여될 개체에 받아들이기 어려울 정도로 독성인 추가 성분을 내포하지 않는 형태의 제조물을 지칭한다. 이런 제제는 무균이다 "무균" 제제는 무균이거나 또는 모든 살아있는 미생물 및 그들의 포자가 없다.
본원에서 이용된 바와 같이, "담체"는 이용된 용량 및 농도에서 거기에 노출되는 세포 또는 포유동물에 비독성인 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제를 포함한다. 종종, 생리학적으로 허용되는 담체는 수성 pH 완충된 용액이다. 생리학적으로 허용되는 담체의 실례는 완충액, 예를 들면, 인산염, 구연산염 및 다른 유기 산; 아스코르빈산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (가령, 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 헥사메토늄 염화물; 벤잘코늄 염화물, 벤제토늄 염화물; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들면, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 그리고 m-크레졸); 저분자량 (약 10개보다 적은 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 그리고 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들면, EDTA; 당, 예를 들면, 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들면, 나트륨; 금속 착물 (가령, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들면, TWEEN™, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 그리고 PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
본원에서 관심되는 "희석제"는 제약학적으로 허용되고 (인간에 투여하기 안전하고 비독성인), 그리고 액체 제제, 예를 들면, 동결건조 후 재구성되는 제제의 제조에 유용한 것이다. 예시적인 희석제는 무균수, 정균성 주사용수 (BWFI), pH 완충된 용액 (가령, 인산염 완충된 식염수), 무균 식염수, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 대안적 구체예에서, 희석제는 염 및/또는 완충액의 수성 용액을 포함할 수 있다.
"보존제"는 세균 활성을 감소시키기 위해 본원에서 제제에 첨가될 수 있는 화합물이다. 보존제의 첨가는 예로서, 복수 이용 (복수 투약) 제제의 생산을 용이하게 할 수 있다. 잠재적 보존제의 실례는 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄, 헥사메토늄 염화물, 벤잘코늄 염화물 (알킬벤질디메틸암모늄 염화물의 혼합물, 여기서 알킬 기는 긴 사슬 화합물이다) 및 벤제토늄 염화물을 포함한다. 다른 유형의 보존제는 방향족 알코올, 예를 들면, 페놀, 부틸 및 벤질 알코올, 알킬 파라벤, 예를 들면, 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올, 그리고 m-크레졸을 포함한다. 본원에서 가장 바람직한 보존제는 벤질 알코올이다.
"안정된" 제제는 그 안에 단백질이 보관 시에 이의 물리적 및 화학적 안정성 및 완전성을 본질적으로 유지하는 것이다. 단백질 안정성을 계측하기 위한 다양한 분석 기법이 당해 분야에서 가용하고, 그리고 Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) 및 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)에서 리뷰된다. 안정성은 선별된 기간 동안 선별된 온도에서 계측될 수 있다. 신속한 선별검사를 위해, 제제는 시간 안정성이 계측되는 2 주 내지 1 개월 동안 40℃에서 유지될 수 있다. 제제가 2-8℃에서 보관되는 경우에, 일반적으로 제제는 30℃ 또는 40℃에서 최소한 1 개월 동안 안정되고 및/또는 2-8℃에서 최소한 2 년 동안 안정되어야 한다. 제제가 30℃에서 보관되는 경우에, 일반적으로 제제는 30℃에서 최소한 2 년 동안 안정되고 및/또는 40℃에서 최소한 6 개월 동안 안정되어야 한다. 가령, 보관 동안 응집의 정도는 단백질 안정성의 지표로서 이용될 수 있다. 따라서, "안정된" 제제는 약 10%보다 적은 및 바람직하게는, 약 5%보다 적은 단백질이 제제에서 응집체로서 존재하는 것일 수 있다. 다른 구체예에서, 제제의 보관 동안 응집체 형성에서 임의의 증가가 결정될 수 있다.
"재구성된" 제제는 단백질이 전역에서 분산되도록, 동결건조된 단백질 또는 항체 제제를 희석제에서 용해시킴으로써 제조된 것이다. 재구성된 제제는 관심되는 단백질로 치료되는 환자에 투여 (가령, 피하 투여)에 적합하고, 그리고 본 출원의 일부 구체예에서, 비경구 또는 정맥내 투여에 적합한 것일 수 있다.
"등장성" 제제는 인간 혈액과 본질적으로 동일한 삼투압을 갖는 것이다. 등장성 제제는 일반적으로, 약 250 내지 350 mOsm의 삼투압을 가질 것이다. 용어 "저장성"은 인간 혈액의 것보다 낮은 삼투압을 갖는 제제를 설명한다. 상응하게, 용어 "고장성"은 인간 혈액의 것보다 높은 삼투압을 갖는 제제를 설명하는데 이용된다. 등장성은 예로서, 증기압 또는 결빙 유형 삼투압계를 이용하여 계측될 수 있다. 본 발명의 제제는 염 및/또는 완충액의 첨가의 결과로서 고장성이다.
본원에서 설명된 본 출원의 구체예는 "구성되는" 및/또는 "본질적으로 구성되는" 구체예를 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 값 또는 파라미터에서 "약"에 대한 언급은 그 자체로 상기 값 또는 파라미터에 관계하는 변이를 포함한다 (및 설명한다). 가령, "약 X"를 지칭하는 설명은 "X"의 설명을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 값 또는 파라미터에서 "아님"에 대한 언급은 일반적으로, 값 또는 파라미터 "이외"를 의미하고 설명한다. 가령, 상기 방법이 유형 X의 암을 치료하는데 이용되지 않는다는 것은 상기 방법이 X 이외에 유형의 암을 치료하는데 이용된다는 것을 의미한다.
본원에서 이용된 용어 "약 X-Y"는 "약 X 내지 약 Y"와 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 이용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥에서 달리 지시되지 않으면, 복수 지시대상을 포함한다.
II. 항-BCMA 단일-도메인 항체
본 출원의 한 양상은 BCMA, 예를 들면, 인간 BCMA에 특이적으로 결합하는 단리된 단일-도메인 항체 (본원에서 "항-BCMA sdAbs"로서 지칭됨)를 제공한다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 BCMA 활성을 조정한다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 길항제 항체이다. 본원에서 설명된 항-BCMA sdAbs 중에서 한 가지로부터 유래된 항원 결합 단편, 그리고 본원에서 설명된 항-BCMA sdAbs 중에서 한 가지를 포함하는 항원 결합 단백질이 더욱 제공된다. 예시적인 항-BCMA sdAbs는 아래의 표 2에서 열거된다.
표 2. 예시적인 항-BCMA sdAbs.
SdAb 실례 AA 서열 번호 실례 NA 서열 번호 CDR1 CDR2 CDR3
269A37346 115 153 DYYAIG
(서열 번호: 1)		 CISRSDGSTYYADSVKG (서열 번호: 39) AGADCSGYLRDYEF
(서열 번호: 77)
269A37348 116 154 TYGMA
(서열 번호: 2)		 SKASMNYSGRTYYADSVKG (서열 번호: 40) AGTGCSTYGCFDAQIIDY
(서열 번호: 78)
269A37917 117 155 TFTMG
(서열 번호: 3)		 AISLSPTLAYYAESVKG (서열 번호: 41) ADRKSVMSIRPDY
(서열 번호: 79)
269A37355 118 156 INAMG
(서열 번호: 4)		 SIRGLGRTNYDDSVKG (서열 번호: 42) VYVTLLGGVNRDY
(서열 번호: 80)
269A37915 119 157 SIVMG
(서열 번호: 5)		 AIMWNDGITYLQDSVKG (서열 번호: 43) ASKGRYSEYEY
(서열 번호: 81)
269A37936 120 158 RAVIV
(서열 번호: 6)		 FIKPSDGTIYYIDSLKG (서열 번호: 44) ASPEDWYTDWIDWSIYR
(서열 번호: 82)
269A37953 121 159 SDVMG
(서열 번호: 7)		 AIMWNDGITYLQDSVKG (서열 번호: 45) ASKGRYSEYEY
(서열 번호: 83)
269A37965 122 160 NDHMA
(서열 번호: 8)		 AIDWSGRTTNYADPVEG (서열 번호: 46) VLRAWISYDNDY
(서열 번호: 84)
269A37972 123 161 KNTVA
(서열 번호: 9)		 SITWDGRTTYYADSVKG (서열 번호: 47) DLGKWPAGPADY
(서열 번호: 85)
269A37353 124 162 SHVMG
(서열 번호: 10)		 VIGWRDISTSYADSVKG (서열 번호: 48) ARRIDAADFDS
(서열 번호: 86)
269A37948 125 163 TYFMA
(서열 번호: 11)		 GIAWSGGSTAYADSVKG (서열 번호: 49) SRGIEVEEFGA
(서열 번호: 87)
269B005 126 164 INVMA
(서열 번호: 12)		 AVTRDGRKSCGDSVKG (서열 번호: 50) DGWGATTLDYTYGMDY
(서열 번호: 88)
269B023 127 165 TFTMG
(서열 번호: 13)		 SITWDGRSAYYAESVKG (서열 번호: 51) DRKSVMSIRPDY
(서열 번호: 89)
269B024 128 166 INAMG
(서열 번호: 14)		 TITRGGSTNYGPSVKG (서열 번호: 52) ERLDGSGYGYEYDY
(서열 번호: 90)
269B028 129 167 KNTVA
(서열 번호: 15)		 SITCDGRTTYYANSVNG (서열 번호: 53) YRKSIMSIQPDY
(서열 번호: 91)
269B030 130 168 SIVMG
(서열 번호: 16)		 AIMWNDGLTYLQGSVKG (서열 번호: 54) DRKSVMSIRPDY
(서열 번호: 92)
269B038 131 169 TFTMG
(서열 번호: 17)		 AISLSPTLAYYAESVKG (서열 번호: 55) RRIDAADFDS
(서열 번호: 93)
269B054 132 170 KNTVA
(서열 번호: 18)		 SITWDGRTTYYADSVKG (서열 번호: 56) LGKWPAGPADY
(서열 번호: 94)
269B059 133 171 INTMD
(서열 번호: 19)		 AISLSPTLAYYAESVKG (서열 번호: 57) DRKSVMSIRPDY
(서열 번호: 95)
269B060 134 172 KNTVA
(서열 번호: 20)		 SITCDGRTTYYANSVKG (서열 번호: 58) LGKWPAGSADY
(서열 번호: 96)
269B069 135 173 DYWMH
(서열 번호: 21)		 SIDTSGQTTYYADSLKG (서열 번호: 59) RYRGGTWYGMAN
(서열 번호: 97)
269B074 136 174 SNTMA
(서열 번호: 22)		 STTWNGRSTYYADSVKG (서열 번호: 60) LGKWPAGPADY
(서열 번호: 98)
269B076 137 175 TFTMG
(서열 번호: 23)		 DISGGRTNYADSVKG (서열 번호: 61) DRKSVMSIRPDY
(서열 번호: 99)
269B079 138 176 VAAISL
(서열 번호: 24)		 FTISRDNAKNTVVLQMNSLKP (서열 번호: 62) DRKSVMSIRPDY
(서열 번호: 100)
269B083 139 177 KNTVA
(서열 번호: 25)		 SITWDGRTTYYADSVKG (서열 번호: 63) TASCHLFGLGSGAFVS
(서열 번호: 101)
269B085 140 178 TFTMG
(서열 번호: 26)		 AISLSPTLAYYAESVKG (서열 번호: 64) SKDRYSEYEY
(서열 번호: 102)
269B093 141 179 TFTMG
(서열 번호: 27)		 AISLSPTLAYYAESVKGKG (서열 번호: 65) KNGGPVDY
(서열 번호: 103)
269B094 142 180 SIVMG
(서열 번호: 28)		 AIMWNDGITYLQDSVKG (서열 번호: 66) SKGRYSEYEY
(서열 번호: 104)
269B104 143 181 TFTMG
(서열 번호: 29)		 AINLSPTLTYYAESVKG (서열 번호: 67) ERKSVMAIPPDY
(서열 번호: 105)
269B109 144 182 TFTMG
(서열 번호: 30)		 SITLIPTFPYYAYSVKG (서열 번호: 68) YRKYLMSILPDY
(서열 번호: 106)
269B110 145 183 TFTMG
(서열 번호: 31)		 AISLSPTLAYYAESVKG (서열 번호: 69) NRNSQRVIAALSWIGMNY
(서열 번호: 107)
269B113 146 184 TFTMG
(서열 번호: 32)		 AISLSPTLAYYAESVKG (서열 번호: 70) RRIDAADFDS
(서열 번호: 108)
269B126 147 185 TFTMG
(서열 번호: 33)		 VIGWRDINASYADSVKG (서열 번호: 71) RRIDATDFDS
(서열 번호: 109)
269B129 148 186 NHVMG
(서열 번호: 34)		 VIGWRDISTSYADSVKG (서열 번호: 72) RRIDAADFDS
(서열 번호: 110)
269B131 149 187 NYILA
(서열 번호: 35)		 HISRSGGKSGYGDSVKG (서열 번호: 73) PLWYGSPTLIDY
(서열 번호: 111)
269B135 150 188 TFTMG
(서열 번호: 36)		 AISLSPTLAYYAESVKG (서열 번호: 74) DRKSVMSIRPDY
(서열 번호: 112)
269B136 151 189 TFTMG
(서열 번호: 37)		 AISLSPTLAYYAEPVKG (서열 번호: 75) DRKSVMSIRPDY
(서열 번호: 113)
269B139 152 190 NNFVMG
(서열 번호: 38)		 AISLSPTLAYYVESVKG (서열 번호: 76) DRKSVMSIRPDY
(서열 번호: 114)
CD269로서 또한 알려져 있는 B 세포 성숙 항원 (BCMA)은 종양 괴사 인자 수용체 상과, 다시 말하면, TNFRSF17의 구성원이다 (Thompson et al., J. Exp. Medicine, 192 (1):129-135, 2000). 인간 BCMA는 형질 세포 및 다발성 골수종 세포에서 거의 배타적으로 발현된다 (가령, Novak et al., Blood, 103(2): 689-694, 2004; Neri et al., Clinical Cancer Research, 73(19):5903-5909; Felix et al., Mol. Oncology, 9(7):1348-58, 2015를 참조한다). BCMA는 B-세포 활성화 인자 (BAFF) 및 증식 유도 리간드 (APRIL)에 결합할 수 있다 (가령, Mackay et al., 2003 및 Kalled et al., Immunological Review, 204: 43-54, 2005). BCMA는 다발성 골수종에 대한 면역치료적 작용제를 위한 적합한 종양 항원 표적일 수 있다. 높은 친화성의 항체는 BCMA 및 이의 선천적 리간드 BAFF와 APRIL 사이에 결합을 차단할 수 있다. 항-BCMA sdAbs는 예로서, 종양 세포에 대한 세포독성 효과를 증강하기 위해, CAR-T 세포를 이용한 세포 면역요법과 조합으로 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 서열 번호: 115의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 116의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 117의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 118의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 119의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 120의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 121의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 122의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 123의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 124의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 125의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 126의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 127의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 128의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 129의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 130의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 131의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 132의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 133의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 134의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 135의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 136의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 137의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 138의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 139의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 140의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 141의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 142의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 143의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 144의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 145의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 146의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 147의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 148의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 149의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 150의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 151의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 152의 아미노산 서열의 1개, 2개, 또는 3개 CDRs 전부를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 낙타이다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 인간화된다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들면, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 1-38에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 39-76에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 77-114에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 또는 3개 CDRs 모두를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 낙타이다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 인간화된다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들면, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 1-38에서 선택되는 아미노산 서열에 최소한 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성 중에서 한 가지를 갖는 CDR1; (b) 서열 번호: 39-76에서 선택되는 아미노산 서열에 최소한 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성 중에서 한 가지를 갖는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 77-114에서 선택되는 아미노산 서열에 최소한 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성 중에서 한 가지를 갖는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 최소한 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 중에서 한 가지를 갖는 CDR은 참고 서열에 비하여 치환 (가령, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항-BCMA sdAb는 BCMA에 결합하는 능력을 유지한다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호:1-38에서 선택되는 아미노산 서열에 약 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 치환), 삽입 또는 결실 중에서 한 가지를 갖는 CDR1; (b) 서열 번호:39-76에서 선택되는 아미노산 서열에 약 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 치환), 삽입 또는 결실 중에서 한 가지를 갖는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 77-114에서 선택되는 아미노산 서열에 약 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환 (가령, 보존성 치환), 삽입, 또는 결실 중에서 한 가지를 갖는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 친화성 성숙된다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 낙타이다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 인간화된다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들면, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 82의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 57의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 96의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 102의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 105의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 106의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 107의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 108의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 110의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 112의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, (a) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열 번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 번호: 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 3개 CDRs를 포함하는 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 낙타이다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 인간화된다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들면, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 구체예에서, 앞서 설명된 구체예 중에서 한 가지를 포함하는 항-BCMA sdAb (다시 말하면, 특정한 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 포함하는 항-BCMA sdAb)는 서열 번호: 115-152에서 선택되는 아미노산 서열에 최소한 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성 중에서 한 가지를 갖는 VHH 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 최소한 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 중에서 한 가지를 갖는 VHH 서열은 참고 서열에 비하여 치환 (가령, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항-BCMA sdAb는 BCMA에 결합하는 능력을 유지한다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 115-152에서 선택되는 아미노산 서열에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일부 구체예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDRs 외측의 영역에서 (다시 말하면, FRs에서) 발생한다. 임의선택적으로, 항-BCMA sdAb는 번역후 변형을 포함하는, 서열 번호: 115-152에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 서열 번호: 115-152로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-BCMA sdAb가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 115-152로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다.
일부 구체예에서, 기능적 에피토프는 조합 알라닌 스캐닝에 의해 지도화될 수 있다. 이러한 과정에서, 조합 알라닌-스캐닝 전략은 항-BCMA sdAbs와의 상호작용에 필요한, BCMA 단백질 내에 아미노산을 확인하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 에피토프는 입체형태적이고, 그리고 BCMA에 결합된 항-BCMA sdAbs의 결정 구조가 에피토프를 확인하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 출원은 서열 번호: 388-394로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로부터 유래된 BCMA의 에피토프를 제공한다. 일부 구체예에서, 본 출원은 서열 번호: 388-394로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 BCMA의 에피토프를 제공한다.
일부 구체예에서, 본 출원은 BCMA에 결합에 대해 본원에서 설명된 항-BCMA sdAbs 중에서 한 가지와 경쟁하는 항체를 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 BCMA 상에서 에피토프에 결합에 대해 본원에서 제공된 항-BCMA sdAbs와 경쟁하는 항체를 제공한다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 115-152로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA sdAb와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 115-152로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA sdAb와 경쟁적으로 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.
일부 구체예에서, 경쟁 검정이 BCMA에 결합에 대해 본원에서 설명된 항-BCMA sdAb와 경쟁하는 단일클론 항체를 확인하는데 이용될 수 있다. 경쟁 검정은 2개의 항체가 동일한 또는 입체적으로 중복 에피토프를 인식함으로써 동일한 에피토프에 결합하는 지, 또는 하나의 항체가 항원에 대한 다른 항체의 결합을 경쟁적으로 저해하는 지를 결정하는데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이런 경쟁 항체는 본원에서 설명된 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프 (가령, 서열 번호: 388-394로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로부터 유래된 BCMA 에피토프)에 결합한다. 예시적인 경쟁 검정은 일과적인 검정, 예를 들면, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)에서 제공된 것들을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 항체가 결합하는 에피토프를 지도화하기 위한 상술된 예시적인 방법은 Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, N.J.)에서 제공된다. 일부 구체예에서, 2개의 항체는 각각이 다른 것의 결합을 50% 또는 그 이상 차단하면, 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 일컬어진다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 항-BCMA sdAb와 경쟁하는 항체는 낙타, 키메라, 인간화 또는 인간 항체이다. 일부 구체예에서, 본 출원은 본원에서 설명된 바와 같은 낙타, 키메라, 인간화, 또는 인간 항-BCMA sdAb와 경쟁하는 항체를 제공한다.
일부 구체예에서, 앞서 설명된 항-BCMA sdAbs 중에서 한 가지를 포함하는 항-BCMA 항체 또는 항원 결합 단백질이 제공된다. 일부 구체예에서, 항-BCMA 항체는 낙타, 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 비롯한 단일클론 항체이다. 일부 구체예에서, 항-BCMA 항체는 항체 단편, 예를 들면, VHH 단편이다. 일부 구체예에서, 항-BCMA 항체는 임의의 항체 부류 또는 아이소타입, 예를 들면, IgG1 또는 IgG4의 Fc 영역을 포함하는 전장 중쇄 단독 항체이다. 일부 구체예에서, Fc 영역은 감소되거나 또는 최소화된 작동체 기능을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 구체예 중에서 한 가지에 따른 항-BCMA 항체 (가령, 항-BCMA sdAbs체) 또는 항원 결합 단백질은 아래의 "항체의 특질"의 섹션 1-7에서 설명된 바와 같이, 임의의 특질을 단독적으로 또는 조합으로 통합할 수 있다.
일부 구체예에서, 앞서 설명된 항-BCMA 항체 (가령, 항-BCMA sdAbs) 중에서 한 가지를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAbs를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공되고, 여기서 상기 핵산은 서열 번호: 153-190으로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열에 최소한 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성 중에서 한 가지를 갖는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 153-190으로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 구체예에서, 이런 핵산을 포함하는 벡터 (가령, 발현 벡터)가 제공된다. 일부 구체예에서, 이런 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 일부 구체예에서, 항-BCMA 항체를 만드는 방법이 제공되고, 여기서 상기 방법은 상기에 제시된 바와 같이, 항-BCMA 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항-BCMA 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 그리고 임의선택적으로, 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항-BCMA 항체를 회수하는 것을 포함한다.
항체의 특질
1. 항체 친화성
일부 구체예에서, 본원에서 제공된 항-BCMA 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (가령, 10-8 M 또는 그 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다.
일부 구체예에서, Kd는 다음의 검정에 의해 설명된 바와 같이, 관심되는 항체의 Fab 이형 또는 VHH 단편 및 이의 항원으로 수행된 방사성표지화된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 계측된다. 가령, 항원에 대한 Fabs의 용해 결합 친화성은 표지화되지 않은 항원의 적정 시리즈의 존재에서 Fab를 최소 농도의 (125I)-표지된 항원과 평형시키고, 이후 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 평판으로 포획함으로써 계측된다 (가령, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)을 참조한다).
일부 구체예에서, Kd는 ~10 반응 단위 (RU)에서 고정된 항원 CM5 칩으로 25℃에서 BIACORE®-2000 또는 BIACORE ®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 이용한 표면 플라스몬 공명 검정을 이용하여 계측된다. 간단히 말하면, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIACORE, Inc.)은 공급업체의 사용설명서에 따라 N-에틸-N'- (3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화된다. 항원은 거의 10 반응 단위 (RU)의 연계된 단백질을 달성하기 위해, 5 μl/분의 유속에서 주입 전에 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.8로 5 μg/ml (~0.2 μM)까지 희석된다. 항원의 주입 이후에, 반응하지 않은 기를 차단하기 위해 1 M 에탄올아민이 주입된다. 동역학 계측을 위해, 관심되는 항체의 Fab 또는 VHH의 2-배 연속 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)이 거의 25 μl/분의 유속에서 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20TM) 계면활성제 (PBST)를 포함하는 PBS에 주입된다. 연관률 (k온) 및 해리율 (k오프)은 연관 및 해리 센서그램을 동시에 적합시킴으로써 단순한 1 대 1 랭뮤어 결합 모형 (BIACORE ® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 계산된다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비율 k오프/k온으로서 계산된다. 가령, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)을 참조한다. 온 레이트가 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 106 M-1 s-1를 초과하면, 온 레이트는 분광계, 예를 들면, 정지-유동 구비된 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳이 달린 8000-시리즈 SLM-AMINCO TM 분광광도계 (ThermoSpectronic)에서 계측될 때 증가하는 농도의 항원의 존재에서 PBS, pH 7.2에서, 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역)의 증가 또는 감소를 계측하는 형광 퀀칭 기술을 이용함으로써 결정될 수 있다.
2. 항체 단편
일부 구체예에서, 본원에서 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, VHH, 그리고 아래에 설명된 다른 단편을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 항체 단편의 리뷰를 위해, Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)를 참조한다. ScFv 단편의 리뷰를 위해, 예로서 Pluckth
Figure 112019006570822-pct00006
n, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)를 참조한다; 또한, WO 93/16185; 및 U.S. 특허 번호 5,571,894와 5,587,458을 참조한다. 구제 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의를 위해, U.S. 특허 번호 5,869,046을 참조한다.
디아바디는 이가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 가령, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디 역시 Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)에서 설명된다.
항체 단편은 본원에서 설명된 바와 같이, 무손상 항체의 단백질분해 소화뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (가령 대장균 (E. coli) 또는 파지)에 의한 생산을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있다.
3. 키메라 및 인간화 항체
일부 구체예에서, 본원에서 제공된 항체는 키메라 항체이다. 일정한 키메라 항체는 예로서, U.S. 특허 번호 4,816,567; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))에서 설명된다. 한 가지 실례에서, 키메라 항체는 비인간 가변 영역 (가령, 낙타 종, 예를 들면, 라마로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 실례에서, 키메라 항체는 "클래스 전환된" 항체인데, 여기서 부류 또는 하위부류가 부모 항체의 것으로부터 변화되었다. 키메라 항체는 이들의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 구체예에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비인간 항체는 부모 비인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지하면서, 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVRs, 예를 들면, CDRs (또는 이들의 부분)가 비인간 항체로부터 유래되고, 그리고 FRs (또는 이들의 부분)가 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 또는 그 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 임의선택적으로, 인간 불변 영역 중에서 최소한 일부를 또한 포함할 것이다. 일부 구체예에서, 인간화 항체에서 일부 FR 잔기는 예로서, 항체 특이성 또는 친화성을 복원하거나 또는 향상시키기 위해, 비인간 항체 (가령, HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 이들을 만드는 방법은 예로서, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에서 리뷰되고, 그리고 예로서, Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US 특허 번호 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321 및 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (SDR (a-CDR) 합체를 설명); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) ("표면치환"을 설명); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) ("FR 뒤섞음"을 설명); 그리고 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 뒤섞음에 대한 "보도된 선별" 접근법을 설명)에서 더욱 설명된다.
인간화에 이용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: "최고 적합" 방법을 이용하여 선별된 프레임워크 영역 (가령, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)을 참조한다); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위군의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (가령, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)을 참조한다); 인간 성숙 (체성으로 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역 (가령, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)을 참조한다); 및 선별검사 FR 라이브러리로부터 유래된 프레임워크 영역 (가령, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)을 참조한다).
일부 구체예에서, sdAbs는 항원에 대한 도메인의 선천적 친화성을 축소하지 않으면서, 그리고 이종성 종에 대한 이의 면역원성을 감소시키면서 변형된다, 예를 들면, 인간화된다. 가령, 라마 항체의 항체 가변 도메인 (VHH)의 아미노산 잔기가 결정될 수 있고, 그리고 예로서, 프레임워크 영역 내에 낙타 아미노산 중에서 하나 또는 그 이상이 전형적인 형질을 상실하는 폴리펩티드 없이, 인간 공통 서열에서 발견되는 바와 같은 그들의 인간 대응물에 의해 대체된다, 다시 말하면 인간화는 결과의 폴리펩티드의 항원 결합능에 유의미하게 영향을 주지 않는다. 낙타 sdAbs의 인간화는 단일 폴리펩티드 사슬에서 한정된 양의 아미노산의 도입 및 돌연변이유발을 필요로 한다. 이것은 2개의 사슬, 경쇄 및 중쇄에서 아미노산 변화의 도입 및 양쪽 사슬의 어셈블리의 보존을 필요로 하는 scFv, Fab', (Fab')2 및 IgG의 인간화와 대조적이다.
VHH 도메인을 포함하는 단일-도메인 항체는 인간-유사 서열을 갖도록 인간화될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에서 이용되는 VHH 도메인의 FR 영역은 인간 VH 프레임워크 영역에 최소한 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상의 아미노산 서열 상동성 중에서 한 가지를 포함한다. 인간화 VHH 도메인의 한 가지 예시적인 부류는 VHHs가 Kabat 넘버링에 따라, 위치 45에서 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 또는 글루타민으로 구성된 군으로부터 아미노산, 예를 들면, 예로서, L45 및 위치 103에서 트립토판을 보유하는 것으로 특징화된다. 따라서, 이러한 부류에 속하는 폴리펩티드는 인간 VH 프레임워크 영역에 높은 아미노산 서열 상동성을 보여주고, 그리고 상기 폴리펩티드는 그것으로부터 원치 않는 면역 반응의 예상 없이, 그리고 추가 인간화의 부담 없이, 인간에게 직접적으로 투여될 수 있을지도 모른다.
인간화 낙타 sdAbs의 다른 예시적인 부류는 WO 03/035694에서 설명되었고, 그리고 인간 기원의 또는 다른 종으로부터 전통적인 항체에서 전형적으로 발견되는 소수성 FR2 잔기를 내포하지만, 친수성에서 이러한 상실을 이중-사슬 항체로부터 VH 내에 존재하는 보존된 트립토판 잔기를 대체하는 위치 103에서 하전된 아르기닌 잔기에 의해 보완한다. 따라서, 이들 두 부류에 속하는 펩티드는 인간 VH 프레임워크 영역에 높은 아미노산 서열 상동성을 보여주고, 그리고 상기 펩티드는 그것으로부터 원치 않는 면역 반응의 예상 없이, 그리고 추가 인간화의 부담 없이, 인간에게 직접적으로 투여될 수 있을지도 모른다.
4. 인간 항체
일부 구체예에서, 본원에서 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당해 분야에서 공지된 다양한 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)에서 전반적으로 설명된다. 완전 인간 sdAbs를 생산할 수 있는 유전자도입 생쥐 또는 쥐는 당해 분야에서 공지된다. 가령, US20090307787A1, U.S. 특허 번호 8,754,287, US20150289489A1, US20100122358A1, 그리고 WO2004049794를 참조한다.
인간 항체는 항원 공격에 대한 응답으로 무손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 포함하는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 유전자도입 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이런 동물은 전형적으로, 내인성 면역글로불린 좌위를 대체하거나, 또는 염색체외로 존재하거나 또는 동물의 염색체 내로 무작위로 통합되는 인간 면역글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 내포한다. 이런 유전자도입 생쥐에서, 내인성 면역글로불린 좌위는 일반적으로 비활성화된다. 유전자도입 동물로부터 인간 항체를 획득하기 위한 방법의 리뷰를 위해, Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)를 참조한다. 또한, 예로서, XENOMOUSETM 기술을 설명하는 U.S. 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584; HuMab® 기술을 설명하는 U.S. 특허 번호 5,770,429; K-M MOUSE® 기술을 설명하는 U.S. 특허 번호 7,041,870, 그리고 VelociMouse® 기술을 설명하는 U.S. 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900을 참조한다. 이런 동물에 의해 산출된 무손상 항체로부터 인간 가변 영역은 예로서, 상이한 인간 불변 영역과 조합함으로써 더욱 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한, 하이브리도마-기초된 방법에 의해 만들어질 수 있다. 인간 단일클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 생쥐-인간 헤테로골수종 세포주가 설명되었다. (가령, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)을 참조한다). 인간 B-세포 하이브리도마 기법을 통해 산출된 인간 항체 역시 Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)에서 설명된다. 추가 방법은 예로서, U.S. 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터 단일클론 인간 IgM 항체의 생산을 설명) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마를 설명)에서 설명된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기법 (트리오마 기술) 역시 Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에서 설명된다.
인간 항체는 또한, 인간-유래된 파지 전시 라이브러리에서 선택되는 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 산출될 수 있다. 이런 가변 도메인 서열은 이후, 원하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선별하기 위한 기술은 아래에 설명된다.
특정 항원 또는 표적을 향해 지향된 VHH 서열을 획득하기 위한 한 가지 기술은 중쇄 항체를 발현할 수 있는 유전자도입 포유동물을 적절하게 면역화하고 (즉, 상기 항원 또는 표적을 향해 지향된 면역 반응 및/또는 중쇄 항체를 조성하기 위해), 상기 VHH 서열을 내포하는 상기 유전자도입 포유동물 (이들 서열을 인코딩하는 핵산 서열)로부터 적합한 생물학적 표본 (가령, 혈액 표본, 혈청 표본 또는 B-세포의 표본)을 획득하고, 그리고 이후, 그 자체로 공지된 임의의 적합한 기술 (가령, 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지 또는 하이브리도마 기술)을 이용하여, 상기 표본으로부터 시작하여, 상기 항원 또는 표적을 향해 지향된 VHH 서열을 산출하는 것을 수반한다. 가령, 이런 목적으로, WO 02/085945, WO 04/049794 및 WO 06/008548, 그리고 Janssens et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006 Oct. 10; 103(41):15130-5에서 설명된 중쇄 항체-발현 생쥐 및 추가 방법과 기술이 이용될 수 있다. 가령, 이런 중쇄 항체 발현 생쥐는 임의의 적합한 (단일) 가변 도메인, 예를 들면, 자연 공급원으로부터 (단일) 가변 도메인 (가령, 인간 (단일) 가변 도메인, 낙타 (단일) 가변 도메인 또는 상어 (단일) 가변 도메인)뿐만 아니라 예로서, 합성 또는 반합성 (단일) 가변 도메인을 포함하는 중쇄 항체를 발현할 수 있다.
5. 라이브러리-유래된 항체
본 출원의 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 선별검사함으로써 단리될 수 있다. 가령, 파지 전시 라이브러리를 산출하고, 그리고 원하는 결합 특징을 소유하는 항체에 대해 이런 라이브러리를 선별검사하기 위한 다양한 방법이 당해 분야에서 공지된다. 이런 방법은 예로서, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)에서 리뷰되고, 그리고 예로서, McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)에서 더욱 설명된다. sdAb 라이브러리를 구축하기 위한 방법은 설명되었다, 예를 들면, U.S. 특허 번호 7371849를 참조한다.
일정한 파지 전시 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 별도로 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되는데, 이들 라이브러리는 이후, Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)에서 설명된 바와 같이 항원 결합 파지에 대해 선별검사될 수 있다. 파지는 전형적으로, 단일 사슬 Fv (scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 전시한다. 면역화된 공급원으로부터 라이브러리는 하이브리도마를 구축하는 요건 없이 면역원에 대한 높은 친화성 항체를 제공한다. 대안으로, 미경험 레퍼토리는 Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)에 의해 설명된 바와 같이, 면역화 없이 넓은 범위의 비자가 및 또한 자가 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공하도록 클로닝될 수 있다 (가령, 인간으로부터). 최종적으로, 미경험 라이브러리는 또한, Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)에 의해 설명된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고, 그리고 고도로 가변적 CDR3 영역을 인코딩하고 시험관내에서 재배열을 달성하기 위한 무작위 서열을 내포하는 PCR 프라이머를 이용함으로써 합성적으로 만들어질 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 설명하는 특허 공보는 예로서, US 특허 번호 5,750,373, 그리고 US 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 및 2009/0002360을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편인 것으로 고려된다.
6. 다중특이적 항체
일부 구체예에서, 본원에서 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들면, 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 최소한 2개의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 일부 구체예에서, 결합 특이성 중에서 하나는 CD19, CD20, BCMA 및 CD38로 구성된 군에서 선택되는 항원에 대한 것이고, 그리고 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 CD19, CD20, BCMA 및 CD38로 구성된 군에서 선택되는 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한, 세포독성 작용제를 CD19, CD20, BCMA 및 CD38로 구성된 군에서 선택되는 항원을 발현하는 세포로 국부화하는데 이용될 수 있다.
이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다. 다중특이적 항체를 만들기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동발현 (Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829 및 Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)를 참조한다), 그리고 "노브-인투-홀 (knob-into-hole)" 가공 (가령, U.S. 특허 번호 5,731,168을 참조한다)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 다중특이적 항체는 또한, 항체 Fc-이형이합체성 분자를 만들기 위해 정전 스티어링 효과를 가공하고 (WO 2009/089004A1); 2개 또는 그 이상의 항체 또는 단편을 교차연결하고 (가령, US 특허 번호 4,676,980 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)을 참조한다); 이중특이적 항체를 생산하기 위해 류신 지퍼를 이용하고 (가령, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)을 참조한다); 이중특이적 항체 단편을 만들기 위해 "디아바디" 기술을 이용하고 (가령, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)을 참조한다); 그리고 단일 사슬 Fv (sFv) 이합체를 이용하고 (가령, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)을 참조한다); 그리고 가령, Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)에서 설명된 바와 같이 삼중특이적 항체를 제조하고; 그리고 탠덤 단일-도메인 항체를 포함하는 폴리펩티드를 창출함으로써 (가령, U.S. 특허 출원 번호 20110028695; 및 Conrath et al. J. Biol. Chem., 2001; 276(10):7346-50을 참조한다) 만들어질 수 있다. "문어 항체"를 비롯하여, 3개 또는 그 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 가공된 항체 역시 본원에서 포함된다 (가령, US 2006/0025576A1을 참조한다).
7. 항체 변이체
일부 구체예에서, 본원에서 제시된 항체의 아미노산 서열 변이체가 예기된다. 가령, 상기 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질을 향상시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 상기 항체를 인코딩하는 핵산 서열 내로 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이런 변형은 예로서, 항체의 아미노산 서열로부터 결실 및/또는 이들 서열 내로 삽입 및/또는 이들 서열 내에 잔기의 치환을 포함한다. 최종 구조체가 원하는 특징, 예를 들면, 항원 결합을 소유한다면, 최종 구조체에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 만들어질 수 있다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환적 돌연변이유발을 위한 관심되는 부위는 HVRs 및 FRs를 포함한다. 보존성 치환은 "바람직한 치환"의 표제 하에 표 3에서 도시된다. 더욱 실제적인 변화는 "예시적인 치환"의 표제 하에 표 3에서 제공되고, 그리고 아미노산 측쇄 부류에 관하여 아래에 더욱 설명된다. 아미노산 치환은 관심되는 항체 내로 도입될 수 있고, 그리고 산물은 원하는 활성, 예를 들면, 유지된/향상된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 향상된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별검사될 수 있다.
표 3. 아미노산 치환
본래
잔기		 예시적인
치환		 바람직한
치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신 Leu
Leu (L) 노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신 Leu
아미노산은 통상적인 측쇄 성질에 따라 군화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향정위에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비보존성 치환은 이들 부류 중에서 한 가지의 구성원을 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환 변이체의 한 가지 유형은 부모 항체의 하나 또는 그 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다 (가령, 인간화 또는 인간 항체). 일반적으로, 추가 연구를 위해 선별된 결과의 변이체(들)는 부모 항체에 비하여 일정한 생물학적 성질 (가령, 증가된 친화성, 감소된 면역원성)에서 변형 (가령, 향상)을 가질 것이고 및/또는 부모 항체의 실제적으로 유지된 일정한 생물학적 성질을 가질 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화성 성숙된 항체인데, 이것은 예로서, 파지 전시-기초된 친화성 성숙 기술, 예를 들면, 본원에서 설명된 것들을 이용하여 편의하게 산출될 수 있다. 간단히 말하면, 하나 또는 그 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고, 그리고 변이체 항체는 파지에서 전시되고 특정 생물학적 활성 (가령, 결합 친화성)에 대해 선별검사된다.
변경 (가령, 치환)은 예로서, 항체 친화성을 향상시키기 위해 HVRs에서 만들어질 수 있다. 이런 변경은 HVR "핫스팟", 다시 말하면, 체성 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코딩된 잔기 (가령, Chowdhury, Meytods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)) 및/또는 SDRs (a-CDRs)에서 만들어질 수 있고, 결과의 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화성에 대해 시험된다. 이차 라이브러리를 구축하고 이들로부터 재선별함에 의한 친화성 성숙은 예로서, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))에서 설명되었다. 친화성 성숙의 일부 구체예에서, 다양성이 임의의 다양한 방법 (가령, 오류 가능성 PCR, 사슬 뒤섞음, 또는 올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이)에 의해, 성숙을 위해 선택된 가변적 유전자 내로 도입된다. 이차 라이브러리가 이후 창출된다. 상기 라이브러리는 이후, 원하는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 선별검사된다. 다양성을 도입하는 다른 방법은 HVR-지향된 접근법을 수반하는데, 여기서 여러 HVR 잔기 (가령, 한 번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관련된 HVR 잔기는 예로서, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모형화를 이용하여 특이적으로 확인될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
일부 구체예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이런 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실제적으로 감소시키지 않으면, 하나 또는 그 이상의 HVRs 내에서 일어날 수 있다. 가령, 결합 친화성을 실제적으로 감소시키지 않는 보존성 변경 (가령, 본원에서 제시된 바와 같은 보존성 치환)이 HVRs에서 만들어질 수 있다. 이런 변경은 HVR "핫스팟" 또는 CDRs의 외측일 수 있다. 앞서 제공된 변이체 VHH 서열의 일부 구체예에서, 각 HVR은 변경되지 않거나, 또는 단지 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 내포한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인을 위한 유용한 방법은 Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에 의해 설명된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 이러한 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 군 (가령, 하전된 잔기, 예를 들면, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu)이 확인되고, 그리고 항체의 항원과의 상호작용이 영향을 받는 지를 결정하기 위해 중성 또는 음성으로 하전된 아미노산 (가령, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체된다. 추가 치환은 초기 치환에 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치에서 도입될 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, 항체 및 항원 사이에 접촉 포인트를 확인하기 위한 항원 항체 복합체의 결정 구조. 이런 접촉 잔기 및 인접한 잔기는 표적화되거나 또는 치환의 후보로서 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 원하는 성질을 내포하는 지를 결정하기 위해 선별검사될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개 잔기로부터 100개 또는 그 이상의 잔기를 내포하는 폴리펩티드까지의 길이 범위에서 변하는 아미노- 및/또는 카르복실 말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 복수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 실례는 N 말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 (가령, ADEPT에 대한) 또는 폴리펩티드에 대한 항체의 N- 또는 C 말단에 융합을 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
일부 구체예에서, 본원에서 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 또는 감소시키기 위해 변경된다. 항체에 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 또는 그 이상의 글리코실화 부위가 창출되거나 또는 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편의하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우에, 거기에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생산된 선천적 항체는 전형적으로, Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-연쇄에 의해 일반적으로 부착되는 분지된, 바이안테너리 올리고당류를 포함한다. 가령, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)를 참조한다. 올리고당류는 다양한 탄수화물, 예를 들면, 만노오스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토오스 및 시알산뿐만 아니라 바이안테너리 올리고당류 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸코오스를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 출원의 항체에서 올리고당류의 변형은 일정한 향상된 성질을 갖는 항체 변이체를 창출하기 위해 만들어질 수 있다.
일부 구체예에서, Fc 영역에 부착된 (직접적으로 또는 간접적으로) 푸코오스를 결여하는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 가령, 이런 항체에서 푸코오스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코오스의 양은 예로서, WO 2008/077546에서 설명된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해 계측될 때, Asn 297에 부착된 모든 당구조의 총합 (가령, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노오스 구조)에 비하여, Asn297에서 당 사슬 내에 푸코오스의 평균량을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역 내에 대략 위치 297 (Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에서 위치된 아스파라긴 잔기를 지칭한다; 하지만, Asn297은 또한, 항체에서 경미한 서열 변이로 인해, 위치 297의 대략 ± 3 아미노산 상류 또는 하류에, 다시 말하면, 위치 294 및 300 사이에 위치될 수 있다. 이런 푸코실화 변이체는 향상된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 가령, US 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)을 참조한다. "탈푸코실화된" 또는 "푸코오스-결함성" 항체 변이체에 관련된 간행물의 실례는 다음을 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). 탈푸코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 실례는 단백질 푸코실화에서 결함성인 Lec13 CHO 세포 (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1, Presta, L; 및 WO 2004/056312 A1, Adams et al., 특히 실시예 11), 그리고 녹아웃 세포주, 예를 들면, 알파-1,6-푸코실전달효소 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (가령, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO2003/085107을 참조한다)를 포함한다.
항체 변이체는 예로서, 양분된 올리고당류가 더욱 제공되는데, 여기서 항체의 Fc 영역에 부착된 바이안테너리 올리고당류는 GlcNAc에 의해 양분된다. 이런 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 향상된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이런 항체 변이체의 실례는 예로서, WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); US 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에서 설명된다. Fc 영역에 부착된 올리고당류 내에 최소한 하나의 갈락토오스 잔기를 갖는 항체 변이체 역시 제공된다. 이런 항체 변이체는 향상된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이런 항체 변이체는 예로서, WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에서 설명된다.
c) Fc 영역 변이체
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형이 본원에서 제공된 항체의 Fc 영역 내로 도입되고, 따라서 Fc 영역 변이체가 산출될 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (가령, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (가령, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 출원은 전부는 아니지만 일부 작동체 기능을 소유하는 항체 변이체를 예기하는데, 이들 기능으로 인해 이것은 생체내에서 항체의 반감기가 중요하고, 반면 일정한 작동체 기능 (가령, 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 또는 유해한 적용을 위한 바람직한 후보가 된다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확증하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정이 수행될 수 있다. 가령, 항체가 FcγR 결합을 결여 (따라서, ADCC 활성을 아마도 결여)하지만, FcRn 결합 능력을 유지하도록 담보하기 위해, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정이 수행될 수 있다. ADCC를 매개하기 위한 일차 세포, NK 세포는 Fc(RIII만을 발현하고, 반면 단핵구는 Fc(RI, Fc(RII 및 Fc(RIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)의 464 페이지의 표 3에서 요약된다. 관심되는 분자의 ADCC 활성을 사정하기 위한 시험관내 검정의 무제한적 실례는 U.S. 특허 번호 5,500,362 (가령, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)을 참조한다) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)을 참조한다)에서 설명된다. 대안으로, 비방사성 검정 방법이 이용될 수 있다 (가령, 유세포분석법의 경우에 ACTI™ 비방사성 세포독성 검정 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; 및 CytoTox 96® 비방사성 세포독성 검정 (Promega, Madison, WI)을 참조한다. 이런 검정을 위한 유용한 작동체 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안으로, 또는 부가적으로, 관심되는 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들면, 동물 모형, 예를 들면, Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)에서 개시된 것에서 사정될 수 있다. 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성을 결여한다는 것을 확증하기 위해, C1q 결합 검정 또한 실행될 수 있다. 가령, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서 C1q와 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 사정하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다 (가령, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)을 참조한다). FcRn 결합 및 생체내 소실/반감기 결정이 또한, 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다 (가령, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)를 참조한다).
감소된 작동체 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중에서 하나 또는 그 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다 (U.S. 특허 번호 6,737,056). 이런 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 이른바 "DANA" Fc 돌연변이체를 비롯하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중에서 2개 또는 그 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다 (US 특허 번호 7,332,581).
FcRs에 향상된 또는 축소된 결합을 갖는 일정한 항체 변이체가 설명된다. (가령, U.S. 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)를 참조한다).
일부 구체예에서, 항체 변이체는 ADCC를 향상시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 예를 들면, Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 예로서 US 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642 및 Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)에서 설명된 바와 같이, 변경된 (다시 말하면, 향상된 또는 축소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 유발하는 Fc 영역에서 변경이 만들어진다.
증가된 반감기, 그리고 태아에 모계 IgGs의 전달을 책임지는 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 향상된 결합을 갖는 항체 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))는 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에서 설명된다. 이들 항체는 FcRn에 Fc 영역의 결합을 향상시키는, 그 안에 하나 또는 그 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이런 Fc 변이체는 다음의 Fc 영역 잔기 중에서 하나 또는 그 이상에서 치환: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434, 예를 들면, Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것들을 포함한다 (US 특허 번호 7,371,826).
Fc 영역 변이체의 다른 실례와 관련하여, Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); U.S. 특허 번호 5,648,260; U.S. 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351을 또한 참조한다.
d) 시스테인 가공된 항체 변이체
일부 구체예에서, 시스테인 가공된 항체, 예를 들면, "thioMAbs"를 창출하는 것이 바람직할 수 있는데, 여기서 항체의 하나 또는 그 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된다. 특정한 구체예에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 발생한다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올 기는 따라서, 항체의 접근가능한 부위에서 위치되고, 그리고 항체를 다른 모이어티, 예를 들면, 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합하여 본원에서 더욱 설명된 바와 같은 면역접합체를 창출하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 다음의 잔기 중에서 한 가지 또는 그 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 가공된 항체는 예로서, U.S. 특허 번호 7,521,541에서 설명된 바와 같이 산출될 수 있다.
e) 항체 유도체
일부 구체예에서, 본원에서 제공된 항체는 당해 분야에서 공지되고 쉽게 가용한 추가 비단백질성 모이어티를 내포하도록 더욱 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 수용성 중합체의 무제한적 실례는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종중합체 또는 무작위 공중합체), 그리고 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 프롤릴프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (가령, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 그리고 이들의 혼합물을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서 안정성으로 인해, 제조 시에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 그리고 분지되거나 또는 분지되지 않을 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 숫자는 변할 수 있고, 그리고 하나 이상의 중합체가 부착되면, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 이용되는 중합체의 숫자 및/또는 유형은 향상되는 항체의 특정 성질 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건 하에 요법에서 이용될 것인지의 여부 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 고려 사항에 근거하여 결정될 수 있다.
일부 구체예에서, 방사선에 노출에 의해 선별적으로 가열될 수 있는 항체 및 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 일부 구체예에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 그리고 일상적인 세포를 훼손하지 않지만 비단백질성 모이어티를 항체-비단백질성 모이어티의 근위에 세포가 사멸되는 온도까지 가열하는 파장을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
제조 방법
본원에서 설명된 항체 (가령, sdAbs)는 당해 분야에서 공지된 또는 본원에서 설명된 바와 같은 임의의 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
sdAbs를 제조하는 방법은 설명되었다. 가령, Els Pardon et al, Nature Protocol, 2014; 9(3): 674를 참조한다. 단일-도메인 항체 (가령, VHHs)는 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여, 예를 들면, 낙타 종 (가령, 낙타 또는 라마)를 면역화하고 그것으로부터 하이브리도마를 획득함으로써, 또는 당해 분야에서 공지된 분자생물학 기술을 이용하여 sdAbs의 라이브러리를 클로닝하고 비선택된 라이브러리의 개별 클론으로 ELISA에 의해 차후 선별함으로써, 또는 파지 전시를 이용함으로써 획득될 수 있다.
sdAbs의 재조합 생산을 위해, sdAbs를 인코딩하는 핵산은 단리되고, 그리고 추가 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입된다. sdAb를 인코딩하는 DNA는 전통적인 절차를 이용하여 (가령, 항체의 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써) 쉽게 단리되거나 또는 염기서열결정된다. 많은 벡터가 가용하다. 벡터의 선택은 이용되는 숙주 세포에 부분적으로 의존한다. 일반적으로, 바람직한 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 (일반적으로 포유류) 기원이다.
1. 다중클론 항체
다중클론 항체는 일반적으로, 유관한 항원 및 어쥬번트의 복수 피하 (sc) 또는 복막내 (ip) 주사에 의해 동물에서 조성된다. 이것은 이중기능성 또는 유도체화 작용제, 예를 들면, 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통해), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기서 R과 R1은 독립적으로 저급 알킬 기이다)를 이용하여, 면역화되는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들면, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 콩 트립신 저해제에 유관한 항원을 접합하는데 유용할 수 있다. 이용될 수 있는 어쥬번트의 실례는 프로인드 완전 어쥬번트 및 MPL-TDM 어쥬번트 (모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 디코리노미콜레이트)를 포함한다. 면역화 프로토콜은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 선별될 수 있다.
이들 동물은 100 μg 또는 5 μg의 단백질 또는 접합체 (각각, 토끼 또는 생쥐의 경우)를 3 부피의 프로인드 완전 어쥬번트와 조합하고 용액을 복수 부위에서 피내 주사함으로써, 항원, 면역원성 접합체, 또는 유도체에 대항하여 면역화된다. 1 개월 후, 이들 동물은 복수 부위에서 피하 주사에 의해 프로인드 완전 어쥬번트에서 펩티드 또는 접합체의 최초 양의 1/5 내지 1/10로 부양된다. 7 내지 14 일 후, 이들 동물은 채혈되고, 그리고 혈청은 항체 역가에 대해 검정된다. 동물은 역가가 안정 상태를 유지할 때까지 부양된다. 접합체는 또한, 재조합 세포 배양 동안 단백질 융합체로서 만들어질 수 있다. 또한, 응집 작용제, 예를 들면, 백반이 면역 반응을 증강하는데 적절하다.
2. 단일클론 항체
단일클론 항체는 실제적으로 균질한 항체의 개체군으로부터 획득된다, 다시 말하면, 상기 개체군을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생 돌연변이 및/또는 번역후 변형 (가령, 이성화, 아미드화)을 제외하고 동일하다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 구별된 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특징을 지시한다.
가령, 단일클론 항체는 Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)에 의해 최초 설명된 하이브리도마 방법을 이용하여 만들어질 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (U.S. 특허 번호 4,816,567)에 의해 만들어질 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 생쥐 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예를 들면, 햄스터는 면역화에 이용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 이끌어내기 위해 위에서 설명된 바와 같이 면역화된다. 대안으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 림프구는 이후, 하이브리도마 세포를 형성하기 위해, 적합한 융합 작용제, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 골수종 세포와 융합된다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986).
면역화 작용제는 전형적으로, 항원성 단백질 또는 이의 융합 변이체를 포함할 것이다. 일반적으로, 인간 기원의 세포가 요망되면 말초혈 림프구 ("PBLs")가 이용되고, 또는 비인간 포유류 공급원이 요망되면 비장 세포 또는 림프절 세포가 이용된다. 림프구는 이후, 하이브리도마 세포를 형성하기 위해, 적합한 융합 작용제, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 영속화된 세포주와 융합된다. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp. 59-103.
영속화된 세포주는 통상적으로 형질전환된 포유류 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 통상적으로, 쥐 또는 생쥐 골수종 세포주가 이용된다. 이렇게 제조된 하이브리도마 세포는 바람직하게는, 융합되지 않은, 부모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 하나 또는 그 이상의 물질을 내포하는 적합한 배양 배지에서 파종되고 성장된다. 가령, 부모 골수종 세포가 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 전달효소 (HGPRT 또는 HPRT)를 결여하면, 하이브리도마에 대한 배양 배지는 전형적으로, 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것인데, 이들 물질은 HGPRT-결함성 세포의 성장을 예방한다.
바람직한 영속화된 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선별된 항체 생산 세포에 의한 항체의 안정된 높은-수준 생산을 뒷받침하고, 그리고 배지, 예를 들면, HAT 배지에 민감한 것들이다. 이들 중에서, 뮤린 골수종 라인, 예를 들면, Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA로부터 가용한 MOPC-21 및 MPC-11 생쥐 종양, 그리고 American Type Culture Collection, Manassas, Va. USA로부터 가용한 SP-2 세포 (및 이들의 유도체, 예를 들면, X63-Ag8-653)로부터 유래된 것들이 바람직하다. 또한, 인간 단일클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 생쥐-인간 헤테로골수종 세포주가 설명되었다 (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 항원을 향해 지향된 단일클론 항체의 생산에 대해 검정된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역침전에 의해 또는 시험관내 결합 검정, 예를 들면, 방사면역검정 (RIA) 또는 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정된다.
하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지는 원하는 항원을 향해 지향된 단일클론 항체의 존재에 대해 검정될 수 있다. 바람직하게는, 단일클론 항체의 결합 친화성 및 특이성은 면역침전에 의해 또는 시험관내 결합 검정, 예를 들면, 방사면역검정 (RIA) 또는 효소-연결된 검정 (ELISA)에 의해 결정될 수 있다. 이런 기술 및 검정은 당해 분야에서 알려져 있다. 가령, 결합 친화성은 Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)의 스캐차드 분석에 의해 결정될 수 있다.
원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론은 제한 희석 절차에 의해 하위클로닝되고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다 (Goding, 위와 같음). 이런 목적으로 적합한 배양 배지는 예로서, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 이에 더하여, 하이브리도마 세포는 포유동물 내에 종양으로서 생체내에서 성장될 수 있다.
하위클론에 의해 분비된 단일클론 항체는 전통적인 면역글로불린 정제 절차, 예를 들면, 예로서, 단백질 A-세파로오스, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기이동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수 유체 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다.
단일클론 항체는 또한, 재조합 DNA 방법, 예를 들면, U.S. 특허 번호 4,816,567에서 설명된 것들에 의해, 그리고 앞서 설명된 바와 같이 만들어질 수 있다. 단일클론 항체를 인코딩하는 DNA는 전통적인 절차를 이용하여 (가령, 뮤린 항체의 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써) 쉽게 단리되거나 또는 염기서열결정된다. 하이브리도마 세포는 이런 DNA의 바람직한 공급원으로서 역할을 한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터 내로 배치될 수 있고, 이들 벡터는 이후, 이런 재조합 숙주 세포에서 단일클론 항체를 합성하기 위해, 숙주 세포, 예를 들면, 대장균 (E. coli) 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 만약 그렇지 않으면, 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포 내로 형질감염된다. 항체를 인코딩하는 DNA의 세균에서 재조합 발현에 관한 리뷰 논문은 Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) 및 Pliickthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992)을 포함한다.
추가 구체예에서, 항체는 McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)에서 설명된 기술을 이용하여 산출된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)은 각각, 파지 라이브러리를 이용한 뮤린 및 인간 항체의 단리를 설명한다. 차후 간행물은 사슬 뒤섞음에 의한 높은 친화성 (nM 범위) 인간 항체의 생산 (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992))뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합 (Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265-2266 (1993))을 설명한다. 따라서, 이들 기술은 단일클론 항체의 단리를 위한 전통적인 단일클론 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안이다.
DNA는 또한, 예로서 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄와 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 치환함으로써 (U.S. 특허 번호 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)), 또는 비면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 중에서 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유적으로 연결함으로써 변형될 수 있다. 전형적으로, 이런 비면역글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인을 대체하거나, 또는 이들은 항체의 한쪽 항원 결합 부위의 가변 도메인을 대체하여 한 항원에 대한 특이성을 갖는 항원 결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 다른 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 이가 항체를 창출한다.
본원에서 설명된 단일클론 항체는 일가일 수 있는데, 이의 제조는 당해 분야에서 널리 공지된다. 가령, 한 가지 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합 발현을 수반한다. 중쇄는 일반적으로, 중쇄 교차연결을 예방하기 위해 Fc 영역 내에 임의의 포인트에서 절두된다. 대안으로, 유관한 시스테인 잔기는 교차연결을 예방하기 위해 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 또는 결실될 수 있다. 시험관내 방법 역시 일가 항체를 제조하는데 적합하다. 단편, 특히 Fab 단편을 생산하기 위한 항체의 소화는 당해 분야에서 공지된 일과적인 기술을 이용하여 달성될 수 있다.
키메라 또는 하이브리드 항체는 또한, 교차연결 작용제를 필요로 하는 것들 비롯하여, 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 이용하여 시험관내에서 제조될 수 있다. 가령, 면역독소는 이황화물-교환 반응을 이용하여 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 작제될 수 있다. 이런 목적으로 적합한 시약의 실례는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트를 포함한다.
3. 원핵 세포에서 재조합 생산
a) 벡터 작제
본 출원의 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 표준 재조합 기술을 이용하여 획득될 수 있다. 원하는 폴리뉴클레오티드 서열은 항체 생산 세포, 예를 들면, 하이브리도마 세포로부터 단리되고 염기서열결정될 수 있다. 대안으로, 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 합성장치 또는 PCR 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 일단 획득되면, 폴리펩티드를 인코딩하는 서열은 원핵 숙주에서 이종성 폴리뉴클레오티드를 복제하고 발현할 수 있는 재조합 벡터 내로 삽입된다. 당해 분야에서 가용하고 공지된 많은 벡터가 본 발명의 목적에 이용될 수 있다. 적절한 벡터의 선별은 벡터 내로 삽입되는 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환되는 특정 숙주 세포에 주로 의존할 것이다. 각 벡터는 기능 (이종성 폴리뉴클레오티드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 모두) 및 이것이 체류하는 특정 숙주 세포와의 양립성에 따라 다양한 성분을 내포한다. 벡터 성분은 일반적으로, 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 복제 기점, 선별 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위 (RBS), 신호 서열, 이종성 핵산 삽입물 및 전사 종결 서열.
일반적으로, 숙주 세포와 양립성인 종으로부터 유래되는 레플리콘 및 제어 서열을 내포하는 플라스미드 벡터가 이들 숙주와 관련하여 이용된다. 벡터는 통상적으로, 복제 부위뿐만 아니라 형질전환된 세포에서 표현형 선별을 제공할 수 있는 표지 서열을 보유한다. 가령, 대장균 (E. coli)은 전형적으로, 대장균 (E. coli) 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322를 이용하여 형질전환된다. pBR322는 암피실린 (Amp) 및 테트라사이클린 (Tet) 내성을 인코딩하는 유전자를 내포하고, 그리고 따라서, 형질전환된 세포를 확인하기 위한 쉬운 수단을 제공한다. pBR322, 이의 유도체, 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 박테리오파지는 또한, 내인성 단백질의 발현을 위해 미생물 생물체에 의해 이용될 수 있는 프로모터를 내포하거나, 또는 내포하도록 변형될 수 있다. 특정 항체의 발현에 이용되는 pBR322 유도체의 실례는 Carter et al., U.S. 특허 번호 5,648,237에서 상세하게 설명된다.
이에 더하여, 숙주 미생물과 양립하는 레플리콘 및 제어 서열을 내포하는 파지 벡터는 이들 숙주와 관련하여 형질전환 벡터로서 이용될 수 있다. 가령, 박테리오파지, 예를 들면, GEM™-11은 감수성 숙주 세포, 예를 들면, 대장균 (E. coli) LE392를 변환하는데 이용될 수 있는 재조합 벡터를 만드는데 활용될 수 있다.
본 출원의 발현 벡터는 각각의 폴리펩티드 성분을 인코딩하는 2개 또는 그 이상의 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있다. 프로모터는 이의 발현을 조정하는 시스트론의 상류 (5′)에 위치된 번역되지 않는 조절 서열이다. 원핵 프로모터는 전형적으로, 2가지 부류, 유도성 및 구조성에 속한다. 유도성 프로모터는 배양 조건의 변화, 예를 들면, 영양소의 존재 또는 부재 또는 온도에서 변화에 대한 응답으로 자신의 제어 하에 증가된 수준의 시스트론의 전사를 개시하는 프로모터이다.
다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 널리 알려져 있다. 선별된 프로모터는 제한 효소 소화를 통해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고 단리된 프로모터 서열을 본 출원의 벡터 내로 삽입함으로써 경쇄 또는 중쇄를 인코딩하는 시스트론 DNA에 작동가능하게 연결될 수 있다. 선천적 프로모터 서열 및 많은 이종성 프로모터 둘 모두 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 주동하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 이종성 프로모터가 활용되는데, 그 이유는 이들이 일반적으로, 선천적 표적 폴리펩티드 프로모터와 비교하여, 발현된 표적 유전자의 더욱 큰 전사 및 더욱 높은 수율을 허용하기 때문이다.
원핵 숙주에서 이용하기 적합한 프로모터는 PhoA 프로모터, -갈락타마아제 및 락토오스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 및 하이브리드 프로모터, 예를 들면, tac 또는 trc 프로모터를 포함한다. 하지만, 세균에서 기능적인 다른 프로모터 (가령, 다른 공지된 세균 또는 파지 프로모터) 역시 적합하다. 이들의 핵산 서열은 공개되었고, 따라서 당업자가 임의의 필요한 제한 부위를 공급하기 위해 링커 또는 어댑터를 이용하여, 표적 경쇄와 중쇄를 인코딩하는 시스트론에 이들을 작동가능하게 결찰하는 것을 실시가능하게 한다 (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269).
한 양상에서, 재조합 벡터 내에 각 시스트론은 막을 교차하여, 발현된 폴리펩티드의 전위를 주동하는 분비 신호 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 또는 이것은 벡터 내로 삽입되는 표적 폴리펩티드 DNA의 일부분일 수 있다. 본 발명을 위해 선별된 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는 (다시 말하면, 신호 펩티드분해효소에 의해 개열되는) 것이어야 한다. 이종성 폴리펩티드에 선천적인 신호 서열을 인식하고 처리하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우에, 신호 서열은 예로서, 알칼리 인산분해효소, 페니실린분해효소, Ipp, 또는 열저항 장독소 II (STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 구성된 군에서 선택되는 원핵 신호 서열에 의해 치환된다. 본 출원의 일부 구체예에서, 발현 시스템의 양쪽 시스트론에서 이용되는 신호 서열은 STII 신호 서열 또는 이들의 변이체이다.
일부 구체예에서, 본 출원에 따른 항체의 생산은 숙주 세포의 세포질에서 일어날 수 있고, 그리고 이런 이유로, 각 시스트론 내에 분비 신호 서열의 존재를 필요로 하지 않는다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 성분, 예를 들면, 두 번째 항원 결합 부분에 임의선택적으로 융합된 첫 번째 항원 결합 부분의 VH 도메인을 인코딩하는 폴리펩티드 및 두 번째 항원 결합 부분에 임의선택적으로 융합된 첫 번째 항원 결합 부분의 VL 도메인을 인코딩하는 폴리펩티드는 발현되고, 접힘되고, 조립되어 세포질 내에 기능적 항체를 형성한다. 일정한 숙주 균주 (가령, 대장균 (E. coli) trxB- 균주)는 이황화 결합 형성에 우호적인 세포질 조건을 제공하고, 따라서 발현된 단백질 아단위의 적절한 접힘 및 어셈블리를 허용한다. Proba and Pluckthun Gene, 159:203 (1995).
본 발명은 발현된 폴리펩티드 성분의 정량적 비율이 본 출원의 분비되고 적절하게 조립된 항체의 수율을 최대화하기 위해 조정될 수 있는 발현 시스템을 제공한다. 이런 조정은 폴리펩티드 성분에 대한 번역 강도를 동시에 조정함으로써 최소되고 적절하게 조립된 항체의 수율을 최대화하기 위해 조정될 수 있는 발한 부분적으로 달성된다. 번역 강도를 조정하기 위한 한 가지 기술은 Simmons et al., U.S. 특허 번호 5,840,523에서 개시된다. 이것은 시스트론 내에 번역 개시 영역 (TIR)의 변이체를 활용한다. 소정의 TIR에 대해, 일련의 아미노산 또는 핵산 서열 변이체가 다양한 번역 강도에서 창출될 수 있고, 따라서 특정한 사슬의 원하는 발현 수준을 위해 이러한 인자를 조정하는 편의한 수단을 제공한다. TIR 변이체는 비록 핵산 서열에서 침묵 변화가 선호되긴 하지만, 아미노산 서열을 변경할 수 있는 코돈 변화를 유발하는 전통적인 돌연변이유발 기술에 의해 산출될 수 있다. TIR에서 변경은 신호 서열에서 변경과 함께, 예로서 샤인 달가노 서열의 숫자 또는 간격에서 변경을 포함할 수 있다. 돌연변이체 신호 서열을 산출하기 위한 한 가지 방법은 신호 서열의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 코딩 서열의 시작에서 "코돈 은행"의 산출이다 (다시 말하면, 변화는 침묵이다). 이것은 각 코돈의 세 번째 뉴클레오티드 위치를 변화시킴으로써 달성될 수 있다; 부가적으로, 일부 아미노산, 예를 들면, 류신, 세린 및 아르기닌은 상기 은행을 만드는데 복잡성을 부가할 수 있는 복수의 첫 번째와 두 번째 위치를 갖는다. 이러한 돌연변이유발 방법은 Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158에서 상세하게 설명된다.
바람직하게는, 한 세트의 벡터가 그 안에 각 시스트론에 대해 다양한 TIR 강도에서 산출된다. 이러한 한정된 세트는 각 사슬의 발현 수준뿐만 아니라 다양한 TIR 강도 조합 하에 원하는 단백질 산물의 수율의 비교를 제공한다. TIR 강도는 Simmons et al. U.S. 특허 번호 5,840,523에서 상세하게 설명된 바와 같이, 리포터 유전자의 발현 수준을 정량함으로써 결정될 수 있다. 번역 강도 비교에 근거하여, 원하는 개별 TIRs는 선별되고 본 출원의 발현 벡터 구조체에서 조합된다.
b) 원핵 숙주 세포.
본 출원의 항체를 발현하는데 적합한 원핵 숙주 세포는 원시세균 및 진정세균, 예를 들면, 그람 음성 또는 그람 양성 생물체를 포함한다. 유용한 세균의 실례는 에셰리키아 (Escherichia) (가령, 대장균 (E. coli)), 바실루스 (가령, 바실루스 서브틸리스 (B. subtilis)), 엔테로박테리아 (Enterobacteria), 슈도모나스 (Pseudomonas) 종 (가령, 녹농균 (P. aeruginosa)), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescans), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 시겔라 (Shigella), 리조비아 (Rhizobia), 비트레오스실라 (Vitreoscilla), 또는 파라코쿠스 (Paracoccus)를 포함한다. 일부 구체예에서, 그람 음성 세포가 이용된다. 일부 구체예에서, 대장균 (E. coli) 세포가 본 발명을 위한 숙주로서 이용된다. 대장균 (E. coli) 균주의 실례는 균주 W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC 기탁 번호 27,325), 그리고 유전자형 W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompT A(nmpc-fepE) degP41 kanR을 갖는 균주 33D3 (U.S. 특허 번호 5,639,635)을 비롯한 이의 유도체를 포함한다. 다른 균주 및 이들의 유도체, 예를 들면, 대장균 (E. coli) 294 (ATCC 31,446), 대장균 (E. coli) B, 대장균 (E. coli) 1776 (ATCC 31,537) 및 대장균 (E. coli) RV308(ATCC 31,608) 또한 적합하다. 이들 실례는 제한하기 보다는 예시이다. 규정된 유전자형을 갖는 전술한 세균 중에서 한 가지의 유도체를 구축하기 위한 방법은 당해 분야에서 공지되고, 그리고 예로서, Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)에서 설명된다. 세균의 세포에서 레플리콘의 복제가능성을 고려하여, 적절한 세균을 선별하는 것이 일반적으로 필요하다. 가령, 널리 공지된 플라스미드, 예를 들면, pBR322, pBR325, pACYC177, 또는 pKN410이 레플리콘을 공급하는데 이용될 때, 대장균 (E. coli), 세라티아 (Serratia), 또는 살모넬라 (Salmonella) 종이 숙주로서 적절하게 이용될 수 있다.
전형적으로, 숙주 세포는 최소 양의 단백질분해효소를 분비해야 하고, 그리고 추가 단백질분해효소 저해제가 바람직하게는 세포 배양액에 통합될 수 있다.
c) 단백질 생산
숙주 세포는 전술한 발현 벡터로 형질전환되고, 그리고 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 또는 원하는 서열을 인코딩하는 유전자를 증폭하는데 타당하면 변형된 전통적인 영양 배지에서 배양된다. 형질전환은 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 구성 부분에 의해 복제가능하도록, DNA를 원핵 숙주 내로 도입하는 것을 의미한다. 이용된 숙주 세포에 따라, 형질전환은 이런 세포에 타당한 표준 기술을 이용하여 행위된다. 염화칼슘을 이용한 칼슘 처리가 실제적인 세포-벽 장벽을 내포하는 세균 세포에 일반적으로 이용된다. 형질전환을 위한 다른 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 이용한다. 이용되는 또 다른 기술은 전기천공이다.
본 출원의 항체를 생산하는데 이용되는 원핵 세포는 당해 분야에서 공지되고 선별된 숙주 세포의 배양에 적합한 배지에서 성장된다. 적합한 배지의 실례는 루리아 액체배지 (LB) + 필요한 영양소 보충물을 포함한다. 일부 구체예에서, 배지는 또한, 발현 벡터를 내포하는 원핵 세포의 성장을 선별적으로 허용하기 위해, 발현 벡터의 구성에 근거하여 선택된 선별 작용제를 내포한다. 가령, 암피실린이 암피실린 내성 유전자를 발현하는 세포의 성장을 위해 배지에 첨가된다.
탄소, 질소 및 무기 인산염 공급원 이외에 임의의 필요한 보충물은 또한, 단독으로 또는 다른 보충물 또는 배지, 예를 들면, 복합 질소원과의 혼합물로서 도입된 적절한 농도에서 포함될 수 있다. 임의선택적으로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 환원제를 내포할 수 있다.
원핵 숙주 세포는 적합한 온도에서 배양된다. 대장균 (E. coli) 성장을 위해, 예로서, 바람직한 온도는 약 20℃ 내지 약 39℃, 더욱 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 37℃, 이보다 더욱 바람직하게는 약 30℃의 범위에 있다. 배지의 pH는 주로 숙주 생명체에 따라서, 약 5 내지 약 9의 범위에서 변하는 임의의 pH일 수 있다. 대장균 (E. coli)의 경우에, pH는 바람직하게는 약 6.8 내지 약 7.4, 그리고 더욱 바람직하게는 약 7.0이다.
유도성 프로모터가 본 출원의 발현 벡터에서 이용되면, 단백질 발현은 상기 프로모터의 활성화에 적합한 조건 하에 유도된다. 본 출원의 한 양상에서, PhoA 프로모터가 폴리펩티드의 전사를 제어하는데 이용된다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포는 유도를 위한 인산염-제한 배지에서 배양된다. 바람직하게는, 인산염-제한 배지는 C.R.A.P 배지이다 (가령, Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147을 참조한다). 당해 분야에서 공지된 바와 같이, 이용된 벡터 구조체에 따라, 다양한 다른 유도인자가 이용될 수 있다.
본 출원의 발현된 항체는 숙주 세포의 주변세포질 내로 분비되고 이로부터 회수된다. 단백질 회수는 전형적으로, 미생물을 일반적으로 삼투압 충격, 초음파처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 파괴하는 것을 수반한다. 일단 세포가 파괴되면, 세포 조직파편 또는 전체 세포가 원심분리 또는 여과에 의해 제거될 수 있다. 단백질은 예로서, 친화성 수지 크로마토그래피에 의해 더욱 정제될 수 있다. 대안으로, 단백질은 배양 배지 내로 수송되고 그 안에서 단리될 수 있다. 세포는 배양액으로부터 제거될 수 있고, 그리고 배양 상층액이 생산된 단백질의 추가 정제를 위해 여과되고 농축될 수 있다. 발현된 폴리펩티드는 더욱 단리되고, 그리고 통상적으로 공지된 방법, 예를 들면, 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 (PAGE) 및 웨스턴 블롯 검정을 이용하여 확인될 수 있다.
대안으로, 단백질 생산은 발효 과정에 의해 대량으로 수행된다. 다양한 대규모 유가식 발효 절차가 재조합 단백질의 생산에 가용하다. 대규모 발효는 최소한 1000 리터의 용량, 바람직하게는 약 1,000 내지 100,000 리터의 용량을 갖는다. 이들 발효기는 산소 및 영양소, 특히 글루코오스 (바람직한 탄소/에너지 공급원)를 분배하기 위해 혼합기 임펠러를 이용한다. 소규모 발효는 일반적으로, 체적 용량에서 거의 100 리터 이내이고, 그리고 약 1 리터 내지 약 100 리터의 범위에서 변할 수 있는 발효기에서 발효를 지칭한다.
발효 과정 동안, 단백질 발현의 유도는 전형적으로, 세포가 적합한 조건 하에 원하는 밀도, 예를 들면, 약 180-220의 OD550까지 성장된 후 시작되는데, 이 시기에 세포는 초기 정지기에 있다. 당해 분야에서 공지되고 앞서 설명된 바와 같이, 이용된 벡터 구조체에 따라, 다양한 유도인자가 이용될 수 있다. 세포는 유도에 앞서 더욱 짧은 기간 동안 성장될 수 있다. 세포는 비록 더욱 긴 또는 더욱 짧은 유도 시간이 이용될 수 있긴 하지만, 통상적으로 약 12-50 시간 동안 유도된다.
본 출원의 항체의 생산 수율 및 품질을 향상시키기 위해, 다양한 발효 조건이 변형될 수 있다. 가령, 분비된 폴리펩티드의 적절한 어셈블리 및 접힘을 향상시키기 위해, 샤프롱 단백질, 예를 들면, Dsb 단백질 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 및 또는 DsbG) 또는 FkpA (샤프롱 활성을 갖는 펩티딜프롤릴 시스,트랜스-이성화효소)를 과다발현하는 추가 벡터가 숙주 원핵 세포를 공동형질전환하는데 이용될 수 있다. 샤프롱 단백질은 세균 숙주 세포에서 생산된 이종성 단백질의 적절한 접힘 및 용해도를 조장하는 것으로 증명되었다. Chen et al. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605; Georgiou et al., U.S. 특허 번호 6,083,715; Georgiou et al., U.S. 특허 번호 6,027,888; Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210.
발현된 이종성 단백질 (특히, 단백질분해적으로 민감한 것들)의 단백질분해를 최소화하기 위해, 단백질분해효소에 결함성인 일정한 숙주 균주가 본 발명에 이용될 수 있다. 가령, 숙주 세포 균주는 공지된 세균 프로테아제, 예를 들면, 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및 이들의 조합을 인코딩하는 유전자에서 유전적 돌연변이(들)를 달성하기 위해 변형될 수 있다. 일부 대장균 (E. coli) 프로테아제-결함성 균주가 가용하고, 그리고 예로서, Joly et al. (1998), 위와 같음; Georgiou et al., U.S. 특허 번호 5,264,365; Georgiou et al., U.S. 특허 번호 5,508,192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)에서 설명된다.
단백질분해효소에 결함성이고, 그리고 하나 또는 그 이상의 샤프롱 단백질을 과다발현하는 플라스미드로 형질전환된 대장균 (E. coli) 균주가 본 출원의 항체를 인코딩하는 발현 시스템에서 숙주 세포로서 이용될 수 있다.
d) 단백질 정제
본원에서 생산된 항체는 추가 검정 및 이용을 위해 실제적으로 균질한 제조물을 획득하기 위해 더욱 정제된다. 당해 분야에서 공지된 표준 단백질 정제 방법이 이용될 수 있다. 다음의 절차는 적합한 정제 절차의 예시이다: 면역친화성 또는 이온-교환 칼럼에서 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온-교환 수지, 예를 들면, DEAE에서 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 그리고 예로서, 세파덱스 G-75를 이용한 겔 여과.
한 양상에서, 고체상 위에 고정된 단백질 A가 본 출원의 Fc 영역을 포함하는 항체의 면역친화성 정제에 이용된다. 단백질 A는 항체의 Fc 영역에 높은 친화성으로 결합하는, 황색포도상구균 (Staphylococcus aureas)으로부터 41kD 세포 벽 단백질이다. Lindmark et al (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. 단백질 A가 고정되는 고체상은 바람직하게는 유리 또는 실리카 표면을 포함하는 칼럼, 더욱 바람직하게는 제어된 구멍 유리 칼럼 또는 규산 칼럼이다. 일부 적용에서, 칼럼은 오염체의 비특이적 부착을 예방하기 위한 시도에서, 시약, 예를 들면, 글리세롤로 코팅되었다. 고체상은 이후, 고체상에 비특이적으로 결합된 오염체를 제거하기 위해 세척된다. 최종적으로, 관심되는 항체는 용리에 의해 고체상으로부터 회수된다.
4. 진핵 세포에서 재조합 생산
진핵 발현을 위해, 벡터 성분은 일반적으로, 다음 중에서 하나 또는 그 이상을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 또는 그 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 그리고 전사 종결 서열.
a) 신호 서열 성분
또한, 진핵 숙주에서 이용을 위한 벡터는 신호 서열, 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N 말단에서 특정한 개열 부위를 갖는 다른 폴리펩티드를 인코딩하는 삽입물일 수 있다. 선별된 이종성 신호 서열은 바람직하게는, 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는 (다시 말하면, 신호 펩티드분해효소에 의해 개열되는) 것이다. 포유류 세포 발현에서, 포유류 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비성 리더, 예를 들면, 단순 포진 gD 신호가 가용하다.
이런 전구체 영역에 대한 DNA는 본 출원의 항체를 인코딩하는 DNA에 해독틀 안에서 결찰된다.
b) 복제 기점
일반적으로, 복제 기점 성분은 포유류 발현 벡터의 경우에 필요하지 않다 (SV40 기원은 단지 이것이 초기 프로모터를 내포하기 때문에, 전형적으로 이용될 수 있다).
c) 선별 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선별가능 마커로 또한 명명되는 선별 유전자를 내포할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들면, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉사트, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결함을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 가용하지 않은 결정적인 영양소를 공급하는 (가령, 바실루스의 경우에 D-알라닌 라세미화효소를 인코딩하는 유전자) 단백질을 인코딩한다.
선별 계획의 한 가지 실례는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 활용한다. 이종성 유전자로 성공적으로 형질전환되는 세포는 약제 내성을 부여하는 단백질을 생산하고, 그리고 따라서, 선별 섭생에서 생존한다. 이런 우성 선별의 실례는 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 히그로마이신을 이용한다.
포유류 세포에 대한 적합한 선별가능 마커의 다른 실례는 본 출원의 항체를 인코딩하는 핵산을 흡수하는데 적격인 세포의 확인을 할 수 있게 하는 것들, 예를 들면, DHFR, 티미딘 키나아제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 탈아미노효소, 오르니틴 탈카르복실화효소 등이다.
가령, DHFR 선별 유전자로 형질전환된 세포는 먼저 DHFR의 경쟁 길항제인 메토트렉사트 (Mtx)를 내포하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 확인된다. 야생형 DHFR이 이용될 때 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성에서 결함성인 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (가령, ATCC CRL-9096)이다.
대안으로, 폴리펩티드 인코딩-DNA 서열, 야생형 DHFR 단백질, 그리고 다른 선별가능 마커, 예를 들면, 아미노글리코시드 3'-인산전달효소 (APH)로 형질전환된 또는 공동형질전환된 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 내포하는 야생형 숙주)는 선별가능 마커, 예를 들면, 아미노글리코시딕 항균제, 예를 들면, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418에 대한 선별 작용제를 내포하는 배지에서 세포 성장에 의해 선별될 수 있다. U.S. 특허 번호 4,965,199를 참조한다.
d) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로, 숙주 생명체에 의해 인식되고 원하는 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 내포한다. 사실상 모든 진핵 유전자가 전사가 시작되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 상류에 위치된 AT-풍부한 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사의 시작으로부터 70 내지 80개 염기 상류에서 발견되는 다른 서열은 CNCAAT 영역인데, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 대부분의 진핵 유전자의 3' 단부에는 AATAAA 서열이 있는데, 이것은 코딩 서열의 3' 단부에 폴리 A 꼬리의 부가를 위한 신호일 수 있다. 이들 모든 서열은 진핵 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다.
원핵 숙주에서 이용하기 적합한 다른 프로모터는 phoA 프로모터, -락타마아제 및 락토오스 프로모터 시스템, 알칼리 인산분해효소 프로모터, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 그리고 하이브리드 프로모터, 예를 들면, tac 프로모터를 포함한다. 하지만, 다른 공지된 세균 프로모터가 적합하다. 세균 시스템에서 이용을 위한 프로모터는 또한, 항체를 인코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인 달가노 (S.D.) 서열을 내포할 것이다.
포유류 숙주 세포에서 벡터로부터 폴리펩티드 전사는 예로서, 바이러스, 예를 들면, 폴리오마 바이러스, 계두바이러스, 아데노바이러스 (가령, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 간염-B 바이러스 및 가장 바람직하게는 유인원 바이러스 40 (SV40)의 유전체로부터, 이종성 포유류 프로모터, 예를 들면, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열 충격 프로모터로부터 획득된 프로모터에 의해 제어되는데, 단서로서 이런 프로모터는 숙주 세포 시스템과 양립해야 한다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점을 또한 내포하는 SV40 제한 단편으로서 편의하게 획득된다. 인간 시토메갈로바이러스의 극초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편의하게 획득된다. 소 유두종 바이러스를 벡터로서 이용하여 포유류 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 U.S. 특허 번호 4,419,446에서 개시된다. 이러한 시스템의 변형은 U.S. 특허 번호 4,601,978에서 설명된다. 단순 헤르페스 바이러스로부터 티미딘 키나아제 프로모터의 제어 하에 생쥐 세포에서 인간 인터페론 cDNA의 발현에 관해 Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982)을 또한 참조한다. 대안으로, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복이 프로모터로서 이용될 수 있다.
e) 인핸서 요소 성분
고등 진핵생물에 의한 본 출원의 항체를 인코딩하는 DNA의 전사는 종종, 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 포유류 유전자 (글로빈, 엘라스타아제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린)로부터 많은 인핸서 서열이 현재 알려져 있다. 하지만, 전형적으로, 진핵 세포 바이러스로부터 인핸서가 이용될 것이다. 실례는 복제 기원의 후기 측면에서 SV40 인핸서 (bp 100-270), 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 후기 측면에서 폴리오마 인핸서, 그리고 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 진핵 프로모터의 활성화를 위한 증강 요소에 대해, Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)을 또한 참조한다. 인핸서는 폴리펩티드 인코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 부위에서 위치된다.
f) 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포 (효모, 균류, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 생물체로부터 유핵 세포)에서 이용되는 발현 벡터는 또한, 전사의 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 내포할 것이다. 이런 서열은 통상적으로, 진핵 또는 바이러스 DNAs 또는 cDNAs의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 가용하다. 이들 영역은 폴리펩티드-인코딩 mRNA의 번역되지 않은 부분에서 폴리아데닐화된 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 분절을 내포한다. 한 가지 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO94/11026 및 그 안에 개시된 발현 벡터를 참조한다.
g) 숙주 세포의 선별 및 형질전환
본원에서 벡터에서 DNA를 클로닝하거나 또는 발현하는데 적합한 숙주 세포는 척추동물 숙주 세포를 비롯하여, 본원에서 설명된 고등 진핵생물 세포를 포함한다. 배양 중인 (조직 배양) 척추동물 세포의 증식은 일과적인 절차가 되고 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 실례는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 라인 (현탁 배양에서 성장을 위해 하위클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59 (1977)); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO 세포, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 생쥐 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 쥐 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 생쥐 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TR1 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 라인 (Hep G2)이다.
숙주 세포는 항체 생산을 위해 전술한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 그리고 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 또는 원하는 서열을 인코딩하는 유전자를 증폭하는데 타당하면 변형된 전통적인 영양 배지에서 배양된다.
h) 숙주 세포 배양
본 출원의 항체를 생산하는데 이용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 가용한 배지, 예를 들면, Ham's F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) 및 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지 ((DMEM), Sigma)가 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 이에 더하여, Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), U.S. 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 U.S. Pat. Re. 30,985에서 설명된 배지 중에서 한 가지가 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 이용될 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요에 따라, 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (가령, 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (가령, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충액 (가령, HEPES), 뉴클레오티드 (가령, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (가령, GENTAMYCIN™ 약물), 미량 원소 (통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도에서 존재하는 무기 화합물로서 규정됨), 그리고 글루코오스 또는 동등한 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물 또한, 당업자에게 공지될 적절한 농도에서 포함될 수 있다. 배양 조건, 예를 들면, 온도, pH 등은 발현을 위해 선별된 숙주 세포에서 기존에 이용된 것들이고, 그리고 당업자에게 명백할 것이다.
i) 단백질 정제
재조합 기술을 이용할 때, 항체는 세포내에서 생산되거나, 원형질막주위 공간에서 생산되거나, 또는 배지 내로 직접적으로 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생산되면, 첫 번째 단계로서, 미립자 조직파편 (숙주 세포 또는 용해된 단편)이 예로서, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)은 대장균 (E. coli)의 원형질막주위 공간으로 분비되는 항체를 단리하기 위한 절차를 설명한다. 간단히 말하면, 세포 페이스트는 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐 플루오르화물 (PMSF)의 존재에서 약 30 분에 걸쳐 해동된다. 세포 조직파편은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우에, 이런 발현 시스템으로부터 상층액은 일반적으로 먼저, 상업적으로 가용한 단백질 농축 필터, 예를 들면, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 단위를 이용하여 농축된다. 단백질분해효소 저해제, 예를 들면, PMSF가 단백질분해를 저해하기 위해 임의의 전술한 단계에 포함될 수 있고, 그리고 항생제가 우발적인 오염체의 성장을 예방하기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 단백질 조성물은 예로서, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기이동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있는데, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 아이소타입에 의존한다. 단백질 A는 1, 2, 또는 4개 중쇄를 내포하는 인간 면역글로불린에 근거되는 항체를 정제하는데 이용될 수 있다 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G가 모든 생쥐 아이소타입 및 인간 3에 대해 권장된다 (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 수시로 아가로오스이지만, 다른 매트릭스도 가용하다. 기계적으로 안정된 매트릭스, 예를 들면, 제어된 구멍 유리 또는 폴리(스티렌-디비닐)벤젠은 아가로오스로 달성될 수 있는 것보다 더욱 빠른 유속 및 더욱 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우에, Bakerbond ABXTMresin (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)이 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들면, 이온-교환 칼럼에서 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카에서 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE™에서 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (가령, 폴리아스파르트산 칼럼)에서 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전 역시 회수되는 항체에 따라 가용하다.
임의의 예비적 정제 단계(들) 이후에, 관심되는 항체 및 오염체를 포함하는 혼합물은 약 2.5-4.5 사이의 pH에서 용리 완충액을 이용한 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 종속되고, 바람직하게는 낮은 염 농도 (가령, 약 0-0.25M 염)에서 수행될 수 있다.
면역접합체
일부 구체예에서, 본 출원은 또한, 하나 또는 그 이상의 세포독성 작용제, 예를 들면, 화학요법 작용제 또는 약물, 성장 저해성 작용제, 독소 (가령, 단백질 독소, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성 독소, 또는 이들의 단편), 또는 방사성 동위원소에 접합된 본원에서 설명된 임의의 항체 (가령, sdAbs)를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
일부 구체예에서, 면역접합체는 항체-약물 접합체 (ADC)인데, 여기서 항체는 메이탄시노이드 (U.S. 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1을 참조한다); 아우리스타틴, 예를 들면, 모노메틸라우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (U.S. 특허 번호 5,635,483 및 5,780,588 및 7,498,298을 참조한다); 돌라스타틴; 칼리키아마이신 또는 이의 유도체 (U.S. 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 및 5,877,296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer. Res. 58:2925-2928 (1998)을 참조한다); 안트라사이클린, 예를 들면, 다우노마이신 또는 독소루비신 (Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); 및 U.S. 특허 번호 6,630,579를 참조한다); 메토트렉사트; 빈데신; 탁산, 예를 들면, 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 하나 또는 그 이상의 약물에 접합된다.
일부 구체예에서, 면역접합체는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (녹농균 (Pseudomonas aeruginosa)으로부터), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모디카 차란티아 (momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 저해제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 효소적으로 활성 독소 또는 이의 단편에 접합된 본원에서 설명된 바와 같은 항체를 포함한다.
일부 구체예에서, 면역접합체는 방사접합체를 형성하기 위해 방사성 원자에 접합된 본원에서 설명된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사접합체의 생산에 가용하다. 실례는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사접합체가 검출에 이용될 때, 이것은 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들면, tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상법, mri로서 또한 알려져 있음)를 위한 스핀 표지, 예를 들면, 요오드-123 어게인, 요오드-131, 인듐-111, 플루오르-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성 작용제의 접합체는 다양한 이중기능성 단백질 연계 작용제, 예를 들면, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피온산염 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실산염 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이중기능성 유도체 (가령, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (가령, 디숙신이미딜 수베르산염), 알데히드 (가령, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (가령, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (가령, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (가령, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오르 화합물 (가령, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 이용하여 만들어질 수 있다. 가령, 리신 면역독소는 Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)에서 설명된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지화된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO94/11026을 참조한다. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "개열가능한 링커"일 수 있다. 가령, 산-불안정 링커, 펩티드분해효소-민감성 링커, 광불안정 링커, 디메틸 링커 또는 이황화물-내포 링커 (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); U.S. 특허 번호 5,208,020)가 이용될 수 있다.
본원에서 면역접합체 또는 ADCs는 상업적으로 가용한 (가령, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A로부터) BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC 및 술포-SMPB, 그리고 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 교차연결제 시약으로 제조된 이와 같은 접합체를 명시적으로 예기하지만, 이들에 한정되지 않는다.
진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
일부 구체예에서, 본원에서 제공된 임의의 항체 (가령, sdAbs)는 생물학적 표본에서 BCMA의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포괄한다. 일정한 구체예에서, 생물학적 표본은 생물학적 기원의 혈액, 혈청 또는 다른 액체 표본이다. 일부 구체예에서, 생물학적 표본은 세포 또는 조직을 포함한다.
일부 구체예에서, 진단 또는 검출의 방법에서 이용을 위한 항-BCMA 항체 (가령, 본원에서 설명된 항-BCMA sdAbs 중에서 한 가지)가 제공된다. 추가의 양상에서, 생물학적 표본에서 BCMA의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 생물학적 표본에서 BCMA 단백질의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 일정한 구체예에서, BCMA는 인간 BCMA이다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 BCMA에 항-BCMA 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 생물학적 표본을 본원에서 설명된 바와 같은 항-BCMA 항체와 접촉시키고, 그리고 항-BCMA 항체 및 BCMA 사이에 복합체가 형성되는 지의 여부를 검출하는 것을 포함한다. 이런 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 일부 구체예에서, 항-BCMA 항체는 예로서, BCMA가 환자의 선별을 위한 생물마커인 경우에, 항-BCMA 항체를 이용한 요법에 적격인 개체를 선별하는데 이용된다.
일정한 구체예에서, 표지화된 항-BCMA sdAbs가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (가령, 형광, 색소생산, 전자 밀도, 화학발광 및 방사성 표지)뿐만 아니라 예로서, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 모이어티, 예를 들면, 효소 또는 리간드를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 예시적인 표지는 염료 전구체를 산화시키는 과산화수소를 이용하는 효소, 예를 들면, HRP, 락토페록시다아제 또는 마이크로페록시다아제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정된 유리 라디칼 등과 연계된 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예를 들면, 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라아제, 예를 들면, 개똥벌레 루시페라아제 및 세균 루시페라아제 (U.S. 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프타라진디온, 양고추냉이 과산화효소 (HRP), 알칼리 인산분해효소, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다아제, 예를 들면, 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제 및 글루코오스-6-인산염 탈수소효소, 헤테로환상 옥시다아제, 예를 들면, 요산분해효소 및 크산틴 옥시다아제를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
III. 키메라 항원 수용체
본 출원의 한 가지 양상은 하나 또는 그 이상의 단일-도메인 항체 (가령, VHHs)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 제공한다. 섹션 II에서 설명된 항-BCMA sdAbs 중에서 한 가지가 본원에서 설명된 CARs에서 이용될 수 있다. CARs의 예시적인 구조는 도면 15a-15d에서 도시된다.
일부 구체예에서, (a) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, BCMA를 표적으로 하는 CAR (본원에서 "BCMA CAR"로서 또한 지칭됨)가 제공된다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 낙타, 키메라, 인간 또는 인간화이다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포 (가령, T 세포)의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 동시자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 동시자극성 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 동시자극성 분자로부터 유래된다. 일부 구체예에서, BCMA CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 C 말단 및 막경유 도메인의 N 말단 사이에 위치된 힌지 도메인 (가령, CD8α 힌지 도메인)을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, BCMA CAR은 폴리펩티드의 N 말단에서 위치된 신호 펩티드 (가령, CD8α 신호 펩티드)를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로 다음을 포함한다: CD8α 신호 펩티드, 세포외 항원 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD28 막경유 도메인, CD28로부터 유래된 첫 번째 동시자극성 신호전달 도메인, CD137로부터 유래된 두 번째 동시자극성 신호전달 도메인, 그리고 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로 다음을 포함한다: CD8α 신호 펩티드, 세포외 항원 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막경유 도메인, CD137로부터 유래된 동시자극성 신호전달 도메인, 그리고 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예에서, BCMA CAR은 단일특이적이다. 일부 구체예에서, BCMA CAR은 일가이다.
일부 구체예에서, (a) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 BCMA CAR이 제시되고, 여기서 항-BCMA sdAb는 다음 중에서 한 가지를 포함한다: (1) 서열 번호:1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (2) 서열 번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (3) 서열 번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (4) 서열 번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:80의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (5) 서열 번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:81의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (6) 서열 번호:6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:82의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (7) 서열 번호:7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:83의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (8) 서열 번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:84의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (9) 서열 번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:85의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (10) 서열 번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:86의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (11) 서열 번호:11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:87의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (12) 서열 번호:12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:88의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (13) 서열 번호:13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (14) 서열 번호:14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:90의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (15) 서열 번호:15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:91의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (16) 서열 번호:16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:92의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (17) 서열 번호:17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (18) 서열 번호:18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:94의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (19) 서열 번호:19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:57의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:95의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (20) 서열 번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:96의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (21) 서열 번호:21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:97의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (22) 서열 번호:22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:98의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (23) 서열 번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:99의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (24) 서열 번호:24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (25) 서열 번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:101의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (26) 서열 번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:102의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (27) 서열 번호:27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (28) 서열 번호:28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:66의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:104의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (29) 서열 번호:29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:105의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (30) 서열 번호:30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:106의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (31) 서열 번호:31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:69의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:107의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (32) 서열 번호:32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:70의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:108의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (33) 서열 번호:33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:71의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:109의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (34) 서열 번호:34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:110의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (35) 서열 번호:35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (36) 서열 번호:36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:112의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (37) 서열 번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:75의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 (38) 서열 번호:38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:76의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 낙타, 키메라, 인간 또는 인간화이다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 115-152로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VHH 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포 (가령, T 세포)의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 동시자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 동시자극성 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 동시자극성 분자로부터 유래된다. 일부 구체예에서, BCMA CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 C 말단 및 막경유 도메인의 N 말단 사이에 위치된 힌지 도메인 (가령, CD8α 힌지 도메인)을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, BCMA CAR은 폴리펩티드의 N 말단에서 위치된 신호 펩티드 (가령, CD8α 신호 펩티드)를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로 다음을 포함한다: CD8α 신호 펩티드, 세포외 항원 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD28 막경유 도메인, CD28로부터 유래된 첫 번째 동시자극성 신호전달 도메인, CD137로부터 유래된 두 번째 동시자극성 신호전달 도메인, 그리고 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로 다음을 포함한다: CD8α 신호 펩티드, 세포외 항원 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막경유 도메인, CD137로부터 유래된 동시자극성 신호전달 도메인, 그리고 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예에서, BCMA CAR은 단일특이적이다. 일부 구체예에서, BCMA CAR은 일가이다.
일부 구체예에서, 서열 번호: 216-256 및 298-335로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열에 최소한 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성 중에서 한 가지를 갖는 폴리펩티드를 포함하는 BCMA CAR이 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 216-256 및 298-335로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 BCMA CAR이 제공된다. 서열 번호: 216-256 및 298-335로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 역시 제공된다.
일부 구체예에서, 본원에서 제공된 BCMA CARs 중에서 한 가지를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 257-297 및 336-373으로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열에 최소한 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성 중에서 한 가지를 갖는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 257-297 및 336-373으로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 구체예에서, 단리된 핵산은 DNA이다. 일부 구체예에서, 단리된 핵산은 RNA이다. 일부 구체예에서, 앞서 설명된 BCMA CARs를 인코딩하는 핵산 중에서 한 가지를 포함하는 벡터가 제공된다. 일부 구체예에서, 벡터는 발현 벡터이다. 일부 구체예에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들면, 렌티바이러스 벡터이다. 일부 구체예에서, 벡터는 비바이러스 벡터이다. 예시적인 일가 BCMA CARs는 아래의 표 4에서 도시된다.
표 4. 예시적인 일가 BCMA CARs.
실례 벡터 또는
CAR 명칭		 실례 AA 서열 번호 실례 NA 서열 번호 SP 세포외
sdAb		 힌지 TM 세포내 신호전달
CO1 CO2 Prim.
PLLV-hEF1a-269A37346 216 257 CD8α 269A37346 CD8α CD28 CD28 CD137 CD3ζ
PLLV-hEF1a-269A37348 217 258 CD8α 269A37348 CD8α CD28 CD28 CD137 CD3ζ
PLLV-hEF1a-269A37917 218 259 CD8α 269A37917 CD8α CD28 CD28 CD137 CD3ζ
PLLV-hEF1a-269A37355 219 260 CD8α 269A37355 CD8α CD28 CD28 CD137 CD3ζ
PLLV-hEF1a-269A37915 220 261 CD8α 269A37915 CD8α CD28 CD28 CD137 CD3ζ
PLLV-hEF1a-269A37936 221 262 CD8α 269A37936 CD8α CD28 CD28 CD137 CD3ζ
PLLV-hEF1a-269A37953 222 263 CD8α 269A37953 CD8α CD28 CD28 CD137 CD3ζ
PLLV-hEF1a-269A37965 223 264 CD8α 269A37965 CD8α CD28 CD28 CD137 CD3ζ
PLLV-hEF1a-269A37972 224 265 CD8α 269A37972 CD8α CD28 CD28 CD137 CD3ζ
PLLV-hEF1a-269A37353 225 266 CD8α 269A37353 CD8α CD28 CD28 CD137 CD3ζ
PLLV-hEF1a-269A37948 226 267 CD8α 269A37948 CD8α CD28 CD28 CD137 CD3ζ
GSI5011 CAR 227 268 CD8α 269A37346 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
GSI5019 CAR 228 269 CD8α 269A37353 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
GSI5020 CAR 229 270 CD8α 269A37917 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B005S 230 271 CD8α 269B005 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B023S 231 272 CD8α 269B023 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B024S 232 273 CD8α 269B024 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B028S 233 274 CD8α 269B028 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B030S 234 275 CD8α 269B030 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B038S 235 276 CD8α 269B038 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B054S 236 277 CD8α 269B054 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B059S 237 278 CD8α 269B059 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B060S 238 279 CD8α 269B060 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B069S 239 280 CD8α 269B069 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B074S 240 281 CD8α 269B074 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B076S 241 282 CD8α 269B076 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B079S 242 283 CD8α 269B083 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B083S 243 284 CD8α 269B085 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B085S 244 285 CD8α 269B093 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B093S 245 286 CD8α 269B094 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B094S 246 287 CD8α 269B104 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B104S 247 288 CD8α 269B109 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B109S 248 289 CD8α 269B110 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B110S 249 290 CD8α 269B113 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B113S 250 291 CD8α 269B126 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B126S 251 292 CD8α 269B129 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B129S 252 293 CD8α 269B131 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B131S 253 294 CD8α 269B135 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B135S 254 295 CD8α 269B136 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B136S 255 296 CD8α 269B139 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
269B139S 256 297 CD8α 269B024 CD8α CD8α CD137 NA CD3ζ
다가 키메라 항원 수용체
본 출원은 또한, 항원, 예를 들면, BCMA에 특이적으로 결합하는 2개 또는 그 이상 (가령, 약 2, 3, 4, 5, 6개, 또는 그 이상 중에서 한 가지)의 결합 모이어티를 갖는 다가 CARs를 제공한다. 일부 구체예에서, 결합 모이어티 중에서 하나 또는 그 이상은 항원 결합 단편이다. 일부 구체예에서, 결합 모이어티 중에서 하나 또는 그 이상은 단일-도메인 항체이다. 일부 구체예에서, 결합 모이어티 중에서 하나 또는 그 이상은 낙타 항체로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 결합 모이어티 중에서 하나 또는 그 이상은 4-사슬 항체로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 결합 모이어티 중에서 하나 또는 그 이상은 scFvs이다. 일부 구체예에서, 결합 모이어티 중에서 하나 또는 그 이상은 인간 항체로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 결합 모이어티 중에서 하나 또는 그 이상은 항원에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 리간드 또는 다른 비항체 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, 다가 CAR은 단일특이적이다, 다시 말하면, 다가 CAR은 단일 항원을 표적으로 하고, 그리고 단일 항원에 대한 2개 또는 그 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 구체예에서, 다가 CAR은 다중특이적이다, 다시 말하면, 다가 CAR은 하나 이상의 항원을 표적으로 하고, 그리고 다가 CAR은 최소한 하나의 항원에 대한 2개 또는 그 이상의 결합 부위를 포함한다. 동일한 항원에 특이적인 결합 모이어티는 항원의 동일한 에피토프에 결합할 수 있거나 (다시 말하면, "단일-에피토프 CAR"), 또는 항원의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다 (다시 말하면, "다중-에피토프 CAR", 예를 들면, 이중-에피토프 CAR 또는 삼중-에피토프 CAR). 동일한 항원에 특정한 결합 부위는 동일하거나 상이한 sdAbs를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 출원은 (a) 항원 (가령, 종양 항원)에 특이적으로 결합하는 복수 (가령, 최소한 약 2, 3, 4, 5, 6개, 또는 그 이상 중에서 한 가지)의 결합 모이어티를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 다가 (가령, 이가, 삼가, 또는 더욱 높은 숫자의 결합가) 키메라 항원 수용체를 제공한다. 일부 구체예에서, 항원은 CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 및 당지질 F77로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 본 출원은 (a) 항원 (가령, 종양 항원)에 특이적으로 결합하는 복수 (가령, 최소한 약 2, 3, 4, 5, 6개, 또는 그 이상 중에서 한 가지)의 단일-도메인 항체 (sdAbs)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 다가 (가령, 이가, 삼가, 또는 더욱 높은 숫자의 결합가) 키메라 항원 수용체를 제공한다. 일부 구체예에서, 항원은 CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 및 당지질 F77로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 본 출원은 (a) 항원 (가령, 종양 항원)의 첫 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 첫 번째 결합 모이어티 및 상기 항원의 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 두 번째 결합 모이어티를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 다가 (가령, 이가, 삼가, 또는 더욱 높은 숫자의 결합가) 키메라 항원 수용체를 제공하고, 여기서 첫 번째 에피토프 및 두 번째 에피토프는 상이하다. 일부 구체예에서, 항원은 CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 및 당지질 F77로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 첫 번째 결합 모이어티는 sdAb이고, 그리고 두 번째 결합 모이어티는 인간 항체로부터 유래된다 (가령, scFv). 일부 구체예에서, 첫 번째 결합 모이어티는 sdAb이고, 그리고 두 번째 결합 모이어티는 폴리펩티드 리간드이다. 일부 구체예에서, 첫 번째 에피토프는 두 번째 에피토프와 동일하다. 일부 구체예에서, 첫 번째 에피토프는 두 번째 에피토프와 상이하다. 일부 구체예에서, 다가 CAR은 항원 상에서 2개의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 다가 CAR은 항원 상에서 3개 또는 그 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다.
일부 구체예에서, 본 출원은 (a) 항원 (가령, 종양 항원)의 첫 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 첫 번째 sdAb 및 상기 항원의 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 두 번째 sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 다가 (가령, 이가, 삼가, 또는 더욱 높은 숫자의 결합가) 키메라 항원 수용체를 제공하고, 여기서 첫 번째 에피토프 및 두 번째 에피토프는 상이하다. 일부 구체예에서, 항원은 CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 및 당지질 F77로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 결합 모이어티, 예를 들면, sdAbs (복수의 sdAbs, 또는 첫 번째 sdAb 및/또는 두 번째 sdAb 포함)는 낙타, 키메라, 인간 또는 인간화이다. 일부 구체예에서, 결합 모이어티 또는 sdAbs는 펩티드 결합 또는 펩티드 링커를 통해 서로에 융합된다. 일부 구체예에서, 각 펩티드 링커는 약 50개 이내 (가령, 약 35, 25, 20, 15, 10, 또는 5개 이내)의 아미노산 길이이다. 일부 구체예에서, 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포 (가령, T 세포)의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 동시자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 동시자극성 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 동시자극성 분자로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 다가 CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 C 말단 및 막경유 도메인의 N 말단 사이에 위치된 힌지 도메인 (가령, CD8α 힌지 도메인)을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 다가 CAR은 폴리펩티드의 N 말단에서 위치된 신호 펩티드 (가령, CD8α 신호 펩티드)를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로 다음을 포함한다: CD8α 신호 펩티드, 세포외 항원 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막경유 도메인, CD137로부터 유래된 동시자극성 신호전달 도메인, 그리고 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예에서, 다가 CAR은 단일특이적이다. 일부 구체예에서, 다가 CAR은 다중특이적, 예를 들면, 이중특이적이다.
본원에서 설명된 다가 CARs는 상이한 항원 결합 부위에 의한 상승적 결합을 통해 다중결합 항원을 표적으로 하거나, 또는 항원에 대한 결합 친화성 또는 결합능을 증강하는데 특히 적합할 수 있다. 본원에서 설명된 항-BCMA sdAbs 중에서 한 가지가 본원에서 설명된 다가 CARs의 세포외 항원 결합 도메인에서 이용될 수 있다. 이들의 예시적인 다가 BCMA CARs, 예시적인 서열, 구조체 및 벡터의 목록은 표 5에서 도시된다.
일부 구체예에서, (a) 복수 (가령, 최소한 약 2, 3, 4개 또는 그 이상 중에서 한 가지)의 BCMA 결합 모이어티 (가령, 항-BCMA sdAb)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, BCMA를 표적으로 하는 다가 CAR이 제공된다. 항-BCMA sdAbs 중에서 한 가지가 다가 BCMA CAR을 작제하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포외 항원 결합 도메인은 BCMA의 단일 에피토프에 특이적으로 결합하고, 그리고 이들 CARs는 본원에서 단일-에피토프 다가 BCMA CARs로서 지칭된다.
일부 구체예에서, (a) 복수 (가령, 최소한 약 2, 3, 4개 또는 그 이상 중에서 한 가지)의 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 다가 BCMA CAR이 제공되고, 여기서 항-BCMA sdAb는 서열 번호:1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
일부 구체예에서, (a) 최소한 2개 (가령, 2, 3, 4개, 또는 그 이상 중에서 한 가지)의 BCMA 결합 모이어티를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 다가 BCMA CAR (본원에서 "다중-에피토프 다가 CAR"로서 또한 지칭됨)가 제공되고, 여기서 최소한 2개의 BCMA 결합 모이어티는 BCMA 상에서 최소한 2개의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 세포외 항원 결합 도메인은 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 및 두 번째 BCMA 결합 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 BCMA 결합 모이어티는 항-BCMA sdAb이고, 그리고 두 번째 BCMA 결합 모이어티는 인간 항체로부터 유래된다 (가령, scFv). 일부 구체예에서, 첫 번째 BCMA 결합 모이어티는 sdAb이고, 그리고 두 번째 BCMA 결합 모이어티는 BCMA 폴리펩티드 리간드이다. 일부 구체예에서, 첫 번째 항-BCMA 결합 모이어티 및/또는 두 번째 BCMA 결합 모이어티는 서열 번호: 388-394에서 선택되는 아미노산 서열로부터 유래된 BCMA 상에서 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 BCMA 결합 모이어티는 서열 번호: 389 및/또는 390으로부터 유래된 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 두 번째 BCMA 결합 모이어티는 서열 번호: 391 및/또는 392로부터 유래된 에피토프에 특이적으로 결합한다.
일부 구체예에서, (a) 첫 번째 항-BCMA sdAb 및 두 번째 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 다가 BCMA CAR이 제공되고, 여기서 첫 번째 항-BCMA sdAb 및 두 번째 항-BCMA sdAb는 BCMA 상에서 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 항-BCMA sdAbs 중에서 한 가지가 다가 BCMA CAR을 작제하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 첫 번째 항-BCMA sdAb 및/또는 두 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 388-394에서 선택되는 아미노산 서열로부터 유래된 BCMA 상에서 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 389 및/또는 390으로부터 유래된 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 두 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 391 및/또는 392로부터 유래된 에피토프에 특이적으로 결합한다.
일부 구체예에서, (a) 첫 번째 항-BCMA sdAb 및 두 번째 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 다가 BCMA CAR이 제공되고, 여기서 첫 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호:41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호:79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고; 그리고 여기서 두 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호:48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호:86의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 117의 아미노산 서열을 포함하는 VHH 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 두 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 124의 아미노산 서열을 포함하는 VHH 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 124의 아미노산 서열을 포함하는 VHH 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 두 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 117의 아미노산 서열을 포함하는 VHH 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, (a) 첫 번째 항-BCMA sdAb 및 두 번째 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 다가 BCMA CAR이 제공되고, 여기서 첫 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호:48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호:86의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고; 그리고 여기서 두 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호:11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호:49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호:87의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 124의 아미노산 서열을 포함하는 VHH 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 두 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 125의 아미노산 서열을 포함하는 VHH 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, (a) 첫 번째 항-BCMA sdAb 및 두 번째 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 다가 BCMA CAR이 제공되고, 여기서 첫 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호:7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호:45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호:83의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고; 그리고 여기서 두 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호:11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호:49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호:87의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 121의 아미노산 서열을 포함하는 VHH 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 두 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 125의 아미노산 서열을 포함하는 VHH 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, (a) 첫 번째 항-BCMA sdAb 및 두 번째 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 다가 BCMA CAR이 제공되고, 여기서 첫 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호:15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호:53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호:91의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고; 그리고 여기서 두 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호:18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호:94의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 129의 아미노산 서열을 포함하는 VHH 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 두 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 132의 아미노산 서열을 포함하는 VHH 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, (a) 첫 번째 항-BCMA sdAb 및 두 번째 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 다가 BCMA CAR이 제공되고, 여기서 첫 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호:18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호:94의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고; 그리고 여기서 두 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호:96의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 132의 아미노산 서열을 포함하는 VHH 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 두 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 134의 아미노산 서열을 포함하는 VHH 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, (a) 첫 번째 항-BCMA sdAb 및 두 번째 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 다가 BCMA CAR이 제공되고, 여기서 첫 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호:96의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고; 그리고 여기서 두 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호:28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호:66의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호:104의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 134의 아미노산 서열을 포함하는 VHH 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 두 번째 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 142의 아미노산 서열을 포함하는 VHH 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 첫 번째 항-BCMA sdAb)는 두 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 두 번째 항-BCMA sdAb)의 N 말단에서 위치된다. 일부 구체예에서, 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 첫 번째 항-BCMA sdAb)는 두 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 두 번째 항-BCMA sdAb)의 C 말단에서 위치된다. 일부 구체예에서, 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 첫 번째 항-BCMA sdAb) 및 두 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 두 번째 항-BCMA sdAb)는 펩티드 결합 또는 펩티드 링커를 통해 서로에 융합된다. 일부 구체예에서, 펩티드 링커는 약 50개 이내 (가령, 약 35, 25, 20, 15, 10, 또는 5개 이내)의 아미노산 길이이다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포 (가령, T 세포)의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 동시자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 동시자극성 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 동시자극성 분자로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 다가 BCMA CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 C 말단 및 막경유 도메인의 N 말단 사이에 위치된 힌지 도메인 (가령, CD8α 힌지 도메인)을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 다가 BCMA CAR은 폴리펩티드의 N 말단에서 위치된 신호 펩티드 (가령, CD8α 신호 펩티드)를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로 다음을 포함한다: CD8α 신호 펩티드, 세포외 항원 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막경유 도메인, CD137로부터 유래된 동시자극성 신호전달 도메인, 그리고 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예에서, 다가 BCMA CAR은 이가이다. 일부 구체예에서, 다가 BCMA CAR은 삼가이다. 일부 구체예에서, 다가 BCMA CAR은 BCMA 상에서 2개의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 다가 BCMA CAR은 BCMA 상에서 3개 또는 그 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다.
일부 구체예에서, 서열 번호: 298-335로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열에 최소한 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성 중에서 한 가지를 갖는 폴리펩티드를 포함하는 다가 BCMA CAR이 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 298-335로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 다가 BCMA CAR이 제공된다. 서열 번호: 298-335로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 역시 제공된다.
일부 구체예에서, 본원에서 제공된 다가 BCMA CARs 중에서 한 가지를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 336-373으로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열에 최소한 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성 중에서 한 가지를 갖는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 336-373으로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 구체예에서, 단리된 핵산은 DNA이다. 일부 구체예에서, 단리된 핵산은 RNA이다. 일부 구체예에서, 앞서 설명된 다가 BCMA CARs를 인코딩하는 핵산 중에서 한 가지를 포함하는 벡터가 제공된다. 일부 구체예에서, 벡터는 발현 벡터이다. 일부 구체예에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들면, 렌티바이러스 벡터이다. 일부 구체예에서, 벡터는 비바이러스 벡터이다. 예시적인 다가 BCMA CARs는 아래의 표 5에서 도시된다.
표 5. 예시적인 다가 BCMA CARs.
CAR 실례 AA 서열 번호 실례 NA 서열 번호 SP 세포외 항원 결합 도메인 힌지 TM 세포내 신호전달
sdAb #1 링커 #1 서열 번호 sdAb
#2		 링커
#2 서열 번호		 sdAb #3 CO1 Prim.
GSI5014 298 336 CD8α 269A37346 208 269A37346 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
GSI5015 299 337 CD8α 269A37346 208 269A37346 208 269A37346 CD8α CD8α CD137 CD3ζ
GSI5021 300 338 CD8α 269A37353 208 269A37917 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
GSI5022 301 339 CD8α 269A37353 213 269A37917 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
GSI5023 302 340 CD8α 269A37353 215 269A37917 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
GSI5024 303 341 CD8α 269A37917 209 269A37353 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
GSI5025 304 342 CD8α 269A37917 213 269A37353 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
GSI5026 305 343 CD8α 269A37917 214 269A37353 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR001 306 344 CD8α 269A37353 208 269A37948 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR002 307 345 CD8α 269A37353 213 269A37948 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR003 308 346 CD8α 269A37353 215 269A37948 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR004 309 347 CD8α 269A37948 209 269A37353 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR005 310 348 CD8α 269A37948 213 269A37353 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR006 311 349 CD8α 269A37948 214 269A37353 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR007 312 350 CD8α 269A37953 208 269A37948 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR008 313 351 CD8α 269A37953 213 269A37948 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR009 314 352 CD8α 269A37953 215 269A37948 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR010 315 353 CD8α 269A37953 209 269A37948 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR011 316 354 CD8α 269A37953 213 269A37948 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR012 317 355 CD8α 269A37953 214 269A37948 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR013 318 356 CD8α 269B028 208 269B054 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR014 319 357 CD8α 269B028 213 269B054 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR015 320 358 CD8α 269B028 215 269B054 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR016 321 359 CD8α 269B028 209 269B054 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR017 322 360 CD8α 269B028 213 269B054 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR018 323 361 CD8α 269B028 214 269B054 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR019 324 362 CD8α 269B054 208 269B060 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR020 325 363 CD8α 269B054 213 269B060 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR021 326 364 CD8α 269B054 215 269B060 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR022 327 365 CD8α 269B054 209 269B060 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR023 328 366 CD8α 269B054 213 269B060 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR024 329 367 CD8α 269B054 214 269B060 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR025 330 368 CD8α 269B060 208 269B094 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR026 331 369 CD8α 269B060 213 269B094 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR027 332 370 CD8α 269B060S 215 269B094 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR028 333 371 CD8α 269B060 209 269B094 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR029 334 372 CD8α 269B060 213 269B094 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
BCAR030 335 373 CD8α 269B060 214 269B094 NA NA CD8α CD8α CD137 CD3ζ
다중특이적 키메라 항원 수용체
본 출원은 2개 또는 그 이상 (가령, 대략 2, 3, 4, 5, 6개, 또는 그 이상 중에서 한 가지)의 상이한 항원을 표적으로 하는 다중특이적 키메라 항원 수용체를 더욱 제공한다. 일부 구체예에서, 다중특이적 CAR은 각 항원에 대한 하나의 항원 결합 부위를 갖는다. 일부 구체예에서, 다중특이적 CAR은 최소한 하나의 항원에 대한 2개 이상의 항원 결합 부위를 갖는다. 각 항원 결합 부위는 sdAb를 포함할 수 있다. 가령, 일부 구체예에서, 다중특이적 CAR은 각각, 항원에 특이적으로 결합하는 2개의 상이한 sdAbs를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 CAR이다. 일부 구체예에서, 다중특이적 CAR은 각각, 항원에 특이적으로 결합하는 3개의 상이한 sdAbs를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 삼중특이적 CAR이다.
일부 구체예에서, (a) BCMA에 특이적으로 결합하는 첫 번째 단일-도메인 항체 (sdAb) 및 두 번째 항원 (가령, 종양 항원)에 특이적으로 결합하는 두 번째 단일-도메인 항체 (sdAb)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 다중특이적 (가령, 이중특이적) 키메라 항원 수용체 (CAR)가 제공되고, 여기서 첫 번째 항원은 두 번째 항원과 상이하다. 일부 구체예에서, 두 번째 항원은 CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 및 당지질 F77 로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 첫 번째 sdAb 및/또는 두 번째 sdAb는 낙타, 키메라, 인간 또는 인간화이다. 일부 구체예에서, 첫 번째 sdAb 및 두 번째 sdAb는 펩티드 결합 또는 펩티드 링커를 통해 서로에 융합된다. 일부 구체예에서, 펩티드 링커는 약 50개 이내 (가령, 약 35, 25, 20, 15, 10, 또는 5개 이내)의 아미노산 길이이다. 일부 구체예에서, 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포 (가령, T 세포)의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 동시자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 동시자극성 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 동시자극성 분자로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 다중특이적 CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 C 말단 및 막경유 도메인의 N 말단 사이에 위치된 힌지 도메인 (가령, CD8α 힌지 도메인)을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 다중특이적 CAR은 폴리펩티드의 N 말단에서 위치된 신호 펩티드 (가령, CD8α 신호 펩티드)를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로 다음을 포함한다: CD8α 신호 펩티드, 세포외 항원 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막경유 도메인, CD137로부터 유래된 동시자극성 신호전달 도메인, 그리고 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로 다음을 포함한다: CD8α 신호 펩티드, 세포외 항원 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD28 막경유 도메인, CD28로부터 유래된 동시자극성 신호전달 도메인, 그리고 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인.
세포외 항원 결합 도메인
본원에서 설명된 CARs의 세포외 항원 결합 도메인은 하나 또는 그 이상 (가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상 중에서 한 가지)의 결합 모이어티, 예를 들면, sdAbs를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 결합 모이어티는 항체 또는 이들의 항원 결합 단편이다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 결합 모이어티는 4-사슬 항체로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 결합 모이어티는 낙타 항체로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 결합 모이어티는 인간 항체로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 결합 모이어티는 항원에 결합하는 비항체 결합 단백질, 예를 들면, 폴리펩티드 리간드 또는 가공된 단백질이다. 이들 결합 모이어티는 펩티드 결합을 통해 직접적으로, 또는 펩티드 링커를 통해 서로에 융합될 수 있다.
1. 단일-도메인 항체
일부 구체예에서, CAR은 하나 또는 그 이상의 sdAbs를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다. sdAbs는 동일하거나 상이한 기원일 수 있고, 그리고 동일하거나 상이한 크기일 수 있다. 예시적인 sdAbs는 중쇄 단독 항체 (가령, VHH 또는 VNAR)로부터 중쇄 가변 도메인, 경쇄를 자연적으로 결여하는 결합 분자, 전통적인 4-사슬 항체로부터 유래된 단일 도메인 (가령, VH 또는 VL), 인간화 중쇄 단독 항체, 인간 중쇄 분절을 발현하는 유전자도입 생쥐 또는 쥐에 의해 생산된 인간 sdAbs, 그리고 항체로부터 유래된 것들 이외에 가공된 도메인 및 단일 도메인 골격을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 본 출원의 섹션 II에서 설명된 sdAbs를 비롯하여, 당해 분야에서 공지된 또는 본 발명자들에 의해 개발된 임의의 sdAbs가 본원에서 설명된 CARs를 작제하는데 이용될 수 있다. 이들 sdAbs는 생쥐, 쥐, 인간, 낙타, 라마, 칠성장어, 어류, 상어, 염소, 토끼 및 소를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 본원에서 예기된 단일-도메인 항체는 또한, 낙타과 (Camelidae) 및 상어 이외의 종으로부터 자연발생 sdAb 분자를 포함한다.
일부 구체예에서, sdAb는 경쇄를 결여하는 중쇄 항체 (본원에서 "중쇄 단독 항체"로서 또한 지칭됨)로서 알려져 있는 자연발생 단일-도메인 항원 결합 분자로부터 유래된다. 이런 단일 도메인 분자는 예로서, WO 94/04678 및 Hamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448에서 개시된다. 명료함의 이유로, 경쇄를 자연적으로 결여하는 중쇄 분자로부터 유래된 가변 도메인은 이것을 4 사슬 면역글로불린의 전통적인 VH로부터 구별하기 위해 본원에서 VHH로서 알려져 있다. 이런 VHH 분자는 낙타과 (Camelidae) 종, 예를 들면, 낙타, 라마, 비쿠냐, 단봉낙타, 알파카 및 구아나코에서 조성된 항체로부터 유래될 수 있다. 낙타과 (Camelidae) 이외에 다른 종이 경쇄를 자연적으로 결여하는 중쇄 분자를 생산할 수 있고, 그리고 이런 VHHs는 본 출원의 범위 내에 있다.
낙타로부터 VHH 분자는 IgG 분자보다 약 10 배 작다. 이들은 단일 폴리펩티드이고, 그리고 매우 안정되고 극심한 pH 및 온도 조건에 내성일 수 있다. 게다가, 이들은 전통적인 4-사슬 항체의 경우에 해당하지 않는 프로테아제의 작용에 내성일 수 있다. 게다가, VHHs의 시험관내 발현은 높은 수율, 적절하게 접힘된 기능적 VHHs를 생산한다. 이에 더하여, 낙타에서 산출된 항체는 항체 라이브러리의 이용을 통해 또는 낙타 이외에 포유동물의 면역화를 통해 시험관내에서 산출된 항체에 의해 인식되는 것들 이외에 에피토프를 인식할 수 있다 (가령, WO9749805를 참조한다). 따라서, 하나 또는 그 이상의 VHH 도메인을 포함하는 다중특이적 또는 다가 CARs는 전통적인 4-사슬 항체로부터 유래된 항원 결합 단편을 포함하는 다중특이적 또는 다가 CARs보다 표적과 더욱 효율적으로 상호작용할 수 있다. VHHs가 '특이한' 에피토프, 예를 들면, 공동 또는 그루브에 결합하는 것으로 알려져 있기 때문에, 이런 VHHs를 포함하는 CARs의 친화성은 전통적인 다중특이적 폴리펩티드보다 치료적 처치에 더욱 적합할 수 있다.
일부 구체예에서, sdAb는 연골 어류에서 발견되는 면역글로불린의 가변 영역으로부터 유래된다. 가령, sdAb는 상어의 혈청에서 발견되는 신규한 항원 수용체 (NAR)로서 알려져 있는 면역글로불린 아이소타입으로부터 유래될 수 있다. NAR의 가변 영역으로부터 유래된 단일 도메인 분자 ("IgNARs")를 생산하는 방법은 WO 03/014161 및 Streltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909에서 설명된다.
일부 구체예에서, sdAb는 재조합, CDR-합체된, 인간화, 낙타화, 탈면역화된 및/또는 시험관내 산출된다 (가령, 파지 전시에 의해 선별된). 일부 구체예에서, 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 프레임워크 영역 내에 특정한 아미노산 잔기의 "낙타화"에 의해 변경될 수 있다. 낙타화는 전통적인 4-사슬 항체로부터 (자연발생) VH 도메인의 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 중쇄 항체의 VHH 도메인에서 상응하는 위치(들)에서 발생하는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기로 대체하거나 또는 치환하는 것을 지칭한다. 이것은 그 자체로 공지된 방식으로 수행될 수 있는데, 이것은 예로서, 본원에서 추가 설명의 기초에서 당업자에게 명백할 것이다. 이런 "낙타화" 치환은 바람직하게는, 본원에서 규정된 바와 같이 VH-VL 인터페이스에서 및/또는 이른바 낙타과 (Camelidae) 홀마크 잔기에서 형성되고 및/또는 존재하는 아미노산 위치에서 삽입된다 (가령, WO 94/04678, Davies and Riechmann FEBS Letters 339: 285-290, 1994; Davies and Riechmann Protein Engineering 9 (6): 531-537, 1996; Riechmann J. Mol. Biol. 259: 957-969, 1996; 그리고 Riechmann and Muyldermans J. Immunol. Meth. 231: 25-38, 1999를 참조한다).
일부 구체예에서, sdAb는 인간 중쇄 분절을 발현하는 유전자도입 생쥐 또는 쥐에 의해 생산된 인간 sdAb이다. 가령, US20090307787A1, U.S. 특허 번호 8,754,287, US20150289489A1, US20100122358A1, 그리고 WO2004049794를 참조한다. 일부 구체예에서, sdAb는 친화성 성숙된다.
일부 구체예에서, 특정 항원 또는 표적에 대한 자연발생 VHH 도메인은 낙타 VHH 서열의 (미경험 또는 면역) 라이브러리로부터 획득될 수 있다. 이런 방법은 그 자체로 공지된 하나 또는 그 이상의 선별검사 기술을 이용하여, 상기 항원 또는 표적, 또는 이의 최소한 하나의 부분, 단편, 항원 결정인자 또는 에피토프를 이용하여 이런 라이브러리를 선별검사하는 것을 수반하거나 또는 수반하지 않을 수 있다. 이런 라이브러리 및 기술은 예로서, WO 99/37681, WO 01/90190, WO 03/025020 및 WO 03/035694에서 설명된다. 대안으로, (미경험 또는 면역) VHH 라이브러리로부터 유래된 향상된 합성 또는 반합성 라이브러리, 예를 들면, 예로서 WO 00/43507에서 설명된 바와 같이, 무작위 돌연변이유발 및/또는 CDR 뒤섞음과 같은 기술에 의해 (미경험 또는 면역) VHH 라이브러리로부터 획득된 VHH 라이브러리가 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, sdAbs는 전통적인 4-사슬 항체로부터 산출된다. 가령, EP 0 368 684, Ward et al. (Nature 1989 Oct. 12; 341 (6242): 544-6), Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490; WO 06/030220; 그리고 WO 06/003388을 참조한다.
2. 항원
본 출원의 CARs에 의해 표적화된 항원(들)은 세포 표면 분자이다. 결합 모이어티 (가령, sdAbs)는 특수한 질환 상태와 연관된 표적 세포 상에서 세포 표면 마커로서 행동하는 항원을 인식하도록 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 항원 (가령, 첫 번째 항원 및/또는 두 번째 항원)은 종양 항원이다. 일부 구체예에서, 다중특이적 CARs는 2개 또는 그 이상의 종양 항원을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 종양 항원은 B 세포 악성과 연관된다. 종양은 면역 반응, 특히 T 세포 매개된 면역 반응을 위한 표적 항원으로서 역할을 할 수 있는 다수의 단백질을 발현한다. CAR에 의해 표적화된 항원은 단일 병든 세포 상에서 항원 또는 질환에 각각 기여하는 상이한 세포 상에서 발현되는 항원일 수 있다. CAR에 의해 표적화된 항원은 질환에 직접적으로 또는 간접적으로 관련될 수 있다.
종양 항원은 면역 반응, 특히 T-세포 매개된 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 종양 세포에 의해 생산되는 단백질이다. 본 발명의 표적화된 항원의 선별은 치료되는 암의 특정 유형에 의존할 것이다. 예시적인 종양 항원은 예로서, 신경교종-연관된 항원, 암배아 항원 (CEA), β-인간 융모생식선자극호르몬, 알파 태아단백질 (AFP), 렉틴-반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CAIX, 인간 텔로머라아제 역전사효소, RU1, RU2 (AS), 장관 카르복실 에스테르분해효소, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제 (prostase), 전립선-특이적 항원 (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, 프로스테인, PSMA, HER2/neu, 서바이빈 및 텔로머라아제, 전립선-암종 종양 항원-1 (PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타아제, 에프린B2, CD22, 인슐린 성장 인자 (IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린을 포함한다.
일부 구체예에서, 종양 항원은 악성 종양과 연관된 하나 또는 그 이상의 항원성 암 에피토프를 포함한다. 악성 종양은 면역 공격을 위한 표적 항원으로서 역할을 할 수 있는 다수의 단백질을 발현한다. 이들 분자는 조직 특이적 항원, 예를 들면, 흑색종에서 MART-1, 티로시나아제 및 gp100, 그리고 전립선암에서 전립선 산성 인산분해효소 (PAP) 및 전립선-특이적 항원 (PSA)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 다른 표적 분자는 일군의 형질전환-관련된 분자, 예를 들면, 종양유전자 HER2/Neu/ErbB-2에 속한다. 표적 항원의 또 다른 군은 종양태아 항원, 예를 들면, 암배아 항원 (CEA)이다. B-세포 림프종에서, 종양 특이적 이디오타입 면역글로불린은 개별 종양에 독특한 진성 종양 특이적 면역글로불린 항원을 구성한다. B-세포 분화 항원, 예를 들면, CD19, CD20 및 CD37은 B-세포 림프종에서 표적 항원에 대한 다른 후보이다.
일부 구체예에서, 종양 항원은 종양 특이적 항원 (TSA) 또는 종양-연관된 항원 (TAA)이다. TSA는 종양 세포에 독특하고 체내에서 다른 세포에서는 발생하지 않는다. TAA 연관된 항원은 종양 세포에 독특하지 않고, 그리고 그 대신에, 상기 항원에 대한 면역 관용의 상태를 유도하는데 실패하는 조건 하에 정상적인 세포에서도 발현된다. 종양 상에서 항원의 발현은 면역계가 상기 항원에 반응할 수 있게 하는 조건 하에 일어날 수 있다. TAAs는 면역계가 미성숙할 때인 태아 발달 동안 정상적인 세포에서 발현되고 반응할 수 없는 항원일 수 있거나, 또는 이들은 정상적인 세포에서는 극히 낮은 수준에서 정상적으로 존재하지만 종양 세포에서는 훨씬 높은 수준으로 발현되는 항원일 수 있다.
TSA 또는 TAA 항원의 무제한적 실례는 다음을 포함한다: 분화 항원, 예를 들면, MART-1/MelanA (MART-I), gp 100 (Pmel 17), 티로시나아제, TRP-1, TRP-2 및 종양 특이적 다계열 항원, 예를 들면, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pl5; 과다발현된 배아 항원, 예를 들면, CEA; 과다발현된 종양유전자 및 돌연변이된 종양-억제 유전자, 예를 들면, p53, Ras, HER2/neu; 염색체 전위로부터 발생하는 독특한 종양 항원; 예를 들면, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; 그리고 바이러스 항원, 예를 들면, 엡스타인 바르 바이러스 항원 EBVA 및 인간 유두종 바이러스 (HPV) 항원 E6과 E7. 다른 큰, 단백질-기초된 항원은 TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, nm-23HI, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파 태아단백질, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733＼EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO- 1, RCAS 1, SDCCAG16, TA-90＼Mac-2 결합 단백질＼시클로필린 C-연관된 단백질, TAAL6, TAG72, TLP, 그리고 TPS를 포함한다.
일부 구체예에서, 항원(가령, 첫 번째 항원 및/또는 두 번째 항원)은 CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 및 당지질 F77로 구성된 군에서 선택된다.
3. 펩티드 링커
본원에서 설명된 다중특이적 또는 다가 CARs에서 다양한 결합 모이어티 (가령, sdAbs)는 펩티드 링커를 통해 서로에 융합될 수 있다. 일부 구체예에서, 결합 모이어티 (가령, sdAbs)는 임의의 펩티드 링커 없이 서로에 직접적으로 융합된다. 상이한 결합 모이어티 (가령, sdAbs)를 연결하는 펩티드 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. CARs의 상이한 도메인은 또한, 펩티드 링커를 통해 서로에 융합될 수 있다.
CAR에서 각 펩티드 링커는 sdAbs 및/또는 다양한 도메인의 구조적 및/또는 기능적 특질에 따라 동일하거나 상이한 길이 및/또는 서열을 가질 수 있다. 각 펩티드 링커는 독립적으로 선별되고 최적화될 수 있다. CARs에서 이용된 펩티드 링커(들)의 길이, 유연성의 정도 및/또는 다른 성질은 하나 또는 그 이상의 특정 항원 또는 에피토프에 대한 친화성, 특이성 또는 결합능을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 성질에 일부 영향을 줄 수 있다. 가령, 더욱 긴 펩티드 링커가 2개의 인접한 도메인이 서로를 입체적으로 간섭하지 않도록 담보하기 위해 선별될 수 있다. 가령, 다중결합 항원을 향해 지향된 sdAbs를 포함하는 본 출원의 다가 또는 다중특이적 CAR에서, 펩티드 링커의 길이 및 유연성은 바람직하게는, 이것이 다가 CAR에서 각 sdAb가 다합체의 아단위 각각에서 항원 결정인자에 결합하도록 허용하는 정도이다. 일부 구체예에서, 짧은 펩티드 링커가 CAR의 막경유 도메인 및 세포내 신호전달 도메인 사이에 배치될 수 있다. 일부 구체예에서, 펩티드 링커는 인접한 도메인이 서로에 대하여 자유롭게 움직이도록 유연한 잔기 (가령, 글리신 및 세린)을 포함한다. 가령, 글리신-세린 이중항이 적합한 펩티드 링커일 수 있다.
펩티드 링커는 임의의 적합한 길이일 수 있다. 일부 구체예에서, 펩티드 링커는 최소한 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100개 또는 그 이상의 아미노산 길이 중에서 한 가지이다. 일부 구체예에서, 펩티드 링커는 약 100, 75, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5개 또는 더욱 적은 아미노산 길이 중에서 한 가지 이내이다. 일부 구체예에서, 펩티드 링커의 길이는 약 1개 아미노산 내지 약 10개 아미노산, 약 1개 아미노산 내지 약 20개 아미노산, 약 1개 아미노산 내지 약 30개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 15개 아미노산, 약 10개 아미노산 내지 약 25개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 30개 아미노산, 약 10개 아미노산 내지 약 30개 아미노산, 약 30개 아미노산 내지 약 50개 아미노산, 약 50개 아미노산 내지 약 100개 아미노산, 또는 약 1개 아미노산 내지 약 100개 아미노산 중에서 한 가지이다.
펩티드 링커는 자연발생 서열, 또는 비자연발생 서열을 가질 수 있다. 가령, 중쇄 단독 항체의 힌지 영역으로부터 유래된 서열이 링커로서 이용될 수 있다. 가령, WO1996/34103을 참조한다. 일부 구체예에서, 펩티드 링커는 유연한 링커이다. 예시적인 유연한 링커는 글리신 중합체 (G)n, 글리신-세린 중합체 (예로서, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGS)n 및 (GGGGS)n 포함, 여기서 n은 최소한 1의 정수이다), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 그리고 당해 분야에서 공지된 다른 유연한 링커를 포함한다. 일부 구체예에서, 펩티드 링커는 아미노산 서열 GGGGS (서열 번호: 208), (GGGGS)2 (서열 번호: 209), (GGGS)4 (서열 번호: 210), GGGGSGGGGSGGGGGGSGSGGGGS (서열 번호: 211), GGGGSGGGGSGGGGGGSGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열 번호: 212), (GGGGS)3 (서열 번호: 213), (GGGGS)4 (서열 번호: 214), 또는 (GGGGS)3 (서열 번호: 215)을 포함한다.
막경유 도메인
본 출원의 CARs는 세포외 항원 결합 도메인에 직접적으로 또는 간접적으로 융합될 수 있는 막경유 도메인을 포함한다. 막경유 도메인은 자연 공급원으로부터 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, "막경유 도메인"은 세포막, 바람직하게는 진핵 세포 막에서 열역학적으로 안정되는 임의의 단백질 구조를 지칭한다. 본원에서 설명된 CARs에서 이용에 양립성인 막경유 도메인은 자연발생 단백질로부터 획득될 수 있다. 대안으로, 이것은 세포막에서 열역학적으로 안정되는 합성, 비자연발생 단백질 분절, 예를 들면, 소수성 단백질 분절일 수 있다.
막경유 도메인은 막경유 도메인의 3차원 구조에 근거하여 분류된다. 가령, 막경유 도메인은 알파 나선, 하나 이상의 알파 나선의 복합체, 베타-배럴, 또는 세포의 인지질 이중층에 걸쳐 있을 수 있는 임의의 다른 안정된 구조를 형성할 수 있다. 게다가, 막경유 도메인은 또한 또는 대안으로, 막경유 도메인이 막을 교차하는 통과의 횟수 및 단백질의 배향정위를 비롯한 막경유 도메인 위상에 근거하여 분류될 수 있다. 가령, 단일-통과 막 단백질은 세포막을 1회 교차하고, 그리고 다중-통과 막 단백질은 세포막을 최소한 2회 (가령, 2, 3, 4, 5, 6, 7회 또는 그 이상) 교차한다. 막 단백질은 세포의 내측 및 외측에 대하여 그들의 말단 및 막-통과 분절(들)의 위상에 따라 유형 I, 유형 II 또는 유형 III으로서 규정될 수 있다. 유형 I 막 단백질은 단일 막-걸친 영역을 갖고, 그리고 단백질의 N 말단이 세포의 지질 이중층의 세포외 측면 상에 존재하고 단백질의 C 말단이 세포질 측면 상에 존재하도록 배향정위된다. 유형 II 막 단백질 역시 단일 막-걸친 영역을 갖지만, 단백질의 C 말단이 세포의 지질 이중층의 세포외 측면 상에 존재하고 단백질의 N 말단이 세포질 측면 상에 존재하도록 배향정위된다. 유형 III 막 단백질은 복수의 막-걸친 분절을 갖고, 그리고 막경유 분절의 숫자 및 N-과 C-말단의 위치에 근거하여 더욱 하위분류될 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 CAR의 막경유 도메인은 유형 I 단일-통과 막 단백질로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 다중-통과 막 단백질로부터 막경유 도메인은 또한, 본원에서 설명된 CARs에서 이용에 양립성일 수 있다. 다중-통과 막 단백질은 복합적 (최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상) 알파 나선 또는 베타 시트 구조를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 다중-통과 막 단백질의 N 말단 및 C 말단은 지질 이중층의 대립하는 측면 상에 존재한다, 예를 들면, 단백질의 N 말단은 지질 이중층의 세포질 측면 상에 존재하고 단백질의 C 말단은 세포외 측면 상에 존재한다.
일부 구체예에서, CAR의 막경유 도메인은 T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CDl la, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRFl), CD160, CD19, IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (택타일), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CDIOO (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D 및/또는 NKG2C의 막경유 도메인에서 선택되는 막경유 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1에서 선택된다.
일부 구체예에서, 막경유 도메인은 CD28로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 막경유 도메인은 서열 번호: 194의 아미노산 서열을 포함하는 CD28의 막경유 도메인이다. 일부 구체예에서, CD28의 막경유 도메인은 서열 번호: 203의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
일부 구체예에서, 막경유 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 막경유 도메인은 서열 번호: 193의 아미노산 서열을 포함하는 CD8α의 막경유 도메인이다. 일부 구체예에서, CD8α의 막경유 도메인은 서열 번호: 202의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
본원에서 설명된 CARs에서 이용을 위한 막경유 도메인은 또한, 합성, 비자연발생 단백질 분절의 최소한 일부를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 막경유 도메인은 합성, 비자연발생 알파 나선 또는 베타 시트이다. 일부 구체예에서, 단백질 분절은 최소한 거의 20개 아미노산, 예를 들면, 최소한 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 이상의 아미노산이다. 합성 막경유 도메인의 실례는 당해 분야에서, 예를 들면, U.S. 특허 번호 7,052,906 B1 및 PCT 공개 번호 WO 2000/032776 A2에서 공지되고, 이들의 유관한 개시는 본원에 참조로서 편입된다.
막경유 도메인은 막경유 도메인의 C 말단 측면에서 위치된 막경유 영역 및 세포질 영역을 포함할 수 있다. 막경유 도메인의 세포질 영역은 3개 또는 그 이상의 아미노산을 포함할 수 있고, 그리고 일부 구체예에서, 막경유 도메인을 지질 이중층에서 배향정위하는데 도움을 준다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기가 막경유 도메인의 막경유 영역 내에 존재한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기가 막경유 도메인의 세포질 영역 내에 존재한다. 일부 구체예에서, 막경유 도메인의 세포질 영역은 양성으로 하전된 아미노산을 포함한다. 일부 구체예에서, 막경유 도메인의 세포질 영역은 아미노산 아르기닌, 세린 및 리신을 포함한다.
일부 구체예에서, 막경유 도메인의 막경유 영역은 소수성 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구체예에서, CAR의 막경유 도메인은 인공 소수성 서열을 포함한다. 가령, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중항이 막경유 도메인의 C 말단에서 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 막경유 영역은 주로 소수성 아미노산 잔기, 예를 들면, 알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 또는 발린을 포함한다. 일부 구체예에서, 막경유 영역은 소수성이다. 일부 구체예에서, 막경유 영역은 폴리-류신-알라닌 서열을 포함한다. 수치요법, 또는 단백질 또는 단백질 분절의 소수성 또는 친수성 특징은 당해 분야에서 공지된 임의의 방법, 예를 들면, Kyte 및 Doolittle 수치요법 분석에 의해 사정될 수 있다.
세포내 신호전달 도메인
본 출원의 CARs는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 CARs를 발현하는 면역 작동체 세포의 정상적인 작동체 기능 중에서 최소한 하나의 활성화에 책임을 진다. 용어 "작동체 기능"은 세포의 특수한 기능을 지칭한다. T 세포의 작동체 기능은 예로서, 세포용해 활성 또는 사이토킨의 분비를 비롯한 보조 활성일 수 있다. 따라서 용어 "세포질 신호전달 도메인"은 작동체 기능 신호를 전달하고 세포가 특수한 기능을 수행하도록 주동하는 단백질의 부분을 지칭한다. 비록 통상적으로 전체 세포질 신호전달 도메인이 이용될 수 있긴 하지만, 많은 경우에 전체 사슬을 이용하는 것이 필요하지 않다. 세포질 신호전달 도메인의 절두된 부분이 이용되는 정도까지, 이런 절두된 부분은 이것이 작동체 기능 신호를 전달하기만 하면, 본래 사슬 대신에 이용될 수 있다. 용어 세포질 신호전달 도메인은 따라서, 작동체 기능 신호를 전달하는데 충분한 세포질 신호전달 도메인의 임의의 절두된 부분을 포함하는 것으로 의미된다.
일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, CAR은 면역 작동체 세포의 일차 세포내 신호전달 도메인으로 본질적으로 구성되는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. "일차 세포내 신호전달 도메인"은 면역 작동체 기능을 유도하기 위해 자극성 방식으로 작동하는 세포질 신호전달 서열을 지칭한다. 일부 구체예에서, 일차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기초된 활성화 모티프, 또는 ITAM으로서 알려져 있는 신호전달 모티프를 내포한다. 본원에서 이용된 바와 같이, "ITAM"은 일반적으로, 많은 면역 세포에서 발현되는 신호전달 분자의 꼬리 부분 내에 존재하는 보존된 단백질 모티프이다. 상기 모티프는 6-8개 아미노산에 의해 분리된 아미노산 서열 YxxL/I의 2개 반복을 포함할 수 있는데, 여기서 각 x는 독립적으로 임의의 아미노산이고, 보존된 모티프 YxxL/Ix(6-8)YxxL/I가 생산된다. 신호전달 분자내에 ITAMs는 세포 내에서 신호전달에 중요한데, 이것은 최소한 부분적으로, 신호전달 분자의 활성화 이후에 ITAM 내에 티로신 잔기의 인산화에 의해 매개된다. ITAMs는 또한, 신호전달 경로에 관련된 다른 단백질에 대한 도킹 부위로서 기능할 수 있다. 예시적인 ITAM-내포 일차 세포질 신호전달 서열은 CD3ζ, FcR 감마(FCER1G), FcR 베타 (Fc 엡실론 Rib), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것들을 포함한다.
일부 구체예에서, 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인으로 구성된다. 일부 구체예에서, 일차 세포내 신호전달 도메인은 야생형 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인이다. 일부 구체예에서, 야생형 CD3ζ의 일차 세포내 신호전달 도메인은 서열 번호: 197의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 일차 세포내 신호전달 도메인은 하나 또는 그 이상의 돌연변이, 예를 들면, Q65K를 내포하는 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인의 기능적 돌연변이체이다. 일부 구체예에서, 돌연변이체 CD3ζ의 일차 세포내 신호전달 도메인은 서열 번호: 198의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 일차 세포내 신호전달 도메인은 서열 번호: 206 또는 207의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
동시자극성 신호전달 도메인
많은 면역 작동체 세포는 세포 증식, 분화 및 생존을 증진할 뿐만 아니라 세포의 작동체 기능을 활성화시키기 위해, 항원 특이적 신호의 자극에 더하여, 동시자극을 필요로 한다. 일부 구체예에서, CAR은 최소한 하나의 동시자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "동시자극성 신호전달 도메인"은 세포 내에서 신호전달을 매개하여 면역 반응, 예를 들면, 작동체 기능을 유도하는 단백질의 최소한 일부를 지칭한다. 본원에서 설명된 키메라 수용체의 동시자극성 신호전달 도메인은 동시자극성 단백질로부터 세포질 신호전달 도메인일 수 있는데, 이것은 신호를 전달하고 면역 세포, 예를 들면, T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구 또는 호산구에 의해 매개된 반응을 조정한다. "동시자극성 신호전달 도메인"은 동시자극성 분자의 세포질 부분일 수 있다. 용어 "동시자극성 분자"는 동시자극성 리간드와 특이적으로 결합하고, 따라서 면역 세포에 의한 동시자극성 반응, 예를 들면, 하지만 제한 없이, 증식 및 생존을 매개하는 면역 세포 (가령, T 세포) 상에서 동계 결합 상대를 지칭한다.
일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 단일 동시자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개 또는 그 이상 (가령, 약 2, 3, 4개, 또는 그 이상 중에서 한 가지)의 동시자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개 또는 그 이상의 동일한 동시자극성 신호전달 도메인, 예를 들면, CD28의 동시자극성 신호전달 도메인의 2개 사본을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 상이한 동시자극성 단백질, 예를 들면, 본원에서 설명된 임의의 2개 또는 그 이상의 동시자극성 단백질로부터 2개 또는 그 이상의 동시자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 일차 세포내 신호전달 도메인 (가령, CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인) 및 하나 또는 그 이상의 동시자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 동시자극성 신호전달 도메인 및 일차 세포내 신호전달 도메인 (가령, CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인)은 임의선택적 펩티드 링커를 통해 서로에 융합된다. 일차 세포내 신호전달 도메인 및 하나 또는 그 이상의 동시자극성 신호전달 도메인은 임의의 적절한 순서에서 배열될 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 동시자극성 신호전달 도메인은 막경유 도메인 및 일차 세포내 신호전달 도메인 (가령, CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인) 사이에 위치된다. 복수의 동시자극성 신호전달 도메인이 부가적 또는 상승적 자극 효과를 제공할 수 있다.
숙주 세포 (가령, 면역 세포)에서 동시자극성 신호전달 도메인의 활성화는 상기 세포가 사이토킨의 생산 및 분비, 식균 성질, 증식, 분화, 생존 및/또는 세포독성을 증가 또는 감소시키도록 유도할 수 있다. 임의의 동시자극성 분자의 동시자극성 신호전달 도메인은 본원에서 설명된 CARs에서 이용에 양립할 수 있다. 동시자극성 신호전달 도메인의 유형(들)은 작동체 분자가 발현될 면역 작동체 세포의 유형 (가령, T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구, 또는 호산구) 및 원하는 면역 작동체 기능 (가령, ADCC 효과)과 같은 인자에 근거하여 선별된다. CARs에서 이용을 위한 동시자극성 신호전달 도메인의 실례는 제한 없이, B7/CD28 패밀리의 구성원 (가령, B7-1/CD80, B7-2/CD86, B7-H1/PD-L1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, B7-H7, BTLA/CD272, CD28, CTLA-4, Gi24/VISTA/B7-H5, ICOS/CD278, PD- 1, PD-L2/B7-DC 및 PDCD6); TNF 상과의 구성원 (가령, 4- 1BB/TNFSF9/CD137, 4-1BB 리간드/TNFSF9, BAFF/BLyS/TNFSF13B, BAFF R/TNFRSF13C, CD27/TNFRSF7, CD27 리간드/TNFSF7, CD30/TNFRSF8, CD30 리간드/TNFSF8, CD40/TNFRSF5, CD40/TNFSF5, CD40 리간드/TNFSF5, DR3/TNFRSF25, GITR/TNFRSF18, GITR 리간드/TNFSF18, HVEM/TNFRSF14, LIGHT/TNFSF14, 림프독소-알파/TNF-베타, OX40/TNFRSF4, OX40 리간드/TNFSF4, RELT/TNFRSF19L, TACI/TNFRSF13B, TL1A/TNFSF15, TNF-알파 및 TNF RII/TNFRSF1B); SLAM 패밀리의 구성원 (가령, 2B4/CD244/SLAMF4, BLAME/SLAMF8, CD2, CD2F-10/SLAMF9, CD48/SLAMF2, CD58/LFA-3, CD84/SLAMF5, CD229/SLAMF3, CRACC/SLAMF7, NTB-A/SLAMF6 및 SLAM/CD150); 그리고 임의의 다른 동시자극성 분자, 예를 들면, CD2, CD7, CD53, CD82/Kai-1, CD90/Thy1, CD96, CD160, CD200, CD300a/LMIR1, HLA 클래스 I, HLA- DR, 이카로스, 인테그린 알파 4/CD49d, 인테그린 알파 4 베타 1, 인테그린 알파 4 베타 7/LPAM-1, LAG-3, TCL1A, TCL1B, CRTAM, DAP12, 덱틴-1/CLEC7A, DPPIV/CD26, EphB6, TIM-1/KIM-1/HAVCR, TIM-4, TSLP, TSLP R, 림프구 기능 연관된 항원-1 (LFA-1), 그리고 NKG2C를 포함하는, 동시자극성 단백질의 세포질 신호전달 도메인일 수 있다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 동시자극성 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, CD3, 림프구 기능-연관된 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 그리고 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 본 출원의 CAR에서 세포내 신호전달 도메인은 CD28로부터 유래된 동시자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인 및 CD28의 동시자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열 번호: 195의 아미노산 서열을 포함하는 CD28의 동시자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, CD28의 동시자극성 신호전달 도메인은 서열 번호: 204의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
일부 구체예에서, 본 출원의 CAR에서 세포내 신호전달 도메인은 CD137로부터 유래된 동시자극성 신호전달 도메인 (즉, 4-1BB)을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인 및 CD137의 동시자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열 번호: 196의 아미노산 서열을 포함하는 CD137의 동시자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, CD137의 동시자극성 신호전달 도메인은 서열 번호: 205의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
일부 구체예에서, 본 출원의 CAR에서 세포내 신호전달 도메인은 CD28의 동시자극성 신호전달 도메인 및 CD137의 동시자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인, CD28의 동시자극성 신호전달 도메인, 그리고 CD137의 동시자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 N 말단으로부터 C 말단으로 CD28의 동시자극성 신호전달 도메인, CD137의 동시자극성 신호전달 도메인, 그리고 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 195의 아미노산 서열을 포함하는 CD28의 동시자극성 신호전달 도메인. 일부 구체예에서, 서열 번호: 196의 아미노산 서열을 포함하는 CD137의 동시자극성 신호전달 도메인.
동시자극성 신호전달 도메인이 면역 세포의 면역 반응을 조정할 수 있도록, 본원에서 설명된 동시자극성 신호전달 도메인 중에서 한 가지의 변이체 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 일부 구체예에서, 동시자극성 신호전달 도메인은 야생형 대응물과 비교하여 최대 10개 아미노산 잔기 변이 (가령, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 8개)를 포함한다. 하나 또는 그 이상의 아미노산 변이를 포함하는 이런 동시자극성 신호전달 도메인은 변이체로서 지칭될 수 있다. 동시자극성 신호전달 도메인의 아미노산 잔기의 돌연변이는 돌연변이를 포함하지 않는 동시자극성 신호전달 도메인에 비하여 신호 전달에서 증가 및 면역 반응의 증강된 자극을 유발할 수 있다. 동시자극성 신호전달 도메인의 아미노산 잔기의 돌연변이는 돌연변이를 포함하지 않는 동시자극성 신호전달 도메인에 비하여 신호 전달에서 감소 및 면역 반응의 감소된 자극을 유발할 수 있다.
힌지 영역
본 출원의 CARs는 세포외 항원 결합 도메인 및 막경유 도메인 사이에 위치되는 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 힌지 도메인은 단백질의 두 도메인 사이에서 일반적으로 발견되고, 그리고 단백질의 유연성 및 서로에 대하여 이들 도메인 중에서 어느 하나 또는 둘 모두의 움직임을 허용할 수 있는 아미노산 분절이다. 작동체 분자의 막경유 도메인에 대하여 세포외 항원 결합 도메인의 이런 유연성과 움직임을 제공하는 임의의 아미노산 서열이 이용될 수 있다.
힌지 도메인은 약 10-100개 아미노산, 예를 들면, 약 15-75개 아미노산, 20-50개 아미노산, 또는 30-60개 아미노산 중에서 한 가지를 내포할 수 있다. 일부 구체예에서, 힌지 도메인은 최소한 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 또는 75개 아미노산 길이 중에서 한 가지일 수 있다.
일부 구체예에서, 힌지 도메인은 자연발생 단백질의 힌지 도메인이다. 당해 분야에서 힌지 도메인을 포함하는 것으로 공지된 임의의 단백질의 힌지 도메인은 본원에서 설명된 키메라 수용체에서 이용에 양립한다. 일부 구체예에서, 힌지 도메인은 자연발생 단백질의 힌지 도메인의 최소한 일부이고 키메라 수용체에 유연성을 부여한다. 일부 구체예에서, 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 힌지 도메인은 CD8α의 힌지 도메인의 부분, 예를 들면, CD8α의 힌지 도메인의 최소한 15개 (가령, 20, 25, 30, 35, 또는 40개) 연속 아미노산을 내포하는 단편이다. 일부 구체예에서, CD8α의 힌지 도메인은 서열 번호: 192의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, CD8α의 힌지 도메인은 서열 번호: 201의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
항체, 예를 들면, IgG, IgA, IgM, IgE 또는 IgD 항체의 힌지 도메인은 또한, 본원에서 설명된 pH-의존성 키메라 수용체 시스템에서 이용에 양립한다. 일부 구체예에서, 힌지 도메인은 항체의 불변 도메인 CH1 및 CH2를 연결하는 힌지 도메인이다. 일부 구체예에서, 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인이고, 그리고 상기 항체의 힌지 도메인 및 상기 항체의 하나 또는 그 이상의 불변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인 및 상기 항체의 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인 및 상기 항체의 CH2와 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 IgG 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체이다. 일부 구체예에서, 힌지 영역은 IgG1 항체의 힌지 영역 및 CH2와 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 힌지 영역은 IgG1 항체의 힌지 영역 및 CH3 불변 영역을 포함한다.
비자연발생 펩티드 역시 본원에서 설명된 키메라 수용체에 대한 힌지 도메인으로서 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인의 C 말단 및 막경유 도메인의 N 말단 사이에 힌지 도메인은 펩티드 링커, 예를 들면, (GxS)n 링커이고, 여기서 x 및 n은 독립적으로 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 그 이상을 비롯하여, 3 및 12 사이의 정수일 수 있다.
신호 펩티드
본 출원의 CARs는 폴리펩티드의 N 말단에서 신호 펩티드 (신호 서열로서 또한 알려져 있음)를 포함할 수 있다. 일반적으로, 신호 펩티드는 폴리펩티드를 세포 내에 원하는 부위로 표적화시키는 펩티드 서열이다. 일부 구체예에서, 신호 펩티드는 작동체 분자를 세포의 분비 경로로 표적화시키고, 그리고 작동체 분자의 지질 이중층 내로의 통합 및 정착을 허용할 것이다. 본원에서 설명된 CARs에서 이용에 양립하는, 자연발생 단백질의 신호 서열 또는 합성, 비자연발생 신호 서열을 비롯한 신호 펩티드는 당업자에게 명백할 것이다. 일부 구체예에서, 신호 펩티드는 CD8α, GM-CSF 수용체 α 및 IgG1 중쇄로 구성된 군에서 선택되는 분자로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 신호 펩티드는 CD8α로부터 유래된다. 일부 구체예에서, CD8α의 신호 펩티드는 서열 번호: 191의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, CD8α의 신호 펩티드는 서열 번호: 199 또는 200의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
IV. 가공된 면역 작동체 세포
본원에서 설명된 CARs 중에서 한 가지를 포함하는 숙주 세포 (가령, 면역 작동체 세포)가 본 출원에서 더욱 제공된다.
따라서, 일부 구체예에서, (a) BCMA의 첫 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 및 BCMA의 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 두 번째 BCMA 결합 모이어티를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 다가 CAR을 포함하는 가공된 면역 작동체 세포 (가령, T 세포)가 제공되고, 여기서 첫 번째 에피토프 및 두 번째 에피토프는 상이하다.
일부 구체예에서, (a) BCMA의 첫 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 첫 번째 항-BCMA sdAb 및 BCMA의 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 두 번째 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 다가 CAR을 포함하는 가공된 면역 작동체 세포 (가령, T 세포)가 제공되고, 여기서 첫 번째 에피토프 및 두 번째 에피토프는 상이하다. 일부 구체예에서, 첫 번째 항-BCMA sdAb 및/또는 두 번째 항-BCMA sdAb는 낙타, 키메라, 인간 또는 인간화이다. 일부 구체예에서, 첫 번째 항-BCMA 및 두 번째 항-BCMA는 펩티드 결합 또는 펩티드 링커를 통해 서로에 융합된다. 일부 구체예에서, 펩티드 링커는 약 50개 이내 (가령, 약 35, 25, 20, 15, 10, 또는 5개 이내)의 아미노산 길이이다. 일부 구체예에서, 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포 (가령, T 세포)의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 동시자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 동시자극성 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 동시자극성 분자로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 다가 CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 C 말단 및 막경유 도메인의 N 말단 사이에 위치된 힌지 도메인 (가령, CD8α 힌지 도메인)을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 다가 CAR은 폴리펩티드의 N 말단에서 위치된 신호 펩티드 (가령, CD8α 신호 펩티드)를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로 다음을 포함한다: CD8α 신호 펩티드, 세포외 항원 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막경유 도메인, CD137로부터 유래된 동시자극성 신호전달 도메인, 그리고 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예에서, 가공된 면역 작동체 세포는 T 세포, NK 세포, 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 조혈 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 또는 배아 줄기 세포이다. 일부 구체예에서, 가공된 면역 작동체 세포는 자가이다. 일부 구체예에서, 가공된 면역 작동체 세포는 동종이계이다.
일부 구체예에서, (a) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 BCMA CAR을 포함하는 가공된 면역 작동체 세포 (가령, T 세포)가 제공되고, 여기서 항-BCMA sdAb는 다음 중에서 한 가지를 포함한다: (1) 서열 번호:1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (2) 서열 번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (3) 서열 번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (4) 서열 번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:80의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (5) 서열 번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:81의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (6) 서열 번호:6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:82의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (7) 서열 번호:7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:83의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (8) 서열 번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:84의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (9) 서열 번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:85의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (10) 서열 번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:86의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (11) 서열 번호:11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:87의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (12) 서열 번호:12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:88의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (13) 서열 번호:13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (14) 서열 번호:14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:90의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (15) 서열 번호:15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:91의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (16) 서열 번호:16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:92의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (17) 서열 번호:17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (18) 서열 번호:18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:94의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (19) 서열 번호:19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:57의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:95의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (20) 서열 번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:96의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (21) 서열 번호:21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:97의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (22) 서열 번호:22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:98의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (23) 서열 번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:99의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (24) 서열 번호:24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (25) 서열 번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:101의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (26) 서열 번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:102의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (27) 서열 번호:27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (28) 서열 번호:28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:66의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:104의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (29) 서열 번호:29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:105의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (30) 서열 번호:30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:106의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (31) 서열 번호:31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:69의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:107의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (32) 서열 번호:32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:70의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:108의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (33) 서열 번호:33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:71의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:109의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (34) 서열 번호:34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:110의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (35) 서열 번호:35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (36) 서열 번호:36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:112의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (37) 서열 번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:75의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 (38) 서열 번호:38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:76의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3. 일부 구체예에서, 세포외 항원 결합 도메인은 최소한 2개의 항-BCMA sdAbs를 포함한다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 낙타, 키메라, 인간 또는 인간화이다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 115-152로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VHH 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포 (가령, T 세포)의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 동시자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 동시자극성 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 동시자극성 분자로부터 유래된다. 일부 구체예에서, BCMA CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 C 말단 및 막경유 도메인의 N 말단 사이에 위치된 힌지 도메인 (가령, CD8α 힌지 도메인)을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, BCMA CAR은 폴리펩티드의 N 말단에서 위치된 신호 펩티드 (가령, CD8α 신호 펩티드)를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로 다음을 포함한다: CD8α 신호 펩티드, 세포외 항원 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD28 막경유 도메인, CD28로부터 유래된 첫 번째 동시자극성 신호전달 도메인, CD137로부터 유래된 두 번째 동시자극성 신호전달 도메인, 그리고 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로 다음을 포함한다: CD8α 신호 펩티드, 세포외 항원 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막경유 도메인, CD137로부터 유래된 동시자극성 신호전달 도메인, 그리고 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예에서, BCMA CAR은 서열 번호: 216-256, 298-335로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 가공된 면역 작동체 세포는 T 세포, NK 세포, 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 조혈 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 또는 배아 줄기 세포이다. 일부 구체예에서, 가공된 면역 작동체 세포는 자가이다. 일부 구체예에서, 가공된 면역 작동체 세포는 동종이계이다.
2개 또는 그 이상의 상이한 CARs를 포함하는 (또는 발현하는) 가공된 면역 작동체 세포 역시 제공된다. 본원에서 설명된 임의의 2개 또는 그 이상의 CARs는 조합으로 발현될 수 있다. 이들 CARs는 상이한 항원을 표적으로 하고, 따라서 상승적 또는 부가적 효과를 제공할 수 있다. CARs의 세포외 항원 결합 도메인에서 단일-도메인 항체가 단지 단일 항원 가변 사슬 (가령, 중쇄)을 갖기 때문에, 이런 CAR-발현 세포는 2개 또는 그 이상의 scFv-기초된 CARs를 공동발현하는 가공된 면역 작동체 세포에서 목격되는 바와 같은 가변 사슬 짝짓기오류 문제를 갖지 않는다. 2개의 VHH-기초된 CARs를 공동발현하는 예시적인 가공된 면역 작동체 세포는 도면 15e에서 도해된다. 당업자는 다른 sdAbs에 근거되거나 또는 본원에서 설명된 바와 같은 다른 구조를 갖는 CARs 역시 가공된 면역 작동체 세포에서 공동발현될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 2개 또는 그 이상의 CARs는 동일한 벡터 또는 상이한 벡터에서 인코딩될 수 있다.
가공된 면역 작동체 세포는 하나 또는 그 이상의 치료적 단백질 및/또는 면역조절제, 예를 들면, 면역 체크포인트 저해제를 더욱 발현할 수 있다. 가령, 국제 특허 출원 번호 PCT/CN2016/073489 및 PCT/CN2016/087855를 참조하는데, 이들은 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다.
벡터
본 출원은 본원에서 설명된 CARs 중에서 한 가지를 클로닝하고 발현하기 위한 벡터를 제공한다. 일부 구체예에서, 벡터는 진핵 세포, 예를 들면, 포유류 세포에서 복제 및 통합에 적합하다. 일부 구체예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터의 실례는 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관된 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 우두 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터, 그리고 이들의 유도체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 바이러스 벡터 기술은 당해 분야에서 널리 공지되고, 그리고 예로서, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)에서 및 다른 바이러스학과 분자생물학 매뉴얼에서 설명된다.
포유류 세포 내로 유전자 전달을 위한 다수의 바이러스 기초된 시스템이 개발되었다. 가령, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편의한 플랫폼을 제공한다. 이종성 핵산은 벡터 내로 삽입되고, 그리고 당해 분야에서 공지된 기술을 이용하여 레트로바이러스 입자에서 포장될 수 있다. 재조합 바이러스는 이후, 단리되고, 그리고 가공된 포유류 세포에 시험관내 또는 탈체에서 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 당해 분야에서 공지된다. 일부 구체예에서, 아데노바이러스 벡터가 이용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터가 당해 분야에서 공지된다. 일부 구체예에서, 렌티바이러스 벡터가 이용된다. 일부 구체예에서, 자가-비활성화 렌티바이러스 벡터가 이용된다. 가령, 면역조절제 (가령, 면역 체크포인트 저해제) 코딩 서열을 보유하는 자가-비활성화 렌티바이러스 벡터 및/또는 CARs를 보유하는 자가-비활성화 렌티바이러스 벡터는 당해 분야에서 공지된 프로토콜로 포장될 수 있다. 결과의 렌티바이러스 벡터는 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여 포유류 세포 (가령, 일차 인간 T 세포)를 형질도입하는데 이용될 수 있다. 레트로바이러스, 예를 들면, 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 장기간 유전자 전달을 달성하는데 적합한 도구인데, 그 이유는 이들이 도입유전자의 장기간, 안정된 통합 및 자손 세포에서 이의 증식을 허용하기 때문이다. 렌티바이러스 벡터는 또한, 낮은 면역원성을 갖고, 그리고 비-증식 세포를 형질도입할 수 있다.
일부 구체예에서, 벡터는 비바이러스 벡터이다. 일부 구체예에서, 벡터는 트랜스포손, 예를 들면, 잠자는 미녀 (SB) 트랜스포손 시스템, 또는 PiggyBac 트랜스포손 시스템이다. 일부 구체예에서, 벡터는 예로서, 폴리(젖산-코-글리콜산) (PLGA) 및 폴리 젖산 (PLA), 폴리(에틸렌 이민) (PEI), 그리고 덴드리머를 포함하는 중합체-기초된 비바이러스 벡터이다. 일부 구체예에서, 벡터는 양이온성-지질 기초된 비바이러스 벡터, 예를 들면, 양이온성 리포솜, 지질 나노에멀젼 및 고체 지질 나노입자 (SLN)이다. 일부 구체예에서, 벡터는 펩티드-기초된 유전자 비바이러스 벡터, 예를 들면, 폴리-L-리신이다. 유전체 편집에 적합한 임의의 공지된 비바이러스 벡터가 가공된 면역 작동체 세포에 CAR-인코딩 핵산을 도입하는데 이용될 수 있다. 가령, Yin H. et al. Nature Rev. Genetics (2014) 15:521-555; Aronovich EL et al. "The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy." Hum. Mol. Genet. (2011) R1: R14-20; 및 Zhao S. et al. "PiggyBac transposon vectors: the tools of the human gene editing." Transl. Lung Cancer Res. (2016) 5(1): 120-125를 참조하는데, 이들은 본원에 참조로서 편입된다. 일부 구체예에서, CAR을 인코딩하는 핵산 중에서 한 가지 또는 그 이상은 전기천공, 소노포레이션, 포토포레이션, 마그네토펙션, 하이드로포레이션을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 물리적 방법에 의해, 가공된 면역 작동체 세포에 도입된다.
일부 구체예에서, 벡터는 본원에서 설명된 CAR을 인코딩하는 핵산 중에서 한 가지를 포함한다. 핵산은 예로서, 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 또는 그 이상의 선별가능 마커를 이용하는 것을 비롯하여, 당해 분야에서 임의의 공지된 분자 클로닝 방법을 이용하여 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 포유류 세포에서 유전자 발현을 위한 다양한 프로모터가 탐구되었고, 그리고 당해 분야에서 공지된 임의의 프로모터가 본 발명에서 이용될 수 있다. 프로모터는 구조성 프로모터 또는 조절된 프로모터, 예를 들면, 유도성 프로모터로서 거의 분류될 수 있다.
일부 구체예에서, CAR을 인코딩하는 핵산은 구조성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 구조성 프로모터는 이종성 유전자 (도입유전자로서 또한 지칭됨)가 숙주 세포에서 구조성으로 발현되도록 허용한다. 본원에서 예기된 예시적인 구조성 프로모터는 시토메갈로바이러스 (Cytomegalovirus) (CMV) 프로모터, 인간 연장 인자-1알파 (hEF1α), 유비퀴틴 C 프로모터 (UbiC), 포스포글리세로키나아제 프로모터 (PGK), 유인원 바이러스 40 초기 프로모터 (SV40), 그리고 CMV 초기 인핸서 (CAGG)와 연계된 닭 β-액틴 프로모터를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 도입유전자 발현을 주동하는데 있어서 이런 구조성 프로모터의 효율은 엄청나게 많은 수의 연구에서 폭넓게 비교되었다. 가령, Michael C. Milone et al은 일차 인간 T 세포에서 CAR 발현을 주동하는 CMV, hEF1α, UbiC 및 PGK의 효율을 비교하고, 그리고 hEF1α 프로모터가 가장 높은 수준의 도입유전자 발현을 유도할 뿐만 아니라 CD4 및 CD8 인간 T 세포에서 최적으로 유지된다는 결론을 내렸다 (Molecular Therapy, 17(8): 1453-1464 (2009)). 일부 구체예에서, CAR을 인코딩하는 핵산은 hEF1α 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 구체예에서, CAR을 인코딩하는 핵산은 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 유도성 프로모터는 조절된 프로모터의 범주에 속한다. 유도성 프로모터는 하나 또는 그 이상의 조건, 예를 들면, 신체 상태, 가공된 면역 작동체 세포의 미세환경, 또는 가공된 면역 작동체 세포의 생리학적 상태, 유도인자 (다시 말하면, 유도제), 또는 이들의 조합에 의해 유도될 수 있다. 일부 구체예에서, 유도 조건은 가공된 포유류 세포에서 및/또는 제약학적 조성물을 제공받는 개체에서 내인성 유전자의 발현을 유도하지 않는다. 일부 구체예에서, 유도 조건은 다음과 같이 구성된 군에서 선택된다: 유도인자, 방사선조사 (가령, 전리 방사선, 광), 온도 (가령, 열), 산화환원 상태, 종양 환경, 그리고 가공된 포유류 세포의 활성화 상태.
일부 구체예에서, 벡터는 또한, 렌티바이러스 벡터를 통해 형질감염된 숙주 세포의 개체군으로부터 CAR을 발현하는 세포를 선별하기 위한 선별가능 마커 유전자 또는 리포터 유전자를 내포한다. 선별가능 마커 및 리포터 유전자 둘 모두 숙주 세포에서 발현을 할 수 있게 하는 적절한 조절 서열과 측면에서 접할 수 있다. 가령, 벡터는 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열, 그리고 핵산 서열의 발현의 조절에 유용한 프로모터를 내포할 수 있다.
일부 구체예에서, 벡터는 CARs를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 벡터는 첫 번째 CAR을 인코딩하는 첫 번째 핵산 서열 및 두 번째 CAR을 인코딩하는 두 번째 핵산 서열을 포함하는 핵산을 포함하는데, 여기서 첫 번째 핵산은 자가-개열 펩티드를 인코딩하는 세 번째 핵산 서열을 통해 두 번째 핵산에 작동가능하게 연결된다. 일부 구체예에서, 자가-개열 펩티드는 T2A, P2A 및 F2A로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, T2A 펩티드는 서열 번호: 385의 아미노산 서열을 갖는다.
면역 작동체 세포
"면역 작동체 세포"는 면역 작동체 기능을 수행할 수 있는 면역 세포이다. 일부 구체예에서, 면역 작동체 세포는 최소한 FcγRIII을 발현하고 ADCC 작동체 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 면역 작동체 세포의 실례는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 자연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포, 호중구, 그리고 호산구를 포함한다.
일부 구체예에서, 면역 작동체 세포는 T 세포이다. 일부 구체예에서, T 세포는 CD4+/CD8-, CD4-/CD8+, CD4+/CD8+, CD4-/CD8-, 또는 이들의 조합이다. 일부 구체예에서, T 세포는 CAR을 발현하고 표적 세포, 예를 들면, CD20+ 또는 CD19+ 종양 세포에 결합 시에 IL-2, TFN 및/또는 TNF를 생산한다. 일부 구체예에서, CD8+ T 세포는 CAR을 발현하고 표적 세포에 결합 시에 항원 특이적 표적 세포를 용해한다.
일부 구체예에서, 면역 작동체 세포는 NK 세포이다. 다른 구체예에서, 면역 작동체 세포는 확립된 세포주, 예를 들면, NK-92 세포일 수 있다.
일부 구체예에서, 면역 작동체 세포는 줄기 세포, 예를 들면, 조혈 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, iPS, 또는 배아 줄기 세포와 구별된다.
가공된 면역 작동체 세포는 CARs를 면역 작동체 세포, 예를 들면, T 세포 내로 도입함으로써 제조된다. 일부 구체예에서, CAR은 섹션 III에서 설명된 단리된 핵산 중에서 한 가지 또는 벡터 중에서 한 가지를 형질감염시킴으로써 면역 작동체 세포에 도입된다. 일부 구체예에서, CAR은 세포를 미소유체 시스템, 예를 들면, CELL SQUEEZE®를 통해 통과시키는 동안 단백질을 세포막 내로 삽입함으로써 면역 작동체 세포에 도입된다 (가령, U.S. 특허 출원 공개 번호 20140287509를 참조한다).
벡터 또는 단리된 핵산을 포유류 세포 내로 도입하는 방법은 당해 분야에서 공지된다. 설명된 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 방법에 의해 면역 작동체 세포 내로 이전될 수 있다.
벡터를 면역 작동체 세포 내로 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 현미주입, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하기 위한 방법은 당해 분야에서 널리 공지된다. 가령, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York을 참조한다. 일부 구체예에서, 벡터는 전기천공에 의해 세포 내로 도입된다.
벡터를 면역 작동체 세포 내로 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 이용을 포함한다. 바이러스 벡터는 유전자를 포유류, 예를 들면, 인간 세포 내로 삽입하기 위한 가장 폭넓게 이용되는 방법이 되고 있다.
벡터를 면역 작동체 세포 내로 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드 분산 시스템, 예를 들면, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드, 그리고 수중유 유제, 미셀, 혼합된 미셀 및 리포솜을 비롯한 지질-기초된 시스템을 포함한다. 시험관내에서 전달 수송체로서 이용을 위한 예시적인 콜로이드성 시스템은 리포솜 (가령, 인공 막 소포)이다.
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 CARs 중에서 한 가지를 인코딩하는 RNA 분자는 전통적인 방법 (가령, 시험관내 전사)에 의해 제조되고, 그리고 이후, 공지된 방법, 예를 들면, mRNA 전기천공을 통해 면역 작동체 세포 내로 도입될 수 있다. 가령, Rabinovich et al., Human Gene Therapy 17:1027-1035을 참조한다.
일부 구체예에서, 형질도입된 또는 형질감염된 면역 작동체 세포는 벡터 또는 단리된 핵산의 도입 후 탈체에서 증식된다. 일부 구체예에서, 형질도입된 또는 형질감염된 면역 작동체 세포는 증식하도록 최소한 약 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 10 일, 12 일, 또는 14 일 중에서 한 가지 동안 배양된다. 일부 구체예에서, 형질도입된 또는 형질감염된 면역 작동체 세포는 가공된 포유류 세포를 선별하기 위해 더욱 평가되거나 또는 선별검사된다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하고 조절 서열의 기능성을 평가하는데 이용될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용자 생물체 또는 조직에서 존재하지 않거나 또는 이것에 의해 발현되지 않고, 그리고 발현이 쉽게 검출가능한 일부 성질, 예를 들면, 효소 활성에 의해 현성되는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포 내로 도입된 후 적절한 시점에서 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시페라아제, 베타-갈락토시다아제, 클로람페니콜 아세틸 전달효소, 분비된 알칼리 인산분해효소를 인코딩하는 유전자, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 포함할 수 있다 (가령, Ui-Tei et al. FEBS Letters 479: 79-82 (2000)). 적합한 발현 시스템은 널리 알려져 있고, 그리고 공지된 기술을 이용하여 제조되거나 또는 상업적으로 획득될 수 있다.
가공된 면역 작동체 세포에서 CARs를 인코딩하는 핵산의 존재를 확증하는 다른 방법은 예로서, 당업자에게 널리 공지된 분자 생물학적 검정, 예를 들면, 서던 및 노던 블로팅, RT-PCR 및 PCR; 생화학적 검정, 예를 들면, 예로서 면역학적 방법 (가령, ELISAs 및 웨스턴 블롯)에 의한 특정 펩티드의 존재 또는 부재의 검출을 포함한다.
1. T 세포의 공급원
T 세포의 확대 및 유전자 변형에 앞서, T 세포의 공급원이 개체로부터 획득된다. T 세포는 말초혈 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직 및 종양을 비롯한 다수의 공급원으로부터 획득될 수 있다. 일부 구체예에서, 당해 분야에서 가용한 수많은 T 세포주가 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포는 당업자에게 공지된 수많은 기술, 예를 들면, FICOLL™ 분리를 이용하여 개체로부터 수집된 혈액의 단위로부터 획득될 수 있다. 일부 구체예에서, 개체의 순환 혈액으로부터 세포는 성분채집술에 의해 획득된다. 성분채집술 산물은 전형적으로, T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 비롯한 림프구를 내포한다. 일부 구체예에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포는 혈장 분획물을 제거하고, 그리고 이들 세포를 차후 처리 단계를 위한 적절한 완충액 또는 배지에 배치하기 위해 세척될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 인산염 완충된 식염수 (PBS)로 세척된다. 일부 구체예에서, 세척 용액은 칼슘을 결여하고, 그리고 마그네슘을 결여할 수 있거나 또는 전체는 아니지만 많은 이가 양이온을 결여할 수 있다. 다시 한 번, 놀랍게도, 칼슘의 부재에서 초기 활성화 단계는 확대된 활성화를 야기한다. 당업자가 쉽게 인지하는 바와 같이, 세척 단계는 당업자에게 공지된 방법에 의해, 예를 들면, 제조업체의 사용설명서에 따라서 반자동화 "관류" 원심분리기 (가령, Cobe 2991 세포 프로세서, Baxter CytoMate, 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 이용함으로써 달성될 수 있다. 세척한 후, 세포는 다양한 생체적합성 완충액, 예를 들면, 예로서, Ca2+-없는, Mg2+-없는 PBS, 플라스마라이트 A, 또는 완충액이 있거나 또는 없는 다른 식염수에서 재현탁될 수 있다. 대안으로, 성분채집술 표본의 바람직하지 않은 성분은 제거될 수 있고, 그리고 세포는 배양 배지에서 직접적으로 재현탁될 수 있다.
일부 구체예에서, T 세포는 적혈구를 용해시키고, 그리고 예로서, PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 역류 원심 정화에 의해 단핵구를 고갈시킴으로써 말초혈 림프구로부터 단리된다. T 세포의 특정한 아개체군, 예를 들면, CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및 CD45RO+T 세포는 양성 또는 음성 선별 기술에 의해 더욱 단리될 수 있다. 가령, 일부 구체예에서, T 세포는 원하는 T 세포의 양성 선별을 위한 충분한 기간 동안, 항-CD3/항-CD28 (즉, 3x28)-접합된 비드, 예를 들면, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T와 함께 배양에 의해 단리된다. 일부 구체예에서, 기간은 약 30 분이다. 추가 구체예에서, 기간은 30 분 내지 36 시간 또는 그 이상 및 이들 사이에 모든 정수 값의 범위에서 변한다. 추가 구체예에서, 기간은 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 시간이다. 일부 구체예에서, 기간은 10 내지 24 시간이다. 일부 구체예에서, 배양 기간은 24 시간이다. 백혈병을 앓는 환자로부터 T 세포의 단리의 경우에, 더욱 긴 배양 시간, 예를 들면, 24 시간의 이용은 세포 수율을 증가시킬 수 있다. 다른 세포 유형과 비교하여 소수의 T 세포가 있는 임의의 환경에서, 예를 들면, 종양 조직으로부터 또는 면역-약화된 개체로부터 종양 침윤성 림프구 (TIL)를 단리하는 경우에, 더욱 긴 배양 시간이 T 세포를 단리하는데 이용될 수 있다. 게다가, 더욱 긴 배양 시간의 이용은 CD8+ T 세포의 포획의 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합하도록 허용되는 시간을 단순히 단축하거나 또는 늘림으로써 및/또는 비드 대 T 세포의 비율을 증가시키거나 또는 감소시킴으로써 (본원에서 더욱 설명된 바와 같이), T 세포의 아개체군이 배양 개시에서 또는 상기 과정 동안 다른 시점에서, 위하여 또는 대항하여 우선적으로 선별될 수 있다. 추가적으로, 비드 또는 다른 표면 상에서 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비율을 증가시키거나 또는 감소시킴으로써, T 세포의 아개체군은 배양 개시에서 또는 다른 원하는 시점에서, 위하여 또는 대항하여 우선적으로 선별될 수 있다. 당업자는 복수 라운드의 선별이 또한 이용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일부 구체예에서, 선별 절차를 수행하고, 그리고 "비선택된" 세포를 활성화 및 확대 과정에서 이용하는 것이 바람직할 수 있다. "비선택된" 세포는 또한, 추가 라운드의 선별에 종속될 수 있다.
음성 선별에 의한 T 세포 개체군의 농축은 음성으로 선별된 세포에 독특한 표면 마커에 지향된 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 한 가지 방법은 음성 자성 면역부착 또는 유세포분석법을 통한 세포 분류 및/또는 선별인데, 이것은 음성으로 선별된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 지향된 단일클론 항체의 칵테일을 이용한다. 가령, 음성 선별에 의해 CD4+ 세포를 농축하기 위해, 단일클론 항체 칵테일은 전형적으로, CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일정한 구체예에서, CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ 및 FoxP3+을 전형적으로 발현하는 조절 T 세포를 농축하거나 또는 양성으로 선별하는 것이 바람직할 수 있다. 대안으로, 일정한 구체예에서, T 조절 세포는 항-C25 접합된 비드 또는 다른 유사한 선별 방법에 의해 고갈된다.
양성 또는 음성 선별에 의한 원하는 세포 개체군의 단리의 경우에, 세포 및 표면 (가령, 입자, 예를 들면, 비드)의 농도가 변할 수 있다. 일정한 구체예에서, 세포 및 비드의 최대 접촉을 담보하기 위해, 비드 및 세포가 함께 혼합되는 용적을 유의미하게 감소시키는 (즉, 세포의 농도를 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 가령, 한 구체예에서, 2 십억 세포/ml의 농도가 이용된다. 한 구체예에서, 1 십억 세포/ml의 농도가 이용된다. 추가 구체예에서, 100 백만 세포/ml 이상이 이용된다. 추가 구체예에서, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 백만 세포/ml의 세포 농도가 이용된다. 또 다른 구체예에서, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 백만 세포/ml의 세포 농도가 이용된다. 추가 구체예에서, 125 또는 150 백만 세포/ml의 농도가 이용될 수 있다. 높은 농도를 이용하는 것은 증가된 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확대를 유발할 수 있다. 게다가, 높은 세포 농도의 이용은 많은 종양 세포가 존재하는 표본 (즉, 백혈병성 혈액, 종양 조직 등)으로부터, 관심되는 표적 항원, 예를 들면, CD28-음성 T 세포를 약하게 발현할 수 있는 세포의 더욱 효율적인 포획을 허용한다. 이런 세포 개체군은 치료적 가치를 가질 수 있고, 그리고 획득하는데 바람직할 것이다. 가령, 높은 농도의 세포를 이용하는 것은 정상적으로 더욱 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 더욱 효율적인 선별을 허용한다.
일부 구체예에서, 더욱 낮은 농도의 세포를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포 및 표면 (가령, 입자, 예를 들면, 비드)의 혼합물을 유의미하게 희석함으로써, 이들 입자 및 세포 사이의 상호작용이 최소화된다. 이것은 입자에 결합되는 많은 양의 원하는 항원을 발현하는 세포를 선별한다. 가령, CD4+ T 세포는 더욱 높은 수준의 CD28을 발현하고, 그리고 묽은 농도에서 CD8+ T 세포보다 더욱 효율적으로 포획된다. 일부 구체예에서, 이용되는 세포 농도는 5x106/ml이다. 일부 구체예에서, 이용되는 농도는 약 1x105/ml 내지 1x106/ml, 그리고 중간에 임의의 정수 값일 수 있다.
일부 구체예에서, 세포는 2-10℃에서, 또는 실온에서 변하는 속도에서 변하는 시간 길이 동안 회전기에서 배양될 수 있다.
자극을 위한 T 세포는 또한, 세척 단계 후 동결될 수 있다. 이론에 의해 한정됨 없이, 동결 및 차후 해동 단계는 세포 개체군에서 과립구 및 얼마간 단핵구를 제거함으로써 더욱 균일한 산물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 세포는 동결 용액에서 현탁될 수 있다. 많은 동결 용액 및 파라미터가 당해 분야에서 공지되고 이러한 맥락에서 유용할 것이지만, 한 가지 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 내포하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% 플라스말라이트-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민, 그리고 7.5% DMSO를 내포하는 배양 배지, 또는 예로서, 헤스판 및 플라스말라이트 A를 내포하는 다른 적합한 세포 동결 배지를 이용하는 것을 수반하고, 이들 세포는 이후, 분당 1°의 비율에서 -80℃로 동결되고 액체 질소 보관 탱크의 증기 상에서 보관된다. 제어된 동결을 위한 다른 방법뿐만 아니라 -20℃에서 또는 액체 질소에서 통제되지 않는 즉시 동결이 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 냉동보존된 세포는 본원에서 설명된 바와 같이 해동되고 세척되고, 그리고 활성화에 앞서 실온에서 1 시간 동안 안정되도록 허용된다.
본원에서 설명된 바와 같은 확대된 세포가 필요할지도 모르는 때보다 앞선 기간에서 개체로부터 혈액 표본 또는 성분채집물 산물의 수집이 본 출원에서 또한 예기된다. 따라서, 확대되는 세포의 공급원은 필요한 임의의 시점에서 수집될 수 있고, 그리고 원하는 세포, 예를 들면, T 세포는 T 세포 요법으로부터 이익을 얻을 수많은 질환 또는 장애, 예를 들면, 본원에서 설명된 것들에 대한 T 세포 요법에서 추후 이용을 위해 단리되고 동결될 수 있다. 한 구체예에서, 혈액 표본 또는 성분채집물은 전반적으로 건강한 개체로부터 채취된다. 일정한 구체예에서, 혈액 표본 또는 성분채집물은 질환이 발달할 위험에 처해있지만, 아직 질환이 발달하지 않은 전반적으로 건강한 개체로부터 채취되고, 그리고 관심되는 세포는 추후 이용을 위해 단리되고 동결된다. 일정한 구체예에서, T 세포는 확대되고, 동결되고, 그리고 추후 시점에 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 표본은 본원에서 설명된 바와 같은 특정 질환의 진단 직후에, 하지만 임의의 치료에 앞서 환자로부터 수집된다. 추가 구체예에서, 세포는 작용제, 예를 들면, 나탈리주맙, 에팔리주맙, 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예를 들면, 시클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉사트, 미코페놀레이트 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역절제 작용제, 예를 들면, 캄패스, 항-CD3 항체, 사이톡산, 플루다라빈, 시클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228 및 방사선조사로 치료를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 수많은 유관한 치료 양상에 앞서 개체로부터 혈액 표본 또는 성분채집물로부터 단리된다. 이들 약물은 칼슘 의존성 포스파타아제 칼시뉴린을 저해하거나 (시클로스포린 및 FK506), 또는 성장 인자 유도된 신호전달에 중요한 p70S6 키나아제를 저해한다 (라파마이신) (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). 추가 구체예에서, 세포는 환자에 대해 단리되고, 그리고 골수 또는 줄기 세포 이식, 화학요법 작용제, 예를 들면, 플루다라빈을 이용한 T 세포 절제 요법, 외부 빔 방사선 요법 (XRT), 시클로포스파미드, 또는 항체, 예를 들면, OKT3 또는 캄패스와 함께 (가령, 이전에, 동시에 또는 이후에) 추후 이용을 위해 동결된다. 다른 구체예에서, 세포는 B-세포 절제 요법, 예를 들면, CD20과 반응하는 작용제, 예를 들면, 리툭산 이후에 치료에 앞서 단리되고, 그리고 치료에 추후 이용을 위해 동결될 수 있다.
일부 구체예에서, T 세포는 치료 직후에 환자로부터 획득된다. 이점에 관하여, 일정한 암 치료, 특히 면역계를 손상시키는 약물로 치료 이후에, 환자가 치료로부터 정상적으로 회복할 기간 동안 치료 직후에, 획득된 T 세포의 품질은 탈체에서 확대되는 그들의 능력에 대해 최적이거나 또는 향상될 수 있는 것으로 관찰되었다. 유사하게, 본원에서 설명된 방법을 이용한 탈체 조작 이후에, 이들 세포는 증강된 이식 및 생체내 확대를 위한 바람직한 상태에 있을 수 있다. 따라서, 본 발명의 맥락 내에서, 이러한 회복 시기 동안 T 세포, 수지상 세포, 또는 조혈 계통의 다른 세포를 비롯한 혈액 세포를 수집하는 것이 예기된다. 게다가, 일정한 구체예에서, 동원 (가령, GM-CSF로 동원) 및 조건화 섭생이 개체에서, 특히 요법 이후에 규정된 시간 윈도우 동안, 특정 세포 유형의 재증식, 재순환, 재생 및/또는 확대가 선호되는 상태를 창출하는데 이용될 수 있다. 예시적인 세포 유형은 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 그리고 면역계의 다른 세포를 포함한다.
2. T 세포의 활성화 및 확대
본원에서 설명된 CARs로 T 세포의 유전자 변형 전 또는 후 인지에 상관없이, T 세포는 예로서, U.S. 특허 번호 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 그리고 U.S. 특허 출원 공개 번호 20060121005에서 설명된 바와 같은 방법을 이용하여 활성화되고 전반적으로 확대될 수 있다.
일반적으로, T 세포는 CD3/TCR 복합체 연관된 신호를 자극하는 작용제 및 T 세포의 표면 상에서 동시자극성 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 확대될 수 있다. 특히, T 세포 개체군은 본원에서 설명된 바와 같이, 예를 들면, 표면 위에 고정된 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이온운반체와 함께 단백질 키나아제 C 활성인자 (가령, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상에서 보조 분자의 동시자극을 위해, 보조 분자에 결합하는 리간드가 이용된다. 가령, T 세포의 개체군은 T 세포의 증식을 자극하기 위한 적절한 조건 하에, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체. 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besancon, France)을 비롯한 항-CD28 항체의 실례는 당해 분야에 통상적으로 공지된 다른 방법이 그러한 것처럼 이용될 수 있다 (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
일부 구체예에서, T 세포에 대한 일차 자극성 신호 및 동시자극성 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 가령, 각 신호를 제공하는 작용제는 용해 상태에 있거나 또는 표면에 연계될 수 있다. 표면에 연계될 때, 작용제는 동일한 표면에 (즉, "시스" 형성에서) 또는 별개의 표면에 (즉, "트랜스" 형성에서) 연계될 수 있다. 대안으로, 한 작용제는 표면에 연계될 수 있고 다른 작용제는 용해 상태에 있을 수 있다. 한 구체예에서, 동시자극성 신호를 제공하는 작용제는 세포 표면에 결합되고, 그리고 일차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 용해 상태에 있거나 또는 표면에 연계된다. 일정한 구체예에서, 양쪽 작용제가 용해 상태에 있을 수 있다. 다른 구체예에서, 작용제는 가용성 형태에 있을 수 있고, 그리고 이후, 표면, 예를 들면, Fc 수용체를 발현하는 세포, 또는 이들 작용제에 결합할 항체 또는 다른 결합 작용제에 교차연결된다. 이점에 관하여, 가령, 본 발명에서 T 세포를 활성화하고 확대하는데 이용이 예기되는 인공 항원 제시 세포 (aAPCs)에 대해 U.S. 특허 출원 공개 번호 20040101519 및 20060034810을 참조한다.
일부 구체예에서, T 세포는 작용제-코팅된 비드와 조합되고, 이들 비드 및 세포는 차후에 분리되고, 그리고 이후, 이들 세포는 배양된다. 대안적 구체예에서, 배양에 앞서, 작용제-코팅된 비드 및 세포는 분리되지 않고 함께 배양된다. 추가 구체예에서, 이들 비드 및 세포는 먼저 힘, 예를 들면, 자기력의 적용에 의해 농축되어, 세포 표면 마커의 증가된 결찰을 유발하고, 따라서 세포 자극을 유도한다.
실례로서, 세포 표면 단백질은 항-CD3 및 항-CD28이 부착되는 상자성 비드 (3x28 비드)가 T 세포에 접촉하도록 허용함으로써 결찰될 수 있다. 한 구체예에서, 세포 (가령, 104 내지 109 T 세포) 및 비드 (가령, 1:1의 비율에서 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T 상자성 비드)는 완충액, 바람직하게는 PBS (이가 양이온, 예를 들면, 칼슘 및 마그네슘이 없는)에서 조합된다. 다시 한 번, 당업자는 임의의 세포 농도가 이용될 수 있다는 것을 쉽게 인지할 수 있다. 가령, 표적 세포가 표본 내에서 매우 희귀하고 표본의 단지 0.01%만을 구성할 수 있거나 또는 전체 표본 (즉, 100%)이 관심되는 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포 숫자는 본 발명의 맥락 안에 있다. 일정한 구체예에서, 세포 및 입자의 최대 접촉을 담보하기 위해, 입자 및 세포가 함께 혼합되는 용적을 유의미하게 감소시키는 (즉, 세포 농도를 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 가령, 한 구체예에서, 약 2 십억 세포/ml의 농도가 이용된다. 다른 구체예에서, 100 백만 세포/ml 이상이 이용된다. 추가 구체예에서, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 백만 세포/ml의 세포 농도가 이용된다. 또 다른 구체예에서, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 백만 세포/ml의 세포 농도가 이용된다. 추가 구체예에서, 125 또는 150 백만 세포/ml의 농도가 이용될 수 있다. 높은 농도를 이용하는 것은 증가된 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확대를 유발할 수 있다. 게다가, 높은 세포 농도의 이용은 관심되는 표적 항원, 예를 들면. CD28-음성 T 세포를 약하게 발현할 수 있는 세포의 더욱 효율적인 포획을 허용한다. 이런 세포 개체군은 치료적 가치를 가질 수 있고, 그리고 일정한 구체예에서 획득하는 것이 바람직할 것이다. 가령, 높은 농도의 세포를 이용하는 것은 정상적으로 더욱 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 더욱 효율적인 선별을 허용한다.
일부 구체예에서, 혼합물은 수 시간 (약 3 시간) 내지 약 14 일 또는 중간에 임의의 시간별 정수 값 동안 배양될 수 있다. 다른 구체예에서, 혼합물은 21 일 동안 배양될 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 비드 및 T 세포는 약 8 일 동안 함께 배양된다. 다른 구체예에서, 비드 및 T 세포는 2-3 일 동안 함께 배양된다. T 세포의 배양 시간이 60 일 또는 그 이상일 수 있도록, 여러 주기의 자극이 또한, 요망될 수 있다. T 세포 배양에 적합한 조건은 혈청 (가령, 태아 소 또는 인간 혈청), 인터류킨-2 (IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ 및 TNF-α, 또는 당업자에게 공지된 세포의 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 비롯하여, 증식 및 생존력에 필요한 인자를 내포할 수 있는 적절한 배지 (가령, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는, X-vivo 15, (Lonza))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가제는 계면활성제, 플라스마네이트, 그리고 환원제, 예를 들면, N-아세틸-시스테인 및 2-메르캅토에탄올을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 배지는 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15 및 X-Vivo 20, Optimizer를 포함할 수 있는데, 혈청이 없거나, 또는 적절한 양의 혈청 (또는 혈장) 또는 규정된 세트의 호르몬 및/또는 T 세포의 성장 및 확대에 충분한 사이토킨(들)의 양으로 보충된 아미노산, 나트륨 피루브산염 및 비타민이 첨가된다. 항생제, 예를 들면, 페니실린 및 스트렙토마이신은 단지 실험적 배양액에만 포함되고, 개체 내로 주입되는 세포의 배양액에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 뒷받침하는데 필요한 조건, 예를 들면, 적절한 온도 (가령, 37 ℃) 및 대기 (가령, 공기 플러스 5% CO2) 하에 유지된다. 변하는 자극 시간에 노출된 T 세포는 상이한 특징을 전시할 수 있다. 가령, 전형적인 혈액 또는 성분채집된 말초혈 단핵 세포 산물은 세포독성 또는 억제 T 세포 개체군 (TC, CD8)보다 큰 보조 T 세포 개체군 (TH, CD4+)을 갖는다. CD3 및 CD28 수용체를 자극함으로써 T 세포의 탈체 확대는 약 8-9 일에 앞서 TH 세포로 지배적으로 구성되는 T 세포의 개체군을 생산하고, 반면 약 8-9 일 후에, T 세포의 개체군은 TC 세포의 점점 더 큰 개체군을 포함한다. 따라서, 치료의 목적에 따라, 개체에 TH 세포로 지배적으로 구성되는 T 세포 개체군을 주입하는 것이 유리할 수 있다. 유사하게, TC 세포의 항원 특이적 부분집합이 단리되면, 이러한 부분집합을 더욱 큰 정도까지 확대하는 것이 유익할 수 있다.
게다가, CD4 및 CD8 마커에 더하여, 다른 표현형 마커가 유의미하게 변하지만, 대부분은 세포 확대 과정의 코스 동안 재현적이다. 따라서, 이런 재현성은 활성화된 T 세포 산물을 특정한 목적으로 재단하는 능력을 가능하게 할 수 있다.
V. 제약학적 조성물
항-BCMA 단일-도메인 항체 중에서 한 가지, 또는 본원에서 설명된 바와 같은 CARs (가령, BCMA CARs) 중에서 한 가지를 포함하는 가공된 면역 작동체 세포 중에서 한 가지, 그리고 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물이 본 출원에 의해 더욱 제공된다. 제약학적 조성물은 동결건조된 제제 또는 수성 용액의 형태에서, sdAb, 또는 원하는 정도의 순도를 갖는 복수의 가공된 면역 작동체 세포를 임의선택적 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제와 혼합함으로써 제조될 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)).
허용되는 담체, 부형제, 또는 안정제는 이용된 용량 및 농도에서 수용자에 비독성이고, 그리고 완충액, 아스코르빈산, 메티오닌, 비타민 E, 메타중아황산나트륨을 비롯한 항산화제; 보존제, 등장화제, 안정제, 금속 착물 (가령, Zn-단백질 복합체); 킬레이트화제, 예를 들면, EDTA 및/또는 비이온성 계면활성제를 포함한다.
완충액은 특히, 안정성이 pH 의존성이면, 치료 효과를 최적화하는 범위에서 pH를 제어하는데 이용된다. 완충액은 바람직하게는, 약 50 mM 내지 약 250 mM 범위에서 변하는 농도에서 존재한다. 본 발명에서 이용하기 적합한 완충제는 유기 및 무기 산 둘 모두 및 이들의 염을 포함한다. 가령, 구연산염, 인산염, 숙신산염, 주석산염, 푸마르산염, 글루콘산염, 옥살산염, 젖산염, 아세트산염. 추가적으로, 완충액은 히스티딘 및 트리메틸아민 염, 예를 들면, Tris를 포함할 수 있다.
보존제는 미생물 성장을 지연시키기 위해 첨가되고, 그리고 전형적으로, 0.2%-1.0% (w/v)의 범위 내에 존재한다. 본 발명에서 이용하기 적합한 보존제는 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 헥사메토늄 염화물; 벤잘코늄 할로겐화물 (가령, 염화물, 브롬화물, 요오드화물), 벤제토늄 염화물; 티메로살, 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들면, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸을 포함한다.
때때로 "안정제"로서 알려져 있는 긴장성 작용제는 조성물 내에 액체의 긴장성을 조정하거나 또는 유지하기 위해 존재한다. 큰, 하전된 생체분자, 예를 들면, 단백질 및 항체와 함께 이용될 때, 이들은 종종 "안정제"로 명명되는데, 그 이유는 이들이 아미노산 측쇄의 하전된 기와 상호작용하고, 따라서 분자간 및 분자내 상호작용에 대한 잠재력을 줄일 수 있기 때문이다. 긴장성 작용제는 다른 성분의 상대적 양을 고려하여, 중량으로 0.1% 내지 25%, 바람직하게는 1 내지 5% 사이에 임의의 양으로 존재할 수 있다. 바람직한 긴장성 작용제는 다가 당 알코올, 바람직하게는 삼가 또는 그 이상의 당 알코올, 예를 들면, 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다.
추가 부형제는 (1) 증량제, (2) 용해도 개선제, (3) 안정제 및 (4) 변성 또는 용기 벽에 부착을 예방하는 작용제 중에서 하나 또는 그 이상으로서 역할을 할 수 있는 작용제를 포함한다. 이런 부형제는 다음을 포함한다: 다가 당 알코올 (상기 열거된); 아미노산, 예를 들면, 알라닌, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 오르니틴, 류신, 2-페닐알라닌, 글루타민산, 트레오닌 등; 유기 당 또는 당 알코올, 예를 들면, 수크로오스, 락토오스, 락티톨, 트레할로스, 스타키오스, 만노오스, 소르보스, 자일로오스, 리보오스, 리비톨, 미오이니시토스, 미오이노시톨, 갈락토오스, 갈락티톨, 글리세롤, 시클리톨 (가령, 이노시톨), 폴리에틸렌 글리콜; 황 내포 환원제, 예를 들면, 요소, 글루타티온, 티옥산, 나트륨 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 나트륨 티오 황산염; 저분자량 단백질, 예를 들면, 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 다른 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈; 단당류 (가령, 자일로오스, 만노오스, 프룩토오스, 글루코오스; 이당류 (가령, 락토오스, 말토오스, 수크로오스); 삼당류, 예를 들면, 라피노오스; 및 다당류, 예를 들면, 덱스트린 또는 덱스트란.
비이온성 계면활성제 또는 세정제 ("적심제"로서 또한 알려져 있음)가 치료적 작용제를 가용화시킬 뿐만 아니라 교반-유도된 응집에 대항하여 치료적 단백질을 보호하는데 도움을 주기 위해 존재하는데, 이것은 또한, 활성 치료적 단백질 또는 항체의 변성을 유발하지 않으면서, 제제가 전단 표면 스트레스에 노출되도록 허용한다. 비이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/ml 내지 약 1.0 mg/ml, 바람직하게는 약 0.07 mg/ml 내지 약 0.2 mg/ml의 범위에서 존재한다.
적합한 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 (20, 40, 60, 65, 80 등), 폴리옥사머 (184, 188 등), PLURONIC® 폴리올, TRITON®, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르 (TWEEN®-20, TWEEN®-80 등), 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아르산염, 폴리옥시에틸렌 수소첨가된 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 수크로오스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스를 포함한다. 이용될 수 있는 음이온성 세정제는 나트륨 라우릴 황산염, 디옥틸 나트륨 술포숙시네이트 및 디옥틸 나트륨 술폰산염을 포함한다. 양이온성 세정제는 벤잘코늄 염화물 또는 벤제토늄 염화물을 포함한다.
제약학적 조성물이 생체내 투여에 이용되기 위해, 이들은 무균이어야 한다. 제약학적 조성물은 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 무균이 되도록 만들어질 수 있다. 본원에서 제약학적 조성물은 일반적으로, 무균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들면, 피하 주사 바늘에 의해 관통가능한 마개를 갖는 정맥내 용액 가방 또는 바이알 내로 배치된다.
투여 루트는 공지되고 인정된 방법에 따른다, 가령, 적합한 방식으로 긴 기간에 걸쳐 단일 또는 복수 일시 주사 또는 주입, 예를 들면, 피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 병소내 또는 관절내 루트에 의한 주사 또는 주입, 국소 투여, 흡입 또는 지속된 방출 또는 연장된-방출 수단에 의한다.
지속된 방출 제조물이 제조될 수 있다. 지속된 방출 제조물의 적합한 실례는 길항제를 내포하는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스를 포함하고, 여기서 이들 매트릭스는 성형된 물품, 예를 들면, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속된 방출 매트릭스의 실례는 폴리에스테르, 하이드로겔 (가령, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드 (U.S. 특허 번호 3,773,919), L-글루타민산과 . 에틸-L-글루타민산염의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세트산염, 분해성 젖산-글리콜산 공중합체, 예를 들면, LUPRON DEPOT™ (젖산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세트산염으로 구성된 주사가능 마이크로스피어), 그리고 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
본원에서 설명된 제약학적 조성물은 치료되는 특정 징후에 대해 필요에 따라 하나 이상의 활성 화합물 또는 작용제, 바람직하게는 서로에 부정적인 영향을 주지 않는 상보성 활성을 갖는 것들을 또한 내포할 수 있다. 대안으로, 또는 이에 더하여, 조성물은 세포독성 작용제, 화학요법 작용제, 사이토킨, 면역억제제, 또는 성장 저해성 작용제를 포함할 수 있다. 이런 분자는 의도된 목적에 효과적인 양에서 조합으로 적절히 존재한다.
활성 성분은 또한, 예로서 액적형성 기술에 의해 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면, 각각, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (가령, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로유제, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로유제에서 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이런 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition에서 개시된다.
VI. 치료 방법
본 출원은 세포 면역요법에서 이용을 위한 방법 및 조성물에 더욱 관계한다. 일부 구체예에서, 세포 면역요법은 혈액학적 악성 및 고형 종양을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 암을 치료하기 위한 것이다. 본원에서 설명된 항-BCMA sdAbs, CARs, 그리고 가공된 면역 작동체 세포 (가령, CAR-T 세포) 중에서 한 가지가 암을 치료하는 방법에서 이용될 수 있다. 본원에서 설명된 CARs는 항원 상실 도피 돌연변이를 갖는 종양을 치료하고, 그리고 현존하는 요법에 대한 내성을 감소시키는데 유용할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 방법과 조성물은 예로서, 자가면역 질환을 비롯하여, 단일-도메인 항체 또는 CARs에 의해 특이적으로 인식되는 항원과 연관되는 다른 질환을 치료하는데 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 개체 (가령, 인간 개체)에서 암 (가령, 다발성 골수종, 예를 들면, 재발성 또는 난치성 다발성 골수종)을 치료하는 방법이 제공되고, 이들 방법은 다음을 포함하는 제약학적 조성물의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다: (1) 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 다가 CAR을 포함하는 가공된 면역 작동체 세포 (가령, T 세포): (a) BCMA의 첫 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 및 BCMA의 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 두 번째 BCMA 결합 모이어티를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인, 여기서 첫 번째 에피토프 및 두 번째 에피토프는 상이하고; 그리고 (2) 제약학적으로 허용되는 담체. 일부 구체예에서, 개체 (가령, 인간 개체)에서 암 (가령, 다발성 골수종, 예를 들면, 재발성 또는 난치성 다발성 골수종)을 치료하는 방법이 제공되고, 이들 방법은 다음을 포함하는 제약학적 조성물의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다: (1) 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 다가 CAR을 포함하는 가공된 면역 작동체 세포 (가령, T 세포): (a) BCMA의 첫 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 첫 번째 항-BCMA sdAb 및 BCMA의 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 두 번째 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인, 여기서 첫 번째 에피토프 및 두 번째 에피토프는 상이하고; 그리고 (2) 제약학적으로 허용되는 담체. 일부 구체예에서, 가공된 면역 작동체 세포는 자가이다. 일부 구체예에서, 가공된 면역 작동체 세포는 동종이계이다. 일부 구체예에서, 가공된 면역 작동체 세포는 CAR-T 세포이다. 일부 구체예에서, 암은 액상암, 예를 들면, 다발성 골수종, 급성 림프모구성 백혈병, 또는 만성 림프성 백혈병이다. 일부 구체예에서, 암은 난치성 또는 재발성 다발성 골수종이다. 일부 구체예에서, 가공된 면역 작동체 세포는 약 105 내지 약 107 세포/kg, 예를 들면, 약 3x105 내지 약 7x106 세포/kg, 또는 약 3x106 세포/kg의 용량에서 투여된다. 일부 구체예에서, 가공된 면역 작동체 세포는 정맥내 주사에 의해 투여된다. 일부 구체예에서, 가공된 면역 작동체 세포는 약 1 주에 걸쳐 3회 분할 용량에서 투여된다.
일부 구체예에서, 개체 (가령, 인간 개체)에서 암 (가령, 다발성 골수종, 예를 들면, 재발성 또는 난치성 다발성 골수종)을 치료하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 다음을 포함하는 제약학적 조성물의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다: (1) (a) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 BCMA CAR을 포함하는 가공된 면역 작동체 세포 (가령, T 세포); 그리고 (2) 제약학적으로 허용되는 담체, 여기서 항-BCMA sdAb는 다음 중에서 한 가지를 포함한다: (1) 서열 번호:1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (2) 서열 번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (3) 서열 번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (4) 서열 번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:80의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (5) 서열 번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:81의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (6) 서열 번호:6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:82의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (7) 서열 번호:7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:83의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (8) 서열 번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:84의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (9) 서열 번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:85의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (10) 서열 번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:86의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (11) 서열 번호:11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:87의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (12) 서열 번호:12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:88의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (13) 서열 번호:13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (14) 서열 번호:14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:90의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (15) 서열 번호:15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:91의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (16) 서열 번호:16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:92의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (17) 서열 번호:17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (18) 서열 번호:18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:94의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (19) 서열 번호:19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:57의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:95의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (20) 서열 번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:96의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (21) 서열 번호:21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:97의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (22) 서열 번호:22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:98의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (23) 서열 번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:99의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (24) 서열 번호:24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (25) 서열 번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:101의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (26) 서열 번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:102의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (27) 서열 번호:27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (28) 서열 번호:28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:66의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:104의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (29) 서열 번호:29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:105의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (30) 서열 번호:30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:106의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (31) 서열 번호:31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:69의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:107의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (32) 서열 번호:32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:70의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:108의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (33) 서열 번호:33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:71의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:109의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (34) 서열 번호:34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:110의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (35) 서열 번호:35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (36) 서열 번호:36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:112의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (37) 서열 번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:75의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 (38) 서열 번호:38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:76의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3. 일부 구체예에서, 세포외 항원 결합 도메인은 최소한 2개의 항-BCMA sdAbs를 포함한다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 낙타, 키메라, 인간 또는 인간화이다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 115-152로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VHH 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, BCMA CAR은 서열 번호: 216-256 및 298-335로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 가공된 면역 작동체 세포는 자가이다. 일부 구체예에서, 가공된 면역 작동체 세포는 동종이계이다. 일부 구체예에서, 암은 액상암, 예를 들면, 다발성 골수종, 급성 림프모구성 백혈병, 또는 만성 림프성 백혈병이다. 일부 구체예에서, 암은 난치성 또는 재발성 다발성 골수종이다. 일부 구체예에서, 가공된 면역 작동체 세포는 약 105 내지 약 107 세포/kg, 예를 들면, 약 3x105 내지 약 7x106 세포/kg, 또는 약 3x106 세포/kg의 용량에서 투여된다. 일부 구체예에서, 가공된 면역 작동체 세포는 정맥내 주사에 의해 투여된다. 일부 구체예에서, 가공된 면역 작동체 세포는 약 1 주에 걸쳐 3회 분할 용량에서 투여된다.
일부 구체예에서, 다발성 골수종 (가령, 재발성 또는 난치성 다발성 골수종)을 앓는 개체에서 부분적인 또는 완전한 임상적 관해를 획득하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 다음을 포함하는 제약학적 조성물의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다: (1) 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 다가 CAR을 포함하는 가공된 면역 작동체 세포 (가령, T 세포): (a) BCMA의 첫 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 첫 번째 항-BCMA sdAb) 및 BCMA의 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 두 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 두 번째 항-BCMA sdAb)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인, 여기서 첫 번째 에피토프 및 두 번째 에피토프는 상이하고; 그리고 (2) 제약학적으로 허용되는 담체. 일부 구체예에서, 가공된 면역 작동체 세포는 자가이다. 일부 구체예에서, 가공된 면역 작동체 세포는 동종이계이다. 일부 구체예에서, 가공된 면역 작동체 세포는 CAR-T 세포이다. 일부 구체예에서, 암은 액상암, 예를 들면, 다발성 골수종, 급성 림프모구성 백혈병, 또는 만성 림프성 백혈병이다. 일부 구체예에서, 암은 난치성 또는 재발성 다발성 골수종이다. 일부 구체예에서, 가공된 면역 작동체 세포는 약 105 내지 약 107 세포/kg, 예를 들면, 약 3x105 내지 약 7x106 세포/kg, 또는 약 3x106 세포/kg의 용량에서 투여된다. 일부 구체예에서, 가공된 면역 작동체 세포는 정맥내 주사에 의해 투여된다. 일부 구체예에서, 가공된 면역 작동체 세포는 약 1 주에 걸쳐 3회 분할 용량에서 투여된다.
일부 구체예에서, 개체 (가령, 인간 개체)에서 암 (가령, 다발성 골수종, 예를 들면, 재발성 또는 난치성 다발성 골수종)을 치료하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 항-BCMA sdAb 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항-BCMA sdAb는 다음 중에서 한 가지를 포함한다: (1) 서열 번호:1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (2) 서열 번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (3) 서열 번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (4) 서열 번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:80의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (5) 서열 번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:81의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (6) 서열 번호:6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:82의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (7) 서열 번호:7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:83의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (8) 서열 번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:84의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (9) 서열 번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:85의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (10) 서열 번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:86의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (11) 서열 번호:11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:87의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (12) 서열 번호:12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:88의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (13) 서열 번호:13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (14) 서열 번호:14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:90의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (15) 서열 번호:15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:91의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (16) 서열 번호:16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:92의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (17) 서열 번호:17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (18) 서열 번호:18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:94의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (19) 서열 번호:19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:57의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:95의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (20) 서열 번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:96의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (21) 서열 번호:21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:97의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (22) 서열 번호:22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:98의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (23) 서열 번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:99의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (24) 서열 번호:24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (25) 서열 번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:101의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (26) 서열 번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:102의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (27) 서열 번호:27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (28) 서열 번호:28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:66의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:104의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (29) 서열 번호:29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:105의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (30) 서열 번호:30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:106의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (31) 서열 번호:31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:69의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:107의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (32) 서열 번호:32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:70의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:108의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (33) 서열 번호:33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:71의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:109의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (34) 서열 번호:34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:110의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (35) 서열 번호:35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (36) 서열 번호:36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:112의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (37) 서열 번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:75의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 (38) 서열 번호:38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:76의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 낙타, 키메라, 인간 또는 인간화이다. 일부 구체예에서, 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 115-152로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 액상암, 예를 들면, 다발성 골수종, 급성 림프모구성 백혈병, 또는 만성 림프성 백혈병이다. 일부 구체예에서, 암은 난치성 또는 재발성 다발성 골수종이다.
본원에서 설명된 방법은 고형암 및 액상암 둘 모두를 비롯한 다양한 암을 치료하는데 적합하다. 이들 방법은 초기 단계, 진행된 단계 및 전이성 암을 비롯하여, 모든 시기의 암에 적용가능하다. 본원에서 설명된 방법은 어쥬번트 세팅 또는 네오어쥬번트 세팅에서, 당해 분야에서 공지된 다른 유형의 암 요법, 예를 들면, 화학요법, 수술, 방사선, 유전자 요법, 면역요법, 골수 이식, 줄기 세포 이식, 표적화된 요법, 냉동요법, 초음파 요법, 광역학 요법, 고주파 제거 또는 기타 유사한 것과 함께 첫 번째 요법, 두 번째 요법, 세 번째 요법, 또는 복합 요법으로서 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 암은 다발성 골수종이다. 일부 구체예에서, 암은 듀리-새먼 병기결정 시스템에 근거된 I 기, II 기 또는 III 기 및/또는 시기 A 또는 시기 B 다발성 골수종이다. 일부 구체예에서, 암은 국제 골수종 실행 그룹 (IMWG)에 의해 공개된 국제 병기결정 시스템에 근거된 I 기, II 기 또는 III 기 다발성 골수종이다. 일부 구체예에서, 암은 의미 미결정의 단일클론 감마글로불린병증 (MGUS)이다. 일부 구체예에서, 암은 무증상성 (무증상/무통성) 골수종이다. 일부 구체예에서, 암은 증후성 또는 활동성 골수종이다. 일부 구체예에서, 암은 난치성 다발성 골수종이다. 일부 구체예에서, 암은 전이성 다발성 골수종이다. 일부 구체예에서, 개체는 다발성 골수종에 대한 이전 치료에 반응하지 않았다. 일부 구체예에서, 개체는 다발성 골수종의 이전 치료 후 진행성 질환을 앓는다. 일부 구체예에서, 개체는 다발성 골수종에 대한 최소한 약 2, 3, 4회, 또는 그 이상의 치료 중에서 한 가지를 이전에 제공받았다. 일부 구체예에서, 암은 재발성 다발성 골수종이다.
일부 구체예에서, 개체는 활동성 다발성 골수종을 앓는다. 일부 구체예에서, 개체는 최소한 10%의 클론 골수 형질 세포를 갖는다. 일부 구체예에서, 개체는 생검-입증된 골성 또는 골수외 형질세포종을 앓는다. 일부 구체예에서, 개체는 근원적인 형질 세포 증식성 장애에 기인할 수 있는 종말 기관 손상의 증거를 갖는다. 일부 구체예에서, 개체는 고칼슘혈증을 앓는다, 예를 들면, 정상치 상한보다 >0.25 mmol/L (>1mg/dL) 높은 또는 >2.75 mmol/L (>11mg/dL)의 혈청 칼슘을 갖는다. 일부 구체예에서, 개체는 신장 부전증을 앓는다, 예를 들면, 크레아티닌 소실율 분당 <40 mL 또는 혈청 크레아티닌 >177μmol/L (>2mg/dL)을 갖는다. 일부 구체예에서, 개체는 빈혈을 앓는다, 예를 들면, 정상치의 가장 낮은 한계 아래로 >20g/L의 헤모글로빈 값, 또는 헤모글로빈 값 <100g/L을 갖는다. 일부 구체예에서, 개체는 골격 방사선촬영, CT 또는 PET/CT에서 하나 또는 그 이상의 뼈 병변, 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 골용해성 병변을 앓는다. 일부 구체예에서, 개체는 다음의 악성종양 생물마커 (MDEs) 중에서 하나 또는 그 이상을 갖는다: (1) 골수 검사에서 60% 또는 그 이상의 클론 형질 세포; (2) 관련된 경쇄의 절대적 수준이 최소한 100mg/L이라고 한다면, 100 또는 그 이상의 혈청 관련된 / 관련이 없는 유리 경쇄 비율; 그리고 (3) 크기에서 최소한 5mm 또는 그 이상인, MRI에서 하나 이상의 초점성 병변.
제약학적 조성물의 투여는 주사, 섭취, 수혈, 주입 또는 이식에 의한 것을 비롯하여, 임의의 편의한 방식으로 실행될 수 있다. 조성물은 환자에 경동맥, 피하, 피내, 종양내, 결절내, 척수내, 근육내, 정맥내, 또는 복막내 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 전신 투여된다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 주입, 예를 들면, 정맥내 주입에 의해 개체에게 투여된다. 면역요법을 위한 주입 기술은 당해 분야에서 공지된다 (가령, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676 (1988)을 참조한다). 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 피내 또는 피하 주사에 의해 개체에게 투여된다. 일부 구체예에서, 조성물은 정맥내 주사에 의해 투여된다. 일부 구체예에서, 조성물은 종양 또는 림프절 내로 직접적으로 주사된다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 종양 부위에 국부 투여된다, 예를 들면, 종양 세포 내로, 또는 종양 세포를 갖는 조직에 직접적으로 투여된다.
본 발명의 제약학적 조성물의 용량 및 원하는 약물 농도는 구상된 특정 용도에 따라 변할 수 있다. 적절한 용량 또는 투여 루트의 결정은 당업자의 기술 범위 내에 있다. 동물 실험은 인간 요법을 위한 유효 용량의 결정을 위한 신뢰할 만한 보도를 제공한다. 유효 용량의 종간 척도화는 Mordenti, J. and Chappell, W. "The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics," In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-46에 의해 규정된 원리에 따라서 수행될 수 있다. 상이한 제제가 상이한 치료 및 상이한 장애에 효과적일 것이고, 그리고 특정한 장기 또는 조직을 치료하도록 의도된 투여가 다른 장기 또는 조직으로 전달과 상이한 방식으로 전달을 필요하게 만들 수 있다는 것은 본 출원의 범위 내에 있다.
제약학적 조성물이 본원에서 설명된 sdAbs 중에서 한 가지를 포함하는 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 투여 루트에 따라, 하루에 약 10 ng/kg 내지 약 100 mg/kg의 개체 체중 또는 그 이상, 예를 들면, 약 1 mg/kg/일 내지 10 mg/kg/일의 ta 용량에서 투여된다. 특정 용량 및 전달 방법에 대한 보도는 기존 문헌에서 제공된다; 가령, U.S. 특허 번호 4,657,760; 5,206,344; 또는 5,225,212를 참조한다.
제약학적 조성물이 본원에서 설명된 가공된 면역 세포 중에서 한 가지를 포함하는 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 최소한 약 104, 105, 106, 107, 108, 또는 109 세포/kg의 개체 체중 중에서 한 가지의 용량에서 투여된다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 약 104 내지 약 105, 약 105 내지 약 106, 약 106 내지 약 107, 약 107 내지 약 108, 약 108 내지 약 109, 약 104 내지 약 109, 약 104 내지 약 106, 약 106 내지 약 108, 또는 약 105 내지 약 107 세포/kg의 개체 체중 중에서 한 가지의 용량에서 투여된다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 최소한 약 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107 세포/kg 또는 그 이상 중에서 한 가지의 용량에서 투여된다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 약 3x105 내지 약 7x106 세포/kg, 또는 약 3x106 세포/kg의 용량에서 투여된다.
일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 단일 회 동안 투여된다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 복수 회 (가령, 2, 3, 4, 5, 6회, 또는 그 이상 중에서 한 가지) 동안 투여된다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 주 1회, 주 2회, 주 3회, 주 4회, 월 1회, 2 개월마다 1회, 3 개월마다 1회, 4 개월마다 1회, 5 개월마다 1회, 6 개월마다 1회, 7 개월마다 1회, 8 개월마다 1회, 9 개월마다 1회, 또는 연 1회 투여된다. 일부 구체예에서, 투여 사이에 간격은 약 1 주 내지 2 주, 2 주 내지 1 개월, 2 주 내지 2 개월, 1 개월 내지 2 개월, 1 개월 내지 3 개월, 3 개월 내지 6 개월, 또는 6 개월 내지 1 년 중에서 한 가지이다. 특정 환자에 대한 최적 용량 및 치료 섭생은 환자를 질환의 징후에 대해 모니터링하고, 따라서 치료를 조정함으로써 약학 분야의 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
게다가, 용량은 하나 또는 그 이상의 별개 투여에 의해, 또는 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 분할 용량, 예를 들면, 약 2, 3, 4, 5회, 또는 그 이상의 용량 중에서 한 가지에서 투여된다. 일부 구체예에서, 분할 용량은 약 1 주에 걸쳐 투여된다. 일부 구체예에서, 용량은 동등하게 분할된다. 일부 구체예에서, 분할 용량은 전체 용량의 약 20%, 약 30% 및 약 50%이다. 일부 구체예에서, 연속성 분할 용량 사이에 간격은 약 1 일, 2 일, 3 일 또는 그 이상이다. 수일 또는 더욱 긴 기간 동안 반복된 투여의 경우에, 질환에 따라, 치료는 질환 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 지속된다. 하지만, 다른 투약 섭생이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 전통적인 기술과 검정에 의해 쉽게 모니터링된다.
일부 구체예에서, 제약학적 조성물의 양은 개체에서 객관적인 임상적 반응을 유발하는데 효과적이다. 일부 구체예에서, 다발성 골수종 (가령, 재발성 또는 난치성 다발성 골수종)을 앓는 개체에서 객관적인 임상적 반응을 획득하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 다음을 포함하는 제약학적 조성물의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다: (1) 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 다가 CAR을 포함하는 가공된 면역 작동체 세포 (가령, T 세포): (a) BCMA의 첫 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 첫 번째 항-BCMA sdAb) 및 BCMA의 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 두 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 두 번째 항-BCMA sdAb)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인, 여기서 첫 번째 에피토프 및 두 번째 에피토프는 상이하고; 그리고 (2) 제약학적으로 허용되는 담체. 일부 구체예에서, 엄격한 임상적 반응 (sCR)이 개체에서 획득된다.
일부 구체예에서, 제약학적 조성물의 양은 개체에서 질환 관해 (부분적인 또는 완전한)를 유발하는데 효과적이다. 일부 구체예에서, 다발성 골수종 (가령, 재발성 또는 난치성 다발성 골수종)을 앓는 개체에서 질환 관해 (부분적인 또는 완전한)를 유발하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 다음을 포함하는 제약학적 조성물의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다: (1) 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 다가 CAR을 포함하는 가공된 면역 작동체 세포 (가령, T 세포): (a) BCMA의 첫 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 첫 번째 항-BCMA sdAb) 및 BCMA의 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 두 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 두 번째 항-BCMA sdAb)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인, 여기서 첫 번째 에피토프 및 두 번째 에피토프는 상이하고; 그리고 (2) 제약학적으로 허용되는 담체. 일부 구체예에서, 임상적 관해는 개체가 제약학적 조성물을 제공받은 후 약 6 개월, 5 개월, 4 개월, 3 개월, 2 개월, 1 개월 또는 그 이하 중에서 한 가지 이내에 획득된다.
일부 구체예에서, 제약학적 조성물의 양은 개체에서 암의 재발 또는 질환 진행을 예방하는데 효과적이다. 일부 구체예에서, 다발성 골수종 (가령, 재발성 또는 난치성 다발성 골수종)을 앓는 개체에서 재발 또는 질환 진행을 예방하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 다음을 포함하는 제약학적 조성물의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다: (1) 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 다가 CAR을 포함하는 가공된 면역 작동체 세포 (가령, T 세포): (a) BCMA의 첫 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 첫 번째 항-BCMA sdAb) 및 BCMA의 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 두 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 두 번째 항-BCMA sdAb)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인, 여기서 첫 번째 에피토프 및 두 번째 에피토프는 상이하고; 그리고 (2) 제약학적으로 허용되는 담체. 일부 구체예에서, 재발 또는 질환 진행은 최소한 약 6 개월, 1 년, 2 년, 3 년, 4 년, 5 년 또는 그 이상 동안 예방된다.
일부 구체예에서, 제약학적 조성물의 양은 개체에서 생존 (가령, 질환 없는 생존)을 연장하는데 효과적이다. 일부 구체예에서, 생존은 최소한 약 2, 3, 4, 5, 6, 12, 또는 24 개월 동안 연장된다. 일부 구체예에서, 다발성 골수종 (가령, 재발성 또는 난치성 다발성 골수종)을 앓는 개체의 생존을 연장하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 다음을 포함하는 제약학적 조성물의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다: (1) 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 다가 CAR을 포함하는 가공된 면역 작동체 세포 (가령, T 세포): (a) BCMA의 첫 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 첫 번째 항-BCMA sdAb) 및 BCMA의 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 두 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 두 번째 항-BCMA sdAb)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인, 여기서 첫 번째 에피토프 및 두 번째 에피토프는 상이하고; 그리고 (2) 제약학적으로 허용되는 담체.
일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 개체에서 삶의 질을 향상시키는데 효과적이다. 일부 구체예에서, 다발성 골수종 (가령, 재발성 또는 난치성 다발성 골수종)을 앓는 개체의 삶의 질을 향상시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 다음을 포함하는 제약학적 조성물의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다: (1) 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 다가 CAR을 포함하는 가공된 면역 작동체 세포 (가령, T 세포): (a) BCMA의 첫 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 첫 번째 항-BCMA sdAb) 및 BCMA의 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 두 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 두 번째 항-BCMA sdAb)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인, 여기서 첫 번째 에피토프 및 두 번째 에피토프는 상이하고; 그리고 (2) 제약학적으로 허용되는 담체.
일부 구체예에서, 제약학적 조성물의 양은 고형 또는 림프성 종양의 성장을 저해하거나 또는 이의 크기를 감소시키는데 효과적이다. 일부 구체예에서, 고형 또는 림프성 종양의 크기는 최소한 약 10% (예로서, 최소한 약 20%, 30%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 중에서 한 가지를 포함) 감소된다. 일부 구체예에서, 개체에서 고형 또는 림프성 종양의 성장을 저해하거나 또는 이의 크기를 감소시키는 방법이 제공된다.
일부 구체예에서, 제약학적 조성물의 양은 개체에서 종양 전이를 저해하는데 효과적이다. 일부 구체예에서, 최소한 약 10% (예로서, 최소한 약 20%, 30%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 중에서 한 가지를 포함) 전이가 저해된다. 일부 구체예에서, 다발성 골수종 (가령, 재발성 또는 난치성 다발성 골수종)을 앓는 개체의 종양 전이를 저해하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 다음을 포함하는 제약학적 조성물의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다: (1) 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 다가 CAR을 포함하는 가공된 면역 작동체 세포 (가령, T 세포): (a) BCMA의 첫 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 첫 번째 항-BCMA sdAb) 및 BCMA의 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 두 번째 BCMA 결합 모이어티 (가령, 두 번째 항-BCMA sdAb)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인, 여기서 첫 번째 에피토프 및 두 번째 에피토프는 상이하고; 그리고 (2) 제약학적으로 허용되는 담체. 일부 구체예에서, 림프절로의 전이를 저해하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 폐로의 전이를 저해하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 간으로의 전이를 저해하는 방법이 제공된다. 전이는 당해 분야에서 임의의 공지된 방법에 의해, 예를 들면, 혈액 검사, 뼈 스캔, X선 스캔, CT 스캔, PET 스캔 및 생검에 의해 사정될 수 있다.
VII. 키트 및 제조 물품
본원에서 설명된 단일-도메인 항체, 키메라 항원 수용체, 또는 가공된 면역 작동체 세포 중에서 한 가지를 포함하는 키트, 단위 용량 및 제조 물품이 더욱 제공된다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 제약학적 조성물 중에서 한 가지를 내포하고 바람직하게는, 이의 이용을 위한 사용설명서를 제공하는 키트가 제공된다.
본 출원의 키트는 적합한 포장 내에 있다. 적합한 포장은 바이알, 병, 항아리, 유연한 포장 (가령, 밀봉된 Mylar 또는 플라스틱 가방), 기타 등등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 키트는 추가 성분, 예를 들면, 완충액 및 해석 정보를 임의선택적으로 제공할 수 있다. 본 출원은 따라서, 제조 물품을 또한 제공하고, 이들은 바이알 (가령, 밀봉된 바이알), 병, 항아리, 유연한 포장, 기타 등등을 포함한다.
제조 물품은 용기 및 용기 상에 또는 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 적절한 용기에는 예로서, 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 이들 용기는 다양한 물질, 예를 들면, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 일반적으로, 용기는 본원에서 설명된 질환 또는 장애 (가령, 암)를 치료하는데 효과적인 조성물을 보유하고, 그리고 무균 접근 포트를 가질 수 있다 (가령, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통되는 마개를 갖는 정맥내 용액 가방 또는 바이알일 수 있다). 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 개체에서 특정 질환을 치료하는데 이용된다는 것을 표시한다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물을 개체에게 투여하기 위한 사용설명서를 더욱 포함할 것이다. 표지는 재구성 및/또는 이용을 위한 방향을 지시할 수 있다. 제약학적 조성물을 유지하는 용기는 복수 이용 바이알일 수 있는데, 이것은 재구성된 제제의 반복 투여 (가령, 2-6회 투여)를 허용한다. 포장 삽입물은 이런 치료적 산물의 이용과 관련된 징후, 용법, 용량, 투여, 금기 및/또는 주의사항에 관한 정보를 내포하는, 치료적 산물의 상업적인 포장에 관례적으로 포함되는 사용설명서를 지칭한다. 부가적으로, 제조 물품은 제약학적으로 허용되는 완충액, 예를 들면, 주사용 정균수 (BWFI), 인산염-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 두 번째 용기를 더욱 포함할 수도 있다. 이것은 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 비롯하여, 상업적 관점 및 이용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 더욱 포함할 수도 있다.
키트 또는 제조 물품은 약국, 예를 들면, 병원 약국 및 처방 약국에서 보관 및 이용을 위한 충분한 양으로 포장된 복수 단위 용량의 제약학적 조성물 및 사용설명서를 포함할 수 있다.
아래의 실시예 및 예시적인 구체예는 본 발명의 순수한 예시인 것으로 의도되고, 그리고 이런 이유로, 본 발명을 어떤 방식으로도 제한하는 것으로 고려되지 않아야 한다. 다음 실시예 및 예시적인 구체예는 제한이 아닌 예시의 방식에 의하여 제공된다.
VIII. 예시적인 구체예
본 발명은 다음의 구체예를 제공한다:
구체예 1. 다음 중에서 한 가지를 포함하는 항-BCMA 단일-도메인 항체 (sdAb): (1) 서열 번호:1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (2) 서열 번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (3) 서열 번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (4) 서열 번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:80의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (5) 서열 번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:81의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (6) 서열 번호:6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:82의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (7) 서열 번호:7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:83의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (8) 서열 번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:84의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (9) 서열 번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:85의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (10) 서열 번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:86의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (11) 서열 번호:11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:87의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (12) 서열 번호:12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:88의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (13) 서열 번호:13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (14) 서열 번호:14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:90의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (15) 서열 번호:15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:91의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (16) 서열 번호:16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:92의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (17) 서열 번호:17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (18) 서열 번호:18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:94의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (19) 서열 번호:19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:57의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:95의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (20) 서열 번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:96의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (21) 서열 번호:21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:97의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (22) 서열 번호:22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:98의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (23) 서열 번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:99의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (24) 서열 번호:24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (25) 서열 번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:101의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (26) 서열 번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:102의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (27) 서열 번호:27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (28) 서열 번호:28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:66의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:104의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (29) 서열 번호:29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:105의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (30) 서열 번호:30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:106의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (31) 서열 번호:31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:69의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:107의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (32) 서열 번호:32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:70의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:108의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (33) 서열 번호:33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:71의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:109의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (34) 서열 번호:34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:110의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (35) 서열 번호:35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (36) 서열 번호:36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:112의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (37) 서열 번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:75의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; or (38) 서열 번호:38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호:76의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호:114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3.
구체예 2. 구체예 1의 항-BCMA sdAb, 여기서 항-BCMA sdAb는 서열 번호: 115-152로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
구체예 3. 구체예 1 또는 2의 항-BCMA sdAb와 경쟁하는 항-BCMA 항체.
구체예 4. 구체예 3의 항-BCMA 항체, 여기서 항-BCMA 항체는 sdAb이다.
구체예 5. 구체예 1, 2 및 4 중에서 한 가지의 항-BCMA sdAb, 여기서 항-BCMA sdAb는 낙타 항체이다.
구체예 6. 구체예 1, 2 및 4 중에서 한 가지의 항-BCMA sdAb, 여기서 항-BCMA sdAb는 키메라 항체이다.
구체예 7. 구체예 1, 2 및 4 중에서 한 가지의 항-BCMA sdAb, 여기서 항-BCMA sdAb는 인간화이다.
구체예 8. 구체예 1-2 및 4-7 중에서 한 가지의 항-BCMA sdAb, 여기서 항-BCMA sdAb는 VHH 단편이다.
구체예 9. (a) 구체예 1-2 및 4-7 중에서 한 가지의 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR).
구체예 10. 구체예 9의 CAR, 여기서 세포외 항원 결합 도메인은 최소한 2개의 항-BCMA sdAbs를 포함한다.
구체예 11. (a) 최소한 2개의 BCMA 결합 모이어티를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 다가 키메라 항원 수용체 (CAR).
구체예 12. 구체예 11의 다가 CAR, 여기서 세포외 항원 결합 도메인은 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 및 두 번째 BCMA 결합 모이어티를 포함한다.
구체예 13. 구체예 12의 다가 CAR, 여기서 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 및 두 번째 BCMA 결합 모이어티 중에서 하나 또는 그 이상은 sdAb이다.
구체예 14. 구체예 12 또는 13의 다가 CAR, 여기서 첫 번째 BCMA 결합 모이어티는 첫 번째 항-BCMA sdAb이고, 그리고 두 번째 BCMA 결합 모이어티는 두 번째 항-BCMA sdAb이다.
구체예 15. 구체예 12 또는 13의 다가 CAR, 여기서 첫 번째 BCMA 결합 모이어티는 항-BCMA sdAb이고, 그리고 두 번째 BCMA 결합 모이어티는 인간 항체로부터 유래된다.
구체예 16. 구체예 12 또는 13의 다가 CAR, 여기서 첫 번째 BCMA 결합 모이어티는 항-BCMA sdAb이고, 그리고 두 번째 BCMA 결합 모이어티는 BCMA의 폴리펩티드 리간드이다.
구체예 17. 구체예 12-16 중에서 한 가지의 다가 CAR, 여기서 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 및 두 번째 BCMA 결합 모이어티는 BCMA 상에서 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다.
구체예 18. 구체예 12-16 중에서 한 가지의 다가 CAR, 여기서 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 및 두 번째 BCMA 결합 모이어티는 BCMA 상에서 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다.
구체예 19. 구체예 12-18 중에서 한 가지의 다가 CAR, 여기서 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 및/또는 두 번째 BCMA 결합 모이어티는 서열 번호: 388-394에서 선택되는 아미노산 서열로부터 유래된 BCMA 상에서 에피토프에 특이적으로 결합한다.
구체예 20. 구체예 12-19 중에서 한 가지의 다가 CAR, 여기서 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 및 두 번째 BCMA 결합 모이어티 중에서 하나 또는 그 이상은 구체예 1의 항-BCMA sdAb이다.
구체예 21. 구체예 12-20 중에서 한 가지의 다가 CAR, 여기서 첫 번째 BCMA 결합 모이어티는 두 번째 BCMA 결합 모이어티의 N 말단에서 위치된다.
구체예 22. 구체예 12-20 중에서 한 가지의 다가 CAR, 여기서 첫 번째 BCMA 결합 모이어티는 두 번째 BCMA 결합 모이어티의 C 말단에서 위치된다.
구체예 23. 구체예 12-22 중에서 한 가지의 다가 CAR, 여기서 첫 번째 BCMA 결합 모이어티 및 두 번째 BCMA 결합 모이어티는 펩티드 링커를 통해 서로에 융합된다.
구체예 24. 구체예 23의 다가 CAR, 여기서 펩티드 링커는 약 50개 아미노산 길이 이내이다.
구체예 25. 구체예 24의 다가 CAR, 여기서 펩티드 링커는 서열 번호: 208-215로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
구체예 26. 구체예 9-25 중에서 한 가지의 CAR 또는 다가 CAR, 여기서 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택되는 분자로부터 유래된다.
구체예 27. 구체예 26의 CAR 또는 다가 CAR, 여기서 막경유 도메인은 CD8α 또는 CD28로부터 유래된다.
구체예 28. 구체예 27의 CAR 또는 다가 CAR, 여기서 막경유 도메인은 서열 번호: 193 또는 194의 아미노산 서열을 포함한다.
구체예 29. 구체예 9-28 중에서 한 가지의 CAR 또는 다가 CAR, 여기서 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
구체예 30. 구체예 29의 CAR 또는 다가 CAR, 여기서 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다.
구체예 31. 구체예 30의 CAR 또는 다가 CAR, 여기서 일차 세포내 신호전달 도메인은 서열 번호: 197 또는 198의 아미노산 서열을 포함한다.
구체예 32. 구체예 9-31 중에서 한 가지의 CAR 또는 다가 CAR, 여기서 세포내 신호전달 도메인은 동시자극성 신호전달 도메인을 포함한다.
구체예 33. 구체예 32의 CAR 또는 다가 CAR, 여기서 동시자극성 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 동시자극성 분자로부터 유래된다.
구체예 34. 구체예 33의 CAR 또는 다가 CAR, 여기서 동시자극성 신호전달 도메인은 CD28의 세포질 도메인 및/또는 CD137의 세포질 도메인을 포함한다.
구체예 35. 구체예 34의 CAR 또는 다가 CAR, 여기서 동시자극성 신호전달 도메인은 서열 번호: 195 및/또는 서열 번호: 196의 아미노산 서열을 포함한다.
구체예 36. 구체예 32-35 중에서 한 가지의 CAR 또는 다가 CAR, 여기서 세포내 신호전달 도메인은 최소한 2개의 동시자극성 신호전달 도메인을 포함한다.
구체예 37. 세포외 항원 결합 도메인의 C 말단 및 막경유 도메인의 N 말단 사이에 위치된 힌지 도메인을 더욱 포함하는, 구체예 9-36 중에서 한 가지의 CAR 또는 다가 CAR.
구체예 38. 구체예 37의 CAR 또는 다가 CAR, 여기서 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다.
구체예 39. 구체예 38의 CAR 또는 다가 CAR, 여기서 힌지 도메인은 서열 번호: 192의 아미노산 서열을 포함한다.
구체예 40. 폴리펩티드의 N 말단에서 위치된 신호 펩티드를 더욱 포함하는, 구체예 9-39 중에서 한 가지의 CAR 또는 다가 CAR.
구체예 41. 구체예 40의 CAR 또는 다가 CAR, 여기서 신호 펩티드는 CD8α로부터 유래된다.
구체예 42. 구체예 41의 CAR 또는 다가 CAR, 여기서 신호 펩티드는 서열 번호: 191의 아미노산 서열을 포함한다.
구체예 43. 서열 번호: 216-256 및 298-335로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 항원 수용체.
구체예 44. 구체예 11-43 중에서 한 가지의 CAR 또는 다가 CAR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산.
구체예 45. 서열 번호: 257-297 및 336-373으로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는, 청구항 44의 단리된 핵산.
구체예 46. 두 번째 CAR을 인코딩하는 두 번째 핵산 서열을 더욱 포함하는, 구체예 45의 단리된 핵산, 여기서 상기 CAR을 인코딩하는 핵산 서열은 자가-개열 펩티드를 인코딩하는 세 번째 핵산 서열을 통해 두 번째 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.
구체예 47. 구체예 46의 단리된 핵산, 여기서 자가-개열 펩티드는 T2A, P2A 및 F2A로 구성된 군에서 선택된다.
구체예 48. 구체예 47의 단리된 핵산, 여기서 세 번째 핵산 서열은 서열 번호: 385이다.
구체예 49. 구체예 44-48 중에서 한 가지의 단리된 핵산, 여기서 단리된 핵산은 RNA 분자이다.
구체예 50. 구체예 44-49 중에서 한 가지의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
구체예 51. 구체예 50의 벡터, 여기서 벡터는 발현 벡터이다.
구체예 52. 구체예 50 또는 51의 벡터, 여기서 벡터는 바이러스 벡터이다.
구체예 53. 구체예 52의 벡터, 여기서 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
구체예 54. 구체예 50 또는 51의 벡터, 여기서 벡터는 비바이러스 벡터이다.
구체예 55. 구체예 9-43 중에서 한 가지의 CAR 또는 다가 CAR, 구체예 44-49 중에서 한 가지의 단리된 핵산, 또는 구체예 50-54 중에서 한 가지의 벡터를 포함하는 가공된 면역 작동체 세포.
구체예 56. 구체예 55의 가공된 면역 작동체 세포, 여기서 가공된 면역 작동체 세포는 T 세포, NK 세포, 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 조혈 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 또는 배아 줄기 세포이다.
구체예 57. 구체예 56의 가공된 면역 작동체 세포, 여기서 면역 작동체 세포는 T 세포이다.
구체예 58. 구체예 55-57 중에서 한 가지의 가공된 면역 작동체 세포 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물.
구체예 59. 구체예 58의 제약학적 조성물의 효과량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법.
구체예 60. 구체예 59의 방법, 여기서 암은 다발성 골수종이다.
구체예 61. 구체예 60의 방법, 여기서 암은 난치성 또는 재발성 다발성 골수종이다.
구체예 62. 구체예 59-61 중에서 한 가지의 방법, 여기서 가공된 면역 작동체 세포는 자가이다.
구체예 63. 구체예 59-61 중에서 한 가지의 방법, 여기서 가공된 면역 작동체 세포는 동종이계이다.
구체예 64. 구체예 59-63 중에서 한 가지의 방법, 여기서 개체는 인간이다.
구체예 65. 구체예 59-64 중에서 한 가지의 방법, 여기서 제약학적 조성물은 정맥내 투여된다.
구체예 66. 구체예 59-65 중에서 한 가지의 방법, 여기서 제약학적 조성물은 약 1x105 내지 약 1x107 세포/kg의 용량에서 투여된다.
구체예 67. 구체예 59-66 중에서 한 가지의 방법, 여기서 제약학적 조성물은 약 1 주에 걸쳐 3회 분할 용량에서 투여된다.
구체예 68. 개체에서 암을 치료하기 위한 구체예 58의 제약학적 조성물의 용도.
구체예 69. 개체에서 암을 치료하기 위한 약제의 제조에서 구체예 58의 제약학적 조성물의 용도.
구체예 70. 구체예 1-8 중에서 한 가지의 항-BCMA sdAb를 포함하는 제약학적 조성물.
구체예 71. 구체예 70의 제약학적 조성물의 효과량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 질환을 치료하는 방법.
구체예 72. 구체예 71의 방법, 여기서 질환은 암이다.
실시예
아래에 논의된 실시예는 본 발명의 순수한 예시인 것으로 의도되고, 그리고 이런 이유로, 본 발명을 어떤 방식으로도 제한하는 것으로 고려되지 않아야 한다. 이들 실시예는 아래의 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험이라는 것을 나타내는 것으로 의도되지 않는다. 이용된 숫자 (가령, 양, 온도 등)에 대하여 정확도를 담보하기 위한 노력이 이루어졌지만, 일부 실험 오차와 편차가 고려되어야 한다. 달리 지시되지 않으면, 분율은 중량에 의한 분율이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도 (℃)이고, 그리고 압력은 대기압이거나 또는 이에 가깝다.
실시예 1. 항-BCMA sdAbs의 제조
BCMA에 대해 높은 결합 친화성을 갖는 sdAbs를 개발하기 위해, 라마가 재조합 BCMA 항원으로 면역화되었다. 이후, VHH 리드를 확인하기 위해 파지 전시 라이브러리가 작제되었다. 상이한 클론이 무작위로 선발되었고, 그리고 항원 결합에서 주요한 역할을 수행할 수 있는 영역인 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR3)에 따라서 분류되었다. 예시적인 프로토콜이 아래에 설명된다. sdAbs를 제조하기 위한 다른 프로토콜이 설명되었다. 가령, Els Pardon et al, Nature Protocol, 2014; 9(3): 674를 참조한다.
1. 동물 면역화 및 면역 반응 검정
1.1 동물 면역화
C 말단 Fc 태그를 갖는 재조합 인간 BCMA 단백질을 포함하는 면역원 (ACRO Biosystems, 카탈로그 번호:BC7-H5254)이 어쥬번트 또는 PBS와 혼합되고 라마에 주사되었다. 이들 동물은 매번 약 1-주 내지 2-주 간격에서, 전형적으로 200 μg 면역원 및 CFA (완전한 프로인드 어쥬번트)로, 7 회 동안 서비스 공급업체 (Cedarline)에 의해 면역화되었다. 말초혈 표본은 면역화전 시기에서 및 5번째와 7번째 면역화 후 수집되었다. 복수 라운드의 면역화 후, 표적 항원에 대항하여 라마의 면역 반응이 항원 특이적 sdAbs의 역가를 확증하기 위해 평가되었다. 림프구는 약 100 ml의 말초혈로부터 구배 원심분리에 의해 단리되었다. 이들 세포는 RNALATERTM으로 보충되고 -80℃에서 보관되었다. 혈청은 항응고화된 혈액 표본의 원심분리에 의해 획득되고 -80℃에서 보관되었다.
1.2 IgG 분별
IgG-하위부류 분별은 GenScript의 표준 운영 절차에 따라 실행되었다. IgG 하위부류는 단백질 G 및 단백질 A 수지를 이용하여 종말 출혈 혈청으로부터 분획되었다. 1 ml 혈청 표본이 1 ml HITRAP® 단백질 G HP 칼럼 위에 적하되었고, 그리고 상기 칼럼은 10 ml 인산염 완충액 (20 mM, pH 7.0)으로 세척되었다. IgG3 (MW 100,000 Da) 분획물은 0.15 M NaCl, 0.58% 아세트산 (pH 3.5)으로 용리되었고, 그리고 용출물은 pH 7.4까지 1 M Tris-HCl (pH 9.0)로 중화되었다. 차후에, IgG1 (MW 170,000 Da) 분획물은 0.1 M 글리신-HCl (pH 2.7)로 용리되었고, 그리고 용출물은 pH 7.4까지 1 M Tris-HCl (pH 8.5)로 중화되었다. HITRAP® 단백질 G HP 칼럼의 관류는 이후, 1 ml HITRAP® 단백질 A HP 칼럼 위에 부하되었고, 그리고 상기 칼럼은 20 ml 인산염 완충액 (20 mM, pH 7.0)으로 세척되었다. IgG2 (MW 100,000 Da) 분획물은 0.15 M NaCl, 0.58% 아세트산 (pH 4.5)으로 용리되었고, 그리고 용출물은 pH 7.4까지 1 M Tris-HCl (pH 9.0)로 중화되었다. 정제된 IgG1, IgG2 및 IgG3 항체의 농도는 OD280에 의해 결정되었고, 그리고 각각의 순도는 환원 및 비환원 SDS-PAGE 분석 둘 모두에 의해 사정되었다.
1.3 면역 반응 검정
라마의 면역 반응은 ELISA에 의해 평가되었는데, 여기서 혈청 표본 및 정제된 IgGs가 고정된 면역원에 결합에 대해 검정되었다. 면역화전, 5번째 면역화 후 및 종말 출혈에서 수집된 혈청이 평가되었다. 항원 (즉, 재조합 인간 항원 단백질)은 코팅 완충액에서 4 μg/ml로 희석되었다. 마이크로역가 평판은 4℃에서 하룻밤 동안, 희석된 항원으로 코팅되었다. 평판은 이후, 세척 완충액으로 3 회 세척되고, 그 이후에 실온에서 2 시간 동안 차단되었다. 평판은 차후에, 세척 완충액으로 4 회 세척되었다. 일련의 희석된 혈청 또는 IgGs가 평판에 첨가되고 실온에서 1.5 시간 동안 배양되었다. 평판은 이후, 세척 완충액으로 4 회 세척되었다. HRP-접합된 항-라마 IgG 이차 항체가 평판에 첨가되고 실온에서 1 시간 동안 배양되었다. 세척한 후, TMB 기질이 각 웰에 첨가되고, 그리고 1 M HCl로 정지시키기 전에 10 분 동안 배양되었다. 결합을 정량하기 위해, 450 nm에서 흡광도가 MK3 분광계를 이용하여 각 웰에 대해 계측되었다.
2. V H H 파지 전시 라이브러리 작제
2.1 RNA 추출
전체 RNA는 제조업체의 프로토콜에 따라서 TRIZOL® 시약을 이용하여 단리된 림프구 (1.1.1로부터)로부터 추출되었다. 전체 RNA의 양 및 품질은 겔 전기이동에 의해 사정되고, 그리고 OD260/280에서 흡광도를 계측함으로써 정량되었다.
2.2 RT-PCR 및 V H H 증폭
전체 RNA는 제조업체의 프로토콜에 따라서, PRIMESCRIPTTM 1st 가닥 cDNA 합성 키트를 이용하여 oligo(dT)20 프라이머로 cDNA로 역전사되었다. 6개의 전방 및 2개의 후방 특이적 축중성 프라이머가 VHH 단편을 증폭하기 위해 설계되었는데, 이들은 2개의 BglI 제한 부위가 도입되었다. VHH 단편은 아래에 설명된 바와 같은 GenScript의 표준 운영 절차에 따라서 증폭되었다.
중쇄 면역글로불린의 가변 영역 (다시 말하면, VHHs)은 2-단계 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 증폭되었다. 첫 번째 PCR에서, 100 ng의 cDNA 주형은 프라이머 CALL001 (서열 번호: 374) 및 CALL002 (서열 번호: 375)와 혼합되었다. 첫 번째 PCR 반응으로부터 DNA 산물은 아가로즈 겔 전기이동에 의해 분석되었다. 겔 정제 후, 첫 번째 PCR의 DNA 산물은 두 번째 PCR에서 주형으로서 이용되었다. 두 번째 PCR은 프라이머 BACK-1 (서열 번호: 376), BACK-2 (서열 번호: 377) 및 PMCF (서열 번호: 378)로 수행되었다. VHH PCR 단편을 내포하는 증폭된 두 번째 PCR 산물은 겔 정제되고 효소 소화되고, 그리고 이후, 파지미드 플라스미드 내로 삽입되었다. VHH 유전자 단편을 갖는 재조합 플라스미드는 파지 전시 VHH 면역 라이브러리를 산출하기 위해 대장균 (E. coli) 세포 내로 전자 전달되었다.
PCR 반응을 위한 절차는 7 분 동안 94℃에서 초기 변성 단계, 그 이후에 1 분 동안 94℃, 1 분 동안 55℃ 및 1 분 동안 72℃의 30 주기; 그리고 그 이후에, 7 분 동안 72℃에서 최종 신장 단계를 갖는다.
2.3 파지 라이브러리 작제
VHH PCR 산물은 상이한 프라이머 쌍을 이용한 증폭에 의해 획득되었다. PCR 산물은 이후, BglI로 소화되고 겔 정제되었다. 겔 정제된 단편은 GenScript의 인하우스 파지미드 벡터 내로 삽입되었다. 결찰 및 형질전환 조건을 최적화하기 위한 예비 라이브러리가 작제되었다. 이들 최적화된 결찰 및 형질전환 조건은 파지미드 라이브러리를 개발하는데 이용되었다. 형질전환된 세포 중에서 작은 부분은 희석되고 100 μg/ml 암피실린으로 보충된 2xYT 평판 상에 스트리킹되었다. 이들 집락은 라이브러리 크기를 계산하기 위해 계수되었다. 양성 클론은 무작위로 선발되고, 그리고 라이브러리의 품질을 사정하기 위해 염기서열결정되었다. 나머지 형질전환된 세포는 100 μg/ml 암피실린 및 2% 글루코오스로 보충된 YT 평판 위에 스트리킹되었다. 집락의 론은 평판에서 긁어내졌다. 이들 세포 중에서 작은 분취량이 라이브러리 플라스미드 단리에 이용되었다. 나머지는 글리세롤로 보충되고 -80℃에서 스톡으로서 보관되었다.
3. 파지 전시 패닝
3.1 바이오-패닝
작제된 VHH 파지 라이브러리는 각각, GenScript에 의해 개발된 표준 절차를 이용하여, 재조합 인간 BCMA 단백질 및 인간 BCMA를 발현하는 CHO 세포 (다시 말하면, Legend Biotec에 의해 인하우스 제조된 CHO-BCMA 세포)에 대해 패닝되었다. 라이브러리 스톡은 로그 기까지 성장되었고, 그리고 이후, 라이브러리는 M13KO7 조력 파지로 구조되고 25℃에서 진탕기에서 하룻밤 동안 증폭되었다. 상기 파지는 이후, PEG/NaCl로 침전되고, PBS에서 재현탁되고, -80℃에서 보관되었다. 고체상 패닝의 경우에, 마이크로평판 웰은 4℃에서 하룻밤 동안 PBS에서 재조합 인간 BCMA 단백질로 코팅되었다. 액체상 패닝의 경우, CHO-BCMA 세포는 실온에서 1 시간 동안 차단 완충액으로 차단되었다. 코팅 또는 차단 단계 동안, 파지 입자는 마이크로평판 웰에서 차단 완충액 및 Fc 대조 단백질과 함께 전배양되었다. 전배양 후, 파지 입자가 각각, BCMA 단백질 또는 CHO-BCMA 용액으로 코팅된 웰에 첨가되고 1 시간 동안 배양되었다. 배양 후, 결합되지 않은 및 비특이적으로 결합된 파지는 2회 추가 PBS 세척으로 보충된, 6회 동안 PBST로 웰 또는 CHO-BCMA 세포를 헹굼으로써 씻겨 내려갔다. 결합된 파지 입자는 100 mM 트리에틸아민(TEA)에 의해 용리되었고, 그리고 용출물은 1 M Tris-HCl (pH 7.4)에 의해 중화되었다. 용출물 중에서 절반은 이후, 출력 적정을 위해, 지수적으로 성장하는 대장균 (E. coli) TG1 세포를 감염시키는데 이용되었다 (OD600 = 0.4~0.6).
3.2 파지 ELISA
표적 항원에 특정한 클론을 확인하기 위해 파지 ELISA가 수행되었다. 개별 출력 파지 클론은 96-깊은-웰 평판에서 성장되고, 그리고 M13KO7 조력 파지에 의해 하룻밤 동안 구조되었다. 항원 단백질에 결합하는 클론을 확인하기 위해, 96-웰 ELISA 마이크로역가 평판이 4℃에서 하룻밤 동안 코팅 완충액에서 각각, 재조합 인간 BCMA 단백질 및 Fc 대조 단백질로 코팅되었고, 그리고 평판은 이후, 차단 완충액으로 차단되었다. 차단한 후, 하룻밤 세포 배양액으로부터 웰마다 거의 50 μl의 파지 상층액이 4℃에서 1.5-시간 배양 동안 평판에 첨가되었다. 이들 평판은 4회 세척되고, 그리고 HRP-접합된 항-M13 단일클론 항체가 4℃에서 45-분 배양 동안 평판에 첨가되었다. 이들 평판은 다시 한 번, 5회 세척되었고, 그리고 기질 용액이 전개를 위해 웰에 첨가되었다. 450 nm에서 흡수가 각 웰에 대해 계측되었다.
CHO-BCMA 세포에 결합하는 클론을 확인하기 위해, CHO-BCMA 세포는 실온에서 1 시간 동안 차단 완충액으로 차단되었다. 차단한 후, 하룻밤 세포 배양액으로부터 웰마다 거의 20 μl의 파지 상층액이 실온에서 1-시간 배양 동안 세포 용액에 첨가되었다. 이들 세포가 4 회 세척된 후, HRP-접합된 항-M13 단일클론 항체가 실온에서 30-분 배양 동안 첨가되었다. 이들 세포는 5회 세척되었고, 그리고 기질 용액이 이후, 전개를 위해 첨가되었다. 흡수는 450 nm에서 계측되었다. 패닝 후, ELISA 양성 파지 클론이 무작위로 선별되었고, 그리고 DNA가 플라스미드 추출 키트를 이용하여 출력 파지로부터 준비되었다. 플라스미드 내에 항-BCMA VHHs는 염기서열화되었다.
실시예 2. 예시적인 일가 BCMA 키메라 항원 수용체의 제조
N 말단으로부터 C 말단으로 CD8α 힌지 도메인, CD28 막경유 도메인, CD28 세포질 도메인, CD137 세포질 도메인 및 CD3ζ 세포질 도메인을 포함하는 CAR 중추 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 화학적으로 합성되고, 그리고 미리 변형된 렌티바이러스 벡터 하류 내로 클로닝되고 구조성 hEF1α 프로모터에 작동가능하게 연결되었다. 결과의 CAR 중추 벡터는 "PLLV-hEF1α-8281373"으로 명명되었다. 벡터 내에 멀티-클로닝 부위 (MCS)는 PLLV-hEF1α-8281373 벡터, 상류 내로 VHH 단편의 N 말단에 융합된 CD8α 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되고 CAR 중추 서열에 작동가능하게 연결된 코자크 서열을 포함하는 핵산 서열 (서열 번호: 379)의 삽입을 허용하였다.
PLLV-hEF1α-8281373 중추를 이용하여 단일 VHH 도메인을 갖는 단일특이적 CAR을 작제하기 위해, VHH 도메인을 인코딩하는 핵산 서열이 CD8α 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 3'에 작동가능하게 연결되었다. 융합 핵산 서열은 화학적으로 합성되고, 그리고 당해 분야에서 공지된 분자 클로닝 기술에 의해 EcoRI (서열 번호: 380: 5'-GAATTC-3') 및 SpeI (서열 번호:381: 5'-ACTAGT-3') 제한 부위를 통해 PLLV-hEF1α-8281373 CAR 중추 내로 클로닝되었다. 표 4는 예시적인 단일특이적, 일가 항-BCMA CARs를 발현하도록 작제된 벡터를 열거한다.
단일특이적 CAR 구조체를 설계할 때, 추가 서열, 예를 들면, 두 번째 VHH를 인코딩하는 뉴클레오티드를 더욱 용이하게 삽입하기 위해, HpaI (서열 번호: 382: 5'-GTTAAC-3'), MluI (서열 번호: 383: 5'-ACGCGT-3'), NsiI (서열 번호: 384: 5'-ATGCAT-3') 부위를 비롯한 제한 부위가 CD8α 신호 펩티드 핵산 서열 및 VHH 핵산 서열 사이에 포함되었다.
pCMV-△R-8.74 및 pMD2.G (Addgene#12259)를 포함하는 렌티바이러스 포장 플라스미드 혼합물은 미리 최적화된 비율에서 폴리에테르이미드 (PEI)를 포함하는 VHH 단편을 갖는 벡터 PLLV-hEF1α-8281373과 예혼합되고, 이후 적절하게 혼합되고 실온에서 5 분 동안 배양되었다. 형질감염 혼합물은 이후, HEK293 세포에 방울방울 첨가되고 부드럽게 혼합되었다. 그 후에, 세포는 37℃ 및 5% CO2 세포 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양되었다. 상층액은 4℃, 500 g에서 10 분 동안 원심분리 후 수집되었다.
바이러스-내포 상층액은 0.45μm PES 필터를 통해 여과되고, 그 이후에 렌티바이러스 농도에 대해 초원심분리되었다. 초원심분리 후, 상층액은 조심스럽게 폐기되었고, 그리고 바이러스 펠렛이 미리 냉각된 DPBS로 신중하게 헹굼되었다. 바이러스는 적절하게 분취되고, 이후 -80℃에서 즉시 보관되었다. 바이러스 역가는 GenScript에 의해 개발된 HTRF 키트에 근거하여 p24에 의해 결정되었다.
PBMC 준비
백혈구는 건강한 공여자로부터 성분채집술에 의해 수집되었고, 그리고 세포 농도는 R10 배지에서 5x106 세포 /ml로 조정되었다. 백혈구는 이후, 1:1 (v/v) 비율에서 0.9% NaCl 용액과 혼합되었다. 3 ml 림포프렙 배지가 15 ml 원심분리기 튜브에 첨가되었고, 그리고 6 ml의 희석된 림프구 혼합물이 림포프렙 배지의 위에 천천히 층을 이루었다. 림프구 혼합물은 20℃에서 제동 없이 30 분 동안 800 g에서 원심분리되었다. 림프구 백혈구연층이 이후, 200 μl 피펫으로 수집되었다. 수확된 분획물은 용액의 밀도를 감소시키기 위해, 0.9% NaCl 또는 R10으로 최소 6 배 희석되었다. 수확된 분획물은 이후, 20℃에서 10 분 동안 250g에서 원심분리되었다. 상층액은 완전하게 흡인되었고, 그리고 10 ml의 R10이 세포 펠렛을 재현탁하기 위해 세포 펠렛에 첨가되었다. 혼합물은 20℃에서 10 분 동안 250 g에서 더욱 원심분리되었다. 상층액은 다시 한 번 흡인되었다. 100IU/ml IL-2와 함께 2 ml의 37℃ 미리 가온된 R10이 세포 펠렛에 첨가되었고, 그리고 세포 펠렛은 부드럽게 재현탁되었다. 세포 수는 트리판 블루 염색에 따라서 결정되었고, 그리고 이러한 PBMC 표본은 추후 실험에 대해 준비되었다.
T 세포 정제
인간 T 세포는 아래에 설명된 바와 같은 제조업체의 프로토콜에 따라서, Miltenyi Pan T 세포 단리 키트 (Cat#130-096-535)를 이용하여 PBMCs로부터 정제되었다. 세포 수가 먼저 결정되었고, 그리고 세포 현탁액은 10 분 동안 300 g에서 원심분리되었다. 상층액은 이후, 완전하게 흡인되었고, 그리고 세포 펠렛이 107 전체 세포마다 40 μl 완충액에서 재현탁되었다. 10 μl의 Pan T 세포 비오틴-항체 칵테일이 107 전체 세포마다 첨가되고, 철저하게 혼합되고, 냉장고 (2~8℃)에서 약 5 분 동안 배양되었다. 30 μl의 완충액이 이후, 107 세포마다 첨가되었다. 20 μl의 Pan T 세포 마이크로비드 칵테일이 107 세포마다 첨가되었다. 세포 현탁액 혼합물은 충분히 혼합되고 냉장고 (2~8℃)에서 추가 10 분 동안 배양되었다. 자성 분리를 위해 최소 500 μl가 필요하다. 자성 분리를 위해, LS 칼럼이 적합한 MACS 분리기의 자기장에서 배치되었다. 칼럼은 3 ml의 완충액으로 헹굼으로써 준비되었다. 세포 현탁액이 이후, 칼럼 위에 적용되었고, 그리고 표지화되지 않은 세포를 내포하는 관류는 수집되었는데, 이것은 농축된 T 세포 분획물을 대표하였다. 추가 T 세포가 칼럼을 3 ml의 완충액으로 세척하고 통과하는 표지화되지 않은 세포를 수집함으로써 수집되었다. 이들 표지화되지 않은 세포는 다시 한 번, 농축된 T 세포를 대표하고, 그리고 이전 단계로부터 관류와 조합되었다. 모아진 농축된 T 세포는 이후, 원심분리되고 R10+100IU/ml IL-2에서 재현탁되었다.
준비된 T 세포는 차후에, 제조업체의 프로토콜에 따라 인간 T 세포 활성화/확대 키트 (Miltenyi#130-091-441)로 48-96 시간 동안 미리 활성화되었는데, 여기서 항-CD3/CD28 MACSiBead 입자는 1:2의 비드-대-세포 비율에서 첨가되었다.
시험관내 세포독성 검정
미리 활성화된 T 세포는 1200 g, 32℃에서 1.5 시간 동안 원심분리로, 7 μg/ml 폴리브렌의 존재에서 렌티바이러스 스톡으로 형질도입되었다. 형질도입된 세포는 이후, 적합한 조건 하에 도입유전자 발현을 위해 세포 배양 인큐베이터로 이전되었다.
형질도입후 3 일자 또는 7 일자에, 형질도입된 T 세포는 수확되고, 그리고 20:1의 작동체 (CAR-T) 대 표적 세포 비율에서 20 시간 동안 종양 세포와 공동배양되었다. 표적 세포는 인간 다발성 골수종 세포주 RPMI8226.Luc, BCMA를 재조합적으로 발현하는 인간 세포주 K562.BCMA.Luc 세포, CD19를 재조합적으로 발현하는 K562.CD19.Luc 세포주, 또는 인간 교모세포종 세포주 U87MG.Luc 세포이었다. 모든 세포주는 개똥벌레 루시페라아제를 발현하도록 인하우스 가공되었다. 종양 세포에 대한 CAR-T의 세포독성을 검정하기 위해, ONE-GLOTM 발광 루시페라아제 검정 시약 (Promega#E6110)이 제조업체의 프로토콜에 따라 제조되고, 그리고 웰 내에 남아있는 루시페라아제 활성을 검출하기 위해 공동배양된 세포에 첨가되었다. 루시페라아제가 표적 세포에서만 발현되기 때문에, 웰 내에 남아있는 루시페라아제 활성은 웰 내에 생존가능한 표적 세포의 숫자와 직접적으로 상관한다. 최대 루시페라아제 활성은 작동체 세포의 부재에서 배양 배지를 표적 세포에 첨가함으로써 획득되었다. 최소 루시페라아제 활성은 세포독성 검정이 시작되는 시점에서 1%의 최종 농도에서 Triton X-100을 첨가함으로써 결정되었다. 특이적 세포독성은 다음 공식에 의해 계산되었다: 특이적 세포독성 %= 100% * (1-(RLU표본-RLU최소)/(RLU최대-RLU최소)).
BCMA를 표적으로 하는 예시적인 일가 CAR (CD269)이 선택되고 세포독성 검정에서 시험되었다. 도면 1a에서 보여 지는 바와 같이, 시험된 일가 BCMA CARs의 첫 번째 군 사이에서, 선별된 클론은 다발성 골수종 세포주 RPMI8226.Luc 세포에 대한 상이한 수준의 세포독성을 전시하였는데, 60% 이상의 일가 VHH-기초된 CAR-Ts가 RPMI8226.Luc 세포에 대한 >50% 세포독성을 보여주었다. 클론 269A37346, 269A37348, 269A37353 및 269A37355 기초된 CAR-T가 추가 시험을 위해 선택되었다. 특히, 클론 269A37346, 269A37348, 267A37353 및 269A37355 기초된 CAR-T는 형질도입되지 않은 대조 T 세포 (UnT)와 비교하여 CAR-T 처리에 의한 RPMI8226.Luc 세포 죽음에서 20%-30%보다 많은 증가로 다발성 골수종 세포주 RPMI8226.Luc 세포에 대한 강력한 세포독성을 전시하였다. 하지만, 이런 세포독성 증가는 인간 교모세포종 세포주 U87MG.Luc 세포에서는 일어나지 않았다 (도면 1b를 참조한다). UnT 대조와 비교하여 이들 일가 VHH-기초된 CAR-T 세포에 의한 U87MG.Luc에 대한 유의미한 세포독성 효과는 검출되지 않았다. 상기 관찰 결과는 이들 클론 중에서 일부가 표적 특이적이고 BCMA 양성 세포에 대해 강력할지도 모른다는 것을 지시하였다.
예시적인 일가 BCMA CARs의 두 번째 군은 시험관내 세포독성에 대해 사정되었다. 항-BMCA scFv를 포함하는 CAR인 GSS005는 양성 대조로서 역할을 하였다. 항-EGFRvIII scFv를 포함하는 CAR인 GSI026은 음성 대조로서 역할을 하였다. 도면 2a-2b에서 보여 지는 바와 같이, 선별된 클론은 다발성 골수종 세포 RPMI8226.Luc, 그리고 BCMA 과다발현 안정된 세포주 K562.BCMA.Luc에 대한 상이한 수준의 세포독성을 전시하였다. 어떤 클론도 BCMA 음성 세포주 K562.CD19.Luc에 대한 강력한 세포독성을 보여주지 않았다 (도면 2c). 이들 클론 중에서, 269B005S, 269B028S, 269B030S, 269B054S, 269B060S, 269B069S, 269B093S, 269B094S, 269B104S, 269B109S, 269B110S 및 269B129S 기초된 CAR-T가 세포독성 데이터에 따르면 가장 강력하였다.
IFN감마 방출
추가적으로, 시험관내 공동배양 검정으로부터 상층액이 CAR-유도된 사이토킨 방출, 예를 들면, 인터페론 감마 (다시 말하면 IFNγ) 방출을 사정하기 위해 수집되었다. 도면 3에서 보여 지는 바와 같이, 선별된 일가 BCMA CARs를 발현하는 T 세포는 BCMA-발현 표적 세포 K562.BCMA.Luc와의 공동배양 시에 높은 수준의 IFNγ를 방출하였다. 비특이적 CAR-Ts, 예를 들면, GSI026, 또는 형질도입되지 않은 T 세포 (UnT)는 공동배양 동안 IFNγ의 방출을 유도하지 않았다. 사이토킨 방출 데이터는 시험관내 세포독성 데이터와 일치한다.
실시예 3. 예시적인 다가 BCMA 키메라 항원 수용체의 제조
다가 VHH-기초된 CARs는 VHH의 복수 사본, 또는 펩티드 링커를 통해 서로에 융합된 복수의 상이한 VHHs를 인코딩하는 핵산 서열을 CAR 신호 도메인 중추 벡터 내로 클로닝함으로써 작제될 수 있다. 예시적인 다가 BCMA CAR 구조체는 표 5에서 도시된다. 이들 구조체는 글리신-세린 펩티드 링커에 의해 2-3개의 항-BCMA VHHs를 융합하고, 그 이후에 코자크-CD8α 신호 펩티드 핵산 서열과 조합으로 이러한 융합 서열을 직접적으로 합성하고, 그리고 EcoRI 및 SpeI 제한 부위를 통해 PLLV-hEF1α-81373 CAR 중추 내로 클로닝함으로써 제조되었다. 일가 BCMA CAR 구조체 역시 대조로서 역할을 하기 위해, 동일한 PLLV-hEF1α-81373 CAR 중추 내로 클로닝되었다 (가령, GSI5011, GSI5019 및 GSI5020, 표 4).
CAR 유전자를 보유하는 렌티바이러스 벡터는 포장되고, 그리고 실시예 2에서 설명된 바와 같은 프로토콜로 적정되었다. 실시예 2에서 설명된 프로토콜을 이용하여, 인간 PBMCs는 Miltenyi 인간 PanT 세포 단리 키트를 이용한 일차 인간 T 세포의 추가 단리를 위해 지원자의 말초혈로부터 준비되었다. 정제된 T 세포는 실시예 2에서 설명된 바와 같이 Miltenyi 항-CD3/CD28 마이크로비드를 이용하여 미리 활성화되고 확대되었다. 미리 활성화된 T 세포는 이후, 1200 g, 32℃에서 1.5 시간 동안 원심분리에 의해, 7 μg/ml 폴리브렌의 존재에서 렌티바이러스 스톡으로 형질도입되었다. 형질도입된 세포는 이후, 적합한 조건 하에 도입유전자 발현을 위해 세포 배양 인큐베이터로 이전되었다.
시험관내 세포독성 검정
형질도입후 3 일자에, 형질도입된 T 세포는 수확되고 종양 세포와 공동배양되었다. 종양 세포에 대한 CAR-T의 세포독성을 검정하기 위해, ONE-GLOTM 발광 루시페라아제 검정 시약이 공동배양된 세포에 첨가되었고, 그리고 각 CAR-T에 대한 특이적 세포독성이 실시예 2에서 설명된 바와 같이 계측되었다.
첫 번째 실험에서, 일가 BCMA CAR (GSI5011), 이가 BCMA CAR (GSI5014) 및 삼가 BCMA CAR (GSI5015) 발현 T 세포는 20 시간 동안 20:1의 작동체 대 표적 비율에서 RPMI8226.Luc 세포와 공동배양되었다. 3개 CAR 구조체 모두 클론 269A37346의 항-BCMA VHH 도메인을 포함한다. 도면 4a에서 도시된 바와 같이, RPMI8226.Luc 세포의 특이적 용해 백분율은 형질도입되지 않은 대조 T 세포 (UnT)에 의한 0.05%±2.33%와 비교하여, GSI5011-발현 CAR-T 세포에 의해 63.25±2.64%, GSI5014-발현 CAR-T 세포에 의해 61.04±2.75%, 그리고 GSI5015-발현 CAR-T 세포에 의해 59.57±2.64%이었다. 상이한 항원 결합 양상을 갖는, 이들 시험된 BCMA CARs는 BCMA 양성 세포에 대한 강력한 항종양 활성을 가졌다.
두 번째 실험에서, 2개의 상이한 BCMA 결합 모이어티 269A37353 및 269A37917을 갖는 예시적인 이가 BCMA CARs (GSI5021-GSI5026)가 시험되었다. 각각의 이가 BCMA CAR을 발현하는 가공된 T 세포는 20 시간 동안 20:1의 작동체 대 표적 비율에서 RPMI8226.Luc 세포와 공동배양되었다. 일가 BCMA CARs, GSI5019 및 GSI5020 또한 비교를 위해 시험되었다. 도면 4b에서 도시된 바와 같이, RPMI8226.Luc 세포의 특이적 용해 백분율은 형질도입되지 않은 대조 T 세포 (UnT)에 의한 13.49%±1.75%와 비교하여, 각각, GSI5019-발현 CAR-T 세포에 의해 88.21±1.29%, GSI5020-발현 CAR-T 세포에 의해 93.84±1.13%, GSI5021-발현 CAR-T 세포에 의해 71.45±1.79%, GSI5022-발현 CAR-T 세포에 의해 99.80±0.45%, GSI5023-발현 CAR-T 세포에 의해 97.46±0.50%, GSI5024-발현 CAR-T 세포에 의해 81.29±1.27%, GSI5025-발현 CAR-T 세포에 의해 93.50±0.47%, GSI5026-발현 CAR-T 세포에 의해 87.83±0.23%이었다. 또한, 도면 4c에서 묘사된 바와 같이, BCMA-음성 세포주 U87MG.Luc의 특이적 용해 백분율은 형질도입되지 않은 대조 T 세포 (UnT)에 의한 12.49%±3.79%와 비교하여, GSI5019-발현 CAR-T 세포에 의해 2.84±7.41%, GSI5020-발현 CAR-T 세포에 의해 15.50±2.24%, GSI5021-발현 CAR-T 세포에 의해 6.74±3.37%, GSI5022-발현 CAR-T 세포에 의해 8.03±2.36%, GSI5023-발현 CAR-T 세포에 의해 9.00±1.88%, GSI5024-발현 CAR-T 세포에 의해 17.03±2.27%, GSI5025-발현 CAR-T 세포에 의해 16.81±1.98%, GSI5026-발현 CAR-T 세포에 의해 -11.55±5.43%이었다. 상기 데이터는 상이한 항원 결합 양상을 갖는 이가 CARs가 BCMA 양성 세포에 대항하여 강력한 항종양 활성을 갖지만, BCMA 음성 세포에 대해서는 그렇지 않았다는 것을 암시한다.
세 번째 실험에서, 2개의 상이한 BCMA 결합 모이어티를 갖는 예시적인 이가 BCMA CARs (다시 말하면, BCAR001-BCAR008)가 작제되었고, 그리고 이들 이가 BCMA CARs를 발현하는 가공된 CAR-T 세포가 R/R MM 환자 공여자 #13으로부터 획득된 일차 T 세포로부터 준비되었다. RPMI8226 (인간 다발성 골수종 세포주), A549 (인간 폐암 세포주), U87-MG (인간 교모세포종 세포주) 및 Raji (인간 버킷 림프종 세포주)를 비롯하여 인하우스 개발된 개똥벌레 루시페라아제 발현 세포주가 표적 세포로서 이용되었고, 그리고 37℃/5% CO2 세포 인큐베이터에서 20 시간 동안, 형질도입된 T 세포의 각 군과 나란히 공동배양되었다 (20:1 또는 5:1의 작동체: 표적 세포 비율에서). 공동배양의 완결 시에, 각 CAR-T의 세포독성을 사정하기 위해 남아있는 루시페라아제 활성 (상대적 발광 단위, RLU)이 ONE-GLOTM 발광 루시페라아제 검정 키트 (Promega)로 검정되었다. 도면 5a-5e에서 보여 지는 바와 같이, 이가 BCMA CAR-Ts는 RPMI8226.Luc, K562.BCMA.Luc 및 Raji.Luc 세포에 대항하여 용량 의존성 세포독성을 갖지만, BCMA 음성 A549.Luc 및 U87-MG.Luc 세포에 대해서는 세포독성을 거의 갖지 않았다. 도면 5f에서 데이터는 종양 세포에 대한 이들 이가 BCMA CAR-T 세포의 세포독성이 BCMA-특이적이라는 것을 증명하는데, 그 이유는 이들 CAR-T 세포가 CD38+/BCMA-인 K562.C38.Luc 세포에 대해 세포독성이 아니었기 때문이다. BCAR001-BCAR008 CAR-T 세포로 처리된 K562.BCMA.Luc만 UnT 처리된 표적 세포와 비교하여, 한정된 잔여 루시페라아제 활성 (다시 말하면, 생존가능 세포)을 보여주었다 (100 ± 3.95%, 평균 ± 표준 오차의 UnT와 비교하여, BCAR001-BCAR008에 대해 각각 2.88±0.45%, 12.84±1.67%, 2.22±0.56%, 1.77±0.14%, 2.59±0.28%, 6.58±1.19%, 2.47±0.20%, 6.61±1.47%). 이들 결과는 K562.BCMA.Luc 세포에 대항하여 이가 BCMA CAR-T 세포의 강력한 세포독성을 증명한다. BCAR001-BCAR008 CAR-T 세포는 K562.CD38.Luc 세포에 대한 유의미한 세포독성을 갖지 않았는데, 그 이유는 UnT-처리된 표적 세포와 비교하여, 루시페라아제 활성에서 유의미한 감소가 검출되지 않았기 때문이다 (100 ±6.58%, 평균 ± 표준 오차의 UnT와 비교하여, BCAR001-BCAR008 각각에 대해 111.82±5.11%, 111.72±3.43%, 104.74±0.24%, 95.04±2.70%, 93.93±7.23%, 97.72±1.86%, 111.90±2.01%, 108.33±4.05%). 이들 데이터는 이가 BCMA CAR-T의 세포독성이 BCMA 의존성이라는 것을 암시하였다.
IFN감마 방출
추가적으로, CAR-유도된 사이토킨 방출 (가령, 인터페론 감마, IFNγ 방출)을 사정하기 위해 시험관내 공동배양 검정으로부터 상층액이 수집되었다. 도면 6a-6b에서 보여 지는 바와 같이, 공동배양 검정에서 IFNγ 방출은 CAR-의존성이고 BCMA-특이적인데, 이것은 시험관내 세포독성 데이터와 일치한다 (표 6).
표 6. 이가 BCMA CAR-T에 의한 공동배양 검정에서 IFN 감마 방출
RPMI8226.Luc A549.Luc K562.CD38.Luc Raji.Luc
평균, pg/ml s.e. 평균, pg/ml s.e. 평균, pg/ml s.e. 평균, pg/ml s.e.
BCAR001 1097.23 61.87 89.18 42.19 135.81 5.87 795.87 7.29
BCAR002 4651.22 1.13 503.63 130.73 361.87 49.68 3613.30 34.04
BCAR003 3569.84 108.19 243.82 1.31 265.08 3.24 3348.66 49.80
BCAR004 3077.41 110.82 161.70 12.97 128.50 17.08 2931.11 120.31
BCAR005 2850.34 20.16 170.90 8.27 141.20 17.54 2976.27 67.22
BCAR006 2023.71 37.61 223.96 6.21 215.00 17.87 1588.54 77.96
BCAR007 1912.98 2.28 239.43 1.93 289.72 1.94 1472.87 49.76
BCAR008 1798.90 76.85 258.71 19.39 171.89 6.51 1526.93 66.70
UnT 281.75 20.55 143.70 10.46 85.65 1.98 328.61 6.69
통합된 CAR 유전자의 사본수
각 형질도입된 T 세포 군에 대한 통합된 CAR 유전자의 사본수는 반정량적 PCR (q-PCR) 검정에 의해 결정되었다. 간단히 말하면, CAR-T의 각 군으로부터 유전체 DNA는 Gentra Puregene 세포 키트 (Qiagen)로 준비되었다. 유전체 DNA의 농도는 나노드롭에 의해 결정되었고, 그리고 10ng 유전체 DNA 표본은 CAR 특이적 프라이머 (전방 프라이머 137P2F, 서열 번호: 398: 5'-GTCCTTCTCCTGTCACTGGTTAT-3'; 및 후방 프라이머 137P2R, 서열 번호: 399: 5'- TCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCA-3')을 이용하여, ABI#7300 q-PCR 기기에서 SYBR Green 실시간 PCR 마스터 믹스 플러스 (Toyobo)를 이용한 표준화된 q-PCR 검정을 위해 처리되었다. 각 통합된 CAR 유전자의 상대적 사본수는 표적 서열을 내포하는 플라스미드를 이용하여 확립된 표준 곡선에 근거하여 계산되었다.
표 7에서 보여 지는 바와 같이, 높은 사본 숫자의 CAR 벡터가 각 CAR-T 준비 동안 T 세포의 유전체 내로 통합되었다.
표 7. 유전체 통합 사본수.
구조체를 갖는 CAR-T 세포 사본수/ng gDNA
GSI5019 35091.6
GSI5020 27627.2
GSI5021 24926.8
GSI5022 26393.6
GSI5023 32376.3
GSI5024 39319.8
GSI5025 22269.3
GSI5026 34790.4
UnT 26.6
실시예 4. LCAR-B38M에서 2개 V H H 도메인의 에피토프 지도화 및 차별적 에피토프 결합
4개의 항-BCMA VHH 도메인의 에피토프가 지도화되었다. BCMA의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 2개의 상이한 항-BCMA VHH 도메인을 갖는 예시적인 이가 BCMA CAR이 작제되었다. LCAR-B38M CAR로 명명된, VHH1 및 VHH2를 포함하는 이가/이중-에피토프 CAR은 표 5에서 열거된 한 가지 다가 BCMA CAR이다.
표면 플라스몬 공명 (SPR) 검정
4개의 예시적인 항-BCMA VHH 서열 각각은 BCMA VHH-hIgG1Fc의 재조합 발현을 용이하게 하기 위해, 인간 IgG1 Fc 단편 (hIgG1Fc) 서열을 내포하는 벡터 내로 클로닝되었다. 재조합 단백질이 획득되고 SPR 검정을 위해 정제되었다.
BCMA에 대한 각 VHH-hIgG1Fc의 친화성은 BIACORE® 2000 분석 시스템 (GE Healthcare)을 이용한 SPR에 의해 결정되었다. 간단히 말하면, 각 VHH-hIgG1Fc 단백질은 4 μg/ml VHH-hIgG1Fc를 이용하여 CM5(들) 센서 칩에 공유적으로 연계되었다. 재조합 BCMA-His 단백질 (ACRO Biosystems, Cat#BCA-H522y)은 작업 완충액 (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% Tween-20, pH 7.4)에서 계열 희석되고, 그리고 10 μl/분의 유속에서 주입되고, 그 이후에 해리되었다. 연관률과 해리율 상수는 BIACORE® 2000 평가 소프트웨어 버전 3.0 (랭뮤어 결합, 국부 적합, 1: 1 결합 모형)을 이용하여 결정되었다. 이들 4개 VHH-hIgG1Fcs의 결합 친화성은 표 8에서 도시된다.
표 8. 인간 BCMA-His 단백질에 대한 V H H-hIgG1Fcs의 결합 친화성.
리간드 k a (1/Ms) k d (1/s) K D (M)
VHH1-hIgG1Fc 5.5E+04 <1.0E-05* <1.8E-10*
VHH2-hIgG1Fc 1.9E+06 1.5E-02 7.8E-09
VHH3-hIgG1Fc 3.4E+04 1.7E-04 5.1E-09
VHH4-hIgG1Fc 2.1E+06 9.4E-04 4.6E-10
표적 세포에 재조합 V H H-His 단백질의 결합
재조합 항-BCMA VHH-His 단백질은 항-BCMA VHH 서열을 N 말단에서 인간 알부민 신호 펩티드 서열 (N'-MKWVTFISLLFLFSSAYS-C'; 서열 번호: 386) 및 C 말단에서 6xHis-태그 (N'-GSGHHHHHH-C'; 서열 번호: 387)에 융합함으로써 작제되었다. 이들 코돈은 포유류 숙주 세포에서 최적 발현을 위해 더욱 최적화되었다. 획득된 뉴클레오티드 서열은 이후, 5'-XbaI 및 3'-HindIII 제한 부위를 통해 포유류 발현 벡터 pTT5 내로 클로닝되어 플라스미드, pTT5-LAB001 (VHH1의 경우), pTT5-LAB002 (VHH2의 경우) 및 pTT5-LAB003 (VHH1xVHH2의 경우)이 제공되었다.
재조합 BCMA VHH 단백질을 획득하기 위해, HEK293T 세포가 이들 플라스미드로 일시적으로 형질감염되었다. 간단히 말하면, 5x106 HEK293T 세포는 형질감염 하루 전에 10cm 세포 배양 접시에서 파종되었다. 다음 날, 이들 세포는 제조업체의 매뉴얼에 따라서, LIPOFECTAMINETM 2000 시약 (Thermofisher Scientific, 카탈로그 번호: 11668-019)을 이용하여 각 플라스미드로 형질감염되었다. 형질감염 후 4 일에, 상층액이 수확되었고, 그리고 항체의 발현 수준이 HRP 항-His 태그 (Biolegend, 카탈로그 번호: 652504)를 이용하여 ELSIA에 의해 검출되었다. LAB001, LAB002 및 LAB003의 발현 수준은 각각, 109.31ng/ml, 152.48ng/ml 및 396.62ng/ml이었다.
LAB001, LAB002 및 LAB003 항-BCMA VHH-His 단백질의 결합 친화성은 세포-기초된 검정을 이용하여 결정되었다. 간단히 말하면, 계열 희석된 항-BCMA VHH-His 단백질은 4℃에서 2 시간 동안 1x105 표적 세포 (K562.BCMA.Luc 또는 K562.CD38.Luc 세포, 이들은 각각, BCMA 또는 CD39를 안정되게 발현하는 인하우스 개발된 세포주이다)와 함께 배양되었다. 그 후에, 세포는 300g에서 10 분 동안 원심분리되었고, 그리고 상층액이 폐기되었다. 세포 펠렛은 DPBS로 재현탁되었다. 세포 펠렛은 세척되고, 원심분리되고, 그리고 상층액이 2번 더 폐기되었다. 이후, 세포 펠렛은 차후에, 45 분 동안 4℃에서 2 시간 동안 검출 항체 (THETM His 태그 항체 [FITC], GenScript Cat: A01620) 내포 완충액으로 재현탁되었다. 그 후에, 세포는 300g에서 10 분 동안 원심분리되었고, 그리고 상층액이 폐기되었다. 세포 펠렛은 세척되고, 원심분리되고, 그리고 상층액이 2번 더 폐기되었다. K562.BCMA.Luc 또는 K562.CD38.Luc 세포에 대한 LAB001, LAB002 및 LAB003의 결합 친화성은 ATTUNETM Nxt 유세포분석기를 이용하여 결정되었다. 데이터는 "힐 기울기에서 한 부위 특이적 결합"을 이용하여 GraphPad PRISMTM 버전 6.0에 의해 적합되었다.
도면 7a-7c에서 보여 지는 바와 같이, LAB001, LAB002 및 LAB003은 용량 의존성 방식으로 K562.BCMA.Luc 세포에 특이적으로 결합한다. 결합 친화성은 각각, 0.079 nM, 0.035 nM 및 0.0047 nM이었다. 이들 항체 중에서 어느 것도 BCMA 음성 세포주 K562.CD38.Luc에 유의미한 결합을 보여주지 않았다. 게다가, LAB003 (VHH1xVHH2)은 LAB001 (VHH1) 또는 LAB002 (VHH2)보다 훨씬 높은 결합 친화성 (0.0047nM)을 보여주었다.
에피토프 결합
BCMA (NP_001183, UniProt#Q02223)는 184개 아미노산 길이의 막경유 단백질이다. 인간 BCMA는 세포외 도메인 (ECD, 아미노 잔기 번호 1-54), 막경유 도메인 (TM, 아미노 잔기 번호 55-77) 및 세포질 도메인 (CD, 아미노 잔기 번호 78-184)으로 구성된다. 이에 더하여, 서열 분석은 BCMA가 이의 N 말단에서 인식가능한 신호 펩티드를 갖지 않는다는 것을 암시한다 (Laabi Y et al. (1992) EMBO J 11:3897-3904; Laabi Y et al. (1994) Nucleic Acids Res 22:1147-1154; Gras M P (1995) Int Immunol 7:1093-1106; Hong-Bing Shu and Holly Johnson (2000): Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 10.1073).
온라인 데이터베이스 UniProt (worldwide web.uniprot.org/uniprot/Q02223)에 의해 또한 예시된 바와 같이, 3개의 이황화 결합 (Cys-Cys)이 BCMA의 ECD에서 위치되는데, 이들은 위치 8 ↔ 21, 24 ↔ 37 및 28 ↔ 41에서 존재한다 (표 9). BCMA ECD의 이차 구조는 N 말단으로부터 C 말단으로 베타 가닥 (aa12-15), 회전 (aa16-19), 베타 가닥 (aa20-23), 나선 (aa 24-27), 베타 가닥 (aa30-32), 나선 (aa35 - 37), 회전 (aa38-40) 및 회전 (aa42-44)으로 구성된다. BCMA ECD의 구조는 도면 8a에서 도시되는데, 이들은 PDB 데이터베이스 worldwide web.ebi.ac.uk/ pdbe/entry/pdb/2kn1/로부터 구조로부터 복제된다.
표 9. 인간 BCMA의 단백질 서열.
위치(들) 설명 길이 AA 서열
1 - 54 세포외 도메인 54 MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNA (서열 번호: 395)
55 - 77 막경유 도메인 23 ILWTCLGLSLIISLAVFVLMFLL (서열 번호: 396)
78 - 184 세포질 도메인 107 RKINSEPLKDEFKNTGSGLLGMANIDLEKSRTGDEIILPRGLEYTVEECTCEDCIKSKPKVDSDHCFPLPAMEEGATILVTTKTNDYCKSLPAALSATEIEKSISAR (서열 번호: 397)
BCMA 에피토프 펩티드 (269EP001-269EP007)는 도면 8b 및 표 10에서 보여 지는 바와 같이 설계되고, 화학적으로 합성되고, 그리고 N 말단에서 비오틴화되었다. VHH1-hIgG1Fc 또는 VHH2-hIgG1Fc의 결합 친화성은 ELISA를 이용하여 결정되었다. 간단히 말하면, 앞서 설명된 펩티드는 4℃에서 하룻밤 동안 1μM에서 MAXISORPTM ELISA 평판 위에 코팅되었다. 다음 날, 이들 평판은 PBST (0.5% TWEEN-20을 첨가한다)로 2회 세척되고, 그 이후에 실온에서 1 시간 동안 0.5% BSA로 평판 차단되었다. 이들 평판은 이후, PBST로 2회 세척되고, 그 이후에 계열 희석된 VHH1-hIgG1Fc 또는 VHH2-hIgG1Fc가 10nM에서 삼중으로 첨가되고, 이후 4℃에서 2 시간 동안 배양되었다. 이들 평판은 이후, 차가운 PBST로 3 회 세척되고, 그 후에 염소 항-라마-HRP (1:1500, Bethyl Lab# A160)가 각 웰에 첨가되고 실온에서 1 시간 동안 더욱 배양되었다. 이들 평판은 이후, PBST로 4 회 세척되었고, 그리고 TMB 기질이 각 웰에 첨가되고 실온에서 10-30 분 동안 배양되었다. 이들 평판은 이후, 450nm에서 흡광도로 TECAN® 10M 마이크로평판 판독기에서 판독되었다.
표 10. BCMA 에피토프 펩티드 서열.
에피토프 위치 아미노산 잔기 서열 길이
269EP001 1-10 MLQMAGQCSQ (서열 번호: 388) 10
269EP002 8-21 CSQNEYFDSLLHAC (서열 번호: 389) 14
269EP003 11-23 NEYFDSLLHACIP (서열 번호: 390) 13
269EP004 20-30 ACIPCQLRCSS (서열 번호: 391) 11
269EP005 24-42 CQLRCSSNTPPLTCQRYCN (서열 번호: 392) 19
269EP006 36-43 LTCQRYCNAS (서열 번호: 393) 10
269EP007 43-54 ASVTNSVKGTNA (서열 번호: 394) 12
도면 9a에서 보여 지는 바와 같이, VHH1은 269EP005 펩티드에 대해 가장 강한 결합을 보였고, 269EP004 펩티드가 그 뒤를 이었다. 하지만, 269EP003 및 269EP006에 대한 VHH1의 결합은 269EP005 및 269EP004와 비교하여 상대적으로 약했다. VHH1은 269EP005 펩티드에서 위치된 에피토프 (다시 말하면, BCMA ECD의 아미노산 24-36)에 결합하는 경향이 있는데, 상기 펩티드는 나선 (aa24-27), 베타 가닥 (aa30-32) 및 나선 (aa35 - 37)의 이차 구조를 내포한다.
도면 9b에서 보여 지는 바와 같이, VHH2는 269EP002 펩티드에 대해 가장 강한 결합을 보였고, 269EP003 펩티드가 그 뒤를 이었다. 하지만, 269EP001 및 269EP004에 대한 VHH1의 결합은 269EP002 및 269EP003과 비교하여 상대적으로 약했다. BCMA ECD의 첫 번째 베타 가닥 (aa12-15) 및 베타 가닥 (aa20-23)이 269EP002 (aa8-21) 및 269EP003 (aa11-23)에 의해 커버된 서열에서 주로 위치되긴 하지만, VHH2는 이들 첫 2개의 베타 가닥에서 위치된 에피토프에 결합하는 경향이 있다.
경쟁적 결합 검정
VHH1 및 VHH2의 차별적 에피토프 결합은 세포-기초된 경쟁적 결합 검정에 의해 더욱 검증되었다. 인간 BCMA를 과다발현하는 안정된 CHO 세포주 ("CHO-BCMA")가 상기 검정에서 이용되었다.
간단히 말하면, 0.5x106 CHO-BCMA 세포는 4℃에서 0.5 시간 동안 이중으로 12.5 ng/ml LAB001 (이것은 C 말단에서 6xHis 태그를 내포한다)와 함께 전배양되었다. 이후, 계열 희석된 VHH2-hIgG1Fc 재조합 항체가 평판의 각 웰에 첨가되고 4℃에서 다른 1 시간 동안 더욱 배양되었다. 배양 후, 세포는 500μl DPBS로 세척되고 300g에서 10 분 동안 원심분리되었다. 세포 펠렛은 항-His 태그-FITC (1:200, GenScript Cat: A16020)를 내포하는 DPBS로 재현탁되었고, 이후 세포는 500μl DPBS로 세척되고 300g에서 10 분 동안 원심분리되었다. 세포 펠렛은 DPBS로 재현탁되고, 그리고 이후, ATTUNETM Nxt 유세포분석기에서 FACS 분석에 종속되었다. 검정 대조로서, 계열 희석된 VHH2-hIgG1Fc가 상기와 나란하게 동일한 절차에 따라서, LAB001의 존재 없이 CHO-BCMA 세포와 함께 직접적으로 배양되었다. 염소 항인간 IgG (Fc 특이적)-FITC 항체 (Sigma Aldrich Cat:F9512)가 CHO-BCMA 세포에 VHH2-hIgG1Fc의 결합을 검출하는데 이용되었다. 도면 10에서 보여 지는 바와 같이, VHH2-hIgG1Fc 단독은 CHO-BCMA에 용량 의존성 방식으로 결합한다. 하지만, VHH2-hIgG1Fc는 CHO-BCMA 세포에 대한 VHH1-His 결합과 경쟁할 수 없었는데, 이것은 BCMA 상에서 VHH1 및 VHH2의 상이한 결합 부위를 지시한다.
실시예 5. 종양 이종이식 생쥐에서 LCAR-B38M CAR-T의 생체내 효력
LCAR-B38M CAR-T 세포의 생체내 항종양 효력은 다발성 골수종 종양 이종이식편을 갖는 NCG 생쥐 모형 (NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/NjuCrl)에서 평가되었다. LCAR-B38M CAR은 상이한 BCMA 에피토프를 표적으로 하는 2개의 항-BCMA VHH 도메인을 갖는 이가 BCMA CAR이다.
NCG 생쥐 모형은 NOD/Nju에 유사유전자형 생쥐를 제공하는, NOD/Nju 생쥐에서 Prkdc와 Il2rg 좌위의 순차적 CRISPR/Cas9 편집에 의해 창출되었다. NOD/Nju 생쥐는 외래 조혈 줄기 세포의 이식을 허용하는, Sirpa (SIRP α) 유전자에서 돌연변이를 보유한다. Prkdc 녹아웃은 적절한 T-세포와 B-세포 형성을 결여하는 SCID-유사 표현형을 산출한다. Il2rg 유전자의 녹아웃은 NK 세포 생산의 감소를 부가적으로 유발하면서, SCID-유사 표현형을 더욱 악화시킨다. 따라서, NCG 생쥐는 SCID 및 누드 생쥐를 비롯한 통상적으로 이용되는 면역결핍성 생쥐 계통보다 더욱 면역손상되는 "삼중-면역결핍성" 생쥐 계통이다.
Prkdc 및 Il2rg는 T 세포, B 세포, NK 세포 및 정도가 덜하긴 하지만, 수지상 세포의 성숙과 형성에 영향을 주는 유전자의 SCID (중증 복합형 면역 부전증) 패밀리의 일부이다. Prkdc는 DNA-의존성 단백질 키나아제 효소의 촉매성 아단위를 인코딩하는데, 상기 효소는 성숙하는 T와 B 세포에서 항체 다양성을 전파하는데 필요한 과정인 V(D)J 재조합에 필요하다. Il2rg는 IL-2 및 복수의 IL 수용체 (IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21)에서 발견되는 공통 감마 아단위를 인코딩하는데, 이들 수용체는 미성숙 림프구 (가령, T, B 및 NK 세포) 그리고 다른 백혈구의 성숙을 위한 사이토킨-매개된 신호전달을 유도하는데 필요하다.
LCAR-B38M CAR-T 세포는 시험관내에서 RPMI8226.Luc 세포를 사멸시키는 가장 높은 효력을 갖는 CAR-T를 산출하는 T 세포 공급원을 스크리닝하기 위해, 다양한 공여자로부터 T 세포를 이용하여 준비되었다 (도면 11). 도면 11의 결과에 근거하여, LCAR-B38M CAR-T 세포는 생체내 동물 검정을 위한 선별된 공여자의 T 세포를 이용하여 준비되었다. 도면 12a는 LCAR-B38M CAR-T 세포의 이러한 배치 (batch)의 용량 의존성 시험관내 세포독성을 보여준다. 종양 이종이식편을 창출하기 위해, NCG 생쥐는 RPMI8226.Luc 세포가 정맥내 주입되었다. 14 일 후, 종양 이식된 생쥐는 LCAR-B38M CAR-T 세포 또는 형질도입되지 않은 T 세포로 처리되고, 그 이후에 생체내 생물발광 영상 (BLI)이 뒤따랐다.
도면 12b-12c에서 보여 지는 바와 같이, LCAR-B38M CAR-T 세포는 NCG 생쥐에서 이식된 RPMI8226.Luc 종양 세포를 근절하고 이들 생쥐를 구출하는데 효율적이었고, 반면 대조 (UnT) 군에서 대부분의 생쥐는 4 주 이내에 죽었다. 흥미롭게도, 부검 동안, 다양한 전이성 종양이 UnT 군에서 모든 생쥐의 간에서 관찰되었다. 이러한 관찰은 종양 표본으로부터 탈체 루시페라아제 활성을 사정함으로써 더욱 검증되었다 (도면 12d-12e). 대조적으로, LCAR-B38M CAR-T 처리된 생쥐는 간 내에 전이성 종양을 갖지 않았다. 요약하면, 상기 생체내 연구는 NCG 생쥐로부터 다발성 골수종 세포 (가령, RPMI8226.Luc)의 근절에서 LCAR-B38M CAR-T 세포의 효능을 증명한다.
실시예 6. 비인간 영장류에서 LCAR-B38M CAR-T 치료의 안전성 연구
LCAR-B38M CAR-T 세포의 생체내 안전성은 시노몰구스 원숭이 모형에서 평가되었다. PBMC는 2마리 원숭이 (NHP#120117 및 NHP#120545, 둘 모두 수컷, 대략 4kg)의 말초혈 표본으로부터 획득되고, 그리고 밀도 기울기 원심분리에 의해 준비되었다. 시노몰구스 원숭이 T 세포는 제조업체의 매뉴얼에 따라서, 비인간 영장류 Pan T 세포 단리 키트 (Miltenyi#130-091-993)를 이용하여 PBMC로부터 단리되었다. 준비된 원숭이 T 세포는 3 일 동안 비인간 영장류 T 세포 활성화/ 확대 키트 (Miltenyi#130-092-919), 인간 IL-2 및 자가 원숭이 혈청으로 미리 활성화되었다. 그 후에, 미리 활성화된 T 세포는 LCAR-B38M 렌티바이러스로 형질도입되고, 그 이후에 10 추가 일 동안 확대되었다.
자가 CAR-T 세포의 주입 3 일 전에, 이들 원숭이는 정맥내 주입에 의해 22mg/kg 체중의 용량에서 시클로포스파미드로 사전 처리되었다. 자가 주입의 당일에, 세포는 온건한 소용돌이에 의해 37℃ 수조에서 해동되고, 그리고 5 분 이내에 이들 동물에게 즉시 정맥내 주입되었다. 원숭이 NHP#120117은 5x106/kg CAR-T 세포가 주입되었고, 그리고 원숭이 NHP#120545는 4x107/kg CAR-T 세포가 주입되었다.
이들 원숭이는 T-세포 투여 후, 열병, 호흡 곤란, 식욕에서 변화, 설사 및 체중 감소에 대해 모니터링되었다. 투여전 및 투여후 혈액 표본이 획득되고, 그리고 CBC, 혈청 화학 및 사이토킨 수준에 대해 조사되었다. 도면 13a-13f에서 보여 지는 바와 같이, CAR-T 세포는 이들 원숭이에서 유의미한 독성을 나타내지 않았다.
실시예 7. 난치성/재발성 다발성 골수종을 앓는 인간 환자에서 LCAR-B38M CAR-T의 임상 연구
단일-팔, 개방 표지, 다중심, 1/2 단계 임상 연구가 난치성 또는 재발성 다발성 골수종 ("r/r MM")으로 진단된 인간 환자를 치료하는데 있어서 LCAR-B38M CAR-T 세포의 안전성 및 효력을 결정하기 위해 수행되었다. 임상 시험의 정보는 worldwide web.clinicaltrials.gov에서 식별자 NCT03090659로 찾아볼 수 있다.
상기 연구에서, 난치성/재발성 다발성 골수종 환자는 이들 환자의 자가 T 세포로부터 유래된 LCAR-B38M CAR-T 세포로 치료되었다. 0.5x106 - 5x106 세포/체중 kg의 전체 용량이 1 주의 지속 기간에 걸쳐 (가령, 0, 2 및 6 일자에) 3회 분할 용량 (각각, 20%, 30%, 및 50% )에서 정맥내 주사에 의해 각 환자에게 투여되었다. 상기 연구의 1-30 일자 동안, 환자는 부작용에 대해 모니터링되었고, 그리고 환자 표본이 실험실 사정을 위해 획득되었다. 모든 환자는 CAR-T 투여 후 최소한 36 개월 동안 추적 조사된다.
연구의 일차 결과는 LCAR-B38M CAR-T 세포의 주사 후 1-30 일 이내에, 이상 반응 공통 용어 기준 (CTCAE) v4.0에 의해 사정될 때 치료 관련된 부작용의 발생을 계측한다. 이차 결과는 예로서, LCAR-B38M CAR-T 세포의 투여 전후에 환자의 혈청에서 일탈적 면역글로불린 수준, 그리고 골수에서 다발성 골수종 세포의 숫자를 결정함으로써 CAR-T 유도된 항-골수종 반응을 사정한다. 상기 연구의 효력 목적은 병리학적 완전한 반응 비율, 3-년 질환 없는 생존, 3-년 진행 없는 생존을 포함한다.
18-75 세 환자는 (1) 환자가 갱신된 IMWG 기준에 의해 규정된 바와 같은 활성 다발성 골수종의 확증된 이전 진단을 받으면; (2) 분명한 BCMA 발현이 유세포분석법 또는 면역조직화학에 의해, 골수 또는 형질세포종으로부터 악성 형질 세포에서 검출되면; 그리고 (3) 환자가 보르테조밉을 포함하는 최소한 3회의 이전 치료 섭생을 제공받았던 것으로 규정된 바와 같은, 또는 만약 그렇지 않으면, 임상의에 의해 확인된 난치성 다발성 골수종을 앓으면; 또는 환자가 the NCCN clinical practice guidelines in Oncology: Multiple Myeloma (2016 V2)에 의해 규정된 바와 같이 다발성 골수종이 재발하면, 연구에 적격이다.
다음의 환자는 연구로부터 배제된다: (1) 임신 가능성이 있거나, 또는 임신 또는 모유 영양 중인 여성; (2) 임의의 활성 감염 및 통제되지 않는 감염: B형 간염, C형 간염, HIV, 또는 다른 치명적인 바이러스와 세균 감염을 앓는 환자; (3) 필요한 백혈구성분채집술 또는 조건화 화학요법 섭생의 개시에 앞서 2 주 이내에 허용되지 않는 5 mg/일보다 많은 프레드니손 또는 동등한 용량의 다른 코르티코스테로이드의 전신 코르티코스테로이드 스테로이드 요법을 제공받았던 환자; (4) 임의의 통제되지 않는 병발성 질병 또는 심각한 통제되지 않는 의학적 장애를 앓는 환자; (5) CNS 전이 또는 증후성 CNS 침범 (두개 신경병증 또는 종괴성 병변 및 척수 압박 포함)을 보이는 환자; (6) 활성 급성 또는 만성 이식편-대-숙주-질환 (GVHD)을 앓거나, 또는 등록의 6 개월 이내에 GVHD에 대한 면역억제성 약제를 필요로 하는, 동종이계 줄기 세포 이식의 전력이 있는 환자; 또는 (7) 활성 자가면역 피부 질환, 예를 들면, 건선 또는 다른 활성 자가면역 질환, 예를 들면, 류마티스성 관절염을 앓는 환자.
2017년 5월의 중간 분석에서, 재발성 또는 치료 내성 (난치성) 다발성 골수종을 앓는 35명 환자가 LCAR-B38M CAR-T 치료를 제공받았다. 치료 효력의 첫 번째 징후는 빠르면, CAR-T 세포의 초기 주사 후 10 일에 나타났다. 전반적으로, 객관적 반응률은 100%이었고, 그리고 35명 환자 중에서 33명 (94%)이 CAR-T 세포를 제공받고 2 개월 이내에 골수종의 분명한 임상적 관해 (완전한 반응 또는 매우 우수한 부분적인 반응)를 보였다.
분석의 시간 추이에 의해, 19명 환자가 국제 골수종 실행 그룹 (IMWG) 공통 기준에 의한 완전 효력 사정을 위한 미리 설정된 시간인 4 개월 이상 동안 추적 조사되었다. 1명 환자는 부분적인 반응에 도달하였고, 그리고 4명 환자는 효력에서 매우 우수한 부분적인 관해 기준 (VgPR)을 달성하였다. 엄격한 완전한 반응 ("sCR") 기준에 도달한 어떤 환자도 재발하지 않았다. 1 년 이상 (12-14 개월) 동안 추적 조사된 5명 환자는 sCR 상태에서 머물렀고 최소 잔존 질환이 없었다 (다시 말하면, 골수 내에 검출가능한 암 세포 없음).
사이토킨 방출 증후군 ("CRS")은 CAR T-세포 요법의 통상적이고 잠재적으로 위험한 부작용이다. 단지 일시적인 CRS만 35명 환자 중에서 85%에 의해 경험되었다. CRS 증상은 열병, 저혈압, 호흡의 어려움, 그리고 복수의 장기에 문제를 포함한다. 대다수의 환자에서, CRS 증상은 경미하고 관리가능하였다. 단지 2명의 환자만 심각한 CRS (등급 3)를 경험했지만, 토실리주맙 (CAR-T 세포 요법의 임상 시험에서 CRS를 관리하는데 통상적으로 이용되는 염증-감소 치료제)을 제공받을 시에 회복되었다. 어떤 환자도 CAR T-세포 요법으로부터 신경학적 부작용, 다른 통상적인 합병증 및 심각한 합병증을 경험하지 않았다.
이러한 중간 임상 시험 데이터는 난치성/재발성 다발성 골수종을 앓는 환자에 대한 LCAR-B38M CAR-T 치료의 강력한 효력 및 안전성을 증명한다.
예비 임상 연구에서, 3명 환자는 일가 BCMA CAR을 발현하는 자가 T 세포, 다시 말하면, LCAR-B27S CAR-T 세포로 치료되었다. LCAR-B27S CAR (표 4에서 열거된 한 가지 일가 BCMA CAR)은 BCMA 분자의 단일 에피토프를 인식하는 단일 VHH 단편을 내포하는 항원 결합 도메인을 갖는다. 이러한 VHH 도메인은 이중-에피토프/이가 LCAR-B38M CAR의 두 번째 VHH 도메인과 동일하다.
시험관내 세포독성 검정에서, LCAR-B27S CAR-T 세포는 3명의 다발성 골수종 환자 각각으로부터 준비되었고, 그리고 LCAR-B38M CAR-T 세포 역시 대조로서, 이들 동일한 3명의 다발성 골수종 환자 각각으로부터 준비되었다. 양쪽 CAR-T 세포는 20 시간 동안 20:1 및 5:1의 작동체 대 표적 비율 (E/T 비율)에서 RPMI8226.Luc 세포와 공동배양되었다. 도면 14a에서 보여 지는 바와 같이, CAR-T 세포는 환자 A로부터 T 세포를 이용하여 준비되었다. 남아있는 생존가능 세포의 백분율은 RPMI8226.Luc 세포에서 남아있는 루시페라아제 활성에 의한 사정에서, E/T 비율이 20:1일 때, LCAR-B38M의 경우에 3.97±0.75% 및 LCAR-B27S의 경우에 3.17±0.57%이었다. 하지만, E/T 비율이 5:1일 때, LCAR-B38M은 LCAR-B27S와 비교하여 RPMI8226.Luc 세포를 사멸시키는데 더욱 높은 효능을 보여주었다 (LCAR-B38M의 경우에 33.37±0.75% 남아있는 생존가능 세포, LCAR-B27S의 경우에 68.60±1.60%). 도면 14b에서 보여 지는 바와 같이, CAR-T 세포는 환자 B로부터 T 세포를 이용하여 준비되었다. 남아있는 생존가능 세포의 백분율은 RPMI8226.Luc 세포에서 남아있는 루시페라아제 활성에 의한 사정에서, E/T 비율이 20:1일 때, LCAR-B38M의 경우에 4.45±0.57% 및 LCAR-B27S의 경우에 9.32±1.16%이었다. 하지만, E/T 비율이 5:1일 때, LCAR-B38M은 LCAR-B27S와 비교하여 RPMI8226.Luc 세포를 사멸시키는데 더욱 높은 효능을 다시 한 번 보여주었다 (LCAR-B38M의 경우에 40.92±3.00% 남아있는 생존가능 세포, LCAR-B27S의 경우에 84.05±1.56%). 도면 14c에서 보여 지는 바와 같이, CAR-T 세포는 환자 C로부터 T 세포를 이용하여 준비되었다. 남아있는 생존가능 세포의 백분율은 RPMI8226.Luc 세포에서 남아있는 루시페라아제 활성에 의한 사정에서, E/T 비율이 20:1일 때, LCAR-B38M의 경우에 2.56±0.88% 및 LCAR-B27S의 경우에 10.12±1.83%이었다. 하지만, E/T 비율이 5:1일 때, LCAR-B38M은 LCAR-B27S와 비교하여 RPMI8226.Luc 세포를 사멸시키는데 더욱 높은 효능을 다시 한 번 보여주었다 (LCAR-B38M의 경우에 29.99±3.13% 남아있는 생존가능 세포, LCAR-B27S의 경우에 100.93±9.25%).
예비 임상 연구에서, 3명 환자는 LCAR-B27S CAR-T 세포로 치료되었는데, 여기서 모든 전제조건으로서, 주사 및 추적 조사 프로토콜은 이가 LCAR-B38M CAR를 이용한 임상 연구의 것들과 동일하였다. 3x106 세포/체중 kg (환자 A), 5x106 세포/체중 kg (환자 B) 및 7x106 세포/체중 kg (환자 C)의 전체 용량의 자가 LCAR-B27S 변형된 CAR-T 세포가 각각, 1 주의 지속 기간에 걸쳐 (가령, 0, 2 및 6 일자에) 3회 분할 용량 (각각, 20%, 30% 및 50%)에서 정맥내 주사에 의해 각 환자에게 투여되었다. 상기 연구의 1-30 일자 동안, 환자는 부작용에 대해 모니터링되었고, 그리고 환자 표본이 실험실 사정을 위해 획득되었다. 모든 환자는 CAR-T 투여 후 최소한 36 개월 동안 추적 조사되었다.
3명의 환자 중에서 2명의 환자는 매우 우수한 부분적인 반응 (VgPR)에 도달하였지만, 양쪽 환자는 CAR-T 주입 후 6 개월 이내에 재발하였다. 세 번째 환자는 어떤 임상적 반응도 보여주지 않았다. LCAR-B27S로 예비 연구는 결과적으로, 추가 환자 등록 없이 IRB에 의해 종결되었다.
이러한 예비 일가 BCMA CAR 연구 (LCAR-B27S) 및 이가 BCMA CAR 연구 (LCAR-B38M CAR-T)로부터 객관적 반응률, 완전 관해 비율 및 재발률은 아래의 표 11에서 도시된다. 이가 BCMA CAR-T는 일가 BCMA CAR-T와 비교하여 우수한 임상 효능을 보였다.
표 11: 일가 및 이가/이중-에피토프 BCMA CAR-T 요법의 비교 임상 데이터
작용제 N 용량 (세포/kg) 임상 시험 객관적 반응률 (ORR) 완전 관해 (CR) 비율 재발률 (>6 개월)
일가 BCMA CAR-T (LCAR-B27S) 3 각각 3, 5, 7x106 예비 연구 67% 0% 67%
이가/이중-에피토프 BCMA CAR-T
(LCAR-B38M) 		35 0.3x106 - 5.6x106 (중앙=2.9x106 ) NCT03090659 100% 57.1% 7.5%
SEQUENCE LISTING <110> LEGEND BIOTECH IRELAND LIMITED <120> CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS TARGETING BCMA AND METHODS OF USE THEREOF <130> IPA181464-CN <150> PCT/CN2016/094408 <151> 2016-08-10 <160> 399 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Asp Tyr Tyr Ala Ile Gly 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Thr Tyr Gly Met Ala 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Thr Phe Thr Met Gly 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Ile Asn Ala Met Gly 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Ser Ile Val Met Gly 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Arg Ala Val Ile Val 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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acttgaggac acggccgttt attactgtgc ggtcctccgc 300 gcttggatct catatgacaa tgactactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360 <210> 161 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 161 caggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggagg caccttaagt aaaaataccg tggcttggtt ccgccaggct 120 ccagggaagg agcgtgggtt tgtagcgtct attacctggg atggtcgtac gacatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacagtgtat 240 ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggat acggccgttt atgtctgtgc agacttaggg 300 aaatggcctg cgggcccggc ggactactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360 <210> 162 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 162 caggtaaagc tggaggagtc tgggggaggc ttggtgcagg ctgggcggtc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctgaaca caccttcagt agccatgtca tgggctggtt ccgccaggct 120 ccagggaagg agcgtgagtc tgttgcagtt attggctgga gagatattag cacaagctat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa 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caccatttcc agagacggcg ccaagaatgc ggtatatttg 240 caaatgaaca gtctgaaacc tgaggacaca gcggtctatt tatgtggagc cgatggttgg 300 ggtgctacta ccttagatta tacctacggc atggactatt ggggcaaagg gacccaggtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 165 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 165 gcggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggacg caccttcacc atggggtggt tccgtcaggc tccagggaag 120 gagcgtgggt ttgtagcgtc tattacctgg gatggtcgtt cggcatacta tgcagagtcc 180 gtgaagggcc gattcaccat cagccgagac aacgccaaga acacggtggt tttgcaaatg 240 aacagcctga aacctgagga cacggccctt tattactgtg cagcagaccg gaaatcagta 300 atgtctattc ggcccgacta ctggggccag gggacccagg tcaccgtctc ctca 354 <210> 166 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 166 caggtacagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagc ctggggggtc tctaagactc 60 gcatgtgaag cgcctggaag cggcaatagt atcaatgcca tgggctggta ccggcagact 120 ccggggaagc ggcgcgagtt ggtcgcaact attactcggg 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caccttaagt aaaaataccg tggcttggtt ccgccaggct 120 ccagggaagg agcgtgggtt tgtagcgtct attacctggg atggtcgtac gacatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacagtgtat 240 ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggat acggccgttt atgtctgtgc agacttaggg 300 aaatggcctg cgggcccggc ggactactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360 <210> 171 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 171 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgacactc 60 tcctgtgcag cctctggaag catcgacagt atcaatacca tggactggtt ccgtcaggct 120 ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagct attagtttga gtcccacttt agcatattat 180 gcagagtccg tgaagggccg attcaccatc agccgagaca acgccaagaa cacggtggtt 240 ttgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggcccttt attactgtgc agcagaccgg 300 aaatcagtaa tgtctattcg gcccgactac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 172 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 172 gatgtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg 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caggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggacg caccttaagt agtaatacca tggcttggtt ccgccaggct 120 ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcgtct actacctgga atggtcgtag cacatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgatgtat 240 ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggat acggccgttt atgtctgtgc agacttaggg 300 aaatggcctg cgggcccggc ggactactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360 <210> 175 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 175 caggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggacg caccttcacc atggggtggt tccgtcaggc tccagggaag 120 cagcgcgaat tggtcgcaga tattagtggt ggtcgcacaa actatgcaga ttccgtgaag 180 ggacgattca ccatctccag agacaacgcc aagaacacgg tatatctgca aatgaacagc 240 ctgaaacctg aggacacggc cgtttattac tgtgcagcag accggaaatc agtaatgtct 300 attcggcccg actactgggg ccaggggacc caggtcaccg tctcctca 348 <210> 176 <211> 312 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 176 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagg ctggggcctc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggacg caccttcacc gtggcagcta ttagtttgag tcctacttta 120 gcatattatg cagagtccgt gaagggccga ttcaccatca gccgagacaa cgccaagaac 180 acggtggttt tgcaaatgaa cagcctgaaa cctgaggaca cggcccttta ttactgtgca 240 gcagaccgga aatcagtaat gtctattcgg cccgactact ggggccaggg gacccaggtc 300 accgtctcct ca 312 <210> 177 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 177 gatgtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggagcagg ctgggggctc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggagg caccttaagt aaaaataccg tggcttggtt ccgccaggct 120 ccagggaagg agcgtgggtt tgtagcgtct attacctggg atggtcgtac gacatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacagtgtat 240 ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggat acggccgttt attactgtgc gtcgacggca 300 tcgtgccacc tcttcggatt ggggtccggg gcctttgtgt cctggggccg ggggacccag 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 178 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 178 gcggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggacg caccttcacc atggggtggt tccatcaggc tccagggaag 120 gagcgtgagt ttgtagcagc tattagtttg agtcctactt tagcatatta tgcagagtcc 180 gtgaagggcc gattcaccat cagccgagac aacgccaaga acacggtggt tttgcaaatg 240 aacagcctga aacctgagga cacggccctt tattactgtg cagcatccaa ggatagatat 300 tcggaatatg agtactgggg ccaggggacc caggtcaccg tctcctca 348 <210> 179 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 179 caggtaaagc tggaggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggacg caccttcacc atggggtggt tccgtcaggc tccagggaag 120 gagcgtgagt ttgtagcagc tattagtttg agtcctactt tagcatatta tgcagagtcc 180 gtgaagggcc gattcaccat cagccgagac aacgccaaga acacggtggt tttgcaaatg 240 aacagcctga aacctgagga cacggccctt tattactgtg caaaaaaaaa cggggggcct 300 gtggactact ggggcaaagg gacccaggtc accgtctcct ca 342 <210> 180 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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cacggccctt tattactgtg cagcagaccg gaaatcagta 300 atgtctattc ggcccgacta ctggggccag gggacccagg tcaccgtctc ctca 354 <210> 190 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 190 gatgtgcagc tggtggagtc tgggggagga tcggtgcaga ctgggggctc tctgagactc 60 tcctgtacag cctctggacg caccctcaat aactttgtca tgggctggtt ccgtcaggct 120 ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagct attagtttga gtcctacttt agcatattat 180 gtagagtccg tgaagggccg attcaccatc agccgagaca acgccaagaa cacggtggtt 240 ttgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggcccttt attactgtgc agcagaccgg 300 aaatcagtaa tgtctattcg gcccgactac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 191 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 191 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 192 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 192 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 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tatctacatc 960 tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccctttac 1020 tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac aaccatttat gagaccagta 1080 caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga 1140 tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag 1200 aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 1260 agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1320 ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1380 ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1440 aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgctaa 1488 <210> 372 <211> 1503 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 372 atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60 cctgatgtgc agctggtgga gtctggggga ggattggtgc aggctggggg ctctctgaga 120 ctctcctgtg cagcctctgg aggcacctta agtaagaata ccgtggcttg ggtccgccag 180 gctccaggga aggagcgtgg gtttgtaacg tctattacct 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caaacaacca 1080 tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa 1140 gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg 1200 taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 1260 gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag 1320 aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt 1380 gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 1440 ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1500 taa 1503 <210> 373 <211> 1518 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 373 atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60 cctgatgtgc agctggtgga gtctggggga ggattggtgc aggctggggg ctctctgaga 120 ctctcctgtg cagcctctgg aggcacctta agtaagaata ccgtggcttg ggtccgccag 180 gctccaggga aggagcgtgg gtttgtaacg tctattacct gtgatggtcg tacgacatac 240 tatgcgaact ccgtgaaggg ccgattcccc atctccagag acaacgccga gaacacagtg 300 tatctgcaaa tgaacagcct gaaacctgag gatacggccg gttatgtctg tgcagactta 360 gggaagtggc ctgcgggttc ggcggactac tggggccagg ggacccacgt caccgtctcc 420 tccggaggag gaggatccgg cggaggaggc tctggcggcg gcggctccgg cggcggcggc 480 tccgatgtgc agctggtgga gtctggggga ggcttggtgc agcctggggg gtctctgaga 540 ctctcctgtg cagcctctgg acggaccttc agtagcattg tcatgggctg gttccgccag 600 gctccaggga aggagcgtga gtttgtagga gcgattatgt ggaatgatgg tattacatac 660 ttgcaagact ccgtgaaggg ccgatttacc atcttcagag acaacgccaa gaacacggtg 720 tatctgcaaa tgaacagcct gaaacttgag gatacggccg tttattactg tgcagcatcc 780 aagggtagat actcggaata tgagtactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 840 actagtacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 900 cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 960 gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 1020 cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat 1080 atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 1140 tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc 1200 gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1260 cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1320 aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1380 gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1440 ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1500 gccctgcccc ctcgctaa 1518 <210> 374 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 374 gtcctggctg ctcttctaca agg 23 <210> 375 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 375 ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23 <210> 376 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 376 gatgtgcagc tgcaggagtc tggaggagg 29 <210> 377 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 377 gatgtgcagc tgcaggagtc tgggggagg 29 <210> 378 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 378 ctagtgcggc cgctgaggag acggtgacct gggt 34 <210> 379 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 379 gccgccacc 9 <210> 380 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 380 gaattc 6 <210> 381 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 381 actagt 6 <210> 382 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 382 gttaac 6 <210> 383 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 383 acgcgt 6 <210> 384 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 384 atgcat 6 <210> 385 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 385 Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 1 5 10 15 Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 386 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 386 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser <210> 387 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 387 Gly Ser Gly His His His His His His 1 5 <210> 388 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 388 Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln 1 5 10 <210> 389 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 389 Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser Leu Leu His Ala Cys 1 5 10 <210> 390 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 390 Asn Glu Tyr Phe Asp Ser Leu Leu His Ala Cys Ile Pro 1 5 10 <210> 391 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 391 Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser 1 5 10 <210> 392 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 392 Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg 1 5 10 15 Tyr Cys Asn <210> 393 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 393 Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser 1 5 10 <210> 394 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 394 Ala Ser Val Thr Asn Ser Val Lys Gly Thr Asn Ala 1 5 10 <210> 395 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 395 Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser 1 5 10 15 Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr 20 25 30 Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser 35 40 45 Val Lys Gly Thr Asn Ala 50 <210> 396 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 396 Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu Ile Ile Ser Leu Ala Val 1 5 10 15 Phe Val Leu Met Phe Leu Leu 20 <210> 397 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 397 Arg Lys Ile Asn Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly 1 5 10 15 Ser Gly Leu Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr 20 25 30 Gly Asp Glu Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu 35 40 45 Cys Thr Cys Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp 50 55 60 His Cys Phe Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val 65 70 75 80 Thr Thr Lys Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser 85 90 95 Ala Thr Glu Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg 100 105 <210> 398 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 398 gtccttctcc tgtcactggt tat 23 <210> 399 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 399 tcttcttctt ctggaaatcg gca 23

Claims (43)

  1. (a) 첫 번째 B-세포 성숙 항원(BCMA) 결합 모이어티 및 두 번째 BCMA 결합 모이어티를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인으로서, 첫 번째 BCMA 결합 모이어티가 첫 번째 항-BCMA 단일 도메인 항체(sdAb)이고, 두 번째 BCMA 결합 모이어티가 두 번째 항-BCMA sdAb이되, 첫 번째 및 두 번째 항-BCMA sdAb가 각각 VHH 도메인, 세포외 항원 결합 도메인;
    (b) 막경유 도메인; 및
    (c) 세포내 신호전달 도메인
    을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 다가 키메라 항원 수용체(CAR)로서,
    첫 번째 항-BCMA sdAb가 서열번호: 124의 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA sdAb에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 두 번째 항-BCMA sdAb가 서열번호: 117의 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA sdAb에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 다가 CAR.
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  7. 제1항에 있어서,
    (i) 첫 번째 항-BCMA sdAb가 서열번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고;
    (ii) 두 번째 항-BCMA sdAb가 서열번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는, 다가 CAR.
  8. 제1항에 있어서, 첫 번째 항-BCMA sdAb가 서열번호: 124의 아미노산 서열을 포함하고, 두 번째 항-BCMA sdAb가 서열번호: 117의 아미노산 서열을 포함하는, 다가 CAR.
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  14. 삭제
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  18. 제1항에 있어서, 첫 번째 항-BCMA sdAb가 두 번째 항-BCMA sdAb의 N-말단에 있거나; 또는 첫 번째 항-BCMA sdAb가 두 번째 항-BCMA sdAb의 C-말단에 있는, 다가 CAR.
  19. 제1항에 있어서, 막경유 도메인이 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택되는 분자로부터 유래하는, 다가 CAR.
  20. 제19항에 있어서, 막경유 도메인이 CD8α 또는 CD28로부터 유래하는, 다가 CAR.
  21. 제1항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 면역 작동체 세포의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 다가 CAR.
  22. 제21항에 있어서, 일차 세포내 신호전달 도메인이 CD3ζ로부터 유래하는, 다가 CAR.
  23. 제1항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 동시자극성 신호전달 도메인을 포함하는, 다가 CAR.
  24. 제23항에 있어서, 동시자극성 신호전달 도메인이 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 동시자극성 분자로부터 유래하는, 다가 CAR.
  25. 제24항에 있어서, 동시자극성 신호전달 도메인은 CD28의 세포질 도메인 및/또는 CD137의 세포질 도메인을 포함하는, 다가 CAR.
  26. 제1항에 있어서, 세포외 항원 결합 도메인의 C-말단과 막경유 도메인의 N-말단 사이에 위치하는 힌지 도메인을 추가로 포함하는, 다가 CAR.
  27. 제26항에 있어서, 힌지 도메인이 CD8α로부터 유래하는, 다가 CAR.
  28. 제1항에 있어서, 폴리펩티드의 N-말단에 위치하는 신호 펩티드를 추가로 포함하는, 다가 CAR.
  29. 제28항에 있어서, 신호 펩티드가 CD8α로부터 유래하는, 다가 CAR.
  30. 제1항에 있어서, 서열번호: 300 내지 305로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 다가 CAR.
  31. 제1항의 다가 CAR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  32. 제31항에 있어서, 핵산 서열이 서열번호: 338의 서열인, 단리된 핵산.
  33. 제31항에 있어서, 핵산 서열이 서열번호: 339 내지 343으로 구성된 군으로부터 선택되는, 단리된 핵산.
  34. 제31항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  35. 제1항, 제7항, 제8항, 및 제18항 내지 제30항 중 어느 한 항의 다가 CAR, 제31항의 단리된 핵산, 또는 제34항의 벡터를 포함하는 가공된 면역 작동체 세포(engineered immune effector cell).
  36. 제35항에 있어서, 면역 작동체 세포가 T 세포인, 가공된 면역 작동체 세포.
  37. 제35항의 가공된 면역 작동체 세포 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암의 치료에 유용한 약제의 제조에 사용하기 위한 제약학적 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 암이 다발성 골수종인, 제약학적 조성물.
  39. 제37항에 있어서, 암이 난치성 또는 재발성 다발성 골수종인, 제약학적 조성물.
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