TW201930591A - 用於與嵌合抗原受體療法併用之免疫增強rna - Google Patents

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雷瑟斯 Ｒ 強森
卡爾 Ｈ 均
安迪 Ｊ 明恩
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Abstract

本發明提供一種治療諸如癌症之疾病的組合物及方法。本發明亦關於一種投與嵌合抗原受體(CAR)療法及另一治療劑之方法。

Description

用於與嵌合抗原受體療法併用之免疫增強RNA
本發明大體上係關於經工程改造以表現嵌合抗原受體之細胞視情況與RNA分子組合用於治療諸如癌症之疾病的用途。
使用經嵌合抗原受體(CAR)修飾之T細胞(CART)療法的最新開發在利用免疫系統治療癌症之能力方面展示有前景的結果，該療法依賴於將T細胞再導向至癌細胞上之適合細胞表面分子(參見例如Sadelain等人, Cancer Discovery 3:388-398 (2013))。
考慮到持續需要改良之靶向諸如癌症之疾病的策略，特別需要用於改良CART療法之新組合物及方法。
本發明至少部分提供使用表現嵌合抗原受體(CAR)分子之免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)治療諸如癌症之病症的組合物及方法，該嵌合抗原受體(CAR)分子例如結合至腫瘤抗原，例如表現於實體腫瘤或血液腫瘤之表面上的抗原之CAR分子。在一個態樣中，本發明提供CAR表現細胞療法與RNA分子(例如外源RNA分子)，例如刺激RNA分子，例如免疫刺激RNA分子組合之用途。在一些實施例中，該RNA分子為病毒樣雙股RNA分子。在一些實施例中，該RNA分子為人類RN7SL1 RNA分子或其功能變異體。在一些實施例中，該RNA分子增加免疫活性。在一些實施例中，該RNA分子可活化抗原呈現細胞，諸如樹突狀細胞，及T細胞。在不希望受理論束縛的情況下，在一些實施例中，RNA分子之活性至少部分由其二級結構(例如雙股結構，例如髮夾結構)介導，且多種核苷酸序列將具有該活性。
在一個態樣中，本文揭示一種治療患有與第一抗原，例如第一腫瘤抗原之表現相關的疾病之個體之方法，例如一種治療患有癌症之個體之方法，其包含向該個體投與有效數量之表現結合至該第一抗原，例如該第一腫瘤抗原之嵌合抗原受體(CAR)分子的細胞(例如細胞群體)(「CAR表現細胞」)，與RNA分子(例如外源RNA分子)或編碼該RNA分子之核酸分子(例如外源核酸分子)的組合。在一些實施例中，該RNA分子包含第一RNA序列(例如第一外源RNA序列)及第二RNA序列(例如第二外源RNA序列)。在一些實施例中，該第一RNA序列與該第二RNA序列至少80%、85%或90%互補。在一些實施例中，該第一RNA序列長度為至少20個核苷酸且該第二RNA序列長度為至少20個核苷酸。在一些實施例中，該RNA分子增加免疫活性。在一些實施例中，該RNA分子具有以下特性中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12者或全部)：
(i)該RNA分子活化模式識別受體(PRR)，例如視黃酸誘導基因I (RIG-I)；
(ii)該RNA分子活化樹突狀細胞(DC)，例如：如藉由量測DC中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測DC中CD80、CD86或鹼性白胺酸拉鏈轉錄因子ATF-樣3(Batf3)表現之增加，或：如藉由量測DC激活CD8+ T細胞之能力；
(iii)該RNA分子活化巨噬細胞，例如：如藉由量測巨噬細胞中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測巨噬細胞中CD80表現之增加；
(iv)該RNA分子活化T細胞，例如：如藉由量測T細胞中活化標記物表現之增加、T細胞擴增之增加、或T細胞所產生細胞介素之增加，例如：如藉由量測T細胞中CD69或PD-1表現之增加，或如藉由量測T細胞所產生之IFNγ或TNFα；
(v)該RNA分子增強免疫浸潤至腫瘤中，例如DC或T細胞浸潤至腫瘤中；
(vi)該RNA分子減少腫瘤生長；
(vii)該RNA分子提高該個體之存活；
(viii)該RNA分子增強該個體對該等CAR表現細胞或檢查點調節劑(例如抗PD-1抗體分子、抗PD-L1抗體分子、抗CTLA-4抗體分子、抗TIM-3抗體分子或抗LAG-3抗體分子)之反應性；
(ix)該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合；
(x)該RNA分子為天然存在之RN7SL1 RNA分子的功能變異體，其中該RNA分子保留該天然存在之RN7SL1 RNA分子的全部或部分免疫原性特性，視情況其中該RNA分子顯示比該天然存在之RN7SL1 RNA分子降低的與SRP9及/或SRP14之結合性，例如該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合；
(xi)該RNA分子不為聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)；
(xii)該RNA分子不具有RNAi或反義抑制活性或該RNA分子具有最小RNAi或反義抑制活性；或
(xiii)該RNA分子與天然存在之人類基因具有不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%序列一致性。
在一個態樣中，本文揭示一種在患有癌症之個體中提供抗癌免疫反應之方法，其包含向該個體投與有效數量之表現會與第一抗原，例如第一腫瘤抗原結合之嵌合抗原受體(CAR)分子的細胞(例如細胞群體)(「CAR表現細胞」)，與RNA分子(例如外源RNA分子)或編碼該RNA分子之核酸分子(例如外源核酸分子)的組合。在一些實施例中，該RNA分子包含第一RNA序列(例如第一外源RNA序列)及第二RNA序列(例如第二外源RNA序列)。在一些實施例中，該第一RNA序列與該第二RNA序列至少80%、85%或90%互補。在一些實施例中，該第一RNA序列長度為至少20個核苷酸且該第二RNA序列長度為至少20個核苷酸。在一些實施例中，該RNA分子增加免疫活性。在一些實施例中，該RNA分子具有以下特性中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12者或全部)：
(i)該RNA分子活化模式識別受體(PRR)，例如視黃酸誘導基因I (RIG-I)；
(ii)該RNA分子活化樹突狀細胞(DC)，例如：如藉由量測DC中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測DC中CD80、CD86或鹼性白胺酸拉鏈轉錄因子ATF-樣3(Batf3)表現之增加，或：如藉由量測DC激活CD8+ T細胞之能力；
(iii)該RNA分子活化巨噬細胞，例如：如藉由量測巨噬細胞中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測巨噬細胞中CD80表現之增加；
(iv)該RNA分子活化T細胞，例如：如藉由量測T細胞中活化標記物表現之增加、T細胞擴增之增加、或T細胞所產生細胞介素之增加，例如：如藉由量測T細胞中CD69或PD-1表現之增加，或如藉由量測T細胞所產生之IFNγ或TNFα；
(v)該RNA分子增強免疫浸潤至腫瘤中，例如DC或T細胞浸潤至腫瘤中；
(vi)該RNA分子減少腫瘤生長；
(vii)該RNA分子提高該個體之存活；
(viii)該RNA分子增強該個體對該等CAR表現細胞或檢查點調節劑(例如抗PD-1抗體分子、抗PD-L1抗體分子、抗CTLA-4抗體分子、抗TIM-3抗體分子或抗LAG-3抗體分子)之反應性；
(ix)該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合；
(x)該RNA分子為天然存在之RN7SL1 RNA分子的功能變異體，其中該RNA分子保留該天然存在之RN7SL1 RNA分子的全部或部分免疫原性特性，視情況其中該RNA分子顯示比該天然存在之RN7SL1 RNA分子降低的與SRP9及/或SRP14之結合性，例如該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合；
(xi)該RNA分子不為聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)；
(xii)該RNA分子不具有RNAi或反義抑制活性或該RNA分子具有最小RNAi或反義抑制活性；或
(xiii)該RNA分子與天然存在之人類基因具有不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%序列一致性。
在一些實施例中，該第一RNA序列長度為至少25、30、35、40、45或50個核苷酸。在一些實施例中，該第二RNA序列長度為至少25、30、35、40、45或50個核苷酸。在一些實施例中，該第一RNA序列長度為至少25、30、35、40、45或50個核苷酸；且該第二RNA序列長度為至少25、30、35、40、45或50個核苷酸。
在一些實施例中，該第一RNA序列及該第二RNA序列形成雙股RNA分子。在一些實施例中，該第一RNA序列及該第二RNA序列形成長度為至少20、25、30、35、40、45或50個鹼基對之雙股RNA分子。
在一些實施例中，該第一RNA序列與該第二RNA序列100%互補。
在一些實施例中，該第一RNA序列及該第二RNA序列安置於一個RNA分子上。在一些實施例中，該第一RNA序列及該第二RNA序列形成髮夾結構。在一些實施例中，該第一RNA序列及該第二RNA序列形成莖-環結構。在一些實施例中，該莖長度為至少20、25、30、35、40、45或50個鹼基對。在一些實施例中，該環長度為2-10、3-8或4-6個核苷酸。
在一些實施例中，該第一RNA序列及該第二RNA序列安置於分別的RNA分子上。
在一些實施例中，該RNA分子包含一或多個Alu結構域。在一些實施例中，該Alu結構域包含SEQ ID NO: 4或6之胺基酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。在一些實施例中，該Alu結構域包含SEQ ID NO: 4或6之胺基酸序列。
在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 2、4、6、8、10之核苷酸序列或其功能變異體。在一些實施例中，該RNA分子包含選自SEQ ID NO: 2、4、6、8或10之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。在一些實施例中，該RNA分子包含選自SEQ ID NO: 2、4、6、8或10之核苷酸序列。在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 2之核苷酸序列。在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 4之核苷酸序列。在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 6之核苷酸序列。在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 8之核苷酸序列。在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。
在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 1、3、5、7、9之核苷酸序列或其功能變異體。在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含選自SEQ ID NO: 1、3、5、7或9之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。
在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含選自SEQ ID NO: 1、3、5、7或9之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 1之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 3之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 5之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 7之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 9之核苷酸序列。
在一些實施例中，該RNA分子包含5'-三磷酸(5'ppp)。
在一些實施例中，該RNA分子包含至少一個經化學修飾之核苷酸。
在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子為DNA分子。
在一些實施例中，該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子連接於部分，例如結合至腫瘤抗原或組織抗原之靶向部分，例如結合至該第一抗原，例如該第一腫瘤抗原之部分。在一些實施例中，該個體具有腫瘤且該部分使該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子靶向至該腫瘤或腫瘤微環境。
在一些實施例中，該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子係全身投與。在一些實施例中，該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子係局部投與。在一些實施例中，該個體具有腫瘤且該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子係經由腫瘤內投藥投與。
在一些實施例中，該方法包含投與編碼該RNA分子之該核酸分子，其中該RNA分子之表現為誘導性的。在一些實施例中，該個體具有腫瘤且該RNA分子之表現在該腫瘤或腫瘤微環境中為誘導性的。
在一些實施例中，該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子係於囊泡，例如胞外體、脂質體或細胞中投與。
在一些實施例中，該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子安置於與該CAR分子相同之細胞中。
在一些實施例中，該細胞包含編碼該CAR分子之第一核酸分子(例如第一外源核酸分子)及包含編碼該RNA分子之該核酸分子的第二核酸分子(例如第二外源核酸分子)。
在一些實施例中，該第一核酸分子及該第二核酸分子安置於一個核酸分子上。在一些實施例中，該一個核酸分子沿N末端至C末端方向具有以下排列：該第二核酸分子-連接子-該第一核酸分子。在一些實施例中，該連接子編碼自身裂解位點。在一些實施例中，該連接子編碼P2A位點、T2A位點、E2A位點或F2A位點。在一些實施例中，該連接子編碼P2A位點。在一些實施例中，該連接子包含SEQ ID NO: 23之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。在一些實施例中，該第二核酸分子包含SEQ ID NO: 9之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。
在一些實施例中，該第一核酸分子及該第二核酸分子安置於分別的核酸分子上。在一些實施例中，該細胞包含編碼synNotch多肽之第三核酸分子。在一些實施例中，該synNotch多肽包含(i)胞外結構域，其包含非天然存在於Notch受體多肽中且特異性結合至第二抗原，例如第二腫瘤抗原之第二抗原結合結構域。在一些實施例中，該第二抗原與該第一抗原相同。在一些實施例中，該第二抗原與該第一抗原不同。在一些實施例中，該synNotch多肽進一步包含(ii) Notch受體多肽，其包含配體誘導性蛋白水解裂解位點，例如包含Lin 12-Notch重複序列之Notch調節區、S2蛋白水解裂解位點或包含S3蛋白水解裂解位點之跨膜結構域。在一些實施例中，該synNotch多肽進一步包含(iii)胞內結構域，其包含轉錄因子。在一些實施例中，該第二抗原結合結構域與該第二抗原，例如該第二腫瘤抗原之結合誘導該配體誘導性蛋白水解裂解位點處之裂解，例如誘導該S2及/或S3蛋白水解裂解位點處之裂解，因而釋出包含該轉錄因子之該胞內結構域，其中該轉錄因子一旦釋出，即活化編碼該RNA分子之該核酸分子的轉錄。在一些實施例中，(a)該轉錄因子包含Gal4 DNA結合結構域及視情況VP64轉錄活化結構域，且(b)編碼該RNA分子之該核酸分子的N末端連接於Gal4上游活化序列。在一些實施例中，(1)該synNotch多肽包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)，且(2)該Gal4上游活化序列包含SEQ ID NO: 18之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。
在一些實施例中，該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子安置於與該CAR分子不同之細胞中。在一些實施例中，包含該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子的該細胞進一步包含編碼synNotch多肽之核酸分子，其中該synNotch多肽包含：
(i)胞外結構域，其包含非天然存在於Notch受體多肽中且特異性結合至第二抗原，例如第二腫瘤抗原之第二抗原結合結構域，視情況其中該第二抗原與該第一抗原相同，或該第二抗原與該第一抗原不同；
(ii) Notch受體多肽，其包含配體誘導性蛋白水解裂解位點，例如包含Lin 12-Notch重複序列之Notch調節區、S2蛋白水解裂解位點或包含S3蛋白水解裂解位點之跨膜結構域；及
(iii)胞內結構域，其包含轉錄因子，其中：
該第二抗原結合結構域與該第二抗原，例如該第二腫瘤抗原之結合誘導該配體誘導性蛋白水解裂解位點處之裂解，例如誘導該S2及/或S3蛋白水解裂解位點處之裂解，因而釋出包含該轉錄因子之該胞內結構域，其中：
該轉錄因子一旦釋出，即活化編碼該RNA分子之該核酸分子的轉錄，視情況其中：
(a)該轉錄因子包含Gal4 DNA結合結構域及視情況VP64轉錄活化結構域，且
(b)編碼該RNA分子之該核酸分子的N末端連接於Gal4上游活化序列，視情況其中：
(1)該synNotch多肽包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)，且
(2)該Gal4上游活化序列包含SEQ ID NO: 18之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。
在一些實施例中，該CAR分子沿N末端至C末端方向包含結合至該第一抗原，例如該第一腫瘤抗原之第一抗原結合結構域；跨膜結構域；及胞內信號傳導結構域，視情況其中該第一抗原結合結構域藉由鉸鏈結構域連接至該跨膜結構域。
在一些實施例中，該第一或第二抗原係選自：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1；C型凝集素樣分子-1，CD33；表皮生長因子受體變異體III (EGFRvIII)；神經節苷脂G2 (GD2)；神經節苷脂GD3；TNF受體家族成員；B細胞成熟抗原；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特異性膜抗原(PSMA)；受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1 (ROR1)；Fms樣酪胺酸激酶3 (FLT3)；腫瘤相關糖蛋白72 (TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮細胞黏附分子(EPCAM)；B7H3 (CD276)；KIT (CD117)；介白素-13受體次單元α-2；間皮素；介白素11受體α (IL-11Ra)；前列腺幹細胞抗原(PSCA)；蛋白酶絲胺酸21；血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)；路易(Y)抗原；CD24；血小板衍生生長因子受體β (PDGFR-β)；階段特異性胚抗原-4 (SSEA-4)；CD20；葉酸受體α；受體酪胺酸-蛋白激酶ERBB2 (Her2/neu)；黏蛋白1，細胞表面相關(MUC1)；表皮生長因子受體(EGFR)；神經細胞黏附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸磷酸酶(PAP)；伸長因子2突變(ELF2M)；Ephrin B2；纖維母細胞活化蛋白α (FAP)；胰島素樣生長因子1受體(IGF-I受體)，碳酸酐酶IX (CAIX)；蛋白酶體(Prosome，Macropain)次單元，β型，9 (LMP2)；糖蛋白100 (gp100)；由斷點簇區(BCR)及Abelson鼠類白血病病毒性致癌基因同源物1 (Abl)組成之致癌基因多肽(bcr-abl)；酪胺酸酶；ephrin A型受體2 (EphA2)；海藻糖基GM1；唾液酸基路易(Lewis)黏附分子(sLe)；神經節苷脂GM3；轉麩醯胺酸酶5 (TGS5)；高分子量黑素瘤相關抗原(HMWMAA)；o-乙醯基-GD2神經節苷脂(OAcGD2)；葉酸受體β；腫瘤內皮標記物1 (TEM1/CD248)；腫瘤內皮標記物7相關(TEM7R)；緊密連接蛋白(claudin)6 (CLDN6)；促甲狀腺激素受體(TSHR)；G蛋白偶合受體C類第5組，成員D (GPRC5D)；染色體X開放閱讀框架61 (CXORF61)；CD97；CD179a；退行性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盤特異性1 (PLAC1)；globoH糖基神經醯胺之六醣部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白(uroplakin)2 (UPK2)；A型肝炎病毒細胞受體1 (HAVCR1)；腎上腺素受體β 3 (ADRB3)；泛連接蛋白(pannexin)3 (PANX3)；G蛋白偶合受體20 (GPR20)；淋巴細胞抗原6複合物，基因座K 9 (LY6K)；嗅覺受體51E2 (OR51E2)；TCR γ交替閱讀框架蛋白(TARP)；威爾姆斯腫瘤(Wilms tumor)蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1 (NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2 (LAGE-1a)；黑素瘤相關抗原1 (MAGE-A1)；ETS易位變異基因6，位於染色體12p上(ETV6-AML)；精子蛋白17 (SPA17)；X抗原家族，成員1A (XAGE1)；血管生成素結合細胞表面受體2 (Tie 2)；黑素瘤癌症睾丸抗原-1 (MAD-CT-1)；黑素瘤癌症睾丸抗原-2 (MAD-CT-2)；Fos相關抗原1；腫瘤蛋白p53 (p53)；p53突變體；前列腺蛋白；存活素；端粒酶；前列腺癌腫瘤抗原-1，由T細胞識別之黑素瘤抗原1；大鼠肉瘤(Ras)突變體；人類端粒酶反轉錄酶(hTERT)；肉瘤易位斷點；細胞凋亡之黑素瘤抑制劑(ML-IAP)；ERG (跨膜蛋白酶，絲胺酸2 (TMPRSS2) ETS融合基因)；N-乙醯基葡糖胺基-轉移酶V (NA17)；成對盒蛋白Pax-3 (PAX3)；雄激素受體；細胞週期素B1；v-myc禽類髓細胞瘤病病毒性致癌基因神經母細胞瘤衍生同源物(MYCN)；Ras同源物家族成員C (RhoC)；酪胺酸酶相關蛋白2 (TRP-2)；細胞色素P450 1B1 (CYP1B1)；CCCTC結合因子(鋅指蛋白)樣，由T細胞識別之鱗狀細胞癌抗原3 (SART3)；成對盒蛋白Pax-5 (PAX5)；前頂體素(proacrosin)結合蛋白sp32 (OY-TES1)；淋巴細胞特異性蛋白酪胺酸激酶(LCK)；激酶錨定蛋白4 (AKAP-4)；滑膜肉瘤，X斷點2 (SSX2)；晚期糖基化最終產物之受體(RAGE-1)；腎遍在蛋白(renal ubiquitous) 1 (RU1)；腎遍在蛋白2 (RU2)；豆莢蛋白；人類乳頭狀瘤病毒E6 (HPV E6)；人類乳頭狀瘤病毒E7 (HPV E7)；腸道羧基酯酶；突變之熱休克蛋白70-2 (mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白細胞相關免疫球蛋白樣受體1 (LAIR1)；IgA受體之Fc片段(FCAR或CD89)；白細胞免疫球蛋白樣受體亞家族A成員2 (LILRA2)；CD300分子樣家族成員f (CD300LF)；C型凝集素結構域家族12成員A (CLEC12A)；骨髓基質細胞抗原2 (BST2)；含EGF樣模組之黏蛋白樣激素受體樣2 (EMR2)；淋巴細胞抗原75 (LY75)；磷脂醯肌醇蛋白聚糖(Glypican)-3 (GPC3)；Fc受體樣5 (FCRL5)；或免疫球蛋白λ樣多肽1 (IGLL1)。
在一些實施例中，該第一或第二抗原係選自CD19、CD22、BCMA、CD20、CD123、EGFRvIII或間皮素。在一些實施例中，該第一或第二抗原為CD19。在一些實施例中，該第一或第二抗原為BCMA。在一些實施例中，該第一或第二抗原為EGFRvIII。在一些實施例中，該第一或第二抗原為間皮素。
在一些實施例中，該跨膜結構域包含選自以下之蛋白質的跨膜結構域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD123、CD134、CD137或CD154。在一些實施例中，該跨膜結構域包含CD8之跨膜結構域。在一些實施例中，該跨膜結構域包含SEQ ID NO: 635之胺基酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入或缺失，例如保守取代之序列)。在一些實施例中，該跨膜結構域包含SEQ ID NO: 635之胺基酸序列。
在一些實施例中，該胞內信號傳導結構域包含初級信號傳導結構域。在一些實施例中，該初級信號傳導結構域包含來源於以下之功能性信號傳導結構域：CD3 ζ、TCR ζ、FcR γ、FcR β、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278 (ICOS)、FcεRI、DAP10、DAP12或CD66d。在一些實施例中，該初級信號傳導結構域包含來源於CD3 ζ之功能性信號傳導結構域。在一些實施例中，該初級信號傳導結構域包含SEQ ID NO: 641或643之胺基酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入或缺失，例如保守取代之序列)。在一些實施例中，該初級信號傳導結構域包含SEQ ID NO: 641或643之胺基酸序列。
在一些實施例中，該胞內信號傳導結構域包含共刺激結構域。在一些實施例中，該共刺激結構域包含來源於以下之功能性信號傳導結構域：MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整合素、信號傳導淋巴細胞性活化分子(SLAM)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配體受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、4-1BB (CD137)、B7-H3、ICOS (CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM (LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244，2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A，Ly108)、SLAM (SLAMF1，CD150，IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a或與CD83特異性結合之配體。在一些實施例中，該共刺激結構域包含來源於4-1BB之功能性信號傳導結構域。在一些實施例中，該共刺激結構域包含SEQ ID NO: 637之胺基酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入或缺失，例如保守取代之序列)。在一些實施例中，該共刺激結構域包含SEQ ID NO: 637之胺基酸序列。
在一些實施例中，該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子及該CAR表現細胞係同時投與。在一些實施例中，該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子及該CAR表現細胞係依序投與，例如該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子係在投與該CAR表現細胞之前或之後投與。
在一些實施例中，該方法進一步包含投與第三治療劑。在一些實施例中，該第三治療劑係在投與該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子之前投與。在一些實施例中，該第三治療劑係在投與該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子之後投與。在一些實施例中，該第三治療劑及該RNA分子係同時投與。在一些實施例中，該第三治療劑及編碼該RNA分子之該核酸分子係同時投與。在一些實施例中，該第三治療劑係在投與該CAR表現細胞之前投與。在一些實施例中，該第三治療劑係在投與該CAR表現細胞之後投與。在一些實施例中，該第三治療劑及該CAR表現細胞係同時投與。
在一些實施例中，該第三治療劑為前-M2巨噬細胞分子之抑制劑。
在一些實施例中，該第三治療劑係選自IL-13抑制劑、IL-4抑制劑、IL-13Rα1抑制劑、IL-4Rα抑制劑、IL-10抑制劑、CSF-1抑制劑、CSF1R抑制劑、TGF β抑制劑、JAK2抑制劑、細胞表面分子、氧化鐵、小分子抑制劑、PI3K抑制劑、HDAC抑制劑、糖分解路徑之抑制劑、粒線體靶向抗氧化劑、氯膦酸鹽脂質體或其組合。在一些實施例中，該第三治療劑為CSF1R抑制劑。在一些實施例中，該第三治療劑為結合至CSF1R之抗體分子。在一些實施例中，該第三治療劑為CSF1R之小分子抑制劑。在一些實施例中，該第三治療劑為BLZ945。
在一些實施例中，該第三治療劑為檢查點調節劑，視情況其中該第三治療劑為抗PD-1抗體分子、抗PD-L1抗體分子、抗CTLA-4抗體分子、抗TIM-3抗體分子或抗LAG-3抗體分子。在一些實施例中，該檢查點調節劑係在投與該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子之後投與。在一些實施例中，該檢查點調節劑係在投與該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子之前投與。在一些實施例中，該檢查點調節劑及該RNA分子係同時投與。在一些實施例中，該檢查點調節劑及編碼該RNA分子之該核酸分子係同時投與。在一些實施例中，該檢查點調節劑係在投與該CAR表現細胞之後投與。在一些實施例中，該檢查點調節劑係在投與該CAR表現細胞之前投與。在一些實施例中，該檢查點調節劑及該CAR表現細胞係同時投與。
在一些實施例中，該第三治療劑為Flt3配體多肽。
在一些實施例中，投與該RNA分子增強該個體中的該第三治療劑之活性，例如至少20、40、60、80、100、500或1000%。在一些實施例中，投與該CAR表現細胞增強該個體中的該第三治療劑之活性，例如至少20、40、60、80、100、500或1000%。在一些實施例中，該第三治療劑為檢查點調節劑。在一些實施例中，該第三治療劑為抗PD-1抗體分子、抗PD-L1抗體分子、抗CTLA-4抗體分子、抗TIM-3抗體分子或抗LAG-3抗體分子。在一些實施例中，該第三治療劑為抗PD-1抗體分子。在一些實施例中，該第三治療劑為抗CTLA-4抗體分子。在一些實施例中，該增強在具有內源T細胞之個體中出現。在一些實施例中，該增強經由內源T細胞之活化出現。
在一些實施例中，與第一抗原之表現相關的該疾病為癌症。在一些實施例中，該癌症展現腫瘤抗原之異源表現，例如其中該癌症中少於90%、80%、70%、60%或50%之細胞表現該第一腫瘤抗原，或其中該癌症中少於90%、80%、70%、60%或50%之細胞對該CAR表現細胞有反應。在一些實施例中，該癌症係選自間皮瘤(例如惡性胸膜間皮瘤)；肺癌(例如非小細胞肺癌、小細胞肺癌、鱗狀細胞肺癌或大細胞肺癌)；胰臟癌(例如胰管腺癌或轉移性胰管腺癌(PDA))；食道腺癌、卵巢癌(例如漿液性上皮卵巢癌)、乳癌、結腸直腸癌、膀胱癌或其任何組合。在一些實施例中，該癌症為血液癌症，例如選自白血病或淋巴瘤之血液癌症，例如該癌症係選自慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、多發性骨髓瘤、急性淋巴性白血病(ALL)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、B細胞急性淋巴性白血病(BALL)、T細胞急性淋巴性白血病(TALL)、小淋巴細胞性白血病(SLL)、B細胞前淋巴細胞性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、與慢性發炎相關之DLBCL、慢性骨髓性白血病、骨髓增生性贅瘤、濾泡性淋巴瘤、兒童濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞-或大細胞-濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴增生性病狀、MALT淋巴瘤(黏膜相關淋巴組織之結外邊緣區淋巴瘤)、邊緣區淋巴瘤、骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群、非霍奇金淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、脾邊緣區淋巴瘤、脾淋巴瘤/白血病、脾瀰漫性紅髓小B細胞淋巴瘤、毛細胞白血病-變異形式、淋巴漿細胞淋巴瘤、重鏈疾病、漿細胞骨髓瘤、骨骼之孤立性漿細胞瘤、骨外漿細胞瘤、結內邊緣區淋巴瘤、兒童結內邊緣區淋巴瘤、原發性皮膚毛囊中心淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫、原發性縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、ALK+大B細胞淋巴瘤、HHV8相關多中心卡斯特萊曼病(Castleman disease)中出現的大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)或不可分類淋巴瘤。
在一個態樣中，本文揭示一種核酸分子(例如外源核酸分子)，其包含(1)編碼會與第一抗原，例如第一腫瘤抗原結合之嵌合抗原受體(CAR)分子的第一核酸分子(例如第一外源核酸分子)，及(2)包含RNA分子(例如外源RNA分子)或編碼該RNA分子之核酸分子的第二核酸分子(例如第二外源核酸分子)。在一些實施例中，該RNA分子包含第一RNA序列(例如第一外源RNA序列)及第二RNA序列(例如第二外源RNA序列)。在一些實施例中，該第一RNA序列與該第二RNA序列至少80%、85%或90%互補。在一些實施例中，該第一RNA序列長度為至少20個核苷酸且該第二RNA序列長度為至少20個核苷酸。在一些實施例中，該RNA分子增加免疫活性。在一些實施例中，該RNA分子具有以下特性中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12者或全部)：
(i)該RNA分子活化模式識別受體(PRR)，例如視黃酸誘導基因I (RIG-I)；
(ii)該RNA分子活化樹突狀細胞(DC)，例如：如藉由量測DC中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測DC中CD80、CD86或鹼性白胺酸拉鏈轉錄因子ATF-樣3(Batf3)表現之增加，或：如藉由量測DC激活CD8+ T細胞之能力；
(iii)該RNA分子活化巨噬細胞，例如：如藉由量測巨噬細胞中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測巨噬細胞中CD80表現之增加；
(iv)該RNA分子活化T細胞，例如：如藉由量測T細胞中活化標記物表現之增加、T細胞擴增之增加、或T細胞所產生細胞介素之增加，例如：如藉由量測T細胞中CD69或PD-1表現之增加，或如藉由量測T細胞所產生之IFNγ或TNFα；
(v)該RNA分子增強免疫浸潤至腫瘤中，例如DC或T細胞浸潤至腫瘤中；
(vi)該RNA分子減少腫瘤生長；
(vii)該RNA分子提高該個體之存活；
(viii)該RNA分子增強該個體對該等CAR表現細胞或檢查點調節劑(例如抗PD-1抗體分子、抗PD-L1抗體分子、抗CTLA-4抗體分子、抗TIM-3抗體分子或抗LAG-3抗體分子)之反應性；
(ix)該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合；
(x)該RNA分子為天然存在之RN7SL1 RNA分子的功能變異體，其中該RNA分子保留該天然存在之RN7SL1 RNA分子的全部或部分免疫原性特性，視情況其中該RNA分子顯示比該天然存在之RN7SL1 RNA分子降低的與SRP9及/或SRP14之結合性，例如該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合；
(xi)該RNA分子不為聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)；
(xii)該RNA分子不具有RNAi或反義抑制活性或該RNA分子具有最小RNAi或反義抑制活性；或
(xiii)該RNA分子與天然存在之人類基因具有不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%序列一致性。
在一個態樣中，本文揭示一種細胞，例如免疫細胞，例如T細胞或NK細胞，其包含(1)編碼會與第一抗原，例如第一腫瘤抗原結合之嵌合抗原受體(CAR)分子的第一核酸分子(例如第一外源核酸分子)，及(2)包含RNA分子(例如外源RNA分子)或編碼該RNA分子之核酸分子(例如外源核酸分子)的第二核酸分子(例如第二外源核酸分子)。在一些實施例中，該RNA分子包含第一RNA序列(例如第一外源RNA序列)及第二RNA序列(例如第二外源RNA序列)。在一些實施例中，該第一RNA序列與該第二RNA序列至少80%、85%或90%互補。在一些實施例中，該第一RNA序列長度為至少20個核苷酸且該第二RNA序列長度為至少20個核苷酸。在一些實施例中，該RNA分子增加免疫活性。在一些實施例中，該RNA分子具有以下特性中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12者或全部)：
(i)該RNA分子活化模式識別受體(PRR)，例如視黃酸誘導基因I (RIG-I)；
(ii)該RNA分子活化樹突狀細胞(DC)，例如：如藉由量測DC中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測DC中CD80、CD86或鹼性白胺酸拉鏈轉錄因子ATF-樣3(Batf3)表現之增加，或：如藉由量測DC激活CD8+ T細胞之能力；
(iii)該RNA分子活化巨噬細胞，例如：如藉由量測巨噬細胞中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測巨噬細胞中CD80表現之增加；
(iv)該RNA分子活化T細胞，例如：如藉由量測T細胞中活化標記物表現之增加、T細胞擴增之增加、或T細胞所產生細胞介素之增加，例如：如藉由量測T細胞中CD69或PD-1表現之增加，或如藉由量測T細胞所產生之IFNγ或TNFα；
(v)該RNA分子增強免疫浸潤至腫瘤中，例如DC或T細胞浸潤至腫瘤中；
(vi)該RNA分子減少腫瘤生長；
(vii)該RNA分子提高該個體之存活；
(viii)該RNA分子增強該個體對該等CAR表現細胞或檢查點調節劑(例如抗PD-1抗體分子、抗PD-L1抗體分子、抗CTLA-4抗體分子、抗TIM-3抗體分子或抗LAG-3抗體分子)之反應性；
(ix)該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合；
(x)該RNA分子為天然存在之RN7SL1 RNA分子的功能變異體，其中該RNA分子保留該天然存在之RN7SL1 RNA分子的全部或部分免疫原性特性，視情況其中該RNA分子顯示比該天然存在之RN7SL1 RNA分子降低的與SRP9及/或SRP14之結合性，例如該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合；
(xi)該RNA分子不為聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)；
(xii)該RNA分子不具有RNAi或反義抑制活性或該RNA分子具有最小RNAi或反義抑制活性；或
(xiii)該RNA分子與天然存在之人類基因具有不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%序列一致性。
在一個態樣中，本發明提供一種細胞群體，其包含(1)第一細胞，例如免疫細胞，例如T細胞或NK細胞，該第一細胞包含編碼會與第一抗原，例如第一腫瘤抗原結合之嵌合抗原受體(CAR)分子的第一核酸分子(例如第一外源核酸分子)，及(2)第二細胞，該第二細胞包括包含RNA分子(例如外源RNA分子)或編碼該RNA分子之核酸分子(例如外源核酸分子)的第二核酸分子(例如第二外源核酸分子)，其中該RNA分子包含第一RNA序列(例如第一外源RNA序列)及第二RNA序列(例如第二外源RNA序列)，其中該第一RNA序列與該第二RNA序列至少80%、85%或90%互補，其中該第一RNA序列長度為至少20個核苷酸且該第二RNA序列長度為至少20個核苷酸，其中該RNA分子具有以下特性中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12者或全部)：
(i)該RNA分子活化模式識別受體(PRR)，例如視黃酸誘導基因I (RIG-I)；
(ii)該RNA分子活化樹突狀細胞(DC)，例如：如藉由量測DC中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測DC中CD80、CD86或鹼性白胺酸拉鏈轉錄因子ATF-樣3(Batf3)表現之增加，或：如藉由量測DC激活CD8+ T細胞之能力；
(iii)該RNA分子活化巨噬細胞，例如：如藉由量測巨噬細胞中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測巨噬細胞中CD80表現之增加；
(iv)該RNA分子活化T細胞，例如：如藉由量測T細胞中活化標記物表現之增加、T細胞擴增之增加、或T細胞所產生細胞介素之增加，例如：如藉由量測T細胞中CD69或PD-1表現之增加，或如藉由量測T細胞所產生之IFNγ或TNFα；
(v)該RNA分子增強免疫浸潤至腫瘤中，例如DC或T細胞浸潤至腫瘤中；
(vi)該RNA分子減少腫瘤生長；
(vii)該RNA分子提高該個體之存活；
(viii)該RNA分子增強該個體對該等CAR表現細胞或檢查點調節劑(例如抗PD-1抗體分子、抗PD-L1抗體分子、抗CTLA-4抗體分子、抗TIM-3抗體分子或抗LAG-3抗體分子)之反應性；
(ix)該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合；
(x)該RNA分子為天然存在之RN7SL1 RNA分子的功能變異體，其中該RNA分子保留該天然存在之RN7SL1 RNA分子的全部或部分免疫原性特性，視情況其中該RNA分子顯示比該天然存在之RN7SL1 RNA分子降低的與SRP9及/或SRP14之結合性，例如該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合；
(xi)該RNA分子不為聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)；
(xii)該RNA分子不具有RNAi或反義抑制活性或該RNA分子具有最小RNAi或反義抑制活性；或
(xiii)該RNA分子與天然存在之人類基因具有不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%序列一致性。在一些實施例中，該第一核酸分子及該第二核酸分子安置於不同細胞中。在一些實施例中，該第二細胞進一步包含編碼synNotch多肽之第三核酸分子，其中該synNotch多肽包含：
(i)胞外結構域，其包含非天然存在於Notch受體多肽中且特異性結合至第二抗原，例如第二腫瘤抗原之第二抗原結合結構域，視情況其中該第二抗原與該第一抗原相同，或該第二抗原與該第一抗原不同；
(ii) Notch受體多肽，其包含配體誘導性蛋白水解裂解位點，例如包含Lin 12-Notch重複序列之Notch調節區、S2蛋白水解裂解位點或包含S3蛋白水解裂解位點之跨膜結構域；及
(iii)胞內結構域，其包含轉錄因子，其中：
該第二抗原結合結構域與該第二抗原，例如該第二腫瘤抗原之結合誘導該配體誘導性蛋白水解裂解位點處之裂解，例如誘導該S2及/或S3蛋白水解裂解位點處之裂解，因而釋出包含該轉錄因子之該胞內結構域，其中：
該轉錄因子一旦釋出，即活化編碼該RNA分子之該核酸分子的轉錄，視情況其中：
(a)該轉錄因子包含Gal4 DNA結合結構域及視情況VP64轉錄活化結構域，且
(b)編碼該RNA分子之該核酸分子的N末端連接於Gal4上游活化序列，視情況其中：
(1)該synNotch多肽包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)，且
(2)該Gal4上游活化序列包含SEQ ID NO: 18之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。
在一些實施例中，該第一RNA序列長度為至少25、30、35、40、45或50個核苷酸。在一些實施例中，該第二RNA序列長度為至少25、30、35、40、45或50個核苷酸。在一些實施例中，該第一RNA序列長度為至少25、30、35、40、45或50個核苷酸；且該第二RNA序列長度為至少25、30、35、40、45或50個核苷酸。
在一些實施例中，該第一RNA序列及該第二RNA序列形成雙股RNA分子。在一些實施例中，該第一RNA序列及該第二RNA序列形成長度為至少20、25、30、35、40、45或50個鹼基對之雙股RNA分子。
在一些實施例中，該第一RNA序列與該第二RNA序列100%互補。
在一些實施例中，該第一RNA序列及該第二RNA序列安置於一個RNA分子上。在一些實施例中，該第一RNA序列及該第二RNA序列形成髮夾結構。在一些實施例中，該第一RNA序列及該第二RNA序列形成莖-環結構。在一些實施例中，該莖長度為至少20、25、30、35、40、45或50個鹼基對。在一些實施例中，該環長度為2-10、3-8或4-6個核苷酸。
在一些實施例中，該第一RNA序列及該第二RNA序列安置於分別的RNA分子上。
在一些實施例中，該RNA分子包含一或多個Alu結構域。在一些實施例中，該Alu結構域包含SEQ ID NO: 4或6之胺基酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。在一些實施例中，該Alu結構域包含SEQ ID NO: 4或6之胺基酸序列。
在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 2、4、6、8、10之核苷酸序列或其功能變異體。在一些實施例中，該RNA分子包含選自SEQ ID NO: 2、4、6、8或10之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。在一些實施例中，該RNA分子包含選自SEQ ID NO: 2、4、6、8或10之核苷酸序列。在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 2之核苷酸序列。在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 4之核苷酸序列。在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 6之核苷酸序列。在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 8之核苷酸序列。在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。
在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 1、3、5、7、9之核苷酸序列或其功能變異體。在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含選自SEQ ID NO: 1、3、5、7或9之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。
在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含選自SEQ ID NO: 1、3、5、7或9之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 1之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 3之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 5之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 7之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 9之核苷酸序列。
在一些實施例中，該RNA分子包含5'-三磷酸(5'ppp)。
在一些實施例中，該RNA分子包含至少一個經化學修飾之核苷酸。
在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子為DNA分子。
在一些實施例中，該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子連接於部分，例如結合至腫瘤抗原或組織抗原之靶向部分，例如結合至該第一抗原，例如該第一腫瘤抗原之部分。
在一些實施例中，該核酸分子或細胞包含編碼該RNA分子之該核酸分子，其中該RNA分子之表現為誘導性的。
在一些實施例中，該第一核酸分子及該第二核酸分子安置於一個核酸分子上。在一些實施例中，該一個核酸分子沿N末端至C末端方向具有以下排列：該第二核酸分子-連接子-該第一核酸分子。在一些實施例中，該連接子編碼自身裂解位點。在一些實施例中，該連接子編碼P2A位點、T2A位點、E2A位點或F2A位點。在一些實施例中，該連接子編碼P2A位點。在一些實施例中，該連接子包含SEQ ID NO: 23之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。在一些實施例中，該第二核酸分子包含SEQ ID NO: 9之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。
在一些實施例中，該第一核酸分子及該第二核酸分子安置於分別的核酸分子上。在一些實施例中，該細胞包含編碼synNotch多肽之第三核酸分子。在一些實施例中，該synNotch多肽包含(i)胞外結構域，其包含非天然存在於Notch受體多肽中且特異性結合至第二抗原，例如第二腫瘤抗原之第二抗原結合結構域。在一些實施例中，該第二抗原與該第一抗原相同。在一些實施例中，該第二抗原與該第一抗原不同。在一些實施例中，該synNotch多肽進一步包含(ii) Notch受體多肽，其包含配體誘導性蛋白水解裂解位點，例如包含Lin 12-Notch重複序列之Notch調節區、S2蛋白水解裂解位點或包含S3蛋白水解裂解位點之跨膜結構域。在一些實施例中，該synNotch多肽進一步包含(iii)胞內結構域，其包含轉錄因子。在一些實施例中，該第二抗原結合結構域與該第二抗原，例如該第二腫瘤抗原之結合誘導該配體誘導性蛋白水解裂解位點處之裂解，例如誘導該S2及/或S3蛋白水解裂解位點處之裂解，因而釋出包含該轉錄因子之該胞內結構域，其中該轉錄因子一旦釋出，即活化編碼該RNA分子之該核酸分子的轉錄。在一些實施例中，(a)該轉錄因子包含Gal4 DNA結合結構域及視情況VP64轉錄活化結構域，且(b)編碼該RNA分子之該核酸分子的N末端連接於Gal4上游活化序列。在一些實施例中，(1)該synNotch多肽包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)，且(2)該Gal4上游活化序列包含SEQ ID NO: 18之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。
在一些實施例中，該CAR分子沿N末端至C末端方向包含結合至該第一抗原，例如該第一腫瘤抗原之第一抗原結合結構域；跨膜結構域；及胞內信號傳導結構域，視情況其中該第一抗原結合結構域藉由鉸鏈結構域連接至該跨膜結構域。
在一些實施例中，該第一或第二抗原係選自：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1；C型凝集素樣分子-1，CD33；表皮生長因子受體變異體III (EGFRvIII)；神經節苷脂G2 (GD2)；神經節苷脂GD3；TNF受體家族成員；B細胞成熟抗原；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特異性膜抗原(PSMA)；受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1 (ROR1)；Fms樣酪胺酸激酶3 (FLT3)；腫瘤相關糖蛋白72 (TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮細胞黏附分子(EPCAM)；B7H3 (CD276)；KIT (CD117)；介白素-13受體次單元α-2；間皮素；介白素11受體α (IL-11Ra)；前列腺幹細胞抗原(PSCA)；蛋白酶絲胺酸21；血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)；路易(Y)抗原；CD24；血小板衍生生長因子受體β (PDGFR-β)；階段特異性胚抗原-4 (SSEA-4)；CD20；葉酸受體α；受體酪胺酸-蛋白激酶ERBB2 (Her2/neu)；黏蛋白1，細胞表面相關(MUC1)；表皮生長因子受體(EGFR)；神經細胞黏附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸磷酸酶(PAP)；伸長因子2突變(ELF2M)；Ephrin B2；纖維母細胞活化蛋白α (FAP)；胰島素樣生長因子1受體(IGF-I受體)，碳酸酐酶IX (CAIX)；蛋白酶體(Prosome，Macropain)次單元，β型，9 (LMP2)；糖蛋白100 (gp100)；由斷點簇區(BCR)及Abelson鼠類白血病病毒性致癌基因同源物1 (Abl)組成之致癌基因多肽(bcr-abl)；酪胺酸酶；ephrin A型受體2 (EphA2)；海藻糖基GM1；唾液酸基路易(Lewis)黏附分子(sLe)；神經節苷脂GM3；轉麩醯胺酸酶5 (TGS5)；高分子量黑素瘤相關抗原(HMWMAA)；o-乙醯基-GD2神經節苷脂(OAcGD2)；葉酸受體β；腫瘤內皮標記物1 (TEM1/CD248)；腫瘤內皮標記物7相關(TEM7R)；緊密連接蛋白6 (CLDN6)；促甲狀腺激素受體(TSHR)；G蛋白偶合受體C類第5組，成員D (GPRC5D)；染色體X開放閱讀框架61 (CXORF61)；CD97；CD179a；退行性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盤特異性1 (PLAC1)；globoH糖基神經醯胺之六醣部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2 (UPK2)；A型肝炎病毒細胞受體1 (HAVCR1)；腎上腺素受體β 3 (ADRB3)；泛連接蛋白3 (PANX3)；G蛋白偶合受體20 (GPR20)；淋巴細胞抗原6複合物，基因座K 9 (LY6K)；嗅覺受體51E2 (OR51E2)；TCR γ交替閱讀框架蛋白(TARP)；威爾姆斯腫瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1 (NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2 (LAGE-1a)；黑素瘤相關抗原1 (MAGE-A1)；ETS易位變異基因6，位於染色體12p上(ETV6-AML)；精子蛋白17 (SPA17)；X抗原家族，成員1A (XAGE1)；血管生成素結合細胞表面受體2 (Tie 2)；黑素瘤癌症睾丸抗原-1 (MAD-CT-1)；黑素瘤癌症睾丸抗原-2 (MAD-CT-2)；Fos相關抗原1；腫瘤蛋白p53 (p53)；p53突變體；前列腺蛋白；存活素；端粒酶；前列腺癌腫瘤抗原-1，由T細胞識別之黑素瘤抗原1；大鼠肉瘤(Ras)突變體；人類端粒酶反轉錄酶(hTERT)；肉瘤易位斷點；細胞凋亡之黑素瘤抑制劑(ML-IAP)；ERG (跨膜蛋白酶，絲胺酸2 (TMPRSS2) ETS融合基因)；N-乙醯基葡糖胺基-轉移酶V (NA17)；成對盒蛋白Pax-3 (PAX3)；雄激素受體；細胞週期素B1；v-myc禽類髓細胞瘤病病毒性致癌基因神經母細胞瘤衍生同源物(MYCN)；Ras同源物家族成員C (RhoC)；酪胺酸酶相關蛋白2 (TRP-2)；細胞色素P450 1B1 (CYP1B1)；CCCTC結合因子(鋅指蛋白)樣，由T細胞識別之鱗狀細胞癌抗原3 (SART3)；成對盒蛋白Pax-5 (PAX5)；前頂體素結合蛋白sp32 (OY-TES1)；淋巴細胞特異性蛋白酪胺酸激酶(LCK)；激酶錨定蛋白4 (AKAP-4)；滑膜肉瘤，X斷點2 (SSX2)；晚期糖基化最終產物之受體(RAGE-1)；腎遍在蛋白1 (RU1)；腎遍在蛋白2 (RU2)；豆莢蛋白；人類乳頭狀瘤病毒E6 (HPV E6)；人類乳頭狀瘤病毒E7 (HPV E7)；腸道羧基酯酶；突變之熱休克蛋白70-2 (mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白細胞相關免疫球蛋白樣受體1 (LAIR1)；IgA受體之Fc片段(FCAR或CD89)；白細胞免疫球蛋白樣受體亞家族A成員2 (LILRA2)；CD300分子樣家族成員f (CD300LF)；C型凝集素結構域家族12成員A (CLEC12A)；骨髓基質細胞抗原2 (BST2)；含EGF樣模組之黏蛋白樣激素受體樣2 (EMR2)；淋巴細胞抗原75 (LY75)；磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3 (GPC3)；Fc受體樣5 (FCRL5)；或免疫球蛋白λ樣多肽1 (IGLL1)。
在一些實施例中，該第一或第二抗原係選自CD19、CD22、BCMA、CD20、CD123、EGFRvIII或間皮素。在一些實施例中，該第一或第二抗原為CD19。在一些實施例中，該第一或第二抗原為BCMA。在一些實施例中，該第一或第二抗原為EGFRvIII。在一些實施例中，該第一或第二抗原為間皮素。
在一些實施例中，該跨膜結構域包含選自以下之蛋白質的跨膜結構域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD123、CD134、CD137或CD154。在一些實施例中，該跨膜結構域包含CD8之跨膜結構域。在一些實施例中，該跨膜結構域包含SEQ ID NO: 635之胺基酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入或缺失，例如保守取代之序列)。在一些實施例中，該跨膜結構域包含SEQ ID NO: 635之胺基酸序列。
在一些實施例中，該胞內信號傳導結構域包含初級信號傳導結構域。在一些實施例中，該初級信號傳導結構域包含來源於以下之功能性信號傳導結構域：CD3 ζ、TCR ζ、FcR γ、FcR β、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278 (ICOS)、FcεRI、DAP10、DAP12或CD66d。在一些實施例中，該初級信號傳導結構域包含來源於CD3 ζ之功能性信號傳導結構域。在一些實施例中，該初級信號傳導結構域包含SEQ ID NO: 641或643之胺基酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入或缺失，例如保守取代之序列)。在一些實施例中，該初級信號傳導結構域包含SEQ ID NO: 641或643之胺基酸序列。
在一些實施例中，該胞內信號傳導結構域包含共刺激結構域。在一些實施例中，該共刺激結構域包含來源於以下之功能性信號傳導結構域：MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整合素、信號傳導淋巴細胞性活化分子(SLAM)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配體受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、4-1BB (CD137)、B7-H3、ICOS (CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM (LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244，2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A，Ly108)、SLAM (SLAMF1，CD150，IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a或與CD83特異性結合之配體。在一些實施例中，該共刺激結構域包含來源於4-1BB之功能性信號傳導結構域。在一些實施例中，該共刺激結構域包含SEQ ID NO: 637之胺基酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入或缺失，例如保守取代之序列)。在一些實施例中，該共刺激結構域包含SEQ ID NO: 637之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本文揭示之核酸分子(例如外源核酸分子)或細胞及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。
在一個態樣中，本發明提供一種治療患有與第一抗原，例如第一腫瘤抗原之表現相關的疾病之個體之方法，例如一種治療患有癌症之個體之方法，其包含向該個體投與有效量之本文揭示之核酸分子、細胞或醫藥組合物。
一種在患有癌症之個體中提供抗癌免疫反應之方法，其包含向該個體投與有效量之本文揭示之核酸分子、細胞或醫藥組合物。
在一些實施例中，與第一抗原之表現相關的該疾病為癌症。在一些實施例中，該癌症展現腫瘤抗原之異源表現，例如其中該癌症中少於90%、80%、70%、60%或50%之細胞表現該第一腫瘤抗原，或其中該癌症中少於90%、80%、70%、60%或50%之細胞對該CAR表現細胞有反應。在一些實施例中，該癌症係選自間皮瘤(例如惡性胸膜間皮瘤)；肺癌(例如非小細胞肺癌、小細胞肺癌、鱗狀細胞肺癌或大細胞肺癌)；胰臟癌(例如胰管腺癌或轉移性胰管腺癌(PDA))；食道腺癌、卵巢癌(例如漿液性上皮卵巢癌)、乳癌、結腸直腸癌、膀胱癌或其任何組合。在一些實施例中，該癌症為血液癌症，例如選自白血病或淋巴瘤之血液癌症，例如該癌症係選自慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、多發性骨髓瘤、急性淋巴性白血病(ALL)、霍奇金淋巴瘤、B細胞急性淋巴性白血病(BALL)、T細胞急性淋巴性白血病(TALL)、小淋巴細胞性白血病(SLL)、B細胞前淋巴細胞性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤、伯基特氏淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、與慢性發炎相關之DLBCL、慢性骨髓性白血病、骨髓增生性贅瘤、濾泡性淋巴瘤、兒童濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞-或大細胞-濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴增生性病狀、MALT淋巴瘤(黏膜相關淋巴組織之結外邊緣區淋巴瘤)、邊緣區淋巴瘤、骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群、非霍奇金淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、脾邊緣區淋巴瘤、脾淋巴瘤/白血病、脾瀰漫性紅髓小B細胞淋巴瘤、毛細胞白血病-變異形式、淋巴漿細胞淋巴瘤、重鏈疾病、漿細胞骨髓瘤、骨骼之孤立性漿細胞瘤、骨外漿細胞瘤、結內邊緣區淋巴瘤、兒童結內邊緣區淋巴瘤、原發性皮膚毛囊中心淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫、原發性縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、ALK+大B細胞淋巴瘤、HHV8相關多中心卡斯特萊曼病中出現的大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)或不可分類淋巴瘤。
在一些實施例中，該方法進一步包含投與第三治療劑。在一些實施例中，該第三治療劑係在投與該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子之前投與。在一些實施例中，該第三治療劑係在投與該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子之後投與。在一些實施例中，該第三治療劑及該RNA分子係同時投與。在一些實施例中，該第三治療劑及編碼該RNA分子之該核酸分子係同時投與。在一些實施例中，該第三治療劑係在投與該CAR表現細胞之前投與。在一些實施例中，該第三治療劑係在投與該CAR表現細胞之後投與。在一些實施例中，該第三治療劑及該CAR表現細胞係同時投與。
在一些實施例中，該第三治療劑為前-M2巨噬細胞分子之抑制劑。
在一些實施例中，該第三治療劑係選自IL-13抑制劑、IL-4抑制劑、IL-13Rα1抑制劑、IL-4Rα抑制劑、IL-10抑制劑、CSF-1抑制劑、CSF1R抑制劑、TGF β抑制劑、JAK2抑制劑、細胞表面分子、氧化鐵、小分子抑制劑、PI3K抑制劑、HDAC抑制劑、糖分解路徑之抑制劑、粒線體靶向抗氧化劑、氯膦酸鹽脂質體或其組合。在一些實施例中，該第三治療劑為CSF1R抑制劑。在一些實施例中，該第三治療劑為結合至CSF1R之抗體分子。在一些實施例中，該第三治療劑為CSF1R之小分子抑制劑。在一些實施例中，該第三治療劑為BLZ945。
在一些實施例中，該第三治療劑為檢查點調節劑。在一些實施例中，該第三治療劑為抗PD-1抗體分子、抗PD-L1抗體分子、抗CTLA-4抗體分子、抗TIM-3抗體分子或抗LAG-3抗體分子。在一些實施例中，該檢查點調節劑係在投與該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子之後投與。在一些實施例中，該檢查點調節劑係在投與該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子之前投與。在一些實施例中，該檢查點調節劑及該RNA分子係同時投與。在一些實施例中，該檢查點調節劑及編碼該RNA分子之該核酸分子係同時投與。在一些實施例中，該檢查點調節劑係在投與該CAR表現細胞之後投與。在一些實施例中，該檢查點調節劑係在投與該CAR表現細胞之前投與。在一些實施例中，該檢查點調節劑及該CAR表現細胞係同時投與。
在一些實施例中，該第三治療劑為Flt3配體多肽。
在一些實施例中，投與該RNA分子增強該個體中的該第三治療劑之活性，例如至少20、40、60、80、100、500或1000%。在一些實施例中，投與該CAR表現細胞增強該個體中的該第三治療劑之活性，例如至少20、40、60、80、100、500或1000%。在一些實施例中，該第三治療劑為檢查點調節劑。在一些實施例中，該第三治療劑為抗PD-1抗體分子、抗PD-L1抗體分子、抗CTLA-4抗體分子、抗TIM-3抗體分子或抗LAG-3抗體分子。在一些實施例中，該第三治療劑為抗PD-1抗體分子。在一些實施例中，該第三治療劑為抗CTLA-4抗體分子。在一些實施例中，該增強在具有內源T細胞之個體中出現。在一些實施例中，該增強經由內源T細胞之活化出現。
在一個態樣中，本文揭示一種套組，其包含(1)編碼會與第一抗原，例如第一腫瘤抗原結合之嵌合抗原受體(CAR)分子的第一核酸分子(例如第一外源核酸分子)，及(2)包含RNA分子(例如外源RNA分子)或編碼該RNA分子之核酸分子(例如外源核酸分子)的第二核酸分子(例如第二外源核酸分子)。在一些實施例中，該RNA分子包含第一RNA序列(例如第一外源RNA序列)及第二RNA序列(例如第二外源RNA序列)。在一些實施例中，該第一RNA序列與該第二RNA序列至少80%、85%或90%互補。在一些實施例中，該第一RNA序列長度為至少20個核苷酸且該第二RNA序列長度為至少20個核苷酸。在一些實施例中，該RNA分子增加免疫活性。在一些實施例中，該RNA分子具有以下特性中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12者或全部)：
(i)該RNA分子活化模式識別受體(PRR)，例如視黃酸誘導基因I (RIG-I)；
(ii)該RNA分子活化樹突狀細胞(DC)，例如：如藉由量測DC中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測DC中CD80、CD86或鹼性白胺酸拉鏈轉錄因子ATF-樣3(Batf3)表現之增加，或：如藉由量測DC激活CD8+ T細胞之能力；
(iii)該RNA分子活化巨噬細胞，例如：如藉由量測巨噬細胞中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測巨噬細胞中CD80表現之增加；
(iv)該RNA分子活化T細胞，例如：如藉由量測T細胞中活化標記物表現之增加、T細胞擴增之增加、或T細胞所產生細胞介素之增加，例如：如藉由量測T細胞中CD69或PD-1表現之增加，或如藉由量測T細胞所產生之IFNγ或TNFα；
(v)該RNA分子增強免疫浸潤至腫瘤中，例如DC或T細胞浸潤至腫瘤中；
(vi)該RNA分子減少腫瘤生長；
(vii)該RNA分子提高該個體之存活；
(viii)該RNA分子增強該個體對該等CAR表現細胞或檢查點調節劑(例如抗PD-1抗體分子、抗PD-L1抗體分子、抗CTLA-4抗體分子、抗TIM-3抗體分子或抗LAG-3抗體分子)之反應性；
(ix)該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合；
(x)該RNA分子為天然存在之RN7SL1 RNA分子的功能變異體，其中該RNA分子保留該天然存在之RN7SL1 RNA分子的全部或部分免疫原性特性，視情況其中該RNA分子顯示比該天然存在之RN7SL1 RNA分子降低的與SRP9及/或SRP14之結合性，例如該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合；
(xi)該RNA分子不為聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)；
(xii)該RNA分子不具有RNAi或反義抑制活性或該RNA分子具有最小RNAi或反義抑制活性；或
(xiii)該RNA分子與天然存在之人類基因具有不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%序列一致性。
在一個態樣中，本文揭示一種製備細胞之方法，其包含：
(1)提供細胞，例如免疫細胞，例如T細胞或NK細胞，該細胞包含編碼會與第一抗原，例如第一腫瘤抗原結合之嵌合抗原受體(CAR)分子的第一核酸分子(例如第一外源核酸分子)，及
(2)使該細胞離體與包含RNA分子(例如外源RNA分子)或編碼該RNA分子之核酸分子(例如外源核酸分子)的第二核酸分子(例如第二外源核酸分子)接觸。在一些實施例中，該RNA分子包含第一RNA序列(例如第一外源RNA序列)及第二RNA序列(例如第二外源RNA序列)。在一些實施例中，該第一RNA序列與該第二RNA序列至少80%、85%或90%互補。在一些實施例中，該第一RNA序列長度為至少20個核苷酸且該第二RNA序列長度為至少20個核苷酸。在一些實施例中，該RNA分子增加免疫活性。在一些實施例中，該RNA分子具有以下特性中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12者或全部)：
(i)該RNA分子活化模式識別受體(PRR)，例如視黃酸誘導基因I (RIG-I)；
(ii)該RNA分子活化樹突狀細胞(DC)，例如：如藉由量測DC中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測DC中CD80、CD86或鹼性白胺酸拉鏈轉錄因子ATF-樣3(Batf3)表現之增加，或：如藉由量測DC激活CD8+ T細胞之能力；
(iii)該RNA分子活化巨噬細胞，例如：如藉由量測巨噬細胞中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測巨噬細胞中CD80表現之增加；
(iv)該RNA分子活化T細胞，例如：如藉由量測T細胞中活化標記物表現之增加、T細胞擴增之增加、或T細胞所產生細胞介素之增加，例如：如藉由量測T細胞中CD69或PD-1表現之增加，或如藉由量測T細胞所產生之IFNγ或TNFα；
(v)該RNA分子增強免疫浸潤至腫瘤中，例如DC或T細胞浸潤至腫瘤中；
(vi)該RNA分子減少腫瘤生長；
(vii)該RNA分子提高該個體之存活；
(viii)該RNA分子增強該個體對該等CAR表現細胞或檢查點調節劑(例如抗PD-1抗體分子、抗PD-L1抗體分子、抗CTLA-4抗體分子、抗TIM-3抗體分子或抗LAG-3抗體分子)之反應性；
(ix)該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合；
(x)該RNA分子為天然存在之RN7SL1 RNA分子的功能變異體，其中該RNA分子保留該天然存在之RN7SL1 RNA分子的全部或部分免疫原性特性，視情況其中該RNA分子顯示比該天然存在之RN7SL1 RNA分子降低的與SRP9及/或SRP14之結合性，例如該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合；
(xi)該RNA分子不為聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)；
(xii)該RNA分子不具有RNAi或反義抑制活性或該RNA分子具有最小RNAi或反義抑制活性；或
(xiii)該RNA分子與天然存在之人類基因具有不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%序列一致性。
在一些實施例中，該第一RNA序列長度為至少25、30、35、40、45或50個核苷酸。在一些實施例中，該第二RNA序列長度為至少25、30、35、40、45或50個核苷酸。在一些實施例中，該第一RNA序列長度為至少25、30、35、40、45或50個核苷酸；且該第二RNA序列長度為至少25、30、35、40、45或50個核苷酸。
在一些實施例中，該第一RNA序列及該第二RNA序列形成雙股RNA分子。在一些實施例中，該第一RNA序列及該第二RNA序列形成長度為至少20、25、30、35、40、45或50個鹼基對之雙股RNA分子。
在一些實施例中，該第一RNA序列與該第二RNA序列100%互補。
在一些實施例中，該第一RNA序列及該第二RNA序列安置於一個RNA分子上。在一些實施例中，該第一RNA序列及該第二RNA序列形成髮夾結構。在一些實施例中，該第一RNA序列及該第二RNA序列形成莖-環結構。在一些實施例中，該莖長度為至少20、25、30、35、40、45或50個鹼基對。在一些實施例中，該環長度為2-10、3-8或4-6個核苷酸。
在一些實施例中，該第一RNA序列及該第二RNA序列安置於分別的RNA分子上。
在一些實施例中，該RNA分子包含一或多個Alu結構域。在一些實施例中，該Alu結構域包含SEQ ID NO: 4或6之胺基酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。在一些實施例中，該Alu結構域包含SEQ ID NO: 4或6之胺基酸序列。
在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 2、4、6、8、10之核苷酸序列或其功能變異體。在一些實施例中，該RNA分子包含選自SEQ ID NO: 2、4、6、8或10之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。在一些實施例中，該RNA分子包含選自SEQ ID NO: 2、4、6、8或10之核苷酸序列。在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 2之核苷酸序列。在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 4之核苷酸序列。在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 6之核苷酸序列。在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 8之核苷酸序列。在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。
在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 1、3、5、7、9之核苷酸序列或其功能變異體。在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含選自SEQ ID NO: 1、3、5、7或9之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。
在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含選自SEQ ID NO: 1、3、5、7或9之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 1之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 3之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 5之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 7之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 9之核苷酸序列。
在一些實施例中，該RNA分子包含5'-三磷酸(5'ppp)。
在一些實施例中，該RNA分子包含至少一個經化學修飾之核苷酸。
在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子為DNA分子。
在一個態樣中，本文提供一種評估或預測個體對CAR表現細胞療法之反應性的方法，其包含獲取未遮蔽RNA分子(例如外源未遮蔽RNA分子)之含量值或活性值，其中該RNA分子包含SEQ ID NO: 1之核苷酸序列，其中該值包含該RNA分子之量與結合至該RNA分子之蛋白質之量，例如信號識別粒子9 (SRP9)及/或信號識別粒子14 (SRP14)之量的比率，其中：
(i)該值比參考值提高時，指示或預測該個體對該CAR表現細胞療法之反應性的提高；或
(ii)該值比參考值降低時，指示或預測該個體對該CAR表現細胞療法之反應性的降低。
在一個態樣中，本文提供一種治療患有癌症之個體之方法，其包含：
因應未遮蔽RNA分子(例如外源未遮蔽RNA分子)之含量值或活性值比參考值提高，其中該RNA分子包含SEQ ID NO: 1之核苷酸序列，其中該值包含該RNA分子之量與結合至該RNA分子之蛋白質之量，例如信號識別粒子9 (SRP9)及/或信號識別粒子14 (SRP14)之量的比率，向該個體投與CAR表現細胞療法。
在一些實施例中，該方法進一步包含因應該未遮蔽RNA分子之增加之含量值或活性值，向該個體投與前-M2巨噬細胞分子之抑制劑。
在一個態樣中，本文提供一種製備CAR表現細胞(例如CAR表現免疫效應細胞)之方法，其包含在使得該CAR分子得以表現之條件下將本文揭示之任何核酸分子引入至細胞(例如免疫效應細胞)中。
在一個態樣中，本文提供一種細胞，例如免疫細胞，例如T細胞或NK細胞，其包含RNA分子(例如外源RNA分子)或編碼該RNA分子之核酸分子(例如外源核酸分子)。在一些實施例中，該RNA分子包含第一RNA序列(例如第一外源RNA序列)及第二RNA序列(例如第二外源RNA序列)，其中該第一RNA序列與該第二RNA序列至少80%、85%或90%互補，其中該第一RNA序列長度為至少20個核苷酸且該第二RNA序列長度為至少20個核苷酸，其中該RNA分子具有以下特性中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12者或全部)：
(i)該RNA分子活化模式識別受體(PRR)，例如視黃酸誘導基因I (RIG-I)；
(ii)該RNA分子活化樹突狀細胞(DC)，例如：如藉由量測DC中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測DC中CD80、CD86或鹼性白胺酸拉鏈轉錄因子ATF-樣3(Batf3)表現之增加，或：如藉由量測DC激活CD8+ T細胞之能力；
(iii)該RNA分子活化巨噬細胞，例如：如藉由量測巨噬細胞中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測巨噬細胞中CD80表現之增加；
(iv)該RNA分子活化T細胞，例如：如藉由量測T細胞中活化標記物表現之增加、T細胞擴增之增加、或T細胞所產生細胞介素之增加，例如：如藉由量測T細胞中CD69或PD-1表現之增加，或如藉由量測T細胞所產生之IFNγ或TNFα；
(v)該RNA分子增強免疫浸潤至腫瘤中，例如DC或T細胞浸潤至腫瘤中；
(vi)該RNA分子減少腫瘤生長；
(vii)該RNA分子提高該個體之存活；
(viii)該RNA分子增強該個體對該等CAR表現細胞或檢查點調節劑(例如抗PD-1抗體分子、抗PD-L1抗體分子、抗CTLA-4抗體分子、抗TIM-3抗體分子或抗LAG-3抗體分子)之反應性；
(ix)該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合；
(x)該RNA分子為天然存在之RN7SL1 RNA分子的功能變異體，其中該RNA分子保留該天然存在之RN7SL1 RNA分子的全部或部分免疫原性特性，視情況其中該RNA分子顯示比該天然存在之RN7SL1 RNA分子降低的與SRP9及/或SRP14之結合性，例如該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合；
(xi)該RNA分子不為聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)；
(xii)該RNA分子不具有RNAi或反義抑制活性或該RNA分子具有最小RNAi或反義抑制活性；或
(xiii)該RNA分子與天然存在之人類基因具有不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%序列一致性。
在一些實施例中，該細胞進一步包含編碼synNotch多肽之核酸分子，其中該synNotch多肽包含：
(i)胞外結構域，其包含非天然存在於Notch受體多肽中且特異性結合至抗原，例如腫瘤抗原之抗原結合結構域；
(ii) Notch受體多肽，其包含配體誘導性蛋白水解裂解位點，例如包含Lin 12-Notch重複序列之Notch調節區、S2蛋白水解裂解位點或包含S3蛋白水解裂解位點之跨膜結構域；及
(iii)胞內結構域，其包含轉錄因子，其中：
該抗原結合結構域與該抗原，例如該腫瘤抗原之結合誘導該配體誘導性蛋白水解裂解位點處之裂解，例如誘導該S2及/或S3蛋白水解裂解位點處之裂解，因而釋出包含該轉錄因子之該胞內結構域，其中：
該轉錄因子一旦釋出，即活化編碼該RNA分子之該核酸分子的轉錄，視情況其中：
(a)該轉錄因子包含Gal4 DNA結合結構域及視情況VP64轉錄活化結構域，且
(b)編碼該RNA分子之該核酸分子的N末端連接於Gal4上游活化序列，視情況其中：
(1)該synNotch多肽包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)，且
(2)該Gal4上游活化序列包含SEQ ID NO: 18之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。
在一個態樣中，本文提供一種製備包含RNA分子(例如外源RNA分子)之細胞的方法，該方法包含使該細胞與本發明之RNA分子接觸。
在一個態樣中，本文提供一種製備包含RNA分子(例如外源RNA分子)之細胞的方法，該方法包含例如藉由轉導或轉染將編碼本發明之RNA分子之核酸分子(例如外源核酸分子)引入至該細胞中。在一些實施例中，該方法進一步包含將編碼synNotch多肽之核酸分子引入至該細胞中，其中該synNotch多肽包含：
(i)胞外結構域，其包含非天然存在於Notch受體多肽中且特異性結合至抗原，例如腫瘤抗原之抗原結合結構域；
(ii) Notch受體多肽，其包含配體誘導性蛋白水解裂解位點，例如包含Lin 12-Notch重複序列之Notch調節區、S2蛋白水解裂解位點或包含S3蛋白水解裂解位點之跨膜結構域；及
(iii)胞內結構域，其包含轉錄因子，其中：
該抗原結合結構域與該抗原，例如該腫瘤抗原之結合誘導該配體誘導性蛋白水解裂解位點處之裂解，例如誘導該S2及/或S3蛋白水解裂解位點處之裂解，因而釋出包含該轉錄因子之該胞內結構域，其中：
該轉錄因子一旦釋出，即活化編碼該RNA分子之該核酸分子的轉錄，視情況其中：
(a)該轉錄因子包含Gal4 DNA結合結構域及視情況VP64轉錄活化結構域，且
(b)編碼該RNA分子之該核酸分子的N末端連接於Gal4上游活化序列，視情況其中：
(1)該synNotch多肽包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)，且
(2)該Gal4上游活化序列包含SEQ ID NO: 18之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。
在一個態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含細胞，例如免疫細胞，例如T細胞或NK細胞，該細胞包含本發明之RNA分子(例如外源RNA分子)或編碼本發明之RNA分子之核酸分子(例如外源核酸分子)；及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。
在一個態樣中，本文提供一種治療患有癌症之個體之方法，其包含向該個體投與細胞，例如免疫細胞，例如T細胞或NK細胞，該細胞包含本發明之RNA分子(例如外源RNA分子)或編碼本發明之RNA分子之核酸分子(例如外源核酸分子)。
在一個態樣中，本文提供一種增加有需要之個體之免疫反應的方法，該方法包含細胞，例如免疫細胞，例如T細胞或NK細胞，該細胞包含本發明之RNA分子(例如外源RNA分子)或編碼本發明之RNA分子之核酸分子(例如外源核酸分子)。
相關申請案
本申請案主張2018年1月8日申請之美國第62/614,908號及2018年4月6日申請之美國第62/653,932號之優先權，其中之每一者之內容係以全文引用之方式併入本文中。
序列表 本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且以全文引用之方式併入本文中。該ASCII複本於2019年1月7日創建，名為N2067-7149WO_SL.txt且大小為1,080,675個位元組。
定義 除非另作定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語均具有與由一般熟習本發明所屬之技術者通常所理解相同的含義。
術語「一(a及an)」係指冠詞之一個或多於一個(亦即，至少一個)文法對象。舉例而言，「一要素」意謂一個要素或多於一個要素。
當涉及諸如量、暫態持續時間及其類似物之可量測值時，術語「約」意欲涵蓋相較於指定值±20%，或在一些情況下±10%，或在一些情況下±5%，或在一些情況下±1%，或在一些情況下±0.1%之變化，因為此類變化適合於進行所揭示之方法。
術語「嵌合抗原受體」或者「CAR」係指包含至少胞外抗原結合結構域、跨膜結構域及包含來源於如下所定義之刺激分子之功能性信號傳導結構域的細胞質信號傳導結構域(在本文中亦稱為「胞內信號傳導結構域」)之重組多肽構築體。在一些實施例中，CAR多肽構築體中之結構域處於同一多肽鏈中，例如包含嵌合融合蛋白。在一些實施例中，CAR多肽構築體中之結構域彼此不鄰接，例如處於不同多肽鏈中，例如如在本文所述之RCAR中所提供。
在一個態樣中，細胞質信號傳導結構域包含初級信號傳導結構域(例如CD3-ζ之初級信號傳導結構域)。在一個態樣中，細胞質信號傳導結構域進一步包含一或多個來源於至少一個如下所定義之共刺激分子的功能性信號傳導結構域。在一個態樣中，共刺激分子係選自41BB (亦即，CD137)、CD27、ICOS及/或CD28。在一個態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，該嵌合融合蛋白包含胞外抗原識別結構域、跨膜結構域及包含來源於刺激分子之功能性信號傳導結構域的胞內信號傳導結構域。在一個態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，該嵌合融合蛋白包含胞外抗原識別結構域、跨膜結構域以及包含來源於共刺激分子之功能性信號傳導結構域及來源於刺激分子之功能性信號傳導結構域的胞內信號傳導結構域。在一個態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，該嵌合融合蛋白包含胞外抗原識別結構域、跨膜結構域以及包含來源於一或多種共刺激分子之兩個功能性信號傳導結構域及來源於刺激分子之功能性信號傳導結構域的胞內信號傳導結構域。在一個態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，該嵌合融合蛋白包含胞外抗原識別結構域、跨膜結構域以及包含來源於一或多種共刺激分子之至少兩個功能性信號傳導結構域及來源於刺激分子之功能性信號傳導結構域的胞內信號傳導結構域。在一個態樣中，CAR在CAR融合蛋白之胺基末端(N末端)包含視情況存在之前導序列。在一個態樣中，CAR在胞外抗原識別結構域之N末端進一步包含前導序列，其中該前導序列視情況在細胞加工及CAR定位至細胞膜期間自抗原識別結構域(例如scFv)裂解。
包含靶向特定腫瘤標記物X之抗原結合結構域(例如scFv、單結構域抗體或TCR (例如TCR α結合結構域或TCR β結合結構域))的CAR亦稱為XCAR，其中X可為如本文所述之腫瘤標記物。舉例而言，包含靶向CD19之抗原結合結構域的CAR稱為CD19CAR。CAR可在任何細胞，例如如本文所描述之免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)中表現。
術語「信號傳導結構域」係指藉由在細胞內傳輸資訊以藉由產生第二信使或藉由回應於此類信使充當效應子經由所定義之信號傳導路徑調節細胞活性而起作用之蛋白質功能部分。
如本文所用，術語「抗體」係指來源於特異性結合抗原之免疫球蛋白分子的蛋白質或多肽序列。抗體可為多株或單株、多鏈或單鏈或完整的免疫球蛋白且可來源於天然來源或重組來源。抗體可為免疫球蛋白分子之四聚物。
術語「抗體片段」係指完整抗體之至少一部分或其重組變異體，且係指完整抗體之足以賦予抗體片段對標靶(諸如抗原)之識別及特異性結合的抗原結合結構域(例如抗原決定可變區)。抗體片段之實例包括(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、scFv抗體片段、線性抗體、諸如sdAb之單結構域抗體(VL或VH)、駱駝VHH結構域、及由諸如二價片段之抗體片段形成的多特異性分子(包含在鉸鏈區由二硫橋鍵連接之兩個或更多個例如兩個Fab片段)、或兩個或更多個例如兩個經分離CDR或抗體之連接之其他抗原決定基結合片段。抗體片段亦可併入單結構域抗體、最大抗體(maxibody)、微型抗體(minibody)、奈米抗體(nanobody)、胞內抗體(intrabody)、雙功能抗體(diabody)、三功能抗體(triabody)、四功能抗體(tetrabody)、v-NAR及雙-scFv中(參見例如Hollinger及Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005)。抗體片段亦可移植至基於多肽之骨架，諸如III型纖維結合蛋白(Fn3)(參見美國專利第6,703,199號，其描述纖維結合蛋白多肽微型抗體)。
術語「scFv」係指包含至少一個包含輕鏈可變區之抗體片段及至少一個包含重鏈可變區之抗體片段的融合蛋白，其中輕鏈及重鏈可變區經由短的可撓性多肽連接子連續連接且能夠表現為單鏈多肽，且其中scFv保留其所來源之完整抗體的特異性。除非指定，否則如本文所用，scFv可例如相對於多肽之N末端及C末端具有任何次序之VL及VH可變區，scFv可包含VL-連接子-VH或可包含VH-連接子-VL。
如本文所用，術語「互補決定區」或「CDR」係指在抗體可變區內之胺基酸序列，其賦予抗原特異性及結合親和力。舉例而言，通常，各重鏈可變區中存在三個CDR (例如HCDR1、HCDR2及HCDR3)且各輕鏈可變區中存在三個CDR (LCDR1、LCDR2及LCDR3)。既定CDR之精確胺基酸序列邊界可使用多種熟知方案中之任一者確定，該等方案包括由Kabat等人 (1991),「Sequences of Proteins of Immunological Interest」, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (「Kabat」編號方案)；Al-Lazikani等人, (1997) JMB 273,927-948 (「Chothia」編號方案)所描述之方案或其組合。根據Kabat編號方案，在一些實施例中，重鏈可變結構域(VH)中之CDR胺基酸殘基編號為31-35 (HCDR1)、50-65 (HCDR2)及95-102 (HCDR3)；且輕鏈可變結構域(VL)中之CDR胺基酸殘基編號為24-34 (LCDR1)、50-56 (LCDR2)及89-97 (LCDR3)。根據Chothia編號方案，在一些實施例中，VH中之CDR胺基酸編號為26-32 (HCDR1)、52-56 (HCDR2)及95-102 (HCDR3)；且VL中之CDR胺基酸殘基編號為26-32 (LCDR1)、50-52 (LCDR2)及91-96 (LCDR3)。在組合之Kabat及Chothia編號方案中，在一些實施例中，CDR對應於作為Kabat CDR、Chothia CDR或兩者之一部分的胺基酸殘基。舉例而言，在一些實施例中，CDR對應於VH，例如哺乳動物VH，例如人類VH中之胺基酸殘基26-35 (HCDR1)、50-65 (HCDR2)及95-102 (HCDR3)；及VL，例如哺乳動物VL，例如人類VL中之胺基酸殘基24-34 (LCDR1)、50-56 (LCDR2)及89-97 (LCDR3)。
包含抗體或其抗體片段的本發明之CAR組合物之部分可以各種形式存在，例如其中抗原結合結構域表示為多肽鏈之部分，包括例如單結構域抗體片段(sdAb)、單鏈抗體(scFv)或例如人類化抗體(Harlow等人, 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY；Harlow等人, 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York；Houston等人, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；Bird等人, 1988, Science 242:423-426)。在一個態樣中，本發明之CAR組合物之抗原結合結構域包含抗體片段。在另一態樣中，CAR包括包含scFv之抗體片段。
如本文所用，術語「結合結構域」或「抗體分子」(在本文中亦稱為「抗標靶結合結構域」)係指包含至少一個免疫球蛋白可變結構域序列之蛋白質，例如免疫球蛋白鏈或其片段。術語「結合結構域」或「抗體分子」涵蓋抗體及抗體片段。在一實施例中，抗體分子為多特異性抗體分子，例如，其包含複數個免疫球蛋白可變結構域序列，其中該複數個序列中之第一免疫球蛋白可變結構域序列對於第一抗原決定基具有結合特異性且該複數個序列中之第二免疫球蛋白可變結構域序列對於第二抗原決定基具有結合特異性。在一實施例中，多特異性抗體分子為雙特異性抗體分子。雙特異性抗體對於不超過兩種抗原具有特異性。雙特異性抗體分子之特徵為對於第一抗原決定基具有結合特異性之第一免疫球蛋白可變結構域序列及對於第二抗原決定基具有結合特異性之第二免疫球蛋白可變結構域序列。術語「抗體重鏈」係指以其天然存在之構形存在於抗體分子中且通常決定抗體所屬類別的兩種類型之多肽鏈中之較大者。
術語「抗體輕鏈」係指以其天然存在之構形存在於抗體分子中的兩種類型之多肽鏈中之較小者。κ及λ輕鏈係指兩種主要抗體輕鏈同型。
術語「重組抗體」係指使用重組DNA技術產生之抗體，諸如由噬菌體或酵母表現系統所表現之抗體。該術語亦應理解為意謂已藉由合成編碼抗體之DNA分子(且該DNA分子表現抗體蛋白)或指定抗體之胺基酸序列產生的抗體，其中該DNA或胺基酸序列已使用在此項技術中可獲得且熟知的重組DNA或胺基酸序列技術獲得。
術語「抗原」或「Ag」係指引起免疫反應之分子。此免疫反應可能涉及抗體產生或特異免疫勝任細胞之活化或兩者。熟習此項技術者應理解，包括幾乎所有蛋白質或肽之任何大分子均可充當抗原。此外，抗原可來源於重組或基因組DNA。熟習此項技術者應理解，當在本文中使用彼術語時，包含編碼引發免疫反應之蛋白質的核苷酸序列或部分核苷酸序列之任何DNA因此編碼「抗原」。此外，熟習此項技術者應理解，抗原不必僅藉由基因之全長核苷酸序列編碼。顯而易見，本發明包括(但不限於)多於一種基因之部分核苷酸序列之用途且此等核苷酸序列以各種組合排列以編碼引發所需免疫反應之多肽。此外，熟習此項技術者應理解，抗原根本不必藉由「基因」編碼。易於顯而易知，抗原可合成產生或可來源於生物樣品或可為除多肽以外之大分子。此類生物樣品可包括(但不限於)組織樣品、腫瘤樣品、細胞或具有其他生物組分之流體。
術語「抗癌效應」係指可藉由各種手段體現之生物效應，包括(但不限於)例如腫瘤體積之減小、癌細胞數目之減少、轉移數目之減少、壽命預期之延長、癌細胞增殖之減少、癌細胞存活之減少或與癌性病狀相關之各種生理症狀的改善。「抗癌效應」亦可由肽、聚核苷酸、細胞及抗體首先預防癌症出現之能力體現。術語「自體」係指來源於與隨後可重新引入個體中相同的個體之任何物質。
術語「同種異體」係指來源於與引入物質之個體相同物種之不同動物的任何物質。當一或多個基因座處之基因不相同時，兩個或更多個個體稱為彼此同種異體。在一些態樣中，來自相同物種之個體的同種異體物質基因上可足夠不同從而以抗原方式相互作用。
術語「異種」係指來源於不同物種之動物的移植物。
如本文所用，術語「血球分離術」係指此項技術公認之體外過程，藉由該過程，供體或患者之血液自供體或患者移除且通過將所選特定成分分離出之設備且例如藉由回輸法使剩餘部分返回至供體或患者之循環。因此，在「血球分離術樣品」之情況下係指使用血球分離術獲得之樣品。
術語「組合」係指呈一種單位劑型之固定組合，或組合投藥，其中本發明化合物與組合搭配物(例如如下文所解釋之另一藥物，亦稱為「治療劑」或「助劑」)可同時獨立投與或在時間間隔內分開投與，尤其其中此等時間間隔允許組合搭配物顯示協作效應，例如協同效應。單一組分可封裝在套組中或分開封裝。組分中之一或兩者(例如粉末或液體)可在投與前復原或稀釋至所需劑量。如本文所用，術語「共投與」或「組合投與」或其類似術語意欲涵蓋向有需要之單一個體(例如患者)投與所選擇之組合搭配物，且意欲包括藥劑不一定藉由相同投藥途徑投與或同時投與之治療方案。如本文所用，術語「醫藥組合」意謂由混合或組合多於一種活性成分所產生之產物且包括活性成分之固定與不固定組合。術語「固定組合」意謂，活性成分(例如本發明化合物及組合搭配物)均以單一實體或劑量形式同時向患者投與。術語「不固定組合」意謂，活性成分(例如本發明化合物及組合搭配物)均以分別的實體形式同時、並行或依序無特定時間限制地向患者投與，其中該投與在患者體內提供治療有效水準之兩種化合物。後者亦適用於混合物療法，例如投與三種或更多種活性成分。
術語「癌症」係指特徵為異常細胞之快速且不受控制的生長之疾病。癌細胞可局部擴散或經由血流及淋巴系統擴散至身體其他部分。各種癌症之實例描述於本文中且包括(但不限於)乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌及其類似癌症。藉由本文所述之方法治療之較佳癌症包括多發性骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤。
術語「腫瘤」及「癌症」在本文中可互換使用，例如兩個術語涵蓋實體及液體，例如彌漫性或循環腫瘤。如本文所用，術語「癌症」或「腫瘤」包括惡化前以及惡性癌症及腫瘤。
「來源於」在該術語在本文中使用時指示第一與第二分子之間的關係。其一般指第一分子與第二分子之間的結構相似性，且不涵蓋或包括對來源於第二分子之第一分子的過程或來源限制。舉例而言，在來源於CD3ζ分子之胞內信號傳導結構域之情況下，胞內信號傳導結構域保留足夠CD3ζ結構，使得具有所需功能，亦即在適當條件下產生信號之能力。其不涵蓋或包括對產生胞內信號傳導結構域之特定過程的限制，例如其並不意謂，為提供胞內信號傳導結構域，吾人必須以CD3ζ序列開始且刪除不必要序列，或施加突變以達成胞內信號傳導結構域。
片語「與抗原，例如腫瘤抗原之表現相關的疾病」包括(但不限於)與表現抗原(例如野生型或突變抗原)之細胞相關的疾病或與表現抗原(例如野生型或突變抗原)之細胞相關的病狀，包括例如增生性疾病，諸如癌症或惡性疾病，或癌前病狀，諸如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前驅症；或與表現抗原(例如野生型或突變抗原)之細胞相關的非癌症相關適應症。為避免疑問，與抗原之表現相關的疾病可包括與例如因為抗原表現已例如由於靶向抗原之分子之治療而下調故目前不表現抗原但曾經表現抗原之細胞相關的病狀。在一些實施例中，與抗原，例如腫瘤抗原之表現相關的疾病為癌症(例如實體癌症或血液癌症)、病毒感染(例如HIV、真菌感染，例如新型隱球菌(C. neoformans))、自體免疫疾病(例如類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡(SLE或狼瘡)、尋常天疱瘡及休格連氏症候群(Sjogren's syndrome)；發炎性腸病、潰瘍性結腸炎；與黏膜免疫相關之移植相關同種特異性免疫病症；及針對生物製品(例如因子VIII)之非想要免疫反應，其中體液免疫為重要的)。
術語「保守序列修飾」係指胺基酸修飾不顯著影響或改變含有該胺基酸序列之抗體或抗體片段之結合特徵。此類保守修飾包括胺基酸取代、添加及缺失。修飾可藉由此項技術中已知之標準技術(諸如定點突變誘發及PCR介導之突變誘發)引入本發明之抗體或抗體片段中。保守取代為胺基酸殘基置換為具有類似側鏈之胺基酸殘基的取代。此項技術中已限定具有類似側鏈之胺基酸殘基家族。此等家族包括具有鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、β分支鏈側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)之胺基酸。因此，本發明CAR內之一或多個胺基酸殘基可用來自相同側鏈家族之其他胺基酸殘基置換，且可使用本文所描述之功能性分析來測試改變之CAR。
術語「刺激」係指由刺激分子(例如TCR/CD3複合物)與其同源配體之結合誘導的初級反應，藉此介導信號轉導事件，諸如(但不限於)經由TCR/CD3複合物進行信號轉導。刺激可介導某些分子之改變表現，諸如下調TGF-β，及/或重組細胞骨架結構，及其類似者。
術語「刺激分子」係指由提供初級細胞質信號傳導序列之T細胞表現的分子，初級細胞質信號傳導序列對於T細胞信號傳導路徑之至少一些態樣以刺激方式調節TCR複合物之初級活化。在一些實施例中，CAR內含ITAM之結構域再現獨立於內源性TCR複合物之初級TCR的信號傳導。在一個態樣中，初級信號係藉由例如TCR/CD3複合物與負載有肽之MHC分子的結合來起始，且此引起T細胞反應之介導，包括(但不限於)增殖、活化、分化及其類似者。以刺激方式起作用之初級細胞質信號傳導序列(亦稱為「初級信號傳導結構域」)可含有稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基元或ITAM的信號傳導基元。特別適用於本發明的含有ITAM之初級細胞質信號傳導序列之實例包括(但不限於)來源於以下各者之序列：TCR ζ、FcR γ、FcR β、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278 (亦稱為「ICOS」)、FcεRI及CD66d、DAP10及DAP12。在本發明之特定CAR中，本發明之任一或多種CAR中的胞內信號傳導結構域包含胞內信號傳導序列，例如CD3-ζ之初級信號傳導序列。術語「抗原呈現細胞」或「APC」係指在其表面上呈現與主要組織相容複合物(MHC)複合之外來抗原的免疫系統細胞，諸如輔助細胞(例如B細胞、樹突狀細胞及其類似細胞)。T細胞可使用其T細胞受體(TCR)識別此等複合物。APC處理抗原且將其呈現給T細胞。
「胞內信號傳導結構域」在該術語在本文中使用時係指分子之胞內部分。在實施例中，胞內信號結構域轉導效應功能信號且引導細胞執行專門功能。儘管可採用整個胞內信號傳導結構域，但在多數情況下，不必使用整條鏈。至於使用胞內信號傳導結構域之截短部分的程度，此類截短部分只要轉導效應功能信號即可用於替代完整鏈。術語胞內信號傳導結構域因此意欲包括足以轉導效應功能信號之胞內信號傳導結構域的任何截短部分。
胞內信號傳導結構域生成促進含CAR之細胞(例如CART細胞)之免疫效應功能的信號。免疫效應功能之實例(例如在CART細胞中)包括細胞溶解活性及輔助活性，包括細胞介素分泌。
在一實施例中，胞內信號傳導結構域可包含初級胞內信號傳導結構域。例示性初級胞內信號傳導結構域包括來源於負責初級刺激或抗原依賴性模擬之分子的彼等。在一實施例中，胞內信號傳導結構域可包含共刺激胞內結構域。例示性共刺激胞內信號傳導結構域包括來源於負責共刺激信號或抗原獨立刺激之分子的彼等。舉例而言，在CART之情況下，初級胞內信號傳導結構域可包含T細胞受體之細胞質序列，且共刺激胞內信號傳導結構域可包含來自共受體或共刺激分子之細胞質序列。
初級胞內信號傳導結構域可包含稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基元或ITAM的信號傳導基元。含有ITAM之初級細胞質信號傳導序列之實例包括(但不限於)來源於以下之序列：CD3 ζ、FcR γ、FcR β、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278 (亦稱為「ICOS」)、FcεRI、CD66d、DAP10及DAP12。
術語「ζ」或者「ζ鏈」、「CD3-ζ」或「TCR-ζ」係指CD247。Swiss-Prot寄存編號P20963提供例示性人類CD3 ζ胺基酸序列。「ζ刺激結構域」或者「CD3-ζ刺激結構域」或「TCR-ζ刺激結構域」係指CD3-ζ之刺激結構域或其變異體(例如具有突變(例如點突變、片段、插入或缺失)之分子)。在一個實施例中，ζ細胞質結構域包含GenBank寄存編號BAG36664.1之殘基52至164或其變異體(例如具有突變(例如點突變、片段、插入或缺失)之分子)。在一個實施例中，「ζ刺激結構域」或「CD3-ζ刺激結構域」為如SEQ ID NO: 641或643所提供之序列或其變異體(例如具有突變(例如點突變、片段、插入或缺失)之分子)。
術語「共刺激分子」係指T細胞上之同源結合搭配物，其特異性結合共刺激配體，進而介導T細胞之共刺激反應，諸如(但不限於)增殖。共刺激分子為除抗原受體或其配體以外的細胞表面分子，其為有效免疫反應所需。共刺激分子包括(但不限於)MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整合素、信號傳導淋巴細胞性活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配體受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、4-1BB (CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS (CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM (LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及與CD83特異性結合之配體。
共刺激胞內信號傳導結構域係指共刺激分子之胞內部分。
胞內信號傳導結構域可包含其所源自之分子的整個胞內部分或整個天然胞內信號傳導結構域，或其功能片段。
術語「4-1BB」係指CD137或腫瘤壞死因子受體超家族成員9。Swiss-Prot寄存編號P20963提供例示性人類4-1BB胺基酸序列。「4-1BB共刺激結構域」係指4-1BB之共刺激結構域或其變異體(例如具有突變(例如點突變、片段、插入或缺失)之分子)。在一個實施例中，「4-1BB共刺激結構域」為如SEQ ID NO: 637所提供之序列或其變異體(例如具有突變(例如點突變、片段、插入或缺失)之分子)。
「免疫效應細胞」在該術語在本文中使用時係指參與免疫反應，例如免疫效應反應促進之細胞。免疫效應細胞之實例包括T細胞，例如α/β T細胞及γ/δ T細胞、B細胞、自然殺手(NK)細胞、自然殺手T (NKT)細胞、肥大細胞及骨髓源吞噬細胞。
「免疫效應功能或免疫效應反應」在該術語在本文中使用時係指例如免疫效應細胞之增強或促進靶細胞之免疫侵襲的功能或反應。例如免疫效應功能或反應係指T或NK細胞之促進靶細胞之殺死或者生長或增殖抑制的特性。在T細胞之情況下，初級刺激及共刺激為免疫效應功能或反應之實例。
術語「效應功能」係指細胞之專門功能。T細胞之效應功能例如可為細胞溶解活性或輔助活性，包括分泌細胞介素。
術語「編碼」係指諸如基因、cDNA或mRNA之聚核苷酸中的核苷酸之特異性序列在生物過程中充當合成其他聚合物及大分子之模板的固有特性，該等聚合物及大分子具有已確定之核苷酸序列(例如rRNA、tRNA及mRNA)或已確定之胺基酸序列及由其獲得之生物特性。因此，若與該基因相對應之mRNA之轉錄及轉譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白質，則基因、cDNA或RNA編碼蛋白質。核苷酸序列與mRNA序列一致且通常提供於序列表中的編碼股與用作基因或cDNA轉錄之模板的非編碼股均可稱為編碼該基因或cDNA之蛋白質或其他產物。
除非另外指定，否則「編碼胺基酸序列之核苷酸序列」包括為彼此之簡併型式且編碼相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。片語編碼蛋白質或RNA之核苷酸序列亦可包括內含子，其達到編碼蛋白質之核苷酸序列可在一些型式中含有內含子之程度。
術語「有效量」或「治療有效量」在本文中可互換使用，且指如本文所描述能有效實現特定生物結果之化合物、調配物、物質或組合物之量。
術語「內源性」係指來自或在生物體、細胞、組織或系統內部產生之任何物質。
術語「外源性」係指自生物體、細胞、組織或系統外部引入或產生之任何物質。
術語「表現」係指特定核苷酸序列之轉錄及/或轉譯。在一些實施例中，表現包含引入至細胞中之mRNA之轉譯。
術語「轉移載體」係指包含經分離核酸且可用於將經分離核酸遞送至細胞內部之物質組合物。此項技術中已知多種載體，包括(但不限於)線性聚核苷酸、與離子或兩親媒性化合物相關之聚核苷酸、質體及病毒。因此，術語「轉移載體」包括自主複製質體或病毒。該術語亦應解釋為進一步包括促進核酸轉移至細胞中之非質體及非病毒化合物，諸如聚離胺酸化合物、脂質體及其類似物。病毒轉移載體之實例包括(但不限於)腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體及其類似物。
術語「表現載體」係指包含重組性聚核苷酸之載體，該重組性聚核苷酸包含可操作地連接於待表現核苷酸序列之表現控制序列。表現載體包含足夠順式作用元件用於表現；用於表現之其他元件可由宿主細胞供應或在活體外表現系統中。表現載體包括此項技術中已知之所有表現載體，包括併入重組性聚核苷酸之黏質體、質體(例如，裸露或含於脂質體中)及病毒(例如，慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
術語「慢病毒」係指反轉錄病毒科(Retroviridae family)之屬。慢病毒在反轉錄病毒中為獨特的，因為其能夠感染未分化細胞；其可將足夠量之遺傳資訊遞送至宿主細胞之DNA中，因此其為基因遞送載體之最有效方法中之一者。HIV、SIV及FIV均為慢病毒之實例。
術語「慢病毒載體」係指來源於慢病毒基因組之至少一部分的載體，尤其包括如Milone等人, Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)中所提供之自身不活化慢病毒載體。臨床中可使用之慢病毒載體之其他實例包括(但不限於)例如來自Oxford BioMedica之LENTIVECTOR®基因遞送技術、來自Lentigen之LENTIMAX™載體系統及其類似物。非臨床類型之慢病毒載體亦可獲得且將為熟習此項技術者所已知。
術語「同源」或「一致性」係指兩個聚合分子之間，例如兩個核酸分子(諸如兩個DNA分子或兩個RNA分子)之間或兩個多肽分子之間的次單元序列一致性。當兩個分子中之次單元位置由相同單體次單元佔據時；例如若兩個DNA分子中之每一者中之位置均由腺嘌呤佔據，則其在彼位置處為同源或一致的。兩個序列之間的同源性為匹配或同源位置數目之直接函數；例如若兩個序列中之位置有一半(例如長度為十個次單元之聚合物中之五個位置)同源，則該兩個序列為50%同源；若90%之位置(例如10個中之9個)匹配或同源，則該兩個序列為90%同源。
非人類(例如鼠類)抗體之「人類化」形式為含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體之其他抗原結合子序列)。大多數情況下，人類化抗體及其抗體片段為人類免疫球蛋白(受體抗體或抗體片段)，其中來自受體之互補決定區(CDR)之殘基置換為來自諸如具有所需特異性、親和力及能力之小鼠、大鼠或兔之非人類物種(供體抗體)的CDR之殘基。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基置換為相應非人類殘基。此外，人類化抗體/抗體片段可包含既不存在於受體抗體中亦不存在於所引入之CDR或構架序列中之殘基。此等修飾可進一步使抗體或抗體片段效能優化及最佳化。一般而言，人類化抗體或其抗體片段將包含實質上所有至少一個及典型地兩個可變結構域，其中所有或實質上所有CDR區與非人類免疫球蛋白之彼等區相對應且所有或絕大部分FR區為人類免疫球蛋白序列之彼等區。人類化抗體或抗體片段亦可包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，該恆定區典型地為人類免疫球蛋白之恆定區。關於其他細節，參見Jones等人, Nature, 321: 522-525, 1986；Reichmann等人, Nature, 332: 323-329, 1988；Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992。
術語「完全人類」係指諸如抗體或抗體片段之免疫球蛋白，其中整個分子具有人類來源或由與抗體或免疫球蛋白之人類形式一致的胺基酸序列組成。
術語「經分離」意謂自天然狀態改變或移出。舉例而言，天然存在於活的動物中之核酸或肽並非「經分離的」，但自其天然狀態之共存物質部分或完全分離之相同核酸或肽為「經分離的」。經分離核酸或蛋白質可以實質上純化形式存在，或可存在於諸如宿主細胞之非原生環境中。
在本發明之情形中，使用以下通常存在之核酸鹼基之縮寫。「A」係指腺苷，「C」係指胞嘧啶，「G」係指鳥苷，「T」係指胸苷，且「U」係指尿苷。
術語「可操作地連接」或「轉錄控制」係指調節序列與異源核酸序列之間的功能性鍵聯，其導致異源核酸序列之表現。舉例而言，當第一核酸序列與第二核酸序列處於功能性關係時，第一核酸序列可操作地連接第二核酸序列。舉例而言，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則啟動子可操作地連接於編碼序列。可操作地連接之DNA序列可彼此鄰接，且例如若接合兩個蛋白編碼區時必要，則處於同一閱讀框架中。
術語「非經腸」投與免疫原性組合物包括例如皮下(s.c.)、靜脈內(i.v.)、肌肉內(i.m.)或胸骨內注射、腫瘤內或輸注技術。
術語「核酸」或「聚核苷酸」係指脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其單股或雙股形式之聚合物。除非明確限制，否則該術語涵蓋含有天然核苷酸之已知類似物的核酸，該等已知類似物具有與參考核酸類似的結合特性且以與天然存在之核苷酸類似的方式代謝。除非另外指明，否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其保守修飾之變異體(例如簡併密碼子取代，例如保守取代)、對偶基因、直系同源物、SNP及互補序列以及明確指定的序列。特定言之，簡併密碼子取代(例如保守取代)可藉由產生其中一或多個所選(或所有)密碼子之第三位置經混合鹼基及/或脫氧肌苷殘基取代的序列來達成(Batzer等人, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka等人, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；及Rossolini等人, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」可互換使用，且係指由藉由肽鍵共價連接之胺基酸殘基組成之化合物。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸，且關於可構成蛋白質或肽之序列的胺基酸之最大數目無限制。多肽包括任何包含藉由肽鍵彼此接合之兩個或更多個胺基酸的肽或蛋白質。如本文所用，該術語係指短鏈(其在此項技術中通常亦稱為例如肽、寡肽及寡聚物)及長鏈(其在此項技術中一般稱為蛋白質，其存在多種類型)。「多肽」尤其包括例如生物活性片段、實質上同源多肽、寡肽、均二聚體、雜二聚體、多肽變異體、修飾多肽、衍生物、類似物、融合蛋白。多肽包括天然肽、重組肽或其組合。
術語「啟動子」係指由細胞合成機制或引入之合成機制識別，起始聚核苷酸序列之特異性轉錄所需之DNA序列。
術語「啟動子/調節序列」係指表現可操作地連接於啟動子/調節序列之基因產物所必需的核酸序列。在一些情況下，此序列可為核心啟動子序列，且在其他情況下，此序列亦可包括強化子序列及表現基因產物所必需的其他調節元件。啟動子/調節序列可例如為以組織特異性方式表現基因產物之啟動子/調節序列。
術語「組成性」啟動子係指當與編碼或特異於基因產物之聚核苷酸可操作地連接時，在細胞之大多數或全部生理學條件下引起基因產物在細胞中產生之核苷酸序列。
術語「誘導性」啟動子係指當與編碼或特異於基因產物之聚核苷酸可操作地連接時，僅當細胞中存在對應於啟動子之誘導劑時才引起基因產物在細胞中實質上產生之核苷酸序列。
術語「組織特異性」啟動子係指當與編碼或特異於基因之聚核苷酸可操作地連接時，僅當細胞為對應於啟動子之組織類型的細胞時才引起基因產物在細胞中實質上產生之核苷酸序列。
術語「癌症相關抗原」或「腫瘤抗原」可互換地指完整地或以片段形式(例如MHC/肽)在癌細胞表面上表現之分子(典型地為蛋白質、碳水化合物或脂質)，且其適用於使藥理學藥劑優先靶向癌細胞。在一些實施例中，腫瘤抗原為正常細胞與癌細胞所表現之標記物，例如譜系標記物，例如B細胞上之CD19。在一些實施例中，腫瘤抗原為在癌細胞中相較於在正常細胞中過度表現之細胞表面分子，例如相較於正常細胞1倍過度表現、2倍過度表現、3倍過度表現或更多。在一些實施例中，腫瘤抗原為癌細胞中不適當合成之細胞表面分子，例如相較於正常細胞上表現之分子含有缺失、添加或突變之分子。在一些實施例中，腫瘤抗原將僅僅在癌細胞之細胞表面上完整地或以片段形式(例如MHC/肽)表現，且不在正常細胞之表面上合成或表現。在一些實施例中，本發明之CAR包括包含結合至MHC呈現肽之抗原結合結構域(例如抗體或抗體片段)的CAR。通常，來源於內源性蛋白質之肽填充主要組織相容複合物(MHC) I類分子之凹穴，且由CD8 + T淋巴細胞上之T細胞受體(TCR)識別。MHC I類複合物由所有成核細胞組成性表現。在癌症中，病毒特異性及/或腫瘤特異性肽/MHC複合物表示免疫療法之獨特類別之細胞表面標靶。已描述在人類白細胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2之情形下靶向來源於病毒或腫瘤抗原之肽的TCR樣抗體(參見例如Sastry等人, J Virol. 2011 85(5):1935-1942；Sergeeva等人, Blood, 2011 117(16):4262-4272；Verma等人, J Immunol 2010 184(4):2156-2165；Willemsen等人, Gene Ther 2001 8(21) :1601-1608；Dao等人, Sci Transl Med 2013 5(176) :176ra33；Tassev等人, Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100)。舉例而言，TCR樣抗體可自篩選文庫(諸如人類scFv噬菌體呈現庫)鑑別。
術語「腫瘤支持抗原」或「癌症支持抗原」可互換地指表現於本身不具癌性但例如藉由促進癌細胞之生長或存活而支持癌細胞(例如對免疫細胞之抗性)之細胞表面上的分子(典型地為蛋白質、碳水化合物或脂質)。此類型之例示性細胞包括基質細胞及骨髓衍生之抑制細胞(MDSC)。腫瘤支持抗原本身無需在支持腫瘤細胞方面起作用，只要抗原存在於支持癌細胞之細胞上。
如在scFv之情形下所用，術語「可撓性多肽連接子」或「連接子」係指由單獨或組合使用之胺基酸(諸如甘胺酸及/或絲胺酸殘基)組成之肽連接子，其將可變重鏈區與可變輕鏈區連接在一起。在一個實施例中，可撓性多肽連接子為Gly/Ser連接子且包含胺基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n為等於或大於1之正整數。舉例而言，n=1、n=2、n=3、n=4、n=5及n=6、n=7、n=8、n=9及n=10 (SEQ ID NO: 28)。在一個實施例中，可撓性多肽連接子包括(但不限於)(Gly4 Ser)4 (SEQ ID NO: 29)或(Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO: 30)。在另一實施例中，連接子包括多個重複序列(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser) (SEQ ID NO: 31)。本發明之範疇內亦包括以引用的方式併入本文中之WO2012/138475中所描述之連接子。
如本文所用，5'帽(亦稱為RNA帽、RNA 7-甲基鳥苷帽或RNA m7G帽)為經修飾的鳥嘌呤核苷酸，其在轉錄開始後不久即添加至真核信使RNA的「前端」或5'端。5'帽由連接至第一轉錄核苷酸之末端基團組成。其存在對於核糖體識別及保護免於核糖核酸酶(RNase)而言至關重要。帽添加與轉錄偶接，且以共轉錄方式進行，使得各自彼此影響。轉錄開始後不久，所合成之mRNA之5'端由與RNA聚合酶相關之帽合成複合物結合。此酶促複合物催化mRNA封端所需之化學反應。合成以多步驟生物化學反應形式進行。封端部分可經修飾以調節mRNA之功能性，諸如其穩定性或轉譯效率。
如本文所用，「活體外轉錄RNA」係指已活體外合成之RNA，較佳mRNA。一般而言，活體外轉錄RNA自活體外轉錄載體產生。活體外轉錄載體包含用於產生活體外轉錄RNA之模板。
如本文所用，「聚(A)」為藉由聚腺苷酸化連接至mRNA的一連串腺苷。在用於短暫表現之構築體之較佳實施例中，聚A在50與5000之間(SEQ ID NO: 32)，較佳大於64，更佳大於100，最佳大於300或400。聚(A)序列可經化學或酶修飾以調節mRNA功能性，諸如定位、穩定性或轉譯效率。
如本文所用，「聚腺苷酸化」係指聚腺苷部分或其經修飾之變異體與信使RNA分子共價連接。在真核生物體中，大多數信使RNA (mRNA)分子在3'端經聚腺苷酸化。3'聚(A)尾為經由酶(聚腺苷酸化聚合酶)之作用添加至前mRNA的腺嘌呤核苷酸之長序列(通常幾百)。在高級真核生物中，聚(A)尾添加至含有特定序列(聚腺苷酸化信號)之轉錄物上。聚(A)尾及結合至其的蛋白質有助於保護mRNA不被核酸外切酶降解。聚腺苷酸化對於轉錄終止、mRNA自細胞核輸出及轉譯亦為重要的。聚腺苷酸化在DNA轉錄成RNA之後立即在細胞核中發生，但另外亦可稍後在細胞質中發生。轉錄結束後，mRNA鏈經與RNA聚合酶相關之核酸內切酶複合物作用裂解。裂解位點之特徵通常為在裂解位點附近存在鹼基序列AAUAAA。mRNA裂解後，腺苷殘基添加至裂解位點之游離3'端。
如本文所用，「短暫」係指非整合轉殖基因表現時段為數小時、數日或數週，其中若整合至基因組中或含於宿主細胞中之穩定質體複製子內，則表現時間段小於基因表現時間段。
如本文所用，術語「治療(treat/treatment/treating)」係指由投與一或多種療法(例如一或多種治療劑，諸如本發明之CAR)導致減少或改善增生性病症之進展、嚴重程度及/或持續時間，或改善增生性病症之一或多種症狀(較佳一或多種可辨別症狀)。在特定實施例中，術語「治療」係指改善增生性病症之患者不一定可辨別之至少一個可量測物理參數，諸如腫瘤生長。在其他實施例中，術語「治療」係指以物理方式藉由例如穩定可辨別症狀、以生理學方式藉由例如穩定物理參數或其兩者來抑制增生性病症之進展。在其他實施例中，術語「治療」係指減小或穩定腫瘤尺寸或癌細胞計數。
術語「信號轉導路徑」係指在將信號自細胞之一部分傳輸至細胞之另一部分中起作用的多種信號轉導分子之間的生物化學關係。片語「細胞表面受體」包括能夠跨越細胞膜接收信號及傳輸信號之分子及分子複合物。
術語「個體」意欲包括可引起免疫反應之活生物體(例如哺乳動物，人類)。
術語「實質上純化」細胞係指基本上不含其他細胞類型之細胞。實質上純化細胞亦指已與在其天然存在之狀態下通常與其相關之其他細胞類型分離的細胞。在一些情況下，實質上純化細胞群體係指細胞之同源群體。在其他情況下，此術語僅指已與在其天然狀態下與其天然相關之細胞分離的細胞。在一些態樣中，細胞在活體外培養。在其他態樣中，細胞不在活體外培養。
如本文所用，術語「療法」意謂治療。藉由減輕、抑制、緩解或根除疾病狀態來獲得治療作用。
如本文所用，術語「預防」意謂疾病或疾病狀態之預防或保護性治療。
在本發明之情形下，「腫瘤抗原」或「過度增生性病症抗原」或「與過度增生性病症相關之抗原」係指特定過度增生性病症常見的抗原。在某些態樣中，本發明之過度增生性病症抗原來源於癌症，包括(但不限於)原發性或轉移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌及腺癌，諸如乳癌、前列腺癌(例如去勢抗性或療法抗性前列腺癌或轉移性前列腺癌)、卵巢癌、胰臟癌及其類似病症，或漿細胞增生性病症，例如無症狀骨髓瘤(和緩性多發性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、意義不明的單株γ球蛋白血症(MGUS)、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、漿細胞瘤(例如漿細胞惡病質、孤立性骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤及多發性漿細胞瘤)、全身性澱粉狀蛋白輕鏈澱粉樣變性及POEMS症候群(亦稱為克羅-富克斯症候群(Crow-Fukase syndrome)、高槻病(Takatsuki disease)及PEP症候群)。
術語「轉染」或「轉化」或「轉導」係指外源性核酸藉以轉移或引入至宿主細胞中的過程。「轉染」或「轉化」或「轉導」細胞為已經外源性核酸轉染、轉化或轉導之細胞。該細胞包括初級個體細胞及其後代。
術語「特異性結合」係指抗體或配體識別且結合存在於樣品中之同源結合搭配物(例如存在於T細胞上之刺激及/或共刺激分子)蛋白質，但該抗體或配體並不實質上識別或結合樣品中之其他分子。
如本文所用，「可調節嵌合抗原受體(RCAR)」係指一組多肽，在最簡單實施例中典型地為兩個多肽，其在免疫效應細胞中時，向細胞提供針對靶細胞(典型地為癌細胞)之特異性，及胞內信號產生。在一些實施例中，RCAR包含至少一胞外抗原結合結構域、跨膜結構域及細胞質信號傳導結構域(在本文中亦稱為「胞內信號傳導結構域」)，在CAR分子之情況下細胞質信號傳導結構域包含來源於如本文所定義之刺激分子及/或共刺激分子之功能性信號傳導結構域。在一些實施例中，RCAR中的多肽組彼此不鄰接，例如處於不同多肽鏈中。在一些實施例中，RCAR包括二聚開關，其在二聚分子存在時可將多肽彼此偶合，例如可將抗原結合結構域與胞內信號傳導結構域偶合。在一些實施例中，RCAR在如本文所描述之細胞(例如免疫效應細胞)，例如表現RCAR之細胞(在本文中亦稱為「RCARX細胞」)中表現。在一實施例中，RCARX細胞為T細胞，且稱為RCART細胞。在一實施例中，RCARX細胞為NK細胞，且稱為RCARN細胞。RCAR可為表現RCAR之細胞提供針對靶細胞(典型地為癌細胞)之特異性，及可調節之胞內信號產生或增殖，可使表現RCAR之細胞之免疫效應特性最佳化。在實施例中，RCAR細胞至少部分依賴於抗原結合結構域以提供對包含抗原結合結構域所結合之抗原的靶細胞之特異性。
「膜錨」或「膜繫栓結構域」在該術語在本文中使用時係指足以將胞外或胞內結構域錨定於質膜之多肽或部分(例如肉豆蔻醯基)。
「開關結構域」在該術語在本文中使用時例如當涉及RCAR時係指在二聚分子存在下與另一開關結構域相關之實體，典型地基於多肽之實體。該關聯導致連接至(例如稠合至)第一開關結構域之第一實體與連接至(例如稠合至)第二開關結構域之第二實體功能性偶合。第一及第二開關結構域統稱為二聚開關。在實施例中，第一與第二開關結構域彼此相同，例如其為具有相同初級胺基酸序列之多肽且統稱為均二聚開關。在實施例中，第一與第二開關結構域彼此不同，例如其為具有不同初級胺基酸序列之多肽且統稱為雜二聚開關。在實施例中，開關為胞內的。在實施例中，開關為胞外的。在實施例中，開關結構域為基於多肽(例如基於FKBP或FRB)之實體，且二聚分子為小分子，例如雷帕羅吉(rapalogue)。在實施例中，開關結構域為基於多肽之實體，例如結合myc肽之scFv，且二聚分子為多肽、其片段或多肽之多聚體，例如myc配體或與一或多個myc scFv結合之myc配體多聚體。在實施例中，開關結構域為基於多肽之實體，例如myc受體，且二聚分子為抗體或其片段，例如myc抗體。
「二聚分子」在該術語在本文中使用時例如當涉及RCAR時係指促進第一開關結構域與第二開關結構域關聯之分子。在實施例中，二聚分子非天然存在於個體中，或不以將導致顯著二聚之濃度存在。在實施例中，二聚分子為小分子，例如雷帕黴素(rapamycin)或雷帕羅吉，例如RAD001。
術語「生物等效」係指產生等效於由參考劑量或參考量之參考化合物(例如RAD001)產生之效應的效應所需之一定量的除參考化合物(例如RAD001)以外之藥劑。在實施例中，該效應為mTOR抑制水準，例如如藉由P70 S6激酶抑制所量測，例如如在活體內或活體外分析中所評估，例如如藉由本文所述之分析(例如Boulay分析，或藉由西方墨點法(western blot)量測磷酸化S6水準)所量測。在一實施例中，該效應為如藉由細胞分選所量測之PD-1陽性/PD-1陰性T細胞之比率改變。在一實施例中，mTOR抑制劑之生物等效量或劑量為達成與參考化合物之參考劑量或參考量相同水準之P70 S6激酶抑制的量或劑量。在一實施例中，mTOR抑制劑之生物等效量或劑量為實現與參考化合物之參考劑量或參考量相同水準之PD-1陽性/PD-1陰性T細胞之比率改變的量或劑量。
當與例如立體異位mTOR抑制劑(例如RAD001或雷帕黴素)或催化mTOR抑制劑之mTOR抑制劑一起使用時，術語「低免疫增強劑量」係指例如如藉由P70 S6激酶活性抑制所量測之部分而非完全抑制mTOR活性之mTOR抑制劑的劑量。用於例如藉由P70 S6激酶抑制來評估mTOR活性之方法論述於本文中。該劑量不足以導致完全免疫抑制但足以增強免疫反應。在一實施例中，低免疫增強劑量之mTOR抑制劑導致PD-1陽性免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)之數目減少，及/或PD-1陰性免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)之數目增加，或PD-1陰性免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)/PD-1陽性免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)之比率增加。
在一實施例中，低免疫增強劑量之mTOR抑制劑導致原生T細胞之數目增加。在一實施例中，低免疫增強劑量之mTOR抑制劑導致以下中之一或多者：
以下標記物中之一或多者在例如記憶T細胞(例如記憶T細胞前驅體)上的表現增加：CD62L高、CD127高、CD27+及BCL2；
KLRG1在例如記憶T細胞(例如記憶T細胞前驅體)上之表現減少；及
記憶T細胞前驅體之數目增加，該等細胞例如為具有以下特徵中之任一者或組合之細胞：CD62L高增加、CD127高增加、CD27+增加、KLRG1降低及BCL2增加；
其中例如相較於未經治療之個體，上文所述之變化中之任一者例如至少暫時出現。
如本文中所用，「難治性」係指對治療不起反應之疾病，例如癌症。在實施例中，難治性癌症在治療開始前或開始時可對治療具有抗性。在其他實施例中，難治性癌症可在治療期間變得具有抗性。難治性癌症亦稱為抗性癌症。
如本文中所用，「復發(Relapsed)」或「復發(relapse)」係指在一定時段改善或反應之後，例如在例如癌症療法之療法的先前治療之後，疾病(例如癌症)或諸如癌症之疾病的徵象及症狀之再現。舉例而言，該時段之反應可涉及癌細胞水準降至低於某一臨限值，例如低於20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1%。再現可涉及癌細胞水準上升至高於某一臨限值，例如高於20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1%。
在一個態樣中，療法之「有反應者」可為接受療法之後具有完全反應、極佳部分反應或部分反應的個體。在一個態樣中，療法之「無反應者」可為接受療法之後具有輕微反應、穩定疾病或進行性疾病的個體。在一些實施例中，個體具有多發性骨髓瘤且個體對多發性骨髓瘤療法之反應係基於IMWG 2016準則而判定，例如如特此以全文引用的方式併入本文中之Kumar等人, Lancet Oncol. 17, e328-346 (2016)所揭示。
範圍：在本發明通篇中，本發明之各種態樣可以範圍格式呈現。應理解，按範圍格式之描述僅為了方便及簡潔起見且不應解釋為對本發明之範疇的固定限制。因此，範圍之描述應視為已特定揭示所有可能的子範圍以及彼範圍內之個別數值。舉例而言，諸如1至6之範圍之描述應視為已特定揭示子範圍，諸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及彼範圍內之個別數值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3及6。作為另一實例，諸如95-99%一致性之範圍包括具有95%、96%、97%、98%或99%一致性之某範圍，且包括諸如96-99%、96-98%、96-97%、97-99%、97-98%及98-99%一致性之子範圍。不管範圍之寬度如何，此均適用。
「基因編輯系統」在該術語在本文中使用時係指導引且實現由該系統靶向之基因組DNA之位點處或該位點附近的一或多個核酸之變化(例如缺失)之系統(例如一或多個分子)。基因編輯系統在此項技術中已知，且在下文更充分地描述。
下文更詳細地描述本文組合物及方法之多個態樣。其他定義陳述於整個本說明書中。
詳細描述 本發明至少部分提供一種治療個體，例如患有癌症之個體之方法，其包含向該個體投與有效數量之表現CAR分子之細胞(例如細胞群體)，視情況與RNA分子(例如外源RNA分子)或編碼該RNA分子之核酸分子(例如外源核酸分子)的組合。
刺激RNA分子 在一個態樣中，本發明包括一種RNA分子(例如外源RNA分子)，例如刺激RNA分子，例如免疫刺激RNA分子。在一些實施例中，該RNA分子活化模式識別受體(PRR)，例如視黃酸誘導基因I (RIG-I)。在一些實施例中，該RNA分子活化樹突狀細胞(DC)、巨噬細胞及/或T細胞。
在一些實施例中，該RNA分子包含第一RNA序列(例如第一外源RNA序列)及第二RNA序列(例如第二外源RNA序列)。在一些實施例中，該第一RNA序列與該第二RNA序列至少80%、85%或90%互補。在一些實施例中，該第一RNA序列長度為至少20個核苷酸且該第二RNA序列長度為至少20個核苷酸。在一些實施例中，該RNA分子增加免疫活性。在一些實施例中，該RNA分子具有以下特性中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12者或全部)：
(i)該RNA分子活化模式識別受體(PRR)，例如視黃酸誘導基因I (RIG-I)；
(ii)該RNA分子活化樹突狀細胞(DC)，例如：如藉由量測DC中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測DC中CD80、CD86或鹼性白胺酸拉鏈轉錄因子ATF-樣3(Batf3)表現之增加，或：如藉由量測DC激活CD8+ T細胞之能力；
(iii)該RNA分子活化巨噬細胞，例如：如藉由量測巨噬細胞中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測巨噬細胞中CD80表現之增加；
(iv)該RNA分子活化T細胞，例如：如藉由量測T細胞中活化標記物表現之增加、T細胞擴增之增加、或T細胞所產生細胞介素之增加，例如：如藉由量測T細胞中CD69或PD-1表現之增加，或如藉由量測T細胞所產生之IFNγ或TNFα；
(v)該RNA分子增強免疫浸潤至腫瘤中，例如DC或T細胞浸潤至腫瘤中；
(vi)該RNA分子減少腫瘤生長；
(vii)該RNA分子提高該個體之存活；
(viii)該RNA分子增強該個體對該等CAR表現細胞或檢查點調節劑(例如抗PD-1抗體分子、抗PD-L1抗體分子、抗CTLA-4抗體分子、抗TIM-3抗體分子或抗LAG-3抗體分子)之反應性；
(ix)該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合；
(x)該RNA分子為天然存在之RN7SL1 RNA分子的功能變異體，其中該RNA分子保留該天然存在之RN7SL1 RNA分子的全部或部分免疫原性特性，視情況其中該RNA分子顯示比該天然存在之RN7SL1 RNA分子降低的與SRP9及/或SRP14之結合性，例如該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合；
(xi)該RNA分子不為聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)；
(xii)該RNA分子不具有RNAi或反義抑制活性或該RNA分子具有最小RNAi或反義抑制活性；或
(xiii)該RNA分子與天然存在之人類基因具有不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%序列一致性。
在一些實施例中，該第一RNA序列長度為至少25、30、35、40、45或50個核苷酸。在一些實施例中，該第二RNA序列長度為至少25、30、35、40、45或50個核苷酸。在一些實施例中，該第一RNA序列長度為至少25、30、35、40、45或50個核苷酸；且該第二RNA序列長度為至少25、30、35、40、45或50個核苷酸。
在一些實施例中，該第一RNA序列及該第二RNA序列形成雙股RNA分子。在一些實施例中，該第一RNA序列及該第二RNA序列形成長度為至少20、25、30、35、40、45或50個鹼基對之雙股RNA分子。
在一些實施例中，該第一RNA序列與該第二RNA序列100%互補。
在一些實施例中，該第一RNA序列及該第二RNA序列安置於一個RNA分子上。在一些實施例中，該第一RNA序列及該第二RNA序列形成髮夾結構。在一些實施例中，該第一RNA序列及該第二RNA序列形成莖-環結構。在一些實施例中，該莖長度為至少20、25、30、35、40、45或50個鹼基對。在一些實施例中，該環長度為2-10、3-8或4-6個核苷酸。
在一些實施例中，該第一RNA序列及該第二RNA序列安置於分別的RNA分子上。
在一些實施例中，該RNA分子包含一或多個Alu結構域。在一些實施例中，該Alu結構域包含SEQ ID NO: 4或6之胺基酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。在一些實施例中，該Alu結構域包含SEQ ID NO: 4或6之胺基酸序列。
在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 2、4、6、8、10之核苷酸序列或其功能變異體。在一些實施例中，該RNA分子包含選自SEQ ID NO: 2、4、6、8或10之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。在一些實施例中，該RNA分子包含選自SEQ ID NO: 2、4、6、8或10之核苷酸序列。在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 2之核苷酸序列。在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 4之核苷酸序列。在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 6之核苷酸序列。在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 8之核苷酸序列。在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。
在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 1、3、5、7、9之核苷酸序列或其功能變異體。在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 1、3、5、7或9之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。
在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 1、3、5、7或9之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 1之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 3之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 5之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 7之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼該RNA分子之該核酸分子包含SEQ ID NO: 9之核苷酸序列。
在一些實施例中，該RNA分子為RN7SL1 RNA分子，例如人類RN7SL1 RNA分子，或其功能變異體。在一些實施例中，該RNA分子為RN7SL1 RNA分子，例如人類RN7SL1 RNA分子。在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 2之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。在一些實施例中，該RNA分子包含Alu結構域或其功能變異體。在一些實施例中，該RNA分子包括包含SEQ ID NO: 4或6之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)的Alu結構域。在一些實施例中，該RNA分子為Alu-Ya5 RNA分子或其功能變異體。在一些實施例中，該RNA分子為Alu-Ya5 RNA分子。在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 8之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。在一些實施例中，該RNA分子為保留RN7SL1 RNA分子或Alu-Ya5 RNA分子之免疫刺激活性但不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合的RNA分子(例如外源RNA分子)。在一些實施例中，該RNA分子與SRP9及/或SRP14之結合不超過RN7SL1 RNA分子(例如包含SEQ ID NO: 2之核苷酸序列之RNA分子(例如外源RNA分子))與SRP9及/或SRP14之結合的5、10、15、20、25、30或35%。在一些實施例中，該RNA分子包含SEQ ID NO: 10之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。RNA分子及編碼該等RNA分子之DNA分子的例示性序列揭示於表1中。
表 1. 刺激RNA及其他之例示性序列
對RNA之化學修飾
本文所描述之RNA可經化學修飾以增強穩定性或其他有益特徵。修飾包括例如(a)末端修飾，例如5'端修飾(磷酸化、結合、反向鍵聯等)或3'端修飾(結合、DNA核苷酸、反向鍵聯等)，(b)鹼基修飾，例如用穩定鹼基、去穩定鹼基或與搭配物之擴展庫鹼基配對之鹼基置換，移除鹼基(無鹼基核苷酸)或結合鹼基，(c)糖修飾(例如在2'位置或4'位置處或具有非環糖)或糖置換，以及(d)主鏈修飾，包括磷酸二酯鍵之修飾或置換。
經修飾RNA主鏈包括例如硫代磷酸酯；對掌性硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；磷酸三酯；胺基烷基磷酸三酯；甲基及其他烷基膦酸酯，包括3'-伸烷基膦酸酯及對掌性膦酸酯；亞膦酸酯；胺基磷酸酯，包括3'-胺基胺基磷酸酯及胺基烷基胺基磷酸酯；硫羰基胺基磷酸酯；硫羰基烷基膦酸酯；硫羰基烷基磷酸三酯；及具有正常3'-5'鍵之硼烷磷酸酯，此等之2'-5'鍵聯之類似物，及具有反轉極性者，其中相鄰核苷單元對係3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'鍵聯。亦包括多種鹽、混合鹽及游離酸形式。不包括磷原子之經修飾RNA主鏈具有由短鏈烷基或環烷基核苷間鍵、混合雜原子及烷基或環烷基核苷間鍵，或一或多個短鏈雜原子或雜環核苷間鍵形成之主鏈。此等主鏈包括具有(N-嗎啉基)鍵(部分由核苷之糖部分形成)；矽氧烷主鏈；硫醚、亞碸及碸主鏈；甲醯基及硫代甲醯基主鏈；亞甲基甲醯基及硫代甲醯基主鏈；含有烯烴之主鏈；胺基磺酸酯主鏈；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基主鏈；磺酸酯及磺醯胺主鏈；醯胺主鏈；及具有混合N、O、S及CH2 組成部分之其他主鏈。
經修飾RNA亦可含有一或多個經取代糖部分。RNA可在2'位置處包括以下之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基及炔基可為經取代或未經取代之C1 至C10 烷基或C2 至C10 烯基及炔基。例示性適合修飾包括O[(CH2 )n O]m CH3 、O(CH2 ).n OCH3 、O(CH2 )n NH2 、O(CH2 )n CH3 、O(CH2 )n ONH2 及O(CH2 )n ON[(CH2 )n CH3 )]2 ，其中n及m為1至約10。在其他實施例中，RNA在2'位置處包括以下之一：C1 至C10 低碳烷基、經取代之低碳烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3 、OCN、Cl、Br、CN、CF3 、OCF3 、SOCH3 、SO2 CH3 、ONO2 、NO2 、N3 、NH2 、雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷胺基、聚烷胺基、經取代之矽烷基、RNA裂解基團、報導基團、嵌入劑及具有類似特性之其他取代基。在一些實施例中，修飾包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O--CH2 CH2 OCH3 ，亦稱為2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)，亦即烷氧基-烷氧基。另一例示性修飾為2'-二甲基胺基氧基乙氧基，亦即O(CH2 )2 ON(CH3 )2 基團，亦稱為2'-DMAOE，及2'-二甲基胺基乙氧基乙氧基(亦稱為2'-O-二甲基胺基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，亦即2'-O--CH2 --O--CH2 --N(CH2 )2 。在一些實施例中，RNA包含一或多個非環狀核苷酸(或核苷)。RNA可包括一或多個鎖核酸(LNA)，例如具有經修飾核糖部分之核苷酸，其中核糖部分包含額外橋連接，例如2'及4'碳。
RNA亦可包括核鹼基修飾或取代。未經修飾或天然核鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)，及嘧啶鹼基胸嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。經修飾之核鹼基包括其他合成及天然核鹼基，諸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤及鳥嘌呤之6-甲基及其他烷基衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物、2-硫基尿嘧啶、2-硫基胸嘧啶及2-硫基胞嘧啶、5-鹵基尿嘧啶及胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶及胞嘧啶、6-氮雜尿嘧啶、胞嘧啶及胸嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶；經8-鹵基、8-胺基、8-硫醇、8-硫基烷基、8-羥基腺嘌呤及鳥嘌呤以及8位經取代之其他腺嘌呤及鳥嘌呤；5-鹵基(特定言之，5-溴)、5-三氟甲基尿嘧啶及胞嘧啶以及5位經取代之其他尿嘧啶及胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤、7-去氮雜鳥嘌呤及7-去氮雜腺嘌呤及3-去氮雜鳥嘌呤及3-去氮雜腺嘌呤。在一些實施例中，RNA包括一或多個G形夾核苷酸(經修飾之胞嘧啶類似物，其中修飾賦予氫鍵結雙螺旋體內互補鳥嘌呤之華特生-克里克(Watson - Crick)及胡斯坦(Hoogsteen)面之能力)。
RNA分子端之穩定修飾可包括N-(乙醯基胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6)、N-(乙醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-NHAc)、胸苷-2'-O-去氧胸苷(醚)、N-(胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-胺基)、2-二十二烷醯基-尿苷-3"-磷酸酯、反向鹼基dT (idT)及其他修飾。
其他化學修飾揭示於例如WO2015/051318中(例如其中之第75-83頁)，該申請案以全文引用之方式併入本文中。
例如用於靶向之RNA結合物
本文所描述之RNA可與官能性部分結合，例如以改變穩定性或生物分佈。在一些實施例中，RNA與靶向癌細胞或腫瘤微環境之部分結合。舉例而言，RNA可與結合癌細胞之靶向部分結合，例如藉由結合癌細胞及/或出現癌症之組織類型所特有之表面蛋白。在實施例中，靶向部分結合CAR結合之相同抗原，例如CD19、BCMA、EGFRvIII或間皮素。靶向部分可為例如抗體分子，諸如單鏈抗體分子。
在一些實施例中，RNA化學連接於一或多個配體、部分或結合物，此可例如藉由增強RNA之活性、分佈或半衰期賦予功能性。該等部分包括脂質部分，諸如膽固醇部分，膽酸，硫醚，例如綠柱石-S-三苯甲基硫醇，硫代膽固醇，脂族鏈，例如十二烷二醇或十一烷基殘基，磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-膦酸三乙基-銨，多元胺或聚乙二醇鏈，或金剛烷乙酸，軟脂基部分，或十八烷基胺或己基胺基-羰氧基膽固醇部分。
配體亦可包括靶向基團，例如細胞或組織靶向劑，例如凝集素、糖蛋白、脂質或蛋白質，例如抗體分子，其結合至指定細胞類型，諸如癌細胞或腫瘤微環境中之細胞。靶向基團可為促甲狀腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、界面活性劑蛋白A、黏蛋白碳水化合物、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-半乳糖胺多價甘露糖、多價海藻糖、糖基化聚胺基酸、多價半乳糖、運鐵蛋白、雙膦酸鹽、聚麩胺酸鹽、聚天冬胺酸鹽、脂質、膽固醇、類固醇、膽酸、葉酸、維生素B12、生物素或RGD肽或RGD肽模擬物。在一些實施例中，配體包含碳水化合物，例如GalNAc配體包含一或多個N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)或其衍生物。
其他結合物揭示於例如WO2015/051318中(例如其中之第91-107頁)，該申請案以全文引用之方式併入本文中。
在實施例中，結合物經由連接子連接至RNA。例示性連接子揭示於例如WO2015/051318中(例如其中之第107-116頁)，該申請案以全文引用之方式併入本文中。
RNA遞送及調配物
RNA向個體之遞送可例如藉由向個體投與包含該RNA之組合物直接實現，或藉由投與編碼該RNA之載體(例如投與包含該載體之細胞)間接實現。
在一些實施例中，本文揭示之RNA分子(例如外源RNA分子)，例如刺激RNA分子，例如免疫刺激RNA分子藉由向個體投與包含編碼該RNA分子之載體的細胞間接遞送。在一些實施例中，RNA分子之表現為可調節的。在一些實施例中，RNA分子之表現由非天然存在於個體中之啟動子(例如Gal4啟動子)介導，且啟動子之活化由合成Notch (synNotch)肽調節。先前已揭示例示性synNotch介導之表現系統。參見例如Roybal等人, Cell. 2016年2月11日;164(4):770-9及WO2017/193059，其以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，synNotch肽包含(i)識別靶配體(例如腫瘤抗原)之胞外識別結構域(例如scFv結構域)，(ii)包含配體誘導性蛋白水解裂解位點之跨膜結構域，及(iii)包含轉錄因子之胞內結構域(例如Gal4 DNA結合結構域)。synNotch肽與靶配體之結合導致synNotch肽之跨膜結構域之裂解及轉錄因子之釋出，該轉錄因子繼而可進入細胞核且驅動RNA分子之表現。
在一些實施例中，RNA分子藉由包含編碼CAR分子之第一核酸序列、編碼synNotch肽之第二核酸序列及編碼RNA分子之第三核酸序列的CAR T細胞遞送。RNA分子之表現由如上文所描述之synNotch肽調節。
在一些實施例中，RNA分子藉由包含編碼CAR分子之第一核酸序列及編碼RNA分子之第二核酸序列的CAR T細胞遞送。在一些實施例中，第一及第二核酸序列安置於一個核酸分子上。在一些實施例中，第一及第二核酸序列安置於分別的核酸分子上。
在一些實施例中，RNA可使用奈米粒子、樹枝狀聚合物、聚合物、脂質體或陽離子遞送系統直接遞送。陽離子脂質、樹枝狀聚合物或聚合物可結合至RNA或經誘導以形成包覆RNA之囊泡或微胞。適用於全身遞送RNA之藥物遞送系統之一些非限制性實例包括DOTAP、Oligofectamine、固體核酸脂質粒子、心磷脂、聚伸乙基亞胺、Arg-Gly-Asp (RGD)肽及聚醯胺基胺。在一些實施例中，RNA與環糊精形成用於全身投與之複合物。
在一些實施例中，RNA可以脂質體調配物形式遞送。脂質體分為兩大類。陽離子脂質體為帶正電脂質體，其與帶負電核酸分子相互作用形成穩定複合物。對pH敏感或帶負電之脂質體捕獲核酸而非與其複合。一種主要類型之脂質體組合物包括磷脂而非天然衍生之磷脂醯膽鹼。中性脂質體組合物例如可由二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)或二軟脂醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)形成。陰離子脂質體組合物通常由二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油或二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)形成。另一類型之脂質體組合物由磷脂醯膽鹼(PC)(諸如大豆PC及蛋PC)形成。另一類型由磷脂及/或磷脂醯膽鹼及/或膽固醇之混合物形成。脂質體亦可包含經一或多個親水性聚合物(諸如PEG部分)衍生之脂質。舉例而言，脂質體可包含PEG衍生之磷脂，例如DSPE-PEG。脂質體亦可包含界面活性劑，例如天然或合成界面活性劑。界面活性劑可為例如非離子、陰離子、陽離子或兩性的。
在一些實施例中，RNA完全囊封於脂質調配物中，例如以形成SPLP、pSPLP、SNALP或其他核酸-脂質粒子。在一些實施例中，RNA在脂質奈米粒子(LNP)中調配。包含SNALP (l,2-二次亞麻油基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA))之調配物描述於2009年4月15日申請之國際公開案第WO2009/127060號中，其以引用的方式併入本文中。包含XTC之調配物描述於例如2010年1月29日申請之國際申請案第PCT/US2010/022614號中，其以引用的方式併入本文中。包含MC3之調配物描述於例如2010年6月10日申請之國際申請案第PCT/US10/28224號中，其以引用的方式併入本文中。包含C12-200之調配物描述於2010年5月5日申請之國際申請案第PCT/US10/33777號中，其以引用之方式併入本文中。
RNA可全身或局部投與，例如藉由注射至腫瘤或腫瘤微環境中。
在一些實施例中，本文所描述之RNA可經由投與能夠引導RNA表現之載體(例如細胞內之載體)間接遞送。表現可為短暫或持續的，視所用特定構築體及靶組織或細胞類型而定。轉殖基因可作為線性構築體、圓形質體或病毒載體形式引入，其可為整合或非整合載體。轉殖基因亦可經構築以允許其以染色體外質體形式遺傳。
在一些實施例中，RNA可自與CAR相同之核酸表現，例如其中RNA及CAR共享單一啟動子或使用兩個不同啟動子。在一些實施例中，RNA及CAR自不同核酸表現，例如其中兩個核酸在相同細胞或不同細胞中。
在一些實施例中，該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子及該CAR表現細胞係同時投與。在一些實施例中，該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子及該CAR表現細胞係依序投與，例如該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子係在投與該CAR表現細胞之前或之後投與。
其他RNA調配物及遞送方法描述於例如WO2015/051318中(例如其中之第116-137頁)，該申請案以全文引用之方式併入本文中。
嵌合抗原受體(CAR) 在一個態樣中，本文揭示使用表現CAR分子之細胞(例如細胞群體)的方法。在一個態樣中，例示性CAR構築體包含視情況存在之前導序列(例如本文所述之前導序列)、抗原結合結構域(例如本文所述之抗原結合結構域)、鉸鏈(例如本文所述之鉸鏈區)、跨膜結構域(例如本文所述之跨膜結構域)及胞內刺激結構域(例如本文所述之胞內刺激結構域)。在一個態樣中，例示性CAR構築體包含視情況存在之前導序列(例如本文所述之前導序列)、胞外抗原結合結構域(例如本文所述之抗原結合結構域)、鉸鏈(例如本文所述之鉸鏈區)、跨膜結構域(例如本文所述之跨膜結構域)、胞內共刺激信號傳導結構域(例如本文所述之共刺激信號傳導結構域)及/或胞內初級信號傳導結構域(例如本文所述之初級信號傳導結構域)。
可為本文所述CAR分子之一部分的各種組分之非限制性實例之序列列於表 2 中，其中「aa」表示胺基酸，且「na」表示編碼相應肽之核酸。
表 2. CAR之各種組分之序列(aa-胺基酸序列，na-核酸序列).
CAR 抗原結合結構域
在一個態樣中，包含抗原結合結構域之CAR之部分包含靶向腫瘤抗原(例如本文所描述之腫瘤抗原)之抗原結合結構域。在一些實施例中，抗原結合結構域結合至：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1；C型凝集素樣分子-1，CD33；表皮生長因子受體變異體III (EGFRvIII)；神經節苷脂G2 (GD2)；神經節苷脂GD3；TNF受體家族成員；B細胞成熟抗原(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特異性膜抗原(PSMA)；受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1 (ROR1)；Fms樣酪胺酸激酶3 (FLT3)；腫瘤相關糖蛋白72 (TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮細胞黏附分子(EPCAM)；B7H3 (CD276)；KIT (CD117)；介白素-13受體次單元α-2；間皮素；介白素11受體α (IL-11Ra)；前列腺幹細胞抗原(PSCA)；蛋白酶絲胺酸21；血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)；路易(Y)抗原；CD24；血小板衍生生長因子受體β (PDGFR-β)；階段特異性胚抗原-4 (SSEA-4)；CD20；葉酸受體α；受體酪胺酸-蛋白激酶ERBB2 (Her2/neu)；黏蛋白1，細胞表面相關(MUC1)；表皮生長因子受體(EGFR)；神經細胞黏附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸磷酸酶(PAP)；伸長因子2突變(ELF2M)；Ephrin B2；纖維母細胞活化蛋白α (FAP)；胰島素樣生長因子1受體(IGF-I受體)，碳酸酐酶IX (CAIX)；蛋白酶體(Prosome，Macropain)次單元，β型，9 (LMP2)；糖蛋白100 (gp100)；由斷點簇區(BCR)及Abelson鼠類白血病病毒性致癌基因同源物1 (Abl)組成之致癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪胺酸酶；ephrin A型受體2 (EphA2)；海藻糖基GM1；唾液酸基路易(Lewis)黏附分子(sLe)；神經節苷脂GM3；轉麩醯胺酸酶5 (TGS5)；高分子量黑素瘤相關抗原(HMWMAA)；o-乙醯基-GD2神經節苷脂(OAcGD2)；葉酸受體β；腫瘤內皮標記物1 (TEM1/CD248)；腫瘤內皮標記物7相關(TEM7R)；緊密連接蛋白6 (CLDN6)；促甲狀腺激素受體(TSHR)；G蛋白偶合受體C類第5組，成員D (GPRC5D)；染色體X開放閱讀框架61 (CXORF61)；CD97；CD179a；退行性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盤特異性1 (PLAC1)；globoH糖基神經醯胺之六醣部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2 (UPK2)；A型肝炎病毒細胞受體1 (HAVCR1)；腎上腺素受體β 3 (ADRB3)；泛連接蛋白3 (PANX3)；G蛋白偶合受體20 (GPR20)；淋巴細胞抗原6複合物，基因座K 9 (LY6K)；嗅覺受體51E2 (OR51E2)；TCR γ交替閱讀框架蛋白(TARP)；威爾姆斯腫瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1 (NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2 (LAGE-1a)；黑素瘤相關抗原1 (MAGE-A1)；ETS易位變異基因6，位於染色體12p上(ETV6-AML)；精子蛋白17 (SPA17)；X抗原家族，成員1A (XAGE1)；血管生成素結合細胞表面受體2 (Tie 2)；黑素瘤癌症睾丸抗原-1 (MAD-CT-1)；黑素瘤癌症睾丸抗原-2 (MAD-CT-2)；Fos相關抗原1；腫瘤蛋白p53 (p53)；p53突變體；前列腺蛋白；存活素；端粒酶；前列腺癌腫瘤抗原-1，由T細胞識別之黑素瘤抗原1；大鼠肉瘤(Ras)突變體；人類端粒酶反轉錄酶(hTERT)；肉瘤易位斷點；細胞凋亡之黑素瘤抑制劑(ML-IAP)；ERG (跨膜蛋白酶，絲胺酸2 (TMPRSS2) ETS融合基因)；N-乙醯基葡糖胺基-轉移酶V (NA17)；成對盒蛋白Pax-3 (PAX3)；雄激素受體；細胞週期素B1；v-myc禽類髓細胞瘤病病毒性致癌基因神經母細胞瘤衍生同源物(MYCN)；Ras同源物家族成員C (RhoC)；酪胺酸酶相關蛋白2 (TRP-2)；細胞色素P450 1B1 (CYP1B1)；CCCTC結合因子(鋅指蛋白)樣，由T細胞識別之鱗狀細胞癌抗原3 (SART3)；成對盒蛋白Pax-5 (PAX5)；前頂體素結合蛋白sp32 (OY-TES1)；淋巴細胞特異性蛋白酪胺酸激酶(LCK)；激酶錨定蛋白4 (AKAP-4)；滑膜肉瘤，X斷點2 (SSX2)；晚期糖基化最終產物之受體(RAGE-1)；腎遍在蛋白1 (RU1)；腎遍在蛋白2 (RU2)；豆莢蛋白；人類乳頭狀瘤病毒E6 (HPV E6)；人類乳頭狀瘤病毒E7 (HPV E7)；腸道羧基酯酶；突變之熱休克蛋白70-2 (mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白細胞相關免疫球蛋白樣受體1 (LAIR1)；IgA受體之Fc片段(FCAR或CD89)；白細胞免疫球蛋白樣受體亞家族A成員2 (LILRA2)；CD300分子樣家族成員f (CD300LF)；C型凝集素結構域家族12成員A (CLEC12A)；骨髓基質細胞抗原2 (BST2)；含EGF樣模組之黏蛋白樣激素受體樣2 (EMR2)；淋巴細胞抗原75 (LY75)；磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3 (GPC3)；Fc受體樣5 (FCRL5)；或免疫球蛋白λ樣多肽1 (IGLL1)。
抗原結合結構域可為結合至抗原之任何結構域，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、重組抗體、人類抗體、人類化抗體及其功能片段，包括(但不限於)單結構域抗體，諸如重鏈可變結構域(VH)、輕鏈可變結構域(VL)及駱駝源奈米抗體之可變結構域(VHH)，及此項技術中已知充當抗原結合結構域之替代性骨架，諸如重組纖維結合蛋白結構域、T細胞受體(TCR)或其片段(例如單鏈TCR)及其類似物。在一些情況下，抗原結合結構域來源於將最終使用CAR之相同物種為有益的。舉例而言，為用於人類，CAR之抗原結合結構域宜包含抗體或抗體片段之抗原結合結構域的人類或人類化殘基。
CAR跨膜結構域 在各種實施例中，關於跨膜結構域，CAR可經設計以包含連接至CAR之胞外結構域之跨膜結構域。跨膜結構域可包括與跨膜區相鄰之一或多個其他胺基酸，例如與跨膜區所源自之蛋白質之胞外區相關聯的一或多個胺基酸(例如胞外區之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10直至15個胺基酸)及/或與跨膜蛋白所源自之蛋白質之胞內區相關聯的一或多個其他胺基酸(例如胞內區之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10直至15個胺基酸)。在一個態樣中，跨膜結構域為與CAR之其他結構域中之一者相關聯的跨膜結構域。在一些情況下，跨膜結構域可經選擇或經胺基酸取代修飾以避免該等結構域結合至相同或不同表面膜蛋白之跨膜結構域，例如以使與受體複合物之其他成員的相互作用降至最低。在一個態樣中，跨膜結構域能夠與CAR表現細胞之細胞表面上的另一CAR均二聚。在不同態樣中，跨膜結構域之胺基酸序列可經修飾或經取代以使與相同CART中存在之天然結合搭配物之結合結構域的相互作用降至最低。
跨膜結構域可來源於天然或重組來源。在來源為天然時，該結構域可來源於任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。在一個態樣中，每當CAR已結合至標靶時，跨膜結構域能夠向胞內結構域傳導信號。特別適用於本發明中之跨膜結構域可包括至少以下之跨膜區：例如T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD27、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。在一些實施例中，跨膜結構域可包括至少以下之跨膜區：例如KIR2DS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1 (CD11a，CD18)、ICOS (CD278)、4-1BB (CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、SLAMF6 (NTB-A，Ly108)、SLAM (SLAMF1，CD150，IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C。
在一些情況下，跨膜結構域可經由鉸鏈(例如來自人類蛋白質之鉸鏈)連接至CAR之胞外區，例如CAR之抗原結合結構域。舉例而言，在一個實施例中，鉸鏈可為人類Ig (免疫球蛋白)鉸鏈，例如IgG4鉸鏈，或CD8a鉸鏈。在一個實施例中，鉸鏈或間隔子包含SEQ ID NO: 627之胺基酸序列(例如由其組成)。在一個態樣中，跨膜結構域包含SEQ ID NO: 635之跨膜結構域(例如由其組成)。
在一個態樣中，鉸鏈或間隔子包含IgG4鉸鏈。舉例而言，在一個實施例中，鉸鏈或間隔子包含SEQ ID NO: 629之胺基酸序列之鉸鏈。在一些實施例中，鉸鏈或間隔子包含由SEQ ID NO: 630之核苷酸序列編碼的鉸鏈。
在一個態樣中，鉸鏈或間隔子包含IgD鉸鏈。舉例而言，在一個實施例中，鉸鏈或間隔子包含SEQ ID NO: 631之胺基酸序列之鉸鏈。在一些實施例中，鉸鏈或間隔子包含由SEQ ID NO: 632之核苷酸序列編碼的鉸鏈。
在一個態樣中，跨膜結構域可為重組跨膜結構域，在此情況下，其將主要包含疏水性殘基，諸如白胺酸及纈胺酸。在一個態樣中，重組跨膜結構域之各端可發現苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸之三聯體。
視情況，長度在2與10個胺基酸之間的短寡肽或多肽連接子可在CAR之跨膜結構域與細胞質區之間形成連接。甘胺酸-絲胺酸二聯體提供尤其適合之連接子。舉例而言，在一個態樣中，連接子包含SEQ ID NO: 633之胺基酸序列。在一些實施例中，連接子由SEQ ID NO: 634之核苷酸序列編碼。
在一個態樣中，鉸鏈或間隔子包含KIR2DS2鉸鏈。
細胞質結構域 CAR之細胞質結構域或區包括胞內信號傳導結構域。胞內信號傳導結構域一般負責已引入CAR之免疫細胞之正常效應功能中的至少一者之活化。
用於本文所描述之CAR的胞內信號傳導結構域之實例包括共同作用以在抗原受體接合後起始信號轉導的T細胞受體(TCR)及輔受體之細胞質序列，以及此等序列及具有相同功能性能力之任何重組序列的任何衍生物或變異體。
已知單獨TCR產生之信號不足以完全活化T細胞且亦需要二級及/或共刺激信號。因此，T細胞活化據說由兩類獨特細胞質信號傳導序列介導：經由TCR起始抗原依賴性初級活化之彼等(初級胞內信號傳導結構域)；及以抗原非依賴性方式起作用以提供二級或共刺激信號之彼等(二級細胞質結構域，例如共刺激結構域)。
初級信號傳導結構域以刺激方式或抑制方式調節TCR複合物之初級活化。以刺激方式起作用之初級胞內信號傳導結構域可含有已知為基於免疫受體酪胺酸之活化基元或ITAM的信號傳導基元。
含有特定用於本發明之初級胞內信號傳導結構域的ITAM之實例包括TCR ζ、FcR γ、FcR β、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278 (亦稱為「ICOS」)、FcεRI、DAP10、DAP12及CD66d之ITAM。在一個實施例中，本發明之CAR包含胞內信號傳導結構域，例如CD3-ζ之初級信號傳導結構域，例如本文所描述之CD3-ζ序列。
在一個實施例中，初級信號傳導結構域包含經修飾之ITAM結構域，例如相較於天然ITAM結構域具有改變(例如增加或降低)之活性的突變ITAM結構域。在一個實施例中，初級信號傳導結構域包含含有經修飾ITAM之初級胞內信號傳導結構域，例如含有最佳化及/或截短ITAM之初級胞內信號傳導結構域。在一實施例中，初級信號傳導結構域包含一、二、三、四個或更多個ITAM基元。
共刺激信號傳導結構域 CAR之胞內信號傳導結構域本身可包含CD3-ζ信號傳導結構域或其可與適用於本發明之CAR之情形下的任何其他所需胞內信號傳導結構域組合。舉例而言，CAR之胞內信號傳導結構域可包含CD3 ζ鏈部分及共刺激信號傳導結構域。共刺激信號傳導結構域係指包含共刺激分子之胞內結構域的CAR之一部分。在一個實施例中，胞內結構域經設計以包含CD3-ζ之信號傳導結構域及CD28之信號傳導結構域。在一個態樣中，胞內結構域經設計以包含CD3-ζ之信號傳導結構域及ICOS之信號傳導結構域。
共刺激分子可為除淋巴細胞對抗原有效反應所需之抗原受體或其配體以外的細胞表面分子。此類分子之實例包括CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及與CD83特異性結合之配體及其類似者。舉例而言，CD27共刺激已展現可活體外增強人類CART細胞之擴增、效應功能及存活且活體內加強人類T細胞續存及抗腫瘤活性(Song等人. Blood. 2012; 119(3):696-706)。此類共刺激分子之其他實例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、NKG2D、NKG2C及PAG/Cbp。
CAR之細胞質部分內之胞內信號傳導序列可以隨機或指定次序彼此連接。視情況，長度例如在2與10個胺基酸之間(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸)的短寡肽或多肽連接子可在胞內信號傳導序列之間形成連接。在一個實施例中，甘胺酸-絲胺酸二聯體可用作適合連接子。在一個實施例中，單一胺基酸，例如丙胺酸、甘胺酸可用作適合連接子。
在一個態樣中，胞內信號傳導結構域經設計以包含兩個或更多個(例如2、3、4、5個或更多個)共刺激信號傳導結構域。在一實施例中，兩個或更多個(例如2、3、4、5個或更多個)共刺激信號傳導結構域藉由連接分子(例如本文所描述之連接分子)分離。在一個實施例中，胞內信號傳導結構域包含兩個共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，連接分子為甘胺酸殘基。在一些實施例中，連接子為丙胺酸殘基。
在一個態樣中，胞內信號傳導結構域經設計以包含CD3-ζ之信號傳導結構域及CD28之信號傳導結構域。在一個態樣中，胞內信號傳導結構域經設計以包含CD3-ζ之信號傳導結構域及4-1BB之信號傳導結構域。在一個態樣中，4-1BB之信號傳導結構域為SEQ ID NO: 637之信號傳導結構域。在一個態樣中，CD3-ζ之信號傳導結構域為SEQ ID NO: 641之信號傳導結構域。
在一個態樣中，胞內信號傳導結構域經設計以包含CD3-ζ之信號傳導結構域及CD27之信號傳導結構域。在一個態樣中，CD27之信號傳導結構域包含SEQ ID NO: 639之胺基酸序列。在一個態樣中，CD27之信號傳導結構域由SEQ ID NO: 640之核酸序列編碼。
在一個態樣中，本文所描述之CAR表現細胞可進一步包含第二CAR，例如包括不同抗原結合結構域之第二CAR，例如針對相同標靶或不同標靶(例如除本文所描述之癌症相關抗原或本文所描述之不同癌症相關抗原以外之標靶，例如CD19、CD33、CLL-1、CD34、FLT3或葉酸受體β)。在一個實施例中，第二CAR包括與癌症相關抗原表現相同癌細胞類型之標靶之抗原結合結構域。在一個實施例中，CAR表現細胞包含靶向第一抗原且包括具有共刺激信號傳導結構域而非初級信號傳導結構域之胞內信號傳導結構域的第一CAR，及靶向第二不同抗原且包括具有初級信號傳導結構域而非共刺激信號傳導結構域之胞內信號傳導結構域的第二CAR。雖然不希望受理論束縛，但將共刺激信號傳導結構域(例如4-1BB、CD28、ICOS、CD27或OX-40)置於第一CAR上且將初級信號傳導結構域(例如CD3 ζ)置於第二CAR上可將CAR活性限制於表現兩種標靶之細胞。在一個實施例中，CAR表現細胞包含：第一癌症相關抗原CAR，其包括結合本文所描述之靶抗原之抗原結合結構域、跨膜結構域及共刺激結構域；及第二CAR，其靶向不同靶抗原(例如在與第一靶抗原相同的癌細胞類型上表現之抗原)且包括抗原結合結構域、跨膜結構域及初級信號傳導結構域。在另一實施例中，CAR表現細胞包含：第一CAR，其包括結合本文所描述之靶抗原之抗原結合結構域、跨膜結構域及初級信號傳導結構域；及第二CAR，其靶向除第一靶抗原以外之抗原(例如在與第一靶抗原相同的癌細胞類型上表現之抗原)且包括抗原之抗原結合結構域、跨膜結構域及共刺激信號傳導結構域。
在另一態樣中，本發明提供CAR表現細胞(例如，CART細胞)群體。在一些實施例中，CAR表現細胞群體包含表現不同CAR之細胞的混合物。舉例而言，在一個實施例中，CART細胞群體可包括：第一細胞，其表現具有本文所描述之癌症相關抗原之抗原結合結構域的CAR；及第二細胞，其表現具有不同抗原結合結構域(例如本文所描述之不同癌症相關抗原之抗原結合結構域，例如與由第一細胞所表現的CAR之抗原結合結構域結合之癌症相關抗原不同的本文所描述之癌症相關抗原之抗原結合結構域)的CAR。作為另一實例，CAR表現細胞群體可包括：第一細胞，其表現包括本文所描述之癌症相關抗原之抗原結合域的CAR；及第二細胞，其表現包括除如本文所描述之癌症相關抗原以外的標靶之抗原結合域的CAR。在一個實施例中，CAR表現細胞群體包括例如：第一細胞，其表現包括初級胞內信號傳導結構域之CAR；及第二細胞，其表現包括二級信號傳導結構域之CAR。
在另一態樣中，本發明提供一種細胞群體，其中群體中之至少一種細胞表現具有本文所描述之癌症相關抗原之抗原結合結構域的CAR，且第二細胞表現另一試劑，例如增強CAR表現細胞活性之試劑。舉例而言，在一個實施例中，試劑可為抑制抑制性分子之試劑。在一些實施例中，抑制性分子(例如PD-1)可降低CAR表現細胞建立免疫效應反應之能力。抑制性分子之實例包括PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM (CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3 (CD276)、B7-H4 (VTCN1)、HVEM (TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGF (例如TGFβ)。在一個實施例中，抑制抑制性分子之試劑包含與向細胞提供正信號的第二多肽(例如本文所描述之胞內信號傳導結構域)相關聯之第一多肽，例如抑制性分子。在一個實施例中，該試劑包含：例如以下抑制性分子之第一多肽：諸如PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM (CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGF β或其中任一者之片段；及第二多肽，其為本文所描述之胞內信號傳導結構域，例如包含共刺激結構域(例如41BB、CD27、OX40或CD28，例如如本文所描述)及/或初級信號傳導結構域(例如本文所描述之CD3 ζ信號傳導結構域)。在一個實施例中，該試劑包含：PD-1或其片段之第一多肽；及本文所描述之胞內信號傳導結構域(例如本文所描述之CD28信號傳導結構域及/或本文所描述之CD3 ζ信號傳導結構域)之第二多肽。
CD19 CAR及CD19結合序列 在一些實施例中，本文所描述之CAR表現細胞為CD19 CAR表現細胞(例如表現結合至人類CD19之CAR的細胞)。
在一個實施例中，CD19 CAR之抗原結合結構域與描述於Nicholson等人 Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)中之FMC63 scFv片段具有相同或類似結合特異性。在一個實施例中，CD19 CAR之抗原結合結構域包括描述於Nicholson等人Mol . Immun . 34 (16-17): 1157-1165 (1997)中之scFv片段。
在一些實施例中，CD19 CAR包括根據以引用之方式併入本文中的WO2014/153270之表3的抗原結合結構域(例如人類化抗原結合結構域)。WO2014/153270亦描述分析各種CAR構築體之結合及功效之方法。
在一個態樣中，親本鼠類scFv序列為提供於PCT公開案WO2012/079000 (以引用之方式併入本文中)中之CAR19構築體。在一個實施例中，抗CD19結合結構域為描述於WO2012/079000中之scFv。
在一個實施例中，CAR分子包含如PCT公開案WO2012/079000中之SEQ ID NO: 12所提供之融合多肽序列，該公開案提供特異性結合至人類CD19的鼠類來源之scFv片段。
在一個實施例中，CD19 CAR包含如PCT公開案WO2012/079000中之SEQ ID NO: 12所提供之胺基酸序列。在實施例中，胺基酸序列為
(MALPVTALLLPLALLLHAARP)diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO: 847)，或與其實質上同源的序列。信號肽之視情況存在之序列以大寫字母及括號展示。
在一個實施例中，胺基酸序列為：
Diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO: 848)，或與其實質上同源的序列。
在一個實施例中，CD19 CAR具有USAN命名TISAGENLECLEUCEL-T。在實施例中，CTL019藉由T細胞之基因修飾製得，藉由在EF-1 α啟動子之控制下經由用含有CTL019轉殖基因之自身不活化、缺乏複製之慢病毒(LV)載體轉導之穩定插入介導。CTL019可為基於轉殖基因陽性T細胞%向個體遞送之轉殖基因陽性及陰性T細胞之混合物。
在其他實施例中，CD19 CAR包含根據以引用之方式併入本文中的WO2014/153270之表3之抗原結合結構域(例如人類化抗原結合結構域)。
鼠類CD19抗體之人類化為臨床配置所需，其中小鼠特異性殘基可在接受CART19治療，亦即藉由經CAR19構築體轉導之T細胞治療的患者中誘導人類抗小鼠抗原(HAMA)反應。人類化CD19 CAR序列之產生、表徵及功效描述於國際申請案WO2014/153270中，該文獻以全文引用之方式併入本文中，包括實例1-5 (第115-159頁)。
在一些實施例中，CD19 CAR構築體描述於以引用之方式併入本文中的PCT公開案WO 2012/079000中，且鼠類CD19 CAR及scFv構築體之胺基酸序列展示於下表3中，或與任一前述序列實質上一致(例如與本文所描述之任一序列至少85%、90%、95%或更高一致)的序列。
表3. CD19 CAR構築體
含有人類化抗CD19 scFv結構域之CD19 CAR構築體描述於以引用的方式併入本文中之PCT公開案WO 2014/153270中。
抗CD19 scFv結構域之鼠類及人類化CDR序列之重鏈可變結構域序列展示於表4中且輕鏈可變結構域序列展示於表5中。SEQ ID NO係指表3中所見之彼等。
表4. CD19抗體之重鏈可變結構域CDR (Kabat) SEQ ID NO 表5. CD19抗體之輕鏈可變結構域CDR (Kabat) SEQ ID NO
可根據本發明使用此項技術中之任何已知CD19 CAR，例如任何已知CD19 CAR之CD19抗原結合結構域。舉例而言，LG-740；CD19 CAR，其描述於美國專利第8,399,645號；美國專利第7,446,190號；Xu等人, Leuk Lymphoma. 2013 54(2):255-260 (2012)；Cruz等人, Blood 122(17):2965-2973 (2013)；Brentjens等人, Blood, 118(18):4817-4828 (2011)；Kochenderfer等人, Blood 116(20):4099-102 (2010)；Kochenderfer等人, Blood 122(25):4129-39 (2013)；及16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther (ASGCT) (5月15-18日, Salt Lake City) 2013, Abst 10中。
例示性CD19 CAR包括本文(例如本文所描述之一或多個表中)所描述之CD19 CAR，或以下參考文獻中描述的抗CD19 CAR：Xu等人 Blood 123.24(2014):3750-9；Kochenderfer等人 Blood 122.25(2013):4129-39；Cruz等人 Blood 122.17(2013):2965-73；NCT00586391；NCT01087294；NCT02456350；NCT00840853；NCT02659943；NCT02650999；NCT02640209；NCT01747486；NCT02546739；NCT02656147；NCT02772198；NCT00709033；NCT02081937；NCT00924326；NCT02735083；NCT02794246；NCT02746952；NCT01593696；NCT02134262；NCT01853631；NCT02443831；NCT02277522；NCT02348216；NCT02614066；NCT02030834；NCT02624258；NCT02625480；NCT02030847；NCT02644655；NCT02349698；NCT02813837；NCT02050347；NCT01683279；NCT02529813；NCT02537977；NCT02799550；NCT02672501；NCT02819583；NCT02028455；NCT01840566；NCT01318317；NCT01864889；NCT02706405；NCT01475058；NCT01430390；NCT02146924；NCT02051257；NCT02431988；NCT01815749；NCT02153580；NCT01865617；NCT02208362；NCT02685670；NCT02535364；NCT02631044；NCT02728882；NCT02735291；NCT01860937；NCT02822326；NCT02737085；NCT02465983；NCT02132624；NCT02782351；NCT01493453；NCT02652910；NCT02247609；NCT01029366；NCT01626495；NCT02721407；NCT01044069；NCT00422383；NCT01680991；NCT02794961；或NCT02456207中，其中之每一者以全文引用的方式併入本文中。
BCMA CAR及BCMA結合序列 在一些實施例中，本文所描述之CAR表現細胞為BCMA CAR表現細胞(例如表現結合至人類BCMA之CAR的細胞)。例示性BCMA CAR可包括WO2016/014565之表1或16中所揭示的序列，該文獻以引用之方式併入本文中。BCMA CAR構築體可包括視情況存在之前導序列；視情況存在之鉸鏈結構域，例如CD8鉸鏈結構域；跨膜結構域，例如CD8跨膜結構域；胞內結構域，例如4-1BB胞內結構域；及功能性信號傳導結構域，例如CD3 ζ結構域。在某些實施例中，結構域鄰接且處於同一閱讀框架中以形成單一融合蛋白。在其他實施例中，結構域在分別的多肽中，例如如本文所述之RCAR分子中。
例示性BCMA CAR分子或其片段之序列揭示於表6、7及8中。在某些實施例中，全長BCMA CAR分子包括一或多個CDR、VH、VL、scFv，或以下之全長序列：BCMA-1、BCMA-2、BCMA-3、BCMA-4、BCMA-5、BCMA-6、BCMA-7、BCMA-8、BCMA-9、BCMA-10、BCMA-11、BCMA-12、BCMA-13、BCMA-14、BCMA-15、149362、149363、149364、149365、149366、149367、149368、149369、BCMA_EBB-C1978-A4、BCMA_EBB-C1978-G1、BCMA_EBB-C1979-C1、BCMA_EBB-C1978-C7、BCMA_EBB-C1978-D10、BCMA_EBB-C1979-C12、BCMA_EBB-C1980-G4、BCMA_EBB-C1980-D2、BCMA_EBB-C1978-A10、BCMA_EBB-C1978-D4、BCMA_EBB-C1980-A2、BCMA_EBB-C1981-C3、BCMA_EBB-C1978-G4、A7D12.2、C11D5.3、C12A3.2或C13F12.1，如表6、7及8所揭示，或與其實質上(例如95-99%)一致的序列。
可用於抗BCMA CAR構築體中之其他例示性BCMA靶向序列揭示於WO 2017/021450、WO 2017/011804、WO 2017/025038、WO 2016/090327、WO 2016/130598、WO 2016/210293、WO 2016/090320、WO 2016/014789、WO 2016/094304、WO 2016/154055、WO 2015/166073、WO 2015/188119、WO 2015/158671、US 9,243,058、US 8,920,776、US 9,273,141、US 7,083,785、US 9,034,324、US 2007/0049735、US 2015/0284467、US 2015/0051266、US 2015/0344844、US 2016/0131655、US 2016/0297884、US 2016/0297885、US 2017/0051308、US 2017/0051252、US 2017/0051252、WO 2016/020332、WO 2016/087531、WO 2016/079177、WO 2015/172800、WO 2017/008169、US 9,340,621、US 2013/0273055、US 2016/0176973、US 2015/0368351、US 2017/0051068、US 2016/0368988及US 2015/0232557中，該等文獻以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，其他例示性BCMA CAR構築體係使用來自PCT公開案WO2012/0163805 (其內容以全文引用的方式併入本文中)之VH及VL序列產生。
表 6. 例示性抗BCMA scFv結構域及BCMA CAR分子之胺基酸及核酸序列。亦提供各scFv之胺基酸序列可變重鏈及可變輕鏈序列。
表 7. 根據Kabat編號方案之重鏈可變結構域CDR (Kabat等人 (1991), 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)
表 8. 根據Kabat編號方案之輕鏈可變結構域CDR (Kabat等人 (1991), 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)
CD20 CAR及CD20結合序列 在一些實施例中，本文所描述之CAR表現細胞為CD20 CAR表現細胞(例如表現結合至人類CD20之CAR的細胞)。在一些實施例中，CD20 CAR表現細胞包括根據以引用之方式併入本文中的WO2016/164731及PCT/US2017/055627之抗原結合結構域。例示性CD20結合序列或CD20 CAR序列揭示於例如PCT/US2017/055627之表1-5中。在一些實施例中，CD20結合序列或CD20 CAR包含PCT/US2017/055627或WO2016/164731中揭示的CD20 CAR之CDR、可變區、scFv或全長序列。
CD22 CAR及CD22結合序列 在一些實施例中，本文所描述之CAR表現細胞為CD22 CAR表現細胞(例如表現結合至人類CD22之CAR的細胞)。在一些實施例中，CD22 CAR表現細胞包括根據以引用之方式併入本文中的WO2016/164731及PCT/US2017/055627之抗原結合結構域。例示性CD22結合序列或CD22 CAR序列揭示於例如WO2016/164731之表6A、6B、7A、7B、7C、8A、8B、9A、9B、10A及10B以及PCT/US2017/055627之表6-10中。在一些實施例中，CD22結合序列或CD22 CAR序列包含PCT/US2017/055627或WO2016/164731中揭示的CD22 CAR之CDR、可變區、scFv或全長序列。
EGFR CAR及EGFR結合序列 在一些實施例中，本文所描述之CAR表現細胞為EGFR CAR表現細胞(例如表現結合至人類EGFR之CAR的細胞)。在一些實施例中，本文所描述之CAR表現細胞為EGFRvIII CAR表現細胞(例如表現結合至人類EGFRvIII之CAR的細胞)。例示性EGFRvIII CAR可包括以引用之方式併入本文中的WO2014/130657 (例如WO2014/130657之表2)中揭示之序列。
例示性EGFRvIII結合序列或EGFR CAR序列可包含表9中揭示的序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)之CDR、可變區、scFv或全長CAR序列。
表 9. 人類化EGFRvIII CAR構築體


間皮素CAR及間皮素結合序列 在一些實施例中，本文所描述之CAR表現細胞為間皮素CAR表現細胞(例如表現結合至人類間皮素之CAR的細胞)。例示性間皮素CAR可包括以引用之方式併入本文中的WO2015090230及WO2017112741 (例如WO2017112741之表2、3、4及5)中揭示之序列。
例示性間皮素結合序列或間皮素CAR序列可包含表10中揭示的序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)之CDR、可變區、scFv或全長CAR序列。
表 10. 結合至間皮素的人類scFv及CAR之胺基酸序列(粗體加下劃線為前導序列且灰框為連接子序列)。在scFv之情況下，剩餘胺基酸為重鏈可變區及輕鏈可變區，HC CDR (HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3)及LC CDR (LC CDR1、LC CDR2、LCCDR3)中之每一者均加下劃線。在CAR之情況下，其他剩餘胺基酸為CAR之剩餘胺基酸。
RNA轉染 本文揭示製備活體外轉錄RNA CAR之方法。本發明亦包括可直接轉染至細胞中之CAR編碼RNA構築體。一種產生用於轉染之mRNA的方法可包括用專門設計之引子活體外轉錄(IVT)模板，隨後添加聚A，產生含有3'及5'未轉譯序列(「UTR」)、5'帽及/或內部核糖體入口位點(IRES)、待表現核酸及長度通常為50-2000個鹼基之聚A尾的構築體(SEQ ID NO: 841)。所產生之RNA可有效轉染不同種類之細胞。在一個態樣中，模板包括CAR之序列。
在一個態樣中，CAR由信使RNA (mRNA)編碼。在一個態樣中，編碼CAR之mRNA引入至免疫效應細胞，例如T細胞或NK細胞中，以產生CAR表現細胞(例如CART細胞或CAR表現NK細胞)。
在一個實施例中，活體外轉錄之RNA CAR可以短暫轉染形式引入至細胞中。藉由使用聚合酶鏈反應(PCR)產生之模板活體外轉錄產生RNA。來自任何來源之相關DNA可藉由PCR使用適當引子及RNA聚合酶直接轉化成用於活體外mRNA合成之模板。DNA來源可為例如基因組DNA、質體DNA、噬菌體DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其他適當DNA來源。用於活體外轉錄之所需模板為本發明之CAR。舉例而言，用於RNA CAR之模板包含：胞外區，其包含抗腫瘤抗體之單鏈可變結構域；鉸鏈區，跨膜結構域(例如CD8a之跨膜結構域)；及細胞質區，其包括胞內信號傳導結構域，例如包含CD3-ζ之信號傳導結構域及4-1BB之信號傳導結構域。
在一個實施例中，待用於PCR之DNA含有開放閱讀框架。DNA可來自生物體基因組之天然存在之DNA序列。在一個實施例中，核酸可包括一些或全部5'及/或3'未轉譯區(UTR)。核酸可包括外顯子及內含子。在一個實施例中，待用於PCR之DNA為人類核酸序列。在另一實施例中，待用於PCR之DNA為包括5'及3' UTR之人類核酸序列。DNA或者可為通常不表現於天然存在之生物體中的人工DNA序列。例示性人工DNA序列為含有接合在一起形成編碼融合蛋白之開放閱讀框架的基因部分之序列。接合在一起之DNA部分可來自單個生物體或多於一種生物體。
使用PCR產生用於活體外轉錄用於轉染之mRNA之模板。此項技術中熟知進行PCR之方法。用於PCR之引子經設計以具有與待用作PCR模板之DNA區域實質上互補的區。如本文所用，「實質上互補」係指引子序列中之大部分或全部鹼基互補或一或多個鹼基不互補或錯配之核苷酸序列。實質上互補序列能夠與預期DNA標靶在用於PCR之黏接條件下黏接或雜交。引子可經設計以與DNA模板之任何部分實質上互補。舉例而言，引子可經設計以擴增通常在細胞中轉錄之核酸部分(開放閱讀框架)，包括5'及3' UTR。引子亦可經設計以擴增編碼相關特定結構域之核酸部分。在一個實施例中，引子經設計以擴增人類cDNA之編碼區，包括全部或部分5'及3' UTR。適用於PCR之引子可藉由此項技術中熟知之合成方法產生。「正向引子」為含有與DNA模板上在待擴增DNA序列之上游的核苷酸實質上互補之核苷酸區的引子。「上游」在本文中用於指待擴增之DNA序列相對於編碼股之位置5。「反向引子」為含有與在待擴增DNA序列之下游的雙股DNA模板實質上互補之核苷酸區的引子。「下游」在本文中用於指待擴增之DNA序列相對於編碼股之位置3'。
適用於PCR之任何DNA聚合酶可用於本文所揭示之方法中。試劑及聚合酶可商購自多個來源。
亦可使用能夠促進穩定性及/或轉譯效率之化學結構。RNA較佳具有5'及3' UTR。在一個實施例中，5' UTR之長度在1與3000個核苷酸之間。待添加至編碼區之5'及3' UTR序列之長度可藉由不同方法改變，包括(但不限於)設計黏接至UTR之不同區的PCR引子。使用此方法，一般熟習此項技術者可在經轉錄RNA轉染之後改變實現最佳轉譯效率所需的5'及3' UTR長度。
5'及3' UTR可為相關核酸之天然存在之內源性5'及3' UTR。或者，可藉由將UTR序列併入正向及反向引子中或藉由模板之任何其他修飾來添加相關核酸之非內源性UTR序列。相關核酸之非內源性UTR序列之用途可適用於改變RNA之穩定性及/或轉譯效率。舉例而言，已知3' UTR序列中之富AU元件可降低mRNA之穩定性。因此，可選擇及設計3' UTR以基於此項技術中熟知之UTR特性提高經轉錄之RNA的穩定性。
在一個實施例中，5' UTR可含有內源性核酸之Kozak序列。或者，當藉由如上文所描述之PCR添加相關核酸之非內源性5' UTR時，共同Kozak序列可藉由添加5' UTR序列重新設計。Kozak序列可提高一些RNA轉錄物之轉譯效率，但似乎並非為所有RNA實現有效轉譯所必需。此項技術中已知許多mRNA需要Kozak序列。在其他實施例中，5' UTR可為其RNA基因組在細胞中穩定的RNA病毒之5'UTR。在其他實施例中，多種核苷酸類似物可用於3'或5' UTR以阻礙mRNA之核酸外切酶降解。
為了能夠在不需要基因選殖之情況下自DNA模板合成RNA，轉錄啟動子應連接至待轉錄序列上游之DNA模板。當充當RNA聚合酶之啟動子的序列添加至正向引子之5'端時，RNA聚合酶啟動子併入待轉錄之開放閱讀框架上游的PCR產物中。在一個較佳實施例中，啟動子為如本文別處所述之T7聚合酶啟動子。其他適用啟動子包括(但不限於)T3及SP6 RNA聚合酶啟動子。此項技術中已知T7、T3及SP6啟動子的共同核苷酸序列。
在一較佳實施例中，mRNA在5'端上具有帽且具有3'聚(A)尾，此決定細胞中的mRNA之核糖體結合、轉譯起始及穩定性。在圓形DNA模板(例如，質體DNA)上，RNA聚合酶產生不適合於在真核細胞中表現之長多聯產物。在3' UTR之末端經線性化之質體DNA的轉錄產生正常大小之mRNA，其即使在轉錄後經聚腺苷酸化仍在真核轉染中無效。
在線性DNA模板上，噬菌體T7 RNA聚合酶可使轉錄物之3'端延伸越過模板的最後一個鹼基(Schenborn及Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985)；Nacheva及Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003))。
將聚A/T片段整合至DNA模板中之習知方法為分子選殖。然而，整合至質體DNA中之聚A/T序列可使質體不穩定，此為獲自細菌細胞之質體DNA模板通常高度混雜有缺失及其他畸變之原因。此使選殖程序不僅費力且費時，但通常不可靠。此為能夠用聚A/T 3'片段構築DNA模板而無需選殖的方法高度符合需要的原因。
可在PCR期間藉由使用含有聚T尾(諸如100T尾(SEQ ID NO: 842))之反向引子(大小可為50-5000 T (SEQ ID NO: 843))或在PCR之後藉由包括(但不限於)DNA連接或活體外重組之任何其他方法產生轉錄DNA模板之聚A/T區段。聚(A)尾亦向RNA提供穩定性且減少其降解。一般而言，聚(A)尾之長度與經轉錄之RNA的穩定性正相關。在一個實施例中，聚(A)尾在100與5000個腺苷之間(SEQ ID NO: 844)。
RNA之聚(A)尾在使用聚(A)聚合酶(諸如大腸桿菌聚A聚合酶(E-PAP))活體外轉錄之後可進一步延伸。在一個實施例中，將聚(A)尾之長度自100個核苷酸增加至300與400個核苷酸之間(SEQ ID NO: 845)導致RNA之轉譯效率的約兩倍增加。另外，不同化學基團與3'端之連接可提高mRNA穩定性。此類連接可含有經修飾/人工核苷酸、適體及其他化合物。舉例而言，ATP類似物可使用聚(A)聚合酶併入聚(A)尾中。ATP類似物可進一步提高RNA穩定性。
5'帽亦向RNA分子提供穩定性。在一較佳實施例中，本文揭示之方法產生的RNA包括5'帽。使用此項技術中已知及本文所述之技術提供5'帽(Cougot等人, Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001)；Stepinski等人, RNA, 7:1468-95 (2001)；Elango等人, Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005))。
藉由本文所揭示之方法產生之RNA亦可含有內部核糖體入口位點(IRES)序列。IRES序列可為起始帽非依賴性核糖體結合至mRNA且促進轉譯起始的任何病毒、染色體或人工設計序列。可以包括適於細胞電穿孔之任何溶質，其可含有促進細胞滲透性及活力之因子，諸如糖、肽、脂質、蛋白質、抗氧化劑及界面活性劑。
RNA可使用多種不同方法中之任一者引入靶細胞中，例如包括(但不限於)以下之市售方法：電穿孔(Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany))、(ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.)或基因脈衝發生器II (Gene Pulser II) (BioRad, Denver, Colo.)、多功能細胞電穿孔儀(Multiporator) (Eppendort, Hamburg Germany)、使用脂質體轉染之陽離子脂質體介導之轉染、聚合物囊封、肽介導之轉染或生物彈粒子遞送系統(諸如「基因槍」) (參見例如Nishikawa等人 Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001))。
非病毒遞送方法
在一些態樣中，非病毒方法可用於遞送編碼本文所述之CAR的核酸至細胞或組織或個體。
在一些實施例中，非病毒方法包括使用轉座子(亦稱為可轉座元件)。在一些實施例中，轉座子為自身可插入基因組中之位置的DNA片，例如能夠自我複製且將其複本插入基因組中之DNA片，或可自較長核酸剪接且插入基因組中之另一位置的DNA片。舉例而言，轉座子包含由用於轉位之倒置重複側接基因組成之DNA序列。
使用轉座子之核酸遞送的例示性方法包括睡美人轉座子系統(SBTS)及piggyBac (PB)轉座子系統。參見例如Aronovich等人 Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20；Singh等人 Cancer Res. 15(2008):2961-2971；Huang等人 Mol. Ther. 16(2008):580-589；Grabundzija等人 Mol. Ther. 18(2010):1200-1209；Kebriaei等人 Blood. 122.21(2013):166；Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16；Bell等人 Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65；及Ding等人 Cell. 122.3(2005):473-83，其均以引用的方式併入本文中。
SBTS包括兩個組分：1)含有轉殖基因之轉座子及2)轉座酶來源。轉座酶可將來自載體質體(或其他供體DNA)之轉座子轉至靶DNA，諸如宿主細胞染色體/基因組。舉例而言，轉座酶結合至載體質體/供體DNA，自質體切下轉座子(包括轉殖基因)，且將其插入宿主細胞之基因組中。參見例如Aronovich等人 同前文獻。
例示性轉座子包括基於pT2之轉座子。參見例如Grabundzija等人 Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47；及Singh等人 Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971，其均以引用的方式併入本文中。例示性轉座酶包括Tc1/水手型轉座酶，例如SB10轉座酶或SB11轉座酶(一種高活性轉座酶，其可例如自巨細胞病毒啟動子表現)。參見例如Aronovich等人；Kebriaei等人；及Grabundzija等人，其均以引用的方式併入本文中。
SBTS之使用允許轉殖基因，例如編碼本文所述之CAR之核酸的有效整合及表現。本文提供例如使用諸如SBTS之轉座子系統，產生穩定表現本文所描述之CAR的細胞(例如T細胞或NK細胞)之方法。
根據本文所述之方法，在一些實施例中，將含有SBTS組分之一或多個核酸(例如質體)遞送至細胞(例如T或NK細胞)。舉例而言，核酸藉由標準核酸(例如質體DNA)遞送方法(例如本文所描述方法，例如電穿孔、轉染或脂質體轉染)遞送。在一些實施例中，核酸含有包含轉殖基因(例如編碼本文所描述之CAR的核酸)之轉座子。在一些實施例中，核酸含有包含轉殖基因(例如編碼本文所述CAR的核酸)之轉座子以及編碼轉座酶之核酸序列。在其他實施例中，提供具有兩種核酸之系統，例如雙質體系統，例如其中第一質體含有包含轉殖基因之轉座子且第二質體含有編碼轉座酶之核酸序列。舉例而言，第一及第二核酸共遞送至宿主細胞。
在一些實施例中，藉由使用利用SBTS之基因插入與使用核酸酶(例如鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化因子樣效應核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系統或經工程改造之大範圍核酸酶再工程改造歸巢核酸內切酶)之基因編輯的組合，產生表現本文所描述之CAR的細胞，例如T或NK細胞。
在一些實施例中，使用非病毒遞送方法允許細胞(例如T或NK細胞)之再程式化及細胞直接輸注至個體中。非病毒載體之優點包括(但不限於)容易及相對低成本地產生滿足患者群體所需的足夠量、儲存期間之穩定性及缺乏免疫原性。
編碼CAR之核酸構築體 本發明亦提供編碼一或多個本文所描述之CAR構築體的核酸分子。在一個態樣中，核酸分子作為信使RNA轉錄物提供。在一個態樣中，核酸分子作為DNA構築體提供。
因此，在一個態樣中，本發明係關於一種編碼嵌合抗原受體(CAR)的經分離核酸分子，其中CAR包含抗原結合結構域；跨膜結構域；及胞內信號傳導結構域，其包含刺激結構域，例如共刺激信號傳導結構域及/或初級信號傳導結構域，例如ζ鏈。
編碼所需分子之核酸序列可使用此項技術中已知之重組方法獲得，諸如藉由使用標準技術自表現基因之細胞篩選庫、自已知包括基因之載體獲得基因或自含有基因之細胞及組織直接分離。或者，相關基因可以合成方式產生而非選殖。
本發明亦提供插入有本發明之DNA的載體。來源於反轉錄病毒(諸如慢病毒)之載體為達成長期基因轉移之適合工具，因為其允許長期穩定整合轉殖基因及其在子細胞中之傳播。慢病毒載體具有優於來源於致癌反轉錄病毒(諸如鼠類白血病病毒)之載體的額外優勢，因為其可轉導非增殖性細胞，諸如肝細胞。其亦具有低免疫原性之額外優勢。反轉錄病毒載體亦可為例如γ反轉錄病毒載體。γ反轉錄病毒載體可包括例如啟動子、包裝信號(ψ)、引子結合位點(PBS)、一或多個(例如兩個)長末端重複序列(LTR)及相關轉殖基因(例如編碼CAR之基因)。γ反轉錄病毒載體可能缺乏病毒結構基因，諸如gag、pol及env。例示性γ反轉錄病毒載體包括鼠類白血病病毒(MLV)、脾病灶形成病毒(SFFV)及骨髓增殖肉瘤病毒(MPSV)及由其衍生之載體。其他γ反轉錄病毒載體描述於例如Tobias Maetzig等人,「Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application」Viruses. 2011年6月; 3(6): 677-713中。
在另一實施例中，包含編碼本發明之所需CAR之核酸的載體為腺病毒載體(A5/35)。在另一實施例中，編碼CAR之核酸的表現可使用轉座子(諸如睡美人(sleeping beauty)、CRISPR、CAS9及鋅指核酸酶)實現。參見以下June等人 2009Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716，其以引用的方式併入本文中。
簡言之，編碼CAR之天然或合成核酸之表現通常藉由將編碼CAR多肽或其部分之核酸可操作地連接至啟動子且將構築體併入表現載體中來達成。載體可適合於複製及整合真核生物。典型選殖載體含有轉錄及轉譯終止子、起始序列及適用於調節所需核酸序列之表現的啟動子。
本發明之表現構築體亦可用於使用標準基因遞送方案之核酸免疫接種及基因療法。基因遞送方法為此項技術中已知。參見例如美國專利第5,399,346號、第5,580,859號、第5,589,466號，該等專利以全文引用的方式併入本文中。在另一實施例中，本發明提供基因療法載體。
核酸可選殖至多種類型之載體中。舉例而言，核酸可選殖至包括(但不限於)質體、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒及黏質體之載體中。尤其受關注之載體包括表現載體、複製載體、探針產生載體及測序載體。
此外，表現載體可以病毒載體形式提供給細胞。病毒載體技術為此項技術中熟知且描述於例如Sambrook等人, 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第1-4卷, Cold Spring Harbor Press, NY及其他病毒學與分子生物學手冊中。適用作載體之病毒包括(但不限於)反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒及慢病毒。一般而言，適合載體含有在至少一種生物體中具功能之複製起點、啟動子序列、合宜的限制性核酸內切酶位點及一或多種可選標記物(例如WO 01/96584；WO 01/29058；及美國專利第6,326,193號)。
已針對基因轉移至哺乳動物細胞中開發出多個基於病毒之系統。舉例而言，反轉錄病毒為基因遞送系統提供適宜平台。所選基因可插入載體中且使用此項技術中已知之技術封裝於反轉錄病毒粒子中。隨後可分離重組型病毒且活體內或離體遞送至個體之細胞中。此項技術中已知許多反轉錄病毒系統。在一些實施例中，使用腺病毒載體。多個腺病毒載體為此項技術中已知。在一個實施例中，使用慢病毒載體。
額外啟動子元件(例如強化子)調節轉錄起始頻率。通常，此等定位於起始位點上游30-110 bp區中，但許多啟動子已顯示含有亦在起始位點下游之功能性元件中。啟動子元件之間的間距通常為靈活的，使得在元件倒置或相對於彼此移動時保留啟動子功能。在胸苷激酶(tk)啟動子中，啟動子元件之間的間距在活性開始減退之前可增加至相隔50 bp。視啟動子而定，個別元件看起來可合作地或獨立地起活化轉錄功能。
能夠表現哺乳動物T細胞中之CAR轉殖基因的啟動子之一實例為EF1a啟動子。天然EF1a啟動子驅使伸長因子-1複合物之α次單元的表現，該複合物負責將胺基醯基tRNA酶促遞送至核糖體。EF1a啟動子已廣泛用於哺乳動物表現質體且已顯示有效地自選殖至慢病毒載體中的轉殖基因驅動CAR表現。參見例如Milone等人, Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)。
啟動子之另一實例為即刻早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。此啟動子序列為能夠驅使任何與其可操作地連接之聚核苷酸序列之高表現量的強組成性啟動子序列。然而，亦可使用其他組成性啟動子序列，包括(但不限於)猴病毒40 (SV40)早期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽類白血病病毒啟動子、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)即刻早期啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子(Rous sarcoma virus promoter)，以及人類基因啟動子，諸如(但不限於)肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、伸長因子-1α啟動子、血紅蛋白啟動子及肌酸激酶啟動子。此外，本發明應不限於組成性啟動子之使用。亦涵蓋誘導性啟動子作為本發明之部分。誘導性啟動子之使用提供分子開關，該分子開關能夠在需要此類表現時打開其可操作地連接之聚核苷酸序列之表現或在不需要表現時關閉表現。誘導性啟動子之實例包括(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子及四環素啟動子。
啟動子之另一實例為磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子。在實施例中，可能需要截短PGK啟動子(例如相較於野生型PGK啟動子序列，具有一或多個(例如1、2、5、10、100、200、300或400個)核苷酸缺失的PGK啟動子)。以下提供例示性PGK啟動子之核苷酸序列。
WT PGK 啟動子


例示性截短 PGK 啟動子：
PGK100:

PGK200:

PGK300:

PGK400:
載體亦可包括例如促進分泌之信號序列、聚腺苷酸化信號及轉錄終止子(例如來自牛生長激素(BGH)基因)、允許游離型複製及在原核生物中複製之元件(例如SV40起點及ColE1或此項技術中已知之其他元件)及/或允許選擇之元件(例如安比西林(ampicillin)抗性基因及/或吉歐黴素(zeocin)標記物)。
為評估CAR多肽或其部分之表現，待引入細胞中之表現載體亦可含有可選標記基因或報導基因或兩者以促進自設法經由病毒載體轉染或感染之細胞群體鑑別及選擇表現細胞。在其他態樣中，可選標記物可攜載於獨立DNA段上且用於共轉染程序。可選標記物及報導基因皆可側接適當調節序列以實現在宿主細胞中表現。有用可選標記物包括例如耐抗生素基因，諸如neo及其類似物。
報導基因用於鑑別潛在之轉染細胞，及評估調節序列功能。一般而言，報導基因為受體生物體或組織中不存在或表現的基因，其所編碼多肽之表現可藉由一些容易偵測之特性(例如，酶促活性)來顯現。在DNA已引入受體細胞中之後的適合時間分析報導基因之表現。適合的報導基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯基轉移酶、分泌性鹼性磷酸酶之基因，或綠色螢光蛋白基因(例如Ui-Tei等人, 2000 FEBS Letters 479: 79-82)。適合表現系統為熟知的且可使用已知技術製備或商購獲得。一般而言，以具有最小5'側接區且顯示報導基因最高表現量之構築體鑑別為啟動子。此類啟動子區可連接至報導基因且用於評估試劑調節啟動子所驅動轉錄的能力。
在一個實施例中，載體可進一步包含編碼第二CAR之核酸。在一個實施例中，第二CAR包括針對以下各者之抗原結合結構域：表現在急性骨髓性白血病細胞上之標靶，諸如CD123、CD34、CLL-1、葉酸受體β或FLT3；或表現在B細胞上之標靶，例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a。在一個實施例中，載體包含編碼第一CAR之核酸序列，該第一CAR特異性結合第一抗原且包括具有共刺激信號傳導結構域但不具有初級信號傳導結構域之胞內信號傳導結構域；及編碼第二CAR之核酸，該第二CAR特異性結合第二不同抗原且包括具有初級信號傳導結構域但不具有共刺激信號傳導結構域之胞內信號傳導結構域。
在一個實施例中，載體包含編碼本文所述之CAR的核酸及編碼抑制性CAR之核酸。在一個實施例中，抑制性CAR包含結合會出現在正常細胞上但不會出現在癌細胞上之抗原的抗原結合結構域。在一個實施例中，抑制性CAR包含抑制性分子之抗原結合結構域、跨膜結構域及胞內結構域。舉例而言，抑制性CAR之胞內結構域可為PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM (例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3 (CD276)、B7-H4 (VTCN1)、HVEM (TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR β之胞內結構域。
在實施例中，載體可包含兩個或更多個編碼CAR (例如本文所描述之CAR及第二CAR，例如抑制性CAR或特異性結合至不同抗原之CAR)之核酸序列。在此類實施例中，編碼CAR之兩個或更多個核酸序列藉由同框且呈單一多肽鏈形式之單一核分子編碼。在此態樣中，兩個或更多個CAR可例如藉由一或多個肽裂解位點分離。(例如，胞內蛋白酶之自體裂解位點或受質)。肽裂解位點之實例包括以下，其中GSG殘基為視情況選用：
T2A: (GSG) E G R G S L L T C G D V E E N P G P (SEQ ID NO: 688)
P2A: (GSG) A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P (SEQ ID NO: 691)
E2A: (GSG) Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P (SEQ ID NO: 694)
F2A: (GSG) V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P (SEQ ID NO: 697)
向細胞中引入及表現基因之方法為此項技術中已知。在表現載體之情形下，載體可容易藉由此項技術中之任何方法引入至宿主細胞(例如哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲細胞)中。舉例而言，表現載體可藉由物理、化學或生物方式轉移至宿主細胞中。
用於將聚核苷酸引入至宿主細胞中之物理方法包括磷酸鈣沈澱、脂質體轉染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔及其類似方法。用於製備包含載體及/或外源性核酸之細胞的方法為此項技術中熟知的。參見例如Sambrook等人, 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第1-4卷, Cold Spring Harbor Press, NY。將聚核苷酸引入宿主細胞中之一較佳方法為磷酸鈣轉染。
將所關注的聚核苷酸引入宿主細胞中之生物方法包括使用DNA及RNA載體。病毒載體及尤其反轉錄病毒載體已成為最廣泛用於將基因插入至哺乳動物(例如人類)細胞中之方法。其他病毒載體可來源於慢病毒、痘病毒、I型單純疱疹病毒、腺病毒及腺相關聯病毒及其類似病毒。參見例如美國專利第5,350,674號及第5,585,362號。
將聚核苷酸引入宿主細胞中之化學方式包括膠態分散系統，諸如大分子複合物、奈米囊劑、微球、珠粒及基於脂質之系統，包括水包油乳液、微胞、混合微胞及脂質體。用作活體外及活體內遞送媒劑之一例示性膠態系統為脂質體(例如人工膜囊泡)。可獲得目前先進技術中靶向遞送核酸之其他方法，諸如用靶向奈米粒子或其他適合之亞微米大小的遞送系統遞送聚核苷酸。
在利用非病毒遞送系統之情況下，例示性遞送媒劑為脂質體。預期使用脂質調配物將核酸引入至宿主細胞(活體外、離體或活體內)。在另一態樣中，核酸可與脂質相關聯。與脂質相關聯之核酸可囊封於脂質體之水性內部中，穿插於脂質體之脂質雙層內，經由與脂質體及寡核苷酸相關聯之連接分子連接至脂質體，包覆於脂質體中，與脂質體複合，分散於含有脂質之溶液中，與脂質混合，與脂質組合，以懸浮液形式含於脂質中，含有微胞或與微胞複合，或以其他方式與脂質相關聯。與組合物相關聯之脂質、脂質/DNA或脂質/表現載體不限於溶液中之任何特定結構。舉例而言，其可存在於雙層結構中，以微胞形式存在或具有「塌陷」結構。其亦可簡單地穿插於溶液中，可能形成尺寸或形狀上不均勻的聚集物。脂質為可為天然存在之脂質或合成脂質的脂肪物質。舉例而言，脂質包括細胞質中天然存在之脂肪滴以及含有長鏈脂族烴及其衍生物之化合物類別(諸如脂肪酸、醇、胺、胺基醇及醛)。
適合於使用之脂質可獲自商業來源。舉例而言，二肉豆蔻基磷脂醯膽鹼(「DMPC」)可獲自Sigma, St. Louis, MO；二鯨蠟基磷酸酯(「DCP」)可獲自K & K Laboratories (Plainview, NY)；膽固醇(「Choi」)可獲自Calbiochem-Behring；二肉豆蔻基磷脂醯甘油(「DMPG」)及其他脂質可獲自Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL.)。脂質於氯仿或氯仿/甲醇中之儲備溶液可在約-20℃下儲存。氯仿用作唯一溶劑，因為其比甲醇更容易蒸發。「脂質體」為涵蓋藉由產生封閉脂質雙層或聚集物形成的多種單層及多層脂質媒劑之通用術語。脂質體之特徵可為具有囊泡結構，其具有磷脂雙層膜及內部水性介質。多層脂質體具有藉由水性介質分離之多個脂質層。其在磷脂懸浮於過量水溶液中時自發地形成。脂質組分在形成封閉結構之前進行自身重排且在脂質雙層之間捕獲水及溶解之溶質(Ghosh等人, 1991 Glycobiology 5: 505-10)。然而，亦涵蓋在溶液中具有與正常囊泡結構不同之結構的組合物。舉例而言，脂質可採用微胞結構或僅以脂質分子之非均勻聚集物形式存在。亦涵蓋脂染胺-核酸複合物。
不管用於將外源性核酸引入宿主細胞或以其他方式使細胞曝露於本發明之抑制劑的方法，為了確認宿主細胞中重組DNA序列之存在，可進行多種分析。此類分析包括例如熟習此項技術者熟知之「分子生物」分析，諸如南方及北方墨點法(Southern and Northern blotting)、RT-PCR及PCR；「生物化學」分析，諸如偵測特定肽之存在或不存在，例如藉由免疫學方式(ELISA及西方墨點法)或藉由本文所描述之分析來鑑別在本發明之範疇內的試劑。
本發明進一步提供包含CAR編碼核酸分子之載體。在一個態樣中，CAR載體可直接轉導至細胞，例如T細胞或NK細胞中。在一個態樣中，載體為選殖或表現載體，例如包括(但不限於)以下之載體，一或多個質體(例如表現質體、選殖載體、微環、微載體、雙微染色體)、反轉錄病毒及慢病毒載體構築體。在一個態樣中，載體能夠在哺乳動物T細胞或NK細胞中表現CAR構築體 在一個態樣中，哺乳動物T細胞為人類T細胞。在一個態樣中，哺乳動物NK細胞為人類NK細胞。在一個實施例中，載體選自由以下組成之群：DNA載體、RNA載體、質體載體、慢病毒載體、腺病毒載體或反轉錄病毒載體。
進一步揭示一種載體，其包含編碼本文揭示之RNA分子(例如本文揭示之免疫刺激RNA分子)之核酸分子。在一個實施例中，載體可直接轉導至細胞，例如T細胞或NK細胞中。在一個態樣中，載體為選殖或表現載體，例如包括(但不限於)以下之載體，一或多個質體(例如表現質體、選殖載體、微環、微載體、雙微染色體)、反轉錄病毒及慢病毒載體構築體。在一個態樣中，載體能夠表現哺乳動物T細胞或NK細胞中的RNA分子。在一個態樣中，哺乳動物T細胞為人類T細胞。在一個態樣中，哺乳動物NK細胞為人類NK細胞。在一個實施例中，載體選自由以下組成之群：DNA載體、RNA載體、質體載體、慢病毒載體、腺病毒載體或反轉錄病毒載體。在一些實施例中，編碼CAR之核酸分子及編碼RNA分子(例如免疫刺激RNA分子)之核酸分子安置於單載體上。在一些實施例中，編碼CAR之核酸分子及編碼RNA分子(例如免疫刺激RNA分子)之核酸分子安置於分別的載體上。
細胞來源 在擴增及基因修飾之前，自個體獲得細胞(例如免疫效應細胞，例如T細胞或NK細胞)來源。術語「個體」意欲包括可引起免疫反應之活生物體(例如哺乳動物)。個體之實例包括人類、狗、貓、小鼠、大鼠及其轉殖基因物種。T細胞可獲自許多來源，包括周邊血液單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、肋膜積液、脾組織及腫瘤。
在本發明之某些態樣中，可使用此項技術中可獲得的多種免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)株。在本發明之某些態樣中，T細胞可獲自使用熟習此項技術者已知之多種技術(諸如Ficoll™分離)自個體收集之血液單元。在一個較佳態樣中，藉由血球分離術獲得來自個體之循環血液的細胞。血球分離術產物通常含有淋巴細胞，包括T細胞、單核球、粒細胞、B細胞、其他成核白血球、紅血球及血小板。在一個態樣中，藉由血球分離術收集之細胞可經洗滌以移除血漿部分且將細胞置於適當緩衝液或培養基中以用於後續處理步驟。在本發明之一個態樣中，用磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)洗滌細胞。在一替代態樣中，洗滌溶液缺乏鈣且可缺乏鎂或可缺乏許多(若並非全部)二價陽離子。
在鈣不存在下之初始活化步驟可能導致放大之活化。如一般熟習此項技術者將易於瞭解，洗滌步驟可藉由熟習此項技術者已知之方法實現，諸如藉由根據製造商說明書使用半自動「流通」離心機(例如，Cobe 2991細胞處理器、Baxter CytoMate或Haemonetics細胞保存器5)。洗滌後，可將細胞再懸浮於多種生物相容性緩衝劑中，諸如不含Ca不含Mg之PBS、PlasmaLyte A或其他具有或不具有緩衝劑之生理食鹽水溶液。或者，可移除血球分離術樣品之非所需組分且細胞直接再懸浮於培養基中。
認識到，本申請案之方法可利用包含5%或更少(例如2%)人類AB血清之培養基條件，且採用已知培養基條件及組合物，例如Smith等人,「Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement」Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31中所描述之培養基條件及組合物。
在一個態樣中，藉由溶解紅血球及例如藉由經由PERCOLLTM梯度離心或藉由逆流離心淘析耗盡單核球，自周邊血液淋巴細胞分離T細胞。特定的T細胞亞群(諸如CD3+、CD4+、CD8+、CD45RA+及/或CD45RO+T細胞)可藉由正或負選擇技術進一步分離。舉例而言，在一個態樣中，T細胞藉由與抗CD3/抗CD28 (例如3x28)結合珠粒(諸如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T)一起培育足以正選擇所需T細胞之時間段而經分離。在一個態樣中，該時間段為約30分鐘。在另一態樣中，該時間段在30分鐘至36小時或更長及其間所有整數值範圍內。在另一態樣中，該時間段為至少1、2、3、4、5或6小時。在另一較佳態樣中，該時間段為10至24小時。在一個態樣中，培育時間段為24小時。在相較於其他細胞類型存在極少T細胞的任何情況下可使用較長培育時間分離T細胞，諸如自腫瘤組織或免疫功能不全個體分離腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)。此外，使用較長培育時間可提高捕捉CD8+ T細胞之效率。因此，藉由簡單縮短或延長時間使T細胞結合於CD3/CD28珠粒及/或藉由增加或降低珠粒與T細胞之比率(如本文進一步描述)，對於或針對在培養起始時或在該方法期間之其他時間點可優先選擇T細胞之亞群。另外，藉由增加或降低珠粒或其他表面上抗CD3及/或抗CD28抗體之比率，在培養開始時或在其他所需時間點可優先選擇T細胞之亞群。熟習此項技術者將認識到在本發明之背景下亦可使用多輪選擇。在某些態樣中，可能需要進行選擇程序且在活化及擴增過程中使用「未經選擇之」細胞。「未經選擇之」細胞亦可經受其他多輪選擇。
藉由負選擇增濃T細胞群體可使用針對負選擇之細胞所獨特之表面標記物的抗體之組合來實現。一種方法為經負磁性免疫黏附或流式細胞量測術分選及/或選擇細胞，該負磁性免疫黏附或流式細胞量測術使用針對負選擇細胞上存在之細胞表面標記物之單株抗體混合物。舉例而言，為藉由負選擇增濃CD4+細胞，單株抗體混合物典型地包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。在某些態樣中，可能需要增濃或正選擇通常表現CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+及FoxP3+之調節T細胞。在某些態樣中，可能需要增濃CD127低的細胞。或者，在某些態樣中，藉由抗C25結合之珠粒或其他類似選擇方法耗盡T調節細胞。
本文所描述之方法可包括例如使用例如本文所描述之負選擇技術選擇免疫效應細胞(例如，作為T調節性細胞耗盡群體之T細胞、CD25+耗盡細胞)之特定亞群。較佳地，T調節耗盡細胞群體含有少於30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%之CD25+細胞。
在一個實施例中，使用抗CD25抗體或其片段或CD25結合配體IL-2自群體移除T調節細胞，例如CD25+ T細胞。在一個實施例中，抗CD25抗體或其片段或CD25結合配體與受質(例如珠粒)結合或以其他方式塗佈在受質(例如珠粒)上。在一個實施例中，抗CD25抗體或其片段結合至如本文所描述之受質。
在一個實施例中，使用來自MiltenyiTM 之CD25耗盡劑自群體移除T調節細胞，例如CD25+ T細胞。在一個實施例中，細胞與CD25耗盡劑之比率為1e7個細胞比20 μL，或1e7個細胞比15 μL，或1e7個細胞比10 μL，或1e7個細胞比5 μL，或1e7個細胞比2.5 μL，或1e7個細胞比1.25 μL。在一個實施例中，例如對於T調節細胞(例如CD25+耗盡)而言，使用超過5億個細胞/毫升。在另一態樣中，使用6、7、8或9億個細胞/毫升之細胞濃度。
在一個實施例中，待耗盡之免疫效應細胞群體包括約6×109 個CD25+ T細胞。在其他態樣中，待耗盡之免疫效應細胞群體包括約1×109 至1×1010 個CD25+ T細胞及其間任何整數值。在一個實施例中，所得T調節耗盡細胞群體具有2×109 個T調節細胞，例如CD25+細胞，或更少(例如1×109 、5×108 、1×108 、5×107 、1×107 個或更少CD25+細胞)。
在一個實施例中，使用具有耗盡管組(諸如，管162-01)之CliniMAC系統自群體移除T調節細胞，例如CD25+細胞。在一個實施例中，CliniMAC系統在諸如DEPLETION2.1之耗盡設置上運行。
在不希望受特定理論束縛的情況下，在血球分離術之前或在製造CAR表現細胞產物期間降低個體中免疫細胞之負調節子之水準(例如減少非想要免疫細胞，例如TREG 細胞之數目)可降低個體復發風險。舉例而言，耗盡TREG 細胞之方法為此項技術中已知。減少TREG 細胞之方法包括(但不限於)環磷醯胺(cyclophosphamide)、抗GITR抗體(本文所述之抗GITR抗體)、CD25耗盡及其組合。
在一些實施例中，製造方法包含在製造CAR表現細胞前減少TREG 細胞數目(例如耗盡)。舉例而言，製造方法包含在製造CAR表現細胞(例如T細胞、NK細胞)產物之前，使樣品(例如血球分離術樣品)與抗GITR抗體及/或抗CD25抗體(或其片段，或CD25結合配體)接觸，例如以耗盡TREG 細胞。
在一實施例中，在收集細胞用於製造CAR表現細胞產物前將個體用一或多種減少TREG 細胞之療法預治療，進而降低個體對CAR表現細胞治療復發之風險。在一實施例中，減少TREG 細胞之方法包括(但不限於)向個體投與環磷醯胺、抗GITR抗體、CD25耗盡或其組合中之一或多者。投與環磷醯胺、抗GITR抗體、CD25耗盡或其組合中之一或多者可在CAR表現細胞產物輸注之前、期間或之後進行。
在一實施例中，在收集細胞用於製造CAR表現細胞產物前將個體用環磷醯胺預治療，進而降低個體對CAR表現細胞治療復發之風險。在一實施例中，在收集細胞用於製造CAR表現細胞產物前將個體用抗GITR抗體預治療，進而降低個體對CAR表現細胞治療復發之風險。
在一個實施例中，待移除之細胞群體既非調節T細胞或腫瘤細胞，亦非以其他方式負面影響CART細胞之擴增及/或功能的細胞，例如表現CD14、CD11b、CD33、CD15或藉由潛在免疫抑制細胞表現之其他標記物的細胞。在一個實施例中，設想此類細胞與調節T細胞及/或腫瘤細胞同時移除，或在該耗盡後移除，或以另一順序移除。
本文所述之方法可包括多於一個選擇步驟，例如多於一個耗盡步驟。藉由負選擇增濃T細胞群體可例如使用針對負選擇之細胞所獨特之表面標記物的抗體之組合來實現。一種方法為經負磁性免疫黏附或流式細胞量測術分選及/或選擇細胞，該負磁性免疫黏附或流式細胞量測術使用針對負選擇細胞上存在之細胞表面標記物之單株抗體混合物。舉例而言，為藉由負選擇增濃CD4+細胞，單株抗體混合物可包括CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。
本文所述之方法可進一步包括自表現腫瘤抗原(例如不包含CD25之腫瘤抗原，例如CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b)之群體移除細胞，藉此提供適於表現CAR (例如本文所述之CAR)的T調節耗盡(例如CD25+耗盡)及腫瘤抗原耗盡之細胞群體。在一個實施例中，表現腫瘤抗原之細胞與T調節(例如CD25+)細胞同時移除。舉例而言，抗CD25抗體或其片段及抗腫瘤抗原抗體或其片段可連接至可用於移除細胞之相同受質(例如珠粒)，或抗CD25抗體或其片段或抗腫瘤抗原抗體或其片段可連接至混合物可用於移除細胞之分別的珠粒。在其他實施例中，T調節細胞(例如CD25+細胞)之移除及表現腫瘤抗原之細胞的移除為依序的，且可例如以任一次序進行。
亦提供如下方法，其包括自群體移除表現檢查點抑制劑(例如本文所描述之檢查點抑制劑)之細胞，例如PD1+細胞、LAG3+細胞及TIM3+細胞中之一或多者，藉此提供T調節耗盡(例如CD25+耗盡)細胞及檢查點抑制劑耗盡細胞(例如PD1+、LAG3+及/或TIM3+耗盡細胞)之群體。例示性檢查點抑制劑包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM (例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3 (CD276)、B7-H4 (VTCN1)、HVEM (TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR β。在實施例中，檢查點抑制劑為PD1或PD-L1。在一個實施例中，表現檢查點抑制劑之細胞與T調節(例如CD25+細胞)同時移除。舉例而言，抗CD25抗體或其片段及抗檢查點抑制劑抗體或其片段可連接至可用於移除細胞之相同珠粒，或抗CD25抗體或其片段或抗腫瘤抗原抗體或其片段可連接至混合物可用於移除細胞之分別的珠粒。在其他實施例中，T調節細胞(例如CD25+細胞)之移除及表現檢查點抑制劑之細胞的移除為依序的，且可例如以任一次序進行。
在一個實施例中，可選擇表現以下中之一或多者的T細胞群體：IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、粒酶B及穿孔蛋白或其他適當分子(例如其他細胞介素)。可例如藉由PCT公開案第WO 2013/126712號中所述之方法確定篩選細胞表現之方法。
為了藉由正選擇或負選擇分離所需細胞群體，細胞濃度及表面(例如粒子，諸如珠粒)可變化。在某些態樣中，可能需要顯著減小珠粒與細胞混合在一起的體積(例如增加細胞濃度)以確保細胞與珠粒最大接觸。舉例而言，在一個態樣中，使用20億個細胞/毫升之濃度。在一個態樣中，使用10億個細胞/毫升之濃度。在另一態樣中，使用大於1億個細胞/毫升。在另一態樣中，使用10,00萬、15,00萬、20,00萬、25,00萬、30,00萬、35,00萬、40,00萬、45,00萬或50,00萬個細胞/毫升之細胞濃度。在另一態樣中，使用75,00萬、80,00萬、85,00萬、90,00萬、95,00萬或1億個細胞/毫升之濃度。在其他態樣中，可使用1.25億或1.5億個細胞/毫升之濃度。使用高濃度可導致增加之細胞產量、細胞活化及細胞擴增。此外，使用高細胞濃度允許更高效捕捉可微弱表現相關靶抗原之細胞(諸如CD28陰性T細胞)或來自存在許多腫瘤細胞之樣品(例如白血病血液、腫瘤組織等)之細胞。此類細胞群體可具有治療價值且將需要獲得。舉例而言，使用高細胞濃度允許更有效選擇通常具有較弱CD28表現之CD8+ T細胞。
在相關態樣中，可能需要使用較低濃度之細胞。藉由顯著稀釋T細胞及表面(例如粒子，諸如珠粒)之混合物，使粒子與細胞之間的相互作用降至最低。此選擇表現大量待結合於粒子之所需抗原之細胞。舉例而言，CD4+ T細胞表現較大量CD28且在稀濃度下比CD8+ T細胞更有效捕捉。在一個態樣中，所用細胞濃度為5×10e6/ml。在其他態樣中，所用濃度可為約1×105 /ml至1×106 /ml，及其間任何整數值。
在其他態樣中，細胞可在2-10℃或室溫下在旋轉器上培育持續變化之時間長度或變化之速度下培育。
用於刺激之T細胞亦可在洗滌步驟後經冷凍。不希望受理論束縛，冷凍及隨後解凍步驟藉由在細胞群體中移除粒細胞及一定程度上移除單核球來提供更均勻產物。在移除血漿及血小板之洗滌步驟後，細胞可懸浮於冷凍溶液中。儘管許多冷凍溶液及參數為此項技術中已知且將適用於此情況，但一種方法涉及使用含有20% DMSO及8%人類血清白蛋白之PBS，或含有10%聚葡萄糖40及5%右旋糖、20%人類血清白蛋白及7.5% DMSO，或31.25% Plasmalyte-A、31.25%右旋糖5%、0.45% NaCl、10%聚葡萄糖40及5%右旋糖、20%人類血清白蛋白及7.5% DMSO之培養基，或含有例如Hespan及PlasmaLyte A之其他適合細胞冷凍培養基，隨後細胞在每分鐘1°之速率下冷凍至-80℃且以氣相儲存於液氮儲存槽中。可使用受控冷凍以及在-20℃下或在液氮中不受控立即冷凍之其他方法。
在某些態樣中，將冷凍保存之細胞如本文所述解凍及洗滌，且在室溫下靜置一小時，隨後使用本發明之方法活化。
本發明之情形中亦預期在可能需要如本文所述擴增細胞之前一段時間自個體收集血液樣品或血球分離術產物。因此，待擴增之細胞來源可在需要之任何時間點收集，且所需細胞(諸如免疫效應細胞，例如T細胞或NK細胞)經分離及冷凍以便後續用於細胞療法(例如T細胞療法)以用於多種將受益於細胞療法(例如T細胞療法)之疾病或病狀(諸如本文所描述之彼等)。在一個態樣中，血液樣品或血球分離術取自一般健康個體。在某些態樣中，血液樣品或血球分離術取自處於患上疾病之風險中但尚未患上疾病的一般健康個體，且所關注細胞經分離及冷凍以供隨後使用。在某些態樣中，免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)可擴增、冷凍且在稍後時間使用。在某些態樣中，在診斷出如本文所描述之特定疾病後不久但在任何治療之前自患者收集樣品。在另一態樣中，自來自個體之血液樣品或血球分離術分離細胞，隨後進行多種相關治療模態，包括(但不限於)用以下藥劑治療：諸如那他珠單抗(natalizumab)、艾法珠單抗(efalizumab)、抗病毒劑、化學療法、輻射、免疫抑制劑(諸如環孢素、硫唑嘌呤、甲胺喋呤(methotrexate)、黴酚酸酯及FK506)、抗體或其他免疫燒蝕劑(諸如CAMPATH、抗CD3抗體、環磷醯胺、氟達拉濱(fludarabine)、環孢素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸、類固醇、FR901228)及照射。
在本發明之另一態樣中，在給個體留下功能性T細胞之治療後直接自患者獲得T細胞。就此而言，已觀測到在某些癌症治療之後，特定言之使用破壞免疫系統之藥物治療之後，在患者通常將自治療恢復的時段期間治療之後不久，獲得之T細胞品質可最佳或其離體擴增之能力得到改良。同樣，在使用本文所描述之方法離體操縱之後，此等細胞之增強移植及活體內擴增可呈較佳狀態。因此，本發明之情形內涵蓋在此恢復階段期間收集血球，包括T細胞、樹突狀細胞或造血譜系之其他細胞。此外，在某些態樣中，移動(例如，用GM-CSF移動)及調節方案可用於建立個體內之條件，其中尤其在治療之後的界定時間窗期間，特定細胞類型之再增殖、再循環、再生及/或擴增為有利的。說明性細胞類型包括T細胞、B細胞、樹突狀細胞及免疫系統之其他細胞。
在一個實施例中，自已接受低免疫增強劑量之mTOR抑制劑的個體獲得表現CAR分子(例如本文所描述之CAR分子)之免疫效應細胞。在一實施例中，在充足時間之後或在充分給予低免疫增強劑量之mTOR抑制劑之後，收集待經工程改造以表現CAR之免疫效應細胞(例如T細胞)群體，以便個體中的或自個體收集的PD1陰性免疫效應細胞(例如T細胞)之水準或PD1陰性免疫效應細胞(例如T細胞)/PD1陽性免疫效應細胞(例如T細胞)之比率至少短暫增加。
在其他實施例中，已或將經工程改造以表現CAR之免疫效應細胞(例如T細胞)群體可藉由與一定量之增加PD1陰性免疫效應細胞(例如T細胞)數目或增加PD1陰性免疫效應細胞(例如T細胞)/PD1陽性免疫效應細胞(例如T細胞)之比率的mTOR抑制劑接觸而經離體處理。
在一個實施例中，T細胞群體缺乏甘油二酯激酶(DGK)。DGK缺乏細胞包括不表現DGK RNA或蛋白質或具有降低或抑制之DGK活性的細胞。DGK缺乏細胞可藉由遺傳方法產生，例如投與RNA干擾劑(例如siRNA、shRNA、miRNA)以減少或防止DGK表現。或者，DGK缺乏細胞可藉由用本文所描述之DGK抑制劑處理來產生。
在一個實施例中，T細胞群體缺乏Ikaros。Ikaros缺乏細胞包括不表現Ikaros RNA或蛋白質或具有降低或抑制之Ikaros活性的細胞，Ikaros缺乏細胞可藉由遺傳方法產生，例如投與RNA干擾劑(例如siRNA、shRNA、miRNA)以減少或防止Ikaros表現。或者，Ikaros缺乏細胞可藉由用Ikaros抑制劑(例如來那度胺(lenalidomide))處理來產生。
在實施例中，T細胞群體缺乏DGK及缺乏Ikaros，例如不表現DGK及Ikaros，或具有降低或抑制之DGK及Ikaros活性。此類DGK及Ikaros缺乏細胞可藉由本文所描述之任何方法產生。
在實施例中，NK細胞獲自個體。在另一實施例中，NK細胞為NK細胞株，例如NK-92細胞株(Conkwest)。
CAR細胞(包括同種異體CAR細胞)的修飾 在本文所描述之實施例中，免疫效應細胞可為同種異體免疫效應細胞，例如T細胞或NK細胞。舉例而言，該細胞可為同種異體T細胞，例如缺乏功能T細胞受體(TCR)及/或人類白細胞抗原(HLA)(例如HLA I類及/或HLA II類)及/或β-2微球蛋白(β2 m)之表現的同種異體T細胞。同種異體CAR組合物及其方法已描述於例如WO 2016/014565之第227-237頁中，該文獻以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，使用例如本文所述之方法(例如siRNA、shRNA、成簇規律間隔短回文重複序列(CRISPR)、轉錄活化因子樣效應核酸酶(TALEN)或鋅指核酸內切酶(ZFN))修飾細胞(例如T細胞或NK細胞)，以減少TCR及/或HLA及/或β2 m及/或本文所述之抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM (例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3 (CD276)、B7-H4 (VTCN1)、HVEM (TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR β)之表現。
在一些實施例中，細胞(例如T細胞或NK細胞)經工程改造以表現端粒酶次單元，例如端粒酶催化次單元，例如TERT，例如hTERT。在一個實施例中，此類修飾改良細胞於患者中之續存。
T細胞之活化及擴增 T細胞通常可使用如以下文獻中所述之方法活化及擴增：例如美國專利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；及美國專利申請公開案第20060121005號。
一般而言，本發明之T細胞可藉由與其上連接有刺激CD3/TCR複合物相關聯信號之試劑及刺激T細胞表面上之共刺激分子的配體之表面接觸來擴增。詳言之，T細胞群體可如本文所描述刺激，諸如藉由與抗CD3抗體或其抗原結合片段或固定於表面上之抗CD2抗體刺激，或藉由與蛋白激酶C活化因子(例如苔蘚抑素)以及鈣離子載體接觸。為了共刺激T細胞表面上之輔助分子，使用結合輔助分子之配體。舉例而言，T細胞群體可與抗CD3抗體及抗CD28抗體在適於刺激T細胞增殖之條件下接觸。為了刺激CD4+ T細胞或CD8+ T細胞之增殖，可使用抗CD3抗體及抗CD28抗體。抗CD28抗體之實例包括9.3、B-T3、XR-CD28 (Diaclone, Besançon, France)，可按此項技術中通常已知之其他方法使用(Berg等人, Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998；Haanen等人, J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999；Garland等人, J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999)。
在某些態樣中，T細胞之初級刺激信號及共刺激信號可藉由不同方案提供。舉例而言，提供各信號之試劑可在溶液中或偶合至表面。當偶合至表面時，試劑可偶合至相同表面(亦即以「順式」形式)或分別的表面(亦即以「反式」形式)。或者，一種試劑可偶合至表面且另一試劑在溶液中。在一個態樣中，提供共刺激信號之試劑結合至細胞表面且提供初級活化信號之試劑在溶液中或偶合至表面。在某些態樣中，兩種試劑皆可在溶液中。在一個態樣中，該等試劑可呈可溶形式，且隨後交聯至表面(諸如表現Fc受體之細胞，或抗體，或將結合於該等試劑之其他結合劑)。就此而言，關於預期在本發明中用於活化及擴增T細胞之人工抗原呈現細胞(aAPC)，參見例如美國專利申請公開案第20040101519號及第20060034810號。
在一個態樣中，兩種試劑固定於珠粒上，在同一珠粒上，亦即「順式」；或在分別的珠粒上，亦即「反式」。舉例而言，提供初級活化信號之試劑為抗CD3抗體或其抗原結合片段且提供共刺激信號之試劑為抗CD28抗體或其抗原結合片段；且兩種試劑以等效分子量共同固定於同一珠粒。在一個態樣中，使用結合於用於CD4+ T細胞擴增及T細胞生長之珠粒的1:1比率之各抗體。在本發明之某些態樣中，使用一定比率之結合至珠粒之抗CD3:CD28抗體，以便觀測到T細胞擴增相較於使用1:1比率所觀測到的擴增增加。在一個特定態樣中，觀測到相較於使用1:1比率所觀測到的擴增，約1至約3倍之增加。在一個態樣中，結合於珠粒之CD3:CD28抗體的比率介於100:1至1:100及在其之間的所有整數值範圍內。在本發明之一個態樣中，更多抗CD28抗體比抗CD3抗體結合至粒子，亦即CD3:CD28之比率小於一。在本發明之某些態樣中，結合於珠粒之抗CD28抗體與抗CD3抗體之比率大於2:1。在一個特定態樣中，使用1:100之結合於珠粒的抗體CD3:CD28比率。在一個態樣中，使用1:75之結合於珠粒的抗體CD3:CD28比率。在另一態樣中，使用1:50之結合於珠粒的抗體CD3:CD28比率。在一個態樣中，使用1:30之結合於珠粒的抗體CD3:CD28比率。在一個較佳態樣中，使用1:10之結合於珠粒的抗體CD3:CD28比率。在一個態樣中，使用1:3之結合於珠粒的抗體CD3:CD28比率。在又一個態樣中，使用3:1之結合於珠粒的抗體CD3:CD28比率。
可使用1:500至500:1及其間之任何整數值的粒子比細胞比率刺激T細胞或其他靶細胞。如一般熟習此項技術者可容易瞭解，粒子與細胞之比率可視相對於靶細胞之粒徑而定。舉例而言，小尺寸珠粒可僅結合少數細胞，而較大珠粒可結合許多細胞。在某些態樣中，細胞比粒子之比率在1:100至100:1及其間之任何整數值範圍內且在其他態樣中，包含1:9至9:1及其間之任何整數值的比率亦可用於刺激T細胞。導致T細胞刺激的抗CD3及抗CD28偶合粒子比T細胞之比率可如上所指變化，然而，某些較佳值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1及15:1，一個較佳比率為至少1:1粒子/T細胞。在一個態樣中，使用1:1或更小的粒子比細胞之比率。在一個特定態樣中，較佳粒子:細胞比率為1:5。在其他態樣中，粒子比細胞之比率可視刺激天數而變化。舉例而言，在一個態樣中，粒子比細胞之比率在第一天為1:1至10:1，且其後每天或每隔一天向細胞添加額外粒子長達10天，最終比率為1:1至1:10 (以添加當天之細胞計數計)。在一個特定態樣中，刺激第一天粒子比細胞之比率為1:1且在刺激第三天及第五天調整至1:5。在一個態樣中，每天或每隔一天添加粒子直至第一天的最終比率為1:1，且刺激第三天及第五天為1:5。在一個態樣中，粒子比細胞之比率在刺激第一天為2:1且在刺激第三天及第五天調整至1:10。在一個態樣中，每天或每隔一天添加粒子直至第一天的最終比率為1:1，且刺激第三天及第五天為1:10。熟習此項技術者將瞭解多種其他比率可適用於本發明。詳言之，比率將視粒徑以及細胞尺寸及類型而變化。在一個態樣中，第一天使用之最典型比率為約1:1、2:1及3:1。
在本發明之其他態樣中，細胞(諸如T細胞)與試劑塗佈之珠粒組合，隨後分離珠粒與細胞，且隨後培養細胞。在一替代態樣中，在培養之前，試劑塗佈之珠粒及細胞不分離，而是一起培養。在另一態樣中，珠粒及細胞首先藉由施加力(諸如磁力)集中，導致細胞表面標記物之接合增加，藉此誘導細胞刺激。
舉例而言，細胞表面蛋白可藉由使連接有抗CD3及抗CD28之順磁性珠粒(3x28珠粒)與T細胞接觸而接合。在一個態樣中，在例如PBS之緩衝劑(不具有二價陽離子，諸如鈣及鎂)中組合細胞(例如，104 至109 個T細胞)與珠粒(例如，1:1比率之DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T順磁性珠粒)。此外，一般熟習此項技術者可易於瞭解可使用任何細胞濃度。舉例而言，樣品中的靶細胞可能極少且僅構成樣品之0.01%，或全部樣品(亦即，100%)可包含所關注的靶細胞。因此，任何細胞數目均在本發明之情形內。在某些態樣中，可能需要顯著減小粒子與細胞混合在一起的體積(亦即增加細胞濃度)以確保細胞與粒子最大接觸。舉例而言，在一個態樣中，使用約100億個細胞/毫升、90億個細胞/毫升、80億個細胞/毫升、70億個細胞/毫升、60億個細胞/毫升、50億個細胞/毫升或20億個細胞/毫升之濃度。在一個態樣中，使用大於1億個細胞/毫升。在另一態樣中，使用1000萬、1500萬、2000萬、2500萬、3000萬、3500萬、4000萬、4500萬或5000萬個細胞/毫升之細胞濃度。在另一態樣中，使用7500萬、8000萬、8500萬、9000萬、9500萬或1億個細胞/毫升之濃度。在其他態樣中，可使用1.25億或1.5億個細胞/毫升之濃度。使用高濃度可導致增加之細胞產量、細胞活化及細胞擴增。此外，使用高細胞濃度允許更有效捕捉可能微弱表現所關注的靶抗原之細胞，諸如CD28陰性T細胞。此類細胞群體可具有治療價值且在某些態樣中將需要獲得。舉例而言，使用高細胞濃度允許更有效選擇通常具有較弱CD28表現之CD8+ T細胞。
在一個實施例中，經編碼CAR (例如本文所描述之CAR)之核酸轉導的細胞例如藉由本文所描述之方法擴增。在一個實施例中，細胞在培養物中擴增數小時(例如約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小時)至約14天(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14)之時段。在一個實施例中，細胞擴增4至9天之時段。在一個實施例中，細胞擴增8天或更少(例如7、6或5天)之時段。在一個實施例中，細胞(例如本文所描述之CAR細胞)在培養物中擴增5天，且所得細胞比在培養物中在相同培養條件下擴增9天的相同細胞更強效。效力可例如藉由各種T細胞功能，例如增殖、靶細胞殺死、細胞介素產生、活化、遷移或其組合來界定。在一個實施例中，與在培養物中在相同培養條件下擴增9天的相同細胞相比，擴增5天的細胞(例如本文所描述之CAR細胞)在抗原刺激後展示細胞倍增之至少一、二、三或四倍增加。在一個實施例中，細胞(例如本文所描述之表現CAR之細胞)在培養物中擴增5天，且所得細胞展現與在培養物中在相同培養條件下擴增9天的相同細胞相比，更高之促炎性細胞介素產生，例如IFN-γ及/或GM-CSF水準。在一個實施例中，與在培養物中在相同培養條件下擴增9天的相同細胞相比，擴增5天的細胞(例如本文所描述之CAR細胞)展示以pg/ml為單位之促炎性細胞介素產生(例如IFN-γ及/或GM-CSF水準)之至少一、二、三、四、五、十倍或更多增加。
在本發明之一個態樣中，混合物可培養數小時(約3小時)至約14天或其間任何小時整數值。在一個態樣中，混合物可培養21天。在本發明之一個態樣中，珠粒與T細胞一起培養約八天。在一個態樣中，珠粒與T細胞一起培養2-3天。亦可能需要若干刺激循環使得T細胞培養時間可為60天或更久。適於T細胞培養之條件包括可含有增殖及生存所必需因子之適當培養基(例如最低必需培養基或RPMI培養基1640或X-vivo 15 (Lonza))，該等因子包括血清(例如胎牛血清或人類血清)、介白素-2 (IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ及TNF-α或為熟練技術人員已知的用於細胞生長之任何其他添加劑。用於細胞生長之其他添加劑包括(但不限於)界面活性劑、人血漿蛋白粉及還原劑，諸如N-乙醯基-半胱胺酸及2-巰基乙醇。培養基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15及X-Vivo 20、Optimizer，添加有胺基酸、丙酮酸鈉及維生素，無血清或補充有適量血清(或血漿)或限定激素組，及/或足以使T細胞生長及擴增之量的細胞介素。抗生素(例如，青黴素及鏈黴素)僅包括於實驗培養物中，而不在待輸注至個體之細胞培養物中。靶細胞維持在為載體生長所必需之條件下，該等條件例如適當溫度(例如37℃)及氛圍(例如空氣加5% CO2 )。
在一個實施例中，細胞在包括一或多種介白素之適當培養基(例如本文所描述之培養基)中擴增，其經14天擴增時段導致細胞之至少200倍(例如200倍、250倍、300倍、350倍)增加，例如如藉由本文所描述之方法(諸如流式細胞量測術)所量測。在一個實施例中，細胞在IL-15及/或IL-7 (例如IL-15及IL-7)存在下擴增。
在實施例中，本文所描述方法，例如CAR表現細胞製造方法包含自細胞群體例如使用抗CD25抗體或其片段或CD25結合配體IL-2移除T調節細胞，例如CD25+ T細胞。本文描述自細胞群體移除T調節細胞，例如CD25+ T細胞之方法。在實施例中，該等方法，例如製造方法進一步包含使細胞群體(例如T調節細胞(諸如CD25+ T細胞)已耗盡之細胞群體；或先前已接觸抗CD25抗體、其片段或CD25結合配體之細胞群體)與IL-15及/或IL-7接觸。舉例而言，細胞群體(例如先前已接觸抗CD25抗體、其片段或CD25結合配體之細胞群體)在IL-15及/或IL-7存在下擴增。
在一些實施例中，在例如離體製造CAR表現細胞期間使本文所描述之CAR表現細胞與包含介白素-15 (IL-15)多肽、介白素-15受體α (IL-15Ra)多肽或IL-15多肽及IL-15Ra多肽兩者之組合(例如hetIL-15)的組合物接觸。在實施例中，在例如離體製造CAR表現細胞期間使本文所描述之CAR表現細胞與包含IL-15多肽之組合物接觸。在實施例中，在例如離體製造CAR表現細胞期間使本文所描述之CAR表現細胞與包含IL-15多肽與IL-15 Ra多肽兩者之組合的組合物接觸。在實施例中，在例如離體製造CAR表現細胞期間使本文所描述之CAR表現細胞與包含hetIL-15之組合物接觸。
在一個實施例中，在離體擴增期間使本文所描述之CAR表現細胞與包含hetIL-15之組合物接觸。在一實施例中，在離體擴增期間使本文所描述之CAR表現細胞與包含IL-15多肽之組合物接觸。在一實施例中，在離體擴增期間使本文所描述之CAR表現細胞與包含IL-15多肽及IL-15Ra多肽之組合物接觸。在一個實施例中，接觸使得淋巴細胞亞群，例如CD8+ T細胞存活及增殖。
曝露於不同刺激時間之T細胞可展現不同特徵。舉例而言，典型血液或經血球分離術之周邊血液單核細胞產物中的輔助T細胞群體(TH，CD4+)大於細胞毒性或抑制T細胞群體。藉由刺激CD3及CD28受體離體擴增T細胞產生在約第8-9天之前主要由TH細胞組成的T細胞群體，而在約第8-9天之後，T細胞群體包含愈來愈大之TC細胞群體。因此，視治療目的而定，向個體輸注主要包含TH細胞之T細胞群體可能有利。類似地，若已分離TC細胞之抗原特異性亞型，則在更大程度上擴增此亞型可為有益的。
此外，除CD4及CD8標記之外，其他表型標記物顯著變化，但大部分在細胞擴增過程之過程期間可再現。因此，此類再現性使能夠針對特定目的調整活化T細胞產物。
在構築CAR後，可利用各種分析來評估分子在適當活體外及動物模型中的活性，諸如(但不限於)抗原刺激之後擴增T細胞、在缺乏再刺激的情況下維持T細胞擴增的能力，及抗癌活性。評估CAR作用的分析在下文進一步詳細描述。
初級T細胞中CAR表現之西方墨點分析可用於偵測單體及二聚體之存在。參見例如Milone等人, Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)。極簡言之，表現CAR之T細胞(CD4+ 及CD8+ T細胞之1:1混合物)活體外擴增超過10天，隨後溶解且在還原條件下SDS-PAGE。藉由西方墨點法使用TCR-ζ鏈之抗體偵測含有全長TCR-ζ細胞質結構域及內源性TCR-ζ鏈之CAR。在非還原條件下使用相同T細胞亞群用於SDS-PAGE分析以允許評估共價二聚體形成。
可藉由流式細胞量測術量測CAR+ T細胞在抗原刺激後之活體外擴增。舉例而言，CD4+ 及CD8+ T細胞之混合物用αCD3/αCD28 aAPC刺激，隨後在待分析之啟動子控制下用表現GFP之慢病毒載體轉導。例示性啟動子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C或磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子。在培養第6天藉由流式細胞量測術評估CD4+ 及/或CD8+ T細胞亞群之GFP螢光。參見例如Milone等人, Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)。或者，在第0天用αCD3/αCD28塗佈之磁性珠粒刺激CD4+ 及CD8+ T細胞之混合物，且在第1天使用表現CAR之雙順反子慢病毒載體以及eGFP使用2A核糖體跳躍序列經CAR轉導。在洗滌之後，用抗原表現細胞(諸如多發性骨髓瘤細胞株或表現抗原之K562)再刺激培養物。每隔一天向培養物添加100 IU/ml外源性IL-2。藉由流式細胞量測術使用基於珠粒之計數列舉GFP+ T細胞。參見例如Milone等人, Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)。
亦可量測在無再刺激存在下的持續CAR+ T細胞擴增。參見例如Milone等人, Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)。簡言之，在第0天用經αCD3/αCD28塗佈之磁性珠粒刺激且在第1天經指定CAR轉導之後，在培養第8天使用Coulter Multisizer III粒子計數器、Nexcelom Cellometer Vision或Millipore Scepter量測平均T細胞體積(fl)。
動物模型亦可用於量測CART活性。舉例而言，可使用利用人類抗原特異性CAR+ T細胞治療免疫缺乏小鼠之原發性人類多發性骨髓瘤的異種移植模型。參見例如Milone等人, Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)。極簡言之，在建立MM之後，將小鼠關於處理組進行隨機化。可將不同數目之CART細胞注射至負載MM之免疫缺乏小鼠。以每週一次之時間間隔，評估動物之疾病進展及腫瘤負荷。使用對數等級檢驗(log-rank test)比較該等組之存活曲線。此外，亦可分析免疫缺乏小鼠中T細胞注射後4週的絕對周邊血液CD4+ 及CD8+ T細胞數。向小鼠注射多發性骨髓瘤細胞且3週後注射T細胞，該等T細胞經工程改造以表現CAR，例如藉由編碼連接於eGFP之CAR的雙順反子慢病毒載體。藉由在注射前與模擬轉導細胞混合，將T細胞相對於45-50%輸入GFP+ T細胞標準化，且藉由流式細胞量測術證實。以1週之時間間隔評估動物之白血病。使用對數等級檢驗比較CAR+ T細胞組之存活曲線。
細胞增殖及細胞介素產生之評估先前已描述於例如Milone等人, Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)。簡言之，在微量滴定盤中藉由以下方式對CAR介導之增殖進行評估：混合經洗滌T細胞與表現該抗原之K562細胞或其他抗原表現骨髓瘤細胞，在使用之前用γ輻射照射。抗CD3 (純系OKT3)及抗CD28 (純系9.3)單株抗體添加至含KT32-BBL細胞之培養物中充當陽性對照用於刺激T細胞增殖，因為此等信號支持長期CD8+ T細胞離體擴增。使用CountBright™螢光珠粒(Invitrogen, Carlsbad, CA)及流式細胞量測術，如製造商所述對在培養物中的T細胞計數。藉由GFP表現使用以eGFP-2A連接的CAR表現慢病毒載體工程改造之T細胞鑑別CAR+ T細胞。對於不表現GFP之CAR+ T細胞，使用生物素標記之重組抗原蛋白及二級抗生素蛋白-PE結合物偵測CAR+ T細胞。T細胞上之CD4+ 及CD8+ 表現亦同時用特異性單株抗體(BD Biosciences)偵測。根據製造商說明使用人類TH1/TH2細胞介素細胞學珠粒陣列套組(BD Biosciences, San Diego, CA)對再刺激24小時後收集的上清液進行細胞介素量測。使用FACScalibur流式細胞儀評定螢光，且根據製造商說明分析資料。
可藉由標準51Cr釋出分析來評估細胞毒性。參見例如Milone等人, Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)。簡言之，靶細胞(例如表現該抗原之K562株及初級多發性骨髓瘤細胞)在37℃、在頻繁攪拌下用51Cr (NaCrO4，New England Nuclear, Boston, MA)負載2小時，用完全RPMI洗滌兩次且塗佈於微量滴定盤中。在各孔中，在完全RPMI中，混合不同效應細胞:靶細胞(E:T)比率之效應T細胞與靶細胞。亦製備僅含有培養基(自發釋出，SR)或1% triton-X 100清潔劑溶液(總釋出，TR)之額外孔。在37℃下培育4小時後，自各孔收集清液層。隨後使用γ粒子計數器(Packard Instrument Co., Waltham, MA)量測釋出之51Cr。各條件至少一式三份進行，且使用下式計算溶解百分比：溶解% = (ER - SR) / (TR - SR)，其中ER表示各實驗條件釋出之平均51Cr。或者，亦可使用Bright-Glo™螢光素酶分析來評估細胞毒性。
成像技術可用於評估攜有腫瘤之動物模型中CAR之特定運輸及增殖。此類分析已描述於例如Barrett等人, Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011)中。簡言之，向NOD/SCID/γc-/- (NSG)或其他免疫缺乏小鼠IV注射多發性骨髓瘤細胞，隨後7天後，在用CAR構築體電穿孔之後4小時注射CART細胞。將T細胞用慢病毒構築體穩定轉染以表現螢火蟲螢光素酶且針對生物發光，使小鼠成像。或者，多發性骨髓瘤異種移植模型中單次注射CAR+ T細胞之治療功效及特異性可如下量測：將NSG小鼠用經轉導以穩定表現螢火蟲螢光素酶之多發性骨髓瘤細胞注射，隨後數天後單次尾靜脈注射經CAR構築體電穿孔之T細胞。在注射後各時間點使動物成像。舉例而言，可產生第5天(治療前2天)及第8天(CAR+ PBL後24小時)代表性小鼠中螢火蟲螢光素酶陽性腫瘤之光子密度熱圖。
可替代地或與本文所揭示之方法組合地，揭示用於以下中之一或多者的方法及組合物：偵測及/或定量CAR表現細胞(例如活體外或活體內(例如臨床監測))；免疫細胞擴增及/或活化；及/或CAR特異性選擇，其包括使用CAR配體。在一個例示性實施例中，CAR配體為結合至CAR分子，例如結合至CAR之胞外抗原結合結構域之抗體(例如結合至抗原結合結構域之抗體，例如抗個體基因型抗體；或結合至胞外結合結構域之恆定區之抗體)。在其他實施例中，CAR配體為CAR抗原分子(例如如本文所述之CAR抗原分子)。
在一個態樣中，揭示一種用於偵測及/或定量CAR表現細胞之方法。舉例而言，CAR配體可用於在活體外或活體內偵測及/或定量CAR表現細胞(例如患者中CAR表現細胞之臨床監測，或患者給藥)。該方法包括：
提供CAR配體(視情況，標記之CAR配體，例如包括標籤、珠粒、放射性或螢光標記之CAR配體)；
獲取CAR表現細胞(例如獲取含有CAR表現細胞之樣品，諸如製造樣品或臨床樣品)；
使CAR表現細胞與CAR配體在發生結合之條件下接觸，藉此偵測存在之CAR表現細胞之水準(例如量)。可使用諸如FACS、ELISA及其類似技術之標準技術，偵測CAR表現細胞與CAR配體之結合。
在另一態樣中，揭示一種擴增及/或活化細胞(例如免疫效應細胞)之方法。該方法包括：
提供CAR表現細胞(例如第一CAR表現細胞或短暫表現CAR之細胞)；
使該CAR表現細胞與CAR配體(例如如本文所描述之CAR配體)在發生免疫細胞擴增及/或增殖之條件下接觸，藉此產生經活化及/或擴增之細胞群體。
在某些實施例中，CAR配體存在於(例如固定或連接至)受質(例如非天然存在之受質)上。在一些實施例中，受質為非細胞受質。非細胞受質可為選自例如盤(例如微量滴定盤)、膜(例如硝化纖維素膜)、基質、晶片或珠粒之固體載體。在實施例中，CAR配體存在於受質中(例如受質表面上)。CAR配體可固定、連接或共價或非共價締合(例如交聯)於受質。在一個實施例中，CAR配體連接(例如共價連接)至珠粒。在前述實施例中，免疫細胞群體可在活體外或離體擴增。該方法可進一步包括在CAR分子配體存在下培養免疫細胞群體，例如使用本文所述之任一方法培養。
在其他實施例中，擴增及/或活化細胞之方法進一步包含添加第二刺激分子，例如CD28。舉例而言，CAR配體及第二刺激分子可固定至受質，例如一或多個珠粒，藉此提供增加之細胞擴增及/或活化。
在又一態樣中，提供一種選擇或增濃CAR表現細胞之方法。該方法包括使CAR表現細胞與如本文所述之CAR配體接觸；以及基於CAR配體之結合選擇細胞。
在又其他實施例中，提供一種耗盡、減少及/或殺死CAR表現細胞之方法。該方法包括使CAR表現細胞與如本文所述之CAR配體接觸；以及基於CAR配體之結合靶向細胞，由此減少CAR表現細胞之數目及/或殺死CAR表現細胞。在一個實施例中，CAR配體偶合至毒性劑(例如毒素或細胞消融藥物)。在另一實施例中，抗個體基因型抗體可引起效應細胞活性，例如ADCC或ADC活性。
可用於本文所揭示之方法之例示性抗CAR抗體描述於例如WO 2014/190273及Jena等人,「Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials」, PLOS 2013年3月 8:3 e57838中，其內容以引用的方式併入。在一個實施例中，抗個體基因型抗體分子識別抗CD19抗體分子，例如抗CD19 scFv。舉例而言，抗個體基因型抗體分子可與Jena等人, PLOS 2013年3月 8:3 e57838中描述的CD19特異性CAR mAb純系第136.20.1號競爭結合；可具有與CD19特異性CAR mAb純系第136.20.1號相同之CDR (例如VH CDR1、VH CDR2、CH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3中之一或多者，例如全部，使用Kabat定義、Chothia定義或Kabat及Chothia定義之組合)；可具有如CD19特異性CAR mAb純系第136.20.1號之一或多個(例如2個)可變區，或可包含CD19特異性CAR mAb純系第136.20.1號。在一些實施例中，根據Jena等人中所描述之方法製得抗個體基因型抗體。在另一實施例中，抗個體基因型抗體分子為WO 2014/190273中所述之抗個體基因型抗體分子。在一些實施例中，抗個體基因型抗體分子具有與諸如136.20.1的WO 2014/190273之抗體分子相同之CDR (例如VH CDR1、VH CDR2、CH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3中之一或多者，例如全部)；可具有WO 2014/190273之抗體分子之一或多個(例如2個)可變區，或可包含諸如136.20.1的WO 2014/190273之抗體分子。在其他實施例中，抗CAR抗體結合至CAR分子之胞外結合結構域之恆定區，例如如WO 2014/190273中所描述。在一些實施例中，抗CAR抗體結合至CAR分子之胞外結合結構域之恆定區，例如重鏈恆定區(例如CH2-CH3鉸鏈區)或輕鏈恆定區。舉例而言，在一些實施例中，抗CAR抗體與WO 2014/190273中描述之2D3單株抗體競爭結合，具有與2D3相同之CDR (例如VH CDR1、VH CDR2、CH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3中之一或多者，例如全部)，或具有2D3之一或多個(例如2個)可變區，或包含如WO 2014/190273中所描述之2D3。
在一些態樣及實施例中，本文之組合物及方法針對特定T細胞亞群最佳化，例如如2014年7月31日申請之美國第62/031,699號中所描述，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，最佳化T細胞亞群相較於對照T細胞(例如表現相同構築體的不同類型(例如CD8+ 或CD4+ )之T細胞)展現增強之續存。
在一些實施例中，CD4+ T細胞包含本文所描述之CAR，該CAR包含適合於CD4+ T細胞(例如針對其最佳化，例如導致其續存增強)之胞內信號傳導結構域，例如ICOS結構域。在一些實施例中，CD8+ T細胞包含本文所描述之CAR，該CAR包含適合於CD8+ T細胞(例如針對其最佳化，例如導致其續存增強)之胞內信號傳導結構域，例如4-1BB結構域、CD28結構域或除ICOS結構域以外之另一共刺激結構域。
在一態樣中，本文描述一種治療個體，例如患有癌症之個體的方法。該方法包括向該個體投與有效量之以下各者：
1) 包含CAR (CARCD4+ )之CD4+ T細胞，
該CAR包含：
抗原結合結構域，例如本文所述之抗原結合結構域；
跨膜結構域；及
胞內信號傳導結構域，例如第一共刺激結構域，例如ICOS結構域；以及
2) 包含CAR (CARCD8 + )之CD8+ T細胞，該CAR包含：
抗原結合結構域，例如本文所述之抗原結合結構域；
跨膜結構域；及
胞內信號傳導結構域，例如第二共刺激結構域，例如4-1BB結構域、CD28結構域或除ICOS結構域以外之另一共刺激結構域；
其中CARCD4+ 與CARCD8+ 彼此不同。
視情況，該方法進一步包括投與：
3) 包含CAR (第二CARCD8 + )之第二CD8+ T細胞，該CAR包含：
抗原結合結構域，例如本文所述之抗原結合結構域；
跨膜結構域；及
胞內信號傳導結構域，其中第二CARCD8 + 包含不存在於CARCD8 + 上之胞內信號傳導結構域，例如共刺激信號傳導結構域，且視情況不包含ICOS信號傳導結構域。
其他分析，包括此項技術中已知的分析，亦可用於評估本發明之CAR構築體。
治療應用 使用生物標記物評估CAR有效性、個體適合性或樣品適合性之方法 在另一態樣中，本發明提供一種評估或監測CAR表現細胞療法在個體(例如患有癌症之個體)中之有效性的方法。該方法包括獲取CAR療法之有效性、個體適合性或樣品適合性之值，其中該值指示CAR表現細胞療法之有效性或適合性。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，在接受CAR表現細胞療法之前、期間或之後評估個體。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，有反應者(例如完全有反應者)具有或鑑別為具有與無反應者相比，GZMK、PPF1BP2或原始T細胞中一者、兩者或更多者(全部)更大之水準或活性。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，無反應者具有或鑑別為具有與有反應者相比，IL22、IL-2RA、IL-21、IRF8、IL8、CCL17、CCL22、效應T細胞或調節T細胞中一者、兩者、三者、四者、五者、六者、七者或更多者(例如全部)更大之水準或活性。
在一實施例中，復發者為如下患者，其具有或鑑別為具有與非復發者相比，增加的以下基因中之一或多者(例如2、3、4者或全部)之表現量：MIR199A1、MIR1203、uc021ovp、ITM2C及HLA-DQB1，與非復發者相比，減少的以下基因中之一或多者(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11者或全部)之表現量：PPIAL4D、TTTY10、TXLNG2P、MIR4650-1、KDM5D、USP9Y、PRKY、RPS4Y2、RPS4Y1、NCRNA00185、SULT1E1及EIF1AY。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，無反應者具有或鑑別為具有更大百分比之免疫細胞耗盡標記物，例如一、二種或更多種免疫檢查點抑制劑(例如PD-1、PD-L1、TIM-3及/或LAG-3)。在一個實施例中，無反應者具有或鑑別為具有與來自有反應者之表現PD-1或LAG-3之免疫效應細胞之百分比相比，更大百分比之表現PD-1、PD-L1或LAG-3之免疫效應細胞(例如CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞)(例如CAR表現CD4+細胞及/或CD8+ T細胞)。
在一個實施例中，無反應者具有或鑑別為具有更大百分比之具有耗盡表型之免疫細胞，例如共表現至少兩種耗盡標記物，例如共表現PD-1、PD-L1及/或TIM-3之免疫細胞。在其他實施例中，無反應者具有或鑑別為具有更大百分比之具有耗盡表型之免疫細胞，例如共表現至少兩種耗盡標記物，例如共表現PD-1及LAG-3之免疫細胞。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，無反應者具有或鑑別為具有與CAR表現細胞療法之有反應者(例如完全有反應者)相比，CAR表現細胞群體中更大百分比之PD-1/PD-L1+/LAG-3+細胞。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，部分有反應者具有或鑑別為具有與有反應者相比，CAR表現細胞群體中更高百分比之PD-1/PD-L1+/LAG-3+細胞。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，無反應者具有或鑑別為具有CAR表現細胞群體中之PD1/PD-L1+ CAR+之耗盡表型及LAG3之共表現。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，無反應者具有或鑑別為具有與有反應者(例如完全有反應者)相比，CAR表現細胞群體中更大百分比之PD-1/PD-L1+/TIM-3+細胞。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，部分有反應者具有或鑑別為具有與有反應者相比，CAR表現細胞群體中更高百分比之PD-1/PD-L1+/TIM-3+細胞。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，血球分離術樣品中之CD8+ CD27+ CD45RO-T細胞之存在為個體對CAR表現細胞療法之反應之正性預測因子。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，血球分離術樣品中高百分比之PD1+ CAR+及LAG3+或TIM3+ T細胞為個體對CAR表現細胞療法之反應之不良預測因子。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，有反應者(例如完全或部分有反應者)具有以下概況中之一者、兩者、三者或更多者(或全部)：
(i)具有與參考值，例如CD27+免疫效應細胞之無反應者數目相比，更大數目之CD27+免疫效應細胞；
(ii)具有與參考值，例如CD8+ T細胞之無反應者數目相比，更大數目之CD8+ T細胞；
(iii)具有與參考值，例如表現一或多種檢查點抑制劑之細胞之無反應者數目相比，更低數目之表現一或多種檢查點抑制劑，例如選自PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3或KLRG-1之檢查點抑制劑或組合之免疫細胞；或
(iv)具有與參考值，例如靜止TEFF 細胞、靜止TREG 細胞、原始CD4細胞、非刺激性記憶細胞或早期記憶T細胞之無反應者數目相比，更大數目之靜止TEFF 細胞、靜止TREG 細胞、原始CD4細胞、非刺激性記憶細胞或早期記憶T細胞中一者、兩者、三者、四者或更多者(全部)或其組合。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，(vi)之細胞介素水準或活性選自細胞介素CCL20/MIP3a、IL17A、IL6、GM-CSF、IFN-γ、IL10、IL13、IL2、IL21、IL4、IL5、IL9或TNFα中一者、兩者、三者、四者、五者、六者、七者、八者或更多者(或全部)或其組合。細胞介素可選自IL-17a、CCL20、IL2、IL6或TNFa中之一者、兩者、三者、四者或更多者(全部)。在一個實施例中，選自IL-17A及CCL20中之一或兩者的細胞介素之水準或活性增加指示反應增加或復發減少。
在實施例中，藉由本文之方法鑑別之有反應者、無反應者、復發者或非復發者可根據臨床準則進一步評估。舉例而言，完全有反應者具有或鑑別為對治療展現完全反應(例如完全緩解)的患有疾病(例如癌症)之個體。如本文所描述，可例如使用NCCN Guidelines® 或Cheson等人, J Clin Oncol 17:1244 (1999)及Cheson等人, 「Revised Response Criteria for Malignant Lymphoma」, J Clin Oncol 25:579-586 (2007) (均以全文引用的方式併入本文中)鑑別完全反應。部分有反應者具有或鑑別為對治療展現部分反應(例如部分緩解)的患有疾病(例如癌症)之個體。如本文所描述，可例如使用NCCN Guidelines®或Cheson準則鑑別部分反應。無反應者具有或鑑別為對治療不展現反應的患有疾病(例如癌症)之個體，例如患者具有穩定疾病或進行性疾病。如本文所描述，可例如使用NCCN Guidelines®或Cheson準則鑑別無反應者。
替代性地或與本文所揭示之方法組合，因應該值，執行以下中之一者、兩者、三者、四者或更多者：
例如向有反應者或非復發者投與CAR表現細胞療法；
投與改變劑量之CAR表現細胞療法；
改變CAR表現細胞療法之進度或時程；
例如向無反應者或部分有反應者投與另一藥劑以及CAR表現細胞療法，例如檢查點抑制劑，例如本文所描述之檢查點抑制劑；
在用CAR表現細胞療法治療之前向無反應者或部分有反應者投與增加個體中較年輕T細胞之數目的療法；
修改CAR表現細胞療法之製造過程，例如在引入編碼CAR之核酸之前增濃較年輕T細胞，或例如針對鑑別為無反應者或部分有反應者之個體提高轉導效率；
例如針對無反應者或部分有反應者或復發者，投與替代性療法；或
若個體為或鑑別為無反應者或復發者，則例如藉由CD25耗盡、投與環磷醯胺、抗GITR抗體中之一或多者或其組合，減少TREG 細胞群體及/或TREG 基因簽名。
在某些實施例中，個體經抗GITR抗體預治療。在某一實施例中，個體在輸注或再輸注之前經抗GITR抗體治療。
組合療法 如本文所描述之與RNA分子組合的CAR表現細胞可與其他已知藥劑及療法組合使用。如本文所用，「組合」投與意謂在個體受病症折磨之過程期間向個體遞送兩種(或更多種)不同治療，例如在個體已被診斷患有病症之後及在病症已治癒或消除或出於其他原因治療停止之前，遞送兩種或更多種治療。在一些實施例中，一種治療之遞送在第二治療之遞送開始時仍存在，以使得就投與而言存在重疊。此在本文中有時稱為「同時」或「並行遞送」。在其他實施例中，一種治療之遞送在另一治療之遞送開始之前結束。在任一情況之一些實施例中，治療由於組合投與而更有效。舉例而言，與第二治療在不存在第一治療下投與時所可見相比，第二治療更有效，例如等效作用在更少之第二治療下可見，或第二治療更大程度上減輕症狀；或第一治療可見類似情況。在一些實施例中，遞送使得症狀減輕或與病症相關之其他參數大於一種治療在不存在另一治療下遞送時所觀測到的。兩種治療之作用可部分相加，完全相加或大於相加。遞送可使得所遞送之第一治療之作用在遞送第二治療時仍可偵測。
如本文所描述之與RNA分子組合的CAR表現細胞及至少一種額外治療劑可同時，於相同或分別的組合物中，或依序投與。對於依序投與，首先可投與如本文所描述之與RNA分子組合的CAR表現細胞，且其次可投與額外藥劑，或投與次序可顛倒。
CAR療法及/或其他治療劑、程序或儀器治療在病症活躍期期間或在疾病緩解或不太活躍期期間投與。CAR療法可在其他治療之前、與治療並行、治療後或在病症緩解期間投與。
當組合投與時，CAR療法及額外藥劑(例如第二或第三藥劑)或全部可以與各藥劑例如以單一療法形式獨立使用之量或劑量相比更高、更低或相同的量或劑量投與。在某些實施例中，CAR療法、額外藥劑(例如第二或第三藥劑)或全部之投與量或劑量與各藥劑例如以單一療法形式獨立使用之量或劑量相比更低(例如至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)。在其他實施例中，引起所需作用(例如癌症治療)的CAR療法、額外藥劑(例如第二或第三藥劑)或全部之量或劑量與各藥劑例如以單一療法形式獨立使用為達成相同治療作用所需之量或劑量相比更低(例如低至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)。
在一些實施例中，本發明揭示一種組合療法，其包括本文所描述之CAR表現細胞療法、本文所描述之RNA分子(例如外源RNA分子)(或編碼RNA分子之核酸分子(例如外源核酸分子))及另一治療劑。
PD-1 抑制劑 在一些實施例中，另一治療劑為PD-1抑制劑。在一些實施例中，PD-1抑制劑係選自PDR001 (Novartis)、納武單抗(Nivolumab) (Bristol-Myers Squibb)、派姆單抗(Pembrolizumab) (Merck & Co)、皮立珠單抗(Pidilizumab) (CureTech)、MEDI0680 (Medimmune)、REGN2810 (Regeneron)、TSR-042 (Tesaro)、PF-06801591 (Pfizer)、BGB-A317 (Beigene)、BGB-108 (Beigene)、INCSHR1210 (Incyte)或AMP-224 (Amplimmune)。
在一個實施例中，PD-1抑制劑為抗PD-1抗體分子。在一個實施例中，PD-1抑制劑為如2015年7月30日公開之題為「Antibody Molecules to PD-1 and Uses Thereof」之US 2015/0210769中所述之抗PD-1抗體分子，該案以全文引用之方式併入。在一個實施例中，抗PD-1抗體分子包含US 2015/0210769中揭示的BAP049-純系-E或BAP049-純系-B之CDR、可變區、重鏈及/或輕鏈。本文所描述之抗體分子可藉由US 2015/0210769中所述之載體、宿主細胞及方法製得，該文獻以全文引用之方式併入。
在一個實施例中，抗PD-1抗體分子為納武單抗(Bristol-Myers Squibb)，亦稱為MDX-1106、MDX-1106-04、ONO-4538、BMS-936558或OPDIVO®。納武單抗(純系5C4)及其他抗PD-1抗體揭示於US 8,008,449及WO 2006/121168中，該等文獻以全文引用之方式併入。在一個實施例中，抗PD-1抗體分子為派姆單抗(Merck & Co)，亦稱為拉立珠單抗(Lambrolizumab)、MK-3475、MK03475、SCH-900475或KEYTRUDA®。派姆單抗及其他抗PD-1抗體揭示於Hamid, O.等人(2013)New England Journal of Medicine 369 (2): 134-44、US 8,354,509及WO 2009/114335中，該等文獻以全文引用之方式併入。在一個實施例中，抗PD-1抗體分子為皮立珠單抗(CureTech)，亦稱為CT-011。皮立珠單抗及其他抗PD-1抗體揭示於Rosenblatt, J.等人(2011)J Immunotherapy 34(5): 409-18、US 7,695,715、US 7,332,582及US 8,686,119中，該等文獻以全文引用之方式併入。在一個實施例中，抗PD-1抗體分子為MEDI0680 (Medimmune)，亦稱為AMP-514。MEDI0680及其他抗PD-1抗體揭示於US 9,205,148及WO 2012/145493中，該等文獻以全文引用之方式併入。在一個實施例中，抗PD-1抗體分子為REGN2810 (Regeneron)。在一個實施例中，抗PD-1抗體分子為PF-06801591 (Pfizer)。在一個實施例中，抗PD-1抗體分子為BGB-A317或BGB-108 (Beigene)。在一個實施例中，抗PD-1抗體分子為INCSHR1210 (Incyte)，亦稱為INCSHR01210或SHR-1210。在一個實施例中，抗PD-1抗體分子為TSR-042 (Tesaro)，亦稱為ANB011。
其他已知抗PD-1抗體分子包括例如以下文獻中所描述之抗體分子：WO 2015/112800、WO 2016/092419、WO 2015/085847、WO 2014/179664、WO 2014/194302、WO 2014/209804、WO 2015/200119、US 8,735,553、US 7,488,802、US 8,927,697、US 8,993,731及US 9,102,727，該等文獻以全文引用之方式併入。
在一個實施例中，PD-1抑制劑為抑制PD-1信號傳導路徑之肽，例如如US 8,907,053中所描述，該文獻以全文引用之方式併入。在一個實施例中，PD-1抑制劑為與恆定區(例如免疫球蛋白序列之Fc區)融合之免疫黏附素(例如包含PD-L1或PD-L2的胞外或PD-1結合部分之免疫黏附素)。在一個實施例中，PD-1抑制劑為AMP-224 (B7-DCIg (Amplimmune)，例如揭示於WO 2010/027827及WO 2011/066342中，該等文獻以全文引用之方式併入)。
PD-L1 抑制劑 在一些實施例中，另一治療劑為PD-L1抑制劑。在一些實施例中，PD-L1抑制劑係選自FAZ053 (Novartis)、阿特珠單抗(Atezolizumab) (Genentech/Roche)、阿維魯單抗(Avelumab) (Merck Serono及Pfizer)、德瓦魯單抗(Durvalumab) (MedImmune/AstraZeneca)或BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb)。
在一個實施例中，PD-L1抑制劑為抗PD-L1抗體分子。在一個實施例中，PD-L1抑制劑為如2016年4月21日公開之題為「Antibody Molecules to PD-L1 and Uses Thereof」之US 2016/0108123中所揭示之抗PD-L1抗體分子，該文獻以全文引用之方式併入。在一個實施例中，抗PD-L1抗體分子包含US 2016/0108123中揭示的BAP058-純系O或BAP058-純系N之CDR、可變區、重鏈及/或輕鏈。
在一個實施例中，抗PD-L1抗體分子為阿特珠單抗(Genentech/Roche)，亦稱為MPDL3280A、RG7446、RO5541267、YW243.55.S70或TECENTRIQ™。阿特珠單抗及其他抗PD-L1抗體揭示於US 8,217,149中，該文獻以全文引用之方式併入。在一個實施例中，抗PD-L1抗體分子為阿維魯單抗(Merck Serono及Pfizer)，亦稱為MSB0010718C。阿維魯單抗及其他抗PD-L1抗體揭示於WO 2013/079174中，該文獻以全文引用之方式併入。在一個實施例中，抗PD-L1抗體分子為德瓦魯單抗(MedImmune/AstraZeneca)，亦稱為MEDI4736。德瓦魯單抗及其他抗PD-L1抗體揭示於US 8,779,108中，該文獻以全文引用之方式併入。在一個實施例中，抗PD-L1抗體分子為BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb)，亦稱為MDX-1105或12A4。BMS-936559及其他抗PD-L1抗體揭示於US 7,943,743及WO 2015/081158中，該等文獻以全文引用之方式併入。
其他已知抗PD-L1抗體包括例如以下文獻中所描述之抗體：WO 2015/181342、WO 2014/100079、WO 2016/000619、WO 2014/022758、WO 2014/055897、WO 2015/061668、WO 2013/079174、WO 2012/145493、WO 2015/112805、WO 2015/109124、WO 2015/195163、US 8,168,179、US 8,552,154、US 8,460,927及US 9,175,082，該等文獻以全文引用之方式併入。
LAG-3 抑制劑 在一些實施例中，另一治療劑為LAG-3抑制劑。在一些實施例中，LAG-3抑制劑係選自LAG525 (Novartis)、BMS-986016 (Bristol-Myers Squibb)或TSR-033 (Tesaro)。
在一個實施例中，LAG-3抑制劑為抗LAG-3抗體分子。在一個實施例中，LAG-3抑制劑為如2015年9月17日公開之題為「Antibody Molecules to LAG-3 and Uses Thereof」之US 2015/0259420中所揭示之抗LAG-3抗體分子，該文獻以全文引用之方式併入。在一個實施例中，抗LAG-3抗體分子包含US 2015/0259420中揭示的BAP050-純系I或BAP050-純系J之CDR、可變區、重鏈及/或輕鏈。
在一個實施例中，抗LAG-3抗體分子為BMS-986016 (Bristol-Myers Squibb)，亦稱為BMS986016。BMS-986016及其他抗LAG-3抗體揭示於WO 2015/116539及US 9,505,839中，該等文獻以全文引用之方式併入。在一個實施例中，抗LAG-3抗體分子為TSR-033 (Tesaro)。在一個實施例中，抗LAG-3抗體分子為IMP731或GSK2831781 (GSK及Prima BioMed)。IMP731及其他抗LAG-3抗體揭示於WO 2008/132601及US 9,244,059中，該等文獻以全文引用之方式併入。在一個實施例中，抗LAG-3抗體分子為IMP761 (Prima BioMed)。
其他已知抗LAG-3抗體包括例如以下文獻中所描述之抗體：WO 2008/132601、WO 2010/019570、WO 2014/140180、WO 2015/116539、WO 2015/200119、WO 2016/028672、US 9,244,059、US 9,505,839，該等文獻以全文引用之方式併入。
在一個實施例中，抗LAG-3抑制劑為可溶性LAG-3蛋白，例如IMP321 (Prima BioMed)，例如如WO 2009/044273中所揭示，該文獻以全文引用之方式併入。
TIM-3 抑制劑 在一些實施例中，另一治療劑為TIM-3抑制劑。在一些實施例中，TIM-3抑制劑為MGB453 (Novartis)或TSR-022 (Tesaro)。
在一個實施例中，TIM-3抑制劑為抗TIM-3抗體分子。在一個實施例中，TIM-3抑制劑為如2015年8月6日公開之題為「Antibody Molecules to TIM-3 and Uses Thereof」之US 2015/0218274中所揭示之抗TIM-3抗體分子，該文獻以全文引用之方式併入。在一個實施例中，抗TIM-3抗體分子包含US 2015/0218274中揭示的ABTIM3-hum11或ABTIM3-hum03之CDR、可變區、重鏈及/或輕鏈。
在一個實施例中，抗TIM-3抗體分子為TSR-022 (AnaptysBio/Tesaro)。在一個實施例中，抗TIM-3抗體分子包含APE5137或APE5121之CDR序列(或全部CDR序列一起)、重鏈或輕鏈可變區序列、或重鏈或輕鏈序列中之一或多者。APE5137、APE5121及其他抗TIM-3抗體揭示於WO 2016/161270中，該文獻以全文引用之方式併入。在一個實施例中，抗TIM-3抗體分子為抗體純系F38-2E2。
其他已知抗TIM-3抗體包括例如以下文獻中所描述之抗體：WO 2016/111947、WO 2016/071448、WO 2016/144803、US 8,552,156、US 8,841,418及US 9,163,087，該等文獻以全文引用之方式併入。
前 - M2 巨噬細胞分子之抑制劑 在一些實施例中，另一治療劑為前-M2巨噬細胞分子之抑制劑。已知具有M2表型之巨噬細胞在抑制T細胞功能(包括細胞毒性功能)中起一定作用。已知某些細胞介素(諸如IL-13、IL-4、IL-10、CSF-1、TGF-β及GM-CSF)可例如(在IL-13及/或IL-4之情況下)藉由與表現於巨噬細胞上之IL-13Rα1鏈及/或IL-4Rα鏈相互作用將巨噬細胞極化為M2表型。阻斷該等分子之分子適用於本文中所描述之方法及組合物。前-M2巨噬細胞分子之例示性抑制劑包括IL-13之抑制劑、IL-4之抑制劑、IL-13Rα1之抑制劑及/或IL-4Rα之抑制劑，例如如本文所描述。
前-M2巨噬細胞分子之抑制劑包括例如小分子。可與本文揭示之CAR表現細胞及本文揭示之RNA分子一起投與的小分子抑制劑之一實例為紫檀芪(pterostilbene)(參見例如Huang等人, Oncotarget. 2016年6月28日; 7(26): 39363-39375，其以全文引用之方式併入本文中)。
前-M2巨噬細胞分子之抑制劑包括例如抗體分子，多肽，例如融合蛋白，或抑制性核酸，例如siRNA或shRNA，或結合MDSC或TAM上之一或多個表面抗原的CAR表現細胞。
在一個態樣中，前-M2巨噬細胞分子之抑制劑為抗IL-13抗體。該等抗體之產生可藉由此項技術中已知之方法進行。抗IL-13抗體之一實例包括例如來金珠單抗(lebrikizumab)(參見CAS編號953400-68-5)。抗IL-13抗體之另一實例為塔羅金單抗(tralokinumab) (CAS編號1044515-88-9)。抗IL-13抗體之另一實例為或包含GSK2434735之抗IL-13結合結構域。抗IL-13抗體之另一實例為QAX576 (參見例如Rothenberg等人,J. Allergy Clin. Immunol ., 2015, 135(2), 第500-507頁，其以全文引用之方式併入本文中)。
在另一態樣中，前-M2巨噬細胞分子之抑制劑為抗IL-4抗體或抗IL-4Rα抗體。該等抗體之產生可藉由此項技術中已知之方法進行。抗IL-4抗體之一實例包括例如GSK2434735之抗IL-4結合結構域。抗IL-4抗體之另一實例為例如度匹魯單抗(dupilumab)(參見CAS編號1190264-60-8)。
在另一實施例中，前-M2巨噬細胞之抑制劑為IL-13及/或IL-4之抑制劑。可與本文揭示之CAR表現細胞及本文揭示之RNA分子一起投與的IL-13及IL-4之抑制劑之一實例為維生素A衍生物芬維A胺(Fenretinide)((例如4-HPR)參見例如Dong等人 Cancer Letters. 2017年3月1日. 第388卷, 第43-53頁，其以全文引用之方式併入本文中)。
在另一態樣中，前-M2巨噬細胞分子之抑制劑為抗CSF-1抗體或CSF-1之小分子抑制劑。該等抗體之產生可藉由此項技術中已知之方法進行。抗CSF-1抗體之一實例為艾瑪圖單抗(emactuzumab)。CSF-1抑制劑之另一實例為BLZ945 (參見例如Strachan, DC等人, Oncoimmunology, 2013年12月1日, 2(12): e26968，其以全文引用之方式併入本文中)。可與本文揭示之CAR表現細胞及本文揭示之RNA分子一起投與的CSF-1之抑制劑之另一實例為尼達尼布(nintedanib)(參見例如Tandon等人 American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 2017;195:A2397，其以全文引用之方式併入本文中)。
BLZ945為群落刺激因子1受體(CSF1R)之小分子抑制劑。參見例如Pyonteck等人 Nat. Med. 19(2013):1264-72。在實施例中，CAR靶向間皮素，例如包含本文所描述之間皮素結合結構域，例如為表10之CAR，例如為M5。在實施例中，CAR靶向EGFRvIII，例如包含本文所描述之EGFRvIII結合結構域，例如為表9之CAR。BLZ945之結構展示如下。
在另一態樣中，前-M2巨噬細胞分子之抑制劑為相對於其他巨噬細胞，結合表現於MDSC或TAM之表面上之抗原(亦即TAM抗原)，例如於MDSC或TAM之表面上上調之抗原的CAR表現細胞。在實施例中，結合MDSC或TAM抗原之CAR表現細胞結合至CD123。在實施例中，結合MDSC或TAM抗原之CAR表現細胞結合至CSF1R。在實施例中，結合MDSC或TAM抗原之CAR表現細胞結合至CD68。在實施例中，結合MDSC或TAM抗原之CAR表現細胞結合至CD206。
在另一實施例中，前-M2巨噬細胞之抑制劑為JAK2抑制劑。可與本文揭示之CAR表現細胞及本文揭示之RNA分子一起投與的JAK2抑制劑之一實例為盧佐替尼(Ruxolitinib)(參見例如Chen等人 Clinical Lymphoma, Myeloma and Leukemia, 第17卷, 第1期, e93, 2017，其以全文引用之方式併入本文中)。
在另一實施例中，前-M2巨噬細胞分子之抑制劑為細胞表面分子。可與本文揭示之CAR表現細胞及本文揭示之RNA分子一起投與的細胞表面分子之一實例為二肽基肽酶4 (DPP-4)或CD26 (參見例如Zhuge等人 Diabetes 2016年10月; 65(10): 2966-2979，其以全文引用之方式併入本文中)。
在另一實施例中，前-M2巨噬細胞分子之抑制劑為HDAC抑制劑。可與本文揭示之CAR表現細胞及本文揭示之RNA分子一起投與的HDAC抑制劑之一實例為辛二醯苯胺異羥肟酸(SAHA)。
在另一實施例中，前-M2巨噬細胞分子之抑制劑為糖分解路徑之抑制劑。可與本文揭示之CAR表現細胞及本文揭示之RNA分子一起投與的糖分解路徑之抑制劑之一實例為2-脫氧-d-葡萄糖((2-DG)，參見例如Zanganeh, Nat Nanotechnol. 2016年11月; 11(11): 986-994，其以全文引用之方式併入本文中)。
在另一實施例中，前-M2巨噬細胞分子之抑制劑為粒線體靶向抗氧化劑。可與本文揭示之CAR表現細胞及本文揭示之RNA分子一起投與的粒線體靶向抗氧化劑之一實例為MitoQ (Formentini等人, Cell Reports, 第19卷, 第6期, 2017年5月9日, 第1202-1213頁，其以全文引用之方式併入本文中)。
在另一實施例中，前-M2巨噬細胞分子之抑制劑為氧化鐵。可與本文揭示之CAR表現細胞及本文揭示之RNA分子一起投與的氧化鐵之一實例為奈米氧化鐵(ferumoxytol)(參見例如Zanganeh, Nat Nanotechnol. 2016年11月; 11(11): 986-994，其以全文引用之方式併入本文中)。
在實施例中，本發明包括一種組合物，其包含前-M2巨噬細胞分子之抑制劑及醫藥學上可接受之載劑。
Flt3 配體多肽 在一些實施例中，另一治療劑為Fms樣酪胺酸激酶3配體(Flt3配體)多肽。Flt3配體為影響造血譜系中的細胞之生長、存活及/或分化之細胞介素。與其他生長因子組合，Flt3配體可刺激各種細胞類型(包括幹細胞、骨髓及淋巴前驅體細胞、樹突狀細胞及NK細胞)之增殖及發育。例示性Flt3配體多肽揭示於US5554512、US6291661、US7294331、US7361330及US9486519中，該等文獻以全文引用之方式併入本文中。
化學治療劑 在一些實施例中，另一治療劑為化學治療劑。例示性化學治療劑包括蒽環黴素(anthracycline)(例如小紅莓(doxorubicin)(例如脂質體小紅莓))、長春花生物鹼(例如長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbine))、烷化劑(例如環磷醯胺、達卡巴嗪(decarbazine)、美法侖(melphalan)、異環磷醯胺(ifosfamide)、替莫唑胺(temozolomide))、免疫細胞抗體(例如阿倫妥單抗(alemtuzamab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、利妥昔單抗(rituximab)、托西妥莫單抗(tositumomab))、抗代謝物(包括例如葉酸拮抗劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物及腺苷脫胺酶抑制劑(例如氟達拉濱))、mTOR抑制劑、TNFR糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白(GITR)促效劑、蛋白酶體抑制劑(例如阿克拉黴素A (aclacinomycin A)、膠毒素(gliotoxin)或硼替佐米(bortezomib))、諸如沙立度胺(thalidomide)或沙立度胺衍生物(例如來那度胺)之免疫調節劑。
考慮用於組合療法之一般化學治療劑包括阿那曲唑(anastrozole) (Arimidex®)、比卡魯胺(bicalutamide)(Casodex®)、硫酸博萊黴素(bleomycin sulfate) (Blenoxane®)、白消安(busulfan) (Myleran®)、白消安注射劑(Busulfex®)、卡培他濱(capecitabine) (Xeloda®)、N4-戊氧基羰基-5-脫氧-5-氟胞嘧啶核苷、卡鉑(carboplatin) (Paraplatin®)、卡莫司汀(carmustine) (BiCNU®)、氯芥苯丁酸(chlorambucil) (Leukeran®)、順鉑(cisplatin) (Platinol®)、克拉屈濱(cladribine) (Leustatin®)、環磷醯胺(Cytoxan®或Neosar®)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷(Cytosar-U®)、阿糖胞苷脂質體注射劑(DepoCyt®)、達卡巴嗪(DTIC-Dome®)、更生黴素(dactinomycin)(放線菌素D (放線菌素D)，Cosmegan)、鹽酸道諾黴素(daunorubicin hydrochloride) (Cerubidine®)、檸檬酸道諾黴素脂質體注射劑(DaunoXome®)、地塞米松(dexamethasone)、多烯紫杉醇(docetaxel) (Taxotere®)、鹽酸小紅莓(Adriamycin®，Rubex®)、依託泊苷(etoposide) (Vepesid®)、磷酸氟達拉濱(Fludara®)、5-氟尿嘧啶(Adrucil®，Efudex®)、氟他胺(flutamide) (Eulexin®)、替紮他濱(tezacitibine)、吉西他濱(Gemcitabine)(二氟去氧胞苷)、羥基脲(Hydrea®)、艾達黴素(Idarubicin) (Idamycin®)、異環磷醯胺(IFEX®)、伊立替康(irinotecan) (Camptosar®)、L-天冬醯胺酶(ELSPAR®)、甲醯四氫葉酸鈣(leucovorin calcium)、美法侖(Alkeran®)、6-巰基嘌呤(Purinethol®)、甲胺喋呤(Folex®)、米托蒽醌(mitoxantrone) (Novantrone®)、麥羅塔(麥羅塔)、太平洋紫杉醇(paclitaxel) (Taxol®)、菲尼克斯(phoenix) (釔90/MX-DTPA)、噴司他汀(pentostatin)、聚苯丙生20 (polifeprosan 20)與卡莫司汀植入物(Gliadel®)、檸檬酸他莫昔芬(tamoxifen citrate) (Nolvadex®)、替尼泊苷(teniposide) (Vumon®)、6-硫代鳥嘌呤、噻替派(thiotepa)、替拉紮明(tirapazamine) (Tirazone®)、注射用鹽酸拓朴替康(topotecan hydrochloride) (Hycamptin®)、長春鹼(Velban®)、長春新鹼(Oncovin®)及長春瑞濱(Navelbine®)。
例示性烷化劑包括(但不限於)氮芥、乙烯亞胺衍生物、磺酸烷基酯、亞硝基脲及三氮烯：尿嘧啶氮芥(Aminouracil Mustard®、Chlorethaminacil®、Demethyldopan®、Desmethyldopan®、Haemanthamine®、Nordopan®、Uracil nitrogen mustard®、Uracillost®、Uracilmostaza®、Uramustin®、Uramustine®)、氮芥(chlormethine) (Mustargen®)、環磷醯胺(Cytoxan®、Neosar®、Clafen®、Endoxan®、Procytox®、RevimmuneTM )、異環磷醯胺(Mitoxana®)、美法侖(Alkeran®)、氯芥苯丁酸(Leukeran®)、哌泊溴烷(pipobroman) (Amedel®、Vercyte®)、三伸乙基三聚氰胺(Hemel®、Hexalen®、Hexastat®)、三伸乙基硫代磷胺、替莫唑胺(Temodar®)、噻替派(Thioplex®)、白消安(Busilvex®、Myleran®)、卡莫司汀(BiCNU®)、洛莫司汀(CeeNU®)、鏈脲黴素(streptozocin) (Zanosar®)及達卡巴嗪(DTIC-Dome®)。其他例示性烷化劑包括(但不限於)奧沙利鉑(Oxaliplatin) (Eloxatin®)；替莫唑胺(Temodar®及Temodal®)；更生黴素(亦稱為放射菌素-D，Cosmegen®)；美法侖(亦稱為L-PAM、L-溶肉瘤素及苯丙胺酸芥末，Alkeran®)；六甲蜜胺(亦稱為六甲三聚氰胺(HMM)，Hexalen®)；卡莫司汀(BiCNU®)；苯達莫司汀(Bendamustine) (Treanda®)；白消安(Busulfex®及Myleran®)；卡鉑(Paraplatin®)；洛莫司汀(亦稱為CCNU，CeeNU®)；順鉑(亦稱為CDDP，Platinol®及Platinol®-AQ)；氯芥苯丁酸(Leukeran®)；環磷醯胺(Cytoxan®及Neosar®)；達卡巴嗪(亦稱為DTIC、DIC及咪唑甲醯胺，DTIC-Dome®)；六甲蜜胺(亦稱為六甲三聚氰胺(HMM)，Hexalen®)；異環磷醯胺(Ifex®)；普莫司汀(Prednumustine)；丙卡巴肼(Procarbazine) (Matulane®)；氮芥(Mechlorethamine)(亦稱為氮芥(nitrogen mustard)、氮芥(mustine)及鹽酸氮芥(mechloroethamine hydrochloride)，Mustargen®)；鏈脲黴素(Zanosar®)；噻替派(亦稱為硫代磷醯胺、TESPA及TSPA，Thioplex®)；環磷醯胺(Endoxan®、Cytoxan®、Neosar®、Procytox®、Revimmune®)；及苯達莫司汀鹽酸鹽(Treanda®)。
例示性mTOR抑制劑包括例如坦羅莫司(temsirolimus)；瑞達莫司(ridaforolimus)(正式地稱為迪福莫司(deferolimus)，二甲基亞膦酸(1R ,2R ,4S )-4-[(2R )-2 [(1R ,9S ,12S ,15R ,16E ,18R ,19R ,21R , 23S ,24E ,26E ,28Z ,30S ,32S ,35R )-1,18-二羥基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23, 29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五側氧基-11,36-二氧雜-4-氮雜三環[30.3.1.04 , 9 ]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基環己酯，亦稱為AP23573及MK8669，且描述於PCT公開案第WO 03/064383號中)；依維莫司(everolimus) (Afinitor®或RAD001)；雷帕黴素(AY22989，Sirolimus®)；斯馬匹莫(simapimod) (CAS 164301-51-3)；安羅莫司(emsirolimus) (5-{2,4-雙[(3S )-3-甲基嗎啉-4-基]吡啶并[2,3-d ]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055))；2-胺基-8-[反-4-(2-羥基乙氧基)環己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d ]嘧啶-7(8H )-酮(PF04691502，CAS 1013101-36-4)；及N 2 -[1,4-二側氧基-4-[[4-(4-側氧基-8-苯基-4H -1-苯并哌喃-2-基)嗎啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精胺醯甘胺醯基-L-α-天冬胺醯基L-絲胺酸- (SEQ ID NO: 846)，內鹽(SF1126，CAS 936487-67-1)，及XL765。
例示性免疫調節劑包括例如阿夫妥珠單抗(afutuzumab)(獲自Roche®)；乙二醇化非格司亭(pegfilgrastim) (Neulasta®)；來那度胺(CC-5013，Revlimid®)；沙立度胺(Thalomid®)；艾可米得(actimid) (CC4047)；及IRX-2 (包括介白素1、介白素2及干擾素γ之人類細胞介素混合物，CAS 951209-71-5，獲自IRX Therapeutics)。
例示性蒽環黴素包括例如小紅莓(Adriamycin®及Rubex®)；博萊黴素(lenoxane®)；道諾黴素(鹽酸道諾黴素、柔紅黴素(daunomycin)及鹽酸紅比黴素(rubidomycin hydrochloride)，Cerubidine®)；道諾黴素脂質體(檸檬酸道諾黴素脂質體，DaunoXome®)；米托蒽醌(DHAD，Novantrone®)；表柔比星(epirubicin) (Ellence™)；艾達黴素(Idamycin®、Idamycin PFS®)；絲裂黴素C (mitomycin C) (Mutamycin®)；格爾德黴素(geldanamycin)；除莠黴素(herbimycin)；拉維黴素(ravidomycin)；及去乙醯基拉維黴素(desacetylravidomycin)。
例示性長春花生物鹼包括例如酒石酸長春瑞濱(Navelbine®)、長春新鹼(Oncovin®)及長春地辛(Eldisine®)；長春鹼(亦稱為硫酸長春鹼、長春花鹼及VLB，Alkaban-AQ®及Velban®)；及長春瑞濱(Navelbine®)。
例示性蛋白酶體抑制劑包括硼替佐米(Velcade®)；卡非佐米(carfilzomib) (PX-171-007，(S )-4-甲基-N -((S )-1-(((S )-4-甲基-1-((R )-2-甲基環氧乙烷-2-基)-1-側氧基戊-2-基)胺基)-1-側氧基-3-苯基丙-2-基)-2-((S )-2-(2-嗎啉基乙醯胺基)-4-苯基丁醯胺基)-戊醯胺)；馬瑞佐米(marizomib) (NPI-0052)；檸檬酸依薩佐米(ixazomib citrate) (MLN-9708)；迪蘭佐米(delanzomib) (CEP-18770)；及O -甲基-N -[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-絲胺醯基-O -甲基-N -[(1S )-2-[(2R )-2-甲基-2-環氧乙烷基]-2-側氧基-1-(苯基甲基)乙基]-L-絲胺醯胺(ONX-0912)。
生物聚合物遞送方法 在一些實施例中，一或多個如本文所揭示之CAR表現細胞可經由生物聚合物骨架(例如生物聚合物植入物)投與或遞送至個體。生物聚合物骨架可支持或增強本文所描述之CAR表現細胞之遞送、擴增及/或分散。生物聚合物骨架包含可天然存在或合成之生物相容性(例如不實質上誘導發炎性或免疫反應)及/或生物可降解之聚合物。
適合生物聚合物之實例包括(但不限於)單獨或與任何其他聚合物組合物以任何濃度及任何比率組合的瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鹽、海藻酸鹽/磷酸鈣水泥(CPC)、β-半乳糖苷酶(β-GAL)、(1,2,3,4,6-五乙醯基a-D-半乳糖)、纖維素、甲殼素、聚葡萄胺糖、膠原蛋白、彈性蛋白、明膠、玻尿酸膠原蛋白、羥基磷灰石、聚(3-羥基丁酸酯-共-3-羥基-己酸酯) (PHBHHx)、聚(丙交酯)、聚(己內酯) (PCL)、聚(丙交酯-共-乙交酯) (PLG)、聚氧化乙烯(PEO)、聚(乳酸-共-乙醇酸) (PLGA)、聚氧化丙烯(PPO)、聚乙烯醇(PVA)、絲、大豆蛋白及分離大豆蛋白。生物聚合物可經促進附著或遷移之分子，例如結合於淋巴細胞之膠原蛋白受體的膠原蛋白模擬肽，及/或增強待遞送之細胞之遞送、擴增或功能(例如抗癌活性)的刺激分子強化或改質。生物聚合物骨架可為可注射劑，例如凝膠或半固體，或固體組合物。
在一些實施例中，在遞送至個體之前本文所述之CAR表現細胞接種至生物聚合物骨架上。在實施例中，生物聚合物骨架進一步包含一或多種本文所描述之額外治療劑(例如另一CAR表現細胞、抗體或小分子)或增強CAR表現細胞之活性的藥劑，例如併入或結合於骨架之生物聚合物。在實施例中，生物聚合物骨架例如瘤內注射或以手術方式植入腫瘤或植入足以介導抗腫瘤作用之腫瘤附近位置內。生物聚合物組合物及其遞送方法之額外實例描述於Stephan等人,Nature Biotechnology , 2015, 33:97-101；及WO2014/110591中。
醫藥組合物及治療 本發明之醫藥組合物可包含與如本文所描述之RNA分子組合的CAR表現細胞，例如複數個CAR表現細胞，與一或多種醫藥學上或生理學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑組合。此類組合物可包含緩衝劑，諸如中性緩衝生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水及其類似物；碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白質；多肽或胺基酸，諸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，諸如EDTA或麩胱甘肽；佐劑(例如氫氧化鋁)；及防腐劑。在一個態樣中，本發明之組合物調配用於靜脈內投與。
本發明之醫藥組合物可以適於待治療(或預防)疾病之方式投與。投與之量及頻率將由諸如以下之因素決定：患者之病狀以及患者之疾病的類型及嚴重程度，但可藉由臨床試驗確定適當劑量。
在一個實施例中，醫藥組合物實質上不含，例如不存在可偵測水準之例如選自由以下組成之群的污染物：內毒素、黴漿菌、複製勝任型慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、殘餘抗CD3/抗CD28塗佈之珠粒、小鼠抗體、混合人類血清、牛血清白蛋白、牛血清、培養基組分、載體封裝細胞或質體組分、細菌及真菌。在一個實施例中，細菌為選自由以下組成之群的至少一者：糞產鹼桿菌(Alcaligenes faecalis)、白色念珠菌(Candida albicans)、大腸桿菌(Escherichia coli)、流行性嗜血桿菌(Haemophilus influenza)、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitides)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)及A群化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes group A)。
當指示「免疫有效量」、「抗腫瘤有效量」、「腫瘤抑制有效量」或「治療量」時，待投與之本發明組合物之精確量可由醫師考慮個體之年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移程度及患者(個體)病狀的差異來決定。一般可規定包含本文所描述之T細胞之醫藥組合物可以104 至109 個細胞/公斤體重，在一些情況下105 至106 個細胞/公斤體重(包括彼等範圍內之全部整數值)之劑量投與。T細胞組合物亦可以此等劑量多次投與。細胞可藉由使用免疫療法中通常已知之輸注技術投與(參見例如Rosenberg等人, New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988)。
在某些態樣中，可能需要向個體投與活化之T細胞，且隨後根據本發明自其再抽血(或進行血球分離術)、活化T細胞，且使患者再輸注此等活化及擴增之T細胞。此過程可每幾週進行多次。在某些態樣中，T細胞可自抽出的10cc至400cc血液活化。在某些態樣中，T細胞自抽取的20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc血液活化。
可以任何適宜方式投與標的組合物，包括藉由氣霧劑吸入、注射、攝入、輸注、植入或移植。可經動脈、皮下、皮內、瘤內、結節內、髓內、肌肉內、靜脈內(i.v.)注射或腹膜內向患者投與本文所述之組合物。在一個態樣中，藉由皮內或皮下注射向患者投與本發明之T細胞組合物。在一個態樣中，藉由靜脈內注射投與本發明之CAR表現細胞(例如T細胞或NK細胞)組合物。CAR表現細胞(例如T細胞或NK細胞)之組合物可直接注射至腫瘤、淋巴結或感染部位中。在一個態樣中，藉由皮內或皮下注射向患者投與本文揭示的RNA分子或編碼RNA分子之核酸分子。在一個態樣中，藉由靜脈內注射投與本文揭示的RNA分子或編碼RNA分子之核酸分子。在一個態樣中，本文揭示的RNA分子或編碼RNA分子之核酸分子直接注射至腫瘤、淋巴結或感染部位中。
在一特定例示性態樣中，個體可經歷白細胞去除術，其中離體收集、增濃或耗盡白細胞以選擇及/或分離所關注的細胞，例如免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)。此等免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)分離株可藉由此項技術中已知之方法擴增且經處理使得可引入一或多個本發明CAR構築體，藉此產生本發明之CAR表現細胞(例如CAR T細胞或CAR表現NK細胞)。有需要之個體可隨後經歷用高劑量化學療法，繼之以周邊血液幹細胞移植之標準治療。在某些態樣中，在移植之後或與移植同時，個體接受本發明之與RNA分子組合的經擴增CAR表現細胞(例如CAR T細胞或NK細胞)之輸注。在另一態樣中，在手術之前或之後投與本文所描述之與RNA分子組合的經擴增細胞。
在實施例中，例如在投與如本文所描述與RNA分子組合的一或多種表現CAR之細胞之前，對個體進行淋巴細胞耗盡。在實施例中，淋巴細胞耗盡包含投與美法侖、賽特杉、環磷醯胺及氟達拉濱中之一或多者。
上述待向患者投與的治療之劑量將隨所治療之精確病狀性質及治療接受者而變化。可根據此項技術中接受之實踐對用於人類投與之劑量按比例調整。CAMPATH之劑量例如對成年患者而言一般將在1 mg至約100 mg範圍內，通常每日投與持續1與30天之間的時段。較佳每日劑量為每日1 mg至10 mg，但在一些情況下，可使用高達每日40 mg之較大劑量(描述於美國專利第6,120,766號中)。
在一個實施例中，CAR例如使用活體外轉錄引入至免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)中，且個體(例如人類)接受本發明之CAR免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)之初始投與，及本發明之CAR免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)之一或多次後續投與，其中該一或多次後續投與在前一次投與之後少於15天，例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天投與。在一個實施例中，每週向個體(例如人類)投與本發明之CAR免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)之多於一次投與，例如每週投與本發明之CAR免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)之2、3或4次投與。在一個實施例中，個體(例如人類個體)接受每週多於一次CAR免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)之投與(例如每週2、3或4次投與)(在本文中亦稱為週期)，之後一週不投與CAR免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)，且隨後向個體投與一或多次CAR免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)之額外投與(例如每週多於一次CAR免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)之投與)。在另一實施例中，個體(例如人類個體)接受多於一個週期之CAR免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)，且各週期之間的時間少於10、9、8、7、6、5、4或3天。在一個實施例中，對於每週3次投與，每隔一天投與CAR免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)。在一個實施例中，投與本發明之CAR免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)持續至少兩週、三週、四週、五週、六週、七週、八週或更多週。
在一個態樣中，使用慢病毒病毒載體(諸如慢病毒)產生CAR表現細胞(例如CART或CAR表現NK細胞)。彼方式產生之CAR表現細胞(例如CART或CAR表現NK細胞)將具有穩定CAR表現。在一個態樣中，本發明提供一種表現本文揭示之刺激RNA分子(例如免疫刺激RNA分子)之細胞，其中使用慢病毒病毒載體(諸如慢病毒)產生該細胞。
在一個態樣中，使用諸如γ反轉錄病毒載體，例如本文所述之γ反轉錄病毒載體的病毒載體產生CAR表現細胞，例如CART。使用此等載體產生之CART可具有穩定CAR表現。在一個態樣中，使用病毒載體(諸如γ反轉錄病毒載體，例如本文所描述之γ反轉錄病毒載體)產生表現本文揭示之刺激RNA分子(例如免疫刺激RNA分子)之細胞。
在一個態樣中，CAR表現細胞(例如CART或CAR表現NK細胞)在轉導之後短暫表現CAR載體持續4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天。可藉由RNA CAR載體遞送實現CAR短暫表現。在一個態樣中，CAR RNA藉由電穿孔轉導至細胞(例如T細胞或NK細胞)中。在一個態樣中，表現本文揭示之刺激RNA分子(例如免疫刺激RNA分子)之細胞短暫表現RNA分子。在一個態樣中，刺激RNA分子藉由電穿孔遞送至細胞中。
使用短暫表現CAR表現細胞(例如CART或CAR表現NK細胞)(特定言之用攜有鼠類scFv之CAR表現細胞(例如CART或CAR表現NK細胞))治療之患者中可能出現的潛在問題為多次治療之後的過敏反應。
在不受此理論束縛之情況下，咸信此類過敏性反應可由產生體液抗CAR反應(亦即具有抗IgE同型之抗CAR抗體)之患者引起。當存在十天至十四天抗原曝露中斷時，認為患者之抗體產生細胞經歷IgG同型(不引起過敏反應)至IgE同型的類別轉換。
若患者在短暫CAR療法過程期間處於產生抗CAR抗體反應之高風險(諸如由RNA轉導產生之風險)下，則CAR表現細胞(例如CART或CAR表現NK細胞)輸注中斷不應持續超過十天至十四天。
實例 參考以下實驗性實例來進一步詳細描述本發明。除非另外規定，否則提供此等實例僅出於說明的目的，且不意欲為限制性的。因此，本發明決不應解釋為限於以下實例，而是應解釋為涵蓋由於本文所提供之教示而變得明顯之任何及所有變化形式。
無需進一步描述，咸信一般熟習此項技術者可使用前述描述及以下說明性實例製造及利用本發明組合物且實踐所主張之方法。以下實施例特定指出本發明之各種態樣且不應理解為以任何方式限制本發明之剩餘部分。
實例1：腫瘤微環境(TME)中之刺激RNA及藉由CAR T細胞之產生摘要
免疫療法近年來已顯著改良具有不良預後之患者之結果，但當前限於特定癌症類型，且並未達至大多數癌症患者。因此，需要顯著創新將免疫療法之益處延伸至大量患者群體。高度結構化RNA RN7SL1最近已鑑別為能夠在由鄰近纖維母細胞分泌之後刺激腫瘤細胞中的免疫反應基因。因此，腫瘤微環境中的未遮蔽RN7SL1可表示促進免疫檢查點阻斷(ICB)反應性之新穎腫瘤內免疫刺激。在本文中據展示，RN7SL1對初級人類樹突狀細胞(DC)為刺激性的，且增加腫瘤微環境中存在的未遮蔽7SL RNA之量增加腫瘤內DC之頻率且增強T細胞活化。此外，此反應視信號傳導分子MyD88而定，該分子在若干TLR之下游，涉及導致應變性免疫活化之先天性免疫識別。藉由TCGA RNA測序資料鑑別具有高水準未遮蔽RN7SL1之患者亦與增強之免疫浸潤及在對抗PD1及抗CTLA4療法有反應者中增濃的基因簽名相關。為了遞送此刺激RNA，基於T細胞之系統經設計用於直接遞送RN7SL1至腫瘤微環境。使用「synNotch」T細胞，據展現，結構化RNA之產生活體外活化初級人類DC及T細胞。另外，為活體內測試此方法，同基因系統經開發用於CAR T細胞投與，其中B16黑素瘤表現人類CD19作為可由鼠類CAR T細胞靶向之模型新抗原。CAR T細胞之功效在此系統中進行驗證，且將測試synNotch CAR T細胞刺激更有效地控制實體腫瘤的內源免疫反應之能力。總之，此產生用於分析新穎腫瘤內損傷相關分子模式(DAMP)之重要性同時改良實體腫瘤中CAR T細胞之免疫原性的構架。
TCGA 資料反映鼠類模型中所觀測到的實驗變化
TCGA資料集中可獲得的患者樣品之RNA-Seq資料藉由SRP遮蔽之水準分配給各四分位數。此分級藉由產生RN7SL1讀數比SRP9及SRP14讀數之比率進行，因為此等SRP蛋白實驗上已展現為可阻斷7SL之免疫原性。患者基於此比率分離為各四分位數，且隨後評估最高與最低四分位數之間的基因表現之差異(圖1A、圖1B及圖1C)。假髮現率藉由以下方式設定：隨機取樣藉由雙尾成對T檢驗在多重比較下使用Holm校正對1000個基因獲得之p值，及使隨機清單中p值低於第10等級p值之基因視為有差異地調節。使用metascape線上介面對前5%的有差異地調節之基因進行基因本體分析，列出相關增濃項。
未遮蔽 7SL 不顯著影響對抑制性檢查點阻斷療法之反應
向野生型(WT) C57BL/6小鼠在側腹皮下注射5×104 個B16-F10腫瘤細胞，與5×104 個MYC活化小鼠胚胎纖維母細胞(MEF)或共表現SRP9/14之MYC活化MEF。MYC活化對於4-OHT為誘導性的且導致分泌含有未遮蔽7SL1 RNA之胞外體，而SRP9/14之共表現確保7SL1 RNA保持相對遮蔽，使得可量測未遮蔽形式特異性之刺激能力(Nabet BY等人 Cell. 2017;170(2):352-366.e13)。隨後將小鼠用抗CTLA-4或抗PD-1抗體處理(或不)，且隨後藉由測徑規監測腫瘤生長。終點準則視為在任何方向上1.5 cm之腫瘤量測值。如圖2A及圖2B中所示，未遮蔽7SL不顯著影響對抗CTLA-4或抗-PD-1療法之反應。
未遮蔽 7SL 驅動骨髓浸潤至腫瘤微環境中
在圖3A-圖3C中所示研究中，如圖2A及圖2B中所示研究中所描述向小鼠植入腫瘤。13天數後收集腫瘤且評估巨噬細胞或骨髓衍生之抑制細胞(MDSC)的浸潤。巨噬細胞視為Lin-、F4/80+及CD11b+細胞。MDSC視為Lin-、F4/80-、CD11c-、CD11b+及Ly6C+細胞。在圖3D中所示研究中，如圖2A及圖2B中所示研究中所描述將腫瘤用抗CTLA4阻斷抗體處理，且在d15收集腫瘤以量測如由CD206標記的巨噬細胞之M2極化。如圖3A-圖3D中所示，未遮蔽7SL可驅動骨髓浸潤至腫瘤微環境中。
此外，向小鼠植入相同腫瘤且隨後用CSF1R抑制劑BLZ945處理。測試巨噬細胞之極化及CD103+ DC之頻率。在高水準未遮蔽7SL RNA存在下抑制CSF1R信號傳導降低腫瘤中所見的M2巨噬細胞之頻率(圖3E)，同時改良交叉呈現CD103+ DC之浸潤(圖3F)。
抑制 M2 極化使得具有高水準未遮蔽 7SL 之腫瘤可更穩固地對檢查點阻斷作出反應
如同圖2A及圖2B中所示研究中般植入腫瘤且在第0天開始每2天用CSF1R抑制劑BLZ945 (Novartis)處理2週以防止浸潤骨髓細胞之M2極化。在第5天、第8天及第11天將小鼠另外用抗CTLA4 (圖4A)或抗CTLA4及抗PD1 (圖4B、4C、4D及4E)處理。藉由測徑規監測腫瘤生長。如圖4A-圖4E中所示，用CSF1R抑制劑BLZ945處理使得具有高水準未遮蔽7SL之腫瘤可更穩固地對檢查點阻斷作出反應。
另外，向小鼠植入腫瘤且用抗CTLA4 +/- CSF1Ri BLZ945處理。13天後收集腫瘤且使用流式細胞量測術資料之無偏叢集評估免疫群體。活化CD4+ T細胞突出之處為亦用CSF1Ri處理的具有高水準未遮蔽7SL之腫瘤的顯著增加，表明CSF1R驅動之骨髓極化防止最佳CD4+ T細胞活化及極化，且此活化對與ICB之反應為重要的(圖4F)。
CSF1R 抑制與未遮蔽 7SL RNA 的組合使 PDA 腫瘤對 ICB 療法敏感
1×105 個胰管腺癌(PDA)腫瘤細胞與1×105 個用4OHT或EtOH處理的MEF (「myc-ER」)或共表現SRP9/14之MEF (「myc-ER/SRP」)共注射。隨後將小鼠用抗CTLA4及抗PD1抗體之組合(圖5A)或抗CTLA4、抗PD1及BLZ945之三重組合(圖5B)使用圖4A-圖4C中所示研究中概述的處理時程處理。藉由測徑規監測腫瘤生長。如圖5B中所示，CSF1R抑制劑BLZ945與未遮蔽7SL RNA的組合使PDA腫瘤對抗-PD-1及抗CTLA-4抗體療法敏感。
鼠類 h19BBz - P2A - HP ( 髮夾 ) CAR T 細胞 刺激旁觀抗原呈現細胞群體
將鼠類T細胞在抗CD3/CD28珠粒模擬之後用h19BBz或h19BBz-P2A-HP CAR構築體轉導。h19BBz為包含抗CD19 scFv連接至鉸鏈結構域、跨膜結構域及4-1BB及CD3ζ的胞內部分之CAR構築體。h19BBz，亦稱為CTL019，包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列。HP表示長度為25 bp的完美匹配之合成髮夾RNA，以便模擬7SL之免疫原性活性同時避免經由藉由遮蔽蛋白質識別同源序列而潛在遮蔽。HP RNA包含SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。編碼HP RNA之DNA序列包含SEQ ID NO: 9之核苷酸序列。h19BBz-P2A-HP CAR構築體自N-至C-方向編碼髮夾RNA、P2A及h19BBz。h19BBz-P2A-HP CAR構築體包含SEQ ID NO: 22之核苷酸序列。擴增3天之後，將2×106 個CD45.1 T細胞置於具有2×106 個CD45.2未處理脾細胞之培養物中。24小時後藉由流式細胞量測術分析細胞。成熟DC及M1巨噬細胞藉由評估CD80表現鑑別。T細胞活化藉由量測CD69表現評估。如圖6A及圖6B中所示，鼠類h19BBz-P2A-HP CAR T細胞導致比鼠類h19BBz CAR T細胞所致更高水準的巨噬細胞、DC及旁觀T細胞之活化。
鼠類 h19BBz - P2A - HP CAR T 細胞與鼠類 h19BBz CAR T 細胞相比展示改良功效
向小鼠植入B16-hCD19腫瘤且用攜有h19BBz構築體之鼠類CAR T細胞處理。測試腫瘤生長及存活(圖7A及圖7B)。
在第二研究中，向小鼠植入相同腫瘤且用鼠類h19BBz CAR T細胞或鼠類h19BBz-P2A-HP CAR T細胞處理。如圖7C中所示，鼠類h19BBz-P2A-HP CAR T細胞展示比鼠類h19BBz CAR T細胞更佳的抗腫瘤活性。
評估相同小鼠之腫瘤的腫瘤內免疫活化。藉由CAR T細胞遞送HP RNA增加樹突狀細胞之量(圖7D)、增強T細胞活化(圖7F)且減少M2巨噬細胞極化(圖7E)。
總之，鼠類CAR T細胞能夠抑制實體腫瘤生長且藉由此等細胞產生刺激RNA改良對療法之反應。
實例2：使用CAR T細胞遞送刺激RNA 最近，已顯示，腫瘤微環境中存在的胞外體中之長非編碼RNA 7SL1 (RN7SL1)之分泌可活化腫瘤中的模式識別受體(PRR)(Nabet BY等人 Cell. 2017;170(2):352-366.e13)。7SL1為所有細胞之細胞質中均可見的豐富且高度結構化之內源lncRNA且通常參與膜結合蛋白之轉譯。癌細胞能夠活化基質纖維母細胞以經由轉錄因子MYC增強7SL1表現。基質7SL1 RNA之此增加產生不含包括SPR9/14的其RNA結合蛋白(RBP)之7SL1池。此「未遮蔽」7SL1在胞外體中由纖維母細胞分泌。因為RBP通常遮蔽7SL1 RNA免於PRR識別，所以胞外體中的未遮蔽7SL1可在胞外體轉移至癌症或免疫細胞後活化RIG-I(Nabet BY等人 Cell. 2017;170(2):352-366.e13)。胞外體中的未遮蔽7SL1是否可刺激DC及巨噬細胞以促進T細胞激活及活化為無解的問題。
此研究集中於腫瘤微環境中產生的刺激性內源RNA促進APC活化及抗腫瘤T細胞反應之作用，特定言之對於具有不良預先存在的免疫浸潤之腫瘤。為治療上遞送此等RNA至實體腫瘤及可能改良對CAR T細胞療法之反應，工程改造新穎下一代CAR T細胞。此研究測試以下假說：腫瘤微環境中產生或由CAR T細胞遞送的未遮蔽7SL1 RNA活化局部免疫群體上存在之模式識別受體(PRR)。此有利於抗原呈現且增強針對不良免疫原性癌症類型之內源T細胞反應且克服當前對實體腫瘤中的免疫療法之限制。
開發能夠內源免疫活化之 CAR T 細胞
儘管能夠針對可能多樣的新抗原再活化T細胞庫，但免疫檢查點阻斷(ICB)在具有不良免疫浸潤之實體腫瘤中通常無效。CAR T細胞可浸潤先前免疫學上靜默之腫瘤但對靶向單一抗原之依賴使得脫逃不表現靶抗原之亞群，限制其對實體腫瘤之成效。然而，若恰當地配備，則CAR T細胞可藉由促進局部免疫浸潤/活化及刺激同時內源T細胞反應而有效地起始即使具有不良免疫浸潤之腫瘤中的抗腫瘤免疫反應。在起始後，ICB可進一步促進內源T細胞反應。此研究之目的為開發可遞送刺激RNA且促進局部免疫浸潤/活化以便產生互補內源T細胞反應以改良腫瘤清除率之新穎下一代CAR T細胞。
synNotch T 細胞 可遞送活化 DC 及 T 細胞之 RNA DAMP
為工程改造CAR T細胞以遞送諸如未遮蔽7SL1 RNA之刺激RNA，開發誘導性「synNotch」CAR T細胞系統(Roybal KT等人 Cell. 2016;164(4):770-9)。簡言之，來源於抗體之重鏈及輕鏈的單鏈可變片段(scFv)連接至Notch跨膜結構域且連接於由VP64轉錄活化結構域及Gal4 DNA結合結構域組成之胞內轉錄因子。單獨「反應元件」由驅動所關注之基因的細菌Gal4上游活化序列組成。兩種構築體均使用慢病毒或反轉錄病毒載體整合至基因組中。在藉由scFv識別靶抗原後，Notch跨膜結構域裂解，使得嵌合轉錄因子易位至細胞核且活化所關注之基因(圖8A及圖8B)。在此研究中，synNotch受體包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列。synNotch受體之scFv結構域為包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列之抗CD19 scFv。synNotch受體之跨膜及胞內結構域包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列。重要地，synNotch構築體不具有信號傳導結構域且因此通常將不在分離中殺死。Gal4反應元件包含SEQ ID NO: 18之核苷酸序列。
鑒於7SL1 RNA刺激T細胞活化且藉由DC識別結構化RNA刺激T細胞反應(Wang Y等人 Immunol Rev. 2011;243(1):74-90)，設計兩種RNA反應元件。第一者為包含SEQ ID NO: 10之核苷酸序列的25鹼基對髮夾RNA。此髮夾(HP) RNA經設計以模擬7SL之免疫原性活性同時避免經由藉由遮蔽蛋白質識別同源序列而潛在遮蔽。Gal4-HP反應構築體包含SEQ ID NO: 27之核苷酸序列。第二者為7SL1 RNA，使得CAR T細胞模擬含7SL1 RNA之胞外體藉由MYC活化之MEF的分泌。此7SL1 RNA經設計為Alu-Ya5後為聚-A尾。編碼此7SL1 RNA之DNA序列包含SEQ ID NO: 7之核苷酸序列。Gal4-Alu反應構築體包含SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。為初步測試此等synNotch Gal4-HP T細胞，將其與CD19+靶細胞以及初級人類PBMC一起培養。synNotch驅動之RNA的表現相較於不具有反應元件之synNotch T細胞產生表現更高水準CD86及Batf3之循環人類DC (圖9A，資料未展示)。DC之此活化伴隨著活化CD69+ T細胞之百分比之增加(圖9B)。因此，經設計以產生刺激RNA之T細胞具有活化DC及內源T細胞之潛力。
鼠類 CAR T 細胞 可控制實體腫瘤
髮夾(HP) synNotch T細胞能夠活體外刺激DC上共刺激受體及成熟轉錄因子之上調(圖9A及圖9B)。作為檢驗藉由CAR T細胞遞送HP RNA是否活體內產生有利內源免疫效應中的初始步驟，產生同基因鼠類CAR T細胞模型系統。B16-F10黑素瘤細胞用人類CD19抗原(hCD19，pCLPs-EF1a-CD19trunc)轉導。初步資料表明，此等B16-hCD19腫瘤以與WT B16-F10腫瘤類似之速率生長，且免疫浸潤不改變。此外，內源免疫系統不編輯hCD19抗原，對於其他人工抗原情況亦如此。相較於用未轉導之鼠類T細胞處理之小鼠，當用表現hCD19BBz CAR (pMSGV-EF1ah19BBz)之鼠類T細胞處理時，顯著更久地控制此等腫瘤(圖10A、圖10B及圖10D)。相較於僅包含B16-hCD19細胞之腫瘤，當植入B16 WT及B16-hCD19腫瘤細胞之1:1混合物時，用h19BBz鼠類CAR T細胞處理產生中間效應。此外，觀測到hCD19表現細胞之優先喪失(圖10C)。此與藉由CAR T細胞之抗原編輯一致且允許訊問遞送未遮蔽7SL1 RNA是否可改良藉由增強內源T細胞庫喪失或無法表現靶抗原的腫瘤亞群之清除率。
活體內鑑別由 RNA DAMP synNotch T 細胞 活化之內源免疫群體
將表現人類CD19之B16黑素瘤細胞(B16-hCD19)植入C57BL/6小鼠之側腹中。鼠類初級T細胞用hCD19 synNotch構築體及Gal4-髮夾、Gal4-7SL1或Gal4-GFP反應元件(pMSGV-PGK-抗CD19-synNotch-Gal4VP64、pMSGV-PGK-mCherry-Gal4反應)轉導。隨後，當腫瘤在第5天可觸時，隨後將5百萬個synNotch/Gal4雙重陽性T細胞注射至攜帶腫瘤之小鼠中，根據先前公開之劑量(Sampson JH等人 Clin Cancer Res. 2014;20(4):972-84)。藉由測徑規監測腫瘤之生長動力學，隨後在注射後10天收集其。收集之後，藉由流式細胞量測術評估腫瘤中的DC及巨噬細胞中之活化標記物以及巨噬細胞極化。另外，將內源腫瘤特異性CD8+ T細胞在此模型中藉由同源標記物鑑別且用已知對由B16腫瘤細胞表現之黑素細胞分化抗原具有特異性的TRP-2四聚體染色。評估此等細胞之活化標記物。補充此方法，自此等腫瘤分選內源T細胞且進行TCR測序以量測T細胞多樣性。對第二癌症模型重複此等實驗，該模型通常展示相較於B16更低水準之免疫浸潤(例如KPC衍生之胰臟腫瘤株PDA152)。
測定產生 RNA DAMP 之 CAR T 細胞 之功效
產生局部佐劑(諸如刺激RNA)但不具有直接殺死能力之synNotch T細胞不大可能以單一療法形式誘導持續緩解。此已由在臨床試驗中失敗的眾多癌症疫苗及佐劑療法展現。因此，增加之殺死能力為評估此方法之轉譯相關性所需。為解決此，h19BBz CAR構築體將引入至RNA DAMP synNotch T細胞中。因此，鼠類T細胞用三種病毒構築體轉導：h19BBz CAR、hCD19 synNotch及Gal4-髮夾或Gal4-7SL1，或Gal4-GFP反應元件作為陰性對照。此使得此等CAR T細胞可殺死靶細胞且測試部署內源RNA DAMP至腫瘤微環境中之效應。
除了測試RNA DAMP是否可增強直接CAR T細胞殺死之外，此研究亦研究內源T細胞庫是否可藉由RNA DAMP募集、參與抗腫瘤反應、及由於脫逃已失去CAR T細胞靶抗原之亞群而減少復發。為模型化CAR T細胞腫瘤新抗原之不完全外顯率，B16-hCD19及B16-WT腫瘤以1:1比率植入至小鼠側腹中，如圖10A-圖10D中所示研究中所展現。此表示實體腫瘤，其中一半細胞可由CAR T細胞靶向，剩餘部分需要內源免疫反應以實現清除，如在人類腫瘤中已描述(Hegde M等人 Mol Ther. 2013;21(11):2087-101)。植入及投與腫瘤及T細胞，且測定腫瘤生長/存活。測定內源T細胞頻率、活化及功能性，且TCR測序用於評估對內源T細胞庫之效應。為證實最佳反應是否需要內源T細胞庫，將相同混合腫瘤植入Rag1-/-小鼠中，其中注射任何19BBz synNotch T細胞應導致B16-hCD19細胞喪失但B16-WT亞群續存。
測定 RNA DAMP CAR T 細胞 療法與免疫檢查點阻斷組合之功效
儘管藉由CAR T細胞遞送RNA DAMP可增強內源腫瘤反應性T細胞，但此等T細胞易受包括抑制性配體之上調的其他抗性機制影響(Joshi NS等人 Immunity. 2015;43(3):579-90)。另外，CAR T細胞亦可能易受包括免疫檢查點之類似應變性抗性機制的攻擊。為檢查此，向小鼠植入混合腫瘤且用19BBz synNotch T細胞處理，但另外接受三個劑量之抗PD1或抗CTLA4。隨後監測小鼠之腫瘤生長及存活，且處死一個群組以量測CAR T細胞及內源T細胞兩者之活化狀態。對照包括用單獨19BBz synNotch T細胞處理之小鼠。另外，亦在有或無ICB下檢查不遞送刺激RNA之19BBz GFP synNotch T細胞。此量測ICB對單獨CAR T細胞之直接效應且允許更佳評估可歸因於內源T細胞活化之效應。對第二免疫學上「冷」癌症模型(例如PDA152)重複此等實驗。
實例3：RN7SL1活化T細胞及抗原呈現細胞 此實例顯示，RN7SL1可有利地活化T細胞及關鍵抗原呈現細胞(例如CD103+樹突狀細胞)以促進免疫反應。
向小鼠植入與MEF或共表現SRP9/14之MEF 1:1混合之B16-F10腫瘤細胞(圖14A)。注射後2週收集腫瘤且分析其免疫細胞群體。未遮蔽RN7SL1增加腫瘤中的樹突狀細胞之頻率(圖14B)、CD103+樹突狀細胞之百分比(圖14C)、CD69+ CD8+ T細胞之百分比(圖14D)及PD1+ CD8+ T細胞之百分比(圖14E)。CD45+細胞中的巨噬細胞及MDSC之百分比亦增加(圖15A及圖15B)。在不希望受理論束縛的情況下，CSF1R抑制劑阻斷M2極化且可與未遮蔽RN7SL1協同作用。如圖16B及圖16C中所示，組合RN7SL1與CSF1R抑制劑BLZ945增強抗PD1抗體及抗CTLA-4抗體之抗腫瘤活性。
實例4：7SL RNA對人類DC為刺激性的 7SL為由人類DC識別之免疫原性RNA。一式三份地塗佈1.5×106 個健康供體PBMC。資料點表示技術重複，5個個別供體之平均值。200 ng 7SL或零亂(Scr)活體外轉錄RNA囊封於脂質體中且轉染至PBMC中。48小時後收集培養物。此資料展現7SL RNA與零亂對照相比之免疫原性性質(圖17B-圖17D)；此外，在未展示之資料中，零亂RNA (其亦含有5'三磷酸)當相較於空脂質體對照時亦為刺激性的。此意味著，7SL之5'三磷酸基元及結構化性質兩者均對人類DC具有刺激能力，其為重要的抗腫瘤免疫起始劑。
實例5：經7SL RNA刺激之鼠類BMDC引發增強之T細胞反應 DC用以藉由激活CD8+ T細胞反應來起始抗腫瘤免疫。使用鼠類轉殖基因OT-I系統測試7SL刺激之DC執行此功能之能力。藉由在40 ng/mL GM-CSF中培養來自骨髓之5×106 個細胞6天獲得骨髓衍生之樹突狀細胞(BMDC)。在第4天，將200 ng RNA轉染至發育BMDC中。在第6天，將BMDC收集、洗滌、負載Ova肽且再次洗滌。隨後將細胞與經純化OT-I CD8+ T細胞以1:3比率塗佈。48小時後，染色T細胞用於細胞介素產生及活化標記物。7SL刺激之BMDC在刺激IFNγ及TNFα之T細胞產生方面顯著更佳，其與PD1上調相關(圖18B-圖18G)。
實例6：直接注射7SL驅動腫瘤中增強之免疫活化 為了研究注射免疫原性RNA是否具有活體內影響免疫活化之潛力，在側腹向小鼠植入B16-F10腫瘤。隨後在第5天、第8天及第11天在腫瘤部位直接注射200 ng RNA。在第13天收集腫瘤且藉由流式細胞量測術評估免疫浸潤。與零亂RNA對照相比，注射7SL之腫瘤中的DC浸潤顯著增加(圖19B)。此與如藉由CD69+細胞之百分比(圖19C)以及PD1+細胞之百分比(資料未展示)所量測的活化T細胞頻率之增加相關。
實例7：直接注射7SL RNA改良對ICB之反應 因為7SL改良免疫浸潤，所以假設7SL RNA將與免疫檢查點阻斷(ICB)協同作用。為測試此，執行上文概述之相同腫瘤及RNA注射方案，且小鼠同時用PD1 (RMP1-14)及CTLA4 (9H10)之阻斷抗體處理。注射7SL RNA與零亂RNA相比顯著限制早期腫瘤生長(圖20B)且與零亂RNA (圖20C)及空脂質體對照(圖20D)相比改良總存活。
實例8：19BBz-7SL CAR T細胞比親本或對照CAR T細胞更穩固地控制腫瘤 為了以集中方式遞送7SL RNA至腫瘤微環境，能夠產生RNA Pol-III轉錄7SL分子之CAR T細胞經設計以便保持內源RNA之5'三磷酸性質。簡言之，系統由以下組成：標準19BBz CAR分子後為聚-T轉錄終止信號，隨後後為驅動7SL RNA (參見表1中的SEQ ID NO: 849)或零亂對照RNA (參見表1中的SEQ ID NO: 850)之轉錄的人類U6 RNA-Pol-III啟動子。此設置概述於圖21A中，且可比CAR表現展示於圖21B中。向小鼠植入經工程改造以表現人類CD19抗原之B16-F10腫瘤(B16-h19)且在第5天及第12天用指定鼠類CAR T細胞處理。在第8天、第11天及第14天投與抗CTLA-4抗體。7SL-CAR T細胞以單一療法形式(圖21C)及當與CTLA4阻斷抗體組合使用時(圖21D)展示改良之腫瘤控制(圖21E)及存活率。
實例9：19BBz-7SL CAR T細胞改變內源免疫活化 對用7SL-CAR T細胞處理之腫瘤的內源免疫浸潤之初步分析展現可能增強之DC募集(圖22A)及內源T細胞活化(圖22B)，類似於藉由直接注射RNA獲得之結果。此外，巨噬細胞之M2極化並不因應增強之由工程改造T細胞產生的7SL RNA之存在而增加(圖22C)。
實例10：抗CTLA4抗體益處視內源T細胞而定 7SL-CAR T處理小鼠中所見的改良反應之下存在兩種潛在機制。由刺激RNA直接活化CAR T細胞可使得改良CAR T細胞之細胞內在活化且因此改良腫瘤控制，或RNA可分泌至腫瘤微環境中且刺激內源免疫群體。增強之內源T細胞反應將有可能表示能夠靶向CAR抗原陰性腫瘤細胞之多株群體且可與當前經批准之ICB方案協同作用(如上文與抗CTLA4抗體組合所表明)。支持此機制，當向TCRa KO小鼠(不具有T細胞)植入B16-h19腫瘤且用7SL-CAR T細胞與aCTLA4的組合處理時，7SL-CAR T細胞對腫瘤生長之控制並不比親本19BBz CAR T細胞更佳(圖23)。
等效物 本文所引用之每一專利、專利申請案及公開案之揭示內容均以全文引用的方式併入本文中。雖然已參考特定態樣揭示本發明，但顯而易見熟習此項技術者可在不背離本發明之真實精神及範疇的情況下設計本發明之其他態樣及變化。隨附申請專利範圍意欲理解為包括所有此類態樣及等效變化。
專利或申請案文件含有至少一個彩製圖式。在申請且支付必要費用後，專利局將提供附有彩圖之此專利或專利申請公開案之複本。
圖1A、圖1B及圖1C：人類腫瘤中的免疫浸潤之變化使用TCGA資料反映。圖1A為比較7SL/SRP比率之第一四分位數之樣品與7SL/SRP比率之第四四分位數之樣品之間的所列基因之表現圖譜之圖。圖1B及圖1C分別為展示7SL/SRP比率之第一四分位數或第四四分位數之樣品的STAT1及RAB7A之表現量之圖。7SL/SRP比率等於RN7SL1讀數/(SRP9 + SRP14讀數)。第一四分位數為最低四分位數，且第四四分位數為最高四分位數。
圖2A及圖2B為展示測試7SL與抗CTLA-4或抗PD-1抗體之組合之小鼠研究的結果之圖。小鼠胚胎纖維母細胞(MEF) (在圖2A中稱為「myc」且在圖2B中稱為「ER-myc」)或共表現SRP9/14之MEF (在圖2A中稱為「SRP」且在圖2B中稱為「ER-myc SRP」)經4OHT或EtOH處理。EtOH處理及SRP過度表現用作陰性對照。向WT C57BL/6小鼠在側腹皮下注射由B16-F10腫瘤細胞及如所指示加以處理之MEF組成的混合腫瘤。圖2A及圖2B分別為展示各指定時間點之存活百分比及腫瘤體積(cm3 )之圖。
圖3A、圖3B、圖3C、圖3D、圖3E及圖3F為展示測試7SL對巨噬細胞募集及極化之影響之小鼠研究的結果之圖。MEF (在圖3A及圖3B中稱為「myc」)或共表現SRP9/14之MEF (在圖3A及圖3B中稱為「SRP」)經4OHT或EtOH處理。EtOH處理及SRP過度表現用作陰性對照。圖3A為展示各測試組的CD45+細胞中巨噬細胞之百分比之圖。圖3B為展示各測試組的CD45+細胞中MDSC之百分比之圖。圖3C為展示myc + 4OHT處理組(「7SL未遮蔽」)及SRP + 4OHT處理組(「7SL遮蔽」)之巨噬細胞(上圖)及MDSC (下圖)的流式細胞量測術圖之一組圖。圖3D為展示myc + 4OHT +抗CTLA-4處理組(「7SL未遮蔽」)及myc + EtOH +抗CTLA-4處理組(「7SL未活化」)之CD206+巨噬細胞%之圖。圖3E及圖3F：向小鼠植入相同腫瘤且隨後用CSF1R抑制劑BLZ945處理。圖3E為展示CD45+細胞中M2巨噬細胞之百分比之圖。圖3F為展示CD45+細胞中CD103+ DC之百分比之圖。
圖4A、圖4B、圖4C、圖4D、圖4E及圖4F為展示測試7SL、抗CTLA-4及/或抗PD-1抗體及CSF1R抑制劑BLZ945之組合之小鼠研究的結果之圖。圖4A、圖4C及圖4E為展示各測試組之腫瘤體積(cm3 )之圖。圖4B及圖4D為展示各測試組之存活百分比之圖。7SL未遮蔽= myc-ER + 4OHT，7SL遮蔽= myc-ER/SRP + 4OHT，7SL未活化= myc-ER + EtOH。圖4F：向小鼠植入腫瘤且用抗CTLA4 +/- BLZ945處理。收集腫瘤且使用流式細胞量測術資料之無偏叢集評估免疫群體。強調活化CD4+。
圖5A及圖5B為展示測試胰管腺癌(PDA)小鼠模型中7SL、抗CTLA-4抗體、抗PD-1抗體及CSF1R抑制劑BLZ945之組合之研究的結果之圖。在圖5A及圖5B中，繪製各處理組的腫瘤體積(cm3 )相對於測試時間點。
圖6A及圖6B為展示測試鼠類h19BBz-P2A-HP (髮夾) CAR T細胞之活體外研究的結果之圖。經轉導之鼠類T細胞置於具有未處理鼠類脾細胞之培養物中24小時。圖6A為展示巨噬細胞上CD80之表現、DC上CD80之表現及旁觀T細胞上CD69之表現的一組直方圖。藍色對應於經h19BBz CAR轉導之鼠類T細胞之處理組。紅色對應於經h19BBz-P2A-HP CAR轉導之鼠類T細胞之處理組。圖6B為展示經h19BBz CAR或h19BBz-P2A-HP CAR轉導之鼠類T細胞之處理組的成熟DC上CD80之表現、成熟DC上CD86之表現、M1巨噬細胞之百分比及CD69+ T細胞之百分比的一組條形圖。
圖7A、圖7B、圖7C、圖7D、圖7E及圖7F為展示測試鼠類h19BBz CAR T細胞及鼠類h19BBz-P2A-HP (髮夾) CAR T細胞之小鼠研究的結果之圖。圖7A及圖7B為展示接受鼠類h19BBz CAR T細胞或未經處理T細胞之小鼠的腫瘤體積(cm3 )及存活百分比之圖。圖7C為展示接受鼠類h19BBz CAR T細胞或鼠類h19BBz-P2A-HP CAR T細胞之小鼠的腫瘤體積(cm3 )之圖。評估相同小鼠之腫瘤的腫瘤內免疫活化。圖7D、圖7E及圖7F分別為展示CD45+細胞中樹突狀細胞之%、CD206+ M2巨噬細胞%及CD69+ T細胞%之圖。
圖8A為synNotch系統之示意圖。在圖8B及圖8C中，初級人類T細胞經hCD19 synNotch及Gal4-GFP構築體轉導，且與K562-null (圖8C)或K562-CD19表現(圖8B)靶細胞一起培養。T細胞中之GFP表現在24小時後量測。圖8B及圖8C為展示GFP表現量之一對流式細胞量測術圖。
圖9A及圖9B：初級人類T細胞經抗hCD19 synNotch及Gal4-HP構築體轉導，且隨後與K562-CD19靶細胞及PBMC一起培養。抗hCD19 synNotch包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列。Gal4-HP DNA構築體包含SEQ ID NO: 27之核苷酸序列。圖9A為展示來自Gal4-HP或Gal4-Null培養物之T細胞上的CD69量測之一對圖。圖9B為展示循環DC上之CD86表現的一組圖。
圖10A、圖10B、圖10C及圖10D為展示測試鼠類CD19 CAR T細胞之小鼠研究的結果之圖。圖10A及圖10B：B16-hCD19腫瘤植入至小鼠之側腹中。5天後小鼠接受5百萬個h19BBz CAR T細胞之輸注。量測腫瘤生長(圖10A)及存活(圖10B)。圖10C及圖10D：1:1 hCD19:WT混合腫瘤注射至小鼠之側腹中。在第13天量測腫瘤(圖10D)且處死小鼠。接受h19BBz或保持未經處理之小鼠中的hCD19表現藉由流式細胞量測術來量測(圖10C)。
圖11A：由7SL1錨定之信號識別粒子的結構性呈現(Halic與Beckman, Curr Op Mol Bio 2005)。圖11B、圖11C及圖11D：腫瘤內免疫群體之活化的提議模型。在不希望受理論束縛的情況下，腫瘤中存在之未遮蔽7SL RNA可驅動樹突狀細胞募集及後續T細胞活化，此繼而可驅動腫瘤控制，例如在CSF1R抑制劑存在下。未遮蔽7SL RNA之效應可使用由經工程改造T細胞(例如CAR T細胞)表現之刺激RNA複製。圖11E：來自TCGA肺腺癌樣品之RNA-Seq分析藉由未遮蔽7SL1 RNA之水準分離為各四分位數，且圖示指定基因之表現。
圖12A、圖12B及圖12C：未遮蔽7SL增加DC浸潤及腫瘤內T細胞活化，視宿主MyD88信號傳導而定。經轉導以表現4OHT誘導性myc蛋白之MEF使用4OHT活化且與B16-F10黑素瘤細胞以1:1比率植入至小鼠中。腫瘤在13天後經分離且藉由流式細胞量測術評估以測定DC之頻率(圖12A)及T細胞之活化(圖12B)。圖12C：相同實驗在缺乏信號傳導銜接子蛋白MyD88之小鼠中進行且評估T細胞活化。
圖13A、圖13B及圖13C分別為展示髮夾RNA、人類7SL1 RNA及Alu RNA之預測二級結構之圖。圖13A揭示SEQ ID NO: 10。圖13B揭示SEQ ID NO: 851。圖13C按出現之次序分別揭示SEQ ID NO: 852-853。
圖14A、圖14B、圖14C及圖14D：腫瘤微環境(TME)中之未遮蔽RN7SL1增強DC及T細胞活化。圖14A為用於評估未遮蔽RN7SL1對活體內免疫浸潤及活化之影響的MEF系統及腫瘤/MEF共植入設置之示意性圖示。圖14B、圖14C、圖14D及圖14E為展示注射後2週收集之腫瘤中指定促炎性免疫群體之相對頻率的圖。
圖15A及圖15B：TME中之未遮蔽RN7SL1增加腫瘤相關巨噬細胞(TAM)以及骨髓衍生之抑制細胞(MDSC)。圖15A為展示注射後2週收集之腫瘤中指定免疫抑制群體之相對頻率的一對圖。圖15B為展示在用未遮蔽RN7SL1或遮蔽RN7SL1處理之後的TAM及MDSC之染色之一對代表性流式細胞量測術圖。
圖16A、圖16B及圖16C：M2極化之抑制展現未遮蔽RN7SL1之免疫刺激效應。圖16A為展示CSF1R抑制劑阻斷M2極化且可與未遮蔽RN7SL1協同作用之示意圖。圖16B為展示在未遮蔽或遮蔽RN7SL1存在下用抗PD1抗體及抗CTLA-4抗體處理之小鼠的存活百分比之圖。圖16C為展示在未遮蔽或遮蔽RN7SL1存在下用抗PD1抗體、抗CTLA-4抗體及CSF1R抑制劑處理之小鼠的存活百分比之圖。
圖17A、圖17B、圖17C及圖17D：7SL RNA對人類DC為刺激性的。活體外轉錄之RNA經分離且使用脂染胺轉染至健康供體人類PBMC中。48小時後藉由流式細胞量測術評估DC。DC門控為Dump-、CD14-、CD200-、CD11c+、HLA-DR+細胞。圖17A為展示實驗條件之示意圖。圖17B為展示經零亂RNA (Scr)對照處理之PBMC以及經7SL處理之PBMC之DC頻率的倍數變化之圖。圖17C為展示經Scr或7SL處理之PBMC之Batf3 MFI的倍數變化之圖。圖17D為展示經Scr或7SL處理之PBMC之CD86 MFI的倍數變化之圖。
圖18A、圖18B、圖18C、圖18D、圖18E、圖18F及圖18G：經7SL RNA刺激之鼠類BMDC引發增強之T細胞反應。圖18A為展示實驗條件之示意圖。圖18B、圖18C及圖18D分別為展示經7SL處理之BMDC、經零亂RNA處理之BMDC及無BMDC樣品的%IFNγ+細胞、%TNFα+細胞及%PD1+細胞之圖。圖18E、圖18F及圖18G分別為展示與經7SL刺激之BMDC、經零亂RNA處理之BMDC及無BMDC一起培養的T細胞中之TNFα表現之圖。
圖19A、圖19B及圖19C：直接注射7SL驅動腫瘤中增強之免疫活化。圖19A為展示實驗條件之示意圖。圖19B為展示7SL RNA組及零亂對照RNA組中呈CD45+細胞之百分比形式的DC之%之圖。圖19C為展示7SL RNA組及零亂對照RNA組中CD69+ T細胞之%之圖。
圖20A、圖20B、圖20C及圖20D：直接注射7SL RNA改良對ICB之反應。圖20A為展示實驗條件之示意圖。圖20B為展示在第14天量測的經7SL及零亂處理之組之腫瘤體積的圖。圖20C為展示用7SL或零亂對照RNA與ICB處理之小鼠的存活百分比之圖。圖20D為展示用7SL RNA或無RNA與ICB處理之小鼠的存活百分比之圖。
圖21A、圖21B、圖21C、圖21D及圖21E：19BBz-7SL CAR T細胞比親本或對照CAR T細胞更穩固地控制腫瘤。在第5天及第12天靜脈內向小鼠植入B19-h19腫瘤及表現h19BBz之既定mCAR T細胞。第8天、第11天及第14天指示時投與抗CTLA4。N=2個組合之實驗。圖21A為展示表現19BBz CAR分子之構築體(上)及表現19BBz CAR分子及7SL RNA或零亂對照RNA之構築體(下)的一對示意圖。圖21B為展示19BBz組(左)及19BBz-7SL組(右)之CAR表現的一對流式細胞量測術圖。圖21C為展示在不添加抗CTLA4之情況下如所指示用各種CAR T細胞處理之小鼠的存活百分比之圖。圖21D為展示在添加抗CTLA4之情況下如所指示用各種CAR T細胞處理之小鼠的存活百分比之圖。圖21E為展示在第14天量測之19BBz-7SL +抗CTLA4組、19BBz-Scr +抗CTLA4組、19BBz +抗CTLA4組、無T +抗CTLA4組及UTD +抗CTLA4組之腫瘤體積的圖。
圖22A、圖22B及圖22C：19BBz-7SL CAR T細胞改變內源免疫活化。在第5天及第12天靜脈內向小鼠植入B19-h19腫瘤及既定19BBz-7SL或19BBz-Scr mCAR T細胞。在第15天收集腫瘤。圖22A、圖22B及圖22C分別為展示19BBz-7SL組及19BBz-Scr組的作為CD45+細胞之百分比形式之樹突狀細胞、%Ki67+內源T細胞及作為CD45+細胞之百分比形式之M2巨噬細胞的圖。
圖23為展示在不具有內源T細胞之TCRa基因剔除小鼠中用19BBz-7SL +抗CTLA4、19BBz-Scr +抗CTLA-4及19BBz +抗CTLA4處理之小鼠的存活百分比之圖。

Claims (58)

  1. 一種組合物，其包含表現會與第一抗原，例如第一腫瘤抗原結合之嵌合抗原受體(CAR)分子的細胞(例如細胞群體)(「CAR表現細胞」)，該細胞與RNA分子(例如外源RNA分子)或編碼RNA分子之核酸分子(例如外源核酸分子)組合用於治療患有與該第一抗原，例如該第一腫瘤抗原之表現相關之疾病的個體，例如患有癌症之個體，其中： 該RNA分子包含第一RNA序列(例如第一外源RNA序列)及第二RNA序列(例如第二外源RNA序列)，其中該第一RNA序列與該第二RNA序列至少80%、85%或90%互補，其中該第一RNA序列長度為至少20個核苷酸且該第二RNA序列長度為至少20個核苷酸，其中該RNA分子具有以下特性中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12者或全部)： (i)該RNA分子活化模式識別受體(PRR)，例如視黃酸誘導基因I (RIG-I)； (ii)該RNA分子活化樹突狀細胞(DC)，例如：如藉由量測DC中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測DC中CD80、CD86或鹼性白胺酸拉鏈轉錄因子ATF-樣3(Batf3)表現之增加，或：如藉由量測DC激活CD8+ T細胞之能力； (iii)該RNA分子活化巨噬細胞，例如：如藉由量測巨噬細胞中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測巨噬細胞中CD80表現之增加； (iv)該RNA分子活化T細胞，例如：如藉由量測T細胞中活化標記物表現之增加、T細胞擴增之增加、或T細胞所產生細胞介素之增加，例如：如藉由量測T細胞中CD69或PD-1表現之增加，或如藉由量測T細胞所產生之IFNγ或TNFα； (v)該RNA分子增強免疫浸潤至腫瘤中，例如DC或T細胞浸潤至腫瘤中； (vi)該RNA分子減少腫瘤生長； (vii)該RNA分子提高該個體之存活； (viii)該RNA分子增強該個體對該等CAR表現細胞或檢查點調節劑(例如抗PD-1抗體分子、抗PD-L1抗體分子、抗CTLA-4抗體分子、抗TIM-3抗體分子或抗LAG-3抗體分子)之反應性； (ix)該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合； (x)該RNA分子為天然存在之RN7SL1 RNA分子的功能變異體，其中該RNA分子保留該天然存在之RN7SL1 RNA分子的全部或部分免疫原性特性，視情況其中該RNA分子顯示比該天然存在之RN7SL1 RNA分子降低的與SRP9及/或SRP14之結合性，例如該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合； (xi)該RNA分子不為聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)； (xii)該RNA分子不具有RNAi或反義抑制活性或該RNA分子具有最小RNAi或反義抑制活性；或 (xiii)該RNA分子與天然存在之人類基因具有不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%序列一致性。
  2. 一種治療患有與第一抗原，例如第一腫瘤抗原之表現相關的疾病之個體之方法，例如一種治療患有癌症之個體之方法，其包含向該個體投與有效數量之表現會與該第一抗原，例如該第一腫瘤抗原結合之嵌合抗原受體(CAR)分子的細胞(例如細胞群體)(「CAR表現細胞」)，與RNA分子(例如外源RNA分子)或編碼RNA分子之核酸分子(例如外源核酸分子)的組合，其中該RNA分子包含第一RNA序列(例如第一外源RNA序列)及第二RNA序列(例如第二外源RNA序列)，其中該第一RNA序列與該第二RNA序列至少80%、85%或90%互補，其中該第一RNA序列長度為至少20個核苷酸且該第二RNA序列長度為至少20個核苷酸，其中該RNA分子具有以下特性中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12者或全部)： (i)該RNA分子活化模式識別受體(PRR)，例如視黃酸誘導基因I (RIG-I)； (ii)該RNA分子活化樹突狀細胞(DC)，例如：如藉由量測DC中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測DC中CD80、CD86或鹼性白胺酸拉鏈轉錄因子ATF-樣3(Batf3)表現之增加，或：如藉由量測DC激活CD8+ T細胞之能力； (iii)該RNA分子活化巨噬細胞，例如：如藉由量測巨噬細胞中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測巨噬細胞中CD80表現之增加； (iv)該RNA分子活化T細胞，例如：如藉由量測T細胞中活化標記物表現之增加、T細胞擴增之增加、或T細胞所產生細胞介素之增加，例如：如藉由量測T細胞中CD69或PD-1表現之增加，或如藉由量測T細胞所產生之IFNγ或TNFα； (v)該RNA分子增強免疫浸潤至腫瘤中，例如DC或T細胞浸潤至腫瘤中； (vi)該RNA分子減少腫瘤生長； (vii)該RNA分子提高該個體之存活； (viii)該RNA分子增強該個體對該等CAR表現細胞或檢查點調節劑(例如抗PD-1抗體分子、抗PD-L1抗體分子、抗CTLA-4抗體分子、抗TIM-3抗體分子或抗LAG-3抗體分子)之反應性； (ix)該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合； (x)該RNA分子為天然存在之RN7SL1 RNA分子的功能變異體，其中該RNA分子保留該天然存在之RN7SL1 RNA分子的全部或部分免疫原性特性，視情況其中該RNA分子顯示比該天然存在之RN7SL1 RNA分子降低的與SRP9及/或SRP14之結合性，例如該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合； (xi)該RNA分子不為聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)； (xii)該RNA分子不具有RNAi或反義抑制活性或該RNA分子具有最小RNAi或反義抑制活性；或 (xiii)該RNA分子與天然存在之人類基因具有不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%序列一致性。
  3. 一種在患有癌症之個體中提供抗癌免疫反應之方法，其包含向該個體投與有效數量之表現會與第一抗原，例如第一腫瘤抗原結合之嵌合抗原受體(CAR)分子的細胞(例如細胞群體)(「CAR表現細胞」)，與RNA分子(例如外源RNA分子)或編碼RNA分子之核酸分子(例如外源核酸分子)的組合，其中該RNA分子包含第一RNA序列(例如第一外源RNA序列)及第二RNA序列(例如第二外源RNA序列)，其中該第一RNA序列與該第二RNA序列至少80%、85%或90%互補，其中該第一RNA序列長度為至少20個核苷酸且該第二RNA序列長度為至少20個核苷酸，其中該RNA分子具有以下特性中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12者或全部)： (i)該RNA分子活化模式識別受體(PRR)，例如視黃酸誘導基因I (RIG-I)； (ii)該RNA分子活化樹突狀細胞(DC)，例如：如藉由量測DC中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測DC中CD80、CD86或鹼性白胺酸拉鏈轉錄因子ATF-樣3(Batf3)表現之增加，或：如藉由量測DC激活CD8+ T細胞之能力； (iii)該RNA分子活化巨噬細胞，例如：如藉由量測巨噬細胞中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測巨噬細胞中CD80表現之增加； (iv)該RNA分子活化T細胞，例如：如藉由量測T細胞中活化標記物表現之增加、T細胞擴增之增加、或T細胞所產生細胞介素之增加，例如：如藉由量測T細胞中CD69或PD-1表現之增加，或如藉由量測T細胞所產生之IFNγ或TNFα； (v)該RNA分子增強免疫浸潤至腫瘤中，例如DC或T細胞浸潤至腫瘤中； (vi)該RNA分子減少腫瘤生長； (vii)該RNA分子提高該個體之存活； (viii)該RNA分子增強該個體對該等CAR表現細胞或檢查點調節劑(例如抗PD-1抗體分子、抗PD-L1抗體分子、抗CTLA-4抗體分子、抗TIM-3抗體分子或抗LAG-3抗體分子)之反應性； (ix)該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合； (x)該RNA分子為天然存在之RN7SL1 RNA分子的功能變異體，其中該RNA分子保留該天然存在之RN7SL1 RNA分子的全部或部分免疫原性特性，視情況其中該RNA分子顯示比該天然存在之RN7SL1 RNA分子降低的與SRP9及/或SRP14之結合性，例如該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合； (xi)該RNA分子不為聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)； (xii)該RNA分子不具有RNAi或反義抑制活性或該RNA分子具有最小RNAi或反義抑制活性；或 (xiii)該RNA分子與天然存在之人類基因具有不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%序列一致性。
  4. 一種核酸分子(例如外源核酸分子)，其包含(1)編碼會與第一抗原，例如第一腫瘤抗原結合之嵌合抗原受體(CAR)分子的第一核酸分子(例如第一外源核酸分子)，及(2)包含RNA分子(例如外源RNA分子)或編碼RNA分子之核酸分子(例如外源核酸分子)的第二核酸分子(例如第二外源核酸分子)，其中該RNA分子包含第一RNA序列(例如第一外源RNA序列)及第二RNA序列(例如第二外源RNA序列)，其中該第一RNA序列與該第二RNA序列至少80%、85%或90%互補，其中該第一RNA序列長度為至少20個核苷酸且該第二RNA序列長度為至少20個核苷酸，其中該RNA分子具有以下特性中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12者或全部)： (i)該RNA分子活化模式識別受體(PRR)，例如視黃酸誘導基因I (RIG-I)； (ii)該RNA分子活化樹突狀細胞(DC)，例如：如藉由量測DC中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測DC中CD80、CD86或鹼性白胺酸拉鏈轉錄因子ATF-樣3(Batf3)表現之增加，或：如藉由量測DC激活CD8+ T細胞之能力； (iii)該RNA分子活化巨噬細胞，例如：如藉由量測巨噬細胞中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測巨噬細胞中CD80表現之增加； (iv)該RNA分子活化T細胞，例如：如藉由量測T細胞中活化標記物表現之增加、T細胞擴增之增加、或T細胞所產生細胞介素之增加，例如：如藉由量測T細胞中CD69或PD-1表現之增加，或如藉由量測T細胞所產生之IFNγ或TNFα； (v)該RNA分子增強免疫浸潤至腫瘤中，例如DC或T細胞浸潤至腫瘤中； (vi)該RNA分子減少腫瘤生長； (vii)該RNA分子提高該個體之存活； (viii)該RNA分子增強該個體對該等CAR表現細胞或檢查點調節劑(例如抗PD-1抗體分子、抗PD-L1抗體分子、抗CTLA-4抗體分子、抗TIM-3抗體分子或抗LAG-3抗體分子)之反應性； (ix)該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合； (x)該RNA分子為天然存在之RN7SL1 RNA分子的功能變異體，其中該RNA分子保留該天然存在之RN7SL1 RNA分子的全部或部分免疫原性特性，視情況其中該RNA分子顯示比該天然存在之RN7SL1 RNA分子降低的與SRP9及/或SRP14之結合性，例如該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合； (xi)該RNA分子不為聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)； (xii)該RNA分子不具有RNAi或反義抑制活性或該RNA分子具有最小RNAi或反義抑制活性；或 (xiii)該RNA分子與天然存在之人類基因具有不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%序列一致性。
  5. 一種細胞，例如免疫細胞，例如T細胞或NK細胞，其包含如請求項4之核酸分子。
  6. 一種細胞，例如免疫細胞，例如T細胞或NK細胞，其包含(1)編碼會與第一抗原，例如第一腫瘤抗原結合之嵌合抗原受體(CAR)分子的第一核酸分子(例如第一外源核酸分子)，及(2)包含RNA分子(例如外源RNA分子)或編碼RNA分子之核酸分子(例如外源核酸分子)的第二核酸分子(例如第二外源核酸分子)，其中該RNA分子包含第一RNA序列(例如第一外源RNA序列)及第二RNA序列(例如第二外源RNA序列)，其中該第一RNA序列與該第二RNA序列至少80%、85%或90%互補，其中該第一RNA序列長度為至少20個核苷酸且該第二RNA序列長度為至少20個核苷酸，其中該RNA分子具有以下特性中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12者或全部)： (i)該RNA分子活化模式識別受體(PRR)，例如視黃酸誘導基因I (RIG-I)； (ii)該RNA分子活化樹突狀細胞(DC)，例如：如藉由量測DC中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測DC中CD80、CD86或鹼性白胺酸拉鏈轉錄因子ATF-樣3(Batf3)表現之增加，或：如藉由量測DC激活CD8+ T細胞之能力； (iii)該RNA分子活化巨噬細胞，例如：如藉由量測巨噬細胞中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測巨噬細胞中CD80表現之增加； (iv)該RNA分子活化T細胞，例如：如藉由量測T細胞中活化標記物表現之增加、T細胞擴增之增加、或T細胞所產生細胞介素之增加，例如：如藉由量測T細胞中CD69或PD-1表現之增加，或如藉由量測T細胞所產生之IFNγ或TNFα； (v)該RNA分子增強免疫浸潤至腫瘤中，例如DC或T細胞浸潤至腫瘤中； (vi)該RNA分子減少腫瘤生長； (vii)該RNA分子提高該個體之存活； (viii)該RNA分子增強該個體對該等CAR表現細胞或檢查點調節劑(例如抗PD-1抗體分子、抗PD-L1抗體分子、抗CTLA-4抗體分子、抗TIM-3抗體分子或抗LAG-3抗體分子)之反應性； (ix)該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合； (x)該RNA分子為天然存在之RN7SL1 RNA分子的功能變異體，其中該RNA分子保留該天然存在之RN7SL1 RNA分子的全部或部分免疫原性特性，視情況其中該RNA分子顯示比該天然存在之RN7SL1 RNA分子降低的與SRP9及/或SRP14之結合性，例如該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合； (xi)該RNA分子不為聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)； (xii)該RNA分子不具有RNAi或反義抑制活性或該RNA分子具有最小RNAi或反義抑制活性；或 (xiii)該RNA分子與天然存在之人類基因具有不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%序列一致性。
  7. 一種細胞群體，其包含(1)第一細胞，例如免疫細胞，例如T細胞或NK細胞，該第一細胞包含編碼會與第一抗原，例如第一腫瘤抗原結合之嵌合抗原受體(CAR)分子的第一核酸分子(例如第一外源核酸分子)，及(2)第二細胞，該第二細胞包括包含RNA分子(例如外源RNA分子)或編碼RNA分子之核酸分子(例如外源核酸分子)的第二核酸分子(例如第二外源核酸分子)，其中該RNA分子包含第一RNA序列(例如第一外源RNA序列)及第二RNA序列(例如第二外源RNA序列)，其中該第一RNA序列與該第二RNA序列至少80%、85%或90%互補，其中該第一RNA序列長度為至少20個核苷酸且該第二RNA序列長度為至少20個核苷酸，其中該RNA分子具有以下特性中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12者或全部)： (i)該RNA分子活化模式識別受體(PRR)，例如視黃酸誘導基因I (RIG-I)； (ii)該RNA分子活化樹突狀細胞(DC)，例如：如藉由量測DC中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測DC中CD80、CD86或鹼性白胺酸拉鏈轉錄因子ATF-樣3(Batf3)表現之增加，或：如藉由量測DC激活CD8+ T細胞之能力； (iii)該RNA分子活化巨噬細胞，例如：如藉由量測巨噬細胞中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測巨噬細胞中CD80表現之增加； (iv)該RNA分子活化T細胞，例如：如藉由量測T細胞中活化標記物表現之增加、T細胞擴增之增加、或T細胞所產生細胞介素之增加，例如：如藉由量測T細胞中CD69或PD-1表現之增加，或如藉由量測T細胞所產生之IFNγ或TNFα； (v)該RNA分子增強免疫浸潤至腫瘤中，例如DC或T細胞浸潤至腫瘤中； (vi)該RNA分子減少腫瘤生長； (vii)該RNA分子提高該個體之存活； (viii)該RNA分子增強該個體對該等CAR表現細胞或檢查點調節劑(例如抗PD-1抗體分子、抗PD-L1抗體分子、抗CTLA-4抗體分子、抗TIM-3抗體分子或抗LAG-3抗體分子)之反應性； (ix)該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合； (x)該RNA分子為天然存在之RN7SL1 RNA分子的功能變異體，其中該RNA分子保留該天然存在之RN7SL1 RNA分子的全部或部分免疫原性特性，視情況其中該RNA分子顯示比該天然存在之RN7SL1 RNA分子降低的與SRP9及/或SRP14之結合性，例如該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合； (xi)該RNA分子不為聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)； (xii)該RNA分子不具有RNAi或反義抑制活性或該RNA分子具有最小RNAi或反義抑制活性；或 (xiii)該RNA分子與天然存在之人類基因具有不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%序列一致性， 視情況其中： 該第一核酸分子及該第二核酸分子安置於不同細胞中。
  8. 一種醫藥組合物，其包含如請求項4至7中任一項之核酸分子、細胞或細胞群體及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。
  9. 一種治療患有與第一抗原，例如第一腫瘤抗原之表現相關的疾病之個體之方法，例如一種治療患有癌症之個體之方法，其包含向該個體投與有效量之如請求項4至8中任一項之核酸分子、細胞、細胞群體或醫藥組合物。
  10. 一種在患有癌症之個體中提供抗癌免疫反應之方法，其包含向該個體投與有效量之如請求項4至8中任一項之核酸分子、細胞、細胞群體或醫藥組合物。
  11. 一種製備細胞之方法，其包含： (1)提供細胞，例如免疫細胞，例如T細胞或NK細胞，該細胞包含編碼會與第一抗原，例如第一腫瘤抗原結合之嵌合抗原受體(CAR)分子的第一核酸分子(例如第一外源核酸分子)，及 (2)使該細胞離體與包含RNA分子(例如外源RNA分子)或編碼RNA分子之核酸分子(例如外源核酸分子)的第二核酸分子(例如第二外源核酸分子)接觸，其中該RNA分子包含第一RNA序列(例如第一外源RNA序列)及第二RNA序列(例如第二外源RNA序列)，其中該第一RNA序列與該第二RNA序列至少80%、85%或90%互補，其中該第一RNA序列長度為至少20個核苷酸且該第二RNA序列長度為至少20個核苷酸，其中該RNA分子具有以下特性中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12者或全部)： (i)該RNA分子活化模式識別受體(PRR)，例如視黃酸誘導基因I (RIG-I)； (ii)該RNA分子活化樹突狀細胞(DC)，例如：如藉由量測DC中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測DC中CD80、CD86或鹼性白胺酸拉鏈轉錄因子ATF-樣3(Batf3)表現之增加，或：如藉由量測DC激活CD8+ T細胞之能力； (iii)該RNA分子活化巨噬細胞，例如：如藉由量測巨噬細胞中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測巨噬細胞中CD80表現之增加； (iv)該RNA分子活化T細胞，例如：如藉由量測T細胞中活化標記物表現之增加、T細胞擴增之增加、或T細胞所產生細胞介素之增加，例如：如藉由量測T細胞中CD69或PD-1表現之增加，或如藉由量測T細胞所產生之IFNγ或TNFα； (v)該RNA分子增強免疫浸潤至腫瘤中，例如DC或T細胞浸潤至腫瘤中； (vi)該RNA分子減少腫瘤生長； (vii)該RNA分子提高該個體之存活； (viii)該RNA分子增強該個體對該等CAR表現細胞或檢查點調節劑(例如抗PD-1抗體分子、抗PD-L1抗體分子、抗CTLA-4抗體分子、抗TIM-3抗體分子或抗LAG-3抗體分子)之反應性； (ix)該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合； (x)該RNA分子為天然存在之RN7SL1 RNA分子的功能變異體，其中該RNA分子保留該天然存在之RN7SL1 RNA分子的全部或部分免疫原性特性，視情況其中該RNA分子顯示比該天然存在之RN7SL1 RNA分子降低的與SRP9及/或SRP14之結合性，例如該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合； (xi)該RNA分子不為聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)； (xii)該RNA分子不具有RNAi或反義抑制活性或該RNA分子具有最小RNAi或反義抑制活性；或 (xiii)該RNA分子與天然存在之人類基因具有不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%序列一致性。
  12. 如請求項1至11中任一項之用途、方法、核酸分子、細胞、細胞群體或醫藥組合物，其中： (i)該第一RNA序列長度為至少25、30、35、40、45或50個核苷酸；且 (ii)該第二RNA序列長度為至少25、30、35、40、45或50個核苷酸。
  13. 如請求項1至12中任一項之用途、方法、核酸分子、細胞、細胞群體或醫藥組合物，其中該第一RNA序列及該第二RNA序列形成長度為至少20、25、30、35、40、45或50個鹼基對之雙股RNA分子。
  14. 如請求項1至13中任一項之用途、方法、核酸分子、細胞、細胞群體或醫藥組合物，其中該第一RNA序列與該第二RNA序列100%互補。
  15. 如請求項1至14中任一項之用途、方法、核酸分子、細胞、細胞群體或醫藥組合物，其中該第一RNA序列及該第二RNA序列安置於一個RNA分子上，例如該第一RNA序列及該第二RNA序列形成髮夾結構，例如莖-環結構，例如莖-環結構中，該莖長度為至少20、25、30、35、40、45或50個鹼基對，例如其中該環長度為2-10、3-8或4-6個核苷酸。
  16. 如請求項1至15中任一項之用途、方法、核酸分子、細胞、細胞群體或醫藥組合物，其中該第一RNA序列及該第二RNA序列安置於分別的RNA分子上。
  17. 如請求項1至16中任一項之用途、方法、核酸分子、細胞、細胞群體或醫藥組合物，其中該RNA分子包含一或多個Alu結構域，視情況其中該Alu結構域包含SEQ ID NO: 4或6之胺基酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。
  18. 如請求項1至17中任一項之用途、方法、核酸分子、細胞、細胞群體或醫藥組合物，其中該RNA分子包含SEQ ID NO: 2、4、6、8、10之核苷酸序列或其功能變異體。
  19. 如請求項1至18中任一項之用途、方法、核酸分子、細胞、細胞群體或醫藥組合物，其中該RNA分子包含選自SEQ ID NO: 2、4、6、8或10之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。
  20. 如請求項1至19中任一項之用途、方法、核酸分子、細胞、細胞群體或醫藥組合物，其中編碼該RNA分子之核酸分子包含SEQ ID NO: 1、3、5、7、9之核苷酸序列或其功能變異體。
  21. 如請求項1至20中任一項之用途、方法、核酸分子、細胞、細胞群體或醫藥組合物，其中編碼該RNA分子之核酸分子包含選自SEQ ID NO: 1、3、5、7或9之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。
  22. 如請求項1至21中任一項之用途、方法、核酸分子、細胞、細胞群體或醫藥組合物，其中該RNA分子包含5'-三磷酸(5'ppp)。
  23. 如請求項1至22中任一項之用途、方法、核酸分子、細胞、細胞群體或醫藥組合物，其中該RNA分子包含至少一個經化學修飾之核苷酸。
  24. 如請求項1至23中任一項之用途、方法、核酸分子、細胞、細胞群體或醫藥組合物，其中編碼該RNA分子之核酸分子為DNA分子。
  25. 如請求項1至3、9、10或12至24中任一項之用途或方法，其中該RNA分子或編碼該RNA分子之核酸分子係與部份體連接，例如會與腫瘤抗原或組織抗原結合之靶向部分體，例如會與該第一抗原，例如該第一腫瘤抗原結合之部分體，視情況其中該個體具有腫瘤且該部分體使該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子靶向該腫瘤或腫瘤微環境。
  26. 如請求項1至3、9、10或12至25中任一項之用途或方法，其中該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子係全身或局部投與，視情況其中該個體具有腫瘤且該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子係經由腫瘤內投藥。
  27. 如請求項1至3、9、10或12至26中任一項之用途或方法，其中該用途或方法包含投與編碼該RNA分子之該核酸分子，其中該RNA分子之表現為可誘導性，視情況其中該個體具有腫瘤且可在該腫瘤或腫瘤微環境中誘導該RNA分子之表現。
  28. 如請求項1至3、9、10或12至27中任一項之用途或方法，其中該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子係於囊泡中，例如於胞外體、脂質體或細胞中投與。
  29. 如請求項1至3、9、10或12至28中任一項之用途或方法，其中該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子安置於與該CAR分子相同之細胞中。
  30. 如請求項29之用途或方法，其中該細胞包含編碼該CAR分子之第一核酸分子(例如第一外源核酸分子)及包含該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子的第二核酸分子(例如第二外源核酸分子)。
  31. 如請求項4至8、12至24或30中任一項之用途、方法、核酸分子、細胞、細胞群體或醫藥組合物，其中該第一核酸分子及該第二核酸分子安置於一個核酸分子上。
  32. 如請求項31之用途、方法、核酸分子、細胞、細胞群體或醫藥組合物，其中該一個核酸分子沿N末端至C末端方向具有以下排列：該第二核酸分子-連接子-該第一核酸分子，視情況其中該連接子編碼自身裂解位點，視情況其中該連接子編碼P2A位點、T2A位點、E2A位點或F2A位點，視情況其中該連接子編碼P2A位點，視情況其中： (i)該連接子包含SEQ ID NO: 23之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)，及/或 (ii)該第二核酸分子包含SEQ ID NO: 9之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。
  33. 如請求項4至8、12至24或30中任一項之用途、方法、核酸分子、細胞、細胞群體或醫藥組合物，其中該第一核酸分子及該第二核酸分子安置於分別的核酸分子上。
  34. 如請求項4至8、12至24或30中任一項之用途、方法、核酸分子、細胞、細胞群體或醫藥組合物，其中該細胞包含編碼synNotch多肽之第三核酸分子，其中該synNotch多肽包含： (i)胞外結構域，其包含非天然存在於Notch受體多肽中且特異性結合至第二抗原，例如第二腫瘤抗原之第二抗原結合結構域，視情況其中該第二抗原與該第一抗原相同，或該第二抗原與該第一抗原不同； (ii) Notch受體多肽，其包含配體誘導性蛋白水解裂解位點，例如包含Lin 12-Notch重複序列之Notch調節區、S2蛋白水解裂解位點或包含S3蛋白水解裂解位點之跨膜結構域；及 (iii)胞內結構域，其包含轉錄因子，其中： 該第二抗原結合結構域與該第二抗原，例如該第二腫瘤抗原之結合誘導該配體誘導性蛋白水解裂解位點處之裂解，例如誘導該S2及/或S3蛋白水解裂解位點處之裂解，因而釋出包含該轉錄因子之胞內結構域，其中： 該轉錄因子一旦釋出，即活化編碼該RNA分子之該核酸分子的轉錄，視情況其中： (a)該轉錄因子包含Gal4 DNA結合結構域及視情況VP64轉錄活化結構域，且 (b)編碼該RNA分子之該核酸分子的N末端連接於Gal4上游活化序列，視情況其中： (1)該synNotch多肽包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)，且 (2)該Gal4上游活化序列包含SEQ ID NO: 18之核苷酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入、缺失或修飾之序列)。
  35. 如請求項1至3、9、10或12至28中任一項之用途或方法，其中該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子安置於與該CAR分子不同之細胞中。
  36. 如請求項1至35中任一項之用途、方法、核酸分子、細胞、細胞群體或醫藥組合物，其中該CAR分子沿N末端至C末端方向包含結合至該第一抗原，例如該第一腫瘤抗原之第一抗原結合結構域；跨膜結構域；及胞內信號傳導結構域，視情況其中該第一抗原結合結構域藉由鉸鏈結構域連接至該跨膜結構域。
  37. 如請求項1至36中任一項之用途、方法、核酸分子、細胞、細胞群體或醫藥組合物，其中該第一或第二抗原係選自：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1；C型凝集素樣分子-1，CD33；表皮生長因子受體變異體III (EGFRvIII)；神經節苷脂G2 (GD2)；神經節苷脂GD3；TNF受體家族成員；B細胞成熟抗原；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特異性膜抗原(PSMA)；受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1 (ROR1)；Fms樣酪胺酸激酶3 (FLT3)；腫瘤相關糖蛋白72 (TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮細胞黏附分子(EPCAM)；B7H3 (CD276)；KIT (CD117)；介白素-13受體次單元α-2；間皮素；介白素11受體α (IL-11Ra)；前列腺幹細胞抗原(PSCA)；蛋白酶絲胺酸21；血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)；路易(Lewis)(Y)抗原；CD24；血小板衍生生長因子受體β (PDGFR-β)；階段特異性胚抗原-4 (SSEA-4)；CD20；葉酸受體α；受體酪胺酸-蛋白激酶ERBB2 (Her2/neu)；黏蛋白1，細胞表面相關(MUC1)；表皮生長因子受體(EGFR)；神經細胞黏附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸磷酸酶(PAP)；伸長因子2突變(ELF2M)；Ephrin B2；纖維母細胞活化蛋白α (FAP)；胰島素樣生長因子1受體(IGF-I受體)，碳酸酐酶IX (CAIX)；蛋白酶體(Prosome，Macropain)次單元，β型，9 (LMP2)；糖蛋白100 (gp100)；由斷點簇區(BCR)及Abelson鼠類白血病病毒性致癌基因同源物1 (Abl)組成之致癌基因多肽(bcr-abl)；酪胺酸酶；ephrin A型受體2 (EphA2)；海藻糖基GM1；唾液酸基路易(Lewis)黏附分子(sLe)；神經節苷脂GM3；轉麩醯胺酸酶5 (TGS5)；高分子量黑素瘤相關抗原(HMWMAA)；o-乙醯基-GD2神經節苷脂(OAcGD2)；葉酸受體β；腫瘤內皮標記物1 (TEM1/CD248)；腫瘤內皮標記物7相關(TEM7R)；緊密連接蛋白(claudin)6 (CLDN6)；促甲狀腺激素受體(TSHR)；G蛋白偶合受體C類第5組，成員D (GPRC5D)；染色體X開放閱讀框架61 (CXORF61)；CD97；CD179a；退行性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盤特異性1 (PLAC1)；globoH糖基神經醯胺之六醣部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白(uroplakin)2 (UPK2)；A型肝炎病毒細胞受體1 (HAVCR1)；腎上腺素受體β 3 (ADRB3)；泛連接蛋白(pannexin)3 (PANX3)；G蛋白偶合受體20 (GPR20)；淋巴細胞抗原6複合物，基因座K 9 (LY6K)；嗅覺受體51E2 (OR51E2)；TCR γ交替閱讀框架蛋白(TARP)；威爾姆斯腫瘤(Wilms tumor)蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1 (NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2 (LAGE-1a)；黑素瘤相關抗原1 (MAGE-A1)；ETS易位變異基因6，位於染色體12p上(ETV6-AML)；精子蛋白17 (SPA17)；X抗原家族，成員1A (XAGE1)；血管生成素結合細胞表面受體2 (Tie 2)；黑素瘤癌症睾丸抗原-1 (MAD-CT-1)；黑素瘤癌症睾丸抗原-2 (MAD-CT-2)；Fos相關抗原1；腫瘤蛋白p53 (p53)；p53突變體；前列腺蛋白；存活素；端粒酶；前列腺癌腫瘤抗原-1，由T細胞識別之黑素瘤抗原1；大鼠肉瘤(Ras)突變體；人類端粒酶反轉錄酶(hTERT)；肉瘤易位斷點；細胞凋亡之黑素瘤抑制劑(ML-IAP)；ERG (跨膜蛋白酶，絲胺酸2 (TMPRSS2) ETS融合基因)；N-乙醯基葡糖胺基-轉移酶V (NA17)；成對盒蛋白Pax-3 (PAX3)；雄激素受體；細胞週期素B1；v-myc禽類髓細胞瘤病病毒性致癌基因神經母細胞瘤衍生同源物(MYCN)；Ras同源物家族成員C (RhoC)；酪胺酸酶相關蛋白2 (TRP-2)；細胞色素P450 1B1 (CYP1B1)；CCCTC結合因子(鋅指蛋白)樣，由T細胞識別之鱗狀細胞癌抗原3 (SART3)；成對盒蛋白Pax-5 (PAX5)；前頂體素(proacrosin)結合蛋白sp32 (OY-TES1)；淋巴細胞特異性蛋白酪胺酸激酶(LCK)；激酶錨定蛋白4 (AKAP-4)；滑膜肉瘤，X斷點2 (SSX2)；晚期糖基化最終產物之受體(RAGE-1)；腎遍在蛋白(renal ubiquitous) 1 (RU1)；腎遍在蛋白2 (RU2)；豆莢蛋白；人類乳頭狀瘤病毒E6 (HPV E6)；人類乳頭狀瘤病毒E7 (HPV E7)；腸道羧基酯酶；突變之熱休克蛋白70-2 (mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白細胞相關免疫球蛋白樣受體1 (LAIR1)；IgA受體之Fc片段(FCAR或CD89)；白細胞免疫球蛋白樣受體亞家族A成員2 (LILRA2)；CD300分子樣家族成員f (CD300LF)；C型凝集素結構域家族12成員A (CLEC12A)；骨髓基質細胞抗原2 (BST2)；含EGF樣模組之黏蛋白樣激素受體樣2 (EMR2)；淋巴細胞抗原75 (LY75)；磷脂醯肌醇蛋白聚糖(Glypican)-3 (GPC3)；Fc受體樣5 (FCRL5)；或免疫球蛋白λ樣多肽1 (IGLL1)。
  38. 如請求項1至37中任一項之用途、方法、核酸分子、細胞、細胞群體或醫藥組合物，其中該第一或第二抗原係選自CD19、CD22、BCMA、CD20、CD123、EGFRvIII或間皮素。
  39. 如請求項36至38中任一項之用途、方法、核酸分子、細胞、細胞群體或醫藥組合物，其中該跨膜結構域包含選自以下之蛋白質的跨膜結構域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD123、CD134、CD137或CD154，視情況其中該跨膜結構域包含CD8之跨膜結構域，視情況其中該跨膜結構域包含SEQ ID NO: 635之胺基酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入或缺失，例如保守取代之序列)。
  40. 如請求項36至39中任一項之用途、方法、核酸分子、細胞、細胞群體或醫藥組合物，其中該胞內信號傳導結構域包含初級信號傳導結構域，視情況其中該初級信號傳導結構域包含來源於以下之功能性信號傳導結構域：CD3 ζ、TCR ζ、FcR γ、FcR β、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278 (ICOS)、FcεRI、DAP10、DAP12或CD66d，視情況其中該初級信號傳導結構域包含來源於CD3 ζ之功能性信號傳導結構域，視情況其中該初級信號傳導結構域包含SEQ ID NO: 641或643之胺基酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入或缺失，例如保守取代之序列)。
  41. 如請求項36至40中任一項之用途、方法、核酸分子、細胞、細胞群體或醫藥組合物，其中該胞內信號傳導結構域包含共刺激結構域，視情況其中該共刺激結構域包含來源於以下之功能性信號傳導結構域：MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整合素、信號傳導淋巴細胞性活化分子(SLAM)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配體受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、4-1BB (CD137)、B7-H3、ICOS (CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM (LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244，2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A，Ly108)、SLAM (SLAMF1，CD150，IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a或與CD83特異性結合之配體，視情況其中該共刺激結構域包含來源於4-1BB之功能性信號傳導結構域，視情況其中該共刺激結構域包含SEQ ID NO: 637之胺基酸序列(或與其至少約85%、90%、95%、99%或更高一致及/或具有一、二、三個或更多個取代、插入或缺失，例如保守取代之序列)。
  42. 如請求項1至3、9、10或12至41中任一項之用途或方法，其中該癌症展現或鑑別為展現腫瘤抗原之異源表現，例如其中該癌症中少於90%、80%、70%、60%或50%之細胞表現該第一腫瘤抗原，或其中該癌症中少於90%、80%、70%、60%或50%之細胞對該CAR表現細胞有反應。
  43. 如請求項1至3、9、10或12至42中任一項之用途或方法，其中該癌症係選自間皮瘤(例如惡性胸膜間皮瘤)；肺癌(例如非小細胞肺癌、小細胞肺癌、鱗狀細胞肺癌或大細胞肺癌)；胰臟癌(例如胰管腺癌或轉移性胰管腺癌(PDA))；食道腺癌、卵巢癌(例如漿液性上皮卵巢癌)、乳癌、結腸直腸癌、膀胱癌或其任何組合。
  44. 如請求項1至3、9、10或12至43中任一項之用途或方法，其中該癌症為血液癌症，例如選自白血病或淋巴瘤之血液癌症，例如該癌症係選自慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、多發性骨髓瘤、急性淋巴性白血病(ALL)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、B細胞急性淋巴性白血病(BALL)、T細胞急性淋巴性白血病(TALL)、小淋巴細胞性白血病(SLL)、B細胞前淋巴細胞性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、與慢性發炎相關之DLBCL、慢性骨髓性白血病、骨髓增生性贅瘤、濾泡性淋巴瘤、兒童濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞-或大細胞-濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴增生性病狀、MALT淋巴瘤(黏膜相關淋巴組織之結外邊緣區淋巴瘤)、邊緣區淋巴瘤、骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群、非霍奇金淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、脾邊緣區淋巴瘤、脾淋巴瘤/白血病、脾瀰漫性紅髓小B細胞淋巴瘤、毛細胞白血病-變異形式、淋巴漿細胞淋巴瘤、重鏈疾病、漿細胞骨髓瘤、骨骼之孤立性漿細胞瘤、骨外漿細胞瘤、結內邊緣區淋巴瘤、兒童結內邊緣區淋巴瘤、原發性皮膚毛囊中心淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫、原發性縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、ALK+大B細胞淋巴瘤、HHV8相關多中心卡斯特萊曼病(Castleman disease)中出現的大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)或不可分類淋巴瘤。
  45. 如請求項1至3或12至44中任一項之用途或方法，其中該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子及該CAR表現細胞係同時或依序投與，例如該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子係在投與該CAR表現細胞之前或之後投與。
  46. 如請求項1至3、9、10或12至45中任一項之用途或方法，其進一步包含投與第三治療劑，視情況其中： (i)該第三治療劑係與投與該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子同時、在其之前或在其之後投與，例如該第三治療劑係在投與該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子之後投與，或 (ii)該第三治療劑係與投與該CAR表現細胞同時、在其之前或在其之後投與，例如該第三治療劑係在投與該CAR表現細胞之後投與。
  47. 如請求項46之用途或方法，其中該第三治療劑為前-M2巨噬細胞分子之抑制劑。
  48. 如請求項46之用途或方法，其中該第三治療劑係選自IL-13抑制劑、IL-4抑制劑、IL-13Rα1抑制劑、IL-4Rα抑制劑、IL-10抑制劑、CSF-1抑制劑、CSF1R抑制劑、TGF β抑制劑、JAK2抑制劑、細胞表面分子、氧化鐵、小分子抑制劑、PI3K抑制劑、HDAC抑制劑、糖分解路徑之抑制劑、粒線體靶向抗氧化劑、氯膦酸鹽脂質體或其組合，視情況其中該第三治療劑為CSF1R抑制劑，例如結合至CSF1R之抗體分子或CSF1R之小分子抑制劑，例如BLZ945。
  49. 如請求項46之用途或方法，其中該第三治療劑為檢查點調節劑，視情況其中該第三治療劑為抗PD-1抗體分子、抗PD-L1抗體分子、抗CTLA-4抗體分子、抗TIM-3抗體分子或抗LAG-3抗體分子，視情況其中： 該檢查點調節劑係在投與該RNA分子或編碼該RNA分子之該核酸分子之後投與，或 該檢查點調節劑係在投與該CAR表現細胞之後投與。
  50. 如請求項46之用途或方法，其中該第三治療劑為Flt3配體多肽。
  51. 如請求項46至50中任一項之用途或方法，其中投與該RNA分子來增強該第三治療劑於該個體中之活性，視情況其中該第三治療劑為檢查點調節劑，視情況其中該第三治療劑為抗PD-1抗體分子、抗PD-L1抗體分子、抗CTLA-4抗體分子、抗TIM-3抗體分子或抗LAG-3抗體分子。
  52. 如請求項46至50中任一項之用途或方法，其中投與該CAR表現細胞來增強該第三治療劑於該個體中之活性，視情況其中該第三治療劑為檢查點調節劑，視情況其中該第三治療劑為抗PD-1抗體分子、抗PD-L1抗體分子、抗CTLA-4抗體分子、抗TIM-3抗體分子或抗LAG-3抗體分子。
  53. 如請求項51或52之用途或方法，其中係經由活化內源T細胞來增強。
  54. 一種套組，其包含(1)編碼會與第一抗原，例如第一腫瘤抗原結合之嵌合抗原受體(CAR)分子的第一核酸分子(例如第一外源核酸分子)，及(2)包含RNA分子(例如外源RNA分子)或編碼RNA分子之核酸分子(例如外源核酸分子)的第二核酸分子(例如第二外源核酸分子)，其中該RNA分子包含第一RNA序列(例如第一外源RNA序列)及第二RNA序列(例如第二外源RNA序列)，其中該第一RNA序列與該第二RNA序列至少80%、85%或90%互補，其中該第一RNA序列長度為至少20個核苷酸且該第二RNA序列長度為至少20個核苷酸，其中該RNA分子具有以下特性中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12者或全部)： (i)該RNA分子活化模式識別受體(PRR)，例如視黃酸誘導基因I (RIG-I)； (ii)該RNA分子活化樹突狀細胞(DC)，例如：如藉由量測DC中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測DC中CD80、CD86或鹼性白胺酸拉鏈轉錄因子ATF-樣3(Batf3)表現之增加，或：如藉由量測DC激活CD8+ T細胞之能力； (iii)該RNA分子活化巨噬細胞，例如：如藉由量測巨噬細胞中活化標記物表現之增加，例如：如藉由量測巨噬細胞中CD80表現之增加； (iv)該RNA分子活化T細胞，例如：如藉由量測T細胞中活化標記物表現之增加、T細胞擴增之增加、或T細胞所產生細胞介素之增加，例如：如藉由量測T細胞中CD69或PD-1表現之增加，或如藉由量測T細胞所產生之IFNγ或TNFα； (v)該RNA分子增強免疫浸潤至腫瘤中，例如DC或T細胞浸潤至腫瘤中； (vi)該RNA分子減少腫瘤生長； (vii)該RNA分子提高該個體之存活； (viii)該RNA分子增強該個體對該等CAR表現細胞或檢查點調節劑(例如抗PD-1抗體分子、抗PD-L1抗體分子、抗CTLA-4抗體分子、抗TIM-3抗體分子或抗LAG-3抗體分子)之反應性； (ix)該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合； (x)該RNA分子為天然存在之RN7SL1 RNA分子的功能變異體，其中該RNA分子保留該天然存在之RN7SL1 RNA分子的全部或部分免疫原性特性，視情況其中該RNA分子顯示比該天然存在之RN7SL1 RNA分子降低的與SRP9及/或SRP14之結合性，例如該RNA分子不與或實質上不與SRP9及/或SRP14結合； (xi)該RNA分子不為聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)； (xii)該RNA分子不具有RNAi或反義抑制活性或該RNA分子具有最小RNAi或反義抑制活性；或 (xiii)該RNA分子與天然存在之人類基因具有不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%序列一致性。
  55. 一種評估或預測個體對CAR表現細胞療法之反應性的方法，其包含獲取未遮蔽RNA分子(例如外源未遮蔽RNA分子)之含量值或活性值，其中該RNA分子包含SEQ ID NO: 1之核苷酸序列，其中該值包含該RNA分子之量與結合至該RNA分子之蛋白質之量，例如信號識別粒子9 (SRP9)及/或信號識別粒子14 (SRP14)之量的比率，其中： (i)該值比參考值提高時，指示或預測該個體對該CAR表現細胞療法之反應性提高；或 (ii)該值比參考值降低時，指示或預測該個體對該CAR表現細胞療法之反應性降低。
  56. 一種治療患有癌症之個體之方法，其包含： 因應未遮蔽RNA分子(例如外源未遮蔽RNA分子)之含量值或活性值比參考值提高，其中該RNA分子包含SEQ ID NO: 1之核苷酸序列，其中該值包含該RNA分子之量與結合至該RNA分子之蛋白質之量，例如信號識別粒子9 (SRP9)及/或信號識別粒子14 (SRP14)之量的比率，向該個體投與CAR表現細胞療法。
  57. 如請求項56之方法，其進一步包含因應該未遮蔽RNA分子之增加之含量值或活性值，向該個體投與前-M2巨噬細胞分子之抑制劑。
  58. 一種製備CAR表現細胞(例如CAR表現免疫效應細胞)之方法，其包含在可以表現該CAR分子之條件下，將如請求項4、12至24、31至34或36至41中任一項之核酸分子引入至細胞(例如免疫效應細胞)中。
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