CN109734814A - 具有免疫受体的工程化t细胞治疗癌症的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开具有免疫受体的工程化T细胞治疗癌症的用途。所述的嵌合抗原受体由胞外信号肽、抗原结合结构域、胞内第一传导结构域和胞内第二传导结构域组成，包含以免疫受体形式的胞内第一传导结构域。本发明提供了多种嵌合抗原受体氨基酸序列，并提供了特异性针对CD19恶性血液肿瘤的嵌合抗原受体及CAR‑T细胞。在血液肿瘤杀伤试验中，明显加强了CAR‑T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，在临床应用中展现出良好的安全性和抗肿瘤活性。

Description

具有免疫受体的工程化T细胞治疗癌症的用途

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫治疗技术领域，提供了治疗人癌症的组合物和方法。本发明包括涉及基因工程修饰的T细胞，以表达CAR，其中CAR包括抗原结合结构域、第一传导结构域和第二传导结构域。本发明还涉及编码此类跨膜多肽的载体，以及用于免疫治疗的在其表面表达所述CAR的免疫细胞。本发明开辟了对用于治疗癌症的有效的过继性免疫治疗策略的道路。

背景技术

随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimericantigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一 [Schmitz M，et al.Chimeric antigen receptor-engineered T cellsforimmunotherapy of Cancer.J Biomed Biotechnol，2010，doi：10.1155/2010/956304.]。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T 的核心部件，CAR能针对所选择的免疫细胞重定向其特异性和反应性，因此赋予T细胞 HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较与正常T 细胞受体(TCR)应答不同，不受MHC限制，具有活化和增殖的能力，因此具有高效的杀伤肿瘤细胞的能力。嵌合抗原受体(CAR)在T细胞上表达合成蛋白，其将抗体的抗原识别片段(如抗体单链可变区片段)与胞内信号结构域融合。在与表达scFv的同源抗原的靶细胞相互作用时，在T细胞上表达的CAR的表达引起T细胞激活杀伤靶细胞。目前CAR这些研究采用的是在scFv和CD3ζ链胞内结构域融合形成嵌合受体的基础上，加入4-1BB或CD28共刺激分子的第二代CAR-T细胞，以及在第二代CAR-T细胞的基础上，将两个共刺激分子4-1BB和CD28进行串联的第三代CAR-T细胞。基于T淋巴细胞的过继性免疫治疗在部分肿瘤中取得了一定的效果，并且该种免疫治疗方法可以克服抗体治疗的缺陷，但在大多数肿瘤的疗效仍不能令人满意[Grupp SA，et al.Adoptive cellulartherapy.Curr TopMicrobiol Immunol.，.2011；344：149-72.]。这些CAR都是基于单一嵌合分子设计的能够引发抗原特异性T细胞应答，但天然免疫受体通常是由分开的配体结合区和含ITAM的信号链组成的多链复合物，例如T细胞受体TCR-CD3复合物。多链免疫受体复合物的潜在益处是多方面的，包括通过配体结合和信号传导分子之间的多重相互作用获得的更大的信号多样性，以及持续的ITAM信号传导。相关研究报道新一代的CAR以跨膜受体DAP12与杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)组合形成CAR的信号传导结构[Generation of potent T-cellimmunotherapy for cancer using DAP12-Based multichain chimericimmunoreceptors.Cancer Immunology Research,2015,3(7):815-826.]，在众多配体中，DAP12由于能够和多种激活型受体结合形成免疫激活型复合物进而通过磷酸化Syk 或Zap70介导激活型的信号受到格外关注。

本发明提供一种新型的CAR结构，包含胞内第二传导结构域、T2A、胞外信号肽、抗原结合结构域、胞内第一传导结构域，例如胞内第二传导结构域DAP10、DAP12或FcεRγ中的一种、T2A、CD8α信号肽、肿瘤抗原结合结构域、胞内第一传导结构域NKp46、NKp30、 NKp44、SLAM、CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME、、CD2F-10、 KLRD1/KLRC2、SIRPB1、PILRB、CLEC5A、TREM1、TREM2、CD300B、CD300E、 SIGLEC-14、SIGLEC-15、SIGLEC-16或NKG2D中的一种。使用胞内第一信号传导结构和第二信号传导结构，利于CAR-T细胞受到胞外肿瘤抗原刺激时分泌更低水平的细胞因子，能够很好地保证临床应用的安全性，不仅在体外和体内有良好的肿瘤杀伤作用，而且在临床治疗实体瘤和血液肿瘤病人也展现出了显著疗效，而且细胞因子释放反应更为温和。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种安全性更好，疗效更加显著新型嵌合抗原受体及其应用。

本发明的目的之二在于提供编码该嵌合抗原受体的核酸。

本发明的目的之三在于提供含有该嵌合抗原受体的细胞及其应用。

一种新型嵌合抗原受体，其特征在于包含胞外信号肽、抗原结合结构域、胞内第一传导结构域和胞内第二传导结构域，其中所述第一传导结构域选自KIR2DS2、KIR2DL3、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS3、KIR2DS4、 KIR2DS5、KIR3DL1、KIR3DS1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1、KIR3DP1；NKp46、 NKp30、NKp44、SLAM、CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME、、 CD2F-10、KLRD1/KLRC2、SIRPB1、PILRB、CLEC5A、TREM1、TREM2、CD300B、 CD300E、SIGLEC-14、SIGLEC-15、SIGLEC-16或NKG2D中的一种，第二传导结构域选自DAP10、DAP12或FcεRγ中的一种。

所述第一传导结构域NKp46的氨基酸序列优选SEQ ID NO.6所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；所述第一传导结构域NKp30的氨基酸序列优选SEQ IDNO.7所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；所述第一传导结构域NKp44 的氨基酸序列优选SEQ ID NO.8所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；所述第一传导结构域SLAM的氨基酸序列优选SEQ ID NO.9所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；所述第一传导结构域CD48的氨基酸序列优选SEQ ID NO.10 所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；所述第一传导结构域CD229的氨基酸序列优选SEQ ID NO.11所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；所述第一传导结构域2B4的氨基酸序列优选SEQ ID NO.12所示，或与其氨基酸序列具有 85％-99％同一性的多肽；所述第一传导结构域CD84的氨基酸序列优选SEQ ID NO.13所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；所述第一传导结构域NTB-A的氨基酸序列优选SEQ ID NO.14所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；所述第一传导结构域CRACC的氨基酸序列优选SEQ ID NO.15所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；所述第一传导结构域BLAME的氨基酸序列优选SEQ ID NO.16所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；所述第一传导结构域 CD2F-10的氨基酸序列优选SEQ ID NO.17所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；所述第一传导结构域KLRD1/KLRC2的氨基酸序列优选SEQ ID NO.18所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；所述第一传导结构域SIRPB1的氨基酸序列优选SEQ ID NO.19所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；所述第一传导结构域PILRB的氨基酸序列优选SEQ ID NO.20所示，或与其氨基酸序列具有85％ -99％同一性的多肽；所述第一传导结构域CLEC5A的氨基酸序列优选SEQ IDNO.21所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；所述第一传导结构域TREM1的氨基酸序列优选SEQ ID NO.22所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；所述第一传导结构域TREM2的氨基酸序列优选SEQ ID NO.23所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；所述第一传导结构域CD300B的氨基酸序列优选SEQ ID NO.24所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；所述第一传导结构域 CD300E的氨基酸序列优选SEQ ID NO.25所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；所述第一传导结构域SIGLEC-14的氨基酸序列优选SEQ ID NO.26所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；所述第一传导结构域SIGLEC-15的氨基酸序列优选SEQ ID NO.27所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；所述第一传导结构域SIGLEC-16的氨基酸序列优选SEQ ID NO.28所示，或与其氨基酸序列具有 85％-99％同一性的多肽；所述第一传导结构域NKG2D的氨基酸序列优选SEQ ID NO.29 所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽。

所述的抗原结合域结合的抗原与恶性肿瘤有关，所述肿瘤抗原选自CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD123、CD138、CEA、CTLA4、BCMA、CS1、c-Met、 EPCAM、EGFR/EGFRvIII、gp100、GPC3、GD-2、IGF1R、IGF-I receptor、MAGE A3、 mesothelin、MUC1、NY-ESO-1、HER2、PD1、PSMA、ROR1、WT1、糖脂F77或其他任意肿瘤抗原或其他修饰类型和其任何组合。

所述的抗原结合结构域结合的抗原进一步优选为CD19；CD19抗原结合结构域氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示。

所述的抗原结合结构域由抗体片段组成，优选单克隆抗体、Fab、scFv、VHH或其他抗体片段。其抗原结合结构域抗体可来自鼠源、骆驼源或人源化抗体。在具体实施例中，该嵌合抗原受体的抗原结合结构域由CD19特异性单链抗体片段组成，包括单链抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。

在一个实施方案中，所述抗原结合结构域的单链抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)之间由连接肽(Linker)连接，包含GS Linker如(G₃S)₄或(G₄S)₃，优选(G₄S)₃连接肽。

所述胞内信号结构域优选第一信号传导结构域包括KIR2DS2、KIR2DL3、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、 KIR3DL1、KIR3DS1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1、KIR3DP1；NKp46、NKp30、NKp44、 SLAM、CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME、、CD2F-10、KLRD1/KLRC2、 SIRPB1、PILRB、CLEC5A、TREM1、TREM2、CD300B、CD300E、SIGLEC-14、SIGLEC -15、SIGLEC-16或NKG2D的序列。进一步优选的，第二信号传导结构域包括DAP10、 DAP12或FcεRγ的序列。

所述胞内第二传导结构域DAP12通过T2A与胞外信号肽和抗原结合结构域串联。优选的，所述DAP12氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述T2A氨基酸序列如SEQ ID NO.4 所示。

在一个特定实施方案中，该嵌合抗原受体优选包括顺序连接的胞内第二信号传导结构域DAP12、T2A、CD8α信号肽、抗原结合结构域、胞内第一信号传导结构域NKp44。

在一个特定实施方案中，该嵌合抗原受体优选包括顺序连接的胞内第二信号传导结构域DAP12、T2A、CD8α信号肽、抗原结合结构域、胞内第一信号传导结构域TREM1。

本发明嵌合抗原受体结构如下：

第二信号传导结构域-T2A-CD8α信号肽-VL-Linker-VH-第一信号传导结构域

其中抗原结合结构域可由VH-Linker-VL或VL-Linker-VH或VHH1-Linker-VHH2组成，VHH1和VHH2可识别相同抗原，或不同抗原。

一种重组表达载体，其特征在于所述的重组表达载体包括顺序连接的胞内第二传导结构域、T2A、胞外信号肽、抗原结合结构域、胞内第一传导结构域。

一种表达嵌合抗原受体的细胞，该细胞优选免疫细胞；进一步优选T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、造血干细胞、多能干细胞或胚胎干细胞培养分化的免疫细胞。

一种制备新型嵌合抗原受体修饰的T细胞的方法，该方法包括分离和激活待修饰的T 细胞，然后以前述表达载体转导该T细胞。

含有所述新型嵌合抗原受体、表达载体、所述细胞在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

所述的肿瘤优选包括脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、肝癌、肾脏癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、皮肤癌、胸腺瘤、肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、子宫癌和其任何组合。

在具体实施方案中，涉及制备治疗实体肿瘤和血液系肿瘤的药物用途。

本发明所述的新型嵌合抗原受体涉及在制备抗肿瘤药物及细胞免疫疗法中的应用。

本发明所述的免疫效应细胞涉及在制备抗肿瘤药物及细胞免疫疗法中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供具有免疫受体的嵌合抗原受体，包含胞内第二传导结构域、T2A、胞外信号肽、抗原结合结构域、胞内第一传导结构域，例如胞内第二传导结构域DAP12、T2A、 CD8α信号肽、肿瘤抗原结合结构域、胞内第一传导结构域。使用胞内第一信号传导结构和第二信号传导结构，利于CAR-T细胞受到胞外肿瘤抗原刺激时分泌更低水平的细胞因子，能够很好地保证临床应用的安全性，不仅在体外和体内有良好的肿瘤杀伤作用，而且在临床治疗实体瘤和血液肿瘤病人也展现出了显著疗效，而且细胞因子释放反应更为温和。以CD19抗原靶点为例，与现有技术相比，该新型嵌合抗原受体显示了较高的抗肿瘤能力，由其修饰的免疫细胞具有较高的靶向识别肿瘤抗原的能力，增强了对肿瘤细胞的杀伤活性，本发明不仅可以应用于血液肿瘤的治疗，而且可以拓展CAR-T在实体瘤治疗中的应用。

附图说明

图1是含有不同抗原结合结构域或胞内第二传导结构域的CAR结构，展示了本发明中所涉及的多种嵌合抗原结构图。

图2是CAR-T细胞感染不同CAR慢病毒后细胞增殖情况，CAR-T和NTD细胞在体外扩增10天，其中NTD为未转染CAR慢病毒的T细胞。

图3是CAR-T细胞在CD19抗原刺激下IFN-γ的分泌情况，CAR-T细胞分别与靶细胞共培养24h。

图4是CAR-T细胞对CD19抗原阳性细胞株杀伤作用，CAR-T细胞分别与靶细胞共培养杀伤8h。

图5是人白介素6释放水平图，CAR1-T1患者回输CAR1细胞后，体温在最后一次回输后3天开始升高，细胞因子检测结果显示白介素6(IL-6)分泌水平显著提高100倍。

具体实施方式

本发明提供了一种免疫受体的抗原受体、免疫效应细胞及其在临床治疗血液肿瘤和实体瘤中的应用，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

本发明的新型嵌合抗原受体包含胞外信号肽结构，例如CD8α信号肽、4-1BB信号肽、 GM-CSFRα信号肽或CD4信号肽，优选CD8α信号肽。

本文所用的术语“胞内信号结构域”指的是能够传导细胞效应功能信号并指导细胞执行特定功能的蛋白质结构区域。胞内信号结构域可以包括第一信号传导结构域、第二信号传导结构域和/或跨膜结构域。

本文所用的术语氨基酸序列的“同一性”(identity)可以与“相似性”互换使用，指的是氨基酸序列之间通过序列比对软件例如BLAST确定的相似程度。氨基酸序列比对的方法和软件对于本领域技术人员是公知的。可以通过对已知氨基酸序列进行一个或几个(例如1-15个，例如2、3、5、8、10或12个)氨基酸残基的取代、缺失和/或添加而获得经改造的氨基酸序列。例如，通过常规蛋白质工程手段(例如氨基酸保守取代等)，对本发明SEQ IDNO.6所示的NKp46胞内第一信号传导结构域进行改造，可以获得与SEQ ID NO.6具有至少85％(例如85％～99％或90％～99％或95％～99％)序列同一性，并且具有基本相同的信号传导结构域的变体序列。

本文所用的术语“抗原结合结构域”是包括具有功能的抗体部分，优选抗原结合和/ 或完整抗体的可变区。抗体片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv fragments、单链抗体scFv、单域抗体VHH及多特异性抗体。

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、嵌合抗原受体制备

本发明提供提供一种新型嵌合抗原受体。本发明的嵌合抗原受体由胞内第二传导结构域-T2A-胞外信号肽-抗原结合结构域-胞内第一传导结构域顺序串联组成。因此需要分别构建含有不同刺激信号组合的病毒载体。本实施例中以靶向CD19的单链抗体为统一的胞外识别抗原的结构，分别需要构建如下嵌合抗原受体：

DAP12-T2A-CD8α信号肽-CD19抗原结合结构域-NKp46 (CAR1)

DAP12-T2A-CD8α信号肽-CD19抗原结合结构域-NKp30 (CAR2)

DAP12-T2A-CD8α信号肽-CD19抗原结合结构域-NKp44 (CAR3)

DAP12-T2A-CD8α信号肽-CD19抗原结合结构域-SLAM (CAR4)

DAP12-T2A-CD8α信号肽-CD19抗原结合结构域-CD48 (CAR5)

DAP12-T2A-CD8α信号肽-CD19抗原结合结构域-CD229 (CAR6)

DAP12-T2A-CD8α信号肽-CD19抗原结合结构域-2B4 (CAR7)

DAP12-T2A-CD8α信号肽-CD19抗原结合结构域-CD84 (CAR8)

DAP12-T2A-CD8α信号肽-CD19抗原结合结构域-NTB-A (CAR9)

DAP12-T2A-CD8α信号肽-CD19抗原结合结构域-CRACC (CAR10)

DAP12-T2A-CD8α信号肽-CD19抗原结合结构域-BLAME (CAR11)

DAP12-T2A-CD8α信号肽-CD19抗原结合结构域-CD2F-10 (CAR12)

DAP12-T2A-CD8α信号肽-CD19抗原结合结构域-KLRD1/KLRC2 (CAR13)

DAP12-T2A-CD8α信号肽-CD19抗原结合结构域-SIRPB1 (CAR14)

DAP12-T2A-CD8α信号肽-CD19抗原结合结构域-PILRB (CAR15)

DAP12-T2A-CD8α信号肽-CD19抗原结合结构域-CLEC5A (CAR16)

DAP12-T2A-CD8α信号肽-CD19抗原结合结构域-TREM1 (CAR17)

DAP12-T2A-CD8α信号肽-CD19抗原结合结构域-TREM2 (CAR18)

DAP12-T2A-CD8α信号肽-CD19抗原结合结构域-CD300B (CAR19)

DAP12-T2A-CD8α信号肽-CD19抗原结合结构域-CD300E (CAR20)

DAP12-T2A-CD8α信号肽-CD19抗原结合结构域-SIGLEC14 (CAR21)

DAP12-T2A-CD8α信号肽-CD19抗原结合结构域-SIGLEC15 (CAR22)

DAP12-T2A-CD8α信号肽-CD19抗原结合结构域-SIGLEC16 (CAR23)

DAP12-T2A-CD8α信号肽-CD19抗原结合结构域-NKG2D (CAR24)

1、含有靶向CD19的嵌合抗原受体的基因序列

设计依次含有自然杀伤激活受体(简称DAP12)、T2A、CD8α信号肽、CD19抗原结合结构域、免疫受体，其结构如上所示。其中DAP12的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示， T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，CD19抗原结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示，NKp46的氨基酸序列如 SEQ ID NO.6所示，NKp30的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，NKp44的氨基酸序列如 SEQ ID NO.8所示，SLAM的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，CD48的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，CD229的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，2B4的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，CD84的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，NTB-A的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，CRACC的氨基酸序列如SEQID NO.15所示，BLAME的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，CD2F-10的氨基酸序列如SEQ IDNO.17所示，KLRD1/KLRC2的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，SIRPB1的氨基酸序列如SEQID NO.19所示，PILRB的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示，CLEC5A的氨基酸序列如SEQ IDNO.21所示，TREM1的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示，TREM2的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示，CD300B 的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示，CD300E的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示， SIGLEC-14的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示，SIGLEC-15的氨基酸序列如SEQ IDNO.27所示，SIGLEC-16的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示，NKG2D的氨基酸序列如 SEQ IDNO.29所示。

2、构建表达嵌合抗原受体的慢病毒载体

pELNS-DAP12-T2A-CD8α质粒由南京卡提医学科技有限公司保存，或者根据文献(Enxiu Wang et al.Generation of Potent T-cell Immunotherapy for Cancer UsingDAP12-Based,Multichain,Chimeric Immunoreceptors.2015,Cancer ImmunologyResearch,3 (7):815)公开的方法进行构建，CD19抗原结合结构域-第一传导结构域、基因合成由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并提供质粒，将质粒pELNS-DAP12-T2A-CD8α分别和合成的基因片段通过BamHI、SalI双酶切(购自Takara公司)，酶切反应按说明书进行，酶切后再连接，获得表达嵌合抗原受体的慢病毒载体CAR1-CAR24。将5μL慢病毒载体转化大肠杆菌TOP10感受态细胞中(购自南京安杰优生物科技有限公司)，37℃培养16h 后挑取单克隆，挑取的单克隆在37℃条件下培养12h后用质粒抽提试剂盒(购自Takara 公司)抽提质粒，具体方法见说明书。

3、慢病毒包装

本实施例包装慢病毒采用磷酸钙法，具体步骤如下：

(1)293T细胞隔天传代

每个T150细胞瓶种植5×10⁶个细胞。48小时后，细胞数目应该达到20-25百万/瓶。

(2)293T细胞铺瓶

a)以1个T150细胞培养瓶为例，用约15ml的1×PBS轻柔地洗细胞两次

b)加入3ml0.25％胰酶-2.21mM EDTA

c)等到细胞脱落，加入12ml 10％(wt)FBS(购自Gibico)的DMEM培养基(购自corning)至已经脱落的细胞中

d)收集并将细胞转移至无菌离心管，1000rpm,离心10分钟

e)吸掉上清，将沉淀重悬于10ml 10％(wt)FBS的DMEM培养液中。

f)细胞计数，根据细胞浓度计算12×10⁶个细胞所需要的体积

g)将细胞和25ml的10％(wt)FBS的DMEM培养液合并，放入T150细胞瓶中，轻摇，使得细胞均匀分布到细胞瓶底37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。

(3)细胞转染

观察细胞，细胞密度大约达到80％-90％，此时就可以开始转染

a)在转染前30-60分钟，轻柔吸掉培养液。

b)混合质粒DNA和氯化钙溶液，以一个T150瓶为例，需要28ug pRSV.rev(购自Invitrogen公司)，28ug pGAG-Pol(购自Invitrogen公司)，11ug pVSVG(购自Invitrogen公司)，23ug重组慢病毒表达质粒CAR1/CAR2/CAR3/CAR4，加入到1.5ml氯化钙溶液中，混匀。

c)将1.5ml BBS溶液加入到15ml无菌离心管中，用1ml枪头把DNA-氯化钙溶液混匀后滴加到BBS溶液中，迅速混匀15-20下，室温孵育25-30分钟。

d)用5ml移液管把DNA-氯化钙-BBS混合物(购自上海碧云天生物技术有限公司)均匀逐滴加到T150瓶中。在含5％二氧化碳的37℃细胞培养箱内培养，6h换液。

e)6h后换液。轻轻晃动培养板数次以充分悬浮一些磷酸钙沉淀，吸去含磷酸钙沉淀的培养液，加入20ml新鲜的5％(wt)FBS的DMEM培养液，继续培养。

(4)初次收集病毒上清

a)将前一天转染的293T细胞培养上清收集到离心管，1000rpm离心5分钟，标记，暂存于4℃冰箱。

b)将事先预热的20ml 5％(wt)FBS的DMEM培养基加入细胞瓶中，37℃细胞培养箱继续培养过夜。

(5)第二次收集病毒上清液(48h/第四天)。

(6)过滤上清

将两次收集的上清液集中在一起，用0.45μm的滤膜过滤去除细胞碎片。

(7)病毒浓缩

4℃，12000-24000rpm离心过夜

(8)病毒储存

离心后，倾倒全部上清，加入新鲜5％(wt)FBS的DMEM培养基重悬，进行病毒分装，迅速存放于-80℃冰箱备用

(9)慢病毒滴度测定

a)病毒感染293T细胞

感染前将293T细胞铺至24孔板中，取已纯化浓缩病毒200μL加到293T细胞中， 24h后用含10％FBS(wt)的DMEM培养基换液，感染72h后于1200r/min条件下离心 5min以收集细胞，抽提基因组。

b)抽提基因组

基因组抽提试剂盒为购自于Takara公司，按试剂盒说明书操作

c)qPCR测定病毒滴度

反应体系如下：Probe qPCR Mix 12.5μL(购自Takara)，上游引物0.5μL(由南京金斯瑞合成)，下游引物0.5μL(由南京金斯瑞合成)，探针1μL(由南京金斯瑞合成)，模板2μL，灭菌水8.5μL，反应体系为25μL，反应条件按照说明书设置，反应结束后，用分析软件分析数据，根据标准曲线计算病毒滴度。计算结果显示，病毒滴度为1×10⁷TU/ml。

实施例2、病毒感染T细胞

1、T细胞的分离活化及病毒感染

(1)人外周血单核细胞的分离

用含有抗凝剂的采血管采集外周血约10ml，室温(18-25℃)自然沉降约30min，收集上层血浆，将收集的上层血浆于5000r/min条件下离心10min，按体积比1:1加到淋巴细胞分离液(购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)上，梯度离心，3000r/min，离心30min，离心后，离心管由上之下分层：第一层为血浆层；第二层为淋巴细胞白膜层；第三层为透明分离液层；第四层红细胞层。吸取淋巴细胞白膜层，并用PBS洗涤2次，两次离心以1500r/min，离心10min，PBS重悬细胞，加入5％自体血浆+300IU/ml重组人IL-2+KBM581完全培养基培养人外周血单核细胞。

(2)慢病毒感染T淋巴细胞

用含5％自体血浆+300IU/ml重组人IL-2+KBM581完全培养基培养新制备的单个核细胞PBMC，IL-2购自R&D Systems，KBM581购自Corning，第0天加入CD3/CD28 Dynabeads免疫磁珠(购自invitrogen)活化T细胞，前3天进行慢病毒感染，加入0.25MOI 对应的慢病毒载体，未感染的T淋巴细胞作为空白对照，48h后将培养基更换为含有5％自体血浆+300IU/ml重组人IL-2+KBM581完全培养基，继续培养7-9天。

2、T细胞中CAR阳性率的检测

将培养至第7天的已感染病毒的T细胞，1200r/min，离心5min，弃尽上清以收集细胞，用含有体积分数1％FBS的PBS溶液重悬细胞，并将细胞调整密度为1×10⁵个/ml，加入Biotin Rabbit Anti-Mouse FMC63scFv(上海星湾生物技术有限公司)，再加入Streptavidin-PE(BD Biosciences公司)，4℃孵育15min，PBS溶液洗涤2次，上流式细胞仪进行检测，结果显示经过7天的培养，CAR-T细胞CAR的阳性率：CAR1～CAR24病毒感染组阳性率52.3％～79.7％。

实施例3、病毒感染CAR-T细胞对细胞增殖的影响

各组病毒感染完T细胞后，将T细胞用含体积分数5％自体血浆+300IU/ml重组人IL-2+KBM581完全培养基，每1-2天计数一次。然后观察T淋巴细胞生长情况，结果如图2所示。结果表明细胞在感染表达CAR的病毒后，依然能够形成典型的增殖克隆团，通过对细胞进行计数，绘制细胞增殖曲线可见CAR1～CAR24增殖相似，比未感染病毒的 T细胞(图2中NTD)增殖能力稍弱。

实施例4、检测CAR-T细胞的细胞因子分泌

(1)细胞因子检测采用Elisa的方法，使用R&D公司试剂盒进行。

(2)标准品的稀释：准备1ml离心管7支，依次编号号码，先在各离心管中加入标准品稀释液500μL，然后取原浓度标准品500μL加入到1只已编好号的离心管中，充分混匀，再在该离心管中取500μL加入第二支离心管中，充分混匀；再在该离心管中取 500μL加入第三只离心管中，充分混匀；再在该离心管中取500μL加入第四只离心管中，充分混匀；再在该离心管中取500μL加入第五只离心管中，充分混匀；再在该离心管中取500μL加入第六只离心管中，充分混匀；再在该离心管中取500μL加入第七只离心管中，充分混匀。

(3)在酶标包被板上设标准品孔，依次加入不同浓度的标准品100μL，每个浓度 2-3个平行孔。

(4)加样：分别设置空白孔(空白对照孔用水代替，酶标试剂及生物素标记的抗体操作照旧)、待测样品孔，在酶标包被板上待测样品孔中先加样品100μL，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀

(5)孵育：室温放置孵育2h

(6)洗涤：弃去液体，甩干，每孔加200μL洗涤液，静止30s后弃去，如此重复 3次，拍干

(7)加抗体：酶标包被板上加入100μL检测抗体

(8)孵育：同操作(5)

(9)洗涤：同操作(6)

(10)加标记：每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记链霉亲和素

(11)孵育：避光室温放置孵育20min

(12)洗涤：同操作(6)

(13)显色：每孔加入显色液100μL，轻轻震荡混匀，避光室温放置孵育20min

(14)终止：每孔加入终止液50μL，终止反应

(15)测定：以空白值校零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加入终止液后15min内进行。

选择抗原表达水平具有差异的靶细胞与CAR1～CAR24的CAR-T细胞共培养，检测CAR-T受到抗原刺激产生响应作用分泌IFN-γ水平，CD19抗原靶细胞选择293T-CD19 (CD19阳性)和293T(CD19阴性)，以此来显示出CAR-T在受到CD19抗原刺激时所特异性分泌出IFN-γ，结果反映出CAR-T细胞对于抗原表达水平具有差异的靶细胞产生了不同的响应作用。CAR1～CAR24的CAR-T细胞在与CD19阳性靶细胞293T-CD19共培养时显著分泌IFN-γ(图3)，表明CAR1～CAR24的CAR-T细胞对于抗原阳性的肿瘤细胞具有响应作用。

实施例5、病毒感染靶向CD19CAR-T细胞体外杀伤效果评估

(1)靶向CD19抗原杀伤：培养靶细胞293T-CD19(CD19阳性)、293T(CD19阴性)和效应细胞CAR1～CAR24的CAR-T；

(2)收集靶细胞和效应细胞，1500rpm/min，离心5min，弃上清

(3)用10％FBS+1640完全培养基重悬靶细胞和效应细胞

(4)利用实时细胞分析系统(RTCA)，在E-Plate16的空中加入50μL 1640培养基

(5)利用RTCA检测基线，确定所选孔接触正常

(6)设置效靶比为0:1、1:1、5:1、10:1

(7)取出E-Plate16，按照效靶比，在每孔中加入混合均匀的靶细胞悬液100μL，使每孔种细胞数目为10⁴cells/100μL。

(8)将E-Plate16置于培养箱中，以37℃，5％CO2条件下，过夜放置

(9)第二天，将E-Plate16取出，加入50μL相应的效应细胞，计算加入效应细胞8h后的杀伤率。

(10)

检测结果如图4所示。CAR1～CAR24的CAR-T对CD19抗原阳性细胞杀伤作用显著，明显高于NTD组。体外杀伤实验结果表明具有免疫受体的工程化T细胞靶向CD19抗原具备很强的抗肿瘤活性。

实施例6、CAR3修饰的自体T细胞对CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病患者的临床试验治疗效果

采集急性B淋巴细胞白血病患者100ml外周血，分离纯化获得T细胞(实施例2)，添加5％自体血浆、300IU/ml重组人IL-2和CD3/CD28磁珠体外激活1天后转导CAR3 慢病毒载体。以0.8～1.5×10⁶/mL的培养密度每天进行扩大培养9～12天。

将CAR3分别转导至来自5例不同急性B淋巴细胞白血病患者的T细胞中，转导后的细胞命名为CAR3-T1、CAR3-T2、CAR3-T3、CAR3-T4、CAR3-T5。

以下以CAR3-T1急性B淋巴细胞白血病患者的治疗为例。

CAR3-T1患者：

(1)粒系：增生活跃，中性中幼粒细胞比例增高。中性晚幼粒细胞比例正常。成熟阶段比例减低。

(2)红系：

(3)淋巴细胞：比例明显增多。可见到原始淋巴细胞，占26.5％。

(4)巨核细胞：全片见巨核细胞8个；分类8个巨核细胞；原始细胞为0个；幼稚巨核细胞为0个；颗粒性巨核细胞为7个；产血小板型巨核细胞为0个；裸核巨核细胞为 1个。血小板可见

(5)血片：白细胞数正常，粒细胞分类中少见，淋巴细胞比例明显增高，单核细胞比例减少，血小板可见。

(6)印象：急性淋巴细胞白血病复发

经医院推荐，通过伦理审查，病人签署知情同意书，然后进行CAR3细胞治疗的临床试验研究。

CAR3修饰的自体T细胞治疗过程为：采集患者外周血，体外分选获得T细胞，T细胞体外激活与扩增，制备CAR3-T1细胞制剂，制剂质量控制与放行，分两个时间点分两次通过静脉回输至病人体内，共计输注约2.5×10⁸CAR-T细胞。

CAR3-T1病人回输CAR3细胞后，出现温和的发热反应，体温在最后一次回输后3 天开始升高，细胞因子检测结果显示白介素6(IL-6)分泌水平较基线期提高100倍，如 图5所示，患者持续发烧3天均未超过39℃，随后体温逐渐下降并达到正常体温。国外 报道的CD19CAR-T治疗急性B淋巴细胞白血病患者副反应严重时在3天内发生持续高 热。本临床试验结果表明本发明所涉及的新型嵌合抗原受体修饰的T细胞在治疗性B淋 巴细胞白血病中有着更温和的反应，对患者副作用更小。在回输后的14天后对患者的外 周血和骨髓进行检测。如表1结果所示，外周血中CD19阳性(CD19+)细胞所占的百分 比由治疗前16％降低为0％，骨髓中CD19阳性(CD19+)细胞所占的百分比由治疗前26.5％ 降低为＜1％。结合血液学检测结果表明：该病人经过本发明提供的CAR3细胞治疗后， 外周血和骨髓中CD19阳性的白血病细胞被完全清除，达到临床完全缓解。

表1急性B淋巴细胞白血病患者治疗前后B淋巴细胞的变化

检测项目	外周血(治疗前)	外周血(治疗后)	骨髓(治疗前)	骨髓(治疗后)
					CD19+细胞	16％	0％	26.5％	＜1％

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 南京卡提医学科技有限公司

<120> 具有免疫受体的工程化T细胞治疗癌症的用途

<130> 2019

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 93

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

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<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

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Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met

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Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu Ala Val Tyr Phe Leu

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Lys

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<213> 人工序列(artificial sequence)

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<213> 人工序列(artificial sequence)

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<212> PRT

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<213> 人工序列(artificial sequence)

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<212> PRT

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1 5 10 15

Gly Ile Ile Cys Leu Ser Leu Met Ser Thr Leu Gly Ile Leu Leu Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 19

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Leu Leu Val Val Gly Val Ser Ala Ile Tyr Ile Cys Trp Lys Gln Lys

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Ala

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35 40

<210> 21

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 21

Met Asn Trp His Met Ile Ile Ser Gly Leu Ile Val Val Val Leu Lys

1 5 10 15

Val Val Gly Met Thr Leu Phe Leu Leu Tyr Phe Pro Gln Ile Phe Asn

20 25 30

Lys

<210> 22

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 22

Thr Pro Asp Ser Glu Ile Asn Leu Thr Asn Val Thr Asp Ile Ile Arg

1 5 10 15

Val Pro Val Phe Asn Ile Val Ile Leu Leu Ala Gly Gly Phe Leu Ser

20 25 30

Lys Ser Leu Val Phe Ser Val Leu Phe Ala Val Thr Leu Arg Ser Phe

35 40 45

Val Pro

50

<210> 23

<211> 62

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 23

Pro Phe Pro Pro Thr Ser Ile Leu Leu Leu Leu Ala Cys Ile Phe Leu

1 5 10 15

Ile Lys Ile Leu Ala Ala Ser Ala Leu Trp Ala Ala Ala Trp His Gly

20 25 30

Gln Lys Pro Gly Thr His Pro Pro Ser Glu Leu Asp Cys Gly His Asp

35 40 45

Pro Gly Tyr Gln Leu Gln Thr Leu Pro Gly Leu Arg Asp Thr

50 55 60

<210> 24

<211> 56

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 24

His Lys Arg Asn His Tyr Met Leu Leu Val Phe Val Lys Val Pro Ile

1 5 10 15

Leu Leu Ile Leu Val Thr Ala Ile Leu Trp Leu Lys Gly Ser Gln Arg

20 25 30

Val Pro Glu Glu Pro Gly Glu Gln Pro Ile Tyr Met Asn Phe Ser Glu

35 40 45

Pro Leu Thr Lys Asp Met Ala Thr

50 55

<210> 25

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 25

Arg Leu Ser Ser Pro His Phe Leu Leu Val Val Leu Leu Lys Leu Pro

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ser Met Leu Gly Ala Val Phe Trp Val Asn Arg Pro Gln

20 25 30

Trp Ala Pro Pro Gly Arg

35

<210> 26

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 26

Ser Trp Pro Leu Val Leu Thr Leu Ile Arg Gly Ala Leu Met Gly Ala

1 5 10 15

Gly Phe Leu Leu Thr Tyr Gly Leu Thr Trp Ile Tyr Tyr Thr Arg Cys

20 25 30

Gly Gly Pro Gln Gln Ser Arg Ala Glu Arg Pro Gly

35 40

<210> 27

<211> 71

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 27

Ala Ser Gly Ala Ser Thr Val Ala Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gly Phe

1 5 10 15

Lys Ala Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu Ala Ala Arg Ala Ala Arg Arg

20 25 30

Arg Pro Glu His Leu Asp Thr Pro Asp Thr Pro Pro Arg Ser Gln Ala

35 40 45

Gln Glu Ser Asn Tyr Glu Asn Leu Ser Gln Met Asn Pro Arg Ser Pro

50 55 60

Pro Ala Thr Met Cys Ser Pro

65 70

<210> 28

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 28

Ser Gly Pro Met Thr Gly Val Val Leu Val Ala Val Gly Glu Val Ala

1 5 10 15

Met Lys Ile Leu Leu Leu Cys Leu Cys Leu Ile Leu Leu Arg Val Arg

20 25 30

Ser Cys Arg Arg Lys Ala Ala Arg Ala Ala Leu Gly Met Glu Ala Ala

35 40 45

Asp Ala Val Thr Asp

50

<210> 29

<211> 78

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 29

Met Gly Trp Ile Arg Gly Arg Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met Ser

1 5 10 15

Glu Phe His Asn Tyr Asn Leu Asp Leu Lys Lys Ser Asp Phe Ser Thr

20 25 30

Arg Trp Gln Lys Gln Arg Cys Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg Glu

35 40 45

Asn Ala Ser Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly

50 55 60

Ile Arg Phe Ile Ile Met Val Ala Ile Trp Ser Ala Val Phe

65 70 75

<210> 30

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 30

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln

195 200 205

Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser

Claims (10)

1.一种具有免疫受体的嵌合抗原受体，其特征在于包含胞外信号肽、抗原结合结构域、胞内第一传导结构域和胞内第二传导结构域，其中所述胞外信号肽选自CD8α信号肽、4-1BB信号肽、GM-CSFRα信号肽或CD4信号肽中的一种，胞内第一传导结构域选自KIR2DS2、KIR2DL3、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DL1、KIR3DS1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1、KIR3DP1；NKp46、NKp30、NKp44、SLAM、CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME、、CD2F-10、KLRD1/KLRC2、SIRPB1、PILRB、CLEC5A、TREM1、TREM2、CD300B、CD300E、SIGLEC-14、SIGLEC-15、SIGLEC-16或NKG2D中的一种，胞内第二传导结构域选自DAP10、DAP12或FcεRγ中的一种。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，第二传导结构域通过T2A与胞外信号肽和抗原结合结构域串联；优选的，所述DAP10氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述DAP12氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述FcεRγ氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述T2A氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于所述胞外信号肽选自氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的CD8α信号肽，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；胞内第一传导结构域选自氨基酸如SEQ ID NO.6所示的NKp46、SEQ ID NO.7所示的NKp30、SEQID NO.8所示的NKp44、SEQ ID NO.9所示的SLAM、SEQ ID NO.10所示的CD48、SEQ ID NO.11所示的CD229、SEQ ID NO.12所示的2B4、SEQ ID NO.13所示的CD84、SEQ ID NO.14所示的NTB-A、SEQ ID NO.15所示的CRACC、SEQ ID NO.16所示的BLAME、SEQ ID NO.17所示的CD2F-10、SEQ ID NO.18所示的KLRD1/KLRC2、SEQ ID NO.19所示的SIRPB1、SEQ ID NO.20所示的PILRB、SEQ ID NO.21所示的CLEC5A、SEQ ID NO.22所示的TREM1、SEQ ID NO.23所示的TREM2、SEQ ID NO.24所示的CD300B、SEQ ID NO.25所示的CD300E、SEQ ID NO.26所示的SIGLEC-14、SEQ ID NO.27所示的SIGLEC-15、SEQ ID NO.28所示的SIGLEC-16或SEQ IDNO.29所示的NKG2D，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽。

4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于所述的抗原结合结构域抗体选自单克隆抗体、Fab、scFv或VHH，其特征在于所述的抗原结合域结合的抗原与恶性肿瘤有关，包括但不限于CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD123、CD138、CEA、CTLA4、BCMA、CS1、c-Met、EPCAM、EGFR/EGFRvIII、gp100、GPC3、GD-2、IGF1R、IGF-Ireceptor、MAGE A3、mesothelin、MUC1、NY-ESO-1、HER2、PD1、PSMA、ROR1、WT1、糖脂F77或其他任意肿瘤抗原或其他修饰类型和其任何组合。

5.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于抗原结合结构域结合的抗原为CD19，所述抗原结合结构域CD19氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示。

6.一种表达权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体的细胞；其特征在于所述的细胞选自免疫细胞；所述的细胞选自T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、造血干细胞、多能干细胞或胚胎干细胞培养分化的免疫细胞。

7.一种重组表达载体，其特征在于所述的重组表达载体包括顺序连接的胞内第二传导结构域、T2A、胞外信号肽、抗原结合结构域、胞内第一传导结构域。

8.一种制备权利要求1所述的嵌合抗原受体修饰的T细胞的方法，其特征在于该方法包括分离和激活待修饰的T细胞，然后以权利要求7所述的重组表达载体转导该T细胞。

9.一种药物组合物，其特征在于包含有效量的权利要求7中任一项所述的细胞和药学上可接受的载体。

10.权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体在制备抗肿瘤药物或肿瘤细胞免疫疗法中的应用；优选在制备抗血液恶性肿瘤和实体恶性肿瘤药物中的应用。