CN116284385A

CN116284385A - 靶向bcma的p329g抗体及其与嵌合抗原受体细胞的组合和应用

Info

Publication number: CN116284385A
Application number: CN202111487287.1A
Authority: CN
Inventors: 徐伟; 危华锋; D·B·达洛夫斯基; 许丹; 姚影
Original assignee: Xinda Cell Pharmaceutical Suzhou Co ltd
Current assignee: Xinda Cell Pharmaceutical Suzhou Co ltd
Priority date: 2021-12-07
Filing date: 2021-12-07
Publication date: 2023-06-23
Also published as: WO2023104100A1; WO2023104099A1

Abstract

本发明涉及包含P329G突变的特异性结合B细胞成熟抗原蛋白(BCMA)的抗体，以及药物组合，所述药物组合包含(i)选自表达分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)、编码所述CAR多肽的核酸分子、包含所述核酸分子的载体和它们的任意组合；和(ii)所述包含P329G突变的特异性结合BCMA的抗体。本发明还涉及包含所述药物组合的成套药盒、以及所述药物组合在受试者中治疗与BCMA相关的疾病的用途。

Description

靶向BCMA的P329G抗体及其与嵌合抗原受体细胞的组合和应用

技术领域

本发明总体上涉及抗体工程和细胞免疫学领域，具体地，本发明涉及包含P329G突变的特异性结合B细胞成熟抗原蛋白(B-cell maturation antigen，BCMA)的抗体与经工程化以表达分子开关调控型嵌合抗原受体的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的组合，并涉及所述组合用于治疗与BCMA的表达相关的疾病，例如表达或过表达BCMA的癌症。

背景技术

B细胞成熟抗原(BCMA，即CD269，TNFRSF17)是肿瘤坏死因子受体超家族成员(TNFRSF)。BCMA是III型跨膜蛋白，在胞外结构域(ECD)中具有TNFR家族成员特征性的富半胱氨酸结构域(CRD)，该结构域形成配体结合基序。BCMA的配体包括B细胞激活因子(BAFF)和B细胞增殖诱导配体(APRIL)，其中B细胞增殖诱导配体(APRIL)与BCMA 以更高的亲和力结合，促进肿瘤细胞增殖。

BCMA主要表达在成熟B细胞即浆细胞表面，在正常造血干细胞和非血源组织中不表达， BCMA信号对于长效骨髓浆细胞的生存不可或缺，但非总体B细胞稳态所必需。膜表面BCMA 能够被γ分泌酶酶切而脱落，产生的可溶性BCMA(sBCMA)可能通过封闭BAFF/APRIL配体结合来降低膜表面BCMA信号传导。临床前模型以及人体肿瘤中发现BCMA在多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)细胞中过表达，其上调经典以及非经典NF-κB信号，促进 MM细胞生长、生存、粘附，诱导破骨细胞激活、血管生产、转移及免疫抑制等，BCMA表达已经成为诊断MM的重要标志物。此外，MM患者血清中sBCMA水平升高，与骨髓中 MM细胞数量呈正比例相关，且其浓度变化与MM预后及治疗应答密切相关。

鉴于BCMA仅限于表达在浆细胞中，在天然和记忆性B细胞中不表达的特性，BCMA成为治疗MM的热门靶点，目前已开发了多种靶向药物，包括嵌合抗原受体T细胞(CAR-T) 免疫疗法，其中蓝鸟(Bluebird)公司的Abecma(idecabtagene vicleucel，ide-cel)已于2021年 3月份获得FDA批准，用于4线及以上复发难治性MM(RRMM)的治疗，强生(Johnson&Johnson)和南京传奇联合开发的Ciltacabtagene autoleucel(Cilta-cel)也已递交生物制品许可申请(BLA)。

Abecma作为首个靶向BCMA的CAR-T细胞疗法，其通过识别并结合多发性骨髓瘤癌细胞上的BCMA蛋白，导致表达BCMA蛋白的癌细胞死亡。即，其是通过CAR-T细胞上的嵌合抗原受体(CAR)直接靶向肿瘤细胞的表面抗原BCMA蛋白，从而达到识别和杀伤肿瘤细胞的目的。该传统嵌合抗原受体T细胞的不足之处在于，对于回输体内后的CAR-T细胞活性缺乏控制，这些CAR-T细胞在体内激活后会持续识别和杀伤表达其靶向抗原的细胞，在某些情况下(例如肿瘤患者负荷的肿瘤大)，大量快速激活的CAR-T细胞会释放海量炎性细胞因子，使患者产生细胞因子释放综合征(CRS)、神经毒性(NT)等严重毒副反应。一项统计 84个临床试验含有2592例患者的荟萃研究显示，接受传统CAR-T细胞治疗后3级以上CRS 和NT发生率分别为29％和28％。虽然大量临床试验发现，发生毒性反应的多数患者在接受相应处理后能够快速恢复，也未显著影响抗肿瘤疗效，但毒副反应的处理占用大量临床资源，增加患者身心负担和经济负担。

由于绝大部分CAR-T细胞(例如，Abecma)靶向的抗原是肿瘤相关抗原(TAA)而非肿瘤特异性抗原(TSA)，这些TAA除了在肿瘤细胞上表达之外，在很多正常组织尤其是重要组织器官往往也存在低水平表达，CAR-T细胞对于所述正常组织的识别杀伤导致“在靶/ 脱肿瘤(On-target/off tumor)”毒性，机体短期内可能能够耐受，但如果长期不能恢复或者缓解，可能导致严重副作用。例如，临床使用靶向CD19的CAR-T细胞治疗CD19阳性血液肿瘤，CD19CAR-T细胞除了清除肿瘤细胞，它们也杀伤正常B细胞，CAR-T细胞在体内持续存在虽然与患者长期无复发地生存密切相关，但也同时导致机体长期B细胞发育不良，体液免疫缺失，容易引起感染。临床试验表明，接受CD19CAR-T细胞治疗后30天内27-36％淋巴瘤患者发生细菌感染，9.2-28％患者在一个月后发生病毒感染，需要中位时间6.7个月B细胞才能恢复，31-64％患者需要接受丙种球蛋白替代治疗。此外，CAR-T细胞在体内持续激活容易导致功能耗竭，损害其抗肿瘤效应，减少其在体内的存续性，从而降低长期治疗效应。

为了降低CAR-T细胞存在的“在靶/脱肿瘤(On-target/off tumor)”毒性，现有技术中通常采用以下策略。一种策略是在CAR设计时，将CAR中包含的抗原结合结构域设计为靶向肿瘤表面高表达而正常组织不表达或低表达的靶抗原。另一种策略是，严格控制施用的T 细胞剂量，因为过多的CAR-T细胞受抗原刺激后会呈指数级递增，更易引起在靶/脱肿瘤效应。还有一种策略是，在构建CAR时引入诱导型自杀基因，如诱导型Caspase-9(iCasp9)自杀基因，当观察到患者发生在靶/脱肿瘤毒性时，施用AP1903(一种能够激活iCasp9的二聚化化学诱导剂)使CAR-T细胞发生凋亡，减轻毒性(张慧慧等人，自杀基因作为一种“安全性开关”控制CAR-T细胞毒性的临床前研究，中国肿瘤生物治疗杂志，2021，28(3)：225-231)；也有利用单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因作为自杀基因，通过施用更昔洛韦治疗诱导 CAR-T细胞发生凋亡的报导。另外，也有报导使用电穿孔转染方法使T细胞瞬时表达CAR，通过一过性杀伤功能来发挥治疗作用(Kenderian SS等人，CD33-specificchimeric antigen receptor T cells exhibit potent preclinical activity againsthuman acute myeloid leukemia[J]Leukemia.2015；29(8)：1637-1647)。

对于现有技术中报导的使用自杀基因作为“开关”控制CAR-T“在靶/脱肿瘤(On-target /offtumor)”毒性的方案，在将iCasp9导入CAR-T细胞的情形，AP1903属于实验药品，实验人员必须签署协议，才能通过供应商获得；在将HSV-TK基因导入CAR-T细胞的情形，虽然更昔洛韦已用于控制干细胞移植中的移植物抗宿主病，而且临床上获得一定成效，但药物自身有免疫原性，导致清除靶细胞以外的细胞(Traversari C等人，Thepotential immunogenicity of the TK suicide gene does not prevent fullclinical benefit associated with the use of TK-transduced donor lymphocytesin HSCT for hematologic malignancies[J] Blood.2007；109(11)：4708-4715)，此外，TK作用的机制是细胞有丝分裂时干扰DNA合成，仅作用于分裂细胞，需要几天甚至几周才能达到预期效果。因此，本领域仍有开发其他“分子开关”来调控CAR-T细胞活性的迫切需要。

发明概述

靶向BCMA的传统CAR-T细胞在治疗MM仍然面临毒性及复发问题。一项荟萃研究显示，接受靶向BCMA的传统CAR-T细胞治疗后CRS和NT发生率为74％(95％CI，56-91％) 和34％(95％CI，24-43％)，其中3级以上事件发生率分别为25％(95％CI，7-43％)和12％(95％ CI，4-20％)。此外，接受治疗患者由于体内浆细胞缺失导致体液免疫受损，感染发生率增加，接受ide-cel治疗的128例复发难治性多发性骨髓瘤(RRMM)患者中69％发生感染，3级以上感染发生率22％，多数患者需要接受抗感染、升白细胞生长因子及免疫球蛋白替代治疗。同样，在接受Cilta-cel治疗的97例RRMM患者中，56％和20％发生感染及3级以上感染。这些临床结果表明，需要发展一种可调控的BCMA靶向CAR-T细胞疗法。

本发明人通过研究，设计、构建了通过与包含P329G突变的特异性结合BCMA分子的抗体的Fc结构域结合来靶向BCMA的P329G CAR-T细胞，并在体内外验证了其特异、可控的抗肿瘤效应。有别于传统BCMA靶向CAR-T细胞直接识别杀伤MM细胞，本发明的药物组合包括两个组分：BCMA特异的P329G抗体和P329G CAR-T细胞。BCMA特异的P329G 抗体识别表达BCMA的肿瘤细胞后，P329G CAR-T细胞通过识别P329G抗体的Fc结构域再定向至肿瘤细胞，产生肿瘤识别及杀伤效应(参见图1B)。在使用本发明的药物组合的治疗方法中，P329G抗体作为连接P329G CAR-T细胞和肿瘤细胞的桥梁，发挥“分子开关”作用，调节P329G CAR-T细胞活性。

因此，在第一方面，本发明提供了作为表达CAR多肽的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的“分子开关”的、能够特异性结合BCMA分子的P329G突变抗体，其包括但不限于ADI-38497PG Ab(本文中也称为“ADI-38497PG抗体”、“38497PG Ab”、“ADI-38497 PG IgG”、“38497PG IgG”、“PG 38497抗体”)、ADI-38484PG Ab(本文中也称为“ADI-38484 PG抗体”、“38484PG Ab”、“ADI-38484PG IgG”、“38484PG IgG”、“PG 38484 抗体”)。

在一些实施方案中，本发明获得了特异性结合BCMA分子的抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：

(a)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SSSYYWT(SEQ ID NO：25)所示的 CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；氨基酸序列SISIAGSTYYNPSLKS(SEQ ID NO：26)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和氨基酸序列DRGDQILDV(SEQ ID NO：27) 所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列RASQSISRYLN(SEQ ID NO：28)所示的 CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；氨基酸序列AASSLQS(SEQ ID NO：29)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和氨基酸序列QQKYFDIT(SEQ ID NO：30)所示的CDR L3、或所述CDRL3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；

(b)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列NDVIS(SEQ ID NO：31)所示的 CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；氨基酸序列VIIPIFGIANYAQKFQG(SEQ ID NO：32)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和氨基酸序列GRGYYSSWLHDI(SEQ ID NO：33) 所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列QASQDITNYLN(SEQ ID NO：34)所示的 CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；氨基酸序列DASNLET(SEQ ID NO：35)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和氨基酸序列QQAFDLIT(SEQ ID NO：36)所示的CDR L3、或所述CDRL3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；

其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代。

在一些实施方案中，本发明提供了特异性结合BCMA分子的抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：

(a)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SSSYYWT(SEQ ID NO：25)所示的 CDR H1；氨基酸序列SISIAGSTYYNPSLKS(SEQ ID NO：26)所示的CDR H2；和氨基酸序列DRGDQILDV(SEQ ID NO：27)所示的CDR H3；所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列RASQSISRYLN(SEQ ID NO：28)所示的CDR L1；氨基酸序列AASSLQS(SEQ ID NO： 29)所示的CDR L2；和氨基酸序列QQKYFDIT(SEQ ID NO：30)所示的CDR L3；

(b)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列NDVIS(SEQ ID NO：31)所示的 CDR H1；氨基酸序列VIIPIFGIANYAQKFQG(SEQ ID NO：32)所示的CDR H2；和氨基酸序列GRGYYSSWLHDI(SEQ ID NO：33)所示的CDR H3；所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列QASQDITNYLN(SEQ ID NO：34)所示的CDR L1；氨基酸序列DASNLET(SEQ ID NO：35)所示的CDR L2；和氨基酸序列QQAFDLIT(SEQ ID NO：36)所示的CDR L3。

(a)重链可变区包含SEQ ID NO：2的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：3的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；

(b)重链可变区包含SEQ ID NO：9的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：10的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

(a)重链可变区包含SEQ ID NO：2的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：3的序列；

(b)重链可变区包含SEQ ID NO：9的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：10的序列。

在一些实施方案中，本发明的特异性结合BCMA分子的抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 抗体；优选地，其是IgG1或IgG4抗体；更优选地，其是IgG1抗体。

在一些实施方案中，本发明的特异性结合BCMA分子的抗体的抗原结合片段是Fab、Fab’、 F(ab’)₂、Fv、单链Fv、单链Fab、双体抗体(diabody)。

对于所述特异性结合BCMA分子的抗体或抗原结合片段，通过将根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为甘氨酸(G)获得了具有突变Fc结构域的抗体，其中，与未突变的亲本抗体Fc结构域的Fcγ受体结合相比，突变Fc结构域的Fcγ受体结合降低。

在一些实施方案中，所述突变Fc结构域是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的突变Fc结构域，优选地，所述突变Fc结构域是IgG1或IgG4抗体的突变Fc结构域；更优选地，所述突变Fc结构域是IgG1抗体的突变Fc结构域；

在一些实施方案中，特异性结合BCMA分子的抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：5 所示的重链恒定区序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列且其中根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为G；

例如，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：5所示的重链恒定区序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列且其中根据 EU编号的P329位置处的氨基酸突变为G；和SEQ ID NO：6所示的轻链恒定区序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

在一个实施方案中，特异性结合BCMA分子的抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：5 所示的重链恒定区序列和SEQ ID NO：6所示的轻链恒定区序列。

在第二方面，本发明提供了编码本发明第一方面的抗体的核酸、包含编码所述抗体的核酸的载体、包含所述核酸分子或载体的细胞、以及制备所述抗体的方法，所述方法包括在适于表达编码本发明第一方面所述的特异性结合BCMA分子的抗体或抗原结合片段的核酸的条件下，培养导入有编码第一方面所述的特异性结合BCMA分子的抗体或抗原结合片段的核酸的表达载体的宿主细胞，分离所述特异性结合BCMA分子的抗体或抗原结合片段，任选地所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述特异性结合BCMA分子的抗体或抗原结合片段。优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的，更优选的选自大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞，最优选地，所述宿主细胞是HEK293 细胞或CHO细胞。

在第三方面，本发明提供了药物组合，其包含

(i)选自表达分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)、编码所述CAR多肽的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、和它们的任意组合；和

(ii)包含P329G突变的特异性结合BCMA分子的抗体或抗原结合片段(也称为P329G突变抗体)，例如，本发明第一方面的P329G突变抗体，以及

任选地可药用辅料；

其中，所述分子开关调控型CAR多肽包含

(1)人源化抗P329G突变scFv序列，其中所述scFv序列包含能够特异性结合包含P329G 突变的抗体Fc结构域，但不能特异性结合未突变的亲本抗体Fc结构域的如下序列：

(i)重链可变区，其包含根据Kabat编号的

(a)氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO：19)所示的重链互补决定区CDR H1、或所述 CDRH1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；

(b)氨基酸序列EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO：20)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和

(c)氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO：21)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和

(ii)轻链可变区，其包含根据Kabat编号的

(d)氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO：22)所示的轻链互补决定区(CDR L)1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；

(e)氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO：23)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和

(f)氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO：24)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；

其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代；

(2)铰链区/间隔区，其选自

(i)(G₄S)_n、(SG₄)_n或G₄(SG₄)_n肽接头，其中“n”是1至10的整数，例如1至4的整数；例如SEQ ID NO：14所示的序列；

(ii)CD8α铰链区或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO：18所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；

(3)跨膜区(TM)，其选自CD8跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO：15所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；

(4)共刺激信号结构域(CSD)，其选自4-1BB共刺激结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO：16所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；

(5)刺激信号结构域(SSD)，为CD3ζ信号传导结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO：17所示的序列或其具有1-10个、1-5个氨基酸修饰的变体；

其中所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。

在一些实施方案中，本发明药物组合中所述的分子开关调控型CAR多肽包含

(i)重链可变区，其包含根据Kabat编号的

(a)氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO：19)所示的CDR H1；

(b)氨基酸序列EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO：20)所示的CDR H2；和

(c)氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO：21)所示的CDR H3；和

(ii)轻链可变区，其包含根据Kabat编号的

(d)氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO：22)所示的CDR L1；

(e)氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO：23)所示的CDR L2；和

(f)氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO：24)所示的CDR L3；

例如，(i)重链可变区，其包含SEQ ID NO：12的序列或与其具有至少90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，和

(ii)轻链可变区，其包含SEQ ID NO：13的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；

例如，(i)重链可变区，其包含SEQ ID NO：12的序列，和(ii)轻链可变区，其包含SEQ ID NO：13的序列；

(2)铰链区/间隔区，其选自

(i)(G₄S)_n、(SG₄)_n或G₄(SG₄)_n肽接头，其中“n”是1至4的整数，例如SEQ ID NO：14所示的序列；

(ii)SEQ ID NO：18所示的CD8α铰链区序列或其具有1个氨基酸修饰的变体；

(3)跨膜区(TM)，其选自SEQ ID NO：15所示的CD8跨膜结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；

(4)共刺激信号结构域(CSD)，其选自SEQ ID NO：16所示的4-1BB共刺激结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；

(5)刺激信号结构域(SSD)，其选自SEQ ID NO：17所示的CD3ζ信号传导结构域或其具有 1个氨基酸修饰的变体；

其中所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。

在一些实施方案中，本发明药物组合中所述的分子开关调控型CAR多肽还包含位于N 端的信号肽序列，例如，SEQ ID NO：11所示的信号肽序列，

在一些实施方案中，本发明药物组合中所述的分子开关调控型CAR多肽具有SEQID NO： 1所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

在第四方面，本发明提供了编码本发明药物组合中所述的分子开关调控型CAR多肽的核酸、包含编码所述CAR多肽的核酸的载体、和包含所述CAR核酸分子或载体的细胞、或表达所述CAR多肽的细胞，优选地，所述细胞是自体T细胞或同种异体T细胞。

在一些实施方案中，编码本发明药物组合中所述的分子开关调控型CAR多肽的核酸分子是编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的核酸分子。

在一些实施方案中，包含编码本发明药物组合中所述的分子开关调控型CAR多肽的核酸分子的载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。

在一些实施方案中，本发明药物组合中的免疫效应细胞是自体T细胞、NK细胞或同种异体T细胞、NK细胞制备的表达本发明所述的分子开关调控型CAR多肽的T细胞、NK细胞，例如，所述免疫效应细胞是自人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclearcell， PBMC)分离的T细胞、NK细胞制备的表达本发明所述的分子开关调控型CAR多肽的T细胞、NK细胞。

在一些实施方案中，本发明利用自多个不同供者来源的人PBMC制备的原代P329GCAR-T细胞，并利用P329G突变的抗BCMA人源化抗体，在体外共培养体系中评价了P329GCAR-T细胞针对表达BCMA的肿瘤细胞通过抗体发挥的效应功能，由此，P329G突变的抗 BCMA抗体能够作为“分子开关”调节P329G CAR-T细胞对BCMA阳性肿瘤细胞的识别及杀伤活性，该体外效应功能与直接靶向BCMA阳性肿瘤细胞的传统CAR-T细胞相当，但传统CAR-T细胞的活性不依赖P329G突变抗体。

又在一些实施方案中，本发明在接种BCMA表达阳性的人肿瘤细胞系来源肿瘤的免疫缺陷小鼠体内验证了P329G CAR-T细胞联合P329G突变抗体的抗肿瘤效应，并对抗体给药剂量、间隔等进行了研究。

体内外实验表明，只有在P329G抗体存在情况下，P329G CAR-T细胞活性才能“开启”，产生效应功能，识别和杀伤BCMA阳性肿瘤细胞；通过调节P329G抗体剂量及给药间隔，能够调控P329G CAR-T细胞体内扩增程度及其抗肿瘤活性强度。鉴于BCMA与其配体结合后传递促肿瘤信号，P329G抗体能够通过阻断这一信号发挥抗肿瘤效应，因此，BCMA特异的P329G抗体和P329G CAR-T细胞还能够产生协同抗肿瘤效应。

在一些实施方案中，对于本发明的药物组合，(i)将表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞以1×10⁶个细胞/kg体重-10×10⁶个细胞/kg体重，例如1×10⁶个细胞/kg体重、2×10⁶个细胞/kg 体重、3×10⁶个细胞/kg体重、5×10⁶个细胞/kg体重、7×10⁶个细胞/kg体重、9×10⁶个细胞/kg 体重、10×10⁶个细胞/kg体重的剂量以单次或多次静脉内施用至受试者；和

(ii)将本发明的药物组合中所述的P329G突变抗体以0.1-10mg/kg、优选地0.1mg/kg、 0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、9mg/kg、10mg/kg的剂量单元的形式，优选地胃肠外、更优选地静脉内施用至受试者。

在一些实施方案中，本发明的药物组合中的(i)和(ii)分开、同时或依次施用，例如，第一天施用(ii)，同一天静脉内施用(i)，然后通过监测(ii)的体内浓度和期望的治疗功效终点，确定是否多次施用(ii)；或者

第一天施用(i)，第二天静脉内施用(ii)，然后通过监测(ii)的体内浓度和期望的治疗功效终点，确定是否多次施用(ii)；或者

第一天施用(ii)，第二天静脉内施用(i)，然后通过监测(ii)的体内浓度和期望的治疗功效终点，确定是否多次施用(ii)；

例如，(i)和(ii)各施用一次，然后3-4天后、1周、2周、或3周后再施用(ii)、通过监测 (ii)的体内浓度和期望的治疗功效终点，确定是否多次施用(ii)。

在第四方面，本发明提供了本发明的药物组合的用途，用于在受试者中治疗与BCMA相关的疾病，包括向受试者施用治疗有效量的前述第三方面所定义的药物组合，其中所述与 BCMA相关的疾病是例如表达或过表达BCMA的癌症。

在第五方面，本发明提供了本发明的药物组合在制备用于治疗与BCMA相关的疾病的药物中的用途，所述与BCMA相关的疾病是例如表达或过表达BCMA的癌症。

在第六方面，本发明提供了用于治疗与BCMA相关的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的药物组合。

在第七方面，本发明提供了成套药盒，其包含如前述第三方面所定义的药物组合，优选地所述药盒为药物剂量单元形式。

第八方面，本发明提供了一种药物复合物，其是一种由

(i)选自表达本发明药物组合中所述的分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞(例如，T 细胞、NK细胞)；和

(ii)包含P329G突变的特异性结合BCMA分子的抗体或抗原结合片段(也称为P329G突变抗体)，例如，本发明第一方面的P329G突变抗体

通过CAR多肽的胞外结构域中的人源化抗P329G突变scFv序列与P329G突变抗体的Fc结构域结合而产生的复合物；

例如，其中所述免疫效应细胞是自自体T细胞或同种异体T细胞制备的表达本发明药物组合中所述的分子开关调控型CAR多肽的T细胞，例如，所述免疫效应细胞是自人PBMC分离的T细胞制备的表达本发明所述的分子开关调控型CAR多肽的T细胞；

例如，其中P329G突变抗体是ADI-38497PG Ab和/或ADI-38484PG Ab。

本发明还提供了所述药物复合物的用途，用于在受试者中治疗与BCMA相关的疾病，优选地，所述与BCMA相关的疾病是例如表达或过表达BCMA的癌症。

由此，本发明本发明首先在第一方面，通过体外结合能力、亲和力及Fc效应功能检测，获得了高亲和力的BCMA特异的P329G抗体，该抗体能够同时结合BCMA抗原和P329G CAR分子，发挥桥接效应。其次，本发明在第三方面通过使用构建的P329G CAR结构分子并将该CAR分子制备的P329G CAR-T细胞与BCMA特异的P329G抗体组合，然后与BCMA阳性MM细胞体外共培养构建体外共培养体系，在该系统中，验证了P329G抗体作为“分子开关” 调节P329GCAR-T细胞活性的效应，即，只有在P329G突变抗体存在情况下，P329G CAR-T 细胞才能被激活、增殖、分泌效应细胞因子及产生杀伤效应，并且这些效应呈现P329G抗体剂量依赖性，随着抗体剂量升高，P329G CAR-T细胞识别和杀伤效应增强。而未携带P329G 突变的WT抗体不能激发P329G CAR-T细胞效应功能。

此外，本发明的体外实验表明，可溶性BCMA抗原不会影响与BCMA特异的P329G抗体联用时的P329G CAR-T细胞活性，而可溶性BCMA抗原对传统CAR-T细胞产生显著抑制效应。在高和低表达BCMA的MM细胞皮下以及全身性荷瘤免疫缺陷小鼠模型中，本发明的P329G CAR-T细胞联合P329G抗体产生良好的抗肿瘤效应，抗肿瘤效果至少与传统CAR-T 细胞相当，但P329G CAR-T细胞体内扩增程度显著低于传统CAR-T细胞，提示在产生相当抗肿瘤效应同时P329G CAR-T细胞可能诱导更低的CRS、NT等急性毒副效应；进一步地，通过调节P329G抗体给药剂量和间隔能够调节P329G CAR-T细胞体内扩增程度以及抗肿瘤效应强度，在肿瘤清除后，停止给予P329G抗体，仍然能够维持持续的抗肿瘤效应，这为临床应用中“关闭”P329G CAR-T细胞活性，在维持持续抗肿瘤效应同时恢复正常浆细胞数量及体液免疫降低感染等长期毒副效应奠定了基础。

本发明的毒理实验也表明，P329G CAR-T细胞联合P329G抗体没有产生明显毒性，从而为临床转化奠定了基础。

附图简述

结合以下附图一起阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的优选实施方案。出于说明本发明的目的，图中显示了目前优选的实施方案。然而，应当理解本发明不限于图中所示实施方案的精确安排和手段。

图1A显示了用实施例1-1构建的HuR968B、Blue21CAR转导T细胞后，CD3⁺细胞、CD4⁺、CD8⁺T细胞亚群中CAR的表达。

图1B显示了P329G CAR-T细胞通过P329G抗体介导靶向表达BCMA的靶细胞的作用机制。8种CAR构建体的结构。图中，“SP”表示信号肽(signal peptide)；“TMD”表示跨膜结构域(transmembrane domain)；“ICD”表示胞内结构域(intracellular domain)；“CSD”表示共刺激信号结构域(costimulatory domain)；“SSD”表示刺激信号结构域(stimulatorysignaling domain)。在图中的PG CAR所述构建体中，胞外结构域包含能够特异性结合含有P329G突变的突变Fc结构域的抗原结合部分，且所述抗原结合部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区 (VHL)。

图2A显示了采用表面等离子共振法(SPR)测定抗体亲和力的方法示意图。

图2B显示了采用SPR测定ADI-38497PG抗体与重组人、食蟹猴、小鼠、大鼠和兔BCMA蛋白的代表性亲和力图谱。

图2C显示了P329G BCMA抗体与稳定表达人、食蟹猴及小鼠BCMA的CHO-GS细胞的结合能力。

图2D显示了P329G BCMA抗体与表达BCMA的阳性多发性骨髓瘤细胞系MM.1s、RPMI8226、U266、H929、L363及AMOl的结合活性。

图3A显示了采用表面等离子共振法(SPR)测定抗P329G突变的特异性单链抗体-兔Fc 融合蛋白与ADI-38497P329G突变抗体亲和力的检测示意图。

图3B显示了采用SPR测定ADI-38497PG抗体及野生型抗体与抗PG scFv融合蛋白结合的代表性亲和力图谱。

图3C显示了采用表面等离子共振法(SPR)测定抗体亲合力(Avidity)的方法示意图。

图3D显示了采用SPR测定ADI-38497PG抗体及野生型抗体与抗PG scFv融合蛋白(期中，P329G CAR胞外结构域包含抗PG scFv)的代表性亲合力图谱。

图3E显示了ADI-38497WT抗体和ADI-38497PG抗体与P329G CAR-T细胞的结合能力。

图4A显示了ADI-38497WT抗体和ADI-38497PG抗体介导ADCC杀伤的能力。

图4B显示了ADI-38497WT抗体和ADI-38497PG抗体介导ADCP杀伤的能力。

图4C显示了ADI-38497PG抗体介导靶细胞裂解的能力。

图5A显示了针对H929细胞，含P329G突变的ADI-38497PG抗体特异性介导CAR⁺-T的激活。

图5B显示了不同BCMA抗体(ADI-38497PG抗体、ADI-38484PG抗体、ADI-38497WT 抗体、GSK PG IgG)诱导L363靶细胞对HuR968B CAR-T细胞的激活效应。

图5C显示了HuR968B CAR-T细胞受包被的ADI-38497WT抗体或ADI-38497PG抗体刺激后的增殖情况。

图5D显示了HuR968B CAR-T细胞与H929细胞、RPMI8226细胞共培养，在加入不同浓度BCMA抗体(ADI-38497PG抗体、ADI-38484PG抗体、ADI-38497WT抗体、或作为阳性对照的GSKPG IgG)后的CAR-T细胞分泌效应细胞因子的释放结果。

图5E显示了HuR968B CAR-T细胞与不同肿瘤细胞共培养，在加入不同浓度BCMA抗体(ADI-38497PG抗体、ADI-38484PG抗体、ADI-38497WT抗体、或GSK PG IgG)后CAR-T 细胞分泌效应细胞因子的释放结果。

图5F显示了不同BCMA抗体(ADI-38497PG抗体、ADI-38484PG抗体、ADI-38497WT 抗体、或GSK PG IgG)诱导HuR968B CAR-T细胞对不同BCMA表达水平肿瘤细胞(H929⁺⁺细胞、RPMI8226⁺⁺⁺细胞、AMO1⁺细胞和L363⁺细胞)的杀伤效应。

图5G显示了P329G BCMA抗体诱导CAR-T产生对肿瘤细胞的杀伤效应。

图6显示了不同浓度的游离BCMA蛋白对HuR968B CAR-T和Blue21CAR-T细胞杀伤效应的影响。

图7A和图7B显示了小鼠中ADI-38497PG抗体的药代动力学实验结果。

图8A显示了在皮下接种人H929高表达BCMA肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中不同剂量PG抗体联合PG CAR-T细胞的治疗效应。图中，“cCAR-T”表示传统CAR-T，即，Blue21CAR-T。

图8B显示了在皮下接种人H929高表达BCMA肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中不同剂量PG抗体联合PG CAR-T细胞治疗时，小鼠的体重变化。

图8C显示了在皮下接种人H929高表达BCMA肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中不同剂量PG抗体联合PG CAR-T细胞治疗时，PG CAR-T细胞在小鼠体内的扩增情况。

图9A显示了在皮下接种人L363低表达BCMA肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中不同剂量PG抗体联合PG CAR-T细胞的治疗效应。图中，“cCAR-T”表示传统CAR-T，即，Blue21CAR-T。

图9B显示了在皮下接种人L363低表达BCMA肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中不同剂量PG抗体联合PG CAR-T细胞治疗时，小鼠的体重变化。

图9C显示了在皮下接种人L363低表达BCMA肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中不同剂量PG抗体联合PG CAR-T细胞治疗时，PG CAR-T细胞在小鼠体内的扩增情况。

图10A显示了在皮下接种人H929肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中PG抗体联合不同剂量PG CAR-T细胞的治疗效应。

图10B显示了在皮下接种人H929肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中PG抗体联合不同剂量PG CAR-T细胞治疗时，PG CAR-T细胞在小鼠体内的扩增情况。

图11A显示了实施例11-1的实验中PG抗体的给药频率。

图11B显示了在皮下接种人H929肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中，联用PG CAR-T细胞时PG抗体不同给药时频率的治疗效应。

图11C显示了实施例11-1的实验中，PG CAR-T细胞在小鼠体内扩增情况。

图12A显示了在尾静脉接种人H929-luc肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中不同剂量PG抗体联合PG CAR-T细胞治疗效应的荧光图像。

图12B显示了在尾静脉接种人H929-luc肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中不同剂量PG抗体联合PG CAR-T细胞的治疗效应。

图12C显示了在尾静脉接种人H929-luc肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中不同剂量PG抗体联合PG CAR-T细胞治疗时，小鼠的体重变化。

图13A显示了在皮下接种人H929肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中PG抗体联合PGCAR-T细胞的治疗效应。

图13B显示了在皮下接种人H929肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中PG抗体联合PGCAR-T细胞治疗时，小鼠的体重变化。

图13C和图13D显示了在皮下接种人H929肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中PG抗体联合PG CAR-T细胞治疗时，小鼠血液学和血生化检测结果。

发明详述

除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。

I.定义

为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。

如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项。

在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。

术语“BCMA”和“B细胞成熟抗原”可互换地使用，其包括人BCMA的变体、同种型、物种同源物和与BCMA(例如人BCMA)具有至少一个相同表位的类似物。BCMA蛋白也可包括BCMA的片段，诸如胞外结构域以及胞外结构域的片段，例如保持与本发明任何抗体的结合能力的片段。

如本文所用的术语“BCMA抗体”、“针对BCMA的抗体”、“特异性结合BCMA的抗体”、“特异性靶向BCMA的抗体”、“特异性识别BCMA的抗体”可互换地使用，意指能够与B细胞成熟抗原(BCMA)特异性结合的抗体。

术语“抗体”在本文中以最广意义使用，指包含抗原结合位点的蛋白质，涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体、完整抗体和抗体片段。优选地，本发明的抗体是单结构域抗体或重链抗体。

“抗体片段”或“抗原结合片段”在本文中可互换地使用，指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fab、 Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv、单链Fab、双体抗体(diabody)。

术语“scFv”指一种融合蛋白，其包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段，其中轻链可变区和重链可变区任选地借助柔性短多肽接头连续地连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留衍生它的完整抗体的特异性。除非另外指出，否则如本文所用，scFv可以具有按任何顺序(例如，相对于多肽的N末端和C末端)的 VL可变区和VH可变区，scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。

“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”或“高变区”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作CDR H1、CDR H2和CDR H3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作CDR L1、CDR L2和CDR L3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia (Chothia等人，(1989)Nature 342：877-883，Al-Lazikani等人，“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”.Journal of Molecular Biology，273，927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services， National Institutes of Health(1987))，AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(万维网imgt.cines.fr/)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinitypropagation clustering)的North CDR定义。

除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。

CDR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例的CDR之任一)具有相同的Kabat编号位置而确定。在本发明中，当提及抗体可变区和具体CDR序列(包括重链可变区残基)时，是指根据Kabat编号系统的编号位置。

尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用Kabat，Chothia，AbM和Contact方法中的至少两种，可以确定最小重叠区域，从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定CDR序列其余部分的残基。因此，本发明也考虑本文所给出的任何CDR的变体。例如，在一个CDR的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据Kabat或Chothia或AbM定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。

术语“嵌合抗体”是这样的抗体分子，其中(a)将恒定区或其部分改变、替换或交换，从而抗原结合位点与不同的或改变的类别和/或物种的恒定区或赋予嵌合抗体新性能的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物)等连接；或(b)将可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。例如，鼠抗体可以通过将其恒定区更换为来自人免疫球蛋白的恒定区进行修饰。由于更换为人类恒定区，该嵌合抗体可以保留其在识别抗原方面的特异性，同时如与原始鼠抗体相比，具有在人类中降低的抗原性。

“人源化”抗体是指包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在一些实施方案中，人源化抗体中的所有或基本上所有的CDR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含至少一部分的来源于人抗体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。

“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于下述抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

术语“Fc区”指免疫球蛋白重链的C端区域，包括天然序列Fc区和变异Fc区。人IgG重链Fc区通常定义为自其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段，Fc区的C末端447位的赖氨酸残基(依照EU编号系统)可以存在或者缺失。因而，完整抗体组合物可以包括所有K447残基都被消除的抗体群、无K447残基被消除的抗体群、或者混合了有K447 残基的抗体和没有K447残基的抗体的抗体群。

在某些实施方案中，免疫球蛋白的Fc区包含两个恒定结构域域，即CH2和CH3，在另一些实施方案中，免疫球蛋白的Fc区包含三个恒定结构域，即CH2、CH3和CH4。

IgG与Fcγ受体或C1q的结合依赖于定位在铰链区和CH2结构域中的残基。CH2结构域的两个区域对FcγR和补体C1q结合至关重要，并且在IgG2和IgG4中具有唯一的序列。已显示取代人IgG1和IgG2中233-236位的残基和取代人IgG4中327、330和331位的残基可大幅降低ADCC和CDC活性(Armour等人，Eur.J.Immunol.29(8)，1999，2613-2624；Shields 等人，J.Biol.Chem.276(9)，2001，6591-6604)。

“功能性Fc区”与“有功能Fc区”等类似术语可以互换使用，指具有野生型Fc区的效应功能的Fc区。

“变异Fc区”、“Fc突变体”、“携带突变的Fc区”、“突变Fc区”、“Fc区变体”、 “Fc变体”、“变体Fc区”和“突变的Fc区”等类似术语可以互换使用，指包含至少一处氨基酸修饰而区别于天然序列Fc区/野生型Fc区的Fc区。

在一些实施方案中，变异Fc区包含与天然序列Fc区的氨基酸序列相差一处或多处氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列。在一些实施方案中，变异Fc区与野生型IgG的Fc区相比具有至少一处氨基酸取代，所述至少一处氨基酸取代是将根据EU编号的P329位置处的氨基酸取代为甘氨酸(G)。

“Fc受体”或“FcR”指结合抗体Fc区的分子。在一些实施方案中，FcR是天然人FcR。在一些实施方案中，FcR是结合IgG抗体的受体，即FcγR，包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32) 和FcγRIII(CD16)三种受体，以及这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括 FcγRIIA和FcγRIIB，FcγRIII受体包括FcγRIIIA和FcγRIIIB。

术语“效应功能”指随免疫球蛋白同种型变动的归因于免疫球蛋白Fc区的那些生物学活性。免疫球蛋白效应子功能的例子包括：Fc受体结合作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性 (ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞摄取抗原、Clq结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)、下调细胞表面受体(例如B细胞受体) 和B细胞活化。

术语“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)”是某些细胞毒性效应细胞(例如天然杀伤(NK)细胞)介导对靶细胞和外来宿主细胞杀伤的主要机制之一。在一些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体提供T淋巴细胞的抗体依赖性细胞毒作用、增强NK细胞的抗体依赖性细胞毒作用。本发明的嵌合抗原受体通过与结合肿瘤细胞的抗体(或包含Fc部分的其他抗肿瘤分子)结合，诱发表达该嵌合抗原受体的T细胞活化、持续增殖和发挥经该抗体(或包含Fc部分的其他抗肿瘤分子)介导的对目的癌细胞的特异性细胞毒性。

术语“抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)”指一种细胞反应，其中通过结合靶细胞的抗体与巨噬细胞表面的FcγRIIIa结合，诱导激活巨噬细胞，从而使靶细胞内化和被吞噬体酸化降解。ADCP也可由FcγRIIa和FcγRI介导，但是占比较小。

术语“补体依赖的细胞毒性作用(CDC)”是指在补体存在下靶细胞的裂解。补体系统是由一系列蛋白质组成的先天免疫系统的一部分。补体系统的蛋白质称为“补体”，以缩写符号 C1、C2、C3等表示，其是存在于人或脊椎动物血清、组织液中的一组不耐热的，经活化后具有酶活性的蛋白质。C1q是依赖补体的细胞毒性(CDC)途径的第一成分，其能够结合六个抗体，但与两个IgG结合就足以活化补体级联。经典补体途径的激活由补体系统的第一组分(C1q)与结合相关抗原的抗体(适当的亚类)结合而启动，活化一系列补体级联反应，在靶细胞膜中形成孔洞，从而导致靶细胞死亡。为了评估补体活化，可以执行CDC测定法，通过例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述的方法。

术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。(参见，例如，Kindt等Kuby Immunology，6^thed.， W.H.Freeman and Co.91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结合特异性。

如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗体与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法 (ELISA)、SPR或生物膜层干涉技术或本领域已知的其他常规结合测定法测定。

术语“刺激”指由刺激分子(例如，TCR/CD3复合体)与其相应配体的结合所诱导的初次应答，所述初次应答因而介导信号转导事件，例如但不限于借助TCR/CD3复合体的信号转导。刺激可以介导某些分子改变的表达，如下调TGF-β和/或细胞骨架结构的再组织等。

术语“刺激分子”指由提供初级胞质信号传导序列的T细胞表达的分子，所述的初级胞质信号传导序列在T细胞信号传导途径的至少某个方面以刺激性方式调节TCR复合体的初级活化。在一个实施方案中，初级信号例如通过TCR/CD3复合体与载有肽的MHC分子的结合引发并且导致介导T细胞反应，包括但不限于增殖、活化、分化等。在本发明的具体CAR中，本发明的任一种或多种CAR中的胞内信号结构域包含胞内信号传导序列，例如，CD3ζ的初级信号传导序列。

术语“CD3ζ”定义为GenBan登录号BAG36664.1提供的蛋白质或其等同物，并且“CD3ζ刺激信号结构域”定义为来自CD3ζ链胞质结构域的氨基酸残基，所述氨基酸残基足以在功能上传播T细胞活化必需的初始信号。在一个实施方案中，CD3ζ的胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至残基164或作为其功能直向同源物的来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在一个实施方案中，“CD3ζ刺激信号结构域”是在SEQ ID NO：17 中提供的序列或其变体。

术语“共刺激分子”是指细胞上的与共刺激配体特异性结合从而介导细胞的共刺激反应 (例如但不限于增殖)的相应结合配偶体。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的有助于有效免疫应答的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活 NK细胞受体、OX40、CD40、GITR、4-1BB(即CD137)、CD27和CD28。在一些实施方案中， “共刺激分子”是4-1BB(即CD137)。共刺激信号结构域是指共刺激分子的胞内部分。

术语“4-1BB”指TNFR超家族成员，所述成员具有作为GenBank登录号AAA62478.2提供的氨基酸序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基；并且“4-1BB共刺激信号结构域”定义为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸残基214-255或来自非人类物种 (例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在一个实施方案中，“4-1BB共刺激结构域”是作为SEQ ID NO：16提供的序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。

术语“信号传导途径”指在从细胞一个部分传播信号至细胞的另一个部分中发挥作用的多种信号传导分子之间的生物化学关系。

术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子、白介素(IL)，诸如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3， IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12，IL-15；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或 TNF-β；及其它多肽因子，包括γ-干扰素。

“分离的”抗体是指已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中，将本发明的抗体纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。

“分离的”核酸是指这样的核酸分子，其已经与其天然环境的组分分离。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。“分离的编码本发明抗体的核酸”是指一个或多个核酸分子，其编码本发明抗体的链或其片段，包括在单一载体或分开的载体中的这样的核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的这样的核酸分子。

如下进行序列之间序列同一性的计算。

为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％和甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％的参考序列长度。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。

可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol. 48：444-453)算法(在http：//www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(在http：//www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80 和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4 和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵。

还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4)，利用已经并入ALIGN 程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法，((1989)CABIOS，4：11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。

额外地或备选地，可以进一步使用本文所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。

术语“氨基酸变化”和“氨基酸修饰”可互换地使用，是指氨基酸的添加、缺失、取代和其他修饰。可以进行氨基酸的添加、缺失、取代和其他修饰的任意组合，条件是最终的多肽序列具有所需的特性。在一些实施方案中，对抗体的氨基酸取代导致抗体与Fc受体的结合降低。为了改变例如Fc区结合特征的目的，特别优选非保守氨基酸取代，即用具有不同结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸。氨基酸取代包括用非天然存在的氨基酸或二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如、4-羟基脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟基赖氨酸)的取代。可以使用本领域公知的遗传或化学方法产生氨基酸变化。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等。通过除基因工程化之外的方法(如化学修饰) 改变氨基酸侧链基团的方法可能是有用的。本文可使用多种名称来表示相同的氨基酸变化。例如，从Fc结构域的329位的脯氨酸到甘氨酸的取代可以表示为329G、G329、G₃₂₉、P329G Pro329Gly、或简称为“PG”。

术语“保守序列修饰”、“保守序列变化”指未显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰或变化。这类种保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，如位点定向诱变和PCR介导的诱变向本发明的抗体或抗体片段引入修饰。保守性取代是氨基酸残基由具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸取代。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β-侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因而，可以将本发明CAR内部的一个或多个氨基酸残基替换为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基，并且可以使用本文所述的功能测定法测试改变的CAR。

术语“自体的”指这样的任何物质，所述物质从稍后将向个体再次引入所述物质的相同个体衍生。

术语“同种异体的”指这样的任何物质，所述物质从与引入所述物质的个体相同的物种的不同动物衍生。当一个或多个基因座处的基因不相同时，两位或更多位个体据称彼此是同种异体的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体物质可以在遗传上足够地不相似以发生抗原性相互作用。

术语“异种的”指从不同物种的动物衍生的移植物。

如本文所用的术语“单采血液成分术”指本领域认可的体外方法，借助所述方法，供体或患者的血液从供体或患者取出并且穿过这样的装置，所述装置分离选择的特定组分并将剩余部分返回供体或患者的循环，例如，通过再输血。因此，在“单采样品”的语境中，指使用单采血液成分术获得的样品。

术语“免疫效应细胞”指参与免疫应答，例如参与促进免疫效应反应的细胞。免疫效应细胞的例子包括T细胞，例如，α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤 T(NKT)细胞、肥大细胞、和髓细胞衍生的吞噬细胞。

“免疫效应功能”、“免疫效应应答”或“免疫效应反应”指例如免疫效应细胞的增强或促进免疫攻击靶细胞的功能或应答。例如，免疫效应功能或应答指促进杀伤靶细胞或抑制靶细胞生长或增殖的T细胞或NK细胞特性。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应功能或应答的例子。

术语“效应功能”指细胞的特化功能。T细胞的效应功能例如可以是溶细胞活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。

术语“T细胞激活”是指T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞应答，选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒活性和活化标志物的表达。本发明的嵌合抗原受体能够诱导T细胞激活。用于测量T细胞激活的合适测定法在实施例中描述，并是本领域中已知的。

术语“慢病毒”指逆转录病毒科(Retroviridae)的一个属。慢病毒在逆转录病毒当中的独特之处在于能够感染非分裂性细胞；它们可以递送显著量的遗传信息至宿主细胞，从而它们是基因递送载体的最高效方法之一。HIV、SIV和FIV均是慢病毒的例子。

术语“慢病毒载体”指从慢病毒基因组的至少一部分衍生的载体，尤其包括如Milone等人， Mol.Ther.17(8)：1453-1464(2009)中提供的自我失活慢病毒载体。可以在临床使用的慢病毒载体的其他例子例如包括但不限于来自Oxford BioMedica的

基因递送技术、来自Lentigen的LENTIMAX^TM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可获得的并且是本领域技术人员已知的。

术语“与BCMA相关的疾病”是指由BCMA增加的表达或活性引起、加重或以其它方式与其相关的任何病症。

术语“个体”或“受试者”可互换地使用，包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，牛、羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。特别地，个体或受试者是人。

术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖实体瘤和液体肿瘤。

术语“癌症”和“癌性”是指哺乳动物中细胞生长不受调节的生理疾患。

术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。

“肿瘤免疫逃逸”指肿瘤逃避免疫识别和清除的过程。如此，作为治疗概念，肿瘤免疫在此类逃避减弱时得到“治疗”，并且肿瘤被免疫系统识别并攻击。肿瘤识别的例子包括肿瘤结合，肿瘤收缩和肿瘤清除。

术语“半数有效浓度(EC₅₀)”是指在特定的暴露时间后诱导在基线和最大值之间的50％的应答的药物、抗体或毒剂的浓度。

术语“荧光激活细胞分选”或“FACS”是指专门类型的流式细胞术。它提供了根据每个细胞的特定光散射和荧光特征，将生物细胞的异质混合物以每次一个细胞分拣到两个或更多个容器中的方法(FlowMetric.“Sorting Out Fluorescence Activated CellSorting”.2017-11-09)。用于进行FACS的仪器是本领域技术人员已知的并且对于公众是可商购获得的。这种仪器的实例包括Becton Dickinson(Foster City，CA)的FACS StarPlus、FACScan和FACSort仪器、来自Coulter Epics Division(Hialeah，FL)的Epics C和来自Cytomation(Colorado Springs， Colorado)的MoFlo。

术语“可药用辅料”指与活性物质一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂、缓冲剂或稳定剂等。

用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体分子用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。

术语“有效量”指本发明的抗体或组合物的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如哺乳动物的物种；体重、年龄和一般健康状况；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。

“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。抗体或抗体片段或其组合物的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和抗体或抗体部分在个体中激发所需反应的能力而变动。治疗有效量也是这样的一个量，其中抗体或抗体片段或其组合物的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤生长率、肿瘤体积等)至少约20％、更优选地至少约40％、甚至更优选地至少约50％、60％或70％和仍更优选地至少约80％或90％。可以在预示人肿瘤中的功效的动物模型系统中评价化合物抑制可度量参数(例如，癌症)的能力。

术语“药物组合”是指非固定组合产品或固定组合产品，包括但不限于药盒、药物组合物。术语“非固定组合”意指活性成分(例如，(i)P329G CAR-T细胞、以及(ii)针对BCMA的P329G 突变抗体)以分开的实体被同时、无特定时间限制或以相同或不同的时间间隔、依次地施用于受试者，其中这类施用在受试者体内提供有效治疗。术语“固定组合”是指本发明的针对 BCMA的P329G突变抗体和P329G CAR-T细胞的组合各自以特定的单一剂量的形式同时施用于患者。术语“非固定组合”意指本发明的针对BCMA的329G突变抗体和P329GCAR-T 细胞的组合作为分开的实体同时、并行或依次施用于患者，没有特定的剂量和时间限制，其中这样的施用提供了患者体内本发明药物组合的治疗有效水平。在一个优选的实施方案中，药物组合是非固定组合。

术语“组合疗法”或“联合疗法”是指施用两种或更多种组分以治疗如本公开所述的癌症。这种施用包括以基本上同时的方式共同施用这些组分。或者，这种施用包括对于各个活性成分在多种或在分开的容器(例如，胶囊、粉末和液体)中的共同施用或分开施用或依次施用。粉末和/或液体可以在施用前重构或稀释至所需剂量。在一些实施方案中，施用还包括以大致相同的时间，或在不同的时间以顺序的方式，使用本发明的针对BCMA的P329G突变抗体和P329G CAR-T细胞。在任一情况下，治疗方案将提供药物组合在治疗本文所述的病症或病状中的有益作用。

在本文中当谈及核酸时使用的术语“载体(vector)”是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其有效相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为 “表达载体”。

术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从其衍生的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸内容上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是可以用来产生本发明抗体分子的任何类型的细胞系统，包括真核细胞，例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞；和原核细胞，例如，大肠杆菌细胞。宿主细胞包括培养的细胞，也包括转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。

“受试者/患者样品”指从患者或受试者得到的细胞、组织或体液的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。肿瘤样品的例子在本文中包括但不限于肿瘤活检、细针吸出物、支气管灌洗液、胸膜液(胸水)、痰液、尿液、手术标本、循环中的肿瘤细胞、血清、血浆、循环中的血浆蛋白质、腹水、衍生自肿瘤或展现出肿瘤样特性的原代细胞培养物或细胞系，以及保存的肿瘤样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。

在谈及疾病时，术语“治疗”是指减轻所述疾病(即，减缓或阻止或减少所述疾病或其至少一个临床症状的发展)、防止或延迟所述疾病的发作或发展或进展。

11.本发明的分子开关调控型嵌合抗原受体(CAR)

本发明涉及能够特异性结合针对BCMA分子的抗体的突变Fc结构域的嵌合抗原受体多肽。具体地，本发明的嵌合抗原受体包含人源化抗P329G突变scFv序列，且所述scFv序列能够特异性结合包含P329G突变的抗体Fc结构域，但不能特异性结合未突变的亲本抗体Fc 结构域。与未突变的亲本抗体Fc结构域对Fc受体的结合相比较，包含P329G突变的抗体Fc 结构域对Fc受体(例如，Fcγ受体)的结合降低。

本发明的重组CAR构建体包含编码CAR的序列，其中CAR包含人源化抗P329G突变scFv序列，所述scFv序列特异性结合P329G突变的抗体Fc结构域。

在一个实施方案中，本发明的CAR构建体中的scFv序列包含如下序列：

(i)重链可变区，其包含根据Kabat编号的

(ii)轻链可变区，其包含根据Kabat编号的 (d)氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQID NO：22)所示的轻链互补决定区(CDR L)1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；

其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代。

进一步地，scFv可以在N端连接有信号肽序列，例如，SEQ ID NO：11所示的信号肽序列，并且scFv可以在C端连接有如SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：18中提供的任选铰链区/间隔区序列、如SEQ ID NO：15中提供的跨膜区、如SEQ ID NO：16的共刺激信号结构域和包含SEQ ID NO：17或其变体的胞内刺激信号结构域，例如，其中各个结构域彼此邻接并处于相同的可读框以形成单个融合蛋白。

在一些实施方案中，scFv结构域包含(i)重链可变区，其包含SEQ ID NO：12的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，和(ii)轻链可变区，其包含SEQ ID NO：17的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；

在一些实施方案中，scFv结构域包含(i)SEQ ID NO：12所示的重链可变区和(ii)SEQ ID NO：13所示的轻链可变区。在一个实施方案中，scFv结构域还包含(Gly4-Ser)n接头，其中n 是1、2、3、4、5或6、优选地3或4。scFv的轻链可变区和重链可变区可以例如处于以下任何取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。

在一些实施方案中，本发明的示例性CAR构建体包含信号肽序列、人源化抗P329G突变 scFv序列、铰链区/间隔区、跨膜结构域、胞内共刺激信号结构域和胞内刺激信号结构域。

在一个实施方案中，本发明将全长CAR多肽的氨基酸序列作为SEQ ID NO：1提供，如序列表中所示。

在一些实施方案中，本发明提供了重组核酸构建体，其包含编码本发明的CAR的核酸分子，例如，其包含编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的核酸分子。可以使用本领域公知的重组方法获得编码本发明的CAR构建体。备选地，可以合成地产生目的核酸，而非通过基因重组方法产生目的核酸。

本发明包括表达可以直接转导入细胞中的CAR的逆转录病毒载体构建体和慢病毒载体构建体。

在一些实施方案中，将本发明CAR构建体的核酸序列克隆至慢病毒载体中以在单个编码框中产生全长CAR构建体，并用EF1α启动子用于表达。

本领域普通技术人员将理解，本发明的CAR多肽还可以进行修饰，从而在氨基酸序列上变动，但是在所需的活性方面不变动。例如，可以对CAR多肽进行导致“非必需”氨基酸残基处氨基酸置换的额外核苷酸置换。例如，可以将分子中的非必需氨基酸残基替换为来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基。在另一个实施方案中，可以将一个氨基酸片段替换为结构上相似的片段，所述的片段在侧链家族成员的顺序和组成方面中不同，例如，可以进行保守性置换，其中将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基。

本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，所述侧链包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分枝侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

在一些实施方案中，本发明构思了产生功能上等同的CAR多肽分子，例如，可以修饰 CAR中包含的人源化抗P329G突变scFv序列的VH或VL，获得与SEQ ID NO：12具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH和与SEQ ID NO： 13具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL。

本发明的CAR中包含的跨膜结构域是锚定的跨膜结构域，其是能够整合在细胞膜中的多肽链的组成部分。跨膜结构域可以与其他胞外和/或胞内多肽结构域融合，其中这些胞外和/ 或胞内多肽结构域也将被限制在细胞膜上。在本发明的嵌合抗原受体(CAR)多肽中，跨膜结构域赋予本发明的CAR多肽的膜附着。本发明的CAR多肽包含至少一个跨膜结构域，其可以衍生自天然来源或重组来源，包含优势疏水的残基如亮氨酸和缬氨酸。在来源是天然的情况下，结构域可以衍生自膜结合蛋白或跨膜蛋白例如CD28、CD8(例如，CD8α，CD8β)的跨膜结构域。在一个实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的CAR中的跨膜结构域借助铰链区/间隔区与CAR的胞外区 (即，人源化抗P329G突变scFv序列)连接。例如，在一个实施方案中，铰链可以是CD8α铰链区、CD28的铰链区。在一些实施方案中，铰链区或间隔区序列包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列。

另外，甘氨酸-丝氨酸双联体也提供特别合适的接头作为铰链区/间隔区。例如，在一个实施方案中，接头包含GGGGS的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)。

本发明的CAR中包含的胞质结构域包含胞内信号结构域。胞内信号结构域能够活化引入了本发明CAR的免疫细胞的至少一个效应功能。

用于本发明CAR中的胞内信号结构域的例子包括协同发挥作用以在胞外结构域结合 P329G突变的抗体Fc结构域后启动信号转导的T细胞受体(TCR)和共受体的胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能性能力的任何重组序列。

考虑到仅通过TCR生成的信号尚不足以完全活化T细胞，因此本发明的CAR还设计了能够产生共刺激信号的共刺激信号结构域(CSD)。T细胞的活化由两类不同的胞质信号传导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的那些序列(初级胞内信号结构域)和以抗原非依赖性方式发挥作用以提供共刺激信号的那些序列(次级胞质结构域，例如，共刺激结构域)。

在一个实施方案中，本发明的CAR包含初级胞内信号结构域，例如，CD3ζ的初级信号结构域，例如，SEQ ID NO：17所示的CD3ζ信号传导结构域。

本发明CAR中的胞内信号结构域还包次级信号结构域(即，共刺激信号结构域)。共刺激信号结构域指包含共刺激分子的胞内结构域的CAR部分。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外淋巴细胞对抗原作出有效反应所需要的细胞表面分子。在一些实施方案中，共刺激分子包括但不限于CD28、4-1BB(CD137)，其引起的共刺激作用在体外增强人CART细胞的增殖、效应功能和存活并且在体内增进人T细胞的抗肿瘤活性。

在本发明CAR的胞内信号传导序列可以彼此按随机顺序或按指定的顺序连接。任选地，短寡肽接头或多肽接头可以在胞内信号传导序列之间形成键接。在一个实施方案中，甘氨酸- 丝氨酸双联体可以用作合适的接头。在一个实施方案中，单个氨基酸，例如，丙氨酸、甘氨酸，可以用作合适的接头。

在一个实施方案中，本发明CAR的胞内信号结构域设计成包含4-1BB的共刺激信号结构域和CD3ζ的刺激信号结构域。

III.编码本发明的CAR的核酸分子、载体和表达本发明CAR的细胞

本发明提供了编码本文所述的CAR构建体的核酸分子。在一个实施方案中，核酸分子作为DNA构建体提供。

本发明还提供了插入有本发明CAR构建体的载体。通过将编码CAR多肽的核酸有效连接至启动子并将构建体并入表达载体中，实现编码CAR的天然或合成的核酸的表达。载体可以适合在真核生物中复制和整合。常见的克隆载体含有用于调节所需核酸序列的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。

已经开发了众多基于病毒的系统用于转移基因至哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒提供了用于基因递送系统的便利平台。可以使用本领域已知的技术，将选择的基因插入载体并且包装在逆转录病毒粒子中。随后可以分离重组病毒并将其在体内或离体递送至受试者的细胞。众多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。

衍生自逆转录病毒(如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合和其在子代细胞中增殖。慢病毒载体具有胜过衍生自癌-逆转录病毒(如鼠白血病病毒)的载体的额外优点，因为它们可以转导非增殖性细胞，如肝细胞。它们还具有额外的低免疫原性优点。逆转录病毒载体也可以例如是γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以例如包含启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如，两个)长末端重复序列(LTR)和目的转基因，例如，编码CAR的基因。γ逆转录病毒载体可以缺少病毒结构性基因如gag、pol和env。

能够在哺乳动物T细胞中表达CAR转基因的启动子的例子是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合体的α亚基表达，所述α亚基负责酶促递送氨酰基tRNA至核糖体。已经在哺乳动物表达质粒中广泛使用了EF1a启动子并且已经显示有效驱动从克隆至慢病毒载体中的转基因表达CAR。参见，例如，Milone等人，Mol.Ther.17(8)：1453-1464(2009)。

启动子的另一个例子是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这个启动子序列是能够驱动与之有效连接的任何多核苷酸序列高水平表达的组成型强启动子序列。但是，也可以使用其他组成型启动子序列，所述其他组成型启动子序列包括但不限于猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、 MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、埃巴病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1α启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。另外，本发明不应当限于使用组成型启动子。还构思了诱导型启动子作为本发明的部分。

在一些实施方案中，本发明提供了在哺乳动物免疫效应细胞(例如哺乳动物T细胞或哺乳动物NK细胞)中表达本发明的CAR构建体的方法和由此产生的免疫效应细胞。

从受试者获得细胞来源(例如，免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞)。术语“受试者” 意在包括可以激发免疫应答的活生物(例如，哺乳动物)。可以从众多来源获得T细胞，包括外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。

可以使用本领域技术人员已知的任何技术(如Ficoll^TM分离法)，从采集自受试者的血液成分中获得T细胞。在一个优选的方面，通过单采血液成分术获得来自个体循环血液的细胞。单采产物一般含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核的白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以洗涤通过单采血液成分术采集的细胞，以除去血浆级分并且以在用于后续加工步骤的适宜缓冲液或培养基中放置细胞。在本发明的一个方面，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。

可以通过正向或负向选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、 CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，在一个实施方案中，通过与抗CD3/抗CD28缀合的珠(如

M-450CD3/CD28T)温育一段足够正向选择所需T细胞的时间，分离T细胞。在一些实施方案中，该时间段是约30分钟至36小时之间或更长时间。较长的温育时间可以用来在存在少量T细胞的任何情况下分离T细胞，如用于从肿瘤组织或从免疫受损个体分离肿瘤浸润型淋巴细胞(TIL)。另外，使用较长的温育时间可以增加捕获CD8+T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长该时间，允许T细胞与CD3/CD28珠结合和/或通过增加或减少珠对T细胞的比率，可以在培养伊始或在培养过程期间的其他时间点偏好地选择T细胞亚群。

可以用抗体的组合，通过负选择过程完成T细胞群体的富集，其中所述抗体针对负向选择的细胞独有的表面标志物。一种方法是借助负向磁力免疫粘附法或流式细胞术分选和/或选择细胞，所述负向磁力免疫粘附法或流式细胞术使用针对负向选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。

在一些实施方案中，免疫效应细胞可以是同种异体免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞。例如，细胞可以是同种异体T细胞，例如，缺少功能性T细胞受体(TCR)和/或人白细胞抗原(HLA)(例如，HLA I类和/或HLA II类)表达的同种异体T细胞。

缺少功能性TCR的T细胞可以例如经工程化，从而它在其表面上不表达任何功能性TCR；经工程化，从而它不表达构成功能性TCR的一个或多个亚基(例如，经工程化，从而它不表达或显示出减少表达的TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、TCRε和/或TCRζ)；或经工程化，从而它在其表面上产生非常少的功能性TCR。

本文所述的T细胞例如可以如此工程化，从而它不在其表面上表达功能性HLA。例如，本文所述的T细胞可以如此工程化，从而HLA(例如，HLA I类和/或HLA II类)的细胞表面表达下调。在一些方面，可以通过减少或消除β-2微球蛋白(B2M)表达实现HLA的下调。

在一些实施方案中，T细胞可以缺少功能性TCR和功能性HLA，例如，HLA I类和/或HLA II类。

在一个实施方案中，对编码本发明所述的CAR的核酸转导的细胞进行增殖，例如，将细胞在培养下增殖2小时至约14天。

对经体外增殖后获得的表达CAR的免疫效应细胞可以如实施例中所述进行效应功能的检测。

IV.特异性结合BCMA分子的抗体和其包含突变Fc结构域的抗体

本发明提供了以高靶特异性和高亲和性结合BCMA的抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：

其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或保守氨基酸取代。

在一些实施方案中，本发明的结合BCMA分子的抗体结合哺乳动物BCMA，例如人、食蟹猴、小鼠、大鼠和兔BCMA。

在一些实施方案中，本发明的结合BCMA分子的抗体具有以下一个或多个特性：

(1)特异性结合BCMA；

(2)结合人BCMA并且与食蟹猴、小鼠、大鼠和兔BCMA交叉反应；

(3)在不包含突变Fc结构域，例如，在具有未突变的亲本抗体Fc结构域的情形，能够通过抗体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)杀死BCMA-阳性癌症细胞。

在一些实施方案中，本发明的结合BCMA分子的抗体包含特异性结合BCMA的重链可变区和轻链可变区，其中：

(b)重链可变区包含SEQ ID NO：9的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：10的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；

其中所述至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列中的氨基酸变化优选氨基酸取代，更优选氨基酸保守取代，优选地，所述氨基酸变化不发生在CDR区中。

在一些实施方案中，本发明的结合BCMA分子的抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体；优选地，其是IgG1或IgG4抗体；更优选地，其是IgG1抗体，例如，人IgG1抗体。

在一些实施方案中，本文中所提供的结合BCMA分子的抗体包含突变Fc结构域，其中根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为甘氨酸(G)，与未突变的亲本抗体Fc结构域的Fcγ 受体结合相比，突变Fc结构域的Fcγ受体结合降低；例如，所述突变Fc结构域是IgG1、IgG2、 IgG3或IgG4抗体的突变Fc结构域，优选地，所述突变Fc结构域是IgG1或IgG4抗体的突变Fc结构域；更优选地，所述突变Fc结构域是IgG1抗体的突变Fc结构域，例如，所述突变Fc结构域是人IgG1抗体的突变Fc结构域。

包含P329G突变Fc结构域的结合BCMA分子的抗体不能通过与Fcγ受体结合来发挥抗体依赖性细胞毒性，也不能发挥抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)。

在一些实施方案中，本发明提供了编码以上任何结合BCMA分子的抗体或其片段或其任一条链的核酸。在一个实施方案中，提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。在一个实施方案中，提供包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如 CHO细胞或293细胞)或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是原核的。

例如，本发明的核酸包含编码本发明的结合BCMA分子的抗体的核酸。在一些实施方案中，提供包含所述核酸的一个或多个载体。在一个实施方案中，载体是表达载体，例如真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。在一个实施方案中，载体是pcDNA3.4表达载体。

一旦已经制备了用于表达的表达载体或DNA序列，则可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的，例如，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因枪、基于脂质的转染或其他常规技术。在原生质体融合的情况下，将细胞在培养基中培育并且筛选适宜的活性。用于培养所产生的转染细胞和用于回收产生的抗体分子的方法和条件是本领域技术人员已知的并且可以基于本说明书和现有技术已知的方法，根据使用的特定表达载体和哺乳动物宿主细胞变动或优化。

另外，可以通过引入允许选择已转染的宿主细胞的一个或多个标记物，选出已经稳定将 DNA掺入至其染色体中的细胞。标记物可以例如向营养缺陷型宿主提供原养型、杀生物抗性 (例如，抗生素)或重金属(如铜)抗性等。可选择标记基因可以与待表达的DNA序列直接连接或通过共转化引入相同的细胞中。也可能需要额外元件以便最佳合成mRNA。这些元件可以包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。

在一个实施方案中，提供了包含本发明多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了包含本发明表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体的其它细胞。合适的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌。宿主细胞还可以是真核微生物如丝状真菌或酵母，或各种真核细胞，例如昆虫细胞等。也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(HEK293或293F 细胞)、293细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝脏细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝脏细胞(HepG2)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、CHO-S细胞、NSO细胞、骨髓瘤细胞系如Y0、NS0、P3X63和Sp2/0等。适于产生蛋白质的哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki 和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编著，HumanaPress，Totowa， NJ)，第255-268页(2003)。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是CHO细胞或HEK293 细胞。

在一个实施方案中，本发明提供了制备结合BCMA分子的抗体(包括P329G突变抗体) 的方法，其中所述方法包括在适于表达编码所述结合BCMA分子的抗体(包括P329G突变抗体)的核酸的条件下培养包含编码所述结合BCMA分子的抗体(包括P329G突变抗体) 的核酸或包含所述核酸的表达载体的宿主细胞，以及任选地分离所述结合BCMA分子的抗体 (包括P329G突变抗体)。在某个实施方案中，所述方法还包括从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收结合BCMA分子的抗体(包括P329G突变抗体)。

如本文所述制备的本发明的结合BCMA分子的抗体(包括P329G突变抗体)可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且这些对本领域技术人员是显而易见的。可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的结合BCMA分子的抗体(包括P329G突变抗体)的纯度，所述熟知分析方法包括大小排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。

可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的结合BCMA分子的抗体(包括P329G突变抗体)鉴定、筛选或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。一方面，对本发明的结合BCMA分子的抗体(包括P329G突变抗体)测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如FACS、ELISA或Western印迹等来进行。可使用本领域已知方法来测定对BCMA的结合，本文中公开了例示性方法。在一些实施方案中，使用FACS测定本发明的结合BCMA分子的抗体(包括P329G突变抗体)对细胞表面BCMA(例如人BCMA) 的结合。

本发明还提供了用于鉴定具有生物学活性的结合BCMA分子的抗体(包括P329G 突变抗体)的测定法。生物学活性可以包括例如ADCC作用、CDC作用等。

供任何上述体外测定法使用的细胞包括天然表达BCMA或经改造而表达BCMA细胞系。所述经改造而表达BCMA细胞系是正常情况下不表达BCMA的、将编码BCMA 的DNA转染入细胞之后表达BCMA的细胞系。

V.本发明的药物组合

对于优化CAR疗法的安全性和疗效而言，本发明的分子开关调控型嵌合抗原受体是可以控制CAR活性的可调控型CAR。本发明使用将Pro329Gly(抗体Fc段根据EU编号的第329位脯氨酸突变为甘氨酸，简写为P329G)突变抗体作为本发明CAR治疗中的安全开关。在所述P329G 突变抗体不存在时，本发明的CAR活性关闭；在所述P329G突变抗体存在时，本发明的CAR 活性开启；由此，本发明的CAR分子活性的开启和关闭受到P329G突变抗体的调控。

在一些实施方案中，本发明提供了药物组合，其包含(i)表达本发明的分子开关调控型CAR 多肽的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)；和(ii)特异性结合BCMA分子的P329G突变抗体。例如，所述免疫效应细胞是自自体T细胞或同种异体T细胞制备的表达本发明的分子开关调控型CAR多肽的T细胞，例如，所述免疫效应细胞是自人PBMC分离的T细胞制备的表达本发明的分子开关调控型CAR多肽的T细胞。在一些实施方案中，所述P329G突变抗体是ADI-38497PG Ab和/或ADI-38484PG Ab。

在一些实施方案中，本发明提供了药物组合，其包含(i)编码本发明的分子开关调控型CAR 多肽的核酸分子或包含所述核酸组分的载体；和(ii)特异性结合BCMA分子的P329G突变抗体。

在一些实施方案中，本发明的药物组合任选地进一步包含合适制剂的可药用辅料。例如，所述药物组合中的(ii)可根据常规方法制剂化(例如Remington’sPharmaceutical Science，最新版，Mark Publishing Company，Easton，U.S.A)。

在一些实施方案中，本发明的药物组合用于治疗与BCMA相关的疾病，例如表达或过表达BCMA的癌症。

VI.本发明的药物组合的用途和使用本发明的药物组合的治疗方法

本发明提供了前述本发明的药物组合，其用于在受试者中治疗与BCMA相关的疾病。

在一个实施方案中，本发明的药物组合用于在受试者中治疗表达或过表达BCMA的癌症，并且能够减轻癌症的至少一种症状或指征的严重性或抑制癌细胞生长。

本发明提供了在受试者中治疗与BCMA相关的疾病(例如，表达或过表达BCMA的癌症)的方法，其包括向有需要的个体施用治疗有效量的本发明的药物组合。

本发明提供了前述本发明的药物组合在制备用于治疗与BCMA相关的疾病(例如，表达或过表达BCMA的癌症)的药物中的用途。

本发明的药物组合也可以施用于已经用一种或多种先前疗法治疗癌症但随后复发或转移的个体。

在一些实施方案中，本发明的药物组合中的(i)表达本发明的分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)和(ii)特异性结合BCMA分子的P329G突变抗体用于胃肠外、经皮、腔内、动脉内、静脉内、鞘内施用，或直接注入组织或肿瘤中。在一些实施方案中，本发明的药物组合中的(ii)特异性结合BCMA分子的P329G突变抗体在(i)表达本发明的分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)之前、同时或之后施用。

在一些实施方案中，本发明的药物组合中的(i)表达本发明的分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞是自自体T细胞或同种异体T细胞制备的表达本发明CAR多肽的T细胞；本发明的药物组合中的(ii)特异性结合BCMA分子的P329G突变抗体是任何特异性结合BCMA 分子的抗体，其包含P329G突变。优选地，所述P329G突变抗体是ADI-38497PG Ab和/或ADI-38484PG Ab。

当本发明的药物组合中的组分(i)是表达本发明的分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)时，本发明不限制本发明的药物组合中的组分(i)和组分(ii)向受试者施用的顺序，也不限制向受试者施用本发明的药物组合中的组分(i)和组分(ii)之间的时间安排。因此，本发明的药物组合中的(i)和(ii)可以分开、同时或依次施用。当两种组分没有同时施用时，这两种组分的施用可以间隔1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、 48小时或72小时，或间隔本领域技术人员容易确定的任何合适的时间差。例如，第一天静脉内施用(i)，第二天施用(ii)，然后通过监测(ii)的体内浓度和期望的治疗功效终点，确定是否多次施用(ii)；或者第一天施用(ii)，第二天静脉内施用(i)，然后通过监测(ii)的体内浓度和期望的治疗功效终点，确定是否多次施用(ii)；或者同一天间隔1小时、2小时、4小时、6小时、 12小时分别施用(i)和(ii)。

在一些实施方案中，本发明的药物组合中的组分(i)是表达本发明的分子开关调控型CAR 多肽的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)时，还包括将所述组分(i)和组分(ii)在施用于受试者之前预先一起孵育的情况。因此，可以在施用前预先孵育这两种组分1分钟、5分钟、 10分钟、15分钟、30分钟、45分钟或1小时，或本领域技术人员容易确定的任何合适时间。

本发明的药物组合可以以合适的剂量施用于受试者。剂量方案将由主治医生和临床因素决定。如医学领域中公知的，用于任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体重、身体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况、和待并行施用的其他药物。

在一些实施方案中，本发明的药物组合中的组分(i)是表达本发明的分子开关调控型CAR 多肽的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)时，将组分(i)以1×10⁶个细胞/kg体重-10×10⁶个细胞/kg体重，例如1×10⁶个细胞/kg体重、2×10⁶个细胞/kg体重、3×10⁶个细胞/kg体重、 5×10⁶个细胞/kg体重、7×10⁶个细胞/kg体重、9×10⁶个细胞/kg体重、10×10⁶个细胞/kg体重的剂量以单次或多次静脉内施用至受试者；并将组分(ii)以0.1-10mg/kg、优选地0.1mg/kg、 0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、9mg/kg、10mg/kg的剂量单元的形式，优选地胃肠外、更优选地静脉内施用至受试者。

在一些实施方案中，向患有癌症的个体施用本发明的药物组合导致肿瘤的完全消失。在一些实施方案中，向患有癌症的个体施用本发明的药物组合导致肿瘤细胞或肿瘤大小减少至少85％或更多。可以通过本领域已知的任何方法测量肿瘤的减少，例如X-线、正电子发射断层扫描(PET)、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、细胞学、组织学或分子遗传分析。

在一些实施方案中，本发明的药物组合可以降低CAR-T细胞存在的“在靶/脱肿瘤(On-target/off tumor)”毒性。

VII.本发明的药盒

本发明提供了一种成套药盒，其包含本发明的药物组合，优选地所述药盒为药物剂量单元形式。由此可以依据给药方案或药物施用间隔提供剂量单元。

在一个实施方案中，本发明的成套药盒在同一包装内包含：

(i)选自表达本发明的分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)、编码本发明的分子开关调控型CAR多肽的核酸分子、包含所述核酸的载体、和它们的任意组合；

(ii)特异性结合BCMA分子的P329G突变抗体。

本发明所述的各个实施方案/技术方案以及各个实施方案/技术方案中的特征应当被理解为可以任意进行相互组合，这些相互组合得到的各个方案均包括在本发明的范围内，就如同在本文中具体地且逐一地列出了这些相互组合而得到的方案一样，除非上下文清楚地显示并非如此。

描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成对本发明的保护范围的限制。

实施例

实施例1、CAR基因合成、病毒表达载体的构建、P329G CAR-T细胞制备及CAR表达检测

(1-1)CAR基因合成和病毒表达载体的构建

构建了P329G CAR分子(SEQ ID NO：1)，也称为HuR968B CAR，由SEQ ID NO：11所示的信号肽(SP)、识别P329G抗体的特异单链抗体片段(VH-接头-VL，具有SEQ ID NO：12 所示的VH、SEQ ID NO：13所示的VL)、SEQ ID NO：14所示的G4S铰链区、SEQ ID NO：15所示的CD8跨膜结构域(CD8TM)、SEQ ID NO：16所示的41BB共刺激结构域(41BB-CSD)以及SEQ IDNO：17所示的CD3ζ分子胞内激活结构域(CD3ζSSD)融合而成。

另外，构建了直接靶向BCMA的Blue21CAR(SEQ ID NO：8)，用作对照。Blue21CAR从N端到C端含有SEQ ID NO：11所示的信号肽、抗BCMA单链抗体(来自11D53克隆)、SEQ ID NO：18所示的CD8α分子的铰链区及SEQ ID NO：15所示的CD8跨膜结构域、SEQ ID NO：16所示的4-1BB共刺激结构域以及SEQ ID NO：17所示的CD3ζ链胞内激活结构域。

分别将上述编码CAR多肽的DNA片段插入pRK慢病毒表达载体(由pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE载体(Addgene，12252，购自生物风)通过替换启动子和抗性基因改构而成)的EF1α启动子下游，替换载体中的EGFR序列，获得了CAR表达质粒 pRK-HuR968B、pRK-Blue21。

(1-2)慢病毒浓缩液的制备

将实施例1-1制备的CAR表达质粒与结构质粒pMDLg/pRRE(Addgene，12251，购自生物风)、调节质粒pRSV-rev(Addgene，12253，购自生物风)及包膜质粒pMD2G(Addgene，12259，购自生物风)以3：3∶2∶2的质量比例用PEI转染法转染Lenti-X-293T细胞(Takara公司)，转染16小时后，更换为含有2％胎牛血清(FBS)的新鲜DEME培养基，继续培养48小时后，收集细胞上清，离心去除细胞碎片，加入PEG80004℃孵育16-64小时进行慢病毒浓缩，再次离心后去上清，采用T细胞培养基重悬慢病毒沉淀物，获得慢病毒浓缩液，分装后-80℃冻存。

(1-3)P329G CAR-T细胞制备及CAR表达检测：

添加注射用重组人白介素-2(国药准字S20040020)至TexMACS GMP Medium(Miltenyi Biotec，170-076-309)中，配制成IL-2浓度为200IU/ml的T细胞培养基。

自ORiCELLS获得了多个供者PBMC细胞，具体信息如下表1所示：

表1.供者PBMC细胞的相关来源信息

第0天使用Pan T Cell Isolation Kit(human)(Miltenyi，130-096-535)对复苏后的各供者 PBMC进行分选，获得T细胞，使用T细胞培养基将T细胞重悬至一定的密度并添加TransAct (Miltenyi，130-111-160)进行激活。

第1天分出一定量T细胞不添加慢病毒浓缩液继续培养，该部分细胞为未转导细胞(UNT， un-transduced T cells)，剩余的T细胞按MOI＝1～5添加自实施例1-2获得的慢病毒浓缩液(所述慢病毒为编码P329G CAR(SEQ ID NO：1)或对照传统CAR(SEQ ID NO：8)的慢病毒) 并将T细胞吹打均匀；第2天离心去除病毒上清，重悬细胞至新鲜T细胞培养基。第3天将所有细胞转移至G-Rex(WILSONWOLF，货号80040S)中，并添加适量新鲜T细胞培养基，放置于37℃CO₂培养箱中静置培养；每隔2～3天，将细胞以培养基的半量更换为新鲜培养基或直接补加IL-2，其中，添加IL-2至细胞培养基中IL-2浓度为200IU/ml。当细胞数量扩增至约为20-80倍时，满足需求后(一般达到2～8x10⁸个细胞)进行细胞收获。离心去除培养基后，将CAR-T细胞采用

CS10(Stemcell，07930)重悬后分装，程序降温至-80℃进行冻存。

取适量CAR-T细胞，FACS缓冲液(PBS+2％FBS)洗涤一次，重悬后加入含LIVE/DEADFixable Dead Cell Stain的FACS缓冲液，室温染色10-15min，洗涤两次，加入PerCP-Cy5.5-CD3、 BUV805-CD、Biotin-F(ab′)₂Fragment山羊抗人IgG(JacksonImmunoResearch，109-066-006； PG CAR检测)或Biotin-F(ab′)₂Fragment山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch， 115-066-006；Blue 21CAR检测)抗体组合，4℃染色30～45min，洗涤两次后再加入 APC-Streptavidin，4℃染色30～45min；细胞洗涤两次后用FACS缓冲液重悬，采用流式细胞仪进行检测。

图1A显示了分别用实施例1-1构建的2种CAR转导T细胞后，CD3⁺细胞、CD4⁺、CD8⁺T细胞亚群中CAR的表达，结果表明这些经转导的T细胞中CAR表达阳性率约为18％～29％。

实施例2、BCMA特异P329G突变抗体与抗原结合活性检测

(2-1)BCMA特异性抗体的合成

从国际申请号PCT/CN2019/074419(BCMA抗体相关专利)获得BCMA亲本抗体 ADI-34861的重轻链可变区序列(分别为SEQ ID NO：37所示的VH、SEQ ID NO：38所示的VL 序列)、ADI-34857的重轻链可变区序列(分别为SEQ ID NO：39所示的VH、SEQ ID NO：40所示的VL序列)，在亲本抗体ADI-34861的基础上进行CDR区突变获得ADI-38497的重轻链可变区序列(SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3)，在亲本抗体ADI-34857的基础上进行CDR区突变获得ADI-38484的重轻链可变区序列(SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10)。与相应的亲本抗体相比，突变后的抗体亲和力显示显著提高，具体实验数据见下表2。

表2亲本和突变抗体与BCMA结合亲和力

从US9273141B2专利中获得GSK公司BCMA抗体克隆J6M0轻重链可变区序列，作为对照抗体(GSK IgG)。

采用全基因合成GSK IgG、ADI-38497、ADI-38484抗体轻重链可变区序列，装入含有 WT的人源IgG1重链恒定区(SEQ ID NO：4)或含有P329G点突变的人源IgG1重链恒定区(SEQ ID NO：5)和κ轻链恒定区(SEQ ID NO：6)的pcDNA3.4表达载体(购自上海伯英)上。将轻重链表达载体按照2∶3摩尔比通过PEI共转染到HEK293细胞中，培养5～7天后收集培养基上清。含有抗体的上清培养基通过Protein A柱进行一步纯化，之后用PBS透析。采用NanoDrop仪器读取280nm吸光度值检测浓度，并用SDS-PAGE和SEC-HPLC方法检测样品纯度。获得了GSK WT抗体、GSK PG抗体；ADI-38497WT抗体、ADI-38497PG抗体；以及ADI-38484WT抗体、 ADI-38484PG抗体。具有BCMA抗体克隆ADI-38497重链可变区(SEQ ID NO：2)和轻链可变区(SEQ ID NO：3)序列的抗体在本申请中也称为ADI-38497抗体，包括ADI-38497PG抗体和ADI-38497WT抗体；具有BCMA抗体克隆ADI-38484重链可变区(SEQ ID NO：9)和轻链可变区(SEQ ID NO：10)序列的抗体在本申请中也称为ADI-38484抗体，包括ADI-38484PG抗体和ADI-38484WT抗体。

(2-2)抗体的亲和力检测

通过Biacore T200测定了ADI-38497PG抗体与不同种属BCMA的亲和力，图2A显示了采用表面等离子共振法(SPR)测定抗体亲和力的方法示意图。

具体方法如下：将抗人Fc IgG(Ab97221，Abcam)偶联到CM5芯片(29149603，Cytiva) 表面后，将ADI-38497PG抗体捕获在芯片表面，通过检测芯片表面抗体与流动相中的BCMA 抗原之间的结合与解离获得亲和力及动力学常数。测定过程使用10倍稀释后的10×HBS-EP+ (BR-1006-69，Cytiva)作为实验缓冲液。亲和力检测中的每个循环包括捕获ADI-38497PG抗体、结合一种浓度抗原及芯片再生。将梯度稀释后的抗原(抗原浓度梯度为1.25-40nM，2倍稀释)，以30μl/分钟的流速流由低浓度到高浓度的顺序流过芯片表面，结合时间180s，设定合适的解离时间(900s或600s或60s)。最后使用10mM甘氨酸-HCl，pH 1.5(BR-1003-54， Cytiva)对芯片进行再生。

数据结果通过Biacore T200分析软件(版本号3.1)，使用1∶1结合模型进行分析。

图2B展示了采用SPR测定ADI-38497PG抗体与重组人、食蟹猴、小鼠、大鼠和兔BCMA蛋白的代表性亲和力图谱。结果显示，ADI-38497PG抗体与上述不同种属来源的BCMA蛋白均可结合，其中结合活性的高低顺序依次为人BCMA＞猴BCMA＞小鼠BCMA＞大鼠BCMA> 兔BCMA。

表3 ADI-38497PG抗体与来自不同种属的BCMA蛋白的结合亲和力

(2-3)P329G BCMA抗体与不同种属来源BCMA抗原结合活性检测

首先，制备了表达不同种属来源BCMA抗原的CHO GS细胞。具体而言，将人、小鼠、食蟹猴源的BCMA基因合成并克隆至慢病毒载体中，随后包装含不同种属来源BCMA基因的慢病毒，并用此慢病毒感染CHO GS细胞，后续经流式细胞术分选，得到表达不同种属来源BCMA抗原的CHO GS细胞系，即hBCMA-CHO GS、mBCMA-CHO GS和cynoBCMA-CHO GS细胞。

然后，用FACS缓冲液将ADI-38497PG抗体及GSK来源的BCMA抗体(即，GSK PG IgG用作Benchmark)配制成10倍梯度稀释的不同浓度抗体溶液，分别与1E5个所制备的表达不同种属来源BCMA抗原的CHO GS细胞4℃孵育30分钟，用FACS缓冲液清洗后，再与Fcγ片段特异的APC-山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch，109-136-098)在4℃孵育30 分钟。采用流式细胞术检测与细胞结合的P329G抗体，分析APC通道MFI，以抗体浓度为X 轴，APC通道MFI为Y轴进行绘图并计算结合的EC50。

图2C显示了不同浓度P329G BCMA抗体与稳定表达人、食蟹猴及小鼠BCMA的 CHO-GS细胞的结合能力。由图2C可见，ADI-38497PG IgG抗体能够与细胞表面表达的不同种属BCMA结合，而GSK来源的BCMA抗体(Benchmark)具有较高的种属BCMA特异性，其不识别小鼠BCMA，该结果与SPR检测结果一致。

表4 P329G BCMA抗体与表达不同种属BCMA的CHO-GS细胞的结合EC50值

(2-4)P329G BCMA抗体与肿瘤细胞表面BCMA抗原结合活性检测

取适量处于对数生长期的肿瘤细胞，FACS缓冲液洗涤2次，加入ADI-38497PG抗体、ADI-38484PG抗体及用作Benchmark的GSK PGIgG，对作为染色对照的细胞加入同种型hIgG1抗体，4℃染色30分钟，洗涤两次，加入APC-F(ab′)₂片段的山羊抗人IgG抗体，4℃染色30分钟，细胞洗涤两次后FACS缓冲液重悬，采用流式细胞仪进行检测。

图2D显示不同浓度P329G BCMA抗体与表达BCMA的阳性多发性骨髓瘤细胞系MM.1s、 RPMI8226、U266、H929、L363及AMO1(MM.1s购自南京科佰生物科技有限公司，CBP60239； RPMI8226购自南京科佰生物科技有限公司，CBP60244；U266购自武汉普诺赛生命科技有限公司，CL-0510；H929购自南京科佰生物科技有限公司，CBP60243；L363南京科佰生物科技有限公司，CBP6024；AMO1购自南京科佰生物科技有限公司，CBP60242)的结合活性， ADI-38497PG抗体、ADI-38484PG抗体能够与表达BCMA的阳性肿瘤细胞结合并呈现浓度依赖性。在所述表达BCMA的阳性肿瘤细胞中，MM.1s细胞有最高水平BCMA表达，RPMI8226、U266和H929细胞以中等水平表达BCMA，L363、AMO1细胞以低水平表达BCMA。

表5 P329G BCMA抗体与表达BCMA的阳性肿瘤细胞的结合EC50值

实施例3、BCMA特异性P329G突变抗体与P329G CAR胞外结构域的结合活性检测

(3-1)P329G突变抗体与P329G CAR胞外结构域结合的亲和力检测

通过Biacore T200测定ADI-38497分子(P329G突变抗体或野生型抗体)与抗P329G突变特异性单链抗体-兔Fc融合蛋白(也称为“抗PG scFv融合蛋白”或简称为“抗PG scFv”)的结合亲和力。图3A显示采用表面等离子共振法(SPR)测定抗P329G突变的特异性单链抗体-兔Fc融合蛋白与ADI-38497P329G突变抗体亲和力的检测示意图。

具体方法如下：将合成的抗PG scFv融合蛋白(SEQ ID NO：7)偶联到C1芯片(BR100535， Cytiva)表面后，通过检测芯片表面抗体与流动相中的ADI-38497分子结合与解离获得亲和力及动力学常数。测定过程使用10倍稀释后的10×HBS-EP+(BR-1006-69，Cytiva)作为实验缓冲液。亲和力检测的每个循环包括结合一种浓度的抗体及芯片再生。将梯度稀释后的 ADI-38497分子(浓度梯度为3.125nM-100nM，2倍稀释)，以30μl/分钟的流速流由低浓度到高浓度的顺序流过芯片表面，结合时间180s，解离时间300s。最后使用10mM Glycine-HCl， pH 1.5(BR-1003-54，Cytiva)对芯片进行再生。

图3B展示了采用SPR测定ADI-38497PG抗体及野生型抗体与抗PG scFv融合蛋白结合的代表性亲和力图谱。结果显示，只有ADI-38497PG抗体可特异性的与作为P329G CAR 胞外结构域的抗PG scFv结合。

表6 SPR测定的P329G BCMA抗体及野生型抗体与抗PG scFv的亲和力

(3-2)ADI-38497分子与抗PG scFv融合蛋白的结合亲合力检测

通过Biacore T200测定ADI-38497分子(P329G突变抗体或野生型抗体)与抗PGscFv 融合蛋白的结合亲合力。图3C显示采用表面等离子共振法(SPR)测定抗体亲合力(Avidity) 的方法示意图。

具体方法如下：将抗Fab IgG(I5260，Sigma)偶联到HLC芯片(HLC30M，Xantec)表面后，将ADI-38497分子捕获在芯片表面，通过检测芯片表面抗体与流动相中的抗PG scFv融合蛋白结合与解离获得亲合力及动力学常数。测定过程使用10倍稀释后的10×HBS-EP+(BR-1006-69，Cytiva)作为实验缓冲液。亲合力检测的每个循环包括捕获ADI-38497分子、结合一种浓度的抗PG scFv及芯片再生。将梯度稀释后的抗PG scFv(浓度梯度为1.25nM-40nM， 2倍稀释)，以30μl/分钟的流速流由低浓度到高浓度的顺序流过芯片表面，结合时间180s，解离时间300s。最后使用10mM甘氨酸-HCl，pH 1.5(BR-1003-54，Cytiva)对芯片进行再生。

图3D展示了采用SPR测定ADI-38497PG抗体及野生型抗体与作为P329G CAR胞外结构域的抗PG scFv的代表性亲合力图谱。结果显示，只有ADI-38497PG抗体可特异性地与P329G CAR结合。

表7 SPR测定的P329G BCMA抗体及野生型抗体与抗PG scFv的亲合力

(3-3)P329G BCMA抗体与P329CAR结合活性检测

复苏实施例1制备的P329G CAR-T细胞，用含有10％FBS的RPMI1640培养基重悬，并在37℃培养稳定24小时。用FACS缓冲液将ADI-38497PG抗体以及野生型ADI-38497WT 抗体分别配制成5倍梯度稀释的不同浓度抗体溶液，分别与1E5个CAR阳性细胞4℃孵育 30分钟，用FACS缓冲液清洗后，再与Fcγ片段特异的APC山羊抗人IgG(JacksonImmunoResearch，109-136-098)4℃孵育30分钟。采用流式细胞术检测与细胞结合的抗体，分析APC通道MFI，以抗体浓度为X轴，APC通道MFI为Y轴进行绘图并计算结合的EC50。

图3E显示了ADI-38497WT抗体和ADI-38497PG抗体与P329G CAR-T细胞的结合能力。结果表明，只有P329G突变抗体显示与CAR结合，而WT抗体不与CAR结合，该结果与SPR结果一致。

表8总结了ADI-38497PG抗体和WT抗体与不同供者来源的P329G CAR-T细胞的结合EC50值和EC90值。

表8 BCMA IgG抗体与CAR-T细胞结合的EC50值和EC90值

/>

实施例4、BCMA特异性P329G突变抗体的Fc结构域功能检测

(4-1)ADI-38497PG抗体的ADCC效应功能检测

复苏供者3的PBMC细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，外周血单个核细胞)，用含有RPMI 1640培养基重悬，并在37℃稳定1-2小时。按照效靶比25∶1混合PBMC和靶细胞，并与不同浓度的BCMA抗体进行混合，37℃分别继续培养4小时和24小时，用LDH 检测试剂盒(Promega，G1780)检测抗体介导的PBMC对靶细胞的杀伤效应，并以抗体浓度为X轴，细胞裂解比例为Y轴进行绘图和分析。同时收集细胞，用FACS缓冲液洗涤2次，加入CD3、CD56、CD16及CD107a抗体，其中CD107a抗体需提前加入，与细胞在37℃共孵育1小时。上述细胞抗体混合液于4℃染色30分钟，洗涤两次，FACS缓冲液重悬，采用流式细胞仪进行检测。

图4A显示ADI-38497WT抗体和ADI-38497PG抗体介导ADCC杀伤的能力，结果表明，当测试不同的孵育时间(4小时、24小时)和使用不同的检测指标(对靶细胞的细胞毒性、对CD3、CD56、CD16及CD107a表达的影响)，均显示只有WT抗体介导了对表达BCMA 的阳性H929肿瘤细胞的ADCC细胞毒杀伤效应，而P329G突变抗体缺乏诱导ADCC效应的能力。

(4-2)ADI-38497PG抗体的ADCP效应功能检测

取对数生长期的ADCP报告细胞系(Promega，G9871)与H929细胞，按照效靶比2∶1、5∶1混合ADCP报告细胞和H929靶细胞，并与不同浓度的BCMA抗体进行混合，37℃继续培养20小时，用萤光素酶检测试剂盒(Promega，E2620)检测抗体介导的依赖靶细胞的报告细胞激活效应，并以抗体浓度为X轴，荧光读值变化为Y轴进行绘图和分析。

图4B显示ADI-38497WT抗体和ADI-38497PG抗体介导ADCP杀伤的能力。结果表明，当测试不同的效靶比(2∶1或5∶1)，均显示只有ADI-38497WT抗体介导了对表达BCMA 的阳性H929肿瘤细胞的ADCP杀伤效应，而P329G突变抗体缺乏对表达BCMA的阳性H929 肿瘤细胞诱导ADCP杀伤效应的能力。

(4-3)仅用ADI-38497PG抗体是否介导靶细胞裂解的功能检测

取对数生长期H929细胞和L363细胞，按一定数量铺于孔板中；并将一部分对数生长期H929细胞和L363细胞作为靶细胞经丝裂霉素C处理，用作阴性对照。随后加入不同浓度的ADI-38497PG抗体进行混合，37℃继续分别培养48小时、72小时及120小时，用CellTiter-Glo(Promega，G9242)检测活细胞比例，以共孵育时间为X轴，荧光读值为Y轴进行绘图并分析。

图4C显示了ADI-38497PG抗体介导靶细胞裂解的能力，结果表明，当测试的不同孵育时间(48小时、72小时及120小时)与不同ADI-38497PG抗体浓度(5μg/ml、50μg/ml)，均显示仅用ADI-38497PG抗体缺乏诱导靶细胞裂解的能力。

实施例5、P329G CAR-T体外功能研究

(5-1)CAR-T细胞激活检测

复苏实施例1中供者5制备的CAR-T细胞并在37℃培养稳定过夜。将H929或L363肿瘤靶细胞和CAR-T细胞按照E∶T为2∶1进行混合，并添加5倍或10倍梯度稀释的不同浓度ADI-38497PG抗体溶液至总体积为200μL，放于37℃培养约24小时后离心，收集细胞，用FACS缓冲液洗涤2次，重悬后加入含LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain、Biotin-F(ab′)₂ Fragment山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch，109-066-006)的FACS缓冲液，4℃染色 30分钟，洗涤两次，加入CD4、CD8、CD25、CD69和APC-Streptavidin抗体组合，上述细胞抗体混合液于4℃染色30分钟，洗涤两次，FACS缓冲液重悬，采用流式细胞仪进行检测。

图5A显示了针对H929细胞只有含P329G突变的ADI-38497PG抗体能特异性介导CAR⁺-T的激活，上调CD25、CD69的表达水平，且对CD4⁺CAR⁺和CD8⁺CAR⁺细胞无差异地激活，并呈现ADI-38497PG抗体浓度梯度依赖性。

图5B显示不同BCMA抗体(ADI-38497PG抗体、ADI-38484PG抗体、ADI-38497WT 抗体、GSK PG IgG)诱导L363靶细胞对HuR968B CAR-T细胞的激活效应。由图5B可见，含P329G突变的BCMA抗体(ADI-38497PG抗体、ADI-38484PG抗体、GSK PG IgG)能特异性介导CAR+T细胞的激活，显著上调CD25、CD69的表达水平。CAR阴性细胞群中 CD25、CD69的表达也有微弱上调，表明有较低水平的激活，但该激活程度不显著，可忽略不计。

因此，不论是在高表达BCMA的H929细胞(图5A)还是在低表达BCMA的L363细胞(图5B)作为靶细胞的情况下，只有含P329G突变的BCMA抗体(ADI-38497PG抗体、 ADI-38484PG抗体、GSK PG IgG)能特异性介导CAR⁺-T的激活，显著上调CD25、CD69 的表达水平，并具有P329G突变的BCMA抗体浓度梯度依赖性。

(5-2)CAR-T细胞增殖实验

复苏实施例1中供者4制备的UNT细胞和CAR-T细胞并在37℃培养稳定过夜。使用PBS稀释ADI-38497WT抗体或ADI-38497PG抗体，加入96孔板并于4℃孵育过夜来包被板。将经过夜培养恢复后的CAR-T细胞添加至包被有抗体的96孔板内，作为阳性对照，在 CAR-T细胞中直接加入CD3/CD28偶联磁珠(磁珠：细胞比例3：1)；37℃分别共孵育72小时、 120小时，采用

Luminescent Cell Viability Assay(Promega，G7572)检测细胞的发光值。

图5C显示HuR968B CAR-T细胞受包被的ADI-38497WT抗体或ADI-38497PG抗体刺激后的增殖情况。HuR968B CAR-T细胞在包被的ADI-38497 P329G抗体刺激下产生增殖，与使用ADI-38497WT抗体刺激相比较，在刺激3天或5天后，ADI-38497PG抗体使得 HuR968BCAR-T细胞分别增殖了约7倍或43.5倍；而UNT细胞在ADI-38497PG抗体刺激下，与使用ADI-38497WT抗体刺激相比较，使用ADI-38497PG抗体刺激未导致UNT细胞产生显著增殖。HuR968B CAR-T细胞和UNT细胞在CD3/CD28抗体偶联磁珠刺激情况下均产生了显著增殖。

(5-3)细胞因子检测

复苏实施例1制备的CAR-T细胞并在37℃培养稳定过夜。将肿瘤靶细胞和CAR-T细胞按照E∶T为2∶1进行混合，并添加5倍或10倍梯度稀释的不同浓度BCMA抗体(ADI-38497PG抗体、ADI-38484PG抗体、ADI-38497WT抗体、或作为Benchmark的GSK PG IgG)溶液至总体积为200μL，放于37℃培养约24小时后离心，收集上清。使用BD^TM Cytometric Bead Array(CBA)Human Th1/Th2Cytokine Kit II((BD，551809))对细胞因子进行检测。将试剂盒内Capture Beads等体积混匀后，以25μL/孔进行布板。添加等体积的上清液或上清稀释液或标准品。混匀后添加25μL等体积的人Th1/Th2PE检测试剂，室温避光孵育3小时。使用洗涤缓冲液洗涤两次后重悬，采用流式细胞仪进行检测，通过PE通道MFI值计算细胞因子浓度。

图5D显示来自实施例1的供者4的HuR968B CAR-T细胞与H929细胞、RPMI8226细胞共培养，在加入不同浓度BCMA抗体(ADI-38497PG抗体、ADI-38484PG抗体、ADI-38497 WT抗体、或作为阳性对照的GSK PG IgG)后的CAR-T细胞分泌效应细胞因子的释放结果。

图5E显示来自供者5(购自ORiCELLS，Cat NO.：FPB004F-C，Lot NO.：PCH20210100004， DonorID：Z0086)的HuR968B CAR-T细胞与不同肿瘤细胞共培养，在加入不同浓度BCMA 抗体(ADI-38497PG抗体、ADI-38484PG抗体、ADI-38497WT抗体、或BenchmarkGSK PG IgG)后CAR-T细胞分泌效应细胞因子的释放结果。

从图5D和图5E可以看出，在加入WT BCMA抗体(ADI-38497WT抗体)的情况下，HuR968B CAR-T细胞没有被激活，不分泌IL-2、IFN-γ、TNFα等效应细胞因子，只有在加入含P329G突变的BCMA抗体(ADI-38497PG抗体、ADI-38484PG抗体、或作为阳性对照的GSKPGIgG)的情况下，HuR968B CAR-T细胞被激活，分泌效应细胞因子。且依据不同靶细胞条件下的细胞因子分泌结果来看，效应细胞分泌细胞因子的水平与靶细胞的BCMA表达水平无明显相关性。

(5-4)杀伤效率检测

复苏实施例1制备的CAR-T细胞并在37℃培养稳定过夜。将肿瘤靶细胞和CAR-T细胞按照E∶T为2∶1进行混合，并添加10倍梯度稀释的不同浓度BCMA抗体(ADI-38497PG抗体、ADI-38484PG抗体、ADI-38497WT抗体、或Benchmark GSK PG IgG)溶液至总体积为200μL，放于37℃培养约24小时后离心，转移细胞上清液至96孔白底酶标板中。使用CytoTox96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega，G1780)以及酶标仪(MolecularDevices， SpectraMax i3x)测量上清液中的LDH值，计算杀伤效率。

图5F显示了不同BCMA抗体(ADI-38497PG抗体、ADI-38484PG抗体、ADI-38497WT 抗体、或Benchmark GSK PG IgG)诱导HuR968B CAR-T细胞对不同BCMA表达水平肿瘤细胞(H929⁺⁺细胞、RPMI8226⁺⁺⁺细胞、AMO1⁺细胞和L363⁺细胞)的杀伤效应。在加入WT BCMA抗体的情况下，HuR968B细胞没有被激活，不产生对肿瘤细胞的杀伤效应，只有在加入含P329G突变的BCMA抗体的情况下，P329G CAR-T细胞被激活，从而杀伤靶细胞，且具有抗体浓度依赖性，与本实施例中的上述CAR-T细胞激活及效应细胞因子结果相一致。此外，在以高表达BCMA的H929、RPMI8226细胞作为靶细胞的情况下，P329G BCMA抗体介导HuR968B CAR-T细胞的杀伤效应高于低表达BCMA的AMO1、L363靶细胞。

图5G显示了不论是P329G BCMA抗体还是WT BCMA抗体，均不会介导CAR-T对 BCMA阴性靶细胞(例如BCMA-KO-H929细胞)的杀伤效应，而针对表达BCMA的H929 细胞(H929)，WTBCMA抗体也无法介导杀伤效应，只有P329G BCMA抗体可诱导CAR-T 产生对肿瘤细胞的杀伤效应。

表9 P329G BCMA抗体介导HuR968B CAR-T细胞对H929靶细胞的杀伤效应的EC50值

抗体	EC50(nM)
		ADI-38497PG	0.3502至0.7433
ADI-38497WT	非常宽

实施例6、游离BCMA蛋白对PG CAR-T功能的影响

(6-1)杀伤效率检测

复苏实施例1中供者6制备的CAR-T细胞并在37℃培养稳定过夜。将肿瘤靶细胞和CAR-T细胞按照E∶T为2∶1进行混合，加入一定浓度的PG BCMA抗体，对于传统Blue21 CAR-T则不需要加入BCMA抗体。均添加10倍梯度稀释的不同浓度BCMA蛋白溶液作为游离BCMA蛋白至总体积为200μL，放于37℃培养约24小时后离心，转移细胞上清液至96 孔白底酶标板中。使用CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega，G1780)以及酶标仪(Molecular Devices，SpectraMax i3x)测量上清液中的LDH值，计算杀伤效率。

图6显示不同浓度的游离BCMA蛋白对HuR968B CAR-T及Blue21CAR-T细胞杀伤效应的影响。在加入不同浓度的游离BCMA蛋白的情形下，一旦传统CAR T细胞与游离BCMA 蛋白结合，则其功能就会被阻断(由于传统CAR分子对BCMA的高亲和力)，而当PG BCMA 抗体与可溶性BCMA结合，PG CAR-T仍然能够发挥正常的杀伤效应。因此，PG CAR-T细胞的优势在于其功能受可溶性配体(例如可溶性BCMA)的影响低。

实施例7、ADI-38497PG抗体的体内药代动力学研究

(7-1)抗体注射及取样

将BALB/c小鼠(年龄4-6周，体重15-17g，雌性)分成3组，即ADI-38497PG抗体，1mg/kg 抗体组；ADI-38497PG抗体，10mg/kg抗体组；和ADI-38497PG抗体，200mg/kg抗体组，每组9只小鼠；用1×PBS将抗体分别稀释至0.1mg/mL，1mg/mL和20mg/mL，每只小鼠给药体积10mL/kg，即抗体给药剂量分别为1mg/kg，10mg/mL和200mg/mL；给药方式为静脉注射，给药频率为单次。抗体给药后5分钟、30分钟、2h、6h、24h、48h、96h、168h、 336h和504h小鼠眼眶后静脉丛采集血样100μL，3000g离心，吸取上清液用于血药浓度测定。

(7-2)ADI-38497PG抗体检测

提前一天包被96孔酶标板。用包被液(取一包碳酸盐(Thermo，28382)粉末，溶解于400mL超纯水，定容至500mL，混匀即为包被液)将BCMA抗原稀释至1μg/ml，每孔100μL，封板膜封板，室温过夜。倒掉包被溶液，在吸水纸上拍干，然后每孔加入300μL洗液，振荡混匀10秒，拍干洗液后，重复洗涤3次。排枪加入封闭液，每孔200μL，封板膜封板，室温孵育2h。随后洗板1次。将稀释好的标准曲线(由已知浓度的BCMA抗体梯度稀释，制备标准曲线(例如，使用已知浓度的ADI-38497PG抗体制备标准曲线)、质量控制样品和待测样本每孔100μL，室温孵育2h。倒掉预包被溶液，在吸水纸上拍干，然后每孔加入300μL洗液，振荡混匀10秒，拍干洗液后，重复洗涤3次。重复一次。将山羊抗人IgG-Fc-HRP抗体 (BETHYL)1∶10万稀释，每孔加入100μL，室温避光孵育1h。随后洗板1次。将TMB底物加入到96孔酶标板中，每孔100μL，室温下避光显色5分钟。每孔加入50μLELISA终止液，震荡10秒，30分钟内读取OD450nm和OD620nm值。

图7A和7B显示小鼠中ADI-38497PG抗体(下文小鼠体内实验中也简称为PG Ab)药代动力学实验结果。小鼠静脉注射1mg/kg、10mg/kg、200mg/kg的ADI-38497PG抗体后，血清中ADI-38497PG抗体暴露量(Cmax和AUClast)呈现剂量依赖效应，其他药代动力学参数无明显差异，如表10所示，ADI-38497PG抗体1mg/kg：AUC0-inf，Cmax，CL，T1/2 分别为2480μg×h/mL，30ug/ml，0.40ml/kg/h、145h；ADI-38497PG抗体10mg/kg：AUC0-inf， Cmax，CL，T1/2分别为24720μg×h/mL，187ug/ml，0.32ml/kg/h、219h；ADI-38497PG抗体200mg/kg：AUC0-inf，Cmax，CL，T1/2分别为397734μg×h/mL，3895ug/ml，0.43ml/kg/h、 197h，ADI-38497PG抗体1mg/kg半衰期略短于ADI-38497PG抗体10mg/kg和200mg/kg。

表10 ADI-38497PG抗体药代动力学实验结果

实施例8、PG CAR-T细胞联合不同剂量PG抗体在体内抗BCMA高表达肿瘤的效应

(8-1)小鼠肿瘤接种及处理

用l×PBS重悬H929细胞，制备成细胞浓度为5×10⁶个/mL细胞悬液。NOG小鼠(年龄4-6周，体重15-17g，雌性)右侧背部剃毛，皮下注射H929细胞悬液，注射体积0.2mL/只，即接种量为1×10⁶个细胞/只小鼠。肿瘤细胞接种后7天，将小鼠肿瘤体积在50.82～104.36mm³的小鼠分成7组，分别为PBS载剂组、PG Ab组、仅PG CAR-T组、传统CAR-T组、PG Ab +PG CAR-T，3mg/kg抗体组、PG Ab+PG CAR-T，1mg/kg抗体组和PG Ab+PG CAR-T， 0.3mg/kg抗体组，每组7只小鼠。分别配置浓度为0.3mg/mL，0.1mg/mL和0.03mg/mL的抗体，分组完成后，于第7日进行抗体给药，每只小鼠给药体积10mL/kg，给药频率为每周 1次，给药方式为腹腔注射。用1×PBS重悬供者4制备的CAR-T细胞，制备成CAR⁺细胞为 25×10⁶个/mL细胞悬液，于第7日尾静脉注射细胞悬液0.2mL/只，即回输CAR⁺细胞5×10⁶个/只小鼠。每周2次监测小鼠体重、肿瘤组织最大长轴(L)和最大宽轴(W)。

图8A显示在皮下接种人H929高表达BCMA肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中不同剂量 PG抗体联合PG CAR-T细胞的治疗效应。结果显示，在BCMA高表达肿瘤模型中，仅施用 PGCAR-T细胞未产生明显抗肿瘤效应，仅施用PG抗体产生一定的抗肿瘤效应，只有同时接受PG CAR-T细胞和PG抗体治疗的小鼠产生显著抗肿瘤效应，并呈现抗体剂量依赖效应。 PGCAR-T细胞联用0.3mg/kg抗体、1mg/kg抗体和3mg/kg抗体的处理使得肿瘤生长抑制率(TGI)分别为92％、88％和101％，而仅施用PG CAR-T细胞或仅施用PG抗体处理的小鼠中抗肿瘤药效TGI分别为25％和53％。此外，PG CAR-T细胞联用PG抗体3mg/kg产生的抗肿瘤效应与同等给药剂量的传统Blue21CAR-T细胞的抗肿瘤效应相当，TGI分别为101％和102％。

图8B显示了该实验中小鼠的体重变化。结果显示，经PG CAR-T细胞联用PG抗体治疗的小鼠，其体重在接受处理后保持稳定，在联用PG抗体0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg处理后体重平均升高5.2％、3.0％、7.6％。结果表明，PG CAR-T细胞联合PG抗体治疗产生了显著抗肿瘤效应，并且无明显毒副效应。

(8-2)小鼠体内CAR-T细胞检测：

取30μL实施例8-1的小鼠血样，加入96孔V孔板中，标注为样本检测孔；取10μL 小鼠血样，加入96孔V孔板中，标注为对照孔。向所有孔内加入100μL含有LIVE/DEAD FixableDead Cell Stain以及TruStain FcX^TM(抗mouse小鼠CD16/32)(Biolegend)的FACS缓冲液，轻轻混匀，4℃避光孵育15分钟；随后向样本检测孔内加入Biotin-F(ab′)₂片段Fragment山羊抗人IgG抗体，4℃避光孵育30分钟；随后向样本检测孔中各加入100μL FACS缓冲液，400g离心，弃上清；向所有孔中各加入100μL含有APC-Cy7抗人CD45(Biolegend)、 PerCP-Cy5.5-CD3(BD Biosciences)和APC-链亲和素(Biolegend)的FACS缓冲液，轻轻混匀，4 ℃避光孵育30分钟；然后向所有孔中加入200μL/孔FACS缓冲液，400g离心，弃上清；加入250μL/孔1×RBC Lysis/Fixation solution(Biolegend)，混匀，室温避光孵育20分钟；400 g离心，弃上清；用100μL FACS缓冲液重悬细胞后，每孔加入10μL123count ebeads，使用流式细胞仪检测。

图8C显示实施例8-1的实验中PG CAR-T细胞在小鼠体内扩增情况。结果显示，PGCAR-T细胞体内扩增依赖PG抗体，呈现一定抗体剂量依赖性，更高剂量组小鼠有更高水平的PG CAR-T细胞扩增。仅施用PG CAR-T细胞，其在回输小鼠体内1周开始扩增，2周后扩增到466个细胞/100μL外周血，3周后扩增达到较高水平(3644个细胞/100μL外周血)， 4周后仍维持在高水平(3214个细胞/100μL外周血)；在联用PG CAR-T细胞时给予不同剂量PG抗体0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg的情况下，2周后PG CAR-T细胞体内峰值扩增水平分别达到11428个细胞/100μL外周血、19299个细胞/100μL外周血、35368个细胞/100μL 外周血，4周后仍维持在较高水平，分别为15486个细胞/100μL外周血、25073个细胞/100μL 外周血和27666个细胞/100μL外周血，远高于同期未联合给予抗体组。此外，作为阳性对照的传统Blue21CAR-T细胞，显示相似的扩增动力学，同样在回输小鼠体内1周开始扩增，2 周后扩增达到峰值水平(174769个细胞/100μL外周血)，4周后仍维持在极高水平(131963 个细胞/100μL外周血)。

实施例9、PG CAR-T细胞联合不同剂量PG抗体在体内抗BCMA低表达肿瘤的效应

(9-1)小鼠肿瘤接种及处理

用1×PBS重悬L363细胞，制备成细胞浓度为5×10⁶个/mL细胞悬液。NOG小鼠(年龄4-6周，体重15-17g，雌性)右侧背部剃毛，皮下注射L363细胞悬液，注射体积0.2mL/只，即接种量为1×10⁶个细胞/只小鼠。肿瘤细胞接种后9天，将小鼠肿瘤体积在74.14～110.29mm³的小鼠分成7组，分别为载剂组、PG Ab组、PG CAR-T组、传统CAR-T组、PG Ab+PG CAR-T，3mg/kg抗体组、PG Ab+PG CAR-T，1mg/kg抗体组和PG Ab+PG CAR-T，0.3mg/kg抗体组，每组7只小鼠。分别配置浓度为0.3mg/mL，0.1mg/mL和0.03mg/mL的抗体，分组完成后，于第9日进行抗体给药，每只小鼠给药体积10mL/kg，给药频率为每周1次，给药方式为腹腔注射。用1×PBS重悬供者4制备的CAR-T细胞，制备成CAR⁺细胞为25×10⁶个/mL细胞悬液，于第9日尾静脉注射细胞悬液0.2mL/只，即回输CAR⁺细胞5×10⁶个/只小鼠。每周2 次监测小鼠体重、肿瘤组织最大长轴(L)和最大宽轴(W)。

图9A显示在皮下接种人L363低表达BCMA肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中不同剂量 PG抗体联合PG CAR-T细胞的治疗效应。结果显示，在BCMA低表达肿瘤模型中，仅施用 PGCAR-T未产抗肿瘤效应，而仅施用PG抗体抗肿瘤效应不明显，TGI为21％，只有同时接受PGCAR-T细胞和PG抗体治疗的小鼠才产生显著抗肿瘤效应，并呈现抗体剂量依赖效应。 PGCAR-T细胞联用0.3mg/kg剂量的PG抗体情况下，PG CAR-T细胞诱导了显著的抗肿瘤效应，TGI为87％，当该联用增加PG抗体剂量至1mg/kg和3mg/kg时，PG CAR-T细胞诱导的抗肿瘤最大效应显著增加，TGI分别为103％和103％，显示出与传统Blue21 CAR-T细胞相同的抗肿瘤效应。

图9B显示了该实验中小鼠的体重变化。结果显示，经PG CAR-T细胞联用PG抗体治疗的小鼠，其体重在接受处理后保持平稳上升，在联用PG抗体0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg 后体重平均升高18.2％、10.5％、8.5％。结果表明，PG CAR-T细胞联合PG抗体治疗产生了显著抗肿瘤效应，并且未诱导明显毒性。

(9-2)小鼠体内CAR-T细胞检测：方法同实施例8-2。

图9C显示实施例9-1的实验中PG CAR-T细胞在小鼠体内扩增情况。结果显示，仅施用PG CAR-T细胞，其在回输小鼠体内1周开始扩增，2周后扩增到919个细胞/100μL外周血，3周时快速下降到204个细胞/100μL外周血；在联用PG CAR-T细胞时给予不同剂量PG 抗体0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg的情况下，2周后PG CAR-T细胞体内峰值扩增水平达到 4380个细胞/100μL外周血、8049个细胞/100μL外周血和3347个细胞/100μL外周血，3周后仍维持在较高水平，分别为2475个细胞/100μL外周血、4121个细胞/100μL外周血和1969 个细胞/100μL外周血，远高于同期未联合给予抗体组。此外，作为阳性对照的传统Blue21 CAR-T细胞同样在回输小鼠体内2周后扩增达到峰值水平(76836个细胞/100μL外周血)， 3周后仍维持在高水平(36328个细胞/100μL外周血)。

实施例10、不同剂量PG CAR-T细胞联合PG抗体在体内的抗肿瘤效应

(10-1)小鼠肿瘤接种及处理

用1×PBS重悬H929细胞，制备成细胞浓度为5×10⁶个/mL细胞悬液。NOG小鼠(年龄4-6周，体重15-17g，雌性)右侧背部剃毛，皮下注射H929细胞悬液，注射体积0.2mL/只，即接种量为1×10⁶个细胞/只小鼠。肿瘤细胞接种后9天，将小鼠肿瘤体积在59.50～105.82mm³的小鼠分成7组，分别为载剂组、PG Ab组、仅施用PG CAR-T组、PG Ab+PG CAR-T，10×10⁶组、PG Ab+PG CAR-T，1×10⁶个细胞组、PG Ab+PG CAR-T，0.1×10⁶个细胞组和PG Ab+PG CAR-T，0.01×10⁶个细胞组，每组7只小鼠。配置浓度为0.3mg/mL的抗体，分组完成后，于第9日进行抗体给药，每只小鼠给药体积10mL/kg，给药频率为每周1次，给药方式为腹腔注射。用1×PBS重悬供者4制备的CAR-T细胞，制备成CAR⁺细胞为50×10⁶个/mL细胞悬液，随后10倍梯度稀释，再制备成5×10⁶、0.5×10⁶和0.05×10⁶个/mL的细胞悬液，于第9日尾静脉注射细胞悬液0.2mL/只。每周2次监测小鼠体重、肿瘤组织最大长轴(L)和最大宽轴(W)。

图10A显示在皮下接种人H929肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中PG抗体联合不同剂量 PG CAR-T细胞的治疗效应。结果显示，在给予极低剂量0.01×10⁶个CAR-T细胞的情况下， CAR-T细胞产生与仅施用PG抗体相似的抗肿瘤效应，TGI分别为49％和50％。增加CAR-T细胞剂量至0.1×10⁶、1×10⁶、10×10⁶个CAR-T细胞，PG CAR-T细胞诱导的抗肿瘤效应显著增加，TGI分别为91％、104％、103％。仅施用CAR-T细胞未显示抗肿瘤效应。

(10-2)体内CAR-T细胞检测：方法同实施例8-2。

图10B显示实施例10-1的实验中PG CAR-T细胞在小鼠体内扩增情况。结果显示，CAR-T 细胞回输小鼠体内在PG抗体诱导下，1周开始扩增，2周后扩增达到峰值水平，3周后仍保持高水平，此外在联用PG抗体时，CAR-T细胞体内扩增依赖CAR-T细胞剂量，更高CAR-T剂量组小鼠有更高水平的CAR-T细胞扩增，0.01×10⁶、0.1×10⁶、1×10⁶、10×10⁶CAR-T细胞剂量组峰值扩增水平分别为6个细胞/100μL外周血、338个细胞/100μL外周血、3640个细胞/100μL外周血、12895个细胞/100μL外周血。

实施例11、PG CAR-T细胞联合PG抗体不同给药频率体内抗肿瘤效应研究

(11-1)小鼠肿瘤接种及处理

用1×PBS重悬H929细胞，制备成细胞浓度为5×10⁶个/mL细胞悬液。NOG小鼠(年龄4-6周，体重15-17g，雌性)右侧背部剃毛，皮下注射H929细胞悬液，注射体积0.2mL/只，即接种量为1×10⁶个细胞/只小鼠。肿瘤细胞接种后7天，将小鼠肿瘤体积在51.25～94.97mm³的小鼠分成7组，分别为载剂组、仅施用PG CAR-T组、PG Ab+PG CAR-T，Q3/4×2组、PGAb+PGCAR-T，QW×4组、PGAb+PG CAR-T，Q2W×2组、PGAb+PG CAR-T，Q3W×2 组和传统CAR-T组，每组7只小鼠。配置浓度为0.1mg/mL的PG Ab抗体，分组完成后，抗体给药，每只小鼠给药体积10mL/kg，给药方式为腹腔注射。用1×PBS重悬供者4制备的 CAR-T细胞，制备成CAR⁺细胞10×10⁶个/mL细胞悬液，尾静脉注射细胞悬液0.2mL/只。每周2次监测小鼠体重、肿瘤组织最大长轴(L)和最大宽轴(W)。

图11A显示实施例11-1的实验中PG抗体的给药频率。Q3-4Dx2：以4周为周期，PG 抗体在第1周给药2次，给药间隔3-4天；Q3W×2：PG抗体给药2次，给药频率为3周/次； Q2W×2：PG抗体给药2次，给药频率为2周/次；QW×4：PG抗体给药4次，给药频率为1 周/次。

图11B显示在皮下接种人H929肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中，联用PG CAR-T细胞时PG抗体不同给药时频率的治疗效应。结果显示，联用PG CAR-T细胞时PG抗体不同给药频率均能够诱导PG CAR-T细胞产生显著抗肿瘤效应，并且增加PG抗体给药频率，PG CAR-T细胞诱导的抗肿瘤效应显著增加，QW×4组CAR-T细胞诱导的抗肿瘤效应最显著，显示出与传统Blue21CAR-T细胞相同的抗肿瘤效应。

(11-2)体内CAR-T细胞检测：方法同实施例8-2。

图11C显示实施例11-1的实验中PG CAR-T细胞在小鼠体内扩增情况。结果显示，联用PG CAR-T细胞时，在PG抗体不同给药频率情况下，CAR-T细胞扩增动力学相似，CAR-T 细胞回输小鼠体内1周开始扩增，2周后扩增达到峰值水平，3周后下降到基线水平。此外，传统Blue21CAR-T细胞同样在回输小鼠体内2周后扩增达到峰值水平，3周后仍维持在高水平。

实施例12、PG CAR-T细胞联合不同剂量PG抗体在体内抗系统性肿瘤效应研究

(12-1)小鼠肿瘤接种及处理

首先，制备了H929-luc细胞。具体而言，用H929细胞(购自南京科佰生物科技有限公司)包装含GFP-萤光素酶基因的慢病毒，并用获得的慢病毒感染H929细胞，后续经流式细胞术分选，得到GFP和萤光素酶双表达的H929-luc细胞系。

然后，用1×PBS重悬H929-luc细胞，制备成细胞浓度为25×10⁶个/mL细胞悬液。NOG 小鼠(年龄4-6周，体重15-17g，雌性)尾静脉注射H929-luc细胞悬液，注射体积0.2mL/只。肿瘤细胞接种后14天，腹腔注射底物D-Luciferin(15mg/mL)，注射体积为10mL/kg/只小鼠，底物注射10分钟后用IVIS spectrum成像分析。将荧光信号在1.17×10⁷～1.43×10⁸photons/sec的小鼠分成7组，分别为载剂组、PG Ab，0.3mg/kg组、PG Ab，3mg/kg组、PG CAR-T组、PG Ab+PG CAR-T，0.3mg/kg+2×10⁶组、PG Ab+PG CAR-T，3mg/kg+2×10⁶组和Blue21CAR-T组，每组6-7只小鼠。分别配置浓度为0.03mg/mL和0.3mg/mL的抗体，分组完成后，于第14日开始进行抗体给药，每只小鼠给药体积10mL/kg，给药频率为每周1 次，给药方式为腹腔注射。用1×PBS重悬供者4制备的CAR-T细胞，制备成CAR⁺细胞10×10⁶个/mL细胞悬液，于第7日尾静脉注射细胞悬液0.2mL/只。

图12A显示在尾静脉接种人H929-luc肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中不同剂量PG抗体联合PG CAR-T细胞治疗效应的荧光图像。结果显示，在系统性肿瘤模型中，PG抗体联合 PG CAR-T细胞同样产生显著抗肿瘤效应，第18天，PG抗体0.3mg/kg联合PG CAR-T细胞组小鼠荧光分布及荧光强度相比对照组显著减少，同时给予PG抗体3mg/kg联合PG CAR-T细胞组小鼠无明显荧光信号，而传统Blue21 CAR-T治疗组仍有大量荧光分布，显示PG CAR-T 细胞组比Blue21 CAR-T更快地诱导抗肿瘤效应；PG抗体3mg/kg联合PG CAR-T细胞组小鼠无明显荧光信号一直维持到第56天，至第63天部分小鼠肿瘤略微显示荧光信号，而此时Blue21 CAR-T治疗组超过一半的小鼠肿瘤明显复发并转移至腹腔，表明PG CAR-T细胞联用PG抗体产生更持久的抗肿瘤效应。

图12B显示在尾静脉接种人H929-luc肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中不同剂量PG抗体联合PG CAR-T细胞的治疗效应。结果显示，在给予PG抗体0.3mg/kg情况下，PG CAR-T细胞产生一定的抗肿瘤效应，增加PG抗体剂量至3mg/kg，PG CAR-T细胞诱导的抗肿瘤效应显著增加，并且抗肿瘤效应维持的更持久，停止给予PG抗体，约4周左右肿瘤生长开始复发，而给予同等细胞剂量的传统Blue21 CAR-T肿瘤复发更快，显示出PG CAR-T细胞比传统Blue21 CAR-T更持久的抗肿瘤效应。仅施用PG CAR-T细胞组、PG抗体组未显示明显抗肿瘤效应。

图12C显示上述实验中小鼠体重变化。结果显示，治疗期间各处理组小鼠体重平稳上升，提示在血液肿瘤模型中不同剂量PG抗体联合PG CAR-T细胞处理未诱导显著毒性。

实施例13、PG CAR-T细胞联合PG抗体在体内毒理研究

(13-1)小鼠肿瘤接种及处理

用1×PBS重悬H929细胞，制备成细胞浓度为5×10⁶个/mL细胞悬液。NOG小鼠(年龄4-6周，体重15-17g，雌性)右侧背部剃毛，皮下注射5×10⁶个/mL的H929细胞悬液，注射体积0.2mL/只。肿瘤细胞接种后6天，将小鼠肿瘤体积在38.49～104.77mm³的小鼠分成8组，如表11所示，分别为未荷瘤的载剂组、PG Ab+PG CAR-T，10mg/kg+10×10⁶组、以及荷瘤的载剂组、PG CAR-T组、PG Ab组、PG Ab+PG CAR-T，10mg/kg+10×10⁶组、PG Ab+ PG CAR-T，3mg/kg+10×10⁶组和PG Ab+PG CAR-T，3mg/kg+1×10⁶组，每组24只小鼠。分别配置浓度为1mg/mL和0.3mg/mL的抗体，分组完成后，抗体给药，每只小鼠给药体积10mL/kg，给药频率为每周1次，给药次数3次，给药方式为腹腔注射。第1次抗体给药后 1天，用1×PBS重悬供者4制备的CAR-T细胞，分别制备CAR⁺细胞50×10⁶个/mL和5×10⁶个/mL细胞悬液。尾静脉注射细胞悬液0.2mL/只。每周2次监测小鼠体重、肿瘤组织最大长轴(L)和最大宽轴(W)。第1次抗体给药前、CAR-T回输后、第3次抗体给药前及实验终点取外周血，每组4只小鼠，用于血液学和血生化检测。

表11各组的处理和给药剂量

图13A显示在皮下接种人H929肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中PG抗体联合PGCAR-T 细胞的治疗效应。结果显示，PG抗体联合PG CAR-T细胞处理组均产生显著抗肿瘤效应，而仅施用PG抗体处理组小鼠抗肿瘤效应较弱，仅施用PG CAR-T未产生抗肿瘤效应。

图13B显示本实验中小鼠体重变化。结果显示，治疗期间荷瘤和非荷瘤处理组小鼠体重平稳上升，且体重相较对照小鼠无明显变化，提示不同剂量PG抗体联合不同剂量PGCAR-T细胞治疗未诱导明显毒性反应。

图13C和图13D显示上述实验中小鼠血液学和血生化检测结果。结果显示，治疗期间荷瘤和非荷瘤处理组小鼠血液学和血生化指标较对照小鼠无明显变化，表明PG抗体联合PG CAR-T细胞治疗未产生毒性反应。

实施例14、临床研究

1.临床研究目的：

1)评价输注“PG 38497抗体+PG CAR-T细胞”治疗复发/难治性多发性骨髓瘤(relapsed/refractory multiple myeloma，RRMM)的安全性和耐受性；

2)评价输注“PG38497抗体+PG CAR-T细胞”治疗RRMM的临床疗效。

3)评价“PG 38497抗体+PG CAR-T细胞”给药后的药代动力学(pharmacokinetics，PK) 和药效动力学(pharmacodynamic，PD)特征。

4)评价“PG 38497抗体+PG CAR-T细胞”给药后的免疫原性。

2.受试药物：

本实施例所述受试药物的活性组分为：P329G BCMA抗体(ADI-38497PG抗体)和P329G CAR-T细胞(患者自体PBMC细胞改造获得CAR-T细胞)。

P329G BCMA抗体的制剂处方为20.0mg/ml P329G BCMA抗体，0.76mg/ml组氨酸，1.08mg/ml盐酸组氨酸，50.00mg/ml山梨醇，0.20mg/ml聚山梨酯80，pH 6.0；P329G BCMA 抗体的规格：60mg(3mL)/瓶。

P329G CAR-T细胞的规格：每袋含有溶解于7.5％DMSO冻存保护剂中的90-140×10⁶抗P329G CAR-T阳性细胞。

P329G BCMA抗体的生产企业为信达生物制药(苏州)有限公司；P329G CAR-T细胞的生产企业为信达细胞制药(苏州)有限公司。

3.入选标准

1)18周岁及以上，性别不限。

2)根据国际骨髓瘤工作组(International Myeloma Working Group，IMWG)多发性骨髓瘤的诊断标准，有初次诊断为多发性骨髓瘤的检查证明资料。

3)既往经过至少3线治疗，每线治疗有至少1个完整治疗周期，(除非最佳疗效记录为疾病进展(progressive disease，PD)，根据IMWG标准)；且必须包含蛋白酶体抑制剂和免疫调节剂。

4)在最近的抗骨髓瘤治疗期间或之后12个月内出现有检查资料证明的疾病进展。

5)根据以下任一标准确定筛选时存在可测量病灶：

①骨髓细胞学、骨髓活检组织或流式检测单克隆浆细胞比例≥5％；

②血清单克隆蛋白(M-蛋白)水平≥0.5g/dL；

③尿M蛋白水平≥200mg/24小时；

④血清或尿液中无可测量病灶的轻链型多发性骨髓瘤：血清免疫球蛋白游离轻链≥10 mg/dL且血清免疫球蛋白κ/λ游离轻链比异常。

6)ECOG评分为0或1分。

7)预期生存时间≥12周。

8)受试者必须有适当的器官功能，入组前符合下列所有实验室检查结果：

①血常规：绝对嗜中性粒细胞计数(absolute neutrophil count，ANC)≥1×109/L；绝对淋巴细胞计数(absolute lymphocyte count，ALC)≥0.3×109/L；血小板≥50×109/L；血红蛋白≥60g/L；

②肝功能：ALT和AST≤2.5×正常值上限(upper limit ofnormal，ULN)；血清总胆红素≤1.5×ULN；

③肾功能：血清肌酐≤2.5×ULN；或根据Cockcroft-Gault公式计算的肌酐清除率(creatinine clearance，CrCl)≥40ml/min；

④程血功能：纤维蛋白原≥1.0g/L；活化的部分凝血活酶时间，活化的部分凝血活酶时间≤1.5×ULN，凝血酶原时间≤1.5×ULN；

⑤静息状态下动脉血氧饱和度>91％；

⑥左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)≥50％。

9)受试者及其配偶同意在受试者签署知情同意书(informed consentform，ICF)后至最后一次接受“P329G BCMA抗体+PG CAR-T细胞”治疗(该治疗中的任一组分)给药一年内采取有效的工具或者药物避孕措施(不包括安全期避孕)。

10)受试者必须签署ICF，表明其理解本研究的目的和程序并且愿意参加研究。须在开始任何一项研究相关但不属于受试者疾病标准治疗的检查或程序前获得知情同意。

3.剂量选择依据

P329G BCMA抗体的起始剂量和最大剂量(初步)推荐分别为0.3mg/kg和3mg/kg。PGCAR-T细胞(初步)推荐为2×10⁶个细胞/kg体重。

该剂量的推荐是基于初步的体外活性研究、体内活性研究、小鼠毒理学研究及对同靶点药物临床安全性等方面的综合评价。

“P329G BCMA和P329G CAR-T细胞”的体外研究中，scFv与P329G抗体的结合Kd为5.72nM，计算出EC90对应Cmax为7.772μg/mL，从而计算出P329G BCMA抗体的初始剂量为0.3mg/kg。H929BCMA-high荷瘤鼠模型中，P329G BCMA和P329G CAR-T细胞(3mg/kg 抗体+～250*10⁶个细胞)剂量下小鼠整体安全。P329G BCMA和P329G CAR-T细胞进入体内后快速扩增，但扩增峰值小于传统CAR-T细胞。相同细胞剂量下，P329G CAR-T的最大细胞量是传统CAR-T的六分之一。这提示，P329G CAR-T比传统CAR-T在安全性方面有更大的潜力，传统CAR-T在2*10⁶个/kg细胞剂量下，具有较好的临床疗效，因此拟定P329G CAR-T研究起始细胞剂量为2*10⁶个/kg。

本临床研究中在输注P329G CAR-T细胞前1天输注第1剂P329G BCMA抗体，目的是首先使作为adaptor分子的P329G BCMA抗体与肿瘤细胞表面的BCMA抗原充分结合，以利于之后输注的CAR-T细胞尽快识别并聚集于肿瘤部位，发挥肿瘤杀伤效应。P329G BCMA 抗体在小鼠体内的半衰期约为1周，IgG1人体理论半衰期为3周(无靶点介导的消除)，考虑到1剂抗体可能不足以产生完全杀灭肿瘤的效果，故拟定P329G BCMA抗体的给药方式为 Q3W周期性给药。

4.临床方案

本研究是一项评估输注“P329G BCMA和P329G CAR-T细胞”治疗RRMM受试者的安全性、耐受性、药代动力学和初步疗效的临床研究。

入组的受试者将接受外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)单采 (-28～-21天)。之后，利用受试者自身的T细胞制备P329G CAR-T细胞制剂(以下简称PG CAR-T细胞)。成功制备PG CAR-T细胞后，受试者将会首先接受环磷酰胺和氟达拉滨的清淋预处理方案(-5～-3天)，预处理结束休息评估1天后接受1剂P329G BCMA抗体(以下简称ADI-38497PG抗体)输注，隔天(0天)接受PG CAR-T细胞输注，之后自PG CAR-T 细胞输注目算起，每21天周期性输注ADI-38497PG抗体，最多输注24个月，直至疾病进展、出现不可耐受的毒性、受试者撤回知情同意或出现其他需停止研究治疗的原因(以先发生者为准)。

本研究分为剂量递增和剂量扩展两部分。

1)在剂量递增阶段，采用经典“3+3”方式，固定PG CAR-T细胞剂量，充分探索ADI-38497PG抗体的最优剂量。ADI-38497PG抗体剂量共设3个剂量组：0.3mg/kg、1mg/kg、3 mg/kg。PG CAR-T细胞剂量为2*10⁶个/kg。DLT观察窗为ADI-38497PG抗体首剂给药后21 天，DLT观察期内包含1次PG CAR-T细胞给药。

2)固定PG CAR-T细胞进行ADI-38497PG抗体剂量递增。每个剂量组先入组3例受试者，如果先入组的3例受试者在DLT观察窗内未观察到DLT，可开始下一剂量组给药；如果 3例中有≥2例发生DLT，则终止剂量递增；如果某剂量先入组的3例受试者中有1例出现 DLT，同一剂量组需增加3例受试者(此时该剂量组总共6例受试者)，若补充的3例受试者无DLT发生，则可开始下一剂量组给药，若补充的3例受试者中有≥1例发生DLT，不允许继续进行剂量递增。同时，需在上一剂量组补足6例受试者进行试验直至确定最大耐受剂量(maximum tolerated dose，MTD)，因此MTD剂量组至少需要6例受试者方能确认。若抗体起始剂量0.3mg/kg组前3例受试者中有≥2例受试者出现DLT，则退至更低的抗体剂量 0.1mg/kg进行剂量探索；如果先入组的3例受试者中有1例出现DLT，该剂量组需增加3例受试者(此时该剂量组总共6例受试者)，若补充的3例受试者无DLT发生，则可开始下一剂量组给药，若补充的3例受试者中有≥1例发生DLT，则退至更低的抗体剂量0.1mg/kg进行剂量探索。

研究者可根据研究中累积的数据，与赞助方讨论一致后选择预测可能具有更高获益/风险比的剂量继续研究。例如，若上述试验整体安全性良好，预测进一步提高PG CAR-T细胞剂量有增加受试者获益的可能，则继续探索5*10⁶个/kg PG CAR-T细胞剂量的安全性。在剂量递增阶段，将由研究者审查安全性数据，并结合PK数据，决定是否需要进行下一剂量组的探索并在必要时调整剂量递增方案。前3例受试者将采用交错入组策略。第1和第2例受试者、以及第2和第3例受试者之间必须间隔一个至少2周的观察期。

在研究药物剂量递增阶段，若受试者完成DLT观察期并且未出现DLT，将继续接受当前剂量组的治疗，直至疾病进展、不可耐受的毒性、受试者撤回知情同意或出现其他需停止研究治疗的原因(以先发生者为准)，最长治疗期24个月。

3)剂量扩展阶段：

为充分探索“P329G BCMA抗体和P329G CAR-T细胞”的有效性和安全性，在研究进行过程中或整体爬坡结束后，研究者可根据前期获得的安全性和疗效信号，PG CAR-T细胞及抗体PK等数据，选择1～2个剂量组进行剂量扩展，每个剂量组可补充3～6例受试者。

剂量限制毒性

按照美国国立癌症研究所不良事件通用术语标准(National Cancer InstituteCommon Terminology Criteria for Adverse Events，NCI CTCAE)v5.0对不良事件(其中CRS和免疫效应细胞相关神经毒性综合征(immune effector cell-associatedneurotoxicity syndrome，ICANS)使用ASTCT发布的分级标准)进行毒性评价。本临床研究中DLT定义为在剂量递增阶段的首次P329G BCMA抗体给药后21天内出现的与研究药物相关的任何3～5级毒性事件，除外以下情况：

①3级CRS(分级参见附录4)，经适当治疗在3天内恢复至≤2级。

②持续<7天的3-4级肿瘤溶解综合征(tumor lysis syndrome，TLS)。

③3级神经毒性，经适当治疗在3天内恢复至基线水平或≤1级。

④任何可直接归因于MM本身所致血细胞减少症的并发症，例如感染，出血。

⑤血液学毒性：

ο3级中性粒细胞减少症，或持续＜14天的4级中性粒细胞减少症；

ο3级贫血，或持续＜14天的4级贫血；

ο3级血小板减少症，或持续＜21天的4级血小板减少症；

ο以上描述的中性粒细胞减少症、贫血和血小板减少症之外的任何血细胞减少症。

·非血液学毒性：

ο任何级别的发热，包括中性粒细胞缺乏伴发热；

ο3级腹泻持续<3天；

ο3级恶心和/或呕吐持续<3天；

ο3级疲劳持续<7天；

ο3～4级转氨酶、胆红素、肌酸激酶、血尿素氮或肌酐升高，持续<7天；

ο无任何胰腺炎临床体征或症状的脂肪酶升高；

ο任何非血液学的3级实验室检查AE，无症状且短期内逆转(7天内恢复至基线期或≤2 级水平)。

发生在P329G BCMA抗体首剂给药21天以后的与“P329G BCMA抗体和P329G CAR-T细胞”治疗相关的3～4级毒性事件，将由研究者和赞助方审阅并共同讨论决定是否作为DLT事件。此时，当期剂量和下一个剂量的受试者入组将会推迟。

5.临床治疗方案

1)外周血单个核细胞(PBMC)采集

受试者在开始外周血PBMC采集前，不允许接受以下治疗：

计划方案前7天内针对MM的任何既往全身治疗需要白细胞单采。

采集前4周内使用过其他试验性药物，除非试验治疗中未记录到缓解或PD，且PBMC采集已过去至少3个半衰期。

采集前7天内接受过治疗剂量的皮质类固醇(定义为＞10mg/天泼尼松或等效药物)。允许使用生理替代、外用、鼻内和吸入性类固醇。

采集流程：

①一份单采血中单核细胞(MNC)总数≥10⁸个，单采后红细胞压积(PCV)≤20％，单采体积控制范围50-70mL。

②采血袋取样管在近袋段5-7cm处热封两次，两道热封口间距0.5-1.0cm。采血袋表面贴附采血者信息及采血体积数。

③针对不同类型单采设备，注意选用淋巴细胞富集程序，而非干细胞富集程序。

④针对不同类型单采耗材，血样混匀后在留样袋中保留3-5mL血样，并在近袋端的管路上两次热封，如耗材不带有留样袋，则需在取样管路中保留2-3mL血样，并在近袋端和管路开口端分别热封；

2)桥接治疗

单个核细胞采集后至清淋预处理之前，如果受试者肿瘤负荷高，为维持病情的稳定，可以由研究者与赞助方讨论后决定是否使用桥接治疗。桥接治疗必须是受试者先前接受后至少达到疾病稳定的一种短期治疗。不允许使用桥接治疗后达到完全缓解的受试者接受“P329G BCMA和P329G CAR-T细胞”治疗。

3)清淋预处理

受试者在开始清淋给药之前，必须符合以下标准：

经研究者判断不存在显著的活动性感染；

1.受试者清淋给药前48小时内腋下体温≤38度；

2.受试者清淋给药前7天内，肝肾功能、心肺功能需满足以下要求：

①总胆红素≤1.5×ULN；ALT和AST≤2.5×ULN；

②肌酐≤2.5ULN；

③静息状态下动脉血氧饱和度＞91％。

3.受试者清淋给药前7天内需按照访视时间表完成以下检查：体格检查、生命体征、肿瘤负荷评估(不分泌型通过骨髓细胞学+活检评估；分泌型进行血M蛋白检测，髓外病灶做相关影像学检查)、血常规、血生化、尿常规、凝血功能、12导联心电图检查、静息状态下动脉血氧饱和度检查、合并用药/不良事件等；上述检查结果经研究者评估能够进行清淋；

4.桥接治疗后未达到CR。

5.无其它经研究者判断不适合清淋给药的情况。

推荐的清淋预处理方案如下：

环磷酰胺300mg/m²静脉输注，超过30分钟，每天1次连续3天；氟达拉滨30mg/m²静脉输注，超过30分钟(在环磷酰胺输注完毕后马上输注)，每天1次连续3天；

若清淋前患者存在中度的肾功能受损(肌酐清除率30～70mL/min/1.73m²)，推荐清淋预处理用药：环磷酰胺剂量不变，氟达拉滨减量至20mg/m²/天×3天。

4)P329G BCMA和P329G CAR-T细胞输注

2.受试者在P329G BCMA和P329G CAR-T细胞输注前48小时内腋下体温≤38度；

3.在P329G CAR-T细胞输注前5天内，受试者不得接受治疗剂量的皮质类固醇激素(≥10mg/天的强的松或者其它等效剂量的皮质类固醇激素)和其它免疫抑制药物；

4.静息状态下动脉血氧饱和度>91％；

5.无其它经研究者判断不适合细胞输注的情况。

P329G BCMA和P329G CAR-T细胞制剂的给药信息见下表。输注P329G CAR-T细胞制剂后受试者应至少住院2周，具体时间应由研究者根据受试者病情的评估决定出院时间。

表12 P329G BCMA和P329G CAR-T细胞输注给药

6.实验结果

本实施例为“P329G BCMA和P329G CAR-T细胞”治疗方法首次在人体开展的药物临床研究。从前述的体内外实验结果表明，P329G CAR-T细胞具有良好抗肿瘤效应，在足量P329G BCMA抗体存在情况下，极低剂量P329G CAR-T细胞就能够诱导完全抗肿瘤效应，效应至少与同等剂量传统CAR-T细胞相当；P329G CAR-T细胞活性受P329G BCMA抗体调控并呈现抗体剂量依赖性，不同剂量P329G BCMA抗体诱导不同抗肿瘤效应。

以上描述了本发明的示例性实施方案，本领域技术人员应当理解的是，这些公开内容仅是示例性的，在本发明的范围内可以进行各种其它替换、适应和修改。因此，本发明不限于文中列举的具体实施方案。

序列表

/>

/>

/>

Claims

1.特异性结合BCMA分子的抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：

(a)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SSSYYWT(SEQ ID NO：25)所示的CDR H1或由所述氨基酸序列组成、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；氨基酸序列SISIAGSTYYNPSLKS(SEQ ID NO：26)所示的CDR H2或由所述氨基酸序列组成、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和氨基酸序列DRGDQILDV(SEQ ID NO∶27)所示的CDR H3或由所述氨基酸序列组成、或所述CDRH3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列RASQSISRYLN(SEQ ID NO：28)所示的CDR L1或由所述氨基酸序列组成、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；氨基酸序列AASSLQS(SEQ ID NO：29)所示的CDR L2或由所述氨基酸序列组成、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和氨基酸序列QQKYFDIT(SEQ ID NO：30)所示的CDRL3或由所述氨基酸序列组成、或所述CDRL3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；

(b)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列NDVIS(SEQ ID NO：31)所示的CDR H1或由所述氨基酸序列组成、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；氨基酸序列VIIPIFGIANYAQKFQG(SEQ ID NO：32)所示的CDR H2或由所述氨基酸序列组成、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和氨基酸序列GRGYYSSWLHDI(SEQ ID NO：33)所示的CDR H3或由所述氨基酸序列组成、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列QASQDITNYLN(SEQ ID NO：34)所示的CDR L1或由所述氨基酸序列组成、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；氨基酸序列DASNLET(SEQ ID NO：35)所示的CDR L2或由所述氨基酸序列组成、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和氨基酸序列QQAFDLIT(SEQ ID NO：36)所示的CDR L3或由所述氨基酸序列组成、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；

其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代；

例如，其中：

(a)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SSSYYWT(SEQ ID NO：25)所示的CDR H1；氨基酸序列SISIAGSTYYNPSLKS(SEQ ID NO：26)所示的CDR H2；和氨基酸序列DRGDQILDV(SEQ ID NO：27)所示的CDR H3；所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列RASQSISRYLN(SEQ ID NO：28)所示的CDR L1；氨基酸序列AASSLQS(SEQ ID NO：29)所示的CDR L2；和氨基酸序列QQKYFDIT(SEQ ID NO：30)所示的CDR L3；

(b)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列NDVIS(SEQ ID NO：31)所示的CDR H1；氨基酸序列VIIPIFGIANYAQKFQG(SEQ ID NO：32)所示的CDR H2；和氨基酸序列GRGYYSSWLHDI(SEQ ID NO：33)所示的CDR H3；所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列QASQDITNYLN(SEQ ID NO：34)所示的CDR L1；氨基酸序列DASNLET(SEQ ID NO：35)所示的CDR L2；和氨基酸序列QQAFDLIT(SEQ ID NO：36)所示的CDR L3；

例如，其中：

(a)重链可变区包含SEQ ID NO：2的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：3的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；

(b)重链可变区包含SEQ ID NO：9的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO∶10的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；

例如，其中：

(b)重链可变区包含SEQ ID NO：9的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：10的序列；

例如，所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体；优选地，其是IgG1或IgG4抗体；更优选地，其是IgG1抗体；

例如，所述抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、单链Fv、单链Fab、双体抗体(diabody)。

2.根据权利要求1所述的特异性结合BCMA分子的抗体或抗原结合片段，其还包含突变Fc结构域，其中根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为甘氨酸(G)，与未突变的亲本抗体Fc结构域的Fcγ受体结合相比，突变Fc结构域的Fcγ受体结合降低；例如，所述突变Fc结构域是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的突变Fc结构域，优选地，所述突变Fc结构域是IgG1或IgG4抗体的突变Fc结构域；更优选地，所述突变Fc结构域是IgG1抗体的突变Fc结构域；

例如，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：5所示的重链恒定区序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列且其中根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为G；

例如，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：5所示的重链恒定区序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列且其中根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为G；和SEQ ID NO：6所示的轻链恒定区序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；

例如，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：5所示的重链恒定区序列和SEQ IDNO：6所示的轻链恒定区序列。

3.分离的核酸，其编码权利要求1或2所述的特异性结合BCMA分子的抗体或抗原结合片段。

4.包含权利要求3的核酸的载体，优选地所述载体是表达载体。

5.包含权利要求3的核酸或权利要求4的载体的宿主细胞，优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的，更优选的选自大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞，最优选地，所述宿主细胞是HEK293细胞或CHO细胞。

6.制备权利要求1或2所述的特异性结合BCMA分子的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括在适于表达编码权利要求1或2所述的特异性结合BCMA分子的抗体或抗原结合片段的核酸的条件下，培养导入有编码权利要求1或2所述的特异性结合BCMA分子的抗体或抗原结合片段的核酸的表达载体的宿主细胞，分离所述特异性结合BCMA分子的抗体或抗原结合片段，任选地所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述特异性结合BCMA分子的抗体或抗原结合片段。

7.药物组合，其包含

(ii)包含P329G突变的特异性结合BCMA分子的抗体或抗原结合片段(也称为P329G突变抗体)，例如，权利要求2的P329G突变抗体；以及

任选地可药用辅料；

其中，所述分子开关调控型CAR多肽包含

(1)人源化抗P329G突变scFv序列，其中所述scFv序列包含能够特异性结合包含P329G突变的抗体Fc结构域，但不能特异性结合未突变的亲本抗体Fc结构域的如下序列：

(i)重链可变区，其包含根据Kabat编号的

(a)氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO：19)所示的重链互补决定区CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；

(ii)轻链可变区，其包含根据Kabat编号的

(()氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO：24)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；

其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代；

(2)铰链区/间隔区，其选自

(i)(G₄S)_n、(SG₄)_n或G₄(SG₄)_n肽接头，其中“n”是1至10的整数，例如1至4的整数；例如SEQID NO：14所示的序列；

(3)跨膜区(TM)，其选自CD8跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQID NO：15所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；

优选地，所述CAR多肽包含

(i)重链可变区，其包含根据Kabat编号的

(a)氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO：19)所示的CDR H1；

(b)氨基酸序列EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO：20)所示的CDR H2；和

(c)氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO：21)所示的CDR H3；和

(ii)轻链可变区，其包含根据Kabat编号的

(d)氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO：22)所示的CDR L1；

(e)氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO：23)所示的CDR L2；和

(()氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO：24)所示的CDR L3；

例如，(i)重链可变区，其包含SEQ ID NO：12的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，和

(ii)轻链可变区，其包含SEQ ID NO∶13的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；

例如，(i)重链可变区，其包含SEQ ID NO：12的序列，和(ii)轻链可变区，其包含SEQ IDNO：13的序列；

(2)铰链区/间隔区，其选自

(i)(G₄S)_n、(SG₄)_n或G₄(SG₄)_n肽接头，其中“n”是1至4的整数，例如SEQ ID NO∶14所示的序列；

(5)刺激信号结构域(SSD)，其选自SEQ ID NO：17所示的CD3ζ信号传导结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；

其中所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。

8.根据权利要求7所述的药物组合，其中所述分子开关调控型CAR多肽还包含位于N端的信号肽序列，例如，SEQ ID NO∶11所示的信号肽序列，

优选地，所述分子开关调控型CAR多肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

9.根据权利要求7或8所述的药物组合，其中编码CAR多肽的核酸分子是编码权利要求7或8的药物组合中所述的CAR多肽的核酸分子，例如，是编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的核酸分子。

10.根据权利要求7-9中任一项所述的药物组合，其中所述载体是包含编码权利要求7-9中任一项的药物组合中所述的CAR多肽的核酸分子的载体，例如，所述载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。

11.根据权利要求7或8所述的药物组合，其中所述免疫效应细胞是自自体T细胞、NK细胞或同种异体T细胞、NK细胞制备的表达权利要求7或8所述的分子开关调控型CAR多肽的T细胞、NK细胞，例如，所述免疫效应细胞是自人PBMC分离的T细胞、NK细胞制备的表达权利要求7或8所述的分子开关调控型CAR多肽的T细胞、NK细胞。

12.根据权利要求7或8所述的药物组合，其中

(i)将表达权利要求7或8的药物组合中所述的CAR多肽的免疫效应细胞以1×10⁶个细胞/kg体重-10×10⁶个细胞/kg体重，例如1×10⁶个细胞/kg体重、2×10⁶个细胞/kg体重、3×10⁶个细胞/kg体重、5×10⁶个细胞/kg体重、7×10⁶个细胞/kg体重、9×10⁶个细胞/kg体重、10×10⁶个细胞/kg体重的剂量以单次或多次静脉内施用至受试者；和

(ii)将权利要求7或8的药物组合中所述的P329G突变抗体以0.1-10mg/kg、优选地0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、9mg/kg、10mg/kg的剂量单元的形式，优选地胃肠外、更优选地静脉内施用至受试者。

13.根据权利要求12所述的药物组合，其中(i)和(ii)分开、同时或依次施用，例如，第一天施用(ii)，同一天静脉内施用(i)，然后通过监测(ii)的体内浓度和期望的治疗功效终点，确定是否多次施用(ii)；或者

第一天施用(i)，第二天静脉内施用(ii)，然后通过监测(ii)的体内浓度和期望的治疗功效终点，确定是否多次施用(ii)二或者

例如，(i)和(ii)各施用一次，然后3-4天后、1周、2周、或3周后再施用(ii)、通过监测(ii)的体内浓度和期望的治疗功效终点，确定是否多次施用(ii)。

14.根据权利要求7-13中任一项所述的药物组合的用途，用于在受试者中治疗与BCMA相关的疾病，包括向受试者施用治疗有效量的权利要求7-13中任一项所述的药物组合，优选地，所述与BCMA相关的疾病是例如表达或过表达BCMA的癌症。

15.根据权利要求7-13中任一项所述的药物组合在制备用于治疗与BCMA相关的疾病的药物中的用途，所述与BCMA相关的疾病是例如表达或过表达BCMA的癌症。

16.用于治疗与BCMA相关的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的权利要求7-13中任一项所述的药物组合。

17.成套药盒，其包含权利要求7-13中任一项所述的药物组合，优选地所述药盒为药物剂量单元形式。

18.一种药物复合物，其是一种由

(i)选自表达权利要求7或8的药物组合中所述的分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)；和

(ii)包含P329G突变的特异性结合BCMA分子的抗体或抗原结合片段(也称为P329G突变抗体)，例如，权利要求2的P329G突变抗体

例如，其中所述免疫效应细胞是自自体T细胞、NK细胞或同种异体T细胞、NK细胞制备的表达权利要求7或8的药物组合中所述的分子开关调控型CAR多肽的T细胞、NK细胞，例如，所述免疫效应细胞是自人PBMC分离的T细胞、NK细胞制备的表达权利要求7或8的药物组合中所述的分子开关调控型CAR多肽的T细胞、NK细胞。

19.根据权利要求18所述的药物复合物的用途，用于在受试者中治疗与BCMA相关的疾病，优选地，所述与BCMA相关的疾病是例如表达或过表达BCMA的癌症。