KR102058568B1 - 세포 내 전달 - Google Patents

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KR102058568B1
KR102058568B1 KR1020147013150A KR20147013150A KR102058568B1 KR 102058568 B1 KR102058568 B1 KR 102058568B1 KR 1020147013150 A KR1020147013150 A KR 1020147013150A KR 20147013150 A KR20147013150 A KR 20147013150A KR 102058568 B1 KR102058568 B1 KR 102058568B1
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안드레아 아다모
로버트 랭거
클래브스 에프 젠슨
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메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
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Abstract

세포막에 변화(perturbations)를 주기 위한 미세유체 시스템으로, 상기 시스템은 루멘(lumen)으로 한정하고 미세유체 채널을 통해서 버퍼에 현탁된 세포가 통과할 수 있게 배치된 미세유체 채널을 포함하는 시스템으로, 상기 미세유체 채널은 세포 변형 협착부(cell-deforming constriction)를 포함하고 상기 협착부의 직경은 상기 세포 직경의 함수이다.

Description

세포 내 전달{INTRACELLULAR DELIVERY}
관련 출원
본 특허출원은 2011년 10월 17일 출원된 미국 가출원 번호 611548,013 및 2012년 8월 17일 출원된 미국 가출원 611684,301에 우선권을 주장하며, 그 모든 내용은 참고문헌으로 본 특허출원에 병합된다.
연방-지원 연구에 해당함
본 발명의 적어도 일 부분은, 국립보건원으로부터 수여된 그랜트(Grant) 5 RCI EB011187-02 하에, 정부 지원을 받아 만들어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
배경기술
많은 의약품들은 주로 저분자 약물 개발에 초점을 맞추고 있다. 이러한 약물은 이른바, 비교적 작은 크기 때문에 신체 전체에서 그들이 목표하는 지점으로 자유롭게 용해될 수 있다. 이러한 분자들은 또한 주로 방해 받지 않고 다른 방법으로 불투과성 세포막을 가로 질러 미끄러질 수 이다. 그러나 차세대 단백질, DNA 또는 RNA 기반 치료는, 쉽게 세포막을 통과할 수 없고, 따라서 전달을 용이하게 하는 세포적 변형을 필요로 한다. 확립된 방법은 막을 돌파하고 세포질로 물질을 전달하기 위해 화학 물질이나 전기 펄스를 사용하는 것이다. 적절한 세포 내 전달은 차세대 치료의 연구, 개발, 구현에 있어서 중요한 단계이다.
종래의 방법은 종종 개발이 어렵고, 이들의 특정한 적용에 매우 구체적이다. 또한 이러한 줄기 세포 및 면역 세포 등, 많은 임상적으로 중요한 세포 유형은 종래의 방법에 따라 적절하게 처리되지 않는다. 따라서 현대 의학/생물학 연구의 요구를 충족할 수 있는 보다 강력하고 정확한 기술이 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명은 제어된 손상, 예를 들어, 세포에 협착, 급속한 스트레칭, 급속한 압축 또는 높은 전단 속도의 펄스를 실시하는 것은 주위의 세포 미디엄으로부터 세포의 세포질로 분자를 수용한다는 놀라운 발견에 근거한다. 따라서, 본 발명은 진핵 세포에 물질(예를 들어, 화합물 또는 조성물)의 직접-세포질 내로 전달하는 벡터-프리 마이크로 유체 플랫폼을 제공한다. 본 발명의 장치는 표적 세포에 원하는 분자를 전달하기 위해 다목적으로 널리 적용될 수 있는 실험실 도구로서 유용하다. 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 세포 내에 분자의 전달은 예를 들어, 협착 및/또는 압력을 통한 세포의 속도와 선형 또는 단조롭게 비례한다. 예를 들면, 본 발명의 장치를 통한 세포 현탁액의 50 μl는 몇 초 내에 장치를 통해서 이동한다. 처리량은 채널 당 1 cell/second (또는 그 이하)에서 채널 당 1,000 cells/second 이상의 범위이다. 협착을 통한 일반적인 세포 속도는 10 mm/second 내지 500 mm/second 를 포함하고, 세포 속도는 10 m/s (또는 그 이상) 일 수도 있다. 전체 시스템의 처리량을 향상시키기 위해 추가 채널을 병렬로 배치할 수 있다.
분자의 수용은 확산-기반이 아닌 엔도사이토시스(endocytosis)이다. 즉, 페이로드(payload)(세포에 전달되는 화합물(들))가 세포질에 존재하기보다는 본 발명의 장치를 통한 관의 엔도솜(endosomes)에 존재한다. 세포 처리 후 엔도솜 내에 어떤 페이로드가 나타나지도, 조금 존재하지도 않는다. 예를 들어, 큰 분자들은 작은 분자들보다 더 천천히 전달된다. 제어된 세포 스트레칭 및 협착을 통한 세포의 이동 속도는 세포의 생존성 및 온전성을 유지하면서 표적 분자로 우수하게 전달된다. 처리 후, 세포 생존률은 예를 들어 70-100 % 사이이다. 예를 들어, 전형적인 생존률은 처리 후 90 %이다. 비교하면, 초 또는 밀리 초로 자립형 고속 전단 속도를 사용한 이전의 전달 방법은 처리 후 세포 생존률이 저조할 수 있다. 종래 기술과는 대조적으로 본 발명의 방법은 세포가 협착을 통해 통과할 때, 약 100 마이크로 초의 아주 짧은 시간에 100-1000 Pa 범위의 전단 펄스로 전달되는 세포를 제공한다. 본 기술은, 그러나, 종래의 기술과는 근본적으로 다르다. 본 기술은 종래의 기술과는 다른 전단력을 부과 할 수 있는 협착부를 통과함으로써, 바람직하게는 세포의 전체적인 기계적 변형이 존재한다. 바람직한 실시예에서, 세포들은 전류를 받지 않는다. 다른 실시예에서, 조합 처리가 사용된다. 예를 들어 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 본 명세서에서 사용되는 장치의 기계적 변형이 예측된다 (침투성 협착의 유형으로, 여기에서 전류는 세포막의 일시적인 구멍을 생성 하는데 사용되며, 핵산 또는 매크로몰(macromoles)의 유입을 허용하게 한다).
페이로드는 세포 내에 전달되는 화합물 또는 조성물이다. 예를 들어, 페이로드는 단백질, 형광 다이, 퀀텀 닷, 탄소 나노 튜브, RNA 분자, DNA 분자, 항원 및 기타 고분자, 나노 입자 및 물질의 조성물을 포함할 수 있다.
장치의 협착의 너비(width)는, 협착된 부분의 길이, 입사 영역의 기하학적 구조, 그리고 장치의 채널 깊이는 세포로의 분자 전달에 영향을 미친다. 바람직하게는 도관의 협착된 부분의 너비는 직경이 4㎛ 이내이며, 도관의 협착된 부분의 길이는 40-50㎛ 사이인 것이 바람직하다. 협착된 부분의 길이는 일반적으로 90㎛을 초과하지 않는다. 협착된 부분의 직경은 처리되어야 할 세포의 종류에 관련된다. 후술하는 바와 같이, 상기 직경은 세포 의 직경보다 작다(예를 들어, 세포의 직경의 20-99 %). 많은 세포는 직경 5-15㎛ 이다. 예를 들어, 수지상 세포는 직경이 7-8㎛ 이다. 예를 들어, 협착부의 직경은 단일 세포의 처리를 위해 4.5, 5, 5.5, 6 또는 6.5㎛ 이다. 다른 예에서, 인간 난(human egg)을 처리하기 위한 협착된 부분의 사이즈/직경은 더 크거나 작은 협착이 가능하지만, 6.2㎛ 내지 8.4㎛ 사이이다 (인간 난자의 직경은 약 12㎛). 또 다른 예는, 배아 (예를 들어, 2-3 세포 클러스터(cluster))는 12㎛및 17㎛ 사이의 협착 직경을 사용하여 처리된다.
본 발명의 장치 및 방법은 수지상 세포와 같은 전문적인 항원 제시 세포를 이용한 백신의 개발 및 제조에 유용하다. 예를 들어, 항원 제시를 자극하는 방법은, 임시 협착 또는 높은 전단 펄스와 같이 제어된 상처에 수지상 세포를 주입하는 것 및 표적 항원을 포함하는 용액으로 수지상 세포를 접촉시키는 것으로 이루어진다. 이 방법은 종래 자극 방법에 비해 매우 활성화된 항원 제시 세포를 얻을 수 있다. 백신 생산은 협착-포함 장치(이로써 급속 스트레칭 사건에 세포를 주입하는)를 통해 수지상 세포 또는 다른 항원 제시 세포를 추진하고, 이 후 페이로드(예를 들어, 항원)를 포함하는 용액에 세포를 인큐베이팅 함으로써 이루어진다. 세포의 급속한 변형 후 하나 또는 그 이상의 항원을 함유하는 세포 배양 배지에 담겨 있는 세포는, 그러나 상기 세포는 급속 변형 사건/프로세스의 이전, 동안, 및/또는 후에 항원과 접촉할 수 있다.
계면 활성제(예를 들어, 0.1-10 % w/w)가 선택적으로 플로우 버퍼에(flow buffer)에서 사용된다(예를 들어, 폴록사머(poloxamer), 동물 유래 혈청, 알부민 단백질). 세포로의 분자의 송달은 계면 활성제의 존재에 의해 영향을 받지 않는다; 그러나 계면 활성제는 선택적으로 작동하는 동안 장치의 막힘을 줄이기 위해 사용된다.
장치는 실리콘, 금속(예를 들어, 스테인레스 스틸), 플라스틱(예를 들어, 폴리스티렌), 세라믹 또는 마이크론 규모의 특성을 에칭(etching)하기 적합하고, 세포가 통과하는 하나 또는 그 이상의 채널 또는 도관을 포함하는 임의의 다른 재료로 만들어진다. 실리콘은 특히 적당하다. 이것은 미세 패턴 형성 방법이 실리콘에 잘 확립되어 있기 때문이며, 따라서 새로운 장치 제조, 디자인 변경 등이 쉽다. 또한 실리콘 의 강성은 폴리디메틸실록산(PDMS), 예를 들어 높은 전달 속도, 과 같은 보다 유연한 기판상의 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 장치는 2, 10, 20, 25,45, 50, 75, 100 또는 그 이상의 채널을 포함한다. 장치는 실리콘을 에칭하여 미세 가공된다. 세포는 압력을 적용하여 채널 또는 도관을 통해 예를 들어, 밀어서, 이동된다. 세포 드라이버(cell driver)가 압력을 가할 수 있다. 세포 드라이버는, 예를 들어, 압력 펌프, 가스 실린더, 컴프레서, 진공 펌프, 시린지, 시린지 펌프, 연동 펌프, 매뉴얼 시린지, 파이펫, 피스톤, 캐필러리 액터(capillary actor), 중력 등을 포함할 수 있다. 채널의 대안으로, 세포는 네트(net) 또는 밀접하게-배치된 플레이트 모양의 협착을 통과시킬 수 있다. 두 경우 모두, 세포 횡단을 통한 협착의 너비은, 자연, 즉, 스트레스를 받지 않은 상태에서, 자연적으로 처리될 세포의 너비 또는 직경의 20-99 % 이다. 온도는 조성물의 수용에 영향을 미치고, 생존율에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명의 방법은 상온 (예를 들어, 20 ℃), 생리적 온도(예를 들어, 39 ℃), 생리적 온도 보다 높게, 또는 저하된 온도(예를 들어, 4 ℃) 또는 이들의 전형적인 온도 사이의 온도에서 수행된다.
협착, 스트레칭(stretching) 및/또는 높은 전단 속도의 펄스에 의한 제어된 세포의 손상 후, 세포들은 세포 내에 도입하길 원하는 어떤 화합물 또는 분자를 함유하는 전달 용액에서 인큐베이션된다. 제어된 손상은 작은, 예를 들어, 200 nm의 직경, 세포막의 결함으로 특징지어질 수 있다. 세포의 회복 기간은 협착을 통과함으로써 발생하는 손상을 닫기 위한 몇 분 정도이다. 전달 기간은 상온에서 작동될 때, 1-10 분 또는 그 이상, 예를 들어, 15, 20, 30, 60 분 또는 그 이상을 포함하며, 2-5 분에 최적이다. 전달 용액에서 인큐베이션되는 긴 기간은 반드시 흡수 증가를 내지 않는다. 예를 들어, 데이터는 5분 후에, 세포의 흡수가 거의 없거나 또는 전혀 추가되지 않은 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명은 세포에 약물 전달 분야에서의 종래 방법과 관련된 단점에 대해, 그리고 오래된 문제에 대한 해결책을 제공한다.
진핵 세포로의 물질의 전달에 관하여, 세포들은 2 개의 주요 카테고리로 분류될 수 있다:
1) 전달-용이(ETD, Easy-to-deliver) 세포: 대부분의 이용 가능한 화학 물질 및 바이러스 방법들이 본 카테고리로 분류된다. 전달-용이 세포들은 종종 직접적으로 임상적 관련성이 없다.
2) 전달-곤란(DTD, Difficult-to-deliver) 세포: 높은 임상적 관련성. 전달 기술의 진보는 현저하게 새 치료법의 개발을 가속/활성화 할 수 있다. 본 카테고리는 줄기 세포, 1차 전지 세포(primary cells) 및 면역 세포를 포함한다. DTD의 전달 시장은 신규 RNA, 줄기 세포 및 단백질 기반 치료제로서 앞으로 몇 년 동안 기세를 얻어 비약적으로 성장될 것으로 예상된다.
비록 동일한 기술이 ETD 세포로 사용될 수 있지만, 본 명세서에 기재된 기술은 DTD의 연구 분야에 특히 유용하다는 것을 증명하고 있다. 또한, ETD 또는 DTD 세포 모두에 대해 어떤 다른 방법에 의해서도 효과적으로 전달될 수 없는, (예를 들어, 퀀텀 닷, 탄소 나노 튜브 및 항체 등) 물질의 전달을 용이하게 한다.
일반적으로 한 예에서, 본 발명의 구체예는 세포막에 협착을 일으키기 위한 마이크로 유체 시스템을 제공한다. 상기 시스템은 루멘(lumen)으로 한정하고(defining) 미세유체 채널을 통해서 버퍼에 현탁된 세포가 통과할 수 있게 배치된 미세유체 채널을 포함하는 시스템으로, 상기 미세유체 채널은 협착부(constriction)를 포함하고 상기 협착부의 직경은 상기 세포 직경의 함수이다.
본 발명의 구체예는 다음과 같은 특징의 하나 또는 그 이상을 제공할 수 있다. 상기 협착부의 직경은 실질적으로 이를 통과하는 상기 세포 직경의 실질적으로 20-99%이다. 상기 채널의 교차 섹션(cross-section)은 원형, 타원형, 길게 늘어진 슬릿(slit), 정사각형, 육각형 및 삼각형으로 구성된 군으로부터 선택된다. 상기 협착부는 입구부(entrance portion), 센터포인트(centerpoint) 및 출구부(exit portion)를 포함한다. 상기 입구부는 협착 각도(constriction angle)로 정의하고, 상기 협착각은 상기 채널의 막힘을 감소시키도록 최적화된다. 마이크로 유체 시스템은 또한 병렬로 배치 된 마이크로 유체 채널을 복수 개, 예를 들어, 2, 5, 10, 20, 40, 45, 50, 75, 100, 500, 1000 또는 그 이상을 포함한다.
일반적으로, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 또한 세포 내에 화합물을 전달하기 위한 방법을 제공 할 수 있다. 상기 방법은 현탁액에 세포를 제공하거나 또는 용액에 세포 및 페이로드를 현탁하는 것을 제공하고; 협착부를 포함하는 미세 유체 채널을 통해 용액을 통과하고; 상기 세포 직경의 함수로서 상기 협착부의 크기를 맞추고(sizing); 협착부를 포함하는 미세유체 채널을 통해 상기 용액을 통과시키고; 상기 세포를 상기 협착부를 통해 통과시킴으로써 상기 세포에 압력이 가해져서 페이로드가 지나가기에 충분한 크기의 세포 변화(perturbations)가 일어나고; 그리고 세포가 상기 협착부를 통과한 이후에 미리 설정한 시간 동안 페이로드 포함 용액에서 상기 세포를 인큐베이팅 하는; 것을 포함한다.
본 발명의 구체예는 다음과 같은 특징의 하나 또는 이상을 제공할 수 있다. 상기 협착부의 직경은 실질적으로 세포 직경의 20-99%이다. 상기 마이크로 유체 채널의 교차 섹션(cross-section)은 원형, 타원형, 길게 늘어진 슬릿(slit), 정사각형, 육각형 및 삼각형으로 구성된 군으로부터 선택된다. 상기 용액을 통과시키는 것은 상기 용액이 상기 협착부의 입구부(entrance portion), 센터포인트(centerpoint) 및 출구부(exit portion )를 통해 통과시키는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 상기 입구부의 협착 각도를 조절하여 상기 미세유체 채널이 막히는 것을 감소시키는 것을 더 포함한다. 상기 용액은 병렬로 배열된 복수 개의 미세 유체 채널을 통과하는 것을 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 또 다른 구체예는 또한 세포 내에 화합물을 전달하기 위한 방법을 제공 할 수 있다. 상기 방법은 용액에 세포를 제공하거나 또는 용액에 세포를 현탁하는 것을 제공하고; 협착부를 포함하는 미세 유체 채널을 통해 용액을 통과하고; 상기 세포 직경의 함수로서 상기 협착부의 크기를 맞추고(sizing); 협착부를 포함하는 미세유체 채널을 통해 상기 용액을 통과시키고; 상기 세포를 상기 협착부를 통해 통과시킴으로써 상기 세포에 압력이 가해져서 세포 변화(perturbations)가 일어나고; 그리고 세포가 상기 협착부를 통과한 이후에 미리 설정한 시간 동안 페이로드 포함 용액에서 상기 세포를 인큐베이팅하고; 상기 협착부는 페이로드가 지나가기에 충분한 크기인 것을 포함한다.
본 발명의 구체예는 다음과 같은 특징의 하나 또는 그 이상을 제공할 수 있다. 상기 협착부의 직경은 실질적으로 세포 직경의 20-99%이다. 상기 마이크로 유체 채널의 교차 섹션(cross-section)은 원형, 타원형, 길게 늘어진 슬릿(slit), 정사각형, 육각형 및 삼각형으로 구성된 군으로부터 선택된다. 상기 용액을 통과시키는 것은 상기 용액이 상기 협착부의 입구부(entrance portion), 센터포인트(centerpoint) 및 출구부(exit portion )를 통해 통과시키는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 상기 입구부의 협착 각도를 조절하여 상기 미세유체 채널이 막히는 것을 감소시키는 것을 더 포함한다. 상기 용액을 통과시키는 것은, 직렬과 병렬 중 하나로 배열된 복수 개의 미세유체 채널을 통해 상기 용액이 통과한다. 상기 인큐베이팅은 0.0001초에서 20분(또는 더 길게) 동안 상기 세포를 인큐베이팅하는 것을 포함한다. 상기 압력은 전단(shearing) 및 압축(compression) 중 하나이다.
일반적으로 또 다른 양태에서, 본 발명의 구체예는 또한 세포 내에 화합물을 전달하기 위한 방법을 제공할 수 있다. 상기 방법은 용액에 세포를 제공하거나 또는 용액에 세포를 현탁하는 것을 제공하고; 세포를 변형시킴으로써 세포막에 변화를 일으키고; 그리고 상기 세포가 변형된 후에 페이로드를 가지는 용액 내 세포를 인큐베이팅한다.
본 발명의 구체예는 다음과 같은 특징의 하나 또는 그 이상을 제공할 수 있다. 상기 세포를 변형시키는 것은 상기 세포를 1 μs 에서 10 ms, 예를 들어, 10 μs , 50 μs , 100 μs , 500 μs 및 750 μs 동안 변형시키는 것을 포함한다. 상기 인큐베이팅은 0.0001초에서 20분, 예를 들어, 1 초, 30 초, 90 초, 270 초 및 900 초 동안 일어난다.
본 발명의 다양한 구체예는 다음 기능 중 하나 또는 그 이상을 제공 할 수 있다. 종래 기술과 비교하면 전달의 정확성 및 확장성을 달성할 수 있다. 세포에 물질 의 전달을 자동화할 수 있다. 단백질, RNA , siRNA, 펩타이드, DNA 및 융화 염료 등 의 물질을 세포, 예를 들어, 배아 줄기 세포 또는 유도 다능성 줄기 세포(iPSCs), 1차 전지 세포 또는 불멸화 세포주 등의 세포에 이식할 수 있다. 장치 및 방법은 모든 세포 유형에 적합하고, 협착부의 크기는 치료해야 할 세포 에 맞게 조정된다. 장치 및 방법은 상당한 이점을 제공할 수 있다. 종래 기술과 비교 했을 경우, 예를 들어 전류 시스템의 실험적인 노이즈를 저감할 수 있다. 물질의 전달량은 세포 집단 전체에서 일관될 수 있다. 세포는 개별적이 아닌 일괄적으로 처리될 수 있다. 또한, 본 발명은 세포질의 다양한 나노 입자 및 단백질을 전달하는 매우 독특한 기회를 실증했다. 종래의 방법은 이러한 기능을 수행하기에는 상당히 신뢰성이 없거나 비효율적이다.
민감한 페이로드, 예를 들어, 단백질(특히 거대 단백질, 예를 들어, 30, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500 kDa 또는 그 이상의), 퀀텀 닷 또는 민감하고 전기에 노출되어 손상될 수 있는 기타 페이로드의 전달과 관련하여, 이들은 민감한 페이로드의 완전성과 활성을 유지하면서 안정적으로 세포에 전달된다. 따라서 본 장치 및 방법은 전기천공과 같은 페이로드 조성물을 전기로 주입하고(이것에 의해 페이로드를 손상시킴) 세포 생존률을 낮추는(예를 들어 전기천공 후에 일반적으로 505 또는 그 이상의 세포가 사멸) 종래 기술에 대해 중대한 이점을 갖는다. 급속한 스트레치/변형 방법의 또 다른 이점은 줄기 세포 또는 전구 세포가 처리된 세포의 분화 또는 활성 상태를 변화시키지 않고, 페이로드가 수용되게 한다는 것이다. 또한 치료 목적, 예를 들어, 백신 생산을 위한 세포의 세포질에 조성물을 전달 하는 것 뿐만 아니라, 상기 방법은 분자, 예를 들어, 탐지 가능한 마커를 포함하는 거대 분자를 도입하기 위해, 진단 또는 이미징(imaging)의 목적을 위해 세포 내 구성을 라벨링(label)하거나, 또는 세포 소기관 등 세포 내 구조를 분류하는 데 사용된다.
본 발명의 다양한 구체예는 다음의 기능 중 하나 또는 그 이상을 제공 할 수 있다. DNA는 예를 들어, 줄기 세포, 1차 줄기 세포, 면역 세포와 같은 용량-대- 전달(dose-to-deliver) 세포로 송달될 수 있다. 매우 거대한 플라스미드(심지어 염색체 전체)의 전달을 할 수 있다. 관심 있는 유전자의 발현 수준을 연구하기 위해 유전자 구조물의 알려진 양의 세포로의 정량적 전달 및 이의 농도에 대한 민감성 역시 쉽게 달성될 수 있다. 쉽게/더 효율적으로 안정적인 전달, 상동 재조합, 및 지역-특이적 돌연변이 유발 목적을 달성하기 위해 DNA의 재조합을 강화하는 효소의 알려진 양과 함께 DNA 서열의 알려진 양의 전달을 이룰 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법 및 장치는 또한 보다 효율적인/결정적인 RNA 연구를 위한 RNA 정량적 전달을 위해서도 유용하다. 세포의 세포질로 작은 간섭 RNA( siRNA) 전달 역시 쉽게 달성된다.
본 발명의 다양한 구체예는 다음의 기능 중 하나 이상을 제공 할 수 있다. RNA는 리포좀을 필요로 하지 않고 , RNA 간섭을 위해 세포 내에 전달될 수 있다. 다이서(dicer) 분자의 알려진 양과 RNA 분자의 알려진 양은 다른 조건 하에서 여러 세포주에 걸쳐 표준화된, 효율적인, RNA를 달성하기 위해 송달될 수 있다. mRNA는 전사 후 수준에서 유전자 발현의 규제 측면을 연구 하기 위해 세포 내에 전달 될 수 있다. RNA 및 세포의 반감기를 연구하기 위해 표지된 RNA의 알려진 양이 가능할 수 있다. 보편적인 단백질 전달이 달성될 수 있다. 세포에서 이들의 반감기를 연구하기 위해 알려진 양의 표지 단백질이 전달될 수 있다. 태그된 단백질의 알려진 양이 세포 환경에서 단백질-단백질 상호작용을 연구하기 위해 전달될 수 있다. 면역 염색, 형광 기반 의 웨스턴 블롯을 위한 살아있는 세포 표지된 항체의 전달을 실현할 수 있다.
본 발명의 다양한 구체예는 다음의 임상 및 연구 능력 중 하나 또는 그 이상을 제공할 수 있다. 향상된 스크리닝 및 용량 연구를 위한 세포 모델로 약물의 정량적 전달을 달성할 수 있다. 이 방법은 단백질 치료제를 확인하거나 질병의 메커니즘을 이해하기 위하여 사이토졸의 단백질 활성을 스크리닝하는 고용량 방법으로 효율적으로 사용될 수 있다. 이러한 적용은 현재의 단백질 전달 방법의 비효율성으로 인해 심하게 제한받고 있다. 상기 장치 및 기술은 특정 순환 혈액 세포(예, 림프구), 세포, 특히 난모세포의 동결보존을 향상시키기 위해 고용량으로 당을 세포 속으로 전달, 단백질, mRNA, DNA 및/또는 성장인자의 도입에 의한 표적 세포 분화, iPS 세포 생산을 위해 세포 리프로그래밍(reprogramming)을 유도하기 위한 유전적 또는 단백질 물질의 전달, 유전자 변형 줄기 세포주의 개발을 위해 배아 줄기 세포로 DNA 및/또는 재조합 효소의 전달, 유전자 변형 개체의 발달을 위해 접합체로 DNA 및/또는 재조합 효소의 전달, DC 세포 활성화, iPSC 의 생성 및 줄기 세포 분화, 퀀텀 닷(quantum dots, 퀀텀 닷)의 도입뿐만 아니라 진단 및/또는 기계적 연구를 위한 나노 입자 전달에 유용하다. 성형 수술과 관련하여 사용되는 피부 세포는 또한 본 명세서에 기재된 장치 및 방법을 사용하여 변형된다.
항원 및/또는 면역 자극 분자를 전달하는 방법을 사용하여 항원 제시를 자극하는 방법은 자극의 종래 방법과 비교하여 향상된 활성 수준을 갖고, 제시 세포, 예를 들면 수지상 세포를 생산함으로써, 표적 항원에 대해 면역을 매개하는 T 및 B 세포의 수준을 향상시킨다. 이러한 방법은 따라서, 암 또는 감염에 대한 반응으로 면역계를 활성화하는 수단으로 사용될 수 있다.
스크리닝, 이미징, 진단 목적을 위해 장치는 세포 표지의 방법에 사용된다. 세포를 표지하는 방법은 검출 가능한 마커를 포함하는 용액과 세포를 접촉하고, 제어된 손상에 세포를 주입하는 것으로 수행될 수 있으며, 상기 손상은 높은 전단의 일시적 협착 또는 펄스를 포함한다. 검출 가능한 마커는 형광 분자, 방사성핵종(radionuclide), 퀀텀 닷, 금 나노 입자 또는 마그네틱 비드(magnetic bids)를 포함한다.
외인성 조성물을 도입하려는 목적을 위한 줄기 세포의 조작은 종래 기술로는 어려웠다. 본 명세서에 기재된 장치 및 방법은, 예를 들어, 협착 채널을 통해 줄기 세포 또는 인공 다능성 줄기 세포(iPSCs) 등의 전구 세포의 통과는 분화를 유도하지 않지만, 세포로 조성물의 확실한 유도 흡수를 유발하지 않는다. 예를 들어, 분화 인자는 이러한 세포에 도입된다. 도입된 인자를 흡수한 후, 상기 인자(들)은 세포 내에 도입된 방법과 관련된 문제 없이 도입된 인자에 의해 지시된 분화 경로를 진행한다.
단일 세포뿐만 아니라, 매우 큰 세포, 예를 들어, 배아; 대략 직경 200 ㎛, 세포 클러스터, 예를 들어, 2-3개의 세포를 포함하는 배아와 같은 2-5개의 세포 클러스트는 타겟 조성물을 수용하도록 처리되어 있다. 구멍(aperture)의 크기가 조절되어, 즉, 협착부의 너비가 클러스터 크기의 바로 아래로 조절된다. 예를 들어, 채널의 너비는 세포 클러스터 너비의 20-99 %이다.
세포 또는 세포 클러스터는 정제/분리되거나 또는 원하는 세포 유형으로 농축된다. 수지상 세포 또는 기타 다른 세포, 예를 들어, 본 발명의 방법에서 사용되는 대식 세포, B 세포, T 세포, 또는 배아 줄기 세포, iPS 와 같은 줄기 세포는 정제되거나 농축된다. 예를 들어, 세포는 세포 표면 마커 또는 다른 식별 특성의 발현 덕분에 분리 또는 농축된다. 수지상 세포는 β-인테그린, CD11 또는 기타 식별 세포 표면 마커의 발현에 의해 식별 및 분리된다. 세포에 대해, 용어 "분리된"은 세포가 다른 세포 유형 또는 자연적으로 발생하는 세포 물질을 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.
예를 들어, 특정 조직 유형 또는 표현형의 세포 샘플은 이것이 세포 개체의 적어도 60 % 인 경우, "실질적으로 순수한" 것이다. 바람직하게는 제제는 적어도 세포집단의 75%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 99 % 또는 100 %이다. 순도는 어떠한 적절한 표준 방법으로, 예를 들어 유세포 분석기(FACS)에 의해, 측정된다.
폴리뉴클레오티드, 폴리펩타이드 또는 기타 제제와 같은 페이로드 조성물은 정제 및/또는 분리된다. 구체적으로는, 본 명세서에서 사용되는 용어, "분리된” 또는 "정제된" 핵산 분자, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 기타 세포 물질, 재조합 기술로 생산된 배양 배지 또는 화학적으로 합성된 화학 전구체 또는 기타 화합물을 실질적으로 포함하지 않는다. 정제된 화합물은 관심 있는 화합물의 중량(건조 중량)의 적어도 60 % 이다. 바람직하게 제제는 관심 있는 화합물의 중량의 적어도 75 %, 보다 바람직하게는 적어도 90 %, 가장 바람직하게는 99 % 이다. 예를 들어, 정제된 화합물은 원하는 화합물의 중량의 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 98 %, 99 % 또는 100 % (w/w) 이다. 순도는 어떤 적절한 표준 방법에 의해, 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피 , 박층 크로마토그래피 또는 고속 액체 크로마토 그래피(HPLC) 분석을 통해 측정된다. 정제 또는 분리된 폴리뉴클레오티드(RNA 또는 DNA)는 자연적으로 존재하는 상태에서 그에 인접한 유전자 또는 배열이 없다. 분리 또는 정제된 핵산 분자는 다음을 포함한다: (a) 자연적으로 존재하는 게놈 DNA 분자의 일부인 DNA, 그러나 자연적으로 존재하는 개체의 게놈 분자의 그 부분에 인접한 핵산 서열에 모두 인접하지 않은; (b) 어느 정도 원핵 생물 또는 진핵 생물의 게놈 DNA 또는 벡터에 포함된 핵산 분자로서, 결과 분자는 자연적으로 존재하는 모든 벡터 또는 게놈 DNA와 동일하지 않은; (c) cDNA, 게놈 절편, PCR로 생산된 절편, 제한 절편과 같은 분리된 분자; 및 (d) 하이브리드 유전자 일부인 재조합 뉴클레오티드 서열, 즉, 융합 단백질을 암호화 하는 유전자. 본 발명에 따른 분리된 핵산 분자는 화학적으로 변형되고 및/또는 변형된 골격을 갖는 핵산 분자 뿐만 아니라 합성적으로 생산된 분자를 더 포함한다.
현탁액은 어떤 생리적 또는 세포 적합적인 버퍼 또는 용액이다. 예를 들어, 현탁액은 세포 배양 배지 또는 인산 완충 식염수이다. 페이로드는 세포 내에 전달되는 것을 의도한 조성물을 함유하는 동일하거나 다른 현탁액이다.
상기 장치의 장점은 원하는 페이로드의 변형을 방지하고, 또한 반드시 전자기장 또는 다른 형태의 스트레스에 페이로드를 필수적으로 노출하지 않는다는 것이다. 전기천공(electroporation)과 관련하여, 이 방법은 단백질을 손상시키고 전달에 효과가 없는 것으로 나타났다. 이러한 결정적인 단점은 본 명세서에 기재되어 있는 방법의 문제가 아니다. 본 발명의 방법은 특히 고감도의 페이로드, 예를 들어, 단백질, 특히 큰 단백질(예를 들어, 40kDa -70 kDa 에서 최대 120, 130, 150,200 kDa 또는 그 이상), 거대 핵산 구조물 (예를 들어, 플라스미드 및 1 kb, 2 kb, 5 kb 또는 그 이상의 핵산 폴리머를 함유하는 기타 구조물 및 전체 염색체 이상), 퀀텀 닷(예를 들어, 직경 12 nm) 뿐만 아니라 거대 화합물 및 기타 전기에 노출되면서 민감하게 되거나 쉽게 손상되는 것으로 알려진 다른 물질의 전달에 특히 적합하다. 예를 들어, 나노 입자 또는 퀀텀 닷의 표면 리간드는 손상될 수 있고, 전기 필드에 반응하여 충전될 수 있어 그들의 기능을 제한/제거함으로써 입자의 응집을 발생시킨다. 그러나 또 다른 통제된 손상 방법의 이점은 전달 조성물과 세포를 접촉시키는 타이밍이다. 특히 온도 및 전기 에 민감한 단백질과 관련하여, 종래 방법과 비교해 상대적으로 단기간 동안 처리 후에 페이로드 용액과 세포가 접촉된다. 장치의 미세 유체의 성질은 또한 더 작은 작업 볼륨을 요구하여 귀중한 원료 및/또는 세포를 절약한다. 장치는 또한 각각의 개별 방법에 비해 전달을 크게 향상시키기 위해 전기천공 또는 리포좀과 같은 종래의 전달 방법과 결합할 수 있다.
전달된 페이로드의 기능적 활성은 유체 전단 응력과 역으로 상관된다, 즉, 세포막의 스트레칭과 같은 세포 막에 물리적 변형 전단보다 오히려 페이로드의 수용을 매개한다. 기존의 나노 입자 전달 방법은 세포의 세포 내 환경에 대해 엑세스를 얻을 물질보다 양이 많을 수 있다; 그러나 이러한 방법은 종래 방법이 엔도솜에 전달된 물질의 봉쇄를 일으킨다는 사실 때문에, 본 명세서에 기재된 방법과 비교하여 전달된 물질의 낮은 활성을 일으킨다. 본 명세서에서 기재된 방법은 세포로 전달된 페이로드의 더 적은양이 기타 사이토졸 구성 요소에 대한 액세스 가능성에 기인하여 전달된 분자의 기능적 활성량을 크게 만든다는 점에서 화합물/조성물의 직접-사이토졸 전달을 일으킨다. 예를 들어, 나노 입자를 전달하기 위한 종래 방법은 2-10배 양으로 세포로 물질을 전달했지만, 엔도솜의 격리 때문에 전달된 물질의 기능성 활성이 없거나 거의 없었다. 본 발명의 장치 및 방법은 엔도솜 격막을 피함으로써 종래 세포 내 전달 방법 상기 단점을 극복한다.
추가적인 장점 및 특징은 본 발명이 종래 접근보다 훨씬 빠른 치료 및 세포 속도의 시간 규모를 포함한다는 것이다. 또한 기타 방법은 본 발명의 방법만큼, 예를 들어, 협착부(세포 직경의 %)의 크기(직경)에 상대적인 세포의 크기(직경)로 결정되는 것, 강하게 세포를 압박하지 않는다. 이 급속한, 강력한, 하위-무두질(sub-leather), 압박 또는 변형은, 우수하게 세포에 의한 직접-사이토졸 페이로드의 수용을 발생시킨다. 세포의 변형은 갑자기, 즉, 실질적으로 1 μs 에서 1 ms로 일어난다. 일반적으로 너무 적은 스트레스는 세포 변화(perturbations)를 유발하지 않지만, 동시에 너무 많은 세포 스트레스로 인한 변형은 세포에 치명적일 수 있다. 따라서 흐름의 주제는 일시적인 변화(perturbations)로 충분한 스트레스를 유발하지만, 영구적이거나 세포를 죽게 만드는 너무 많은 스트레스를 유발하지 않는 시스템 및 방법을 제공한다.
상기 방법들 중 어느 하나는 in vitro, ex vivo, 또는 in vivo 에서 수행된다. in vivo 적용을 위해 본 장치는 예를 들어, 인라인 스텐트(in-line stent)와 같은 혈관 내강(vascular lumen)에 이식될 수 있다. 본 발명의 이들 및 기타 능력은, 본 발명 그 자체로서, 다음의 도면, 상세한 설명 및 특허청구범위의 검토 후 더욱 완벽하게 이해될 것이다.
도1a는 본 발명의 미세유체 시스템의 개략도이다. 세포들은 협착부를 통해 통과된 후 전달 물질(페이로드)에 노출된다.
도 1b 는 본 발명의 미세유체 시스템의 개략도이다. 세포들은 전달 물질(페이로드)을 포함하는 용액에서 세포를 현탁하는 프로세스 전반에서 전달 물질(페이로드)에 노출된다(예를 들어, 세포들은 협착부를 통해 통과하기 전 후에 전달 물질에 노출된다).
도 2A는 본 발명의 미세유체 시스템의 개략도이다.
도 2B는 깊이, 너비 및 길이를 나타내는 미세유체 시스템의 설명도이다.
도 3은 미세유체 시스템의 개략도이다.
도 4는 세포벽의 변화(perturbation)를 나타내는 개략도이다.
도 5는 미세유체 시스템의 사진이다.
도 6은 미세유체 시스템의 사진이다.
도 7은 미세유체 시스템의 사진이다.
도 8a-8b는 본 발명의 구체예에 따른 미세유체 시스템으로부터 얻은 결과 그래프이다.
도 9는 본 발명의 구체예에 따른 미세유체 시스템을 사용하여 처리된 세포로부터 얻은 결과 그래프이다.
도 10은 본 발명의 구체예에 따른 미세유체 시스템을 사용하여 처리된 세포로부터 얻은 결과 그래프이다.
도 11은 본 발명의 구체예에 따른 미세유체 시스템을 사용하여 처리된 세포로부터 얻은 결과 그래프이다.
도 12는 본 발명의 미세유체 시스템의 개략도이다.
도 13은 본 발명의 구체예에 따른 미세유체 시스템을 사용하여 처리된 세포로부터 얻은 결과 그래프이다.
도 14는 본 발명의 구체예에 따른 미세유체 시스템을 사용하여 처리된 세포로부터 얻은 결과 그래프이다.
도 15는 본 발명의 구체예에 따른 미세유체 시스템을 사용하여 처리된 세포로부터 얻은 결과 그래프이다.
도 16a-16f는 본 발명의 구체예에 따른 미세유체 시스템의 개략도이다.
도 17은 본 발명의 미세유체 시스템을 사용하는 방법과 관련한 흐름도이다.
도 18a-18b는 본 발명의 구체예에 따른 미세유체 시스템을 사용하여 처리된 세포로부터 얻은 결과 그래프이다.
도 19는 전달의 오버레이(overlay) 및 공초점 형광 이미지이고, 뒤이어 본 발명을 이용하여 퀀텀 닷(QD)으로 처리된 세포 전달의 z-단면 공초점 형광 이미지이다.
도 20A는 폴리-이미다졸 리간드(PIL)로 코팅된 QD로 본 발명에 따른 처리를 할때에 HeLa 세포 사이토졸로의 전달 효율을 나타낸다. 유세포 분석기로 측정되는 세포 생존율은 > 80 % 이다.
도 20B는 본 발명에 의해 플레인 QD535를 전달시, HeLa 세포의 생존률을 프로피디움 요오드(propidium iodide) 염색 및 유세포 분석기로 측정한 도이다.
도 21은 다양한 미디어에서의 구축설계도, 흡광도 및 안정도를 나타낸 도이다.
도 22A는 처리 및 대조 세포의 생존 세포 공초점 현미경 이미지를 나타낸 도이다.
도 22B는 녹색 및 적색 채널에서 시간의 함수로 처리된 세포의 강도의 변화를 나타낸 도이다.
도 23은 평균 세포 형광 및 생존율을 유세포 분석기로 측정한 도이다.
도 24는 10nM의 퀀텀 닷 용액으로 장치 처리 후 세포 사이토졸 내의 비응집된 단일 퀀텀 닷의 형광(epifluorescence) 이미징을 나타내고, 자가형광을 갖는 3개의 퀀텀 닷의 깜박임 흔적을 나타낸 도이다.
도 25는 세포 속도 및 협착부 설계에 의존한 전달 성능을 보여주는 실험 결과를 나타낸다.
도 26은 공초점 현미경으로 측정되는 퍼시픽 블루 컨쥬게이션 3kDa 덱스트란(pacific blue conjugated 3kDa dextran)의 전달 후, HeLa 세포의 다른 수평면의 스캔(scan)을 나타낸 도이다.
도 27은 천공된 막을 통해 세포 내로 물질의 수동적 확산을 시뮬레이션하는 단순화된 2D 확산 모델을 나타낸 도이다.
도 28은 물질의 2중(two-tiered) 전달 결과를 나타낸 도이다.
도 29는 siRNA, 단백질 및 나노입자 전달과 관련된 데이터를 나타낸 도이다.
도 30은 세포 유형에 따른 본 발명의 적용가능성을 나타낸 도이다.
도 31은 나노물질 및 항체 전달 데이터를 나타낸 도이다.
도 32는 단백질 전달의 적용예를 나타낸다.
도 33은 성공적으로 전달된 페이로드를 나타내는 세포 유형 예시를 나타낸 표이다.
도 34는 시스템을 나타내는 설명도로, 상기 시스템에서 환자의 혈액은 거대 분자와 같은 페이로드의 전달을 위해 미세유체 장치에 의해 처리된다.
도 35는 페이로드를 전달하는 10 ㎛ - 6 ㎛ 장치로 처리된 인간 배아 줄기 세포의 전달 효율 및 생존율을 나타낸 도이다.
도 36은 본 발명의 본 발명을 이용하여 융합된 리프로그래밍 단백질의 직접 전달에 의한 마우스 및 인간 iPSC 세포주의 생성 및 특성을 나타낸다.
도 37은 예비(preliminary) 단백질 리프로그래밍 결과 및 인간 배아 줄기 세포 마커 Oct4, SSEA-4, Tra-60, Tra-80, IPSC 콜로니(colonies)의 알칼라인 포스파타아제(AP)의 발현을 나타낸다.
도 38은 채널에 국소적 전기장을 도입하여, 전기천공과 세포 변형을 결합하기 위해, 포토리소그래피 패터닝(photolithographic patterning) 및 Au 증착에 의해 협착부의 양쪽에 통합된 전극으로 변경된 장치를 나타내는 현미경 일러스트이다.
도 39는 미세유체 시스템의 또 다른 실시예를 나타낸 것으로, 입구부는 90도의 협착각을 갖는다.
도 40A 및 40B는 도 2A에 묘사된 실시예 및 도 39에 묘사된 실시예에 따라 장치 사이의 생존력 및 전달 효율을 비교한 플롯이다.
도 41은 CD45에 대한 항체 알렉사 488(Alexa 488)에 의해 측정된 활성화된 T 세포의 CD45 발현 히스토그램이다. 세포는 낮은 형광 강도를 나타내는 CD45 침묵 RNA(CD45 silencing RNA)의 존재하에 장치로 처리됨으로써 CD45 유전자 발현의 넉다운(knockdown) 을 나타낸다.
도 42는 재생 의료; 면역학; 이미징 및 센싱; 및 암 백신 및 암 연구와 같은 본 발명의 다양한 적용 분야를 나타낸다.
도 43A 및 도 43B는 캐스케이드 블루 컨쥬게이션 3kDa 덱스트란(cascade blue conjugated 3kDa dextran)에 노출된 대조 집단의 유세포 분석기로부터 얻은 세기(intensity) 히스토그램을 나타내고, 그리고 30㎛-6㎛ 장치로 주입된 세포 집단 및 3kDa 덱스트란에 노출된 세포 집단을 나타낸 도이다.
도 44는 본 발명의 미세유체 장치 및 관련 방법을 사용하여 처리된 후의 인간 배아 줄기 세포의 GFP 넉다운을 막대 그래프로 나타낸 도이다.
본 발명의 실시예는 물질이 세포 내에 전달될 수 있도록 세포막에 변화(perturbations)를 발생시키기 위해, 주어진 시간 동안 세포에 제어된 변형을 적용하기 위한 기술을 제공한다. 상기 변형은 예를 들어, 압력, 기계적 압력이나 전단력에 의해 유도된 압력에 의해 유도된다. 일 실시예에서, 미세유체 시스템은 소규모(예를 들어, 마이크로 리터(microlitres), 나노 리터(nanoliters), 피코 리터(picoliters)와 같은 서브 밀리리터(sub milliliter) 부피)로 유체를 기하학적으로 한정하는 것에 의해 유체를 통제 및/또는 조작하는 구조를 포함한다. 마이크로 유체 시스템은 세포 내로 거의 모든 페이로드를 세포 내적으로 전달할 수 있다. 상기 시스템은 세포가 이를 통해 통과하는 협착부를 갖는 하나 또는 그 이상의 미세유체 채널로 구성되어 있다. 바람직하게, 세포는 상기 시스템을 통해 구동 압력인 액체 매체 중에 현탁시켜, 미세유체 채널을 통해 흐른다. 세포가 협착부를 통과할 때, 이의 막은 막의 일시적인 붕괴를 유발하고, 주위 매체에 존재하는 페이로드의 수용을 일으키도록 변화된다. 협착부는 표적 세포의 크기의 함수이나, 바람직하게는 세포의 직경보다 작거나 같다. 다수의 협착부가 병렬 및/또는 직렬로 연결될 수 있다. 세포의 변화는 세포에서 물질이 세포 밖에서 세포 안으로 이동하도록 하는 세포의 틈(breach) (예를 들어, 구멍(holes), 찢어진 곳(tear), 빈 부분(cavity), 틈(aperture), 포어(pores), 브레이크, 간격, 천공(perforation))이다. 본 명세서에 기재된 방법으로 생성된 변화(예를 들어, 포어(pores) 또는 구멍(holes))는 보체 또는 박테리아 용혈소(hemolysins)에 의해 생성된 것과 같은 다량체의 구멍 구조를 형성하는 단백질 소단위체의 조립 결과로 형성되는 것이 아니다. 다른 실시예들은 본 명세서에 개시된 주제의 범위 내이다.
도 1-3에 따르면, 미세유체 시스템(5)는 관형(tubular) 루멘으로 한정하는 채널(10)을 포함한다. 미세유체 채널(10) 은 바람직하게는 단일 타겟세포(20)이 한 번에 협착부(15)를 통과할 수 있도록 구성된 협착부(15)를 포함한다. 비록 전달 물질은 세포(20)가 협착부(15)를 통해 통과한 후 버퍼(25)에 첨가될 수 있지만, 바람직하게는, 세포(20)는 전달 물질(30)을 포함하는 버퍼(25)에 현탁된 채널 (10)을 통해 통과한다. 세포(20)가 협착부 (15)를 통해 접근하고 통과하면, 협착부(15)는 세포(20)에 압력을 가하고(예를 들어, 기계적 압박), 세포(20)를 압축 탈수한다(예를 들어, 세포 (201)에 나타난다). 협착부(15)에 의해 세포에 적용된 압력은 세포막(예를 들어 세포 (202))에 변화를 야기한다(예를 들어, 도 4에 나타난다). 세포가 협착부(15)를 통해 통과하면, 세포(20)는 전달 물질(30)(예를 들어, 세포 (203))을 포함하여 구멍을 통해 버퍼(25)에 물질을 수용하기 시작한다. 세포막은 시간이 지나면 회복되고, 적어도 전달 물질(30)의 일부분이 바람직하게는 세포 내에 고립된 상태로 남는다.
협착부(15)의 구성은 세포(20)의 수축을 제어하기 위해 조작화될 수 있고, 그럼으로써 세포(20)에 적용되는 압력을 제어할 수 있다. 바람직하게 협착 (15)는 입구부(35), 센터포인트(40) 및 출구부(45)를 포함한다. 예를 들어, 협착부(15)의 직경(들)은 세포에 인가되는 압력을 조정하기 위하여 (그리고 얼마나 빨리 그 압력이 인가/방출 되는지 조정하기 위하여) 바꿀 수 있고, 협착부(15)의 길이는 세포에 적용되는 시간 압력의 양을 조절하기 위해 바꿀 수 있다. 특정 구성에서는, 세포의 물리적 수축이 요구되기 보다는 오히려, 매우 간단하게 비정상적으로 높은 전단 속도 및/또는 압축률로 세포를 주입하는 것만으로 바라는 변화를 일으킬 수 있다. 일반적으로 미세유체 시스템의 외경에 관계되지 않으며, 외경 대한 내경의 비율은 다양할 수 있다(예, 5보다 크다).
센터포인트(40)의 직경은 세포(20)의 직경의 함수일 수 있다. 바람직하게는, 센터포인트(40)는 세포(20)의 직경과 같거나 더 적다(예를 들어, 세포 직경의 20-99%). 비록 최적의 센터포인트의 직경은 적용 도구 및/또는 세포의 유형에 따라 변할 수 있지만, 바람직하게는, 센터포인트(40)의 직경은 세포 직경의 60 % 및 70 % 사이이다. 종래 실험에서 사용된 센터포인트 (40)의 실시예의 직경은 5-6 ㎛ 및 7-8 ㎛이다. 센터포인트(40)는 세포(20)의 직경보다 클 수 있지만, 세포(20)에 적용된 압력(예를 들어, 전단)의 펄스를 야기하도록 구성된다. 그러한 압력은 채널 (10)의 벽에 터치하지 않고 세포(20)에 적용될 수 있다. 전단은 알려진 기술로 측정될 수 있다(예를 들어, Journal of Applied Physics 27,1097 (1956); Murphey 등).
입구부(35)의 협착 각도(예를 들어, 도 2A)는 변화할 수 있다(예를 들어, 얼마나 빨리 직경이 감소하는지에 따라). 협착 각도는 바람직하게는 세포가 이를 통과하는 동안 시스템(5)의 막힘을 최소화하는 각도이다. 출구부(45)의 각도도 마찬가지로 변화할 수 있다. 예를 들어, 출구부(45)의 각도는 비-층류의 흐름을 가져올 수 있는(예를 들어 1-80도 범위) 난류/소용돌이의 가능성을 줄일 수 있도록 구성되어 있다. 비록 다른 구성(예를 들어, 벽은 곡선일 수 있다) 가능하지만, 입구부(35) 및/또는 출구부(45)의 벽은 바람직하게는 선형이다.
채널 (10)의 단면, 입구부(35), 센터포인트(40) 및 출구부(45)는 다양할 수 있다. 예를 들어, 다양한 단면은 원형, 타원형, 길게 늘어진 슬릿, 정사각형, 육각형, 삼각형 및 기타일 수 있다. 센터포인트(40)의 길이도 다양할 수 있고, 협착부 (15)를 통해 통과하도록 세포(20)에 인가되는 압력이 가해지는 시간의 양을 변화시키도록 조정할 수 있다. 주어진 유량에서, 더 긴 협착부(15)(예를 들어, 더 긴센터포인트 (40))는 더 긴 기간 동안 세포 (20)에 압력을 가할 것이다. 채널 (10), 도입부 (35), 센터포인트 (40) 및 출구부 (45)의 깊이는 다양할 수 있다. 예를 들어, 깊이가 더 단단한 협착부를 제공하도록 조절될 수 있고, 그럼으로써 협착부 깊이의 변화와 어느 정도 유사하게 전달을 증가시킬 수 있다. 장치 설계 사이에서 너비 및 길이가 다양할 수 있고, 리소그래피 공정(장치가 실리콘 기반인 경우)에서 사용되는 크롬 마스크 등으로 인한 것과 같은 장치의 제조 중에 결정될 수 있다. 깊이는 깊은 반응성 이온 식각(etching) 공정에서와 같이 장치의 제조 중에 결정될 수 있고, 채널 전반에서 균일할 수 있다. 깊이는 예를 들어, 15-20㎛ 일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 장치 디멘션(dementions)은 길이, 너비 및 협착부의 수를 나타내는 일련의 번호가 부여된다(예를 들어, 30㎛-6m x 5는 30㎛ 길이, 6㎛ 너비 및 5 협착부를 나타낸다).
세포(20)가 채널(10)을 통과하는 속도는 또한 세포(20)에 대한 전달 물질(30)의 전달을 제어하기 위해 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 채널(10)을 통해 세포(20)의 속도를 조정하는 것은 압력이 세포에 적용되는 시간의 양을 변화시킬 수 있고, 얼마나 빨리 압력이 세포에 적용되는지를(예를 들어, 서서히 또는 충격적으로) 변화시킬 수 있다. 비록 다른 속도가 가능하지만, 세포(20)은 적어도 0.1 mm/s, 예를 들어, 0.1 mm/s 내지 5 m/s, 및 바람직하게는 10 mm/s 내지 500 mm/s 사이의 비율로 시스템 (5)를 통과할 수 있다. 몇 몇 실시예에서, 세포(20)은 5 m/s 을 초과하는 속도로 시스템(5)를 통과할 수 있다.
채널(10)은 실리콘, 유리, 세라믹, 크리스탈 기판, 비정질 기판 및 폴리머(예를 들어, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), PDMS, 환형 올레핀 코폴리머(COC) 등) 등의 다양한 재료로 제조될 수 있다. 제조는 바람직하게는 클린-룸 기반으로, 예를 들어, 드라이 에칭(dry etching), 웨트 에칭(wet etching), 포토리소그래피(photolithography), 사출 성형, 레이저 박리, SU -8 마스크 등을 사용할 수 있다. 일 실시예로 채널(10)은 대략 40-50 ㎛ 길이이고, 약 50 ㎛ 의 비-협착 직경을 갖고, 대략 4-8 ㎛ 의 협착 직경을 갖는다. 바람직하게는 채널(10)의 길이는 막힘을 피하도록 짧게 유지된다. 다른 크기도 가능하다.
도 39는 미세유체 시스템의 또 다른 실시예를 나타낸다. 이 실시예에서, 채널(10)은 세포(20)을 수축하지 않는 예비 입구부(50)을 포함한다. 확장된 채널부(55)는 90도(예를 들어, 도 2A의 알파)의 협착 각도를 갖기 위해 입구부(35)를 제공한다.
도 40A 및 40B는 두 실시예 사이의 생존 능력 및 전달 효율의 비교를 나타내는 두 플롯이다. 표지 (4000)은 도 2A에 따른 실시예를 이용하여 얻은 측정값을 나타내고, 표지 (4010)은 도 39에 따른 실시예를 이용하여 얻은 측정값을 나타낸다. 동일한 세포 속도 및 작동 압력에 대해, 도 39의 실시예는 높은 전달 효율 및 생존율을 갖는 것으로 나타난다. 이것은 도 2A의 실시예와 같이 압축 하에 유사한 전단 속도, 세포 속도 및 시간 소비를 갖는다.
여러 파라미터는 세포(20) 내에 전달 물질(30)의 전달에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 협착부(15)의 치수는 작동 유속(예를 들어, 협착부 (15)로 세포 통과 시간), 버퍼(25)에서 전달 물질(30)의 농도, 협착 후 버퍼(25)에서 세포 (20)이 회복/인큐베이션되는 시간의 양이 세포(20)로 전달 물질(30)의 흡수에 영향을 미칠 수 있다. 세포(20)로 물질(30)의 전달에 영향을 미치는 추가 파라미터는, 협착부(15)에서의 세포(20)의 속도, 협착부(20)의 전단 속도, 흐름 속도에 수직인 속도 성분, 세포 압축률 및 협착 시간을 포함할 수 있다. 이러한 파라미터는 전달 물질(30)의 전달을 제어하도록 설계될 수 있다. 버퍼(25)(예를 들어, 염 농도, 혈청 함량 등)의 조성물은 또한 전달 물질 (30)의 전달에 영향을 미칠 수 있다. 협착부 (15)를 통해 세포 (20)이 통과하면서, 협착부 (15)에 유도된 변형/스트레스는 일시적으로 변화를 통해 물질의 수동 확산을 유발하는 세포의 손상을 일으킬 수 있습니다. 몇몇 실시예에서, 세포 (20)은, 비록 다른 변형이 가능하지만(예를 들어, 나노 초에서 시간까지 의 범위), 세포 신호 전달 메커니즘을 통해 세포 사멸 경로를 활성화하는 가능성을 최소화 하는 100 μs 의 짧은 기간 동안 변형된다. 첫 번째 관찰은 세포 (20)에 의하여 전달 물질 (30) 의 흡수가 협착부 (15)를 통해 세포 (20)을 통과한 후 약 몇 분 동안 일어난다는 것을 나타냈다.
세포(20)은 다양한 방법으로 채널(10)을 통해 구동될 수 있다. 예를 들면, 압력이 도입 측(예를 들어, 가스 실린더 또는 압축기)의 펌프에 의해 적용될 수 있으며, 진공이 출구 측에 진공 펌프로 적용될 수 있고, 튜브를 통한 모세관 활성 및/또는 시스템(5)는 중력이 공급될 수 있다. 변위 기반 흐름 시스템이 또한 사용될 수 있다(예를 들어, 시린지 펌프, 연동 펌프, 수동 시린지 또는 피펫, 피스톤 등). 단일 채널(10)을 통해 예시적인 유량은 몇 초에서 대략 1 μl 이다. 또한 버퍼 (25)는 채널(10) 의 막힘을 줄이거나 제거하는 것 및 생존율을 향상시키도록 설계될 수 있는 하나 또는 그 이상의 윤활제(플루로닉(pluronics) 또는 다른 계면 활성제)를 포함할 수 있다.
시스템(5)는 전달 물질(30)의 전달량이 세포 집단을 걸쳐 일관되는지 확인하기 위해 제어될 수 있다. 예를 들어, 시스템(5)는 세포(20)의 투과가능한 세포막에 전달 물질(30)을 전달하는 압축 후 대류 전달 메커니즘의 사용을 포함할 수 있다. 이차 흐름의 유량을 제어함으로써, 세포에 제공된 전달 물질(30)의 양이 바람직하게 제어될 수 있다. 또한 막 복구 동안 버퍼(25)에 전달 물질(30)의 농도를 제어하는 것은 세포 집단에 전달 물질(30)의 전달 일관성을 향상시킬 수 있다. 비록 다른 구성이 가능하더라도(예를 들어, 전기적 및/또는 광 센서가 형광 등의 세포 특성을 측정하기 위해 사용될 수 있다), 바람직하게는, 시스템(5)는 어떠한 전기장 및/또는 화학 제제를 적용하지 않고 순수하게 기계적인 시스템으로 작동한다. 또한 시스템(5)는 바람직하게는 전달되는 물질의 종류에 관계없이 작동한다. 예를 들어, 단백질, RNA 및 DNA는 추가적인 변형이 없이, 동일한 시스템을 통해 전달될 수 있다.
세포(20)의 특정 유형의 몇 가지 구성에서, 세포(20)은 세포의 내부에서 전달 물질의 흡수를 돕는 하나 또는 그 이상의 용액에 인큐베이션될 수 있다. 예를 들어, 세포(20)은 액틴 세포 골격을 해중합(depolymerization)하기 위해 1 시간 전에 전달하는 란트런쿨린 A(Lantrunculin A, 0.lflg/ml)과 같은 해중합 용액에 인큐베이션될 수 있다. 추가의 예로, 세포는 미세소관 네트워크를 해중합하기 위해 전달 2 시간 전에 10 ㎛ 콜히친(Sigma)에 인큐베이션될 수 있다. 이 방법은 DNA를 전달할 때, 유전자 발현을 얻는 것을 도울 수 있다.
또한 도 5에 따르면, 시스템(5)의 병렬 구성 사진이 나타나 있다. 시스템 (5)는 병렬 채널은 임의의 숫자를 포함할 수 있다. 바람직하게는 시스템(5)에 이러한 추가 병렬 채널이 추가되면서, 전반적인 시스템(5) 처리량을 향상시킬 수 있다. 도 6은 채널(10)의 각각의 주입구에 필터를 포함하는 시스템(5)의 병렬 구성의 사진을 나타낸다. 또한 도 6은 여러 단계를 포함하는 입구부(35)를 포함하는 협착부 (15)의 구성을 나타낸다. 또한 도 7은 시스템(5)의 원형(prototype)의 추가 사진을 나타낸다. 도 7에서 알 수 있는 것처럼, 인큐베이션 웰을 포함하는 원형은 대략 1 인치 x ¼ 인치 x ¼ 인치의 크기를 갖는다. 시스템 (5)의 다른 구성은 또한 ㅅ소터(sorters), 전처리/후처리 모듈 및/또는 센서 모듈(예를 들어, 광학적, 전기적, 자기적)을 포함할 수 있다.
실시예에 관해서 다음에 상세하게 기재된 것처럼, 미세유체 시스템 및 관련 방법은 광범위한 적용 범위를 갖는다. 도 42는 다양한 적용 분야의 예를 나타내는 설명도이다. 예를 들어, 현재 주제는 세포 리프로그래밍 및 줄기 세포 분화를 가능하게 하는 것과 같은 재생 의료에 적용될 수 있다. 현재 주제는 수지상 세포, 단핵구, T 세포, B 세포 및 다른 림프구에 전달을 통해 항원 제시 및 면역 활성 증강/억제를 위한 것과 같은 면역학에 적용될 수 있다. 또한, 이미징 및 감지는 퀀텀 닷, 탄소 나노 튜브 및 항체의 표적 세포에 대한 개선된 전달 혜택을 누릴 수 있다. 또한 현재의 주제는 혈액 순환 종양 세포(CTC) 분리 및 림프종의 치료를 위한 것과 같은 암 백신 및 연구에 적용될 수 있다. 본 방법은 또한, 활성 siRNA 및 질병을 치료하거나 세포 행동을 조작할 수 있는 작은 분자 화합물을 스크리닝 하기 위한 견고한 플랫폼을 제공한다.
이 개념은 세포(20)가 다른 방법으로 막 비투과성 색소를 섭취(take-up)하도록 유도된 프로토타입에서 성공적으로 증명된다(예를 들어, 버퍼(25)에 존재하는 분자량 3kDA에서 2kDA 형광 염료, DNA , 단백질, RNA, 나노 튜브 또는 나노 입자). 세포(20)은 72 시간 이상 전달 물질을 유지하면서 공정 후 회복 및 증식하는 것을 보여준다. 도 33에 나열된 것을 포함하는, 11개의 다른 세포 유형이 본 시스템으로 테스트되었고, 본 시스템이 다른 세포 유형에서 견고한 성능을 제공하는 것을 증명한다. 도 33 은 현재의 주제가 성공적으로 적용된 세포 유형을 포함하는 표이다. 평균 세포 처리량은 약 5,000-20,000 cells/second 로 측정되고, 평균 전달 효율은 96 %에서 측정되었으며, 세포 생존율은 단일 채널 (10)을 사용하여 95 %에서 측정되었다. 모든 테스트는 상온에서 실시되었다. 그러나 온도는 일부 기술에서 변경될 수 있다. 예를 들어, 본 방법은 상온(예를 들어, 20 ℃), 생리적 온도(예를 들어, 39 ℃), 생리적 온도보다 높은 온도, 또는 낮은 온도(예를 들어, 4 ℃) 또는 이들 예제 온도 사이의 온도에서 수행될 수 있다. 낮은 온도에서 수행되는 방법은(즉, 실질적으로 4 ℃ 부근으로, 냉장고, 아이스 바스(ice bath) 또는 기타 공지 기술을 사용) 전달 효율 및 세포 생존율을 현저히 개선시킨다. 따라서 온도는 조성물 전달 및 세포 생존률에 영향을 주도록 조정될 수 있다.
도 8a-b에서 나타나 있듯이, 협착부(15)를 통해 세포 속도를 증가시키는 것은 전달 물질(30)의 전달 백분율 및 전달 효율을 증가시킬 수 있다. 전달 효율은 세포 속도와 선형으로 변한다는 것을 알 수 있고, 이것은 용량 의존성 응답이다.
도 9에 나타나 있듯이, 세포가 협착부(15)를 통과한 후, 버퍼(25)에서의 세포 인큐베이션 시간은, 세포(20)에 대한 전달 물질(30)의 전반적인 전달 백분율에 영향을 줄 수 있다. 그러나, 주목할 것은 특정 인큐베이션 시간(대략 2-3분)이 지난 후, 전달 백분율은 실질적으로 변화하지 않았다는 것이다. 이러한 데이터를 기초하여, 협착부(15)를 통해 통과한 후 세포(20)에 일어나는 변화는 세포(20)가 협착부(15)를 통과한 후 약 5 분 내에 정정된다. 또한 참조로, - 1 분은 대조군에 상응한다.
도 10에 나타나 있듯이, 여러 번 협착부(15)를 통해 통과하는 세포(20)는 전반적인 전달 백분율에 영향을 미칠 수 있지만, 세포(20)의 전반적인 생존률에 부정적인 영향을 미친다. 이러한 데이터 생성을 위해, 세포는 협착부 (15)를 통해 통과되고, 수집되고, 그리고 대략 1분 내에 다시 장치를 통해 통과되었다.
세포(20)가 변화되고 있는 시간 동안(예를 들어, 협착부 (15)를 통과 한 후), 세포 내로부터 물질이 변화를 통해 추출될 수 있다는 것이 관찰되었다. 따라서, 세포(20)가 변화될 때, 물질은 세포(20)의 안팎에서 흐를 수 있다는 것이 발견되었다. 이러한 속성은, 시스템(5)이 세포 용해 없이 세포 내 물질을 샘플링(sampling)하는 방법으로 사용될 수 있다는 것을 의미한다. 세포막의 변화는 바람직하게는 세포질에서 거대 분자의 유출을 가져올 것이며, 따라서 세포질의 조성을 알아내기 위하여 사용될 수 있다.
도 11에 나타나 있듯이, HeLa 세포를 발현하는 안정된 녹색 형광 단백질(GFP)은 GFP 침묵 siRNA (Ambion, USA)의 존재 하에 처리되고, 48 시간의 형광 넉 다운(knockdown) 동안 FACS(FACS Canto II, BD Biosciences, USA)로 분석되었다. 도 11은 리포펙타민 2000 (Lipofectamine 2000 , Invitrogen , USA) 등의 시판되는 시약에 상응하는 유전자 발현의 > 40 % 넉 다운을 나타낸다. 또한 도 11에서, 스크램블된(scrambled) siRNA 대조군은 이 넉 다운이 변형 프로세스 그 자체로 일어나지 않는다는 것을 나타낸다.
도 13-14에 나타나 있듯이, 스퀴즈(squeeze) 디멘젼은 전달 물질(30)의 전반적인 전달 효율에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 도 13-14은 작동 압력이 변하듯이(예를 들어, 협착부 (15)의 길이 및/또는 너비이 다양한 것처럼), 전반적인 전달 효율이 다소 변하는 것을 나타낸다(도 14는 다른 상태 하에 퀀텀 닷(나노 입자)의 전달과 관한 것이다). 또한 도 18a-8b에 나타나 있듯이, 추정 된 세포의 속도는 전반적인 생존율 및 전달 물질 (30)의 전달 효율에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 도 18a는 작동 속도가 변하듯이, 전반적인 전달 효율이 다소 변하는 것을 나타낸다. 또한, 도 18b 는 작동 속도가 변하듯이, 세포의 생존율이 다소 변할 수 있는 것을 보여주고 있다. 이러한 그림은 생존에 영향을 최소화하면서 협착부의 길이의 변화가 전달을 강화할 수 있다는 것을 보여주고 있다. 또한, 더 큰 분자는 더 작은 분자보다 협착 후에 낮은 속도로 세포로 들어간다. 본 명세서에 개시된 세포 내 전달 방법은 이것이 여러 다른 유형의 물질 및 세포에 적용될 수 있다는 점에서 “보편적”이다. 또한 본 장치에 의해 유도된 막의 파괴 는 비록 다른 크기의 파괴가 가능할 수 있지만, 일반적으로 크기가 적어도 ~100 nm일 수 있다.
도 12에 따른 일 실시예에서, 버퍼(25)와 사이토졸 사이의 농도 구배는 전달된 물질의 양을 예상대로 제어하도록 제어될 수 있다. 세포(20)가 협착부에 의해 포레이트(porated)된 후, 거대 분자의 농축된 클라우드(cloud)에 세포(20)를 노출시키는 국소 전달 방법이 사용될 수 있다. 이러한 국소적인 전달 방법 중 어느 것은, 그러나 적절한 기능을 보장하기 위해 측정된 변화 재밀봉(resealing) 시간을 고려해야 한다. 이것은 세포막의 근방에 고농도의 페이로드를 전달하는 채널에 직교하는 "미세노즐(micronozzle)"을 통합해서 구현될 수 있다(도 6A 에 도시). 바람직하게는, 미세 노즐은 협착부 (15) 및/또는 근처에 배치될 수 있다. 이러한 접근 방식은 대류 성분을 갖는 확산 전달 메커니즘을 보충하게 하면서, 높은 농도에서 보다 정밀한 세포 로딩을 가능하게 할 수 있다. 바람직하게, 세포 (20)이 협착부 (15) 고농도 영역에 있는 동안, 투여(injection)가 이루어진다. 이것은 버퍼 전체에서 고농도를 유지할 필요가 없기 때문에, 국부 기술은 귀중한 전달 물질을 절약한다는 장점을 갖는다.
도 16a에 따르면, 일련의 마이크로필러(micropillars)(100)은 세포(20)에 압력을 가하는 데 사용될 수 있고, 이로써 변화가 야기된다. 이 구체예에서, 세포(20)은 압력이 세포(20)에 인가되도록 협착 필러 어레이(pillar array)를 통해 강제된다.
도 16b에 따르면, 압축 플레이트(plates)(105)는 변화가 생기도록 세포(20)에 압력을 가하는 데 사용될 수 있다. 이러한 구체예에서, 압축 플레이트(105)는 압력이 예정된 시간 동안 세포(20)에 인가되도록 제어될 수 있다. 압축 플레이트(105)는 세포(20)에 압력을 적용하도록 하나 또는 두 플레이트가 이동함으로써 구성될 수 있다. 압축 플레이트(105)의 추가 세트 역시 세포 (20)이 실질적으로 둘러싸이도록 제공될 수 있다.
도 16c에 따르면, 완충 첨가제(115)(또는 세포 표면에 결합한 증량 물질)는 세포(20)의 직경보다 큰 협착부(15)를 통해 세 (20)이 통과하도록 스퀴징(squeezing)을 시뮬레이션(simulate)하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 완충 첨가제(115)에 의해 방해되기 때문에 시뮬레이션된 협착부가 가능하다. 완충 첨가제(115)의 예는, 미세 입자 또는 나노 입자(예를 들어, 폴리머 기반, 지질 기반, 세라믹 기반, 금속 등)를 포함한다. 비록 필수적이지는 않지만, 이러한 예를 들어, 항체, DNA 서열, 펩티드 또는 작은 분자 등의 입자들은 세포 결합 리간드로 라벨링(labeled)된다.
도 16d에 따르면, 비즈(beads)(120)가 세포(20)를 압축하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 16e와 같이, 자기력 및/또는 정전력이 세포 (20)에 압력을 가하는 데 사용될 수 있다. 바람직하게, 세포(20)에 적용되는 힘은 변화를 일으키기에 충분하다.
도 16f에 따르면, 다수의 유체 스트림(multiple fluid streams)(125)는 세포 (20)의 압축 (또는 급격한 임시 전단)이 생기도록 유도될 수 있다. 예를 들어, 다수의 유체 스트림(125)은 그들이 접근하거나 또는 서로 충돌할 때와 같이 소성될 수 있다. 세포 (20)이 다수의 유체 스트림(125)을 통해 통과할 수 있듯이, 세포 (20)의 막에 변화가 일어나도록 힘이 적용될 수 있다. 또한, 전달을 용이하게 하기 위해 좁은 슬릿 형상(slit-like)의 노즐(nozzle)을 통해 소성(fired)될 수 있다.
시스템(5)은, 다른 구성이 가능하겠지만, 도 7과 같이 독립형 시스템(standalone system)일 수 있다. 예를 들어, 시스템(5)은 국소 세포 내 전달을 위해 환자에게 in vivo로 이식될 수 있거나 또는 세포를 환자에게 되돌리기 전에, 세포 치료용 기계에 ex vivo 로 통합될 수 있다.
본 명세서에 개시된 전달의 장점 이외에, 시스템의 미세 유체의 성질은 전달 조건, 전처리 및 세포의 후속 특성을 정확히 제어하도록 하기 위한 하나를 가능하게 한다. 예를 들어, 시스템은 형광 활성 세포 정렬(FACS) 모듈과 직렬로 구현될 수 있다. 이것은 실시간으로 동일한 시스템에 원하는 세포의 전달 및 정렬(sorting)을 가능하게 할 수 있다. 각종 전처리 및 후처리-정렬 분석 기술의 효율적으로 사용될 수 있고, 따라서 약물 검사 및 진단을 위한 지속적인, 고-처리량 분의 개발을 가능하게 할 수 있다.
표적 세포에 전달된 페이로드의 전달 효율은 미세 유체 장치로 진행된 처리를 갖는 집단뿐만 아니라 페이로드에 표적 세포의 대조 집단을 제공함으로써 결정된다. 대조 시료는 장치로 처리된 세포와 같은 시간에 적어도 같은 양을 위해, 동일한 농도에서, 동일한 전달 용액에 노출된다. 표면 결합, 엔도사이토시스(endocytosis), 및 기타 자가형광과 같은 영향을 보상하기 위해, 전달 지역은 이러한 지역에 놓인 살아있는 대조 세포의 오로지 상위 15%로 정의된다. 따라서 시료의 전달 효율은 전달 지역 내에 있는 살아있는 세포의 백분율에 상당한다. 예를 들어, 도 43A는 캐스케이드 블루 컨쥬게이션 3kDa 덱스 트란(cascade blue conjugated 3kDa dextran)에 노출된 대조 집단의 유세포 분석기로부터 얻어진 강도 히스토그램이다. 도 43B는 30㎛-6㎛ 장치에 공급된 세포의 유세포 분석기로부터 얻는 강도 히스토그램이다. 정의된 전달 지역은 도 43A 및 43B의 가려지지 않은(unshaded) 지역이다.
작동에 관한 도 17과 관련해서, 도 1-3을 더 참조하여, 세포 내 전달 시스템 (5)를 실행하기 위한 프로세스(1000)가 나타나는 단계를 포함한다. 그러나 프로세스(1000)는, 하나의 예시이며 이에 제한되는 것이 아니다. 프로세스(1000)는 예를 들어, 단계를 추가, 삭제, 수정 또는 재배치 하는 등으로 변경될 수 있다.
단계 (1005)에서, 세포(20)는 전달 물질(30)과 함께 버퍼(25)에 부유된다. 전형적인 세포 농도는 104 내지 109 개의 cells/ml의 범위일 수 있다. 전달 물질 농도는 10 mg/ml 내지 0.1 ug/ml 의 범위일 수 있다. 전달 물질은 손상/포어(pores)가 1-5 분 동안 열린 상태인 것을 고려하여 원하는 설정에 따라 전달 전이나 또는 직후에 세포 버퍼에 첨가될 수 있다. 버퍼은 적절한 세포 증식, 세포 건강 유지 또는 세포 신호 전달 경로의 도입을 위해 필요한 염, 당, 성장 인자, 동물 파생 산물 또는 기타 다른 성분으로 구성될 수 있다. 추가 물질을 버퍼(25)에 첨가 할 수 있다. 예를 들어, 계면 활성제(예: 플루로닉(pluronics)) 및/또는 벌킹 재료(bulking materials)를 버퍼(25)에 첨가할 수 있다.
단계 (1010)에서, 세포(20) 및 전달 물질(30)을 포함하는 버퍼(25)는 시스템(5)의 채널 (10)을 통해 통과될 수 있다. 버퍼(25)는 중력 또는 기타 다른 방법을 사용하여 채널(10)을 통과해 통과할 수 있다. 예를 들어, 압력이 채널(10)의 입구 측 버퍼(25)에 적용될 수 있고(예를 들어, 가스 실린더 및/또는 압축기를 사용하여), 및/또는 진공이 출구 측 진공 펌프에 의해 적용될 수 있다. 또한, 변위 기반 흐름 시스템(displacement based flow systems)을 사용할 수도 있다.
개별 세포(20)가 협착부(15)를 통과하면, 전달 물질(30)이 세포(20)의 내로 전달될 수 있도록 세포막의 발달을 위해 구멍(holes)과 같은 변화를 일으키는 협착부(15)의 솔리드 형성(solid construction)에 의해, 순간적으로 세포(20)에 압력이 적용된다. 세포(20)에 적용된 압력의 양 및/또는 지속 시간은 협착부(15)의 수치, 협착부(15)를 통해 통과하는 세포(20)의 속도, 및/또는 협착부 (15)의 모양 조정에 의해 변화될 수 있다. 일 구성으로, 약 5,000-20,000 cells/second이 협착부 (15)를 통해 통과하고, 각 세포는 약 100 μs 로 협착된다.
시스템(5)은 하나 또는 그 이상의 채널(10)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 시스템(5)은 병렬 구성으로 배치된 채널(10)의 50-100개를 포함할 수 있다. 병렬 구성을 사용하는 것은 채널(10)의 하나 또는 그 이상의 막힘 발달의 결과를 줄일 수 있고, 시스템(5) 전반적인 처리량을 증가시킬 수 있다. 또한 시스템(5)은 하나 또는 그 이상의 서로 연속된 채널을 포함할 수 있다.
단계 (1015)에서, 세포(20)가 협착부(15)를 통해 통과한 후, 세포는 버퍼(25)에 머물러 인큐베이션/회복 된다. 이 동안, 세포(20)는 세포막의 변화를 통해 버퍼(25)에 존재하는 전달 물질(30)의 일부를 수용할 것이다. 수용의 하나의 메커니즘은 더 큰 분자가 작은 분자보다 느린 속도로 흡수되는 것 때문에 확산-기반이다. 바람직하게, 세포(20)는 비록 다른 기간이 가능하지만, 약 2-5 분 동안에 버퍼 (25)에서 인큐베이션/회복 된다. 인큐베이션/회복 기간 동안, 전달 물질 (30)의 전달량이 세포 집단 전체에서 일관되도록 보장하기 위해 특정 상태가 제어될 수 있다. 예를 들어, 후기-협착(post-constriction), 인큐베이션/회복에 전달 물질을 충돌시키는 대류 전달 메커니즘(convective delivery mechanisms)이 사용될 수 있다.
선택적으로, 단계 (1020)에서, 세포가 인큐베이션/회복 된 후에, 세포는 버퍼을 제거하기 위해 세척될 수 있다. 비록, 세척은 세포로 흡수된 전달 물질(30)의 양을 통제하기 위해 다른 시간에 진행할 수 있지만, 복구되어야 할 변화에 대한 소요 기간이 지난 후에 진행하는 것이 바람직하다.
실시예 1: 기능적으로 조작된 나노입자들의 전달
조작된 나노재료들은 살아 있는 세포의 이미징 도구들, 치료용 분자 전달제들, 또는 빛이나 자기장과 같은 외부 핸들로 살아 있는 세포를 조작하기 위한 방법으로서 광범위한 잠재력을 가진다.(Howarth, M., et al. Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells. Nature Methods 5, 397­399 (2008)). 그러나 다수의 이들 잠재적인 적용은 나노재료들이 세포 사이토졸로 전달되는 것을 요구한다. QD와 같은 대부분의 나노입자들은 수성 배지에서 나노입자들이 용해성을 가지도록 하는 폴리머를 이용하여 부동태화될 필요가 있고, 이는 일반적으로 나노입자들이 세포막을 가로질러 수동적으로 확산되는 것을 방지한다. 나노입자들의 미세주입(microinjection)은 특별한 장비의 필요성 및 낮은 처리량(throughput)으로 인해 비실용적인 것으로 간주되는 반면, 전기천공은 세포 내에서 QD 응집을 일으킨다. 따라서 QD를 세포 사이토졸로 전달하려는 대부분의 시도들은, 세포에 의해 세포내 이입(endocytosing)되고 엔도솜(endosome)에서 벗어난 QD에 의존해 왔다. 본 발명의 청구 주제 이전에는, 만족스럽고 측정 가능한 방식으로 세포 세포질 내로 QD를 전달하는 것이 불가능하였다. 본 발명의 시스템은 초기 접근들의 이러한 전달 문제에 대한 해답을 제공한다.
미세유체 장치는 새로운 세대의 최근에 개시된 생물학적으로 호환가능한 QD와 결합된다(Liu, W., et al. Compact biocompatible quantum dots via RAFT-mediated synthesis of imidazole-based random copolymer ligand. JACS 132,472-483 (2010)). 실시예 1 전반에 사용된 상기 QD는 다중 금속-킬레이팅 이미다졸기 및 다중 수용성화 부동태화 폴리(에틸렌)글리콜(PEG)을 포함하는 폴리-이미다졸 리간드로 코팅되었다.
QD의 사이토졸성 전달을 위해, 세포는 QD를 포함하는 PBS 용액으로 분취하였다. 상기 세포-QD 용액은 미세유체 장치로 피펫팅(pipetting)하고, 상기 용액은 일정한 압력으로 채널을 통해 들어간 후, 5분 동안 인큐베이션하였다. 이러한 인큐베이션 기간 이후에, 과량의 QD는 원심분리에 의해 분리하였다. 대조군 개체군에 있어서, 상기 세포-QD 용액이 미세유체 장치 내에 놓이고, 상기 세포들은 사이토졸성 전달 프로토콜과 등량의 시간 동안 QD 용액에 노출되었다.
도 19는 투과 및 공초점 형광 이미지들의 오버레이(overlay), 및 그 다음은 본 발명을 이용하여 QD와 함께 전달된 처리된 세포의 z-단면 공초점 형광 이미지이다. 도 19는 처리(즉, 전달) 직후의 이미지(상부) 및 37℃ 및 5% CO2에서 48시간 인큐베이션 이후의 이미지(하부)를 보여준다. 확산 염색 패턴(diffuse staining pattern)은 세포질에 제한되고, 상기 나노입자들은 핵에 들어가지 않는 것으로 나타난다(세포 내의 어두운 영역). 기준자(scale bar)는 10㎛이다. 도 19에 이미지화된 QD를 코팅했던 특정의 유리 폴리-이미다졸 리간드는 PEG기를 통해 생체 적합성을 제공하는 것 이외에는 어떠한 기능성도 갖지 않는다. 공초점 현미경 이미지들에 따르면, 미세유체 장치를 통해 유동한 이후에 분리된 HeLa 세포가 세포의 상이한 z-단면 전반에서의 확산성 세포질성 QD 염색을 나타내는 것으로 보여진다(도 19의 상부). 확산성 염색은 5% CO2 및 37℃에서 세포의 인큐베이션 및 부착 이후에 48시간 이후에도 계속된다(도 19, 하부). 확산성 QD 형광은 가능하게도 세포 분열로 인해 48시간 정도에 희미해지게 된다(도 19). 상기 장치는 QD(약 13㎚의 유체 역학적 직경)를 약 40%의 살아 있는 세포 개체군으로 약 10,000세포/초의 처리 속도로 전달하였다. 도 20A는 PIL로 코팅된 QD에 의한 본 발명에 따른 처리 시에 HeLa 세포 사이토졸 내로의 전달 효율을 나타낸다. 유동 세포 분석법으로 측정될 때 세포 생존율은 80% 초과였다. 도 20B는 프로피디움 요오드화물 염색 및 유동 세포 분석 측정에 의해 측정될 때 본 발명의 청구 주제에 의한 플레인(plain) QD535의 전달 시의 HeLa 세포의 생존율을 나타낸다. 유동 세포 분석법으로 측정될 때의 처리된 세포의 생존율, 공초점 이미지 상의 확산성 염색, 및 상기 세포의 부착 능력은 살아 있는 세포의 세포질 내로의 QD의 전달에 상응한다.
엔도솜에 격리된 QD에 대비하여 사이토졸로 전달된 QD로부터 실재로 형광이 발생하는지 확인하기 위하여, 사이토졸의 환원 환경과 상호작용 시에 이의 방출 프로필을 변화시키도록 나노입자를 고안하였다. 세포 세포질 내의 환원 잠재성은 -260 내지 -220mV이고, 트리펩타이드 글루타티온(tripeptide glutathione)을 고농도(5 내지 10mM)로 유지하는 것에 의해 주로 좌우된다. 따라서 사이토졸 환경에 노출되는 경우에 그 방출이 변하는 QE-염료 구조체의 형광을 측정함으로써 전달된 나노입자들의 편재화 및 화학적 접근성이 결정될 수 있다. QD-염료는 환원성 이황화 결합을 통해 접합된 카복시-X-로다민(Rox) 염료(λ 방출 = 610㎚)에 대한 에너지 공여체로서 역할을 하는 녹색 방출 QD(λ 방출 = 541㎚)를 포함하여 구축되었다.
도 21은 구조체 설계, 흡광도, 다양한 배지에서의 안전성을 나타낸다. 2100은 염료와의 접합 이전의 개략도로서, QD 코팅 이전의 PIL의 개략도(왼쪽) 및 얻어진 QD-이황화물-Rox 구조체(오른쪽)의 개략도이다(일정한 비례로 도시되지 않은 이미지). 2110은 QD-이황화물-염료 구조체의 흡광 스펙트럼이다. 405㎚ 및 488㎚에서의 여기(excitation)는 실험 전반에 걸쳐 QD에 의한 배타적 흡수를 제공하였다. 2120은 37℃ 및 5% CO2의 완전 배양 배지에서의 구조체를 위해 QD에서 Rox로의 형광 에너지의 전이 안전성으로, 세포외 환경에서 다이황화 결합이 개열되지 않는다는 것을 보여준다. 플롯 2130은 QD의 형광 회복에 의해 도시된 바와 같이 사이토졸성 환원제인 글루타티온에 의한 이황화 결합의 개열을 예시한다. 2140에서는 비-티올 환원제인 트리스(2-카복시에틸)포스핀의 처리 시에 QD의 형광 회복이 나타나 있으며, 이는 이황화 결합의 개열을 추가로 지지한다.
PIL 내로 혼입된 티올기는 티올화된 Rox 염료와의 이황화 결합을 형성하였다. 정제된 구조체의 흡광 스펙트럼은 QD 당 평균 13개의 Rox 염료에서 QD 및 Rox 둘 모두의 흡광 특징을 가지며(2120), 이로 인해 QD 형광을 효과적으로 켄칭(quenching)한다(2130). 이러한 구조체는 사이토졸 내의 특정 환원 환경에 대한 비가역적 센서로 작용한다. 이황화 가교가 손상 없이 그대로 있는 반면에 QD는 488㎚(현미경법) 또는 405㎚(유동 세포 분석법)에서 레이저에 의해 선택적으로 여기되는 경우, 상기 구조체는 적색에서의 Rox 방출이 우세하도록 형광 공명 에너지 전이(FRET)를 수행한다. 용액 검정(solution assay)에서, 세포성 환원제인 글루타티온은 이황화 결합을 개열하여, Rox 염료를 방출하고 QD 형광이 회복되도록 한다(2140). 비-티올계 환원제인 트리스-(2카복시에틸)포스핀도 또한 QD 형광이 회복되도록 하는데, 이는 QD 표면으로부터 Rox의 방출이 글루타티온에 의한 PIL 변위(displacement)를 경유하는 것이 아님을 나타낸다(2140). Rox 형광은, PIL 상의 긴 PEG기에 의해 입체적 장애를 갖는 이황화 가교 일부로 인해, 그리고 염료와 QD 표면 사이의 일부 소량의 비-특이적 상호작용으로 인해 완전히 사라지지 않을 수 있다.
유동 세포 분석법 및 공초점 현미경법으로 측정한 바와 같이, 상기 구조체의 형광 프로필에서의 변화에 따르면, QD-이황화물-Rox 구조체들이 세포 세포질로 전달되는 것으로 확인된다. 환원성 사이토졸 환경에 노출되는 경우, 이황화 결합의 개열이 QD로부터 염료로의 FRET 공정을 방해한다. 따라서 QD의 배타적 여기 시에 QD 채널 형광이 시간이 지남에 따라 증가하는 반면, Rox 채널 형광은 시간이 지남에 따라 감소한다. 살아 있는 HeLa 세포들은 고농도의 QD-이화화물-Rox를 갖는 용액에서 미세유체 장치에 의해 처리되고, 5분 동안 인큐베이션한 후, 세포 배양 배지(즉, 처리된 세포들)를 첨가하기 전에 과량의 QD를 제거하기 위해 세척하였다. 대조군 세포들은 미세유체 장치로 처리하는 것 대신에 QD-이황화물-Roc와 함께 5분 동안 인큐베이션하였고, 세포 배양 배지에 놓기 전에 세척하였다. 처리된 세포 및 대조군 세포들의 Rox 및 QD 채널 형광은 공초점 현미경법 및 유동 세포 분석법 둘 모두에 의해 관찰되었다.
도 22A 및 도 22B는 살아 있는 세포의 공초점 현미경법 이미지들 및 형광 강도 분석을 예시한 것으로, QD 표면의 세포질성 염색 및 화학적 접근성을 증명한다. 도 22A는 처리된 세포들(상부) 및 대조군 세포들(하부)의 이미지를 예시하고 있다. 확산성 녹색 형광의 출현은 처리된 세포들에서만 존재한다. 기준자는 10㎛이다. 도 22B는 녹색 및 적색 채널에서 시간의 함수로서 강도에서의 변화를 예시하고 있다. 각각의 시점에서 n이 20미만이기 때문에, 총 평균 형광에서의 변동은 0시의 시점에 정상화함으로써(normalizing) 보정되었다.
공초점 현미경 하에, 처리된 세포들의 세포질 전반에 나타나는 확산성 형광은 강한 적색에서 강한 녹색으로 진행한다(도 22A에 도시된 바와 같음). 대조군 세포 이미지들은 링 형상의 형광에 의해 증명된 바와 같이 외막 상에서 몇몇 비-특이적 결합을 나타내며, 녹색 채널 신호에서의 증가는 없다. 이들 효과는 FRET 효과를 줄이는 사이토졸성 이황화 결합의 예상된 개열과 일치한다. 도 22B에서, 선 그래프는 처리된 세포 및 대조군 세포들에 대한 총 형광 및 자가형광에 대해 정상화함으로써 전달된 형광 물질에서의 세포간 차이에 대한 보정 이후에 세포 당 평균 QD 및 Rox 채널 강도를 작도한 것이다. 처리된 세포들에 있어서, 상기 그래프는 QD 형광이 Rox 형광 상부로 상승하는 인큐베이션 2와 4시간 사이의 교차형 그래프를 보여준다. 흥미롭게도, 상기 처리된 세포의 Rox 신호는 9시간 이후에 자가 형광 수준을 초과하여 안정화되는 것으로 나타난다. 이는 용액 검정에서의 결과와 일치하며, 여기서 몇몇 FRET는 환원 이후에도 잔류한다. 관측된 확산성 염색 및 QD 신호의 증가와 Rox 신호의 감소는 사이토졸성 전달 및 후속적인 이황화 결합의 개열을 강하게 지지한다. FRET에 의해 Rox로 켄칭된 대조군 세포들의 QD 형광은 자가 형광과는 구별되지 않는 것으로 나타난다. 상기 대조군 세포들은 초기 시점에 자가 형광을 초과한 일부 Rox 형광을 표시하며, 이는 이어 안정적으로 감소한다. 이는 QD-S-S-Rox와 세포의 표면 사이의 비-특이적 상호작용, 및 그 이후의 상기 구조체의 배지로의 재-용매화에 기인할 수 있다.
도 23은 유동 세포 분석법에 의한 평균 세포 형광 및 생존율의 측정치를 예시하고 있다. 2300은 세포 당 QD(왼쪽) 및 Rox(오른쪽)의 평균 형광으로, 처리된 세포들에서만 QD 형광의 증가를 나타낸다. 처리된 세포 및 대조군 세포들 둘 모두에서의 Rox 형광은 24시간 시점 정도에 자가 형광 수준으로 존재한다. 2310은 선택된 시점에 상기 QD 채널(외쪽) 및 Rox 채널(오른쪽)에서 처리된 세포 및 대조군 세포들 중의 형광 강도의 분포를 나타낸 히스토그램이다. QD 전달은 적어도 35%의 세포 개체군에서 일어나는 것으로 추정된다. 회색 영역은 히스토그램에서 형광 강도 피크의 이동에서 눈을 인도하는 것을 의미한다. 2320은 프로피디움 요오드화물에 의해 측정될 때 대조군 및 처리된 세포들의 생존율을 예시하고 있다.
도 23에 예시된 유동 세포 분석법에 의한 측정치에 따르면, QD-이황화물-Rox 구조체들은 사이토졸 환경과 상호작용할 수 있는 것으로 확인된다. 상기 유동 세포 분석법에 의한 측정치는 전달된 세포들(처리된 세포 개체군의 약 35%) 및 전달되지 않은 세포들을 포함한 모든 살아 있는 세포들에 대해 기록되어 있었다. 2100에서는 상기 처리 개체군 및 대조군 개체군의 세포 당 평균 형광이 예시되어 있다. 상기 처리된 세포들에 있어서 초기에는 평균 QD 형광이 상승하여, 약 9시간 정도에 최고에 달하며, 그 이후에 점진적으로 감소하는데, 이는 자가 형광 수준에 상응하게 유지되는 대조군 세포 개체군의 QD 형광과는 대조적이다. 이는 QD와 염료 사이의 이황화물 가교의 사이토졸성 환원, 및 그 이후의 세포 분열에 의한 형광 구조체들의 희석과 일치한다. 상기 처리된 세포 및 대조군 세포들 둘 모두에 대한 Rox 형광은 높게 시작하여 최초 2시간 이내에 감소한다. 이러한 감소는 인큐베이션 도중에 세포 표면에 결합되어 있었던 입자의 배지 내로의 재-용매화에 기인한다. 상기 처리된 세포 개체군에서의 평균 Rox 형광은 처리 개체군 내의 전달되지 않은 세포들의 존재로 인해 대조군 세포들과 유사하게 나타난다. 상기 처리 개체군 내에 전달된 세포 및 전달되지 않은 세포의 존재는 2310으로 도시된 QD 및 Rox 강도에 대한 히스토그램들에서 구별될 수 있다. 시간의 증가와 함께, 형광 히스토그램들은 처리된 세포들에 대해서는 양봉 형태가 되지만, 대조군 세포들에 대해서는 단봉 형태로 유지된다. 상기 처리된 세포 개체군의 서브세트에서 QD 형광은 시간이 지남에 따라 증가하며(2100), 이는 처리된 세포 및 전달된 세포들의 사이토졸에서 FRET 공정의 중단을 추가로 지지한다. 막 결합형 구조체들이 배지 내로 재-용매화됨에 따라 Rox 형광은 전반적으로 감소하지만, 상기 처리된 세포 개체군의 서브세트는 Rox 형광을 유지한다. 이는 공초점 현미경법에서 관측된 QD-S-S-Rox 결합의 불완전한 환원과 일치한다. 프로피디움 요오드화물 염색에 의해 측정된 바와 같이, 상기 처리된 세포 개체군의 생존율은 모든 시점에서 상기 대조군 개체군의 10% 이내에 있다(2130). 상기 대조군에 대한 90% 초과의 세포 생존율은 전기천공법 및 폴리머 기반 방법들과 같은 대안적인 방법들과 유리하게도 필적할만하고, 이러한 대안적인 방법들은 처리 후 생존율이 40% 내지 60%로 낮게 수득되었다.
도 24는 10nM의 QD 용액에 의한 장치의 처리(상부) 이후에 세포 사이토졸 내의 집성되지 않은 단일 QD, 및 자가 형광 의한 3개의 QD-표지된 2400, 2410 및 2420의 점멸 흔적(blinking trace)에 대한 에피형광 이미징(epifluorescence imaging)을 예시하고 있다. QD 점멸 흔적은 긴 획득 빈 시간(acquisition bin time: 500밀리초)로 인해 이진수가 아닌 것으로 나타난다. 기준자는 10㎛이다.
또한 QD 전달 플랫폼은, 관측된 방출 간헐도가 단일 QD와 일치함에 따라 집성되지 않은 QD-이황화물-Rox 구조체들을 전달함으로써 단일 분자의 이미징을 가능케 한다. 이러한 실험에 있어, QD-이황화물-Rox 구조체들은 사이토졸로 전달된 이후에, 10시간 동안 인큐베이션하고, 에피형광 현미경 상에서 이미징한다. 10시간의 인큐베이션은 사이토졸 내부로부터의 QD 형광이 이황화 결합의 환원을 통해 회수되었다는 것을 확실케 하였지만, 충분한 광자가 수집되었는지를 확실케 하기 위해서 에피형광 현미경법이 사용되었다. 몇몇 점멸성 QD는 세포들이 본 발명의 청구 주제에 의해 낮은 QD 농도로 처리되었을 때 관측되었다(도 24). 2400, 2410, 및 2420으로 도시된 사이토졸 중의 점멸성 QD의 강도 흔적은 긴 획득 빈 시간(500밀리초)의 결과로서 이진수가 아닌 것으로 나타난다. 병진성 세포 이동은 시간의 획득 프레임(약 1분) 동안에 최소화되는 것으로 간주되었다. 이들 데이터에 따르면, 본 발명의 청구 주제를 이용하여 QD를 형광 표지로서 전달함으로써 세포 사이토졸 내의 단일 분자 사건을 관측하는 능력이 증명된다.
실시예 1에서는 본 발명의 청구 주제의 실시형태에 따른 세포 사이토졸 내로의 나노입자의 전달이 증명된다. 사이토졸성 환원제에 의한 QD-이황화물-Rox의 개열을 관측함으로써, 나노입자 표면이 사이토졸 구성성분과 상호작용하는 것으로 나타났다. 본 발명의 청구 주제의 실시형태에서는 세포 생존율 및 QD 온전성을 보존하면서 임의의 세포 침투 또는 엔도솜 탈출 리간드 없이 QD를 세포 세포질 내로 높은 처리량으로 전달하는 것이 가능하다. 35%의 전달 효율은 미세유체 협착부의 개수를 증가키시거나, 협착부의 치수를 변경하거나, 처리 주기의 수를 증가시킴으로써 추가로 증가될 수 있다. 현재 대부분의 세포 침투용 펩타이드의 전달 방법들 또는 양전하 보조 전달 방법들과는 달리, 본 발명의 청구 주제는 동일한 나노입자 상에서 세포내 전달 핸들과 사이토졸성 단백질 표적화 핸들의 이중 접합을 요구하지 않는다. 상기 전자에 대한 요구를 제공함으로써, 교차 반응성, 접합 전략들의 불균일한 반응성 효율, 및 접합 화학량론에 대한 근심의 완화가 달성될 수 있다. 따라서 QD 구조체 설계에서의 유의한 유연성이 수득되어, 세포내 단백질의 표지 및 추적을 위한 상황을 조성한다. 상기 방법들은, 스트렙타아비딘-비오틴, HaloTag-클로로알칸, 및 소타아제 태깅(sortase tagging)을 들 수 있지만 이에 제한되지 않는 입증된 단백질 표적화 전략들을 통해 세포내 단백질들 및 세포기관들을 표적화하는 복잡한 설계에 의해 많은 형광 나노재료들의 전달에 유용하다.
실시예 1에서, 모든 화학 약품들은 시그마 알드리히(Sigma Aldrich)로부터 수득하였으며, 달리 개시하지 않는 한 수신된 상태로 사용하였다. 공기 민감성 재료들은 산소 수준이 0.2ppm 미만인 건식 질소 분위기 하에서 Omni-Lab VAC 글러브 박스(glovebox) 내에서 다루어졌다. 모든 용매는 분광 분석용이거나, 시약 수준이다. 방향족 고리 함유 화합물들은 소형 UV 램프 및 KMnO4를 이용하여 TLC 상에서 가시화되었다. 아민 함유 화합물들은 닌하이드린 착색제를 이용하여 TLC 상에서 가시화되었다. 플래쉬 칼럼 크로마토그래피는 텔레다인 아이스코 콤비플레쉬 콤패니언(Teledyne Isco Combiflash Companion) 상에서 수행되었다. HeLa 세포들은 ATCC로부터 구입하였으며, 모든 세포 배지의 재료들은 달리 개시되지 않는 한 미디어테크(Mediatech)로부터 구입하였다.
실시예 1에서, 1H NMR 스펙트럼은 브루커(Bruker) DRX 401 NMR 분광기 상에 기록하였다. MS-ESI는 브루커 달토닉스(Bruker Daltonics) APEXIV 4.7 FT-ICR-MS 기기 상에서 수행되었다. UV-Vis 흡광도 스펙트럼은 HP 8453 다이오드 어레이 분광 광도계를 이용하여 얻었다. 광루미네센스(photoluminescence) 및 흡광도 스펙트럼은 바이오테크 시너지 4 마이크로플레이트 리더(BioTek Synergy 4 Microplate Reader)로 기록하였다. 폴리머의 분자량은 좁은 폴리스티렌 표준물질에 대해 직렬로 배치된 3개의 PLgel 칼럼(103Å, 104Å, 및 105Å)이 구비된 아질런트(Agilent) 100 시리즈 HPLC/GPC 시스템 상의 DMF 용액에서 결정되었다. 염료 유도체들은 베리언 프로스타 프렙(Varian ProStar Prep) HPLC 시스템을 이용하여 정제되었다. 개질된 폴리머는 스파덱스(SephadexTM) G-25M으로 충진된 GE 헬쓰케어(Healthcare)의 PD-10 칼럼을 이용하여 정제하였다. 리간드-교환된 QD는 밀리포어 아미콘 울트라(Millipore Amicon Ultra) 30K-차단형 원심분리용 필터를 이용한 원심분리 투석에 의해 정제되며, 자가 충진형 수퍼덱스(Superdex) 200 10/100 유리 칼럼이 구비된 AKTA프라임 플러스(AKTAprime Plus) 크로마토그래피 시스템(아머샴 바이오사이언스(Amersham Biosciences))에 의해 정제되었다. 유동 세포 분석법에 의한 측정은 LSR 포르데사(Fortessa)(BD 바이오사이언스) 상에서 이루어졌다.
실시예 1에서, 478㎚에서의 제1 흡수 피크가 갖는 CdSe 코어는 앞서 기록된 방법 (1)을 이용하여 합성하였다. 요약하면, 0.4mmol(54.1㎎)의 CdO, 0.8mmol(0.2232g)의 TDPA, 및 9.6mmol(3.72g)의 TOPO를 25㎖의 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 용액은 160℃에서 1시간 동안 탈기하고, CdO가 용해되어 투명하고 균질한 용액이 형성될 때까지 아르곤 하에서 300℃까지 가열하였다. 이러한 과정 이후에 160℃에서 상기 용액을 진공 하에서 두어 생성된 물을 제거하였다. 상기 용액을 아르곤 하에 360℃까지 다시 가열하였고, TOP-Se 용액(1.5㎖의 TOP 중의 1.5㎖의 1.5M TOP-Se)을 신속하게 첨가하여 478㎚에서 제1 흡수 특징을 갖는 CdSe 코어를 수득하였다.
CdS 쉘은 앞서 기록된 과정(2)의 변형을 통해 CdSe 코어 상에 증착되었다. 아세톤을 이용하여 헥산으로부터 반복적인 침전에 의해 단리된 코어는 올레일아민(3㎖)과 옥타데센(6㎖)의 용매 혼합물에서 180℃까지 승혼하였다. 이어, Cd 및 S 전구체 용액들은 시간 당 4㎖의 속도로 연속해서 도입되었다. 상기 Cd 전구체는 옥타데센(1.5㎖)과 TOP(3㎖)의 용매 혼합물 중에서 0.33mmol의 Cd-올리에이트 및 0.66mmol의 올레일아민으로 이루어져 있다. 상기 S 전구체는 6㎖의 TOP 중의 0.3 mmol의 헥사메틸디실라티안[(TMS)2S]으로 이루어져 있다. 각각이 Cd 및 S인 총 3개의 일분자층의 첨가는 541㎚에서 방출하는 QD를 수득하며 옥탄에서 희석하는 경우에 60%의 양자 수율을 얻는다. CdSe(CdS)의 소광 계수는 문헌(3)으로부터의 CdSe 코어의 소광 계수를 이용하여 산정하였으며, 이는 오버코팅 단계 도중에 CdSe 코어의 95%가 유지되는 것으로 추정되었다.
실시예 1에서, 실리콘 칩은 포토리소그래피 및 심도 반응성 이온 에칭 기법들을 이용하여 제조하였다. 상기 얻어진 에칭된 실리콘 웨이퍼를 세정하여(H202 및 H2S04 사용) 잔류물을 제거하고, 산화시켜 유리 표면을 얻었으며, 개별적으로 포장된 장치 내로 다이싱(dicing)되기 전에 파이렉스(Pyrex) 웨이퍼에 결합되었다. 이어, 각각의 장치는 사용 이전에 결함이 있는지 개별적으로 검사하였다.
실시예 2: 거대분자들의 전달
거대분자들의 세포내 전달은 치료용 적용 및 연구용 적용에 있어서 중요한 단계이다. 예를 들어, DNA 및 RNA의 나노입자 매개 전달은 유전자 요법에 유용한 반면, 단백질 전달은 임상적 설정 및 실험실 설정 둘 모두에서 세포 기능에 영향을 미치도록 사용되었다. 소형 분자들, 퀀텀 닷, 또는 금 나노입자들과 같은 기타 재료들은 암 요법 내지 세포내 표지 및 단일 분자 추적과 같은 것을 위해 사이토졸에 절단된다.
상기 기법의 다양성을 증명하기 위해, 모델 덱스트란 분자들은 몇몇 세포 유형, 즉 DC2.4 수지상 세포들, 신생아 인간 포피 섬유아세포(NuFF) 및 마우스 배아 줄기세포들(mESC)에 전달되었으며, 이들 각각의 전달 효율은 최대 55%, 65% 및 30%로 달성되었다. 초기 실험들에서 마우스에서 유래한 1차 림프구, 대식세포 및 수지상 세포에서 성공적인 전달이 나타났다. 게다가, 상기 기법은 과도한 세포독성을 야기하지 않거나, 줄기세포 분화를 유도하지 않았다. 실제로, 모든 세포 유형은 최고 시험 속도에서도 60% 이상 생존할 수 있었다. 장치의 설계 및 작동 조건들은 임의의 상술한 세포 유형에 대해 이전에는 최적화되지 않았다.
도 25는 전달 성능이 세포 속도 및 협착부의 설계에 의존한다는 것을 보여주는 실험 결과를 예시하고 있다. 협착부 치수는 첫 번째 숫자가 협착부의 길이에 상응하고, 두 번째 숫자가 협착부의 너비에 상응하고, 세 번째 숫자가 존재하는 경우에 채널 당 일련의 협착부의 개수에 상응하도록 숫자(예를 들어, 10㎛-6㎛×5)로 표시되어 있다. 2500에서는 전달 효율이 도시되어 있으며, 2510에는 처리 18시간 이후의 세포 생존율(유동 세포 분석법에 의해 측정됨)이 40㎛-6㎛(○), 20㎛-6㎛(□) 및 10㎛-6㎛×5(Δ) 장치의 설계에 대해 세포 속도의 함수로서 도시되어 있다. 2520에서는 전달 효율이 도시되어 있고, 2530에는 세포 생존율(유동 세포 분석법에 의해 측정됨)이 30㎛-6㎛ 장치에 의해 처리된 1차 인간 섬유아세포(□), DC2.4 수지상 세포들(○), 및 마우스 배아 줄기세포들(mESC)(Δ)에서 속도의 함수로서 도시되어 있다. 인간 섬유아세포 및 수지상 세포들은 전달 18시간 이후에 분석하였다. MESC는 전달 1시간 이후에 분석하였다. 모든 데이터 포인트는 3회 운행되었으며, 에러 바(error bar)는 2개의 표준편차를 나타낸다.
도 26은 공초점 현미경법으로 측정된 바와 같이, 퍼시픽 블루(Pacific Blue)가 접합된 3kDa 덱스트란의 전달 이후에 HeLa 세포의 상이한 수평면의 스캔 2600을 예시하고 있다. 스캔은 상부에 하부로 판독한 후, 좌측에서 우측으로 판독하며, 이때 상부 좌측은 z = 6.98㎛에 있고, 하부 우측은 z = -6.7㎛에 있다. 기준자는 6㎛를 나타낸다. 2610에서는 10㎛-6㎛(□), 20㎛-6㎛(○), 30㎛-6㎛(Δ), 및 40㎛-6㎛ (◇) 장치의 살아 있는 세포 전달 효율이 도시되어 있다. 시간의 축은 세포들이 표적 전달 용액에 노출되기 전에 이들 세포의 초기 처리로부터 경과된 시간의 양을 나타낸다. 모든 결과는 처리 18시간 이후에 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. 2620에서는 전달된 세포 개체군의 평균 강도가 자가 형광을 위해 제어되도록 미처리 세포들에 의해 정규화되었다. 플루오레신-접합된 70kDa 덱스트란(수평선) 및 퍼시픽 블루-접합된 3kDa 덱스트란(대각선)이 세포로 전달되고(제1 및 제3 주기), 연속적인 처리 주기에서 세포로부터 제거된다(제2 주기). 대조군은 전달 용액에만 노출되고 상기 장치에 의해 처리되지 않는 세포들을 나타낸다. 모든 데이터 포인트는 3회 운영되었으며, 에러 바는 2개의 표준편차를 나타낸다.
이전의 나노입자 및 세포 침투용 펩타이드(CPP) 기반 전달 기법들이 세포내 이입 경로를 이용함에 따라, 본 발명의 청구 주제의 전달 기작에서 세포내 이입 영향을 배제하는 증거가 제시된다. 도 26은 2600에서 퍼시픽 블루-접합된 3kDa 덱스트란으로 처리된 세포들의 공초점 현미경법에 의해 당업자가 세포내 이입 방법들에 관해 기대할 수 있는 반점 특징과 대비해서 확산성 사이토졸성 염색을 증명한 것을 예시하고 있다. 게다가, 전달 실험을 세포내 이입이 최소화되는 온도인 4℃에서 수행되는 경우, 전달 효율은 시험 탑재물 재료인 3kDa 및 70kDa 덱스트란 둘 모두에 대한 온도에 의해 최소로 영향을 받는다. 이러한 데이터에 따르면, 세포내 이입이 이러한 시스템에서의 전달에 책임이 있을 가능성이 없는 것으로 나타난다.
시간에 따른 전달 동역학이 특성화되었다. 세포들은 전달 재료의 부재 하에 본 발명의 청구 주제에 의해 처리되고, 처리 이후에는 소정의 시간 간격으로 퍼시픽 블루-표지된 3kDa 덱스트란에 후속적으로 노출되었다. 이러한 접근법에서, 세포들이 협착부를 통과함에 따라, 이들 막이 붕괴되지만, 이들이 표지된 덱스트란에 노출되기 전까지는 어떠한 측정 가능한 전달도 일어나지 않는다. 따라서 상기 각 시점에서의 전달 효율은 처리 이후의 이러한 시간의 양 동안에 다공성으로 유지되는 세포들의 비율을 반영할 수 있다. 이러한 방법은 포어 형성/폐쇄의 동역학을 포착한다. 상기 결과에 따르면, 장치 설계(2610)와는 무관하게 처리 이후 최초 1분 이내에 거의 90%의 전달이 이루어진다는 것을 나타낸다. 상기 관측된 시간 척도는, 막 치유 동역학에 대한 이전 연구가 상처 유도 약 30초 이후에 발생하는 막 밀봉을 기록하고 있기 때문에 포어 형성 가설을 지지한다. 대조적으로, 나노입자 및 CPP 매개 전달 기작과 같은 세포내 이입 방법들에 대한 권장된 시간 척도는 시간의 순서에 관한 것이다.
막 포어(pores)을 통한 재료의 전달이 확산성이기 때문에 재료는 포어의 수명 동안에 세포 내로 교환되거나 세포 외로 교환될 수 있다. 한편, 세포내 이입 또는 전달 기작은 일방향성이어야 한다. 즉, 상기 기작은 재료의 세포 내로의 수송을 조장해야만 한다. 세포막을 가로지르는 재료의 양방향 수송을 증명하기 위해, 3회의 전달 주기로 이루어진 실험을 수행하였다. 제1 주기에서, 세포들은 3kDa 및 70kDa 덱스트란의 존재 하에 처리되고, 덱스트란 용액에서 5분 동안 인큐베이션되고, PBS로 2회 세척하였다. 샘플의 1/3을 보유하고, 후처리 공정을 위해 도말하였다. 제2 주기에서, 나머지 세척된 세포들을 다시 상기 장치로 처리하지만, 임의의 전달 재료의 부재 하에 처리하였으며, 추가의 5분 동안 인큐베이션하였다. 이러한 샘플의 1/2를 후처리 공정을 위해 도말하였다. 제2 주기에서, 제2 주기로부터의 나머지 세포들은 제1 주기와 동일한 조건 하에서 상기 장치를 통해 운영하고, 5분 동안 인큐베이션하고, PBS로 2회 세척하였다. 상기 세포들은 실험 18시간 이후에 유동 세포 분석법으로 분석하였다. 정규화된 형광 강도에서의 변화는 제1 주기 동안에 세포 내로의 덱스트란의 총 확산, 제2 주기 동안에 세포 밖으로의 덱스트란의 총 확산, 및 제3 주기 동안에 역확산을 증명한 것이다(2620). 따라서 이들 결과는 확산성 전달 기작과 일치한다.
도 27은 천공된 막을 가로질러 재료의 세포 내로의 수동 확산을 조장하는 COMSOL 멀티피직스(Multiphysics)로서 공지된 소프트웨어 패키지에서 개발된 단순화된 2D 확산 모델을 예시하고 있다. COMSOL 멀티피직스는 유한 원소 분석, 해결 프로그램(solver) 및 시뮬레이션 소프트웨어/FEA 소프트웨어 패키지로서, 다양한 물리학, 공학 응용, 특히 결합 현상, 또는 다중 물리학을 위해 COMSOL에 의해 개발되었다. 2700에서 재료의 전달/손실은 막 확산성의 함수로서 도시되어 있다. 시뮬레이션 결과는 관심 있는 재료가 천공 시기에 버퍼(□) 또는 세포(○) 내에 존재하는 경우에 막 확산성의 함수로서 세포로 전달된 재료의 비율/세포부터서 손실된 재료의 비율을 나타낸다. 2710은 재료가 버퍼에서 세포로 전달되는 경우에 시뮬레이션된 시스템, 및 상기 막을 가로질러 형성되는 농도 구배를 나타낸 그래프이다.
상기 세포 세포질 내로 및 외로의 입자 확산성에 대한 문헌치(literature value)들을 이용하여 도 26의 실험 결과는 유리한 질량 전달 모드로서 확산에 의해 정량적으로 재현되었다. 게다가, 실험 데이터를 이러한 모델에 적합하도록 함으로써 이러한 기법은 버퍼 중의 전달 재료의 10 내지 40%를 상기 세포 사이토졸 내로 전달한다. 비교해 보면, 단백질 전달을 위한 CPP 방법들은 버퍼 중의 재료의 0.1%만을 상기 사이토졸로 전달하는 것으로 추정된다.
입자의 크기(또는 유체 역학적 반경)는 특정 크기를 갖는 막 포어 내로 들어가는 이의 능력 및 이의 확산성에 영향을 미친다. 따라서 이러한 매개변수는 포어 형성/확산 기작에서 전달 효율에 영향을 미친다. 일련의 실험에서, 플루오레신 또는 퍼시픽 블루에 접합된 3kDa, 10kDa, 70kDa, 500kDa 및 2MDa 덱스트란의 시험 탑재물들이 전달되었다. 크기가 3.1MDa인 것으로 추정되는 플루오레신-표지된 플라스미드들도 또한 전달되었다. 이들 모델 분자들은 관심 있는 재료들을 전달하기 위해 이들의 분자량에서의 유사성에 기초하여 선별되었다. 예를 들어, 3kDa-10kDa 덱스트란은 몇몇 짧은 펩타이드 또는 siRNA와 유사한 크기를 갖는 반면, 70kDa-2MDa 범위는 대부분의 단백질 및 몇몇 소형 나노입자들의 크기와 유사하다.
도 28은 재료의 2-단계 전달의 결과를 예시하고 있다. 2800에서는 퍼시픽 블루-접합된 3kDa 덱스트란(□), 플루오레신-접합된 70kDa 덱스트란(○) 및 2MDa 덱스트란(Δ)로 처리된 HeLa 세포들에 대해 속도의 함수로서 살아 있는 세포의 전달 효율이 도시되어 있다. 이러한 실험은 10㎛-6㎛×5 칩을 이용하여 수행되었다. 모든 데이터 포인트는 3회 운영되었으며, 에러 바는 2개의 표준편차를 나타낸다. 2810 및 2820에는 미처리 HeLa 세포들(적색), 700㎜/초에서 처리된 HeLa 세포들(녹색), 500㎜/초에서 처리된 HeLa 세포들(오렌지색), 300㎜/초에서 처리된 HeLa 세포들(밝은 청색), 또는 전달 재료에만 노출된 HeLa 세포들(대조군, 짙은 청색)에 대한 유동 세포 분석 데이터의 히스토그램 오버레이가 예시되어 있다. 상기 전달 재료는 퍼시픽 블루-접합된 3kDa 덱스트란(2810) 및 플루오레신-접합된 70kDa 덱스트란(2820)으로 이루어져 있다.
상기 실험에 따르면, 70kDa 초과의 분자들은 3kDa 덱스트란에 대해 상이한 전달 프로파일을 갖는 것으로 나타났었다(2800). 상기 장치는 10㎛-6㎛×5 장치가 500㎜/초에서 작동하는 2-단계 전달을 초래하였다. 즉, 상기 장치는, 예를 들어 90%초과의 살아 있는 세포들이 3kDa 분자들을 받아들이도록 하는 반면, 약 50%의 살아 있는 세포들이 70kDa 및 2MDa 초과의 분자들을 받아들이도록 한다.
이들 유동 세포 분석 데이터에 상응하는 히스토그램들에 따르면, 3kDa 덱스트란의 전달은 2개의 독특한 피크를 생성하는 것으로 나타난다(2810). 제1 하위 개체군에서, 세포들은 평균 형광 강도에서 2 내지 6배의 증가와 함께 대조군들(대조군에서는 0㎜/초의 데이터 포인트에 대해 초기에 개시된 바와 같은 세포내 이입 및 표면 결합에 대해 설명함)에 대해 피크 변경에 의해 관측된 바와 같은 온건한 전달 수준을 나타낸다. 제2 개체군에서, 세포들은 대조군들에 대해 평균 형광 강도에서 20 내지 100배의 증가에 상응하는 증강된 전달 수준을 나타낸다. 이러한 효과는 상기 후자의 세포들의 하위 개체군이 상기 전자보다 더욱 심각하게 천공되어 있으며, 그 결과 재료 유입에서 거의 10배의 증가를 가능케 한다는 것을 나타낼 수 있다. 실제로, 300㎜/초, 500㎜/초 및 700㎜/초 곡선에 의해 예시된 바와 같이 작동 속도를 증가시킴으로써 처리 심각도(treatment severity)가 증가되면 증강된 전달과 함께 세포들의 비율(%)이 증가하는 것으로 나타난다. 70kDa 초과의 덱스트란 분자들의 전달에 대해 유사한 특징이 당업자에 의해 관측된다(2820). 그러나 더욱 낮은 입자 확산성 및 가능한 크기 배제 효과가 전체적인 전달된 량을 감소시킴에 따라 상기 효과는 덜 두드러지게 된다. 온건한 전달 개체군(제1 피크)만이 3kDa 사례에서 관측된 2 내지 6배의 증가와 비교해서 평균 형광 강도에서 1.5 내지 2배의 증가를 나타낸다. 이러한 효과는, 온건한 전달 개체군이 전달에 대한 본 발명의 정의에 기초하여 대조군과 구별하기 어려운 보다 큰 분자들의 경우에서와 같이 2800에서의 전달 데이터의 불일치를 설명할 수 있다. 그 결과, 70kDa 및 2MDa 덱스트란과 같이 보다 큰 분자들에 있어서, 제2 증강된 전달 개체군이 주로 당업자에 의해 측정된다.
신속한 기계적 변형에 의해 전달된 재료가 활성을 나타내고 세포 사이토졸에서 생물학적으로 이용 가능한지를 검증하기 위해, 시험 탑재물인 GFP 사일런싱(silencing) siRNA(암비온(Ambion), 미국)를 불안정화된 GFP를 발현하는 HeLa 세포들로 전달하는 일련의 실험을 수행하였다. 처리 18시간 이후에 투여량-의존적이고 서열-특이적인 GFP 넉다운(knockdown; 최대 80%)이 관측되었다. 세포 속도 및 장치 설계에 대한 유전자 넉다운 반응은 보다 높은 속도 및 다중 협착부 설계가 보다 큰 유전자 넉다운을 산출하도록 하는 덱스트란 전달 실험과 일치하였다. 리포펙타민(Lipofectamine) 2000은 이들 실험에서 양성 대조군으로서 사용되었다. 장치 설계 및 작동 매개변수는 이들 실험을 수행하기 이전에 siRNA의 전달용으로는 최적화되어 있지 않다.
도 29는 siRNA, 단백질 및 나노입자의 전달과 관련된 데이터를 예시하고 있다. 2900에서는 유전자 넉다운이 5μΜ의 전달 농도에서 10㎛-6㎛×5 칩을 이용한 항-eGFP siRNA의 전달 18시간 이후에 HeLa 세포들을 발현하는 불안정화된 GFP에서 장치의 유형 및 세포 속도의 함수로서 도시되어 있다. 리포펙타민 2000이 양성 대조군으로서 사용되었다. 2910에서는 신속한 기계적 변형 및 전기천공법에 의한 플루오레신-표지된 70kDa 덱스트란 및 퍼시픽 블루-표지된 3kDa 덱스트란의 전달 효율이 도시되어 있다. 각각의 덱스트란 유형은 전달 용액에 0.1㎎/㎖의 농도로 존재하였다. 2920에서는 플루오레신-표지된 소혈청 알부민(○)의 전달 효율, 퍼시픽 블루-접합된 3kDa 덱스트란(□)의 전달 효율, 및 세포 생존율(Δ)이 30㎛-6㎛ 장치를 이용하여 속도의 함수로서 도시되어 있다. 2930에는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 태그를 갖는 튜뷸린으로의 항체의 전달 직후의 HeLa 세포들의 형광 현미경 사진들이 도시되어 있다. 기준자는 5㎛이다. 2940 및 2950에는 10㎛-6㎛×5 장치에 의한 처리 1초 이후에 고정된 세포 중의 금 나노입자들(일부가 화살표로 표시됨)의 터널링 전자 현미경법(TEM) 이미지들이 도시되어 있다. 기준자는 500㎚이다. 모든 데이터 포인트는 3회 운영되었으며, 에러 바는 2개의 표준편차를 나타낸다.
추가의 실험에서, 이전의 도전적인 응용을 위해 사이토졸성 전달 잠재성이 탐구된다. 본 발명의 청구 주제의 성능을 상업적으로 이용 가능한 방법들과 비교하기 위해, 단백질 모델로서의 3kDa 및 70kDa 덱스트란은 본 발명의 주제 및 네온(Neon) 전기천공법 시스템(Invitrogen)을 이용하여 인간 섬유아세포로 전달되었다. 상기 결과에 따르면, 신속한 기계적 변형에 의해 이 같은 거대분자들의 전달 효율에 있어서 7배 또는 그 이상의 증가가 제공되는 것으로 나타난다(2910). 상기 방법을 단백질 전달로 전환하기 위해, 채널 직경이 30㎛ 내지 6㎛인 장치는 생존율을 90% 초과로 유지하면서 HeLa 세포로 플루오레신-표지된 소혈청 알부민(BSA)을 최대 44%의 효율로 전달하기 위해 사용되었다. 튜뷸린(바이오 레전드(Bio Legend))에 대한 알렉사 플루오르 488-표지된 항체가 또한 0.25㎎/㎖의 항체 농도를 이용하는 30㎛-6㎛ 장치에 의한 처리 이후에 HeLa 세포로 전달되었다(2930). 상기 확산성 염색에 따르면, 재료는 엔도솜에 포획되지 않으며, 그 결과 살아 있는 세포 항체를 이용한 사이토졸 내의 세포 구조의 염색에 적합한 것으로 나타난다. 아포리포단백질(apolipoprotein) E는 또한 이러한 기법을 이용하여 성공적으로 전달되었다.
나노입자의 전달을 위해, 변형 1초 이후에 고정된 세포들의 TEM 이미지들(2940 및 2950)에서는 15㎚ 크기의 PEG 1000-코팅된 금 나노입자들의 전달이 증명된다. 상기 금 나노입자들은 주로 집성되지 않은 상태로 나타나며, 명백히 엔도솜 내로 격리되지 않았다. 이들 이미지들에서, 전달에 책임이 있는 세포 세포질에서의 다양한 결함에 대한 증거가 관측되었다. 이전의 기법들을 성공하기 위해 노력했던 목표인 세포 사이토졸로 직접적인 퀀텀 닷의 비-세포독성 전달, 즉 높은 처리량이 증명되었다. 이들 실험에서, Rox 염료가 그들의 표면에 결합되어 있는 퀀텀 닷은 신속한 기계적 변형에 의해 전달되어, 시간이 지남에 따라 관측되었다. 이들 데이터에 따르면, 전달 효율의 최소 추정치는 35%로 나타나며, 전달된 퀀텀 닷이 사이토졸 내에 존재하며, 세포내 환경에 대해 화학적으로 접근 가능한 것으로 확인되었다.
일시적인 포어(transient pores)들이 세포가 미세유체 협착부를 통과함에 따라 세포의 신속한 기계적 변형에 의해 형성된다. 확산성 사이토졸성 염색(도 26에서 2600), siRNA 기능성(도 29에서 2900) 및 천공된 막을 가로지르는 재료의 양방향성 이동(도 26에서 2920)을 증명함으로써 이러한 기작은 데이터에 의해 지지된다. 협착부의 치수, 직렬 협착부의 개수, 및 전달 효율 및 생존율에 영향을 미치는 세포 속도와 같은 다수의 매개변수가 증명되었다(도 25). 따라서 이들 매개변수들은 세포의 유형 및 전달 재료의 크기에 기초하여 개별 적용을 위한 장치의 설계를 최적화하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 2에서, 이러한 기법은 전달 전의 다중 전처리 단계, 및 처리 이후의 분석 및 분류 단계로 이루어진 대형 통합 시스템 내로 혼입될 수 있는 미세유체 시스템에 기반을 두고 있다. 10,000개 세포들/초의 평균 처리 속도로 상기 전달 장치는, 예를 들어 전달 직후에 세포를 분류하거나 기타 분석 업무를 수행하기 위해 유동 세포 분석 기기와 함께 직렬로 배치될 수 있다.
본원에 개시된 장치, 시스템 및 방법들은 기존의 방법들에 대한 다수의 잠재적인 이점을 제공한다. 전기천공법 및 미세주입과 유사하게, 이는 천공 기반 기작이며, 따라서 외생성 재료들, 탑재물의 화학적 변형, 또는 세포내 이입 경로에 의존하지 않는다. 그러나 전기천공법과는 대조적으로 이는 단백질 전달에 제한된 성공을 달성했던 전기장에 의존하지 않으며, 몇몇 탑재물에 대해 손상을 입힐 수 있거나, 세포독성을 야기할 수 있다. 실제로, 현재의 결과에 따르면 대부분의 적용에서 상대적으로 높은 생존율이 증명되었으며, 퀀텀 닷과 같은 민감성 탑재물은 손상되지 않는 것으로 나타난다. 따라서 본 발명의 청구 주제는 사이토졸성 재료의 표지 및 추적과 같은 분야에서 유의한 이점을 제공하며, 여기서 전기천공법으로 인해 퀀텀 닷 손상이 하나의 문제가 될 수 있으며, 화학적 전달 방법들의 사용으로 인해 이용 가능한 표면 화학특성의 범위가 제한될 수 있다.
실시예 2에서는 또한 단백질을 세포 사이토졸로 전달하는 장치의 능력이 증명되었다. 데이터 및 모델링 추정치들에 따르면, 본 발명의 청구 주제가 세포 침투용 펩타이드의 사용 또는 전기천공법과 같은 이전의 관행에 대비하여 세포 당 10 내지 100배 이상의 재료를 전달할 수 있는 것으로 나타난다. 전달 비율에서의 이러한 향상은 단백질 기반 세포 리프로그래밍, 예를 들어 세포 사이토졸로의 전사 인자들의 전달이 신뢰 가능한 iPSC 생성 방법을 개발하는데 있어서 주요 장애물인 리프로그래밍에 사용하기 위한 강력한 방법을 제공한다. 또한 당업자라면 관심 있는 다양한 단백질들/펩타이드들을 전달함으로써 질병 기작을 연구하기 위해 발명의 청구 주제를 이용할 수 있다. 실제로, 본 발명의 청구 주제는, 대부분의 CPP 또는 나노입자 기반 기법들과는 달리 본 발명의 청구 주제가 단백질 구조 및 화학특성에 민감하지 않고, 세포내 이입 경로에 의존하지 않으며, 단백질 기능성에도 영향을 미치지 않기 때문에 높은 처리량으로 펩타이드 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 청구 주제가 1차 세포들을 전달하기 위한 잠재성을 증명하였기 때문에 속한 기계적 변형에 의한 사이토졸성 전달은 생체외(ex-vivo) 처리 기작으로서 수행될 수 있다. 이러한 접근법에서, 혈액 또는 기타 조직에서 단리된 환자의 표적 세포들은 환자의 인체 외부의 장치에 의해 처리된 후, 인체내로 재-도입된다. 이 같은 접근법은 단백질 또는 나노입자 치료제의 전달 효율의 증가를 이용하며, 기존의 기법들보다 안전하다. 이는 상기 접근법이 잠재적으로 독성인 벡터 입자들에 대한 필요성을 배제하며, 세망내피세포 제거 및 탈표적 전달(off-target delivery)과 연관된 임의의 잠재적인 부작용을 완화한다.
실시예 2에서, 상기 실리콘 기반 장치들은 포토리소그래피 및 심도 반응성 이온 에칭 기법들을 이용하여 미세제조 시설에서 제조되었다. 이러한 공정에서, 두께가 450㎛인 6" 실리콘 웨이퍼는 헥사메틸디실라잔(HMDS)으로 처리되고, 포토레지스트(OCG934, 후지필름(FujiFilm))를 이용하여 3,000rpm으로 60초 동안 스핀-코팅되며, 협착부 채널 설계를 갖는 크롬 마스크를 통해 자외선(EV1-EVG)에 노출되고, AZ405(AZ 일렉트릭 머티리얼스(Electronic Materials) 용액에서 100초 동안 현상하였다. 90℃에서 베이킹(baking)한지 20분 후, 상기 웨이퍼를 심도 반응성 이온 에칭(SPTS 테크놀로지스(Technologies))에 의해 목적하는 깊이(본 실시예의 경우에 전형적으로 15㎛)까지 에칭하였다. 피라냐(Piranha) 처리(H202 및 H2S04)는 에칭 공정이 완료된 이후에 임의의 잔류하는 포토레지스트를 제거하기 위해 사용되었다. 접속 구멍(즉, 유입구 및 유출구)을 에칭하기 위해, 접속 구멍 패턴 및 보다 두꺼운 포토레지스트 AZ9260(AZ 일렉트릭 머티리얼스)을 포함하는 상이한 마스크를 이용하여 웨이퍼의 맞은편(즉 에칭된 채널을 포함하지 않는 측면)에 대해 상기 공정을 반복하여 수행하였다.
산소 플라즈마 및 RCA 세정은 임의의 잔류하는 불순물을 제거하기 위해 사용되었다. 습식 산화는 상기 웨이퍼가 파이렉스 웨이퍼에 양극 방향으로 결합하고 개별 장치로 다이싱하기 전에 실리콘 산화물을 100 내지 200㎚ 두께로 성장시키기 위해 사용되었다. 각각의 장치는 사용 이전에 결함에 대해 개별적으로 검사하였다.
각각의 실험 이전에, 유입 및 유출 저장소(모두 퍼스트컷트(Firstcut)에 의해 주문 설계되고 제조됨)가 구비된 거치대 상에 장치를 장착하였다. 이들 저장소는 부나엔(Buna-N)의 오링(O-ring)(맥마스터-카르(McMaster-Carr))을 이용하는 장치와 상호작용하여 적절한 밀봉을 제공한다. 상기 유입 저장소는 테플론 배관을 이용하는 압력 조절기 시스템에 연결되어 상기 장치를 통해 재료를 밀어내기 위해 필요한 구동력을 제공하였다. 실시예 2에서는 압력이 최대 70psi로 수용될 수 있다.
실시예 2의 세포 배양액은 HeLa(ATCC)를 포함하며, HeLa를 발현하는 GFP 및 DC2.4(ATCC) 세포들은 10% 소태아 혈청(FBS)(아틀란타 바이올라지스(Atlanta Biologies)) 및 1% 페니실린 스트렙토마이신(미디어테크)이 보충된 고글루코오스 두벨코(Dubelco) 개질 필수 배지(DMEM, 미디어테크)에서 배양하였다. 1차 인간 섬유아세포 세포들(NuFF)(글로벌스템(Globalstem))은 15% FBS가 보충된 고글루코오스 DMEM에서 배양하였다. 세포들은 37℃ 및 5% C02에서 배양기 내에 방치하였다. 적용 가능한 경우, 부착형 세포들은 5 내지 10 분 동안 0.05% 트립신/EDTA(미디어테크)로 처리함으로써 현탁하였다.
마우스 배아 줄기세포들(mESC)은 1000유닛/㎖ LIF(밀리포어, 미국)가 보충된 배지에서 마우스 배아 섬유아세포(케미콘(Chemicon)) 상에서 성장시켰으며, 이때 상기 배지는 85% 녹아웃 DMEM, 15% 소태아 혈청, 1mM 글루타민, 0.1mM 베타 메르캅토에탄올 및 1% 비-필수 아미노산으로 이루어졌다. 0.25% 트립신/EDTA를 이용하여 2 내지 3일 마다 세포를 계대 배양하였다. 상기 장치로 처리하는 경우, mESC는 적어도 처리 2주 후에 콜로니를 형성하고 정상적인 형태를 유지할 수 있었다.
실시예 2에 있어서 실험을 수행하기 위해, 세포들은 먼저 목적하는 전달 버퍼(성장 배지, 포스페이트 완충 식염수(PBS) 또는 3% FBS 및 1% F-68 플루로닉스(Pluronics; 시그마))가 보충된 PBS에서 현탁하고, 목적하는 전달 재료와 혼합한 후, 상기 장치의 유입 저장소에 넣었다. 이러한 저장소는 조절기에 의해 제어되는 압축 공기 배관에 연결되며, 선택된 압력(0 내지 70psi)은 상기 장치를 통해 유체를 구동하기 위해 사용될 수 있다. 이어, 처리된 세포들은 유출 저장소로부터 수집된다. 세포들은 임의의 추가적인 처리에 적용하기 전에 포어 폐쇄를 확인하기 위해 처리 5 내지 20분 이후에 전달 용액에서 실온으로 인큐베이션하였다.
상이한 크기의 덱스트란 또는 단백질의 전달을 상기 덱스트란의 전달과 비교한 실시예 2의 실험에서, 상기 관심 있는 분자들은 공-전달되었다. 즉, 이들은 동일한 장치 상에서 동일한 세포 개체군을 이용하여 동일한 실험에 사용되었으며, 이들 형광 표지에 기초하여 분화하였다. 모든 실험 조건은 3회 수행되었으며, 에러 바는 2개의 표준편차를 나타낸다.
형광-표지된 덱스트란 분자들(Invitrogen) 또는 아포리포단백질 E(Invitrogen)를 전달하기 위해, 상기 실시예 2의 실험은, 상기 전달 버퍼가 0.1 내지 0.3㎎/㎖의 덱스트란 또는 1㎎/㎖의 아포리포단백질 E를 각각 함유하도록 상술한 바와 같이 수행되었다.
플루오레신-접합된 BSA(Invitrogen)를 전달하기 위해, 먼저 세포들을 5㎎/㎖의 미표지된 BSA(Sigma)를 함유하는 배양 배지에서 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 1㎎/㎖의 플루오레신-접합된 BSA를 함유하는 전달 버퍼을 이용하여 실시예 2의 장치로 처리하였다. 전-인큐베이션 단계는 세포 표면에 대한 형광-표지된 BSA의 비특이적 결합을 최소화하도록 의도되었다.
실시예 2에 대한 GFP 넉다운은 미처리 대조군에 대한 세포 개체군의 평균 형광 강도에서의 감소(%)로서 측정되었다. 리포펙타민 2000 + siRNA 입자들은 1㎍의 siRNA를 100㎕의 PBS 중의 1㎕의 리포펙타민 2000 시약과 조합함으로써 제조되었다. 실온에서 인큐베이션한지 20분 이후, 20㎕의 이러한 혼합물을 약 20,000개의 세포 및 100㎕의 배지를 함유하는 각각의 실험 웰에 첨가하였다. 상기 세포들은 분석 이전에 18시간 동안 입자들과 함께 인큐베이션하도록 하였다.
실시예 2에서, 금 나노입자들은 티올 말단형 1000MW 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 나노입자 표면에 접합함으로써 제조한 후, 과량의 PEG는 원심분리(30분 동안 10,000rcf)에 의해 4회 세척하였으며, 상기 얻어진 재료는 100nM의 최종 농도가 될 때까지 PBs에서 현탁하였다. HeLa 세포들에 대한 GNP 전달을 이미징하기 위해, 상기 세포들을 3% FBS, 1% F-68 플루로닉스 및 47nM의 GNP가 보충된 PBS에서 현탁하고, 10㎛-6㎛×5 장치에 의해 처리하고, 0.1M 카코딜산나트륨 버퍼(pH 7.4) 중의 2.5%(w/v) 글루타르알데하이드, 3%(w/v) 파라포름알데하이드 및 5.0%(w/v) 수크로오즈에서 고정하였다. 하룻밤 동안 고정한 후, 상기 세포들은 베로날 아세테이트(veronal-acetate) 버퍼 중의 1%(w/v) OsO4에서 1시간 동안 후-고정하였다. 이어, 이들은 베로날 아세테이트 버퍼(pH 6.0) 중의 0.5% 아세트산 우라늄으로 하룻밤 동안 염색하고, 탈수하고, 스퍼 수지(Spurr's resin)에 포매하였다. 단면을 라이허트 울트라커트(Reichert Ultracut) E(Leica) 상에서 다이아몬드 나이프를 사용하여 70㎚의 두께로 절단하였다. M410 전자 현미경(Phillips)을 사용하여 단면을 검사하였다.
실시예 2에서, 네온 전기천공법 시스템(Invitrogen)은 플루오레신-표지된 70kDa 및 퍼시픽 블루-표지된 3kDa 덱스트란으로 NuFF 세포를 형질 감염시키기 위해 사용되었다. 제조사의 과정은 다음과 같다: 세포들을 세척하고, 적절한 버퍼에 이들을 현탁하였다. 0.1㎎/㎖의 덱스트란 농도와 더불어 107개 세포/㎖의 농도로 10㎕ 팁을 이용하여 세포들을 처리하였다. 사용된 3개의 조건은 다음과 같다: 1) 1700V로 20밀리초 동안 1회 펄스, 2) 1600V로 10밀리초 동안 3회 펄스, 및 3) 1400V로 20밀리초 동안 2회 펄스. 조건 1 및 3 둘 모두는 각각 84% 및 82%의 eGFP 플라스미드 전달 효율로 인간 섬유아세포 세포들을 형질 감염시키기 위한 최적의 조건으로서 제조사에 의해 권장되었다.
실시예 2의 공초점 이미지들에서, 샘플은 800rcf로 4분 동안 원심분리하고, 이미징 이전에 PBS로 2 내지 3회 세척하였다. 60배율의 수침 렌즈가 구비된 니콘(Nikon) TE2000-U 도립 현미경 상에서 CI 공초점 부가유닛(confocal add-on unit)을 이용하여 살아 있는 세포들에 대해 공초점 이미지들을 찍었다. 형광 샘플들은 405㎚ 레이저로 여기시키고, 표준 DAPI 필터(니콘)를 이용하여 검출하였다.
실시예 2의 형광 현미경법에서, 샘플들을 800rcf에서 4분 동안 원심분리하고, 이미징 이전에 PBS로 2 내지 3회 세척하였다. 네오플루아르(Neofluar) 렌즈(차이스(Zeiss))가 구비된 악시오버트(Axiovert) 200(차이스) 도립 현미경을 이용하여 이미지들을 수득하였다. 형광 여기는 X-cite 120Q 수은 램프(루멘 다이나믹스(Lumen Dynamics))에 의해 제공되었다. 상기 현미경에는 하마마츠(Hamamatsu) C4742-95 카메라(하마마츠)가 구비되어 있으며, 이미지들은 이미지제이(ImageJ, NIH)로 분석하였다.
실시예 2의 유동 세포 분석법에서, 전달 실험 이후에 세포들을 분석하기 위해 세포들을 PBS(96-웰 플레이트에서 각 웰 당 100㎕ 미만)로 2 내지 3회 세척하였다. 이어, 이들은 3% FBS, 1% F-68 플루로닉스 및 10㎍/㎖ 프로피디움 요오드화물(시그마)이 보충된 PBS에 재현탁하였다. 고처리량 샘플링 로봇이 구비된 LSR 포르테사(Fortessa)(BD 바이오사이언스) 또는 FACSCanto(BD 바이오사이언스) 상에서 세포들을 분석하였다. 405㎚ 및 488㎚ 레이저는 목적하는 형광 발색단의 여기를 위해 사용되었다. 프로피디움 요오드화물(생사 착색제(live/dead stain)), 플루오레신 및 퍼시픽 블루의 신호를 695㎚ 장파장 투과 필터, 530/30 필터 및 450/50 필터를 이용하여 각각 검출하였다. 데이터 분석은 FACS 디바(Diva; BD 바이오사이언스) 및 플로우조(FlowJo) 소프트웨어(플로우조)를 이용하여 수행하였다.
실시예 3: 줄기세포들 및 면역 세포들
단백질들, 나노입자들, siRNA, DNA 및 탄소 나노튜브들은 배아 줄기세포들 및 면역 세포들을 포함한 11개의 상이한 세포 유형들로 성공적으로 전달하였다. 실제로, 구조적으로 다양한 재료들을 전달하는 능력, 및 구조적으로 다양한 재료들을 형질 감염시키기 어려운 이의 적용 가능성은 상기 장치 및 방법들이 연구 및 임상적 적용에서 광범위한 적용 가능성을 갖는 것을 보여준다.
실시예 3에서, 각각의 장치는 45개의 동일하고 평행한 미세유체 채널로 이루어져 있으며, 상기 채널은 실리콘 칩 상에서 에칭되고 파이렉스 층에 의해 밀봉된 하나 이상의 협착부를 포함한다. 각각의 협착부(하기에 더욱 상세하게 개시됨)의 너비 및 길이는 각각 4 내지 8㎛ 및 10 내지 40㎛의 범위이다. 상기 실시예 3의 장치는 전형적으로 20,000개의 세포들/초의 처리 속도로 작동하였으며, 막힘으로 인해 실패 이전에 장치 당 일백만개의 처리된 세포들에 근접한 세포를 얻었다. 평행한 채널 설계는 하나의 채널에서의 임의의 막힘 또는 결함이 인근 채널의 유속에 영향을 미칠 수 없기 때문에 세포들의 균일한 처리를 확실케 하면서 처리량을 증가시키기 위해 선택되었다(상기 장치는 일정한 압력에서 작동할 수 있음). 사용 이전에, 상기 장치는 먼저 유입 및 유출 저장소를 실리콘 장치에 연결하는 강철 인터페이스에 연결될 수 있다. 이어, 세포들과 목적하는 전달 재료의 혼합물은 유입 저장소 내에 놓일 수 있으며, 테플론 배관은 유입구에 부착된다. 이어, 압력 조절기는 유입 저장소에서의 압력을 조절하고 상기 장치를 통해 세포들을 구동하기 위해 사용될 수 있다. 상기 처리된 세포들은 유출 저장소로부터 수집될 수 있다.
확인되었던 전달 효율에 영향을 미치는 매개변수들(예를 들어, 상기 실시예 2 참조)은 세포 속도, 협착부의 치수 및 협착부의 개수를 포함할 수 있다(그 결과, 세포들이 겪은 전단 및 압축 속도를 변경함). 예를 들어, 살아 있는 HeLa 세포들에 대한 막 불투과성인 퍼시픽 블루-표지된 3kDa 덱스트란 분자들의 전달 효율은 상이한 협착부 설계를 가로지르는 세포 속도와 함께 단조롭게 증가한다(예를 들어, 도 25의 2500). 협착부 치수는 또한 전달에 영향을 미친다. 즉, 협착부 길이를 20㎛에서 40㎛로 증가시키면 모든 작동 속도에서 전달 효율이 배가되었으며(예를 들어, 도 25의 2500), 생존율에 대한 효과는 최소가 되었다(예를 들어, 도 25의 2510). 협착부 너비를 감소시키면, 유사한 효과가 나타났다. 직렬의 협착부 개수를 증가시키면, 또한 길이가 10㎛인 5개의 직렬의 협착부를 구비한 장치가 모든 세포 속도에서 단일의 10㎛, 20㎛ 또는 40㎛ 길이 설계를 능가하도록 전달 효율이 증가하였다(예를 들어, 도 25의 2500 및 2510). 이들 데이터에서, 0㎜/초의 데이터 포인트는 대조군 사례에 상응하며, 이때 상기 세포들은 기타 샘플과 동일한 처리를 경험하지만, 상기 장치를 통과하지는 않으며, 그 결과 임의의 세포내 이입 또는 표면 결합 효과를 반영한다.
상기 기법의 다양성을 조사하기 위해, 통상적으로 형질 감염시키기 어려운 몇몇 세포 유형들, 특히 면역 세포들 및 줄기세포들로 모델 덱스트란 분자들을 전달하기 위한 이의 능력을 평가하였다. 형광-표지된 70kDa 및 3kDa 덱스트란은, 이들이 많은 단백질 및 siRNA 분자들과 각각 크기가 유사하고, 유동 세포 분석법에 의해 검출하기 쉬우며, 이들이 음하전을 띰에 따라 최소 표면 결합 효과를 갖기 때문에 이들 실험용으로 사용되었다.
도 30은 세포 유형들 전반에 걸쳐 본 발명의 청구 주제의 적용 가능성을 예시하고 있다. 3000에서는 3kDa 및 70kDa 덱스트란을 전달하기 위해 30㎛-6㎛ 장치로 처리된 NuFF 세포들의 전달 효율 및 생존율이 도시되어 있다. 3010에는 3kDa 및 70kDa 덱스트란을 전달하기 위해 10㎛-4㎛ 장치로 처리된, 쥐의 비장에서 단리된 수지상 세포들의 전달 효율 및 생존율이 도시되어 있다. 3020에는 3kDa 및 70kDa 덱스트란 을 전달하기 위해 10㎛-6㎛ 장치로 처리된 쥐 배아 줄기세포들의 전달 효율 및 생존율이 도시되어 있다. 3030에는 3kDa 덱스트란의 전달 효율이 도시되어 있으며, 3040에는 원심분리에 의해 마우스 전혈로부터 단리되고 1000㎜/초로 30㎛-5㎛ 및 30㎛-5㎛×5 장치에 의해 처리된 B-세포들(CD19+), T-세포들(TCR-β+) 및 대식세포(CD11b)에 대한 70kDa 덱스트란의 전달 효율이 도시되어 있다. 3kDa 및 70kDa 덱스트란은 각각 퍼시픽 블루 및 플루오레신으로 표지되었다. 모든 데이터 포인트는 3회 운영되었으며, 에러 바는 2개의 표준편차를 나타낸다.
다양한 장치 설계를 이용함으로써 덱스트란 분자들이 신생 인간 포피 섬유아세포(NuFF)(3000), 1차 쥐 수지상 세포들(3010) 및 배아 줄기세포들(3020)로 전달되었다. 이들 실험에서는 세포 생존율(3000, 3010 및 3020)이 최소 손실(25% 미만)로 수득되었으며, 쥐 배아 줄기세포들에서의 결과에서는 상기 방법이 분화를 유도하지 않는다는 것으로 나타난다. 추가적인 연구에서, 백혈구 세포들(담황갈색 코트층)은 원심분리에 의해 쥐 혈액에서 단리되었으며, 상기 장치로 이들을 처리하였다. 항체 염색에 의해 구별된 바와 같이, B 세포들, T 세포들 및 대식세포에서는 3kDa 및 70kDa 덱스트란 둘 모두의 성공적인 전달이 나타났다(3030 및 3040).
현재의 전달 문제점을 다루는데 있어서 본 발명의 청구 주제의 잠재성을 예시하기 위해, 세포 리프로그래밍에서 탄소 나노튜브 기반 감지에 이르는 가능한 적용에서 다수의 실험이 수행되었다. 하기에 개시된 적용 특이적 재료 이외에, 본 발명의 청구 주제는 아포리포단백질 E, 소혈청 알부민 및 GFP-플라스미드들과 같은 다양한 시험 탑재물들의 성공적인 전달을 증명하였다.
도 31은 나노재료 및 항체의 전달로부터의 데이터를 예시하고 있다. 3100에는 퍼시픽 블루-표지된 3kDa 덱스트란, 및 Cy5-표지되고 DNA로 둘러싸인 탄소 나노튜브를 전달하기 위해 10㎛-6㎛×5 장치로 처리된 HeLa 세포들의 전달 효율 및 생존율이 도시되어 있다. 3110에는 세포내 이입(오른쪽) 대비 상기 처리된 세포들(외쪽)에서의 탄소 나노튜브의 전달을 나타내기 위해 G-밴드(적색)에서 라만(Raman) 산란에 의해 중복된 명시야 세포 이미지들이 도시되어 있다. 기준자는 2㎛이다. 3120에는 알렉사 플루오르 488 태그(오른쪽 패널)가 구비된 튜뷸린에 대한 항체 및 퍼시픽 블루-표지된 3kDa 덱스트란(중간 패널)의 전달 18시간 이후에 HeLa 세포의 형광 현미경사진이 도시되어 있다. 3130에는 알렉사 플루오르 488-표지된 항-튜뷸린 항체를 전달하기 위해 500㎜/초로 10㎛-6㎛×5 장치에 의해 처리된 HeLa 세포들의 전달 효율 및 생존율이 도시되어 있다. 상이한 항체 농도에서의 전달 효율은 100㎍/㎖의 농도 및 미처리 세포들에서의 세포내 이입 대조군과 비교된다.
유동 세포 분석법(3100) 및 라만 분광법(3110)에 의한 탄소 나노튜브(DNA 올리고뉴클레오타이드에 의해 캡슐화됨)의 성공적인 전달의 검증. 튜뷸린에 대한 항체도 또한 이러한 기법을 이용하여 전달되었으며(3120 및 3130), 그 결과 사이토졸성 전달과 일치할 수 있는 세포를 통해 확산성 분포를 수득하였다. 상술한 재료들은 현재 세포 사이토졸로 전달되기 어려우며, 각각의 재료는 종종 전달을 조장하기 위해 전문화된 변형을 요구한다. 실시예 3에서, 4개의 재료 모두는 10㎛-6㎛×5 장치에 대해 동일한 세트의 조건을 이용하여 HeLa 세포들로 전달되었다.
1차 세포들에 대한 단백질들의 효율적인 전달은 몇몇 치료적 적용을 가능케 할 수 있다. 예를 들어, 세포 리프로그래밍에서의 도전(challenge)은 이전의 CPP 기반 단백질 전달 방법들의 비효율성이다. 도 32는 단백질 전달 적용을 예시하고 있다. 3200에는 10㎛-6㎛ 장치 대비 세포 침투용 펩타이드에 의한 NuFF 세포들로의 c-Myc, Klf-4, Oct-4 및 Sox-2의 전달에 대한 웨스턴 블랏 분석이 도시되어 있다. 4개의 단백질 각각은 흡수를 조장하기 위해 부가적인 9개의 아르기닌(9R) 기를 갖는다. 용해물(Ly) 칼럼은 세척되고 용해된 세포들의 단백질 함량에 상응하는 반면, 수프 칼럼은 배지 환경의 단백질 함량에 상응한다. 3210에는 퍼시픽 블루-표지된 3kDa 덱스트란 및 알렉사 플루오르 488-표지된 난백 알부민을 전달하기 위해 10㎛-4㎛ 장치로 처리된, 비장에서 단리된 수지상 세포들의 전달 효율 및 생존율이 도시되어 있다. 모든 데이터 포인트는 3회 운영되었으며, 에러 바는 2개의 표준편차를 나타낸다.
4개의 예시적인 전사 인자들(Oct4, Sox2, c-Myc 및 Klf-4)을 인간 섬유아세포 세포들로 전달하는 능력을 검토하고, CPP 방법과 비교하였다(3200). 상기 결과에 따르면, 많은 재료가 엔도솜에 포획된 채로 유지될 수 있는 세포내 이입에 의존하지 않는다는 사실 이외에, 신속한 기계적 변형에 의한 전달은 4개의 단백질 모두에 대해 유의하게 높은 전달 효율을 달성하는 것으로 나타난다. 이러한 결과는, 본 발명의 청구 주제가 CPP에 대비하여 단백질 전달에서의 10 내지 100배의 향상을 나타낼 수 있다는 것을 보여준 상술한 시뮬레이션 작업과 일치한다.
수지상 세포들(DC)에서의 항원 제시는 본 발명의 청구 주제가 하나의 이점을 제공하는 또 다른 분야이다. 연구원들은 강력한 세포독성 T 세포 반응을 유도하기 위해 DC의 MHC 클래스 I 수용체 상에서 항원을 발현하기 위한 방법들을 탐구하고 있었다. 암 백신의 제조에서 직접적인 임상적 의의를 갖는 본 발명의 청구 주제는, 예를 들어 MHC 클래스 I의 제시가 사이토졸성 단백질들에 대해 거의 배타적이기 때문에 항원성 단백질들의 사이토졸성 전달에 의존한다. 재료의 직접적인 사이토졸성 전달을 조장함으로써, 본 발명의 청구 주제는 특정 항원에 대한 생체내(in vivo) 세포독성 T 세포 반응을 야기하기 위한 플랫폼으로서 작용한다. 이러한 능력을 나타내기 위해, 모델 항원 단백질인 알렉사 488-표지된 난백 알부민을 성공적으로 비장에서 유래한 쥐 수지상 세포들로 전달하였다(3210). 이러한 세포 유형에서 보다 높은 세포내 이입 속도에도 불구하고, 상기 장치는 세포내 이입 대조군(0㎜/초)에 대비하여 전달 비율에서의 유의한 증가를 초래하였다. 게다가, 상기 전달된 재료는 세포 변형 기작으로 인해 세포질에 존재한다. 이러한 특징은 세포질성 압력이 MHC 클래스 I 항원의 제시를 위한 중요한 요건이기 때문에 항원 전달을 위해 특히 중요하다.
실시예 3의 시스템은 탄소 나노튜브, 금 나노입자들 및 항체를 전달하는 이의 능력를 갖는 가능한 연구 도구로서, 상기 3개의 재료들은 현재의 기법들로 전달하기는 어렵다. 본 발명의 청구 주제는 살아 있는 세포 구조/단백질들의 항체 및 퀀텀 닷 염색을 조장하고, 사이토졸성 분자 프로브 또는 화학적 센서로서 탄소 나노튜브의 사용을 가능케 함으로써 세포내 공정을 탐침하는 능력을 유의하게 확장시킨다. 강력한 단백질 전달 방법으로서, 대부분의 CPP 또는 나노입자 기반 기법들과는 달리 이러한 방법이 단백질 구조 및 화학특성에 민감하지 않고, 세포내 이입 경로에 의존하지 않으며, 단백질 기능성에 영향을 미치지 않기 때문에 이는 높은 처리량으로 펩타이드/단백질 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.
부가적으로, 본 발명의 청구 주제는 요법에 유용하다(도 32). 예를 들어, 환자의 표적 세포들은 혈액 또는 기타 조직으로부터 단리되고, 목적하는 치료제를 전달하기 위해 상기 장치에 의해 처리되며, 인체에 재-도입된다. 이 같은 접근법은 치료용 거대분자들의 증가된 전달 효율을 이용하며, 기본의 기법들 보다 안전하다. 이는 상기 접근법이 잠재적으로 독성인 벡터 입자들에 대한 필요성을 배제하고, 세망내피세포 제거 및 탈표적 전달과 연관된 임의의 잠재적인 부작용을 완화하기 때문이다.
실시예 4: 맞춤형 암 백신 접종
거대분자들의 세포내 전달에서의 현재의 도전은 질병 기작의 보다 양호한 이해에 대한 유의한 장벽, 및 신규한 치료용 접근법의 실행이다. 최근 전달 기술에서의 진전에도 불구하고, 환자 유래 세포들의 처리는 하나의 도전으로 남아있고, 현재의 방법들은 종종 독성 전기장 또는 외생성 재료들에 의존한다. 미세유체 플랫폼 및 관련된 시스템 및 방법들은 전달을 조장하기 위해 세포들의 기계적인 변형에 의존한다. 이러한 제어된 물리적 접근법은 단백질 기반 세포 리프로그래밍 및 퀀텀 닷 전달과 같은 이전의 도전적인 분야에서의 결과를 산출하여 왔다.
세포 거동에 영향을 미치는 가장 효과적이고 직접적인 방법은 세포 세포질에 활성제를 전달하는 것이다. 따라서 거대분자들의 세포내 전달은 신약 개발에서 생화학적 공정의 연구에 이르는 적용 내지 치료용 적용을 이용한 연구 및 개발(R&D)에 중요한 역할을 한다. 그러나 현재의 방법들은 한계가 있다. 이들은 종종 환자 유래 세포(1차 세포)들에서 낮은 효능을 가지며, 독성 전기장 또는 외생성 재료에 의존하며, 단백질과 같은 구조적으로 다양한 재료들의 전달에 부적당하다.
이들 사안을 제기할 수 있는 강력한 전달 플랫폼은 생물학 연구에서 유의한 진전을 가능케 하고, 맞춤형 암 백신 접종과 같은 새로운 요법들의 생성을 위한 기반으로서 작용한다. 예를 들어, 면역 세포들을 위한 효과적인 단백질 전달 방법이 암 백신 접종 플랫폼으로서 작용할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본원에 개시된 미세유체 장치, 관련된 시스템 및 방법들은 세포가 협착부를 통과함에 따라 세포를 신속하게 변형함으로써 재료의 세포내 전달을 조장한다. 상기 변형 공정은 세포막 일시적인 붕괴를 야기하고, 따라서 주변의 버퍼으로부터 세포 사이토졸 내로의 재료의 수동 확산을 가능케 한다. 현재의 방법들이 의존하고 있는 외생성 재료 및 전기장에 대한 필요성을 배제함으로써, 이러한 접근법은 감소된 독성과 더불어 단순화된 강력한 전달 접근법을 제공한다. 이로 인해, 이러한 방법은 암 백신 접종과 같은 몇몇 연구 및 임상적 적용에서의 이점과 함께 거대분자들의 세포내 전달에 대한 광범위한 플랫폼으로서 작용할 수 있다.
도 34는 환자의 혈액이 거대분자들의 전달을 위해 미세유체 장치에 의해 처리되는 시스템을 나타낸 도해이다. 본 발명의 청구 주제의 일 실시형태는 환자의 혈액으로부터 단리된 수지상 세포들(DC)이 특정 암 항원에 대해 이들을 활성화시기 위해 생체외에서 장치에 의해 처리된 후에 환자의 혈류 내로 재도입되는 시스템을 포함한다. 예를 들어, 전달된 항원은 생체검사로부터 수득된 특정 질병 또는 환자-특이적 질병과 연관되어 있는 것으로 공지된 일반적으로 발현되는 단백질이다. 암 항원을 DC 세포질로 직접 전달함으로써, 당업자는 MHC-I 항원 제시 경로를 활용할 수 있으며, 환자에서 강력한 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 유도할 수 있다. 이어, 이들 활성화된 T-세포들은 표적 항원을 발현하는 임의의 암세포들을 찾아서 파괴한다. 확립된 질병-특이적 항원 또는 환자의 종양으로부터 직접 유래한 항원을 이용하는데 있어서 플랫폼의 유연성은 상기 플랫폼이 기타 요법들에 대해 내성을 갖는 환자를 치료하는 것을 허용한다. 실제로, 이는 최소 부작용으로 맞춤형의 표적화된 질병 반응을 제공한다. 본 실시형태는 숙련된 기술자에 의해 전형적인 병원 실험실에서 수행될 수 있다(처리 당 1시간). 이의 크기가 작고 상대적인 단순하기 때문에 환자에 의해 작동되는 처리 시스템이 또한 사용될 수 있다.
암 백신 방법은 마우스 모델에서 증명되었다. 상기 시스템은 쥐 수지상 세포들에 대한 모델 항원인 난백 알부민의 성공적인 전달 및 가공을 위해 사용되었으며, 항원 제시의 증가에 의해 나타난 바와 같이 MHC 클래스 I 수용체 상의 SIINFEKL 펩타이드의 성공적인 전달 및 가공을 위해 사용되어 왔다. 이들 처리된 수지상 세포들은 시험관내(in vitro)에서 증식성 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 조장한다. 처리된 DC는 생체 내 CTL 반응을 생성하기 위해 동물 내로 재도입된다. 상기 장치는 인간 혈액으로부터 단리된 DC로 항원을 전달하는데 유용하다.
상기 데이터에 따르면, 상기 장치는 과도한 세포 사멸을 야기하지 않은 채 민감성 1차 세포들(DC를 포함함)로 재료를 전달할 수 있는 것으로 나타난다. 따라서 세포 손상은 심각한 사안은 아니다. 면역 반응은 처리된 세포들의 숫자를 증가시키고, 전달된 항원의 양 및 다양성을 증가시키고, 및/또는 지질 다당류와 같은 활성화 인자들을 공-전달함으로써 향상될 수 있다. 상기 장치로 처리된 세포들에서는 거의 독성이 관측되지 않았으며, 그 결과 상기 방법들을 실현 가능하게 하였을 뿐만 아니라 치료용 인간 및 수의학적 적용에 유리하게 하였다.
실시예 5: 혈액 암 처리
실시예 4에 개시된 바와 같이, 세포들의 신속한 기계적 변형은 수지상 세포들(DC)로 항원을 전달하기 위한 강력한 수단을 제공하며, 따라서 세포성 요법들을 위한 플랫폼이 될 수 있다. 이러한 시스템은 세포들의 신속한 기계적 변형이 주변 배지로부터 재료의 확산성 전달을 가능케 하는 일시적인 막 포어들의 형성을 야기할 수 있다는 발견에 기반을 두고 있다. 앞서 토의된 기존의 요법들과는 달리, 이러한 방법은 주문 제작한 융합 단백질들, 항원 교차 제시, 바이러스성 벡터들, 나노입자들 또는 세포내 이입 기작들에 의존하지 않으며, 따라서 이는 치료비용을 줄이면서 생체 내 효율에서의 엄청난 향상을 제공한다. 근본적으로 상이한 이러한 접근법의 유연성 및 단순성으로 인해 수지상 세포의 활성화를 위한 광범위한 플랫폼이 가능하게 되며, 상기 수지상 세포의 활성화는 다양한 암 항원에 대한 CD8 반응을 유도할 수 있다. 상기 시스템은 몇몇 부가적인 암 유형(예를 들어, 흑색종, 췌장암, 등)뿐만 아니라, 면역 요법들에 대해 더욱 우호적인 B 세포 림프종과 같은 혈액 암을 표적화할 수 있으며, 질병을 방지하기 위해 필수적이고 맞춤형인 새로운 접근법을 제공한다.
암에 대한 세포성 요법은 환자의 면역 시스템을 활성화하고 상기 질병에 대한 지속성 항원-특정 CD8 T 세포 반응을 구동하기 위한 이의 능력으로 인해 매력적인 선택안이다. 전립선암에 대해 최근에 승인된 프로벤지(Provenge®)와 같은 이들 요법들은 화학 요법들 및 방사선 처리에 대비하여 최소 부작용을 갖는다. 그러나 세포성 요법들을 개발하는데 있어서 가장 큰 장벽 중 하나는 세포 세포질 내로 항원을 전달함으로써 적절한 항원 제시를 달성하는 것이었다. 통상적으로, CD8 효과기 반응의 활성화는 항원 제시 세포(예를 들어. 수지상 세포)로 들어가는 외래 단백질의 위치에 의해 CD4 반응과는 구별된다. 세포질에서 발견되는 단백질들은 CD8 반응을 유도하는 반면, 세포내 이입에 의해 포획된 세포외 단백질들은 CD4 반응을 유도한다. 항원 제시 세포들 내에서의 교차 제시 기작이 규명되지 않은 상태로 남아있기 때문에, 당업자라면 강력한 세포독성 효과기 CD8 반응을 이용하여 요법들을 증진시키기 위해 목적하는 항원을 세포 세포질로 직접 전달하는 신뢰 가능한 방법을 개발해야 한다. 수지상 세포들에 대한 강력하고 효과적인 세포질성 전달 방법은 다양한 암 유형에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 플랫폼으로서 사용된다.
도 8A 및 도 11에 도시된 HeLa 세포들에 대한 실험에 따르면, 상기 세포의 신속한 기계적 변형이 세포막에서 일시적인 상처/포어의 형성을 초래하는 것으로 나타났으며, 상기 일시적인 상처/포어의 형성은 주변 버퍼으로부터 세포 세포질 내로의 지료의 수동 확산을 가능케 하였다. 이전에는 보고되지 않은 이러한 현상은 처리 이후에 생존 가능하며 정상적으로 증식하는 세포들을 생성한다. 실험에 따르면, 보다 큰 분자들은 보다 작은 분자들보다 낮은 전달 비율을 나타내는 것으로 나타났으며, 그 결과 이는 확산성 기작임을 보여준다. 공초점 현미경법에 의해 측정된 바와 같이, 성공적인 siRNA 전달 및 확산성 사이토졸 염색은 또한 전달된 재료들이 사이토졸 내에 존재하고, 활성 상태/접근 가능한 상태로 존재한다는 것을 보여준다. 통상적으로, 항원 전달 방법들은 종종 세포주에서 가능성을 보여주지만, 1차 면역 세포들로 번역하지 못한다. 그러나 본원에서 개시된 전달 방법은 세포내 이입 경로 또는 외생성 재료들에 대한 세포성 반응과는 독립적이며, 이는 세포 유형들에 따라 유의하게 다를 수 있으며, 주로 막 이중층 특성에 의존한다. 그 결과, 이의 단순성 및 신규한 경로로 인해 이러한 기술은 세포주로부터 1차 면역 세포의 전달로의 이행에 더욱 우호적이며, 따라서 항원 제시에서의 중요한 향상을 제공한다.
항원의 MHC 클래스 I 제시, 및 수지상 세포의 성숙은 난백 알부민 단백질의 전달에 대한 반응에서 항체 염색으로 분석될 수 있다. OT-I 및 OT-II TCR 형질 전환 마우스로부터 수확한 T 세포들은 또한 난백 알부민 및/또는 SIINFEKL 항원의 로딩(loading)에 대한 반응에서 CD8 및 CD4 증식을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 상기 시스템은 세포내 이입 단독에 의해 프라이밍(priming)된 수지상 세포들과 비교해서 증가된 CD8 증식에 대해 최적화될 수 있다.
1차 쥐 수지상 세포들은 B6 마우스의 비장으로부터의 MACS CD11c+ 분리(밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotec), 독일)에 의해 정제된다. 13㎛ HeLa 세포의 막을 천공할 수 있는, 채널 너비가 6㎛인 협착부를 포함하는 장치가 사용될 수 있다. 이들 수지상 세포들의 보다 큰 크기로 인해, 미세제조 및 채널 너비가 3 내지 5㎛인 시험 장치들이 성능 검사를 위해 이용될 수 있다. 포토리소그래피 및 심도 반응성 이온 에칭에 대한 기존의 프로토콜들은 이들 장치의 효율적인 제조를 가능케 하기 위해 개질될 수 있다. 형광-표지된 덱스트란 분자들은 FACS에 의한 전달 효율을 평가하기 위해 모델 분자들로서 사용될 수 있다. 후속적으로, 난백 알부민 단백질은 상기 세포들로 전달될 수 있으며, 1차 세포에서 단백질 흡수를 확인하기 위해 웨스턴 블랏에 의해 검정될 수 있다.
신속한 변형 방법이 세포의 성숙을 유도한다는 것을 보여주기 위해 수지상 세포의 성숙은 CD80 및 CD86 항체 염색에 의해 검토될 수 있다. 지질 다당류(LPS)와 같은 세포외 TLR 작용제들의 사용은 전달 이후에 DC 성숙을 수동으로 유도하기 위해 필요한 것으로 여겨지는 경우에 고려될 수 있다. 난백 알부민 단백질은 수지상 세포들로 전달될 수 있으며, 항원 제시는 MHC-T-SIINFEKL 항체에 의해 정량화될 수 있다. 부가적으로, TCR-특이적 펩타이드들의 전달 반응에서의 항원 제시 효율은 펩타이드에 대해 항원성 단백질들을 전달/제시하기 위한 시스템의 능력을 보여주기 위해 평가될 수 있다. 후속적으로, CD8 및 CD4 T 세포들은 TCR 형질 전환 OT-I 및 OT-II 마우스로부터 각각 수확하고, CFSE로 염색한 후, 5일 동안 난백 알부민-처리 수지상 세포들과 함께 공-배양될 수 있다. 상기 서브세트 둘 모두의 T 세포 증식은 FACS에 의해 측정될 수 있다. 장치 설계는 통상의 시험관내 방법들(예를 들어, 세포내 이입)과 비교해서 증가된 수준의 기능적 CD8 T 세포 개체군을 생성하기 위해 최적화될 수 있다.
항원-특이적 CD8 반응을 유도하는 다목적 능력은 비효율적인 항원 제시 또는 전달 방법의 부적절한 유연성으로 인해 현재까지 규명하기 어려운 것으로 입증되었던 암 세포성 요법들의 목표였다. 기존의 방법들은 해로운 전기장에 대한 이들의 의존성, 외생성 재료들의 사용, 단백질 서열 변형 및/또는 항원의 전달을 조장하기 위한 세포내 이입 경로를 포함한 다수의 단점을 갖는다. 그러나 본 발명의 청구 주제는 임의의 상술한 문제로 어려움을 겪지 않은 사이토졸성 전달에 대한 근본적으로 상이한 접근법을 제공한다. 게다가, 이의 천공-확산 기작의 특성으로 인해 이러한 방법이 항원 유형 전반에 걸쳐 광범위하게 적용 가능하며, 따라서 다양한 표적 암들을 제시할 수 있다. 동일한 기작은 더욱 강력한 T 세포 반응을 생성하기 위한 DC 성숙/활성화를 향상시키도록 부가적인 신호전달 분자들을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이 같이 광범위한 플랫폼은 암 백신 연구 하에서는 임의의 기존의 항원 전달/제시 기작에 비해 더욱 다목적이며 강력하다.
실시예 5는 광범위한 영향을 나타낼 수 있다. 미국 전역에서의 암으로 인한 광범위한 사회적 부담(2011년에 미국에서 570,000명의 사망이 추정됨)을 고려해 볼 때, 암은 유의한 비율의 개체군에 영향을 미칠 가능성이 있다. 영향을 받은 개체군은 질병을 방지하기 위한 환자의 면역 시스템의 능력을 이용하는 신규한 세포 요법들의 개발로부터 이익을 얻는다. 본 발명의 청구 주제는 골수 증식성 신생물 및 골수 형성 이상 증후군뿐만 아니라 혈액 암, 예를 들어 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종과 같은 다양한 암 유형에 대한 더욱 효율적이고 맞춤형인 치료 플랫폼이다. 또한 상기 방법들은, 예를 들어 혈액 순환을 통해 전달되는 이들의 성향으로 인해 전이성 암의 치료에 유용하다. 알려지지 않은 항원 에피토프(epitope)를 갖는 암은, 예를 들어 종양 생체검사 샘플을 분해하고 상기 용해물을 환자의 DC에 전달하고 인체 내로 DC를 재도입함으로써 치료될 수 있다. 이는 당업자가 광범위한 암 항원에 대한 숙주의 T 세포들을 활성화할 수 있게 하여, 효과적인 다중 표적 치료를 확실케 한다. 이러한 맞춤형 양태는 적대적인 환경에서의 노출로 인해 희귀한 형태의 암이 발병할 수 있는 사람, 종종 현재의 치료가 제대로 이루어지지 않은 사람에 대해 특별한 관심을 가질 수 있다. 개인의 질병에 대해 치료를 조정함으로써, 이러한 방법은 다중 약물-내성 암과 같이 심지어 가장 공격적인 사례에서 시기적절하고 효과적인 간병을 제공할 수 있다. 이러한 면역 기반 요법은 또한 CD8 T 세포들이 전이성 세포들을 용이하게 위치 추적하고 파괴할 수 있기 때문에 전이(암 관련 사망의 약 90%에 대해 책임이 있음)를 예방하는데 특히 효과적일 수 있는 반면, 이들 치료를 통해 제공된 면역학적 기억은 미래의 재발을 방지할 수 있다. 또한, 연구 도구로서 이러한 방법은 항원 교차 제시 공정을 더욱 잘 이해하고, 그 결과 기존/대안적인 면역 활성화 방법들의 효능을 향상시키기 위해 항원 가공에 대한 전례 없는 기계학적 연구를 가능케 할 수 있다.
실시예 6: 세포 리프로그래밍
줄기세포들은 재생 의학, 특히 빠르게 팽창하는 조직 공학 분야 내에서 현재의 연구에 중요한 역할을 한다. iPSC는 이들의 자가 재생 능력, 임의의 세포 유형으로 분화하려는 증명된 능력, 및 자가 조직 특징(환자-특이적 특징)으로 인해 특히 관심이 있다. 따라서 iPSC는 일반적인 전분화성 공급원으로부터 다중 계통 전구 세포들을 유도하는 가능성을 제공하며, 이때 상기 전분화성 공급원은 독특하면서 여전히 상호작용성인 조직 구획 내로 조합될 수 있다. 게다가, 이들 세포들은 결국 임상 적용에서 인간 배아 줄기세포들(hESC)에 대한 필요성을 배제할 수 있으며, 따라서 이들 세포 유형들에 재앙이었던 도덕적 및 윤리적 논쟁을 피할 수 있다. 더욱이, 환자 유래 iPSC는 hESC 유래 세포들의 면역 거부 문제점을 회피하거나 최소화한다. 따라서 현재의 연구는 주로 다수의 iPSC를 생산하기 위해 효율적이고 바이러스 부재 프로토콜을 고안하는데 초점이 맞춰져 있다.
iPSC는 원래 4개의 전사 인자들, 즉 Oct 3/4, Sox2, c-Myc 및 Klf4의 레트로바이러스성 과발현에 기초하여 성인 쥐 및 인간 섬유아세포(HF)를 전분화성 상태로 리프로그래밍함으로써 생성되었다. 이들 iPSC는 전체적 유전자 발현, DNA 메틸화 및 히스톤 변형에서 주로 ES 세포들과 동일할 뿐만 아니라, 3개의 배엽 모두를 나타내는 세포 유형들로 분화될 수 있다. iPSC 기술이 생물 의학적 연구 및 세포 기반 요법에 대한 엄청난 잠재성을 가질지라도, 이의 전체 잠재성을 구현하기 위해 주요 장애물이 극복되어야 한다. 예를 들어, 대부분의 iPSC 세포주는 리프로그래밍 인자 암호화 유전자의 레트로바이러스성 또는 렌티바이러스성 도입에 의해 다양한 체세포들로부터 유래하고, 이로 인해 바이러스성 벡터의 통합에 의해 다중 염색체의 붕괴를 초래하였으며, 이때 임의의 다중 염색체의 붕괴는 유전적 기능장애 및/또는 종양을 야기할 수 있다. 또한, 리프로그래밍 이식 유전자들(특히, c-Myc 및 Klf4)은 이의 잔류 발현 및/또는 재활성화가 종양 형성을 야기할 수 있다는 가능성을 증가시키는 발암(oncogenesis)과 밀접하게 연관되어 있다. 따라서 많은 실험실에서는 아데노바이러스, 에피솜성 벡터, mRNA, 및 마이크로 RNA와 같은 상이한 게놈 비통합성 접근법들을 탐구하였다. 특히, iPSC가 세포 침투성 펩타이드(CPP)에 융합된 4개의 리프로그래밍 인자들(Oct 3/4, Sox2, c-Myc 및 Klf4)의 직접적인 전달에 의해 생성될 수 있는 것으로 나타났다. 마우스 iPSC의 생성이 대장균(E. coli)에서 발현된 4개의 CPP-융합된 인자들의 전달에 의해 발생할 수 있는 것으로 기록되어 있지만, 인간 iPSC는 포유류 세포들에서 발현되는 4개의 CPP-융합된 인자들에 의해 생성될 수 있는 것으로 나타날 수 있다. 그러나 2가지 연구 모두에 따르면, 단백질 기반 리프로그래밍의 리프로그래밍 효율이 매우 낮은 것(0.01% 미만)으로 기록되어 있다. 단백질 기반 리프로그래밍이 임의의 유형의 유전적 재료(DNA 또는 RNA) 및 벡터 비히클(바이러스 또는 플라스미드)을 포함하고 있지 않기 때문에 단백질들의 직접적인 전달은 가장 안전한 리프로그래밍 과정들 중 하나를 제공한다. 단백질 기반 인간 iPSC는 바이러스성 게놈 통합과 연관된 비정상적인 특성 없이 기능성 도파민 뉴런을 효율적으로 생성하는 것으로 나타났다. 단백질 기반 리프로그래밍의 효율은 전달 플랫폼 기술을 이용하는 본 발명의 청구 주제에 의해 향상될 수 있기 때문에 임상적으로 생존 가능한 iPS 세포들을 생성할 가능성이 넓게 열려 있다. 게다가, 이러한 접근법은 mRNA에서의 번역 및/또는 전사, 및 플라스미드 및 바이러스성 리프로그래밍을 통제하는 확률론적 공정들을 회피함으로써 세포 기능에 대한 더욱 양호한 수준의 제어를 가능케 한다. 따라서 직접적인 단백질 전달은 돌연변이성 삽입의 위험성을 회피하고 고도로 민감성인 리프로그래밍 공정의 더욱 정확한 제어를 가능케 함으로써 2가지의 근본적인 이점을 제공한다. 본원에 개시된 전달 기술은 HF 및 줄기세포들로 단백질들을 높은 효율로 전달하는 이의 능력을 증명하였다. 기존의 세포 침투용 펩타이드 방법론과 이러한 기법의 전달 능력을 비교하는 실험에 따르면, 이러한 접근법을 이용한 전달에서 유의한 증가(시뮬레이션에 기초하여 잠재적으로 100배 이상)가 나타났다. 게다가, 이의 물리적 천공 기작은 화학적 변형에 대한 필요성, 또는 대안적인 단백질 전달 방법들과 연관이 있는 외생성 화합물들의 사용을 없앤다. 소형 분자들, siRNA 및 기타 인자들은 또한 상기 방법이 전달되는 재료의 유형에 대해 불가지론(agnosticism)적이므로 리프로그래밍 도중에 함께 전달될 수 있다. 따라서 이러한 시스템은 직접적인 단백질 전달을 통해 세포 리프로그래밍을 유도하기 위한 독특한 도구를 제공한다. 이러한 단순한 작용 기작(즉, 포어을 통한 확산)은 또한 당업자가 잠재적으로는 전달량을 매우 정확하게 예측하고 제어할 수 있도록 하며, 따라서 리프로그래밍 동역학에 대한 이해를 향상시키기 위해 최적화 연구를 조장하며, 그 결과 효율이 엄청나게 증가된다. 최종적으로, 당업자는 임상적 조직 공학 및 세포 요법 적용을 위한 iPSC를 생성하기 위해 이러한 미세유체 기법을 의료 장치로서 이용할 수 있다.
게다가, 이러한 시스템의 적용은 단백질 전달에만 제한되지 않는다. 이러한 기법은 다양한 거대분자들(DNA, RNA, 단백질들, 당류, 및 펩타이드)을 거의 모든 세포 유형에 전달할 수 있는 보편적인 전달 방법에 포함할 수 있다. 이는 현재 기술에 대해 서비스가 부족한 다수의 적용을 가능케 한다. 예를 들어, 현재의 리포솜성 방법, 나노입자 및 전기천공법 기반 방법들은 종종 특정 1차 세포들(예를 들어, 면역 세포들 또는 줄기세포들)을 형질 감염시키려고 노력하고 있으며, 단백질 및 나노입자들(예를 들어, 퀀텀 닷)을 전달하는데 비효과적일 수 있다. 치료용 스크리닝 및 질병 기작의 적용을 위한 펩타이드 전달은 또한 이러한 신규한 방법에 의해 도입될 수 있는 반면, 동시대의 관행은 종종 화학적 변형 또는 캡슐화를 요구한다. 당업자는 또한 세포기관 표지 및 기작론적 질병 연구를 위한 개질된 퀀텀 닷을 전달하기 위해 이러한 나노입자 기반 감지 적용을 위한 방법을 이용할 수 있다.
세포내 전달은 유전자 발현의 근본적인 연구에서부터 질병 기작 및 이러한 적용에 도입된 바와 같은 iPSC의 생성에 이르는 많은 생물학적 연구 적용의 초석이다. 리포좀, 폴리머성 나노입자들 및 전기천공법과 같은 확립된 전달 방법들은 종종 전달 비히클(또는 전기천공법의 경우에 자기장)로서 외생성 화합물들의 사용을 포함하며, 재료- 및/또는 세포-특이적이다. 예를 들어, 리포펙타민(인비트로젠)은 DNA 및 RNA 분자들을 (세포주 또는 1차 세포들의 서브세트로) 전달할 수 있지만, 단백질들 또는 기타 거대분자들을 전달하기 위해 적절한 복합체를 형성할 수 없다. 반면, 전기천공법은, 다양한 세포 유형들을 표적화하려는 이의 능력이 유망할지라도 높은 자기장으로 인해 세포를 손상시키고, 단백질 전달에서 성공도 제한적이다. 이는, 예를 들어 iPSC 생성에서 요구되는 다중 형질 감염으로 인해 특히 부적합하게 된다. 막 침투형 펩타이드들은 주로 단백질들에 대해 특이적인 또 다른 전달 기법이다. 그러나 이들 펩타이드 기반 방법들은 단백질 기능성에 대한 예측할 수 없는 효과를 가지며, 엔도솜에서 유의한 단백질 분해를 겪는다. 그 결과 최소의 세포 사멸로 다양한 거대분자들(DNA, RNA, 단백질들, 펩타이드, 소형 분자들)을 전달할 수 있는 보편적인 방법을 개시하고 있는 본 발명의 청구 주제는 단일 기술 플랫폼에서 세포 기능에 대해 전례 없는 제어를 가능케 하고, 그 결과 질병 기작의 연구, 거대분자 치료 조건의 확인, 줄기세포들의 유도 분화 또는 리프로그래밍, 및 리포터 세포주를 이용한 진단 기법들의 개발을 가능케 한다.
본원에 개시된 미세유체 장치는 광범위하고 보편적인 전달 플랫폼으로서 작용할 수 있다. 미세유체 장치로서, 이는 단일 세포 수준으로 처리 조건에 대한 정확한 제어 이점을 향유한다. 단일 세포 수준의 제어와 대규모 처리량의 독특한 조합은 이러한 장치를 기존의 전달 방법들에 대비하여 독특한 위치에 놓이게 한다. 데이터에 따르면, 현재까지 암 세포주, 배아 줄기세포들, 1차 섬유아세포 및 1차 림프구를 포함한 11개 이상의 상이한 세포 유형들로 재료를 전달하는 시스템의 능력이 증명되었다. 이의 기계적 천공 기작은 또한 탄소 나노튜브 및 퀀텀 닷과 같은 이전에는 도전적이던 재료 전달을 가능케 하였다.
iPSC를 생성하기 위해 재조합 단백질들을 이용한 이전의 작업에서 엄청나게 낮은 효율(0.01% 미만)이 증명되었으며, 그 결과 광범위한 임상적 적용에는 부적합하였다. 그러나 본원에 개시된 장치, 시스템 및 방법들은 높은 효율 및 최소 세포 사멸로 단백질들을 세포질로 직접 전달하는 이들의 능력을 증명하였으며, 따라서 더욱 효과적인 전달을 통해 리프로그래밍 효율에서의 실질적인 증가를 야기하기 위한 유망한 기회를 제공한다. 이용 가능한 단백질의 양을 직접 결정함으로써, 당업자는 세포내 동역학에 대한 정확한 제어를 발휘할 수 있다. 반면, 기타 리프로그래밍 방법들(예를 들어, 바이러스성, 플라스미드 및 mRNA 발현)은 단백질의 이용 가능성 수준을 결정하기 위해 확률론적 효과에 의존하며, 따라서 동역학 연구에는 적합하지 않다. 현재의 리프로그래밍 방법론의 낮은 효율은, 상기 공정이 확률론적 변이에 매우 민감하며, 좁은 범위의 전사 인자 발현 수준만이 리프로그래밍을 초래할 것이라는 것을 보여준다. 세포질로 단백질들을 직접 전달함으로써, 당업자는 단백질의 이용 가능성에 대한 전례 없는 제어를 발휘할 수 있으며, 따라서 리프로그래밍에 필요한 정확한 조건을 더욱 일관되게 도입할 수 있다. 일단 이들 조건들이 확인되고 최적화되면, 처리를 겪은 모든 세포에 대해 정확하게 재생될 수 있으며, 따라서 리프로그래밍 효율을 극적으로 향상시킬 수 있다.
이러한 기법은 다양한 세포내 전달 적용을 가능케 하며, 상기 전달 적용보다 나은 결과는 낸다. 또한 상기 기법의 엄격한 기계적 특성은 화학 작용제 또는 자기장의 사용에서 기인한 임의의 잠재적인 조합을 배제한다. 데이터에 따르면, 처리의 결과로서 세포 거동에서 임의의 실질적인 변화는 나타나지 않았다. 따라서 이러한 시스템은 리프로그래밍 적용에서 특정 유용성을 갖는 강력하고 고처리량 및 고효율의 보편적인 세포내 전달 기작이다.
증거에 따르면, 세포가 협착부를 통과함에 따라 발생하는 신속한 변형이 세포성 막에서 일시적인 포어의 형성을 유도하며, 이는 주변 버퍼으로부터 사이토졸 내로의 거대분자들의 확산을 가능케 하는 것으로 나타난다. 이러한 기법은 암 세포주, 1차 섬유아세포, 1차 림프구 및 배아 줄기세포들을 포함한 11개의 상이한 세포 유형들(분화를 야기하지 않음)에서 증명되었다. 하나의 원형은 초당 약 20,000 세포들을 처리할 수 있고, 세포 농도 범위(104 내지 108 세포들/㎖)에서 작동할 수 있다. 막힘과 관련된 사안들은, 또한 각각의 장치가 세정되거나 재생되는 선택안과 함께 막힘 이전에 약 1백만 개의 세포들을 처리할 수 있도록 실험 프로토콜 및 칩 설계를 개선함으로써 주로 완화되었다. 또한 다중 채널 설계는 하나의 채널의 막힘이 기타 채널의 성능에 영향을 미치지 않도록 유의한 중복성(redundancy)을 제공한다. 압력-구동된 유동(제어된 일정한 압력에서의 유동) 및 채널의 병렬 설계는 상기 칩 내의 막힌 채널들의 비율과는 무관하게 채널 당 일정한 유동 프로파일을 확보한다.
인간 섬유아세포 및 배아 줄기세포들로 덱스트란 분자들을 전달하는 상기 장치의 능력이 증명되어 있다. 도 35는 세포 리프로그래밍의 잠재적인 이점을 예시하고 있다. 3500에서는 3kDa 덱스트란을 전달하기 위해 10㎛-6㎛ 장치로 처리된 인간 배아 줄기세포들의 전달 효율 및 생존율이 도시되어 있다. 3510에는 10㎛-6㎛ 장치 대비 세포 침투용 펩타이드에 의한 NuFF 세포들로의 c-Myc, Klf-4, Oct-4 및 Sox-2의 전달에 대한 웨스턴 블랏 분석이 도시되어 있다. 용해물(Ly) 칼럼은 세척되고 용해된 세포들의 단백질 함량에 상응하는 반면, 수프 칼럼은 배지 환경의 단백질 함량에 상응한다. 3520에는 리프로그래밍 인자들의 전달 이후에 고정된 NuFF 세포들의 공초점 현미경법 이미지들이 도시되어 있다. 상기 단백질들은 알렉사 488-접합된 항-FLAG 항체를 이용하여 태깅되며, 핵은 DAPI에 의해 염색된다.
게다가, 상기 장치의 전달 효율은 단백질 기반 리프로그래밍용으로 현재 사용되는 9-아르기닌(CPP) 방법의 전달 효율과 비교하였다. 상기 결과(3510)에 따르면, 웨스턴 블랏에 의해 측정된 바와 같이 전달된 c-Myc, Klf4, Oct4 및 Sox2의 양의 유의한 증가가 증명되었다. 이어, 공초점 현미경법에 따르면, 세포핵으로 이들 전사 인자들의 성공적인 편재화가 확인되었다(3520). 단순한 2D 확산 모델은 세포 세포질 내부 및 외부에서 입자 확산성에 대한 문헌치에 기반을 둔 전달 기작을 시뮬레이션하기 위해 COMSOL에서 개발되었다. 이러한 모델을 상기 실험 데이터에 적용함으로써, 상기 기법은 버퍼 중에 존재하는 전달 재료의 10 내지 40%를 세포 사이토졸 내로 전달하는 것으로 추정될 수 있다. 비교해 보면, 단백질 전달을 위한 CPP 방법들은 오직 0.1%의 버퍼 재료를 사이토졸로 전달하는 것으로 추정된다. 따라서 이러한 접근법은 전달된 리프로그래밍 재료의 양에서의 상당한 증가(10 내지 100배)를 제공한다. 게다가, 이는 전달된 전사 인자들의 더욱 큰 생체 이용 가능성을 보장한다.
도 36은 융합된 리프로그래밍 단백질들의 직접적인 전달에 의한 마우스 및 인간 iPSC 세포주의 생성 및 특성화를 도시하고 있다. 3600에는 초기 마우스 간세포 배양(첫 번째 이미지); 6회 단백질 처리 이후의 형태(두 번째 이미지); 확립된 iPS 콜로니(세 번째 이미지); 및 확립된 iPS 콜로니의 AP 염색(네 번째 이미지)이 도시되어 있다. 3610에는 p-miPSC에서의 ESC 마커(Nanog, Oct4 및 SSEA1)의 면역 염색이 도시되어 있다. 핵은 DAPI(청색)로 염색되었다. 3620에서, Oct4 프로모터의 중아황산염 서열 분석은 p-miPSC-1 및 p-miPSC-2 세포주에서 거의 완전한 후생적 리프로그래밍을 보여준다. 열린 원 및 닫힌 원은 메틸화되지 않은 CpG 및 메틸화된 CpG를 각각 나타낸다. 3630에서, 생체 내 분화 잠재성은 면역 결핍 마우스 내로 p-miPSC를 주입하고 기형종을 H&E로 염색함으로써 분석하였다. 얻어진 기형종은 3개의 배엽, 즉 외배엽 (신경관 또는 표피), 중비엽 (연골 또는 근육), 및 내배엽 (호흡 상피세포 또는 장 유사성 상피세포) 계통 세포들을 나타내는 조직을 포함하고 있었다. 3640에서, E13.5 태아에서 p-miPSC-1(좌측 패널) 및 p-miPSC-2(우측 패널)로부터 유래한 키메라(chimera)는 주입된 p-miPSC로부터의 높은 수준의 GFP를 보여준다. 3650 내지 3670에서, 인간 iPSC 세포주인 p-hiPSC-01(3660) 및 p-hiPSC-02(3670)는 생검된 성인 인간 섬유아세포로부터 4개의 CPP-융합된 리프로그래밍 인자들의 직접적인 전달에 의해 생성된다(3650).
도 37은 예비 단백질 리프로그래밍 결과를 도시하고 있다. 3700에는 섬유아세포로부터 콜로니로의 형태학적 변화의 진행이 도시되어 있다. 흰색 화살표는 잠재적인 리프로그래밍된 세포들을 나타낸다. 적색 화살표는 콜로니를 형성하는 유착형 iPSC를 향해 표시되어 있다. 3710 내지 3760에서, iPSC 콜로니 중의 인간 배아 줄기세포 마커인 Oct4, SSEA-4, Tra-60, Tra-80 및 알칼리 포스파타아제(AP)의 발현이 도시되어 있다. 적절한 경우, 작은 박스는 DAPI 대비 착색제를 나타내다. 기준자는 100㎛이다.
단백질 기반 인간 iPSC가 생성되고 특성화되었기 때문에, 후생적 분석, 생체 내 전분화능 및 키메라 형성을 포함한 모든 기준에 의해 검토된 바와 같이 CPP-융합된 리프로그래밍 인자들의 이전 전달 방법에 의해 더욱 완전히 리프로그래밍된 마우스 및 인간 iPSC가 생성되었다(도 36). 그러나 부분적으로 정제된 단백질들의 사용에도 불구하고, 상기 리프로그래밍 효율은 여전히 낮았으며(0.1% 미만), 바이러스성 리프로그래밍 방법들보다 긴 시간이 들었다. 따라서 80㎍/㎖의 버퍼 농도에서 4개의 리프로그래밍 단백질들인 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 인간 섬유아세포로 전달하기 위해 상기 장치를 이용하려고 시도하였다. 세포들은 각각의 전달 사이에 48시간 간격으로 4회 처리하였다. 배양 14 내지 20일 이후에 첫 번째 리프로그래밍된 hiPSC 유사 콜로니가 나타났다. 이 시간 동안에는 세포가 iPSC 콜로니를 형성하고 이들이 몇몇 hESC 마커를 발현함에 따라 섬유아세포 형태에서의 변천이 관측되었다(도 37).
클라트린(clathrin), 포낭(caveolae) 및 거대 음세포 작용(macropinocytosis)이 세포내 이입 내부화(endocytotic internalization)를 위한 3개의 가장 일반적으로 제안된 기작이다. 세포내 이입이 신속한 세포 변형 이후에 거대분자의 전달과 연관이 있는지를 검토하기 위해, 이들 기작을 차단하는 공지된 화학 약품을 이용하는 것이 가능하다. 구체적으로는, 클로로프로마진(chlorpromazine)은 클라트린 매개 세포내 이입을 억제하기 위해 사용될 수 있고; 제니스테인(genistein)은 포낭 매개 세포내 이입을 억제하기 위해 사용될 수 있으며; 5-(N-에틸-N-이소프로필) 아밀로라이드(EIPA)는 거대 음세포 작용을 억제하기 위해 사용될 수 있다(모두는 시그마 알드리히로부터 구매할 수 있음). HeLa 세포들은 처리 이전에 2시간 동안 클로로프로마진(10㎍/㎖), 제니스테인(200μΜ) 및 EIPA(25μΜ)와 함께 인큐베이션될 수 있다. 이어, 덱스트란, dsRED 및 dsRED-9R 단백질들은 처리된 세포들의 신속한 변형에 의해 전달될 수 있다. FACS에 의해 측정된 바와 같이, 개개의 전달 효율은 CPP 및 장치 기반 전달 기작 둘 모두에 대한 세포내 이입 억제의 영향을 예시할 수 있다. 공초점 현미경법을 이용한 엔도솜 마커(인비트로젠)에 의한 공-편재화 실험은 또한 엔도솜 내로 격리되는 재료의 비율(%)을 결정하는데 도움을 줄 수 있다.
세포내 이입 기작을 완화시키기 위해 신속한 세포 변형 시스템을 전기천공법과 같은 기타 확립된 전달 방법들과 결합하는 것이 가능하다. 협착부 주변에 전극을 혼입하면, 변형과 전기천공법이 결합되어 전달 효과를 이용하여 개별 방법에 대비하여 증강된 시스템 성능을 구현하도록 할 수 있다. 또한 클로로퀸(chloroquine; 시그마), 다양한 폴리머 또는 엔도솜 탈출 펩타이드와 같은 화학 작용제의 공-전달은 신속한 세포 변형 시스템에서 전달된 재료들의 엔도솜 탈출을 지원하기 위해 사용될 수 있다.
세포가 협착부를 통과함에 따라, 이는 짧지만(약 10 내지 100us) 신속한 전단 및 압축을 경험한다. 앞서, 접선 전단은 포어 형성을 유도하기 위해 나타냈다. 그러나 상기 시스템은 또한 기계적 압축을 유도한다. 이들 매개변수들을 평가하기 위해서, HeLa 및 HF 세포들은 액틴 세포 골격을 붕해하도록 전달 이전에 1시간 동안 0.1㎍/㎖의 란트런큘린(Lantrunculin) A(인비트로젠)에서 인큐베이션할 수 있다. 이어, 형광-표지된 덱스트란(인비트로젠)은 신속한 변형 장치를 이용하여 처리된 세포 개체군에 전달될 수 있다. 이들 실험들은 또한 미소관 네트워크를 붕해하기 위해 전달 이전에 2시간 동안 10μΜ 콜히친(colchicine; 시그마)에서 인큐베이션하였던 세포들을 이용하여 반복 수행될 수 있다. FACS 분석은 미처리 대조군에 대비하여 독소-처리된 세포들의 전달 효율을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 포어 형성은 주어진 기하학 구조에 대한 반응에서 세포의 변형율과 연관성이 있는 것으로 여겨진다. 변형에 저항하는 세포 골격의 역할은 변형율의 정량적 측정을 제공하기 위해 세포 변형성을 탐침하는 장치를 이용하여 이전에 조사되었다. 이러한 방법에서, 협착부의 일측에 전극들이 놓이고, 2개의 전극 사이에서의 정전 용량에서의 변화는 세포가 협착부를 통과함에 따라 측정된다. 이어, 협착부를 가로지르는 정전 용량에서의 변화는 세포 체류 시간, 즉 이의 변형율과 연관성이 있다. 상술한 실험에서 장치의 전달 성능은 변형율과 천공 효율 사이의 정량적 상관관계를 생성하기 위해 이들의 이전 변형과 연관성이 있을 수 있다.
초음파 천공(sonoporation)을 특성화한 공개된 연구와 유사하게, 주사 전자 현미경(SEM) 및 투과 전자 현미경(TEM) 기법들은 시간이 지남에 따라 제안된 포어의 크기 및 분포를 직접 측정하기 위해 처리 이후에 소정의 시간 간격으로 고정된 샘플에 이용될 수 있다. 세포 고정은 25% 글루테르알데하이드 용액(시그마)을 이용하여 실온에서 수행될 수 있다. 이어, 세포 샘플들은 이미징 이전에 연속적인 에탄올에 의한 세정을 통해 탈수될 수 있다. 환경 SEM(ESEM) 기법들은 고정된 샘플들을 직접 이미징하기 위해 사용될 수 있다. 그러나 이의 상대적으로 낮은 해상도(약 200㎚)로 인해 이러한 기법은 1 내지 0.5㎛ 축척의 형태학적 변경 또는 상처를 검출하기에 적합하다. ESEM이 임의의 형태학적 변경을 검출하지 못하는 경우, 상기 세포들은, SEM을 이용하여 더욱 미세한 포어 구조를 직접 관측하기 위해 필요한 나노미터 축척까지 해상도를 증강시키도록 진공 증발기를 이용하여 1 내지 10㎚ 두께의 금 층으로 코팅될 수 있다. 또한 TEM은 SEM이 목적하는 결과를 생성하지 못하는 경우에 대안적인 이미징 기법으로서 사용될 수 있다. 이들 기법들은 당업자가 국부적인 상처와 균일한 천공 전달 기작 사이를 구별할 수 있게 하며, 평균 포어 크기 및 분포를 측정할 수 있게 한다. 신속한 세포 변형을 겪은 세포들에서 포어 크기 및 분포는 미처리 세포들과 비교할 수 있다. 막 표면 상의 국부적인 포어 분포는 상처 모델을 나타내는 반면, 더욱 균일한 분포는 균일한 천공 모델을 지지한다.
COMSOL 멀티피직스 소프트웨어는 천공된 세포의 3D 모델을 구성하기 위해 사용될 수 있다. 기작론적 연구로부터 적절한 포어 모델과 조합된, 세포질 및 버퍼 확산성에 대한 공개된 데이터를 이용함으로써, 전달의 예측 모델을 생성하는 것이 가능하다. 상기 모델은 낮은 확산성 세포질을 높은 확산성 버퍼 영역으로부터 분리하는 다공성 막을 모방한다. 상기 모델의 가정 하에, 상기 포어은 즉각적인 재밀봉 이전에 고정된 시간의 양 동안에 고정된 크기를 갖는다. 형태 및 직경의 변경과 같은 동력학적 포어 거동은 MatLab 또는 기타 소프트웨어와의 결합을 통해 복잡한 모델 내로 혼입될 수 있다. 시뮬레이션된 전달량의 예측은 FACS 및 겔 전기영동(예를 들어, 웨스턴 블랏)에 기반을 둔 실험 데이터를 이용하여 검증될 수 있다. 이들 비교는 상기 모델을 미세 조정하기 위해 사용될 수 있으며, 그 결과 전달된 재료의 양을 예측할 수 있게 한다. 이러한 모델의 예측 성능은 포어 크기, 포어 개방 시간 및 버퍼 농도를 변경하는 효과를 시뮬레이션할 수 있으며,그 결과 추후 연구에 대한 길잡이로서 사용될 수 있다.
다중 물리현상 시뮬레이션(예를 들어, COMSOL 또는 CFD-ACE)은 또한 상기 상지 전체에 대한 유체 유동을 모델링하기 위해 사용될 수 있다. 이들 모델들은 유입구, 유출구 및 협착부 영역에서의 유속 및 전단 응력을 더욱 정확하게 예측하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 데이터는 협착부 설계 전반에서의 전달 효율에 대해 전단 응력과 유속 사이의 연결고리를 설명하기 위해 사용될 수 있다. 게다가, 상기 장치의 광범위한 모델을 구축함으로써, 상이한 채널들 사이의 압력 강하의 일관성을 연구하는 것이 가능하며, 세포 개체군 전반에 걸친 처리 균일성을 향상하기 위해서 거의 동일한 조건 하에서 모든 채널이 작동하는 것을 확인하기 위해 유입구 및 유출구 설계를 조절하는 것이 가능하다.
상기 전달 현상은 주로 전달 효율 및 세포 생존율을 증가시키기 위해 최적화될 수 있다. 개체군 균일성(즉, 동일한 양의 재료를 각각의 세포로 전달함)은 2차 최적화 매개변수로서 사용될 수 있다. 초기 결과에는 민감성 매개변수로서 확인된 세포 속도, 협착부 길이, 협착부 너비 및 진입부 영역의 형태가 있다. 반면, 배지 조성물은 주요 인자인 것으로 여겨지지 않는다. 전체적으로 협착부 길이 및 너비가 5 내지 50㎛ 및 4 내지 8㎛ 사이에서 변하는 일련의 장치를 구성하는 것이 가능하다. 상기 협착부를 형성하기 위해 주요 채널이 좁아짐에 따른 상이한 테이퍼 각도(taper angle)가 가능하다. FACS에 의해 측정된 바와 같이, 이들 장치들로부터의 실험 효율 및 생존율 데이터는 전단 응력의 효과 및 협착부 치수를 더욱 잘 이해하기 위해 상술한 모델링 데이터와 연관성이 있을 수 있다. 이러한 공정은 상기 처리에 대해 상이하게 반응하는 상이한 세포주에 대해 반복할 수 있다. 이러한 데이터는 특정 세포 유형들(또는 이의 특정 서브세트)에 대해 최적화된 기화학 구조 및 작동 매개변수들을 구비한 장치를 개발하기 위해 사용될 수 있다.
도 38은 대안적인 장치 구조를 예시한 현미경사진을 도시하고 있다. 협착부와 전극을 조합하는 예비 작업의 명시야 현미경사진이 도시되어 있다(기준자는 30㎛임). 도 38에 도시된 바와 같이, 상기 장치는 전기천공법과 신속한 변형 현상을 결합함으로써 변형될 수 있다. 금 전극은 상기 채널 내로 국부화된 전기장을 도입하기 위해 포토리소그래프 패터닝 및 Au 증착에 의해 협착부의 일측 상에 혼입될 수 있다. 후속적인 실험에서는 현재의 방법들에 대해 향상된 성능을 증명하는 작동 매개변수 값들(전기장 강도, 빈도, 및 작동 속도)이 확인될 수 있다. 2개의 독립적인 천공 기작을 결합함으로써, 당업자는 각각의 세포 유형에 대한 시스템 성능을 최적화하기 위해 상기 시스템에 대한 더욱 미세한 제어를 발휘하고 다중 매개변수들을 조작할 수 있다. 부가적으로, 전기장은 낮은 확산율을 겪고 있는 DNA와 같은 보다 큰 하전된 분자들을 전달하기 위한 구동력으로서 사용될 수 있다.
잠재적인 공동 연구원이 사용하기에 적합한 시스템의 최신형 1회용 버전(version)이 가능하다. PMMA 및 폴리카보네이트의 사출 성형 또는 고온 엠보싱(hot embossing)은 상기 장치의 폴리머 기반 버전을 실행하기 위해 사용될 수 있다. 후속적인 비용 감소는 이들 이들 장치가 1회용 도구로서 사용될 수 있도록 할 수 있으며, 그 결과 멸균성 및 사용 용이성을 향상시킨다. 또한 배관 연결, 장착 시스템 및 압력 조절기 구성을 단순화함으로써, 사용자 친화적인 시스템을 공급하는 것이 실현 가능하다.
iPS 세포들 내로의 섬유아세포의 단백질 기반 리프로그래밍, 및 리프로그래밍 매개변수 공간에 대한 최적화 연구가 가능하다. 이전 연구에 따르면, 인간 및 마우스 조직 둘 모두로부터 CPP-융합된 리프로그래밍 인자들의 직접적인 전달에 의해 iPSC가 생성될 수 있는 것으로 나타났으며(도 36), 이들 단백질-iPSC가 바이러스성 iPSC와 연관된 비정상적인 표현형 없이 기능성 세포들(예를 들어, 도파민 뉴런)로 분화할 수 있는 것으로 나타났다. 그러나 배양액에서의 단백질 분해, 전달 비효율성 및 세포들의 엔도솜 내부에서의 분해를 포함한 다수의 인자들로 인해, 직접적인 단백질 전달에 의한 리프로그래밍 효율은 임의의 실질적 사용을 위해서는 너무나 낮다(0.01% 미만). 본원에 개시된 미세유체 장치들은 세포질로 직접 효율적인 단백질의 전달을 허용함으로써 단백질 기반 리프로그래밍의 효율을 유의하게 증가시킬 수 있으며, 따라서 유리 단백질 또는 캡슐화된 단백질의 전달 방법들에서 일상적으로 접하는 가혹한 엔도솜 환경 및 난해한 엔도솜 탈출 공정을 피할 수 있다.
인간 iPSC의 생성은 미세유체 기반 전달에 의해 조장된다. 상기 장치는 하나 이상, 예를 들어 4개의 리프로그래밍 단백질들(c-Myc(단백질: 유전자은행 등록 번호: NP_002458.2; 및 DNA: 유전자은행 등록 번호: NM_002467.4), Klf4(단백질: 유전자은행 등록 번호: AAH30811.1; 및 DNA: 유전자은행 등록 번호: NM_004235.4), Oct4(단백질: 유전자은행 등록 번호: ADW77326.1; 및 DNA: 유전자은행 등록 번호: HQ122675.1), 및 Sox2(단백질: 유전자은행 등록 번호: NP_003097.1; 및 DNA: 유전자은행 등록 번호: NM_003106.3);)을 배아 인간 섬유아세포(HF)로 전달하기 위해 사용된다. 4개의 야마나카(Yamanaka) 인자(MKOS는 c-Myc-Klf4-Oct4-Sox2임) 이외에, 몇몇 부가적인 인자들(예를 들어, Lin28(단백질: 유전자은행 등록 번호: AAH28566.1; 및 DNA: 유전자은행 등록 번호: NM_024674.4), Nanog(단백질: 유전자은행 등록 번호: AAP49529.1; 및 DNA: 유전자은행 등록 번호: NM_024865.2), Esrrb(단백질: 유전자은행 등록 번호: AAI31518.1; 및 DNA: 유전자은행 등록 번호: NM_004452.3), Glis1(단백질: 유전자은행 등록 번호: NP_671726.2; 및 DNA: 유전자은행 등록 번호: NM_147193.2), 및 PRDM14(단백질: 유전자은행 등록(Genbank Accession) 번호: NP_078780.1; 및 DNA: 유전자은행 등록 번호: NM_024504.3))은 리프로그래밍 효율을 증강시키기 위해 확인되었다. 6개의 인자들(MKOS + Lin28 및 Nanog; MKOSLN)의 포유류 발현 및 정제가 완전히 확립되어 있으며, 리포터 검정을 이용하여 각각의 인자의 생체 활성이 확립되었다. 이들 인자들은 대장균 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 대장균 발현 단백질들은 인산화, 아세틸화 및 유비퀴틴화와 같은 번역후 변형이 없기 때문에, 정제된 단백질들은 포유류 세포들(HEK293 및 CHO)에서의 발현 이후에 사용될 수 있다. 대장균 발현 단백질들(매사추세츠 캠브릿지 소재의 스템전트(Stemgent)로부터 상업적으로 이용 가능함)은 비교용으로 사용될 수 있다. 먼저, 형질 감염에 의해 HEK293 세포에서 발현된 FLAG-태깅된 리프로그래밍 인자들은 50mM 트리스-HCl, pH 7.4, 250mM NaCl, 5mM EDTA, 1% NP-40 및 프로테아제 억제제를 함유하는 NP40 세포 용해 버퍼에서 재현탁될 수 있다. 원심분리 후, 수집된 용해성 분획은 평형화된 항-FLAG M2 아가로즈 치환성 겔과 함께 첨가될 수 있다. PBS로 2회 세척 이후, 보유하고 있는 FLAG-태깅된 단백질들은 0.1㎎/㎖의 FLAG 펩타이드(시그마)를 첨가함으로써 용리될 수 있다. 인간 섬유아세포 및 4개 또는 6개 정제된 단백질들의 현탁된 용액은 상기 장치에 적용될 수 있으며, 처리된 세포들은 다음 전달 주기 이전에 1일, 2일 또는 3일 동안 제어된 hESC 배지를 함유한 0.1% 젤라틴-코팅된 플레이트 상에 도말될 수 있다. 상기 미세유체 장치를 이용하여 단백질 전달 주기(6 내지 16회)를 반복한 이후, 처리된 세포들은 마이토마이신(mitomycin) C-처리된 마우스의 배아 섬유아세포(MEF) 상에 도말하고, hESC 완전 배지를 이용하여 3 내지 4주 동안 성장하였다. IPSC 콜로니는 MEF 상에 접종한지 3주 이내에 육안으로 관측될 수 있다. iPSC 생성 효율은 본 발명의 초기 CPP-융합된 재조합 단백질들을 이용하여 단백질 전달에 의한 효율과 비교할 수 있다. 이들 iPSC 후보 물질들은, 앞서 개시한 바와 같이, 시험관내 및 생체 내 전분화능뿐만 아니라 분자 및 세포성 특성을 포함한 진성 iPSC의 모든 기준에 대해 철저히 검토될 수 있다. 4개 또는 6개의 인자들을 사용하면, 더욱 향상된 효율을 갖는 iPSC 세포주가 생성될 것이다. 또한 Esrrb, Glis1 및 PRDM14과 같은 부가적인 인자들을 추가로 발현하고 리프로그래밍 실험에서 이들 인자를 이용하는 것이 가능하다.
리프로그래밍 단백질들 및 mRNA 및/또는 마이크로 RNA는 함께 전달될 수 있다. 상기 미세유체 장치는 단백질들뿐만 아니라 임의의 기타 거대분자들을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 최적의 비-게놈성 통합 리프로그래밍을 위한 독특한 특성을 활용하기 위해, 리프로그래밍 인자들 및 mRNA 및/또는 마이크로 RNA의 사용을 조합하는 것이 가능하다. 특히, iPSC 세포주는 마이크로 RNA만을 이용하여 성공적으로 생성될 수 있다는 것이 가장 큰 관심사이다. 실제로, 마이크로 RNA의 리포펙타민 기반 형질 감염은 iPSC 유사 콜로니를 생성할 수 있다. 마이크로 RNA가 리프로그래밍 인자들과는 상이한 기작에서 리프로그래밍을 유도할 가능성이 있기 때문에 상기 미세유체 장치를 통한 리프로그래밍 단백질들 및 마이크로 RNA 둘 모두의 적절한 조합은 리프로그래밍 효율을 추가로 증강시킬 수 있다. 단백질들과 mRNA의 조합된 전달은 리프로그래밍 효율을 유의하게 조장할 수 있다. 따라서 단백질, mRNA 및/또는 마이크로 RNA의 최적의 조합 처리는 상기 미세유체 장치를 이용하여 전달될 수 있다. 마이크로 RNA/mRNA가 단백질로서 등가의 제어 수준을 제공할 수 없을지라도, 고처리량 최적화 연구에 있어서 상기 장치의 성능은 여전히 이전의 접근법에 대비해서 효율 측면에서 유의한 증가를 제공한다.
상기 미세유체 장치의 독특한 특징들은 제어되고 반복 가능한 방식으로 다양한 정량화된 양의 각각의 인자의 전달을 가능케 할 수 있다. 본 발명의 청구 주제의 최적화는 HF로의 단백질 전달을 위해 신뢰 가능하고 고효율의 도구의 개발을 조장한다. 각각의 리프로그래밍 인자의 최적의 전달 양 및 전달 빈도를 설명하는 것이 가능하다. mRNA, 플라스미드 또는 바이러스성 방법들과는 달리, 상기 시스템은 전사 인자들의 유효한 세포내 농도를 결정하기 위해 유전자 발현 및/또는 번역의 확률론적 특성에 의존하지 않는다. 따라서 단백질을 사이토졸로 직접 전달하는 장치의 능력으로 인해 상기 장치는 세포내 환경에 대한 정확한 제어를 발휘하도록 이를 독특한 위치에 놓이게 된다. 처리 빈도(매일, 2일 또는 3일 마다 1회), 및 4개의 인자들 각각의 단백질 농도를 독립적으로 변경하는 일련의 전달 스케줄이 가능하다. 특히, 보다 높은 수준의 Oct4가 효율적인 리프로그래밍을 위해 중요하다는 것을 보여주는 몇몇 보고서에 기초하여, 기타 인자들의 농도를 동일하게 유지하면서 상이한 농도의 Oct4를 이용하는 효과를 시험하는 것이 가능하다. c-Myc의 상이한 농도는 주어진 세포 유형에 대해 평가될 수 있는데, 이는 이의 높은 수준이 몇몇 상황에서는 iPSC 대신에 주로 형질 전환된 콜로니를 생성하는 것으로 밝혀져 있기 때문이다. 게다가, 이의 매우 짧은 반감기(약 30분)로 인해 적절한 농도로 c-Myc의 더욱 빈번한 처리 효과를 시험하는 것이 가능하다.
리프로그래밍 인자들의 일시적인 처리를 위한 최적화는 상술한 방법들을 이용하여 조장된다. 각각의 인자는 리프로그래밍 공정에서 기능적 역할을 하여, 상기 공정에 참여한다. 적어도 하나 및 몇몇 경우에 인자들의 조합은 목적하는 리프로그래밍 결과를 달성하기 위해 필요하다. 예를 들어, c-Myc는 분화 유전자의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있다. 또한 Klf4는 분화 경로 및 전분화능의 억제와 관련된 마이크로 RNA let-7을 억제하는 것으로 알려져 있다. 따라서 일시적으로 조절된 리프로그래밍은 차선의 조건에 기초하여 초기 기간 동안 c-Myc 및/또는 Klf4를 처리함으로써 가능할 수 있다. 또한 Nanog는 iPSC 생성을 위해 요구되지 않을지라도, 전분화능의 최종 확립 및 유지를 위해 결정적인 것으로 알려져 있다. 따라서 리프로그래밍 공정의 후기 단계에 Nanog의 첨가 효과가 시험될 수 있다. 게다가, 마이크로 RNA 및 단백질의 순차적인 처리가 시험될 수 있으며, 상기 리프로그래밍 효율을 각각의 처리 또는 동시 처리에 의한 리프로그래밍 효율과 비교하였다. 이러한 일시적으로 조절된 리프로그래밍은 미세유체 장치의 독특한 특징으로 인해 실현 가능하며, 단백질 리프로그래밍을 추가로 최적화하기 위해 중요할 수 있다. 리프로그래밍 효율은 28일째 날의 콜로니 숫자를 처리된 HF 세포들의 숫자로 나눔으로써 산정될 수 있다. 일단 완료가 되면, 회귀 분석은 iPSC을 생성하기 위해 각각의 리프로그래밍 인자의 상대적인 중요성, 이의 최적의 농도, 최적 전달 빈도/타이밍, 및 그 결과로서 최적 프로토콜을 추론하기 위해 사용될 수 있다. 각각의 세포로 전달된 단백질의 양 및 타이밍을 제어하는 능력은 리프로그래밍 공정에서 각각의 인자의 기능적 유의성을 설명할 수 있으며, 그 결과 세포 리프로그래밍 공정 및 전분화능 확립에 대한 이해를 추가로 향상시킬 수 있다. 또한 이러한 작업의 결과는 특정 리프로그래밍의 요구를 충족시키고 임상적으로 적용 가능한 버전의 결과적인 개발을 가능케 하도록 장치 설계를 추가로 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
상술한 바와 같이 최적화된 단백질 리프로그래밍 과정을 이용함으로써, 상기 프로토콜은 일반적으로 환자-특이적 성인 인간의 섬유아세포 세포들에 적용될 수 있다. ESC 및 iPSC의 기능성 도파민 뉴런으로의 효율적인 분화, 및 이식 효과에 대해 연구되어 있기 때문에, 파킨슨(Parkinson)병 환자들로부터 유래한 인간 섬유아세포의 iPSC 또는 iPSC 세포주를 생성하는 것이 가능하다. 일단 iPSC 세포주가 생성되고 특성화되면, 이들은 도파민 뉴런으로 분화하고 이들의 세포성, 분자적, 생리학적 및 전기 생리학적 특징을 특성화하기 위해 유도된다. 상기 도파민 뉴런들은 무수정체 생쥐인 유전적 PD 모델과 같은 파킨슨 질병의 동물 모델 내로 이식 이후에 생체 내 기능성에 대해 검사한다.
미세유체 기반 단백질 전달은 직접적인 세포 전환, 예를 들어 기능성 뉴런, 간세포 및 혈액 세포와 같은 기타 세포 유형들로의 섬유아세포의 직접적인 전환을 위해 사용될 수 있다. 과거에는, 상기 조작에서는 주요 전사 인자들의 바이러스성 발현이 이용되어, 유의한 염색체 붕괴 및 유전자 돌연변이를 야기하며, 그 결과 본원에서 개시된 방법들을 이용하여 직접적인 단백질 전달과 같은 비-바이러스성의 게놈 비-통합형 전환 방법들을 개발할 필요성을 증가시켰다. 따라서 상기 장치는 직접적인 세포 전환을 위한 미세유체 기반 단백질 전달용으로 사용될 수 있다. 특정 전사 인자들의 포유류에서의 발현이 종종 어렵기 때문에 하나 또는 2개의 단백질 인자들에 의한 전환을 시험하는 것이 더욱더 가능성이 있을 수 있다. 그러나 단일 인자, 예를 들어 Oct4 또는 Sox2를 이용하여 혈액 또는 신경 전구체를 각각 생성하도록 섬유아세포를 다른 세포 운명으로 전환하는 것이 가능하다. 이들 단백질들은 미세유체 기반 단백질 전달을 이용한 세포 전환을 위해 정제된 형태로 용이하게 이용 가능하다.
도 44는 상기 미세유체 장치 및 관련된 방법들을 이용하여 활성 siRNA 서열들 및 스크램블(scrambling) 대조군들로 처리한지 48시간 이후에 GFP 강도로 측정된 바와 같이 HESC에서 GFP 넉다운을 예시하고 있는 막대그래프이다. 도 45A 및 도 45B는 3kDa 청색 염료의 전달 이후에 염료 강도 및 인간 배아 줄기세포의 생존율을 예시하고 있는 2개의 플롯이다.
본 발명의 범주 및 진의 내에는 기타 실시형태들이 있다. 예를 들어, 소프트웨어의 특성으로 인해 상술한 기능들은 소프트웨어, 하드웨어, 펌웨어(firmware), 하드와이어링(hardwiring), 또는 이들 임의의 조합을 이용하여 실시될 수 있다. 기능들을 시행하는 특징들은 또한 다양한 위치에서 물리적으로 배열될 수 있으며, 이러한 위치에는 상이한 물리적 위치에서 기능의 일부가 시행되도록 분포되는 것이 포함된다.
하나 이상의 참고문헌은 본 명세서에 포함된다. 본 발명의 개시내용은 임의의 인용된 자료가 본 발명의 개시내용과 일치하지 않은 정도로 제한되어야 한다. 게다가 본원에서 참고로 인용된 자료가 특허청구범위의 유효성을 유지하기 위해 필요한 경우에 필요한 정도로 무시되어야 한다.
추가로, 상기 상세한 설명이 본 발명을 지칭하는 반면, 상기 상세한 설명은 하나 이상의 발명을 포함할 수 있다.

Claims (63)

  1. 버퍼에 현탁된 세포가 통과할 수 있게 하는 루멘(lumen)을 한정하는 미세유체 채널을 포함하되,
    상기 미세 유체 채널은 세포 변형 협착부(cell-deforming constriction)를 포함하고, 상기 협착부의 직경은 세포의 직경보다 작고, 상기 협착부의 직경은 페이로드(payload)가 지나가기에 충분한 크기로 세포의 변화를 유도하기 위해 선택되는 것을 특징으로 하는 페이로드(payload)를 세포로 전달하기 위한 미세유체 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 상기 협착부의 직경은 이를 통과하는 상기 세포 직경의 20-99%인 미세유체 시스템.
  3. 제2항에 있어서, 상기 협착부의 직경은 상기 세포 직경의 20-60% 미만인 미세유체 시스템.
  4. 제1항에 있어서, 상기 협착부의 직경은 또한 상기 변형의 결과로 세포가 죽을 것이라는 가능성을 감소시키기 위해 선택되는 미세유체 시스템.
  5. 제1항에 있어서, 상기 채널의 단면(cross-section)은 원형, 타원형, 길게 늘어진 슬릿(slit), 사각형, 육각형 및 삼각형으로 구성된 군으로부터 선택되는 미세유체 시스템.
  6. 제1항에 있어서, 상기 협착부는 입구부(entrance portion), 센터포인트(centerpoint) 및 출구부(exit portion )를 포함하는 미세유체 시스템.
  7. 제6항에 있어서, 상기 입구부는 협착 각도(constriction angle)로 한정하고, 상기 협착각은 상기 채널의 막힘을 감소시키도록 선택되는 미세유체 시스템.
  8. 제6항에 있어서, 상기 입구부는 90도의 협착 각도로 한정하는 미세유체 시스템.
  9. 제1항에 있어서, 직렬 및 병렬로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 배열된 복수 개의 미세유체 채널을 더 포함하는 미세유체 시스템.
  10. 제1항에 있어서, 상기 미세 유체 채널은 복수 개의 협착부를 포함하는 미세 유체 시스템.
  11. 제10항에 있어서, 상기 복수 개의 협착부는 직렬 및 병렬로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 배열되는 미세 유체 시스템.
  12. 제1항에 있어서, 세포 드라이버(cell driver)를 더 포함하는 미세유체 시스템.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세포 드라이버는 압력 펌프, 가스 실린더, 컴프레서, 진공 펌프, 시린지, 시린지 펌프, 연동 펌프, 매뉴얼 시린지, 파이펫, 피스톤 및 캐필러리 액터(capillary actor)로 구성된 군으로부터 선택되는 미세유체 시스템.
  14. 현탁 용액 내의 세포를 제공하고;
    세포-변형 협착부를 포함하는 미세유체 채널을 통해 상기 용액을 통과시키고; 상기 협착부의 직경은 상기 협착부를 통과할 때 압력(deforming force)이 세포에 가해짐으로써 페이로드(payload)가 지나가기에 충분한 크기로 세포의 변화가 일어나도록 상기 세포의 직경 보다 작으며; 그리고
    세포가 협착부를 통과한 이후에 미리 설정한 시간 동안 페이로드 포함 용액에서 세포를 인큐베이팅하는; 것을 포함하는 페이로드를 세포로 전달하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 현탁 용액은 상기 협착부를 통과하기 전, 도중 및 후; 혹은 통과하기 전, 도중 또는 후;에 상기 세포 및 상기 페이로드를 포함하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 현탁 용액은 협착부를 통과하기 전에 상기 세포 및 상기 페이로드를 포함하는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 현탁 용액은 협착부를 통과한 후에 상기 세포 및 상기 페이로드를 포함하는 방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 협착부의 직경은 상기 세포 직경의 20-99%인 방법.
  19. 제14항에 있어서, 상기 협착부의 직경은 상기 세포 직경의 20-60% 미만인 방법.
  20. 제14항에 있어서, 상기 채널의 단면(cross-section)은 원형, 타원형, 길게 늘어진 슬릿(slit), 사각형, 육각형 및 삼각형으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  21. 제14항에 있어서, 상기 용액을 통과시키는 것은, 상기 용액을 상기 협착부의 입구부, 센터포인트 및 출구부를 통해 통과하는 것을 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 입구부의 협착 각도를 조절하여 상기 미세 유체 채널이 막히는 것을 감소시키는 것을 더 포함하는 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 입구부의 협착 각도를 조절하여 전달과 세포 생존율을 향상시키는 것을 더 포함하는 방법.
  24. 제14항에 있어서, 상기 용액을 통과시키는 것은, 직렬 및 병렬로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 배열된 복수 개의 미세유체 채널을 통해 상기 용액을 통과하는 것을 포함하는 방법.
  25. 제14항에 있어서, 상기 미세 유체 채널은 복수 개의 협착부를 포함하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 복수 개의 협착부는 직렬 및 병렬로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 배열되는 방법.
  27. 제14항에 있어서, 상기 인큐베이팅은 상기 세포를 0.0001초 이상 인큐베이팅하는 것을 포함하는 방법.
  28. 제14항에 있어서, 상기 인큐베이팅은 상기 세포를 0.0001초에서 60분 동안 인큐베이팅하는 것을 포함하는 방법.
  29. 제14항에 있어서, 상기 세포 변형은 상기 세포를 1㎲에서 1ms 동안 변형시키는 것을 포함하는 방법.
  30. 제14항에 있어서, 상기 압력은 압축(compression) 또는 압축과 전단(shearing)을 포함하는 방법.
  31. 현탁 용액 내의 세포를 제공하고;
    세포-변형 협착부를 통해 세포를 통과시키고, 상기 협착부 직경은 상기 협착부를 통과할 때 압력(deforming force)이 세포에 가해짐으로써 페이로드(payload)가 지나가기에 충분한 크기로 세포의 변화가 일어나도록 상기 세포의 직경 보다 작으며; 그리고
    세포가 변형된 후에 페이로드 포함 용액에서 세포를 인큐베이팅하는; 것을 포함하는 페이로드를 세포로 전달하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 현탁 용액은 상기 협착부를 통과하기 전, 도중 및 후; 혹은 통과하기 전, 도중 또는 후;에 상기 세포 및 상기 페이로드를 포함하는 방법.
  33. 제31항에 있어서, 상기 현탁 용액은 협착부를 통과하기 전에 상기 세포 및 상기 페이로드를 포함하는 방법.
  34. 제31항에 있어서, 상기 현탁 용액은 협착부를 통과하기 후에 상기 세포 및 상기 페이로드를 포함하는 방법.
  35. 제31항에 있어서, 상기 협착부의 직경은 상기 세포 직경의 20-99%인 방법.
  36. 제31항에 있어서, 상기 협착부의 직경은 상기 세포 직경의 20-60% 미만인 방법.
  37. 제31항에 있어서, 상기 용액을 통과시키는 것은, 직렬 및 병렬로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 배열된 복수 개의 미세유체 채널을 통해 상기 용액이 통과하는 것을 포함하는 방법.
  38. 제31항에 있어서, 상기 인큐베이팅은 상기 세포를 0.0001초에서 60분 동안 인큐베이팅하는 것을 포함하는 방법.
  39. 제31항에 있어서, 상기 인큐베이팅은 상기 세포를 0.0001초 이상 인큐베이팅하는 것을 포함하는 방법.
  40. 제31항에 있어서, 상기 세포 변형은 상기 세포를 1㎲에서 1ms 동안 변형시키는 것을 포함하는 방법.
  41. 제31항에 있어서, 상기 압력은 압축(compression) 또는 압축과 전단(shearing)을 포함하는 방법.
  42. 세포-변형 협착부를 포함하는 장치를 포함하되, 상기 협착부 직경은 세포의 갑작스러운 일시적 변형을 위해 상기 세포의 직경 보다 작으며, 상기 협착부는 세포의 변화를 일어나게 하며, 상기 변화는 페이로드가 통과하기에 충분한 크기이며, 상기 협착부는:
    (i) 미세 유체 채널에서;
    (ii) 복수 개의 마이크로필라(micropillar) 사이에 형성되며;
    (iii) 어레이로 구성된 복수 개의 마이크로필라(micropillar) 사이에 형성되며; 또는
    (iv) 하나 이상의 이동가능한 플레이트 사이에 형성되는 것을 특징으로 하는,
    용액 내에 현탁된 세포를 이용하고 페이로드(payload)를 세포로 전달하기 위한 미세유체 시스템.
  43. 제42항에 있어서, 상기 협착부의 직경은 상기 세포 직경의 20-99%인 미세유체 시스템.
  44. 제43항에 있어서, 상기 협착부의 직경은 상기 세포 직경의 20-60% 미만인 미세유체 시스템.
  45. 제42항에 있어서, 상기 협착부는 미세 유체 채널에 있는 미세유체 시스템.
  46. 제45항에 있어서, 상기 미세 유체 채널은 복수 개의 협착부를 포함하는 미세유체 시스템.
  47. 제46항에 있어서, 상기 복수 개의 협착부는 직렬 및 병렬로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 배열되는 미세유체 시스템.
  48. 제42항에 있어서, 상기 시스템은 상기 세포를 1㎲에서 1ms 동안 변형시키도록 구성되는 미세유체 시스템.
  49. 현탁 용액 내 복수 개의 타겟 세포를 제공하고;
    복수 개의 타겟 세포를 포함하는 용액을 복수 개의 미세유체 채널을 통해 통과시키고, 상기 각각의 채널은 적어도 하나의 세포 변형 협착부를 포함하며, 상기 협착부의 직경은 복수개의 타겟 세포 각각에 대한 변형이 유도됨으로써 페이로드가 지나가기에 충분한 크기의 세포 변화가 일어나도록 상기 세포의 직경 보다 작으며; 그리고
    세포가 상기 채널을 통과한 후에 페이로드 포함 용액 내 복수 개의 타겟 세포를 미리 설정된 시간 동안 인큐베이팅하는;
    것을 포함하는, 페이로드를 복수 개의 타겟 세포로 전달하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 협착부의 직경은 상기 세포 직경의 20-99%인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 협착부의 직경은 상기 세포 직경의 20-60% 미만인 방법.
  52. 제49항에 있어서, 상기 현탁 용액은 상기 협착부를 통과하기 전, 도중 및 후; 혹은 통과하기 전, 도중 또는 후;에 상기 세포 및 상기 페이로드를 포함하는 방법.
  53. 제49항에 있어서, 상기 현탁 용액은 협착부를 통과하기 전에 상기 세포 및 상기 페이로드를 포함하는 방법.
  54. 제49항에 있어서, 상기 현탁 용액은 협착부를 통과하기 후에 상기 세포 및 상기 페이로드를 포함하는 방법.
  55. 제49항에 있어서, 상기 채널의 단면(cross-section)은 원형, 타원형, 길게 늘어진 슬릿(slit), 사각형, 육각형 및 삼각형으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  56. 제49항에 있어서, 상기 용액을 통과시키는 것은, 직렬 및 병렬로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 배열된 복수 개의 미세유체 채널을 통해 상기 용액이 통과하는 것을 포함하는 방법.
  57. 제49항에 있어서, 상기 복수 개의 미세유체 채널 각각은 복수 개의 협착부를 포함하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 복수 개의 협착부는 직렬 및 병렬로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 배열되는 방법.
  59. 제49항에 있어서, 상기 인큐베이팅은 상기 세포를 0.0001초 이상 인큐베이팅하는 것을 포함하는 방법.
  60. 제49항에 있어서, 상기 인큐베이팅은 상기 세포를 0.0001초에서 60분 동안 인큐베이팅하는 것을 포함하는 방법.
  61. 제49항에 있어서, 상기 세포 변형은 상기 세포를 1㎲에서 1ms 동안 변형시키는 것을 포함하는 방법.
  62. 제49항에 있어서, 압력은 압축(compression) 또는 압축과 전단(shearing)을 포함하는 방법.
  63. 제14항 내지 제41항 및 제49항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 하기의 전달을 위해 사용되는 방법:
    (i) 세포 리프로그래밍(reprogramming)을 위해 DNA, RNA, siRNA 또는 단백질을 제1 섬유아세포 및 줄기세포로 전달:
    (ii) 항원 또는 RNA를 제1 면역 세포로 전달:
    (iii) 타겟 세포의 영상화에 도움을 주기 위해, 양자점(quantum dots) 및 탄소 나노튜브(carbon nanotubes) 중 적어도 하나를 타겟 세포에 전달; 또는
    (iv) 약물을 타겟 세포에 전달, 상기 타겟 세포는 종양 세포.
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