RU2656156C2 - Внутриклеточная доставка - Google Patents
Внутриклеточная доставка Download PDFInfo
- Publication number
- RU2656156C2 RU2656156C2 RU2014119926A RU2014119926A RU2656156C2 RU 2656156 C2 RU2656156 C2 RU 2656156C2 RU 2014119926 A RU2014119926 A RU 2014119926A RU 2014119926 A RU2014119926 A RU 2014119926A RU 2656156 C2 RU2656156 C2 RU 2656156C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cell
- cells
- delivery
- constriction
- microfluidic
- Prior art date
Links
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 title claims abstract description 331
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 title abstract description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 723
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 244
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 155
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 147
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 claims abstract description 97
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 44
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 29
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 20
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 239000002041 carbon nanotube Substances 0.000 claims abstract description 15
- 229910021393 carbon nanotube Inorganic materials 0.000 claims abstract description 15
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 210000004990 primary immune cell Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 80
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 claims description 78
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 30
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 26
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 23
- 230000006835 compression Effects 0.000 claims description 22
- 238000007906 compression Methods 0.000 claims description 22
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 claims description 20
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 12
- 238000012800 visualization Methods 0.000 claims description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 3
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 22
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 20
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 abstract description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 8
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 143
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 61
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 50
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 46
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 45
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 44
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 43
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 40
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 37
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 34
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 32
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 30
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 30
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 30
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 29
- 238000013461 design Methods 0.000 description 26
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 26
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 25
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 25
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 24
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 24
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 23
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 22
- 230000008569 process Effects 0.000 description 22
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 21
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 description 20
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 description 20
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 20
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 20
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 20
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 20
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 20
- 230000004044 response Effects 0.000 description 20
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 19
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 18
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 18
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 17
- VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N pacific blue Chemical compound FC1=C(O)C(F)=C2OC(=O)C(C(=O)O)=CC2=C1 VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000011160 research Methods 0.000 description 17
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 16
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 15
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 15
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 14
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 14
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 13
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 13
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 13
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 13
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 13
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 13
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 13
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 12
- 238000011161 development Methods 0.000 description 12
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 12
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 12
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 12
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 11
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 11
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 11
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 11
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 10
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 9
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 9
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 9
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 9
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 9
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 9
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 description 8
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 8
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 8
- UHYPYGJEEGLRJD-UHFFFAOYSA-N cadmium(2+);selenium(2-) Chemical group [Se-2].[Cd+2] UHYPYGJEEGLRJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 8
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 8
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 8
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 7
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 7
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 7
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 7
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 7
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 6
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 6
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 6
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 6
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 5
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 5
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 5
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 5
- 238000000708 deep reactive-ion etching Methods 0.000 description 5
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 5
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 4
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 5,5-diethylbarbituric acid Chemical compound CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 4
- 101710095339 Apolipoprotein E Proteins 0.000 description 4
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 4
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 4
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 4
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 4
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000000942 confocal micrograph Methods 0.000 description 4
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 4
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 4
- 238000000206 photolithography Methods 0.000 description 4
- -1 polydimethylsiloxane Polymers 0.000 description 4
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 4
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 4
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical group CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 3
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 3
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 3
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000014102 antigen processing and presentation of exogenous peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 3
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 3
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 3
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 3
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 3
- 210000000442 hair follicle cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 3
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 3
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 3
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 3
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000012342 propidium iodide staining Methods 0.000 description 3
- 239000005297 pyrex Substances 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- QGLWBTPVKHMVHM-KTKRTIGZSA-N (z)-octadec-9-en-1-amine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCN QGLWBTPVKHMVHM-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100257359 Caenorhabditis elegans sox-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010008805 Chromosomal abnormalities Diseases 0.000 description 2
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 2
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 description 2
- 229920000089 Cyclic olefin copolymer Polymers 0.000 description 2
- 239000004713 Cyclic olefin copolymer Substances 0.000 description 2
- 101150099612 Esrrb gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101001123298 Homo sapiens PR domain zinc finger protein 14 Proteins 0.000 description 2
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 2
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 2
- 101100257363 Mus musculus Sox2 gene Proteins 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102100028974 PR domain zinc finger protein 14 Human genes 0.000 description 2
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 2
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002319 barbital Drugs 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 2
- CZPLANDPABRVHX-UHFFFAOYSA-N cascade blue Chemical compound C=1C2=CC=CC=C2C(NCC)=CC=1C(C=1C=CC(=CC=1)N(CC)CC)=C1C=CC(=[N+](CC)CC)C=C1 CZPLANDPABRVHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- ZPEIMTDSQAKGNT-UHFFFAOYSA-N chlorpromazine Chemical compound C1=C(Cl)C=C2N(CCCN(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 ZPEIMTDSQAKGNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001076 chlorpromazine Drugs 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 239000012776 electronic material Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 2
- QDERNBXNXJCIQK-UHFFFAOYSA-N ethylisopropylamiloride Chemical compound CCN(C(C)C)C1=NC(N)=C(C(=O)N=C(N)N)N=C1Cl QDERNBXNXJCIQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 229940045109 genistein Drugs 0.000 description 2
- TZBJGXHYKVUXJN-UHFFFAOYSA-N genistein Natural products C1=CC(O)=CC=C1C1=COC2=CC(O)=CC(O)=C2C1=O TZBJGXHYKVUXJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000006539 genistein Nutrition 0.000 description 2
- ZCOLJUOHXJRHDI-CMWLGVBASA-N genistein 7-O-beta-D-glucoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC(O)=C2C(=O)C(C=3C=CC(O)=CC=3)=COC2=C1 ZCOLJUOHXJRHDI-CMWLGVBASA-N 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000001746 injection moulding Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 101150111214 lin-28 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 230000034701 macropinocytosis Effects 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 2
- 229910052754 neon Inorganic materials 0.000 description 2
- GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N neon atom Chemical compound [Ne] GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZVEZMVFBMOOHAT-UHFFFAOYSA-N nonane-1-thiol Chemical compound CCCCCCCCCS ZVEZMVFBMOOHAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- CCCMONHAUSKTEQ-UHFFFAOYSA-N octadecene Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCC=C CCCMONHAUSKTEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 2
- 230000003307 reticuloendothelial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JVJGCCBAOOWGEO-RUTPOYCXSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-4-amino-2-[[(2s,3s)-2-[[(2s,3s)-2-[[(2s)-2-azaniumyl-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-carboxylatobutanoyl]amino]-6-azaniumy Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JVJGCCBAOOWGEO-RUTPOYCXSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODJQKYXPKWQWNK-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Thiobispropanoic acid Chemical compound OC(=O)CCSCCC(O)=O ODJQKYXPKWQWNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 206010002945 Aphakia Diseases 0.000 description 1
- 230000028728 B cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 241000252506 Characiformes Species 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005853 Clathrin Human genes 0.000 description 1
- 108010019874 Clathrin Proteins 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 1
- 108010020195 FLAG peptide Proteins 0.000 description 1
- 238000004252 FT/ICR mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 206010048723 Multiple-drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 201000007224 Myeloproliferative neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229920000459 Nitrile rubber Polymers 0.000 description 1
- 108010075205 OVA-8 Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000003012 bilayer membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002902 bimodal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 239000007978 cacodylate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 230000005773 cancer-related death Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000004323 caveolae Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000008668 cellular reprogramming Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012707 chemical precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229930193282 clathrin Natural products 0.000 description 1
- 230000006395 clathrin-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000012303 cytoplasmic staining Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940124447 delivery agent Drugs 0.000 description 1
- 230000004041 dendritic cell maturation Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000005672 electromagnetic field Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000001317 epifluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005530 etching Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000004424 eye movement Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 1
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- PTCGDEVVHUXTMP-UHFFFAOYSA-N flutolanil Chemical compound CC(C)OC1=CC=CC(NC(=O)C=2C(=CC=CC=2)C(F)(F)F)=C1 PTCGDEVVHUXTMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 1
- FFUAGWLWBBFQJT-UHFFFAOYSA-N hexamethyldisilazane Chemical compound C[Si](C)(C)N[Si](C)(C)C FFUAGWLWBBFQJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000006525 intracellular process Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 108091023663 let-7 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091063478 let-7-1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091049777 let-7-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001459 lithography Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011070 membrane recovery Methods 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002071 nanotube Substances 0.000 description 1
- 230000018352 negative regulation of endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000000276 neural tube Anatomy 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N octane Chemical compound CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000103 photoluminescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920002523 polyethylene Glycol 1000 Polymers 0.000 description 1
- 238000012805 post-processing Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000018883 protein targeting Effects 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 229940034080 provenge Drugs 0.000 description 1
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 229920005604 random copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 210000001533 respiratory mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000007727 signaling mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052814 silicon oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M sodium dimethylarsinate Chemical compound [Na+].C[As](C)([O-])=O IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KFZUDNZQQCWGKF-UHFFFAOYSA-M sodium;4-methylbenzenesulfinate Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S([O-])=O)C=C1 KFZUDNZQQCWGKF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 230000023895 stem cell maintenance Effects 0.000 description 1
- 230000008080 stochastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005309 stochastic process Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 229940124598 therapeutic candidate Drugs 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical group 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 230000005641 tunneling Effects 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000007794 visualization technique Methods 0.000 description 1
- 238000009279 wet oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
- C12M1/02—Apparatus for enzymology or microbiology with agitation means; with heat exchange means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/02—Form or structure of the vessel
- C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Mechanical Engineering (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Electromagnetism (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине, а именно к безвекторной микрожидкостной платформе для внутриклеточной доставки в цитозоль эукариотической клетки соединения или композиции. Предложены микрожидкостные системы для обеспечения разрывов в клетке и способы доставки груза в клетку. Микрожидкостные системы включают устройство, в частности микрожидкостный канал, содержащее деформирующее клетку сужение, и компонент, обеспечивающий продвижение клеток. Диаметр сужения составляет 20-99% от диаметра клетки и индуцирует в клетке достаточно крупные разрывы, чтобы груз прошел через них. Способы доставки груза в клетку с использованием указанной системы обеспечивают доставку ДНК, РНК, миРНК или белка в первичные фибробласты и стволовые клетки, антигена или РНК в первичные иммунные клетки, квантовых точек, углеродных нанотрубок или лекарственных средств в клетку-мишень. Изобретения позволяют исключить модификацию желаемого груза, пригодны для доставки чувствительных грузов, а также обеспечивают прямую доставку груза в цитозоль, избегая эндосомального компартмента, не приводят к изменению состояния дифференцировки или активности обработанной клетки. 5 н. и 40 з.п. ф-лы, 45 ил., 4 пр.
Description
РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
По настоящей заявке испрашивается приоритет временной заявки США №61/548013, поданной 17 октября 2011 года, и временной заявки США №61/684301, поданной 17 августа 2012 года, содержание каждой из которых включено в настоящее описание в качестве ссылки.
ЗАЯВЛЕНИЕ О ФЕДЕРАЛЬНО СПОНСИРУЕМОМ ИССЛЕДОВАНИИ
Настоящее изобретение было осуществлено по меньшей мере частично при поддержке правительства по гранту 5 RC1 EB011187-02, выданному National Institute of Health. Правительство имеет определенные права на настоящее изобретение.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Разработка многих фармацевтических препаратов в большой степени сфокусирована на низкомолекулярных лекарственных средствах. Эти лекарственные средства называются так вследствие их относительно небольшого размера, который позволяет им свободно диффундировать в организме, достигая их мишени. Эти молекулы также способны проникать через в ином случае непроницаемую клеточную мембрану по большей части беспрепятственно. Однако лекарственные средства следующего поколения на основе белков, ДНК или РНК не могут беспрепятственно проходить через клеточную мембрану и, таким образом, для облегчения их доставки требуется клеточная модификация. В общепризнанных способах используются химические вещества и электрические импульсы для прохождения через мембрану и доставки материала в цитоплазму. Надлежащая внутриклеточная доставка является критической стадией в этом исследовании, разработке и осуществлении лекарственных средств следующего поколения.
Существующие способы часто трудно разработать и они являются высокоспецифическими в отношении их конкретного применения. Более того, существующие способы не направлены надлежащим образом на многие клинически важные типы клеток, такие как стволовые клетки и иммунные клетки. Таким образом, существует потребность в более надежном и точном способе, способном удовлетворить потребности современных биологических/медицинских исследований.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение основано на неожиданном открытии, что контролируемое повреждение, например, осуществление воздействия на клетку сжатия, быстрого растягивания, быстрого сдавливания или импульса с высоким усилием сдвига приводит к захвату молекул в цитоплазму клетки из окружающей клеточной среды. Таким образом, изобретение относится к безвекторной микрожидкостной платформе для внутриклеточной доставки прямо в цитозоль эукариотической клетки материалов, например, соединения или композиции. Устройство является пригодным в качестве универсального и широко применимого лабораторного инструмента для доставки желаемых молекул в клетки-мишени. Доставка молекул в клетку с использованием способов, описанных в настоящем описании, является пропорциональной, например, линейно или монотонно скорости клеток через область сужения и/или сдавления. Например, 50 мкл суспензии клеток проходит через устройство за несколько секунд. Пропускная способность находится в диапазоне от 1 клетка/секунда на канал (или даже менее) до более чем 1000 клеток/секунда на канал. Типичные скорости клеток через сужение включают от 10 мм/секунда до 500 мм/секунда, хотя скорость клеток может составлять вплоть до 10 м/c (или даже выше). Дополнительные каналы можно помещать параллельно для увеличения общей пропускной способности системы.
Захват молекулы происходит посредством диффузии, а не эндоцитоза, т.е. груз (соединение(я), подлежащее доставке в клетку) находится в цитоплазме, а не в эндосомах после прохождения через устройство. В эндосомах после обработки клеток груз появляется в небольшом количестве или он не появляется. Например, крупные молекулы захватываются медленнее, чем молекулы меньших размеров. Контролируемое растяжение клеток и скорость движения клеток через сужение приводит к более высокой доставке молекул-мишеней при сохранении жизнеспособности и целостности клеток. После обработки жизнеспособность клеток составляет 70-100%, например, типичная жизнеспособность составляет 90% после обработки. При сравнении было показано, что предшествующие способы доставки с использованием высоких уровней сдвига отдельно в течение секунд или миллисекунд приводят к низкой жизнеспособности клеток после обработки. В противоположность предшествующим способам, способы по изобретению подвергают клетки сдвиговому импульсу в диапазоне 100-1000 Па в течение очень короткого периода времени (приблизительно 100 микросекунд) по мере того, как клетка проходит через сужение. Однако настоящие способы существенно отличаются от предшествующих способов. В настоящих способах предпочтительно происходит полная механическая деформация клетки по мере того, как она проходит через сужение, что может обеспечить сдвиговые усилия, отличающиеся от предшествующих способов. В предпочтительных вариантах осуществления клетки не подвергают воздействию электрического тока. В других вариантах осуществления используют комбинированную обработку, например, механическую деформацию с использованием устройства, описанного в настоящем описании, с последующей или предшествующей электропорацией (тип осмотической трансфекции, при которой используют электрический ток для обеспечения временных отверстий в клеточных мембранах, позволяя вхождение нуклеиновых кислот или макромолекул).
Груз представляет собой соединение или композицию, подлежащие доставке в клетку. Например, груз может включать белки, флуоресцентные красители, квантовые точки, углеродные нанотрубки, молекулы РНК, молекулы ДНК, антигены и другие макромолекулы, наночастицы и композиции.
Ширина сужения устройства, длина суженной части, геометрия области входа и глубина трубки устройства влияют на доставку молекул в клетку. Предпочтительно ширина суженной области трубки составляет не менее 4 мкм в диаметре, и длина суженной части трубки предпочтительно составляет 40-50 мкм. Длина суженной части, как правило, не превышает 90 мкм. Диаметр суженной части соответствует типу клетки, подлежащей обработке. Как описано ниже, диаметр является меньшим, чем диаметр клетки (например, 20-99% от диаметра клетки). Многие клетки имеют диаметр 5-15 мкм, например, дендритные клетки имеют диаметр 7-8 мкм. Например, диаметр области сужения составляет 4,5, 5, 5,5, 6 или 6,5 мкм для обработки единичных клеток. В другом примере размер/диаметр области сужения для обработки яйцеклетки человека составляет от 6,2 мкм до 8,4 мкм, хотя возможны сужения большего и меньшего размера (диаметр яйцеклетки человека составляет приблизительно 12 мкм). В другом примере эмбрионы (например, кластеры из 2-3 клеток) обрабатывают с использованием диаметра сужения от 12 мкм до 17 мкм.
Устройство и способы пригодны для разработки и изготовления вакцин с использованием специализированных антигенпредставляющих клеток, таких как дендритные клетки. Например, способ стимуляции представления антигена осуществляют, подвергая дендритную клетку контролируемому повреждению, такому как временное сжатие или импульс с высоким сдвиговым усилием, и контактируя дендритную клетку с раствором, содержащим антиген-мишень. Способ обеспечивает высоко активированные антигенпредставляющие клетки по сравнению с предшествующими способами стимуляции. Изготовление вакцины осуществляют, пропуская дендритные клетки или другие антигенпредставляющие клетки через содержащее сужение устройство (тем самым, подвергая клетки явлению быстрого растяжения), а затем инкубируя клетки в растворе, содержащем груз, например, антиген. Клетки подвергают периодическому культивированию в культуральной среде, содержащей один или несколько антигенов, после быстрой деформации клеток, однако клетки можно контактировать с антигеном до, в процессе и/или после явления/процесса быстрой деформации.
В циркулирующем буфере необязательно используют поверхностно-активные вещества (например, 0,1-10% масс./масс.) (например, полоксамер, сыворотка животного, белок-альбумин). На доставку молекул в клетки не влияет присутствие поверхностно-активных веществ; однако поверхностно-активные вещества необязательно используют для уменьшения закупорки устройства в процессе эксплуатации.
Устройство изготавливают из кремния, металла (например, нержавеющая сталь), пластмассы (например, полистирол), керамики или любого другого материала, пригодного для гравирования рельефа микронного масштаба и включает одну или несколько трубок или каналов, через которые проходят клетки. Кремний является особенно пригодным, поскольку способы формирования микрорельефа являются налаженными для этого материала, таким образом, проще изготовить новые устройства, изменить конструкцию и т.д. Кроме того, жесткость кремния может обеспечить преимущество над более мягкими субстратами, такими как полидиметилсилоксан (PDMS), например, более высокие уровни доставки. Например, устройство включает 2, 10, 20, 25, 45, 50 75, 100 или более каналов. Микрорельеф на устройстве формируют гравированием на кремнии. Клетки продвигают, например, проталкивают, через каналы или трубки с использованием давления. Клеточный привод может обеспечивать давление. Клеточный привод может включать, например, нагнетающий насос, газовый баллон, компрессор, вакуумный насос, шприц, шприцевой насос, перистальтический насос, ручной шприц, пипетку, поршень, капиллярный действующий элемент и гравитацию. В качестве альтернативы каналам клетки можно пропускать через сужение в форме сети или близко помещенных пластин. В любом случае, ширина сужения, через которое проходят клетки, составляет 20-99% от ширины или диаметра клетки, подлежащей обработке, в ее естественном, т.е. не подвергнутом стрессу, состоянии. Температура может влиять на захват композиций и влиять на жизнеспособность. Способы осуществляют при комнатной температуре (например, 20°C), физиологической температуре (например, 39°C), температуре, превышающей физиологическую температуру, или сниженной температуре (например, 4°C), или при температурах между этими иллюстративными температурами.
После контролируемого повреждения клетки посредством сужения, растяжения и/или импульса с высоким усилием сдвига клетки инкубируют в растворе для доставки, который содержит соединение или молекулу, которые желают ввести в клетку. Контролируемое повреждение может характеризоваться как небольшой, например диаметром 200 нм, дефект в клеточной мембране. Для закрытия повреждения, вызванного прохождением через сужение, период восстановления для клеток составляет порядка нескольких минут. Период доставки составляет 1-10 минут или более, например, 15, 20, 30, 60 минут или более, причем 2-5 минут являются оптимальными при работе при комнатной температуре. Более длительные периоды инкубации в растворе для доставки необязательно обеспечивают увеличенный захват. Например, данные показали, что после 5 минут клетки захватывают мало дополнительного материала или не захватывают его.
Таким образом, изобретение относится к решению длительно существовавших проблем в области доставки лекарственного средства к клеткам и устранению недостатков предшествующих способов.
Что касается доставки материала в эукариотическую клетку, клетки можно классифицировать на две основных категории:
1) Простые для доставки (ETD) клетки: Большинство доступных химических и вирусных способов относятся к этой категории. Простые для доставки клетки часто не имеют прямого клинического значения.
2) Трудные для доставки (DTD) клетки: Высокое клиническое значение. Достижения в технологии доставки могут значительно облегчить/ускорить разработку новых способов терапии. Эта категория включает стволовые клетки, первичные клетки и иммунные клетки. Ожидается, что рынок доставки DTD значительно вырастет по мере ускорения разработки новых терапевтических средств на основе РНК, стволовых клеток и белков в последующие годы.
Способы, описанные в настоящем описании, оказались особенно пригодными для областей разработки DTD, хотя некоторые способы можно использовать для клеток ETD. Кроме того, они облегчают доставку материалов (таких как квантовые точки, углеродные нанотрубки и антитела), которые нельзя эффективно доставить никаким другим способом как в клетки ETD, так и в клетки DTD.
Как правило, в одном аспекте вариант осуществления изобретения может относиться к микрожидкостной системе для обеспечения разрывов клеточной мембраны, причем система включает микрожидкостный канал, определяющий просвет и имеющий такую конфигурацию, что клетка, суспендированная в буфере, может проходить через него, где микрожидкостный канал включает сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра клетки.
Варианты осуществления изобретения также могут обеспечить один или несколько из следующих признаков. Диаметр сужения составляет по существу 20-99% от диаметра клетки, проходящей через него. Поперечное сечение канала выбрано из группы, состоящей из округлого, эллиптического, удлиненного щелевого, квадратного, шестиугольного и треугольного. Сужение включает область входа, центральную точку и область выхода. Область входа определяет угол сужения, где угол сужения оптимизирован для уменьшения закупорки канала. Микрожидкостная система, кроме того, включает множество микрожидкостных каналов, расположенных параллельно, например, 2, 5, 10, 20, 40, 45, 50, 75, 100, 500, 1000 или более.
Как правило, в другом аспекте варианты осуществления изобретения также обеспечивают способ доставки соединения в клетку, причем способ включает предоставление клетки в суспензии или суспендирование клетки и груза в растворе, пропускание раствора через микрожидкостный канал, который включает сужение, изменение размера сужения в зависимости от диаметра клетки, пропускание клетки через сужение так, чтобы к клетке применялось давление, вызывающее разрывы в клетке, достаточно крупные, чтобы груз прошел через них, и инкубацию клетки в растворе в течение заданного периода времени после того, как он пройдет через сужение.
Варианты осуществления изобретения также могут обеспечивать один или несколько из следующих признаков. Диаметр сужения составляет по существу 20-99% от диаметра клетки. Поперечное сечение микрожидкостного канала выбрано из группы, состоящей из кругового, эллиптического, удлиненного щелевого, квадратного шестиугольного и треугольного. Прохождение раствора включает прохождение раствора через область вхождения, центральную точку и область выхода из сужения. Кроме того, способ включает уменьшение закупорки микрожидкостного канала путем корректирования угла сужения в области входа. Прохождение раствора включает прохождение раствора через множество микрожидкостных каналов, расположенных параллельно.
Как правило, в другом аспекте варианты осуществления изобретения также могут обеспечить способ доставки соединения в клетку, причем способ включает предоставление клетки в растворе или суспендирование клетки в растворе, прохождение раствора через микрожидкостный канал, который включает сужение, изменение размера сужения в зависимости от диаметра клетки, прохождение клетки через сужение так, чтобы к клетке применялось давление, вызывающее разрывы в клетке, и инкубацию клетки в растворе, содержащем груз, в течение заданного периода времени после того, как он проходит через сужение, где разрывы являются достаточно большими, чтобы груз проходил через них.
Варианты осуществления изобретения также обеспечивают один или несколько из следующих признаков. Диаметр сужения составляет по существу 20-99% от диаметра клетки. Поперечное сечение микрожидкостного канала выбрано из группы, состоящей из кругового, эллиптического, удлиненного щелевого, квадратного шестиугольного и треугольного. Прохождение раствора включает прохождение раствора через область вхождения, центральную точку и область выхода из сужения. Кроме того, способ включает уменьшение закупорки микрожидкостного канала путем корректирования угла сужения в области входа. Прохождение раствора включает прохождение раствора через множество микрожидкостных каналов, расположенных последовательно и параллельно. Инкубация включает инкубацию клетки в течение от 0,0001 секунды до 20 минут (или даже более). Давление представляет собой давление сдвига и сдавления.
Как правило, в другом аспекте, варианты осуществления изобретения также обеспечивают способ доставки соединения в клетку, причем способ включает предоставление клетки в растворе или суспендирование клетки в растворе, деформацию клетки так, чтобы в мембране клетки возникали разрывы, и инкубацию клетки в растворе с грузом после деформации клеток.
Варианты осуществления изобретения также могут обеспечить один или несколько из следующих признаков. Деформация клетки включает деформацию клетки в течение от 1 мкс до 10 мс, например, 10 мкс, 50 мкс, 100 мкс, 500 мкс и 750 мкс. Инкубацию проводят в течение от 0,0001 секунд до 20 минут, например, 1 секунды, 30 секунд, 90 секунд, 270 секунд и 900 секунд.
Различные варианты осуществления изобретения могут обеспечить одну или несколько из следующих возможностей. По сравнению с предшествующими способами можно достигать большей точности и масштабируемости. Доставка материала к клетке может быть автоматизирована. Материал, такой как белки, РНК, миРНК (siRNA), пептиды, ДНК и не проникающий краситель можно вводить в клетку, такую как эмбриональные стволовые клетки или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC), первичные клетки или иммортализованные клеточные линии. Устройство и способы пригодны для любого типа клеток, и размер области сужения адаптируют к размеру клетки, подлежащей обработке. Устройства и способы могут обеспечить значительные преимущества. Например, экспериментальные искажения в настоящих системах могут быть снижены по сравнению с предшествующими способами. Доставляемые количества материала могут быть постоянными для популяции клеток. Клетки можно индивидуально обрабатывать, а не обрабатывать партией. Изобретение также продемонстрировало довольно уникальную возможность доставлять различные наночастицы и белки в цитозоль. Существующие способы являются недостаточно надежными и недостаточными в отношении выполнения таких функций.
Что касается доставки чувствительных грузов, например, белки (особенно крупные белки, например, более 30, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500 кДа или более), квантовые точки или другие грузы, которые являются чувствительными к электричеству или повреждаются под воздействием электричества, надежно доставляются в клетки при сохранении целостности и активности чувствительного груза. Таким образом, устройство и способы имеют значительные преимущества над существующими способами, такими как электропорация, которая подвергает композиции груза воздействию электричества (тем самым, повреждая груз) и приводят к низкой жизнеспособности (например, 505 или более клеток, как правило, погибают после электропорации). Другим преимуществом способа быстрого растяжения/деформации является то, что стволовые клетки или клетки-предшественники становятся восприимчивыми к захвату груза без изменения состояния дифференцировки или активности обработанной клетки. В дополнение к доставке композиций в цитоплазму клетки для терапевтических целей, например, изготовления вакцин, способ используют для введения молекул, например, больших молекул, содержащих поддающийся обнаружению маркер, для мечения внутриклеточных структур, таких как органеллы, или для мечения внутриклеточных компонентов для целей диагностики или визуализации.
Различные варианты осуществления изобретения также могут обеспечить одну или несколько из следующих возможностей. ДНК можно доставлять в подлежащие доставке дозы клетки, такие как стволовые, первичные, иммунные клетки. Можно проводить доставку очень крупных плазмид (даже целых хромосом). Можно без труда проводить количественную доставку в клетку известного количества генной конструкции для исследования уровня экспрессии представляющего интерес гена и ее чувствительности к концентрации. Можно проводить доставку известных количеств последовательностей ДНК вместе с известным количеством ферментов, которые усиливают рекомбинацию ДНК, для достижения более простой/более эффективной стабильной доставки, гомологичной рекомбинации и сайт-специфического мутагенеза. Способы и устройства, описанные в настоящем описании, также могут быть пригодными для количественной доставки РНК для более эффективных/наглядных исследований РНК. Также можно без труда проводить доставку малой интерферирующей РНК (миРНК) в цитоплазму клетки.
Различные варианты осуществления изобретения также могут обеспечить одну или несколько из следующих возможностей. РНК можно доставлять в клетку для подавления РНК без необходимости в липосомах. Известные количества молекул РНК вместе с известными количествами молекул dicer можно доставлять для обеспечения стандартизованной эффективной РНК в множестве клеточных линий в различных условиях. мРНК можно доставлять в клетки для исследования аспектов регуляции экспрессии генов на посттрансляционном уровне. Могут быть возможными известные количества метки для РНК в целях исследования времени полужизни РНК и клеток. Можно достигать универсальной доставки белка. Известные количества белков-меток можно доставлять для исследований времени полужизни в клетках. Можно осуществлять доставку белков-меток в область расположения исследуемого белка. Известные количества меченых белков можно доставлять для исследования белок-белковых взаимодействий в клеточной среде. Можно осуществлять доставку меченых антител в живые клетки для иммунного окрашивания и вестерн-блоттинга на основе флуоресценции.
Различные варианты осуществления изобретения также могут обеспечивать одну или несколько из следующих клинических или исследовательских возможностей. Можно достигать количественной доставки лекарственных средств в клеточных моделях для улучшения скрининговых исследований и исследований дозировок. Способ можно использовать в качестве высокопроизводительного способа скрининга активности белка в цитозоле, чтобы помочь идентифицировать белковые терапевтические средства или понять механизмы заболевания. Такие применения в настоящее время строго ограничиваются современными способами доставки белков вследствие их неэффективности. Устройства и способы пригодны для внутриклеточной доставки лекарственных средств в конкретную подгруппу циркулирующих клеток крови (например, лимфоциты), высокопроизводительной доставки сахаров в клетки для улучшения криоконсервации клеток, особенно ооцитов, направленной клеточной дифференцировки посредством введения белков, мРНК, ДНК и/или факторов роста, доставки генетического или белкового материала для индукции перепрограммирования клеток для получения клеток iPS, доставки ДНК и/или ферментов рекомбинации в эмбриональные стволовые клетки для разработки линий трансгенных стволовых клеток, доставки ДНК и/или ферментов рекомбинации в зиготы для получения трансгенных организмов, активации DC-клеток, получения iPSC, и дифференцировки стволовых клеток, доставки наночастиц для диагностики и/или механических исследований, а также введения квантовых точек. Также с использованием устройств и способов, описанных в настоящем описании, модифицируют клетки кожи, используемые для пластической хирургии.
Способ стимуляции представления антигена с использованием способа доставки антигена и/или иммуностимулирующих молекул обеспечивает антигенпредставляющие клетки, например, дендритные клетки, с увеличенными уровнями активности по сравнению с традиционными способами стимуляции, тем самым обеспечивая увеличенные уровни опосредуемого T и B-клетками иммунитета в отношении антигена-мишени. Таким образом, такой способ можно использовать в качестве средства активации иммунной системы в ответ на злокачественную опухоль или инфекции.
Для целей скрининга, визуализации или диагностики устройство используют в способе мечения клеток. Способ мечения клеток осуществляют, подвергая клетку контролируемому повреждению и контактируя клетки с раствором, содержащим поддающийся обнаружению маркер, где указанное повреждение включает временное сужение или импульс высокого сдвига. Поддающийся обнаружению маркер включает флуоресцентную молекулу, радионуклид, квантовые точки, золотые наночастицы или магнитные гранулы.
До изобретения манипулирование со стволовыми клетками для введения экзогенных композиций было трудным. Устройство и способы, описанные в настоящем описании, например, для пропускания стволовых клеток или клеток-предшественников, таких как индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC), через канал с сужением, не индуцируют дифференцировку, но надежно индуцируют захват композиции в клетку. Например, в такие клетки вводят факторы дифференцировки. После захвата введенных факторов клетки проходят путь дифференцировки, определяемый введенным фактором, без осложнений, ассоциированных со способом, посредством которого фактор(ы) был введен в клетку.
В дополнение к отдельным клеткам, даже очень крупным клеткам, например яйцеклеткам, диаметром приблизительно 200 мкм, кластеры клеток, например, кластеры из 2-5 клеток, таких как эмбрион, содержащий 2-3 клетки, обрабатывают для захвата заданных композиций. Размер отверстия корректируют соответствующим образом, т.е. так, чтобы ширина сужения была немного ниже размера кластера. Например, ширина канала составляет 20-99% от ширины кластера клеток.
Клетки или кластеры клеток очищают/выделяют или обогащают желаемым типом клеток. Дендритные клетки или другие клетки, например, иммунные клетки, такие как макрофаги, B-клетки, T-клетки или стволовые клетки, такие как эмбриональные стволовые клетки или iPS, используемые в способах, очищают или увеличивают в количестве. Например, клетки выделяют или увеличивают в количестве посредством экспрессии на них маркеров клеточной поверхности или других идентифицирующих характеристик. Дендритные клетки идентифицируют и выделяют благодаря экспрессии ими β-интегрина, CD11c или других идентифицирующих маркеров клеточной поверхности. Что касается клеток, термин "выделенный" означает, что клетка по существу свободна от других типов клеток или клеточного материала, с которыми она встречается в природе. Например, образец клеток конкретного типа тканей или фенотипа является "по существу чистым", когда популяция клеток в нем составляет по меньшей мере 60%. Предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% или 100% препарата составляет популяция клеток. Чистоту измеряют подходящим стандартным способом, например, активируемой флуоресценцией сортировкой клеток (FACS).
Композиции груза, такие как полинуклеотиды, полипептиды или другие средства, являются очищенными и/или выделенными. В частности, как используют в рамках изобретения, "выделенная" или "очищенная" молекула нуклеиновой кислоты, полинуклеотид, полипептид или белок, являются по существу свободными от другого клеточного материала или культуральной среды при продуцировании рекомбинантными способами или химических предшественников или других химических веществ, когда они химически синтезированы. Очищенные соединения имеют по меньшей мере 60% по массе (масса сухого вещества) представляющего интерес соединения. Предпочтительно препарат имеет по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% по массе представляющего интерес соединения. Например, очищенное соединение представляет собой соединение, которое имеет по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 98%, 99% или 100% (масс./масс.) желаемого соединения по массе. Чистоту измеряют любым подходящим стандартным способом, например, колоночной хроматографией, тонкослойной хроматографией или высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). Очищенный или выделенный полинуклеотид (рибонуклеиновая кислота (РНК) или дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК)) является свободным от генов или последовательностей, которые фланкируют его в его встречающемся в природе состоянии. Примеры выделенной или очищенной молекулы нуклеиновой кислоты включают: (a) ДНК, которая является частью встречающейся в природе молекулы геномной ДНК, но не фланкируется обеими последовательностями нуклеиновой кислоты, которые фланкируют эту часть молекулы в геноме организма, в котором она встречается в природе; (b) нуклеиновую кислоту, встроенную в вектор или в геномную ДНК прокариотического или эукариотического организма так, чтобы полученная молекула не была идентична какому-либо встречающемся в природе вектору или геномной ДНК; (c) отдельную молекулу, такую как кДНК, геномный фрагмент, фрагмент, продуцируемый полимеразной цепной реакцией (ПЦР), или фрагмент рестрикции; и (d) рекомбинантную нуклеотидную последовательность, которая является частью гибридного гена, т.е. гена, кодирующего слитый белок. Выделенные молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением дополнительно включают молекулы, продуцируемые синтетически, а также любые нуклеиновые кислоты, которые изменены химически и/или которые имеют модифицированные основные цепи.
Суспензионный раствор представляет собой любой физиологический или совместимый с клеткой буфер или раствор. Например, суспензионный раствор представляет собой клеточную культуральную среду или фосфатно-солевой буфер. Груз представляет собой тот же самый или отличающийся суспензионный раствор, который также содержит композицию, предназначенную для доставки внутрь клетки.
Преимущества устройства включают избегание модификации желаемого груза и отсутствие необходимости в воздействии на груз каких-либо электромагнитных полей или других форм стресса. Что касается электропорации, было показано, что этот способ повреждает белки и является неэффективным в отношении доставки. Этот существенный недостаток не является проблемой в случае способа, описанного в настоящем описании; способ по настоящему изобретению особенно пригоден для доставки чувствительных грузов, например белков, в частности, крупных белков (например, от 40 кДа до 70 кДа, и вплоть до 120, 130, 150, 200 кДа или более), крупных конструкций нуклеиновых кислот (например, плазмиды и другие конструкции, содержащие полимеры нуклеиновой кислоты размером 1 т.п.н., 2 т.п.н., 5 т.п.н. или более и вплоть до целых хромосом), крупных соединений, а также квантовых точек (например, диаметром 12 нм) и других материалов, которые известны тем, что они являются чувствительными и легко повреждаются под воздействием электричества. Например, поверхностные лиганды на наночастице или квантовой точке могут повреждаться или могут становиться заряженными в ответ на электрическое поле, что, таким образом, приводит к агрегации частиц, тем самым ограничивая/устраняя их функциональность. Другим преимуществом способа контролируемого повреждения является время контактирования клеток с композицией для доставки. Особое значение для белков, которые являются чувствительными к протеазам, температурам, а также электричеству, имеет то, что клетки контактируют с раствором груза после обработки и в течение относительно короткого периода времени по сравнению с предшествующими способами. Микрожидкостный характер устройства также требует меньших рабочих объемов, тем самым экономя дорогостоящие исходные материалы и/или клетки. Устройство также может быть сопряжено с существующими способами доставки, такими как электропорация или липосомы, для обеспечения усиленной доставки относительно каждого способа по отдельности.
Функциональная активность доставляемого груза обратно коррелирует со сдвиговой нагрузкой на жидкость, т.е. физическая нагрузка на мембрану клетки, такая как растяжение клеточной мембраны, опосредует захват груза в большей степени, чем усилие сдвига. Общепринятые способы доставки наночастиц могут приводить к большему количеству материала, получающему доступ к внутриклеточной среде клетки; однако эти способы обеспечивают меньшую активность доставляемого материала по сравнению со способами, описанными в настоящем описании, вследствие того факта, что предшествующие способы приводят к изоляции доставляемого материала в эндосомах. Способы, описанные в настоящем описании, обеспечивают прямую доставку в цитозоль соединений/композиций, так чтобы меньшее количество груза, доставляемое в клетку, обеспечивало больший уровень функциональной активности доставляемых молекул вследствие их доступности для других компонентов цитозоля. Например, предшествующие способы доставки наночастиц обеспечили в 2-10 раз большее количество доставляемого материала в клетки, но с небольшой или отсутствием функциональной активности доставляемого материала вследствие изоляции в эндосомах. Устройства и способы по изобретению преодолевают этот недостаток предшествующих способов внутриклеточной доставки вследствие избегания эндосомального компартмента.
Дополнительные преимущества и признаки включают временной масштаб обработки и скорости клеток, которые являются значительно более высокими, чем для предшествующих подходов. Более того, другие способы не сдавливают клетки настолько, насколько настоящие способы, например, как определяют по размеру (диаметру) клетки относительно размера (диаметра) сужения (в качестве % от диаметра клетки). Это быстрое, мощное, но сублетальное, сдавление или деформация обеспечивает лучшие результаты в отношении прямого захвата груза в цитозоль клетками. Деформация клеток является быстрой, т.е. происходит в течение по существу от 1 мкс до 1 мс. Как правило, индуцированный чрезмерной деформацией стресс клетки может быть летальным для клетки, хотя в то же время недостаточный стресс не индуцирует разрывов в клетке. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам и системам, которые обеспечивают достаточный стресс для индукции временных разрывов, но не чрезмерный стресс, чтобы разрывы оказались постоянными и летальными для клетки.
Любые из описанных выше способов осуществляют in vitro, ex vivo или in vivo. Для применений in vivo устройство может быть имплантировано в просвет сосуда, например, встроенный стент. Эти и другие возможности изобретения, а также само изобретение, станут более понятными после обзора следующих чертежей, подробного описания и формулы изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1A представлена схематическая диаграмма микрожидкостной системы. Клетки подвергают воздействию доставляемого материала (груза) после пропускания через сужение.
На фиг. 1B представлена схематическая диаграмма микрожидкостной системы. Клетки подвергают воздействию доставляемого материала (груза) на протяжении всего процесса посредством суспендирования клеток в растворе, который включает доставляемый материал (груз) (например, клетки подвергают воздействию доставляемого материала до и после пропускания через сужение).
На фиг. 2A представлена схематическая диаграмма варианта осуществления микрожидкостной системы.
На фиг. 2B представлена иллюстрационная диаграмма микрожидкостной системы, на которой изображены глубина, ширина и длина.
На фиг. 3 представлена схематическая диаграмма микрожидкостной системы.
На фиг. 4 представлена схематическая диаграмма, на которой показаны разрывы клеточной стенки.
На фиг. 5 представлена фотография микрожидкостной системы.
На фиг. 6 представлена фотография микрожидкостной системы.
На фиг. 7 представлена фотография микрожидкостной системы.
На фиг. 8A-8B представлены графики, на которых показаны иллюстративные результаты, полученные для микрожидкостной системы.
На фиг. 9 представлен график, на котором показаны иллюстративные результаты, полученные для клеток, которые обрабатывали с использованием микрожидкостной системы.
На фиг. 10 представлен график, на котором показаны иллюстративные результаты, полученные для клеток, которые обрабатывали с использованием микрожидкостной системы.
На фиг. 11 представлен график, на котором показаны иллюстративные результаты, полученные для клеток, которые обрабатывали с использованием микрожидкостной системы.
На фиг. 12 представлена схематическая диаграмма микрожидкостной системы.
На фиг. 13 представлен график, на котором показаны иллюстративные результаты, полученные для клеток, которые обрабатывали с использованием микрожидкостной системы.
На фиг. 14 представлен график, на котором показаны иллюстративные результаты, полученные для клеток, которые обрабатывали с использованием микрожидкостной системы.
На фиг. 15 представлен график, на котором показаны иллюстративные результаты, полученные для клеток, которые обрабатывали с использованием микрожидкостной системы.
На фиг. 16A-16F представлены иллюстративные схематические диаграммы микрожидкостных систем.
На фиг. 17 представлена проточная диаграмма, относящаяся к способу с использованием микрожидкостной системы.
На фиг. 18A-18B представлены графики, на которых показаны иллюстративные результаты, полученные для клеток, которые обрабатывали с использованием микрожидкостной системы.
На фиг. 19 представлено наложение трансмиссионных и конфокальных флуоресцентных изображений, за которыми следуют конфокальные флуоресцентные изображения z-сечения обработанных клеток, доставляемых с помощью квантовых точек (QD) с использованием настоящего изобретения.
На фиг. 20A проиллюстрирована эффективность доставки в цитозоль клеток HeLa при обработке с помощью настоящего изобретения посредством QD, покрытых полиимидазольным лигандом (PIL). Жизнеспособность клеток составляла >80% при измерении посредством проточной цитометрии.
На фиг. 20B иллюстрируется жизнеспособность клеток HeLa при доставке простых QD535 с помощью настоящего изобретения, при измерении по окрашиванию йодидом пропидия и с помощью проточной ицитометрии.
На фиг. 21 иллюстрируется модель конструкции, поглощение и стабильность в различных средах.
На фиг. 22A иллюстрируются изображения конфокальной микроскопии живых клеток для обработанных и контрольных клеток.
На фиг. 22B иллюстрируется изменение интенсивности обработанных клеток в зависимости от времени в зеленых и красных каналах.
На фиг. 23 иллюстрируется измерение посредством проточной цитометрии средней флуоресценции и жизнеспособности клеток.
На фиг. 24 иллюстрируется эпифлуоресцентная визуализация неагрегированных единичных квантовых точек в цитозоле клеток после обработки с помощью устройства посредством 10 нМ раствора квантовых точек, и мерцающие следы трех квантовых точек с аутофлуоресценцией.
На фиг. 25 иллюстрируются результаты эксперимента, демонстрирующие, что эффективность доставки зависит от скорости клетки и конструкции сужения.
На фиг. 26 проиллюстрированы изображения различных горизонтальных плоскостей клеток HeLa после доставки конъюгированного с pacific blue 3 кДа декстрана, при измерении с помощью конфокальной микроскопии.
На фиг. 27 иллюстрируется упрощенная 2D-модель диффузии, которая имитирует пассивную диффузию материала в клетку через мембрану с порами.
На фиг. 28 иллюстрируются результаты двухуровневой доставки материала.
На фиг. 29 иллюстрируются данные, относящиеся к доставке миРНК, белка и наночастиц.
На фиг. 30 иллюстрируется применимость настоящего изобретения для различных типов клеток.
На фиг. 31 иллюстрируются данные доставки наноматериала и антитела.
На фиг. 32 иллюстрируются применения для доставки белка.
На фиг. 33 представлена таблица иллюстративных типов клеток, в которые был успешно доставлен груз.
На фиг. 34 представлена иллюстрация, на которой изображена система, в которой кровь пациента обрабатывают с помощью микрожидкостного устройства для доставки груза, такого как макромолекулы.
На фиг. 35 иллюстрируется эффективность доставки и жизнеспособность эмбриональных стволовых клеток человека, обработанных с помощью устройства 10 мкм-6 мкм для доставки груза.
На фиг. 36 представлено получение и охарактеризация линий iPSC мыши и человека посредством прямой доставки слитых перепрограммирующих белков с использованием настоящего изобретения.
На фиг. 37 представлены результаты перепрограммирования белков и представлена экспрессия маркера эмбриональных стволовых клеток человека Oct4, SSEA-4, Tra-60, Tra-80, щелочной фосфатазы (AP) в колониях iPSC.
На фиг. 38 представлены микрофотографии, иллюстрирующие устройство, модифицированное посредством встроенных электродов на любую сторону сужения посредством фотолитографического формирования рельефа и нанесения Au для внесения локализованного электрического поля в канал, тем самым комбинируя деформацию клеток с электропорацией.
На фиг. 39 представлен другой вариант осуществления микрожидкостной системы, где область вхождения имеет угол сужения 90 градусов.
На фиг. 40A и 40B представлены графики, на которых показано сравнение жизнеспособности и эффективности доставки между устройством в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления, представленным на фиг. 2A, и устройством в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления, представленным на фиг. 39.
На фиг. 41 представлена гистограмма экспрессии CD45 в активированных T-клетках при измерении с помощью антитела к CD45 с Alexa 488. Клетки, которые обрабатывали с помощью устройства в присутствии РНК для подавления CD45, проявляют более низкий пик интенсивности флуоресценции, тем самым указывая на нокдаун экспрессии гена CD45.
На фиг. 42 представлена иллюстрация, на которой показано несколько иллюстративных областей применения, таких как регенеративная медицина; иммунология; визуализация и сенсорное обнаружение; и вакцины против злокачественной опухоли и исследование злокачественной опухоли.
На фиг. 43A и 43B представлены гистограммы интенсивности проточной цитометрии контрольной популяции, которую подвергли воздействию конъюгированного с cascade blue декстрана массой 3 кДа, и популяции клеток, которую обрабатывали в устройстве 30 мкм-6 мкм, а затем подвергали воздействию декстрана массой 3 кДа.
На фиг. 44 представлена столбиковая диаграмма, иллюстрирующая нокдаун GFP в эмбриональных стволовых клетках человека после обработки с использованием микрожидкостного устройства и сходных способов.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Варианты осуществления изобретения относятся к способам осуществления контролируемой деформации клетки в течение заданного количества времени для обеспечения разрывов в клеточной мембране, так чтобы материалы можно было доставлять внутрь клетки. Деформацию можно обеспечивать, например, посредством давления, индуцированного механической нагрузкой и сдвиговыми усилиями. В одном примере микрожидкостная система включает структуру, которая контролирует и/или манипулирует жидкостями посредством геометрического ограничения жидкостей в мелком масштабе (например, субмиллилитровые объемы, такие как микролитры, нанолитры и пиколитры). Микрожидкостная система способна к внутриклеточной доставке практически любого груза в клетку. Система состоит из одного или нескольких микрожидкостных каналов с сужением, через которые проходит клетка. Предпочтительно клетки проходят через микрожидкостный канал, будучи суспендированными в жидкой среде, которая пропускается через систему под давлением. Когда клетка проходит через сужение, ее мембрана нарушается, вызывая временные разрывы мембраны и обеспечивая захват груза, который присутствует в окружающей среде. Размер сужения зависит от размера клетки-мишени, однако предпочтительно он имеет тот же порядок или меньше, чем диаметр клетки. Множество сужений можно располагать параллельно и/или последовательно. Разрыв в клетке представляет собой отверстие в клетке, которое позволяет материалу извне клетки пройти в клетку (например, выемка, трещина, полость, отверстие, пора, щель, брешь, перфорация). Разрывы (например, поры или выемки), создаваемые способами, описанными в настоящем описании, не образуются в результате сборки субъединиц белков с образованием мультимерной структуры поры, такой как пора, создаваемая комплементом или бактериальными гемолизинами. Другие варианты осуществления находятся в пределах объема описанного изобретения.
Ссылаясь на фиг. 1-3, микрожидкостная система 5 включает канал 10, определяющий просвет трубки. Микрожидкостный канал 10 включает сужение 15, которое предпочтительно организовано так, что только одна клетка-мишень 20 может пройти через сужение 15 за один раз. Предпочтительно клетки 20 проходят через канал 10, будучи суспендированными в буферном растворе 25, который также включает доставляемые материалы 30, хотя доставляемые материалы можно доставлять в буферный раствор 25 после того, как клетки 20 пройдут через сужение 15. По мере того, как клетка 20 приближается и проходит через сужение 15, в сужении 15 применяется давление (например, механическое сдавление) на клетку 20, сдавливающее клетку 20 (например, показанную как клетка 201). Давление, примененное к клетке посредством сужения 15, вызывает разрывы (например, выемки, представленные на фиг. 4) в клеточной мембране (например, клетка 202). После прохождения клетки через сужение 15, клетка 20 начинает захватывать материал в буферном растворе 25 через выемки, включая доставляемый материал 30 (например, клетка 203). Клеточная мембрана восстанавливается стечением времени, и по меньшей мере часть доставляемого материала 30 предпочтительно остается захваченным в клетку.
Конфигурацию сужения 15 можно выполнять так, чтобы контролировать сужение клетки 20, тем самым контролируя давление, применяемое к клетке 20. Предпочтительно сужение 15 включает область 35 входа, центральную точку 40 и область 45 выхода. Например, диаметр(ы) сужения 15 можно варьировать для коррекции давления, применяемого к клетке (и как быстро это давление применяется/устраняется), и длину сужения 15 можно варьировать для коррекции количества времени, в течение которого давление применяют к клетке. В определенных конфигурациях физическое сужение клетки не требуется, вместо этого кратковременное воздействие на клетку необычно высокого уровня сдвига и/или уровня сдавления может вызывать желаемые разрывы. Как правило, отсутствует требование, касающееся внешнего диаметра микрожидкостной системы, и соотношение внутреннего диаметра и внешнего диаметра можно варьировать (например, более 5).
Диаметр центральной точки 40 может зависеть от диаметра клетки 20. Предпочтительно центральная точка 40 имеет тот же порядок или меньше, чем диаметр клетки 20 (например, 20-99% от диаметра клетки). Предпочтительно диаметр центральной точки 40 составляет от 60% до 70% от диаметра клетки, хотя оптимальный диаметр центральной точки может варьировать, в зависимости от применения и/или типа клетки. Иллюстративные диаметры центральной точки 40, которые использовали в предшествующих экспериментах, составляет 5-6 мкм и 7-8 мкм. Центральная точка 40 также может превышать диаметр клетки 20, но организована так, чтобы обеспечить импульс давления (например, сдвиг), который применяется к клетке 20. Такое давление можно применять к клетке 20 без прикосновения ее к стенкам канала 10. Сдвиг можно измерять известными способами (например, Journal of Applied Physics 27, 1097 (1956); Murphey et al.).
Угол сужения (например, на фиг. 2A) области 35 входа может варьировать (например, то, как быстро уменьшается диаметр). Угол сужения предпочтительно представляет собой угол, который минимизирует закупорку системы 5 во время прохождения через нее клеток. Угол области 45 выхода также может варьировать. Например, угол области 45 выхода организован так, чтобы снижать вероятность турбулентности/завихрений, которые могут привести к неламинарному потоку (например, диапазон 1-80 градусов). Стенки области 35 входа и/или области 45 выхода предпочтительно являются линейными, хотя возможны другие конфигурации (например, стенки могут быть искривленными).
Поперечное сечение канала 10, области 35 входа, центральной точки 40 и области 45 выхода могут варьировать. Например, различные поперечные сечения могут быть круговыми, эллиптическими, удлиненными щелевыми, квадратными, шестиугольными, треугольным и т.д. Длина центральной точки 40 также может варьировать, и ее можно корректировать так, чтобы варьировать количество времени, когда давление применяют к клетке 20, по мере того, как она походит через сужение 15. При данной скорости потока более длинное сужение 15 (например, более длинная центральная точка 40) будет обеспечивать давление на клетку 20 в течение более длительного периода времени. Глубина канала 10, область 35 входа, центральная точка 40 и область 45 выхода могут варьировать. Например, глубину можно корректировать, чтобы обеспечить большее сужение и тем самым усилить доставку аналогично изменениям ширины сужения. Ширина и длина варьируют среди конструкций устройств и она может быть установлена в процессе изготовления устройства, например, с помощью хромированного фотошаблона, используемого на стадии литографии (когда устройство основано на кремнии). Глубина может быть единообразной на протяжении канала и ее можно устанавливать в процессе изготовления устройства, например, посредством стадии глубокого реактивного ионного травления. Глубина может составлять, например, 15 мкм-20 мкм. Как используют в рамках изобретения, размеры устройства указывают с помощью серии цифр, указывающих длину, ширину и количество сужений (например, 30 мкм-6 мкм-x5 обозначает устройство с длиной 30 мкм, шириной 6 мкм и 5 сужениями).
Скорость, при которой клетки 20 проходят через канал 10, также можно варьировать для контроля доставки доставляемого материала 30 в клетки 20. Например, корректирование скорости клеток 20 через канал 10 может изменять количество времени, в течение которого давление применяют к клеткам, и может изменять быстроту применения давления к клетке (например, медленно или импульсом). Клетки 20 проходят через систему 5 со скоростью по меньшей мере 0,1 мм/с, такой как от 0,1 мм/с до 5 м/с, и предпочтительно от 10 мм/с до 500 мм/с, хотя возможны другие скорости. В некоторых вариантах осуществления клетки 20 могут проходить через систему 5 при скорости, превышающей 5 м/c.
Канал 10 может быть изготовлен из различных материалов, таких как кремний, стекло, керамика, кристаллические субстраты, аморфные субстраты и полимеры (например, поли-метилметакрилат (PMMA), PDMS, сополимер циклических олефинов (COC) и т.д.). Предпочтительно изготовление предпочтительно проводят в чистом помещении и в нем могут использоваться, например, сухая гравировка, влажная гравировка, фотолитография, инжекционное формование, лазерное выжигание, шаблоны SU-8 и т.д. Один иллюстративный канал 10 имеет длину приблизительно 40-50 мкм с диаметром в области без сужения приблизительно 50 мкм и диаметром сужения приблизительно 4-8 мкм. Предпочтительно длину канала 10 оставляют настолько короткой, чтобы избегать закупоривания. Возможны другие размеры.
На фиг. 39 представлен другой вариант осуществления микрожидкостной системы. В этом варианте осуществления канал 10 включает предварительную область 50 входа, которая не сужает клетку 20. Расширенная область 55 канала обеспечивает, чтобы область 35 входа имела угол сужения 90 градусов (например, альфа на фиг. 2A).
На фиг. 40A и 40B представлены два графика, на которых показано сравнение жизнеспособности и эффективности доставки между двумя иллюстративными вариантами осуществления. Обозначение 4000 указывает на изменения, проведенные при использовании варианта осуществления в соответствии с фиг. 2A, в то время как 4010 обозначает измерения, проведенные при использовании варианта осуществления в соответствии с фиг. 39. Показано, что для той же скорости клетки и действующего давления, вариант осуществления на фиг. 39 обеспечивает высокую эффективность доставки и жизнеспособность. Это происходит несмотря на наличие сходных скоростей сдвига, скоростей клеток и времени, затраченного при сдавлении, с вариантом осуществления на фиг. 2A.
Несколько параметров могут влиять на доставку доставляемого материала 30 в клетку 20. Например, размеры сужения 15, действующие скорости потока (например, время прохождение клетки до сужения 15), концентрация доставляемого материала 30 в буферном растворе 25, и количество времени, в течение которого клетка 20 восстанавливается/инкубируется в буферном растворе 25 после сужения, могут влиять на поглощение доставляемого материала 30 клеткой 20. Дополнительные параметры, влияющие на доставку материала 30 в клетку 20, могут включать скорость клетки 20 в сужении 15, скорость сдвига в сужении 20, компонент скорости, который перпендикулярен скорости потока, степень сдавления клетки и время в сужении. Такие параметры можно рассчитывать для контроля доставки доставляемого материала 30. Композиция буферного раствора 25 (например, концентрация соли, содержание сыворотки и т.д.) также могут влиять на доставку доставляемого материала 30. По мере того, как клетка 20 проходит через сужение 15, деформация/стресс, индуцируемые сужением 15, временно вызывают повреждение клетки, которое вызывает пассивную диффузию материала через разрыв. В некоторых вариантах осуществления, клетка 20 деформируется только в течение короткого периода времени, порядка 100 мкс, для минимизации вероятности активации апоптотических каскадов через механизмы передачи сигнала в клетке, хотя возможна другая длительность (например, в диапазоне от наносекунд до часов). Первоначальные наблюдения показали, что поглощение доставляемого материала 30 клеткой 20 происходит в течение времени порядка минут после того, как клетка 20 проходит через сужение 15.
Клетки 20 могут направляться через канал 10 различными способами. Например, можно применять давление с помощью насоса на стороне входа (например, газовый баллон или компрессор), вакуум можно применять с помощью вакуумного насоса на стороне выхода, можно применять капиллярное действие через трубку и/или система 5 может представлять собой систему с подачей самотеком. Также можно использовать проточные системы на основе вытеснения (например, шприцевой насос, перистальтический насос, ручной шприц или пипетка, поршни и т.д.). Иллюстративные скорости потока через один канал 10 составляют порядка 1 мкл за несколько секунд. Кроме того, буферный раствор 25 может включать одно или несколько смазывающих веществ (pluronic или другие поверхностно-активные вещества), которые могут быть предназначены для снижения или устранения закупорки канала 10 и повышения жизнеспособности.
Систему 5 можно контролировать так, чтобы доставка количеств доставляемого материала 30 была стабильной среди популяции клеток. Например, система 5 может включать использование конвекционного механизма доставки после сужения, который направляет доставляемый материал 30 к проницаемой мембране клетки 20. Посредством контроля скорости потока во вторичном потоке, предпочтительно можно контролировать качество доставляемого материала 30, предоставленного клетке. Кроме того, контроль концентрации доставляемого материала 30 в буферном растворе 25 в процессе восстановления мембраны также может увеличить стабильность доставки доставляемого материала 30 к популяции клеток. Предпочтительно система 5 действует в качестве исключительно механической системы без применения каких-либо электрических полей и/или химических агентов, хотя возможны другие конфигурации (например, электрические и/или оптические сенсоры можно использовать для измерения свойств клеток, таких как флуоресценция). Кроме того, система 5 предпочтительно действует независимо от типа доставляемого материала. Например, белки, РНК и ДНК можно доставлять через одну и ту же систему без каких-либо дополнительных модификаций.
В некоторых конфигурациях в случае определенных типов клеток 20, клетки 20 можно инкубировать в одном или нескольких растворах, которые облегчают поглощение доставляемого материала внутрь клетки. Например, клетки 20 можно инкубировать в растворе для деполимеризации, таком как Lantrunculin A (мкг/мл), в течение 1 часа перед доставкой для деполимеризации актинового цитоскелета. В качестве дополнительного примера клетки можно инкубировать в 10 мкМ колхицине (Sigma) в течение 2 часов перед доставкой для деполимеризации сети микротрубочек. Эти способы могут помочь обеспечить экспрессию гена при доставке ДНК.
Ссылаясь на фиг. 5, показана фотография параллельной конфигурации системы 5. Система 5 может включать любое количество параллельных каналов. Предпочтительно по мере добавления дополнительных параллельных каналов к системе 5, может быть увеличена общая пропускная способность системы 5. На фиг. 6 показана фотография параллельной конфигурации системы 5, которая включает фильтры на входе каждого из каналов 10. Кроме того, на фиг. 6 также показана конфигурация сужения 15, которая включает область 35 входа, которая включает множество ступеней. Ссылаясь на фиг. 7, показана дополнительная фотография прототипа системы 5. Как очевидно из фиг. 7, прототип, включая инкубационную лунку, имеет размеры приблизительно 1 дюйм × ¼ дюйма × ¼ дюйма (2,5 см×0,6 см×0,6 см). Другие конфигурации системы 5 также могут включать сортеры, модули для предварительной обработки/пост-обработки, и/или сенсорные модули (например, оптические, электрические и магнитные).
Как более подробно описано ниже в отношении примеров, микрожидкостная система и сходные способы имеют широкий диапазон применений. На фиг. 42 представлена иллюстрация, на которой изображено несколько иллюстративных областей применения. Например, настоящее изобретение можно использовать для регенеративной медицины, например, для обеспечения перепрограммирования клеток и дифференцировки стволовых клеток. Настоящее изобретение можно использовать для иммунологии, например, для представления антигена и усиления/подавления иммунной активности через доставку в дендритные клетки, моноциты, T-клетки, B-клетки и другие лимфоциты. Кроме того, увеличенная доставка квантовых точек, углеродных нанотрубок и антител может быть пригодной для визуализации и сенсорного обнаружения. Кроме того, настоящее изобретение имеет применение в вакцинах против злокачественной опухоли и в исследованиях, таких как выделение циркулирующих опухолевых клеток (CTC) и лечение лимфомы. Способ также обеспечивает надежную платформу для скрининга активной миРНК и низкомолекулярных соединений, способных лечить заболевание, или манипулирования поведением клеток.
Эта идея была успешно продемонстрирована в прототипе, где клетки 20 индуцировали для захвата иным образом не проникающего через мембрану красителя (например, флуоресцентные красители с молекулярной массой от 3 кДа до 2 МДа), ДНК, белка, РНК, нанотрубок или наночастиц, присутствующих в буферном растворе 25. Было показано, что клетки 20 восстанавливаются и пролиферируют после процесса, удерживая доставленный материал в течение более чем 72 часов. С помощью этой системы было исследовано одиннадцать различных типов клеток, включая типы клеток, приведенные на фиг. 33, таким образом, демонстрируя, что система обеспечивает надежную эффективность для различных типов клеток. На фиг. 33 представлена таблица, включающая типы клеток, для которых успешно было применено настоящее изобретение. Средняя пропускная способность для клеток была измерена на уровне порядка 5000-20000 клеток/секунда, средняя эффективность доставки была измерена на уровне 96%, и жизнеспособность клеток была измерена на уровне 95% с использованием одного канала 10. Все испытания проводили при комнатной температуре. Однако в некоторых способах температура может варьировать. Например, способы можно осуществлять при комнатной температуре (например, 20°C), физиологической температуре (например, 39°C), превышающей физиологическую температуру, или сниженной температуре (например, 4°C), или температурах между этими иллюстративными температурами. Выполнение способов при сниженной температуре (т.е. по существу около 4°C, которую можно обеспечивать, например, с использованием охлаждения, ледяной бани или других известных способов), обеспечило неожиданное повышение эффективности доставки и жизнеспособности клеток. Таким образом, температуру можно корректировать для влияния на доставку композиции и жизнеспособность клеток.
Как показано на фиг. 8A-8B, увеличение скорости клетки через сужение 15 может увеличить процент доставки и эффективность доставки доставляемого материала 30. Было обнаружено, что эффективность доставки изменяется линейно в зависимости от скорости клеток, и что существовал зависимый от дозы ответ.
Как показано на фиг. 9, время инкубации клетки в буферном растворе 25 после того, как клетка проходит сужение 15, может оказывать эффект на общий процент доставки доставляемого материала 30 к клетке 20. Однако было отмечено, что после определенного времени инкубации (приблизительно 2-3 минуты), процент доставки по существу не изменялся. Исходя из этих данных, полагают, что разрывы, возникающие в клетке 20 после того, как она проходит через сужение 15, корректируются в пределах порядка пяти минут после прохождения клетки 20 сужения 15. Кроме того, и для сравнения, -1 минута соответствует контрольной группе.
Как показано на фиг. 10, было выявлено, что прохождение клеток 20 через сужение 15 несколько раз может иметь эффект на общий процент доставки, но что оно отрицательно влияет на жизнеспособность клеток 20. Для получения этих данных клетки пропускали через сужение 15, собирали и вновь пропускали через устройство приблизительно в пределах 1 минуты.
Было выявлено, что в то время, когда клетки 20 имеют разрывы (например, после прохождения через сужение 15), материал из клетки может выходить через разрывы. Таким образом, было выявлено, что когда клетки 20 имеют разрывы, материал может входить и выходить из клетки 20. Это свойство означает, что систему 5 можно использовать в качестве способа взятия образца внутриклеточного материала без лизиса клетки. Разрывы в клеточной мембране предпочтительно приводят к утечке макромолекул из цитоплазмы и, таким образом, это можно использовать для исследования состава цитоплазмы.
Как показано на фиг. 11, стабильные клетки HeLa, экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок (GFP), обрабатывали в присутствии подавляющей GFP миРНК (Ambion, США) и анализировали посредством FACS (FACS Canto II, BD Biosciences, США) через 48 часов в отношении нокдауна флуоресценции. Результаты на фиг. 11 указывают на >40% нокдаун экспрессии гена - результат, сравнимый с результатом коммерческих реагентов, таких как Lipofectamine 2000 (Invitrogen, U.S.A). Рандомизированные контрольные миРНК, также представленные на фиг. 11, указывают на то, что этот нокдаун не вызван самим процессом деформации.
Как показано на фиг. 13-14 размеры сужения могут оказывать эффект на общую эффективностью доставки доставляемого материала 30. Например, на фиг. 13-14 показано, что по мере варьирования рабочего давления (например, посредством варьирования длины и/или ширины сужения 15) общая эффективность доставки в некоторой степени варьирует (фиг. 14 относится к доставке квантовых точек (наночастиц) в различных условиях). Более того, как показано на фиг. 18A-18B, оцененные скорости клеток могут иметь эффект на общую жизнеспособность и эффективность доставки доставляемого материала 30. Например, на фиг. 18A показано, что по мере варьирования рабочей скорости, общая эффективность доставки в некоторой степени варьирует. Кроме того, на фиг. 18B показано, что по мере варьирования рабочей скорости, жизнеспособность клеток может в некоторой степени варьировать. На этих фигурах показано, что изменение длины сужения может усилить доставку при минимальном влиянии на жизнеспособность. Кроме того, более крупные молекулы входят в клетку при более низкой скорости после сужения, чем более мелкие молекулы. Этот способ внутриклеточной доставки, описанный в настоящем описании, является "универсальным", поскольку он работает для многих различных типов материалов и клеток. Кроме того, нарушения мембраны, индуцируемые с помощью этого устройства, обычно могут иметь размеры по меньшей мере ~100 нм, хотя возможны нарушения других размеров.
Ссылаясь на фиг. 12, в одном варианте осуществления градиент концентрации между буферным раствором 25 и цитозолем можно контролировать, чтобы прогнозируемым образом контролировать количество доставляемого материала. Можно использовать способы локализованной доставки, которые осуществляют воздействие на клетки 20 концентрированной взвеси макромолекул после внесения пор в клетки 20 посредством сужения. Однако любой такой способ локализованной доставки должен учитывать оцененное время закрытия разрыва для обеспечения надлежащего функционирования. Это можно осуществлять посредством включения "микронасадки", перпендикулярной каналу, которая доставляет высокую концентрацию груза близко к клеточной мембране (проиллюстрировано на фиг. 6A). Предпочтительно микронасадка может быть расположена в сужении 15 и/или вблизи него. Такой подход может позволить дополнение механизма диффузионной доставки конвекционным механизмом, таким образом, обеспечивая более точную нагрузку клеток более высокими концентрациями. Предпочтительно инжекция происходит, когда клетка 20 находится в области высокой концентрации в сужении 15. Локализованный способ имеет дополнительное преимущество, состоящее в сохранении ценных доставляемых материалов, поскольку в этом случае нет необходимости в поддержании высоких концентраций в буфере.
Ссылаясь на фиг. 16A, для применения давления к клеткам 20, так чтобы обеспечивался разрыв, можно использовать серию микростолбиков 100. В этом варианте осуществления клетки 20 проталкивают через набор сужающих столбиков так, чтобы к клеткам 20 применялось давление.
Ссылаясь на фиг. 16B, сдавливающие пластины 105 можно использовать для применения давления к клеткам 20 так, чтобы возникали разрывы. В этом варианте осуществления сдавливающие пластины 105 можно контролировать так, чтобы давление применялось к клеткам 20 в течение заданного количества времени. Сдавливающие пластины 105 могут быть организованы так, чтобы одна или обе пластины двигались, применяя давление к клеткам 20. Также могут быть предоставлены дополнительные наборы сдавливающих пластин 105, так чтобы клетки 20 были по существу окружены.
Ссылаясь на фиг. 16C, можно использовать добавки 115 в буфер (или наполнители, связывающиеся с поверхностью клеток) для имитации сдавления по мере того, как клетка 20 проходит через сужение 15, диаметр которого превышает диаметр клетки 20. Например, возможно имитируемое сужение вследствие препятствия посредством добавок 115 в буфер. Примеры добавок 115 в буфер включают микро или наночастицы (например, на основе полимеров, на основе липидов, на основе керамики, металлические и т.д.). Эти частицы метят связывающим клетку лигандом, таким как антитело, последовательность ДНК, пептид или низкомолекулярное соединение, хотя это не требуется.
Ссылаясь на фиг. 16D, для сдавления клетки 20 можно использовать гранулы 120. Например, для применения давления к клетке 20 можно использовать магнитные и/или электростатические силы, или, в случае фиг. 16E, для продвижения клетки 20. Предпочтительно сила, применяемая к клетке 20, является достаточной для обеспечения разрыва.
Ссылаясь на фиг. 16F, множество потоков 125 жидкости может быть направлено таким образом, чтобы обеспечить сдавление (или быстрый временный сдвиг) клетки 20. Например, множество потоков 125 жидкости может быть запущено таким образом, чтобы они приближались или сталкивались друг с другом. По мере того, как клетки 20 проходят через множество потоков 125 жидкости, можно применять силу к клеткам 20 так, чтобы возникал разрыв мембраны клетки 20. Альтернативно клетки можно запускать через узкую щелеобразную насадку для облегчения доставки.
Система 5 может представлять собой независимую систему, такую как система, представленная на фиг. 7, хотя возможны другие конфигурации. Например, система 5 может быть имплантирована in vivo пациенту для локальной внутриклеточной доставки, и/или она может быть включена ex vivo в устройство для обработки клеток перед возвращением клеток пациенту.
В дополнение к ее преимуществам доставки, описанным в настоящем описании, микрожидкостной характер системы обеспечивает осуществление точного контроля условий доставки, предварительной обработки и последующей охарактеризации клеток. Например, система может быть выполнена последовательно с модулем для активированной флуоресценцией сортировки клеток (FACS). Это может обеспечить доставку и сортировку желаемых клеток в одной и той же системе в реальном времени. Также можно использовать различные способы анализа до обработки и после сортировки, таким образом, позволяя разработку непрерывных высокопроизводительных анализов для скрининга лекарственных средств и диагностики.
Эффективность доставки груза, доставляемого в клетки-мишени, определяют, подвергая контрольную популяцию клеток-мишеней воздействию груза, также как и популяцию, подвергнутую обработке с помощью микрожидкостного устройства. Контрольный образец подвергают воздействию того же раствора для доставки при той же концентрации в течение по меньшей мере того же количества времени, что и клетки, обработанные с помощью устройства. Для компенсации поверхностного связывания, эндоцитоза и других эффектов, таких как аутофлуоресценция, область доставки определяют так, чтобы только наилучшие 1-5% живых контрольных клеток попали в эту область. Эффективность доставки образца, таким образом, соответствует проценту живых клеток, которые находятся в области доставки. Например, на фиг. 43A представлена гистограмма интенсивности при проточной цитометрии контрольной популяции, которую подвергли воздействию конъюгированного с cascade blue декстрана массой 3 кДа. На фиг. 43B представлена гистограмма интенсивности при проточной цитометрии клеток, подвергнутых воздействию устройства 30 мкм-6 мкм. Определенная область доставки представляет собой незакрашенную область как на фиг. 43A, так и на фиг. 43B.
В процессе работы, ссылаясь на фиг. 17, и далее ссылаясь на фиг. 1-3, способ 1000 проведения внутриклеточной доставки с помощью системы 5 включает представленные стадии. Однако способ 1000 является только иллюстративным и не ограничивающим. Способ 1000 можно изменять, например, добавлением, удалением, изменением или перестановкой стадий.
На стадии 1005 клетки 20 суспендируют в буферном растворе 25 вместе с доставляемыми материалами 30. Типичные концентрации клеток могут находиться в диапазоне от 104 до 109 клеток/мл. Концентрации доставляемого материала могут находиться в диапазоне от 10 мг/мл до 0,1 мкг/мл. Доставляемый материал можно добавлять в клеточный буфер до или сразу после доставки в зависимости от ситуации, учитывая, что повреждения/поры остаются открытыми в течение 1-5 минут. Буферные растворы могут состоять из ряда солей, сахаров, факторов роста, происходящих из животных продуктов или любого другого компонента, необходимого для надлежащей пролиферации клеток, поддержания здоровья клеток или индукции каскадов передачи сигнала. Также в буферный раствор 25 можно добавлять дополнительные материалы. Например, в буферный раствор 25 можно добавлять поверхностно-активные вещества (например, pluronic) и/или наполнители.
На стадии 1010 буферный раствор 25, включающий клетки 20 и доставляемые материалы 30, пропускают через канал 10 системы 5. Буферный раствор 25 можно пропускать через канал 10 с использованием гравитации или это можно осуществлять другими способами. Например, можно применять давление к буферному раствору 25 на стороне входа в канал 10 (например, с использованием газового баллона и/или компрессора), и/или вакуум можно применять с помощью вакуумного насоса на стороне выхода. Кроме того, также можно использовать проточные системы на основе вытеснения.
По мере прохождения индивидуальных клеток 20 через сужение 15, к клетке 20 кратковременно применяется давление вследствие твердой конструкции сужения 15, вызывающее развитие разрывов, таких как выемки, в клеточной мембране, так чтобы доставляемые материалы 30 можно было доставлять внутрь клетки 20. Количество и/или длительность применяемого к клетке 20 давления можно варьировать, корректируя размеры сужения 15, скорость, при которой клетка 20 проходит через сужение 15, и/или корректируя форму сужения 15. В одной конфигурации приблизительно 5000-20000 клеток/секунда проходят через сужение 15, и каждая клетка сдавливается в течение приблизительно 100 мкс.
Система 5 может включать один или несколько каналов 10. Например, система 5 может включать 50-100 каналов 10, которые расположены в параллельной конфигурации. Использование параллельной конфигурации может уменьшить последствия закупорки в одном или нескольких каналах 10, и может увеличивать общую пропускную способность системы 5. Кроме того, система 5 может включать один или несколько каналов последовательно друг за другом.
На стадии 1015 после прохождения клетками 20 сужения 15, клеткам позволяют инкубироваться/восстановиться посредством нахождения в буферном растворе 25. За это время клетки 20 захватят некоторые из доставляемых материалов 30, присутствующие в буферном растворе 25, через разрывы в клеточной мембране. Один из механизмов захвата основан на диффузии, поскольку более крупные молекулы, по-видимому, поглощаются более медленно, чем более мелкие молекулы. Предпочтительно клеткам 20 позволяют инкубироваться/восстановиться в буферном растворе 25 в течение порядка 2-5 минут, хотя возможна другая длительность. За то время, когда клетки 20 инкубируются/восстанавливаются в буферном растворе 25, материал из клеток 20 также может выходить из клетки в буферный раствор 25. В ходе периода инкубации/восстановления, определенные условия можно контролировать для обеспечения того, чтобы доставляемые количества доставляемых материалов 30 являлись стабильными в клеточной популяции. Например, после сужения можно использовать конвекционные механизмы, которые направляют доставляемый материал к инкубирующейся/восстанавливающейся клетке.
Необязательно, на стадии 1020, после инкубации/восстановления клеток, клетки можно промывать для удаления буферного раствора. Предпочтительно промывание происходит после периода времени, требуемого для устранения разрывов, хотя промывание можно проводить в другое время для контроля количества доставляемых материалов 30, поглощенных клетками.
Пример 1 - Доставка функциональных сконструированных наночастиц
Сконструированные наноматериалы имеют огромный потенциал в качестве инструментов для визуализации живых клеток, средств для доставки терапевтических молекул или даже в качестве способов манипуляции живыми клетками с помощью внешних средств, таких как световые или магнитные поля. (Howarth, M., et al. Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells. Nature Methods 5, 397-399 (2008)). Однако большинство из этих потенциальных применений требуют, чтобы наноматериалы доставлялись в цитозоль клеток. Большинство наночастиц, таких как QD необходимо пассивировать с помощью полимера, который обеспечивает растворимость наночастиц в водной среде и который в основном препятствует их пассивной диффузии через клеточную мембрану.
Микроинъекция наночастиц считается непрактичной вследствие необходимости в специализированном оборудовании и низкой пропускной способности, в то время как электропорация вызывает агрегацию QD внутри клетки. Таким образом, большинство попыток доставить QD в цитоплазу клетки основано на эндоцитозе QD клеткой и просачивании из эндосом. До настоящего изобретения было невозможно доставить QD в цитоплазму клеток удовлетворительным и масштабируемым образом. Настоящая система обеспечивает решение этой проблемы доставки предшествующих подходов.
Микрожидкостное устройство комбинируют с новым поколением недавно описанных биологически совместимых QD. (Liu, W., et al. Compact biocompatible quantum dots via RAFT-mediated synthesis of imidasol-based random copolymer ligand. JACS 132, 472-483 (2010)). QD, используемые на протяжении примера 1, покрывали полиимидазольным лигандом, состоящим из множества хелатирующих металл имидазольных групп и множества солюбилизирующих в воде пассивирующих молекул поли(этилен)гликоля (PEG).
Для доставки QD в цитозоль клетки разделяли на аликвоты в раствор PBS, содержащий QD. Раствор с клетками-QD переносили пипеткой в микрожидкостное устройство и раствор пропускали через каналы при постоянном давлении с последующим временем инкубации 5 мин. После этого периода инкубации избыток QD отделяли центрифугированием. Для контрольной популяции раствор с клетками-QD помещали в микрожидкостное устройство и клетки подвергали воздействию раствора QD в течение количества времени, эквивалентного протоколу доставки в цитозоль.
На фиг. 19 представлено наложение трансмиссионных и конфокальных флуоресцентных изображений, за которыми следуют конфокальные флуоресцентные изображения z-сечения обработанных клеток, в которые доставляли QD с использованием настоящего изобретения. На фиг. 19 иллюстрируются (сверху) изображения сразу после обработки (т.е. доставки) и (снизу) после инкубации в течение 48 ч при 37°C и 5% CO2. Профиль диффузного окрашивания ограничен цитоплазмой, и наночастицы, по-видимому, не проникают в ядро (темная область в клетке). Масштабная метка соответствует 10 мкм. Конкретный свободный полиимидазольный лиганд, который покрывал QD, визуализированные на фиг. 19, не обладал функциональностью, отличной от обеспечения биосовместимости через группы PEG. Изображения конфокальной микроскопии показывают, что клетки HeLa, открепленные и округлые после прохождения через микрожидкостное устройство, имеют диффузное цитоплазматическое окрашивание QD в различных z-сечениях клетки (фиг. 19, сверху). Диффузное окрашивание сохраняется даже через 48 часов после инкубации и прикрепления клеток при 37°C в 5% CO2 (фиг. 19, низ). Диффузная флуоресценция QD снижается через 48 ч, вероятно, вследствие деления клеток (фиг. 19). Устройство доставляло QD (гидродинамический диаметр ~13 нм) в ~40% популяции живых клеток при скорости прохождения ~10000 клеток/c. На фиг. 20A иллюстрируется эффективность доставки в цитозоль клеток HeLa при обработке с использованием настоящего изобретения посредством QD, покрытых PIL. Жизнеспособность клеток составляла >80% при измерении посредством проточной цитометрии. На фиг. 20B иллюстрируется жизнеспособность клеток HeLa при доставке простых QD535 с использованием настоящего изобретения, при измерении по окрашиванию йодидом пропидия и измерении с помощью проточной цитометрии. Жизнеспособность обработанных клеток при измерении с помощью проточной цитометрии, диффузное окрашивание на конфокальных изображениях и способность клеток к прикреплению согласуются с доставкой QD в цитоплазму живой клетки.
Для подтверждения того, что флуоресценция действительно является следствием QD, доставляемых в цитозоль, в противоположность QD, изолируемым в эндосомах, наночастицу конструировали так, чтобы она изменяла ее профиль испускания при взаимодействии с восстанавливающей средой цитозоля. Потенциал к восстановлению внутри клеточной цитоплазмы составляет от ~260 до ~220 мВ и в основном определяется поддержанием высоких концентраций (5-10 мМ) трипептида глутатиона.
Таким образом, посредством измерения флуоресценции конструкции QD-краситель, испускание которой изменяется под воздействием цитозольной среды, можно определить локализацию и химическую доступность доставляемых наночастиц. Конструировали QD-краситель, состоящий из QD зеленого свечения (λ-испускание = 541 нм), которые действуют в качестве донора энергии для красителя карбокси-X-родамина (Rox) (λ-испускание = 610 нм), конъюгированного через поддающуюся восстановлению дисульфидную связь.
На фиг. 21 иллюстрируется модель конструкции, поглощение и стабильность в различных средах. На 2100 представлено схематическое изображение PIL перед конъюгацией с красителем и нанесением на QD (слева) и полученной конструкции QD-дисульфид-Rox (справа) (изображение не в масштабе). На 2110 представлен спектр поглощения конструкции красителя QD-дисульфид. Возбуждение при 488 нм и при 405 нм обеспечило исключительное поглощение для QD на протяжении эксперимента. На 2120 представлена стабильность переноса энергии флуоресценции с QD на Rox для этой конструкции в полной культуральной среде при 37°C и 5% CO2, что демонстрирует, что дисульфидная связь не расщепляется во внеклеточной среде. На графике 2130 проиллюстрировано расщепление дисульфидной связи цитозольным восстановителем глутатионом, как показано по восстановлению флуоресценции QD. На 2140 представлено восстановление флуоресценции QD при обработке нетиольным восстановителем трис(2-карбоксиэтил)фосфином, далее подтверждая расщепление дисульфидной связи.
Тиольные группы, которые включали в PIL, образовывали дисульфидные связи с тиолированными красителями Rox. Спектр поглощения очищенной конструкции имеет признаки поглощения как QD, так и Rox (2120) при среднем уровне 13 молекул красителя Rox на QD, что эффективно осуществляло гашение флуоресценции QD (2130). Эта конструкция служит в качестве необратимого сенсора специфической восстанавливающей среды в цитозоле. Когда QD селективно возбуждают лазером при 488 нм (микроскопия) или 405 нм (проточная цитометрия) в то время как дисульфидные мостики остаются неизмененными, конструкция претерпевает резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET), так что испускание Rox в красной области преобладает. В анализе в растворе клеточный восстановитель глутатион расщепляет дисульфидные мостики, высвобождая краситель Rox и позволяя флуоресценции QD восстановиться (2140). Восстановитель не на основе тиола трис-(2-карбоксиэтил)фосфин также обеспечивает восстановление флуоресценции QD, указывая на то, что высвобождение Rox с поверхности QD происходит не посредством вытеснения PIL глутатионом (2140). Флуоресценция Rox может не полностью исчезать, поскольку некоторые из дисульфидных мостиков пространственно закрыты длинными группами PEG на PIL, и вследствие небольшого неспецифического взаимодействия между красителем и поверхностью QD.
Изменения профиля флуоресценции конструкции при измерении посредством проточной цитометрии и конфокальной микроскопии, подтверждают доставку конструкций QD-дисульфид-Rox в цитоплазму клетки. Под воздействием восстанавливающей среды цитозоля расщепление дисульфидных связей прерывает процесс FRET от QD до красителя. Таким образом, при исключительном возбуждении QD, флуоресценция канала QD возрастает, в то время как флуоресценция канала Rox снижается с течением времени. Живые клетки HeLa обрабатывали с помощью микрожидкостного устройства в растворе при высокой концентрации QD-дисульфид-Rox, инкубировали в течение 5 минут и промывали для удаления избытка QD перед добавлением среды для культивирования клеток (т.е. обработанных клеток). Контрольные клетки инкубировали с QD-дисульфид-Rox в течение 5 минут вместо обработки с использованием микрожидкостного устройства, и промывали перед помещением в среду для культивирования клеток. Флуоресценцию канала Rox и QD этих обработанных и контрольных клеток наблюдали с помощью как конфокальной микроскопии, так и проточной цитометрии.
На фиг. 22A и 22B иллюстрируются изображения конфокальной микроскопии живых клеток и анализ интенсивности флуоресценции, демонстрирующий цитоплазматическое окрашивание и химическую доступность поверхности QD. На фиг. 22A иллюстрируются изображения обработанных клеток (сверху) и контрольных клеток (снизу). Появление диффузной зеленой флуоресценции присутствует только в обработанных клетках. Масштабная метка соответствует 10 мкм. На фиг. 22B иллюстрируется изменение интенсивности в зависимости от времени в зеленых и красных каналах. Поскольку n<20 в каждый момент времени, колебания общей средней флуоресценции корректировали посредством нормализации к моменту времени 0 ч.
Под конфокальным микроскопом диффузная флуоресценция, которая появляется в цитоплазме обработанных клеток, прогрессирует от выраженной красной до выраженной зеленой (как показано на фиг. 22A). Изображения контрольных клеток демонстрируют некоторое неспецифическое связывание на наружной мембране, на которое указывает флуоресценция в форме кольца, и отсутствует увеличение сигналов в зеленом канале. Эти эффекты согласуются с ожидаемым расщеплением цитозольных дисульфидных связей, которые снижают эффект FRET. На фиг. 22B, на линейных графиках представлена средняя интенсивность каналов QD и Rox на клетку после корректирования в отношении различий от клетки к клетке в отношении доставляемого флуоресцентного материала посредством нормализации к общей флуоресценции, для обработанных и контрольных клеток, и аутофлуоресценции. Для обработанных клеток, на графике показано пересечение на уровне 2-4 часов инкубации, где флуоресценция QD возрастает выше флуоресценции Rox. Интересно, что показано, что сигнал Rox обработанных клеток стабилизирован выше уровней аутофлуоресценции после 9 часов. Это согласуется с результатами анализов в растворе, где некоторый FRET оставался после восстановления. Наблюдаемое диффузное окрашивание, и увеличение сигнала QD и снижение сигнала Rox убедительно подтверждают доставку в цитозоль и последующее расщепление дисульфидных связей. Флуоресценция QD в контрольных клетках после гашения посредством FRET до Rox, оказалась неотличимой от аутофлуоресценции. Контрольные клетки проявляют некоторую флуоресценцию Rox выше аутофлуоресценции в ранние моменты времени, которая затем устойчиво снижается. Это может быть приписано неспецифическим взаимодействиям между QD-S-S-Rox и поверхностью клетки, с последующим повторным растворением конструкций в среде.
На фиг. 23 иллюстрируется измерение с помощью проточной цитометрии средней флуоресценции и жизнеспособности клеток. На 2300 представлена средняя флуоресценция QD (слева) и Rox (справа) на клетку, демонстрирующая увеличение флуоресценции QD только в обработанных клетках. Флуоресценция Rox как в обработанных, так и в контрольных, клетках происходит на уровнях аутофлуоресценции в момент времени 24 ч. На 2310 представлена гистограмма распределения интенсивности флуоресценции среди обработанных и контрольных клеток в выбранные моменты времени в канале QD (слева) и канале Rox (справа). Согласно оценке, доставка QD произошла по меньшей мере в 35% популяции клеток. Серые области предназначены для направления движения глаз на пики гистограмм интенсивности флуоресценции. На 2320 проиллюстрирована жизнеспособность контрольных и обработанных клеток при измерении с помощью йодида пропидия.
Результаты измерений с помощью проточной цитометрии, проиллюстрированные на фиг. 23, подтверждают, что конструкции QD-дисульфид-Rox могут взаимодействовать с цитозольной средой. Результаты измерения проточной цитометрии регистрировали на всех живых клетках, охватывая как доставленные (~35% обработанной популяции клеток), так и недоставленные клетки. На 2100 проиллюстрирована средняя флуоресценция на клетку для обработанных и контрольных популяций клеток. Средняя флуоресценция QD сначала увеличивается для обработанных клеток, достигая пика через ~9 ч, и постепенно снижается после этого, в противоположность флуоресценции QD в популяции контрольных клеток, которая остается сравнимой с уровнями аутофлуоресценции. Это согласуется с восстановлением в цитозоле дисульфидных мостиков между QD и красителем внутри обработанных клеток с последующим разбавлением флуоресцентных конструкций посредством деления клеток. Флуоресценция Rox как для обработанных, так и для контрольных клеток начинается на высоком уровне и падает в течение первых 2 ч. Это падение приписывается к повторному растворению в среде частиц, которые связались с клеточной поверхностью в процессе инкубации. Средняя флуоресценция Rox в обработанной клеточной популяции оказалась сходной с контрольными клетками вследствие присутствия в обработанной популяции клеток, в которые не произошла доставка. Присутствие клеток в которые как произошла доставка, так и не произошла доставка, в обработанной популяции можно отличить на гистограммах интенсивности QD и Rox, представленных на 2310. С увеличением времени гистограммы флуоресценции становятся бимодальными для обработанных клеток, но остаются унимодальными для контрольных клеток. Флуоресценция QD увеличивается с течением времени в подгруппе клеток обработанной клеточной популяции (2100), далее подтверждая прерывание процесса FRET в цитозоле обработанных и подвергнутых доставке клеток. Флуоресценция Rox в общем снижается по мере повторного растворения связанных с мембраной конструкций в среде, однако подгруппа обработанной популяции клеток сохраняет флуоресценцию Rox. Это согласуется с неполным восстановлением связей QD-S-S-Rox, наблюдаемым при конфокальной микроскопии. Жизнеспособность обработанной клеточной популяции при измерении по окрашиванию йодидом пропидия находится в пределах 10% от контрольной популяции во все моменты времени (2130). Жизнеспособность клеток >90% относительно контрольной группы выигрывает в сравнении с альтернативными способами, такими как электропорация и способы на основе полимеров, которые обеспечивают жизнеспособность после обработки только 40-60%.
На фиг. 24 иллюстрируется эпифлуоресцентное изображение неагрегированных единичных QD в цитозоле клеток после обработки в устройстве с 10 нМ раствором QD (сверху), и кривые мерцания для трех QD, обозначенных как 2400, 2410 и 2420, с аутофлуоресценцией. Кривые мерцания для QD, по-видимому, являются небинарными вследствие длительного времени в емкостях для получения данных (500 мс). Масштабные метки представляют собой 10 мкм.
Платформа для доставки QD также позволила визуализацию единичных молекул посредством доставки неагрегированных конструкций QD-дисульфид-Rox, поскольку наблюдаемая периодичность испускания согласуется с единичными QD. Для этого эксперимента конструкции QD-дисульфид-Rox доставляли в цитозоль с последующей инкубацией в течение 10 часов и визуализировали на эпифлуоресцентном микроскопе. Инкубация в течение 10 часов обеспечила восстановление флуоресценции QD внутри цитозоля вследствие восстановления дисульфидной связи; эпифлуоресцентную микроскопию использовали для обеспечения того, чтобы было накоплено достаточно фотонов. Несколько мерцающих QD наблюдали, когда клетки обрабатывали с использованием настоящего изобретения при низких концентрациях QD (фиг. 24). Кривые интенсивности мерцающих QD в цитозоле, представленные на 2400, 2410 и 2420, выглядят небинарными в результате длительного времени в емкостях для получениях данных (500 мс). Движения переходных клеток считали минимальными в ходе временных рамок получения данных (~1 мин). Эти данные демонстрируют возможность наблюдения событий отдельных молекул в цитозоле клеток посредством доставки QD в качестве флуоресцентных меток с использованием настоящего изобретения.
В примере 1 продемонстрирована доставка наночастиц в цитозоль клеток в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Путем наблюдения за расщеплением QD-дисульфид-Rox цитозольными восстановителями было показано, что поверхность наночастиц взаимодействует с цитозольными компонентами. Варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают доставку QD в цитоплазму клеток с высокой пропускной способностью без каких-либо проникающих в клетку или ускользающих от эндосом лигандов при сохранении жизнеспособности клеток и целостности QD. Эффективность доставки 35% можно далее увеличить посредством увеличения количества микрожидкостных сужений, изменения размеров сужений или увеличения количества циклов обработки. В отличие от большинства способов доставки, обусловленных проникающим в клетку пептидом или положительным зарядом, настоящее изобретение не требует двойной конъюгации средства для внутриклеточной доставки и средства, нацеливающего на белок цитозоля, на одной и той же наночастице. Посредством устранения необходимости вышеуказанного, можно достигать уменьшения проблем перекрестной реактивности, неравной реакционной эффективности стратегий конъюгации и стехиометрии конъюгации. Таким образом, достигают значительной приспособляемости модели конструкции QD, позволяющей внутриклеточное мечение и отслеживание белков. Способы пригодны для доставки множества флуоресцентных материалов с помощью комплексных решений, которые осуществляют нацеливание на внутриклеточные белки и органеллы через испытанные стратегии нацеливания на белки, такие как, но не ограничиваясь ими, стрептавидин-биотин, HaloTag-хлоралкан и мечение сортазой.
В примере 1 все химические реагенты приобретали от Sigma Aldrich и использовали в полученном виде, если нет иных указаний. Чувствительные к воздуху материалы содержали в перчаточном боксе Omni-Lab VAC в атмосфере сухого азота с уровнями кислорода <0,2 м.д. Все растворители были спектроскопическими или реагентными. Соединения, содержащие ароматическое кольцо, визуализировали на TLC с использованием ручной УФ-лампы и KMnO4. Содержащие амины соединения визуализировали на TLC с использованием нингидринового красителя. Колоночную флэш-хроматографию проводили на Teledyne Isco Combi Flash Companion. Клетки HeLa приобретали от ATCC и все материалы клеточной среды приобретали от Mediatech, если нет иных указаний.
В примере 1, спектры 1H ЯМР регистрировали на ЯМР-спектрометре Bruker DRX 401. MS-ESI проводили на устройстве Bruker Daltonics APEXIV 4.7 FT-ICR-MS. Спектры поглощения в ультрафиолетовой и видимой области спектра получали с использованием спектрофотометра с диодной матрицей HP 8453. Спектры фотолюминесценции и поглощения регистрировали с помощью устройства для считывания микропланшетов BioTek Synergy 4 Microplate Reader. Молекулярные массы полимеров определяли в растворе DMF на системе ВЭЖХ/GPC серии Agilent 1100 с тремя колонками PLgel (103, 104, 105 A) последовательно против точных полистироловых стандартов. Производные красителей очищали с использованием системы ВЭЖХ Varian ProStar Prep HPLC system. Модифицированный полимер очищали с использованием колонок GE Healthcare's PD-10, заполненных SephadexTM G-25M. QD после обмена лигандов очищали диализом с центрифугированием с помощью центрифужных фильтров с пороговым значением 30K Millipore Amicon Ultra и с помощью GFC на системе хроматографии AKTAprime Plus (Amersham Biosciences), оборудованной предварительно заполненной стеклянной колонкой Superdex 200 10/100. Измерения проточной цитометрией проводили на LSR Fortessa (BD Biosciences).
В примере 1 ядра CdSe с первым пиком поглощения 478 нм синтезировали с использованием ранее описанного способа (1). Обобщая, 0,4 ммоль (54,1 мг) CdO, 0,8 ммоль (0,2232 г) TDPA, 9,6 ммоль (3,72 г) TOPO помещали в 25 мл круглодонную колбу. Раствор дегазировали в течение 1 ч при 160°C и нагревали до 300°C в атмосфере аргона до тех пор, пока CdO не растворялся и не образовывал прозрачный однородный раствор. После этого следовало помещение раствора в вакуум при 160°C для удаления образовавшейся воды. Раствор повторно нагревали до 360°C в атмосфере аргона и быстро добавляли раствор TOP-Se (1,5 мл 1,5 M TOP-Se в 1,5 мл TOP) с получением элементов CdSe с первым признаком поглощения при 478 нм.
Оболочки CdS наносили на ядра CdSe посредством модификации ранее описанных методик (2). Ядра, выделенные посредством повторяющихся преципитаций из гексана с ацетоном, доводили до 180°C в смеси растворителей олеиламина (3 мл) и октадецена (6 мл). Затем непрерывно подавляли первичные растворы Cd и S при скорости 4 мл/ч. Первичный раствор Cd состоял из 0,33 ммоль Cd-олеата и 0,66 ммоль олеиламина в смеси растворителей октадецена (1,5 мл) и TOP (3 мл). Первичный раствор S состоял из 0,3 ммоль гексаметилдисилатиана [(TMS)2S] в 6 мл TOP. Добавление всего 3 монослоев каждого из Cd и S обеспечивало QD с испусканием при 541 нм и квантовым выходом 60% при разбавлении в октане. Коэффициент экстинкции CdSe(CdS) вычисляли с использованием коэффициента экстинкции ядер CdSe из литературы (3) и предполагая, что 95% ядер CdSe сохранялись в ходе стадии покрытия.
В примере 1, кремниевый чип изготавливали с использованием способов фотолитографии и глубокого реактивного ионного травления. Полученную кремниевую пластину с гравировкой очищали (с помощью H2O2 и H2SO4) для удаления дебриса, окисляли для получения стеклянной поверхности и связывали с пластиной Pyrex, а затем разрезали на индивидуально упакованные устройства. Затем каждое устройство исследовали по отдельности в отношении дефектов перед применением.
Пример 2 - Доставка макромолекул
Внутриклеточная доставка макромолекул является важной стадией в терапевтических и исследовательских применениях. Опосредуемая наночастицами доставка ДНК и РНК, например, является пригодной для генной терапии, в то время как доставку белков используют для влияния на функции клеток как в клинических, так и в лабораторных условиях. Другие материалы, такие как низкомолекулярные соединения, квантовые точки или золотые наночастицы, доставляют в цитозоль для целей, варьирующих от терапии злокачественной опухоли до внутриклеточного мечения и отслеживания отдельных молекул.
Чтобы продемонстрировать универсальность способа, модельные молекулы декстрана доставляли в несколько типов клеток: дендритные клетки DC2.4, фибробласты крайней плоти новорожденного человека (NuFF) и эмбриональные стволовые клетки мыши (mESC), которые достигали эффективности доставки вплоть до 55%, 65% и 30%, соответственно. Первоначальные эксперименты также показали успешную доставку в первичные лимфоциты, макрофаги и дендритные клетки, происходящие из мышей. Более того, этот способ не обеспечил избыточной цитотоксичности или не индуцировал дифференцировку стволовых клеток. Действительно все типы клеток были жизнеспособными более чем на 60% даже при более высоких исследованных скоростях. Конструкция устройства и условия функционирования не были предварительно оптимизированы ни для одного из упомянутых выше типов клеток.
На фиг. 25 проиллюстрированы результаты эксперимента, демонстрирующие, что эффективность доставки зависит от скорости клетки и конструкции сужения. Размеры сужения обозначены цифрами (например, 10 мкм-6 мкм-x5), так что первое число соответствует длине сужения, второе число соответствует ширине сужения и третье число (если оно присутствует) соответствует количеству сужений последовательно на канал. На 2500 показана эффективность доставки и на 2510 представлена жизнеспособность клеток через 18 часов после обработки (измеренная с помощью проточной цитометрии) в зависимости от скорости клеток для конструкций устройств 40 мкм-6 мкм (o), 20 мкм-6 мкм (□) и 10 мкм-6 мкм-x5 (Δ). На 2520 показана эффективность доставки и жизнеспособность клеток 2530 (измеренная посредством проточной цитометрии) в зависимости от скорости для первичных фибробластов человека (□), дендритных клеток DC2.4 (o), и эмбриональных стволовых клеток мыши (mESC) (Δ), обработанных с помощью устройства 30 мкм-6 мкм. Фибробласты и дендритные клетки человека анализировали через 18 часов после доставки. MESC анализировали через 1 час после доставки. Все точки данных анализировали в трех экземплярах и планки погрешности соответствуют двум стандартным отклонениям.
На фиг. 26 проиллюстрированы изображения, 2600, различных горизонтальных плоскостей клетки HeLa после доставки конъюгированного с pacific blue декстрана массой 3 кДа, при определении посредством конфокальной микроскопии. Изображения представлены сверху вниз, а затем слева направо, где сверху слева представлено изображение при z=6,98 мкм и снизу справа представлено изображение при z=-6,7 мкм. Масштабная метка соответствует 6 мкм. На 2610 представлена эффективность доставки в живые клетки с помощью устройства 10 мкм-6 мкм (□), 20 мкм-6 мкм (o), 30 мкм-6 мкм (Δ) и 40 мкм-6 мкм (◊). Ось времени указывает на количество времени после первоначальной обработки клеток до того, как они были подвергнуты воздействию намеченного раствора для доставки. Все результаты измеряли с помощью проточной цитометрии через 18 часов после обработки. На 2620 представлена средняя интенсивность для популяции клеток, в которую осуществляли доставку, нормализованная к необработанным клеткам для контроля аутофлуоресценции. Конъюгированный с флуоресцеином декстран массой 70 кДа (горизонтальные линии) и конъюгированный с pacific blue декстран массой 3 кДа (диагональные линии) доставляются в клетки (циклы 1 и 3) и удаляются из клеток (цикл 2) в последовательных циклах обработки. Контроль соответствует клеткам, которые подверглись воздействию только раствора для доставки, но не были обработаны с помощью устройства. Все точки данных исследовали в трех экземплярах и планки погрешностей соответствуют двум стандартным отклонениям.
Поскольку в предшествующих способах доставки на основе наночастиц и проникающего в клетку пептида (CPP) используются каскады эндоцитоза, существуют данные, которые вычеркивают влияние эндоцитоза в механизме доставки с помощью настоящего изобретения. На фиг. 26 на 2600 иллюстрируется, что конфокальная микроскопия клеток, обработанных конъюгированным с pacific blue декстраном массой 3 кДа, демонстрирует диффузное окрашивание цитозоля в противоположность точечной характеристике, которой можно ожидать в случае способов, обусловленных эндоцитозом. Более того, когда эксперименты по доставке проводят при 4°C, что является температурой, при которой эндоцитоз минимизируется, температура в минимальной степени влияет на эффективность доставки для обоих исследуемых материалов грузов: декстрана массой 3 кДа и 70 кДа. Эти данные указывают на то, что маловероятно, что эндоцитоз ответственен за доставку в этой системе.
Охарактеризовывали кинетику доставки с течением времени. Клетки обрабатывали с использованием настоящего изобретения в отсутствие доставляемого материала, а затем подвергали воздействию меченного pacific blue декстрана массой 3 кДа в определенные временные интервалы после обработки. В этом подходе по мере того, как клетки проходили через сужение, их мембраны нарушались; однако не происходило поддающейся измерению доставки до тех пор, пока они не подвергались воздействию меченого декстрана. Таким образом, эффективность доставки в каждый момент времени может отражать соотношение клеток, в которых остались поры в течение этого количества времени после обработки. Этот способ устанавливает кинетику образования/закрытия пор. Результаты указывают на то, что практически 90% доставки происходит в течение первой минуты после обработки, независимо от конструкции устройства (2610). Наблюдаемая временная шкала подтверждает гипотезу образования пор, поскольку в предшествующих работах, касающихся кинетики репарации мембраны, описано, что закрытие мембраны происходит приблизительно через 30 с после индукции повреждения. Напротив рекомендованный временной масштаб для способов, обусловленных эндоцитозом, таких как механизмы опосредуемой наночастицами и CPP доставки, составляет порядка нескольких часов.
Поскольку доставка материала через поры в мембранах является диффузионной, материал может обмениваться между внутренним и внешним содержимым клетки на протяжении времени существования поры. С другой стороны, опосредуемые эндоцитозом или конвекционные механизмы должны быть однонаправленными, т.е. должны обеспечивать только транспорт материала в клетку. Чтобы продемонстрировать двунаправленный транспорт материала через клеточную мембрану, проводили эксперимент, состоящий из 3 циклов доставки. На первом цикле клетки обрабатывали в присутствии декстрана массой 3 кДа и 70 кДа, инкубировали в течение 5 мин в растворе декстрана и промывали два раза посредством PBS. Одну треть образца сохраняли и высевали для наблюдения. На втором цикле оставшиеся промытые клетки вновь обрабатывали с помощью устройства, но в отсутствие какого-либо доставляемого материала, и инкубировали в течение дополнительных 5 мин. Половину этого образца высевали для наблюдения. На третьем цикле оставшиеся клетки после второго цикла пропускали через устройство в тех же условиях, что и на первом цикле (т.е. в присутствии декстрана), инкубировали в течение 5 минут и промывали два раза в PBS. Клетки анализировали посредством проточной цитометрии через 18 часов после эксперимента. Изменения нормализованной интенсивности флуоресценции демонстрируют суммарную диффузию декстрана в клетки в ходе первого цикла, из клеток в ходе второго цикла, и обратно в ходе третьего цикла (2620). Таким образом, эти результаты согласуются с механизмом диффузионной доставки.
На фиг. 27 проиллюстрирована упрощенная диффузионная 2D-модель разработанная в пакете программ, известном как COMSOL Multiphysics, который имитирует пассивную диффузию материала в клетку через мембрану с порами. COMSOL Multiphysics представляет собой пакет программ для анализа методом конечных элементов, алгоритм решения и программное обеспечение моделирования/FEA, разработанный COMSOL для различных физических и инженерных применений, особенно сопряженных явлений или мультифизики. На 2700 показана доставка/утрата материала в зависимости от диффузионной способности мембраны. Результаты моделирования указывают на процент материала, доставленного/утраченного из клетки в зависимости от диффузионной способности мембраны, когда представляющий интерес материал находится в буфере (□) или в клетке (o) в момент образования пор. На 2710 представлено графическое изображение смоделированной системы и градиент концентрации, который образуется на мембране, если материал доставляют из буфера в клетку.
С использованием литературных значений для диффузионной способности частиц внутрь и наружу цитоплазмы клеток, экспериментальные результаты, представленные на фиг. 26 качественно воссоздавали с диффузией в качестве единственного режима переноса массы. Более того, при аппроксимации экспериментальных данных к этой модели, этот способ доставляет 10-40% доставляемого материала буфера в цитозоль клетки. При сравнении было оценено, что способы CPP для доставки белка доставляют только 0,1% материала буфера в цитозоль.
Размер частиц (или гидродинамический радиус) влияет на их диффузионную способность и на их способность проникать через поры в мембране, имеющие размер частиц. Таким образом, этот параметр влияет на эффективность доставки в механизме образования пор/диффузии. В серии экспериментов доставляли исследуемые грузы декстрана размером 3 кДа, 10 кДа, 70 кДа, 500 кДа и 2 МДа, конъюгированные с флуоресцеином или pacific blue. Также доставляли меченные флуоресцеином плазмиды, оцененные на уровне 3,1 МДа. Эти модельные молекулы выбирали на основе сходства их молекулярной массы с представляющими интерес доставляемыми материалами. Декстран размером 3 кДа-10 кДа, например, имеет сходный размер с некоторыми короткими пептидами или миРНК, в то время как диапазон 70 кДа-2 МДа имитирует размер большинства белков и некоторых небольших наночастиц.
На фиг. 28 иллюстрируются результаты двухуровневой доставки материала. На 2800 представлена эффективность доставки живых клеток в зависимости от скорости, для клеток HeLa, обработанных декстраном массой 3 кДа, конъюгированным с Pacific Blue (□), декстраном массой 70 кДа, конъюгированным с флуоресцеином (o) и декстраном массой 2 МДа (Δ). Этот эксперимент проводили на чипе 10 мкм-6 мкм-x5. Все точки данных исследовали в трех экземплярах и планки погрешностей соответствуют двум стандартным отклонениям. На 2810 и 2820 иллюстрируется наложения гистограмм данных проточной цитометрии для клеток HeLa, которые являются необработанными (красный), обработанными при 700 мм/с (зеленый), обработанными при 500 мм/с (оранжевый), обработанными при 300 мм/с (светло-голубой) или только подвергнутыми воздействию доставляемого материала (контроль, темно синий). Доставляемый материал состоял из конъюгированного с pacific blue декстрана массой 3 кДа (2810) и конъюгированного с флуоресцеином декстрана массой 70 кДа (2820).
Эксперименты показали, что молекулы, имеющие размер больше 70 кДа, имеют отличающийся профиль доставки от декстрана массой 3 кДа (2800). Устройство обеспечивало двухуровневую доставку, где устройство 10 мкм-6 мкм-x5, действовавшее при 500 мм/с, например, обеспечивало более 90% живых клеток получением молекул массой 3 кДа, в то время как приблизительно 50% получали более крупные молекулы размером 70 кДа и 2 МДа.
Гистограммы, соответствующие этим данным проточной цитометрии, указывают на то, что доставка декстрана массой 3 кДа обеспечивает два отчетливых пика (2810). В первой субпопуляции клетки проявляют умеренные уровни доставки, как наблюдали по сдвигу пика относительно контролей (контроли учитывают эндоцитоз и поверхностное связывание, как описано ранее для точек данных 0 мм/с) с увеличением в 2-6 раз средней интенсивности флуоресценции. Во второй популяции клетки проявляют увеличенные уровни доставки, соответствующие увеличению в 20-100 раз средней интенсивности флуоресценции относительно контролей. Этот эффект может указывать на то, что последняя из субпопуляций имела больше пор, чем первая, таким образом, обеспечивая увеличение количества входящего материала практически в 10 раз. Действительно, как проиллюстрировано с помощью кривых для 300 мм/с, 500 мм/с и 700 мм/с, увеличение строгости обработки посредством увеличения действующих скоростей, по-видимому, увеличивает долю клеток с увеличенной доставкой. Наблюдаются сходные характеристики доставки более крупных молекул декстрана массой 70 кДа (2820). Однако эффект является менее выраженным, поскольку меньшая диффузионная способность частиц и возможные эффекты исключения по размеру снижают общее доставляемое количество. Популяция с умеренной доставкой (первый пик) демонстрирует увеличение средней интенсивности флуоресценции только в 1,5-2 раза по сравнению с наблюдаемым увеличением в 2-6 раз в случае 3 кДа. Этот эффект может объяснить различие в данных доставки на 2800, как и в случае более крупных молекул, популяцию с мягкой доставкой может быть трудно отличить от контролей на основе представленного определения доставки. В результате для более крупных молекул, таких как декстран массой 70 кДа и 2 МДа, по большей части измеряют вторую популяцию с усиленной доставкой.
Для подтверждения того, что материал, доставляемый посредством быстрой механической деформации, является активным и биологически доступным в цитозоле клеток, проводили серию экспериментов, доставляющих исследуемый груз в виде подавляющей GFP миРНК (Ambion, США) в клетки HeLa, экспрессирующие дестабилизированный GFP. Наблюдали дозозависимый и специфический к последовательности GFP нокдаун (вплоть до 80%) через 18 часов после обработки. Ответ в виде нокдауна генов на скорость клеток и конструкцию устройства согласовывался с экспериментами по доставке декстрана, так что более высокие скорости и конструкции с множественными сужениями обеспечивали больший нокдаун генов. Lipofectamine 2000 использовали в качестве положительного контроля в этих экспериментах. Конструкция устройства и параметры работы не были оптимизированы для доставки миРНК перед проведением этих экспериментов.
На фиг. 29 проиллюстрированы данные, касающиеся доставки миРНК, белка и наночастиц. На 2900 проиллюстрирован нокдаун генов в зависимости от типа устройства и скорости клеток в дестабилизированных экспрессирующих GFP клетках HeLa через 18 часов после доставки миРНК против eGFP с использованием 10 мкм-6 мкм-x5 чипа при концентрации доставки 5 мкМ. lipofectamine 2000 использовали в качестве положительного контроля. На 2910 представлена эффективность доставки меченного флуоресцеином декстрана массой 70 кДа и меченного pacific blue декстрана массой 3 кДа посредством быстрой механической деформации и электропорации. Каждый тип декстрана был в концентрации 0,1 мг/мл в растворе для доставки. На 2920 представлена эффективность доставки меченного флуоресцеином бычьего сывороточного альбумина (o), эффективность доставки конъюгированного с pacific blue декстрана массой 3 кДа (□) и жизнеспособность клеток (Δ) в зависимости от скорости, с использованием устройства 30 мкм-6 мкм. На 2930 представлены флуорсцентные микрофотографии клеток HeLa сразу после доставки антител против тубулина с меткой Alexa Fluor 488. Масштабные метки соответствуют 5 мкм. На 2940 и 2950 представлены изображения микроскопии туннелирующих электронов (TEM) золотых наночастиц (некоторые из них указаны стрелками) в клетках, полученных через ~1 с после обработки с использованием устройства 10 мкм-6 мкм-x5. Масштабные метки соответствуют 500 нм. Все точки данных анализировали в трех экземплярах и планки погрешностей соответствуют двум стандартным отклонениям.
В следующих экспериментах исследовали возможность доставки в цитозоль при ранее затруднительных применениях, таких как доставка белков и наночастиц. Для сравнения эффективности настоящего изобретения с коммерчески доступными способами декстран массой 3 кДа и 70 кДа доставляли в качестве белковой модели в фибробласты человека с использованием настоящего изобретения и системы электропорации Neon (Invitrogen). Результаты указывают на то, что быстрая механическая деформация обеспечивает увеличение доставки в 7 раз или более для таких макромолекул (2910). Для переключения способа на доставку белков, устройство с диаметром канала 30 мкм-6 мкм использовали для доставки меченного флуоресцеином бычьего сывороточного альбумина (BSA) в клетки HeLa с вплоть до 44% эффективностью при сохранении жизнеспособности выше 90% (2920). Также после обработки в клетки HeLa доставляли меченные Alexa Fluor 488 антитела к тубулину (Bio Legend) с помощью устройства 30 мкм-6 мкм с использованием концентрации антитела 0,25 мг/мл (2930). Диффузное окрашивание указывает на то, что материал не захватывается в эндосомы и, таким образом, пригоден для окрашивания антителом клеточных структур цитозоля живых клеток. Также с использованием этого способа успешно доставляли аполипопротеин E.
Для доставки наночастиц, изображения TEM для клеток, фиксированных через ~1 с после деформации (2940 и 2950) демонстрируют доставку покрытых PEG 1000 15-нм золотых наночастиц. Золотые наночастицы, по-видимому, по большей части были неагрегированными и визуально не изолировались в эндосомах. На этих изображениях наблюдали доказательства различных дефектов в цитоплазме клеток, ответственных за доставку. Была продемонстрирована высокоэффективная нетоксичная доставка квантовых точек прямо в цитозоль клеток - цель, которой трудно было достигнуть с помощью предшествующих способов. В этих экспериментах квантовые точки с красителем Rox, связанным с их поверхностью, доставляли посредством быстрой механической деформации и наблюдали с течением времени. Эти данные обеспечили минимальную оцененную эффективность доставки 35% и подтвердили, что доставленные квантовые точки находились в цитозоле и были химически доступными для внутриклеточной среды.
Временные поры образуются посредством быстрой механической деформации клетки по мере того, как она проходит через микрожидкостное сужение. Данные подтверждают этот механизм посредством демонстрации диффузного окрашивания цитозоля (фиг. 26 на 2600), функциональности миРНК (фиг. 29 на 2900) и двунаправленного движения материала через мембрану с порами (фиг. 26 на 2920). Был идентифицирован ряд параметров, таких как размеры сужения, количество последовательных сужений и скорость клеток, которые влияют на эффективность доставки и жизнеспособность (фиг. 25). Таким образом, эти параметры можно использовать для оптимизации конструкции устройства для индивидуальных применений на основе типа клеток и размера доставляемого материала.
В примере 2 этот способ основан на микрожидкостной системе, которая может быть включена в более крупную интегрированную систему, состоящую из множества стадий предварительной обработки перед доставкой и стадий анализа или сортировки после обработки. При средней пропускной скорости 10000 клеток/с, устройство для доставки, например, может быть встроено в одной линии с устройством для проточной цитометрии для сортировки клеток или выполнения других аналитических задач сразу после доставки.
Устройства, системы и способы, описанные в настоящем описании, обеспечивают ряд потенциальных преимуществ над существующими способами. Аналогично электропорации и микроинъекции, эта система представляет собой механизм на основе образования пор и, таким образом, она не основана на экзогенных механизмах, химической модификации грузов или каскадах эндоцитоза. Однако в противоположность электропорации, она не основана на электрических полях, которые имеют ограниченный успех при доставке белков, могут повреждать некоторые грузы или вызывают цитотоксичность. Действительно, текущие результаты продемонстрировали относительно высокую жизнеспособность в большинстве применений и чувствительные грузы, такие как квантовые точки, оказываются неповрежденными. Таким образом, настоящее изобретение относится к значительным преимуществам в областях, таких как мечение и отслеживание материала цитозоля, где повреждение квантовой точки вследствие электропорации может быть проблемой и использование химических способов доставки может ограничить диапазон доступных поверхностных химических групп.
В примере 2 также продемонстрирована способность устройства доставлять белки в цитозоль клеток. Данные и оценки при моделировании указывают на то, что настоящее изобретение может доставлять в 10-100 раз больше материала на клетку относительно предшествующих методик, таких как использование проникающих в клетку пептидов или электропорации. Это увеличение скоростей доставки обеспечивает мощный способ для применения в перепрограммировании клеток с помощью белков, например, где доставка факторов транскрипции в цитозоль клеток является основным препятствием для разработки надежных способов получения iPSC. Также настоящее изобретения можно использовать для исследования механизма заболевания посредством доставки различных представляющих интерес белков/пептидов. Действительно настоящее изобретение можно использовать для высокопроизводительного скрининга пептидных библиотек, поскольку, в отличие от большинства способов на основе CPP или наночастиц, настоящее изобретение является нечувствительным к структуре и химии белков, не основано на каскадах эндоцитоза и не влияет на функциональность белков.
Поскольку настоящее изобретение продемонстрировало потенциал к доставке в первичные клетки, доставку в цитозоль посредством быстрой механической деформации также можно использовать в качестве механизма лечения ex vivo. В этом подходе клетки-мишени пациента, выделенные из крови или другой ткани, обрабатывают с помощью устройства вне организма пациента, а затем повторно вводят в организм. Преимуществом такого подхода является увеличенная эффективность доставки терапевтических средств на основе белков или наночастиц, и она является более безопасной, чем существующие способы, поскольку она устраняет необходимость в потенциально токсичных векторных частицах и смягчает какие-либо потенциальные побочные эффекты, ассоциированные с ретикулоэндотелиальным выведением и нецелевой доставкой.
В примере 2 устройства на основе кремния изготавливали на микротехнологическом оборудовании с использованием способов фотолитографии и глубокого реактивного ионного травления. В этом процессе кремниевые пластины размером 6'' (15 см) толщиной 450 мкм обрабатывали гексаметилдисилазаном (HMDS), покрытым методом центрифугирования фототвердеющим материалом (OCG934, FujiFilm) в течение 60 с при 3000 об./мин., подвергали УФ-излучению (EV1-EVG) через хромированный фотошаблон с конструкцией канала сужения и проявляли в растворе AZ405 (AZ Electronic Materials) в течение 100 с. После обжига в течение 20 мин при 90°C, пластину протравливали посредством глубокого реактивного ионного травления (SPTS Technologies) до желаемый глубины (как правило, в этом примере 15 мкм). Обработку Piranha (H2O2 и H2SO4) использовали для удаления какого-либо оставшегося фототвердеющего материала после завершения процесса травления. Для гравирования отверстий для доступа (т.е. входа и выхода) процесс повторяли на противоположной стороне пластины (т.е. стороне, не содержащей выгравированные каналы) с использованием отличающегося шаблона, который содержит узоры отверстий для доступа, и большей толщины фототвердеющего материала AZ9260 (AZ Electronic Materials).
Кислородную плазму и очистку RCA использовали для удаления каких-либо оставшихся примесей. Влажное окисление использовали для выращивания 100-200 нм оксида кремния, а затем пластину анодным образом связывали с пластиной Pyrex и нарезали на индивидуальные устройства. Каждое устройство перед применением по отдельности исследовали в отношении дефектов.
Перед каждым экспериментом устройства помещали на держатель с резервуарами на входе и на выходе (все индивидуально разработаны и изготовлены Firstcut). Эти резервуары соединены с устройством с использованием уплотнительных колец Buna-N (McMaster-Carr) для обеспечения надлежащей герметизации. Резервуар на входе соединен с системой регулятора давления с использованием тефлоновой трубки для обеспечения необходимой движущей силы для продвижения материала через устройство. В примере 2 можно было использовать давления вплоть до 70 фунт./кв. дюйм (482,6 кПа).
Клеточная культура примера 2 включала HeLa (ATCC), эксрессирующие GFP HeLa и DC2.4 (ATCC), клетки культивировали в модифицированной способом дульбекко питательной среде (DMEM, Mediatech) с высоким содержанием глюкозы, дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS) (Atlanta Biologies) и 1% пенициллин-стрептомицином (Mediatech). Первичные фибробластные клетки человека (NuFF) (Globalstem) культивировали в DMEM с высоким содержанием глюкозы, дополненной 15% FBS. Клетки поддерживали в инкубаторе при 37°C и 5% CO2. В соответствующих случаях, прикрепляющиеся клетки суспендировали посредством обработки 0,05% трипсином/EDTA (Mediatech) в течение 5-10 мин.
Эмбриональные стволовые клетки мыши (mESC) выращивали на эмбриональных фибробластах мыши (Chemicon) в среде, состоящей из 85% DMEM для нокаута, 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 1 мМ глутамина, 0,1 мМ бета-меркаптоэтанола и 1% неосновных аминокислот, дополненных 1000 единиц/мл LIF (Millipore, США). Клетки пассировали каждые 2-3 суток с использованием 0,25% трипсина/EDTA. При обработке с помощью устройства mESC были способны вновь формировать колонии и сохраняли нормальную морфологию даже через 2 недели после обработки.
Для проведения эксперимента примера 2, клетки сначала суспендировали в желаемом буфере для доставки (среда для роста, фосфатно-солевой буфер (PBS) или PBS, дополненный 3% FBS и 1% F-68 Pluronics (Sigma)), смешанным с желаемым доставляемым материалом и помещали в резервуар устройства на входе. Этот резервуар соединен с линией сжатого воздуха, контролируемой регулятором, и выбранное давление (0-70 фунт./кв. дюйм (0-482,6 кПа)) использовали для направления жидкости через устройство. Затем обработанные клетки собирают из резервуара на выходе. Клетки инкубировали при комнатной температуре растворе для доставки в течение 5-20 мин после обработки для обеспечения закрытия пор перед проведением дальнейшей обработки.
В экспериментах примера 2, сравнивающих доставку молекул декстрана различных размеров или белка против декстрана, представляющие интерес молекулы доставляли совместно, т.е. их использовали в одном и том же эксперименте с одной и той же популяцией клеток, на одно и том же устройстве и различали на основе их флуоресцентных меток. Все экспериментальные условия осуществляли в трех экземплярах и планки погрешности соответствуют двум стандартным отклонениям.
Для доставки флуоресцентно меченных молекул декстрана (Invitrogen) или аполипопротеина E (Invitrogen), эксперименты примера 2 проводили, как описано выше, так чтобы буфер для доставки содержал 0,1-0,3 мг/мл декстрана или 1 мг/мл аполипопротеина E, соответственно.
Для доставки конъюгированного с флуоресцеином BSA (Invitrogen), клетки сначала инкубировали в культуральной среде, содержавшей 5 мг/мл немеченого BSA (Sigma), в течение 2 часов при 37°C, а затем обрабатывали с помощью устройства примера 2 с использованием буфера для доставки, содержащего 1 мг/мл конъюгированного с флуоресцеином BSA. Стадия предварительной инкубации была предназначена для минимизации неспецифического связывания флуоресцентно меченного BSA с клеточной поверхностью.
Нокдаун GFP в примере 2 измеряли в качестве процентного снижения средней интенсивности флуоресценции популяции клеток относительно необработанных контролей. Lipofectamine 2000 + частицы миРНК получали посредством комбинирования 1 мкг миРНК с 1 мкл реагента Lipofectamine 2000 в 100 мкл PBS. После инкубации в течение 20 мин при комнатной температуре, 20 мкл этой смеси добавляли в каждую экспериментальную лунку, содержащую ~20000 клеток и 100 мкл среды. Клеткам позволяли инкубироваться с частицами в течение 18 часов перед анализом.
В примере 2 золотые наночастицы получали посредством конъюгации полиэтиленгликоля (PEG) с концевым тиолом с ММ 1000 с поверхностью наночастицы, затем избыток PEG смывали четыре раза посредством центрифугирования (10000 rcf в течение 30 мин) и полученный материал суспендировали в PBS до конечной концентрации 100 нМ. Для визуализации доставки GNP в клетках HeLa, клетки суспендировали в PBS, дополненном 3% FBS, 1% F-68 Pluronics и 47 нМ GNP; обрабатывали с помощью устройства 10 мкм-6 мкм-x5 и фиксировали в 2,5% (масс./об.) глутаральдегиде, 3% (масс./об.) параформальдегиде и 5,0% (масс./об.) сахарозе в 0,1 M буфере на основе какодилата натрия (pH 7,4). После фиксации в течение ночи клетки подвергали постфиксации в 1% (масс./об.) OsO4 в веронал-ацетатном буфере в течение 1 ч. Затем их целиком окрашивали в течение ночи с помощью 0,5% уранилацетата в веронал-ацетатном буфере (pH 6,0), дегидратировали и заключали в смолу Spurr. Срезы нарезали на Reichert Ultracut E (Leica) при толщине 70 нм с помощью алмазного ножа. Срезы исследовали с помощью электронного микроскопа EM410 (Phillips).
В примере 2, систему электропорации Neon (Invitrogen) использовали для трансфекции клеток NuFF меченным флуоресцеином декстраном массой 70 кДа и меченным pacific blue декстраном массой 3 кДа. При промывании клеток следовали методике изготовителя и их суспендировали в соответствующих буферах. Клетки обрабатывали с использованием 10-мкл наконечника при плотности 10 клеток/мл с концентрацией декстрана 0,1 мг/мл. Три типа использованных условий были следующими: 1) один импульс 1700 В длительностью 20 мс, 2) три импульса 1600 В длительностью 10 мс, 3) два импульса 1400 В длительностью 20 мс. Условия как 1, так и 3, были рекомендованы изготовителем в качестве оптимальных условий для трансфекции фибробластных клеток человека с эффективностью доставки плазмиды eGFP 84% и 82%, соответственно.
На конфокальных изображениях примера 2 образцы центрифугировали при 800 rcf в течение 4 мин и промывали 2-3 раза посредством PBS перед визуализацией. Конфокальные изображения получали на живых клетках с использованием конфокального дополнительного блока C1 на инвертационном микроскопе Nikon TE2000-U с водно-иммерсионными линзами 60x. Возбуждение флуоресцентных образцов осуществляли с помощью лазера при 405 нм и детекцию проводили с использованием стандартного фильтра DAPI (Nikon).
Для флуоресцентной микроскопии примера 2 образцы центрифугировали при 800 rcf в течение 4 мин и промывали 2-3 посредством PBS перед визуализацией. Изображения получали с использованием инертационного микроскопа Axiovert 200 (Zeiss), оборудованного линзами Neofluar (Zeiss). Возбуждение флуоресценции обеспечивали с помощью ртутной лампы X-cite 120Q (Lumen Dynamics). Микроскоп оборудован камерой Hamamatsu C4742-95 (Hamamatsu) и изображения анализировали с помощью ImageJ (NIH).
Для проточной цитометрии примера 2 для анализа клеток после эксперимента по доставке клетки промывали 2-3 раза посредством PBS (>100 мкл на лунку в 96-луночном планшете). Затем их ресуспендировали в PBS, дополненном 3% FBS, 1% F-68 Pluronics и 10 мкг/мл йодида пропидия (Sigma). Клетки анализировали на LSR Fortessa (BD Biosciences) или FACSCanto (BD Biosciences), оборудованных высокопроизводительным роботом для взятия образцов. Лазеры 405 нм и 488нм использовали для возбуждения желаемых флуорофоров.
Сигналы йодида пропидия (краситель живые/погибшие), флуоресцеина и pacific blue выявляли с использованием длинноволнового пропускающего фильтра при 695 нм, фильтров 530/30 и 450/50, соответственно. Анализ данных проводили с использованием программного обеспечения FACS Diva (BD Biosciences) и FlowJo (FlowJo).
Пример 3 - стволовые клетки и иммунные клетки
Белки, наночастицы, миРНК, ДНК и углеродные нанотрубки успешно доставляли в одиннадцать различных типов клеток, включая эмбриональные стволовые клетки и иммунные клетки. Действительно, способность доставлять структурно разнообразные материалы и их применимость к первичным клеткам, которые трудно трансфицировать, указывает на то, что устройство и способы имеют широкую применимость в исследовательских и клинических применениях.
В примере 3 каждое устройство состоит из 45 идентичных параллельных микрожидкостных каналов, содержащих одно или несколько сужений, выгравированных на кремниевом чипе и герметизированных с помощью слоя Pyrex. Ширина и длина каждого сужения (более подробно описанного ниже) находится в диапазоне 4-8 мкм и 10-40 мкм, соответственно. Устройство примера 3, как правило, действовало при пропускной скорости 20000 клеток/с, обеспечивая практически один миллион обработанных клеток на устройство, пока не происходил отказ в работе вследствие закупорки. Конструкция параллельного канала была выбрана для увеличения пропускной способности, одновременно обеспечивая единообразную обработку клеток, поскольку какая-либо закупорка или дефекты в одном канале не могут повлиять на скорость потока в соседних каналах (устройство может действовать при постоянном давлении). Перед применением устройство можно сначала соединить со стальным соединительным устройством, которое соединяет резервуары на входе и на выходе с кремниевым устройством. Затем смесь клеток и желаемого доставляемого материала можно помещать в резервуар на входе и к входу подсоединять тефлоновую трубку. Затем можно использовать регулятор давления для коррекции давления в резервуаре на входе и продвижения клеток через устройство. Обработанные клетки можно собирать с резервуара на выходе.
Параметры, которые влияют на эффективность доставки, которые были идентифицированы (см., например, пример 2 выше), могут включать скорость клеток, размеры сужения и количество сужений (тем самым, изменяя уровни сдвига и сдавления в отношении клеток). Например, эффективность доставки не проходящих через мембрану меченных pacific blue молекул декстрана массой 3 кДа в живые клетки HeLa увеличивается монотонно с увеличением скорости клеток через различные конструкции сужения (например, фиг. 25 на 2500). Размеры сужения также влияют на доставку; увеличение длины сужения от 20 мкм до 40 мкм практически удваивало эффективность доставки при всех рабочих скоростях (например, фиг. 25 на 2500), с минимальным эффектом на жизнеспособность (например, фиг. 25 на 2510). Уменьшение ширины сужения имело сходный эффект. Увеличение количества сужений последовательно также увеличивало эффективность доставки, так что устройство с пятью сужениями длиной 10 мкм последовательно превосходило конструкции с одним сужением длиной 10 мкм, 20 мкм или 40 мкм при всех скоростях клеток (например, фиг. 25 на 2500 и 2510). В этих данных точки данных 0 мм/с соответствуют контрольному случаю, где клетки претерпевают ту же обработку, что и другие образцы, но их не пропускают через устройство, и, таким образом, они отражают любые эффекты эндоцитоза и поверхностного связывания.
Для исследования универсальности способа оценивали его способность доставлять модельные молекулы декстрана в несколько типов клеток, которые традиционно трудно трансфицировать, особенно иммунные клетки и стволовые клетки. Для этих экспериментов использовали флуоресцентно меченный декстран массой 70 кДа и 3 кДа, поскольку эти типы декстрана имеют сходный размер с многими молекулами белков и миРНК, соответственно, их легко обнаруживать посредством проточной цитометрии, и они имеют минимальные эффекты поверхностного связывания, поскольку они отрицательно заряжены.
На фиг. 30 проиллюстрирована применимость настоящего изобретения для различных типов клеток. На 3000 показана эффективность доставки и жизнеспособность клеток NuFF, обработанных с помощью устройства 30 мкм-6 мкм для доставки декстрана массой 3 кДа и 70 кДа. На 3010 представлена эффективность доставки и жизнеспособность выделенных из селезенки дендритных клеток мыши, обработанных с помощью устройства 10 мкм-4 мкм, для доставки декстрана массой 3 кДа и 70 кДа. На 3020 представлена эффективность доставки и жизнеспособность эмбриональных стволовых клеток мыши, обработанных с помощью устройства 10 мкм-6 мкм, для доставки декстрана массой 3 кДа и 70 кДа. На 3030 представлена эффективность доставки декстрана массой 3 кДа и на 3040 представлена эффективность доставки декстрана массой 70 кДа в B-клетки (CD19+), T-клетки (TCR-B+) и макрофаги (CD11b), выделенные из цельной крови мыши посредством центрифугирования и обработанные с помощью устройств 30 мкм-5 мкм и 30 мкм-5 мкм-x5 при 1000 мм/с. Декстран массой 3 кДа и 70 кДа метили посредством pacific blue и флуоресцеина, соответственно. Все точки данных анализировали в трех экземплярах и планки погрешности соответствуют двум стандартным отклонениям.
С использованием различных конструкций устройства молекулы декстрана доставляли в фибробласты крайней плоти новорожденного человека (NuFF) (3000), первичные дендритные клетки мыши (3010) и эмбриональные стволовые клетки (3020). Эти эксперименты обеспечили минимальную утрату (<25%) жизнеспособности клеток (3000, 3010 и 3020) и результаты для эмбриональных стволовых клеток мыши указывают на то, что этот способ не индуцирует дифференцировку. В следующих исследованиях лейкоциты (лейкоцитарная пленка) выделяли из крови мыши центрифугированием и обрабатывали их с помощью устройства. B-клетки, T-клетки и макрофаги, различаемые с помощью окрашивания антителами, показали успешную доставку декстрана массой как 3 кДа, так и 70 (3030 и 3040).
Для иллюстрации потенциала настоящего изобретения в отношении решения имеющихся в настоящее время проблем доставки, проводили ряд экспериментов с возможными применениями в диапазоне от перепрограммирования клеток до сенсорного обнаружения с помощью углеродных нанотрубок. В дополнение к применению конкретных материалов, подробно описанных ниже, настоящее изобретение продемонстрировало успешную доставку различных исследуемых грузов, таких как аполипопротеин E, бычий сывороточный альбумин и GFP-плазмиды.
На фиг. 31 проиллюстрированы данные доставки наноматериалов и антитела. На 3100 представлена эффективность доставки и жизнеспособность клеток HeLa, обработанных с помощью устройства 10 мкм-6 мкм-x5 в отношении доставки меченного pacific blue декстрана массой 3 кДа и меченных Cy5 заключенных в ДНК углеродных нанотрубок. На 3110 представлены светлопольные изображения клеток, на которые наложено рассеяние Рамана в G-полосе (красный) для указания на доставку углеродных нанотрубок в обработанные клетки (слева) против эндоцитоза (справа). Масштабные метки соответствуют 2 мкм. На 3120 представлена флуоресцентная микрофотография клетки HeLa через 18 ч после доставки меченного pacific blue декстрана массой 3 кДа (средняя панель) и антител к тубулину с меткой Alexa Fluor 488 (правая панель). Масштабные метки соответствуют 3 мкм. На 3130 представлена эффективность доставки и жизнеспособность клеток HeLa, обработанных с помощью устройства 10 мкм-6 мкм-x5, при 500 мм/с, для доставки меченных Alexa Fluor 488 антител против тубулина. Эффективность доставки при различных концентрациях антитела сравнивают с контролем с эндоцитозом при 100 мкг/мл и необработанными клетками.
Подтверждение успешной доставки углеродных нанотрубок (инкапсулированных в олигонуклеотид ДНК) осуществляли посредством проточной цитометрии (3100) и спектрокскопии Рамана (3110). Также с использованием этого способа доставляли антитела к тубулину (3120 и 3130), обеспечивая диффузное распределение в клетке, которое согласуется с доставкой в цитозоль. Упомянутые выше материалы в настоящее время трудно доставить в цитозоль клетки и каждый материал часто требует специализированной модификации для облегчения доставки. В примере 3 все четыре материала доставляли в клетки HeLa с использованием одного и того же набора условий в устройстве 10 мкм-6 мкм-x5.
Эффективная доставка белков в первичные клетки может обеспечить несколько терапевтических применений. Проблемой перепрограммирования клеток, например, является неэффективность предшествующих способов доставки на основе CPP. На фиг. 32 проиллюстрированы применения для доставки белков. На 3200 представлен анализ с использованием вестерн-блоттинга доставки c-Myc, Klf-4, Oct-4 и Sox-2 посредством проникающих в клетку пептидов против доставки с помощью устройства 10 мкм-6 мкм в клетки NuFF. Каждый из четырех белков имеет дополнительные 9 групп аргинина (9R) для облегчения захвата. Столбцы лизата (Ly) соответствуют содержанию белка в клетках, которые промывали и лизировали, в то время как столбцы среды соответствуют содержанию белка в среде. На 3210 представлена эффективность доставки и жизнеспособность для выделенных из селезенки дендритных клеток, обработанных с помощью устройства 10 мкм-4 мкм, для доставки меченного pacific blue декстрана массой 3 кДа и меченного Alexa Fluor 488 овальбумина. Все точки данных анализировали в трех экземплярах и планки погрешностей соответствуют двум стандартным отклонениям.
Возможность доставлять четыре иллюстративных фактора транскрипции (Oct4, Sox2, c-Myc и Klf-4) в фибробластные клетки человека исследовали и сравнивали со способом CPP (3200). Результаты показывают, что в дополнение к тому, что доставка посредством быстрой механической деформации не основана на эндоцитозе, который может оставлять большое количество материала в эндосомах, она обеспечивает значительно более высокую эффективность доставки всех 4 белков. Этот результат согласуется с упомянутым выше моделированием, которое показало, что настоящее изобретение может иметь улучшение доставки белка относительно CPP в 10-100 раз.
Представление антигена в дендритных клетках (DC) представляет собой другую область, в которой настоящее изобретение имеет преимущество. Исследователи исследовали способы экспрессии антигенов на рецепторах MHC класса I DC, чтобы индуцировать мощный ответ цитотоксических T-клеток. Настоящее изобретение, которое имеет прямое клиническое значение для получения вакцин против злокачественной опухоли, например, основано на цитозольной доставке антигенных белков, поскольку представление посредством MHC класса I происходит практически исключительно для цитозольных белков. Способствуя прямой цитозольной доставке материала, настоящее изобретение служит в качестве платформы для достижения ответа цитотоксических T-клеток in vivo против конкретного антигена. Для иллюстрации этой способности меченный Alexa 488 овальбумин, модельный антигенный белок, успешно доставляли в дендритные клетки мыши, происходящие из селезенки (3210). Несмотря на более высокий уровень эндоцитоза в этом типе клеток, устройство обеспечивало значительное увеличение скоростей доставки относительно контролей с эндоцитозом (0 мм/с). Более того, доставляемый материал находится в цитоплазме вследствие механизма деформации клеток. Этот признак является особенно важным для доставки антигена, поскольку цитоплазматиическое воздействие является критическим требованием для представления антигенов MHC класса I.
Система примера 3 представляет собой полезный исследовательский инструмент, способный доставлять углеродные нанотрубки, золотые наночастицы и антитела (фиг. 31) - три материала, которые трудно доставлять с помощью современных способов. Настоящее изобретение значительно расширяет возможность исследовать внутриклеточные процессы, облегчая окрашивание антителами и квантовыми точками структур/белков живых клеток и обеспечивая применение углеродных нанотрубок в качестве цитозольного молекулярного зонда или химического сенсора. В качестве надежного способа доставки белков, его можно использовать для высокопроизводительного скрининга библиотек пептидов/белков, поскольку, в отличие от большинства способов на основе CPP или наночастиц, этот способ является нечувствительным к структуре и химии белков, не основан на каскадах эндоцитоза и не влияет на функциональность белков.
Кроме того, настоящее изобретение является пригодным для терапии (фиг. 32). Например, клетки-мишени пациента выделяют из крови или другой ткани, обрабатывают с помощью устройства для доставки желаемого терапевтического средства, и повторно вводят в организм. Такой подход имеет преимущество увеличенной эффективности доставки терапевтических макромолекул и является более безопасным, чем существующие способы, поскольку он устраняет потребность в потенциально токсичных векторных частицах и устраняет какие-либо потенциальные побочные эффекты, ассоциированные с ретикулоэндотелиальным выведением и нецелевой доставкой.
Пример 4 - Персонализированная вакцинация против злокачественной опухоли
Современные проблемы внутриклеточной доставки макромолекул являются существенным препятствием для лучшего понимания механизмов заболевания и внедрения новых терапевтических подходов. Несмотря на последние достижения в технологии доставки, обработка полученных от пациента клеток остается проблемой, и современные способы часто основаны на токсических электрических полях или эндогенных материалах. Микрожидкостная платформа и сходные системы и способы основаны на механической деформации клеток для облегчения доставки. Этот контролируемый физический подход обеспечивает результаты в областях, которые ранее были трудными, таких как перепрограммирование клеток с помощью белков и доставка квантовых точек.
Наиболее эффективным и прямым способом для влияния на поведение клетки является доставка активных веществ в цитоплазму клеток. Таким образом, внутриклеточная доставка макромолекул играет важную роль в исследовании и разработке (R&D), причем применения варьируют от разработки лекарственных средств до исследования биохимических процессов для терапевтических применений. Однако современные способы имеют ограничения. Они часто имеют низкую эффективность в полученных от пациента (первичных) клетках, основаны на токсичных электрических полях или экзогенных материалах, и непригодны для доставки структурно разнообразных материалов, таких как белки.
Надежная платформа для доставки, способная решать эти проблемы, обеспечивает значительные достижения в биологических исследованиях и служит в качестве основы для нового поколения лекарственных средств, таких как персонализированная вакцинация против злокачественной опухоли. Эффективный способ доставки белков в иммунные клетки, например, может служить в качестве платформы для вакцинации против злокачественной опухоли.
Как описано выше, микрожидкостные устройства, сходные системы и способы, описанные в настоящем описании, облегчают внутриклеточную доставку материала посредством быстрой деформации клетки по мере того, как она проходит через сужение. Процесс деформации вызывает временное нарушение клеточной мембраны и тем самым обеспечивает пассивную диффузию материала из окружающего буфера в цитозоль клетки. Посредством устранения потребности в экзогенных материалах и электрических полях, на которых основаны современные способы, этот подход обеспечивает упрощенный надежный подход для доставки со сниженной токсичностью. Таким образом, этот способ может служить в качестве широкой платформы для внутриклеточной доставки макромолекул с преимуществами в некоторых исследовательских и клинических применениях, таких как вакцинация против злокачественной опухоли.
На фиг. 34 представлена иллюстрация, на которой изображена система, в которой кровь пациента обрабатывают с помощью микрожидкостного устройства для доставки макромолекул. Один вариант осуществления настоящего изобретения включает систему, в которой дендритные клетки (DC), выделенные из крови пациента, обрабатывают с помощью устройства ex vivo для активации их против конкретного антигена злокачественной опухоли, а затем вновь вводят в кровоток пациента. Например, доставленный антиген представляет собой часто экспрессируемый белок, о котором известно, что он ассоциирован с конкретным заболеванием, или белок, специфический для пациента, полученный при биопсии. Посредством доставки антигенов злокачественной опухоли прямо в цитоплазму DC можно исследовать каскад представления антигена MHC-I и индуцировать мощный ответ цитотоксических T-лимфоцитов (CTL) у пациента. Затем эти активированные T-клетки находят и уничтожают любые злокачественные клетки, которые экспрессируют антиген-мишень. Универсальность платформы в отношении использования общепризнанных специфических антигенов заболевания или антигенов, происходящих непосредственно из опухоли пациента, позволяют лечить пациентов, которые являются устойчивыми к другим способам терапии. Действительно, это обеспечивает персонализированный направленный ответ против заболевания с минимальными побочными эффектами. Этот вариант осуществления может осуществлять обученный технический специалист в типичной больничной лаборатории (<1 ч на обработку). Вследствие малого размера и относительной простоты также можно использовать управляемую пациентом систему лечения.
Способ для вакцин против злокачественной опухоли был продемонстрирован в модели на мышах. Эту систему использовали для успешной доставки и обработки овальбумина, являющегося модельным антигенам, в дендритные клетки мыши, на которую указывает увеличенное представление антигена, пептида SIINFEKL, на рецепторах MHC класса I. Эти обработанные дендритные клетки стимулируют пролиферативный ответ цитотоксических T-лимфоцитов (CTL) in vitro. Обработанные DC вновь вводят животному для получения ответа CTL in vivo. Устройства являются пригодными для доставки антигенов в DC, выделенные из крови человека.
Данные указывают на то, что устройство способно доставлять материал в чувствительные первичные клетки (включая DC), не вызывая чрезмерной гибели клеток. Таким образом, повреждение клеток не является серьезной проблемой. Иммунный ответ может быть усилен посредством увеличения количества обработанных клеток, увеличения количества и разнообразия доставляемого антигена и/или совместной доставки активирующих факторов, таких как липополисахарид. В случае клеток, обработанных с помощью устройства, наблюдали небольшую токсичность или отсутствие токсичности, что, таким образом, делает способы не только осуществимыми, но также преимущественными для терапевтических применений у человека и ветеринарных применений.
Пример 5 - Лечение злокачественной опухоли крови
Как описано в примере 4, быстрая механическая деформация клеток может обеспечить надежное средство для доставки антигенов в дендритные клетки (DC) и, таким образом, может быть платформой для клеточной терапии. Эта система основана на открытии, что быстрая механическая деформация клеток может обеспечить образование временных пор в мембране, которые обеспечивают диффузионную доставку материала из окружающей среды. В отличие от существующих способов терапии, описанных ранее, этот способ не основан на специализированных механизмах слитых белков, перекрестном представлении антигена, вирусных векторах, наночастицах или механизмах эндоцитоза; таким образом, он обеспечивает значительное увеличение эффективности in vivo при снижении расходов на терапию. Универсальность и простота этого фундаментально отличающегося подхода обеспечивает широкую платформу для активации дендритных клеток, которые могут индуцировать ответ CD8 против различных антигенов злокачественной опухоли. Система может быть нацелена на злокачественные опухоли крови, такие как B-клеточная лимфома, которые являются более восприимчивыми к иммунной терапии, а также несколько дополнительных типов злокачественной опухоли (например, меланома, рак поджелудочной железы, и т.д.) и обеспечивает актуальный персонализированный новых подход для борьбы с заболеванием.
Клеточная терапия злокачественной опухоли является привлекательной возможностью вследствие ее способности активировать иммунную систему пациента и запускать длительный антигенспецифический ответ CD8 T-клеток против заболевания. Эти способы терапии, такие как недавно одобренная Provenge® для рака предстательной железы, имеют минимальные побочные эффекты относительно химиотерапии и лучевой терапии. Однако одним из наибольших препятствий для разработки клеточной терапии является достижение надлежащего представления антигенов посредством доставки антигенов в цитоплазму клеток.
Традиционно, активация эффекторного ответа CD8 отличается от ответа CD4 положением чужеродного белка, входящего в антигенпредставляющую клетку (например, дендритную клетку). Белки, находящиеся в цитоплазме, индуцируют ответ CD8, в то время как внеклеточные белки, уловленные посредством эндоцитоза, индуцируют ответ CD4. Поскольку механизм перекрестного представления в антигенпредставляющих клетках остается неясным, необходимо разработать надежный способ доставки желаемого антигена прямо в цитоплазму клетки для обеспечения терапии с использованием мощного ответа цитотоксических эффекторов CD8. Надежный эффективный способ цитоплазматической доставки в дендритные клетки используют в качестве платформы для индукции иммунных ответов против различных типов злокачественной опухоли.
Эксперименты на клетках HeLa, проиллюстрированные на фиг. 8A и фиг. 11, показали, что быстрая механическая деформация клеток приводит к образованию временных повреждений/пор в клеточной мембране, которые обеспечивают пассивную диффузию материала из окружающего буфера в цитоплазму клеток. Это ранее не описанное явление продуцирует клетки, которые являются жизнеспособными и нормально пролиферируют после лечения. Эксперименты показали, что более крупные молекулы проявляют более низкие уровни доставки, чем меньшие молекулы, тем самым указывая на диффузионный механизм. Успешная доставка миРНК и диффузное окрашивание цитозоля, определяемые с помощью конфокальной микроскопии, также указывают на то, что доставляемые материалы располагаются в цитозоле и находятся в активном/доступном состоянии. Традиционно, способы доставки антигена часто оказываются перспективными в клеточных линиях, но не переносятся на первичные иммунные клетки. Однако способ доставки, описанный в настоящем описании, является независимым от каскадов эндоцитоза или клеточного ответа на экзогенные материалы, которые могут значительно варьировать среди типов клеток, и основан в основном на свойствах бислоя мембраны. Таким образом, благодаря простоте и новому пути, эта технология является более подверженной переходу с доставки в клеточную линию на доставку в первичные иммунные клетки и, таким образом, обеспечивает значительное улучшение представления антигена.
Представление антигенов MHC класса I и созревание дендритных клеток можно анализировать с помощью окрашивания антителом в ответ на доставку белка овальбумина. T-клетки, полученные от трансгенных мышей OT-I и OT-II TCR, также можно использовать для определения пролиферации CD8 и CD4 в ответ на нагрузку антигеном овальбумином и/или SIINFEKL. Систему можно оптимизировать для увеличенной пролиферации CD8 по сравнению с дендритными клетками, стимулированными посредством эндоцитоза отдельно.
Первичные дендритные клетки мыши очищают посредством выделения MACS CD11c+ (Miltenyi Biotec, Германия) из селезенок мышей B6. Можно использовать устройство, которое содержит сужения с шириной канала 6 мкм, способное образовывать 13-мкм поры в мембране клеток HeLa. Вследствие меньшего размера этих дендритных клеток, можно проводить микрообработку и исследование устройства с шириной канала 3-5 мкм. Существующие протоколы фотолитографии и глубокого реактивного ионного травления можно модифицировать для обеспечения эффективного изготовления этих устройств. Флуоресцентно меченные молекулы декстрана можно использовать в качестве модельных молекул для оценки эффективности доставки посредством FACS. Затем белок овальбумин можно доставлять в клетки и оценивать с помощью вестерн-блоттинга для подтверждения захвата белка в первичные клетки.
Созревание дендритных клеток можно исследовать с помощью окрашивания антителами против CD80 и CD86, чтобы показать, что способ быстрой деформации индуцирует созревание клеток. Использование внеклеточных агонистов TLR, таких как липополисахарид (LPS), можно рассматривать, если считается необходимым вручную индуцировать созревание DC после доставки. Белок овальбумин можно доставлять в дендритные клетки и представление антигена можно количественно определять с помощью антител против MHC-I-SIINFEKL. Кроме того, можно оценивать эффективность представления антигена в ответ на доставку специфичных к TCR пептидов, чтобы показать способность системы доставлять/представлять антигенные белки против пептидов. Затем CD8 и CD4 T-клетки можно собирать из трансгенных по TCR мышей OT-I и OT-II, соответственно, окрашивать посредством CFSE, и кокультивировать с обработанными овальбумином дендритными клетками в течение 5 суток. Пролиферацию T-клеток обеих подгрупп можно измерять посредством FACS. Конструкцию устройства можно оптимизировать для получения увеличенных уровней популяций функциональных CD8 T-клеток по сравнению с общепринятыми способами in vitro (например, эндоцитоз).
Универсальная способность индуцировать антигенспецифические ответы CD8 является целью терапии злокачественной опухоли, которая являлась недостижимой до настоящего времени вследствие неэффективного представления антигена и недостаточной приспосабливаемости способа доставки. Существующие способы имеют ряд недостатков, включая их зависимости от повреждающих электрических полей, использования экзогенных материалов, модификации белковой последовательности и/или каскадов эндоцитоза для облегчения доставки антигена. Однако настоящее изобретение обеспечивает фундаментально отличающийся подход цитозольной доставки, который не обладает ни одной из упомянутых выше проблем. Более того, вследствие природы его механизма образования пор-диффузии, этот способ широко применим среди различных типов антигенов и, таким образом, он может быть направлен на ряд злокачественных опухолей-мишеней. Этот механизм можно даже использовать для введения дополнительных молекул передачи сигнала в целях повышения созревания/активации DC для достижения более мощного ответа T-клеток. Такая широкая платформа является более универсальной и надежной, чем любые из существующих механизмов доставки/представления антигена, исследуемых для вакцин против злокачественной опухоли.
Пример 5 может иметь широкое применение. Учитывая огромное социальное бремя злокачественной опухоли в стране (согласно оценкам, 570000 смертей в США в 2011 году); злокачественная опухоль может поразить значительную часть популяции. Для популяции заболевших людей является преимущественной разработка новых клеточных способов терапии, которые приспособят мощь иммунной системы пациента для борьбы с заболеванием. Настоящее изобретение является более эффективной персонализированной платформой для лечения различных типов злокачественных опухолей, таких как злокачественные опухоли крови, например, лейкозы, лимфомы и множественные миеломы, а также миелопролиферативные новообразования и миелодиспластические синдромы. Способы также особенно пригодны для лечения метастатических злокачественных опухолей, например, вследствие их склонности к распространению через кровоток. Например, злокачественные опухоли с неизвестным антигенным эпитопом можно лечить посредством расщепления образца биоптата опухоли, доставки лизата в DC пациента, и повторного введения DC в организм. Это может обеспечить активацию T-клеток хозяина против широкого диапазона антигенов злокачественной опухоли, тем самым обеспечивая эффективное лечение, направленное против множества мишеней. Этот персонализированный аспект может представлять особый интерес для людей, у которых могут развиться редкие формы злокачественной опухоли, часто не излечимые современными способами лечениям, вследствие воздействия неблагоприятных условий внешней среды. Посредством адаптации лечения к индивидуальному заболеванию, этот способ может обеспечить своевременный эффективный уход даже в наиболее агрессивных случаях, таких как злокачественные опухоли с множественной устойчивостью к лекарственным средствам. Эта терапия на основе иммунитета также, в частности, может быть эффективной для профилактики метастазов (ответственных за ~90% смертей, связанных со злокачественной опухолью), поскольку CD8 T-клетки могут без труда находить и уничтожать метастатические клетки, в то время как иммунологическая память, обеспечиваемая этими способами лечения, может предотвратить рецидив в будущем. Кроме того, в качестве исследовательского инструмента этот способ может обеспечить беспрецедентные механистические исследования процессинга антигена для лучшего понимания процессов перекрестного представления антигенов и, таким образом, увеличения эффективности существующих/альтернативных способов активации иммунной системы.
Пример 6 - Перепрограммирование клеток
Стволовые клетки играют важную роль в современных исследованиях в области регенеративной медицины, особенно в быстро расширяющейся области инженерии тканей. iPSC представляют особый интерес вследствие их способности к самообновлению, продемонстрированной способности к дифференцировке в любой тип клеток и аутологичных (специфических для пациента) характеристик. Таким образом, iPSC обеспечивают возможность получать клетки-предшественники множества ростков из общего плюрипотентного источника, которые могут быть объединены в различные, но, тем не менее, взаимодействующие тканевые компартменты. Более того, эти клетки в конечном итоге могут устранить необходимость в эмбриональных стволовых клетках человека (hESC) в клинических применениях, таким образом, позволяя избегать множества моральных и этических споров, которые связаны с этими типами клеток. Более того, происходящие из пациента iPSC устраняют или минимизируют проблемы иммунного отторжения происходящих из hESC клеток. Таким образом, современные исследования в значительной степени сфокусированы на разработке эффективных безвирусных протоколов для получения больших количеств iPSC.
iPSC первоначально были получены посредством перепрограммирования фибробластов взрослых мышей и человека (HF) в плюрипотентное состояние на основе ретровирусной сверхэкспрессии 4 факторов транскрипции Oct 3/4, Sox2, c-Myc и Klf4. Эти iPSC не только в значительной степени идентичны клеткам ES в отношении общей экспрессии генов, метилирования ДНК и модификации гистонов, но также они способны дифференцироваться в типы клеток, соответствующие всем 3 зародышевым слоям. В то время как технология iPSC имеет огромный потенциал для биомедицинского исследования и клеточной терапии, для реализации ее полного потенциала необходимо преодолеть значительные препятствия. Например, большинство линий iPSC происходят из различных соматических клеток вследствие ретровирусного или лентивирусного введения генов, кодирующих факторы перепрограммирования, что приводит к множественным хромосомным нарушениям вследствие встраивания вируса, любое из которых может вызывать генетическую дисфункцию и/или опухоль. Кроме того, перепрограммирующие трансгены (в частности, c-Myc и Klf4) тесно ассоциированы с онкогенезом, повышая вероятность того, что его остаточная экспрессия и/или реактивация могут вызвать образование опухоли. Таким образом, во многих лабораториях недавно исследовали различные подходы без встраивания в геном, такие как аденовирусы, эписомальные векторы, мРНК и микроРНК. Примечательно, что было показано, что iPSC можно получать посредством прямой доставки четырех факторов перепрограммирования (Oct 3/4, Sox2, c-Myc и Klf4), слитых с проникающими в клетку пептидами (CPP). В то время как было описано, что получение iPSC мыши можно осуществлять посредством доставки четырех слитых с CPP факторов, экспрессируемых в E. coli, может быть показано, что iPSC человека можно получать посредством четырех слитых с CPP факторов, экспрессируемых в клетках млекопитающих. Однако в обоих исследованиях сообщалось, что эффективность перепрограммирования в случае перепрограммирования на основе белков является очень низкой (<0,01%). Поскольку перепрограммирование на основе белков не вовлекает никакой тип генетического материала (ДНК или РНК) и векторного носителя (вирус или плазмида), прямая доставка белков обеспечивает одну из наиболее безопасных методик перепрограммирования. Показано, что iPSC человека на основе белков эффективно формировали функциональные дофаминовые нейроны без аномальных свойств, ассоциированных с встраиванием вируса в геном. Поскольку эффективность перепрограммирования на основе белков может быть повышена с помощью настоящего изобретения с использованием технологии платформы для доставки, она открывает широкую возможность для получения клинически ценных клеток iPS. Более того, этот подход обеспечивает линейный уровень контроля над клеточной функцией вследствие избегания стохастических процессов, которые управляют трансляцией и/или транскрипцией при перепрограммировании с помощью мРНК, плазмиды и вируса. Таким образом, прямая доставка белка обеспечивает два фундаментальных преимущества над альтернативными способами: устранение риска мутагенного встраивания и обеспечение более точного контроля высокочувствительных процессов перепрограммирования. Технология доставки, описанная в настоящем описании, продемонстрировала ее способность доставлять белки с высокой эффективностью в HF и стволовые клетки. Эксперименты, сравнивающие способности этого способа к доставке с существующими методологиями с проникающими пептидами показали значительное увеличение доставки с использованием этого подхода (увеличение потенциально в 100 раз на основе моделирования). Более того, его физический механизм образования пор устраняет потребность в химической модификации или использовании экзогенных соединений, которые вовлечены в альтернативные способы доставки белка. Низкомолекулярные соединения, миРНК и другие факторы также можно совместно доставлять в процессе перепрограммирования, поскольку способ является агностическим к типу доставляемого материала. Таким образом, эта система обеспечивает уникальный инструмент для индукции перепрограммирования клеток через прямую доставку белка. Этот простой механизм действия (т.е. диффузия через поры) также позволяет потенциально прогнозировать и контролировать доставляемые количества с высокой точностью, таким образом, облегчая исследования по оптимизации для увеличения понимания динамики перепрограммирования и тем самым значительного увеличения эффективности. Наконец, можно использовать этот микрожидкостный способ в качестве медицинского устройства для получения iPSC для клинической модификации тканей и применений в клеточной терапии.
Более того, применения этой системы не ограничены доставкой белков. Этот способ может быть включен в универсальный способ доставки, способный доставлять ряд макромолекул (ДНК, РНК, белки, сахара и пептиды) практически в любой тип клеток. Это обеспечивает реципиентов для применений, для которых современные технологии являются недостаточными. Современные способы на основе липосом, наночастиц и электропорации, например, часто не могут трансфицировать определенные первичные клетки (такие как иммунные клетки или стволовые клетки) и могут быть неэффективными в отношении доставки белков и наночастиц (таких как квантовые точки). Пептидная доставка для терапевтического скрининга и применений на основе механизма заболевания также может быть осуществлена с помощью этого нового способа, в то время как современные способы часто требуют химической модификации или инкапсулирования. Также можно использовать этот способ для применений в сенсорном обнаружении на основе наночастиц для доставки модифицированных квантовых точек в целях мечения органелл и исследований механизма заболевания.
Внутриклеточная доставка является краеугольным камнем множества биологических научных применений в диапазоне от фундаментальных исследований экспрессии генов до механизмов заболевания и, на что направлена настоящая заявка, получения iPSC. Общепринятые способы доставки, такие как липосомы, полимерные наночастицы и электропорация, часто вовлекают использование экзогенных соединений в качестве носителя для доставки (или электрических полей в случае электропорации) и они являются специфическими для материала и/или клеток. Например, Lipofectamine (Invitrogen) может доставлять молекулы ДНК и РНК (в подгруппы клеточных линий или первичных клеток) но не может образовывать надлежащего комплекса для доставки белков или других макромолекул. Электропорация, с другой стороны, хотя и является перспективной с точки зрения ее способности нацеливаться на различные типы клеток, вызывает повреждения клеток вследствие высоких электрических полей и имеет ограниченный успех в доставке белков. Это делает ее особенно непригодной для множественных трансфекций, требуемых, например, для получения iPSC. Проникающие через мембрану пептиды являются другим способом доставки, которые являются в большой степени специфическими для белков. Эти способы на основе пептидов, однако, обладают непредсказуемыми эффектами на функциональность белка и связаны со значительной деградацией белка в эндосоме. Таким образом, настоящее изобретение, относящееся к универсальному способу, способному доставлять ряд макромолекул (ДНК, РНК, белки, пептиды, низкомолекулярные соединения), при минимальной гибели клеток, обеспечивает беспрецедентный контроль клеточной функции в одной технологической платформе, тем самым позволяя исследовать механизм заболевания, идентифицировать макромолекулярные терапевтические кандидаты, направлять дифференцировку или перепрограммирование стволовых клеток и разрабатывать диагностические способы с репортерными клеточными линиями.
Микрожидкостное устройство, описанное в настоящем описании, может служить в качестве широкой универсальной платформы для доставки. В качестве микрожидкостного устройства оно имеет преимущество точного контроля условий обработки на уровне единичной клетки. Уникальная комбинация контроля на уровне единичной клетки и макромасштабной пропускной способности ставит это устройство в уникальное положение относительно существующих способов доставки. Данные к настоящему времени продемонстрировали способность системы доставлять материал в более чем 11 различных типах клеток, включая злокачественные клеточные линии, эмбриональные стволовые клетки, первичные фибробласты и первичные лимфоциты. Ее механизм механического образования пор также обеспечил доставку прежде проблематичных материалов, таких как углеродные нанотрубки и квантовые точки.
Предшествующая работа с использованием рекомбинантных белков для получения iPSC продемонстрировала чрезмерно низкую эффективность (<0,01%) и тем самым она непригодна для широко распространенного клинического применения. Однако устройство, системы и способы, упомянутые в настоящем описании, продемонстрировали их способность доставлять белки прямо в цитоплазму с высокой эффективностью и минимальной гибелью клеток, таким образом, обеспечивая привлекательную возможность достигнуть существенного увеличения эффективности перепрограммирования посредством более эффективной доставки. Посредством прямого определения количества доступного белка можно осуществлять точный контроль внутриклеточной кинетики. С другой стороны, другие способы перепрограммирования (например, экспрессия с помощью вирусов, плазмид и мРНК) основаны на стохастических эффектах для определения уровня доступности белка и, таким образом, непригодны для исследования кинетики. Низкая эффективность современных методологий перепрограммирования указывает на то, что процесс является в высокой степени чувствительным к стохастическим изменениям и только узкий диапазон уровней экспрессии факторов транскрипции приведет к перепрограммированию. Посредством прямой доставки белков в цитоплазму можно осуществлять беспрецедентный контроль доступности белка и, таким образом, более согласованно применять точные условия, необходимые для перепрограммирования. После идентификации и оптимизации эти условия можно воспроизводить в точности для каждой клетки, подвергающейся обработке, и, таким образом, можно значительно повысить эффективность перепрограммирования.
Этот способ обеспечивает/улучшает различные применения внутриклеточной доставки. Кроме того, строго механическая природа этого способа устраняет какие-либо потенциальные осложнения вследствие применения химических агентов или электрических полей. Данные не показали никаких существенных изменений в поведении клеток в результате обработки. Таким образом, эта система является надежным, высокопроизводительным, высокоэффективным, универсальным механизмом внутриклеточной доставки с конкретной пригодностью в применениях по перепрограммированию.
Данные указывают на то, что быстрая деформация, которая происходит, когда клетка проходит через сужение, индуцирует образование временных пор в клеточной мембране, обеспечивающих диффузию макромолекул из окружающего буфера в цитозоль. Этот способ был продемонстрирован на 11 различных типах клеток, включая злокачественные клеточные линии, первичные фибробласты, первичные лимфоциты и эмбриональные стволовые клетки (не вызывая дифференцировки). Один прототип способен обрабатывать ~20000 клеток/с и действовать при диапазоне концентраций клеток (104-108 клеток/мл). Проблемы, касающиеся закупорки, также были в большой степени устранены посредством усовершенствования экспериментальных протоколов и конструкций чипов, так чтобы каждое устройство было способно обрабатывать ~1 миллион клеток перед закупоркой, с возможностью очистки и повторного использования. Кроме того, многоканальная конструкция обеспечивает значительную избыточность, так что закупорка одного канала не влияет на эффективность других. Обеспечиваемый давлением поток (при контролируемом постоянном давлении) и параллельная конструкция каналов обеспечивает постоянный профиль потока на канал, независимо от процента закупоренных каналов в чипе.
Была продемонстрирована способность устройства доставлять молекулы декстрана в фибробласты и эмбриональные стволовые клетки человека. На фиг. 35 проиллюстрированы потенциальные преимущества перепрограммирования клеток. На 3500 представлена эффективность доставки и жизнеспособность эмбриональных стволовых клеток человека, обработанных с помощью устройства 10 мкм-6 мкм для доставки декстрана массой 3 кДа. На 3510 представлен анализ с использованием вестерн-блоттинга доставки c-Myc, Klf-4, Oct-4 и Sox-2 с помощью проникающих в клетку пептидов против доставки с помощью устройства 10 мкм-6 мкм в клетки NuFF. Столбцы лизата (Ly) соответствуют содержанию белка в клетках, которые промывали и лизировали, в то время как столбцы среды соответствуют содержанию белка в среде. На 3520 представлены изображения конфокальной микроскопии клеток NuFF, фиксированных после доставки перепрограммирующих факторов. Белки мечены с использованием конъюгированного с Alexa 488 антитела против FLAG и ядра окрашены DAPI.
Более того, эффективность доставки с помощью устройств сравнивали с эффективностью доставки способа с 9 остатками аргинина (CPP), в настоящее время используемого для перепрограммирования на основе белков. Результаты (3510) продемонстрировали значительное увеличение количества доставляемых c-Myc, Klf4, Oct4 и Sox2 при измерении с помощью вестерн-блоттинга. Затем с помощью конфокальной микроскопии была подтверждена успешная локализация этих факторов транскрипции в ядре клетки (3520). Была разработана простая 2-D-модель диффузии в COMSOL для моделирования механизма доставки на основе литературных величин диффузионной способности частиц внутрь цитоплазмы клеток и наружу. Посредством аппроксимации этой модели к экспериментальным данным, может быть оценено, что способ доставляет 10-40% доставляемого материала, присутствующего в буфере, в цитозоль клеток. Посредством сравнения оценено, что способы CPP для доставки белка доставляют только 0,1% материала буфера в цитозоль. Таким образом, этот подход обеспечивает надежное увеличение количества доставляемого перепрограммирующего материала (в 10-100 раз). Более того, он обеспечивает более высокую биодоступность доставляемых факторов транскрипции.
На фиг. 36 представлено получение и охарактеризация линий iPSC мыши и человека посредством прямой доставки слитых перепрограммирующих белков. На 3600 представлена исходная культура гепатоцитов мыши (первое изображение); морфология после 6 циклов обработки белком (второе изображение); установившиеся колонии iPS (третье изображение); и окрашивание посредством AP установившихся колоний iPS (четвертое изображение). На 3610 представлено иммунное окрашивание маркеров ESC (Nanog, Oct4 и SSEA1) в p-miPSC. Ядра окрашивали посредством DAPI (синий). На 3620 анализ секвенирования с бисульфитом промотора Oct4 демонстрирует практически полное эпигенетическое перепрограммирование в линиях p-miPSC-1 и p-miPSC-2. Незакрашенные и закрашенные круги указывают на метилированные и метилированные CpG, соответственно. На 3630 потенциал к дифферецнировке in vivo анализировали посредством инъекции p-miPSCs иммунодефицитным мышам и посредством окрашивания с помощью H&E тератом. Полученные тератомы содержали ткани, соответствующие все три зародышевых слоя; клетки ростка эктодермы (невральная трубка или эпидермис), мезодермы (хрящи или мышцы) и эндодермы (дыхательный эпителий или подобный кишечному эпителий). На 3640 химеры, происходящие из p-miPSC-1 (левая панель) и p-miPSC-2 (правая панель), плода на E13.5 демонстрирует высокий уровень GFP из инъецированного p-miPSCs. На 3650-3670, линии iPSC человека, p-hiPSC-01 (3660) и p-hiPSC-02 (3670) получают посредством прямой доставки слитых с CPP четырех перепрограммирующих факторов из полученных биопсией фибробластов взрослого человека (3650).
На фиг. 37 представлены предварительные результаты перепрограммирования с помощью белков. На 3700 представлено прогрессирование морфологических изменений из фибробластов в колонии. Белыми стрелками указаны потенциальные перепрограмированные клетки. Красная стрелка указывает на коалесцирующие iPSC, образующие колонию. На 3710-3760 представлена экспрессия маркеров эмбриональных стволовых клеток человека: Oct4, SSEA-4, Tra-60, Tra-80, щелочная фосфатаза (AP) в колониях iPSC. В соответствующих случаях небольшой прямоугольник соответствует контрастной окраске DAPI. Масштабные метки соответствуют 100 мкм.
Поскольку iPSC человека были получены на основе белков и охарактеризованы, далее получали полностью перепрограммированные iPSC мыши и человека с помощью предшествующего способа доставки слитых с CPP перепрограммирующих факторов, как исследовали с помощью всех критериев, включающих эпигенетический анализ, плюрипотентность in vivo и образование химеры (фиг. 36). Однако, несмотря на применение частично очищенных белков эффективность перепрограммирования все еще была низкой (<0,1%) и отнимала больше времени, чем способы перепрограммирования с помощью вирусов. Таким образом, была предпринята попытка использовать устройство для доставки 4 перепрограммирующих белков: Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc в фибробласты человека при концентрации буфера 80 мкг/мл. Клетки обрабатывали 4 раза с интервалом 48 ч между доставками в каждом случае. После 14-20 суток в культуре появлялись первые перепрограммированные hiPSC-подобные колонии. В это время наблюдали изменение морфологии фибробластов, поскольку они образовывали колонии iPSC и они экспрессировали несколько маркеров hESC (фиг. 37).
Клатрин, кавеолы и макропиноцитоз являются тремя наиболее часто предполагаемыми механизмами интернализации посредством эндоцитоза. Для исследования того, вовлечен ли эндоцитоз в макромолекуляную доставку после быстрой деформации клеток, можно использовать известные химические реагенты для блокирования этих механизмов. В частности, хлорпромазин можно использовать для ингибирования опосредуемого клатрином эндоцитоза; генистеин можно использовать для ингибирования опосредуемого кавеолами эндоцитоза; и 5-(N-этил-N-изопропил)амиролид (EIPA) можно использовать для ингибирования макропиноцитоза (все из них можно приобретать от Sigma Aldrich). Клетки HeLa можно инкубировать с хлорпромазином (10 мкл/мл), генистеином (200 мкМ) и EIPA (25 мкМ) в течение 2 часов перед обработкой. Затем можно доставлять декстран, белки dsRED и dsRED-9R посредством быстрой деформации обработанных клеток. Соответствующая эффективность доставки при измерении посредством FACS может проиллюстрировать влияние ингибирования эндоцитоза на механизмы доставки как с помощью CPP, так и с помощью устройства. Эксперименты по колокализации с маркерами эндосом (Invitrogen) с использованием конфокальной микроскопии также могут помочь определить процент материала, который изолирован в эндосомах.
Является возможным сопряжение системы быстрой деформации клеток с другими общепринятыми способами доставки, такими как электропорация, для устранения механизмов эндоцитоза. Включение электродов вблизи сужения может обеспечить сопряжение деформации и электропорации для достижения эффектов доставки, обеспечивающих усиленную эффективность системы относительно каждого способа отдельно. Кроме того, совместная доставка химических веществ, таких как хлороквин (Sigma), различные полимеры или обеспечивающие просачивание из эндосом пептиды, можно использовать для обеспечения ускользания от эндосом доставляемых материалов в системе быстрой деформации клеток.
По мере прохождения клетки через сужение, она подвергается кратковременному (~10-100 мкс), но быстрому сдвигу или сдавлению. Ранее было оказано, что тангенциальный сдвиг индуцирует образование пор. Однако система также индуцирует механическое сдавление. Для оценки этих параметров, клетки HeLa и HF можно инкубировать в 0,1 мкг/мл лантрункулина A (Invitrogen) в течение 1 часа перед доставкой для деполимеризации актинового цитоскелета. Затем в популяцию обработанных клеток можно доставлять флуоресцентно меченный декстран (Invitrogen) с использованием устройства для быстрой деформации. Эти эксперименты также можно повторять с клетками, которые инкубируют в 10 мкМ колхицине (Sigma) в течение 2 часов перед доставкой для деполимеризации сети микротрубочек. Для измерения эффективности доставки обработанных токсином клеток относительно необработанных клеток можно использовать анализ FACS. Полагают, что образование пор коррелирует со скоростью деформации клетки в ответ на данную геометрию. Роль цитоскелета в ограничении деформации ранее исследовали с использованием устройства, которое исследует способность клетки к деформации, для получения количественных показателей уровней деформации. В этом способе электроды помещают на любую сторону сужения и измеряют изменение емкости между двумя электродами по мере прохождения клетки. Затем изменения емкости в сужении сопоставляют с времени прохождения клетки, т.е. ее состоянием деформации. Эффективность доставки устройством в упомянутых выше экспериментах можно сопоставить с этими предшествующими исследованиями деформации, чтобы получить количественную взаимосвязь между уровнем деформации и эффективностью образования пор.
Аналогично опубликованным исследованиям, характеризующим образование пор под действием ультразвука, можно использовать способы сканирующей электронной микроскопии (SEM) и трансмиссионной электронной микроскопии (TEM) на образцах, фиксированных при определенных временных интервалах после обработки для прямого измерения размера и распределения предполагаемых пор с течением времени. Фиксацию клеток можно проводить при комнатной температуре с использованием 25% раствора гултаральдегида (Sigma). Затем перед визуализацией образцы клеток можно дегидратировать посредством последовательных промываний этанолом. Для прямой визуализации фиксированных образцов можно использовать способы средовой SEM (ESEM). Однако вследствие относительно низкого разрешения (~200 нм), этот способ пригоден для обнаружения морфологических изменений или повреждений масштаба 1-0,5 мкм. Если ESEM не обнаруживает никаких морфологических изменений, клетки можно покрывать слоем золота толщиной 1-10 нм с использованием вакуумного испарителя для усиления разрешения до нанометрового масштаба, необходимого для прямого наблюдения более мелких структур пор с использованием SEM. Также можно использовать TEM в качестве альтернативного способа визуализации, если SEM не даст желаемых результатов. Эти способы позволяют отличить локальное повреждение от единообразного механизма доставки с образованием пор и измерить средний размер и распределение пор. Размер и распределение пор в клетках, которые претерпели быструю деформацию клеток, можно сравнивать с необработанными клетками. Локализованное распределение пор на поверхности мембраны указывает на модель повреждения, в то время как более единообразное распределение подтверждает единообразную модель образования пор.
Микрофизическое программное обеспечение COMSOL можно использовать для конструирования 3D-модели клетки с порами. С использованием опубликованных данных в отношении диффузионной способности цитоплазмы и буфера, в сочетании с соответствующими моделями пор из механистических исследований, можно получить прогнозирующую модель доставки. Модель имитирует пористую мембрану, разделяющую цитоплазму с низкой диффузионной способностью и область буфера с высокой диффузионной способностью. Согласно допущениям в модели поры имеют фиксированный размер в течение фиксированного периода времени перед моментальным закрытием. Динамическое поведение пор, такое как изменения формы и диаметра, может быть включено в комплексные модели посредством сопряжения с MatLab или другим программным обеспечением. Смоделированные прогнозы о доставляемом количестве можно подтверждать с использованием экспериментальных данных на основе FACS и гель-электрофореза (например, вестерн-блоты). Эти сравнения можно использовать для тонкой регуляции модели и, таким образом, они позволяют ей прогнозировать количество доставляемого материала. Прогнозирующие способности этой модели могут имитировать эффекты варьирования размера пор, времени открытия поры и концентраций буфера и, таким образом, их можно использовать в качестве руководства для дальнейших исследований.
Мультифизическое моделирование (например, COMSOL или CFD-ACE) также можно использовать для моделирования прохождения жидкости через устройство. Эти модели можно использовать для того, чтобы точнее предсказать скорости потока и нагрузку сдвига в областях входа, выхода и сужения. Эти данные можно использовать для установления связей между нагрузкой сдвига и скоростью потока в целях эффективной доставки через конструкции сужения. Более того, посредством конструирования широкой модели устройства можно исследовать устойчивость падения давления между различными каналами и корректировать конструкции входа и выхода для обеспечения того, чтобы все каналы действовали в практически идентичных условиях, так чтобы повысилось единообразие обработки популяции клеток.
Процесс доставки можно оптимизировать, главным образом, для увеличения эффективности доставки и жизнеспособности клеток. Единообразие популяции (т.е. доставка сходного количества материала в каждую клетку) можно использовать в качестве вторичного параметра оптимизации. Исходные результаты идентифицировали скорость клеток, длину сужения, ширину сужения и форму области входа в качестве чувствительных параметров. С другой стороны, состав среды оказался не основным фактором. Можно конструировать серию устройств, в которых систематически варьирует длина и ширина сужения между 5-50 мкм и 4-8 мкм, соответственно. Возможны различные углы наклона при уменьшении ширины главного канала с образованием сужения. Экспериментальные данные об эффективности и жизнеспособности для этих устройств при измерении с помощью FACS, можно сопоставлять с упомянутыми выше данными моделирования для лучшего понимания эффектов нагрузки сдвига и размеров сужения. Этот процесс можно повторять для различных линий клеток, которые могут по-разному отвечать на обработку. Эти данные можно использовать для разработки устройств с оптимизированной геометрией и рабочими параметрами для конкретных (или конкретных подгрупп) типов клеток.
На фиг. 38 представлены микрофотографии, иллюстрирующие альтернативные структуры устройств. Представлен микроснимок, полученный при светлопольном освещении, предварительного комбинирования сужения и электродов (масштабная метка 30 мкм). Как проиллюстрировано на фиг. 38, устройство может быть модифицировано посредством сопряжения явления быстрой деформации с электропорацией. Золотые электроды можно встраивать на любую сторону сужения посредством фотолитографического формирования рельефа и наслоения Au для введения локализованного электрического поля в канал. Последующие эксперименты могут идентифицировать действующие величины параметров (сила электрического поля, частота и действующая скорость), которые демонстрируют улучшенную эффективность относительно современных способов. Посредством сопряжения двух независимых механизмов образования пор, можно осуществлять более точный контроль над системой и манипулировать множеством параметров в целях оптимизации эффективности системы для каждого типа клеток. Кроме того, электрические поля можно использовать в качестве движущей силы для доставки более крупных заряженных молекул, таких как ДНК, которые имеют низкие скорости диффузии.
Возможна усовершенствованная одноразовая версия системы, пригодной для применения потенциальными компаньонами. Для осуществления версии устройства на основе полимера можно использовать инжекционное формование или горячее тиснение PMMA и поликарбоната. Вытекающее снижение затрат может обеспечить использование этих устройств в качестве одноразового инструмента, таким образом, увеличивая стерильность и простоту применения. Кроме того, посредством упрощения соединения трубок, системы установки и системы регуляции давления, является осуществимым предоставление удобной для пользования системы.
Является возможным перепрограммирование фибробластов на основе белков в клетки iPS и исследования по оптимизации пространства параметров перепрограммирования. Предшествующие исследования показали, что iPSC можно получать посредством прямой доставки слитых с CPP перепрограммирующих факторов из тканей как человека, так и мыши (фиг. 36) и что эти белок-iPSC могут дифференцироваться в функциональные клетки (например, дофаминовые нейроны) без аномальных фенотипов, ассоциированных с вирусными iPSC. Однако вследствие многих факторов, включающих деградацию белка в культуре, неэффективность доставки и деградацию внутри эндосом клеток, эффективность перепрограммирования посредством прямой доставки белка является слишком низкой (<0,01%) для любого практического применения. Микрожидкостные устройства, описанные в настоящем описании, могут значительно увеличить эффективность перепрограмирования на основе белков, позволяя эффективную доставку белка в цитоплазму, таким образом, избегая вредоносной эндосомальной среды и затруднительного процесса ускользания от эндосом, которые обычно встречаются при способах доставки свободного или инкапсулированного белка.
Получение iPSC человека облегчается посредством микрожидкостной доставки. Устройство используют для доставки одного или нескольких, например, 4 перепрограмирующих белков (c-Myc (белок, номер доступа Genbank NP_002458.2; ДНК, номер доступа Genbank NM_002467.4), Klf4 (белок, номер доступа Genbank AAH30811.1; ДНК, номер доступа Genbank NM_004235.4), Oct4 (белок, номер доступа Genbank ADW77326.1; ДНК, номер доступа Genbank HQ122675.1), и Sox2 (белок, номер доступа Genbank NP_003097.1; ДНК, номер доступа Genbank NM_003106.3)) в эмбриональные фибробласты человека (HF). В дополнение к четырем факторам Yamanaka (MKOS представляет собой c-Myc-Klf4-Oct4-Sox2), было идентифицировано несколько дополнительных факторов (например, Lin28 (белок, номер доступа Genbank AAH28566.1; ДНК, номер доступа Genbank NM_024674.4) и Nanog (белок, номер доступа Genbank AAP49529.1; ДНК, номер доступа Genbank NM_024865.2), Esrrb (белок, номер доступа Genbank AAI31518.1; ДНК, номер доступа Genbank NM_004452.3), Glis1 (белок, номер доступа Genbank NP_671726.2; ДНК, номер доступа Genbank NM_147193.2), и PRDM14 (белок, номер доступа Genbank NP_078780.1; ДНК, номер доступа Genbank NM_024504.3)), усиливающих эффективность перепрограммирования. Была полностью разработана экспрессия у млекопитающих и очистка 6 факторов (MKOS + Lin28 и Nanog; MKOSLN) и установлена биоактивность каждого фактора с использованием репортерных анализов. Эти факторы могут экспрессироваться либо в E.coli, либо в клетках млекопитающих. Поскольку экспрессируемые E.coli белки лишены посттрансляционных модификаций, таких как фосфорилирование, ацетилирование и убиквитинилирование, после экспрессии в клетках млекопитающих можно использовать очищенные белки (HEK293 и CHO). Для сравнения, можно использовать экспрессируемые в E.coli белки (коммерчески доступные от Stemgent, Cambridge, MA). Во-первых, меченные FLAG перепрограммирующие факторы, экспрессируемые в клетках HEK293 посредством трансфекции, можно ресуспендировать в буфере для лизиса клеток NP40, содержащем 50 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 250 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 1% NP-40, и ингибиторы протеазы. После центрифугирования, в собранную растворимую фракцию можно добавлять уравновешенный агарозный аффинный гель против FLAG M2. После промывания PBS два раза, оставшиеся меченные FLAG белки можно элюировать посредством добавления 0,1 мг/мл пептида FLAG (Sigma). Раствор с суспендированными фибробластами человека и 4 или 6 очищенными белками можно использовать в устройстве и обработанные клетки можно высевать на покрытые 0,1% желатином чашки с кондиционированной средой hESC за 1, 2 или 3 сток до следующего цикла доставки. После повторения циклов доставки (6-16) с микрожидкостным устройством, обработанные клетки можно высевать на обработанные митомицином C эмбриональные фибробласты мыши (MEF) и выращивать в течение 3-4 недель с регулярной средой hESC. Колонии IPSC могут стать видимыми в пределах 3 недель после посева на MEF. Эффективность получения iPSC можно сравнивать с эффективностью при доставке с помощью белков с использованием оригинальных слитых с CPP рекомбинантных белков авторов изобретения. Эти кандидаты iPSC можно тщательно исследовать в отношении всех критериев аутентичных iPSC, включая молекулярные и клеточные свойства, а также плюрипотентность in vitro и in vivo, как описано ранее. Использование 4 или 6 факторов обеспечит линии iPSC со значительно увеличенной эффективностью. Также возможно далее экспресировать дополнительные факторы, такие как Esrrb, Glis1 и PRDM14, и использовать эти факторы в экспериментах по перепрограммированию.
Перепрограммирующие белки и мРНК и/или микроРНК можно доставлять в комбинации. Микрожидкостное устройство можно использовать для доставки не только белков, но также других макромолекул. Чтобы воспользоваться преимуществом этого уникального свойства для оптимального перепрограммирования без встраивания в геном, возможно комбинировать применение перепрограммирующих факторов и мРНК и/или микроРНК. В частности, значительный интерес представляет то, что линии iPSC можно успешно получать с использованием только микроРНК. Действительно, трансфекция на основе Lipofectamine микроРНК может образовывать iPSC-подобные колонии. Поскольку микроРНК, вероятно, индуцируют перепрограммирование по механизму, отличающемуся от перепрограммирующих факторов, соответствующее комбинирование как перепрограммирующих белков, так и микроРНК с использованием микрожидкостного устройства может далее повысить эффективность перепрограммирования. Комбинированная доставка белков и мРНК может значительно упростить эффективность перепрограммирования. Таким образом, с использованием микрожидкостного устройства можно осуществлять оптимально комбинированную обработку белками, мРНК и/или микроРНК. Хотя микроРНК/мРНК может не обеспечить эквивалентный белкам уровень контроля, возможность исследований высокопроизводительной оптимизации устройства, тем не менее, обеспечивает значительное увеличение эффективности относительно предшествующих подходов.
Уникальные признаки микрожидкостного устройства могут обеспечить доставку различных определенных количеств каждого фактора контролируемым повторяющимся образом. Оптимизация настоящего изобретения облегчает разработку надежного высокоэффективного инструмента для доставки белка в HF. Можно установить оптимальные количества для доставки и долю каждого перепрограммирующего фактора. В отличие от способов на основе мРНК, плазмид или вирусов, эта система не основана на стохастической природе экспрессии и/или трансляции генов для определения эффективной внутриклеточной концентрации факторов транскрипции. Таким образом, способность устройства доставлять белок прямо в цитозоль ставит его в уникальное положение в отношении осуществления точного контроля над внутриклеточной средой. Возможна серия схем доставки, которые варьируют частоту обработки (один раз в 1, 2 или 3 суток) и концентрацию белка каждого из четырех факторов независимо. В частности, на основе нескольких сообщений, указывающих на то, что более высокие уровни Oct4 являются критическими для эффективного перепрограммирования, можно исследовать эффект использования различных концентраций Oct4 при сохранении концентраций других факторов на том же уровне. Различные концентрации c-Myc можно оценивать для данного типа клеток, поскольку было выявлено, что его высокие уровни образуют по большей части трансформированные колонии вместо iPSC в некоторых ситуациях. Более того, можно исследовать эффект более частой обработки c-Myc вследствие его чрезвычайно короткого времени полужизни (~30 мин) при соответствующей концентрации.
Оптимизация временной обработки перепрограммирующими факторами облегчается с использованием описанных способов. Каждый фактор имеет функциональную роль и участвует в процессе перепрограммирования. По меньшей мере один и, в некоторых случаях, комбинации факторов необходимы для достижения желаемого результата перепрограммирования. Например, известно, что c-Myc подавляет экспрессию генов дифференцировки. Кроме того, известно, что Klf4 подавляет микроРНК let-7, которая связана с каскадами дифференцировки и ингибированием плюрипотентности. Таким образом, временно регулируемое перепрограммирование может быть возможным посредством обработки c-Myc и/или Klf4 в течение первоначального периода на основе субоптимальных условий. Кроме того, хотя Nanog не требуется для получения iPSC, известно, что он является критическим для конечного установления и поддержания плюрипотентности. Таким образом, можно исследовать эффект добавления Nanog на более поздней стадии процесса перепрограммирования. Более того, можно исследовать последовательную обработку посредством микроРНК и белков, и можно сравнивать эффективность перепрограммирования с эффективностью перепрограммирования каждой из обработок или одновременной обработкой. Это временно регулируемое перепрограммирование является осуществимым благодаря уникальному признаку микрожидкостного устройства и может быть важным для дальнейшей оптимизации перепрограммирующих белков. Эффективность перепрограммирования можно вычислять посредством деления количества колоний на 28 сутки на количество обработанных клеток HF. После завершения можно использовать регрессионный анализ для установления относительной важности каждого перепрограммирующего фактора, его оптимальной концентрации, оптимальной частоты/времени доставки и, в результате, оптимального протокола для получения iPSC. Возможность контролировать количество и временной режим для белка, доставляемого в каждую клетку, может пролить свет на функциональное значение каждого фактора в процессе перепрограммирования, тем самым далее увеличивая понимание процесса перепрограммирования клеток и установления плюрипотентности. Кроме того, результаты этой работы можно использовать для дальнейшего усовершенствования конструкции устройства так, чтобы она удовлетворяла конкретным потребностям перепрограммирования и обеспечивала в итоге разработку клинически применимых версий.
С использованием оптимизированной методики перепрограммирования белков, как описано выше, протокол можно, в общем, использовать для специфических для пациента взрослых фибробластных клеток человека. Поскольку была исследована эффективная дифференцировка ESC и iPSC в функциональные дофаминовые нейроны и эффекты трансплантации, можно получить iPSC или линии iPSC из фибробластов человека, полученных от пациентов с болезнью Паркинсона. После получения и охарактеризации линий iPSC индуцируют их дифференцировку в дофаминовые нейроны и охарактеризовывают их клеточные, молекулярные, физиологические и электрофизиологические свойства. Дофаминовые нейроны после трансплантации исследуют в отношении функциональности in vivo в модели на животных болезни Паркинсона, таких как генетическая модель PD, мыши с афакией.
Микрожидкостную доставку белков можно использовать для прямого преобразования клеток, например, прямого преобразования фибробластов в другие типы клеток, такие как функциональные нейроны, гепатоциты и клетки крови. В прошлом для манипуляций использовалась вирусная экспрессия ключевых факторов транскрипции, вызывающая значительные хромосомные нарушения и мутации генов, тем самым демонстрируя необходимость в разработке невирусных способов преобразования без встраивания в геном, таких как прямая доставка белка с использованием способов, описанных в настоящем описании. Таким образом, устройство можно использовать для микрожидкостной доставки белков для прямого преобразования клеток. Поскольку экспрессия у млекопитающих определенных факторов транскрипции иногда является затрудненной, может быть более осуществимым исследование преобразования с помощью одного или двух белковых факторов. Однако возможно направлять фибробласты на другую клеточную судьбу с использованием единичного фактора, например, Oct4 или Sox2, для получения предшественников крови или нейрональных предшественников, соответственно. Эти белки являются легкодоступными в очищенной форме для преобразований клеток с использованием микрожидкостной доставки белков.
На фиг. 44 представлена столбиковая диаграмма, иллюстрирующая нокдаун в HESC при измерении по интенсивности GFP через 48 часов после обработки активными последовательностями миРНК и рандомизированными контролями с использованием микрожидкостного устройства и сходных способов. На фиг. 45A и 45B представлены два графика, иллюстрирующих интенсивность красителя и жизнеспособность эмбриональных клеток человека после доставки синего красителя массой 3 кДа.
Другие варианты осуществления находятся в пределах объема и сущности изобретения. Например, вследствие характера программного обеспечения, функции, описанные выше, можно осуществлять с использованием программного обеспечения, технических средств, встроенных программ, фиксированного монтажа или комбинаций любого из них. Элементы, выполняющие функции, также могут находиться в различных положениях, в том числе могут быть распределены, так что части функций осуществляются в других физических положениях.
Отмечается, что одна или несколько ссылок включены в настоящее описание. В случае, когда любой из включенных материалов не согласуется с настоящим описанием, настоящее описание будет решающим. Более того, когда это необходимо, материал, включенный в настоящее описание в качестве ссылки, следует не учитывать, если это необходимо, для сохранения допустимости формулы изобретения.
Кроме того, хотя представленное выше описание относится к изобретению, описание может включать более одного изобретения.
Claims (84)
1. Микрожидкостная система для обеспечения разрывов в клетке, причем система включает:
a) микрожидкостный канал, определяющий просвет, позволяющий клетке, суспендированной в буфере, проходить через него, где микрожидкостный канал включает деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения составляет 20-99% от диаметра клетки и где диаметр сужения выбирают таким образом, чтобы индуцировать разрывы в клетке, достаточно крупные, чтобы груз прошел через них; и
b) компонент, обеспечивающий продвижение клеток;
где компонент, обеспечивающий продвижение клеток, выполнен с возможностью перемещения клетки через микрожидкостный канал.
2. Микрожидкостная система по п. 1, где диаметр сужения выбран также таким образом, чтобы уменьшать вероятность того, что клетка погибнет в результате деформации.
3. Микрожидкостная система по п. 1, где диаметр сужения составляет от 20% до менее 60% от диаметра клетки.
4. Микрожидкостная система по п. 1, где сужение включает область входа, центральную точку и область выхода.
5. Микрожидкостная система по п. 4, где
угол сужения области входа оптимизирован для уменьшения закупорки канала или для повышения доставки и жизнеспособности клеток или
область входа определят угол сужения 90 градусов.
6. Микрожидкостная система по п. 1, дополнительно содержащая множество микрожидкостных каналов, расположенных последовательно и/или параллельно.
7. Микрожидкостная система по п. 1, где микрожидкостный канал содержит множество сужений.
8. Микрожидкостная система по п. 7, где множество сужений расположено последовательно и/или параллельно.
9. Микрожидкостная система по п. 1, где компонент, обеспечивающий продвижение клеток, выбран из группы, состоящей из: нагнетающего насоса, газового баллона, компрессора, вакуумного насоса, шприца, шприцевого насоса, перистальтического насоса, ручного шприца, пипетки, поршня и капиллярного действующего элемента.
10. Микрожидкостная система по любому из пп. 1-9, где поперечное сечение микрожидкостного канала выбрано из группы, состоящей из округлого, эллиптического, удлиненного щелевого, квадратного, шестиугольного и треугольного.
11. Способ доставки груза в клетку, причем способ включает:
предоставление клетки в суспензионном растворе;
пропускание раствора через микрожидкостный канал, который включает деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения составляет 20-99% от диаметра клетки и деформирует клетку таким образом, что вызывает разрывы в клетке, достаточно большие, чтобы груз прошел через них; и
инкубацию клетки в содержащем груз растворе в течение заданного периода времени после того, как она прошла через сужение.
12. Способ по п. 11, где суспензионный раствор содержит клетку и груз до, в течение и/или после прохождения через сужение.
13. Способ по п. 11, где диаметр сужения составляет от 20% до менее 60% от диаметра клетки.
14. Способ по п. 11, где поперечное сечение микрожидкостного канала выбрано из группы, состоящей из кругового, эллиптического, удлиненного щелевого, квадратного шестиугольного и треугольного.
15. Способ по п. 11, где прохождение раствора включает прохождение раствора через область вхождения, центральную точку и область выхода сужения, где область входа определяет угол сужения.
16. Способ по п. 15, дополнительно включающий уменьшение закупорки микрожидкостного канала или повышение доставки и жизнеспособности клеток путем корректирования угла сужения в области входа.
17. Способ по п. 16, где область входа определят угол сужения 90 градусов.
18. Способ по п. 11, где прохождение раствора включает прохождение раствора через множество микрожидкостных каналов, расположенных последовательно и/или параллельно.
19. Способ по п. 11, где микрожидкостный канал содержит множество сужений.
20. Способ по п. 19, где множество сужений расположено последовательно и/или параллельно.
21. Способ по п. 11, где инкубация клетки в содержащем груз растворе включает инкубацию клетки в течение более чем 0,0001 секунды.
22. Способ по п. 21, где инкубация клетки в содержащем груз растворе включает инкубацию клетки в течение от 0,0001 секунды до 60 минут.
23. Способ по п. 11, где способ используют для доставки:
(i) ДНК, РНК, миРНК или белка в первичные фибробласты и стволовые клетки для перепрограммирования клеток;
(ii) антигена или РНК в первичные иммунные клетки;
(iii) по меньшей мере одного из квантовых точек и углеродных нанотрубок в клетку-мишень для облегчения визуализации клетки-мишени; или
(iv) лекарственных средств к клетке-мишени и где клетка-мишень представляет собой опухолевую клетку.
24. Способ по любому из пп. 11-23, где клетку деформируют сдавлением или сдавлением и сдвигом.
25. Способ доставки груза в клетку, причем способ включает:
предоставление клетки в суспензионном растворе;
пропускание клетки через деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения составляет 20-99% от диаметра клетки и деформирует клетку таким образом, что вызывает разрывы в клетке, достаточно большие, чтобы груз прошел через них; и
инкубацию клетки в содержащем груз растворе после деформации клетки, где клетку подвергают контакту с содержащим груз раствором после деформации клетки.
26. Способ по п. 25, где диаметр сужения составляет от 20% до менее 60% от диаметра клетки.
27. Способ по п. 25, где прохождение раствора включает прохождение раствора через множество сужений, расположенных последовательно и/или параллельно.
28. Способ по п. 25, где прохождение раствора включает прохождение раствора через микрожидкостный канал, содержащий множество сужений.
29. Способ по п. 28, где множество сужений расположено последовательно и/или параллельно.
30. Способ по п. 25, где деформация клетки включает деформацию клетки в течение от 1 мкс до 1 мс и/или где инкубация происходит в течение от 0,0001 секунды до 20 минут.
31. Способ по п. 25, где способ используют для доставки:
(i) ДНК, РНК, миРНК или белка в первичные фибробласты и стволовые клетки для перепрограммирования клеток;
(ii) антигена или РНК в первичные иммунные клетки;
(iii) по меньшей мере одного из квантовых точек и углеродных нанотрубок в клетку-мишень для облегчения визуализации клетки-мишени; или
(iv) лекарственных средств к клетке-мишени и где клетка-мишень представляет собой опухолевую клетку.
32. Способ по любому из пп.25-31, где разрывы вызывают сдавлением или сдавлением и сдвигом.
33. Способ доставки груза в клетку, причем способ включает:
предоставление суспензии клетки и груза;
пропускание суспензии через устройство, содержащее деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения составляет 20-99% от диаметра клетки, чтобы быстро и временно деформировать клетку; и
инкубацию клетки в суспензии в течение заданного периода времени после быстрой и временной деформации,
где сужение располагается:
(i) в микрожидкостном канале;
(ii) между множеством микростолбиков;
(iii) между множеством микростолбиков, организованых в виде ряда; или
(iv) между пластинами, организованными так, чтобы одна или обе пластины двигались.
34. Способ по п. 33, где сужение располагается в микрожидкостном канале.
35. Способ по п. 34, где микрожидкостный канал содержит множество сужений.
36. Способ по п. 35, где множество сужений расположено последовательно и/или параллельно.
37. Способ по п. 33, где сужение составляет от 20% до менее 60% от диаметра клетки.
38. Способ по п. 33, где способ используют для доставки:
(i) ДНК, РНК, миРНК или белка в первичные фибробласты и стволовые клетки для перепрограммирования клеток;
(ii) антигена или РНК в первичные иммунные клетки;
(iii) по меньшей мере одного из квантовых точек и углеродных нанотрубок в клетку-мишень для облегчения визуализации клетки-мишени; или
(iv) лекарственных средств к клетке-мишени и где клетка-мишень представляет собой опухолевую клетку.
39. Способ по любому из пп.33-38, где пропускание суспензии через сужение деформирует клетку по существу в течение от 1 мкс до 1 мс.
40. Микрожидкостная система для применения в отношении клетки, суспендированной в растворе, и обеспечения разрывов в клетке, причем система включает:
a) устройство, содержащее деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения составляет 20-99% от диаметра клетки для быстрого и временного деформирования клетки, где сужение обеспечивает разрывы в клетке и где разрывы являются достаточно крупными, чтобы груз прошел через них, и
b) компонент, обеспечивающий продвижение клеток;
где компонент, обеспечивающий продвижение клеток, выполнен с возможностью перемещения клетки через деформирующее клетку сужение и
где сужение располагается:
(i) в микрожидкостном канале;
(ii) между множеством микростолбиков;
(iii) между множеством микростолбиков, организованых в виде ряда; или
(iv) между пластинами, организованными так, чтобы одна или обе пластины двигались.
41. Микрожидкостная система по п. 40, где сужение составляет от 20% до менее 60% от диаметра клетки.
42. Микрожидкостная система по п. 40, где сужение располагается в микрожидкостном канале.
43. Микрожидкостная система по п. 42, где микрожидкостный канал содержит множество сужений.
44. Микрожидкостная система по п. 43, где множество сужений расположено последовательно и/или параллельно.
45. Микрожидкостная система по любому из пп. 40-44, где клетка деформирована в течение от 1 мкс до 1 мс.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161548013P | 2011-10-17 | 2011-10-17 | |
US61/548,013 | 2011-10-17 | ||
US201261684301P | 2012-08-17 | 2012-08-17 | |
US61/684,301 | 2012-08-17 | ||
PCT/US2012/060646 WO2013059343A1 (en) | 2011-10-17 | 2012-10-17 | Intracellular delivery |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2014119926A RU2014119926A (ru) | 2015-11-27 |
RU2656156C2 true RU2656156C2 (ru) | 2018-05-31 |
Family
ID=48141314
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014119926A RU2656156C2 (ru) | 2011-10-17 | 2012-10-17 | Внутриклеточная доставка |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US10696944B2 (ru) |
EP (2) | EP2768942B1 (ru) |
JP (2) | JP6219832B2 (ru) |
KR (1) | KR102058568B1 (ru) |
CN (3) | CN107058101B (ru) |
AU (1) | AU2012326203B2 (ru) |
BR (1) | BR112014009346B1 (ru) |
CA (1) | CA2852672C (ru) |
DK (1) | DK2768942T3 (ru) |
ES (1) | ES2764105T3 (ru) |
HR (1) | HRP20200051T1 (ru) |
HU (1) | HUE047507T2 (ru) |
LT (1) | LT2768942T (ru) |
PL (1) | PL2768942T3 (ru) |
PT (1) | PT2768942T (ru) |
RS (1) | RS59898B1 (ru) |
RU (1) | RU2656156C2 (ru) |
SI (1) | SI2768942T1 (ru) |
WO (1) | WO2013059343A1 (ru) |
Families Citing this family (165)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PT2768942T (pt) | 2011-10-17 | 2020-01-21 | Massachusetts Inst Technology | Entrega intracelular |
US11046596B2 (en) | 2012-10-25 | 2021-06-29 | Hydrus Technology Pty. Ltd. | Electrochemical liquid treatment apparatus |
US9725709B2 (en) * | 2013-03-12 | 2017-08-08 | OpenCell Technologies, Inc. | Intracellular delivery and transfection methods and devices |
GB201308946D0 (en) | 2013-05-16 | 2013-07-03 | The Technology Partnership Plc | Method and device |
ITPD20130220A1 (it) * | 2013-08-02 | 2015-02-03 | Univ Padova | Metodo per la riprogrammazione e programmazione cellulare mediante l'impiego di tecnologia microfluidica |
PL3033184T3 (pl) * | 2013-08-16 | 2021-09-20 | Massachusetts Institute Of Technology | Selektywne dostarczanie materiału do komórek |
WO2015073587A2 (en) | 2013-11-18 | 2015-05-21 | Rubius Therapeutics, Inc. | Synthetic membrane-receiver complexes |
EP3125927B1 (en) | 2014-04-01 | 2021-01-27 | Rubius Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for immunomodulation |
CA2949865C (en) | 2014-05-23 | 2023-10-24 | Hydrus Technology Pty. Ltd. | Electrochemical treatment methods |
US11046595B2 (en) | 2014-05-23 | 2021-06-29 | Hydrus Technology Pty. Ltd. | Electrochemical treatment methods |
US10081816B1 (en) | 2014-07-03 | 2018-09-25 | Nant Holdings Ip, Llc | Mechanical transfection devices and methods |
US10760040B1 (en) | 2014-07-03 | 2020-09-01 | NanoCav, LLC | Mechanical transfection devices and methods |
US10947526B2 (en) | 2014-07-03 | 2021-03-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Microfluidic assay for rapid optimization of cell electroporation |
AU2015338893A1 (en) * | 2014-10-31 | 2017-05-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Delivery of biomolecules to immune cells |
JP6846345B2 (ja) * | 2014-11-14 | 2021-03-24 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | 破壊及び場による細胞への化合物及び組成物の送達 |
EP3037517A1 (en) * | 2014-12-28 | 2016-06-29 | Femtofab Co., Ltd. | Process for modifying a cell by putting material into the cell |
KR102428464B1 (ko) * | 2014-12-28 | 2022-08-03 | 주식회사 펨토바이오메드 | 세포에 물질을 주입하여 세포를 변환시키는 방법 |
EP3037515A1 (en) * | 2014-12-28 | 2016-06-29 | Femtofab Co., Ltd. | Modified cell prepared by putting material into the cell without using delivery vehicle |
EP3037518B1 (en) * | 2014-12-28 | 2020-05-06 | Femtobiomed Inc. | Device for putting material into cell |
EP3242946A4 (en) * | 2015-01-07 | 2018-09-26 | Indee. Inc. | A method for mechanical and hydrodynamic microfluidic transfection and apparatus therefor |
CN107250373A (zh) * | 2015-01-12 | 2017-10-13 | 麻省理工学院 | 通过微流体递送实现的基因编辑 |
EP3929296A1 (en) | 2015-01-30 | 2021-12-29 | The Regents of The University of California | Protein delivery in primary hematopoietic cells |
WO2016168680A1 (en) * | 2015-04-17 | 2016-10-20 | Exocyte Therapeutics Pte Ltd. | Method for developing exosome-based vaccines |
CN107922911A (zh) * | 2015-07-09 | 2018-04-17 | 麻省理工学院 | 将物质递送至无核细胞 |
DK3325081T3 (da) * | 2015-07-24 | 2021-10-11 | Sorrento Therapeutics Inc | Fremgangsmåder til lymfatisk levering af aktive stoffer |
EP3325080B1 (en) * | 2015-07-24 | 2021-09-01 | Sorrento Therapeutics, Inc. | Methods for better delivery of active agents to tumors |
CN105384825B (zh) | 2015-08-11 | 2018-06-01 | 南京传奇生物科技有限公司 | 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用 |
CA2996582A1 (en) | 2015-08-31 | 2017-03-09 | I Peace, Inc. | Pluripotent stem cell manufacturing system and method for producing induced pluripotent stem cells |
EP3344575B1 (en) | 2015-09-04 | 2020-04-15 | SQZ Biotechnologies Company | Intracellular delivery of biomolecules to cells comprising a cell wall |
EP3344747B1 (en) | 2015-09-04 | 2022-11-09 | SQZ Biotechnologies Company | Intracellular delivery of biomolecules mediated by a surface with pores |
EP3365269A4 (en) * | 2015-10-19 | 2019-06-19 | The Methodist Hospital | DISTRIBUTION, BY MEMBRANE DEFORMATION, FROM CRISPR-CAS9 TO DIFFICULT CELLS TO BE TRANSFERRED |
EA201891532A1 (ru) | 2015-12-28 | 2019-01-31 | Новартис Аг | Композиции и способы лечения гемоглобинопатий |
CN116218916A (zh) | 2016-01-12 | 2023-06-06 | Sqz生物技术公司 | 复合物的细胞内递送 |
AU2017244108B2 (en) | 2016-03-29 | 2021-03-18 | University Of Southern California | Chimeric antigen receptors targeting cancer |
WO2017173373A1 (en) | 2016-03-31 | 2017-10-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Flow-through microfluidic methods and devices featuring membrane-perturbing surface interactions for intracellular delivery |
US11225638B2 (en) | 2016-04-04 | 2022-01-18 | CyteQuest, Inc. | System, device and method for electroporation of cells |
US10717083B2 (en) | 2016-04-11 | 2020-07-21 | Indian Institute Of Technology, Bombay | Microdevice for separating plasma from human blood |
CN109415741A (zh) * | 2016-05-03 | 2019-03-01 | Sqz生物技术公司 | 细胞内递送生物分子以诱导耐受性 |
US20210138050A1 (en) * | 2016-05-03 | 2021-05-13 | Sqz Biotechnologies Company | Intracellular delivery of biomolecules to induce tolerance |
WO2017201378A1 (en) * | 2016-05-19 | 2017-11-23 | University Of Rochester | Micro-slits for reticulocyte maturation |
US20190136224A1 (en) * | 2016-05-31 | 2019-05-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Hydrodynamically Controlled Electric Fields for High Throughput Transformation & High Throughput Parallel Transformation Platform |
EP3463664A1 (en) | 2016-06-06 | 2019-04-10 | The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. | Systems and methods for cell transduction |
EP3500662B1 (en) * | 2016-08-20 | 2022-10-05 | The Regents Of The University Of California | High-throughput system and method for the temporary permeabilization of cells |
WO2018047149A1 (en) * | 2016-09-12 | 2018-03-15 | Texas Children's Hospital | Cell filtration as a means of introducing exogenous material into a cell |
EP3516068A4 (en) | 2016-09-19 | 2020-10-14 | University of Southern California | NON-RADIOACTIVE CYTOTOXICITY ASSAYS |
US10738338B2 (en) | 2016-10-18 | 2020-08-11 | The Research Foundation for the State University | Method and composition for biocatalytic protein-oligonucleotide conjugation and protein-oligonucleotide conjugate |
WO2018074980A1 (en) * | 2016-10-21 | 2018-04-26 | Agency For Science, Technology And Research | Device, system and method for intracellular delivery of substances |
WO2018089497A1 (en) * | 2016-11-08 | 2018-05-17 | Georgia Tech Research Corporation | Methods for convectively-driven intracellular delivery |
US10011848B2 (en) | 2016-11-09 | 2018-07-03 | City University Of Hong Kong | System and method for delivery of substance into mammalian cells |
US11332713B2 (en) | 2016-11-16 | 2022-05-17 | KSQ Therapeutics, Inc. | Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy |
CN106525273B (zh) * | 2016-11-24 | 2018-10-30 | 哈尔滨工业大学 | 基于量子点薄膜的细胞温度传感器及其制备方法 |
GB201701946D0 (en) * | 2017-02-06 | 2017-03-22 | Univ Leeds Innovations Ltd | Fluid flow device |
TW201839136A (zh) | 2017-02-06 | 2018-11-01 | 瑞士商諾華公司 | 治療血色素異常症之組合物及方法 |
US11684922B2 (en) | 2017-02-13 | 2023-06-27 | The Regents Of The University Of California | Device and method for intracellular delivery of biomolecular cargo via acoustic wave exposure |
WO2018232287A1 (en) * | 2017-06-16 | 2018-12-20 | Neem Scientific, Inc. | Nanoneedle and related apparatus and methods |
EP3645092B1 (en) * | 2017-06-30 | 2024-04-03 | Avectas Limited | Electrospray catheter |
JP7057423B2 (ja) | 2017-10-26 | 2022-04-19 | レプリゲン・コーポレイション | 微小交互接線流灌流フィルタ、処理容器およびその使用方法 |
SG11202004457XA (en) | 2017-11-17 | 2020-06-29 | Iovance Biotherapeutics Inc | Til expansion from fine needle aspirates and small biopsies |
CA3083118A1 (en) | 2017-11-22 | 2019-05-31 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Expansion of peripheral blood lymphocytes (pbls) from peripheral blood |
US20210317187A1 (en) | 2017-12-05 | 2021-10-14 | Sqz Biotechnologies Company | Intracellular delivery of biomolecules to modulate antibody production |
US11365390B2 (en) | 2017-12-19 | 2022-06-21 | Xcell Biosciences, Inc. | Methods of modulating cell phenotype by way of regulating the gaseous environment |
EP3728559A1 (en) | 2017-12-20 | 2020-10-28 | SQZ Biotechnologies Company | System for delivery of a payload into a cell |
WO2019136459A1 (en) | 2018-01-08 | 2019-07-11 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells |
US11713446B2 (en) | 2018-01-08 | 2023-08-01 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Processes for generating TIL products enriched for tumor antigen-specific T-cells |
EP3737743A1 (en) | 2018-01-08 | 2020-11-18 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells |
CN112135627A (zh) * | 2018-03-12 | 2020-12-25 | Sqz生物技术公司 | 细胞内递送生物分子以修饰免疫应答 |
CA3093826A1 (en) | 2018-03-12 | 2019-09-19 | Sqz Biotechnologies Company | Methods for treating hpv-associated diseases |
JP2019154314A (ja) * | 2018-03-13 | 2019-09-19 | 国立大学法人九州大学 | キャピラリーチップ及びこれを備える装置、並びに細胞への外来物質の導入方法 |
CA3093915A1 (en) | 2018-03-15 | 2019-09-19 | KSQ Therapeutics, Inc. | Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy |
BR112020018658A2 (pt) | 2018-03-15 | 2020-12-29 | KSQ Therapeutics, Inc. | Composições de regulação gênica e métodos para imu-noterapia aprimorada |
US20210161635A1 (en) * | 2018-04-04 | 2021-06-03 | The General Hospital Corporation | Microfluidic Systems and Methods to Denude Mammalian Oocytes |
EP3556845A1 (en) | 2018-04-20 | 2019-10-23 | Cellix Limited | A method and device for transfecting cells |
IL278630B1 (en) | 2018-05-11 | 2024-06-01 | Lupagen Inc | Systems and methods for closed circuit and real-time changes of the patient's cells |
US11654434B2 (en) | 2018-06-24 | 2023-05-23 | Nemametrix Inc. | Microinjection chip, device, system and uses thereof for unicellular or multicellular organisms |
US20210388390A1 (en) | 2018-10-04 | 2021-12-16 | Sqz Biotechnologies Company | Intracellular delivery of biomolecules to enhance antigen presenting cell function |
CN113677392B (zh) * | 2018-10-26 | 2024-09-17 | 凯拓盘公司 | 用于电穿孔的装置、系统和套件及其使用方法 |
CN112969469A (zh) | 2018-11-05 | 2021-06-15 | 艾欧凡斯生物治疗公司 | 抗pd-1抗体难治性nsclc患者的治疗 |
PE20211292A1 (es) | 2018-11-05 | 2021-07-20 | Iovance Biotherapeutics Inc | Procesos para la produccion de linfocitos infiltrantes de tumor y usos de estos en inmunoterapia |
JP2022506508A (ja) | 2018-11-05 | 2022-01-17 | アイオバンス バイオセラピューティクス,インコーポレイテッド | Akt経路阻害剤を利用したtilの拡大培養 |
BR112021008266A2 (pt) | 2018-11-05 | 2022-01-04 | Iovance Biotherapeutics Inc | Métodos para expandir linfócitos infiltrantes de tumor em uma população terapêutica de linfócitos infiltrantes de tumor e para tratar um sujeito com câncer, e, população terapêutica de linfócitos infiltrantes de tumor |
US10731012B2 (en) * | 2018-11-06 | 2020-08-04 | President And Fellows Of Harvard College | Anti-clogging microfluidic multichannel device |
KR102232757B1 (ko) * | 2018-11-22 | 2021-03-26 | (주)엑솔런스바이오테크놀로지 | 체외충격파를 이용한 표적물질 전달 장치 |
WO2020117856A1 (en) * | 2018-12-04 | 2020-06-11 | Cellfe, Inc. | Methods and systems for intracellular delivery |
JP2022514023A (ja) | 2018-12-19 | 2022-02-09 | アイオバンス バイオセラピューティクス,インコーポレイテッド | 操作されたサイトカイン受容体対を使用して腫瘍浸潤リンパ球を拡大培養する方法及びその使用 |
US20220105166A1 (en) * | 2019-01-25 | 2022-04-07 | Sqz Biotechnologies Company | Anucleate cell-derived vaccines |
KR20210134353A (ko) | 2019-02-28 | 2021-11-09 | 에스큐지 바이오테크놀로지스 컴퍼니 | 면역 반응을 변형시키기 위한 pbmc로의 생체분자의 전달 |
JP2022522473A (ja) | 2019-03-01 | 2022-04-19 | アイオバンス バイオセラピューティクス,インコーポレイテッド | 液性腫瘍からの腫瘍浸潤リンパ球の拡大培養及びその治療的使用 |
JP7353381B2 (ja) * | 2019-03-12 | 2023-09-29 | エムエックスティー バイオテック | 細胞内物質伝達のためのマイクロ流体システムおよび方法 |
KR102217407B1 (ko) | 2019-03-12 | 2021-02-22 | 고려대학교 산학협력단 | 관성을 기반으로 한 세포 내 전달 미세 유체 플랫폼 및 이를 이용한 세포 내 물질 전달방법 |
JP7379654B2 (ja) | 2019-03-15 | 2023-11-14 | カーティザン セラピューティクス,インコーポレーテッド | 抗bcmaキメラ抗原受容体 |
AU2020271040A1 (en) | 2019-04-08 | 2021-11-18 | Sqz Biotechnologies Company | Cartridge for use in a system for delivery of a payload into a cell |
US20220168739A1 (en) * | 2019-04-11 | 2022-06-02 | The Chinese University Of Hong Kong | Systems and methods for controlled membrane disruption |
WO2020232029A1 (en) | 2019-05-13 | 2020-11-19 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy |
US20220213422A1 (en) * | 2019-05-15 | 2022-07-07 | Cellfe, Inc. | Methods and systems for intracellular delivery and products thereof |
US20220298461A1 (en) * | 2019-06-12 | 2022-09-22 | Cellfe, Inc. | Methods and systems for cell labeling and imaging |
US11041172B2 (en) | 2019-06-25 | 2021-06-22 | Inari Agriculture, Inc. | Homology dependent repair genome editing |
CN110272810A (zh) * | 2019-07-01 | 2019-09-24 | 广州世赛生物科技有限公司 | 外源物质递送至真核细胞内的装置和方法及其应用 |
AU2020299541A1 (en) * | 2019-07-02 | 2022-01-27 | Kytopen Corporation | Devices, systems, and kits for electro-mechanical delivery and methods of use thereof |
KR102483442B1 (ko) * | 2019-11-06 | 2022-12-30 | 고려대학교 산학협력단 | 액적 기반 미세유체 세포내 물질전달 방법 및 플랫폼 |
KR102499546B1 (ko) * | 2020-10-07 | 2023-02-14 | 고려대학교 산학협력단 | 액적 변형에 기반한 세포내 물질 전달방법 및 이를 위한 칩 |
CN114867556B (zh) * | 2019-11-06 | 2023-09-15 | 高丽大学校算学协力团 | 将材料输送到细胞内的基于液滴变形方法和用于其的芯片 |
CA3161104A1 (en) | 2019-12-11 | 2021-06-17 | Cecile Chartier-Courtaud | Processes for the production of tumor infiltrating lymphocytes (tils) and methods of using the same |
CN115176005A (zh) | 2019-12-18 | 2022-10-11 | 诺华股份有限公司 | 用于治疗血红蛋白病的组合物和方法 |
TW202208617A (zh) | 2020-05-04 | 2022-03-01 | 美商艾歐凡斯生物治療公司 | 用於產生腫瘤浸潤性淋巴球的過程及其在免疫療法中的用途 |
TW202208616A (zh) | 2020-05-04 | 2022-03-01 | 美商艾歐凡斯生物治療公司 | 改良之腫瘤反應性t細胞的選擇 |
CR20220576A (es) | 2020-05-11 | 2022-12-07 | Hoffmann La Roche | Tratamiento conjunto con pbmc modificadas y un inmunoconjugado |
EP4153722A1 (en) * | 2020-05-22 | 2023-03-29 | SQZ Biotechnologies Company | Point of care system for automatically processing cells |
US20210371881A1 (en) * | 2020-05-26 | 2021-12-02 | TransCytos, LLC | Devices and methods for transfection |
KR20230058389A (ko) | 2020-07-29 | 2023-05-03 | 에스큐지 바이오테크놀로지스 컴퍼니 | 유핵 세포를 사용해 돌연변이체 ras에 대한 면역 반응을 자극하는 방법 |
CN116322752A (zh) | 2020-07-29 | 2023-06-23 | Sqz生物技术公司 | 使用无核细胞刺激对突变体ras的免疫应答的方法 |
CN112268934B (zh) * | 2020-09-16 | 2022-06-28 | 东南大学 | 一种针对循环肿瘤细胞的检测芯片及其检测方法 |
JP2023546359A (ja) | 2020-10-06 | 2023-11-02 | アイオバンス バイオセラピューティクス,インコーポレイテッド | 腫瘍浸潤リンパ球療法によるnsclc患者の治療 |
WO2022076606A1 (en) | 2020-10-06 | 2022-04-14 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies |
CN112275337B (zh) * | 2020-10-29 | 2022-03-18 | 上海荧辉医疗器械有限公司 | 一种微流控芯片及细胞筛选装置和方法 |
JP2023550090A (ja) | 2020-11-18 | 2023-11-30 | セルフィー、インク. | 生体細胞へのメカノポレーションベースのペイロード送達のための方法及びシステム |
WO2022125941A1 (en) | 2020-12-11 | 2022-06-16 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with braf inhibitors and/or mek inhibitors |
AU2021401302A1 (en) | 2020-12-17 | 2023-07-06 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with ctla-4 and pd-1 inhibitors |
EP4262827A1 (en) | 2020-12-17 | 2023-10-25 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of cancers with tumor infiltrating lymphocytes |
EP4271407A1 (en) | 2020-12-29 | 2023-11-08 | SQZ Biotechnologies Company | Formulations of activating antigen carriers |
EP4271517A1 (en) | 2020-12-29 | 2023-11-08 | SQZ Biotechnologies Company | High-throughput microfluidic chip having parallelized constrictions for perturbing cell membranes |
CA3203706A1 (en) | 2020-12-29 | 2022-07-07 | Howard Bernstein | Formulations for cryopreservation of pbmcs |
CA3203408A1 (en) | 2020-12-29 | 2022-07-07 | Maisam DADGAR | Microfluidic chip having increased throughput for use in a system for delivery of a payload into a cell |
US20220233677A1 (en) | 2020-12-29 | 2022-07-28 | Sqz Biotechnologies Company | Methods for treating cancers with modified pbmcs |
WO2022147443A1 (en) | 2020-12-29 | 2022-07-07 | Sqz Biotechnologies Company | Methods for treating cancers with activating antigen carriers |
EP4277981A1 (en) * | 2021-01-13 | 2023-11-22 | The General Hospital Corporation | Viscoelastic mechanoporation systems and methods of use thereof |
CA3206549A1 (en) | 2021-01-29 | 2022-08-04 | Frederick G. Vogt | Methods of making modified tumor infiltrating lymphocytes and their use in adoptive cell therapy |
WO2022207717A1 (en) | 2021-04-01 | 2022-10-06 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Multistage device and method for intracellular delivery |
EP4314239A1 (en) | 2021-04-02 | 2024-02-07 | SQZ Biotechnologies Company | Reprogramming of cells and uses thereof |
US20240158729A1 (en) * | 2021-04-12 | 2024-05-16 | MxT Biotech | Intracellular delivery platform |
CA3215830A1 (en) | 2021-04-19 | 2022-10-27 | Rafael CUBAS | Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies |
US20240247285A1 (en) | 2021-05-10 | 2024-07-25 | Sqz Biotechnologies Company | Methods for delivering genome editing molecules to the nucleus or cytosol of a cell and uses thereof |
EP4359527A2 (en) | 2021-06-23 | 2024-05-01 | Novartis AG | Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies |
WO2023004074A2 (en) | 2021-07-22 | 2023-01-26 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Method for cryopreservation of solid tumor fragments |
WO2023009716A1 (en) | 2021-07-28 | 2023-02-02 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with kras inhibitors |
WO2023010090A1 (en) | 2021-07-29 | 2023-02-02 | Sqz Biotechnologies Company | Methods to generate enhanced tumor infiltrating lymphocytes through microfluidic delivery |
CN113862112B (zh) * | 2021-09-03 | 2023-08-15 | 南昌大学 | 微流控离心式挤压的细胞转染系统及细胞转染方法 |
US20230130686A1 (en) * | 2021-10-25 | 2023-04-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Devices and systems for delivery of materials to cells |
AR127482A1 (es) | 2021-10-27 | 2024-01-31 | Iovance Biotherapeutics Inc | Sistemas y métodos para coordinar la fabricación de células para inmunoterapia específica de paciente |
WO2023086803A1 (en) | 2021-11-10 | 2023-05-19 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes |
EP4430168A1 (en) | 2021-11-11 | 2024-09-18 | Stemcell Technologies Canada Inc. | Methods to generate enhanced tumor infiltrating lymphocytes through microfluidic delivery |
CN114181825B (zh) * | 2021-11-29 | 2024-05-03 | 南昌大学 | 一种外加电场作用下微流控离心式挤压的细胞转染系统 |
DE102021214276A1 (de) * | 2021-12-14 | 2023-06-15 | Robert Bosch Gesellschaft mit beschränkter Haftung | Vorrichtung und Verfahren zum Splitten dreidimensionaler Agglomerate |
WO2023133423A1 (en) | 2022-01-05 | 2023-07-13 | Sqz Biotechnologies Company | Modified hematopoietic stem cells and uses thereof |
CN114316950B (zh) * | 2022-01-12 | 2022-08-26 | 广东粤港澳大湾区国家纳米科技创新研究院 | 通过前体胶囊制备量子点材料的方法和量子点材料、量子点组合物以及量子点器件 |
WO2023147488A1 (en) | 2022-01-28 | 2023-08-03 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods |
WO2023147486A1 (en) | 2022-01-28 | 2023-08-03 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Tumor infiltrating lymphocytes engineered to express payloads |
WO2023164466A1 (en) | 2022-02-23 | 2023-08-31 | Sqz Biotechnologies Company | Methods of producing glial cells and uses thereof |
WO2023196877A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies |
WO2023201369A1 (en) | 2022-04-15 | 2023-10-19 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Til expansion processes using specific cytokine combinations and/or akti treatment |
WO2023220608A1 (en) | 2022-05-10 | 2023-11-16 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with an il-15r agonist |
WO2023230141A1 (en) | 2022-05-24 | 2023-11-30 | Sqz Biotechnologies Company | Reprogramming of cells with self-amplifying rna |
WO2023230253A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Sqz Biotechnologies Company | Cartridges and devices for use in a system for delivery of a payload into a cell |
EP4299739A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-03 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Compositions, systems, and methods for genome editing |
EP4299733A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-03 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Compositions, systems, and methods for genome editing |
WO2024005864A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Compositions, systems, and methods for genome editing |
WO2024005863A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Compositions, systems, and methods for genome editing |
WO2024026490A1 (en) | 2022-07-28 | 2024-02-01 | Sqz Biotechnologies Company | Polynucleotides encoding linked antigens and uses thereof |
WO2024026492A1 (en) | 2022-07-28 | 2024-02-01 | Sqz Biotechnologies Company | Methods for treating cancer with enhanced antigen presenting cells |
WO2024026491A2 (en) | 2022-07-28 | 2024-02-01 | Sqz Biotechnologies Company | Enhanced antigen presenting cell formulations |
WO2024030758A1 (en) | 2022-08-01 | 2024-02-08 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies |
WO2024068996A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (C.H.U.V.) | Anti-sars-cov-2 antibodies and use thereof in the treatment of sars-cov-2 infection |
WO2024098024A1 (en) | 2022-11-04 | 2024-05-10 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof |
WO2024112571A2 (en) | 2022-11-21 | 2024-05-30 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Two-dimensional processes for the expansion of tumor infiltrating lymphocytes and therapies therefrom |
WO2024118836A1 (en) | 2022-11-30 | 2024-06-06 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes with shortened rep step |
WO2024178397A2 (en) | 2023-02-24 | 2024-08-29 | Elevatebio Technologies, Inc. | Modified immune effector cells and methods of use |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070243523A1 (en) * | 2006-03-31 | 2007-10-18 | Fluxion Biosciences Inc. | Methods and Apparatus for the Manipulation of Particle Suspensions and Testing Thereof |
US20090280518A1 (en) * | 2008-05-12 | 2009-11-12 | Massachusetts Institute Of Technology | System for high throughput measurement of mechanical properties of cells |
WO2010016800A1 (en) * | 2008-08-08 | 2010-02-11 | Agency For Science, Technology And Research | Microfluidic continuous flow device |
US20110030808A1 (en) * | 2009-08-08 | 2011-02-10 | The Regents Of The University Of California | Pulsed laser triggered high speed microfluidic switch and applications in fluorescent activated cell sorting |
RU2424792C2 (ru) * | 2004-05-03 | 2011-07-27 | Хермес Байесайенсиз, Инк. | Липосомы, используемые для доставки лекарственных средств |
Family Cites Families (109)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2502621C3 (de) | 1975-01-23 | 1978-09-14 | Kernforschungsanlage Juelich Gmbh, 5170 Juelich | Messung elastischer und dielektrischer Eigenschaften der Membran lebender Zellen |
US4478824A (en) | 1983-08-08 | 1984-10-23 | Franco Robert S | Method for altering red blood cell function and survival |
FR2569477B1 (fr) * | 1984-08-24 | 1987-01-02 | Descartes Universite Rene | Appareil et procede pour la determination de la deformabilite des globules rouges du sang |
JP2720161B2 (ja) | 1988-02-01 | 1998-02-25 | 株式会社アドバンス | 細胞変形能測定装置 |
JP2685544B2 (ja) | 1988-11-11 | 1997-12-03 | 株式会社日立製作所 | 血液フィルタおよび血液検査方法並びに血液検査装置 |
JP2532707B2 (ja) | 1990-03-08 | 1996-09-11 | 佑二 菊池 | 血液回路及びこれを用いた血液測定装置及び血液測定方法 |
SG46225A1 (en) | 1990-04-24 | 1998-02-20 | Flustat Pty Limited | Oral vaccine comprising antigen surface-associated with red blood cells |
US5658892A (en) | 1993-01-15 | 1997-08-19 | The General Hospital Corporation | Compound delivery using high-pressure impulse transients |
US6218166B1 (en) | 1994-12-09 | 2001-04-17 | John Wayne Cancer Institute | Adjuvant incorporation into antigen carrying cells: compositions and methods |
JP3926842B2 (ja) | 1995-03-08 | 2007-06-06 | ザ・スクリプス・リサーチ・インステイチユート | 抗原提示系およびt−細胞の活性化方法 |
US6051409A (en) | 1995-09-25 | 2000-04-18 | Novartis Finance Corporation | Method for achieving integration of exogenous DNA delivered by non-biological means to plant cells |
ATE234622T1 (de) | 1995-12-04 | 2003-04-15 | Puget Sound Blood Ct | Nicht-immunogene blutplättchen und rote blutzellen enthaltende zubereitungen |
JP2000516911A (ja) | 1996-03-28 | 2000-12-19 | ホワイトヘッド インスティテュート フォー バイオメディカル リサーチ | オプソニン強化細胞、および抗原に対する免疫応答を調節する方法 |
US5885470A (en) | 1997-04-14 | 1999-03-23 | Caliper Technologies Corporation | Controlled fluid transport in microfabricated polymeric substrates |
DE69732225T2 (de) | 1997-05-05 | 2005-06-23 | Dideco S.R.L., Mirandola | Verfahren zur Verkapselung von biologisch aktiven Stoffen in Erythrocyten und Gerät dafür |
US5842787A (en) | 1997-10-09 | 1998-12-01 | Caliper Technologies Corporation | Microfluidic systems incorporating varied channel dimensions |
WO2003046171A1 (en) | 2001-11-27 | 2003-06-05 | Cellectricon Ab | A method for combined sequential agent delivery and electroporation for cell structures and use thereof |
SE9704076D0 (sv) | 1997-11-06 | 1997-11-06 | Holdingbolaget Vid Goeteborgs | Method for permeabilisation of cell structures and use thereof |
GB9816583D0 (en) | 1998-07-31 | 1998-09-30 | Univ Ulster | Nucleic acid carrier |
AU5757100A (en) | 1999-06-21 | 2001-01-09 | General Hospital Corporation, The | Methods and devices for cell culturing and organ assist systems |
JP2002325572A (ja) | 2000-12-25 | 2002-11-12 | Univ Osaka | 外来物質の導入方法 |
AU2002252073A1 (en) | 2001-02-22 | 2002-09-12 | The Scepens Eye Research Institute, Inc. | Tolerogenic antigen presenting cells and in treating immune-inflammatory conditions |
WO2003020039A1 (en) | 2001-08-28 | 2003-03-13 | Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center | Immune tolerance to predetermined antigens |
US20030133922A1 (en) | 2002-01-15 | 2003-07-17 | Kasha John R. | Oral tolerance using allogeneic platelets in ITP |
US7501278B2 (en) | 2002-06-05 | 2009-03-10 | Panasonic Corporation | Extracellular potential measuring device and method for fabricating the same |
GB0214528D0 (en) | 2002-06-24 | 2002-08-07 | Univ Aberdeen | Materials and methods for induction of immune tolerance |
WO2004063342A2 (en) | 2003-01-09 | 2004-07-29 | Invitrogen Corporation | Cellular delivery and activation polypeptide-nucleic acid complexes |
US20060134067A1 (en) * | 2003-02-18 | 2006-06-22 | Maxcyte, Inc. | Loading of cells with antigens by electroporation |
JP4116057B2 (ja) * | 2004-06-17 | 2008-07-09 | 研 中田 | 生体力学的刺激負荷装置 |
CN101905879B (zh) | 2004-07-27 | 2012-05-30 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 用于制备碳纳米管/超高摩尔质量聚乙烯复合纤维的方法 |
US20060134772A1 (en) * | 2004-11-18 | 2006-06-22 | The Regents Of The University Of California | System for locating cells and for cellular analysis |
US8420078B2 (en) | 2005-03-10 | 2013-04-16 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Methods and immunogenic cell preparations for treating antigen-associated diseases |
US7704743B2 (en) | 2005-03-30 | 2010-04-27 | Georgia Tech Research Corporation | Electrosonic cell manipulation device and method of use thereof |
US7993821B2 (en) | 2005-08-11 | 2011-08-09 | University Of Washington | Methods and apparatus for the isolation and enrichment of circulating tumor cells |
WO2007067032A1 (en) | 2005-12-09 | 2007-06-14 | Academisch Medisch Cemtrum Bij De Universiteit Van Amsterdam | Means and methods for influencing the stability of cells |
WO2007097934A2 (en) | 2006-02-17 | 2007-08-30 | Elusys Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for using erythrocytes as carriers for delivery of drugs |
US20070249038A1 (en) * | 2006-04-21 | 2007-10-25 | Andrea Adamo | Microfluidic device for single cell targeted operations |
EP2054499A2 (en) | 2006-08-17 | 2009-05-06 | Massachusetts Institute of Technology | Method and apparatus for microfluidic injection |
US20080311140A1 (en) | 2007-05-29 | 2008-12-18 | Baylor College Of Medicine | Antigen specific immunosuppression by dendritic cell therapy |
US8841135B2 (en) | 2007-06-20 | 2014-09-23 | University Of Washington | Biochip for high-throughput screening of circulating tumor cells |
WO2008156021A1 (ja) | 2007-06-21 | 2008-12-24 | National University Corporation Nagoya University | 細胞壁を備える細胞に外来物質を導入する方法 |
FR2919804B1 (fr) | 2007-08-08 | 2010-08-27 | Erytech Pharma | Composition et vaccin therapeutique anti-tumoral |
GB0718160D0 (en) | 2007-09-18 | 2007-10-24 | Medical Res Council | Methods |
EP2057998A1 (en) | 2007-10-31 | 2009-05-13 | Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf | Use of modified cells for the treatment of multiple sclerosis |
CN101874201B (zh) | 2007-11-28 | 2012-08-15 | 柯尼卡美能达精密光学株式会社 | 血液流动性测量装置及血液流动性测量方法 |
JP2010002582A (ja) | 2008-06-19 | 2010-01-07 | Konica Minolta Business Technologies Inc | 画像形成装置 |
WO2010010513A2 (en) | 2008-07-21 | 2010-01-28 | Trium Investments (Pty) Limited | Solar panel mounting arrangement |
JP5137129B2 (ja) | 2008-07-23 | 2013-02-06 | 国立大学法人山口大学 | 血液細胞の力学的特性測定装置 |
US8211656B2 (en) | 2008-08-13 | 2012-07-03 | The Invention Science Fund I, Llc | Biological targeting compositions and methods of using the same |
US20110091973A1 (en) | 2008-12-09 | 2011-04-21 | Glaser Larry F | Modified and fusion enhanced erythrocytes, cells and uses thereof |
US9157550B2 (en) | 2009-01-05 | 2015-10-13 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Microfluidic systems and methods |
WO2010105135A1 (en) | 2009-03-13 | 2010-09-16 | Tufts University | Methods, apparatuses, and kits for introducing genetic material into living cells |
US9017991B2 (en) | 2009-03-13 | 2015-04-28 | Tufts University | Methods tip assemblies and kits for introducing material into cells |
SG174373A1 (en) | 2009-03-20 | 2011-10-28 | Agency Science Tech & Res | Devices for separating cells and methods of using them |
WO2010129671A2 (en) | 2009-05-08 | 2010-11-11 | Chauncey Sayre | Method of and apparatus for changing one type of cell into another type of cell |
GB0909754D0 (en) | 2009-06-05 | 2009-07-22 | Magnani Mauro | Drug delivery systems |
CA2766907A1 (en) | 2009-07-06 | 2011-01-13 | Novartis Ag | Self replicating rna molecules and uses thereof |
AU2010311515B2 (en) | 2009-10-27 | 2014-02-20 | Erytech Pharma | Composition to induce specific immune tolerance |
WO2011078665A1 (en) | 2009-12-21 | 2011-06-30 | Keygene N.V. | Improved techniques for transfecting protoplasts |
WO2011084882A2 (en) | 2010-01-05 | 2011-07-14 | Contrafect Corporation | Methods and compositions for enhanced immunological therapy and targeting of gram-positive bacteria |
US8844570B2 (en) | 2010-02-01 | 2014-09-30 | California Institute Of Technology | Generating binary states using a microfluidic channel |
JP5704590B2 (ja) | 2010-02-05 | 2015-04-22 | 国立大学法人東京農工大学 | サイズ選択マイクロキャビティアレイを用いた循環腫瘍細胞の検出 |
US20110287948A1 (en) | 2010-03-22 | 2011-11-24 | Massachusetts Institute Of Technology | Measurement of material properties and related methods and compositions based on cytoadherence |
WO2012097450A1 (en) | 2011-01-19 | 2012-07-26 | The University Of British Columbia | Apparatus and method for particle separation |
WO2012118799A2 (en) | 2011-02-28 | 2012-09-07 | President And Fellows Of Harvard College | Cell culture system |
CN116179323A (zh) | 2011-05-27 | 2023-05-30 | 不列颠哥伦比亚大学 | 用于高通量分析的微流控细胞捕获和分析设备 |
MX2013013243A (es) | 2011-07-05 | 2014-05-30 | Sotio As | Medios y metodos para activar la inmunoterapia celular del cancer utilizando celulas cancerosas destruidas mediante presion hidrostatica y celulas dendriticas. |
US20130065314A1 (en) | 2011-08-25 | 2013-03-14 | Phytocentric Biotech Inc. | Algal transformation systems, compositions and methods |
PT2768942T (pt) | 2011-10-17 | 2020-01-21 | Massachusetts Inst Technology | Entrega intracelular |
CN104684546A (zh) | 2012-06-07 | 2015-06-03 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 用于药物靶向的纳米疗法 |
US9255245B2 (en) | 2012-07-03 | 2016-02-09 | Agilent Technologies, Inc. | Sample probes and methods for sampling intracellular material |
CN102925337B (zh) | 2012-11-08 | 2014-06-18 | 武汉友芝友生物制药有限公司 | 一种微流体细胞捕获芯片及其制备方法 |
US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
GB201300049D0 (en) | 2013-01-03 | 2013-02-20 | Transimmune Ag | Method for obtaining immuno-stimulatory dendritic cells |
GB201300052D0 (en) | 2013-01-03 | 2013-02-20 | Transimmune Ag | Method for obtaining immuno-suppressive dendritic cells |
WO2014120956A1 (en) | 2013-01-30 | 2014-08-07 | Asta Fluidic Technologies, Inc. | Microfluidic-based fetal red blood cell detection |
US9725709B2 (en) | 2013-03-12 | 2017-08-08 | OpenCell Technologies, Inc. | Intracellular delivery and transfection methods and devices |
CA2905999A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | The Regents Of The University Of California | High-throughput cargo delivery into live cells using photothermal platforms |
KR20140115560A (ko) | 2013-03-21 | 2014-10-01 | 인하대학교 산학협력단 | 기계적 스트레스를 이용한 단세포 생물체 개질 방법 및 이에 사용되는 장치 |
PT2981607T (pt) | 2013-04-03 | 2020-11-20 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Geração eficaz de células t direcionadas a tumores, derivadas de células estaminais pluripotentes |
PL3033184T3 (pl) | 2013-08-16 | 2021-09-20 | Massachusetts Institute Of Technology | Selektywne dostarczanie materiału do komórek |
CA2927947A1 (en) | 2013-10-22 | 2015-04-30 | Cellanyx Diagnostics, Llc | Systems, devices and methods for microfluidic culturing, manipulation and analysis of tissues and cells |
WO2015103331A1 (en) | 2013-12-31 | 2015-07-09 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Methods and systems for continuous flow cell lysis in a microfluidic device |
EP3125927B1 (en) | 2014-04-01 | 2021-01-27 | Rubius Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for immunomodulation |
EP3800248A3 (en) | 2014-04-18 | 2021-08-04 | Editas Medicine, Inc. | Crispr-cas-related methods, compositions and components for cancer immunotherapy |
US10947526B2 (en) | 2014-07-03 | 2021-03-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Microfluidic assay for rapid optimization of cell electroporation |
AU2015338893A1 (en) | 2014-10-31 | 2017-05-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Delivery of biomolecules to immune cells |
JP6846345B2 (ja) | 2014-11-14 | 2021-03-24 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | 破壊及び場による細胞への化合物及び組成物の送達 |
WO2016094715A2 (en) | 2014-12-10 | 2016-06-16 | Berkeley Lights, Inc. | Movement and selection of micro-objects in a microfluidic apparatus |
EP3242946A4 (en) | 2015-01-07 | 2018-09-26 | Indee. Inc. | A method for mechanical and hydrodynamic microfluidic transfection and apparatus therefor |
CN107250373A (zh) | 2015-01-12 | 2017-10-13 | 麻省理工学院 | 通过微流体递送实现的基因编辑 |
WO2016183482A1 (en) | 2015-05-13 | 2016-11-17 | Rubius Therapeutics, Inc. | Membrane-receiver complex therapeutics |
GB201513278D0 (en) | 2015-07-03 | 2015-09-09 | Transimmune Ag And Yale University | Device and method for obtaining immunostimulatory antigen-presenting cells |
CN107922911A (zh) | 2015-07-09 | 2018-04-17 | 麻省理工学院 | 将物质递送至无核细胞 |
EP3344575B1 (en) | 2015-09-04 | 2020-04-15 | SQZ Biotechnologies Company | Intracellular delivery of biomolecules to cells comprising a cell wall |
EP3344747B1 (en) | 2015-09-04 | 2022-11-09 | SQZ Biotechnologies Company | Intracellular delivery of biomolecules mediated by a surface with pores |
JP2018538343A (ja) | 2015-12-22 | 2018-12-27 | サングイ バイオ ピーティーワイ. エルティーディー | 赤血球を用いる治療方法 |
LT3402491T (lt) | 2016-01-11 | 2022-02-25 | Rubius Therapeutics, Inc. | Kompozicijos ir būdai, susiję su daugiamodalinėmis terapinėmis ląstelių sistemomis, skirti vėžio indikacijoms |
CN116218916A (zh) | 2016-01-12 | 2023-06-06 | Sqz生物技术公司 | 复合物的细胞内递送 |
CN109415741A (zh) | 2016-05-03 | 2019-03-01 | Sqz生物技术公司 | 细胞内递送生物分子以诱导耐受性 |
US20210138050A1 (en) | 2016-05-03 | 2021-05-13 | Sqz Biotechnologies Company | Intracellular delivery of biomolecules to induce tolerance |
US20170326213A1 (en) | 2016-05-16 | 2017-11-16 | Augusta University Research Institute, Inc. | Protein-Coupled Red Blood Cell Compositions and Methods of Their Use |
CN106244543A (zh) | 2016-07-29 | 2016-12-21 | 北京时合生物科技有限公司 | 一种pbmc体外诱导分化成为树突状细胞的方法 |
WO2018089497A1 (en) | 2016-11-08 | 2018-05-17 | Georgia Tech Research Corporation | Methods for convectively-driven intracellular delivery |
WO2020041480A1 (en) * | 2018-08-21 | 2020-02-27 | The Regents Of The University Of California | High-throughput system and method for the temporary permeabilization of cells using lipid bilayers |
CN114867556B (zh) * | 2019-11-06 | 2023-09-15 | 高丽大学校算学协力团 | 将材料输送到细胞内的基于液滴变形方法和用于其的芯片 |
EP4277981A1 (en) * | 2021-01-13 | 2023-11-22 | The General Hospital Corporation | Viscoelastic mechanoporation systems and methods of use thereof |
WO2022207717A1 (en) * | 2021-04-01 | 2022-10-06 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Multistage device and method for intracellular delivery |
EP4324926A1 (en) * | 2021-04-12 | 2024-02-21 | MxT Biotech | Intracellular delivery platform |
-
2012
- 2012-10-17 PT PT128413291T patent/PT2768942T/pt unknown
- 2012-10-17 HU HUE12841329A patent/HUE047507T2/hu unknown
- 2012-10-17 RU RU2014119926A patent/RU2656156C2/ru active
- 2012-10-17 EP EP12841329.1A patent/EP2768942B1/en active Active
- 2012-10-17 WO PCT/US2012/060646 patent/WO2013059343A1/en active Application Filing
- 2012-10-17 SI SI201231714T patent/SI2768942T1/sl unknown
- 2012-10-17 LT LTEP12841329.1T patent/LT2768942T/lt unknown
- 2012-10-17 CN CN201710109954.XA patent/CN107058101B/zh active Active
- 2012-10-17 DK DK12841329.1T patent/DK2768942T3/da active
- 2012-10-17 JP JP2014537184A patent/JP6219832B2/ja active Active
- 2012-10-17 BR BR112014009346-6A patent/BR112014009346B1/pt active IP Right Grant
- 2012-10-17 US US14/352,354 patent/US10696944B2/en active Active
- 2012-10-17 EP EP19187758.8A patent/EP3608394A1/en active Pending
- 2012-10-17 PL PL12841329T patent/PL2768942T3/pl unknown
- 2012-10-17 RS RS20200038A patent/RS59898B1/sr unknown
- 2012-10-17 CN CN201280060689.6A patent/CN103987836B/zh active Active
- 2012-10-17 ES ES12841329T patent/ES2764105T3/es active Active
- 2012-10-17 AU AU2012326203A patent/AU2012326203B2/en active Active
- 2012-10-17 KR KR1020147013150A patent/KR102058568B1/ko active IP Right Grant
- 2012-10-17 CA CA2852672A patent/CA2852672C/en active Active
- 2012-10-17 CN CN202110519751.4A patent/CN113337402A/zh active Pending
-
2017
- 2017-09-28 JP JP2017187368A patent/JP6629272B2/ja active Active
-
2018
- 2018-09-25 US US16/141,107 patent/US20190093073A1/en not_active Abandoned
-
2020
- 2020-01-13 HR HRP20200051TT patent/HRP20200051T1/hr unknown
- 2020-03-13 US US16/818,021 patent/US20200277566A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2424792C2 (ru) * | 2004-05-03 | 2011-07-27 | Хермес Байесайенсиз, Инк. | Липосомы, используемые для доставки лекарственных средств |
US20070243523A1 (en) * | 2006-03-31 | 2007-10-18 | Fluxion Biosciences Inc. | Methods and Apparatus for the Manipulation of Particle Suspensions and Testing Thereof |
US20090280518A1 (en) * | 2008-05-12 | 2009-11-12 | Massachusetts Institute Of Technology | System for high throughput measurement of mechanical properties of cells |
WO2010016800A1 (en) * | 2008-08-08 | 2010-02-11 | Agency For Science, Technology And Research | Microfluidic continuous flow device |
US20110030808A1 (en) * | 2009-08-08 | 2011-02-10 | The Regents Of The University Of California | Pulsed laser triggered high speed microfluidic switch and applications in fluorescent activated cell sorting |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
HALLOW D.M. et al. "Shear-Induced Intracellular Loading of Cells With Molecules by Controlled Microfluidics", Biotechnology and Bioengineering, 2008, v.99, no.4, p.846-854. * |
SHELBY ET AL. "A microfluidic model for single-cell capillary obstruction by Plasmodium falciparum infected erythrocyte", PROC. NAT. ACAD. SCI., 2003, v.100, no.25, p.14618-14622. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2656156C2 (ru) | Внутриклеточная доставка | |
US10364441B2 (en) | Methods tip assemblies and kits for introducing material into cells | |
Huang et al. | On-demand intracellular delivery of single particles in single cells by 3D hollow nanoelectrodes | |
JP7046795B2 (ja) | 細孔を有する表面によって媒介される生体分子の細胞内送達 | |
CN107002089B (zh) | 化合物和组合物向细胞中的破坏和场实现的递送 | |
Tiefenboeck et al. | Intracellular delivery of colloids: Past and future contributions from microinjection | |
WO2014102539A1 (en) | Delivery method using mesoporous silica nanoparticles | |
Huang et al. | Light-Patterned RNA Interference of 3D-Cultured Human Embryonic Stem Cells. | |
US20230130686A1 (en) | Devices and systems for delivery of materials to cells | |
Sharei et al. | Intracellular delivery of biomolecules by mechanical deformation | |
Sharei | Cell squeezing: a vector-free microfluidic platform for intracellular delivery of macromolecules | |
Fard | Developing 3D brain models for cell surface sugar targeting with bio-conjugated nanodiamonds | |
CN111363762A (zh) | 一种向细胞内传递外源性分子的方法 | |
Xu | Engineering Cell Access Using Nanostraws | |
Zhao | Micro/Nanofluidics Based Electroporation for Precise Material Delivery to Cells | |
Schneiderc et al. | A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery |