CN109475620A - 抗原特异性t细胞的生产 - Google Patents

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Abstract

本发明在各种方面提供用于抗原特异性T细胞的磁富集和/或扩增，从而允许鉴定和表征抗原特异性T细胞及其T细胞受体(TCR)以用于治疗和/或诊断目的，并且提供用于生产用于疗法的抗原特异性工程化T细胞。在富集和/或扩增步骤期间，在磁场的存在下孵育顺磁性纳米aAPC通过将顺磁性颗粒磁聚集在T细胞表面上而活化T细胞。

Description

抗原特异性T细胞的生产
背景技术
抗原特异性T细胞的扩增由于抗原特异性初始前体的稀有性(其可以少至百万分之一)而变得复杂。为了产生过继性疗法所需的大量肿瘤特异性T细胞(举例而言)，常规地将淋巴细胞在数周内用抗原刺激，通常随后在劳动密集型过程中进行T细胞选择和亚克隆。此外，目前用于扩增淋巴细胞的各种方法(例如抗CD3/抗CD28珠粒)具有产生展现出有点呈耗尽表型的T细胞的趋势。参见Sachamitr P.等人，Induced pluripotent stem cells：challenges and opportunities for cancer immunotherapy，Front Immunol.2014年4月17日；5：176。
出于治疗和诊断目的，需要能够快速产生大量和/或高频率的抗原特异性T细胞(包括不展现出耗尽表型的T细胞)的技术。
发明内容
本发明在各种方面提供用于抗原特异性T细胞的磁富集和/或扩增，从而允许鉴定和表征抗原特异性T细胞及其T细胞受体(TCR)以用于治疗和/或诊断目的，并且提供用于生产用于疗法的抗原特异性工程化T细胞。在富集和/或扩增步骤期间，在磁场的存在下孵育顺磁性纳米aAPC通过将顺磁性颗粒磁聚集在T细胞表面上而活化T细胞。
在各种方面，本发明提供了扩增用于过继性免疫疗法的抗原特异性T细胞群的方法，所述抗原特异性T细胞群包括表达异源T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞。根据本发明的实施方案扩增的T细胞显示多功能表型(Tcm，Tem)，这与非特异性地用抗CD3/抗CD28扩增的T细胞(其更接近耗尽的表型)相反。
在一些实施方案中，本发明提供了人工抗原呈递细胞，其尤其被配置成用于抗原特异性T细胞的磁富集和扩增，所述磁富集和扩增包括在分开的珠粒上分离抗原呈递复合物(信号1)和淋巴细胞共刺激信号(信号2)(例如抗CD28)，以允许另外的控制水平和过程的变化。
在再其他方面，本发明提供了针对在T细胞群中的反应性特异性筛选大量候选抗原的方法。所述方法采用用磁柱和顺磁性aAPC进行的对抗原特异性T细胞的顺序富集，其中阴性部分用于随后的富集步骤。通过由呈递不同肽抗原的aAPC混合物呈递，可以在每个富集步骤中对若干种候选抗原进行分批。由于顺序富集的每个步骤可以筛选许多候选抗原肽，因此在不稀释原始样品中抗原特异性T细胞前体的频率的情况下所述方法容易地允许测试至少75种抗原。
在示例性实施方案中，本发明提供了治疗患有血液恶性肿瘤(例如急性骨髓性白血病(AML)或骨髓增生异常综合征)的患者的方法。在一些实施方案中，患者在同种异体干细胞移植后复发。使用来自HLA匹配供体的T细胞来源，使用磁柱和呈递至少2或3种肿瘤相关肽抗原的一种或多种顺磁性纳米aAPC对抗原特异性T细胞进行磁富集和活化。将肽抗原被动加载到制备的纳米aAPC上，配体通过游离半胱氨酸化学地缀合到颗粒上，所述游离半胱氨酸已经被工程化到免疫球蛋白序列的Fc部分的C末端附近的蛋白质中。例如，aAPC可以在相同或不同的纳米颗粒群上包含信号1和信号2。
在一些实施方案中，磁活化发生至少5分钟，例如5分钟至5小时或5分钟至2小时，随后通过培养至少5天并且在一些实施方案中长达3周来扩增。可以在表型上表征得到的CD8+ T细胞以确认它们具有中央记忆或效应记忆表型和多功能。可以将扩增的T细胞给予患者以建立抗肿瘤应答。
从以下详细描述中，本发明的其他方面和实施方案将是清楚的。
附图说明
图1示出在T细胞活化的背景下的信号1和信号2(左图)以及在顺磁性颗粒上人工抗原呈递细胞的构建(右图)。只有同源T细胞被aAPC活化。
图2图示出可以在根据本发明的实施方案的纳米颗粒上呈递的不同的共刺激信号(信号2)，并且图示出通过将信号2放置在单独的颗粒上而实现的对信号2的控制。
图3展示出在磁场的存在下将具有T细胞共受体(CD3ε)的顺磁性颗粒聚集在T细胞表面上。
图4示出磁场的存在增强了具有顺磁性aAPC的T细胞的增殖，并且所述增强取决于存在于单独的纳米颗粒上的信号2的量。
图5示出信号1和信号2即使存在于分开的纳米颗粒上时也可以支持T细胞扩增(A，左图)，并且得到的CD8 T细胞等同于由呈递两种信号的aAPC活化的那些(A，右图)。图B示出与在分开的颗粒上呈递信号相比，用呈递两种信号的aAPC活化的T细胞的细胞因子分泌谱(分泌的细胞因子或效应分子的数量)。
图6图示出与不聚集的聚苯乙烯颗粒(A)相比，在磁场的存在下包含分开的信号1和信号2的顺磁性珠粒的聚集，以及用磁扩增系统观察到的增加的扩增(B)。
图7示出可看到最佳T细胞扩增，其中信号1和2聚集得足够接近。随着粒度增加，S1+S2途径的功效降低(右图)。相比之下，含有两种信号的纳米颗粒显示出相反的效果(左图)。
图8示出了可以改变共刺激的类型以定制活化谱。
图9示出了用于在对细胞的克隆型T细胞受体进行测序之前纯化细胞的门控方案。最初采用初始T细胞并使用E+E系统用纳米aAPC刺激。在第7天，将细胞收获并通过流式细胞术分析。左图示出培养中观察到的以及对淋巴细胞群门控的事件总数。在中间图中，对活细胞/死细胞染色并仅对活细胞门控，在右图中，使用加载有trp-2肽的MHC_Ig二聚体进行染色，并且仅对阳性细胞进行分选(约18.3％)。然后将这些细胞送去进行TCR测序，结果示于图10中。
图10示出基于TCR测序分析的生产性和非生产性克隆的数量。
图11比较了前面几个克隆的频率(在Carreno等人，Science 15；348(6236)：803-8(2015)中鉴定为＞0.1％频率和＞100个读段)(图A)，如与磁富集和扩增后的生产性克隆的频率(图B)相比较。
图12示出基于总读段百分比的T细胞克隆型的频率。
图13是所有克隆的V和J配对频率的3D直方图。
图14是基于总读段的前10个克隆的V和J配对频率的3D直方图。
图15示出从健康供体产生功能活性人新抗原特异性CD-8+ T细胞。使用磁富集和扩增过程同时测试来自MCF-7乳腺癌的三种新表位。
图16示出肽到具有定点MHC缀合的纳米颗粒上的被动加载在1周后提供增加的扩增。
具体实施方式
本发明在各种方面提供用于抗原特异性T细胞的磁富集和/或磁扩增，从而允许鉴定和表征抗原特异性T细胞及其T细胞受体(TCR)以用于治疗和/或诊断目的，并且提供用于生产用于疗法的抗原特异性工程化T细胞。磁富集是指使用在其表面上具有MHC-肽抗原呈递复合物的顺磁性纳米颗粒，使得可以通过磁柱将抗原特异性T细胞与T细胞群分离，而其他细胞(包括非同源T细胞)通过。对所富集T细胞的扩增可以在存在或不存在磁场的情况下进行。磁增强的扩增是指使用在其表面上具有MHC-肽抗原呈递复合物和一种或多种淋巴细胞共刺激配体(可以在相同或不同的颗粒上)的顺磁性纳米颗粒对T细胞进行的扩增和/或活化，使得磁场的存在诱导纳米颗粒和TCR的磁聚集，从而驱动抗原特异性T细胞部分的活化和随后的扩增。在US 2016/0051698中公开了纳米级人工抗原呈递细胞的磁聚集以驱动T细胞扩增，将所述文献通过引用特此并入。在各种实施方案中，富集和扩增的过程包括磁活化，其中在磁场的存在下孵育包含信号1和信号2(在相同或不同的纳米颗粒群上)的顺磁性纳米aAPC。在磁场的存在下的孵育通常进行至少5分钟、或至少10分钟、或至少15分钟、或至少30分钟、或至少一小时、或至少2小时。例如，在磁场的存在下的孵育可以进行5分钟至约2小时或约10分钟至约1小时。
在各种方面，本发明提供了扩增用于过继性免疫疗法的抗原特异性T细胞群的方法，所述抗原特异性T细胞群包括表达异源T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞。过继性免疫疗法涉及离体活化和扩增免疫细胞，所得细胞被转移至患者以治疗疾病，例如癌症。如果可以在相对短的时间内包括从稀少前体细胞产生足够数量和频率的活化抗原特异性CTL，例如通过过继转移诱导抗原特异性细胞毒性(CD8+)淋巴细胞(CTL)应答可能是一种有吸引力的疗法。在一些实施方案中，所述途径甚至可以产生预防疾病复发的长期记忆。除了癌症免疫疗法和涉及CTL的免疫疗法之外，本发明还可用于其他免疫细胞，包括CD4+ T细胞和调节性T细胞，因此广泛适用于针对感染性疾病和自身免疫疾病的免疫疗法等。另外，根据本发明的实施方案扩增的T细胞显示多功能表型(Tcm，Tem)，这与非特异性地用抗CD3/抗CD28扩增的T细胞(其更接近耗尽的表型)相反。
在一些实施方案中，根据以下公开内容产生具有中央记忆(Tcm)或效应记忆(Tem)表型的T细胞，然后将嵌合抗原受体或异源TCR引入细胞中以产生CAR-T细胞以用于过继性疗法。可使用本文所述的方法在体内活化和扩增此类细胞。
在再其他实施方案中，纳米颗粒包含与CAR-T受体(例如CD19)接合的配体作为信号1。根据这些实施方案的纳米颗粒允许CAR-T细胞的磁活化和随后的扩增。
例如，在各种实施方案中，根据本发明的实施方案扩增的CD8+淋巴细胞包含以下表型：低PD-1表达；中央记忆表型(CD3+，CD44+，CD62L+)；以及效应记忆表型(CD3+，CD44+，CD62L-)。在一些实施方案中，当用加载有同源抗原的aAPC刺激时，根据本发明的实施方案富集和扩增的CD8+淋巴细胞产生促炎标记物如IFNγ、TNFα、IL-2、MIP-1β、GrzB和/或穿孔素。
在一些方面，本发明提供了快速产生大量抗原特异性T细胞的方法，可以在表型上和/或基因型上表征所述抗原特异性T细胞以鉴定生产性的且有效的抗原特异性TCR。在此方面，例如，本发明提供了鉴定抗原特异性T细胞受体(TCR)的方法。所述方法包括用表面上具有MHC-肽抗原呈递复合物的顺磁性纳米颗粒对异质T细胞群进行磁富集和/或磁扩增，如本文更详细描述的。然后用MHC-肽配体对扩增的T细胞进行分选(例如，通过流式细胞术)，以获得高度富集抗原特异性TCR的T细胞群。然后可以对TCR库进行测序和/或分析。与扩增的T细胞的功能表征一起，可以在短时间内鉴定具有定义亲和力的TCR。此类TCR可用于异源表达以产生用于过继性疗法的工程化T细胞。
在此方面，本发明允许产生足够数量的T细胞以便在仅几天内测序。例如，在一些实施方案中，将磁富集的细胞通过培养约2天至长达9周，或在一些实施方案中5天至约2周(例如，约1周)来扩增。DNA测序可以使用任何已知的方法进行，包括焦磷酸测序、新一代测序(NGS；DNA或RNA测序)或合成测序。测序通常包括TCRα和/或β链，其包含由V、D和J基因区形成的TCR的互补决定区，例如β受体链的CDR3。
在另一方面，本发明提供了针对与候选抗原肽文库的反应性筛选T细胞群的方法。在各种实施方案中，所述方法包括用顺磁性纳米颗粒的混合物对群体中的抗原特异性T细胞进行磁富集和磁扩增，所述顺磁性纳米颗粒各自在其表面上具有呈递候选抗原肽的MHC-肽抗原呈递复合物。所述方法还包括在表型上对所富集和扩增的T细胞例如针对它们与候选肽的反应性进行评价。
在一些实施方案中，用来自初始磁富集步骤的流通部分进行顺序磁富集，每次顺序富集使用不同的感兴趣抗原肽或不同的抗原肽集合。例如，在一些实施方案中，进行至少6次、或至少10次、或至少20次顺序磁富集。由于顺序富集的每个步骤可筛选5至约20种候选抗原肽，因此所述方法允许测试30至400种抗原。在各种实施方案中，在不稀释原始样品中抗原特异性T细胞前体的频率的情况下，测试至少50种抗原，或测试至少75种抗原，或测试至少100种抗原，或测试至少150种抗原，或测试至少200种抗原，或测试至少300种抗原。
在其他方面，本发明提供了扩增包含异源或工程化T细胞受体(TCR)的T细胞的方法。所述方法包括对包含表达异源或工程化T细胞受体(TCR)的T细胞的T细胞群进行磁富集和磁扩增。用顺磁性纳米颗粒进行富集和扩增，所述顺磁性纳米颗粒具有由颗粒表面上的异源或工程化T细胞受体(TCR)识别的MHC-肽抗原呈递复合物。在一些实施方案中，从约10％至约40％(例如，至少约20％)的抗原特异性频率开始，所述方法在约10至14天内产生高频率和数量的抗原特异性T细胞。
在其他方面，本发明提供了通过磁富集和扩增制备抗原特异性T细胞群的方法，其中将MHC-肽复合物通过MHC缀合的纳米颗粒的被动加载来制备。将纳米颗粒的被动加载与在肽的存在下MHC的重折叠进行比较，随后抗原呈递复合物缀合或附接于颗粒表面。通过制备未约束于特定抗原肽的批量颗粒，所述方法的工作流程和成本大大改善。如美国专利6,734,013(将其通过引用以其全文特此结合)中所公开的，通过碱汽提、快速中和以及在肽的存在下重折叠将肽抗原主动加载到MHC-Ig上产生了配体，与相应的被动加载的MHC-Ig相比，所述配体强10至100倍(针对T细胞染色而言)。然而，本发明的实施方案即使使用被动加载的HLA-Ig配体也提供具有优异功能的抗原特异性T细胞的稳固富集和扩增。例如，在一些实施方案中，通过与过量肽抗原一起孵育来将所述MHC缀合的纳米颗粒被动加载至少约2天。
尽管已经用包含信号1(MHC-肽复合物)和信号2(例如，抗-CD28)的aAPC描述了磁富集和扩增，但在本发明的各种方面，在一些实施方案中aAPC仅包含信号1。在所回收的T细胞的富集步骤期间或扩增期间添加第二纳米颗粒，所述第二纳米颗粒在其表面上缀合有淋巴细胞共刺激配体。通过在单独的颗粒上提供“信号2”(例如，淋巴细胞共刺激配体)，可以控制刺激的时间设定和类型。第二纳米颗粒也可以是顺磁性的，以允许第二颗粒与呈递MHC-肽抗原呈递复合物的第一纳米颗粒磁聚集在一起。在这些实施方案中，纳米颗粒优选保持较小，例如小于约200nm，小于约100nm，或小于约50nm。因此，在一些实施方案中，第二纳米颗粒是顺磁性的，并且在一个或多个富集步骤期间回收的T细胞的扩增期间添加第二纳米颗粒。
在一些实施方案中，所述第二纳米颗粒不是顺磁性的，并且是在抗原特异性T细胞的磁富集期间添加。因为信号2纳米颗粒不会被柱磁性地结合，所以信号2纳米颗粒将不会导致非特异性T细胞的磁捕获。在一些实施方案中，非顺磁性纳米颗粒途径用于顺序富集，以避免在每个富集步骤中非同源T细胞的丢失或不希望的保留。第二纳米颗粒可以是任何非顺磁性材料，包括任何已知的聚合物材料，包括聚苯乙烯或胶乳颗粒或包含PLGA、PLGA-PEG、PLA或PLA-PEG的颗粒。
在再其他方面，本发明提供了产生表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的方法，所述方法包括用在其表面上具有MHC-肽抗原呈递复合物的顺磁性纳米颗粒对T细胞群进行磁富集和扩增，从而制备富集和扩增的抗原特异性T细胞群；并且用嵌合抗原受体(CAR)转化T细胞群。
在各种实施方案中，患者是癌症患者，并且可以将扩增的CAR-T细胞过继转移至患者，任选地通过给予生物相容性aAPC再活化。在一些实施方案中，所述方法包括用药物组合物进行加强免疫从而在体内扩增和再活化CAR-T细胞，所述药物组合物包含呈递所述MHC-肽抗原呈递复合物和淋巴细胞共刺激配体的人工抗原呈递细胞(aAPC)。用于治疗用途的合适的aAPC描述于WO 2016/105542中，将其通过引用以其全文特此结合。
在相关的实施方案中，本发明提供了扩增表达CAR的T细胞的方法，以增强生产过程。例如，所述方法可包括提供如上所述的表达CAR的T细胞群，并在顺磁性纳米颗粒的存在下对T细胞群进行磁富集和/或扩增，所述顺磁性纳米颗粒在其表面上具有MHC-肽抗原呈递复合物。
示例性CAR包括衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)融合至CD3-ζ跨膜和胞内结构域或其他TCR信号传导结构域的融合物。CAR可以通过靶向例如CD19而靶向恶性B细胞。
在各种方面，本发明使用人工抗原呈递细胞(aAPC)，其将刺激信号捕获和递送至免疫效应细胞，例如抗原特异性T淋巴细胞，例如CTL。存在于支持T细胞活化的aAPC上的信号包括信号1-在I类或II类主要组织相容性复合物(MHC)的背景下呈递的并且结合抗原特异性T细胞受体(TCR)的抗原肽；和信号2-调节T细胞应答的一种或多种共刺激配体。如本文所述，信号1和信号2可以在分开的颗粒上提供，并且选择用于信号2的颗粒材料(例如，顺磁性或非顺磁性的)可以为方法提供另外的功能。信号1和信号2配体可以以定点方式化学地缀合到纳米颗粒上，使得配体在颗粒上保持功能取向。
在此系统的一些实施方案中，信号1由单体、二聚体或多聚体MHC构建体赋予。在一些实施方案中，通过与免疫球蛋白重链序列的可变区或者CH1或CH2区融合产生二聚体构建体。MHC复合物加载有一种或多种抗原肽。信号2是B7.1(T细胞受体CD28的天然配体)或针对CD28的活化型抗体。信号1和信号2配体可包括糖基的变化或游离半胱氨酸巯基的修饰。
在一些方面，本发明提供了制备用于过继转移的抗原特异性T细胞群的方法。在这些方面，T细胞来自患者或合适的供体。aAPC可以呈递对于感兴趣的疾病常见的抗原(例如，肿瘤型)，或者可以呈递在个体化基础上选择的一种或多种抗原。在一些实施方案中，扩增步骤可进行约3天至约2周，或约5天至约10天(例如，约1周)。然后可以重复富集和扩增过程一次或多次，以获得抗原特异性细胞的最佳扩增(和进一步的纯度)。对于随后的富集和扩增轮次，可以向T细胞中添加另外的aAPC以支持样品中较大的抗原特异性T细胞群的扩增。在某些实施方案中，最后一轮(例如，第2、3、4或5轮)扩增在体内发生，其中将生物相容性纳米APC添加至扩增的T细胞群中，然后输注到患者体内。
在某些实施方案中，所述方法提供了抗原特异性T细胞的约1000-10,000倍扩增(或更多)，其中在例如少于约一个月、或少于约三周、或少于约两周、或在约一周内的跨度中产生超过约108个抗原特异性T细胞。可将所得细胞给予患者以治疗疾病。在一些实施方案中，可以将aAPC与所得抗原特异性T细胞制品一起给予患者。
当在个体化的基础上选择T细胞抗原时，用来自受试者或患者的T细胞筛选各自呈递一种候选抗原肽的aAPC文库，并确定或定量T细胞对每种aAPC-肽的应答。在一些实施方案中，例如，通过定量细胞因子表达或T细胞活化的其他替代标记物的表达(例如，通过免疫化学或表达基因的扩增(例如通过RT-PCR))，可以对T细胞应答进行分子量化。在一些实施方案中，定量步骤是在培养中进行约15小时与48小时之间。在其他实施方案中，T细胞应答是通过检测细胞内信号传导(例如Ca2+信号传导或在T细胞活化期间早期发生的其他信号传导)来确定的，并且因此可在用纳米aAPC培养的约15分钟至约5小时内(例如在约15分钟至约2小时内)进行定量。选择显示最稳固反应的肽用于免疫疗法，所述免疫疗法包括在一些实施方案中本文所述的过继性免疫疗法途径。在一些实施方案中，并且特别是对于癌症免疫疗法，对患者的肿瘤进行遗传分析(例如，使用新一代测序)，并且从患者的独特肿瘤突变标记(例如，包括患者肿瘤DNA中的不存在于非肿瘤细胞中的独特突变)预测肿瘤抗原。合成这些预测的抗原(“新抗原”)并使用本文所述的aAPC平台针对患者的T细胞进行筛选。一旦鉴定/确认了反应性抗原，就可以制备aAPC用于本文所述的富集和扩增方案，或者在一些实施方案中可以将aAPC直接给予患者。
在一些方面，针对顺磁性纳米-aAPC的阵列或文库筛选受试者或患者的T细胞(如本文所述)，其中每种顺磁性纳米-aAPC呈递一种肽抗原。确定或量化针对每种的T细胞应答，提供了关于患者T细胞库的有用信息，并因此提供受试者或患者的状况。例如，针对突变蛋白、过表达的蛋白和/或其他肿瘤相关抗原的T细胞抗肿瘤应答的数量和特性可以用作生物标记物以分层风险，并且在一些实施方案中可涉及计算机实施的分类器算法以对抗药性或药物敏感性的应答谱进行分类或将应答谱分层为免疫疗法(例如，检查点抑制剂疗法或过继性T细胞转移疗法)的候选物。例如，此类T细胞应答的数量或强度可能与疾病进展的高风险成反比，和/或可与患者对免疫疗法(其可包括检查点抑制剂疗法、过继性T细胞转移或其他癌症免疫疗法中的一种或多种)的可能反应直接相关。
在再其他方面和实施方案中，针对顺磁性纳米APC的阵列或文库筛选患者的T细胞，每种顺磁性纳米APC呈递一种候选肽抗原。例如，所述阵列或文库可以呈递肿瘤相关抗原，或可以呈递自身抗原，或可以呈递与各种感染性疾病有关的T细胞抗原。通过将阵列或文库与患者的T细胞一起孵育，并且在存在磁场以促进T细胞受体聚集的情况下，可以快速确定T细胞应答的存在和/或这些T细胞应答的数量或强度。此信息可用于诊断例如亚临床肿瘤、自身免疫或免疫疾病、或者感染性疾病，并且可以提供对疾病生物学(包括潜在的致病性或治疗性T细胞、T细胞抗原)的初步了解、以及对代表药物或免疫疗法靶标的感兴趣T细胞受体的了解。
本发明提供用于癌症和其他疾病的免疫疗法，其中离体检测、富集和/或扩增抗原特异性免疫细胞在治疗上或诊断上是所希望的。本发明总体上适用于检测、富集和/或扩增抗原特异性T细胞(包括细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、辅助T细胞和调节性T细胞)以及NKT细胞或甚至B细胞，其中相应的配体被呈递在aAPC的表面上。
在一些实施方案中，患者是癌症患者。离体进行抗原特异性CTL的富集和扩增以便过继转移至患者提供了稳固的抗肿瘤免疫应答。可根据所述方法治疗或评价的癌症包括历史上引发不良免疫应答或具有高复发率的癌症。示例性癌症包括各种类型的实体瘤，所述实体瘤包括癌、肉瘤和淋巴瘤。在各种实施方案中，癌症是黑素瘤(包括转移性黑素瘤)、结肠癌、十二指肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、导管癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、子宫内膜癌、睾丸癌、胃癌、发育不良的口腔粘膜、息肉病、头颈癌、侵袭性口腔癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、间皮瘤、过渡性和鳞状细胞泌尿系统癌、脑癌、神经母细胞瘤、和神经胶质瘤。
在一些实施方案中，癌症是血液恶性肿瘤，包括白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。例如，血液恶性肿瘤可以是急性髓样白血病、慢性骨髓性白血病、儿童急性白血病、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增生异常综合征、恶性皮肤T细胞、蕈样真菌病、非MF皮肤T细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、和富含T细胞的皮肤淋巴样增生。
在各种实施方案中，癌症是I期、II期、III期或IV期。在一些实施方案中，癌症是转移性和/或复发性的。在一些实施方案中，癌症是临床前的，并且在本文所述的筛选系统中检测到(例如，结肠癌、胰腺癌或早期难以检测的其他癌症)。
在一些实施方案中，患者患有感染性疾病。感染性疾病可以是这样的一种疾病，其中离体富集和扩增抗原特异性免疫细胞(例如CD8+或CD4+ T细胞)以便过继转移至患者可以增强或提供生产性/保护性免疫应答。可以治疗的感染性疾病包括由细菌、病毒、朊病毒、真菌、寄生虫、蠕虫等引起的那些疾病。此类疾病包括AIDS、乙/丙型肝炎病毒、CMV感染和移植后淋巴组织增生性障碍(PTLD)。例如，CMV是在器官移植患者中发现的最常见的病毒病原体，并且是经历骨髓或外周血干细胞移植的患者的发病和死亡的主要原因。这是由于这些患者的免疫受损状态，其允许血清阳性患者中潜伏病毒的再活化或血清阴性个体中的机会性感染。这些治疗的有用替代方案是预防性免疫治疗方案，其涉及在开始移植程序之前产生源自患者或来自适当供体的病毒特异性CTL。PTLD发生在很大一部分移植患者中，并且由Epstein-Barr病毒(EBV)感染引起。认为EBV感染存在于美国约90％的成年人群中。免疫系统保持检查活跃的病毒复制和感染，但是，如在CMV情况中，通过移植疗法使免疫受损的个体失去了控制性T细胞群，这允许病毒再活化。这代表了移植方案的严重障碍。EBV还可能参与各种血液癌症和非血液癌症中的肿瘤促进。对于涉及生物膜或支持非浮游状态下细菌生长的基质的感染性疾病，CD8+ T细胞对于分辨率可能是重要的。募集渗入生物膜基质的活化CD8+ T细胞的抗原特异性应答可证明对于消除抗生素抗性微生物感染是有效的。
在一些实施方案中，患者患有自身免疫疾病，其中调节性T细胞(例如CD4+、CD25+、Foxp3+)的离体富集和扩增以用于过继转移至患者可以抑制有害的免疫应答。可以治疗的自身免疫疾病包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、I型糖尿病、多发性硬化症、克罗恩病、溃疡性结肠炎、银屑病、重症肌无力、Goodpasture综合征、格雷夫斯病、寻常型天疱疮、阿狄森氏病(Addison’s disease)、疱疹样皮炎、乳糜泻和桥本氏甲状腺炎。在一些实施方案中，患者疑似患有自身免疫疾病或免疫病症(例如前一句中描述的那些)，并且针对如本文所述的顺磁性纳米aAPC文库的T细胞应答的评价可用于鉴定或确认免疫病症。
因此，在各种实施方案中，本发明涉及抗原特异性T细胞的富集和扩增，例如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、辅助T细胞或调节性T细胞。在一些实施方案中，本发明涉及抗原特异性CTL的富集和扩增。前体T细胞可以从患者或从合适的HLA匹配的供体获得。前体T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞(PBMC)、骨髓、淋巴结组织、脾组织和肿瘤。在一些实施方案中，样品是来自患者的PBMC样品。在一些实施方案中，PBMC样品用于分离感兴趣的T细胞群，例如CD8+、CD4+或调节性T细胞。在一些实施方案中，使用熟练技术人员已知的任何数量的技术，例如Ficoll分离，从采集自受试者的血液单位获得前体T细胞。例如，来自个体循环血液的前体T细胞可通过单采血液成分术或白细胞析离法获得。单采血液成分术产物通常包括淋巴细胞(包括T细胞和前体T细胞)、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。白细胞析离法是一种其中将白细胞从血液样品分离的实验室程序。
可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以除去血浆部分，并将细胞置于合适的缓冲液或介质中以用于后续处理步骤。洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，例如通过根据制造商的说明书使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器)。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液，例如不含Ca和Mg的PBS。可选地，可以除去单采血液成分术的样品中不需要的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
如果需要，可以通过裂解红细胞和消耗单核细胞(例如通过PERCOLLTM梯度离心)从外周血淋巴细胞中分离前体T细胞。
如果需要，可以将T细胞亚群与可能存在的其他细胞分开。例如，可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离T细胞的特定亚群，例如CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、和CD45RO+ T细胞。其他富集技术包括例如使用针对负选择的细胞上存在的细胞表面标记物的单克隆抗体混合物，通过负磁免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择。
在某些实施方案中，将白细胞通过白细胞析离法收集，并随后使用已知方法例如可商购的磁富集柱针对CD8+ T细胞进行富集。然后使用采用aAPC试剂的磁富集，进一步针对抗原特异性T细胞对富CD8细胞进行富集。在各种实施方案中，分离至少约105个、或至少约106个、或至少约107个富CD8细胞用于抗原特异性T细胞富集。
在各种实施方案中，使包含免疫细胞(例如，CD8+ T细胞)的样品与具有磁性的人工抗原呈递细胞(aAPC)接触。顺磁性材料对磁场具有小的正磁化率。这些材料被磁场吸引，并且当去除外场时，材料不保持磁性。示例性顺磁性材料包括但不限于镁、钼、锂、钽和氧化铁(iron oxide)。适用于磁富集的顺磁性珠粒是可商购的(DYNABEADSTM，MACSMICROBEADSTM，Miltenyi Biotec)。在一些实施方案中，aAPC颗粒是铁葡聚糖珠粒(例如，葡聚糖涂覆的氧化铁珠粒)。
抗原呈递复合物包含抗原结合槽，其含有抗原以呈递给T细胞或T细胞前体。抗原呈递复合物可以是例如I类或II类MHC分子，并且可以连接或系连以提供二聚体或多聚体MHC。在一些实施方案中，MHC是单体的，但它们在纳米颗粒上的紧密结合对于亲合力和活化是足够的。在一些实施方案中，MHC是二聚体。二聚体I类MHC构建体可以通过与免疫球蛋白重链序列融合、然后通过一个或多个二硫键(和与相关的轻链)结合来构建。在一些实施方案中，信号1复合物是非经典的MHC样分子，例如CD1家族的成员(例如，CD1a、CD1b、CD1c、CD1d和CD1e)。MHC多聚体可以通过肽或化学接头直接系连产生，或者可以通过生物素部分与链霉亲和素结合而形成多聚体。在一些实施方案中，抗原呈递复合物是涉及与免疫球蛋白序列融合的I类MHC或II类MHC分子复合物，其基于免疫球蛋白骨架提供的稳定性和分泌效率而极其稳定且易于产生。
具有免疫球蛋白序列的I类MHC分子复合物描述于美国专利6,268,411中，将其通过引用以其全文特此结合。这些I类MHC分子复合物可以在免疫球蛋白重链末端以构象完整的方式形成。与抗原肽结合的I类MHC分子复合物可以稳定地结合抗原特异性淋巴细胞受体(例如T细胞受体)。在各种实施方案中，免疫球蛋白重链序列不是全长的，但包含Ig铰链区，以及CH1、CH2和/或CH3结构域中的一者或多者。Ig序列可以包含或不包含可变区，但是在存在可变区序列的情况下，可变区可以是完整的或部分的。复合物可进一步包含免疫球蛋白轻链。缺乏可变链序列的I类MHC配体(例如，HLA-Ig)可以采用到颗粒的定点缀合，如WO2016/105542中所述，将其通过引用以其全文特此结合。
示例性I类MHC分子复合物包含至少两种融合蛋白。第一融合蛋白包含第一I类MHCα链和第一免疫球蛋白重链(或其包含铰链区的部分)，并且第二融合蛋白包含第二I类MHCα链和第二免疫球蛋白重链(或其包含铰链区的部分)。第一免疫球蛋白重链和第二免疫球蛋白重链结合以形成I类MHC分子复合物，其包含两个I类MHC肽结合槽。免疫球蛋白重链可以是IgM、IgD、IgG1、IgG3、IgG2β、IgG2α、IgG4、IgE或IgA的重链。在一些实施方案中，IgG重链用于形成I类MHC分子复合物。如果需要多价I类MHC分子复合物，则可使用IgM或IgA重链分别提供五价或四价分子。
示例性的I类分子包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E，并且它们可以单独使用或以任何组合使用。在一些实施方案中，抗原呈递复合物是HLA-A2配体。如本文使用的术语MHC在每种情况下可以被HLA替代。
示例性II类MHC分子复合物描述于美国专利6,458,354、美国专利6,015,884、美国专利6,140,113和美国专利6,448,071中，将它们通过引用以其全文特此结合。II类MHC分子复合物包含至少四个融合蛋白。两个第一融合蛋白包含(i)免疫球蛋白重链(或其包含铰链区的部分)和(ii)II类MHC β链的胞外结构域。两个第二融合蛋白包含(i)免疫球蛋白κ或λ轻链(或其部分)和(ii)II类MHC α链的胞外结构域。两个第一融合蛋白和两个第二融合蛋白结合形成II类MHC分子复合物。每个第一融合蛋白的II类MHC β链的胞外结构域和每个第二融合蛋白的II类MHC α链的胞外结构域形成II类MHC肽结合槽。
免疫球蛋白重链可以是IgM、IgD、IgG3、IgG1、IgG2β、IgG2α、IgG4、IgE、或IgA的重链。在一些实施方案中，IgG1重链用于形成包含两个抗原结合槽的二价分子复合物。任选地，可以包括重链的可变区。IgM或IgA重链可分别用于提供五价或四价分子复合物。
II类MHC分子复合物的融合蛋白可包含插入在免疫球蛋白链与II类MHC多肽的胞外结构域之间的肽接头。接头序列的长度可以变化，这取决于调节抗原结合和受体交联程度所需的柔性。
在一些实施方案中，免疫球蛋白序列是人源化单克隆抗体序列。
信号2通常是影响T细胞的分子，即对前体T细胞或抗原特异性T细胞具有生物学效应的分子。此类生物学效应包括例如：前体T细胞分化成CTL、辅助T细胞(例如Th1，Th2)或调节性T细胞；和/或T细胞的增殖。因此，影响T细胞的分子包括T细胞共刺激分子、粘附分子、T细胞生长因子和调节性T细胞诱导分子。在一些实施方案中，aAPC包含至少一种这样的配体；任选地，aAPC包含至少两种、三种或四种这样的配体。
在某些实施方案中，信号2是T细胞共刺激分子。T细胞共刺激分子有助于抗原特异性T细胞的活化。此类分子包括但不限于与如下项特异性地结合的分子：CD28(包括抗体)、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、B7-H3、4-1BB、4-1BBL、CD27、CD30、CD134(OX-40L)、B7h(B7RP-1)、CD40、LIGHT；与HVEM特异性地结合的抗体；与CD40L特异性地结合的抗体；以及与OX40特异性地结合的抗体。在一些实施方案中，共刺激分子(信号2)是抗体(例如，单克隆抗体)或其部分，例如F(ab’)2、Fab、scFv或单链抗体或其他抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体是人源化单克隆抗体或其具有抗原结合活性的部分，或者是完全人抗体或其具有抗原结合活性的部分。
可以使用的共刺激配体的组合(在相同或分开的纳米颗粒上)包括抗CD28/抗CD27和抗CD28/抗41BB。可以改变这些共刺激配体的比例以影响扩增。
示例性信号1和信号2配体描述于WO 2014/209868中，其描述了具有游离巯基(例如，未配对的半胱氨酸)的配体，使得恒定区可以偶联至具有适当化学官能性的纳米颗粒支持物。
可用于纳米aAPC的粘附分子可用于介导纳米aAPC与T细胞或T细胞前体的粘附。有用的粘附分子包括例如ICAM-1和LFA-3。
在一些实施方案中，信号1由肽-HLA-A2复合物提供，而信号2由B7.1-Ig或抗CD28提供。示例性的抗CD28单克隆抗体是9.3mAb(Tan等人，J.Exp.Med.1993 177：165)，其可以在某些实施方案中人源化和/或作为完全完整抗体或其抗原结合片段与珠粒缀合。
一些实施方案使用T细胞生长因子，其影响T细胞的增殖和/或分化。T细胞生长因子的例子包括细胞因子(例如白细胞介素、干扰素)和超抗原。如果需要，细胞因子可以存在于包含融合蛋白的分子复合物中，或者可以被aAPC包封。特别有用的细胞因子包括IIL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21γ干扰素和CXCL10。任选地，在扩增步骤期间细胞因子仅由培养基组分提供。
纳米颗粒可以由任何材料制成，并且可以适当地选择材料以获得所需的磁性，并且所述材料可以包括例如金属，如铁、镍、钴或稀土金属的合金。顺磁性材料还包括镁、钼、锂、钽和氧化铁。适于富集材料(包括细胞)的顺磁性珠粒是可商购的，并且包括铁葡聚糖珠粒，例如葡聚糖包衣的氧化铁珠粒。在本发明的不需要磁性的方面中，纳米颗粒也可以由非金属或有机(例如聚合物)材料制成，例如纤维素、陶瓷、玻璃、尼龙、聚苯乙烯、橡胶、塑料或胶乳。用于制备纳米颗粒的示例性材料是聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)或PLA及其共聚物，它们可以与这些实施方案结合使用。可以使用的其他材料(包括聚合物和共聚物)包括在PCT/US 2014/25889中描述的那些，将该文献通过引用以其全文特此结合。
在一些实施方案中，磁性颗粒是生物相容的。这在将aAPC与富集和扩增的细胞结合递送给患者的实施方案中特别重要。例如，在一些实施方案中，磁性颗粒是生物相容的铁葡聚糖顺磁性珠粒。
在各种实施方案中，颗粒的尺寸(例如，平均直径)在约10至约500nm内，或在约20至约200nm内。尤其是在aAPC将被递送给患者的实施方案中，微米级aAPC太大而不能由淋巴管携带，并且当皮下注射时保留在注射部位。静脉注射时，它们会留在毛细血管床中。事实上，微米级珠粒的不良运输已经排除了aAPC应该运送在哪里进行最佳免疫疗法的研究。纳米aAPC的运输和生物分布可能比微米级aAPC更高效。例如，aAPC可能最有效的两个潜在位点是淋巴结(其中存在初始和记忆T细胞)以及肿瘤本身。直径约50至约200nm的纳米颗粒可被淋巴管吸收并转运至淋巴结，从而得以接近更大的T细胞库。如PCT/US 2014/25889(将其通过引用特此并入)中所述，皮下注射纳米aAPC导致比对照或静脉注射的珠粒更少的肿瘤生长。
对于磁聚集，在一些实施方案中，优选纳米颗粒的尺寸在10至250nm、或20至100nm的范围内。细胞-纳米颗粒界面处的受体-配体相互作用尚不清楚。然而，纳米颗粒结合和细胞活化对膜空间组织敏感，这在T细胞活化期间特别重要，并且磁场可用于操纵簇群结合的纳米颗粒以增强活化。例如，T细胞活化诱导持续增强的纳米级TCR聚集状态，并且纳米颗粒对这种聚集敏感，其方式是较大的颗粒对这种聚集不敏感。
此外，纳米颗粒与TCR簇的相互作用可用于增强受体触发。T细胞活化由信号传导蛋白的集聚介导，其中“信号传导簇”跨越数百纳米，最初在T细胞-APC接触位点的外围形成并向内迁移。如本文所述，外部磁场可用于富集抗原特异性T细胞(包括稀少的初始细胞)并驱动与TCR结合的磁性纳米aAPC的集聚，导致TCR簇的集聚和初始T细胞的增强活化。磁场可以对顺磁性颗粒施加适当的强力，但在其他方面在生物学上是惰性的，使其成为控制颗粒行为的有力工具。结合顺磁性纳米aAPC的T细胞在外部施加的磁场存在下被活化。纳米aAPC本身被磁化，并且被场源和场中的附近纳米颗粒吸引，诱导珠粒并因此诱导TCR集聚以促进aAPC介导的活化。
与初始T细胞相比，纳米aAPC结合更多的TCR并诱导先前活化的更大活化。此外，外部磁场的施加诱导纳米aAPC集聚在初始细胞上，在体外和体内过继转移后增强T细胞增殖。重要的是，在黑素瘤过继性免疫疗法模型中，在磁场中由纳米aAPC活化的T细胞介导肿瘤排斥。因此，使用施加的磁场允许活化初始T细胞群，否则所述初始T细胞群对刺激的反应差。这是免疫疗法的重要特征，因为已显示初始T细胞比癌症免疫疗法的更分化的亚型更有效，具有更高的增殖能力和更强的产生强烈的长期T细胞应答的能力。因此，纳米aAPC可用于磁场增强的T细胞活化，以增加从初始前体扩增的抗原特异性T细胞的产量和活性从而改善对于例如患有感染性疾病、癌症或自身免疫疾病的患者的细胞疗法，或为免疫抑制患者提供预防性保护。
可以通过吸附或通过直接化学键合(包括共价键合)将分子直接附接到纳米颗粒上。参见Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，New York，1996。分子本身可以用包括如下的各种化学官能团直接活化：亲核基团、离去基团或亲电子基团。活化官能团包括烷基和酰卤、胺、巯基、醛、不饱和键、酰肼、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酮和已知可活化用于化学键合的其他基团。可选地，可以通过使用小分子偶联试剂将分子结合到纳米颗粒上。偶联剂的非限制性示例包括碳二亚胺、马来酰亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺酯、双氯乙胺、双官能醛(如戊二醛)、酸酐等。在其他实施方案中，分子可以通过亲和结合(例如生物素-链霉亲和素连接或偶联)偶联至纳米颗粒，如本领域所熟知的。例如，链霉亲和素可以通过共价或非共价附接与纳米颗粒结合，并且可以使用本领域熟知的方法合成生物素化的分子。
如果考虑与纳米颗粒共价结合，则可以用含有一个或多个化学部分或官能团的聚合物涂覆支持物，所述一个或多个化学部分或官能团可用于与合适反应物的共价附接(通常通过接头)。例如，氨基酸聚合物可具有基团，例如赖氨酸的ε-氨基基团，所述基团可用于通过适当的接头共价偶联分子。本公开内容还考虑将第二涂层置于纳米颗粒上以提供这些官能团。
活化化学可用于允许分子特异性地稳定地附接到纳米颗粒的表面上。有许多方法可用于将蛋白质附接到官能团上。例如，常用的交联剂戊二醛可用于以两步法将蛋白质胺基团附接到胺化的纳米颗粒表面。所得的连接是水解稳定的。其他方法包括使用含有与蛋白质上的胺反应的n-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯的交联剂，含有与含胺、含巯基或含组氨酸的蛋白质反应的活性卤素的交联剂，含有与胺或巯基基团反应的环氧化物的交联剂，马来酰亚胺基团与巯基之间的轭合，以及通过糖侧链部分的高碘酸盐氧化然后还原胺化形成蛋白质醛基。
在一些实施方案中，信号1和/或信号2配体通过在免疫球蛋白序列的Fc区中工程化的游离半胱氨酸化学地缀合至颗粒。
当在相同或不同的颗粒上同时使用时，特定配体的比例可以变化，以增加纳米颗粒在抗原或共刺激配体呈递中的有效性。例如，可以按如下各种比例纳米颗粒与HLA-A2-Ig和抗CD28(或其他信号2配体)偶联：例如约30∶1、约25∶1、约20∶1、约15∶1、约10∶1、约5∶1、约3∶1、约2∶1、约1∶1、约0.5∶1、约0.3∶1、约0.2∶1、约0.1∶1、或约0.03∶1。在一些实施方案中，所述比例为2∶1至1∶2。与支持物偶联的蛋白质的总量可以是例如约250mg/ml、约200mg/ml、约150mg/ml、约100mg/ml、或约50mg/ml颗粒。因为与T细胞活化和分化相比，诸如细胞因子释放和生长的效应子功能可对信号1与信号2具有不同的要求，所以这些功能可以分开确定。
纳米颗粒的构型可以从形状不规则到球形和/或从具有不平坦或不规则表面到具有平滑表面而变化。非球形aAPC描述于WO 2013/086500中，将其通过引用以其全文特此结合。
在某些实施方案中，aAPC是顺磁性颗粒，其在50至100nm的范围内(例如，大约85nm)，PDI(尺寸分布)小于0.2，或在一些实施方案中小于0.1。aAPC可具有0至-10mV的表面电荷，例如约-2至-6mV。aAPC每个颗粒可具有10至120个配体，例如每个颗粒约25至约100个配体，其中配体通过免疫球蛋白序列的Fc区中引入的游离半胱氨酸与颗粒缀合。颗粒可含有约1∶1比例的HLA二聚体：抗CD28，二者可存在于相同或不同的颗粒群上。纳米颗粒提供了同源T细胞的有力扩增，同时即使肽抗原是被动加载也没有展现出对非同源TCR的刺激。颗粒以冻干形式稳定至少两年或三年。
aAPC将抗原呈递给T细胞，因此可用于富集和扩增抗原特异性T细胞，包括来自初始T细胞的抗原特异性T细胞。基于例如对癌症、癌症类型、感染性疾病等的期望疗法选择肽抗原。在一些实施方案中，进行该方法以治疗癌症患者，并对患者特异性的新抗原进行鉴定，并合成以用于加载aAPC。在一些实施方案中，通过肿瘤的遗传分析(例如，核酸测序)、之后预测性生物信息学来鉴定三个与十个之间的新抗原。如本文所示，可以一起使用若干种抗原(在分开的aAPC上)，而不损失该方法中的功能。在一些实施方案中，抗原是天然的非突变的癌抗原，其中许多是已知的。以下更详细地描述了这种用于在个性化的基础上鉴定抗原的方法。
多种抗原可以与抗原呈递复合物结合。抗原的性质取决于所用抗原呈递复合物的类型。例如，肽抗原可以与I类和II类MHC肽结合槽结合。非经典MHC样分子可用于呈递非肽抗原，例如磷脂、复合碳水化合物等(例如，细菌膜组分，如分枝菌酸和脂阿拉伯甘露聚糖)。任何能够诱导免疫应答的肽都可以与抗原呈递复合物结合。抗原肽包括肿瘤相关抗原、自身抗原、同种异体抗原和感染因子的抗原。
“肿瘤相关抗原”包括衍生它们的肿瘤专门表达的独特肿瘤抗原、在许多肿瘤中表达但在正常成人组织中不表达的共有肿瘤抗原(癌胚胎抗原)、以及也由发生肿瘤的正常组织表达的组织特异性抗原。肿瘤相关抗原可以是例如胚胎抗原、具有异常翻译后修饰的抗原、分化抗原、突变的癌基因或肿瘤抑制因子的产物、融合蛋白、或肿瘤病毒蛋白。
多种肿瘤相关抗原是本领域已知的，并且其中许多是可商购的。癌胚胎抗原和胚胎抗原包括癌胚抗原和甲胎蛋白(通常仅在发育中的胚胎中高度表达，但通常分别由肝脏和结肠的肿瘤高度表达)，MAGE-1和MAGE-3(在黑素瘤、乳腺癌和神经胶质瘤中表达)，胎盘碱性磷酸酶唾液酸基-路易斯X(在腺癌中表达)，CA-125和CA-19(在胃肠道、肝脏和妇科肿瘤中表达)，TAG-72(在结直肠肿瘤中表达)，上皮糖蛋白2(在许多癌中表达)，胰腺癌胚胎抗原，5T4(在胃癌中表达)，甲胎蛋白受体(在多种肿瘤类型中特别是在乳腺肿瘤中表达)，以及M2A(在生殖细胞瘤形成中表达)。
肿瘤相关分化抗原包括酪氨酸酶(在黑素瘤中表达)和特定表面免疫球蛋白(在淋巴瘤中表达)。
突变的致癌基因或肿瘤抑制基因产物包括Ras和p53(二者均在许多肿瘤类型中表达)，Her-2/neu(在乳腺癌和妇科癌症中表达)，EGF-R，雌激素受体，孕酮受体，视网膜母细胞瘤基因产物，myc(与肺癌相关)，ras，p53，与乳腺肿瘤相关的非突变体，MAGE-1和MAGE-3(与黑素瘤、肺癌和其他癌症相关)。融合蛋白包括BCR-ABL，其在慢性髓样白血病中表达。肿瘤病毒蛋白包括16型HPV E6和E7，它们发现于宫颈癌中。
组织特异性抗原包括黑素转铁蛋白和MUC1(在胰腺癌和乳腺癌中表达)；CD10(以前称为常见急性淋巴细胞白血病抗原，或CALLA)或表面免疫球蛋白(在B细胞白血病和淋巴瘤中表达)；IL-2受体的α链，T细胞受体，CD45R，CD4+/CD8+(在T细胞白血病和淋巴瘤中表达)；前列腺特异性抗原和前列腺酸性磷酸酶(在前列腺癌中表达)；GP 100，MelanA/Mart-1，酪氨酸酶，gp75/brown，BAGE和S-100(在黑素瘤中表达)；细胞角蛋白(在各种癌中表达)；以及CD19，CD20和CD37(在淋巴瘤中表达)。
肿瘤相关抗原还包括改变的糖脂和糖蛋白抗原，例如含神经氨酸的糖鞘脂(例如，在黑素瘤和一些脑肿瘤中表达的GM2和GD2)；血型抗原，特别是T和唾液酸化的Tn抗原，其可在癌中异常表达；以及粘蛋白，如CA-125和CA-19-9(在卵巢癌上表达)或低糖基化的MUC-1(在乳腺癌和胰腺癌上表达)。
例如，在一些实施方案中，待治疗的患者患有膀胱癌，用NY-ESO-1、MAGE-A10和MUC-1抗原中的一种或多种富集和扩增T细胞。在一些实施方案中，待治疗的患者患有脑癌，用NY-ESO-1、存活蛋白和CMV抗原中的一种或多种富集和扩增T细胞。在一些实施方案中，待治疗的患者患有乳腺癌，用MUC-1、存活蛋白、WT-1、HER-2、和CEA抗原中的一种或多种富集和扩增T细胞。在一些实施方案中，待治疗的患者患有宫颈癌，用HPV抗原富集和扩增T细胞。在一些实施方案中，待治疗的患者患有结直肠癌，用NY-ESO-1、存活蛋白、WT-1、MUC-1和CEA抗原中的一种或多种富集和扩增T细胞。在一些实施方案中，待治疗的患者患有食道癌，用NY-ESO-1抗原富集和扩增T细胞。在一些实施方案中，待治疗的患者患有头颈癌，用HPV抗原富集和扩增T细胞。在一些实施方案中，待治疗的患者患有肾癌或肝癌，用NY-ESO-1抗原富集和扩增T细胞。在一些实施方案中，待治疗的患者患有肺癌，用NY-ESO-1、存活蛋白、WT-1、MAGE-A10和MUC-1抗原中的一种或多种富集和扩增T细胞。在一些实施方案中，待治疗的患者患有黑素瘤，用NY-ESO-1、存活蛋白、MAGE-A10、MART-1和GP-100中的一种或多种富集和扩增T细胞。在一些实施方案中，待治疗的患者患有卵巢癌，用NY-ESO-1、WT-1和间皮素抗原中的一种或多种富集和扩增T细胞。在一些实施方案中，待治疗的患者患有前列腺癌，用存活蛋白、hTERT、PSA、PAP和PSMA抗原中的一种或多种富集和扩增T细胞。在一些实施方案中，待治疗的患者患有肉瘤，用NY-ESO-1抗原富集和扩增T细胞。在一些实施方案中，待治疗的患者患有淋巴瘤，用EBV抗原富集和扩增T细胞。在一些实施方案中，待治疗的患者患有多发性骨髓瘤，用NY-ESO-1、WT-1和SOX2抗原中的一种或多种富集和扩增T细胞。在一些实施方案中，待治疗的患者患有淋巴瘤，用EBV抗原富集和扩增T细胞。
在一些实施方案中，待治疗的患者患有急性骨髓性白血病或骨髓增生异常综合征，用存活蛋白、WT-1、PRAME、RHAMM和PR3抗原中的一种或多种(包括1、2、3、4或5种)富集和扩增T细胞。
“感染因子的抗原”包括以下项的组分：原生动物、细菌、真菌(单细胞和多细胞)、病毒、朊病毒、细胞内寄生虫、蠕虫和可诱导免疫应答的其他感染因子。
细菌抗原包括以下项的抗原：革兰氏阳性球菌、革兰氏阳性杆菌、革兰氏阴性细菌、厌氧菌，例如放线菌科、芽孢杆菌科、巴尔通氏体科、博德特氏菌科、噬细胞菌科(Captophagaceae)、棒状杆菌科、肠杆菌科、军团菌科、微球菌科、分枝杆菌科、诺卡氏菌科、巴斯德氏菌科、假单胞菌科、螺旋体科、弧菌科的生物以及不动杆菌属、布鲁菌属、弯曲杆菌属、丹毒丝菌属、爱文氏菌属(Ewingella)、弗朗西斯氏菌属、加德纳菌属、螺杆菌属、Levinea、李斯特菌属、链杆菌属和Tropheryma的生物。
原生动物感染因子的抗原包括以下项的抗原：疟疾疟原虫、利什曼原虫属物种、锥虫属物种和血吸虫属物种。
真菌抗原包括以下项的抗原：曲霉属，芽生菌属，假丝酵母属，球孢子菌属，隐球酵母属，组织胞浆菌属，副球孢子菌属(Paracoccicioides)，孢子丝菌属(Sporothrix)，毛霉目的生物，诱导着色真菌病(choromycosis)和足分支菌病的生物，以及毛癣菌属、小孢子菌属、表皮癣菌属和马拉色菌属的生物。
病毒肽抗原包括但不限于腺病毒、单纯疱疹病毒、乳头瘤病毒、呼吸道合胞病毒、痘病毒、HIV、流感病毒、和CMV。特别有用的病毒肽抗原包括HIV蛋白(如HIV gag蛋白(包括但不限于膜锚定(MA)蛋白、核心衣壳(CA)蛋白和核衣壳(NC)蛋白))、HIV聚合酶、流感病毒基质(M)蛋白和流感病毒核衣壳(NP)蛋白、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎核心蛋白(HBcAg)、戊型肝炎蛋白(HBeAg)、乙型肝炎DNA聚合酶、丙型肝炎抗原等。
抗原(包括抗原肽)可以主动或被动地与抗原呈递复合物的抗原结合槽结合，如美国专利6,268,411所述，将其通过引用以其全文特此结合。任选地，抗原肽可以与肽结合槽共价地结合。
如果需要，肽系链可用于将抗原肽与肽结合槽连接。例如，多种I类MHC分子的晶体学分析表明，β2M的氨基端距离MHC肽结合槽中存在的抗原肽的羧基端非常接近，大约20.5埃。因此，使用相对短的接头序列，长度大约13个氨基酸，可以将肽系连到β2M的氨基端。如果序列合适，该肽将与MHC结合沟结合(参见美国专利6,268,411)。
可以使用磁富集或其他细胞分选或捕获技术将与aAPC结合的抗原特异性T细胞与未结合的细胞分离。可用于此目的的其他方法包括流式细胞术和其他色谱手段(例如，涉及固定本文所述的抗原呈递复合物或其他配体)。在一个实施方案中，通过与珠粒(例如抗原呈递复合物/抗CD28-缀合的顺磁性珠粒(例如))孵育足以对所需抗原特异性T细胞进行阳性选择的时间来分离(或富集)抗原特异性T细胞。
在一些实施方案中，使用例如针对CD44的抗体，T细胞群可以基本上耗尽先前有活性的T细胞，留下富含初始T细胞的群体。将纳米aAPC与该群体结合基本上不会活化初始T细胞，但可以允许其纯化。
在再其他实施方案中，靶向NK细胞、NKT细胞或B细胞(或其他免疫效应细胞)的配体可以并入顺磁性纳米颗粒中，并用于磁富集这些细胞群，任选地如下文描述的那样通过培养来扩增。另外的免疫效应细胞配体描述于PCT/US 2014/25889中，将其通过引用以其全文特此结合。
不希望受理论束缚，去除不需要的细胞可以减少对细胞因子和生长信号的竞争、去除抑制性细胞，或者可以简单地为感兴趣的细胞的扩增提供更多的物理空间。
然后将富集的T细胞通过培养任选地在磁体附近扩增一段时间以产生磁场，这增强了aAPC结合细胞的T细胞受体聚集。可以用纳米aAPC刺激培养物不同的时间，例如约5分钟至约72小时(例如，约0.5、2、6、12、36、48或72小时以及连续刺激)。可以评估刺激时间在高度富集的抗原特异性T细胞培养物中的影响。如本领域已知的，可以将抗原特异性T细胞放回培养物中并分析细胞生长、增殖速率、各种效应子功能等。此类条件可根据所需的抗原特异性T细胞应答而变化。在一些实施方案中，将T细胞通过培养约2天至约3周来扩增，或在一些实施方案中，培养约5天至约2周、或约5天至约10天来扩增。在一些实施方案中，将T细胞通过培养约1周来扩增，之后任选地进行第二富集和扩增步骤。在一些实施方案中，进行2、3、4或5轮富集和扩增。
在一轮或多轮富集和扩增(例如约7天)后，样品的抗原特异性T细胞组分将是T细胞的至少约1％，或在一些实施方案中，是样品中T细胞的至少约5％、至少约10％、至少约15％、或至少约20％、或至少约25％。此外，这些T细胞通常显示活化状态。从分离自患者的原始样品中，各种实施方案中的抗原特异性T细胞扩增(在约7天内)约100倍至约10,000倍，例如至少约100倍或至少约200倍。2周后，在各种实施方案中，抗原特异性T细胞扩增至少1000倍、或至少约2000倍、至少约3,000倍、至少约4,000倍、或至少约5,000倍。在一些实施方案中，抗原特异性T细胞在两周后扩增超过5000倍或大于10,000倍。在一轮或多轮富集和扩增(一周或两周)后，获得至少约106、或至少约107、或至少约108、或至少约109个抗原特异性T细胞。
纳米aAPC对T细胞前体的扩增、活化和分化的影响可以按本领域技术人员已知的任何种方式进行测定。使用增殖测定，通过检测对每种类型T细胞特异的标记物确定培养物中CTL、辅助T细胞或调节性T细胞的增加，可以实现功能的快速确定。此类标记物在本领域中是已知的。可以通过使用铬释放测定法测定细胞因子产生或细胞溶解活性来检测CTL。
除了产生具有适当效应子功能的抗原特异性T细胞外，抗原特异性T细胞功效的另一个参数是归巢受体的表达，所述归巢受体允许T细胞运送到病理部位(Sallusto等人，Nature 401，708-12，1999；Lanzavecchia&Sallusto，Science 290，92-97，2000)。
例如，效应子CTL功效与以下归巢受体表型相关：CD62L+、CD45RO+、和CCR7-。因此，可以针对这些归巢受体的表达来表征纳米aAPC诱导和/或扩增的CTL群。归巢受体表达是与起始刺激条件相关的复杂性状。据推测，这可以通过共刺激复合物以及细胞因子环境二者来控制。已经涉及的一种重要细胞因子是IL-12(Salio等人，2001)。如下所讨论，纳米aAPC提供了改变单独分离的组分(例如，T细胞效应分子和抗原呈递复合物)以优化生物学结果参数的潜力。任选地，诸如IL-12等细胞因子可以被包括在初始诱导培养物中以影响抗原特异性T细胞群中的归巢受体谱。
任选地，包含抗原特异性T细胞的细胞群可以继续与相同的纳米aAPC或第二纳米aAPC一起孵育一段时间，所述时间足以形成相对于第一细胞群中抗原特异性T细胞的数量包含增加数量的抗原特异性T细胞的第二细胞群。通常，这种孵育进行3-21天，优选7-10天。
合适的孵育条件(培养基，温度等)包括用于培养T细胞或T细胞前体的那些以及本领域已知的用于使用DC或人工抗原呈递细胞诱导抗原特异性T细胞形成的那些。参见，例如，Latouche&Sadelain，Nature Biotechnol.18，405-09，2000年4月；Levine等人，J.Immunol.159，5921-30，1997；Maus等人，Nature Biotechnol.20，143-48，2002年2月。还参见下文的具体实施例。
为了评估增殖信号的大小，可以将抗原特异性T细胞群用CFSE标记并针对细胞分裂的速率和数量进行分析。在用结合抗原的纳米aAPC刺激一到两轮后，可以用CFSE标记T细胞。此时，抗原特异性T细胞应占总细胞群的2％-10％。可以使用抗原特异性染色检测抗原特异性T细胞，使得抗原特异性T细胞的分裂速率和数量可以通过CFSE损失来追踪。在刺激后的不同时间(例如，12、24、36、48和72小时)，可以分析细胞的抗原呈递复合物染色和CFSE。用尚未结合抗原的纳米aAPC进行刺激可用于确定增殖的基线水平。任选地，可以通过监测3H-胸苷的掺入来检测增殖，如本领域已知的。
使用纳米aAPC获得的抗原特异性T细胞可以通过任何适当的途径给予患者，包括静脉给药、动脉内给药、皮下给药、皮内给药、淋巴管内给药、和肿瘤内给药。患者包括人类和兽医患者。
抗原特异性调节性T细胞可用于实现免疫抑制作用，例如用于治疗或预防移植患者中的移植物抗宿主病，或用于治疗或预防自身免疫疾病(例如上文列出的那些)或过敏症。调节性T细胞的用途公开于例如US 2003/0049696、US 2002/0090724、US 2002/0090357、US 2002/0034500、和US 2003/0064067中，将它们通过引用以其全文特此结合。
根据这些方法制备的抗原特异性T细胞可以按范围为从约5-10 x 106个CTL/kg体重(约7 x 108个CTL/治疗)多至约3.3x 109个CTL/kg体重(约6x 109个CTL/治疗)的剂量给予患者(Walter等人，New England Journal of Medicine 333，1038-44，1995；Yee等人，JExp Med 192，1637-44，2000)。在其他实施方案中，患者可接受约103、约5 x 103、约104、约5x 104、约105、约5 x 105、约106、约5 x 106、约107、约5 x 107、约108、约5 x 108、约109、约5x 109、或约1010个细胞/静脉给予的剂量。在再其他实施方案中，患者可以在200μl推注中接受例如约8 x 106或约12 x 106个细胞的结内注射。任选地与细胞一起给予的纳米APC的剂量包括至少约103、约5 x 103、约104、约5 x 104、约105、约5 x 105、约106、约5 x 106、约107、约5 x 107、约108、约5 x 108、约109、约5 x 109、约1010、约5 x 1010、约1011、约5 x 1011、或约1012个纳米aAPC/剂量。
在一个示例性实施方案中，对衍生自患者的相同样品重复进行富集和扩增过程。在第0天富集并活化T细胞群，然后培养适当的一段时间(例如，约3-20天)。随后，纳米aAPC可用于再次针对感兴趣抗原富集和扩增，进一步增加群体纯度并为进一步的T细胞扩增提供另外的刺激。随后可以将纳米aAPC和富集的T细胞的混合物再次在体外培养一段适当的时间，或立即再次输注到患者体内以致体内进一步的扩增和治疗效果。富集和扩增可以重复任何次数，直到实现所需的扩增。
在一些实施方案中，可以一次使用针对不同抗原的纳米aAPC的混合物，以同时富集和扩增针对多种抗原的抗原T细胞。在此实施方案中，各自载有不同MHC-肽的许多不同的纳米aAPC批次将被组合并用于同时富集针对每种感兴趣抗原的T细胞。将针对这些抗原中的每一种富集和活化得到的T细胞库，因此可以同时培养针对多种抗原的应答。这些抗原可能与单一的治疗干预有关；例如，单个肿瘤上存在的多种抗原。
在一些实施方案中，在通过过继转移接受抗原特异性T细胞之前，或在通过患者肿瘤的遗传分析直接给予载有体外鉴定的新抗原的aAPC之前，患者接受采用一种或多种检查点抑制剂的免疫疗法。在各种实施方案中，一种或多种检查点抑制剂靶向CTLA-4或PD-1/PD-L1中的一种或多种，所述一种或多种检查点抑制剂可包括针对此类靶标的抗体(例如单克隆抗体)或其部分、或其人源化或完全人类形式。在一些实施方案中，检查点抑制剂疗法包括伊匹单抗(ipilimumab)或Keytruda(派姆单抗)。
在一些实施方案中，患者接受约1至5轮(例如，一轮、两轮、三轮、四轮或五轮)过继性免疫疗法。在一些实施方案中，过继性免疫疗法的每次给予与一轮检查点抑制剂疗法同时或之后(例如，约1天至约1周后)进行。在一些实施方案中，在检查点抑制剂剂量后约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约1周提供过继性免疫疗法。
在再其他实施方案中，将纳米aAPC到患者的过继转移或直接输注包括靶向CTLA-4或PD-1/PD-L1中的一种或多种的配体，其作为珠粒上的配体。在这些实施方案中，所述方法可以避免给予可溶性检查点抑制剂疗法的某些副作用。
在一些方面，本发明提供了用于个体化癌症免疫疗法的方法。使用aAPC完成所述方法以鉴定患者将响应的抗原，之后向患者给予加载有适当肽的aAPC，或者之后离体富集和扩增抗原特异性T细胞。
全基因组测序极大地改变了我们对癌症生物学的理解。癌症的测序已经产生关于涉及许多人类癌症发展的分子过程的重要数据。已经在涉及调节以下三种主要细胞过程的途径的关键基因中鉴定出驱动性突变：(1)细胞命运，(2)细胞存活和(3)基因组维持。Vogelstein等人，Science 339，1546-58(2013)。
全基因组测序还有可能彻底改革我们的癌症免疫治疗方法。测序数据可以提供关于共有的和个性化的靶标的信息以用于癌症免疫疗法。原则上，突变蛋白对免疫系统来说是外来的，并且是推定的肿瘤特异性抗原。实际上，测序工作已经定义了数百甚至数千个潜在相关的免疫靶标。有限的研究显示，针对这些新表位的T细胞应答可以发现于癌症患者中或由癌症疫苗诱导。然而，针对特定癌症的这种应答的频率以及患者之间共有这种应答的程度尚不清楚。我们对肿瘤特异性免疫应答的有限理解的主要原因之一是用于验证潜在免疫相关靶标的当前途径是麻烦且耗时的。
因此，在一些方面，本发明提供了基于平台的高通量途径，以便检测针对癌症中新抗原的T细胞应答。该途径使用本文所述的aAPC平台来检测针对癌症抗原的甚至低频率的T细胞应答。了解此类应答的频率和人与人之间的可变性将对癌症疫苗的设计和个性化的癌症免疫疗法产生重要影响。
尽管中枢耐受性消除了针对自身蛋白质的T细胞应答，但致癌突变诱导了新表位，针对所述新表位可以形成T细胞应答。衍生自全外显子组测序的突变目录提供了鉴定此类新表位的起点。使用HLA结合预测算法(Srivastava，PLoS One 4，e6094(2009))，已经预测每种癌症可以具有多达7-10个新表位。类似的途径估计了数百种肿瘤新表位。然而，此类算法在预测T细胞应答中可能具有低准确度，并且预期仅有10％的预测的HLA结合表位在HLA的背景下结合(Lundegaard C，Immunology 130，309-18(2010))。因此，必须验证预测的表位是否存在针对那些潜在新表位的T细胞应答。
在某些实施方案中，纳米aAPC系统用于筛选在多种癌症或特定患者的癌症中诱导T细胞应答的新表位。可以对癌症进行遗传分析，例如，通过全外显子组测序。例如，在一组24种晚期腺癌中，鉴定到每种肿瘤平均约50个突变。在分析的大约20,000个基因中，1327个具有至少一个突变，以及148个具有两个或更多个突变。鉴定了974个错义突变，具有另外少量的缺失和插入。
可以从突变蛋白质中重叠的九氨基酸窗口产生候选肽列表。选择含有突变氨基酸的所有九-AA窗口和来自每种蛋白质的2个非突变型“对照”。使用MHC结合预测算法(包括Net MHC和稳定矩阵方法(SMM))的共有性，计算性地评估这些候选肽的MHC结合。针对HLA-A2等位基因主要开发纳米aAPC和MHC结合算法。可以调整共有预测的灵敏度截止值，直到鉴定出易处理数量的含有突变的肽(约500个)和非突变型对照肽(约50个)。
然后合成肽文库。将载有MHC(例如，A2)的aAPC沉积在多孔板中并被动地加载肽。可以从A2阳性健康供体和A2阳性癌症患者的PBMC分离CD8 T细胞。随后，将分离的T细胞与加载的aAPC一起孵育以进行富集步骤。孵育后，将板或培养瓶置于磁场上，并除去含有未与aAPC结合的无关T细胞的上清液。培养与aAPC结合的剩余T细胞并使其扩增7至21天。通过用aAPC再次刺激和细胞内IFNγ荧光染色评估抗原特异性扩增。
在一些实施方案中，针对纳米APC的阵列或文库筛选患者的T细胞，并将结果用于诊断或预后目的。例如，针对突变蛋白、过表达的蛋白和/或其他肿瘤相关抗原的T细胞抗肿瘤应答的数量和特性可用作生物标记物以分层风险。例如，此类T细胞应答的数量可与疾病进展的风险或与对化疗的抗性或无应答的风险成反比。在其他实施方案中，针对纳米APC的阵列或文库筛选患者的T细胞，并且T细胞应答的存在或这些T细胞应答的数量或强度确定患者具有亚临床肿瘤，和/或提供对肿瘤生物学的初步了解。
在一些实施方案中，针对顺磁性aAPC的阵列或文库筛选患者或受试者的T细胞，每种顺磁性aAPC呈递不同的候选肽抗原。此筛选可以提供关于受试者或患者的T细胞库的大量信息，并且结果可用于诊断或预后目的。例如，针对突变蛋白、过表达的蛋白和/或其他肿瘤相关抗原的T细胞抗肿瘤应答的数量和特性可用作生物标记物以分层风险、监测免疫疗法的功效或预测免疫疗法治疗的结果。此外，此类T细胞应答的数量或强度可与疾病进展的风险成反比，或者可预测对化疗的抗性或无应答性。在其他实施方案中，针对各自呈递候选肽抗原的纳米APC的阵列或文库筛选受试者或患者的T细胞，并且T细胞应答的存在或这些T细胞应答的数量或强度例如通过鉴定自身免疫疾病或鉴定患者具有亚临床肿瘤提供了关于患者的健康的信息。在这些实施方案中，该过程不仅鉴定潜在的疾病状态，而且提供对疾病生物学的初步了解。
在示例性实施方案中，患者患有血液癌症，例如急性骨髓性白血病(AML)或骨髓增生异常综合征，并且在一些实施方案中，患者在同种异体干细胞移植后复发。使用来自HLA匹配供体的T细胞来源，使用磁柱和顺磁性纳米aAPC对抗原特异性T细胞进行磁富集和活化，所述顺磁性纳米aAPC呈递2至5种肿瘤相关肽抗原，其任选地选自存活蛋白、WT-1、PRAME、RHAMM和PR3。将抗原被动地加载到制备的纳米aAPC上，所述纳米aAPC通过定点缀合而在相同或不同的颗粒群上呈递信号1和信号2。
磁活化可以进行5分钟至5小时、或5分钟至2小时，随后通过培养至少5天、以及在一些实施方案中培养长达2周或长达3周来扩增。得到的CD8+ T细胞可以在表型上表征以证实：低PD-1表达；中央记忆表型(CD3+、CD45RA-、CD62L+)；和效应记忆表型(CD3+、CD45RA-、CD62L-)。扩增的T细胞可以按1至约4次给药给予患者，以建立抗肿瘤反应。
基于以下说明性实施例，本发明的其他方面和实施方案将对于本领域技术人员而言是清楚的。
实施例
人工抗原呈递细胞(aAPC)可以在顺磁性颗粒(例如葡聚糖涂覆的氧化铁纳米颗粒)上构建，以用于活化抗原特异性T细胞。图1。信号1和信号2的存在导致T细胞活化和扩增。通过使用顺磁性颗粒，可以通过磁场诱导信号1和/或信号2的聚集。图3和图6A。
通过控制在单独的纳米颗粒上的共刺激信号(信号2)的呈递，可以控制和改变共刺激信号的类型。图2。当使用顺磁性颗粒时，磁场的存在增强了T细胞的增殖，并且此效应取决于在与信号1分开的纳米颗粒上存在的信号2的量。图4。无论信号1和2是存在于相同还是不同的颗粒上，所得到的T细胞在品质上是相同的。图5。
当信号1和信号2二者存在于分开的(顺磁性或非顺磁性)珠粒上时，观察到抗原特异性T细胞的最高扩增，当两种颗粒均是顺磁性时观察到最高的扩增。图6。
随着粒度增加，S1+S2途径的功效降低。相比之下，含有两种信号的纳米颗粒显示出相反的效果。因此，当对信号1和信号2使用分开的纳米颗粒时，颗粒优选保持在200nm或更小，例如100nm或30nm，这支持高水平的扩增。图7。
通过将每个信号放置在单独的珠粒上，可以改变共刺激的类型以定制活化谱。例如，含有50/50抗CD28和抗CD27的信号2珠粒以及含有25/75抗CD28和抗41BB的信号2珠粒支持高水平的扩增。图8。
磁富集和扩增导致快速鉴定具有所需抗原特异性的新型TCR。图9，图10。富集和扩增的T细胞可以是四聚体或二聚体，其被分选以产生高纯度的抗原特异性T细胞群以用于TCR测序。这是一种快速鉴定和生成足够材料以便在很短的时间内进行充分的TCR测序的方式。
磁富集导致高频率的生产性克隆型。图11，图12。这些结果与Carreno等人的结果相比良好(图11A)，其中频率分布更均匀。可以评价克隆的V和J配对频率(图13，图14)。
磁富集和扩增允许筛选T细胞群针对候选抗原(包括新抗原)的反应性。筛选可以按分批方式进行。图15。例如，从健康供体鉴定功能活性人新抗原特异性CD-8+ T细胞。使用磁富集和扩增过程同时测试来自MCF-7乳腺癌的三种新表位。因此，可以针对来自突变抗原的预测新表位检测多克隆CD8 T细胞群的应答。由于这些T细胞群通常非常稀少，因此通常不可能用常规技术如四聚体分析来检测它们。
顺序富集使这一过程更高效。通过顺序富集，然后将磁富集步骤的阴性细胞群(其仅包含对所需抗原呈阴性的未结合T细胞)与加载有另一组抗原肽的新纳米颗粒一起孵育。此过程可以在每次运行中用10-15种不同的肽加载的纳米颗粒重复多次(例如，至少6次)。这使得顺序E+E途径能够探测单个样品中至少90种不同的抗原。
图16示出肽到具有定点MHC缀合的纳米颗粒上的被动加载在1周后提供增加的扩增。将CD8+ T细胞从初始C57BL/6脾中分离，并与加载有Trp2肽的纳米颗粒(Kb Ig二聚体/aCD28)以20uL颗粒/107个细胞在4℃孵育1小时。然后使用磁柱分离与纳米颗粒结合的细胞，并在96孔板中培养7天。在第7天，将细胞收获、计数并用抗CD8抗体和Trp2/Kb五聚体染色。对于对照，使用具有无关肽的Kb五聚体。
纳米颗粒的设计和构建(其中信号1和信号2通过分子FC末端处的工程化游离半胱氨酸以定点方式共价结合)使得它们非常稳定而具有长保存期。这允许生产大的无加载批次，其随后被动地加载感兴趣肽。例如，在加载过程中，将未加载的颗粒与过量的肽在4℃下孵育至少3天。然后通过在磁柱上洗涤加载的纳米颗粒除去未结合的过量游离肽。顺磁性颗粒将保留在柱上，并且游离肽将被洗掉。在强烈洗涤(3-5次)后，将除去磁体并洗脱颗粒。这种被动加载途径为系统带来了高抗原柔性，降低了制造成本，并使分批途径能够生成定制的患者特异性多抗原/颗粒混合物(5-10种抗原)，并实现高通量筛选以进行新表位鉴定(＞50个表位)。
目前性能使用比率为大约1∶1的信号1和信号2(抗CD28)以及高蛋白质密度(80-200个配体)/颗粒。颗粒在50至150nm的范围内。

Claims (76)

1.一种鉴定抗原特异性T细胞受体(TCR)的方法，所述方法包括：
用在顺磁性纳米颗粒的表面上具有MHC-肽抗原呈递复合物的所述纳米颗粒对异质T细胞群进行磁富集和扩增，
用MHC-肽配体分选所扩增的T细胞，以获得具有所需抗原特异性的T细胞群；并且
对所述T细胞群中的TCR基因或其部分进行测序。
2.如权利要求1所述的方法，其中将T细胞和所述顺磁性纳米颗粒在磁场的存在下孵育至少5分钟。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述异质T细胞群包括外周血单核细胞(PBMC)样品、记忆T细胞、初始T细胞、先前活化的T细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述异质T细胞群来自骨髓、淋巴结组织、脾组织或肿瘤。
5.如权利要求3所述的方法，其中通过白细胞析离法分离所述异质T细胞群。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中将所述异质T细胞群针对CD8+细胞、CD4+细胞或T调节细胞来富集。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述异质T细胞群包含至少106个CD8+细胞、CD4+细胞或T调节细胞。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中将磁富集的细胞通过培养约2天至约9周以及任选地至少约1周来扩增。
9.如权利要求8所述的方法，其中将磁富集的细胞通过培养约5天至约2周来扩增。
10.如权利要求9所述的方法，其中使用所述MHC肽抗原呈递复合物进行细胞分选。
11.一种针对与抗原肽文库的反应性筛选T细胞群的方法，所述方法包括：
使用顺磁性纳米颗粒的混合物对所述T细胞群中的抗原特异性T细胞进行磁富集和扩增，所述顺磁性纳米颗粒各自具有呈递感兴趣抗原肽的表面缀合型MHC-肽抗原呈递复合物，
并且从表型上评价所扩增的T细胞。
12.如权利要求11所述的方法，其中将T细胞和所述顺磁性纳米颗粒在磁场的存在下孵育至少5分钟。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述T细胞群来自骨髓、淋巴结组织、脾组织或肿瘤。
14.如权利要求13所述的方法，其中通过白细胞析离法分离所述T细胞群。
15.如权利要求11至14中任一项所述的方法，其中将所述T细胞群针对CD8+细胞或CD4+细胞来富集。
16.如权利要求11至15中任一项所述的方法，其中所述T细胞群包含至少106个CD8+细胞、CD4+细胞。
17.如权利要求11至16中任一项所述的方法，其中将磁富集的细胞通过培养至少约2天来扩增。
18.如权利要求11至17中任一项所述的方法，其中针对细胞因子表达来评价所扩增的T细胞。
19.如权利要求11至18中任一项所述的方法，其中用流通部分进行顺序富集和扩增，每次顺序富集和扩增测试不同的感兴趣抗原肽。
20.如权利要求19所述的方法，其中进行至少六次顺序富集和扩增，以及任选地至少十次顺序富集和扩增步骤。
21.如权利要求20所述的方法，其中每次顺序富集和扩增步骤包括五至约20个感兴趣抗原肽。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中测试至少75种抗原，或任选地其中测试至少100种抗原。
23.如权利要求11至22中任一项所述的方法，其中所述T细胞群来自癌症患者、患有自身免疫疾病的患者或患有感染性疾病的患者。
24.一种扩增包含异源或工程化T细胞受体(TCR)的T细胞的方法，所述方法包括：
用顺磁性纳米颗粒对T细胞群进行磁富集和扩增，所述T细胞群包含表达异源或工程化T细胞受体(TCR)的T细胞，所述顺磁性纳米颗粒在其表面上具有由所述异源或工程化T细胞受体(TCR)识别的MHC-肽抗原呈递复合物。
25.如权利要求24所述的方法，其中将T细胞和所述顺磁性纳米颗粒在磁场的存在下孵育至少5分钟。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述T细胞群中的所述异源或工程化T细胞受体的起始频率为至少约20％。
27.如权利要求25或26所述的方法，其中将所述工程化T细胞通过培养至少10天、和任选地10至20天、和任选地10至14天来扩增。
28.一种制备抗原特异性T细胞群的方法，所述方法包括：
提供包含来自患者或合适供体的T细胞的样品；
使所述样品与第一纳米颗粒接触，所述第一纳米颗粒是顺磁性的并且在其表面上包含MHC-肽抗原呈递复合物，其中通过MHC缀合的纳米颗粒的被动加载来制备所述MHC-肽复合物；
将磁场置于所述顺磁性纳米颗粒附近，
回收与所述顺磁性颗粒相关联的抗原特异性T细胞，并且
任选地在磁场的存在下扩增所回收的T细胞。
29.如权利要求28所述的方法，其中将T细胞和所述顺磁性纳米颗粒在磁场的存在下孵育至少5分钟。
30.如权利要求29所述的方法，其中通过与过量肽抗原一起孵育来将所述MHC缀合的纳米颗粒被动加载至少约2天。
31.如权利要求29或30所述的方法，其中在所回收的T细胞的富集或扩增期间添加第二纳米颗粒，所述第二纳米颗粒在其表面上具有淋巴细胞共刺激配体。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述第二纳米颗粒是顺磁性的，并且在所回收的T细胞的扩增期间添加所述第二纳米颗粒。
33.如权利要求31所述的方法，其中所述第二纳米颗粒不是顺磁性的，并且是在抗原特异性T细胞的磁富集期间添加。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述第二纳米颗粒是聚合物，并且任选地包括PLGA、PLGA-PEG、PLA或PLA-PEG。
35.如权利要求28至34中任一项所述的方法，其中所述T细胞群包括外周血单核细胞(PBMC)样品、记忆T细胞、初始T细胞、先前活化的T细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述T细胞群来自骨髓、淋巴结组织、脾组织或肿瘤。
37.如权利要求35所述的方法，其中通过白细胞析离法分离所述T细胞群。
38.如权利要求28至37中任一项所述的方法，其中将所述T细胞群针对CD8+细胞、CD4+细胞或T调节细胞来富集。
39.如权利要求28至37中任一项所述的方法，其中所述T细胞群包含至少106个CD8+细胞、CD4+细胞或T调节细胞。
40.如权利要求28至39中任一项所述的方法，其中将磁富集的细胞通过培养约2天至约9周来扩增。
41.如权利要求40所述的方法，其中将磁富集的细胞通过培养约5天至约4周来扩增。
42.如权利要求41所述的方法，其中进行另外至少一轮的磁富集和扩增。
43.如权利要求28至42中任一项所述的方法，其中所述患者是癌症患者。
44.如权利要求28至43中任一项所述的方法，其还包括将所扩增的抗原特异性T细胞过继转移至所述患者。
45.如权利要求44所述的方法，其还包括用药物组合物进行加强免疫，所述药物组合物包含呈递所述MHC-肽抗原呈递复合物和淋巴细胞共刺激配体的人工抗原呈递细胞(aAPC)。
46.一种产生表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的方法，所述方法包括：
用在其表面上具有MHC-肽抗原呈递复合物的顺磁性纳米颗粒对T细胞群进行磁富集和扩增，从而制备富集和扩增的抗原特异性T细胞群；并且
用嵌合抗原受体(CAR)转化所述T细胞群。
47.如权利要求46所述的方法，其中将T细胞和所述顺磁性纳米颗粒在磁场的存在下孵育至少5分钟。
48.如权利要求47所述的方法，其中通过与过量肽抗原一起孵育来将MHC缀合的纳米颗粒被动加载至少约2天。
49.如权利要求47或48所述的方法，其中在所回收的T细胞的富集或扩增期间添加第二纳米颗粒，所述第二纳米颗粒在其表面上缀合有淋巴细胞共刺激配体。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述第二纳米颗粒是顺磁性的，并且在所回收的T细胞的扩增期间添加所述第二纳米颗粒。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述第二纳米颗粒不是顺磁性的，并且是在抗原特异性T细胞的磁富集期间添加。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述第二纳米颗粒是聚合物，并且任选地包括PLGA、PLGA-PEG、PLA或PLA-PEG。
53.如权利要求46至52中任一项所述的方法，其中所述T细胞群包括外周血单核细胞(PBMC)样品、记忆T细胞、初始T细胞、先前活化的T细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述T细胞群来自骨髓、淋巴结组织、脾组织或肿瘤。
55.如权利要求54所述的方法，其中通过白细胞析离法分离所述T细胞群。
56.如权利要求46至55中任一项所述的方法，其中将所述T细胞群针对CD8+细胞来富集。
57.如权利要求46至56中任一项所述的方法，其中所述T细胞群包含至少106个CD8+细胞。
58.如权利要求46至57中任一项所述的方法，其中将磁富集的细胞通过培养约5天至约9周来扩增。
59.如权利要求58所述的方法，其中将磁富集的细胞通过培养约5天至约4周来扩增。
60.如权利要求59所述的方法，其中进行另外至少一轮的磁富集和扩增。
61.如权利要求46至60中任一项所述的方法，其中所述患者是癌症患者。
62.如权利要求46至61中任一项所述的方法，其还包括将表达所述CAR的T细胞群过继转移至患者。
63.如权利要求62所述的方法，其还包括用药物组合物进行加强免疫，所述药物组合物包含呈递所述MHC-肽抗原呈递复合物和淋巴细胞共刺激配体的人工抗原呈递细胞(aAPC)。
64.一种扩增表达CAR的T细胞的方法，所述方法包括：
根据权利要求46提供表达CAR的T细胞群，并且
在顺磁性纳米颗粒的存在下对所述T细胞群进行磁扩增，所述顺磁性纳米颗粒在其表面上具有MHC-肽抗原呈递复合物。
65.如权利要求64所述的方法，其中将T细胞和所述顺磁性纳米颗粒在磁场的存在下孵育至少5分钟。
66.一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括：
给予根据权利要求46或61所述的方法制备的CAR-T，并且
向所述患者给予人工抗原呈递细胞，所述人工抗原呈递细胞呈递与MHC复合的感兴趣抗原以及淋巴细胞共刺激配体。
67.一种治疗患有在同种异体干细胞移植后已复发的血液癌症的患者的方法，所述方法包括：
提供包含来自合适供体的T细胞的样品；
使所述样品与纳米颗粒接触，所述纳米颗粒是顺磁性的并在其表面上包含：(1)MHC-肽抗原呈递复合物(信号1)，其中通过MHC缀合的纳米颗粒的被动加载来制备所述MHC-肽复合物；以及(2)抗CD28共刺激配体(信号2)；
将磁场置于所述顺磁性纳米颗粒附近，
回收与所述顺磁性颗粒相关联的抗原特异性T细胞，
扩增所回收的T细胞；并且
向所述患者给予所扩增的T细胞。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述患者患有急性骨髓性白血病(AML)或骨髓增生异常综合征。
69.如权利要求67所述的方法，其中MHC是MHC-Ig。
70.如权利要求67至69中任一项所述的方法，其中使用磁柱和顺磁性纳米aAPC对抗原特异性T细胞进行磁富集和活化，所述顺磁性纳米aAPC呈递2至5种肿瘤相关肽抗原。
71.如权利要求70所述的方法，其中一种或多种肽抗原选自存活蛋白、WT-1、PRAME、RHAMM和PR3。
72.如权利要求70或71所述的方法，其中将所述肽抗原被动地加载到制备的纳米aAPC上，所述纳米aAPC通过定点缀合而在相同或不同的颗粒群上呈递信号1和信号2。
73.如权利要求67至72中任一项所述的方法，其中将所述T细胞和所述顺磁性纳米颗粒在磁场的存在下孵育至少5分钟。
74.如权利要求73所述的方法，其中将所述T细胞和所述顺磁性纳米颗粒在磁场的存在下孵育5分钟至5小时。
75.如权利要求74所述的方法，其中将所述T细胞通过培养至少约5天来扩增。
76.如权利要求67至75中任一项所述的方法，其中向所述患者给予所扩增的T细胞1至约4次。
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