KR20220032642A - 종양 특이적 세포 고갈을 위한 항 cd25 fc 감마 수용체 이중특이적 항체 - Google Patents

종양 특이적 세포 고갈을 위한 항 cd25 fc 감마 수용체 이중특이적 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고형 종양의 치료 방법으로서, 상기 방법이 CD25에 대한 항체의 사용을 포함하는, 치료 방법에 관한 것이다. 특히, CD25에 대한 항체는 종양 내의 조절 T 세포(Treg)의 고갈용으로 최적화된다. 본 발명은 또한 신규한 항-CD25 항체 및 다른 항암 약물, 예를 들면, 암 항원 또는 억제성 Fc 수용체 FcγRIIb(CD32b)를 표적화하는 화합물인 면역 체크포인트 억제제와의 이들의 조합을 제공한다.

Description

종양 특이적 세포 고갈을 위한 항 CD25 FC 감마 수용체 이중특이적 항체{ANTI CD25 FC GAMMA RECEPTOR BISPECIFIC ANTIBODIES FOR TUMOR SPECIFIC CELL DEPLETION}
본 발명은 암 면역요법과 관련된 CD25에 대한 항체의 사용 및 고형암의 치료 방법을 포함하는 암 치료 방법에 관한 것이다.
암 면역요법은 암을 치료하거나 예방하기 위해 대상체 자신의 면역계의 사용을 포함한다. 면역요법은 암 세포가 종종 면역계에 의해 검출될 수 있는 미묘하게 다른 분자를 표면에 갖는다는 사실을 이용한다. 이러한 분자 또는 암 항원은 가장 일반적으로 단백질이지만 탄수화물과 같은 분자를 또한 포함한다. 따라서 면역요법은 이러한 표적 항원을 통해 종양 세포를 공격하는 면역계의 자극과 관련된다. 그러나 악성 종양 특히 고형 종양은 종양 세포에 모두 내재된 다양한 기전 및 종양 미세환경의 성분에 의해 매개된 면역 감시를 벗어날 수 있다. 후자의 경우, 조절 T 세포(Treg 세포 또는 Tregs)에 의한 종양 침윤 및 더욱 구체적으로, 효과기 T 세포(Teff) 대 Treg의 불리한 균형(즉, Teff 대 Treg의 낮은 비율)은 중요한 인자로서 제안되었다(참조: Smyth M er al., 2014, Immunol Cell Biol. 92, 473-4).
그들의 발견 이후, 조절 T 세포는 면역 항상성을 중재하고, 주변 내성의 확립 및 유지를 촉진시키는데 중요한 것으로 밝혀졌다. 그러나 암과 관련되어 그들의 역할은 더 복잡하다. 암 세포가 자체 및 종양 관련 항원 둘 다를 발현시키기 때문에, 효과기 세포 반응을 저해하려는 조절 T 세포의 존재는 종양 진행에 기여할 수 있다. 따라서 확립된 종양에서 조절 T 세포의 침윤은 효과적인 항종양 반응과 일반적인 암 치료에 대한 주요 장애 중의 하나이다. 조절 T 세포에 의해 사용된 억제 기전은 현재의 치료 특히, 항종양 반응의 유도 또는 강화에 의존하는 면역요법의 제한 또는 심지어 실패에도 상당히 기여할 것으로 생각된다(참조: Onishi H et al;, 2012 Anticanc. Res. 32, 997-1003).
암을 치료하기 위한 치료적 접근법으로서 조절 T 세포의 고갈은 뮤린 모델에서 종양 확립 및 진행에 대한 조절 T 세포의 기여를 나타낸 연구에 의해 뒷받침되는 접근법이다. 또한, 조절 T 세포에 의한 종양 침윤은 또한 몇몇 인간 암에서 더 나쁜 예후와 관련되어 있다(참조: Shang B et al., 2015, Sci Rep. 5:15179). 그러나 종양에서 조절 T 세포의 고갈은 복잡하고, 이 분야의 연구 결과는 모순적이다. 따라서 당해 분야에서 조절 T 세포의 고갈과 관련된 암을 치료하는 방법이 필요하다.
조절 T 세포의 고갈을 달성하기 위한 잠재적인 분자 표적 중에서, IL-2/CD25 상호작용은 뮤린 모델에서 여러 연구의 대상이었고 이들 중 일부는 랫트 항-마우스 CD25 항체인 PC61의 사용과 관련된다(참조: Setiady Y et al., 2010. Eur J Immunol. 40: 780-6). 이 항체의 CD25 결합 및 기능적 활성은 다른 저자에 의해 생성된 모노클로날 항체의 패널의 그것과 비교되었다(참조: Lowenthal J.W et al., 1985. J. Immunol., 135, 3988-3994; Moreau, J.-L et al., 1987. Eur. J. Immunol. 17,929-935; Volk HD et al., 1989 Clin. exp. Immunol. 76, 121-5; Dantal J et al., 1991, Transplantation 52:110-5).
이러한 방식으로 마우스 IL-2 결합 부위와 구별되거나 공통적인 이러한 표적 내의 항-마우스 CD25에 대한 3개의 에피토프(epitope)가 특성화되었다. PC61(마우스 IgG1 아이소타입을 가짐)은 항-마우스 CD25 항체에 대한 많은 다른 하이브리도마 (및 항-인간 CD25 항체로서 개시된 것들 대부분; 참조: 예를 들면, WO2004/045512, WO2006/108670, WO1993/011238, 및 WO1990/007861)로서 CD25에 대한 IL-2의 결합을 차단하거나 억제한다. 또한, 마우스 CD25에 대한 PC61의 결합은 7D4와 같은 다른 항-마우스 CD25 항체와 마찬가지로, IL-2 결합 부위에서 CD25의 ADP-리보실화에 의해 영향을 받지 않는다(참조: Teege S et al., 2015, Sci Rep 5: 8959).
일부 문헌은 암에서 또는 Treg 고갈과 관련하여 단독으로 또는 조합하여 항-CD25의 사용을 언급한다(참조: WO2004/074437; WO2006/108670; WO2006/050172; WO2011/077245; WO2016/021720; WO2004/045512; Grauer O et al., 2007　Int. J. Cancer: 121: 95-105). 그러나 암의 마우스 모델에서 시험될 때, 랫트 항-마우스 CD25 PC61은 종양 확립 후 전달될 때 항-종양 활성을 입증하지 못했다.
자가면역에 관한 뮤린 모델에서, 항-CD25 PC61 항체는 IL-2 수용체 차단과 주변 Treg의 고갈에 대한 항-CD25 항체 내에서 매우 다양한 Fc 효과기 기능의 효과를 평가하기 위해 재설계되었다(참조: Huss D et al., 2016. Immunol.148: 276-86). 그러나 종양에서 조절 T 세포를 고갈시키거나 항종양 치료적 활성을 매개하는 능력은 PC61(자체로서, 조작된 항체로서, 또는 마우스 CD25에 대한 PC61의 것들과 유사한 CD25 결합 특징을 갖는 것으로 설계되었거나 특성화된 항-인간 CD25로서)에 대해 단독으로 또는 다른 항체 또는 항암 화합물과 조합하여 평가되지 않았다.
본 발명은 신규한 항-CD25 항체 및 특히 종양 내에서 조절 T 세포를 효율적으로 고갈시키도록 하는 구조적 요소를 특징으로 하는 항-CD25 항체의 신규한 용도를 제공한다. 이 범위에서, 랫트 IgG1 PC-61의 구조적 및 기능적 특징(마우스 CD25와 관련하여 기재된 바와 같음)은 조절 T 세포를 고갈시키는 용도 및 종양에 대한 효능 측면에서 단독으로 또는 다른 항암제와 함께 놀랍게도 향상된 특징을 제공하는 항체를 제공하기 위해 개질되었다. 이러한 발견은 인간 대상체의 종양에 대해 필적할 만한 효과를 제공하는 신규한 항-인간 CD25를 정의하고 생성하는데 사용될 수 있다.
따라서 본 발명자들에 의한 중요한 발견은 항-마우스 항-CD25 PC61이 단지 림프절 및 순환에서 Treg를 고갈시킬 수 있지만, 종양 내에서는 그렇게 하지 못했다는 것이다. 종양에서 Treg 고갈의 결여는 항종양 활성의 부족과 관련이 있다. 이 새롭고 예기치 않은 데이터는 본 발명자들이 종양내 Treg의 강력한 고갈 및 항종양 활성을 유도하는 Fc 유전공학을 통한 항-마우스 CD25의 고갈 활성을 증가시키는 것을 촉진시켰다.
본 발명은 대상체에게 항-CD25 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 암을 갖는 인간 대상체를 치료하는 방법으로서 상기 대상체가 종양(바람직하게는 고형 종양)을 갖고, 상기 항-CD25 항체가 적어도 하나의 활성화 Fcγ 수용체(바람직하게는 FcγRI, FcγRIIc 및 FcγRIIIa로부터 선택됨)에 고친화도로 결합하고, 종양 침윤성 조절 T 세포를 고갈시키는 IgG1 항체인, 치료 방법을 제공한다.
이러한 항체는 CD25에 대해 10-8 M 미만의 해리 상수(Kd) 및/또는 적어도 하나의 활성화 Fcγ 수용체에 대해 약 10-6M 미만의 해리 상수를 갖는다. 가장 바람직하게는 항-CD25 항체는 Fcγ 수용체와 관련된 다른 특징에 의해 특성화되고, 특히
(a) 1보다 우수한 활성 대 억제성 비율(A/I)을 갖는 Fcγ 수용체에 결합하고/하거나
(b) FcγRIIb에 결합하는 것보다 더 높은 친화도로 FcγRI, FcγRIIc 및 FcγRIIIa 중의 적어도 하나에 결합한다.
치료 방법에서 항-CD25 항체의 사용을 고려하면, 더 바람직한 특징을 제공할 수 있다. 항-CD25 항체는 바람직하게는 모노클로날 항체, 특히 인간 또는 인간화 항체이다. 또한, 면역 세포 및/또는 이의 활성을 유도하기 위한 면역계의 성분의 다른 성분과의 상호작용의 관점에서, 항-CD25 항체는 추가로 향상된 CDC, ADCC 및/또는 ADCP 반응, 바람직하게는 증가된 ADCC 및/또는 ADCP 반응, 보다 바람직하게는 증가된 ADCC 반응을 유도할 수 있다.
본 발명의 항-CD25 항체(일반적으로 상기 및 상세한 설명에 추가로 상세히 정의된 바와 같음)는 인간 대상체를 치료하는 방법에 사용될 수 있고, 여기서 상기 항-CD25 항체는 확립된 고형 종양을 갖는 대상체에게 투여된다(바람직하게는 고형 종양을 갖는 대상체를 동정하는 단계를 추가로 포함하는 방법에서). 이러한 방법은 상기 대상체에게 면역 체크포인트 억제제를, 예를 들면, 항체 결합 및 면역 체크포인트 단백질의 억제 형태로 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 면역 체크포인트 억제제는 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체일 수 있는 PD-1 길항제이다. 보다 일반적으로, 항-CD25 항체는 상기 대상체에게 상기 항-CD25 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 고형 종양에서 조절 T 세포를 고갈시키는 방법에 사용될 수 있다.
추가적으로 본 발명의 항-CD25 항체는 인간 대상체에서 암을 치료하기 위한 의약의 제조에 사용될 수 있고, 여기서 상기 대상체는 고형 종양을 갖는다. 이 범위에서 상기 항체는 면역 체크포인트 억제제, 바람직하게는 PD-1 길항제와 조합하여 투여하기 위한 것이다.
추가적으로 본 발명은 상기 정의된 항-CD25 항체와 인간 대상체의 암 치료에 사용하기 위한 다른 항암 화합물(바람직하게는, 상세한 설명에 설명된 면역 체크포인트 억제제 또는 다른 화합물)의 조합을 제공하고, 여기서 상기 대상체는 고형 종양을 갖고, 상기 항-CD25 항체 및 항암 화합물(예: PD-1 길항제와 같은 면역 체크포인트 억제제)은 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여된다. 이 범위에서, 또한 본 발명은 상기 항-CD25 항체, 및 항암 화합물(예: PD-1 길항제와 같은 면역 체크포인트 억제제)을 포함하는, 암을 치료하는 데 사용하기 위한 키트를 제공한다.
추가적으로 본 발명은 또한 약제학적으로 허용되는 매질에 상기 정의된 바와 같은 항-CD25 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 또한 항암 화합물(예: PD-1 길항제와 같은 면역 체크포인트 억제제)을 포함할 수 있다.
또한 본 발명은
(a) CD25에 결합하는 제1 항원 결합 잔기; 및
(b) 또 다른 항원에 결합하는 제2 항원 결합 잔기를 포함하는 이중특이적 항체를 제공하고,
상기 이중특이적 항체는 적어도 하나의 활성 Fcγ 수용체에 고친화도로 결합하고 종양 침윤성 조절 T 세포를 고갈시키는 IgG1 항체이다. 바람직하게는, 이러한 제2 항원 결합 잔기는 면역 체크포인트 단백질, 종양 관련 항원으로부터 선택된 항원에 결합하거나, 항-인간 활성 Fc 수용체 항체(항-FcγRI, 항-FcγRIIc 또는 항-FcγRIIIa 항체)이거나(또는 이에 기초함), 길항적 항-인간 FcγRIIb 항체이다(또는 이에 기초함).
바람직하게는, 이러한 이중특이적 항체는 PD-1, CTLA-4, BTLA, KIR, LAG3, VISTA, TIGIT, TIM3, PD-L1, B7H3, B7H4, PD-L2, CD80, CD86, HVEM, LLT1, GAL9, GITR, OX40, CD137 및 ICOS로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역 체크포인트 단백질에 결합하는 제2 항원 결합 잔기를 포함한다. 이러한 면역 체크포인트 단백질은 바람직하게는 종양 세포 상에서 발현되고, 가장 바람직하게는 PD-1, PD-L1 및 CTLA-4로부터 선택된다. 면역 체크포인트 단백질에 결합하는 제2 항원 결합 잔기는 면역 체크포인트 억제제로서 작용하는 시판되는 항체에 포함되거나 이에 기초하고, 예를 들면,
(a) PD-1의 경우에, 항-PD-1 항체는 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙일 수 있고;
(b) PD-L1의 경우에, 항-PD-L1은 아테졸리주맙이고;
(c) CTLA-4의 경우에, 항-CTLA-4는 이필리무맙이다.
이러한 이중특이적 항체는 듀오바디, BiTE DART, CrossMab, 노브-인-홀, Triomab 또는 이중특이적 항체 및 이의 단편의 다른 적합한 분자 포맷을 포함하는 임의의 시판되는 포맷으로 제공될 수 있다.
대안적으로, 이러한 이중특이적 항체는 종양 관련 항원에 결합하는 제2 항원 결합 잔기를 포함한다. 대안적인 구현예에서, 이러한 항원 및 상응하는 항체는 제한 없이, CD22 (블리나투모맙), CD20 (리툭시맙, 토시투모맙), CD56 (로르보투주맙), CD66e/CEA (라베투주맙), CD152/CTLA-4 (이필리무맙), CD221/IGF1R (MK-0646), CD326/Epcam (에드레콜로맙), CD340/HER2 (트라스투주맙, 페르투주맙) 및 EGFR (세툭시맙, 파니투무맙)을 포함한다.
본 발명의 항-CD25 항체와 또 다른 항암 화합물, 또는 상기 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 조합은 상기 조합 또는 상기 이중특이적 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법에 사용될 수 있고, 특히 대상체가 고형 종양을 갖는 경우, 그리고 대상체의 암의 치료에 사용하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 본 발명을 수행함에 있어 당업자를 돕기 위해 제공되는 것을 의미하고, 다음 도면을 참조하여 본 발명의 범주를 제한하는 것은 결코 의도되지 않는 다음의 실시예에 의해 추가로 기재될 것이다.
도 1은 혈액과 림프절에 대한 CD25pos 조절 T 세포의 발현을 도시한다.
(A) 상이한 종양 모델의 림프절(LN) 및 종양 침윤성 림프구(TIL)에 존재하는 T 세포 서브세트의 표면 상의 CD25(검출 항체 클론 7D4; 항-마우스 CD25, IgM 아이소타입)의 발현. 히스토그램은 각 종양 모델에 대해 하나의 마우스를 대표한다.
(B) MCA205 종양 모델을 사용하여 개별 실험의 풀링된 데이터(n = 10)로부터의 PBMC 및 T 세포 서브세트에서 CD25-양성 세포의 백분율 및 CD25의 MFI. 동일한 평가(T 세포 서브세트로 제한됨)가 (C) 및 (D)의 MC38, B16 및 CT26 종양 모델에서 수행되었다. 오차 막대는 평균의 표준 오차(SE)를 나타낸다. CD4-양성, Foxp3-양성 세포와 CD8-양성 또는 CD4-양성/Foxp3-음성 세포 사이의 통계적 관련성이 표시된다.
도 2는 MCA205 종양 모델에서 혈액 및 림프절에 대한 CD25-양성 T 세포의 항-CD25 (αCD25) 매개 고갈의 제한을 도시한다.
(A) CD4-양성 T 세포에서 CD25 (검출 항체 클론 7D4; 항-마우스 CD25, IgM 아이소타입) 및 FoxP3의 발현. (B) Treg(CD4-양성, FoxP3-양성 T 세포 상에 게이트됨)에서 CD25의 평균 형광 강도. 종양 함유 마우스에게 5 x 105 MCA205 세포로 s.c. 접종 후 5일 및 7일째에 200㎍의 항-CD25-r1 (αCD25-r1; 항-CD25 랫트 IgG1), 항-CD25-m2a (αCD25-m2a; 항-CD25 뮤린 IgG2a), 항-CTLA-4(αCTLA-4; 항-CTLA4 클론 B56)를 주사하거나, 처리하지 않았다(tx 부재). 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 림프절(LN) 및 종양 침윤성 림프구(TIL)를 9일째에 수거하고, 유동 세포 계측법 분석을 위해 처리하고 염색했다.
도 3은 도 2의 MCA205 종양 모델에서 T 세포 하위 집단에 대한 항-CD25 (αCD25) 매개 효과를 도시한다.
(A) 전체 CD4-양성 T 세포로부터의 FoxP3-양성 세포의 백분율 및 (B) PBMC (세포 수/mL), LN (3개의 배수 림프절에서의 총 세포 수) 및 TIL (세포 수/종양 g)에서의 CD4-양성, FoxP3-양성 T 세포의 절대 수는 CD4-양성, FoxP3-음성 T 세포와 동시에 도시하고, (C) 효과기 CD4-양성, FoxP3-양성 T 세포 (Treg 세포)의 비율 및 (D) CD4-양성 FoxP3-음성 및 CD8-양성 T 세포 상에 게이트된 효과기 CD8-양성 T 세포의 비율)/Treg 세포.
도 4는 종양 도전 후 10일에 미처리된 MCA205 종양 모델(도 2 참조)에서 유동 세포 계측법에 의해 평가된 B 세포 (CD19-양성), T 세포 (CD3-양성, CD5-양성), NK 세포 (NK1.1-양성), 과립구 (CD11b + Ly6G +), 통상적인 수지상 세포 (cDC; CD11c-고 MHCII-양성) 및 단핵구/대식세포 (Mono/Mφ, CD11b-양성, Ly6G-음성, NK1.1-음성, CD11c-저/음성)상의 FcγR의 발현에 대한 대표적인 히스토그램을 도시한다. 오차 막대는 SEM (n = 3)을 나타내고, 데이터는 발견이 일관되는 3개의 개별 실험 중 하나에 상응한다.
도 5는 Treg 고갈이 활성 Fc-감마 수용체의 발현에 의존하는 방법을 도시한다. C57BL/6 야생형 마우스 (wt) 및 Fcer1g-/- 마우스는 0일째에 5 x 105 MCA205 세포를 피하 주사한 다음, 5일 및 7일째에 200㎍의 항-CD25를 주사하였다. 종양, 배수 림프절 및 혈액을 9일째에 수거하고, 유동 세포 계측법 분석을 위해 처리하여 염색하였다. 조절 T 세포는 PBMC, LN 및 TIL에서 CD4 및 FoxP3 발현에 의해 동정되었다. 총 CD4+ 세포에서 Foxp3+의 백분율이 도시된다(A).
동일한 접근법을 야생형 (wt), Fcgr3-/-, Fcgr4-/- 또는 Fcgr2b-/-에 적용하여 FcγRIIb에 의한 종양에서 αCD25-r1 매개 Treg 고갈의 억제를 입증했다. 플롯은 TIL에서만 전체 CD4+ T 세포에서 Treg (CD4+ Foxp3+)의 백분율의 정량화를 나타낸다(B).
도 6은 확립된 종양의 박멸에 대한 항-CD25-m2a 및 항-PD-1 조합 결과의 상승 효과를 도시한다. 개별 마우스의 성장 곡선(A) 및 시간 경과에 따른 각 처리 그룹에 대한 MCA205 종양 용적의 평균(B)이 도시되어 있다. 100일 후 종양 부재 생존자의 수 또는 통계적 유의성이 각 그래프에 표시된다. 오차 막대는 평균의 SE를 나타낸다. 두 개의 개별 실험의 누적 데이터와 함께 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선이 또한 도시되어 있다. MC38 (C) 또는 CT26 (D) 종양 세포를 주사하고 MCA205 모델 (조건 당 n = 10)에 기재된 바와 같이 처리된 마우스의 생존 곡선을 또한 도시된다. 마우스에게 5 x 105 MCA205, MC38 또는 CT26 세포를 피하 주사한 다음, 5일째에 지시된 항-CD25 (200μg i.p.)로 처리한 후 항 PD-1(αPD-1, 항-PD1, 클론 RMP1-14; 100μg i.p.)을 6, 9 및 12일째에 투여하였다(또는 투여하지 않았다). 종양 크기를 1주일에 2회 측정하였고, 임의의 직교 직경이 150mm에 이르면 마우스를 안락사시켰다.
도 7은 14일째에 수거된 면역 세포를 사용하여 도 6에 기재된 바와 같이 확립된 MCA205 종양 모델의 기능적 분석을 도시한다. MCA205 종양에서 종양 침윤성 CD4+Foxp3- 및 CD8+ T 세포에서의 Ki67+ 세포의 비율(%)(A) 및 종양에서 CD4-양성, FoxP3-음성 Teff/Treg 비 및 CD8 양성/Treg 비(B)가 각 치료군에 대해 도시된다. PMA와 이오노마이신에 의한 생체외 재자극 후 IFNg 발현에 대한 종양 침윤성 림프구의 세포내 염색(C) 및 인터페론 감마(IFNγ) 생성 에펙터 T 세포의 빈도(D)도 또한 CD4-양성 및 CD8-양성 세포에서 동일한 치료군에 대해 도시된다. (B)의 히스토그램은 치료 그룹당 대표적 마우스에 상응한다. 2개의 별도의 실험(n= 10) 및 통계적 유의성의 대표적인 플롯은 (A), (B) 및 (D)에 제공된다.
도 8은 항-CD25-m2a/항-PD1에 의한 종양 제거가 CD8+ T 세포 의존적임을 도시한다. 처리되지 않은(tx 없음, A), 항-CD25-m2a와 항-PD-1의 조합(αPD-1 + αCD25-m2a; B) 또는 항-CD8을 추가로 포함하는 동일 조합(αPD-1 + αCD25-m2a + αCD8; C)으로 처리된 개별 마우스의 MCA205 종양 성장 곡선. 각 치료군(n = 7)에 대한 40일 후의 생존자 수는 각 그래프에 표시된다. 상응하는 카플란-마이어 생존 곡선도 생성되었다(D). 마우스에 5 x 105 MCA205 세포를 피하 주사하고, 5일째에 200μg의 항-CD25-m2a(αCD25-m2a, 클론 PC61, 마우스 IgG2a 아이소타입)로 처리한 후, 6, 9 및 12일째에 100μg의 항-PD-1(αPD-1, 클론 RMP1-14)로 복강내 처리했다. 지시된 마우스 그룹에서, CD8-양성 세포는 200㎍의 항-CD8(αCD8, 클론 2.43)을 4, 9, 12, 17일째에 복강내 주사하여 고갈시켰다. 종양 크기는 1주일에 두 번 측정하였고, 임의의 직교 직경이 150mm에 이르면 마우스를 안락사시켰다.
도 9는 항-CD25-m2a/항-PD-1요법이 B16 흑색종 종양에 대한 적어도 부분적 종양 억제를 유도함을 도시한다. 도 6a에서 정의된 바와 같이, Gvax 단독 또는 지시된 항체와 조합하여 처리된 개별 마우스의 B16 종양 성장 곡선. 상응하는 카플란-마이어 생존 곡선도 생성되었다(B). 마우스에게 5 x 104 B16 흑색종 세포를 피내 주사한 다음, 5일째에 200㎍의 항-CD25(αCD25-r1, 클론 PC61 랫트 IgG1 아이소타입 또는 αCD25-m2a, 클론 PC61 마우스 IgG2a 아이소타입)로 처리한 후, 6, 9 및 12일째 200μg의 항-PD-1(αPD-1, 클론 RMP1-14) ip 및 1 x 106 조사된 (150 Gy) B16-Gvax i.d. 처리했다. 종양의 성장을 추적하고, 어느 것이 먼저이든지 간에 임의의 직교 직경이 150mm에 도달하거나 연구 80일째 중 마우스를 안락사시켰다. 상이한 군(n, 마우스의 수)에 대한 평균 생존일은 다음과 같았다: Gvax 단독(n = 14)의 경우 21일, Gvax + αCDD-1 (n = 15)의 경우 27일, Gvax + αCD25-r1 (n = 7)의 경우 21일, Gvax + αCD25-m2a (n = 8)의 경우 33일, Gvax +αPD-1 + αCD25-r1 (n = 13)의 경우 29일 및 Gvax + αPD-1 + αCD25-m2a (n = 12)의 경우 39일.
도 10은 처리되지 않거나(PBS, 비히클만), IgG1(PC61m1; 따라서 낮은 Fc 수용체 매개 살상 활성, 낮은 ADCC 및 CDC 활성을 갖는 마우스 IgG1 아이소타입) 또는 IgG2a(PC61m2; 따라서 높은 Fc 수용체 매개 활성, 높은 ADCC 및 CDC 활성을 갖는 마우스 IgG2a)를 갖고, 항-마우스 PD1(αPD1 RMP1-14)과 추가로 결합되거나 결합되지 않은 항-마우스 CD25로 처리된 개별 마우스의 CT26 종양 성장 곡선을 도시한다. 이식을 위해 사용된 CT26 세포를 로그 상 성장 동안 수거하고 차가운 PBS에 재현탁시켰다. 연구 1일째에, 각 마우스는 0.1mL 세포 현탁액에서 3 X 105 세포를 오른쪽 옆구리에 피하 주사했다. 항-마우스 CD25를 6일째(촉지할 수 있는 종양이 검출되었을 때) 복강내(10mg/kg) 주사했다. 항-마우스 PD1을 7일째, 10일째, 14일째 및 17일째에 복강내(100㎍/주사) 주사했다. 종양을 성장을 모니터랑하기 위해 매주 2회 2차원에서 캘리퍼링하였다. 종양 크기(mm3)는 다음과 같이 계산하였다: 종양 용적 = (w2 x l)/2, 여기서 w = 폭 및 l = 종양의 길이(mm). 연구 종점은 어느 것이 먼저이든지 간에 2000mm3 의 종양 용적 또는 60일이었다.
도 11은 처리되지 않거나(PBS, 비히클만), IgG1 또는 IgG2a(각각 PC61m1 및 PC61m2)를 갖고, 항-마우스 PD-L1 클론 10F.9G2 (aPDL110F.9G2)와 추가로 결합되거나 결합되지 않은 항-마우스 CD25로 처리된 개별 마우스의 CT26 종양 성장 곡선을 도시한다. 도 10의 αPD1-기반 조합 실험에 대한 모델, 섭생 및 분석을 수행하였다.
도 12는 도 10의 CT26 종양 모델에 대해 기재된 바와 같이, 처리되지 않거나(PBS, 비히클만), IgG1 또는 IgG2a(각각 PC61m1 및 PC61m2)를 갖고, 항-마우스 PD-1 클론 RMP1-14 (aPD1 RMP1-14)와 추가로 결합되거나 결합되지 않은 항-마우스 CD25로 처리된 개별 마우스의 MC38 종양 성장 곡선을 도시한다. 이식에 사용된 MC38 결장 암종 세포를 로그 상 성장 중에 수거하고 차가운 PBS에 재현탁시켰다. 각 마우스는 0.1mL 세포 현탁액에서 5 X 105 종양 세포를 오른쪽 옆구리에 피하 주사했다. 종양의 용적이 100 내지 150mm3의 표적 범위에 접근함에 따라 종양을 모니터링했다. 종양 이식 후 22일째, 연구 1일째에 63 내지 196mm3 범위의 개별 종양 용적을 가진 동물을 104 내지 108mm3 범위의 그룹 평균 종양 용적을 갖는 9개의 그룹(n = 10)으로 분류하였다. 치료는 확립된 MC38 종양을 갖는 마우스의 D1에 대해 개시했다. 각 치료의 효과를 1일, 2일, 5일, 9일 및 12일째에 PBS를 복강내(i.p.) 투여받은 비히클 처리 대조군과 비교했다. 항-PD1을 2일째에 시작하여 2주 동안 1주일에 2번 100㎍/동물로 복강내 투여했다. PC61-m1 및 PC61-m2a를 1일째에 200㎍/동물로 1회 복강내 투여했다. 종양 용적 종말점이 1000mm3에 도달시 개별 동물이 연구를 종료하면서 종양 측정을 45일까지 매주 2회 실시하였다.
도 13은 처리되지 않거나(PBS, 비히클만), IgG1 또는 IgG2a(각각 PC61m1 및 PC61m2)를 갖고, 항-마우스 PD-L1 클론 10F.9G2 (aPDL110F.9G2)와 추가로 결합되거나 결합되지 않은 항-마우스 CD25로 처리된 개별 마우스의 MC38 종양 성장 곡선을 도시한다. 도 12의 αPD1-기반 조합 실험에 대한 모델, 섭생 및 분석을 수행하였다.
도 14는 특유의 유형의 인간 암으로부터의 샘플에서 종양 국소화 면역 세포의 주변에서 CD25 발현을 도시한다. 대표적인 히스토그램은 단계 IV 인간 난소 암종(복막 전이; A)의 TIL 서브세트 및 인간 방광암(B)에서 CD25 발현을 입증한다. 대표적인 히스토그램은 또한 다른 유형의 암(C)으로부터 단리된 PBMC 및 TIL 내의 개별적인 CD8-양성, CD4-양성, FoxP3-음성 및 CD4-양성, FoxP3-양성 T 세포 서브세트에 대해 수득하였다. CD25 발현을 흑색종(상부 패널), NSCLC(중간 패널) 및 RCC(하부 패널)에 대한 각각의 연구된 환자 코호트내 개별 T 세포 서브세트에 대한 백분율(%) 및 평균 형광 강도(MFI)로서 CD25 발현의 정량화가 또한 도시된다(D).
도 15는 6주째에 요법(B; 40배 고전력 장 당 평균 계수가 표시된다)에 반응하는 한 명 및 반응하지 않는 한 명의 두 환자에서 기준선 및 6주째에 CD8 및 FoxP3 IHC 염색의 정량화와 병행하여 나타낸, 항-PD-1 요법("기준선") 전 및 2회 주입 후('주 6')에 피하 흑색종 전이의 항-PD-1 다중 면역조직화학적(IHC) 분석으로 처리된 환자에서 CD25 발현에 대한 데이터를 도시한다. 항-PD1으로 처리된 흑색종 및 RCC 환자에 대해 기준선 및 요법시(6주째) CD8-양성, CD25-양성 및 FoxP3-양성, CD25-양성, 이중 염색 세포의 백분율(%)이 도시된다(C).
도 16은 모두 인간 IgG1 아이소타입을 갖고 특정 아미노산(PC61-IgG1의 경우 K409R, S70-IgG1의 경우 F405L; A)에서 돌연변이된 항-마우스 CD25 (PC61) 및 항-마우스/인간 PD-L1 (클론 S70)의 항원 결합 영역을 사용하여 생성된 이중특이적 항-IgG1-, 항-PD-L1-기반 듀오바디(bs CD25/PD-L1)의 구조 및 결합 활성을 도시한다. CD25에 대한 bs CD25/PD-L1의 특이성은 마우스 CD25 (CD25+ 세포주) 또는 마우스 PD-L1 (PD-L1+ 세포주)을 발현시키는 벡터로 형질감염된 세포주(SUP-T1 세포, 인간 T 림프아세포, SUP-T1 [VB] ATCC® CRL-1942?)를 사용하여 시험되었다. 최초의 세포주 및 다른 2개의 생성되는 세포주는 bs CD25/PD-L1의 결합 능력을 관련 단일특이적 항체(aCD25, 클론 PC61; aPD-L1, 클론 S70)의 결합과 비교하는데 사용되었다. CD25+ 세포주와 PD-L1+ 세포주는 서로 1:1의 비율로 혼합하고 (또는 각각 형질감염되지 않은 대조군 세포와 별도로), 이어서 bs CD25/PD-L1, aCD25, aPD-L1과 항체 또는 임의의 항체 없이(항체 부재) 30분간 배양하였다. 배양 후, 세포 샘플의 세 그룹을 다른 세포 샘플(B)에서 이중 양성 세포의 백분율을 계산하기 위해 유동 세포 계측법으로 분석된다. bs CD25/PD-L1(BsAb)의 특이성은 CD25+ 세포주와 PD-L1+ 세포주를 별도로 사용하여 확인되었다. 각 세포주는 1차 항체로서 bs CD25/PDL1 또는 각각의 단일특이적 Ab(MsAb, CD25+ 세포에 대한 항-마우스 CD25 IgG1 및 PD-L1+ 세포에 대한 항-마우스 PD-L1)를 사용하거나 완충제만을 사용하여 표지되었다. 이어서, 세포를 30분 동안 FACS 완충액 중 2차 항체로서 인간 AF647(aHuman) 및 정치 가능한 생존 염료로 배양하였다. 2차 항체만(aHuman AF647)으로 배양되거나 1차 항체도 2차 항체도 사용하지 않고 배양된(염색되지 않음) 세포가 음성 대조군으로 사용된다. 이어서, 세포를 유동 세포 계측법으로 분석하여 MsAb와 비교하여 BsAb로 수득된 양성 세포의 백분율을 계산한다(각 패널의 오른쪽에 표시됨; C).
도 17은 개별적으로 또는 함께 혼합된 이중특이적 IgG1-기재 듀오바디(Bs CD25 PD-L1), 항-마우스 CD25(aCD25) IgG1 및 항-마우스 PD-L1(aPD-L1) IgG1 단일특이적 항체(aCD25&aPD-L1), 또는 도 16에 기재된 바와 같은 아이소타입 IgG1 대조군의 MCA205 종양 마우스 모델(도 3에 기재된 바와 같이 확립됨; 각 그룹에 대해 4 내지 5마리의 마우스 포함)에서 LN 및 종양의 효과기 및 조절 T 세포에 대한 영향을 도시한다. 종양 침윤성 림프구(TIL) 또는 림프절 세포(LN)를 단리하기 위해 사용된 샘플을 분리하고, Foxp3, CD3 및 CD4 양성(A) 또는 CD8 양성/Treg (FoxP3-양성, CD4-양성)의 비율(B)에 기초하여 각 처리 그룹에서 효과기 및 조절 T 세포의 존재에 대해 분석하였다. 자극에 반응하는 종양 침윤성 CD4-양성 T 세포의 능력에 대한 각 치료의 생체내 효과도 또한 평가되었다. TIL은 골지 플러그 단백질 억제제의 존재하에서 PMA와 이오노마이신을 사용하여 시험관내에서 재자극한 다음, CD5와 CD4에 대해 세포외로 및 인터페론-γ(IFNg)의 고정 후 세포내로 염색했다. IFNg에 양성인 CD5-양성 및 CD4-양성 T 세포의 백분율은 유동 세포 계측법으로 분석하였다(C).
본 발명의 항-인간 CD25 항체 및 암을 치료하는 방법, 약제학적 조성물, 다른 항암 화합물과의 조합에서, 이중특이적 항체에서 이들의 사용의 추가의 정의를 포함하여 본 발명의 추가의 목적은 상세한 설명 및 실시예에 제공된다.
본 발명은 CD25에 결합하는 항체를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여 대상체에서 암, 특히 고형 종양을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하고, 이에 의해 항-CD25 항체는 특히 종양 내에서 조절 T 세포를 효율적으로 고갈시키도록 하는 구조적 요소를 특징으로 한다.
본 발명은 또한 암, 특히 고형 종양을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 본 발명에 정의된 바와 같은 CD25에 결합하는 항체를 제공한다.
대안적으로, 본 발명은 암, 특히 고형 종양을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조를 위해 조절 T 세포를 효율적으로 고갈시키도록 하는 CD25에 결합하는 항체의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 암, 특히 고형 종양을 치료 또는 예방하는 데 있어서, 조절 T 세포를 효율적으로 고갈시키도록 하는 CD25에 결합하는 항체의 용도를 제공한다.
본 발명은 고갈형 아이소타입(PC61의 경우 마우스 IgG2, 인간의 IgG1과 등가)에 대한 항-CD25 항체의 아이소타입(랫트 항-마우스 CD25 항체 PC61에 의해 예시됨)을 스위칭하여 고형 종양 맥락에서 조절 T 세포의 고갈을 개선시키는 방법을 개시한다. 또한, 본 발명자들은 CD25가 치료 맥락에서, 예를 들면, 확립된 고형 종양에서 조절 T 세포의 고갈을 위해 표적화될 수 있고, CD25가 조절 T 세포에서 우선적으로 발현된다는 것을 처음으로 발견했다. 본 발명자들은 활성적 Fc 감마 수용체에 대한 결합이 강화된 조작된 항-CD25 항체가, 예를 들면, 다른 암 표적화 화합물, 면역 체크포인트 단백질, 종양 관련 항원 또는 억제성 Fcγ 수용체를 표적화하는 것들과 관련될(이중특이적 항체와 함께 또는 이내) 수 있는 치료적 접근법인 종양 침윤성 조절 T 세포의 효과적인 고갈을 유도한다는 것을 발견했다.
본 발명자들은 또한 억제성 Fc 감마 수용체 IIb는 종양 부위에서 상향조절되어 원래의 항-마우스 CD25 항체 PC61에 의한 효과적인 종양내 조절 T 세포 고갈을 방지한다는 것을 처음으로 발견했다. 이와 같이, 본 발명은 CD25 및 Fc 감마 수용체 IIb를 표적화하는 단계를 포함하는 조합 접근법을 포함하는 치료적 적용을 포함한다.
CD25는 IL-2 수용체의 알파 쇄이고, 활성화 T 세포, 조절 T 세포, 활성화 B 세포, 일부 흉선 세포, 골수 전구체 및 희소돌기아교세포 상에서 발견된다. CD25는 CD122 및 CD132와 결합하여 IL-2에 대한 고친화도 수용체로서 작용하는 헤테로삼량체성 복합체를 형성한다. 인간 CD25의 컨센서스 서열은 서열번호 1로 이하 제시된다(Uniprot 수탁 번호 P01589; 아미노산 22-240에 상응하는 성숙한 인간 CD25의 세포외 도메인은 밑줄이 그어져 있고, 서열번호 2에 제시된다):
Figure pat00001
본원에 사용된 "CD25에 결합하는 항체"는 IL-2 수용체의 CD25 서브유닛에 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 이 서브유닛은 IL-2 수용체의 알파 서브유닛으로도 공지되어 있다. 이러한 항체는 또한 본원에서 "항-CD25 항체"로서 지칭된다.
항-CD25 항체는 IL-2 수용체의 CD25서브유닛(항원)에 특이적 결합할 수 있는 항체이다. "특이적 결합", "특이적으로 결합하다" 및 "특이적으로 결합하다"는 항체가 목적하는 항원에 대해 약10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M 또는 10-12 M 미만의 해리 상수(Kd)를 갖는다는 것을 의미하는 것으로 이해할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 해리 상수는 10-8 M 미만, 예를 들면, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M 또는 10-12 M의 범위이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 항원 결합 부위를 포함하는 손상되지 않은 면역글로불린 분자 및 이의 단편을 모두 지칭하며, 키메라 항체, 인간화 항체, 헤테로접합체 및/또는 다중특이적 항체(예: 이중특이적 항체, 디아바디, 트리바디 및 테트라바디)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 폴리클로날, 모노클로날, 유전자 조작 및 달리 변형된 형태의 항체, 및, 예를 들면, Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rlgG, 폴리펩티드-Fc 융합, 단일 쇄 변이체(scFv 단편, VHH, Trans-bodies®, Affibodies®, 상어 단일 도메인 항체, 단일 쇄 또는 탠덤 디아바디(TandAb®), VHH, Anticalins®, Nanobodies®, 미니바디, BiTE®, 바이사이클릭 펩티드 및 기타 대안적인 면역글로불린 단백질 스캐폴드)를 포함하는 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 자연 발생적으로 생산되는 경우 가질 수 있는 공유 결합 변형(예: 글리칸의 부착)이 결여될 수 있다.
일부 구현예에서, 항체는 공유 결합 변형(예: 글리칸, 검출 가능한 잔기, 치료 잔기, 촉매 잔기, 또는 항체의 개선된 안정성 또는 투여를 제공하는 다른 화학적 그룹, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜)을 함유할 수 있다. "항체"는 또한 낙타과 항체(중쇄 단독 항체) 및 안티카린과 같은 항체 유사 분자를 의미할 수 있다(참조: Skerra (2008) FEBS J 275, 2677-83).
일부 구현예에서, 항체는 각각 단일 항체 서열과 결합하고 항원(예: 상이한 참조 항-인간 CD25 항체와 결합되는 인간 CD25 세포외 도메인 내의 상이한 에피토프) 내의 다소 상이한 에피토프를 결합시키는 항체 패널로서 생성되는 폴리클로날 또는 올리고클로날이다. 폴리클로날 또는 올리고클로날 항체는 문헌(참조: Kearns JD et al., 2015. Mol Cancer Ther.14:1625-36)에 기재된 바와 같이 의학적 용도를 위한 단일 제제로 제공될 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 항체는 모노클로날이다. 항체는 추가로 또는 대안적으로 인간화되거나 인간일 수 있다. 추가의 측면에서, 항체는 인간 또는 임의의 경우에 인간 대상체에서 그의 사용 및 투여를 허용하는 포맷 및 특징을 갖는 항체이다.
항체(Ab) 및 면역글로불린(Ig)은 동일한 구조적 특성을 갖는 당단백질이다. 면역글로불린은 IgA, IgD, IgG, IgE 또는 IgM과 같은 임의의 부류로부터 유래될 수 있다. 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4와 같은 임의의 서브클래스일 수 있다. 본 발명의 바람직한 국면에서, 항-CD25 항체는 IgG 부류, 바람직하게는 IgG1 서브클래스로부터 유래된다. 하나의 측면에서, 항-CD25 항체는 인간 IgG1 서브클래스로부터 유래된다.
IgG 항체의 Fc 영역은 다수의 세포 Fcγ 수용체(FcγR)와 상호작용하여 하류 효과기 기전을 자극하고 조절한다. 5개의 활성화 수용체, 즉 FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32a), FcγRIIc (CD32c), FcγRIIIa (CD16a) 및 FcγRIIIb (CD16b), 및 1개의 억제성 수용체 FcγRIIb (CD32b)가 존재한다. IgG 항체와 면역계의 통신은 항체에 의해 감지되고 수집된 정보를 면역계로 전달하여 선천 면역계와 적응 면역계 사이에 연결을, 특히 생물치료제의 맥락에서 제공하는 FcγR에 의해 조절되고 매개된다(참조: Hayes J et al., 2016. J Inflamm Res 9: 209-219).
IgG 서브클래스는 FcγR에 결합하는 능력이 다르고, 이 차별적인 결합은 기능적 반응의 범위를 유도하는 능력을 결정한다. 예를 들면, 인간에서 FcγRIIIa는 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)의 활성화에 관여하는 주요 수용체이고, IgG1에 의해 밀접하게 이어지는 IgG3은 이 수용체에 대한 최고 친화도를 나타내어 ADCC를 강력하게 유도하는 능력을 반영한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 항체는 FcγR와 고친화도로, 바람직하게는 활성화 수용체에 고친화도로 결합한다. 바람직하게는, 항체는 고친화도로 FcγRI 및/또는 FcγRIIa 및/또는 FcγRIIIa에 결합한다. 특별한 구현예에서, 항체는 약 10-6M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만의 해리 상수로 FcγR에 결합한다.
하나의 측면에서, 항체는 IgG1 항체, 바람직하게는 적어도 하나의 Fc 활성화 수용체에 결합할 수 있는 인간 IgG1 항체이다. 예를 들면, 항체는 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIIa 및 FcγRIIIb로부터 선택된 하나 이상의 수용체에 결합할 수 있다. 하나의 측면에서, 항체는 FcγRIIIa에 결합할 수 있다. 하나의 측면에서, 항체는 FcγRIIIa 및 FcγRIIa 및 임의로 FcγRI에 결합할 수 있다. 하나의 측면에서, 항체는 이러한 수용체에 고친화도로, 예를 들면, 약 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만의 해리 상수로 결합할 수 있다.
하나의 측면에서, 항체는 억제성 수용체, FcγRIIb에 저친화도로 결합한다. 하나의 측면에서, 항체는 10-7 M 이상, 10-6M 이상 또는 10-5M 이상의 해리 상수로 FcγRIIb에 결합한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 항-인간 CD25 항체는 인간 IgG1 서브클래스로부터 유래되고, 바람직하게는, 본원에 논의된 바와 같이, 특히 인간 기원의 세포와 관련하여 ADCC 및/또는 ADCP 활성을 갖는다. 실제로, 이전에 기재된 바와 같이(참조: Nimmerjahn F et al., 2005. Science, 310:1510-2), mIgG2a 아이소타입(인간 IgG1 아이소타입에 상응함)은 적어도 1보다 우수한 높은 활성적 대 억제성 비율(A/I)로 FcγR 아형에 결합한다. 대조적으로, 다른 아이소타입(예: rIgG1 아이소타입)은 억제성 FcγRIIb뿐만 아니라 단일 활성 FcγR 단독(FcγRIII)에 유사한 친화도로 결합하여 낮은 A/I 비율(<1)을 초래한다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 이 낮은 A/I 비율은 낮은 종양내 Treg 고갈 및 아이소타입의 낮은 항종양 치료 활성과 상관관계가 있다.
바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항-CD25 항체는 바람직하게는 고친화도로 인간 CD25에 결합한다. 더욱 바람직하게는, 항-CD25 항체는 상기 나타낸 바와 같이, 인간 CD25의 세포외 영역에 결합한다. 하나의 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항-CD25 항체를 제공한다. 특히, 실시예는 PC-61.5.3 하이브리도마에 의해 분비되고 일반적으로 PC61 또는 PC-61로 식별되는 항체로 생성된 실험 데이터를 제공한다. 실시예에 개시된 것들(PC61의 CD25-결합 도메인을 포함하는 재조합 항체 포함)과 함께 문헌(예를 들면, Setiady Y et al., 2010. Eur. J. Immunol. 40:780-6; McNeill A et al., 2007. Scand J Immunol. 65:63-9; Teege S et al., 2015, Sci Rep 5: 8959)에서 PC-61 및 마우스 CD25를 포함하는 검정은 실시예에 기재된 바와 같이 적합한 아이소타입이 관련되는 경우, CD25(특히, IL-2 결합을 차단시킴으로써) 및 Fcγ 수용체(특히, 바람직하게는 인간 활성화 Fcγ 수용체를 결합시키고 효율적으로 조절 T 세포를 고갈시킴으로써)와의 상호작용 수준 모두에서 PC61의 동일한 기능적 특징을 갖는 인간 CD25를 인식하는 인간 항체를 특성화하기 위해 적용될 수 있다. 적합한 방법은 본원에 기재된 바와 같은 항체의 필요한 기능적 특성을 달성하기 위해 당업자에게 공지될 것이다.
바람직한 구현예에서, 암을 갖는 인간 대상체를 치료하는 방법은 대상체에게 항-CD25 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 대상체는 바람직하게는 고형 종양을 갖고, 상기 항-CD25 항체는 바람직하게는 FcγRI (CD64), FcγRIIc (CD32c) 및 FcγRIIIa (CD16a)로부터 선택된 적어도 하나의 활성화 Fcγ 수용체 수용체에 고친화도로 결합하고 종양 침윤성 조절 T 세포를 고갈시키는 인간 IgG1 항체이다. 바람직하게는, 항-CD25 항체는 CD25에 대해 10-8 M 미만의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 보다 바람직하게는, 항-CD25 항체는 인간 CD25에 결합하여 마우스 CD25의 것들과 유사한 IL-2 결합 및 Treg 고갈에 대한 효과를 제공한다. 추가의 구현예에서, 항-CD25 항체는 1보다 우수한 활성적 대 억제성 비율(A/I)로 Fcγ 수용체에 결합하고 또는 FcγRIIb (CD32b)에 결합하는 것보다 큰 친화도로 FcγRI (CD64), FcγRIIc (CD32c), FcγRIIIa (CD16a)에 결합한다.
PC-61 항체의 CD25 결합 도메인은 클로닝되고 적절한 불변 영역과 융합된 재조합 단백질로서 발현된다. PC-61 항체의 CD25 결합 도메인의 서열 뿐만 아니라 CD25의 세포외 도메인 내의 별개의 에피토프에 대한 이의 특이성 및/또는 이의 다른 기능적 활성은 임의의 적합한 기술에 의해(예: CD25-면역화된 설치류의 하이브리도마의 패널을 상승시키거나 재조합 항체의 라이브러리를 생성시킨 다음, 이들 항체 레퍼토리를 본원에 기재된 바와 같이 기능적으로 특성화하기 위한 CD25 단편으로 스크리닝함으로써) 생성되고 스크리닝되는 후보 항-CD25 항체를 비교하는 데 사용될 수 있다. 결과적으로 동정된 항-CD25 항체는 또한 재조합 항체로서, 특히 완전 항체로서 또는 본원에 기재된 단편 또는 변이체로서 생성될 수 있다.
천연 항체 및 면역글로불린은 일반적으로 두 개의 동일한 경(L)쇄 및 두 개의 동일한 중(H)쇄로 구성된 약 150,000달톤의 헤테로사량체성 당단백질이다. 각각의 중쇄는 아미노 말단에 가변 도메인(VH)에 이어 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 아미노 말단에 가변 도메인(VL) 및 카복시 말단에 불변 도메인을 갖는다.
가변 영역은 구조적으로 상보성인 항원 표적과 상호작용할 수 있고, 상이한 항원 특이성을 갖는 항체와 아미노산 서열의 차이를 특징으로 한다. H 또는 L 쇄 중 어느 하나의 가변 영역은 항원 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열을 함유한다. 이 서열 내에는 상이한 특이성의 항체 사이의 극단적인 다양성 때문에 "초가변"이라 불리는 더 작은 서열이 있다. 이러한 초가변 영역은 또한 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 영역으로 지칭된다.
이들 CDR 영역은 특정 항원 결정기 구조에 대한 항체의 기본적인 특이성을 설명한다. CDR은 가변 영역 내에서 인접하지 않은 아미노산의 스트레치를 나타내지만, 종에 관계없이, 가변 중쇄 및 경쇄 영역 내의 이들 중요한 아미노산 서열의 위치는 가변 쇄의 아미노산 서열 내에 유사한 위치를 갖는 것으로 밝혀졌다. 모든 항체의 가변 중쇄 및 경쇄는 각각 경(L)쇄 및 중(H)쇄에 대해 각각 다른 것(L1, L2, L3, H1, H2, H3이라 지칭됨)과 불연속적인 3개의 CDR 영역을 갖는다. 허용된 CDR 영역은 이전에 기재되어 있다(참조: Kabat et al., 1977, J Biol Chem 252, 6609-6616).
본 발명의 항체는 보체 의존성 세포독성(CDC) 및/또는 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 및/또는 항체 의존성 세포 매개 식균 작용(ADCP)뿐만 아니라, 표적화, 증식 차단 및/또는 Treg 세포의 고갈을 허용하는 임의의 다른 기전을 통해 기능할 수 있다.
"보체 의존성 세포독성"(CDC)은 보체의 존재하에 본 발명의 항체에 의한 항원-발현 세포의 용해를 의미한다.
"항체 의존성 세포 매개 세포독성"(ADCC)은 Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예: 자연 살해(NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합 항체를 인식하여 표적 세포의 용해를 유도하는 세포 매개 반응을 의미한다.
"항체 의존성 세포 매개 식균 작용"(ADCP)은 Fc 수용체(FcR)를 발현하는 식세포(예: 대식세포)가 표적 세포 상의 결합 항체를 인식하여 표적 세포의 식균 작용을 일으키는 세포 매개 반응을 의미한다.
CDC, ADCC 및 ADCP는 당업계에 공지되고 이용 가능한 검정을 사용하여 측정 될 수 있다(참조: Clynes et al., (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-6). 항체의 불변 영역은 항체가 보체를 고착시키고 세포 의존성 세포독성 및 식균 작용을 중재하는 능력에 중요하다. 따라서, 본원에서 논의된 바와 같이, 항체의 아이소타입은 항체가 세포독성/식균 작용을 매개하는 것이 바람직한지의 여부에 기초하여 선택될 수 있다.
본원에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 구현예에서, Treg 세포의 고갈을 유도하는항-CD25 항체가 사용된다. 예를 들면, 강한 CDC 반응 및/또는 강한 ADCC 및/또는 강한 ADCP 반응을 유도하는 항-CD25 항체가 사용될 수 있다. CDC, ADCC 및/또는 ADCP를 증가시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, CDC 반응은 C1q 결합의 친화도를 증가시키는 항체의 돌연변이로 증가될 수 있다(참조: ldusogie et al., (2001) J lmmunol 166, 2571-5).
ADCC는, 예를 들면, YB2/0 세포주에서 항체의 생산에 의해 또는 인간 IgG1의 Fc 부분에 특정 돌연변이의 도입을 통해 항체 글리칸으로부터 푸코스 잔기를 제거하는 방법(예: S298A/E333A/K334A, S239D/I332E/A330L, G236A/S239D/A330L/I332E)(참조: Lazar et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103, 2005-2010, Smith et al., (2012) Proc Natl Acad Sci USA 109, 6181-6)에 의해 증가될 수 있다. ADCP는 또한 인간 IgG1의 Fc 부분에 특정 돌연변이의 도입에 의해 증가 될 수 있다(참조: Richards et al., (2008) Mol Cancer Ther 7, 2517-27).
본 발명의 바람직한 구현예에서, 항체는 ADCC 반응을 유도하도록, 즉 ADCC 반응이 다른 항-CD25 항체 또는 비변형 항-CD25 모노클로날 항체 예와 비교하여 향상되거나, 증가되거나 개선되도록 최적화된다.
본원에 사용된 "키메라 항체"는 랫트 또는 마우스 항체와 같은 한 종의 면역글로불린 및 인간 항체와 같은 다른 종의 면역글로불린 불변 영역으로부터 유도된 가변 서열을 갖는 항체를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 키메라 항체는 ADCC를 유도하기 위해 강화된 불변 영역을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 또한 부분적으로 또는 전체적으로 합성적일 수 있고, 여기서 항체의 폴리펩티드 쇄의 적어도 일부는 합성되고, 가능하게는 그들의 동족 항원에 대한 결합을 위해 최적화된다. 이러한 항체는 키메라 또는 인간화 항체일 수 있고, 구조가 완전히 사량체일 수 있거나, 또는 이량체일 수 있고, 단지 단일 중쇄 및 단일 경쇄를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 모노클로날 항체일 수 있다. 본원에 사용된 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생성된 항체에 국한되지 않는다. 용어 "모노클로날 항체"는 생산 방법이 아니라 임의의 진핵 세포, 원핵 세포 또는 파지 클론을 포함하여 단일 클론에서 유래된 항체를 의미한다.
본 발명의 항체는 또한 인간 항체일 수 있다. 본원에 사용된 "인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 모두가 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 의미한다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 불변 영역은 또한 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유도된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열(예: 생체내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 특성을 나타내는 항-CD25 항체는 본 발명의 추가의 목적을 나타낸다. 추가의 구현예에서, 본 발명은 본원에서 정의된 바와 같은 항-CD25 항체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 일부 구현예에서, 이러한 제공된 핵산 분자는 코돈 최적화된 핵산 서열을 함유할 수 있고, 또는 예를 들면, 박테리아, 효모, 곤충, 물고기, 뮤린, 유인원 또는 인간 세포와 같은 숙주 세포에서의 발현을 위한 적절한 핵산 벡터 내의 발현 카세트에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 목적하는 항체를 발현하는 이종 핵산 분자(예: DNA 벡터)를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 단리된 항-CD25 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 핵산(예: 벡터를 통해 숙주 세포를 포함할 수 있고, 또는 숙주 세포에 전달될 수 있는 이종 핵산)을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 숙주 세포 (및/또는 이종 핵산 서열)는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 숙주 세포로부터 분비되고 세포 배양 상청액으로부터 단리되도록 배열되고 작제된다.
본 발명의 항체는 단일특이적, 이중특이적 또는 다중특이적일 수 있다. "다중특이적 항체"는 하나의 표적 항원 또는 폴리펩티드의 상이한 에피토프에 대해 특이적일 수 있거나, 하나 이상의 표적 항원 또는 폴리펩티드에 특이적인 항원-결합 도메인을 함유할 수 있다(참조: Kufer et al., (2004) Trends Biotechnol 22, 238-44).
본 발명의 한 측면에서, 항체는 단일특이적 항체이다. 하기에 추가로 논의된 바와 같이, 대안적인 측면에서, 항체는 이중특이적 항체이다.
본원에 사용된 "이중특이적 항체"는 단일 항원 또는 폴리펩티드, 또는 2개의 상이한 항원 또는 폴리펩티드 상의 2개의 별개의 에피토프에 결합하는 능력을 갖는 항체를 지칭한다.
본원에서 논의된 바와 같은 본 발명의 이중특이적 항체는 체세포 혼성화와 같은 생물학적 방법; 또는 세포주 또는 유기체에서 목적하는 항체 구조를 코딩하는 비-천연 DNA 서열의 발현과 같은 유전적 방법; 화학적 방법(예: 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 결합 또는 다른 항체 또는 항체 단편과 같은 하나 이상의 분자 본체에 의한); 또는 이들의 조합을 통해 생성될 수 있다.
단일특이성 또는 이중특이성을 생성할 수 있는 기술 및 생성물은 문헌에서 광범위하게 검토된 바와 같이, 또한 대안적인 포맷, 항체-약물 접합체, 항체 디자인 방법, 시험관내 스크리닝 방법, 불변 영역, 번역 후 및 화학적 변형, Fc 공학과 같은 암 세포사를 유발하기 위한 개선된 특징과 관련하여 당업계에 공지되어 있다(참조: Tiller K and Tessier P, 2015 Annu Rev Biomed Eng. 17: 191-216; Speiss C et al., 2015. Molecular Immunology 67: 95-106; Weiner G, 2015. Nat Rev Cancer, 15: 361-370, Fan G et al., 2015. J Hematol Oncol 8 :130).
본원에 사용된 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 항체가 결합하는 항원 상의 부위를 의미한다. 당업계에 익히 공지된 바와 같이, 에피토프는 연속 아미노산(선형 에피토프) 또는 단백질의 3중 중첩에 의해 병치되는 비연속적 아미노산(형태 에피토프) 모두로부터 형성될 수 있다. 연속 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출시 유지되지만, 3중 중첩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매로 처리시 손실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간 형태에 적어도 3개, 보다 일반적으로 적어도 5 또는 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간 형태를 결정하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있고, 예를 들면, x-선 결정학 및 2-D 핵자기 공명을 포함한다. 예를 들어, 문헌[참조: Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996)]을 참조한다.
일부 구현예에서, 항-CD25 항체는 특히 암 치료 또는 진단을 위한 치료제 또는 진단 제제와 같은 접합된 탑재물을 추가로 포함하는 제제에 포함될 수 있다. 방사성 핵종 또는 독소를 갖는 항-CD25 항체 접합체가 사용될 수 있다. 일반적으로 사용되는 방사성 핵종의 예는, 예를 들면, 특히 90Y, 131I 및 67Cu이며, 일반적으로 사용되는 독소의 예는 독소루비신 및 칼리케아미신이다. 추가의 구현예에서, 항-CD25 항체는 변경된 반감기를 갖도록 변형될 수 있다. 변형된 반감기를 달성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
하나의 구현예에서, 항체는 바람직하게는 CD25-발현 세포의 고갈(ADCC, ADCP 및/또는 CDC를 통해)을 촉진시키는 것 이외에, 인간 CD25의 기능을 차단할 수 있다. 바람직하게는, 이는 또한 인간 IL-2의 인간 CD25에 대한 결합을 차단하고, 가장 바람직하게는 CD25-발현 세포에서 인간 IL-2 신호 전달을 차단한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 본 발명의 임의의 측면의 대상체는 포유동물, 바람직하게는 고양이, 개, 말, 당나귀, 양, 돼지, 염소, 소, 햄스터, 마우스, 랫트, 토끼 또는 기니 피그이지만, 가장 바람직하게는 대상체는 인간이다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 모든 측면에서, 대상체는 바람직하게는 인간이다.
본원에서 사용된 용어 "암", "암성" 또는 "악성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유류의 생리적 조건을 지칭하거나 기재한다.
암의 예는 암종, 림프종, 백혈병, 모세포종 및 육종을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 암의 보다 특별한 예로는 편평 세포 암종, 골수종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 신경교종, 간세포 암종(HCC), 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML), 다발성 골수종, 위장 (관) 암, 신장암, 난소암,간암, 림프아구성 백혈병, 림프구성 백혈병, 결장직장암, 자궁내막암, 신장암, 전립선암, 갑상선암, 흑색종, 연골육종, 신경교세포종, 췌장암, 다형성 교모세포종, 자궁경부암, 뇌암, 위암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장 암종 및 두경부암이 포함된다.
하나의 측면에서, 암은 고형 종양을 포함한다. 고형 종양의 예는 육종(해면골, 연골, 지방, 근육, 혈관, 조혈 또는 섬유 결합 조직과 같은 조직에서의 간엽 기원의 형질전환된 세포로부터 발생하는 암을 포함함), 암종(상피 세포에서 발생하는 종양 포함), 중피종, 신경교세포종, 망막모세포종 등이다. 고형 종양을 포함하는 암은, 제한 없이, 뇌암, 폐암, 위암, 십이지장암, 식도암, 유방암, 결장 및 직장암, 신장암, 방광암, 신장암, 췌장암, 전립선암, 난소암, 흑색종, 구강암, 육종, 안암, 갑상선암, 요도암, 질암, 경부암, 림프종 등을 포함한다.
본 발명의 한 측면에서, 암은 흑색종, 비소세포 폐암, 신장암, 난소암, 방광암, 육종 및 결장암으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 측면에서, 암은 흑색종, 난소암, 비소세포 폐암 및 신장암으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 암은 흑색종, 난소암 또는 유방암이 아니다. 바람직한 측면에서, 암은 육종, 결장암, 흑색종 또는 결장직장암, 또는 보다 일반적으로 MCA205, CT26, B16 또는 MC38 세포주(실시예에서 동정된 바와 같음)가 치료적 관리에 유용한 것으로 화합물을 입증하기 위한 전임상 모델을 나타낼 수 있는 임의의 인간 암이다.
본원에 사용된 바와 같이, 암으로 진단되거나 암이 의심되는 대상체에게 적용되는 용어 "종양"은 임의의 크기의 악성 또는 잠재적인 악성 신생물 또는 조직 덩어리를 의미하고, 원발성 종양 및 2차 신생물을 포함한다. 용어 "암", "악성 종양", "신생물", "종양" 및 "암종"은, 세포 증식의 조절의 유의한 손실을 특징으로 하는 비정상적인 성장 표현형을 나타내도록 비교적 비정상적이며 제어되지 않고/않거나 자율적인 성장을 나타내는 종양 및 종양 세포를 지칭하기 위해 본원에 상호교환적으로 사용될 수 있다. 일반적으로, 검출 또는 치료를 위한 목적하는 세포는 전암성(예: 양성), 악성, 전-전이성, 전이성 및 비-전이성 세포를 포함한다. 본 개시의 교시는 임의의 암 및 모든 암에 관련될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "고형 종양"은 낭종 또는 액체 영역, 특히 백혈병 또는 비-고형 림프암 이외의 종양 및/또는 전이(어디에 위치하든)를 일반적으로 포함하지 않는 조직의 비정상적 성장 또는 덩어리이다. 고형 종양은 양성 또는 악성 일 수 있다. 다른 유형의 고형 종양은 그들을 형성하는 세포의 유형 및/또는 그들이 위치하는 조직 또는 기관에 명명된다. 고형 종양의 예는 육종(해면골, 연골, 지방, 근육, 혈관, 조혈 또는 섬유 결합 조직과 같은 조직에서의 간엽 기원의 형질 전환된 세포로부터 발생하는 암을 포함함), 암종(상피 세포에서 발생하는 종양 포함), 흑색종, 림프종, 중피종, 신경교세포종 및 망막모세포종이다.
본 발명에 따른 특히 바람직한 암은 고형 종양의 존재를 특징으로 하는 암을 포함하고, 즉 대상체는 비-고형 종양을 갖지 않는다. 본원에서 논의된 바와 같은 본 발명의 모든 측면에서, 암은 고형 종양, 즉 대상체가 고형 종양을 갖는(비-고형 종양을 갖지 않음) 것이 바람직하다.
본원에서 사용되는 바와 같은 암을 "치료하다" 또는 "치료하는"은 적어도 하나의 양성 치료 효과, 예를 들면, 암세포 수 감소, 종양 크기 감소, 말초 기관으로의 암세포 침윤 비율 감소, 또는 종양 전이 또는 종양 성장의 속도 감소의 달성을 규정한다.
암의 양성 치료 효과는 여러 가지 방법으로 측정될 수 있다(예를 들면, Weber (2009) J Nucl Med 50, 1S-10S). 예로써, 종양 성장 억제와 관련하여, 국립 암 센터(NCI) 표준에 따르면, T/C =42%는 항 종양 활성의 최소 수준이다. T/C <10%는 높은 항종양 활성 수준으로 간주되고, T/C(%) = 치료되는 평균 종양 용적/대조군의 평균 종양 용적 Х100이다. 일부 구현예에서, 치료적으로 유효량으로 달성되는 치료는 무진행 생존(PFS), 질환 부재 생존(DFS) 또는 전체 생존(OS) 중 하나이다. "종양 진행까지의 시간"이라고도 하는 PFS는 암이 성장하지 않는 치료 동안 및 이후 시간의 길이를 나타내고, 환자가 완전한 반응 또는 부분 반응을 경험 한 시간의 양 및 환자가 안정된 질환을 경험한 시간의 양을 포함한다. DFS는 환자가 질환 없이 유지되는 치료 동안 및 이후의 시간의 길이를 의미한다. OS는 순수하거나 미치료된 개체 또는 환자와 비교했을 때 기대 수명의 연장을 의미한다.
본원에 사용된 "예방"이란 암 증상의 발병을 지연시키거나 예방하는 것을 의미한다. 예방은 (질병이 발생하지 않도록) 절대적일 수 있거나, 일부 개체 또는 제한된 시간 동안만 효과적일 수 있다.
본 발명의 바람직한 측면에서, 대상체는 확립된 종양을 갖고, 즉 대상체는, 예를 들면, 고형 종양으로서 분류되는 종양을 이미 갖는다. 이와 같이, 본원에 기재된 본 발명은 대상체가 이미 고형 종양과 같은 종양을 가지고 있을 때 사용될 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 현존하는 종양을 치료하는데 사용될 수 있는 치료 옵션을 제공한다. 본 발명의 하나의 측면에서, 대상체는 현존하는 고형 종양을 갖는다. 본 발명은 이미 고형 종양을 갖는 대상체에서의 예방으로서, 또는 바람직하게는 치료로서 사용될 수 있다. 하나의 측면에서, 본 발명은 예방적 또는 예방으로 사용되지 않는다.
하나의 측면에서, 예를 들면, 다른 암 치료법(예: 소정의 암에 대한 관리 치료의 표준)과 비교하여 종양 퇴보가 증가되거나, 종양 성장이 손상되거나 감소되고/되거나, 생존 시간이 본원에 기재된 발명을 사용하여 향상될 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 암을 치료하거나 예방하는 방법은 암을 가진 대상체를 동정하는 단계, 특히 고형 종양과 같은 종양을 갖는 대상체를 동정하는 단계를 추가로 포함한다.
암 환자를 치료하는데 효과적인 본원에 기재된 치료법의 투여량 섭생은 환자의 질환 상태, 연령 및 체중, 및 대상체에서 항암 반응을 유도하는 치료법의 능력과 같은 인자에 따라 다양할 수 있다. 적절한 투여량의 선택은 당업자의 능력 내에 있다. 예를 들면, 0.01, 0.1, 0.3, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 또는 50mg/kg. 일부 구현예에서, 이러한 양은 관련 집단에 투여될 때(즉, 치료적 투여 섭생으로) 목적하거나 유익한 결과와 상호관련이 있다고 결정된 투여 섭생에 따라 투여하기에 적합한 단위 투여량 (또는 이의 전체 분획)이다.
본원에 기재된 본 발명의 임의의 측면에 따르는 항체는 약제학적으로 허용되는담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물의 형태일 수 있다. 이러한 조성물은, 예를 들면, 액체 용액(예: 주사 가능하고 주입 가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환제 또는 리포솜과 같은 액체, 반고체 및 고체 투여 제형을 포함한다. 일부 구현예에서, 바람직한 형태는 의도된 투여 방식 및/또는 치료적 적용에 의존할 수 있다. 항체를 함유하는 약제학적 조성물은, 제한 없이, 경구, 점막, 흡입, 국소, 협측, 비강, 직장 또는 비경구(예: 정맥내, 주입, 종양내, 결절내, 피하, 복강내, 근육내, 피내, 경피 또는 대상체의 조직의 물리적 파열을 포함하는 다른 종류의 투여 및 조직에서의 파열을 통한 약제학적 조성물의 투여)를 포함하는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법으로 투여될 수 있다. 이러한 제형은, 예를 들면, 피내, 종양내 또는 피하 투여 또는 정맥내 주입에 적합한 주사 가능한 또는 주입 가능한 용액의 형태일 수 있다. 투여는 간헐적 투약을 포함할 수 있다. 대안적으로, 투여는 동시에 또는 다른 화합물의 투여 사이에 적어도 선택된 시간 동안 연속 투여(예: 관류)를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 항체는 신속 방출 및/또는 분해로부터 보호하는 담체, 예를 들면, 임플란트, 경피 패치 및 미세캡슐화 전달 시스템과 같은 조절 방출 제형으로 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다.
당업자는, 예를 들면, 전달 경로(예: 경구 대 정맥내 또는 피내 또는 종양내 등)가 투여량에 영향을 줄 수 있고/있거나 요구되는 투여량이 전달 경로에 영향을 줄 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들면, 특정 부위 또는 위치 내(예: 종양 내)의 제제의 고농도가 목적시 되는 경우, 집중 전달(예: 이 실시예에서, 종양 내 전달)은 바람직하고/하거나 유용할 수 있다. 소정의 치료 섭생에 대한 경로 및/또는 투여 일정을 최적화할 때 고려해야 할 다른 인자는, 예를 들면, 치료되는 특정 암(예: 유형, 병기, 위치 등), 대상체의 임상 상태(예: 나이, 전반적인 건강 등), 병용 요법의 존재 또는 부재, 및 개업의에게 공지된 다른 인자를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건하에서 멸균되고 안정해야한다. 당해 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬 구조로 제형화 될 수 있다. 멸균 주사 가능한 용액은 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에 필요한 양으로 항체와 도입한 후 여과 멸균함으로써 제조할 수 있다. 비경구 투여용 제형은 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 중의 에멀젼, 페이스트 및 본원에서 논의된 바와 같은 이식 가능한 서방출 또는 생분해성 제형을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 멸균 주사 가능한 제형은 비독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매를 사용하여 제조될 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 각각의 약제학적 조성물은 사용되는 투여량 및 농도에서 대상체에게 비독성인 약제학적으로 허용되는 분산제, 습윤제, 현탁화제, 등장제, 코팅제, 항균 및 항진균제, 담체, 부형제, 염 또는 안정화제를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 조성물은 소정의 방법 및/또는 투여 부위, 예를 들면, 비경구(예: 피하, 피내 또는 정맥내 주사), 종양내 또는 종양 주위 투여와 양립할 수 있는 암의 치료에 사용하기 위한 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 치료 방법 또는 조성물의 구현예는 모든 대상체에서 양성 치료 효과를 달성하는데 효과적이지 않을 수 있지만, 양호한 의학적 관행과 스튜던츠(Student's) t-테스트, χ2-테스트, 만 및 히트니(Mann and Whitney)에 따른 U-테스트, 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 테스트(H-테스트), 죤키어-터프스프라(Jonckheere-Terpstra) 테스트 및 윌콕슨(Wilcoxon)-테스트와 같은 당업계에 공지된 임의의 통계적 테스트에 의해 결정된 통계적으로 유의한 수의 대상체와 일관되는 약제학적 조성물 및 투여 섭생을 사용하여 그렇게 수행해야 한다.
상기 및 이후에 종양, 종양 질환, 암종 또는 암이 언급되는 경우, 또한 원래의 기관 또는 조직에서 및/또는 임의의 다른 위치에서의 전이는 종양 및/또는 전이의 위치에 관계없이 대안적으로 또는 추가로 암시된다.
본원에서 논의된 바와 같이, 본 발명은 조절 T 세포(조절 T 세포)를 고갈시키는 것에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 한 측면에서, 항-CD25 항체는 종양 침윤성 조절 T 세포를 고갈시키거나 감소시킨다. 하나의 측면에서, 상기 고갈은 ADCC를 통해 이루어진다. 다른 측면에서, 상기 고갈은 ADCP를 통해 이루어진다. 항-CD25 항체는 또한 순환 조절 T 세포를 고갈시키거나 감소시킬 수 있다. 하나의 측면에서, 상기 고갈은 ADCC를 통해 이루어진다. 다른 측면에서, 상기 고갈은 ADCP를 통해 이루어진다.
이와 같이, 본 발명은 항-CD25 항체를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 종양에서 조절 T 세포를 고갈시키는 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 조절 T 세포는 고형 종양에서 고갈된다. "고갈된"이란, 조절 T 세포의 수, 비율 또는 백분율이 항-CD25 항체가 투여되지 않는 경우에 비해 감소됨을 의미한다. 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 특정 구현예에서, 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 99% 이상의 종양 침윤성 조절 T 세포가 고갈된다.
본원에서 사용된 "조절 T 세포"("Treg", "Treg 세포" 또는 "조절 T 세포")는 자가 면역, 알레르기 및 감염을 조절하는 데 있어서 특화된 CD4+ T 림프구의 계통을 지칭한다. 전형적으로, 그들은 T 세포 집단의 활성을 조절하지만, 그들은 또한 특정의 타고난 면역계 세포 유형에도 영향을 줄 수 있다. 조절 T 세포는 일반적으로 바이오 마커 CD4, CD25 및 Foxp3의 발현에 의해 동정된다. 자연적으로 발생하는 Treg 세포는 일반적으로 말초 CD4+ T 림프구의 약 5 내지 10%를 구성한다. 그러나 종양 미세환경(즉, 종양 침윤성 Treg 세포) 내에서, 그들은 총 CD4+ T 림프구 집단의 20 내지 30%를 차지할 수 있다.
활성화된 인간 Treg 세포는 퍼포린 또는 그랜자임 B 의존 경로를 통해 효과기 T 세포 및 APC와 같은 표적 세포를 직접 죽일 수 있고; 세포독성 T-림프구 관련 항원 4(CTLA4+) Treg 세포는 APC에 의한 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO) 발현을 유도하고, 이들은 또한 트립토판을 감소시킴으로써 T-세포 활성화를 억제하고; Treg 세포는 생체내에서 인터류킨-10(IL-10) 및 형질전환 성장 인자(TGF
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)를 방출시키고, 따라서 MHC 분자, CD80, CD86 및 IL-12의 발현을 억제함으로써 T 세포 활성화를 직접 억제하고 APC 기능을 억제할 수 있다. Treg 세포는 또한 항원 제시 세포에서 CD80 및 CD86에 결합할 수 있는 높은 수준의 CTLA4를 발현시킴으로써 면역력을 억제하고 효과기 T 세포의 적절한 활성화를 방지할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 고형 종양에서 조절 T 세포에 대한 효과기 T 세포의 비율은 증가된다. 일부 구현예에서, 고형 종양에서 조절 T 세포에 대한 효과기 T 세포의 비율은 5, 10, 15, 20, 40 또는 80 이상으로 증가된다.
면역 효과기 세포는 면역 반응의 효과기 단계에 관여하는 면역 세포를 의미한다. 예시적인 면역 세포는 골수 또는 림프양 기원의 세포, 예를 들면, 림프구(예: B 세포 및 세포 용해성 T 세포(CTL)를 포함하는 T 세포), 살해 세포, 자연 살해 세포, 대식세포, 단핵구, 호산구, 호중구, 다형핵 세포, 과립구, 비만 세포 및 호염기구를 포함한다.
면역 반응의 효과기 단계에 관여하는 면역 효과기 세포는 특이적 Fc 수용체를 발현하고 특이적 면역 기능을 수행한다. 효과기 세포는 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC), 예를 들면, ADCC를 유도할 수 있는 호중구를 유도할 수 있다. 예를 들면, FcαR을 발현하는 단핵구, 대식세포, 호중구, 호산구 및 림프구는 표적 세포의 특이적 사멸 및 면역계의 다른 성분에 항원의 제시 또는 항원을 제시하는 세포에의 결합에 관여한다. 효과기 세포는 또한 표적 항원, 표적 세포 또는 미생물을 식균할 수 있다. 본원에서 논의된 바와 같이, 본 발명에 따르는 항체는 ADCC를 유도하는 능력에 대해 최적화될 수 있다.
일부 구현예에서, 암에 대한 상이한 제제는 동일하거나 상이한 전달 경로를 통해 및/또는 상이한 스케줄에 따라 항체와 함께 투여될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 일부 구현예에서, 제1 활성제의 하나 이상의 용량은 하나 이상의 다른 활성제와 실질적으로 동시에, 일부 구현예에서 공통 경로를 통해 및/또는 단일 조성물의 일부로서, 하나 이상의 다른 활성제와 함께 투여된다. 당업자는 본 발명에 따라 제공된 병용 요법의 일부 구현예가 상승 효과를 달성함을 추가로 인식할 것이고; 일부의 그러한 구현예에서, 조합에 사용되는 하나 이상의 제제의 용량은 물질적으로 상이할(예: 보다 낮음) 수 있고/있거나, 표준이고, 바람직하거나 그 제제가 상이한 치료 섭생에 사용될 경우(예: 단독 요법으로 및/또는 상이한 병용 요법의 일부로서) 필요한 것보다 대체 경로에 의해 전달될 수 있다.
2종 이상의 활성제가 본 발명에 따라 사용되는 일부 구현예에서, 이러한 제제는 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나의 제제의 투여는 다른 제제의 투여에 비례하여 구체적으로 시기를 정한다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 제1 제제는 특정 효과가 관찰되도록 (또는, 예를 들면, 소정의 투여 섭생과 관심의 특정 효과 사이의 상관 관계를 나타내는 집단 연구에 기초하여 관찰 될 것으로 기대되도록) 투여된다. 일부 구현예에서, 조합 투여되는 제제에 대한 목적하는 상대적 투여 섭생은 예를 들면, 생체외, 생체내 및/또는 시험관내 모델을 사용하여 경험적으로 평가되거나 결정될 수 있고, 일부 구현예에서, 이러한 평가 또는 경험적 결정은 생체내, 환자 집단(예: 상관 관계가 확립되도록), 또는 대안적으로 관심있는 특정 환자에서 이루어진다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명자들은 항-CD25 항체가 면역 체크포인트 억제제와 조합될 때 개선된 치료 효과를 나타낸다는 것을 나타냈다. 본 실시 예에 나타낸 바와 같이, 항-CD25 항체 및 면역 체크포인트 억제제와의 병용 요법은 확립된 종양의 치료에서 상승 효과를 가질 수 있다. 본 실시예에서 PD-1/PD-L1에 관한 데이터는 PD-1/PD-L1 상호작용을 방해하는 것에 관한 것이다. 이와 같이, PD-1 수용체와 PD-L1 리간드 사이의 상호작용은 차단되어 "PD-1 차단"을 초래할 수 있다. 하나의 측면에서, 조합은 예를 들면, 항-CD25 항체 또는 PD-1/PD-L1 차단 단독(직접 항-PD1 항체를 사용하거나, 간접적으로 항 PD-L1 항체를 사용하여)과 비교하여, 증진된 종양 퇴화, 종양 성장의 증진된 손상 또는 감소 및/또는 본원에 기재된 바와 같이 본 발명을 사용하여 증진될 수 있는 생존 시간을 유도할 수 있다.
본원에 사용된 "면역 체크포인트" 또는 "면역 체크포인트 단백질"은 특히 T-세포 반응의 조절을 위한 면역계의 억제 경로에 속하는 단백질을 지칭한다. 정상적인 생리학적 조건하에서 면역 체크포인트는 특히 병원균에 대한 반응 중에 자가 면역을 예방하는 데 중요하다. 암 세포는 면역 감시를 피하기 위해 면역 체크포인트 단백질의 발현의 조절을 변경할 수 있다.
면역 체크포인트 단백질의 예로는 PD-1, CTLA-4, BTLA, KIR, LAG3, TIGIT, CD155, B7H3, B7H4, VISTA 및 TIM3, 또한 OX40, GITR, ICOS, 4-1BB 및 HVEM을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 면역 체크포인트 단백질은 면역 반응을 억제 방식으로 중재하는 다른 면역 체크포인트 단백질에 결합하는 단백질을 지칭할 수도 있다. 이러한 단백질은 PD-L1, PD-L2, CD80, CD86, HVEM, LLT1 및 GAL9를 포함한다.
"면역 체크포인트 단백질 억제제"는 면역 체크포인트 단백질에 의해 매개되는 신호전달 및/또는 단백질-단백질 상호작용을 방해할 수 있는 임의의 단백질을 지칭한다. 본 발명의 한 측면에서, 면역 체크포인트 단백질은 PD-1 또는 PD-L1이다. 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 바람직한 측면에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-PD-1 또는 항 PD-L1 항체를 통한 PD-1/PD-L1 상호작용을 방해한다.
이와 같이, 본 발명은 또한 항-CD25 항체 및 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 암의 치료에 사용하기 위한 항-CD25 항체 및 면역 체크포인트 억제제를 제공한다.
본 발명은 추가로 암 치료용 약제를 제조하기 위한, 항-CD25 항체 및 면역 체크포인트 억제제의 용도를 제공한다. 항-CD25 항체 및 면역 체크포인트 억제제의 투여는 동시, 개별적 또는 순차적일 수 있다.
본 발명은 대상체의 암 치료에 사용하기 위한 항-CD25 항체 및 면역 체크포인트 억제제의 조합을 제공하고, 여기서 항-CD25 항체 및 면역 체크포인트 억제제는 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여된다. 이러한 항-인간 CD25 항체는 바람직하게는 인간 IgG1이고, ADCC, ADCP 및/또는 CDC를 허용하는 서열을 나타내거나 결여하는 면역 체크포인트를 표적화하는 항체와 함께 특이적으로 사용될 수 있다.
대안적인 측면에서, 본 발명은 암의 치료에 사용하기 위한 항-CD25 항체를 제공하고, 여기서 상기 항체는 면역 체크포인트 억제제와 함께 투여하기 위한 것이다. 본 발명은 또한 암 치료용 의약을 제조하는데 있어서 항-CD25 항체의 용도를 제공하고, 여기서 상기 의약은 면역 체크포인트 억제제와 함께 투여하기 위한 것이다.
본 발명은 약제학적으로 허용되는 매질에 항-CD25 항체 및 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 논의된 바와 같이, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1의 억제제, 즉 PD-1 길항제일 수 있다.
CD279라고도 공지된 PD-1(프로그램된 세포사 단백질 1)은 활성화된 T 세포와 B 세포에서 발현되는 세포 표면 수용체이다. 이의 리간드와의 상호작용은 시험관내 및 생체내 둘 다에서 T 세포 반응을 감쇠시키는 것으로 나타났다. PD-1은 두 개의 리간드인 PD-L1과 PD-L2를 결합한다. PD-1은 면역글로블린 수퍼패밀리에 속한다. PD-1 신호전달은 주요 조직적합성 복합체(MHC)(Freeman (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105, 10275-6)에 의해 제시된 펩티드 항원에 매우 근접한 PD-1 리간드에 대한 결합을 필요로 한다. 따라서, T 세포막에서 PD-1과 TCR의 공동 결찰을 방지하는 단백질, 항체 또는 소분자는 유용한 PD-1 길항제이다.
하나의 구현예에서, PD-1 수용체 길항제는 PD-1에 특이적으로 결합하고 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 차단하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 항-PD-1 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 항-PD-1 항체는 인간 또는 인간화 항체일 수 있다. 항-PD-1 항체는 PD-1 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이다. 당업계에 공지된 항-PD-1 항체는 니볼루맙 및 펨브롤리주맙을 포함한다.
본 발명의 PD-1 길항제는 또한 PD-1 수용체에 대한 리간드의 결합을 방해하거나 억제하기 위해 PD-1의 리간드에 결합하고/하거나 차단하거나, PD-1 수용체를 통한 억제 신호 전달을 유도하지 않고 PD-1 수용체에 직접 결합하고 차단하는 화합물 또는 제제를 포함한다.
대안적으로, PD-1 수용체 길항제는 억제 신호 전달을 유발하지 않고 PD-1 수용체에 직접 결합할 수 있고, 또한 PD-1 수용체의 리간드에 결합하여 리간드가 PD-1 수용체를 통한 신호 전달을 유발하는 것을 감소시키거나 억제할 수 있다. PD-1 수용체에 결합하고 억제 신호의 전달을 유발하는 리간드의 수 및/또는 양을 감소시킴으로써, 더 적은 세포가 PD-1 신호 전달에 의해 전달된 음성 신호에 의해 약화되고 더 강력한 면역 반응을 달성할 수 있다.
하나의 구현예에서, PD-1 수용체 길항제는 PD-L1에 특이적으로 결합하고 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 차단하는 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 항-PD-L1 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙(MPDL3280A)과 같은 인간 또는 인간화 항체일 수 있다.
본 발명은 또한 항-CD25 항체 및 T 세포 활성화 공동자극 경로의 작용제인 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. T 세포 활성화 공동자극 경로의 항체 작용제는, 제한 없이, ICOS, GITR, OX40, CD40, LIGHT 및 4-1BB에 대한 작용제 항체를 포함한다.
본 발명자들은 놀랍게도 억제성 Fc 수용체인 FcγRIIb (CD32b)의 수준이 고형 종양에서 증가할 수 있음을 동정하였다. 따라서, 암을 치료하는 추가의 방법은 항-CD25 항체 및 FcγRIIb (CD32b)를 감소시키고, 차단하고, 억제하고/하거나 길항하는 화합물을 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 FcγRIIb 길항제는 FcγRIIb 유도 세포내 신호전달을 간섭하는 소분자, 억제성 FcγRIIb 수용체와 결합하지 않는 변형된 항체 또는 항-인간 FcγRIIb (항-CD32b) 항체일 수 있다. 예를 들면, 길항적 항-인간 FcγRIIb 항체는 또한 그들의 항종양 특성에 대해 특성화되었다(참조: Roghanian A 등, 2015, Cancer Cell, 27, 473-488, Rozan C 등, 2013, Mol Cancer Ther. 12:1481-91, WO2015173384, WO2008002933).
추가의 국면에서, 본 발명은
(a) CD25에 결합하는 제1 항원 결합 잔기; 및
(b) 종양 관련 항원인 면역 체크포인트 단백질에 결합하는, 항-인간 활성 Fc 수용체 항체(예: 항-FcgRI, 항-FcgRIIa, 항-FcgRIII)이고 (또는 이에 기초하고), 또는 길항적 항-인간 FcγRIIb 항체인 (또는 이에 기초하는) 제2 항원 결합 잔기를 포함하는 이중특이적 항체로서,
상기 이중특이적 항체가 바람직하게는 적어도 하나의 활성화 Fcγ 수용체에 고친화도로 결합하고 종양 침윤성 조절 T 세포를 고갈시키는 IgG1 항체인, 이중특이적 항체를 제공한다.
본원에서 사용된 "종양 관련 항원"은 그들에 인접한 비-암 세포와 구별할 수 있게 하는 종양 세포 상에서 발현된 항원을 의미하며, 제한 없이, CD20, CD38, PD-L1, EGFR, EGFRV3, CEA, TYRP1 및 HER2를 포함한다. 관련 종양 관련 항원 및 상응하는 치료학적으로 유용한 항종양 항체 제제를 기재하는 다양한 검토 기사가 공개되었다(참조: 예를 들어, Sliwkowski & Mellman (2013) Science 341, 192-8). 이러한 항원 및 상응하는 항체는, 제한 없이, CD22 (블리나투모맙), CD20 (리툭시맙, 토시투모맙), CD56 (로르보투주맙), CD66e/CEA (라베투주맙), CD152/CTLA-4 (이필리무맙), CD221/IGF1R (MK-0646), CD326/Epcam (에드레콜로맙), CD340/HER2 (트라스투주맙, 퍼투주맙) 및 EGFR (세툭시맙, 파니투무맙)을 포함한다.
한 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 ADCC, 또는, 한 측면에서, 강화된 ADCC를 유도한다.
이중특이적 항체는 CD25 상의 특이적 에피토프 및 본원에서 정의된 바와 같은 면역 체크포인트 단백질 또는 종양 관련 항원 상의 특이적 에피토프에 결합할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 제2 항원 결합 잔기는 PD-L1에 결합한다. 바람직한 측면에서, 본 발명은
(a) CD25에 결합하는 제1 항원 결합 잔기; 및
(b) 종양 세포 상에서 발현되는 면역 체크포인트 단백질에 결합하는 제2 항원 결합 잔기를 포함하는 이중특이적 항체를 제공한다.
특정 구현예에서, 종양 세포 상에서 발현되는 면역 체크포인트 단백질은 PD-L1, VISTA, GAL9, B7H3 또는 B7H4이다. 더욱 바람직하게는, 항-CD25 항체는 Fcγ 수용체에 고친화도로 결합하고, 종양 침윤성 조절 T 세포를 고갈시키는 IgG1 항체이다.
당업자는 공지된 방법을 사용하여 이중특이적 항체를 생산할 수 있을 것이다. 본 발명에 따르는 이중특이적 항체는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 임의의 측면에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따르는 이중특이적 항체 내의 제2 항원 결합 잔기는 인간 PD-1, 인간 PD-L1 또는 인간 CTLA-4에 결합한다.
한 측면에서, 이중특이적 항체는 CD25 및 종양 침윤성 조절 T 세포, 예를 들면, CTLA4, ICOS, GITR, 4-1BB 또는 OX40 상에서 높은 수준으로 발현되는 면역 조절 수용체에 결합할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 항-CD25 항체 및 면역 체크포인트 억제제, 바람직하게는 본원에 논의된 바와 같은 PD-1 길항제(직접적으로, 항-PD1 항체를 사용하거나, 간접적으로 항-PD-L1 항체를 사용하여)를 포함하는 키트를 제공한다. 한 측면에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-PD-L1이다. 대안적인 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 바와 같은 항-CD25 항체 및 T 세포 활성화 공동자극 경로의 작용제인 항체를 포함한다. 상기 키트는 사용 설명서를 포함할 수 있다.
추가적으로, 키트는 본원에 기재된 바와 같은 항-CD25 항체 및 FcγRIIb (CD32b)를 감소시키고, 차단하고, 억제하고/하거나 길항하는 화합물, 또는 대안적으로본원에 기재된 바와 같은 항-CD25 항체 및 항-인간 활성 Fc 수용체 항체(항-FcγRI, 항-FcγRIIc 또는 항-FcγRIIIa)를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 임의의 측면은 추가적인 암 요법과 조합하여 수행될 수 있다. 특히, 본 발명에 따르는 항-CD25 항체 및 임의로 면역 체크포인트 억제제 (또는 임의의 다른 병용 요법)는 공동자극 항체, 화학 요법 및/또는 방사선 요법, 표적 치료 또는 모노클로날 항체 요법과 병용 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 화학요법 본체는 세포에 파괴적인 본체를 의미하고, 즉 본체는 세포의 생존력을 감소시킨다. 화학요법 본체는 세포독성 약물일 수 있다. 고려되는 화학요법제는, 제한 없이, 알킬화제, 안트라사이클린, 에포틸론, 니트로 소우레아, 에틸렌이민/메틸멜라민, 알킬 설포네이트, 알킬화제, 항대사물질, 피리 미딘 유사체, 에피포도필로톡신, 효소, 예를 들면, L-아스파라기나제; 생물학적 반응 조절제, 예를 들면, IFNα, IFN-γ, IL-2, IL-12, G-CSF 및 GM-CSF; 백금 배위 착물, 예를 들면, 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴, 안트라센디온, 치환된 우레아, 예를 들면, 하이드록시우레아, N-메틸하이드라진(MIH) 및 프로카바진을 포함하는 메틸하이드라진 유도체, 부신피질 억제제, 예를 들면, 미토탄(o,p'-DDD) 및 아미노글루테티미드; 프레드니손 및 등가물, 덱사메타손 및 아미노글루테티미드와 같은 아드레노코르티코스테로이드 길항제를 포함하는 호르몬 및 길항제; 프로게스틴, 예를 들면, 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트 및 메게스트롤 아세테이트; 에스트로겐, 예를 들면, 디에틸스틸베스트롤 및 에티닐 에스트라디올 등가물; 항에스트로겐, 예를 들면, 타목시펜; 테스토스테론 프로피오네이트 및 플루옥시메스테론/등가물을 포함하는 안드로겐; 항안드로겐, 예를 들면, 플루타미드, 생식샘 자극 호르몬 방출 호르몬 유사체 및 류프롤리드; 및 비스테로이드성 항안드로겐, 예를 들면, 플루타미드를 포함한다.
추가의 암 요법은 또한 암 백신의 투여를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "암 백신"은 암 환자에게 투여되고 환자 자신의 면역 반응을 강화시킴으로써 암 세포를 박멸하도록 고안된 치료적 암 백신을 의미한다. 암 백신은 종양 세포 백신(자가조직 및 동종), 수지상 세포 백신(생체외 생성되고 펩티드 활성화됨), 단백질/펩티드 기반 암 백신 및 유전자 백신(DNA, RNA 및 바이러스 기반 백신)을 포함한다. 따라서, 원칙적으로 치료적 암 백신은 수술, 방사선 요법 및 화학 요법과 같은 통상적인 요법으로 난치성인 진행성 암 및/또는 재발된 종양의 추가 성장을 억제하는데 이용될 수 있다.
종양 세포 기반 백신(자가조직 및 동종)에는 가용성 면역 자극제, 예를 들면, 사이토카인(IL2, IFN-g, IL12, GMCSF, FLT3L), 면역 조절 수용체에 대한 단일 쇄 Fv 항체(PD-1, CTLA-4, GITR, ICOS, OX40, 4-1BB)를 분비하고/하거나 그들의 막 상에서 특히 ICOS-리간드, 4-1BB 리간드, GITR-리간드, 및/또는 OX40 리간드와 같은 면역-자극 수용체를 위한 리간드를 발현시키기 위해 유전적으로 변형된 것들을 포함한다.
추가의 암 요법은 말초 및 종양 미세내에서 면역 조절을 감소시키는 다른 항체 또는 소분자 시약, 예를 들면, TGFb 경로, IDO(인돌아민 데옥시게나제), 아르기나제 및/또는 CSF1R을 표적화하는 분자일 수 있다.
'병용'은 본 발명에 따르는 임의의 측면의 투여 전 또는 투여와 동시에 또는 투여 이후에 부가적인 요법의 투여를 의미할 수 있다.
물질 & 방법
마우스
C57BL/6 및 BALB/c 마우스는 챨스 리버 라보라토리즈(Charles River Laboratories)로부터 구입하였다. Fcer1g-/- 및 Fcgr3-/- 마우스는 에스. 비어스(S. Beers)(University of Southampton, UK)에 의해 친절하게 제공되었다. Fcgr4-/- 및 Fcgr2b-/- 마우스는 제이.브이, 래베치(J.V. Ravetch)(The Rockefeller University, New York, USA)의 친절한 선물이었다. 모든 동물 연구는 런던 대학 및 영국 본사의 윤리적 승인 및 규정에 따라 수행되었다.
세포주 및 조직 배양
MC38, B16, CT26 및 MCA205 종양 세포(3-메틸콜안트렌 유도된 약한 면역원성 섬유육종 세포; G. Kroemer, Gastave Roussy Cancer Institute) 및 레트로 바이러스 생산에 사용된 293T 세포를 10% 소 태아 혈청(FCS, 시그마), 100U/mL 페니실린, 100㎍/mL 스트렙토마이신 및 2mM L-글루타민(모두 깁코(Gibco)로부터의 것)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, Sigm)에서 배양했다. 항체 생산에 사용된 K562 세포를 10% IgG 고갈 FCS(Life Technologies)가 보충된 페놀 레드-부재 Iscove 변형된 둘베코 배지(IMDM)에서 배양했다. B16(마우스 피부 흑색종 세포) 및 CT26(N-니트로소-N-메틸우레탄 유발, 미분화 결장 암종 세포주) 세포 및 관련 배양 조건은 ATCC를 통해 입수할 수 있다.
항체 생산
항-CD25의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 서열은 cDNA 말단(RACE)의 신속한 증폭에 의해 PC-61.5.3 하이브리도마로부터 분리된 후, 뮤린 IgG2a 및 pFUSEss-CHIg-mG2A 및 pFUSE2ss-CLIg-mk 플라스미드(Invivogen)로부터 공급된 k 쇄의 불변 영역으로 클로닝했다. 이어서, 각 항체 쇄를 뮤린 백혈병 바이러스(MLV) 유래 레트로바이러스 벡터로 서브클로닝하였다. 예비 실험을 위해, 항체는 중쇄 및 경쇄 모두를 암호화하는 벡터로 형질도입된 K562 세포를 사용하여 생산하였다.
PC-61.5.3 항체로부터 재클로닝된 항-CD25 중쇄 가변 DNA 서열은 하기 단백질 서열을 코딩한다:
Figure pat00003
PC-61.5.3 항체로부터 재클로닝된 항-CD25 경쇄 가변 DNA 서열은 하기 단백질 서열을 코딩한다:
Figure pat00004
항체는 단백질 G HiTrap MabSelect 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 상청액으로부터 정제하고, 인산염 완충 식염수(PBS)에 투석시키고, 농축시키고 필터 멸균시켰다. 추가의 실험을 위해, 항체 생산은 에비트리아 아게(Evitria AG)에 위탁되었다. 시판되는 항-CD25 클론 PC-61은 BioXcell로부터 구입하였다.
공개된 항-PDL1 (MPDL3280A/RG7446) 가변 중쇄 및 경쇄 DNA 서열은 재클로닝되고 재조합 항체로서 발현되었다.
생체내 종양 실험
배양된 종양 세포를 트립신화하고, 세척하고 PBS에 재현탁시키고 옆구리에 피하(s.c.) 주사했다(C57BL/6 마우스의 MCA205 및 MC38 모델의 경우 5Х105세포; C57BL/6 마우스의 B16 모델의 경우 2.5 x 105 세포, BALB/c 마우스의 CT26 모델의 경우 5 x 105 세포). 항체를 도면 범례에 기재된 시점에 복강내(i.p.) 주사했다. 기능적 실험을 위해, 10일 후 종양, 배수 림프절 및 조직을 수거하고, 문헌(참조: Simpson 등 (2013) J Exp Med 210, 1695-710)에 기재된 바와 같이 세포 유동 계측법에 의한 분석으로 처리했다. 치료 실험을 위해, 종양은 매주 2회 측정되었고, 용적은 3개의 직교 직경의 곱으로 계산되었다. 임의의 직경이 150mm에 이르면 마우스를 인도적으로 안락사시켰다. 종양 보유 마우스를 5일째 및 7일째에 200㎍의 항-CD25-r1(αCD25-r1), 항-CD25-m2a(αCD25-m2a) 또는 항-CTLA-4(αCTLA-4) 및 6일, 9일 및 12일째에 100㎍의 항-PD-1의 항-PD-1로 처리하였다. 치료 실험을 위해, 마우스는 5일 및 7일째에 표현형 분류 및 고갈을 위해 5일째에만 처리하였다. 종양 크기를 1주일에 2회 측정하고, 임의의 종양 치수가 150mm에 도달했을 때 마우스를 안락사시켰다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 림프절(LN) 및 종양(TIL)을 9일째에 수거하고, 유동 세포 계측법 분석을 위해 처리하고 염색하였다.
유동 세포 계측법
취득은 BD LSR II Fortessa(BD Biosciences)로 수행하였다. 다음의 직접 접합된 항체를 사용하였다: 항-CD25 (7D4)-FITC, CD4 (RM4-5)-v500(BD Biosciences); 항-IFNγ (XMG1.2)-AlexaFluor488, 항-PD-1 (J43)-PerCP-Cy5.5, 항-Foxp3 (FJK-16s)-PE, 항-CD3 (145-2C11)-PE-Cy7, 항-Ki67 (SolA15)-eFluor450, 항-CD5 (53-7.3)-eFluor450, 정착 가능한 생존 염료-eFluor780(eBioscience); 항-CD8 (53-6.7) -BrilliantViolet650(BioLegend); 및 항-그랜자임 B (GB11)-APC(Invitrogen). 다음 항체가 인간 세포를 염색하기 위해 사용되었다: 항-CD25 (BC96)-BrilliantViolet650(Biolegend), 항-CD4 (OKT4)-AlexaFluor700(eBioscience), 항-CD8 (SK1)-V500, 항-Ki67 (B56)-FITC(BD Biosciences); 항-FoxP3 (PCH101)-PerCP-Cy5.5(eBioscience); 항-CD3 (OKT3)-BrilliantViolet785(Biolegend). Foxp3의 핵 내 염색은 Foxp3 전사 인자 염색 완충액 세트(eBioscience)를 사용하여 수행하였다. 사이토카인의 세포내 염색을 위해, 세포를 골지플러그(BD Biosciences)의 존재하에 37℃에서 4시간 동안 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA, 20ng/mL)와 이오노마이신(500ng/mL)(Sigma Aldrich)으로 재자극시킨 다음, Cytofix/Cytoperm 완충액 세트(BD Biosciences)를 사용하여 염색하였다. 세포의 절대수의 정량화를 위해, 취득 전에 각 샘플에 정의된 수의 형광 비드(UV 레이저 용 세포 분류 설정 비드, ThermoFisher)를 첨가하고, 계수 기준으로 사용했다.
인간 조직
말초 혈액(PBMC) 및 종양 침윤성 림프구(TIL)를 진행성 흑색종(n = 10, 12개 병변), 초기 단계 비소세포 폐암(NSCLC)(n = 8), 및 신장 세포 암종(RCC)(n = 5) 환자의 3개의 별개 코호트에서 연구했다. 제시된 인간 데이터는 3가지 별개의 윤리적으로 승인된 번역 연구(흑색종 REC 번호 11/LO/0003, NSCLC - REC 번호 13/LO/1546, RCC-REC 번호 11/LO/1996)에서 유래된다. 모든 경우에 서면 동의를 얻었다.
종양 침윤성 림프구(TIL)의 단리
종양은 수술실에서 종양 대표 지역이 격리된 병리과로 직접 가져 갔다. 이어서, 샘플을 후속적으로 멸균 조건하에 갈은 후, 37℃에서 30분 동안 효소 소화(Liberase TL 연구 등급(Roche) 및 DNAse I(Roche)를 갖는 RPMI-1640(Sigma))에 이어, gentleMACS(Miltenyi Biotech)를 사용하여 기계적 해리시켰다. 생성되는 단일 세포 현탁액을 여과하고, Ficoll-paque(GE Healthcare) 구배를 통해 통과시켜 백혈구를 농축시켰다. 살아있는 세포를 계수하고, 액체 질소로 옮기기 전에 -80℃에서 10% 디메틸 설폭사이드로 인간 AB 혈청(Sigma)에서 동결시켰다.
다중-매개변수 유동 세포 계측법에 의한 TIL 및 PBMC의 표현형 분석
종양 샘플 및 PBMC를 해동하고, 완전한 RPMI로 세척하고, FACS 완충액(500mL PBS, 2% FCS, 2nM EDTA)에 재현탁시키고, 환저 96 웰 플레이트에 배치했다. 표면 항체의 마스터믹스를 제조자 권장 희석으로 제조했다: CD8-V500, SK1 클론(BD Biosciences), PD-1-BV605, EH12.2H7 클론(Biolegend), CD3-BV785. 고정 가능한 생존 염료(eFlour780, eBioscience)도 표면 마스터믹스에 포함되었다. 세포내 고정 및 투과성 완충액 세트(eBioscience)를 사용하여 20분 동안 투과시킨 다음, 제조자 권장 희석으로 사용된 다음 항체로 이루어진 세포내 염색 패널을 적용했다: 그랜자임 B-V450, GB11 클론(BD Biosciences), FoxP3-PerCP-Cy5.5, PCH101 클론(eBioscience), Ki67-FITC, 클론 B56(BD Biosciences) 및 CTLA-4-APC, L3D10 클론(Biolegend).
다중 면역조직화학
종양 샘플을 완충된 포르말린에 고정시키고 파라핀에 매립시켰다. 2 내지 5μm 조직 절편을 절단하고, 다음 면역조직화학용 항체로 염색했다: 항-CD8 (SP239), 항-CD4 (SP35)(Spring Biosciences Inc.), 항-FoxP3 (236A/E7)(스페인 마드리드의 Dr. G. Roncador CNIO의 선물) 및 항-CD25 (4C9)(Leica Biosystems). 다중 염색을 위해, 파라핀 매립 조직 절편을 세포 컨디셔닝 1 시약(Ventana Medical Systems, Inc.) 및 내인성 퍼옥시다제의 불활성화를 위한 과산화수소를 사용하여 을 사용하여 항원 회수 후 30분 동안 1차 항원으로 배양했다. 검출은 퍼옥시다제 기반 검출 시약(OptiView DAB IHC 검출 키트 Ventana Medical Systems, Inc.) 및 알칼리성 포스파타제 검출 시약(UltraView Universal Alkaline Phosphatase Red Detection Kit, Ventana Medical Systems, Inc.)을 사용하여 수행하였다. 면역 알칼리성 포스파타제의 추가 주기는 대안적 기질(Fast Red가 이전에 사용된 경우 Fast Blue, 또는 그 반대)을 사용하여 수행되었다. 면역조직화학과 단백질 반응 패턴을 평가하였다. 다중 면역 염색의 채점도 수행하였다. 이 연구에 대한 승인은 국립 연구 윤리 서비스 연구 윤리위원회 4(REC 참조 번호 09/H0715/64)로부터 얻은 것이다.
항-CD25- 및 항-PD-L1-기반 이중특이적 듀오바디의 작제 및 검증
Bs CD25 PD-L1 듀오바디는 Fab 교환을 가능하게 하는 CH3 도메인에서 단일 매칭 점 돌연변이를 함유하는 2개의 부모 IgG1로부터 출발하여 문헌에 개시된 기술에 따라 생성 및 생산되었다(참조: Labrijn AF 등, Nat Protoc.2014, 9 : 2450-63] 참조). 간단히 말하면, 항-마우스 CD25(PC61; 상기한 바와 같은 마우스 IgG1 아이소타입) 및 항-마우스/인간 PD-L1(아테졸리주맙으로 공지되기도 한, 클론 S70, MPDL3280A, RG7446 또는 클론 YW243.55.S70; 참조: WO2010077634 및 Herbst R 등, 2014, Nature 515:563-7) 각각은 CH3 도메인에서 K409R 돌연변이(PC61-IgG1의 경우) 돌연변이 및 F405L 돌연변이(S70-IgG1의 경우)를 갖는 포유동물 발현 벡터(504865 | UCOER 발현 벡터 - 마우스 3.2kb Puro Set-Novagen)에서 클로닝하는 반면, 경쇄는 동일하게 유지되고, 포유동물 세포에서는 별도의 재조합 단백질로 생성된다. 이러한 부모 IgG1은 절반 분자의 재조합을 가능하게 하기 위해 허용되는 산화환원 조건하(예: 75mM 2-MEA, 5시간 배양)에 등몰량으로 시험관내에서 혼합한다. 쇄간 디설파이드 결합의 재산화를 허용하기 위해 환원제를 제거한 후, 생성되는 이종이량체 단백질은 SDS-PAGE 크로마토그래피 기반 또는 질량 분석법 기반 방법을 사용하여 교환 효율을 분석한다. Bs CD25 PD-L1의 경우, 질량 분석법은 이종이량체 단백질의 분자량이 클론 S70 단일 중쇄 및 경쇄(74 Kd) 및 PD61-IgG1 단일 중쇄 및 경쇄(77 Kd)의 분자량의 첨가에 상응하여 151 Kd임을 확인하였고, 각 부모 IgG1의 절반이 단일 분자에서 결합되었음을 나타낸다.
Bs CD25 PD-L1의 특이성은 대조군으로서 부모 항체, 및 FACS 완충액(PBS + 2% FCS + 2mM EDTA)으로 희석된 문헌 및 제조자 지침에 따라 사용된 IgG1-인식 검출 항체(aHuman, Alexa FluorR647, AffiniPure 염소 항-인간 IgG, Fcγ 단편 특이적; Jackson Labs 109-605-098)를 사용하여 실시예 5에 기재된 바와 같이 유동 세포 계측법에 의해 추가로 확인되었다. 추가의 유동 세포 계측법 및 세포 생물학 물질은 고정 가능한 생존 염료 eFluor780(Ebioscience 65086514), PMA(50ng/ml; Santa Cruz Biotechnology, sc-3576) 및 이오노마이신(400ng/ml; Sigma I0634), 및 골지 플러그 단백질 억제제(BD Bioscience, 512301KZ)이다.
MCA205 모델에서 Bs CD25 PD-L1의 검증은 이전 실시예에서 제시된 동일한 접근법을 사용하여 아이소타입 대조군, MCA205 주사 후 7일째에 투여된 단일특이적 항체(각각 100㎍) 또는 이중특이적 듀오바디(각각 200㎍) 및 10일째에 수득되고 제조된 마우스 조직을 사용하여 수행되었다.
고갈에 적합한 표적이 되도록 하는 Treg에서 CD25의 고발현
인터류킨-2 고친화도 수용체 알파(IL2Rα)인 CD25는 역사적으로 Treg의 진실된 표면 마커로서 사용되었고, 따라서 항체 매개 Treg 고갈용 표적로서 사용되었다. 항-CD25(aCD25)가 또한 활성화 효과기 T 세포를 제거할 수 있는지 여부에 관해 논란이 있었기 때문에, 종양 및 말초 림프양 기관에서 림프구 하위집단에서 CD25의 발현이 분석되었다.
마우스에 MCA205(5 x 105 세포, C57BL/6 마우스), B16(2.5 x 105 세포, C7BL/6 마우스) 또는 CT26(5 x 105 세포, BALB/c 마우스) 세포를 옆구리에 피하(s.c.) 주사하고, 10일 후 종양(TIL) 및 배수 림프절을 수거하여 유동 세포 계측법으로 분석하였다.
본 발명자들은 종양 도전 후 10일째에 종양 보유 마우스의 종양, 배수 림프절 및 혈액내에서 개별 T 림프구 하위집단에 의한 CD25의 상대적 발현을 평가하고자 하였다. 결과는 도 1에 도시된다. 상이한 모델의 이식 가능한 종양 세포주(MCA205 육종, MC38 결장 선암종, B16 흑색종 및 CT26 결장직장 암종을 포함함)에 걸쳐, CD25 발현은 이미 기재된 바와 같이(참조: Sakaguchi 등, 1995; J Immunol; Shimizu 등, 1999; J Immunol), CD4-양성, Foxp3-양성 T 세포(Treg)에서 지속적으로 높았고, CD4+Foxp3- 및 CD8+ T 세포에서 최소였다(도 1a). 이의 면역원성과 더 높은 T 세포 침윤 때문에, MCA205 종양 모델에서 Treg 고갈에 대한 영향을 보다 상세히 조사했다(도 1b-c). 시험관내 연구와는 달리, 효과기 구획 (CD4+FoxP3- 및 CD8+ T 세포) 상의 CD25의 최소 발현은 생체내에서 관찰되었다. 비록 CD25는 종양 침윤성 CD8+ 및 CD4+FoxP3- T 효과기 세포(Teff)에서 약간 상향 조절되었다. CD25-양성 세포의 백분율(3.08%-8.35% CD8+, 14.11-26.87% CD4-양성, Foxp3-음성 세포) 및 세포 기준당 발현 수준(CD8-양성에서 평균 형광 강도(MFI) 166.6 및 CD4-양성, Foxp3-음성 세포에서 134)은 Treg(83.66-90.23%, MFI 1051.9; p <0.001)에서보다 상당히 낮았다. 마지막으로, CD25는 또한 배수 림프절 및 혈액에 존재하는 Treg 상에서 발현되었지만, 평균 형광 강도(MFI)에 기초한 발현 수준은 종양 침윤성 Treg 상에서 더 높았다. Treg 세포와 비교하여 Teff 세포 상에서 CD25의 상당히 낮은 발현은, CD25가 Treg 상의 발현 수준이 유의하게 높은 종양에서의 Treg 고갈에 대해 적합하고 매력적인 표적이라는 것을 나타낸다.
아이소타입 스워핑은 항-CD25를 사용하는 효과적이고 안전한 종양내 Treg 고갈에 필요하다
전통적으로, 항-CD25 항체(αCD25) 클론 PC-61(랫트 IgG1, κ)(αCD25-r1)은 마우스 모델에서 Treg 고갈에 사용되어 왔으며, 이는 말초 림프양 기관에서 Treg의 제거를 유도하는 것으로 반복적으로 나타내었다. FcγR 결합에서 종간 차이를 피하기 위해, PC-61의 불변 영역은 아이오타입을 고갈시키는 마우스인 뮤린 IgG2a, κ(αCD25-m2a)와 스워핑되고, 말초 및 종양 둘 다에서의 Treg의 수를 정량화하고 종양 침윤성 Treg의 고갈을 초래하는 것으로 공지된 항-TLA4(αTLA4, 클론 9H10)의 효과와 비교하였다.
면역 조절 항체의 활성을 공동 정의하는 데에서 종양내 Treg 고갈의 중요성을 입증하는 이전의 증거에 기초하여, 본 발명자들은 이의 높은 면역원성 때문에 MCA205 마우스 모델에서 혈액, 배수 림프절(LN) 및 종양 침윤성 림프구(TIL)에서 Teff 및 Treg의 빈도 및 종양내 활성화 Teff에 대한 항-CD25의 임의의 잠재적인 부정적 영향을 평가하기 위한 αCD25-r1의 효과를 비교하고자 했다,
종양 보유 마우스에게 5 x 105 MCA205 세포로 피하 접종 후 5일째 및 7일째에 200㎍의 항-CD25-r1(αCD25-r1), 항-CD25-m2a(αCD25-m2a) 또는 항-CTLA-4(αCTLA-4)를 주사했다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 림프절(LN) 및 종양(TIL)을 9 일째에 수거하고, 유동 세포 계측법 분석을 위해 처리하여 염색하였다. 결과는 도 2 및 3에 도시된다.
αCD25의 생체내 투여는 림프절 및 특히 혈액에서 CD25+ 세포의 수를 항체 아이소타입과는 독립적으로 감소시켰다. 그들의 서명 전사 인자인 Foxp3의 발현에 의해 Treg의 수를 정량화할 때, 두 아이소타입은 다시 말초에서 동등하게 효과적이었지만, 놀랍게도 마우스 IgG2a 아이소타입만이 αCTLA4로 관찰된 수준에 필적할 만한 수준으로 종양 침윤성 Treg의 빈도 및 절대수를 현저하게 감소시켰다. CD25 발현은 종양 침윤성 효과기 T 세포의 작은 비율에서 상향조절되지만(참조: 실시예 1), 본 발명자들은 말초 또는 종양에서 CD8+ 및 CD4+Foxp3-의 수를 유의한 감소는 관찰되지 않았다. 결과적으로, 두 αCD25 아이소타입은 말초에서 증가된 Teff/Treg 비를 초래했다. 그러나 αCD25-m2a만이 말초에서가 아니라 종양 부위에서 Treg를 우선적으로 고갈시키는 것으로 공지된 항-CTLA4와 유사한 방식으로 이 비를 증가시켰다. 이는 이전 연구에서 확립된 종양에 대해 관찰된 효능의 부족을 잠재적으로 설명한다. 따라서, 항-CD25(마우스 IgG2a)만이 림프절과 혈액에서 Treg의 수를 감소시키고 종양 침윤성 Treg를 고갈시킨다. 중요하게는, 순환성 및 LN 상주성 Treg의 수가 감소했음에도 불구하고, αCD25-m2a의 다중 투여 후에 피부, 폐 및 간에서 거시적 독성의 증거가 관찰되지 않았다. 이러한 유형의 항-CD25 요법은 이러한 실험 동안 마우스에서 이의 독성으로 인해 다른 중요한 문제와 관련되지 않았는데, 이는 락테이트 탈수소효소(LDH)의 혈청 수준뿐만 아니라 일반적 건강 상태 및 전체 체중의 통계적으로 관련된 차이가 없었고, 간 효소(AST, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제; ALT, 알라닌 아미노-트랜스퍼라제)가 다른 치료군 중에서 측정되었기 때문이다.
피하 MCA205 종양을 보유한 마우스의 혈액, 비장, LN 및 종양에서 상이한 백혈구 하위 집단에 대한 활성 및 억제성 FcγR 모두의 발현 수준을 또한 결정하였다(도 4). FcγR은 다른 모든 연구 기관에 비해 종양 침윤성 골수 세포(과립구 세포, 통상의 수지상 세포 및 단핵구/대식세포)에서 더욱 발현되는 것으로 나타났다. FcγR에 대한 항-CD25의 두 Fc 변이체의 결합 친화도는 또한 표면 플라스몬 공명에 의해 결정되었다(표 1).
Figure pat00005
이들 데이터는 mIgG2a 아이소타입이 모든 FcγR 아형에 높은 억제성 대 활성적 비율(A/I)로 결합한다는 것을 입증한다. 대조적으로, rIgG1 아이소타입은 단일 활성 FcγR, FcγRIII뿐만 아니라 억제성 FcγRIIb와 유사한 친화도로 결합하여 낮은 A/I 비율(<1)을 초래한다.
상이한 FcγR의 발현이 결여된 마우스에서 종양 침윤성 Treg의 수는 어떤 특이적 FcγR이 항-CD25-매개 Treg 고갈에 관여하였는지를 구별하기 위해 상이한 마우스 모델에서 확립되었다(도 5). C57BL/6 대조군 마우스 및 Fcer1g-/- 마우스에 MCA205 세포를 피하 주사하고, 종양, 배수 림프절 및 혈액을 수거하고, 유동 세포 계측법을 위해 처리하여 염색하였다. 조절 T 세포는 CD4 및 FoxP3 발현에 의해 동정되었다. 총 CD4-양성 세포로부터의 Foxp3-양성의 백분율은 항-CD25 효과가 Fcer1g 유전자의 발현에 기인하는 방법을 보여준다. 임의의 활성화 FcγR(I, III 및 IV)을 전혀 발현하지 않는 Fcer1g-/- 마우스의 분석은 Treg 고갈의 완전한 부재를 입증했다. 말초에서 αCD25-r1에 의해, 그리고 말초 및 종양에서 αCD25-m2a에 의한 Treg 제거는 CD25에 대한 IL-2 결합의 차단이 아니라 FcγR 매개 ADCC로부터 기인한다. αCD25-m2a에 의한 고갈은 Fcgr3-/- 및 Fcgr4-/- 마우스 모두에서 Treg 제거가 유지되면서 임의의 개별적 활성 FcγR에 의존적이지 않았다. 따라서 αCD25-r1에 의한 말초 Treg의 고갈은 이 수용체의 높은 종양내 발현에도 불구하고 종양에서 고갈되지 않는다. 그러나 종양내 Treg 고갈은 억제성 수용체 FcγRIIb의 발현이 결여된 마우스에서 효과적으로 회복된다. 이 설정에서, 종양내 Treg 고갈은 αCD25-r1과 αCD25-m2a 사이에서 비교할 만하다. 따라서 종양에서 αCD25-r1에 의한 Treg 고갈의 결핍은 낮은 A/I 결합비와 이 아이소타입에 의해 결합된 단일 활성 수용체에 의해 매개되는 ADCC를 억제하는 FcγRIIb의 높은 종양내 발현으로 설명될 수 있다.
항-CD25 요법은 항-PD-1와 상승작용하고, 확립된 종양을 박멸시키고, 종양 보유 마우스의 생존을 증가시킨다
종양내 Treg 고갈에서 더 우수한 효율성 때문에, αCD25-m2a가 확립된 종양의 치료에서 더 나은 치료 결과를 가질 수 있다고 가설화되었다. 확립된 종양에 대한 αCD25-m2a 및 -r1의 항종양 활성은 종양이 확립될 때 MCA205 세포의 피하 이식 후 5일째에 αCD25의 단일 투여량을 투여하여 평가하였다. 결과는 도 6에 제공된다.
관찰된 종양내 Treg를 고갈시키는 능력의 부족과 일치하여, 확립된 종양(5일째)을 갖는 마우스에게 제공된 αCD25의 단일 투여는 αCD25-r1에 대한 보호를 초래하지 않았다.
한편, αCD25-m2a를 투여한 마우스의 성장 지연 및 장기간 생존이 관찰되었다(15.4%). 종양 미세환경 내에서 T 세포 조절을 조절하는 면역치료 표적으로서의 보조-억제성 수용체 PD-1 및 PD-1 핵심 역할을 표적화하는 약제의 임상 적 관련성 때문에, 본 발명자들은 CD25+ Treg 세포의 고갈 및 PD-1 차단이 조합으로 상승작용적일 수 있다고 가설화했다.
동일한 모델에서, 항 PD-1(αPD-1, 클론 RMP1-14; 3일마다 100㎍의 투여량으로)을 사용하여 αCD25와 PD-1 차단의 조합을 시험하였다. 단일 요법으로서의 αPD-1은 확립된 MCA205 종양 모델의 치료에 효과적이지 않고, αCD25-r1과의 조합은 이의 효과를 향상시키지 않았다.
그러나 αCD25-m2a의 단일 투여 후 αPD-1 치료에 의해 78.5%의 마우스에서 확립된 종양을 박멸시켜 100일 이상의 장기간 생존을 초래했다. 이러한 종양에서 종양 침윤성 Treg를 고갈시키지 못한 αCD25-r1과의 조합과 대조적으로, αCD25-m2a가 αPD-1 요법과 상승 작용을 하는 부분적 치료 효과를 갖는 MC38 및 CT26 종양 모델에서 유사한 결과가 관찰되었다. 따라서, 이 병용 투여는 효율적인 종양 제거가 상이한 종양 마우스 모델의 장기간 생존을 현저하게 개선시키도록 했다.
αCD25-m2a와 αPD-1 조합과의 상승작용에 기초하는 작용의 기전을 이해하기 위해, 본 발명자들은 치료 프로토콜의 끝인 αPD-1의 제3 투여 후 24시간 MCA205 종양 미세환경에 존재하는 종양 침윤성 림프구(TIL)의 표현형과 기능을 평가했다(도 7). αPD-1에 의한 단일요법은 Teff의 증식에도 종양에서의 Teff 침윤의 크기에도 영향을 미치지 않았으며, 여기서 본 발병자들은 치료 활성의 부족을 유지하는데 있어서 Treg의 지속적인 고빈도(데이터는 도시되지 않음) 및 Teff/Treg의 낮은 비율을 관찰했다.
반대로, αCD25-m2a에 의한 종양내 Treg 고갈은 종양내에서 높은 비율의 증식 및 인터페론-γ(IFN-γ) 생성 CD4+FoxP3- T 세포를 유도하였고, 이는 높은 Teff/Treg 비율 및 항-종양 반응에 상응한다. 이 효과는 항-PD-1과 함께 추가로 향상되었고, 이는 항-CD25-m2a에 의한 단일요법과 비교하여 훨씬 더 높은 증식 및 IFN-γ 생성 CD4-양성, FoxP3-음성 T 세포의 수의 1.6배 증가시켰다.
대조적으로, 항-CD25-r1에 의한 Treg 고갈의 관찰된 결핍은 단일요법으로 또는 항-PD-1과 조합하여 사용될 때, Teff 증식 또는 IFN-γ 생산에 변화를 초래하지 않았다.
효율적인 Treg 고갈을 가능하게 하는 원래의 마우스 IgG1 아이소타입 또는 마우스 IgG2a 아이소타입을 갖는 PC61으로 생성된 데이터는 그러한 항-CD25는 단독으로 또는 항암 항체와 조합하여 확립된 종양, 특히 효율적인 종양내 Treg 고갈을 필요로하는 종양을 거부하는데 효과적일 수 있음을 시사한다.
상기에 나타낸 바와 같이, αCD25-m2a의 단일 용량의 투여 후 αPD-1 요법은 MCA205 마우스 모델에서 종양 크기 및 마우스 생존 모두에 긍정적인 영향을 미쳤다. 항-CD25-m2a/항-PD1에 기인하는 이러한 치료 효과는 항-CD8 항체의 추가 투여가 종양 크기 및 마우스 생존을 미처리 동물에서 관찰된 수준으로 되게 하기 때문에 CD8-양성 T 세포의 활성에 의존적이다(도 8). 따라서, MCA205 종양 제거는 CD8-양성 및 Treg 세포 집단 모두에 대한 αPD-1/αCD25 상승 작용의 영향에 의존하며, 그 전체적인 효과기 T 세포 반응은 항-CD25 항체를 고갈시킴으로써 부정적으로 영향을 받지 않는다.
이러한 상승작용은 αCD25-m2a와 αPD-1이 GM-CSF-발현 전체 종양 세포 백신 인 Gvax와 조합되었을 때 면역원성이 불량한 B16 흑색종 종양 모델에 대해서도 관찰되었다(도 9). 이 시스템에서, Gvax 요법 단독도 Gvax와 αPD-1 또는 αCD25-r1의 조합도 종양 성장을 차단하거나 종양 보유 마우스의 생존을 연장시킬 수 없다. 이 설정에서, Gvax와 αCD25-m2a(단독 또는 αPD-1과 함께)의 조합만. 이러한 개선은 αCD25-r1이 투여된 임의의 치료군에서 관찰되지 않았다.
αPD-1(도 10) 또는 αPD-L1(도 11)이 투여되는 경우 모두 MC38 종양 모델에서 면역 체크포인트 억제제와 αCD25-m2a의 상승작용에 대한 유사한 결과가 관찰되었다. 또한, CT26 종양 모델은 이러한 조합의 치료 효과를 확인했다(도 12 및 13). 따라서, αCD25-m2a가 Treg 고갈에 기인하는 부분적 치료 효과를 가진 경우, 이 유리한 특성은 면역 체크포인트 억제제에 기초하는 요법에 대한 반응을 놀랍게도 증가시킬 가능성을 제공한다.
CD25는 인간 종양을 침윤하는 Treg 상에서 고도로 발현되고, 항-PD-1 요법은 인간 종양에서 CD25-발현 Treg의 침윤을 유도한다
CD25는 마우스 모델에 기초한 Treg 고갈 및 조합 면역요법 접근법을 위한 매력적인 표적으로 보인다. 인간에서 Treg 고갈에 대한 가능한 표적으로서 CD25를 입증하기 위해, 말초 혈액 및 종양 침윤성 림프구의 발현 수준은 유동 세포 계측법 및 면역조직화학(IHC)에 의해 난소암, 방광암, 흑색종, 비소세포 암종(NSCS) 및 신장 세포 암종(RCC) 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 사용하여 비교했다. 펨브로리주맙에 의한 αPD-1 요법 수용 전후의 RCC 환자의 종양 샘플에서 Treg 및 CD25 발현 수를 정량화하였다. 결과는 도 14와 15에 도시된다.
해부학적 위치, 종양 유형 또는 단계와는 독립적으로, Treg에서의 CD25 발현은 CD4+ Foxp3- (10-15%) 및 CD8+ (<5%) T 세포에서보다 유의하게 더 높다(50-85%)는 것이 관찰되었다. 뮤린 모델과 유사하게, MFI에 의해 평가된 CD25 발현 수준은 모든 연구된 종양 아형 내에서 CD4+FoxP3- 및 CD8+ Teff에 비해 CD4+FoxP3+ Treg에서 유의하게 더 높았다.
이러한 관찰은 다중 면역조직화학(IHC)에 의해 추가로 지지되었다. 동일한 환자 코호트로부터 흑색종, NSCLC 및 RCC 종양의 분석은 치밀한 CD8-양성 영역에서 조차, T 세포 침윤물인 CD25 발현은 FoxP3-양성 세포로 제한되어 유지되었음을 입증했다. 현저하게, 이 발현 프로파일은 종양 아형, 단계, 절제 부위, 현재 또는 이전 요법에 관계없이 일관되게 유지되었으며, 그들은 마우스 모델에서 얻은 데이터와 일치한다.
또한, 피하 뮤린 종양에서 관찰된 Treg의 높은 비율과 대조적으로, RCC 샘플은 미처리 종양에서 부족한 수의 Treg를 나타냈다. 그러나 항-PD-1 요법은 CD8+ T 세포와 Treg(Foxp3-양성 세포)에 의해 모두 유의한 침윤을 초래했다. 또한, 흑색종 및 RCC 샘플에서 생성된 데이터는 CD25가 Foxp3-양성 세포에 의해 고도로 발현되는 반면, 이의 발현은 Foxp3-음성, CD8-양성 세포에서는 최소였음을 확인했다.
CD25 발현이 치료적 면역 조절의 맥락에서 평가될 때. 코어 생검은 각각 진행된 신장암 및 흑색종 환자의 기준선 및 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙의 2주기의 의 4주기 후 동일한 병변에서 수행되었다. 전신 면역 조절에도 불구하고, CD25 발현은 다중 IHC에 의해 평가된 치밀한 CD8-양성 T 세포 침윤물의 영역에서조차 Foxp3-양성 Treg로 제한되어 유지되었다.
이러한 결과는 기재된 전 임상 데이터의 번역 값을 확인하고 인간 암에서 CD25를 통한 Treg의 선택적 치료 표적화의 개념에 대한 추가의 지원을 제공한다. 또한, 항-PD1 치료와 관련한 인간 고형 암에서의 CD25 발현 프로파일은 PD-1 길항제와 같은 면역 체크포인트 억제제에 의해 항-마우스 CD25 PC61(IgG2a)과 비교할 수 있을 만큼 CD25 결합 및 Fcγ 수용체 특이성을 갖는 항-인간 CD25 항체의 치료적 조합에 대한 근거를 제공한다.
항-CD25- 및 항-PD-L1-기반 이중특이적 항체 및 항체의 조합은 효율적인Treg 고갈 및 사이토카인 유도성을 제공한다
이전 실시예는 PC61에 기초하고, 적절한 아이소타입을 갖는 항체의 Treg 고갈, CD25 결합 특성이 PD-1 길항제(항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체임)와 같은 면역 체크포인트 단백질을 표적화하는 항체와 같은 다른 항암 화합물과 함께 이용될 수 있음을 보여주었다. 이러한 발견은 2가지 항원-결합 특성 및 관련 아이소타입(예: IgG1)을 결합하는 이중특이적 항체의 작제를 시사한다.
이 접근법은 Bs CD25 PD-L1(도 16a)로 명명된 단일 헤테로머 단백질 내에서 별도로 생산되는 두 개의 별개의 단일특이적 항체로부터 단일 중쇄 및 경쇄의 효율적인 결합을 가능하게 하는 듀오바디 기술을 사용하여 검증되었다. 이 항체의 결합 특이성은 각각 마우스 CD25 또는 마우스 PD-L1을 발현하는 두 개의 유전적으로 변형된 인간 세포주를 사용하여 검증되었으며, 초기 단일특이적 항체의 결합 특이성과 비교되었다(도 16b 및 c). 이들 세포주는 별도로 또는 동량으로 혼합되어 유동 세포 계측법으로 시험되어 Bs CD25 PD-L1이 CD25-양성 및 PD-L1-양성 세포에 동시에 결합함으로써 형성되는 이중 양성 세포 복합체의 복합체를 검출가능하게 하여도 이중 CD25, PD-L1 특이성을 유지한다는 것을 보여준다.
BsAb CD25 PD-L1의 기능적 특성은 이전 실시예에서 PC61을 검증하는데 사용 된 세포 상호작용 및 고갈 모델을 사용하여 생체내에서 평가했다. MCA205 모델은 종양 및 LN에서 효과기 및 조절 T 세포에 대한 BsAb의 영향을 평가하기 위해 사용되었다. 이 모델에서, BsAb CD25 PD-L1은 CD4 양성, Foxp3 양성 조절 T 세포를 인식하여 고갈시키고, 항-CD25 (PC61-m2a) 또는 단일특이적 항-CD25 및 항-PD-L1 항체의 조합(도 17 ab)과 동등한 효능으로 종양 및 LN에서 CD8-양성, Foxp3-양성 조절 T 세포 비율을 증가시킨다. 또한, BsAb CD25 PD-L1은 단일특이적 항-CD25와 항 -PD-L1의 조합과 적어도 유사하고 가능하게는 항-CD25 m2a 항체 중 하나 단독보다 우수한 수준에서 인터페론 감마를 발현하는 CD4-양성, CD5-양성 세포의 수를 증가시킨다(도 17c).
이 데이터는 암을 치료하기 위한 PC61-기반 Treg 고갈 항-인간 CD25 항체의 사용이 적절한 아이소타입을 선택함으로써 향상될 뿐만 아니라 다른 항암 약물, 특히 상이한 세포 표면 항원에 결합하는 항암 항체와 효율적으로 결합할 수 있는 방법을 보여준다. 이 접근법은 단일특이적 항체의 신규한 혼합물로서, 또는 부모 모노클로날 항체의 Treg 고갈, CD25 결합 및 다른 결합 특성을 유지하기 위해 관련되고 생산되는 신규한 이중특이적 항체로서 2개의 생성물을 생성하고 투여함으로써 추구될 수 있다.
본 명세서에 언급된 모든 문헌은 참조된 주제에 특별한 주의를 기울이면서 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범위 및 취지로부터 벗어나지 않고 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 특정의 바람직한 구현예와 관련하여 기재되었지만, 청구된 본 발명은 이러한 특정 구현예에 부당하게 제한되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 실제로, 분자 생물학, 세포 면역학 또는 관련 분야의 숙련자에게 자명한 본 발명을 수행하기 위한 기재된 방식의 다양한 변형은 하기 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
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Claims (18)

  1. 항-CD25 항체를 포함하는 인간 대상체의 고형 종양 치료용 약제학적 조성물로서, 상기 항-CD25 항체는 FcγRI,FcγRIIc 및 FcγRIIIa로부터 선택된 적어도 하나의 활성화 Fcγ수용체에 고친화도로 결합하고 종양-침윤성 조절 T 세포를 고갈시키는 인간 IgG1 항체이고, 상기 조성물은 면역 체크포인트 억제제와 조합하여 상기 대상체에게 투여하기 위한 것인, 약제학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 면역 체크포인트 억제제는 PD-1 길항제인, 약제학적 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 PD-1 길항제는 항-PD-1 항체인, 약제학적 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    항-PD-1 항체는 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙인, 약제학적 조성물.
  5. 제 2항에 있어서,
    상기 PD-1 길항제는 항-PD-L1 항체인, 약제학적 조성물.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙인, 약제학적 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 항-CD25 항체는 CD25에 대해 10-8 M 미만의 해리 상수(Kd)를 갖는, 약제학적 조성물.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 항-CD25 항체는 적어도 하나의 활성화 Fcγ수용체에 대해 약 10-6M 미만의 해리 상수(Kd)를 갖는 약제학적 조성물.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 항-CD25 항체가 1보다 우수한 활성적 대 억제성 비(A/I)로 Fcγ수용체에 결합하는 약제학적 조성물.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 항-CD25 항체는 FcγRIIb에 결합하는 것보다 더 높은 친화도로 FcγRI, FcγRIIc 및 FcγRIIIa 중의 적어도 하나에 결합하는 약제학적 조성물.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 항-CD25 항체가 모노클로날 항체인 약제학적 조성물.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 항-CD25 항체가 인간, 키메라 또는 인간화 항체인 약제학적 조성물.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 항-CD25 항체가 CDC, ADCC 및 ADCP 반응 중 적어도 하나로부터 선택되는 반응을 유도하는 약제학적 조성물.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 항-CD25 항체는 증가된 ADCC 및 증가된 ADCP 반응 중 적어도 하나로부터 선택되는 반응을 유도하는 약제학적 조성물.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 항-CD25 항체는 증가된 ADCC 반응을 유도하는 약제학적 조성물.
  16. 제 1항에 있어서,
    상기 항-CD25 항체가 확립된 종양을 갖는 대상체에게 투여되는 약제학적 조성물.
  17. 인간 대상체의 암을 치료에 사용하기 위한, 제 1항에 따른 항-CD25 항체 및 면역 체크포인트 억제제를 포함하고, 상기 항-CD25 항체 및 면역 체크포인트 억제제가 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여되는, 약제학적 조성물.
  18. 인간 대상체의 암 치료에 사용하기 위한, 제 1항에 따른 항-CD25 항체 및 면역 체크포인트 억제제를 포함하고, 상기 항-CD25항체 및 면역 체크포인트 억제제는 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여되는, 키트.
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