CN114340777A - 用于机电递送的装置、系统和套件及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
提供了用于细胞转染的装置、系统和套件。装置包括第一电极、第二电极和在它们之间的电穿孔区，其中施加于所述第一和第二电极的电势差在所述电穿孔区中产生足以对流动路径中的至少一个细胞亚群进行转染的电场。还提供了使用本发明的装置、系统和套件将组合物引入多个细胞的至少一部分的方法。
Description
联邦政府资助研究的声明
本发明根据国家科学基金会(NSF)颁发的SBIR第I阶段授权号1747096和SBIR第II阶段授权号1853194在政府的支持下进行。政府享有本发明的某些权利。
背景技术
免疫疗法目前处于基础科学研究和药物驱动的临床应用的前沿。这种趋势部分是由于靶基因修饰的最新进展以及CRISPR/Cas复合物编辑在治疗开发中的广泛使用。为了鉴定具有治疗意义的遗传修饰，研究组织通常不得不筛选成千上万的遗传变异，这些遗传变异可以包括内源基因的修饰或经工程化的基因的插入。这种药物发现过程是很费力的，需要在实验室内进行大量的体力劳动，由于缺乏适当的高通量技术因此给整个行业造成了瓶颈。
生物技术和制药研究与开发活动已转变为使流程的几乎所有步骤都自动化。工作流程包括由复杂的实验室管理软件提供支持以实现高通量发现的液体处理机器人。然而，转染步骤的局限在于低通量、效率低下的技术以及无法自动化的使用者密集型系统。用于转染的自动化平台不仅具有大幅降低过程成本的潜力，而且还增加了细胞活力和成功工程化的细胞的数量，同时还减少了发现时间，这在竞争性免疫疗法领域是至关重要的。
通过电穿孔转染的独特优势是RNA递送。现有的递送DNA的病毒技术似乎可与以电穿孔方式转染相提并论，但是缺乏GMP质量的非逆转录病毒RNA病毒。所以，为了达到将mRNA递送至细胞中的目的，具有电穿孔平台的公司一直是合作和收购的目标。
目前的高通量基因转移方法通常需要使用病毒递送(例如慢病毒载体)，其中病毒颗粒感染细胞并且转导所关注的遗传修饰。虽然病毒学方法可以应用于高通量自动化系统，但是生产中存在局限性，这种局限性延长了研究工作的时间线：病毒载体必须克隆，转染至病毒产生系中，然后病毒颗粒必须纯化。这个过程可能要耗费研究组织数月的时间，从而显著地影响了平台开发的时间线，同时增加了药物发现的成本。另外，使用病毒转导进行基因转移并不适合所有细胞类型的遗传修饰，因为某些细胞(诸如特异性免疫细胞亚群)对病毒感染具有耐受性。因此，在生物技术行业内，对于不依赖于病毒递送机制的用于基因转移的高通量自动化系统的需求仍未得到满足。
发明内容
在一个方面，本发明的特征在于一种用于将组合物机电递送到悬浮于液体(例如，流经装置的液体)中的多个细胞中的装置，所述装置包括第一电极和第二电极以及电穿孔区。所述第一电极包括第一入口、第一出口和具有最小横截面尺寸的第一管腔，并且所述第二电极包括第二入口、第二出口和包含最小横截面尺寸的第二管腔。所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，并且具有的最小横截面尺寸大于约100μm(例如，从100μm至10mm、从150μm至15mm、从200μm至10mm、从250μm至5mm、从500μm至10mm、从1mm至10mm、从1mm至50mm、从5mm至25mm、或从20mm至50mm，例如约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约5mm、约10mm、约15mm、约25mm、或约50mm)，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横向横截面面积。所述第一出口、所述电穿孔区和所述第二入口流体连通。
在另一个方面，本发明的特征在于一种用于将组合物电穿孔到悬浮于液体(例如，流经装置的液体)中的多个细胞中的装置，所述装置包括第一电极和第二电极以及电穿孔区。所述第一电极包括第一入口、第一出口和具有最小横截面尺寸的第一管腔，并且所述第二电极包括第二入口、第二出口和包含最小横截面尺寸的第二管腔。所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，并且具有的最小横截面尺寸大于约100μm(例如，从100μm至10mm、从150μm至15mm、从200μm至10mm、从250μm至5mm、从500μm至10mm、从1mm至10mm、从1mm至50mm、从5mm至25mm、或从20mm至50mm，例如约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约5mm、约10mm、约15mm、约25mm、或约50mm)，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横向横截面面积。所述第一出口、所述电穿孔区和所述第二入口流体连通。细胞的转染可以通过与静态电穿孔系统中的递送机构不同的机电递送机构发生在所述电穿孔区内。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述电穿孔区的横向横截面是选自圆形、圆盘形、椭圆形、正多边形、不规则多边形、曲线形、星形、平行四边形、梯形和不规则形状的形状(例如，具有凸起的形状，诸如凸起的狭槽或凹槽、不规则多边形和/或曲线形)。在一些实施方案中，所述电穿孔区的所述横截面沿着所述电穿孔区的长度(即，纵轴或流动方向)而变化。在一些实施方案中，所述形状沿着长度是一致的，但是相对于沿着所述电穿孔区的长度的中心纵轴在位置上有所变化(例如，所述横截面形状围绕中心轴从所述电穿孔区的一个末端旋转到另一个末端，诸如螺旋)。在特定实施方案中，所述电穿孔区具有基本上圆形的横向横截面。在一些实施方案中，所述电穿孔区具有的横向横截面面积在约7,850μm2和约2,000mm2之间(例如，在约8,000μm2和约1mm2之间、在约8,000μm2和约10mm2之间、在约8,000μm2和约100mm2之间、在约9,000μm2和5mm2之间、在约1mm2和约10mm2之间、在约1mm2和约100mm2之间、在约3mm2和约20mm2之间、在约10mm2和约50mm2之间、在约25mm2和约75mm2之间、在约50mm2和约100mm2之间、在约75mm2和约200mm2之间、在约100mm2和约350mm2之间、在约150mm2和约500mm2之间、在约300mm2和约750mm2之间、在约500mm2和约1,000mm2之间、在约750mm2和约1,500mm2之间、或在约950mm2和约2,000mm2之间，例如，约8,000μm2、约9,000μm2、约1mm2、约5mm2、约10mm2、约15mm2、约20mm2、约25mm2、约50mm2、约60mm2、约75mm2、约80mm2、约100mm2、约150mm2、约200mm2、约250mm2、约300mm2、约350mm2、约400mm2、约450mm2、约500mm2、约600mm2、约700mm2、约800mm2、约900mm2、约1,000mm2、约1,100mm2、约1,200mm2、约1,300mm2、约1,400mm2、约1,500mm2、约1,600mm2、约1,700mm2、约1,800mm2、约1,900mm2、或约2,000mm2)。
在一些实施方案中，所述电穿孔区具有的长度在0.005mm和50mm之间(例如，在0.005mm和0.05mm之间、在0.005mm和0.5mm之间、在0.005mm和25mm之间、在0.01mm和1mm之间、在0.05mm和5mm之间、在0.1mm和10mm之间、在0.1mm和50mm之间、在0.5mm和5mm之间、在0.5mm和25mm之间、在1mm和5mm之间、在1mm和10mm之间、在1mm和25mm之间、在3mm和15mm之间、在3mm和50mm之间、在10mm和20mm之间、在10mm和50mm之间、在15mm和25mm之间、在20mm和30mm之间、在25mm和40之间、或在30mm和50mm之间，例如，约0.005mm、约0.01mm、约0.05mm、约0.1mm、约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、或约50mm)。在一些实施方案中，所述电穿孔区具有的长度在0.005mm和25mm之间(例如，在0.005mm和0.05mm之间、在0.005mm和0.5mm之间、在0.01mm和1mm之间、在0.05mm和5mm之间、在0.1mm和10mm之间、在0.5mm和5mm之间、在0.5mm和10mm之间、在1mm和5mm之间、在1mm和10mm之间、在1mm和25mm之间、在3mm和10mm之间、在7mm和15mm之间、在10mm和20mm、或在15mm和25mm之间，例如，约0.005mm、约0.01mm、约0.05mm、约0.1mm、约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约10mm、约12mm、约15mm、约18mm、约20mm、约23mm、或约25mm)。
在一些实施方案中，所述第一电极和/或所述第二电极中的任一者的管腔具有的最小横截面尺寸在0.01mm和500mm之间(例如，在0.01mm和0.1mm之间、在0.01mm和0.5mm之间、在0.01mm和10mm之间、在0.05mm和5mm之间、在0.1mm和10mm之间、在0.5mm和5mm之间、在0.5mm和50mm之间、在1mm和5mm之间、在1mm和10mm之间、在1mm和25mm之间、在3mm和15mm之间、在3mm和50mm之间、在10mm和20mm之间、在10mm和100mm之间、在15mm和30mm之间、在20mm和40mm之间、在20mm和200mm之间、在30mm和50之间、在30mm和300mm之间、在45mm和60mm之间、在50mm和100mm之间、在50mm和500mm之间、在75mm和150mm之间、在75mm和300mm之间、在100mm和200mm之间、在100mm和500mm之间、在150mm和300mm之间、在200mm和400mm之间、在300mm和450mm之间、或在350mm和500mm之间，例如，约0.005mm、约0.01mm、约0.05mm、约0.1mm、约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约10mm、约15mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、约50mm、约60mm、约70mm、约80mm、约90mm、约100mm、约150mm、约200mm、约250mm、约300mm、约350mm、约400mm、约450mm、或约500mm)。
在一些实施方案中，所述第一电极或所述第二电极的中的任一者的管腔的最小横截面尺寸与所述电穿孔区的最小横截面尺寸的比率在1∶10和10∶1之间(例如，在1∶10和1∶5之间、在1∶10和1∶2之间、在1∶10和1∶1之间、在1∶10和2∶1之间、在1∶10和5∶1之间、在1∶5和1∶2之间、在1∶5和1∶1之间、在1∶5和2∶1之间、在1∶5和5∶1之间、在1∶2和2∶3之间、在1∶2和1∶1之间、在1∶2和2∶1之间、在1∶2和6∶1之间、在2∶3和2∶1之间、在2∶3和4∶1之间、在1∶1和2∶1之间、在1∶1和3∶1之间、在1∶1和10∶1之间、在3∶2和3∶1之间、在3∶2和6∶1之间、在2∶1和3∶1之间、在2∶1和5∶1之间、在5∶2和5∶1之间、在3∶1和4∶1之间、在7∶2和5∶1之间、在7∶2和10∶1之间、在4∶1和8∶1之间、在5∶1和10∶1、或在7∶1和10∶1之间，例如，约1∶10、约1∶9、约1∶8、约1∶7、约1∶6、约1∶5、约1∶2、约2∶3、约1∶1、约3∶2、约2∶1、约5∶2、约3∶1、约7∶2、约4∶1、约9∶2、约5∶1、约6∶1、约7∶1、约8∶1、约9∶1、或约10∶1)。
在一些实施方案中，所述电穿孔区的最小横截面尺寸与所述电穿孔区的长度的比率在1∶100和100∶1之间(例如，在1∶100和1∶50之间、在1∶100和1∶25之间、在1∶100和1∶10之间、在1∶100和1∶1之间、在1∶50和1∶5之间、在1∶50和1∶2之间、在1∶50和2∶1之间、在1∶25和1∶10之间、在1∶25和1∶5之间、在1∶25和1∶1之间、在1∶25和10∶1之间、在1∶10和1∶1之间、在1∶10和2∶1之间、在1∶10和5∶1之间、在1∶5和1∶2之间、在1∶5和1∶1之间、在1∶5和2∶1之间、在1∶2和1∶1之间、在1∶2和2∶1之间、在1∶1和2∶1之间、在1∶1和5∶1之间、在1∶1和10∶1之间、在1∶1和50∶1之间、在1∶1和100∶1之间、在2∶1和5∶1之间、在2∶1和20∶1之间、在3∶1和10∶1之间、在4∶1和25∶1之间、在5∶1和50∶1之间、在10∶1和50∶1之间、在40∶1和80∶1之间、在50∶1和100∶1之间、或在75∶1和90∶1之间，例如，约1∶100、约1∶75、约1∶50、约1∶25、约1∶10、约1∶5、约1∶2、约1∶1、约3∶2、约2∶1、约5∶2、约3∶1、约7∶2、约4∶1、约5∶1、约10∶1、约20∶1、约30∶1、约40∶1、约50∶1、约60∶1、约70∶1、约80∶1、约90∶1、或约100∶1)。
在一些实施方案中，所述第一电极和/或所述第二电极中的任一者的管腔的横向横截面面积与所述电穿孔区的横向横截面面积的比率在1∶100和100∶1之间(例如，在1∶100和1∶50之间、在1∶100和1∶25之间、在1∶100和1∶10之间、在1∶100和1∶1之间、在1∶50和1∶5之间、在1∶50和1∶2之间、在1∶50和2∶1之间、在1∶25和1∶10之间、在1∶25和1∶5之间、在1∶25和1∶1之间、在1∶25和10∶1之间、在1∶10和1∶1之间、在1∶10和2∶1之间、在1∶10和5∶1之间、在1∶5和1∶2之间、在1∶5和1∶1之间、在1∶5和2∶1之间、在1∶2和1∶1之间、在1∶2和2∶1之间、在1∶1和2∶1之间、在1∶1和5∶1之间、在1∶1和10∶1之间、在1∶1和50∶1之间、在1∶1和100∶1之间、在2∶1和5∶1之间、在2∶1和20∶1之间、在3∶1和10∶1之间、在4∶1和25∶1之间、在5∶1和50∶1之间、在10∶1和50∶1之间、在40∶1和80∶1之间、在50∶1和100∶1之间，或在75∶1和90∶1之间，例如，约1∶100、约1∶75、约1∶50、约1∶25、约1∶10、约1∶5、约1∶2、约1∶1、约3∶2、约2∶1、约5∶2、约3∶1、约7∶2、约4∶1、约5∶1、约10∶1、约20∶1、约30∶1、约40∶1、约50∶1、约60∶1、约70∶1、约80∶1、约90∶1、或约100∶1)。
在一些实施方案中，所述装置还包括与所述第一入口流体连通的第一储集器(例如，样品袋)和/或与所述第二出口流体连通的第二储集器(例如，收集袋，例如，回收袋)。另外，所述装置可以包括与所述第一管腔或所述第二管腔流体连通的第三储集器。所述第三储集器可以含有一种或多种用于转染的试剂(例如，具有被选择用于转染的组合物的试剂)，例如，有效负载悬浮液，诸如待递送至所述细胞的遗传组合物。在一些实施方案中，所述第三储集器被构造为含有缓冲液、缓冲液添加剂和/或有效负载悬浮液，所述有效负载悬浮液包含可以在所述电穿孔或机电过程之前或期间稀释的非液相组合物(例如，固体盐)。在一些实施方案中，所述第一电极或所述第二电极中的任一者具有用于与所述第三储集器流体连通的附加入口或出口。
在一些实施方案中，所述第一电极或所述第二电极中的任一者可以是多孔的或导电流体(例如，导电液体)。
如前述实施方案中的任一者所述的装置可以包括与所述第一入口流体连通的递送源。所述递送源可以被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。递送源也可以被构造为使用流体置换机构(例如，单个注射泵或多个注射泵)递送其他组分，诸如要引入所述细胞(例如，作为转染试剂储集器)的组合物(例如，遗传组合物)或另外的缓冲液或缓冲液添加剂，所述流体置换机构与所述递送源和所述第一管腔流体连接。
在一些实施方案中，所述递送源被构造为在所述电穿孔区之前(例如上游)或之内递送组分。在一些实施方案中，所述递送源被构造为使得所述流体置换机构(例如，单个注射泵或多个注射泵)专用于一种缓冲剂、缓冲液添加剂和/或有效负载悬浮液并且与悬浮中的所述多个细胞流体连通。
在一些实施方案中，所述装置还包括一个或多个附加电穿孔区(例如，一个、两个、三个、四个、六个、八个、十个、11个、12个、24个、27个、36个、48个、64个、96个、384个、1536个或更多个附加电穿孔区)，这些电穿孔区可以被构造为并联的、串联的或它们的组合。所述一个或多个附加电穿孔区可以各自具有基本上均一的横向横截面面积。
在前述实施方案中的任一者的一些实施方案中，所述装置可以另外包括壳体，所述壳体被构造为包裹所述第一电极、第二电极和所述电穿孔区。所述壳体可以包括可操作地耦合至所述第一电极的第一电输入和可操作地耦合至所述第二电极的第二电输入。在一些实施方案中，所述壳体还包括热控制器，所述热控制器被构造为增加所述装置和/或其中悬浮有所述多个细胞的所述液体的温度，其中所述热控制器是加热元件，所述加热元件选自由以下各项组成的组：加热块、液体流、电池供电的加热器和薄膜加热器。在一些实施方案中，所述壳体还包括热控制器，所述热控制器被构造为减少所述装置和/或其中悬浮有所述多个细胞的所述液体的温度，其中所述热控制器是冷却元件，所述冷却元件选自由以下各项组成的组：液体流、蒸发冷却器和帕尔贴(Peltier)装置。所述壳体可以整合至或可释放地连接至所述装置。
在另一个方面，本发明包括一种用于将组合物机电递送到悬浮于液体中的多个细胞中的装置，其中所述装置包括第一电极，所述第一电极包括第一入口、第一出口和具有最小横截面尺寸的第一管腔；第二电极，所述第二电极包括第二入口、第二出口和具有最小横截面尺寸的第二管腔；第三入口和第三出口，其中所述第三入口和所述第三出口与所述第一管腔流体连通，其中所述第三入口和所述第三出口与在所述第一入口和所述第一出口之间的所述第一电极相交；第四入口和第四出口，其中所述第四入口和所述第四出口与所述第二管腔流体连通，其中所述第四入口和所述第四出口与在所述第二入口和所述第二出口之间的所述第二电极相交；以及电穿孔区，所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，其中所述电穿孔区具有的最小横截面尺寸大于约100μm(例如，从100μm至10mm、从150μm至15mm、从200μm至10mm、从250μm至5mm、从500μm至10mm、从1mm至10mm、从1mm至50mm、从5mm至25mm、或从20mm至50mm，例如约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约5mm、约10mm、约15mm、约25mm、或约50mm)，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面面积。所述第一出口、所述电穿孔区和所述第二入口流体连通。所述电穿孔区的横向横截面是选自圆形、圆盘形、椭圆形、正多边形、不规则多边形、曲线形、星形、平行四边形、梯形和不规则形状的形状(例如，具有凸起的形状，例如凸起的狭槽或凹槽、不规则多边形和/或曲线形)。在一些实施方案中，所述电穿孔区的所述横截面沿着所述电穿孔区的长度(即，纵轴或流动方向)而变化。在一些实施方案中，所述形状沿着长度是一致的，但是相对于沿着所述电穿孔区的长度的中心纵轴在位置上有所变化(例如，所述横截面形状围绕中心轴从所述电穿孔区的一个末端旋转到另一个末端，诸如螺旋)。在特定实施方案中，所述电穿孔区具有基本上圆形的横向横截面。在一些实施方案中，所述电穿孔区具有的横向横截面面积在约7850μm2和约2,000mm2之间(例如，在约8,000μm2和约1mm2之间、在约8,000μm2和约10mm2之间、在约8,000μm2和约100mm2之间、在约9,000μm2和5mm2之间、在约1mm2和约10mm2之间、在约1mm2和约100mm2之间、在约3mm2和约20mm2之间、在约10mm2和约50mm2之间、在约25mm2和约75mm2之间、在约50mm2和约100mm2之间、在约75mm2和约200mm2之间、在约100mm2和约350mm2之间、在约150mm2和约500mm2之间、在约300mm2和约750mm2之间、在约500mm2和约1,000mm2之间、在约750mm2和约1,500mm2之间、或在约950mm2和约2,000mm2之间，例如，约8,000μm2、约9,000μm2、约1mm2、约5mm2、约10mm2、约15mm2、约20mm2、约25mm2、约50mm2、约60mm2、约75mm2、约80mm2、约100mm2、约150mm2、约200mm2、约250mm2、约300mm2、约350mm2、约400mm2、约450mm2、约500mm2、约600mm2、约700mm2、约800mm2、约900mm2、约1,000mm2、约1,100mm2、约1,200mm2、约1,300mm2、约1,400mm2、约1,500mm2、约1,600mm2、约1,700mm2、约1,800mm2、约1,900mm2、或约2,000mm2)。
在另一个方面，本发明包括一种用于将组合物转染到悬浮于液体中的多个细胞中的装置，其中所述装置包括第一电极，所述第一电极包括第一入口、第一出口和具有最小横截面尺寸的第一管腔；第二电极，所述第二电极包括第二入口、第二出口和具有最小横截面尺寸的第二管腔；第三入口和第三出口，其中所述第三入口和所述第三出口与所述第一管腔流体连通，其中所述第三入口和所述第三出口与在所述第一入口和所述第一出口之间的所述第一电极相交；第四入口和第四出口，其中所述第四入口和所述第四出口与所述第二管腔流体连通，其中所述第四入口和所述第四出口与在所述第二入口和所述第二出口之间的所述第二电极相交；以及电穿孔区，所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，其中所述电穿孔区具有的最小横截面尺寸大于约100μm(例如，从100μm至10mm、从150μm至15mm、从200μm至10mm、从250μm至5mm、从500μm至10mm、从1mm至10mm、从1mm至50mm、从5mm至25mm、或从20mm至50mm，例如约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约5mm、约10mm、约15mm、约25mm、或约50mm)，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面面积。所述第一出口、所述电穿孔区和所述第二入口流体连通。所述电穿孔区的横向横截面是选自圆形、圆盘形、椭圆形、正多边形、不规则多边形、曲线形、星形、平行四边形、梯形和不规则形状的形状(例如，具有凸起的形状，例如凸起的狭槽或凹槽、不规则多边形和/或曲线形)。在一些实施方案中，所述电穿孔区的所述横截面沿着所述电穿孔区的长度(即，纵轴或流动方向)而变化。在一些实施方案中，所述形状沿着长度是一致的，但是相对于沿着所述电穿孔区的长度的中心纵轴在位置上有所变化(例如，所述横截面形状围绕中心轴从所述电穿孔区的一个末端旋转到另一个末端，诸如螺旋)。在特定实施方案中，所述电穿孔区具有基本上圆形的横向横截面。在一些实施方案中，所述电穿孔区具有的横向横截面面积在约7850μm2和约2,000mm2之间(例如，在约8,000μm2和约1mm2之间、在约8,000μm2和约10mm2之间、在约8,000μm2和约100mm2之间、在约9,000μm2和5mm2之间、在约1mm2和约10mm2之间、在约1mm2和约100mm2之间、在约3mm2和约20mm2之间、在约10mm2和约50mm2之间、在约25mm2和约75mm2之间、在约50mm2和约100mm2之间、在约75mm2和约200mm2之间、在约100mm2和约350mm2之间、在约150mm2和约500mm2之间、在约300mm2和约750mm2之间、在约500mm2和约1,000mm2之间、在约750mm2和约1,500mm2之间、或在约950mm2和约2,000mm2之间，例如，约8,000μm2、约9,000μm2、约1mm2、约5mm2、约10mm2、约15mm2、约20mm2、约25mm2、约50mm2、约60mm2、约75mm2、约80mm2、约100mm2、约150mm2、约200mm2、约250mm2、约300mm2、约350mm2、约400mm2、约450mm2、约500mm2、约600mm2、约700mm2、约800mm2、约900mm2、约1,000mm2、约1,100mm2、约1,200mm2、约1,300mm2、约1,400mm2、约1,500mm2、约1,600mm2、约1,700mm2、约1,800mm2、约1,900mm2、或约2,000mm2)。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述电穿孔区具有的最小横截面尺寸在0.1mm和50mm之间(例如，在0.1mm和0.5mm之间、在0.1mm和1mm之间、在0.1mm和5mm之间、在0.1mm和10mm之间、在0.5mm和5mm之间、在1mm和5mm之间、在1mm和10mm之间、在1mm和25mm之间、在3mm和15mm之间、在3mm和50mm之间、在10mm和20mm之间、在10mm和100mm之间、在15mm和30mm之间、在20mm和40mm之间、在20mm和200mm之间、在30mm和50之间、在45mm和60mm之间、在50mm和100mm之间、在75mm和150mm之间、在100mm和200mm之间、在150mm和300mm之间、在200mm和400mm之间、在300mm和450mm之间、或在350mm和500mm之间，例如，约0.1mm、约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约10mm、约15mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、或约50mm)。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述电穿孔区具有的长度在0.005mm和50mm之间(例如，在0.005mm和0.05mm之间、在0.005mm和0.5mm之间、在0.005mm和25mm之间、在0.01mm和1mm之间、在0.05mm和5mm之间、在0.1mm和10mm之间、在0.1mm和50mm之间、在0.5mm和5mm之间、在0.5mm和25mm之间、在1mm和5mm之间、在1mm和10mm之间、在1mm和25mm之间、在3mm和15mm之间、在3mm和50mm之间、在10mm和20mm之间、在10mm和50mm之间、在15mm和25mm之间、在20mm和30mm之间、在25mm和40之间、或在30mm和50mm之间，例如，约0.005mm、约0.01mm、约0.05mm、约0.1mm、约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、或约50mm)。在一些实施方案中，所述电穿孔区具有的长度在0.005mm和25mm之间(例如，在0.005mm和0.05mm之间、在0.005mm和0.5mm之间、在0.01mm和1mm之间、在0.05mm和5mm之间、在0.1mm和10mm之间、在0.5mm和5mm之间、在0.5mm和10mm之间、在1mm和5mm之间、在1mm和10mm之间、在1mm和25mm之间、在3mm和10mm之间、在7mm和15mm之间、在10mm和20mm、或在15mm和25mm之间，例如，约0.005mm、约0.01mm、约0.05mm、约0.1mm、约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约10mm、约12mm、约15mm、约18mm、约20mm、约23mm、或约25mm)。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述第一电极和/或所述第二电极中的任一者的管腔具有的最小横截面尺寸在0.01mm和500mm之间(例如，在0.01mm和0.1mm之间、在0.01mm和0.5mm之间、在0.01mm和10mm之间、在0.05mm和5mm之间、在0.1mm和10mm之间、在0.5mm和5mm之间、在0.5mm和50mm之间、在1mm和5mm之间、在1mm和10mm之间、在1mm和25mm之间、在3mm和15mm之间、在3mm和50mm之间、在10mm和20mm之间、在10mm和100mm之间、在15mm和30mm之间、在20mm和40mm之间、在20mm和200mm之间、在30mm和50之间、在30mm和300mm之间、在45mm和60mm之间、在50mm和100mm之间、在50mm和500mm之间、在75mm和150mm之间、在75mm和300mm之间、在100mm和200mm之间、在100mm和500mm之间、在150mm和300mm之间、在200mm和400mm之间、在300mm和450mm之间、或在350mm和500mm之间，例如，约0.005mm、约0.01mm、约0.05mm、约0.1mm、约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约10mm、约15mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、约50mm、约60mm、约70mm、约80mm、约90mm、约100mm、约150mm、约200mm、约250mm、约300mm、约350mm、约400mm、约450mm、或约500mm)。在一些实施方案中，所述第一电极或所述第二电极中的任一者的管腔的最小横截面尺寸与所述电穿孔区的最小横截面尺寸的比率在1∶10和10∶1之间(例如，在1∶10和1∶5之间、在1∶10和1∶2之间、在1∶10和1∶1之间、在1∶10和2∶1之间、在1∶10和5∶1之间、在1∶5和1∶2之间、在1∶5和1∶1之间、在1∶5和2∶1之间、在1∶5和5∶1之间、在1∶2和2∶3之间、在1∶2和1∶1之间、在1∶2和2∶1之间、在1∶2和6∶1之间、在2∶3和2∶1之间、在2∶3和4∶1之间、在1∶1和2∶1之间、在1∶1和3∶1之间、在1∶1和10∶1之间、在3∶2和3∶1之间、在3∶2和6∶1之间、在2∶1和3∶1之间、在2∶1和5∶1之间、在5∶2和5∶1之间、在3∶1和4∶1之间、在7∶2和5∶1之间、在7∶2和10∶1之间、在4∶1和8∶1之间、在5∶1和10∶1、或在7∶1和10∶1之间，例如，约1∶10、约1∶5、约1∶2、约2∶3、约1∶1、约3∶2、约2∶1、约5∶2、约3∶1、约7∶2、约4∶1、约9∶2、约5∶1、约6∶1、约7∶1、约8∶1、约9∶1、或约10∶1)。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述电穿孔区的最小横截面尺寸与所述电穿孔区的长度的比率在1∶100和100∶1之间(例如，在1∶100和1∶50之间、在1∶100和1∶25之间、在1∶100和1∶10之间、在1∶100和1∶1之间、在1∶50和1∶5之间、在1∶50和1∶2之间、在1∶50和2∶1之间、在1∶25和1∶10之间、在1∶25和1∶5之间、在1∶25和1∶1之间、在1∶25和10∶1之间、在1∶10和1∶1之间、在1∶10和2∶1之间、在1∶10和5∶1之间、在1∶5和1∶2之间、在1∶5和1∶1之间、在1∶5和2∶1之间、在1∶2和1∶1之间、在1∶2和2∶1之间、在1∶1和2∶1之间、在1∶1和5∶1之间、在1∶1和10∶1之间、在1∶1和50∶1之间、在1∶1和100∶1之间、在2∶1和5∶1之间、在2∶1和20∶1之间、在3∶1和10∶1之间、在4∶1和25∶1之间、在5∶1和50∶1之间、在10∶1和50∶1之间、在40∶1和80∶1之间、在50∶1和100∶1之间、或在75∶1和90∶1之间，例如，约1∶100、约1∶75、约1∶50、约1∶25、约1∶10、约1∶5、约1∶2、约1∶1、约3∶2、约2∶1、约5∶2、约3∶1、约7∶2、约4∶1、约5∶1、约10∶1、约20∶1、约30∶1、约40∶1、约50∶1、约60∶1、约70∶1、约80∶1、约90∶1、或约100∶1)。在一些实施方案中，所述第一电极和/或所述第二电极中的任一者的管腔的横向横截面面积与所述电穿孔区的横向横截面面积的比率在1∶100和100∶1之间(例如，在1∶100和1∶50之间、在1∶100和1∶25之间、在1∶100和1∶10之间、在1∶100和1∶1之间、在1∶50和1∶5之间、在1∶50和1∶2之间、在1∶50和2∶1之间、在1∶25和1∶10之间、在1∶25和1∶5之间、在1∶25和1∶1之间、在1∶25和10∶1之间、在1∶10和1∶1之间、在1∶10和2∶1之间、在1∶10和5∶1之间、在1∶5和1∶2之间、在1∶5和1∶1之间、在1∶5和2∶1之间、在1∶2和1∶1之间、在1∶2和2∶1之间、在1∶1和2∶1之间、在1∶1和5∶1之间、在1∶1和10∶1之间、在1∶1和50∶1之间、在1∶1和100∶1之间、在2∶1和5∶1之间、在2∶1和20∶1之间、在3∶1和10∶1之间、在4∶1和25∶1之间、在5∶1和50∶1之间、在10∶1和50∶1之间、在40∶1和80∶1之间、在50∶1和100∶1之间，或在75∶1和90∶1之间，例如，约1∶100、约1∶75、约1∶50、约1∶25、约1∶10、约1∶5、约1∶2、约1∶1、约3∶2、约2∶1、约5∶2、约3∶1、约7∶2、约4∶1、约5∶1、约10∶1、约20∶1、约30∶1、约40∶1、约50∶1、约60∶1、约70∶1、约80∶1、约90∶1、或约100∶1)。所述第一电极或所述第二电极中的任一者、或它们二者可以是多孔的或导电流体(例如，液体)。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述装置还包括与所述第一入口流体连通的第一储集器。在一些实施方案中，还包括与所述第二出口流体连通的第二储集器。在一些实施方案中，所述装置还包括与所述第三入口和所述第三出口流体连通的第三储集器。在一些实施方案中，所述装置还包括与所述第四入口和所述第四出口流体连通的第四储集器。在一些实施方案中，所述装置还包括与所述第一电极或所述第二电极中的任一者的管腔流体连通的第五储集器，其中所述第一电极或所述第二电极中的任一者具有至少一个用于与所述第五储集器流体连通的附加入口。在一些实施方案中，所述装置还包括与所述第一入口流体连通的流体递送源，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。在一些实施方案中，所述装置还包括多个电穿孔区(例如，布置为串联的、并联的或它们的组合)。所述多个电穿孔区中的每个可以具有基本上均一的横向横截面面积。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述装置还包括壳体(例如，盒)，所述壳体包括被构造为包裹所述装置的所述第一电极、所述第二电极和所述至少一个电穿孔区的壳体。所述壳体可以包括可操作地耦合至所述第一电极的第一电输入和可操作地耦合至所述第二电极的第二电输入。在一些实施方案中，所述壳体还包括热控制器，所述热控制器被构造为增加所述装置和/或其中悬浮有所述多个细胞的所述液体的温度，其中所述热控制器是加热元件，所述加热元件选自由以下各项组成的组：加热块、液体流、电池供电的加热器和薄膜加热器。在一些实施方案中，所述壳体还包括热控制器，所述热控制器被构造为减少所述装置和/或其中悬浮有所述多个细胞的所述液体的温度，其中所述热控制器是冷却元件，所述冷却元件选自由以下各项组成的组：液体流、蒸发冷却器和帕尔贴(Peltier)装置。在一些实施方案中，所述壳体整合至所述装置或可释放地连接至所述装置。在一些实施方案中，所述壳体(例如，盒)被构造用于与自动化封闭系统一起使用和/或插入到自动化封闭系统中，所述自动化封闭系统用于在临床或医院环境中将细胞疗法递送给患者。
在一些实施方案中，所述壳体还包括用于在所述样本的电穿孔期间、之前和之后进行细胞悬浮液和/或缓冲液储存的冷却/加热区域/壳体。在一些实施方案中，所述系统(例如，装置和壳体)是外部供电的。
在一些实施方案中，本发明的装置包括使用者接口或其他替代性使用者接口，所述使用者接口允许使用者能够选择参数，诸如流速、波形、施加的电势、要转染的体积、时间延迟、冷却特征部、加热特征部、转染状态、进度，以及用于优化转染方案的其他参数。在一些实施方案中，使用者接口还包含预先设定的参数选择，允许使用者能够在标准条件下操作系统，该标准条件此前已由使用者验证或由制造商推荐。在一些实施方案中，使用者接口可以连接至程序，以允许系统的自动运行和/或运行算法，以针对已知细胞类型的给定样品优化转染。在一些实施方案中，如果所述使用者选择此功能，则所述优化算法具有独立或自主调整转染参数的能力。在一些实施方案中，所述优化算法允许连续调整在所述转染过程中使用的所述参数，所述参数可以取决于所述细胞类型、细胞悬浮液的电导率、细胞悬浮液的体积、粘度、一个或多个转染盒的寿命、所述悬浮液的物理状态或一个或多个转染装置的状态。
在一些实施方案中，所述优化算法具有根据已知的输入细胞类型参数来执行预测分析以及相应地调整转染参数的能力。在一些实施方案中，所述优化算法根据本发明的装置中的任一者内的电信号来调整转染参数。在一些实施方案中，所述优化算法根据独特的无量纲输入参数来调整转染参数。在一些实施方案中，所述优化算法具有根据独特的多变量参数组合来调整转染参数的能力，所述参数预测高活力结果、高效率结果或匹配的活力和效率结果。这些独特的多变量参数组合可以是已知的关系，诸如雷诺数，或者可以是新的关系，诸如剪切速率与流体速度、通道直径与流体速度、电场与流体速度等之间的关系。一般而言，通过施加的电脉冲递送的电能的量与通过流体流递送的机械能的量之间存在平衡。根据所期望的结局，例如高细胞收率或高效率，存在电效应和机械效应的最佳组合。对于给定的电脉冲条件，更快的流体流使暴露于所述细胞的电能的量减少，并且趋于使细胞活力和细胞收率增加。但是这只会发生在一个点上，除此之外，细胞收率开始减少，因为所述电池未经历足够的电能来进行有效的有效负载递送。
在另一个方面，本发明包括一种用于将组合物机电递送到悬浮于液体中的多个细胞中的系统，其中所述系统包括所述装置的前述实施方案中的任一者。
在另一个方面，本发明包括一种用于将组合物电穿孔到悬浮于液体中的多个细胞中的系统，其中所述系统包括所述装置的前述实施方案中的任一者(例如，其中所述电穿孔通过机电递送机构进行)。
在另一个方面，本发明包括一种用于将组合物机电递送到悬浮于液体中的多个细胞中的系统，所述系统包括装置和电势源。所述装置包括第一电极、第二电极和电穿孔区。所述第一电极包括第一入口、第一出口和包含最小横截面尺寸的第一管腔；并且所述第二电极包括第二入口、第二出口和包含最小横截面尺寸的第二管腔。所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，并且具有的最小横截面尺寸大于约100μm(例如，从100μm至10mm、从150μm至15mm、从200μm至10mm、从250μm至5mm、从500μm至10mm、从1mm至10mm、从1mm至50mm、从5mm至25mm、或从20mm至50mm，例如约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约5mm、约10mm、约15mm、约25mm、或约50mm)。所述电穿孔区具有基本上均一的横截面面积。所述第一出口、所述电穿孔区和所述第二入口流体连通。所述系统还包括电势源，其中所述装置的第一电极和第二电极可释放地与所述电势源可操作地接触。在一些实施方案中，所述装置还包括与所述第一入口流体连通的第一储集器和/或与所述第二出口流体连通的第二储集器。
在另一个方面，本发明包括一种用于将组合物电穿孔到悬浮于液体中的多个细胞中的系统，所述系统包括装置和电势源。所述装置包括第一电极、第二电极和电穿孔区。所述第一电极包括第一入口、第一出口和包含最小横截面尺寸的第一管腔；并且所述第二电极包括第二入口、第二出口和包含最小横截面尺寸的第二管腔。所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，并且具有的最小横截面尺寸大于约100μm(例如，从100μm至10mm、从150μm至15mm、从200μm至10mm、从250μm至5mm、从500μm至10mm、从1mm至10mm、从1mm至50mm、从5mm至25mm、或从20mm至50mm，例如约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约5mm、约10mm、约15mm、约25mm、或约50mm)。所述电穿孔区具有基本上均一的横截面面积。所述第一出口、所述电穿孔区和所述第二入口流体连通。所述系统还包括电势源，其中所述装置的第一电极和第二电极可释放地与所述电势源可操作地接触。在一些实施方案中，所述装置还包括与所述第一入口流体连通的第一储集器和/或与所述第二出口流体连通的第二储集器。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述电穿孔区的横截面是选自圆形、圆盘形、椭圆形、正多边形、不规则多边形、曲线形、星形、平行四边形、梯形和不规则形状的形状。在一些实施方案中，所述电穿孔区具有基本上圆形的横向横截面。在一些实施方案中，所述电穿孔区具有的最小横截面尺寸在0.1mm和50mm之间(例如，在0.1mm和0.5mm之间、在0.1mm和1mm之间、在0.1mm和5mm之间、在0.1mm和10mm之间、在0.5mm和5mm之间、在1mm和5mm之间、在1mm和10mm之间、在1mm和25mm之间、在3mm和15mm之间、在3mm和50mm之间、在10mm和20mm之间、在10mm和100mm之间、在15mm和30mm之间、在20mm和40mm之间、在20mm和200mm之间、在30mm和50之间、在45mm和60mm之间、在50mm和100mm之间、在75mm和150mm之间、在100mm和200mm之间、在150mm和300mm之间、在200mm和400mm之间、在300mm和450mm之间、或在350mm和500mm之间，例如，约0.1mm、约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约10mm、约15mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、或约50mm)。
在本发明的前述任一系统的一些实施方案中，所述电穿孔区具有的横截面面积在约7,850μm2和约2,000mm2之间(例如，在约8,000μm2和约1mm2之间、在约8,000μm2和约10mm2之间、在约8,000μm2和约100mm2之间、在约9,000μm2和5mm2之间、在约1mm2和约10mm2之间、在约1mm2和约100mm2之间、在约3mm2和约20mm2之间、在约10mm2和约50mm2之间、在约25mm2和约75mm2之间、在约50mm2和约100mm2之间、在约75mm2和约200mm2之间、在约100mm2和约350mm2之间、在约150mm2和约500mm2之间、在约300mm2和约750mm2之间、在约500mm2和约1,000mm2之间、在约750mm2和约1,500mm2之间、或在约950mm2和约2,000mm2之间，例如，约8,000μm2、约9,000μm2、约1mm2、约5mm2、约10mm2、约15mm2、约20mm2、约25mm2、约50mm2、约60mm2、约75mm2、约80mm2、约100mm2、约150mm2、约200mm2、约250mm2、约300mm2、约350mm2、约400mm2、约450mm2、约500mm2、约600mm2、约700mm2、约800mm2、约900mm2、约1,000mm2、约1,100mm2、约1,200mm2、约1,300mm2、约1,400mm2、约1,500mm2、约1,600mm2、约1,700mm2、约1,800mm2、约1,900mm2、或约2,000mm2)。
在前述任一系统的一些实施方案中，所述电穿孔区具有的长度在0.005mm和50mm之间(例如，在0.005mm和0.05mm之间、在0.005mm和0.5mm之间、在0.005mm和25mm之间、在0.01mm和1mm之间、在0.05mm和5mm之间、在0.1mm和10mm之间、在0.1mm和50mm之间、在0.5mm和5mm之间、在0.5mm和25mm之间、在1mm和5mm之间、在1mm和10mm之间、在1mm和25mm之间、在3mm和15mm之间、在3mm和50mm之间、在10mm和20mm之间、在10mm和50mm之间、在15mm和25mm之间、在20mm和30mm之间、在25mm和40之间、或在30mm和50mm之间，例如，约0.005mm、约0.01mm、约0.05mm、约0.1mm、约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、或约50mm)。在所述系统的一些实施方案中，所述电穿孔区的长度在0.005mm和25mm之间(例如，在0.005mm和0.05mm之间、在0.005mm和0.5mm之间、在0.01mm和1mm之间、在0.05mm和5mm之间、在0.1mm和10mm之间、在0.5mm和5mm之间、在0.5mm和10mm之间、在1mm和5mm之间、在1mm和10mm之间、在1mm和25mm之间、在3mm和10mm之间、在7mm和15mm之间、在10mm和20mm、或在15mm和25mm之间，例如，约0.005mm、约0.01mm、约0.05mm、约0.1mm、约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约10mm、约12mm、约15mm、约18mm、约20mm、约23mm、或约25mm)。
在前述任一系统的一些实施方案中，所述第一电极和/或所述第二电极中的任一者的管腔具有的最小横截面尺寸在0.01mm和500mm之间(例如，在0.01mm和0.1mm之间、在0.01mm和0.5mm之间、在0.01mm和10mm之间、在0.05mm和5mm之间、在0.1mm和10mm之间、在0.5mm和5mm之间、在0.5mm和50mm之间、在1mm和5mm之间、在1mm和10mm之间、在1mm和25mm之间、在3mm和15mm之间、在3mm和50mm之间、在10mm和20mm之间、在10mm和100mm之间、在15mm和30mm之间、在20mm和40mm之间、在20mm和200mm之间、在30mm和50之间、在30mm和300mm之间、在45mm和60mm之间、在50mm和100mm之间、在50mm和500mm之间、在75mm和150mm之间、在75mm和300mm之间、在100mm和200mm之间、在100mm和500mm之间、在150mm和300mm之间、在200mm和400mm之间、在300mm和450mm之间、或在350mm和500mm之间，例如，约0.005mm、约0.01mm、约0.05mm、约0.1mm、约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约10mm、约15mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、约50mm、约60mm、约70mm、约80mm、约90mm、约100mm、约150mm、约200mm、约250mm、约300mm、约350mm、约400mm、约450mm、或约500mm)。
在本发明的系统的一些实施方案中，所述第一电极或所述第二电极中的任一者的管腔的最小横截面尺寸与所述电穿孔区的最小横截面尺寸的比率在1∶10和10∶1之间(例如，在1∶10和1∶5之间、在1∶10和1∶2之间、在1∶10和1∶1之间、在1∶10和2∶1之间、在1∶10和5∶1之间、在1∶5和1∶2之间、在1∶5和1∶1之间、在1∶5和2∶1之间、在1∶5和5∶1之间、在1∶2和2∶3之间、在1∶2和1∶1之间、在1∶2和2∶1之间、在1∶2和6∶1之间、在2∶3和2∶1之间、在2∶3和4∶1之间、在1∶1和2∶1之间、在1∶1和3∶1之间、在1∶1和10∶1之间、在3∶2和3∶1之间、在3∶2和6∶1之间、在2∶1和3∶1之间、在2∶1和5∶1之间、在5∶2和5∶1之间、在3∶1和4∶1之间、在7∶2和5∶1之间、在7∶2和10∶1之间、在4∶1和8∶1之间、在5∶1和10∶1、或在7∶1和10∶1之间，例如，约1∶10、约1∶9、约1∶8、约1∶7、约1∶6、约1∶5、约1∶2、约2∶3、约1∶1、约3∶2、约2∶1、约5∶2、约3∶1、约7∶2、约4∶1、约9∶2、约5∶1、约6∶1、约7∶1、约8∶1、约9∶1、或约10∶1)。在一些实施方案中，所述电穿孔区的最小横截面尺寸与所述电穿孔区的长度的比率在1∶100和100∶1之间(例如，在1∶100和1∶50之间、在1∶100和1∶25之间、在1∶100和1∶10之间、在1∶100和1∶1之间、在1∶50和1∶5之间、在1∶50和1∶2之间、在1∶50和2∶1之间、在1∶25和1∶10之间、在1∶25和1∶5之间、在1∶25和1∶1之间、在1∶25和10∶1之间、在1∶10和1∶1之间、在1∶10和2∶1之间、在1∶10和5∶1之间、在1∶5和1∶2之间、在1∶5和1∶1之间、在1∶5和2∶1之间、在1∶2和1∶1之间、在1∶2和2∶1之间、在1∶1和2∶1之间、在1∶1和5∶1之间、在1∶1和10∶1之间、在1∶1和50∶1之间、在1∶1和100∶1之间、在2∶1和5∶1之间、在2∶1和20∶1之间、在3∶1和10∶1之间、在4∶1和25∶1之间、在5∶1和50∶1之间、在10∶1和50∶1之间、在40∶1和80∶1之间、在50∶1和100∶1之间、或在75∶1和90∶1之间，例如，约1∶100、约1∶75、约1∶50、约1∶25、约1∶10、约1∶5、约1∶2、约1∶1、约3∶2、约2∶1、约5∶2、约3∶1、约7∶2、约4∶1、约5∶1、约10∶1、约20∶1、约30∶1、约40∶1、约50∶1、约60∶1、约70∶1、约80∶1、约90∶1、或约100∶1)。
在一些实施方案中，所述第一电极和/或所述第二电极中的任一者的管腔的横向横截面面积与所述电穿孔区的横向横截面面积的比率在1∶100和100∶1之间(例如，在1∶100和1∶50之间、在1∶100和1∶25之间、在1∶100和1∶10之间、在1∶100和1∶1之间、在1∶50和1∶5之间、在1∶50和1∶2之间、在1∶50和2∶1之间、在1∶25和1∶10之间、在1∶25和1∶5之间、在1∶25和1∶1之间、在1∶25和10∶1之间、在1∶10和1∶1之间、在1∶10和2∶1之间、在1∶10和5∶1之间、在1∶10和10∶1之间、在1∶5和1∶2之间、在1∶5和1∶1之间、在1∶5和2∶1之间、在1∶5和50∶1之间、在1∶2和1∶1之间、在1∶2和2∶1之间、在1∶2和10∶1之间、在1∶1和2∶1之间、在1∶1和5∶1之间、在1∶1和10∶1之间、在1∶1和50∶1之间、在1∶1和100∶1之间、在2∶1和5∶1之间、在2∶1和20∶1之间、在2∶1和50∶1之间、在3∶1和10∶1之间、在3∶1和30∶1之间、在4∶1和25∶1之间、在5∶1和10∶1之间、在5∶1和50∶1之间、在10∶1和50∶1之间、在10∶1和100∶1之间、在40∶1和80∶1之间、在50∶1和100∶1之间、或在75∶1和90∶1之间，例如，约1∶100、约1∶75、约1∶50、约1∶25、约1∶10、约1∶5、约1∶2、约1∶1、约3∶2、约2∶1、约5∶2、约3∶1、约7∶2、约4∶1、约5∶1、约6∶1、约7∶1、约8∶1、约9∶1、约10∶1、约15∶1、约20∶1、约25∶1、约30∶1、约40∶1、约50∶1、约60∶1、约70∶1、约80∶1、约90∶1、或约100∶1)。所述第一电极或所述第二电极中的任一者、或它们二者可以是多孔的或导电流体(例如，液体)。
在前述任一系统的一些实施方案中，所述系统包括与所述第一电极或所述第二电极中的任一者的管腔流体连通的第三储集器，其中所述第一电极或所述第二电极中的任一者具有用于与所述第三储集器流体连通的附加入口。在一些实施方案中，所述系统还包括与所述第一入口流体连通的流体递送源，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。
在一些实施方案中，本发明的系统还包括控制器，所述控制器可操作地耦合至所述电势源，以将电压脉冲递送至所述第一电极和所述第二电极，其中所述电压脉冲在所述第一电极和所述第二电极之间产生电势差，从而在所述电穿孔区中产生电场。在一些实施方案中，所述系统包括多个电穿孔区(例如，作为本文提供的装置的多个任何实施方案的一部分)。所述多个电穿孔区中的每个可以具有基本上均一的或不均一的横向横截面面积。
在一些实施方案中，所述系统还包括外部结构，所述外部结构包括被构造为包裹所述装置的所述第一电极、所述第二电极和所述至少一个电穿孔区的壳体(例如，其中所述外部结构还包括可操作地耦合至所述第一电极的第一电输入和可操作地耦合至所述第二电极的第二电输入)。所述壳体可以包括热控制器，所述热控制器被构造为增加所述装置和/或其中悬浮有所述多个细胞的所述液体的温度。所述热控制器可以是加热元件，所述加热元件选自由以下各项组成的组：加热块、液体流、电池供电的加热器和薄膜加热器。另外地或可替代地，所述热控制器可以被构造为减少所述装置和/或其中悬浮有所述多个细胞的所述液体的温度，其中所述热控制器是冷却元件，所述冷却元件选自由以下各项组成的组：液体流、蒸发冷却器和帕尔贴装置。
在本发明的前述任一系统的一些实施方案中，所述电势源可释放地连接至所述外部结构的所述第一电输入和所述第二电输入。所述第一电输入或所述第二电输入与所述电势源之间的可释放连接可以选自由以下各项组成的组：钳子、夹子、弹簧、护套、钢丝刷、机械连接、感应连接或它们的组合。所述外部结构可以整合至或可释放地连接至所述装置。在一些实施方案中，壳体(例如，盒)被构造为使多个装置并联地、串联地或在时间上偏移地通电，其中所述壳体还包括容纳多个电穿孔装置的托盘，其中所述托盘被两个栅网电极改装，其中第一栅网电极与第二栅网电极电绝缘，其中所述多个装置中的每个的所述第一电极的外部可释放地与第一弹簧加载的电极、第一机械连接的电极或第一感应连接的电极中的任一者可操作地接触，其中所述多个装置中的每个的所述第二电极的外部可释放地与第二弹簧加载的电极、第二机械连接的电极或第二感应耦合的电极中的任一者可操作地接触，其中所述多个装置中的每个可释放地通过所述栅网电极中的开口进入所述壳体(例如，盒)，其中每个装置的所述第一弹簧加载的电极、第一机械连接的电极或第一感应连接的电极中的任一者与所述第一栅网电极可操作地接触，并且每个装置的所述第二弹簧加载的电极、第二机械连接的电极或第二感应连接的电极与所述第二栅网电极可操作地接触，其中所述栅网电极连接至所述电势源。
在一些实施方案中，所述壳体(例如，盒)包封一个或多个前述发明或者一个或多个用于连续流电穿孔的电穿孔装置。在一些实施方案中，所述壳体(例如，盒)被构造为允许与自动化封闭系统一起使用和/或插入到自动化封闭系统中，所述自动化封闭系统将细胞疗法递送给患者。在一些实施方案中，所述壳体还包括用于在所述样本的电穿孔期间、之前和之后进行细胞悬浮液和/或缓冲液储存的冷却/加热区域/壳体。在一些实施方案中，所述系统(例如，一个或多个装置和壳体)是外部供电的。
在一些实施方案中，所述系统还包括优化算法，如果所述使用者选择此功能，则所述优化算法具有独立或自主调整电穿孔参数的能力。这些优化算法允许连续调整在电穿孔过程中使用的参数，该参数可以取决于细胞类型、电导率、悬浮液的体积、粘度、电穿孔盒的寿命、悬浮液的物理状态或电穿孔装置的状态。
在系统的前述任一方面的一些实施方案中，所述电势源将电压脉冲递送至所述栅网电极，其中所述第一栅网电极以特定的施加电压通电，同时所述第二栅网电极以特定的施加电压通电，其中所述多个装置中的每个由所述栅网电极以相同的施加电压脉冲通电，以使得在每个装置的所述至少一个电穿孔区中的每个内产生的电场的幅度基本上相等。在一些实施方案中，所述电势源包括附加电路或程序，所述附加电路或程序被构造为调节电压脉冲至所述栅网电极的递送，其中所述多个装置中的每个可接收来自所述栅网电极的不同电压，其中在每个装置的所述至少一个电穿孔区中的每个内产生的电场的幅度不相等。
在另一个方面，本发明提供了一种用于将组合物机电递送到悬浮于液体中的多个细胞中的系统，所述体系包括：装置，所述装置包括第一电极，所述第一电极包括第一入口、第一出口和第一管腔；第二电极，所述第二电极包括第二入口、第二出口和第二管腔；第三入口和第三出口，其中所述第三入口和所述第三出口与所述第一管腔流体连通，其中所述第三入口和所述第三出口与在所述第一入口和所述第一出口之间的所述第一电极相交；第四入口和第四出口，其中所述第四入口和所述第四出口与所述第二管腔流体连通，其中所述第四入口和所述第四出口与在所述第二入口和所述第二出口之间的所述第二电极相交；电穿孔区，所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，其中所述电穿孔区具有的长度在0.005mm和50mm(例如，在0.005mm和0.05mm之间、在0.005mm和0.5mm、在0.005mm和25mm之间、在0.01mm和1mm之间、在0.05mm和5mm之间、在0.1mm和10mm之间、在0.1mm和50mm之间、在0.5mm和5mm之间、在0.5mm和25mm之间、在1mm和5mm之间、在1mm和10mm之间、在1mm和25mm之间、在3mm和15mm之间、在3mm和50mm之间、在10mm和20mm之间、在10mm和50mm之间、在15mm和25mm之间、在20mm和30mm之间、在25mm和40之间，或在30mm和50mm之间，例如，约0.005mm、约0.01mm、约0.05mm、约0.1mm、约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、或约50mm)并且包含的最小横截面尺寸大于约100μm(例如，从100μm至10mm、从150μm至15mm、从200μm至10mm、从250μm至5mm、从500μm至10mm、从1mm至10mm、从1mm至50mm、从5mm至25mm、或从20mm至50mm，例如约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约5mm、约10mm、约15mm、约25mm、或约50mm)，其中所述电穿孔区的横向横截面面积是基本上均一的；并且其中所述第一管腔的最小横截面尺寸与所述电穿孔区的最小横截面尺寸的比率在1∶10和10∶1之间(例如，在1∶10和1∶5之间、在1∶10和1∶2之间、在1∶10和1∶1之间、在1∶10和2∶1之间、在1∶10和5∶1之间、在1∶5和1∶2之间、在1∶5和1∶1之间、在1∶5和2∶1之间、在1∶5和5∶1之间、在1∶2和2∶3之间、在1∶2和1∶1之间、在1∶2和2∶1之间、在1∶2和6∶1之间、在2∶3和2∶1之间、在2∶3和4∶1之间、在1∶1和2∶1之间、在1∶1和3∶1之间、在1∶1和10∶1之间、在3∶2和3∶1之间、在3∶2和6∶1之间、在2∶1和3∶1之间、在2∶1和5∶1之间、在5∶2和5∶1之间、在3∶1和4∶1之间、在7∶2和5∶1之间、在7∶2和10∶1之间、在4∶1和8∶1之间、在5∶1和10∶1之间，或在7∶1和10∶1之间，例如，约1∶10、约1∶5、约1∶2、约2∶3、约1∶1、约3∶2、约2∶1、约5∶2、约3∶1、约7∶2、约4∶1、约9∶2、约5∶1、约6∶1、约7∶1、约8∶1、约9∶1或约10∶1)，其中所述第二管腔的最小横截面尺寸与所述电穿孔区的最小横截面尺寸的比率在1∶10和10∶1之间(例如，在1∶10和1∶5之间、在1∶10和1∶2之间、在1∶10和1∶1之间、在1∶10和2∶1之间、在1∶10和5∶1之间、在1∶5和1∶2之间、在1∶5和1∶1之间、在1∶5和2∶1之间、在1∶5和5∶1之间、在1∶2和2∶3之间、在1∶2和1∶1之间、在1∶2和2∶1之间、在1∶2和6∶1之间、在2∶3和2∶1之间、在2∶3和4∶1之间、在1∶1和2∶1之间、在1∶1和3∶1之间、在1∶1和10∶1之间、在3∶2和3∶1之间、在3∶2和6∶1之间、在2∶1和3∶1之间、在2∶1和5∶1之间、在5∶2和5∶1之间、在3∶1和4∶1之间、在7∶2和5∶1之间、在7∶2和10∶1之间、在4∶1和8∶1之间，在5∶1和10∶1之间、或在7∶1和10∶1之间，例如约1∶10、约1∶5、约1∶2、约2∶3、约1∶1、约3∶2、约2∶1、约5∶2、约3∶1、约7∶2、约4∶1、约9∶2、约5∶1、约6∶1、约7∶1、约8∶1、约9∶1、或约10∶1)，并且所述第一出口、所述电穿孔区和所述第二入口流体连通；以及电势源，其中所述装置的所述第一电极和所述第二电极可释放地与所述电势源可操作地接触。所述电穿孔区的横向横截面是选自由以下各项组成的组的封闭形状：圆形、圆盘形、椭圆形、正多边形、不规则多边形、曲线形、星形、平行四边形、梯形和不规则形状。所述电穿孔区可以具有基本上圆形的横向横截面。
在另一个方面，本发明提供了一种用于将组合物电穿孔到悬浮于液体中的多个细胞中的系统，所述体系包括：装置，所述装置包括第一电极，所述第一电极包括第一入口、第一出口和第一管腔；第二电极，所述第二电极包括第二入口、第二出口和第二管腔；第三入口和第三出口，其中所述第三入口和所述第三出口与所述第一管腔流体连通，其中所述第三入口和所述第三出口与在所述第一入口和所述第一出口之间的所述第一电极相交；第四入口和第四出口，其中所述第四入口和所述第四出口与所述第二管腔流体连通，其中所述第四入口和所述第四出口与在所述第二入口和所述第二出口之间的所述第二电极相交；电穿孔区，所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，其中所述电穿孔区具有的长度在0.005mm和50mm(例如，在0.005mm和0.05mm之间、在0.005mm和0.5mm、在0.005mm和25mm之间、在0.01mm和1mm之间、在0.05mm和5mm之间、在0.1mm和10mm之间、在0.1mm和50mm之间、在0.5mm和5mm之间、在0.5mm和25mm之间、在1mm和5mm之间、在1mm和10mm之间、在1mm和25mm之间、在3mm和15mm之间、在3mm和50mm之间、在10mm和20mm之间、在10mm和50mm之间、在15mm和25mm之间、在20mm和30mm之间、在25mm和40之间，或在30mm和50mm之间，例如，约0.005mm、约0.01mm、约0.05mm、约0.1mm、约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、或约50mm)并且包含的最小横截面尺寸大于约100μm(例如，从100μm至10mm、从150μm至15mm、从200μm至10mm、从250μm至5mm、从500μm至10mm、从1mm至10mm、从1mm至50mm、从5mm至25mm、或从20mm至50mm，例如约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约5mm、约10mm、约15mm、约25mm、或约50mm)，其中所述电穿孔区的横向横截面面积是基本上均一的；并且其中所述第一管腔的最小横截面尺寸与所述电穿孔区的最小横截面尺寸的比率在1∶10和10∶1之间(例如，在1∶10和1∶5之间、在1∶10和1∶2之间、在1∶10和1∶1之间、在1∶10和2∶1之间、在1∶10和5∶1之间、在1∶5和1∶2之间、在1∶5和1∶1之间、在1∶5和2∶1之间、在1∶5和5∶1之间、在1∶2和2∶3之间、在1∶2和1∶1之间、在1∶2和2∶1之间、在1∶2和6∶1之间、在2∶3和2∶1之间、在2∶3和4∶1之间、在1∶1和2∶1之间、在1∶1和3∶1之间、在1∶1和10∶1之间、在3∶2和3∶1之间、在3∶2和6∶1之间、在2∶1和3∶1之间、在2∶1和5∶1之间、在5∶2和5∶1之间、在3∶1和4∶1之间、在7∶2和5∶1之间、在7∶2和10∶1之间、在4∶1和8∶1之间、在5∶1和10∶1之间，或在7∶1和10∶1之间，例如，约1∶10、约1∶5、约1∶2、约2∶3、约1∶1、约3∶2、约2∶1、约5∶2、约3∶1、约7∶2、约4∶1、约9∶2、约5∶1、约6∶1、约7∶1、约8∶1、约9∶1，或约10∶1)，其中所述第二管腔的最小横截面尺寸与所述电穿孔区的最小横截面尺寸的比率在1∶10和10∶1之间(例如，在1∶10和1∶5之间、在1∶10和1∶2之间、在1∶10和1∶1之间、在1∶10和2∶1之间、在1∶10和5∶1之间、在1∶5和1∶2之间、在1∶5和1∶1之间、在1∶5和2∶1之间、在1∶5和5∶1之间、在1∶2和2∶3之间、在1∶2和1∶1之间、在1∶2和2∶1之间、在1∶2和6∶1之间、在2∶3和2∶1之间、在2∶3和4∶1之间、在1∶1和2∶1之间、在1∶1和3∶1之间、在1∶1和10∶1之间、在3∶2和3∶1之间、在3∶2和6∶1之间、在2∶1和3∶1之间、在2∶1和5∶1之间、在5∶2和5∶1之间、在3∶1和4∶1之间、在7∶2和5∶1之间、在7∶2和10∶1之间、在4∶1和8∶1之间，在5∶1和10∶1之间、或在7∶1和10∶1之间，例如，约1∶10、约1∶5、约1∶2、约2∶3、约1∶1、约3∶2、约2∶1、约5∶2、约3∶1、约7∶2、约4∶1、约9∶2、约5∶1、约6∶1、约7∶1、约8∶1、约9∶1、或约10∶1)，并且所述第一出口、所述电穿孔区和所述第二入口流体连通；以及电势源，其中所述装置的所述第一电极和所述第二电极可释放地与所述电势源可操作地接触。所述电穿孔区的横向横截面是选自由以下各项组成的组的封闭形状：圆形、圆盘形、椭圆形、正多边形、不规则多边形、曲线形、星形、平行四边形、梯形和不规则形状。所述电穿孔区可以具有基本上圆形的横向横截面。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述电穿孔区具有的最小横截面尺寸在0.1mm和50mm之间(例如，在0.1mm和0.5mm之间、在0.1mm和1mm之间、在0.1mm和5mm之间、在0.1mm和10mm之间、在0.5mm和5mm之间、在1mm和5mm之间、在1mm和10mm之间、在1mm和25mm之间、在3mm和15mm之间、在3mm和50mm之间、在10mm和20mm之间、在10mm和100mm之间、在15mm和30mm之间、在20mm和40mm之间、在20mm和200mm之间、在30mm和50之间、在45mm和60mm之间、在50mm和100mm之间、在75mm和150mm之间、在100mm和200mm之间、在150mm和300mm之间、在200mm和400mm之间、在300mm和450mm之间、或在350mm和500mm之间，例如，约0.1mm、约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约10mm、约15mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、或约50mm)。
在一些实施方案中，所述电穿孔区具有的横向横截面面积在约7,850μm2和约2,000mm2之间(例如，在约8,000μm2和约1mm2之间、在约8,000μm2和约10mm2之间、在约8,000μm2和约100mm2之间、在约9,000μm2和5mm2之间、在约1mm2和约10mm2之间、在约1mm2和约100mm2之间、在约3mm2和约20mm2之间、在约10mm2和约50mm2之间、在约25mm2和约75mm2之间、在约50mm2和约100mm2之间、在约75mm2和约200mm2之间、在约100mm2和约350mm2之间、在约150mm2和约500mm2之间、在约300mm2和约750mm2之间、在约500mm2和约1,000mm2之间、在约750mm2和约1,500mm2之间、或在约950mm2和约2,000mm2之间，例如约8,000μm2、约9,000μm2、约1mm2、约5mm2、约10mm2、约15mm2、约20mm2、约25mm2、约50mm2、约60mm2、约75mm2、约80mm2、约100mm2、约150mm2、约200mm2、约250mm2、约300mm2、约350mm2、约400mm2、约450mm2、约500mm2、约600mm2、约700mm2、约800mm2、约900mm2、约1,000mm2、约1,100mm2、约1,200mm2、约1,300mm2、约1,400mm2、约1,500mm2、约1,600mm2、约1,700mm2、约1,800mm2、约1,900mm2、或约2,000mm2)。
在一些实施方案中，所述电穿孔区具有的长度在0.005mm和50mm之间(例如，在0.005mm和0.05mm之间、在0.005mm和0.5mm之间、在0.005mm和25mm之间、在0.01mm和1mm之间、在0.05mm和5mm之间、在0.1mm和10mm之间、在0.1mm和50mm之间、在0.5mm和5mm之间、在0.5mm和25mm之间、在1mm和5mm之间、在1mm和10mm之间、在1mm和25mm之间、在3mm和15mm之间、在3mm和50mm之间、在10mm和20mm之间、在10mm和50mm之间、在15mm和25mm之间、在20mm和30mm之间、在25mm和40之间、或在30mm和50mm之间，例如，约0.005mm、约0.01mm、约0.05mm、约0.1mm、约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、或约50mm)。在本发明的系统的一些实施方案中，所述电穿孔区的长度在0.005mm和25mm之间(例如，在0.005mm和0.05mm之间、在0.005mm和0.5mm之间、在0.01mm和1mm之间、在0.05mm和5mm之间、在0.1mm和10mm之间、在0.5mm和5mm之间、在0.5mm和10mm之间、在1mm和5mm之间、在1mm和10mm之间、在1mm和25mm之间、在3mm和10mm之间、在7mm和15mm之间、在10mm和20mm、或在15mm和25mm之间，例如，约0.005mm、约0.01mm、约0.05mm、约0.1mm、约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约10mm、约12mm、约15mm、约18mm、约20mm、约23mm、或约25mm)。
在一些实施方案中，所述装置或系统还包括用于细胞转染的多个流体约束空腔，所述流体约束空腔与所述至少一个电穿孔区流体连通，并且其中所述多个细胞经历相似或不同的电场和相似或不同的流速(例如，位移速度)。在一些实施方案中，所述电极可以是具有多个入口和出口的任何构型(例如，歧管)，所述入口和出口在多个非导电流体约束空腔中产生收缩和支持细胞电穿孔。在一些实施方案中，用于细胞电穿孔的所述多个流体约束空腔中的每个都包括单独的壳体(例如，盒)并且可以独立地操作。在一些实施方案中，每个单独的壳体(例如，盒)被构造为暴露于相同或不同的操作参数，所述操作参数控制流速(例如，位移速度)、电场或其他参数的组合。在一些实施方案中，每个壳体被构造为整合进一个或多个控制器系统中。在其他实施方案中，一个或多个控制器系统被构造为容纳一个或多个单独的壳体。
在一些实施方案中，所述装置或系统还包括用于细胞电穿孔的多个流体约束空腔，所述流体约束空腔与所述至少一个电穿孔区流体连通，并且其中所述多个细胞经历相似或不同的电场和相似或不同的流速(例如，位移速度)。在一些实施方案中，所述电极可以是具有多个入口和出口的任何构型(例如，歧管)，所述入口和出口在多个非导电流体约束空腔中产生收缩和支持细胞电穿孔。在一些实施方案中，用于细胞电穿孔的所述多个流体约束空腔中的每个都包括单独的壳体(例如，盒)并且可以独立地操作。在一些实施方案中，每个单独的壳体(例如，盒)被构造为暴露于相同或不同的操作参数，所述操作参数控制流速(例如，位移速度)、电场或其他参数的组合。在一些实施方案中，每个壳体被构造为整合进一个或多个控制器系统中。在其他实施方案中，一个或多个控制器系统被构造为容纳一个或多个单独的壳体。
在一些实施方案中，所述第一电极和/或所述第二电极中的任一者的管腔具有的最小横截面尺寸在0.01mm和500mm之间(例如，在0.01mm和0.1mm之间、在0.01mm和0.5mm之间、在0.01mm和10mm之间、在0.05mm和5mm之间、在0.1mm和10mm之间、在0.5mm和5mm之间、在0.5mm和50mm之间、在1mm和5mm之间、在1mm和10mm之间、在1mm和25mm之间、在3mm和15mm之间、在3mm和50mm之间、在10mm和20mm之间、在10mm和100mm之间、在15mm和30mm之间、在20mm和40mm之间、在20mm和200mm之间、在30mm和50之间、在30mm和300mm之间、在45mm和60mm之间、在50mm和100mm之间、在50mm和500mm之间、在75mm和150mm之间、在75mm和300mm之间、在100mm和200mm之间、在100mm和500mm之间、在150mm和300mm之间、在200mm和400mm之间、在300mm和450mm之间、或在350mm和500mm之间，例如，约0.005mm、约0.01mm、约0.05mm、约0.1mm、约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约10mm、约15mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、约50mm、约60mm、约70mm、约80mm、约90mm、约100mm、约150mm、约200mm、约250mm、约300mm、约350mm、约400mm、约450mm、或约500mm)。
在一些实施方案中，所述第一电极或所述第二电极中的任一者的管腔的最小横截面尺寸与所述电穿孔区的最小横截面尺寸的比率在1∶10和10∶1之间(例如，在1∶10和1∶5之间、在1∶10和1∶2之间、在1∶10和1∶1之间、在1∶10和2∶1之间、在1∶10和5∶1之间、在1∶5和1∶2之间、在1∶5和1∶1之间、在1∶5和2∶1之间、在1∶5和5∶1之间、在1∶2和2∶3之间、在1∶2和1∶1之间、在1∶2和2∶1之间、在1∶2和6∶1之间、在2∶3和2∶1之间、在2∶3和4∶1之间、在1∶1和2∶1之间、在1∶1和3∶1之间、在1∶1和10∶1之间、在3∶2和3∶1之间、在3∶2和6∶1之间、在2∶1和3∶1之间、在2∶1和5∶1之间、在5∶2和5∶1之间、在3∶1和4∶1之间、在7∶2和5∶1之间、在7∶2和10∶1之间、在4∶1和8∶1之间、在5∶1和10∶1、或在7∶1和10∶1之间，例如，约1∶10、约1∶5、约1∶2、约2∶3、约1∶1、约3∶2、约2∶1、约5∶2、约3∶1、约7∶2、约4∶1、约9∶2、约5∶1、约6∶1、约7∶1、约8∶1、约9∶1、或约10∶1)。在一些实施方案中，所述电穿孔区的最小横截面尺寸与所述电穿孔区的长度的比率在1∶100和100∶1之间(例如，在1∶100和1∶50之间、在1∶100和1∶25之间、在1∶100和1∶10之间、在1∶100和1∶1之间、在1∶50和1∶5之间、在1∶50和1∶2之间、在1∶50和2∶1之间、在1∶25和1∶10之间、在1∶25和1∶5之间、在1∶25和1∶1之间、在1∶25和10∶1之间、在1∶10和1∶1之间、在1∶10和2∶1之间、在1∶10和5∶1之间、在1∶10和10∶1之间、在1∶5和1∶2之间、在1∶5和1∶1之间、在1∶5和2∶1之间、在1∶5和50∶1之间、在1∶2和1∶1之间、在1∶2和2∶1之间、在1∶2和10∶1之间、在1∶1和2∶1之间、在1∶1和5∶1之间、在1∶1和10∶1之间、在1∶1和50∶1之间、在1∶1和100∶1之间、在2∶1和5∶1之间、在2∶1和20∶1之间、在2∶1和50∶1之间、在3∶1和10∶1之间、在3∶1和30∶1之间、在4∶1和25∶1之间、在5∶1和10∶1之间、在5∶1和50∶1之间、在10∶1和50∶1之间、在10∶1和100∶1之间、在40∶1和80∶1之间、在50∶1和100∶1之间、或在75∶1和90∶1之间，例如，约1∶100、约1∶75、约1∶50、约1∶25、约1∶10、约1∶5、约1∶2、约1∶1、约3∶2、约2∶1、约5∶2、约3∶1、约7∶2、约4∶1、约5∶1、约6∶1、约7∶1、约8∶1、约9∶1、约10∶1、约15∶1、约20∶1、约25∶1、约30∶1、约40∶1、约50∶1、约60∶1、约70∶1、约80∶1、约90∶1、或约100∶1)。在一些实施方案中，所述第一电极和/或所述第二电极中的任一者的管腔的横向横截面面积与所述电穿孔区的横向横截面面积的比率在1∶100和100∶1之间(例如，在1∶100和1∶50之间、在1∶100和1∶25之间、在1∶100和1∶10之间、在1∶100和1∶1之间、在1∶50和1∶5之间、在1∶50和1∶2之间、在1∶50和2∶1之间、在1∶25和1∶10之间、在1∶25和1∶5之间、在1∶25和1∶1之间、在1∶25和10∶1之间、在1∶10和1∶1之间、在1∶10和2∶1之间、在1∶10和5∶1之间、在1∶10和10∶1之间、在1∶5和1∶2之间、在1∶5和1∶1之间、在1∶5和2∶1之间、在1∶5和50∶1之间、在1∶2和1∶1之间、在1∶2和2∶1之间、在1∶2和10∶1之间、在1∶1和2∶1之间、在1∶1和5∶1之间、在1∶1和10∶1之间、在1∶1和50∶1之间、在1∶1和100∶1之间、在2∶1和5∶1之间、在2∶1和20∶1之间、在2∶1和50∶1之间、在3∶1和10∶1之间、在3∶1和30∶1之间、在4∶1和25∶1之间、在5∶1和10∶1之间、在5∶1和50∶1之间、在10∶1和50∶1之间、在10∶1和100∶1之间、在40∶1和80∶1之间、在50∶1和100∶1之间、或在75∶1和90∶1之间，例如，约1∶100、约1∶75、约1∶50、约1∶25、约1∶10、约1∶5、约1∶2、约1∶1、约3∶2、约2∶1、约5∶2、约3∶1、约7∶2、约4∶1、约5∶1、约6∶1、约7∶1、约8∶1、约9∶1、约10∶1、约15∶1、约20∶1、约25∶1、约30∶1、约40∶1、约50∶1、约60∶1、约70∶1、约80∶1、约90∶1、或约100∶1)。
在一些实施方案中，所述系统还包括与所述第一入口流体连通的第一储集器、与所述第二出口流体连通的第二储集器、与所述第三入口和所述第三出口流体连通的第三储集器、与所述第四入口和所述第四出口流体连通的第四储集器，和/或与所述第一电极或所述第二电极中的任一者的管腔流体连通的第五储集器，例如，其中所述第一电极或所述第二电极中的任一者具有至少一个用于与所述第五储集器流体连通的附加入口。在一些实施方案中，所述系统还包括与所述第一入口流体连通的流体递送源，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。在一些实施方案中，所述装置还包括多个电穿孔区，例如，其中所述多个电穿孔区中的每个具有基本上均一的或不均一的横向横截面面积。
前述任一方面的系统可以另外包括控制器，所述控制器可操作地耦合至所述电势源，以将电压脉冲递送至所述第一电极和所述第二电极，以在所述第一电极和所述第二电极之间产生电势差，从而在所述电穿孔区中产生电场。
在一些实施方案中，所述系统还包括外部结构，所述外部结构包括被构造为包裹所述装置的所述第一电极、所述第二电极和所述至少一个电穿孔区的壳体。所述系统可以另外包括可操作地耦合至所述第一电极的第一电输入和可操作地耦合至所述第二电极的第二电输入。所述壳体可以另外包括热控制器，所述热控制器被构造为增加所述装置和/或其中悬浮有所述多个细胞的所述液体的温度，其中所述热控制器是加热元件，所述加热元件选自由以下各项组成的组：加热块、液体流、电池供电的加热器和薄膜加热器。另外地或可替代地，所述壳体可以另外包括热控制器，所述热控制器被构造为减少所述装置和/或其中悬浮有所述多个细胞的所述液体的温度，其中所述热控制器是冷却元件，所述冷却元件选自由以下各项组成的组：液体流、蒸发冷却器和帕尔贴装置。在一些实施方案中，所述电势源可释放地连接至所述外部结构的所述第一电输入和所述第二电输入，例如，其中在所述第一电输入或所述第二电输入与所述电势源之间的所述可释放连接选自由以下组成的组：钳子、夹子、弹簧、护套、钢丝刷、机械连接、感应连接或它们的组合。所述外部结构和/或壳体可以整合至或可释放地连接至所述装置。
在一些实施方案中，所述系统还包括多个装置，例如，具有多个外部结构。在一些实施方案中，壳体被构造为使多个装置并联地、串联地或在时间上偏移地通电，其中所述壳体还包括容纳多个电穿孔装置的托盘，其中所述托盘被两个栅网电极改装，其中第一栅网电极与第二栅网电极电绝缘，其中所述多个装置中的每个的所述第一电极的外部可释放地与第一弹簧加载的电极、第一机械连接的电极或第一感应连接的电极中的任一者可操作地接触，其中所述多个装置中的每个的所述第二电极的外部可释放地与第二弹簧加载的电极、第二机械连接的电极或第二感应耦合的电极中的任一者可操作地接触，其中所述多个装置中的每个可释放地通过所述栅网电极中的开口进入所述壳体，其中每个装置的所述第一弹簧加载的电极、第一机械连接的电极或第一感应连接的电极中的任一者与所述第一栅网电极可操作地接触，并且每个装置的所述第二弹簧加载的电极、第二机械连接的电极或第二感应连接的电极与所述第二栅网电极可操作地接触，其中所述栅网电极连接至所述电势源。在一些实施方案中，所述电势源将电压脉冲递送至所述栅网电极，其中所述第一栅网电极以特定的施加电压通电，而所述第二栅网电极以特定的施加电压通电，其中所述多个装置中的每个由所述栅网电极以相同的施加电压脉冲通电，以使得在每个装置的至少一个电穿孔区中的每个内产生的电场的大小基本上相等。在一些实施方案中，所述电势源包括附加电路或程序，所述附加电路或程序被构造为调节电压脉冲至所述栅网电极的递送，其中所述多个装置中的每个可接收来自所述栅网电极的不同电压，其中在每个装置的所述至少一个电穿孔区中的每个内产生的电场的大小可以不相等。
在另一个方面，本发明提供一种使用本发明的装置或系统中的任一者来将组合物(例如，通过机电递送)引入悬浮于流动液体中的多个细胞的方法。具体而言，本发明的方法包括提供一种装置，所述装置包括第一电极，所述第一电极包括第一出口、第一入口和具有最小横截面尺寸的第一管腔；第二电极，所述第二电极包括第二出口、第二入口和包含最小横截面尺寸的第二管腔；以及电穿孔区，所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，其中所述电穿孔区具有的最小横截面尺寸大于约100μm(例如，从100μm至10mm、从150μm至15mm、从200μm至10mm、从250μm至5mm、从500μm至10mm、从1mm至10mm、从1mm至50mm、从5mm至25mm、或从20mm至50mm，例如约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约5mm、约10mm、约15mm、约25mm、或约50mm)，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面面积；并且其中所述第一出口、所述电穿孔区和所述第二入口流体连通；在所述第一和第二电极之间施加电势差，从而在所述电穿孔区中产生电场；以及使所述多个细胞和所述组合物通过所述电穿孔区，从而增强所述多个细胞的渗透性，以及将所述组合物引入所述多个细胞中。在一些实施方案中，使所述多个细胞通过包括施加流体驱动的正压。在一些实施方案中，所述第一管腔、第二管腔或电穿孔区均不具有最小横截面尺寸，所述最小横截面尺寸使得悬浮于所述液体中的所述多个细胞中的任一个的横截面尺寸被暂时压缩。所述电穿孔可以是基本上非热可逆电穿孔、基本上非热不可逆电穿孔或基本上热不可逆电穿孔。在一些实施方案中，从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的流速在0.001mL/min和1,000mL/min之间(例如，在0.001mL/min和0.05mL/min之间、在0.001mL/min和0.1mL/min之间、在0.001mL/min和1mL/min之间、在0.05mL/min和0.5mL/min之间、在0.05mL/min和5mL/min之间、在0.1mL/min和1mL/min之间、在0.5mL/min和2mL/min之间、在1mL/min和5mL/min之间、在1mL/min和10mL/min之间、在1mL/min和100mL/min之间、在5mL/min和25mL/min之间、在5mL/min和150mL/min之间、在10mL/min和100mL/min之间、在15mL/min和150mL/min之间、在25mL/min和100mL/min之间、在25mL/min和200mL/min之间、在50mL/min和150mL/min之间、在50mL/min和250mL/min之间、在75mL/min和200mL/min之间、在75mL/min和350mL/min之间、在100mL/min和250mL/min之间、在100mL/min和400mL/min之间、在150mL/min和450mL/min之间、在200mL/min和500mL/min之间、在250mL/min和700mL/min之间、在300mL/min和1,000mL/min之间、在400mL/min和750mL/min之间、在500mL/min和1,000mL/min之间、或在750mL/min和1,000mL/min之间，例如，约0.001mL/min、约0.01mL/min、约0.05mL/min、约0.1mL/min、约0.5mL/min、约1mL/min、约5mL/min、约10mL/min、约15mL/min、约20mL/min、约30mL/min、约40mL/min、约50mL/min、约60mL/min、约70mL/min、约80mL/min、约90mL/min、约100mL/min、约150mL/min、约200mL/min、约250mL/min、约300mL/min、约350mL/min、约400mL/min、约450mL/min、约500mL/min、约600mL/min、约700mL/min、约800mL/min、约900mL/min、或约1,000mL/min)，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。
在前述任一方面的一些实施方案中，从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的雷诺数在0.04和2.43×104之间(例如，在10和2000之间、在100和1600之间、在100和1800之间、或在183和1530之间)，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。在一些实施方案中，从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的最大速度在5×10-5m/s和32.7m/s之间(例如，在0.01和10m/s之间、在0.1和5m/s之间、或在0.26和2.08m/s之间)，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。在一些实施方案中，从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的剪切速率在0.11/s和2×1061/s之间(例如，在1/s和100,000/s之间、在10/s和100,000/s之间、在100/s和100,000/s之间、在1,000/s和80,000/s之间、或在2,600和54,000之间)，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。在一些实施方案中，从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的峰值压力在1×10-3Pa和9.5×104Pa之间(例如，在0.1Pa和10,000Pa之间、在1Pa和5,000Pa之间、在100Pa和3000Pa之间、或在136Pa和1600Pa之间)，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。在一些实施方案中，从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的平均速度在1.5×10-5m/s和15.9m/s之间(例如，在7.79×10-2m/s和7.81×10-1m/s之间)，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。在一些实施方案中，从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的运动粘度在1×10-6m2/s和15×10-4m2/s之间(例如，在1.3×10-6m2/s和5.6×10-4m2/s之间)，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。
在前述任一方面的一些实施方案中，悬浮于所述液体中的所述多个细胞中的任一个在所述电穿孔区中的停留时间在0.5ms和50ms之间(例如，在0.5ms和5ms之间、在1ms和10ms之间、在1ms和15ms之间、在5ms和15ms之间、在10ms和20ms之间、在15ms和25ms之间、在20ms和30ms之间、在25ms和35ms之间、在30ms和40ms之间、在35ms和45ms之间、或在40ms和50ms之间，例如，约0.5ms、约0.6ms、约0.7ms、约0.8ms、约0.9ms、约1ms、约1.5ms、约2ms、约2.5ms、约3ms、约3.5ms、约4ms、约4.5ms、约5ms、约5.5ms、约6ms、约6.5ms、约7ms、约7.5ms、约8ms、约8.5ms、约9ms、约9.5ms、约10ms、约10.5ms、约11ms、约11.5ms、约12ms、约12.5ms、约13ms、约13.5ms、约14ms、约14.5ms、约15ms、约20ms、约25ms、约30ms、约35ms、约40ms、约45ms、或约50ms)。在一些实施方案中，所述停留时间为5-20ms(例如，6-18ms、8-15ms或10-14ms)。
在前述任一方面的一些实施方案中，相对于在离开所述装置的所述第二出口时(例如，在离开所述第二出口后48小时内，例如，在离开所述第二出口后24小时内，例如在离开所述第二出口后1分钟和24小时、5分钟和24小时、10分钟和24小时、30分钟和24小时、1小时和24小时、或2小时和24小时之间)细胞表型的基线测量值而言，所述多个细胞具有从0％至约25％的表型变化(例如，从约0％至约2.5％、从约1％至约5％、从约1％至约10％、从约5％至约15％、从约10％至约20％、从约15％至约25％、或从约20％至约25％，例如，约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、或约25％)。
在前述任一方面的一些实施方案中，相对于在离开所述装置的所述第二出口时(例如，在离开所述第二出口后48小时内，例如，在离开所述第二出口后24小时内，例如，在离开所述第二出口后1分钟和24小时、5分钟和24小时、10分钟和24小时、30分钟和24小时、1小时和24小时、或2小时和24小时之间)细胞表型的基线测量值而言，所述多个细胞无表型变化。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述电场由电压脉冲产生，其中所述电压脉冲以特定的施加电压使所述第一电极通电，同时所述第二电极以特定施加的电压通电，从而在所述第一电极和所述第二电极之间施加电势差，其中所述电压脉冲各自具有的幅度在-3kV和3kV之间(例如，在-3kV和1kV之间、在-3kV和-1.5kV之间、在-2kV和2kV之间、在-1.5kV和1.5kV之间、在-1.5kV和2.5kV之间、在-1kV和1kV之间、在-1kV和2kV之间、在-0.5kV和0.5kV之间、在-0.5kV和1.5kV之间、在-0.5kV和3kV之间、在-0.01kV和2kV之间、在0kV和1kV之间、在0kV和2kV之间、在0kV和3kV之间、在0.01kV和0.1kV之间、在0.01kV和1kV之间、在0.02kV和0.2kV之间、在0.03kV和0.3kV之间、在0.04kV和0.4kV之间、在0.05kV和0.5kV之间、在0.05kV和1.5kV之间、在0.06kV和0.6kV之间、在0.07kV和0.7kV之间、在0.08kV和0.8kV之间、在0.09kV和0.9kV之间、在0.1kV和0.7kV之间、在0.1kV和1kV之间、在0.1kV和2kV之间、在0.1kV和3kV之间、在0.15kV和1.5kV之间、在0.2和0.6kV之间、在0.2kV和2kV之间、在0.25kV和2.5kV之间、在0.3kV和3kV之间、在0.5kV和1kV之间、在0.5kV和3kV之间、在0.6kV和1.5kV之间、在0.7kV和1.8kV之间、在0.8kV和2kV之间、在0.9kV和3kV之间、在1kV和2kV之间、在1.5kV和2.5kV之间、或在2kV和3kV之间，例如，约-3kV、约-2.5kV、约-2kV、约-1.5kV、约-1kV、约-0.5kV、约-0.01kV、约0kV、约0.01kV、约0.02kV、约0.03kV、约0.04kV、约0.05kV、约0.06kV、约0.07kV、约0.08kV、约0.09kV、约0.1kV、约0.2kV、约0.3kV、约0.4kV、约0.5kV、约0.6kV、约0.7kV、约0.8kV、约0.9kV、约1kV、约1.1kV、约1.2kV、约1.3kV、约1.4kV、约1.5kV、约1.6kV、约1.7kV、约1.8kV、约1.9kV、约2kV、约2.1kV、约2.2kV、约2.3kV、约2.4kV、约2.5kV、约2.6kV、约2.7kV、约2.8kV、约2.9kV、或约3kV)。在一些实施方案中，所述第一电极以特定的施加电压通电，同时所述第二电极保持接地(例如，0kV)，从而在所述第一电极和所述第二电极之间施加电势差。在一些实施方案中，所述电压脉冲具有的持续时间在0.01ms和1,000ms之间(例如，在0.01ms和0.1ms之间、在0.01ms和1ms之间、在0.01ms和10ms之间、在0.05ms和0.5ms之间、在0.05ms和1ms之间、在0.1ms和1ms之间、在0.1ms和5ms之间、在0.1ms和500ms之间、在0.5ms和2ms之间、在1ms和5ms之间、在1ms和10ms之间、在1ms和25ms之间、在1ms和100ms之间、在1ms和1,000ms之间、在5ms和25ms之间、在5ms和150ms之间、在10ms和100ms之间、在15ms和150ms之间、在25ms和100ms之间、在25ms和200ms之间、在50ms和150ms之间、在50ms和250ms之间、在75ms和200ms之间、在75ms和350ms之间、在100ms和250ms之间、在100ms和400ms之间、在150ms和450ms之间、在200ms和500ms之间、在250ms和700ms之间、在300ms和1,000ms之间、在400ms和750ms之间、在500ms和1,000ms、或在750ms和1,000ms之间，例如，约0.01ms、约0.05ms、约0.1ms、约0.5ms、约1ms、约5ms、约10ms、约15ms、约20ms、约30ms、约40ms、约50ms、约60ms、约70ms、约80ms、约90ms、约100ms、约150ms、约200ms、约250ms、约300ms、约350ms、约400ms、约450ms、约500ms、约600ms、约700ms、约800ms、约900ms、或约1,000ms)。在一些实施方案中，所述电压脉冲以在1Hz和50,000Hz之间的频率施加于所述第一电极和所述第二电极(例如，在1Hz和10Hz之间、在1Hz和100Hz之间、在1Hz和1,000Hz之间、在5Hz和20Hz之间、在5Hz和2,000Hz之间、在10Hz和50Hz之间、在10Hz和100Hz之间、在10Hz和1,000Hz之间、在10Hz和10,000Hz之间、在20Hz和50Hz之间、在20Hz和100Hz之间、在20Hz和2,000Hz之间、在20Hz和20,000Hz之间、在50Hz和500Hz之间、在50Hz和1,000Hz之间、在50Hz和50,000Hz之间、在100Hz和200Hz之间、在100Hz和500Hz之间、在100Hz和1,000Hz之间、在100Hz和10,000Hz之间、在100Hz和50,000Hz之间、在200Hz和400Hz之间、在200Hz和750Hz之间、在200Hz和2,000Hz之间、在500Hz和1,000Hz之间、在750Hz和1,500Hz之间、在750Hz和10,000Hz之间、在1,000Hz和2,000Hz之间、在1,000Hz和5,000Hz之间、在1,000Hz和10,000Hz之间、在1,000Hz和50,000Hz之间、在5,000Hz和10,000Hz之间、在5,000Hz和20,000Hz之间、在5,000Hz和50,000Hz之间、在10,000Hz和15,000Hz之间、在10,000Hz和25,000Hz之间、在10,000Hz和50,000Hz之间、在20,000Hz和30,000Hz之间、或在20,000和50,000Hz之间，例如，约1Hz、约5Hz、约10Hz、约20Hz、约50Hz、约75Hz、约100Hz、约150Hz、约200Hz、约300Hz、约400Hz、约500Hz、约600Hz、约700Hz、约800Hz、约900Hz、约1,000Hz、约2,000Hz、约5,000Hz、约10,000Hz、约15,000Hz、约20,000Hz、约30,000Hz、约40,000Hz或约50,000Hz)。
在一些实施方案中，所述电压脉冲的波形选自由以下各项组成的组：DC波形、方波波形、脉冲波形、双极波形、正弦波形、斜坡波形、不对称双极波形、任意波形以及它们的任何叠加或组合。在一些实施方案中，由所述电压脉冲产生的所述电场具有的大小在1V/cm和50,000V/cm之间(例如，在1V/cm和50V/cm之间、在1V/cm和500V/cm之间、在1V/cm和1,000V/cm之间、在1V/cm和20,000V/cm之间、在5V/cm和10,000V/cm之间、在25V/cm和200V/cm之间、在50V/cm和250V/cm之间、在50V/cm和500V/cm之间、在50V/cm和15,000V/cm之间、在100V/cm和1,000V/cm之间、在300V/cm和500V/cm之间、在500V/cm和10,000V/cm之间、在1000V/cm和25,000V/cm之间、在5,000V/cm和25,000V/cm之间、在10,000V/cm和20,000V/cm之间、在10,000V/cm和50,000V/cm之间，例如，约1V/cm、约2V/cm、约3V/cm、约4V/cm、约5V/cm、约6V/cm、约7V/cm、约8V/cm、约9V/cm、约10V/cm、约20V/cm、约30V/cm、约40V/cm、约50V/cm、约60V/cm、约70V/cm、约80V/cm、约90V/cm、约100V/cm、约150V/cm、约200V/cm、约250V/cm、约300V/cm、约350V/cm、约400V/cm、约450V/cm、约500V/cm、约550V/cm、约600V/cm、约650V/cm、约700V/cm、约750V/cm、约800V/cm、约900V/cm、约1,000V/cm、约2,000V/cm、约3,000V/cm、约4,000V/cm、约5,000V/cm、约6,000V/cm、约7,000V/cm、约8,000V/cm、约9,000V/cm、约10,000V/cm、约15,000V/cm、约20,000V/cm、约25,000V/cm、约30,000V/cm、约35,000V/cm、约40,000V/cm、约45,000V/cm、或约50,000V/cm)。
在一些实施方案中，所述电压脉冲的占空比在0.001％和100％之间(例如，在0.001％和0.1％之间、在0.001％和10％之间、在0.01％和1％之间、在0.01％至100％之间、在0.1％和5％之间、在0.1％和99％之间、在1％和10％之间、在1％和97％之间、在2.5％和20％之间、在5％和25％之间、在5％和40％之间、在10％和25％之间、在10％和50％之间、在10％和95％之间、在15％和60％之间、在15％和85％之间、在20％和40％之间、在30％和50％之间、在40％和60％之间、在40％和75％之间、在50％和85％之间、在50％和100％之间、在75％和100％、或在90％和100％之间，例如，约0.001％、约0.002％、约0.003％、约0.004％、约0.005％、约0.006％、约0.007％、约0.008％、约0.009％、约0.01％、约0.02％、约0.03％、约0.04％、约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或约100％)。
在一些实施方案中，所述液体具有的电导率在0.001mS/cm和500mS/cm之间(例如，在0.001mS/cm和0.05mS/cm之间、在0.001mS/cm和0.1mS/cm之间、在0.001mS/cm和1mS/cm之间、在0.05mS/cm和0.5mS/cm之间、在0.05mS/cm和5mS/cm之间、在0.1mS/cm和1mS/cm之间、在0.1mS/cm和100mS/cm之间、在0.5mS/cm和2mS/cm之间、在1mS/cm和5mS/cm之间、在1mS/cm和10mS/cm之间、在1mS/cm和100mS/cm之间、在1mS/cm和500mS/cm之间、在5mS/cm和25mS/cm之间、在5mS/cm和150mS/cm之间、在10mS/cm和100mS/cm之间、在10mS/cm和250mS/cm之间、在15mS/cm和150mS/cm之间、在25mS/cm和100mS/cm之间、在25mS/cm和200mS/cm之间、在50mS/cm和150mS/cm之间、在50mS/cm和250mS/cm之间、在50mS/cm和500mS/cm之间、在75mS/cm和200mS/cm之间、在75mS/cm和350mS/cm之间、在100mS/cm和250mS/cm之间、在100mS/cm和400mS/cm之间、在100mS/cm和500mS/cm之间、在150mS/cm和450mS/cm之间、在200mS/cm和500mS/cm之间、在300mS/cm和500mS/cm之间，例如，约0.001mS/cm、约0.01mS/cm、约0.05mS/cm、约0.1mS/cm、约0.5mS/cm、约1mS/cm、约5mS/cm、约10mS/cm、约15mS/cm、约20mS/cm、约30mS/cm、约40mS/cm、约50mS/cm、约60mS/cm、约70mS/cm、约80mS/cm、约90mS/cm、约100mS/cm、约150mS/cm、约200mS/cm、约250mS/cm、约300mS/cm、约350mS/cm、约400mS/cm、约450mS/cm、或约500mS/cm)。
在一些实施方案中，悬浮于所述液体中的所述多个细胞的温度在0℃和50℃之间(在0℃和5℃之间、在2℃和15℃之间、在3℃和30℃之间、在4℃和10℃之间、在4℃和25℃之间、在5℃和30℃之间、在7℃和35℃之间、在10℃和25℃之间、在10℃和40℃之间、在15℃和50℃之间、在20℃和40℃之间、在25°和50℃之间、或在35℃和45℃之间，例如，约0℃、约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、或约50℃)。
在一些实施方案中，所述方法还包括在穿孔后将悬浮于所述液体中的所述多个细胞储存于回收缓冲液中。在一些实施方案中，在所述组合物的引入后，所述细胞具有的活力在0.1％和99.9％之间(例如，在0.1％和5％之间、在1％和10％之间、在2.5％和20％之间、在5％和40％之间、在10％和30％之间、在10％和60％之间、在10％和90％之间、在25％和40％之间、在25％和85％之间、在30％和50％之间、在30％和80％之间、在40％和65％之间、在50％和75％之间、在50％和99.9％之间、在60％和80％之间、在75％和99.9％之间、或在85％和99.9％之间，例如，约0.1％、约0.15％、约0.2％、约0.25％、约0.3％、约0.35％、约0.4％、约0.45％、约0.5％、约0.55％、约0.6％、约0.65％、约0.7％、约0.75％、约0.8％、约0.85％、约0.9％、约0.95％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或约99.9％)。
在一些实施方案中，将所述组合物以在0.1％和99.9％之间(例如，在0.1％和5％之间、在1％和10％之间、在2.5％和20％之间、在5％和40％之间、在10％和30％之间、在10％和60％之间、在10％和90％之间、在25％和40％之间、在25％和85％之间、在30％和50％之间、在30％和80％之间、在40％和65％之间、在50％和75％之间、在50％和99.9％之间、在60％和80％之间、在75％和99.9％之间、或在85％和99.9％之间，例如，约0.1％、约0.15％、约0.2％、约0.25％、约0.3％、约0.35％、约0.4％、约0.45％、约0.5％、约0.55％、约0.6％、约0.65％、约0.7％、约0.75％、约0.8％、约0.85％、约0.9％、约0.95％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％，或约99.9％)的效率引入多个所述细胞中。
在一些实施方案中，本发明的方法中的任一者产生的细胞回收数在104个细胞和1012个细胞之间(例如，在104个细胞和105个细胞之间、在104个细胞和106个细胞之间、在104个细胞和107个细胞之间、在5×104个细胞和5×105个细胞之间、在105个细胞和106个细胞之间、在105个细胞和107个细胞之间、在105个细胞和1010个细胞之间、在2.5×105个细胞和106个细胞之间、在5×105个细胞和5×106个细胞之间、在106个细胞和107个细胞之间、在106个细胞和108个细胞之间、在106个细胞和1012个细胞之间、在5×106个细胞和5×107个细胞之间、在107个细胞和108个细胞之间、在107个细胞和109个细胞之间、在107个细胞和1012个细胞之间、在5×107个细胞和5×108个细胞之间、在108个细胞和109个细胞之间、在108个细胞和1010个细胞之间、在108个细胞和1012个细胞之间、在5×108个细胞和5×109个细胞之间、在109个细胞和1010个细胞之间、在109个细胞和1011个细胞之间、在1010个细胞和1011个细胞之间、在1010个细胞和1012个细胞之间，或在1011个细胞和1012个细胞之间，例如，约104个细胞、约2.5×104个细胞、约5×104个细胞、约105个细胞、约2.5×105个细胞、约5×105个细胞、约106个细胞、约2.5×106个细胞、约5×106个细胞、约107个细胞、约2.5×107个细胞、约5×107个细胞、约108个细胞、约2.5×108个细胞、约5×108个细胞、约109个细胞、约2.5×109个细胞、约5×109个细胞、约1010个细胞、约5×1010个细胞、约1011个细胞、或约1012个细胞)。
在一些实施方案中，所述方法产生的细胞回收率在0.1％和100％之间(例如，在0.1％和5％之间、在1％和10％之间、在2.5％和20％之间、在5％和40％之间、在10％和30％之间、在10％和60％之间、在10％和90％之间、在25％和40％之间、在25％和85％之间、在30％和50％之间、在30％和80％之间、在40％和65％之间、在50％和75％之间、在50％和100％之间、在60％和80％之间、在75％和100％之间、在85％和100％之间，例如，约0.1％、约0.15％、约0.2％、约0.25％、约0.3％、约0.35％、约0.4％、约0.45％、约0.5％、约0.55％、约0.6％、约0.65％、约0.7％、约0.75％、约0.8％、约0.85％、约0.9％、约0.95％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或约100％)。在一些实施方案中，所述方法产生的活的经工程化的细胞的收率(例如，回收收率)在0.1％和500％之间(例如，在0.1％和5％之间、在1％和10％之间、在2.5％和20％之间、在5％和40％之间、在10％和30％之间、在10％和60％之间、在10％和90％之间、在25％和40％之间、在25％和85％之间、在30％和50％之间、在30％和80％之间、在40％和65％之间、在50％和75％之间、在50％和100％之间、在60％和80％之间、在60％和150％之间、在75％和100％之间、在75％和200％之间、在85％和150％之间、在90％和250％之间、在100％和200％之间、在100％和400％之间、在150％和300％之间、在200％和500％之间，或在300％和500％之间，例如，约0.1％、约0.15％、约0.2％、约0.25％、约0.3％、约0.35％、约0.4％、约0.45％、约0.5％、约0.55％、约0.6％、约0.65％、约0.7％、约0.75％、约0.8％、约0.85％、约0.9％、约0.95％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、约100％、约150％、约200％、约210％、约220％、约230％、约240％、约250％、约260％、约270％、约280％、约290％、约300％、约310％、约320％、约330％、约340％、约350％、约360％、约370％、约380％、约390％、约400％、约410％、约420％、约430％、约440％、约450％、约460％、约470％、约480％、约490％、或约500％)。
在一些实施方案中，递送至所述多个细胞(例如，机电递送至所述多个细胞)的所述组合物包含至少一种选自由以下各项组成的组的化合物：治疗剂、维生素、纳米颗粒、带电的分子、不带电的分子、经工程化的核酸酶、DNA、RNA、CRISPR-Cas复合物、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、归巢核酸酶、大范围核酸酶(MN)、大范围TAL、酶、转座子、肽、蛋白质、病毒、聚合物、核糖核蛋白(RNP)和多糖。在一些实施方案中，所述组合物具有的在所述液体中的浓度在0.0001μg/mL和1,000μg/mL之间(例如，从约0.0001μg/mL至约0.001μg/mL、约0.001μg/mL至约0.01μg/mL、约0.001μg/mL至约5μg/mL、约0.005μg/mL至约0.1μg/mL、约0.01μg/mL至约0.1μg/mL、约0.01μg/mL至约1μg/mL、约0.1μg/mL至约1μg/mL、约0.1μg/mL至约5μg/mL、约1μg/mL至约10μg/mL、约1μg/mL至约50μg/mL、约1μg/mL至约100μg/mL、约2.5μg/mL至约15μg/mL、约5μg/mL至约25μg/mL、约5μg/mL至约50μg/mL、约5μg/mL至约500μg/mL、约7.5μg/mL至约75μg/mL、约10μg/mL至约100μg/mL、约10μg/mL至约1,000μg/mL、约25μg/mL至约50μg/mL、约25μg/mL至约250μg/mL、约25μg/mL至约500μg/mL、约50μg/mL至约100μg/mL、约50μg/mL至约250μg/mL、约50μg/mL至约750μg/mL、约100μg/mL至约300μg/mL、约100μg/mL至约1,000μg/mL、约200μg/mL至约400μg/mL、约250μg/mL至约500μg/mL、约350μg/mL至约500μg/mL、约400μg/mL至约1,000μg/mL、约500μg/mL至约750μg/mL、约650μg/mL至约1,000μg/mL、或约800μg/mL至约1,000μg/mL，例如，约0.0001μg/mL、约0.0005μg/mL、约0.001μg/mL、约0.005μg/mL、约0.01μg/mL、约0.02μg/mL、约0.03μg/mL、约0.04μg/mL、约0.05μg/mL、约0.06μg/mL、约0.07μg/mL、约0.08μg/mL、约0.09μg/mL、约0.1μg/mL、约0.2μg/mL、约0.3μg/mL、约0.4μg/mL、约0.5μg/mL、约0.6μg/mL、约0.7μg/mL、约0.8μg/mL、约0.9μg/mL、约1μg/mL、约1.5μg/mL、约2μg/mL、约2.5μg/mL、约3μg/mL、约3.5μg/mL、约4μg/mL、约4.5μg/mL、约5μg/mL、约5.5μg/mL、约6μg/mL、约6.5μg/mL、约7μg/mL、约7.5μg/mL、约8μg/mL、约8.5μg/mL、约9μg/mL、约9.5μg/mL、约10μg/mL、约15μg/mL、约20μg/mL、约25μg/mL、约30μg/mL、约35μg/mL、约40μg/mL、约45μg/mL、约50μg/mL、约55μg/mL、约60μg/mL、约65μg/mL、约70μg/mL、约75μg/mL、约80μg/mL、约85μg/mL、约90μg/mL、约95μg/mL、约100μg/mL、约200μg/mL、约250μg/mL、约300μg/mL、约350μg/mL、约400μg/mL、约450μg/mL、约500μg/mL、约550μg/mL、约600μg/mL、约650μg/mL、约700μg/mL、约750μg/mL、约800μg/mL、约850μg/mL、约900μg/mL、约950μg/mL、或约1,000μg/mL)。
在前述任一方面的一些实施方案中，悬浮于所述液体中的所述多个细胞包括真核细胞(例如，动物细胞，例如，人细胞)、原核细胞(例如，细菌细胞)、植物细胞和/或合成细胞。所述细胞可以是原代细胞(例如，原代人细胞)、来自细胞系(例如，人细胞系)的细胞、悬浮中的细胞、贴壁细胞、干细胞、血细胞(例如，外周血单核细胞(PBMC))和/或免疫细胞(例如，白细胞(例如，先天免疫细胞或适应性免疫细胞))。在一些实施方案中，所述细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞或抗原呈递细胞)是未刺激的细胞、刺激的细胞或活化的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是适应性免疫细胞和/或先天免疫细胞。在一些实施方案中，所述多个细胞包括抗原呈递细胞(APC)、单核细胞、T细胞、B细胞、树突细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞、Jurkat细胞、THP-1细胞、人胚肾(HEK-293)细胞、中国仓鼠卵巢(例如，CHO-K1)细胞、胚胎干细胞(ESC)、间充质干细胞(MSC)或造血干细胞(HSC)。在一些实施方案中，所述细胞可以是原代人T细胞、原代人巨噬细胞、原代人单核细胞、原代人NK细胞或原代人诱导性多能干(iPSC)。在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，所述方法还包括在穿孔后将悬浮于所述液体中的所述多个细胞储存于回收缓冲液中。
在另一个方面，本发明提供一种套件，所述套件包括本文所述的装置或系统中的任一者。例如，在一个方面，本发明提供了一种用于将组合物机电递送到悬浮于液体中的多个细胞中的套件，其中所述套件包括多个装置，所述多个装置中的每个包括：第一电极，所述第一电极包括第一出口、第一入口和具有最小横截面尺寸的第一管腔；第二电极，所述第二电极包括第二出口、第二入口和包含最小横截面尺寸的第二管腔；以及电穿孔区，所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，其中所述电穿孔区具有的最小横截面尺寸大于约100μm(例如，从100μm至10mm、从150μm至15mm、从200μm至10mm、从250μm至5mm、从500μm至10mm、从1mm至10mm、从1mm至50mm、从5mm至25mm、或从20mm至50mm，例如约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约5mm、约7mm、约10mm、约15mm、约25mm、或约50mm)，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面面积，其中对所述第一电极和所述第二电极施加电势差在所述电穿孔区中产生电场。以及多个外部结构，所述外部结构被构造为包裹所述多个装置，其中所述多个外部结构中的每个包括：壳体，所述壳体被构造为包裹所述至少一个装置的所述第一电极、第二电极和所述电穿孔区；第一电输入，所述第一电输入可操作地耦合至所述第一电极；以及第二电输入，所述第二电输入可操作地耦合至所述第二电极。在一些实施方案中，所述多个外部结构整合至所述多个装置。在一些实施方案中，所述多个外部结构可释放地连接至所述多个装置。在一些实施方案中，所述壳体还包括热控制器，所述热控制器被构造为增加所述至少一个装置的温度，其中所述热控制器是加热元件，所述加热元件选自由以下各项组成的组：加热块、液体流、电池供电的加热器和薄膜加热器。在一些实施方案中，所述壳体还包括热控制器，所述热控制器被构造为减少所述至少一个装置的温度，其中所述热控制器是冷却元件，所述冷却元件选自由以下各项组成的组：液体流、蒸发冷却器和帕尔贴装置。
在另一个方面，本发明提供了一种用于将组合物电穿孔到悬浮于液体中的多个细胞中的套件，其中所述套件包括多个装置，所述多个装置中的每个包括：第一电极，所述第一电极包括第一出口、第一入口和具有最小横截面尺寸的第一管腔；第二电极，所述第二电极包括第二出口、第二入口和包含最小横截面尺寸的第二管腔；以及电穿孔区，所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，其中所述电穿孔区具有的最小横截面尺寸大于约100μm(例如，从100μm至10mm、从150μm至15mm、从200μm至10mm、从250μm至5mm、从500μm至10mm、从1mm至10mm、从1mm至50mm、从5mm至25mm、或从20mm至50mm，例如约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约5mm、约7mm、约10mm、约15mm、约25mm、或约50mm)，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面面积，其中对所述第一电极和所述第二电极施加电势差在所述电穿孔区中产生电场。以及多个外部结构，所述外部结构被构造为包裹所述多个装置，其中所述多个外部结构中的每个包括：壳体，所述壳体被构造为包裹所述至少一个装置的所述第一电极、第二电极和所述电穿孔区；第一电输入，所述第一电输入可操作地耦合至所述第一电极；以及第二电输入，所述第二电输入可操作地耦合至所述第二电极。在一些实施方案中，所述多个外部结构整合至所述多个装置。在一些实施方案中，所述多个外部结构可释放地连接至所述多个装置。在一些实施方案中，所述壳体还包括热控制器，所述热控制器被构造为增加所述至少一个装置的温度，其中所述热控制器是加热元件，所述加热元件选自由以下各项组成的组：加热块、液体流、电池供电的加热器和薄膜加热器。在一些实施方案中，所述壳体还包括热控制器，所述热控制器被构造为减少所述至少一个装置的温度，其中所述热控制器是冷却元件，所述冷却元件选自由以下各项组成的组：液体流、蒸发冷却器和帕尔贴装置。
在另一个方面，本发明提供了一种用于将组合物机电递送到悬浮于液体中的多个细胞中的套件，所述套件包括：多个装置，所述多个装置中的每个包括前述实施方案的装置；以及多个外部结构，所述外部结构被构造为包裹所述多个装置，其中所述多个外部结构中的每个包括：壳体，所述壳体被构造为包裹所述至少一个装置的所述第一电极、第二电极和所述电穿孔区；第一电输入，所述第一电输入可操作地耦合至所述第一电极；以及第二电输入，所述第二电输入可操作地耦合至所述第二电极。在一些实施方案中，所述多个外部结构整合至所述多个装置。在一些实施方案中，所述多个外部结构可释放地连接至所述多个装置。在一些实施方案中，所述壳体还包括热控制器，所述热控制器被构造为增加所述至少一个装置的温度，其中所述热控制器是加热元件，所述加热元件选自由以下各项组成的组：加热块、液体流、电池供电的加热器和薄膜加热器。在一些实施方案中，所述壳体还包括热控制器，所述热控制器被构造为减少所述至少一个装置的温度，其中所述热控制器是冷却元件，所述冷却元件选自由以下各项组成的组：液体流、蒸发冷却器和帕尔贴装置。
在另一个方面，本发明提供了一种用于将组合物电穿孔到悬浮于液体中的多个细胞中的套件，所述套件包括：多个装置，所述多个装置中的每个包括前述实施方案的装置；以及多个外部结构，所述外部结构被构造为包裹所述多个装置，其中所述多个外部结构中的每个包括：壳体，所述壳体被构造为包裹所述至少一个装置的所述第一电极、第二电极和所述电穿孔区；第一电输入，所述第一电输入可操作地耦合至所述第一电极；以及第二电输入，所述第二电输入可操作地耦合至所述第二电极。在一些实施方案中，所述多个外部结构整合至所述多个装置。在一些实施方案中，所述多个外部结构可释放地连接至所述多个装置。在一些实施方案中，所述壳体还包括热控制器，所述热控制器被构造为增加所述至少一个装置的温度，其中所述热控制器是加热元件，所述加热元件选自由以下各项组成的组：加热块、液体流、电池供电的加热器和薄膜加热器。在一些实施方案中，所述壳体还包括热控制器，所述热控制器被构造为减少所述至少一个装置的温度，其中所述热控制器是冷却元件，所述冷却元件选自由以下各项组成的组：液体流、蒸发冷却器和帕尔贴装置。
在另一个方面，本发明提供了一种用于将组合物机电递送到悬浮于流体中的多个细胞中的装置，其中所述装置包括：第一电极，所述第一电极具有第一入口和第一出口，其中所述第一电极的管腔限定进入区；第二电极，所述第二电极具有第二入口和第二出口，其中所述第二电极的管腔限定回收区；以及电穿孔区，其中所述电穿孔区与所述第一电极的所述第一出口和所述第二电极的所述第二入口流体连接，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面尺寸，并且其中将电势差施加于所述第一电极和所述第二电极时在所述电穿孔区中产生电场。在所述装置中，悬浮于所述流体中的所述多个细胞在进入所述电穿孔区后被电穿孔。
在另一个方面，本发明提供了一种用于将组合物电穿孔到悬浮于流体中的多个细胞中的装置，其中所述装置包括：第一电极，所述第一电极具有第一入口和第一出口，其中所述第一电极的管腔限定进入区；第二电极，所述第二电极具有第二入口和第二出口，其中所述第二电极的管腔限定回收区；以及电穿孔区，其中所述电穿孔区与所述第一电极的所述第一出口和所述第二电极的所述第二入口流体连接，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面尺寸，并且其中将电势差施加于所述第一电极和所述第二电极时在所述电穿孔区中产生电场。在所述装置中，悬浮于所述流体中的所述多个细胞在进入所述电穿孔区后被电穿孔。
在前述任一方法的一些实施方案中，所述套件还包括一个或多个与所述装置的区流体连接的储集器，例如第一储集器和第二储集器，所述区是例如所述进入区或回收区。例如，第一储集器可以与所述进入区流体连接，并且第二储集器可以与所述回收区流体连接。
在某些实施方案中，所述电穿孔区的横截面选自由以下各项组成的组：圆柱体、椭圆形、多边形、星形、平行四边形、梯形和不规则形状。
在一些情况下，所述进入区的横截面尺寸或所述回收区的横截面尺寸在所述电穿孔区的横截面尺寸的0.01％至100,000％之间。例如，所述进入区的横截面尺寸或所述回收区的横截面尺寸可以为所述电穿孔区的横截面尺寸的约0.01％至约1000％，例如，所述电穿孔区的横截面尺寸的约0.01％至约1％、约0.1％至约10％、约5％至约25％、约10％至约50％、约10％至约1000％、约25％至约75％、约25％至约750％、或约50％至约1000％。或者，所述进入区的横截面尺寸或所述回收区的横截面尺寸可以是所述电穿孔区的横截面尺寸的约100％至约100,000％，例如，所述电穿孔区的横截面尺寸的约100％至约1000％、约500％至约5,000％、约1,000％至约10,000％、约5,000％至约25,000％、约10,000％至约50,000％、约25,000％至约75,000％、或约50,000％至约100,000％。
在一些实施方案中，所述电穿孔区的横截面尺寸在0.005mm和50mm之间。在一些实施方案中，所述电穿孔区的长度在0.005mm和50mm之间。在特定实施方案中，所述电穿孔区的长度在0.005mm和25mm之间。在一些实施方案中，所述第一电极或所述第二电极中的任一者的横截面尺寸在0.1mm至500mm之间。在特定实施方案中，所述进入区、回收区或电穿孔区中的任一者都不会减小悬浮于流体中的所述多个细胞中的任一者的横截面尺寸，例如，细胞可以通过所述装置而不变形。
在一些实施方案中，相对于在离开所述电穿孔区时细胞表型的基线测量值而言，所述多个细胞具有从0％至约25％的表型变化。在一些实施方案中，所述多个细胞在离开所述电穿孔区时无表型变化。
在另外的实施方案中，所述装置包括具有壳体的外部结构，所述壳体被构造为包裹所述装置的所述第一电极、第二电极和所述电穿孔区。在一些实施方案中，所述外部结构整合至所述装置。在某些实施方案中，所述外部结构可释放地连接至所述装置。
在另一个方面，本发明提供了一种用于将组合物机电递送到悬浮于流体中的多个细胞中的装置，其中所述装置包括：第一电极，所述第一电极具有第一入口和第一出口，其中所述第一电极的管腔限定进入区；第二电极，所述第二电极具有第二入口和第二出口，其中所述第二电极的管腔限定回收区；第三入口和第三出口，其中所述第三入口和所述第三出口与在所述第一入口和所述第一出口之间的所述第一电极相交；第四入口和第四出口，其中所述第四入口和所述第四出口与在所述第二入口和所述第二出口之间的所述第二电极相交；以及电穿孔区，其中所述电穿孔区与所述第一电极的所述第一出口和所述第二电极的所述第二入口流体连接，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面尺寸，并且其中将电势差施加于所述第一电极和所述第二电极时在所述电穿孔区中产生电场。在所述装置中，悬浮于所述流体中的所述多个细胞在进入所述电穿孔区后被转染。
在另一个方面，本发明提供了一种用于将组合物电穿孔到悬浮于流体中的多个细胞中的装置，其中所述装置包括：第一电极，所述第一电极具有第一入口和第一出口，其中所述第一电极的管腔限定进入区；第二电极，所述第二电极具有第二入口和第二出口，其中所述第二电极的管腔限定回收区；第三入口和第三出口，其中所述第三入口和所述第三出口与在所述第一入口和所述第一出口之间的所述第一电极相交；第四入口和第四出口，其中所述第四入口和所述第四出口与在所述第二入口和所述第二出口之间的所述第二电极相交；以及电穿孔区，其中所述电穿孔区与所述第一电极的所述第一出口和所述第二电极的所述第二入口流体连接，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面尺寸，并且其中将电势差施加于所述第一电极和所述第二电极时在所述电穿孔区中产生电场。在所述装置中，悬浮于所述流体中的所述多个细胞在进入所述电穿孔区后被转染。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述装置还包括一个或多个与所述装置的区(例如，进入区或回收区)流体连接的储集器，例如第一储集器和第二储集器。例如，第一储集器可以与所述进入区流体连接，并且第二储集器可以与所述回收区流体连接。在特定实施方案中，所述装置包括与所述第三入口和所述第三出口流体连接的第三储集器和与所述第四入口和所述第四出口流体连接的第四储集器。
在某些实施方案中，所述电穿孔区的横截面选自由以下各项组成的组：圆柱体、椭圆形、多边形、星形、平行四边形、梯形和不规则形状。
在一些实施方案中，所述进入区的横截面尺寸或所述回收区的横截面尺寸在所述电穿孔区的横截面尺寸的0.01％至100,000％之间。例如，所述进入区的横截面尺寸或所述回收区的横截面尺寸可以为所述电穿孔区的横截面尺寸的约0.01％至约1,000％，例如，所述电穿孔区的横截面尺寸的约0.01％至约1％、约0.1％至约10％、约5％至约25％、约10％至约50％、约10％至约1,000％、约25％至约75％、约25％至约750％、或约50％至约100％。或者，所述进入区的横截面尺寸或所述回收区的横截面尺寸可以是所述电穿孔区的横截面尺寸的约100％至约100,000％，例如，所述电穿孔区的横截面尺寸的约100％至约1000％、约500％至约5,000％、约1,000％至约10,000％、约5,000％至约25,000％、约10,000％至约50,000％、约25,000％至约75,000％、或约50,000％至约100,000％。
在一些实施方案中，所述电穿孔区的横截面尺寸在0.005mm和50mm之间。在一些实施方案中，所述电穿孔区的长度在0.005mm和50mm之间。在特定实施方案中，所述电穿孔区的长度在0.005mm和25mm之间。在一些实施方案中，所述第一电极或所述第二电极中的任一者的横截面尺寸在0.1mm至500mm之间。在特定实施方案中，所述进入区、回收区或电穿孔区中的任一者都不会减小悬浮于流体中的所述多个细胞中的任一者的横截面尺寸，例如，细胞可以通过所述装置而不变形。
在特定实施方案中，所述第一电极和/或所述第二电极是多孔的或导电流体(例如，液体)。
在一些实施方案中，相对于在离开所述电穿孔区时细胞表型的基线测量值而言，所述多个细胞具有从0％至约25％的表型变化。在一些实施方案中，所述多个细胞在离开所述电穿孔区时无表型变化。
在另外的实施方案中，所述装置包括具有壳体的外部结构，所述壳体被构造为包裹所述装置的所述第一电极、第二电极和所述电穿孔区。在一些实施方案中，所述外部结构整合至所述装置。在某些实施方案中，所述外部结构可释放地连接至所述装置。
在另一个方面，本发明提供了一种用于将组合物机电递送到悬浮于流体中的多个细胞中的系统，所述系统包括装置，所述装置包括：第一电极，所述第一电极具有第一入口和第一出口，其中所述第一电极的管腔限定进入区；第二电极，所述第二电极具有第二入口和第二出口，其中所述第二电极的管腔限定回收区；以及电穿孔区，其中所述电穿孔区与所述第一电极的所述第一出口和所述第二电极的所述第二入口流体连接，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面尺寸，并且其中将电势差施加于所述第一电极和所述第二电极时在所述电穿孔区中产生电场。所述系统还包括电势源，其中所述装置的所述第一电极和所述第二电极可释放地连接至所述电势源。在所述系统中，悬浮于所述流体中的所述多个细胞在进入所述电穿孔区后被电穿孔。
在另一个方面，本发明提供了一种用于将组合物电穿孔到悬浮于流体中的多个细胞中的系统，所述系统包括装置，所述装置包括：第一电极，所述第一电极具有第一入口和第一出口，其中所述第一电极的管腔限定进入区；第二电极，所述第二电极具有第二入口和第二出口，其中所述第二电极的管腔限定回收区；以及电穿孔区，其中所述电穿孔区与所述第一电极的所述第一出口和所述第二电极的所述第二入口流体连接，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面尺寸，并且其中将电势差施加于所述第一电极和所述第二电极时在所述电穿孔区中产生电场。所述系统还包括电势源，其中所述装置的所述第一电极和所述第二电极可释放地连接至所述电势源。在所述系统中，悬浮于所述流体中的所述多个细胞在进入所述电穿孔区后被电穿孔。
在一些实施方案中，相对于在离开所述电穿孔区时细胞表型的基线测量值而言，所述多个细胞具有从0％至约25％的表型变化。在一些实施方案中，所述多个细胞在离开所述电穿孔区时无表型变化。
在另外的实施方案中，所述装置包括具有壳体的外部结构，所述壳体被构造为包裹所述装置的所述第一电极、第二电极和所述电穿孔区。在一些实施方案中，所述外部结构包括可操作地耦合至所述第一电极的第一电输入和可操作地耦合至所述第二电极的第二电输入。在一些实施方案中，所述第一电输入或所述第二电输入与所述电势源之间的可释放连接选自由以下各项组成的组：钳子、夹子、弹簧、护套、钢丝刷、机械连接、感应连接或它们的组合。
在一些实施方案中，所述外部结构整合至所述装置。在某些实施方案中，所述外部结构可释放地连接至所述装置。
在一些实施方案中，前述方面中的任一者的装置、系统或方法中的任一者诱导可逆或不可逆电穿孔。在特定实施方案中，所述电穿孔是基本上非热可逆电穿孔、基本上非热不可逆电穿孔或基本上热不可逆电穿孔。
在一些实施方案中，所述装置和所述电势源之间的可释放连接选自由以下各项组成的组：钳子、夹子、弹簧、护套、钢丝刷、机械连接、感应连接或它们的组合。在特定实施方案中，所述装置和所述电势源之间的可释放连接是弹簧。
在一些实施方案中，所述装置还包括一个或多个与装置的区(例如，进入区或回收区)流体连接的储集器，例如第一储集器和第二储集器。例如，第一储集器可以与所述进入区流体连接，并且第二储集器可以与所述回收区流体连接。
在某些实施方案中，所述电穿孔区的横截面选自由以下各项组成的组：圆柱体、椭圆形、多边形、星形、平行四边形、梯形和不规则形状。
在一些实施方案中，所述进入区的横截面尺寸或所述回收区的横截面尺寸在所述电穿孔区的横截面尺寸的0.01％和100,000％之间。例如，所述进入区的横截面尺寸或所述回收区的横截面尺寸可以为所述电穿孔区的横截面尺寸的约0.01％至约1,000％，例如，所述电穿孔区的横截面尺寸的约0.01％至约1％、约0.1％至约10％、约5％至约25％、约10％至约50％、约10％至约1,000％、约25％至约75％、约25％至约750％、或约50％至约100％。或者，所述进入区的横截面尺寸或所述回收区的横截面尺寸可以是所述电穿孔区的横截面尺寸的约100％至约100,000％，例如，所述电穿孔区的横截面尺寸的约100％至约1000％、约500％至约5,000％、约1,000％至约10,000％、约5,000％至约25,000％、约10,000％至约50,000％、约25,000％至约75,000％、或约50,000％至约100,000％。
在一些实施方案中，所述电穿孔区的横截面尺寸在0.005mm和50mm之间。在一些实施方案中，所述电穿孔区的长度在0.005mm和50mm之间。在特定实施方案中，所述电穿孔区的长度在0.005mm和25mm之间。在一些实施方案中，所述第一电极或所述第二电极中的任一者的横截面尺寸在0.1mm至500mm之间。在特定实施方案中，所述进入区、回收区或电穿孔区中的任一者都不会减小悬浮于流体中的所述多个细胞中的任一者的横截面尺寸，例如，细胞可以通过所述装置而不变形。
在另外的实施方案中，所述系统包括与所述进入区流体连接的流体递送源，其中所述流体递送源被构造为将悬浮于所述流体中的所述多个细胞通过所述进入区递送至所述回收区。在一些实施方案中，来自所述流体递送源的递送速率在0.001mL/min至1,000mL/min之间，例如25mL/min。在某些实施方案中，悬浮于所述流体中的所述多个细胞中的任一个的停留时间在0.5ms至50ms之间。在一些实施方案中，所述流体的电导率在0.001mS/cm至500mS/cm之间，例如1-20mS/cm。
在另外的实施方案中，所述系统包括控制器，所述控制器可操作地耦合至所述电势源，以将电压脉冲递送至所述第一电极和所述第二电极，以在所述第一电极和所述第二电极之间产生电势差。在一些实施方案中，所述电压脉冲具有的幅度为-3kV至3kV，例如0.01kV至3kV，例如0.2-0.6kV。在一些情况下，所述电穿孔的占空比在0.001％至100％之间，例如10％-95％。在一些实施方案中，所述电压脉冲具有的持续时间在0.01ms至1,000ms之间，例如1-10ms。在某些实施方案中，所述电压脉冲以在1Hz至50,000Hz之间(例如，100-500Hz)的频率施加于所述第一电极和所述第二电极。所述电压脉冲的波形可以是DC波形、方波波形、脉冲波形、双极波形、正弦波形、斜坡波形、不对称双极波形、任意波形或者它们的任何叠加或组合。在特定实施方案中，由所述电压脉冲产生的所述电场具有的大小在1V/cm至50,000V/cm之间，例如100-1,000V/cm。
在另外的实施方案中，所述系统包括壳体(例如，壳体结构)，所述壳体被构造为容纳本文所述的电穿孔装置。在另外的实例中，所述壳体(例如，壳体结构)包括热控制器，所述热控制器被构造为增加或减少所述壳体或它们的系统的任何部件的温度。在一些实施方案中，所述热控制器是加热元件，例如加热块、液体流、电池供电的加热器或薄膜加热器。在其他实施方案中，所述热控制器是冷却元件，例如液体流、蒸发冷却器、或热电装置(例如帕尔贴装置)。
在另外的实施方案中，所述系统包括多个细胞穿孔装置，例如串联的或并联的细胞穿孔装置。在特定实施方案中，所述系统包括用于所述多个细胞穿孔装置的多个外部结构。
在另一个方面，本发明提供了一种用于将组合物机电递送到悬浮于流体中的多个细胞中的系统，所述系统包括装置，所述装置包括：第一电极，所述第一电极具有第一入口和第一出口，其中所述第一电极的管腔限定进入区；第二电极，所述第二电极具有第二入口和第二出口，其中所述第二电极的管腔限定回收区；第三入口和第三出口，其中所述第三入口和所述第三出口与在所述第一入口和所述第一出口之间的所述第一电极相交；第四入口和第四出口，其中所述第四入口和所述第四出口与在所述第二入口和所述第二出口之间的所述第二电极相交；以及电穿孔区，其中所述电穿孔区与所述第一电极的所述第一出口和所述第二电极的所述第二入口流体连接，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面尺寸，并且其中将电势差施加于所述第一电极和所述第二电极时在所述电穿孔区中产生电场。在所述装置中，悬浮于所述流体中的所述多个细胞在进入所述电穿孔区后被转染。在一些实施方案中，相对于在离开所述电穿孔区时细胞表型的基线测量值而言，所述多个细胞具有从0％至约25％的表型变化。在一些实施方案中，所述多个细胞在离开所述电穿孔区时无表型变化。
在另一个方面，本发明提供了一种用于将组合物电穿孔到悬浮于流体中的多个细胞中的系统，所述系统包括装置，所述装置包括：第一电极，所述第一电极具有第一入口和第一出口，其中所述第一电极的管腔限定进入区；第二电极，所述第二电极具有第二入口和第二出口，其中所述第二电极的管腔限定回收区；第三入口和第三出口，其中所述第三入口和所述第三出口与在所述第一入口和所述第一出口之间的所述第一电极相交；第四入口和第四出口，其中所述第四入口和所述第四出口与在所述第二入口和所述第二出口之间的所述第二电极相交；以及电穿孔区，其中所述电穿孔区与所述第一电极的所述第一出口和所述第二电极的所述第二入口流体连接，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面尺寸，并且其中将电势差施加于所述第一电极和所述第二电极时在所述电穿孔区中产生电场。在所述装置中，悬浮于所述流体中的所述多个细胞在进入所述电穿孔区后被电穿孔。
在一些实施方案中，相对于在离开所述电穿孔区时细胞表型的基线测量值而言，所述多个细胞具有从0％至约25％的表型变化。在一些实施方案中，所述多个细胞在离开所述电穿孔区时无表型变化。
在前述任一方面的另外的实施方案中，所述装置包括具有壳体(例如，壳体结构)的外部结构，所述壳体被构造为包裹所述装置的所述第一电极、第二电极和所述电穿孔区。在一些实施方案中，所述外部结构包括可操作地耦合至所述第一电极的第一电输入和可操作地耦合至所述第二电极的第二电输入。在一些实施方案中，所述第一电输入或所述第二电输入与所述电势源之间的可释放连接选自由以下各项组成的组：钳子、夹子、弹簧、护套、钢丝刷、机械连接、感应连接或它们的组合。
在一些实施方案中，所述外部结构整合至所述装置。在某些实施方案中，所述外部结构可释放地连接至所述装置。
在一些情况下，所述系统诱导可逆或不可逆电穿孔。在特定实施方案中，所述电穿孔是基本上非热可逆电穿孔、基本上非热不可逆电穿孔或基本上热不可逆电穿孔。
在一些实施方案中，所述装置和所述电势源之间的可释放连接选自由以下各项组成的组：钳子、夹子、弹簧、护套、钢丝刷、机械连接、感应连接或它们的组合。在特定实施方案中，所述装置和所述电势源之间的可释放连接是弹簧。
在一些实施方案中，所述装置还包括一个或多个与装置的区(例如，进入区或回收区)流体连接的储集器，例如第一储集器和第二储集器。例如，第一储集器可以与所述进入区流体连接，并且第二储集器可以与所述回收区流体连接。
在某些实施方案中，所述电穿孔区的横截面选自由以下各项组成的组：圆柱体、椭圆形、多边形、星形、平行四边形、梯形和不规则形状。
在一些实施方案中，所述进入区的横截面尺寸或所述回收区的横截面尺寸在所述电穿孔区的横截面尺寸的0.01％至100,000％之间。例如，所述进入区的横截面尺寸或所述回收区的横截面尺寸可以为所述电穿孔区的横截面尺寸的约0.01％至约1,000％，例如，所述电穿孔区的横截面尺寸的约0.01％至约1％、约0.1％至约10％、约5％至约25％、约10％至约50％、约10％至约1,000％、约25％至约75％、约25％至约750％、或约50％至约100％。或者，所述进入区的横截面尺寸或所述回收区的横截面尺寸可以是所述电穿孔区的横截面尺寸的约100％至约100,000％，例如，所述电穿孔区的横截面尺寸的约100％至约1000％、约500％至约5,000％、约1,000％至约10,000％、约5,000％至约25,000％、约10,000％至约50,000％、约25,000％至约75,000％、或约50,000％至约100,000％。
在一些实施方案中，所述电穿孔区的横截面尺寸在0.005mm和50mm之间。在一些实施方案中，所述电穿孔区的长度在0.005mm和50mm之间。在特定实施方案中，所述电穿孔区的长度在0.005mm和25mm之间。在一些实施方案中，所述第一电极或所述第二电极中的任一者的横截面尺寸在0.01mm和500mm之间。在特定实施方案中，所述进入区、回收区或电穿孔区中的任一者都不会减小悬浮于流体中的所述多个细胞中的任一者的横截面尺寸，例如，细胞可以通过所述装置而不变形。
在另外的实施方案中，所述系统包括与所述进入区流体连接的流体递送源，其中所述流体递送源被构造为将悬浮于所述流体中的所述多个细胞通过所述进入区递送至所述回收区。在一些实施方案中，来自所述流体递送源的递送速率在0.001mL/min和1,000mL/min之间，例如25mL/min。在某些实施方案中，悬浮于所述流体中的所述多个细胞中的任一个的停留时间在0.5ms和50ms之间。在一些实施方案中，所述流体的电导率在0.001mS/cm和500mS/cm之间，例如在1mS/cm和20mS/cm之间。
在另外的实施方案中，所述系统包括控制器，所述控制器可操作地耦合至所述电势源，以将电压脉冲递送至所述第一电极和所述第二电极，以在所述第一电极和所述第二电极之间产生电势差。在一些实施方案中，所述电压脉冲具有的幅度为-3kV至3kV，例如0.01kV至3kV，例如0.2-0.6kV。在一些情况下，所述电穿孔的占空比在0.001％至100％之间，例如10％-95％。在一些实施方案中，所述电压脉冲具有的持续时间在0.01ms至1,000ms之间，例如1-10ms。在某些实施方案中，所述电压脉冲以在1Hz至50,000Hz之间(例如，100-500Hz)的频率施加于所述第一电极和所述第二电极。所述电压脉冲的波形可以是DC波形、方波波形、脉冲波形、双极波形、正弦波形、斜坡波形、不对称双极波形、任意波形或者它们的任何叠加或组合。在特定实施方案中，由所述电压脉冲产生的所述电场具有的大小在1V/cm和50,000V/cm之间，例如在100V/cm和1,000V/cm之间。
在另外的实施方案中，所述系统包括壳体(例如，壳体结构)，所述壳体被构造为容纳本文所述的电穿孔装置。在另外的实例中，所述壳体结构包括热控制器，所述热控制器被构造为增加或减少所述壳体结构或它们的系统的任何部件的温度。在一些实施方案中，所述热控制器是加热元件，例如加热块、液体流、电池供电的加热器或薄膜加热器。在其他实施方案中，所述热控制器是冷却元件，例如液体流、蒸发冷却器、或热电装置(例如帕尔贴装置)。
在另外的实施方案中，所述系统包括多个细胞穿孔装置，例如串联的或并联的细胞穿孔装置。在特定实施方案中，所述系统包括用于所述多个细胞穿孔装置的多个外部结构。
在另一个方面，本发明提供将组合物引入悬浮于流体中的多个细胞的至少一部分中的方法，所述方法包括以下步骤：a.提供装置，所述装置包括：第一电极，所述第一电极具有第一入口和第一出口，其中所述第一电极的管腔限定进入区；第二电极，所述第二电极具有第二入口和第二出口，其中所述第二电极的管腔限定回收区；以及电穿孔区，其中所述电穿孔区与所述第一电极的所述第一出口和所述第二电极的所述第二入口流体连接，并且其中将电势差施加于所述第一电极和所述第二电极时在所述电穿孔区中产生电场；b.使所述第一电极和所述第二电极通电，以在所述第一电极和所述第二电极之间产生电势差，从而在所述电穿孔区中产生电场；以及c.使悬浮于具有所述组合物的所述流体中的所述多个细胞通过所述装置的所述电穿孔区中的所述电场。在所述方法中，悬浮于具有所述组合物的流体中的所述多个细胞通过所述电穿孔区中的所述电场的流动增强了所述多个细胞的暂时渗透性，从而将所述组合物引入所述多个细胞的至少一部分。
在另外的实施方案中，所述方法包括评估悬浮于所述流体中的所述多个细胞的一部分的健康状况。在某些实施方案中，所述评估包括测量悬浮于所述流体中的所述多个细胞的一部分的活力。在一些实施方案中，所述评估包括测量悬浮于所述流体中的所述多个细胞的一部分的转染效率。在一些实施方案中，所述评估包括测量悬浮于所述流体中的所述多个细胞的一部分的细胞回收率。在某些实施方案中，所述评估包括细胞表面标志物表达的流式细胞术分析。
在一些实施方案中，相对于在离开所述装置的所述电穿孔区时细胞表型的基线测量值而言，所述多个细胞具有从0％至约25％的表型变化。在一些情况下，所述多个细胞在离开所述装置的所述电穿孔区时无表型变化。
在一些实施方案中，所述方法诱导可逆或不可逆电穿孔。在特定实施方案中，所述电穿孔是基本上非热可逆电穿孔、基本上非热不可逆电穿孔或基本上热不可逆电穿孔。
在一些实施方案中，通过施加正压(例如，泵，例如，注射泵或蠕动泵)来使悬浮于具有所述组合物的所述流体中的细胞通过所述装置的所述电穿孔区中的所述电场。
在某些实施方案中，所述样品中的所述多个细胞中的细胞可以是哺乳动物细胞、真核生物细胞、人细胞、动物细胞、植物细胞、合成细胞、原代细胞、细胞系、悬浮细胞、贴壁细胞、未刺激的细胞、刺激的细胞、活化的细胞、免疫细胞、干细胞、血细胞、红细胞、T细胞、B细胞、中性粒细胞、树突细胞、抗原呈递细胞(APC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞或外周血单核细胞(PBMC)、人胚肾细胞(例如HEK-293细胞)或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括Jurkat细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括原代人T细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括THP-1细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括原代人巨噬细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括原代人单核细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括自然杀伤(NK)细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括中国仓鼠卵巢细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括人胚肾细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括B细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括原代人T细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括原代人单核细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括原代人巨噬细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括胚胎干细胞(ESC)、间充质干细胞(MSC)或造血干细胞(HSC)。在特定实施方案中，所述多个细胞包括原代人诱导性多能干细胞(iPSC)。
在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种选自由以下各项组成的组的化合物：治疗剂、维生素、纳米颗粒、带电的治疗剂、纳米颗粒、带电的分子(例如，溶液中的离子)、不带电的分子、核酸(例如，DNA或RNA)、CRISPR-Cas复合物、蛋白质、聚合物、核糖核蛋白(RNP)、经工程化的核酸酶、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、归巢核酸酶、大范围核酸酶(MN)、大范围TAL、酶、肽、转座子或多糖(例如，葡聚糖，例如，硫酸葡聚糖)。可以在悬浮液中递送至细胞的组合物包含核酸(例如，寡核苷酸、mRNA或DNA)、抗体(或抗体片段，例如双特异性片段、三特异性片段、Fab、F(ab′)2、或单链可变片段(scFV))、氨基酸、多肽(例如，肽或蛋白质)、细胞、细菌、基因治疗剂、基因组工程化的治疗剂、表观基因组工程化的治疗剂、碳水化合物、化学药物、造影剂、磁性颗粒、聚合物珠粒、金属纳米颗粒、金属微粒、量子点、抗氧化剂、抗生素剂、激素、核蛋白、多糖、糖蛋白、脂蛋白、类固醇、镇痛药、局部麻醉剂、抗炎剂、抗微生物剂、化学治疗剂、外泌体、外膜囊泡、疫苗、病毒、噬菌体、佐剂、维生素、矿物质、细胞器以及它们的组合。在某些实施方案中，所述组合物是核酸(例如，寡核苷酸、mRNA或DNA)。在某些实施方案中，所述组合物是抗体。在某些实施方案中，所述组合物是多肽(例如，肽或蛋白质)。
在某些实施方案中，所述组合物具有的在所述流体中的浓度在0.0001μg/mL和1,000μg/mL之间(例如，从约0.0001μg/mL至约0.001μg/mL、约0.001μg/mL至约0.01μg/mL、约0.001μg/mL至约5μg/mL、约0.005μg/mL至约0.1μg/mL、约0.01μg/mL至约0.1μg/mL、约0.01μg/mL至约1μg/mL、约0.1μg/mL至约1μg/mL、约0.1μg/mL至约5μg/mL、约1μg/mL至约10μg/mL、约1μg/mL至约50μg/mL、约1μg/mL至约100μg/mL、约2.5μg/mL至约15μg/mL、约5μg/mL至约25μg/mL、约5μg/mL至约50μg/mL、约5μg/mL至约500μg/mL、约7.5μg/mL至约75μg/mL、约10μg/mL至约100μg/mL、约10μg/mL至约1,000μg/mL、约25μg/mL至约50μg/mL、约25μg/mL至约250μg/mL、约25μg/mL至约500μg/mL、约50μg/mL至约100μg/mL、约50μg/mL至约250μg/mL、约50μg/mL至约750μg/mL、约100μg/mL至约300μg/mL、约100μg/mL至约1,000μg/mL、约200μg/mL至约400μg/mL、约250μg/mL至约500μg/mL、约350μg/mL至约500μg/mL、约400μg/mL至约1,000μg/mL、约500μg/mL至约750μg/mL、约650μg/mL至约1,000μg/mL、或约800μg/mL至约1,000μg/mL，例如，约0.0001μg/mL、约0.0005μg/mL、约0.001μg/mL、约0.005μg/mL、约0.01μg/mL、约0.02μg/mL、约0.03μg/mL、约0.04μg/mL、约0.05μg/mL、约0.06μg/mL、约0.07μg/mL、约0.08μg/mL、约0.09μg/mL、约0.1μg/mL、约0.2μg/mL、约0.3μg/mL、约0.4μg/mL、约0.5μg/mL、约0.6μg/mL、约0.7μg/mL、约0.8μg/mL、约0.9μg/mL、约1μg/mL、约1.5μg/mL、约2μg/mL、约2.5μg/mL、约3μg/mL、约3.5μg/mL、约4μg/mL、约4.5μg/mL、约5μg/mL、约5.5μg/mL、约6μg/mL、约6.5μg/mL、约7μg/mL、约7.5μg/mL、约8μg/mL、约8.5μg/mL、约9μg/mL、约9.5μg/mL、约10μg/mL、约15μg/mL、约20μg/mL、约25μg/mL、约30μg/mL、约35μg/mL、约40μg/mL、约45μg/mL、约50μg/mL、约55μg/mL、约60μg/mL、约65μg/mL、约70μg/mL、约75μg/mL、约80μg/mL、约85μg/mL、约90μg/mL、约95μg/mL、约100μg/mL、约200μg/mL、约250μg/mL、约300μg/mL、约350μg/mL、约400μg/mL、约450μg/mL、约500μg/mL、约550μg/mL、约600μg/mL、约650μg/mL、约700μg/mL、约750μg/mL、约800μg/mL、约850μg/mL、约900μg/mL、约950μg/mL、或约1,000μg/mL)。
在一些实施方案中，所述装置还包括一个或多个与装置的区(例如，进入区或回收区)流体连接的储集器，例如第一储集器和第二储集器。例如，第一储集器可以与所述进入区流体连接，并且第二储集器可以与所述回收区流体连接。
在一些实施方案中，所述装置的所述电穿孔区具有均一的横截面尺寸。在其他实施方案中，所述装置的所述电穿孔区具有不均一的横截面尺寸。在另外的实施方案中，所述装置还包括多个电穿孔区，其中所述多个电穿孔区中的每个(例如，电穿孔区)可以具有均一的横截面或不均一的横截面。在某些实施方案中，所述电穿孔区的横截面选自由以下各项组成的组：圆柱体、椭圆形、多边形、星形、平行四边形、梯形和不规则形状。
在一些实施方案中，所述进入区的横截面尺寸或所述回收区的横截面尺寸在所述电穿孔区的横截面尺寸的0.01％至100,000％之间。例如，所述进入区的横截面尺寸或所述回收区的横截面尺寸可以为所述电穿孔区的横截面尺寸的约0.01％至约100％，例如，所述电穿孔区的横截面尺寸的约0.01％至约1％、约0.1％至约10％、约5％至约25％、约10％至约50％、约25％至约75％、或约50％至约100％。或者，所述进入区的横截面尺寸或所述回收区的横截面尺寸可以是所述电穿孔区的横截面尺寸的约100％至约100,000％，例如，所述电穿孔区的横截面尺寸的约100％至约1000％、约500％至约5,000％、约1,000％至约10,000％、约5,000％至约25,000％、约10,000％至约50,000％、约25,000％至约75,000％、或约50,000％至约100,000％。
在一些实施方案中，所述电穿孔区的横截面尺寸在0.005mm和50mm之间。在一些实施方案中，所述电穿孔区的长度在0.005mm和50mm之间。在一些实施方案中，所述电穿孔区的长度在0.005mm和25mm之间。在一些实施方案中，所述第一电极或所述第二电极中的任一者的横截面尺寸在0.1mm至500mm之间。在特定实施方案中，所述进入区、回收区或电穿孔区中的任一者都不会减小悬浮于流体中的所述多个细胞中的任一者的横截面尺寸，例如，细胞可以通过所述装置而不变形。
在另外的实施方案中，所述装置包括具有壳体的外部结构，所述壳体被构造为包裹所述装置的所述第一电极、第二电极和所述电穿孔区。在一些实施方案中，所述外部结构包括可操作地耦合至所述第一电极的第一电输入和可操作地耦合至所述第二电极的第二电输入。在一些实施方案中，所述外部结构整合至所述装置。在某些实施方案中，所述外部结构可释放地连接至所述装置。
在一些实施方案中，来自所述流体递送源的递送速率在0.001mL/min至1,000mL/min之间，例如20-30mL/min，例如25mL/min。在某些实施方案中，悬浮于所述流体中的所述多个细胞中的任一个的停留时间在0.5ms和50ms之间。在一些实施方案中，所述流体的电导率在0.001mS/cm至500mS/cm之间，例如1-20mS/cm。
在另外的实施方案中，所述方法包括控制器，所述控制器可操作地耦合至所述电势源，以将电压脉冲递送至所述第一电极和所述第二电极，以在所述第一电极和所述第二电极之间产生电势差。在一些实施方案中，所述电压脉冲具有的幅度为-3kV至3kV，例如0.2-0.6kV。在一些情况下，所述电穿孔的占空比在0.001％和100％之间，例如在10％和95％之间。在一些实施方案中，所述电压脉冲具有的持续时间在0.01ms和1,000ms之间，例如在1ms和10ms之间。在某些实施方案中，所述电压脉冲以在1Hz至50,000Hz之间(例如，100-500Hz)的频率施加于所述第一电极和所述第二电极。所述电压脉冲的波形可以是DC波形、方波波形、脉冲波形、双极波形、正弦波形、斜坡波形、不对称双极波形、任意波形或者它们的任何叠加或组合。在特定实施方案中，由所述电压脉冲产生的所述电场具有的大小在1V/cm和50,000V/cm之间，例如在100V/cm和1,000V/cm之间。
在另外的实施方案中，所述方法包括壳体结构，所述壳体结构被构造为容纳本文所述的所述电穿孔装置。在另外的实例中，所述壳体结构包括热控制器，所述热控制器被构造为增加或减少所述壳体或它们的系统的任何部件的温度。在一些实施方案中，所述热控制器是加热元件，例如加热块、液体流、电池供电的加热器或薄膜加热器。在其他实施方案中，所述热控制器是冷却元件，例如液体流、蒸发冷却器、或热电装置(例如帕尔贴装置)。在某些实施方案中，悬浮于所述流体中的所述多个细胞的温度在0℃和50℃之间。
在另外的实施方案中，所述装置包括多个细胞穿孔装置，例如串联的或并联的细胞穿孔装置。在特定实施方案中，所述装置包括用于所述多个装置的多个外部结构。
在一些实施方案中，所述方法还包括在穿孔后将悬浮于所述流体中的所述多个细胞储存于回收缓冲液中。在某些实施方案中，在所述组合物的引入后，所述电穿孔的细胞具有的活力在0.1％和99.9％之间，例如25％和85％。在其他实施方案中，所述组合物至所述细胞的引入效率在0.1％和99.9％之间，例如在25％和85％之间。在某些实施方案中，所述细胞回收率在0.1％和100％之间。在特定实施方案中，所述细胞回收率在0.1％和500％之间。在一些实施方案中，回收的细胞(例如，活细胞)的数量在104和1012之间。
在另一个方面，本发明提供一种用于将组合物机电递送到悬浮于流体中的多个细胞中的套件，所述套件包括如本文所述的多个装置、如本文所述的多个外部结构和转染缓冲液。
在另一个方面，本发明提供一种用于将组合物电穿孔到悬浮于流体中的多个细胞中的套件，所述套件包括如本文所述的多个装置、如本文所述的多个外部结构和转染缓冲液。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述外部结构整合至所述多个细胞装置。在某些实施方案中，所述外部结构可释放地连接至所述多个装置。
附图说明
申请文件含有至少一个以彩色绘制的附图。美国专利及商标局将在要求支付必要费用的情况下提供具有彩色附图的本专利申请的副本。
图1A-1C是本发明的单个电穿孔装置的实施方案的示意图。图1A示出了本发明的装置的操作的示意图。图1B示出了本发明的部件的示意图。图1C示出了图1B所示的本发明的装置的实施方案的照片。
图2A-2B是用于将电能并联地递送至本发明的电穿孔装置的实施方案的壳体的示例性示意图。图2A示出了具有用于使本发明的96个电穿孔装置并联地通电的电网概念的壳体的等距图。图2B示出了本发明的单个电穿孔装置的接口和具有电网的壳体的放大视图，所述装置使用弹簧加载的电极使每个电穿孔装置的第一电极和第二电极牢固地保持紧贴壳体的电网。
图3A-3B是使用本发明的装置对Jurkat细胞(1×107个细胞/mL)的电穿孔的进行流体流速(mL/min)优化的柱状图。将回收的细胞在37℃下含10％FBS的RPMI中培养24小时，然后使用LSR II HTS(BD Bioscience)进行流式细胞分析。图3A示出了使用7-AAD排斥染料评估的Jurkat细胞的活力。图3B示出了使用GFP表达评估的Jurkat细胞的转染效率。
图4A-4D是沿着装置的有源区的流速模拟图示。图4A是表示10mL/min的液体体积流速的3D模型。图4C是表示100mL/min的液体体积流速的3D模型。图4B和4D是分别对应于图4A和4C的2D模型。
图5A-5B是针对Jurkat细胞的电穿孔在本发明的装置的电穿孔区中进行电场优化的柱状图。将回收的细胞在37℃下含10％FBS的RPMI中培养24小时，然后使用LSR II HTS(BD Bioscience)进行流式细胞分析。图5A示出了使用7-AAD排斥染料评估的Jurkat细胞的活力。图5B示出了使用GFP表达评估的Jurkat细胞的转染效率。
图6A-6B是显示温度对使用本发明的装置进行的Jurkat细胞转染的影响的柱状图。图中的“RT”代表室温。将回收的细胞在37℃下含10％FBS的RPMI中培养24小时，然后使用LSR II HTS(BD Bioscience)进行流式细胞分析。图6A示出了使用7-AAD排斥染料评估的Jurkat细胞的活力。图6B示出了使用GFP表达评估的Jurkat细胞的转染效率。
图7A-7D是显示沿着本发明的装置的有源区的电场分布的模拟图示。图7A示出了具有225V的施加电压的装置的电场分布图。图7B是图7A的2D模型纵截面图。图7C示出了具有275V的施加电压的装置的电场分布图。图7D是图7C的2D模型纵截面图。
图8A-8D是显示沿着本发明的装置的有源区的温度分布影响的模拟图示。图8A示出了时间＝0ms时装置的有源区中的液体的温度分布图；图8B示出了时间＝100ms时装置的有源区中的液体的温度分布图；图8C示出了时间＝200ms时装置的有源区中的液体的温度分布图；以及图8D示出了时间＝300ms时装置的有源区中的液体的温度分布图。
图9A-9B是显示针对使用本发明的装置进行的Jurkat细胞的电穿孔对电压脉冲持续时间和脉冲数进行的优化的柱状图。将回收的细胞在37℃下含10％FBS的RPMI中培养24小时，然后使用LSR II HTS(BD Bioscience)进行流式细胞分析。图8A示出了使用7-AAD排斥染料评估的Jurkat细胞的活力。图9B示出了使用GFP表达评估的Jurkat细胞的转染效率。
图10A-10B是显示针对使用本发明的装置进行的Jurkat细胞的电穿孔对样品体积的优化的柱状图。将回收的细胞在37℃下含10％FBS的RPMI中培养24小时，然后使用LSR IIHTS(BD Bioscience)进行流式细胞分析。图10A示出了使用7-AAD排斥染料评估的Jurkat细胞的活力。图10B示出了使用GFP表达评估的Jurkat细胞的转染效率。
图11A-11B是显示针对使用本发明的装置进行的Jurkat细胞的电穿孔对电穿孔区的直径的优化的柱状图。电穿孔以固定的电压和可变的流速进行，以便基本上匹配不同通道尺寸的总细胞停留时间。将回收的细胞在37℃下含10％FBS的RPMI中培养24小时，然后使用LSR II HTS(BD Bioscience)进行流式细胞分析。图11A示出了使用7-AAD排斥染料评估的Jurkat细胞的活力。图11B示出了使用GFP表达评估的Jurkat细胞的转染效率。
图12A-12L示出了显示使用本发明的装置评估的选定电压脉冲波形对Jurkat细胞的电穿孔的影响的柱状图以及示例性波形形状。将回收的细胞在37℃下含10％FBS的RPMI中培养24小时，然后使用LSR II HTS(BD Bioscience)进行流式细胞分析。图12A示出了使用7-AAD排斥染料评估的Jurkat细胞的活力。图12B示出了使用GFP表达评估的Jurkat细胞的转染效率。图12C示出了直流(DC)始终通电电流波形。图12D示出了具有50％的占空比的方波波形(包括偏移)。图12E示出了75％不对称斜坡波形。图12F示出了具有95％的占空比的脉冲波形。图12G示出了具有75％的占空比的方波波形(包括偏移)。图12H示出了正弦波形。图12I示出了25％不对称斜坡波形。图12J示出了具有25％的占空比的方波波形(包括偏移)。图12K示出了无偏移的双极方波波形。图12L示出了对称斜坡波形。
图13A-13B是比较使用本发明的装置和商购获得的细胞转染仪器评估的Jurkat细胞的转染效率和所得的细胞活力的柱状图。使用7-AAD排斥染料评估的Jurkat细胞的活力以及使用GFP表达评估的Jurkat细胞的转染效率。图13A示出了使用Jurkat细胞转染的公开参数(样品在100μL吸头中；3次脉冲/10ms/450V/cm)进行的转染实验的结果。图13B是图13A的重复实验，它示出了与针对Jurkat细胞转染的公开参数相比，使用针对本发明的装置的优化参数进行的实验中的再现性。图13C示出了Cas9核糖核蛋白阵列文库筛选的工作流程示意图，所述筛选使用商购获得的单链sgRNA阵列文库使纯化的Cas9蛋白退火以形成阵列化的Cas9核糖核蛋白文库。使用本发明的装置，Cas9核糖核酸阵列文库筛选将进行基因靶标的鉴定，以便于将来使用基于板的分析进行免疫治疗研究。另外，Cas9核糖核蛋白合并文库筛选可用于进行鉴定未来疗法的基因靶标所需的测定。
图14A-14B是显示使用本发明的装置评估的FITC葡聚糖递送至原代人T细胞的活力和效率，以及使用可变分子量的葡聚糖聚合物来评估葡聚糖递送的任何大小限制的柱状图。将回收的细胞在37℃下含10％FBS的RPMI中培养24小时，然后使用LSR II HTS(BDBioscience)进行流式细胞分析。图14A示出了使用7-AAD排斥染料评估的原代人T细胞的活力。图14B示出了使用GFP表达评估的原代人T细胞的转染效率。
图15A-15B是比较通过公开的针对THP-1单核细胞的转染方案使用本发明的装置和商购获得的细胞转染仪器
评估的THP-1单核细胞的转染效率和活力的柱状图。将回收的细胞在37℃下含10％FBS的RPMI中培养24小时，然后使用LSR II HTS(BDBioscience)进行流式细胞分析。图15A示出了使用7-AAD排斥染料评估的THP-1单核细胞的活力。图15B示出了使用GFP表达评估的THP-1单核细胞的转染效率。
图16A-16B是比较通过公开的针对原代人单核细胞的转染方案使用本发明的装置和商购获得的细胞转染仪器评估的原代人单核细胞的转染效率和活力的柱状图。使用负向选择从外周血分离原代人单核细胞。将回收的细胞在37℃下含10％FBS的RPMI中培养24小时，然后使用LSR II HTS(BD Bioscience)进行流式细胞分析。图16A示出了使用7-AAD排斥染料评估的原代人单核细胞的活力。图16B示出了使用GFP表达评估的原代人单核细胞的转染效率。
图17A-17B是比较通过公开的针对NK-92细胞系的转染方案使用本发明的装置和商购获得的细胞转染仪器评估的NK-92细胞系的转染效率和活力的柱状图。在使用本发明的装置或使用商购获得的仪器进行电穿孔后，将细胞在37℃下完全aMEM(含有25％血清、0.2mM肌醇、0.02mM叶酸、0.1mM巯基乙醇的aMEM)中培养24小时，然后使用iQue(Intellicyt)进行流式细胞分析。图17A示出了使用7-AAD排斥染料评估的活力。图17B示出了通过GFP表达评估的转染效率。
图18A-18B是比较通过公开的针对NK-92MI细胞系的转染方案使用本发明的装置和商购获得的细胞转染仪器评估的NK-92MI细胞系的转染效率和活力的柱状图。在电穿孔后，将细胞在37℃下完全aMEM(含有25％血清、0.2mM肌醇、0.02mM叶酸、0.1mM巯基乙醇的aMEM)中培养24小时，然后使用iQue(Intellicyt)进行流式细胞分析。图18A示出了使用7-AAD排斥染料评估的活力。图18B示出了通过GFP表达评估的转染效率。
图19A-19F是以未电穿孔的细胞作为对照，比较使用本发明的装置电穿孔并且用SIRPα定制mRNA转染的T细胞(图19A-19C)与原代人单核细胞(图19D-19F)的柱状图。将第11天扩增的T细胞用20μg SIRPαmRNA转染，并且在24小时对过表达进行评估。A)以7-AAD阴性细胞测量的活力，B)以SIRPα阳性细胞测量的转染效率，以及C)以平均荧光强度(MFI)测量的SIRPα表达的代表性图。将从PBMC分离的单核细胞用20μg SIRPαmRNA转染，并且在24小时对过表达进行评估。D)以7-AAD阴性细胞测量的活力，E)以SIRPα阳性细胞测量的转染效率，以及F)以平均荧光强度(MFI)测量的SIRPα表达的代表性图。图片是平均值±SEM。
图20A-20D是显示GFP mRNA至人原代初始T细胞的递送的柱状图。图20A示出了回收的细胞，图20B示出了初始T细胞的效率，图20C示出了初始T细胞的活力，图20D示出了总收率。将初始T细胞用10μg商业化GFP mRNA转染，并且在24小时对表达进行评估。图中示出了计数、活力、效率和收率的代表性图。图片是平均值±SEM。
图21A-21B是显示电穿孔不改变人原代初始T细胞的表型的FACS图。图21A示出了未经处理的细胞，图21B示出了电穿孔的细胞。将初始T细胞用10μg商业化GFP mRNA转染，然后在24小时对CD45RA和CD45RO进行染色，如点图所示。CD45RA/CD45RO表型在未经处理的和FlowfectTM电穿孔的初始T细胞之间是等同的。
图22是显示以未经处理的细胞作为对照，使用本发明的装置评估的初始T细胞扩增的动力学图。电穿孔不改变人原代初始T细胞的扩增。将初始T细胞用10μg商业化GFPmRNA转染，然后用可溶性CD3/CD28活化剂扩增。在活化后1、4和6天进行细胞计数。扩增速率在未经处理的和电穿孔的初始T细胞之间是相同的。
图23A-23F示出了本发明的电穿孔装置的示例性实施方案，所述电穿孔装置集成到被构造为使多个细胞样品同时通电和电穿孔的电子放电装置中。图23A示出了电子放电装置的顶视等距图。图23B示出了安装在电子放电装置中的本发明的装置的侧视图，该图示出了如何使用弹簧针型电接触点在系统中形成电接触点。图23C示出了整个电子放电装置的侧视图。图23D示出了电子放电装置的一个替代性实施方案的顶视等距图。图23E示出了安装在电子放电装置中的本发明的装置的侧视图，该图示出了如何使用可曲弹簧型电接触点在系统中形成电接触点。图23F示出了被构造为使多个细胞样品同时通电和电穿孔的电子放电装置的顶视图。
图24A-24B示出了本发明的使用热液体进行温度控制的温度控制电穿孔装置的实施方案。图24A示出了温度控制电穿孔装置的部件的示意图。图24B示出了温度控制电穿孔装置的侧视图，该图示出了在外部框架中的装置。
图25A-25B示出了本发明的基于流体芯片的电穿孔装置的实施方案，所述电穿孔装置被构造为容纳用于样品引入的行业标准移液器吸头。图25A示出了包括嵌入电极和流体通道的流体芯片的实施方案。图25B示出了基于流体芯片的电穿孔装置的部件的示意图。
图26A-26B示出了本发明的连续流电穿孔装置的实施方案。图26A示出了连续流电穿孔装置的部件的剖视示意图。图26B示出了透明的外部视图，该图示出了连续流电穿孔装置的部件。
图27A-27F示出了使用螺旋电极的实施方案的计算建模生成的模拟电场。图27A示出了沿着全部三个笛卡尔轴示出的螺旋电极的模拟电场。图27B示出了从沿着Z轴的横截面示出的螺旋电极的模拟电场。图27C-27F示出了从沿着Z轴的四个不同位置示出的沿着X-Y轴的螺旋电极的模拟电场。
图28A-28C示出了被构造用于制造可扩展性的本发明的两部分电穿孔装置的实施方案。图28A示出了本发明的两部分电穿孔装置的实施方案的顶视等距3D透视图。图28B示出了图28A所示的实施方案的垂直横截面图，该图示出了两个部件如何配合。图28C示出了图28B所示的实施方案的相同视图，其中装置的尺寸(以mm为单位)是重叠的。
图29A-29B示出了本发明的两部分电穿孔装置的实施方案，所述电穿孔装置包括具有用于液体处理套管的接口的嵌入电极。图29A示出了具有嵌入电极的本发明的两部分电穿孔装置的实施方案的顶视等距3D透视图。图29B示出了图29A所示的实施方案的垂直横截面图，该图示出了嵌入电极相对于本发明的装置的电穿孔区的位置。
图29C是增强本发明技术的通量和并行化的多装置方法的图。
图30A-30B示出了本发明的外壳的实施方案，所述外壳被构造为容纳多个本发明的装置、液体处理部件、控制器和任何电气部件。图30A示出了具有使用者界面的本发明的外壳的实施方案。图30B示出了连接至液体分配歧管和样品板的本发明的装置的实施方案。
图31示出了用于细胞计数、活力的转染后分析和表面/胞内标志物的检测的传统的(使用商购获得的Lonza NUCLEOFECTOR 4DTM电穿孔系统，下图)和采纳的(使用本发明的装置和系统，上图)流式细胞术门控策略的比较。
图32A-32B是显示在电穿孔后24小时使用本发明的装置评估的编码GFP的质粒DNA至CHO-K1细胞的递送的活力和效率的柱状图。图32A示出了CHO-K1细胞的活力。图32B示出了使用GFP表达评估的CHO-K1细胞的转染效率。
图33A-33D是显示在电穿孔后24和48小时使用本发明的装置评估的编码GFP的质粒DNA至HEK-293T细胞的递送的活力和效率的柱状图。图33A示出了在电穿孔后24小时HEK-293T细胞的活力。图33B示出了在电穿孔后24小时使用GFP表达评估的HEK-293T细胞的转染效率。图33C示出了在电穿孔后48小时HEK-293T细胞的活力。图33D示出了在电穿孔后48小时使用GFP表达评估的HEK-293T细胞的转染效率。
图34A-34B示出了使用本发明的装置和系统评估的在电穿孔前(图34A)和后(图34B)收集的中国仓鼠卵巢(CHO-K1)细胞的GFP荧光信号。GFP荧光图像使用配备有10×物镜的ECHO Revolve显微镜捕获。
图35A-35B示出了使用本发明的装置和系统评估的在电穿孔前(图35A)和后(图35B)收集的HEK-293T细胞的GFP荧光信号。GFP荧光图像使用配备有10×物镜的ECHORevolve显微镜捕获。
图36A-36D是显示使用商购获得的
转染系统和本发明的装置评估的40kDFITC葡聚糖至原代人T细胞的递送的电穿孔后总细胞计数、活力、效率和相对活阳性转染细胞的柱状图。图36A示出了电穿孔后的总细胞计数。图36B示出了原代人T细胞的活力。图36C示出了递送至原代人T细胞的效率。图36D示出了相对活阳性转染细胞群。
图37是显示在GFP质粒递送至原代人T细胞后针对相对活阳性转染细胞群的
转染系统和本发明的装置之间的比较的柱状图。
图38A-38D是显示在9日龄时mRNA至原代人T细胞的递送的回收率、活力、效率和收率的柱状图。电穿孔使用两个商购获得的转染系统(Lonza NUCLEOFECTOR 4DTM和ThermoFisher
)和本发明的装置来进行。在含有10μg编码EGFP的mRNA的100μL中对100万(106个细胞/mL)或500万(5×106个细胞/mL)个细胞进行电穿孔。在电穿孔后24小时经由流式细胞术进行分析。细胞计数被归一化为100万个细胞输入，并且收率被归一化为使用本发明的装置收集的结果。图38A示出了在两种细胞密度下的回收率。图38B示出了在两种细胞密度下的活力。图38C示出了在两种细胞密度下的效率。图38D示出了在两种细胞密度下的收率。
图39A-39D是显示使用本发明的装置和系统在原代人T细胞中递送靶向CXCR3的Cas9核糖核蛋白复合物(RNP)的回收率、活力、效率和MFI的折线图。用商购获得的Cas9蛋白和两种商业化来源的sgRNA配制Cas9 RNP。在电穿孔后24-72小时经由流式细胞术进行分析。图39A示出了细胞回收率。图39B示出了活力。图39C示出了效率。图39D示出了延长到电穿孔后72小时的靶标KO细胞的总收率。
图40A-40B是显示使用商业化
转染系统和本发明的装置评估的针对电穿孔的THP-1细胞的GFP表达的活细胞计数和FITC标记的葡聚糖至NK-92MI细胞递送的柱状图。图40A示出了THP-1细胞的GFP表达的活细胞计数。图40B示出了FITC标记的葡聚糖至NK-92MI细胞的递送的活细胞计数。
图41A-41B是显示使用商业化
转染系统和本发明的装置评估的所得的GFP mRNA至THP-1单核细胞的递送的活力和效率的比较的柱状图。图41A示出了在转染后24小时评估的THP-1单核细胞的活力。图41B示出了在电穿孔后24小时使用GFP表达评估的THP-1单核细胞的转染效率。
图42A-42C是显示使用本发明的装置和未电穿孔的细胞的对照样品评估的GFPmRNA至THP-1单核细胞的递送的活力、效率和收率的柱状图。图42A示出了在电穿孔后24-72小时评估的经转染的细胞的活力。图42B示出了在电穿孔后24-72小时评估的GFP mRNA的摄取效率。图42C示出了在电穿孔后24-72小时评估的经转染的细胞的收率。
图43A-43B是显示使用本发明的装置评估的GFP mRNA至LPS活化的THP-1细胞的递送的活力和效率的柱状图。图43A示出了在转染后24小时评估的LPS活化的THP-1细胞的活力。图43B示出了在电穿孔后24小时使用GFP表达评估的LPS活化的THP-1细胞的转染效率。
图44A-44D是显示使用本发明的装置评估的40kD FITC葡聚糖和GFP mRNA至原代外周血单核细胞的递送的活力和效率的柱状图。图44A示出了用FITC葡聚糖转染的原代外周血单核细胞的活力。图44B示出了用FITC葡聚糖转染的原代外周血单核细胞的转染效率。图44C示出了用GFP mRNA转染的原代外周血单核细胞的活力。图44B示出了用GFP mRNA转染的原代外周血单核细胞的转染效率。
图45A-45B是显示使用本发明的装置评估的用GFP转染以及LPS刺激的原代外周血单核细胞中的CD80和CD86的表达的柱状图。在电穿孔后24小时和96小时测量CD80和CD86的表达。图45A示出了活化标志物CD80的表达。图45B示出了谱系标志物CD86的表达。
图46A-46C是显示使用本发明的装置评估的用GFP mRNA转染的原代外周血单核细胞(在4-8天内分化为巨噬细胞)的巨噬细胞表型、活力和GFP表达的柱状图。图46A示出了经由FSC和SSC的流式细胞分析评估的巨噬细胞表型。图46B示出了经转染的巨噬细胞的活力。图46C示出了经转染的巨噬细胞的GFP表达百分比。
图47A-47D是显示使用本发明的装置评估的40kD FITC葡聚糖和GFP mRNA至外周血分化的巨噬细胞的递送的活力和效率的柱状图。图47A示出了用FITC葡聚糖转染的外周血分化的巨噬细胞的活力。图47B示出了用FITC葡聚糖转染的外周血分化的巨噬细胞的转染效率。图47C示出了用GFP mRNA转染的外周血分化的巨噬细胞的活力。图47D示出了用GFPmRNA转染的外周血分化的巨噬细胞的转染效率。
图48A-48B是显示使用本发明的装置评估的用GFP mRNA转染后外周血分化的巨噬细胞极化为M1和M2巨噬细胞的能力的柱状图。图48A示出了M1极化的巨噬细胞，其中M1极化以及IFNg+LPS刺激以升高的CD86表达来表示。图48B示出了M2极化的巨噬细胞，其中M2极化、IL-4刺激以CD206表达来表示。
图49A-49C是显示使用商业化
转染系统和本发明的装置评估的用FITC葡聚糖转染的原代人单核细胞的活力、效率和活细胞计数的柱状图。图49A示出了原代人单核细胞的活力。图49B示出了FITC葡聚糖至原代人单核细胞的递送的效率。图49C示出了经转染的原代人单核细胞的活细胞计数。
图50A-50D是比较使用本发明的单通道和连续流装置评估的DNA至不同细胞密度的Jurkat细胞的转染的回收率、活力、效率和收率的柱状图。图50A示出了经转染的Jurkat细胞的回收率。图50B示出了经转染的Jurkat细胞的活力。图50C示出了DNA至Jurkat细胞的转染的效率。图50D示出了经转染的Jurkat细胞的收率。
图51A-51B是比较使用本发明的单通道和连续流装置评估的经转染的Jurkat细胞的GFP和FITC收率的柱状图。图51A示出了经转染的Jurkat细胞的GFP收率。图51B示出了经转染的Jurkat细胞的FITC收率。
图52A-52D是显示使用本发明的连续流装置评估的FITC葡聚糖至高细胞密度悬浮液的递送的柱状图。在电穿孔后24小时经由流式细胞术进行分析。图52A示出了相对于100万个细胞输入的总回收细胞计数。图52B示出了经转染的Jurkat细胞的活力。图52C示出了FITC葡聚糖至Jurkat细胞的转染的效率。图52D示出了经转染的Jurkat细胞的FITC收率。
图53A-53D是显示在本发明的连续流装置中使用不同的mRNA量和不同的细胞浓度在1亿个细胞的细胞数下评估的mRNA至Jurkat细胞的转染的回收率、活力、效率和收率的柱状图。在电穿孔后24小时经由流式细胞术进行分析。图53A示出了在不同的mRNA浓度和细胞浓度下回收的Jurkat细胞的数量。图53B示出了在不同的mRNA浓度和细胞浓度下经转染的Jurkat细胞的活力。图53C示出了在不同的mRNA浓度和细胞浓度下mRNA至Jurkat细胞的转染的效率。图53D示出了在不同的mRNA浓度和细胞浓度下经转染的Jurkat细胞的收率。
图54示出了比较商业化Lonza NUCLEOFECTOR 4DTM转染系统和本发明的装置的未经处理的T细胞和电穿孔的T细胞的流式细胞分析。上图示出了FSC/SSC总细胞图，下图示出了活力染色。死细胞群以红色箭头和红色方框表示。与未经处理的细胞相比，在24h时用Lonza NUCLEOFECTOR 4DTM转染的细胞也发生了形态变化，这表明在用Lonza平台进行电穿孔期间发生了表型变化。
图55示出了使用商业化Lonza LV转染系统和本发明的连续流装置评估的用FITC-葡聚糖或EGFP mRNA对5000万个原代T细胞进行电穿孔获得的总细胞收率的柱状图。
图56A-56B是显示在电穿孔后最多72小时期间使用本发明的连续流装置评估的FITC葡聚糖至10亿个THP-1细胞的悬浮液的递送的活力和效率的柱状图。图56A示出了THP-1细胞的活力。图56B示出了FITC葡聚糖至THP-1细胞的递送的效率。
图57是显示使用本发明的连续流装置评估的从10亿个THP-1细胞的悬浮液开始的活的可回收FITC葡聚糖转染的细胞的收率的柱状图。在电穿孔培养后最多72小时期间跟踪收率，该收率表示输入细胞数的大约50％。在电穿孔后4小时、24小时、48小时和72小时经由流式细胞术进行分析。
图58A-58D是比较使用本发明的装置评估的波形形状和波形电压对FITC葡聚糖至Jurkat细胞的转染的总细胞计数、活力、效率和收率的影响的柱状图。图58A示出了在不同的波形形状和电压下回收的Jurkat细胞的数量。图58B示出了在不同的波形形状和电压下经转染的Jurkat细胞的活力。图58C示出了在不同的波形形状和电压下FITC葡聚糖至Jurkat细胞的转染的效率。图58D示出了在不同的波形形状和电压下经转染的Jurkat细胞的收率。
图59A-59D是比较使用本发明的装置评估的波形最大电压和占空比对FITC葡聚糖至原代T细胞的转染的总细胞计数、活力、效率和收率的影响的柱状图。图59A示出了在不同的波形最大电压和占空比下回收的原代T细胞的数量。图59B示出了在不同的波形最大电压和占空比下经转染的原代T细胞的活力。图59C示出了在不同的波形最大电压和占空比下FITC葡聚糖至原代T细胞的转染的效率。图59D示出了在不同的波形最大电压和占空比下经转染的原代T细胞的收率。
图60A-60D是比较使用本发明的装置评估的波形最大电压和占空比对mRNA至原代T细胞的转染的总细胞计数、活力、效率和收率的影响的柱状图。图60A示出了在不同的波形最大电压和占空比下回收的原代T细胞的数量。图60B示出了在不同的波形最大电压和占空比下经转染的原代T细胞的活力。图60C示出了在不同的波形最大电压和占空比下mRNA至原代T细胞的转染的效率。图60D示出了在不同的波形最大电压和占空比下经转染的原代T细胞的收率。
图61是显示使用本发明的装置评估的CD3/CD28 Dynabead至100万个原代人T细胞的悬浮液的递送的效率的柱状图。在存在和不存在Dynabead的情况下进行电穿孔，其中Dynabead掺入在5分钟或过夜时出现。在电穿孔后24小时经由流式细胞术进行分析。
图62A-62B示出了外部结构的实施方案，所述外部结构被构造为包裹本发明的装置的电极。图62A示出了被构造有闩锁和蛤壳型铰链以包裹本发明的装置的外部结构。图62B示出了图62A的外部结构，其中本发明的装置放置在外部结构的相应内部凹口内。
图63A-63B是显示使用本发明的装置(具有和不具有覆盖装置的电极的外部结构)评估的FITC葡聚糖至THP-1单核细胞的递送的活力和效率的柱状图。在电穿孔后24小时经由流式细胞术进行分析。
图63A示出了THP-1单核细胞的活力。图63B示出了THP-1单核细胞的转染的效率。
图64A-64B是显示使用由不同的聚合物树脂制造的本发明的装置评估的FITC葡聚糖至THP-1单核细胞的递送的活力和效率的柱状图。图64A示出了经转染的THP-1单核细胞的活力。图64B示出了FITC葡聚糖至THP-1单核细胞的转染的效率。
图65A-65B是比较使用手动操作的本发明的装置或使用自动化流体处理平台评估的编码GFP的DNA和mRNA二者至Jurkat细胞的递送的活力和效率的柱状图。图65A示出了经转染的Jurkat细胞的活力。图65B示出了编码GFP的DNA和mRNA至Jurkat细胞的转染的效率。
图66A-66E是比较使用手动操作的本发明的装置或使用自动化流体处理平台评估的编码GFP和mCherry二者的多个mRNA至T细胞的平行(同一天)或连续(相隔2天)递送的活力和效率的柱状图和点图。图66A示出了在电穿孔后24小时编码mCherry的多个mRNA的递送的T细胞活力。图66B示出了在电穿孔后24小时的GFP效率。图66C示出了在电穿孔后24小时的mCherry效率。图66D示出了在电穿孔后24小时的GFP和mCherry二者的效率。图66E示出了在24小时时GFP(x轴)和mCherry(y轴)二者的表达的点图。
图67A-67B是显示使用本发明的装置评估的mRNA至外周血单核细胞(PBMC)的递送的效率的柱状图。这些实验使用商购获得的编码GFP的mRNA来进行，然后对表面受体进行表型染色以鉴定特定细胞群。图67A示出了T细胞亚群中的效率，图67B示出了来自PBMC的非T细胞群中的效率。在电穿孔后24小时经由流式细胞术进行分析。
图68是本发明的系统的实施方案的照片，所述系统具有与第一入口流体连通的储集器(袋)和与第二出口流体连通的储集器(袋)。
图69A是一组显微照片，这些显微照片示出了使用本发明的装置评估的相对于未经处理的对照的eGFP-mRNA表达。图69B和69C是显示活细胞百分比(图69B)和GFP+细胞百分比(图69C)的柱状图。
图70A-70D是显示总NK细胞回收率(图70A)、活力(图70B)、转染效率(图70C)和GFP+细胞收率(图70D)的柱状图。
图71A和71B是显示“无电穿孔”对照(左侧第一条柱)、本发明的装置(Kytopen；左侧第二条柱)和两个传统平台——Thermo(Neon Transfection System)和Lonza 4D-Nucleofector(分别为第三和第四条柱)之间的跨平台比较的柱状图。图71A示出了活力％。图71B示出了转染效率％。
图71C是显示在图71A和71B中比较的三个平台之间的基因表达差异的热图。相对于未经处理的细胞，深色阴影对应于更大程度的基因表达差异。
图72A-72D是在转染后24小时每个反应的相对细胞计数、活力(7-AAD-细胞百分比)、效率(活GFP+细胞百分比)和细胞收率计数(活GFP+细胞计数)的热图，显示为不同的Vrms(y轴)和流速(x轴)的函数。
图73A-73D是在转染后24小时每个反应的相对细胞计数、活力(7-AAD-细胞百分比)、效率(活GFP+细胞百分比)和细胞收率计数(活GFP+细胞计数)的热图，显示为不同的Vrms(y轴)和流速(x轴)的函数。
图74是显示不同的施加能量(Vrms 2/R)s和流速的活细胞收率的密度图。
在将值描述为范围的情况下，应当理解，这种公开包括在该范围内的所有可能的子范围的公开，以及落入该范围内的具体数值，而与是否明确指出具体数值或具体子范围无关。
如本文所用，术语“约”是指所列举的值的+/-10％。
如本文所用，术语“多个”是指多于一个。
如本文所用，术语“基本上均一的”是指+/-5％的差异。
如本文所用，术语“最小横截面尺寸”是指直线的最小长度，所述直线的最小长度通过管腔的横截面的几何中心并且在横截面的同一平面上与管腔的内壁相交两次。
除非另外指明，否则术语“横截面面积”是指横向横截面的面积(例如，沿着垂直于纵轴或流动方向的平面)。
如本文所用，术语“流体连接”是指至少两个装置元件(例如电穿孔装置，储集器等)之间的直接连接，所述直接连接允许流体在此类装置元件之间移动而不通过中间元件。
如本文所用，术语“流体连通”是指至少两个装置元件(例如电穿孔区，储集器等)之间的间接连接，所述间接连接允许流体在此类装置元件之间移动，例如通过中间元件(例如，通过中间管道、中间通道等)。例如，在其中流体从第一电极的管腔通过电穿孔区流入第二电极的管腔的实施方案中，第一电极与第二电极流体连通。
如本文所用，术语“管腔”是指本发明的装置的电极的内部空腔，所述空腔允许流体通过。电极管腔的一部分或全部可以是导电的或不导电的。例如，电极的管腔可以包裹不完全围绕管腔周边的C形导电元件。在其他实施方案中，电极基本上完全由传输电流的导电材料组成。当将电势差施加于本发明的装置的第一电极和第二电极时，可以在第一电极或第二电极中的任一者的管腔中产生的电场不足以使细胞电穿孔在管腔内发生。
如本文所用，术语“进入区”包括本发明的装置的第一电极的管腔，在电穿孔前，流体和悬浮于流体中的多个细胞可以通过所述管腔。进入区可以另外包括与本发明的装置的第一电极的管腔流体连通的附加储集器。当将电势差施加于本发明的装置的第一电极和第二电极时，可以在本发明的装置的进入区内产生的电场不足以使细胞电穿孔发生。
如本文所用，术语“回收区”包括本发明的装置的第二电极的管腔，在电穿孔后，流体和悬浮于流体中的多个细胞可以通过所述管腔。回收区可以另外包括与本发明的装置的第二电极的管腔流体连通的附加储集器。当将电势差施加于本发明的装置的第一电极和第二电极时，可以在本发明的装置的回收区内产生的电场不足以使细胞电穿孔发生。
如本文所用，术语“电穿孔区”是指设置在上游电极的出口(例如，第一出口)和下游电极的入口(例如，第二入口)之间并且与它们流体连通的装置的一部分。电场被递送到电穿孔区中的流体。
如本文所用，术语“转染”是指可以利用除病毒递送方法之外的手段(诸如生物、化学、电、机械或物理方法)将有效负载引入细胞的过程。
如本文所用，术语“电穿孔”是指利用施加的电场在细胞膜中产生小孔的过程，有效负载可以通过所述小孔被引入细胞中(例如，作为转染方法)。
如本文所用，术语“机电递送”是可以利用施加的电场和/或机械穿孔机构的任何组合将有效负载引入细胞的转染过程。这种递送方法具有减少和/或稳定电穿孔区中的细胞的总电场暴露的潜力，从而提高细胞活力和/或转染效率，或者它们二者。本发明的装置被构造为通过机电递送而不是通过单独的电穿孔来转染细胞。
具体实施方式
与传统的基于比色杯的电穿孔方法或商购获得的电穿孔仪器相比，本发明提供用于通过以较大的体积、更高的转染效率、更高的通量、更高的回收率、更高的收率和更高的细胞活力电穿孔来对细胞(例如，原代T细胞)进行转染的装置、系统和方法。具体而言，提供了可以以流经方式、连续方式或使用本发明的多个电穿孔装置进行电穿孔以增加通量和细胞数的系统和方法。
装置
通常，本发明的装置被构造为流经可以与现有的液体处理装置、泵或流体运输设备(诸如常规移液器吸头机器人或大规模液体处理系统)对接的装置，以提供悬浮于流体中的细胞的连续电穿孔。本发明的装置被构造用于通过与静态电穿孔系统中的递送机构不同的机电递送机构而在电穿孔区内进行细胞转染。本发明的装置的通常特征在于三个不同的区域：第一电极，所述第一电极具有第一入口和第一出口，其中第一电极的管腔限定进入区；第二电极，所述第二电极具有第二入口和第二出口，其中所述第二电极的管腔限定回收区；以及电穿孔区，所述电穿孔区与第一电极的第一出口和第二电极的第二入口流体连接。图1A中示出了本发明的装置的实施方案的实例，其中第一电极和第二电极通过它们之间的电穿孔区流体连接。当将电势差施加于第一电极和第二电极时，在两个电极之间的空间(例如，电穿孔区)中产生局部电场，并且对暴露于电场的细胞进行电穿孔。本发明的单个装置可以包括两个电极，如图1A-1C所示；或者，本发明的单个装置可以包括三个或更多个电极，这些电极限定多个电穿孔区，从而允许对悬浮于流体中的细胞进行多次电穿孔。本发明的装置可以包括在第一电极和第二电极之间的多个电穿孔区，以允许细胞在单个装置或多个装置中流动时经过不同的电场，例如，由所述多个电穿孔区中的每个的不同几何形状产生的电场。
在一些情况下，第一电极和第二电极可以是导电线、中空圆柱体、导电薄膜、金属泡沫、网状电极、液体可扩散膜、导电液体或它们的任何组合，可以包括在装置中。电极可以平行于装置的流体流的轴对齐，或者可以垂直于装置的流体流的轴对齐。例如，第一电极和第二电极可以是平行于装置内的流体流的轴布置的中空圆柱体电极，诸如图1A-1C的的装置所示，以使得流体流过电极。在一个替代性实例中，第一电极和/或第二电极可以由具有与装置的流体流的轴对齐的孔的多孔导体(例如，金属网)制成。在一个替代性实例中，第一电极和/或第二电极可以是导电流体，例如液体。在一些情况下，第一电极和第二电极可以被构造为围绕电穿孔区的由固体导体(例如，导线)制成的螺旋，例如双螺旋。在这种构型中，电穿孔区的横截面尺寸保持基本均一，但是第一电极和第二电极沿着电穿孔区的长度改变位置。第一电极和第二电极与电穿孔区流体连通，但是电势差施加于电极时产生的电场随着悬浮于流体中的细胞行进通过本发明的装置而旋转。在某些实施方案中，第一电极和第二电极被包埋于本发明的装置中，并且具有设置在电穿孔区的流体连接之处或附近的有源区域，以使得携带悬浮中的细胞的流体接触电极的一部分，并且在电穿孔区中产生电场。
当电极被构造为中空圆柱体电极时，电极的直径可以为从约0.1mm至约5mm，例如，从约0.1mm至约1mm、从约0.5mm至约1.5mm、从约1mm至约2mm、从约1.5mm至约2.5mm、约2mm至约3mm、从约2.5mm至约3.5mm、约3mm至约4mm、从约3.5mm至约4.5mm、或约4mm至约5mm，例如，约0.1mm、约0.2mm、约0.3mm、约0.4mm、约0.5mm、约0.6mm、约0.7mm、约0.8mm、约0.9mm、约1mm、约1.1mm、约1.2mm、约1.3mm、约1.4mm、约1.5mm、约1.6mm、约1.7mm、约1.8mm、约1.9mm、约2mm、约2.1mm、约2.2mm、约2.3mm、约2.4mm、约2.5mm、约2.6mm、约2.7mm、约2.8mm、约2.9mm、约3mm、约3.1mm、约3.2mm、约3.3mm、约3.4mm、约3.5mm、约3.6mm、约3.7mm、约3.8mm、约3.9mm、约4mm、约4.1mm、约4.2mm、约4.3mm、约4.4mm、约4.5mm、约4.6mm、约4.7mm、约4.8mm、约4.9mm、或约5mm。示例性电极外径为1.3mm，对应于16号电极。
在一些实施方案中，当本发明的装置被构造为包括中空圆柱体电极时，电极的管腔(例如，第一电极或第二电极)可以包括不受电穿孔区的电场影响的区，例如，进入区或回收区。如图1A所示，进入区可以是进入电穿孔区前的第一电极的管腔，其中待电穿孔的悬浮液中的细胞以及待递送至细胞的组合物定位于所述管腔处。回收区可以是在离开电穿孔区后的第二电极的管腔，其中已经递送有组合物的细胞移动至所述管腔之处，以便可以封闭细胞膜中的孔，从而确保递送的组合物保留在细胞内。在这种构型中，当细胞通过第一电极的管腔并且朝向第二电极的管腔时，第一电极通电，第二电极保持接地，在电穿孔区中产生局部电场，从而对通过装置的细胞进行电穿孔。
电穿孔区与本发明的装置的第一电极和第二电极流体连接，并且当电极通电时，在它们之间产生局部电场。电穿孔区的横截面形状可以是允许细胞通过电穿孔区和电穿孔区内的电场的任何合适的形状。横截面形状可以是例如圆形、椭圆形或多边形，例如正方形、矩形、三角形、n边形(例如，具有4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个边的规则或不规则多边形)、星形、平行四边形、梯形或不规则形状(例如，椭圆形或曲线形)。在一些情况下，电穿孔区是沿着其长度具有基本上均一的横截面尺寸的通道，例如，电穿孔区可以具有圆形横截面，其中从进入区的流体连接至回收区的流体连接的直径是常数。在这种构型中，产生的电场更均匀，从而允许产生更可预测的悬浮于流体中的细胞的电场暴露。或者，电穿孔区的横截面尺寸可以沿着长度而变化。例如，电穿孔区的横截面尺寸可以沿着其长度增加或减小，或者可以沿着其长度具有多于一个尺寸变化，例如横截面尺寸，例如直径可以增加或减小至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％，或者至多1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％。在这种构型中，电穿孔区可以具有截短的锥形横截面，其直径从顶部开孔至底部开孔而增大或从顶部开孔至底部开孔而减小。在一些情况下，本发明的装置可以包括多个串联流体连接的电穿孔区，每个电穿孔区具有均一的或不均一的横截面，并且每个电穿孔区都可以具有不同的横截面形状。作为非限制性实例，本发明的装置可以包括多个串联连接的电穿孔区，所述多个电穿孔区中的每个具有不同横截面尺寸的圆柱体横截面，例如，每个电穿孔区具有不同的横截面直径。
在一些实施方案中，电穿孔区的横截面尺寸可以为从约0.005mm至约50mm，例如，约0.005mm至约0.05mm、约0.01mm至约0.1mm、约0.05mm至约0.5mm、约0.1mm至约1mm、约0.5mm至约1mm，从约0.5mm至约2mm、约0.7mm至约1.5mm、约1mm至约5mm、约3mm至约7mm、约5mm至约10mm、约7mm至约12mm、约10mm至约15mm、约13mm至约18mm、约15mm至约20mm、约22mm至约30mm约25mm至约35mm、约30mm至约40mm、约35mm至约45mm、或约40mm至约50mm，例如，约0.005mm、约0.006、约0.007mm、约0.008mm、约0.009mm、约0.01mm、约0.02mm、约0.03mm、约0.04mm、约0.05mm、约0.06mm、约0.07mm、约0.08mm、约0.09mm、约0.1mm、约0.2mm、约0.3mm、约0.4mm、约0.5mm、约0.6mm、约0.7mm、约0.8mm、约0.9mm、约1mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约11mm、约12mm、约13mm、约14mm、约15mm、约16mm、约17mm、约18mm、约19mm、约20mm、约21mm、约22mm、约23mm、约24mm、约25mm、约26mm、约27mm、约28mm、约29mm、约30mm、约31mm、约32mm、约33mm、约34mm、约35mm、约36mm、约37mm、约38mm、约39mm、约40mm，约41mm、约42mm、约43mm、约44mm、约45mm、约46mm、约47mm、约48mm、约49mm、或约50mm。一般而言，电穿孔区的直径被设置为使其不具有接触细胞以通过通道壁使细胞膜变形的收缩部，例如，由于细胞挤压导致的机械变形不会引起细胞穿孔-例如，细胞可以自由地通过电穿孔区。
在一些情况下，电穿孔区的长度可以为从约0.005mm至约50mm，例如约0.005mm至约0.05mm、约0.01mm至约0.1mm、约0.05mm至约0.5mm、约0.1mm至约1mm、从约0.5mm至约2mm、约1mm至约5mm、约3mm至约7mm、约4mm至约8mm、约5mm至约10mm、约7mm至约12mm、约10mm至约15mm、约13mm至约18mm、约15mm至约20mm、约22mm至约30mm、约25mm至约35mm、约30mm至约40mm、约35mm至约45mm、或约40mm至约50mm，例如，约0.005mm、约0.006、约0.007mm、约0.008mm、约0.009mm、约0.01mm、约0.02mm、约0.03mm、约0.04mm、约0.05mm、约0.06mm、约0.07mm、约0.08mm、约0.09mm、约0.1mm、约0.2mm、约0.3mm、约0.4mm、约0.5mm、约0.6mm、约0.7mm、约0.8mm、约0.9mm、约1mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约11mm、约12mm、约13mm、约14mm、约15mm、约16mm、约17mm、约18mm、约19mm、约20mm、约21mm、约22mm、约23mm、约24mm、约25mm、约26mm、约27mm、约28mm、约29mm、约30mm、约31mm、约32mm、约33mm、约34mm、约35mm、约36mm、约37mm、约38mm、约39mm、约40mm、约41mm、约42mm、约43mm、约44mm、约45mm、约46mm、约47mm、约48mm、约49mm、或约50mm。
进入区和/或回收区的横截面尺寸可以独立地基本上等于电穿孔区的横截面尺寸。或者，进入区和/或回收区可以独立地小于或大于电穿孔区的横截面尺寸。例如，当进入区和/或回收区的横截面尺寸被独立地构造为小于电穿孔区的横截面尺寸时，进入区和/或回收区的横截面尺寸可以为电穿孔区的横截面尺寸的约0.01％至约100％、约0.01％至约1％、约0.1％至约10％、约1％至约5％、约1％至约10％、约5％至约25％、约5％至约10％、约10％至约25％、约10％至约50％、约25％至约75％、或约50％至约100％，例如，约0.01％、约0.02％、约0.03％、约0.04％、约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％、约0.1％、约0.15％、约0.2％、约0.25％、约0.3％、约0.35％、约0.4％、约0.45％、约0.5％、约0.55％、约0.6％、约0.65％、约0.7％、约0.75％、约0.8％、约0.85％、约0.9％、约0.95％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或约100％。
或者，当进入区和/或回收区的横截面尺寸被独立地构造为大于电穿孔区的横截面尺寸时，进入区和/或回收区的横截面尺寸可以为电穿孔区的横截面尺寸的约100％至约100,000％，例如，约100％至约1000％、约100％至约250％、约100％至约500％、约250％至约750％、约500％至约1,000％、约500％至约5,000％、约1,000％至约10,000％、约5,000％至约25,000％、约10,000％至约50,000％、约25,000％至约75,000％、或约50,000％至约100,000％，例如约100％、约150％、约175％、约200％、约225％、约250％、约300％、约250％、约400％、约450％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％、约1,000％、约2,000％、约3,000％、约4,000％、约5,000％、约6,000％、约7,000％、约8,000％、约9,000％、约10,000％、约15,000％、约20,000％、约25,000％、约30,000％、约35,000％、约40,000％、约45,000％、约50,000％、约55,000％、约60,000％、约65,000％、约70,000％、约75,000％、约80,000％、约85,000％、约90,000％、约95,000％、或约100,000％。
本发明的装置可以另外包括一个或多个用于流体试剂(例如，缓冲溶液)或样品(例如，细胞的悬浮液和待引入细胞的组合物)的储集器。例如，本发明的装置可以包括用于使悬浮于流体中的细胞在第一电极中流动至电穿孔区的储集器和/或用于保持已经电穿孔的细胞的储集器。类似地，可以存在用于使液体在装置的附加部件(诸如与第一电极或第二电极相交的附加入口)中流动的储集器。单个储集器可以另外连接至本发明的多个装置，例如，在相同的液体被引入两个或更多个本发明的单独装置(被构造为并联地或串联地对细胞进行电穿孔)的情况下。或者，本发明的装置可以被构造为与液体源配合，所述液体源可以是外部储集器(诸如，小瓶、管或囊袋)。类似地，装置可以被构造为与容纳储集器的单独的部件配合。储集器可以具有任何适当的尺寸，例如，以容纳10mL至5000mL，例如，10mL至3000mL、25mL至100mL、100mL至1000mL、40mL至300mL、1mL至100mL、10mL至500mL、250mL至750mL、250mL至1000mL、或1000mL至5000mL。当存在多个储集器时，每个储集器可以具有相同的或不同的尺寸。
除上文讨论的部件之外，本发明的装置可以包括附加部件。例如，本发明的装置的第一电极和第二电极可以包括一个或多个附加流体入口，以允许将非样品流体(例如，缓冲溶液)引入装置的适当区。例如，本发明的装置的回收区可以包括附加入口和出口，以循环回收缓冲液，从而有助于封闭由于电穿孔过程而打开的细胞膜中的孔。
系统和套件
本发明的一个或多个电穿孔装置可以与各种外部部件(例如，电源、泵、储集器(例如，袋)、控制器、试剂、液体和/或样品)以系统的形式组合。在一些实施方案中，本发明的系统包括本发明的多个装置和电势源，所述电势源可释放地连接至本发明的一个或多个装置的第一电极和第二电极。在这种构型中，本发明的一个或多个装置被连接至电势源，并且第一电极通电且第二电极保持接地。这在电穿孔区中产生局部电场，从而对通过一个或多个装置的细胞进行电穿孔。包括本发明的装置的电穿孔系统可以诱导通过本发明的装置和系统的细胞的可逆或不可逆电穿孔。例如，本发明的装置和系统可以诱导悬浮于流体中的细胞的基本上非热可逆电穿孔、基本上非热不可逆电穿孔或基本上热不可逆电穿孔。
在一些情况下，与第一电极和第二电极的可释放连接可以包括可以在电势源与第一电极和第二电极之间维持一致的电接触点的任何实际机电连接。示例性电连接包括但不限于钳子、夹子(例如，鳄鱼夹)、弹簧(例如，片弹簧)、外部护套或套筒、钢丝刷、柔性导体、弹簧针、机械连接、感应连接或它们的组合。其他类型的电连接是本领域已知的。例如，可以将弹簧型电极整合进诸如图2A-2B所示的导电平台中。在图2A-2B所示的实施方案中，本发明的装置被插入壳体中，从而将彼此电绝缘的两个导电网纳入到基部上，所述基部含有用于容纳本发明的装置的单独的开口。本发明的装置可以被安装到导电网中的开口中，以使得装置的第一电极和第二电极可以接触导电网。具体而言，导电网包括弹簧加载的电极，例如连接至弹簧的电极，以使得当将本发明的装置安装到导电网的开口中时，弹簧加载的电极移位和压缩弹簧(它还提供对本发明的装置的第一电极和第二电极的恢复力)，从而确保本发明的装置和电势源之间的电接触。
电势源被构造为将施加的电压递送至一个或多个电极，以便在电极之间提供电势差，从而在电穿孔区中建立均匀的电场。在一些情况下，诸如在双电极电穿孔电路中，施加的电压被递送至第一电极，并且第二电极保持接地。不希望受任何特定理论的束缚，以特定的幅度、特定的频率、特定的脉冲形状、特定的持续时间、特定的施加脉冲数和特定的占空比将施加的电压递送至电极。这些参数与电穿孔区的几何形状有关，它们将在电穿孔区内递送特定的电场，悬浮于流体中的细胞将经历所述电场。可以针对特定的细胞系和/或递送至特定细胞系的组合物优化本文所述的电参数。将电势施加于本发明的一个或多个的装置的电极可以通过可操作地耦合至电势源的控制器(例如，编程的计算机)来启动和/或控制。
本发明的装置的几何形状(例如，电穿孔区的横截面的形状和尺寸)以及本文所述的电势参数，控制电穿孔区内的所得的电场的形状和强度。通常，含有具有均一的横截面的电穿孔区的装置将展示出沿着其长度均匀的电场。为了调节电穿孔区中的所得的电场，电穿孔区可以包括沿着其长度的多个不同的横截面尺寸和/或不同的横截面形状。作为非限制性实例，本发明的装置可以包括多个串联连接的电穿孔区，所述多个电穿孔区中的每个具有不同横截面尺寸的圆形横截面，例如，每个电穿孔区具有不同的横截面直径。在这种构型中，电穿孔区的不同直径的圆形横截面各自作为独立的电穿孔区，并且在相同的施加电压(例如，恒定的DC电压)下，每个电穿孔区在每次尺寸变化时都将诱导不同的电场。
在一些情况下，本发明的装置可以包括多个串联流体连接的电穿孔区，每个电穿孔区具有均一的或不均一的横截面，并且每个电穿孔区都可以具有不同的横截面形状。或者，本发明的系统可以包括处于并联构型的本发明的多个装置，其中每个装置彼此独立地工作以增加电穿孔的总通量。
在一些情况下，施加的电压的幅度为从大约-3kV至3kV，例如，约-3kV至约-0.1kV、约-2kV至约-0.1kV、约-1kV至约-0.1kV、约-0.1kV至约-0.01kV、0.01kV至约3kV，例如，约0.01kV至约0.1kV、约0.02kV至约0.2kV、约0.03kV至约0.3kV、约0.04kV至约0.4kV、约0.05kV至约0.5kV、约0.06kV至约0.6kV、约0.07kV至约0.7kV、约0.08kV至约0.8kV、约0.09kV至约0.9kV、约0.1kV至约1kV、约0.1kV至约2.0kV、约0.1kV至约3kV、约0.15kV至约1.5kV、约0.2kV至约2kV、约0.25kV至约2.5kV，或约0.3kV至约3kV，例如，约0.01至约1kV、约0.1kV至约0.7kV，或约0.2至约0.6kV，例如，约0.01kV、约0.02kV、约0.03kV、约0.04kV、约0.05kV、约0.06kV、约0.07kV、约0.08kV、约0.09kV、约0.1kV、约0.2kV、约0.3kV、约0.4kV、约0.5kV、约0.6kV、约0.7kV、约0.8kV、约0.9kV、约1kV、约1.1kV、约1.2kV、约1.3kV、约1.4kV、约1.5kV、约1.6kV、约1.7kV、约1.8kV、约1.9kV、约2kV、约2.1kV、约2.2kV、约2.3kV、约2.4kV、约2.5kV、约2.6kV、约2.7kV、约2.8kV、约2.9kV，或约3kV。
在一些情况下，施加的电压的频率为从约1Hz至约50,000Hz，例如，从约1Hz至约1,000Hz、约1Hz至约500Hz、约100Hz至约500Hz、约100Hz至约5,000Hz、约500Hz至约10,000Hz、约1000Hz至约25,000Hz、或从约5,000Hz至约50,000Hz，例如，从约10Hz至约1000Hz、约10Hz至约500Hz、约500Hz至约750Hz、或约100Hz至约500Hz，例如，从约1Hz、约2Hz、约3Hz、约4Hz、约5Hz、约6Hz、约7Hz、约8Hz、约9Hz、约10Hz、约20Hz、约30Hz、约40Hz、约50Hz、约60Hz、约70Hz、约80Hz、约90Hz、约100Hz、约110Hz、约120Hz、约130Hz、约140Hz、约150Hz、约160Hz、约170Hz、约180Hz、约190Hz、约200Hz、约210Hz、约220Hz、约230Hz、约240Hz、约250Hz、约260Hz、约270Hz、约270Hz、约280Hz、约290Hz、约300Hz、约310Hz、约320Hz、约330Hz、约340Hz、约350Hz、约360Hz、约370Hz、约380Hz、约390Hz、约400Hz、约410Hz、约420Hz、约430Hz、约440Hz、约450Hz、约460Hz、约470Hz、约480Hz、约490Hz、约500Hz、约510Hz、约520Hz、约530Hz、约540Hz、约550Hz、约600Hz、约700Hz、约800Hz、约900Hz、约1,000Hz、约2,000Hz、约3,000Hz、约4,000Hz、约5,000Hz、约6,000Hz、约7,000Hz、约8,000Hz、约9,000Hz、约10,000Hz、约15,000Hz、约20,000Hz、约25,000Hz、约30,000Hz、约35,000Hz、约40,000Hz、约45,000Hz、或约50,000Hz。
在一些实施方案中，施加的脉冲的形状(例如波形)可以是方波波形、脉冲波形、双极波形、正弦波形、斜坡波形、不对称双极波形或任意波形。其他电压波形是本领域已知的。所选的波形可以以任何实际电压模式施加，包括但不限于高压-低压、低压-高压、直流(DC)、交流(AC)、单极、仅正(+)极性、仅负(-)极性、(+)/(-)极性、(-)/(+)极性或者它们的任何叠加或组合。技术人员可以理解，这些脉冲参数将取决于细胞系，被递送至细胞的组合物的任何电学特征。
施加的电压脉冲可以以约0.01ms至约1,000ms，例如，从约0.01ms至约1ms、约0.1ms至约10ms、约0.1ms至约15ms、约1ms至约10ms、约1ms至约50ms、约10ms至约100ms、约25ms至约200ms、约50ms至约400ms、约100ms至约600ms、约300ms至约800ms、或约500ms至约1,000ms，例如，约0.01ms至100ms、约0.1ms至约50ms、或约1ms至约10ms，例如，约0.01ms、约0.02ms、约0.03ms、约0.04ms、约0.05ms、约0.06ms、约0.07ms、约0.08ms、约0.09ms、约0.1ms、约0.2ms、约0.3ms、约0.4ms、约0.5ms、约0.6ms、约0.7ms、约0.8ms、约0.9ms、约1ms、约2ms、约3ms、约4ms、约5ms、约6ms、约7ms、约8ms、约9ms、约10ms、约11ms、约12ms、约13ms、约14ms、约15ms、约20ms、约30ms、约40ms、约50ms、约60ms、约70ms、约80ms、约90ms、约100ms、约150ms、约200ms、约250ms、约300ms、约350ms、约400ms、约450ms、约500ms、约550ms、约600ms、约650ms、约700ms、约750ms、约800ms、约850ms、约900ms、约950ms、或约1,000ms的持续时间递送至电穿孔区。
在一些情况下，施加的递送电压脉冲的数量可以为从0至约1000，或更多，例如，1或更多、2或更多、3或更多、4或更多、5或更多、6或更多、7或更多、8或更多、9或更多、10或更多、或者100或更多，例如，1-4、2-5、3-6、4-7、5-8、6-9、7-10、8-11、7-12、或9-13，例如，约0.01至约1,000、例如，从约1至约10、约1至约50、约5至约10、约5至约15、约10至约100、约25至约200、约50至约400、约100至约600、约300至约800、或约500至约1,000，例如，约1至100、约1至约50、或约1至约10，例如，约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950、或约1,000。
在一些情况下，施加的递送电压脉冲的数量可以为从1至约1,000,000。例如，在一些情况下，施加的递送电压脉冲的数量为从1,000至1,000,000，例如，从1,000至10,000(例如，从1,000至2,000、从2,000至3,000、从3,000至4,000、从4,000至5,000、从5,000至6,000、从6,000至7,000、从7,000至8,000、从8,000至9,000、或从9,000至10,000，例如，约1,000、约2,000、约3,000、约4,000、约5,000、约6,000、约7,000、约8,000、约9,000、或约10,000)、从10,000至100,000(例如，从10,000至20,000、从20,000至30,000、从30,000至40,000、从40,000至50,000、从50,000至60,000、从60,000至70,000、从70,000至80,000、从80,000至90,000、或从90,000至100,000，例如，约10,000、约25,000、约30,000、约40,000、约50,000、约60,000、约70,000、约75,000、约80,000、约90,000、或约100,000)、或从100,000至1,000,000(例如，从100,000至200,000、从200,000至300,000、从300,000至400,000、从400,000至500,000、从500,000至600,000、从600,000至700,000、从700,000至800,000、从800,000至900,000、或从900,000至1,000,000，例如，约100,000、约200,000、约250,000、约300,000、约400,000、约500,000、约600,000、约700,000、约750,000、约800,000、约900,000、或约1,000,000)。
在一些情况下，施加的电压的脉冲可以以以下占空比递送：约0.001％至约100％，例如从约0.001％至约0.1％、约0.01％至约1％、约0.1％至约5％、约1％至约10％、约2.5％至约20％、约5％至约40％、约10％至约60％、约30％至约80％、或约50％至约100％，例如，约0.01％至100％、约0.1％至约99％、约1％至约97％、或约10％至约95％，例如，约0.001％、约0.002％、约0.003％、约0.004％、约0.005％、约0.006％、约0.007％、约0.008％、约0.009％、约0.01％、约0.02％、约0.03％、约0.04％、约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或约100％。
当电极被连接至电势源并通电时，本发明的一个或多个装置在电穿孔区中产生局部电场，所述电穿孔区对通过的细胞进行电穿孔。在一些情况下，在电穿孔区中产生的电场具有的幅度为约2V/cm至约50,000V/cm，例如，约2V/cm至约1,000V/cm、约100V/cm至约1,000V/cm、约100V/cm至约5,000V/cm、约500V/cm至约10,000V/cm、约1000V/cm至约25,000V/cm、或从约5,000V/cm至约50,000V/cm，例如，从约2V/cm至约20,000V/cm、约5V/cm至约10,000V/cm、或约100V/cm至约1,000V/cm，例如，从约2V/cm、约3V/cm、约4V/cm、约5V/cm、约6V/cm、约7V/cm、约8V/cm、约9V/cm、约10V/cm、约20V/cm、约30V/cm、约40V/cm、约50V/cm、约60V/cm、约70V/cm、约80V/cm、约90V/cm、约100V/cm、约200V/cm、约300V/cm、约400V/cm、约500V/cm、约600V/cm、约700V/cm、约800V/cm、约900V/cm、约1,000V/cm、约2,000V/cm、约3,000V/cm、约4,000V/cm、约5,000V/cm、约6,000V/cm、约7,000V/cm、约8,000V/cm、约9,000V/cm、约10,000V/cm、约15,000V/cm、约20,000V/cm、约25,000V/cm、约30,000V/cm、约35,000V/cm、约40,000V/cm、约45,000V/cm、或约50,000V/cm。
本发明的系统通常包括流体递送源，所述流体递送源被构造为将悬浮于流体中的所述多个细胞通过第一电极(例如，进入区)递送至第二电极(例如，回收区)。流体递送源通常包括泵，包括但不限于注射泵、微泵或蠕动泵。或者，流体可以通过工作流体相对于待递送的流体的储集器的位移来递送，或通过空气置换来递送。其他流体递送源是本领域已知的。在一些情况下，流体递送源被构造为通过正压的施加来使悬浮于流体中的细胞流动。不希望受任何特定理论的束缚，悬浮中的细胞流过本发明的装置的流速以及本发明的装置的电穿孔区的特定几何形状将确定细胞在电穿孔区中的电场中的停留时间。
在一些情况下，从流体递送源递送的流体的体积流速具有的体积流速为约0.001mL/min至约1,000mL/min，例如，从约0.001mL/min至约0.1mL/min、约0.01mL/min至约1mL/min、约0.1mL/min至约10mL/min、约1mL/min至约50mL/min、约10mL/min至约100mL/min、约25mL/min至约200mL/min、约50mL/min至约400mL/min、约100mL/min至约600mL/min、约300mL/min至约800mL/min、或约500mL/min至约1,000mL/min，例如，约0.001mL/min、约0.002mL/min、约0.003mL/min、约0.004mL/min、约0.005mL/min、约0.006mL/min、约0.007mL/min、约0.008mL/min、约0.009mL/min、约0.01mL/min、约0.02mL/min、约0.03mL/min、约0.04mL/min、约0.05mL/min、约0.06mL/min、约0.07mL/min、约0.08mL/min、约0.09mL/min、约0.1mL/min、约0.2mL/min、约0.3mL/min、约0.4mL/min、约0.5mL/min、约0.6mL/min、约0.7mL/min、约0.8mL/min、约0.9mL/min、约1mL/min、约2mL/min、约3mL/min、约4mL/min、约5mL/min、约6mL/min、约7mL/min、约8mL/min、约9mL/min、约10mL/min、约15mL/min、约20mL/min、约25mL/min、约30mL/min、约35mL/min、约40mL/min、约45mL/min、约50mL/min、约55mL/min、约60mL/min、约65mL/min、约70mL/min、约75mL/min、约80mL/min、约85mL/min、约90mL/min、约95mL/min、约100mL/min、约150mL/min、约200mL/min、约250mL/min、约300mL/min、约350mL/min、约400mL/min、约450mL/min、约500mL/min、约550mL/min、约600mL/min、约650mL/min、约700mL/min、约750mL/min、约800mL/min、约850mL/min、约900mL/min、约950mL/min、或约1,000mL/min。在特定实施方案中，流速为从10mL/min至约100mL/min，例如，约10mL/min、20mL/min、30mL/min、40mL/min、50mL/min、60mL/min、70mL/min、80mL/min、90mL/min、或100mL/min。
在一些情况下，从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的雷诺数在0.04和2.43×104之间，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。在一些情况下，从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的最大速度在5×10-5m/s和32.7m/s之间，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。在一些情况下，从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的剪切速率在0.11/s和2×1061/s之间，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。在一些情况下，从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的峰值压力在1×10- 3Pa和9.5×104Pa之间，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。在一些情况下，从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的平均速度在1.5×10-5m/s和15.9m/s之间，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。在一些情况下，从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的运动粘度在1×10-6m2/s和15×10-4m2/s之间，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。
细胞在本发明的装置的电穿孔区中的停留时间可以为从约0.5ms至约50ms，例如，从约0.5ms至约5ms、约1ms至约10ms、约5ms至约15ms、约10ms至约20ms、约15ms至约25ms、约20ms至约30ms、约25ms至约35ms、约30ms至约40ms、约35ms至约45ms、或约40ms至约50ms，例如，约0.5ms、约0.6ms、约0.7ms、约0.8ms、约0.9ms、约1ms、约1.5ms、约2ms、约2.5ms、约3ms、约3.5ms、约4ms、约4.5ms、约5ms、约5.5ms、约6ms、约6.5ms、约7ms、约7.5ms、约8ms、约8.5ms、约9ms、约9.5ms、约10ms、约10.5ms、约11ms、约11.5ms、约12ms、约12.5ms、约13ms、约13.5ms、约14ms、约14.5ms、约15ms、约20ms、约25ms、约30ms、约35ms、约40ms、约45ms、或约50ms。在一些实施方案中，所述停留时间为5-20ms(例如，6-18ms、8-15ms或5-14ms)。
本发明的系统通常具有的特征在于容纳和支撑本发明的一个或多个装置和任何必要的电连接(例如，电极连接)的壳体。壳体可以被构造为保持和使本发明的单个装置通电，或者，壳体可以被构造为保持和使本发明的多个装置同时通电。例如，在图2A-2B所示的本发明的系统的实施方案中，壳体被构造为机架，所述机架可以容纳和使并联工作的本发明的96个单独的装置同时通电。壳体可以包括热控制器，所述热控制器能够在电穿孔期间调节本发明的装置的温度或者热调节系统的部件(例如流体，例如含有细胞的缓冲液或悬浮液)。热控制器可以被构造为加热本发明的装置或它们的系统的部件，冷却本发明的装置或它们的系统的部件，或者进行两种操作。当合适的热控制器被构造为加热本发明的装置或它们的系统的部件时，合适的热控制器包括但不限于加热块或罩、液体加热器(例如，浸没式或循环式流体浴、电池供电的加热器)或电阻加热器(例如，薄膜加热器，例如，加热带)。当合适的热控制器被构造为冷却本发明的装置或它们的系统的部件时，合适的热控制器包括但不限于液体冷却器(例如，浸没式或循环式流体浴、蒸发冷却器)或热电冷却器(例如，帕尔贴冷却器)。例如，当通过液体冷却实施时，本发明的装置或被构造为保持本发明的装置的壳体可以直接接触循环冷却流体的管道，或者围绕包括循环冷却流体的管道的冷却护套。其他加热和冷却元件是本领域已知的。
在一些实施方案中，壳体(例如，盒)被构造用于与自动化封闭系统一起使用和/或插入到自动化封闭系统中，所述自动化封闭系统用于在临床或医院环境中将细胞疗法递送给患者。
在一些实施方案中，壳体(例如，盒)还包括用于在样本的电穿孔期间、之前和之后进行细胞悬浮液和/或缓冲液储存的冷却/加热区域/壳体。在一些实施方案中，系统(例如，装置和壳体)是外部供电的。
在一些实施方案中，本发明的装置包括触摸屏使用者接口或其他替代性使用者接口，所述使用者接口允许使用者能够选择参数，诸如流速、波形、施加的电势、要转染的体积、时间延迟、冷却特征部、加热特征部、电穿孔或转染状态、进度，以及用于优化电穿孔或机电方案的其他参数。在一些实施方案中，使用者接口还包含预先设定的参数选择，允许使用者能够在特定参数和条件下操作系统，这些参数和条件此前已由使用者验证或由制造商推荐。在一些实施方案中，使用者接口可以连接至程序，以允许系统的自动运行和/或运行算法，以针对已知细胞类型的给定样品优化电穿孔。在一些实施方案中，如果使用者选择此功能，则优化算法具有独立或自主调整机电参数的能力。在一些实施方案中，优化算法允许连续调整在电穿孔或机电过程中使用的所述参数，所述参数可以取决于细胞类型、细胞悬浮液的电导率、细胞悬浮液的体积、粘度、一个或多个电穿孔盒的寿命、悬浮液的物理状态或一个或多个转染装置的状态。
在一些实施方案中，优化算法具有根据已知的输入细胞类型参数来执行预测分析以及相应地调整机电参数的能力。在一些实施方案中，优化算法根据本发明的装置中的任一者内的电信号来调整机电参数。在一些实施方案中，优化算法根据本发明的装置中的任一者内的检测流参数来调整机电参数。在一些实施方案中，优化算法根据独特的无量纲输入参数来调整电穿孔参数。在一些实施方案中，优化算法具有根据独特的多变量参数组合来调整电穿孔参数的能力，所述参数预测高活力结果、高效率结果或匹配的活力和效率结果。
本发明的系统可以包括一个或多个外部结构，所述外部结构被构造为覆盖本发明的一个或多个装置的电极，例如减少最终使用者暴露于带电的电连接的机会。通常，本发明的装置(例如，FLOWFECTTM装置)将包括覆盖其电极和电穿孔区的一个外部结构。外部结构可以是非导电材料，例如非导电聚合物，所述非导电材料包括用于机电接合装置的部分(例如，电极或电穿孔区)的结构特征部。外部结构可以在结构内包括一个或多个凹部、切口或类似的开口以容纳装置。外部结构可以被构造为可以从装置移除的部件。例如，外部结构可以包括通过铰链(例如，活动铰链)连接的两个单独的部件，以便可以将外部结构折叠在本发明的装置上。或者，外部结构可以是一个或多个单独的件，所述件可以使用合适的配合特征部连接在一起以形成单一结构。在这些实施方案中，可以使用任何合适的紧固件(例如，按扣、闩锁、按钮或夹子)将外部结构固定至本发明的装置上，这些紧固件可以整合进外部结构中或在外部连接至外部结构。其他合适的紧固件类型是本领域已知的。在一些实施方案中，外部结构包括一个或多个对齐特征部(例如销、凹痕、凹槽或凸片)以确保外部结构的一个或多个件的正确对齐。在一些情况下，外部结构被构造为永久连接至本发明的装置。
在一些实施方案中，壳体(例如，盒，例如，外部结构)包封一个或多个前述发明或者一个或多个用于连续流电穿孔的电穿孔装置。在一些实施方案中，壳体(例如，盒)被构造为允许与自动化封闭系统一起使用和/或插入到自动化封闭系统中，所述自动化封闭系统将细胞疗法递送给患者。在一些实施方案中，壳体还包括用于在样本的电穿孔期间、之前和之后进行细胞悬浮液和/或缓冲液储存的冷却/加热区域/壳体。在一些实施方案中，系统(例如，一个或多个装置和壳体)是外部供电的。
在一些实施方案中，系统还包括优化算法，如果所述使用者选择此功能，则优化算法具有独立或自主调整机电参数的能力。这些优化算法允许连续调整在电穿孔过程中使用的参数，该参数可以取决于细胞类型、电导率、悬浮液的体积、粘度、电穿孔盒的寿命、悬浮液的物理状态或电穿孔装置的状态。
在本文所述的外部结构的实施方案中的任一者中，外部结构提供外部电势源和本发明的装置的电极之间的电连接。例如，外部结构可以包括用于电连接的一个或多个电输入(例如，铲形、香蕉形插头或卡口，例如，BNC连接器)，所述电输入有助于内部结构内的电势源和本发明的装置的电极之间的电连接。
本发明的装置和外部结构可以在套件中与附加外部部件(诸如试剂，例如，缓冲液，例如，转染或回收缓冲液)和/或样品组合。在一些情况下，转染缓冲液包含适合于细胞电穿孔的组合物。在一些情况下，转染缓冲液包含浓度为0.1至200mM(例如，0.1至1.0mM、1.0mM至10mM、或10mM至100mM)的合适浓度的一种或多种盐(例如，氯化钾、氯化钠、磷酸钾、磷酸二氢钾)或糖(例如，葡萄糖或肌醇)，或它们的任何组合。
缓冲液和培养基
本发明的装置和系统可以与转染缓冲液或含有支持转染的添加剂的细胞培养物生长培养基一起使用。可以添加某些添加剂来控制所用的转染缓冲液和/或细胞培养物生长培养基的电导率，这些添加剂包括KCl、MgCl2、NaCl、葡萄糖、Na2HPO4、NaH2PO4、Ca(NO3)2、甘露糖醇、琥珀酸、右旋糖、羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、海藻糖、CaCl2、二甲基亚砜(DMSO)、K2HPO4、KH2PO4、乙烯-双(氧亚乙基次氮基)四乙酸(EGTA)、KOH、NaOH、K2SO4、Na2SO4、组氨酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、ATP-二钠盐和NaHCO3。可以添加某些添加剂来控制所用的转染缓冲液和/或细胞培养物生长培养基的粘度，这些添加剂包括Ficoll、葡聚糖、聚乙二醇(PEG)、甲基纤维素(MethoCel)、胶原蛋白I和基质胶。
方法
本发明的特征在于使用本文所述的电穿孔装置将组合物引入(例如，转染)悬浮于流体中的多个细胞的至少一部分的方法。本文所述的方法可以用于大大增加组合物至细胞类型的递送的通量，这通常被认为是基因工程研究领域和基因修饰的细胞疗法的治疗领域中的瓶颈。具体而言，与典型的转染方法(例如，慢病毒转染)或商购获得的细胞转染仪器(例如，
转染系统(Thermo Fisher，Carlsbad，CA)或4D-NUCLEOFECTOR(Lonza，Switzerland))相比，本文所述的方法在通过施用于多种细胞类型的转染后具有显著增加的回收细胞数、转染效率和细胞活力。
通过使含有悬浮细胞以及含有待引入细胞的组合物的流体通过如本文所述的本发明的装置(例如，电穿孔装置)，可以将组合物引入悬浮于流体中的多个细胞的至少一部分。通过施加正压，例如从连接至流体源的泵(例如，蠕动泵、数字移液器或自动化液体处理源)施加正压，可以使悬浮于流体中的组合物和细胞通过本发明的装置递送。悬浮于流体中的组合物和细胞从第一电极(例如，包括进入区)通过与第一电极流体连接的电穿孔区，然后到达与电穿孔区流体连接的回收区。当悬浮于流体中的组合物和细胞流过第一电极到达电穿孔区时，电势差被施加于第一电极和第二电极，从而使细胞暴露于电穿孔区中的电场中。细胞暴露于所产生的电场增强了所述多个细胞的暂时渗透性，从而将组合物引入所述多个细胞的至少一部分。
在所述方法的一些实例中，相对于在离开本发明的装置的电穿孔区时细胞表型的基线测量值而言，细胞的表型可以改变或可以不改变。在一些情况下，相对于在离开本发明的装置的电穿孔区时细胞表型的基线测量值而言，细胞的表型变化为从0％至约25％，例如，从约0％至约2.5％、从约1％至约5％、从约1％至约10％、从约5％至约15％、从约10％至约20％、从约15％至约25％、或从约20％至约25％，例如，约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、或约25％。在特定情况下，所述多个细胞在离开电穿孔区时无表型变化。例如，建立细胞表型的基线或对照测量值可以是未使用本发明的装置转染的细胞上的细胞表面标志物的表达的测量值。在已使用本发明的装置转染的细胞上，相同的细胞标志物的表达的相应的相同测量值可以用于评估细胞表型的变化。经由细胞表面标志物表达的流式细胞术分析来评估细胞表型，以确保在电穿孔后细胞表型的变化最小或保持不变。待评估的细胞表面标志物的实例包括但不限于CD3、CD4、CD8、CD19、CD45RA、CD45RO、CD28、CD44、CD69、CD80、CD86、CD206、IL-2受体、CTLA4、OX40、PD-1和TIM3。使用明视野或荧光显微术来评估细胞形态，以确认在电穿孔后表型变化的缺乏。
在一些情况下，在将组合物引入所述多个细胞的至少一部分后，所述多个细胞储存于回收缓冲液中。回收缓冲液被构造为促进在所述多个细胞中形成的孔的最终封闭。回收缓冲液通常包括细胞培养基，所述细胞培养基可以包含用于细胞营养和生长的其他成分，例如，血清、矿物质等。技术人员可以理解，回收缓冲液的选择将取决于进行电穿孔的细胞类型。
在本文所述的方法的一些实施方案中，流过本发明的装置的电穿孔区的含有悬浮细胞(例如，置换体积)和要引入细胞的组合物的流体的体积可以为从约0.001mL至约2000mL、约0.001mL至约1000mL，例如，0.001mL至约1000mL，例如，从约0.001mL至约0.1mL、约0.01mL至约1mL、约0.01mL至约750mL、约0.01mL至约1500mL、约0.1mL至约5mL、约0.1mL至500mL、约0.1mL至约2000mL、约1mL至约10mL、约1mL至约1000mL、约2mL至约2000mL、约2.5mL至约20mL、约5mL至约40mL、约10mL至约60mL、约10mL至1000mL、约20mL至约2000mL、约30mL至约80mL、约50mL至约200mL、约100mL至约500mL、或250mL至约750mL、约500mL至约1000mL、约500mL至2000mL、约750mL至1500mL、或约1000mL至2000mL，例如，约0.01mL至100mL、约0.1mL至约99mL、约1mL至约97mL、或约10mL至约95mL，例如，约0.0025mL至约10mL、约0.01mL至约1mL、或约0.025mL至约0.1mL，例如，约0.001mL、约0.0025mL、约0.005mL、约0.0075mL、约0.01mL、约0.025mL、约0.05mL、约0.075mL、约0.1mL、约0.25mL、约0.5mL、约0.75mL、约1mL、约2mL、约3mL、约4mL、约5mL、约6mL、约7mL、约8mL、约9mL、约10mL、约15mL、约20mL、约25mL、约30mL、约35mL、约40mL、约45mL、约50mL、约55mL、约60mL、约65mL、约70mL、约75mL、约80mL、约85mL、约90mL、约95mL、约100mL、约150mL、约200mL、约250mL、约300mL、约350mL、约400mL、约450mL、约500mL、约550mL、约600mL、约650mL、约700mL、约750mL、约800mL、约850mL、约900mL、约950mL、约1000mL、约1050mL、约1100mL、约1150mL、约1200mL、约1250mL、约1300mL、约1350mL、约1400mL、约1450mL、约1500mL、约1550mL、约1600mL、约1650mL、约1700mL、约1750mL、约1800mL、约1850mL、约1900mL、约1950mL，或约2000mL。
在一些实施方案中，流过本发明的装置的电穿孔区的流体体积(例如，置换体积)、置换速率或其他受控参数可以影响或可以不影响多个细胞的转染效率。在一些实施方案中，本发明的装置被构造用于与自动化流体处理平台一起使用，所述自动化流体处理平台可以处理体积小于100μL的多个细胞，这些细胞可以积聚到从大于100μL至约2000mL的体积范围。在一些实施方案中，自动化流体处理平台被构造用于与一个或多个流体递送源(例如泵，例如注射泵、微泵或蠕动泵)一起使用，所述流体递送源递送流过本发明的装置的电穿孔区的流体体积。在一些实施方案中，流过本发明的装置的电穿孔区的流体体积可以通过使工作流体相对于待递送的流体的储集器而置换或通过空气置换来递送。在一些实施方案中，流体递送源被构造为通过正压的施加来使悬浮于流体中的细胞流动。
在某些方面，悬浮有细胞的流体的电导率可以影响悬浮液中的细胞的电穿孔，从而影响组合物至细胞的递送。含有悬浮细胞的流体的电导率可以为从约0.001mS至约500mS，例如，从约0.001mS至约0.1mS、约0.01mS至约1mS、约0.1mS至约10mS、约1mS至约50mS、约10mS至约100mS、约25mS至约200mS、约50mS至约400mS、或约100mS至约500mS，例如，约0.01mS至约100mS、约0.1mS至约50mS、或约1至20mS，例如，约0.001mS、约0.002mS、约0.003mS、约0.004mS、约0.005mS、约0.006mS、约0.007mS、约0.008mS、约0.009mS、约0.01mS、约0.02mS、约0.03mS、约0.04mS、约0.05mS、约0.06mS、约0.07mS、约0.08mS、约0.09mS、约0.1mS、约0.2mS、约0.3mS、约0.4mS、约0.5mS、约0.6mS、约0.7mS、约0.8mS、约0.9mS、约1mS、约2mS、约3mS、约4mS、约5mS、约6mS、约7mS、约8mS、约9mS、约10mS、约15mS、约20mS、约25mS、约30mS、约35mS、约40mS、约45mS、约50mS、约55mS、约60mS、约65mS、约70mS、约75mS、约80mS、约85mS、约90mS、约95mS、约100mS、约150mS、约200mS、约250mS、约300mS、约350mS、约400mS、约450mS、或约500mS。
本发明的方法可以将组合物递送至许多细胞类型，包括但不限于哺乳动物细胞、真核生物细胞、原核生物细胞、合成细胞、人细胞、动物细胞、植物细胞、原代细胞、细胞系、悬浮细胞、贴壁细胞、未刺激的细胞、刺激的细胞或活化的细胞、免疫细胞、干细胞(例如，原代人诱导性多能干细胞(例如，iPSC)、胚胎干细胞(例如，ESC)、间充质干细胞(例如，MSC)或造血干细胞(例如，HSC))、血细胞(例如，红细胞)、T细胞(例如，原代人T细胞)、B细胞、抗原呈递细胞(APC)、自然杀伤(NK)细胞(例如，原代人NK细胞)、单核细胞(例如，原代人单核细胞)、巨噬细胞(例如，原代人巨噬细胞)和外周血单核细胞(PBMC)、中性粒细胞、树突细胞、人胚肾(例如HEK-293)细胞或中国仓鼠卵巢(例如，CHO-K1)细胞。可以被电穿孔的典型细胞数可以为约104个细胞至约1012个细胞(例如，约104个细胞至约105个细胞、约104个细胞至约106个细胞、约104个细胞至约107个细胞、约5×104个细胞至约5×105个细胞、约105个细胞至约106个细胞、约105个细胞至约107个细胞、约2.5×105个细胞至约106个细胞、约5×105个细胞至约5×106个细胞、约106个细胞至约107个细胞、约106个细胞至约108个细胞、约106个细胞至约1012个细胞、约5×106个细胞至约5×107个细胞、约107个细胞至约108个细胞、约107个细胞至约109个细胞、约107个细胞至约1012个细胞、约5×107个细胞至约5×108个细胞、约108个细胞至约109个细胞、约108个细胞至约1010个细胞、约108个细胞至约1012个细胞、约5×108个细胞至约5×109个细胞、约109个细胞至约1010个细胞、约109个细胞至约1011个细胞、约1010个细胞至约1011个细胞、约1010个细胞至约1012个细胞、或约1011个细胞至约1012个细胞，例如，约104个细胞、约2.5×104个细胞、约5×104个细胞、约105个细胞、约2.5×105个细胞、约5×105个细胞、约106个细胞、约2.5×106个细胞、约5×106个细胞、约107个细胞、约2.5×107个细胞、约5×107个细胞、约108个细胞、约2.5×108个细胞、约5×108个细胞、约109个细胞、约2.5×109个细胞、约5×109个细胞、约1010个细胞、约5×1010个细胞、约1011个细胞、或约1012个细胞)。
用于实现约104个细胞至约1012个细胞的细胞穿孔数的细胞浓度，即每毫升液体的细胞数通常在约103个细胞/mL至约1011个细胞/mL的范围内，例如，约103个细胞/mL至约104个细胞/mL、约5×103个细胞/mL至约5×104个细胞/mL、约105个细胞/mL至约105个细胞/mL、约5×105个细胞/mL至约5×106个细胞/mL、约106个细胞/mL至约107个细胞/mL、约5×106个细胞/mL至约5×107个细胞/mL、约107个细胞/mL至约108个细胞/mL、约5×107个细胞/mL至约5×108个细胞/mL、约108个细胞/mL至约109个细胞/mL、约5×108个细胞/mL至约5×109个细胞/mL、约109个细胞/mL至约109个细胞/mL、约5×109个细胞/mL至约5×1010个细胞/mL、或约1010个细胞/mL至约1011个细胞/mL，例如，约103个细胞/mL、约5×103个细胞/mL、约104个细胞/mL、约5×104个细胞/mL、约105个细胞/mL、约5×105个细胞/mL、约106个细胞/mL、约5×106个细胞/mL、约107个细胞/mL、约5×107个细胞/mL、约108个细胞/mL、约5×108个细胞/mL、约109个细胞/mL、约5×109个细胞/mL、约1010个细胞/mL、约5×1010个细胞/mL、或约1011个细胞/mL。
本文所述的本发明的方法可以将任何组合物递送至悬浮于流体中的细胞。可以递送至细胞的组合物包括但不限于治疗剂、维生素、纳米颗粒、带电的分子(例如，溶液中的离子)、不带电的分子、核酸(例如，DNA或RNA)、CRISPR-Cas复合物、蛋白质、聚合物、核糖核蛋白(RNP)、经工程化的核酸酶、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、归巢核酸酶、大范围核酸酶(MN)、大范围TAL、酶、肽、转座子或多糖(例如，葡聚糖，例如，硫酸葡聚糖)。可以在悬浮液中递送至细胞的示例性组合物包含核酸、寡核苷酸、抗体(或抗体片段，例如双特异性片段、三特异性片段、Fab、F(ab′)2、或单链可变片段(scFv))、氨基酸、肽、蛋白质、基因治疗剂、基因组工程化的治疗剂、表观基因组工程化的治疗剂、碳水化合物、化学药物、造影剂、磁性颗粒、聚合物珠粒、金属纳米颗粒、金属微粒、量子点、抗氧化剂、抗生素剂、激素、核蛋白、多糖、糖蛋白、脂蛋白、类固醇、抗炎剂、抗微生物剂、化学治疗剂、外泌体、外膜囊泡、疫苗、病毒、噬菌体、佐剂、矿物质以及它们的组合。待递送的组合物可以包含单一化合物，诸如本文所述的化合物。或者，待递送的组合物可以包含多个靶向不同基因的化合物或组分。
流体中的组合物的典型浓度可以为从约0.0001μg/mL至约1000μg/mL(例如，从约0.0001μg/mL至约0.001μg/mL、约0.001μg/mL至约0.01μg/mL、约0.001μg/mL至约5μg/mL、约0.005μg/mL至约0.1μg/mL、约0.01μg/mL至约0.1μg/mL、约0.01μg/mL至约1μg/mL、约0.1μg/mL至约1μg/mL、约0.1μg/mL至约5μg/mL、约1μg/mL至约10μg/mL、约1μg/mL至约50μg/mL、约1μg/mL至约100μg/mL、约2.5μg/mL至约15μg/mL、约5μg/mL至约25μg/mL、约5μg/mL至约50μg/mL、约5μg/mL至约500μg/mL、约7.5μg/mL至约75μg/mL、约10μg/mL至约100μg/mL、约10μg/mL至约1,000μg/mL、约25μg/mL至约50μg/mL、约25μg/mL至约250μg/mL、约25μg/mL至约500μg/mL、约50μg/mL至约100μg/mL、约50μg/mL至约250μg/mL、约50μg/mL至约750μg/mL、约100μg/mL至约300μg/mL、约100μg/mL至约1,000μg/mL、约200μg/mL至约400μg/mL、约250μg/mL至约500μg/mL、约350μg/mL至约500μg/mL、约400μg/mL至约1,000μg/mL、约500μg/mL至约750μg/mL、约650μg/mL至约1,000μg/mL、或约800μg/mL至约1,000μg/mL，例如，约0.0001μg/mL、约0.0005μg/mL、约0.001μg/mL、约0.005μg/mL、约0.01μg/mL、约0.02μg/mL、约0.03μg/mL、约0.04μg/mL、约0.05μg/mL、约0.06μg/mL、约0.07μg/mL、约0.08μg/mL、约0.09μg/mL、约0.1μg/mL、约0.2μg/mL、约0.3μg/mL、约0.4μg/mL、约0.5μg/mL、约0.6μg/mL、约0.7μg/mL、约0.8μg/mL、约0.9μg/mL、约1μg/mL、约1.5μg/mL、约2μg/mL、约2.5μg/mL、约3μg/mL、约3.5μg/mL、约4μg/mL、约4.5μg/mL、约5μg/mL、约5.5μg/mL、约6μg/mL、约6.5μg/mL、约7μg/mL、约7.5μg/mL、约8μg/mL、约8.5μg/mL、约9μg/mL、约9.5μg/mL、约10μg/mL、约15μg/mL、约20μg/mL、约25μg/mL、约30μg/mL、约35μg/mL、约40μg/mL、约45μg/mL、约50μg/mL、约55μg/mL、约60μg/mL、约65μg/mL、约70μg/mL、约75μg/mL、约80μg/mL、约85μg/mL、约90μg/mL、约95μg/mL、约100μg/mL、约200μg/mL、约250μg/mL、约300μg/mL、约350μg/mL、约400μg/mL、约450μg/mL、约500μg/mL、约550μg/mL、约600μg/mL、约650μg/mL、约700μg/mL、约750μg/mL、约800μg/mL、约850μg/mL、约900μg/mL、约950μg/mL、或约1,000μg/mL)。
在一些情况下，使用热控制器来控制含有悬浮细胞和组合物的流体的温度，所述热控制器被纳入支撑本发明的一个或多个装置的壳体。控制流体的温度以减少来源于电穿孔区中产生的电场的焦耳热的影响，因为太高的温度可以损害电穿孔后的细胞活力。流体的温度可以为从约0℃至约50℃，例如，从约0℃至约10℃、约1℃至约5℃、约2℃至约15℃、约3℃至约20℃、约4℃至约25℃、约5℃至约30℃、约7℃至约35℃、约9℃至约40℃、约10℃至约43℃、约15℃至约50℃、约20℃至约40℃、约25℃至约50℃、或约35℃至约45℃，例如，约0℃、约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、或约50℃。
与典型的转染方法(例如，慢病毒转染)或商购获得的细胞转染仪器(例如，
转染系统(Thermo Fisher，Carlsbad，CA)或4D-NUCLEOFECTOR(Lonza，Switzerland))相比，使用本发明的方法转染的细胞能更有效地转染并且具有更高的活力。例如，对于本文所述的方法，转染效率(即，将组合物成功递送至细胞的效率)可以为约0.1％至约99.9％，例如，从约0.1％至约5％、约1％至约10％、约2.5％至约20％、约5％至约40％、约10％至约60％、约30％至约80％、或约50％至约99.9％，例如，从约10％至约90％、从约25％至约85％，例如，约0.1％、约0.15％、约0.2％、约0.25％、约0.3％、约0.35％、约0.4％、约0.45％、约0.5％、约0.55％、约0.6％、约0.65％、约0.7％、约0.75％、约0.8％、约0.85％、约0.9％、约0.95％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或约99.9％。
在使用本文所述的本发明的方法引入组合物后，悬浮于流体中的细胞的细胞活力(即，电穿孔后存活的细胞的数量或百分比)可以为从约0.1％至约99.9％，例如，从约0.1％至约5％、约1％至约10％、约2.5％至约20％、约5％至约40％、约10％至约60％、约30％至约80％、或约50％至约99.9％，例如，从约10％至约90％、从约25％至约85％，例如，约0.1％、约0.15％、约0.2％、约0.25％、约0.3％、约0.35％、约0.4％、约0.45％、约0.5％、约0.55％、约0.6％、约0.65％、约0.7％、约0.75％、约0.8％、约0.85％、约0.9％、约0.95％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或约99.9％。
在电穿孔后回收的细胞数(即，收集的活细胞数)可以为约104个细胞至约1012个细胞，例如，约104个细胞至约105个细胞、约104个细胞至约106个细胞、约104个细胞至约107个细胞、约5×104个细胞至约5×105个细胞、约105个细胞至约106个细胞、约105个细胞至约107个细胞、约2.5×105个细胞至约106个细胞、约5×105个细胞至约5×106个细胞、约106个细胞至约107个细胞、约106个细胞至约108个细胞、约106个细胞至约1012个细胞、约5×106个细胞至约5×107个细胞、约107个细胞至约108个细胞、约107个细胞至约109个细胞、约107个细胞至约1012个细胞、约5×107个细胞至约5×108个细胞、约108个细胞至约109个细胞、约108个细胞至约1010个细胞、约108个细胞至约1012个细胞、约5×108个细胞至约5×109个细胞、约109个细胞至约1010个细胞、约109个细胞至约1011个细胞、约1010个细胞至约1011个细胞、约1010个细胞至约1012个细胞、或约1011个细胞至约1012个细胞，例如，约104个细胞、约2.5×104个细胞、约5×104个细胞、约105个细胞、约2.5×105个细胞、约5×105个细胞、约106个细胞、约2.5×106个细胞、约5×106个细胞、约107个细胞、约2.5×107个细胞、约5×107个细胞、约108个细胞、约2.5×108个细胞、约5×108个细胞、约109个细胞、约2.5×109个细胞、约5×109个细胞、约1010个细胞、约5×1010个细胞、约1011个细胞、或约1012个细胞。
在电穿孔后回收率(即，收集的活的经工程化的细胞的百分比)可以为从约0.1％至约500％，例如，从约0.1％至约5％、约1％至约10％、约2.5％至约20％、约5％至约40％、约10％至约60％、约30％至约80％、约50％至约99.9％、从约75％至约150％、从约100％至约200％、从约150％至约250％、从约200％至约300％、从约250％至约350％、从约300％至约400％、从约350％至约450％、或从约400％至约500％，例如，约0.1％、约0.15％、约0.2％、约0.25％、约0.3％、约0.35％、约0.4％、约0.45％、约0.5％、约0.55％、约0.6％、约0.65％、约0.7％、约0.75％、约0.8％、约0.85％、约0.9％、约0.95％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99.9％、约100％、约110％、约120％、约130％、约140％、约150％、约160％、约170％、约180％、约190％、约200％、约210％、约220％、约230％、约240％、约250％、约260％、约270％、约280％、约290％、约300％、约310％、约320％、约330％、约340％、约350％、约360％、约370％、约380％、约390％、约400％、约410％、约420％、约430％、约440％、约450％、约460％、约470％、约480％、约490％、或约500％。
技术人员将理解，最佳条件可以根据细胞类型或其他因素而变化。对于每种新细胞类型，可以根据需要调整以下参数：波形、电场、脉冲持续时间、缓冲液暴露时间、缓冲液温度和电穿孔后的条件。
实施例
实施例1-装置和系统
设计并制造了连续流电穿孔装置和相关系统，以允许并联使用多个装置，以增强或最大化在固定时间窗口内发生的细胞电穿孔事件的数量，从而增强或最大化细胞工程化的通量和/或加速生物学发现。电穿孔装置被构造为与当前的自动化流体处理系统兼容，例如，基于移液器吸头的分配器、机器人流体泵等。
图1A示出了电穿孔装置的示例性实施方案的示意图，所述电穿孔装置在这种构型中被示出为移液器吸头。图1A示出了装置的有源区域的近视图，所述有源区域包括电穿孔区。该装置在平台中提供对真核细胞和原核细胞的连续流遗传操纵，该平台可通过与液体处理机器人整合而轻松实现自动化。在图1A-1C的装置中，装置的有源区域包括三个不同的区：进入区、电穿孔区和回收区。在图1A-1C所示的实施方案中，将待引入细胞中的组合物和待转染的细胞放置于进入区中。使细胞和组合物通过电穿孔区，并将经转染的细胞分配到缓冲液中以储存在回收区中。因此，进入区和回收区之间的空间是电穿孔区，并且所有三个区都流体连通(例如，流体连接)，以使得存在一条通过装置的流动路径。
在图1A所示的实施方案中，进入区和回收区由合适的材料(例如，不锈钢)制成的中空电极制造，其中进入区电极用作通电电极并且回收区电极用作接地电极，从而形成电路，同时允许在两个电极之间产生电场(与携带细胞和组合物的流体的电导率结合)。
本发明的电穿孔装置已经被设计为满足注射和嵌件模塑制造技术的要求，二者本质上都是可扩展的，并且如图1B和1C所示。在图1B和1C中，装置主体与电穿孔区整合，该电穿孔区定位于商业化不锈钢电极之间，其中电场是有源的。改变电穿孔区的几何形状以显示基本均一的横截面，从而在电穿孔样品的停留时间内产生更可预测的电场暴露。使用目前的生产方法(例如，3D打印)，每天可制造大约100台装置；使用更强大的大规模生产方法(例如，注塑和嵌件模塑)，可以将其扩展到每天10,000多台装置。
壳体可以被构造为使多个电穿孔装置通电，例如，在具有栅网电极的行业标准96孔移液器头托盘中并联的96个电穿孔装置，以相同的施加电压脉冲同时使所有电穿孔装置通电，以使得每个电穿孔装置内的电场是相同的。可以使用单个电源来递送电能。因此，可以需要将电力分配给每个电穿孔装置的机构。一种实现此的方法如图2A所示，分解图如图2B所示。这种设计的特征在于弹簧加载的电极，其中96个独立的电穿孔装置进入壳体，其中每个电穿孔装置的第一电极和第二电极与壳体的电网物理接触。弹簧加载的电极各自并联连接至壳体的电网，壳体的电网继而通过单组引线连接至电源。壳体是可重复使用的，因此一旦连接至电源，就可以同时对多达96个离散样品进行遗传修饰。电源可以包括被构造为调节脉冲递送的附加电路或程序，以使得本发明的每个单独的装置，例如96个单独的装置，接收不同的电压或不同的波形。
实施例2-最佳转染的实验参数的初步开发
已经进行了实验以使用本发明的装置研究影响Jurkat永生化T细胞系的电穿孔的物理和生物学参数。使用行业标准的流式细胞术方法，使用我们的装置评估了经工程化的Jurkat细胞的细胞活力(通过7-AAD染料排除测量)和转染效率(通过GFP表达测量)，这都是基因递送领域中电穿孔成功的常见指标。
除非另外指明，否则通过在含有5g质粒(例如，GFP表达质粒)的100μL缓冲液中对浓度为1×106个细胞的Jurkat细胞群进行电穿孔来产生以下所示的实验结果。电穿孔实验以100Hz的方波波形和9.5ms的脉冲持续时间进行。在24小时温育后，将细胞用7-AAD染色剂染色并经由流式细胞术分析以测量活细胞和活的GFP表达细胞。实验一式三份进行，误差棒表示平均值的标准误差(SEM)。下表1呈现了用于使用本发明的装置进行转染的所用的参数的概述。
表1中列出的大多数参数彼此独立，但是明显的例外情况属于两个不同的组。第一组相关参数是根据物理通道尺寸和工艺参数而变化的那些参数，诸如雷诺数、速度、平均速度、剪切速率和峰值压力。熟练的技术人员将理解雷诺数是平均速度、运动粘度和通道直径的函数。速度(可以在通道内局部变化)、平均速度、剪切速率和峰值压力是流速和通道尺寸的函数。第二组相关参数是与转染的生物学结局相关的那些参数，包括回收的细胞、细胞活力、转染效率和输入细胞的收率。这些参数取决于许多因素，包括被转染的细胞类型和表1中所示的物理参数的组合。
表1.本文所用的实验参数。
*值从模拟计算
**值从可能用于缓冲液配制的材料估算
实施例3-使用本发明的装置的转染数据
当通过电穿孔通道的流速最大时，本发明的装置显示出峰值转染行为(图3A和3B)。利用受控的分配速率移液器来增加活力和效率，以达到所期望的流速，这相当于细胞样品在电场中的～6.5ms停留时间。使用本发明的装置实现了54％的峰值细胞活力和65％的转染效率，这表明人免疫细胞的转染有了显著的进展。
图4A-4D示出了沿着装置的示例性有源区(即，从第一电极管腔，通过电穿孔区，并且进入第二电极管腔)的流速模拟。在该实施方案中，培养基含有流动的生物细胞。从10mL/min和100mL/min的模拟流体流，确定通过电穿孔区的样品的平均线速度。10mL/min的较低流速产生324mm/s的平均线速度。100mL/min的较高流速产生2,990mm/s的平均线速度。这两个线速度可以分别与估算的停留时间(τres)12.35ms和1.34ms相关。这些装置提供了每分钟16mL的流速。值得注意的是，对于商业化系统产生相等的转染效率，在类似的电场暴露下需要约30ms或更长时间的暴露。这表明，使用本发明的装置，高流速和电场的组合使遗传物质至生物细胞中的递送得以改善。
使用本发明的装置的转染效率受电场强度的影响。图5A和5B分别示出了由各种电场强度产生的细胞活力和转染效率。实现的转染效率为86％，并且活力为77％。
本发明的装置通过将样品在冰上冷却以最小化由于电穿孔过程中温度升高而可能影响细胞活力的任何潜在有害的热效应，从而显示出细胞活力和转染效率的～20％的增加(图6A和6B)。还在耦合电场、流体流和热效应的COMSOL多物理场中开发数值建模，以便在本发明的装置中使用225V或275V(在该模型中)的施加电压来更好地理解样品温度的影响。图7A-7D所示的结果示出了在电穿孔区中的基本上均一的电场。图8A-8D示出了装置中的温度随时间推移的分布。
当在具有匹配频率的一系列脉冲持续时间范围内进行电穿孔时，使用本发明的装置的电穿孔未显示出性能的显著变化(图9A和9B)。通过在9.5ms的持续时间内将脉冲数从1改为5，在活力或效率上均未观察到显著变化，这表明了使用本发明的装置进行的电穿孔的波形灵活性。在该实验中，实现的峰值细胞活力为83％，并且转染效率为88％。
当在一定体积和细胞密度范围内进行电穿孔时，使用本发明的装置的电穿孔未显示出性能的显著变化(图10A和10B)。通过在25至100μL的体积范围内改变细胞的数量，在活力或效率上均未观察到显著变化，这表明了使用本发明的装置进行的电穿孔的物理反应灵活性。在该实验中，实现的峰值细胞活力为83％，并且转染效率为86％。
当在整个电穿孔区的横截面尺寸范围内进行电穿孔时，使用本发明的装置的电穿孔未显示出性能的显著变化(图11A和11B)。通过将电穿孔区的横截面尺寸从500改为900μm，观察到了相似的活力，当改变流速以匹配电穿孔区内的总停留时间时，效率无显著变化，这表明了使用本发明的装置进行的电穿孔的横截面尺寸灵活性。在该实验中，实现的峰值细胞活力为51％，并且转染效率为67％。
活力和效率取决于电压脉冲波形形状，如图12A和12B所示。通过改变波形的形状，调整每个Jurkat细胞所暴露的电流的时间和强度，从而改变活力或效率。在该实验中，使用方波波形、正弦波形和斜坡波形观察到高细胞活力结合高转染效率(超过50％)。可用于本发明的装置的示例性波形在图12C-12L所示。
图13A和13B示出了在冷却条件下利用每分钟10-25mL的流速和400-700V/cm的电场的本发明的装置的活力和效率。与最新商购获得的
转染系统相比，在多个独立实验中，所进行的所有优化均能以更高的效率递送核酸(图13A和13B)。
实施例4-本发明的装置在基因工程中的应用
通过靶向患者的免疫系统有效对抗癌症，原代人T细胞的治疗应用已经显示出免疫肿瘤学领域的重大进步。近年来，包括嵌合抗原受体和经工程化的T细胞受体在内的许多技术已经显示出临床成功。然而，遗传修饰患者免疫系统的应用在某种程度上仍限于治疗血液癌，因为实体瘤的肿瘤微环境抑制了肿瘤部位处的T细胞功能。为了克服肿瘤微环境抑制的一些生物学挑战，希望通过敲除在T细胞表面上表达调控性配体的基因来进一步修饰T细胞使其更有效。这些基因的鉴定通常通过CRISPR筛选来实现，其中Cas9和向导RNA文库被递送至T细胞中，以敲除广泛的内源性基因，从而实现针对特定肿瘤的功能增强。然而，这些文库的递送仍然是鉴定“难以转染”细胞类型(诸如，原代T细胞和自然杀伤细胞)中的基因的障碍。通常，在这些情况下，CRISPR文库以慢病毒颗粒的形式递送，其将感染细胞并将Cas9/向导RNA序列转导到细胞基因组中，然后以序列特异性方式敲除所关注的基因。这些文库的产生非常费力，需要克隆病毒表达质粒并纯化病毒颗粒以进行递送。另外，这种方法在随机基因组插入位点留下了遗传掺入的Cas9/向导RNA序列的不期望的“行李”，这可能打断其他功能基因。对Cas9核糖核蛋白复合物使用非病毒递送是克服这些障碍的一种有吸引力的方法，使研究人员能够使用与向导RNA分子复合的Cas9蛋白的瞬时递送，在无病毒掺入的情况下筛选出大量的敲除基因。
图13C是使用本发明的装置将Cas9核糖核蛋白复合物递送至细胞的方法的流程图。通过电穿孔将Cas9核糖核蛋白复合物递送至细胞使得能够以高效方式对靶向的CRISPR敲除进行高通量分析，从而改变用于治疗应用的新型基因靶标的发现过程。研究利用来自商购获得的细胞表面受体库的200-1,000个基因子集或更大的子集(例如25,000个)来鉴定抑制T细胞存活和持久性的肿瘤微环境抑制基因。
实施例5-人细胞的电穿孔
图14A和14B示出了在700V/cm的电场强度下使用两种不同分子量的荧光葡聚糖分子对原代人T细胞进行电穿孔的活力和效率数据。在该实验中，使用本发明的装置实现了30％的峰值细胞活力和67％的转染效率，这表明原代人免疫细胞的转染有了显著的进展。
在相关实验中，使用公开的
转染系统单核细胞电穿孔方案，在THP-1单核细胞细胞系(ATCC号TIB-202)中，与
相比，使用本发明的装置进行的电穿孔表现出显著提高的性能(图15A和15B)。在该实验中，与使用
转染系统的23.4％相比，使用本发明的装置观察到的细胞活力增加56.4％，而转染效率保持在6％。
使用公开的
转染系统单核细胞电穿孔方案，与原代人单核细胞中的
转染系统相比，使用本发明的装置的电穿孔表现出提高的性能(图16A和16B)。在该实验中，与使用
转染系统观察到的16.6％相比，使用本发明的装置观察到22.3％的增加的细胞活力，而与使用
转染系统观察到的4.7％相比，使用本发明的装置观察到21.6％的增加的转染效率。
与
转染系统相比，在独立的实验中，使用本发明的装置进行的电穿孔显示出提高的性能，并且可以成功地将40kDa葡聚糖分子递送至NK-92(ATCC)(图17A和17B)和NK-92MI(ATCC)(图18A和18B)的自然杀伤细胞系。这些结果证实了，与不可扩展的商购获得的平台相比，本发明的装置能够以可比的细胞活力和改善的转染效率将分子递送至核酸空间之外。
SIRPαmRNA至原代单核细胞的递送
在另一项研究中，使用本发明的装置实现了原代人单核细胞中SIRPα的瞬时表达(图19A-19F)。在原代人单核细胞中非GFP mRNA的这种递送进一步展示了该转染平台装置在过去“难以转染”的免疫细胞群体中发挥作用的能力。作为该过表达展示的对照，使用原代T细胞，它大部分为SIRPα阴性的(仅3.4％的活T细胞对表面标志物呈阳性；图19B)。在转染后，86.9％的活T细胞对SIRPα表面标志物呈阳性(图19B)。在具有高基线的原代单核细胞中(表面标志物阳性为86.5％(图19A))，对平均荧光强度(MFI)进行定量，以确定在转染后受体表达密度是否增加。在递送mRNA后24小时，观察到SIRPα表达比对照细胞基线高1.8倍(图19F)。
靶向CXCR4的Cas9-RNP至原代巨噬细胞的递送
使用本发明的装置，eGFP标记的Cas9-RNP也成功地递送至单核细胞源性人巨噬细胞。经由显微术和流式细胞术证实了eGFP标记的Cas9-RNP至细胞核的递送。在转染后24小时，在高达21.4％的分化巨噬细胞中观察到eGFP的表达，在五天内下降到5.1％。虽然在24小时的时间点未观察到基因编辑，但到48小时时，观察到13.9％的KO效率。如通过流式细胞术确定的敲除效率，到第五天增加到16.5％。
通过mRNA的递送进行初始T细胞工程化
使用本发明的装置，用编码GFP的mRNA对分离的初始T细胞(CD45RA+/CD45RO-)进行电穿孔。在24小时后，分析细胞的活力和效率指标。电穿孔细胞的初始细胞计数和活力与未经处理的细胞相当，并且观察到～40％的递送效率(图20A-20D)。另外，将细胞对初始T细胞标志物CD45RA和CD45RO染色。该染色表明电穿孔细胞的表型无变化，并且细胞保留其“初始”CD45RA+/CD45RO-状态(图21A和21B)。最后，用CD3/CD28活化试剂扩增初始T细胞。在该实验中，在活化后六天内电穿孔细胞的生长速率与未经处理的细胞相当(图22)。
实施例6-使本发明的多个装置通电的装置
图23A-23F示出了整合进外部装置中的本发明的电穿孔装置的示例性实施方案，所述外部装置可以进一步整合进液体处理系统中，以使本发明的装置通电并在自动液体处理平台上完成电穿孔过程。在电穿孔过程中，将称为电子放电机(EDM)的外部装置用于使本发明的装置通电。在图23B、23C和23E所示的装置中，23.1是与支撑轨道整合的平行梁。这些梁是可互换的，并允许改变电接触点样式/机构。另外，该梁允许电接触点的最终定位。23.2是可机械回缩的电接触点。电极使用类似弹簧的机构，以允许装置的不同区在整个EDM中滑动，同时保持与电穿孔装置的主体接触。可以将该元件切换为其他更灵活的电接触点，例如，如图23E所示的片弹簧或钢丝刷型电极。23.3是本发明的电穿孔装置的储集器。23.4是摆动支撑轨道，如果需要，它可以使电极发生另外的偏转。该轨道的特征在于使用类似弹簧的机构，以便在操作员或自动系统(例如，机器人臂)将电穿孔装置放置到位时旋转并允许电接触点的更多偏转。23.5是滑轨，它允许样品固定板线性移动，诸如23.6中所示的样品板。23.7是对齐系统，其提供了放置在样品板上的适当的电穿孔装置。当无自动对齐特征部(例如，机器人控制不施加于EDM)时，将对齐系统用作视觉指示器。通过应用某种形式的线性平移装置，系统可以完成任何阵列格式的1个或多个样品。23.8是本发明的装置的电穿孔区，并且流体连接至进入区23.9和回收区23.10两者。23.11是支撑可机械回缩的电接触点(23.2)的支撑轨道。支撑轨道23.11可以是导电的，使得可以为所有可机械回缩的电接触点(23.2)通电，以进行同时电穿孔实验。或者，支撑轨道23.11可以是绝缘机械可缩回的电接触点(23.2)的非导电材料，使得可以进行单独的电穿孔实验。
当被构造为自动化系统时，通过本发明的装置将所关注的样本样品抽吸到液体处理平台上的另一个位置。然后将样品运输到EDM，在此处电极接触点悬浮于样品板的表面上。然后，将本发明的装置降低到装置中，以便建立与EDM的电极接触点的接触。图23A-23C所示的机构使用弹簧针连接来闭合电路，而图23D-23F的实施方案使用柔性弹簧(例如，片弹簧)、电极来闭合电路。连接电路的替代性方法包括使用导电流体或电解质、扩展到接触的导电隔膜或者具有足够的弹簧常数以在插入过程中挠曲的其他导电柔性材料。这使得EDM适合于使用本发明的各种不同尺寸的装置。该系统可用于根据实验目的独立或同时对一个或多个样品进行电穿孔。可以按比例扩大该技术，以增加到整个范围。例如，通过添加两个线性平移机构，EDM可与本发明的多个电穿孔装置一起使用，或者，在单个样品实验或多个样品实验中与本发明的单个装置一起使用。
图24A和24B提供了被构造为以温度控制方式为本发明的导电装置通电的壳体的示例性实施方案。在图24A的装置中，24.1是中空电极，它被构造为连接至液体处理歧管。电极可以另外包括相互作用环，以减少由与液体处理歧管的连接所产生的摩擦所引起的在电极材料上的应力。24.2是连接通道，它流体连接至中空电极并被构造为扩大在使电极通电后产生的电场。连接通道还充当屏障以限制流体流，以增加和控制样品所经历的电脉冲。24.3是连接至连接通道24.2的导电基极。24.4是支撑基部，它被构造为保持中空电极24.1、连接通道24.2和导电基极24.3。24.5是导电基部，它既支撑中空电极24.1、连接通道24.2、导电基极24.3和支撑基部24.4，又电连接至导电基极24.3，以形成电穿孔电路。导电基部24.5包括流体连接24.6，以使加热或冷却流体流过导电基部24.5，以调节电穿孔过程的温度。在图24B中，24.7是支撑另外的部件的外框架。
在图24A和24B的装置中，当流体从中空电极24.1流出时，样品流体的电导率在与基极24.3的表面相互作用后形成闭合回路。基极24.3可以是任何形状的，它允许细胞经历诱导电穿孔的系统性和可控性电场暴露。中空电极24.1的位置可以从支撑基部24.4沿Z坐标操纵，以限制细胞的电场暴露。在该构型中，基极24.3从支撑基部24.4的底部升高到定位于指定的体积收集极限以上的位置。电穿孔细胞将在整个样品中经历有限的电场(除非闭合电穿孔电路)。这种设计减少了对样品细胞的剪切作用，并增加了发生电穿孔的区域内流动的均匀性。另外，为了产生稳定的电场或进一步操纵电场，将连接通道24.2添加到中空电极24.1的末端，从而使操作员能够放大和控制电脉冲，并由此放大和控制样本所经历的电场。此外，该系统中的电极构型使用非并联电极构型，其中套管为圆形并平行于流动样本的轴，但基极的24.3表面相对于套管的轴呈大于0度的某个角度。这种设计的变型是使用悬浮于孔板上的悬浮电极。当样品流过基极24.3的表面并进行电穿孔时，样品落入孔中。在这种构型中，电极未物理附接到孔板。
实施例7-基于流体芯片的电穿孔装置
图25A-25B示出了基于流体芯片的电穿孔装置的示例性实施方案，该电穿孔装置被构造为容纳行业标准的1-5,000μL常规移液器吸头以将样品引入装置中。在图25A的装置中，25.1和25.2是通过电穿孔区流体和电连接的电极。25.3是流体连接至电穿孔区的移液器吸头插入区域，并且25.4是收集储集器。基于流体芯片的电穿孔装置的电极25.1和25.2由外部电源通电。在图25B的分解图中，25.5是移液器吸头，25.6是图25A的基于流体芯片的电穿孔装置，并且25.7示出了收集板，用于在电穿孔之后保持种类。
移液器吸头25.5悬停在基于流体芯片的电穿孔装置25.6的表面上。基于流体芯片的电穿孔装置包括两个部件：电穿孔板，它含有包封的电极布置，以及覆盖板，它具有嵌入的微流体通道，以允许使用者能够调节递送至细胞的电场的脉冲。如果需要，电穿孔板可以同时或分别流过多个样品的电穿孔。在电穿孔板中发生样本的电穿孔后，样品流向收集板25.7的底部。该系统使用行业标准的液体处理部件，例如1-5,000μL移液器吸头，以促进整合至行业标准的液体处理歧管中。
实施例8-大体积(可缩放)连续流电穿孔装置
图26A-26B示出了设计用于大体积细胞制造的连续流电穿孔装置的示例性实施方案。在图26A所示的实施方案中，26.1和26.2分别是用于循环流体(例如，缓冲溶液)的入口和出口。26.3是保持电穿孔装置的外壳。26.4是电穿孔区，并且流体连接至流体入口26.5和流体出口26.9。在入口26.5后和出口26.9前是圆柱体电极26.7和26.8，所述电极的表面上具有孔26.6。26.10是用于保持流体(例如，生长培养基)的储集器。
在该实施方案中，圆柱体电极26.7和26.8由导电多孔材料制成，它允许流体通过其孔26.6行进到装置的腔中。圆柱体电极26.7、26.8中的孔26.6允许缓冲溶液稳定圆柱体电极26.7、26.8的表面上的化学反应，并最小化由于在电穿孔过程中施加电势而观察到的pH转变。由多孔圆柱电极26.7、26.8引入的缓冲液允许流体流发生变化，从而在圆柱体电极26.7、26.8的内表面上产生“润滑”或护套流，或者在电穿孔时将其他流体动力学要素引入电穿孔过程(诸如含有细胞的悬浮液的旋转)。pH转变的降低减少了电穿孔过程中所用悬浮样本的pH的高变化带来的负面影响。圆柱体电极26.7和26.8满足了外部电路的要求，并允许使用外部电源为系统通电。在一个替代性实施方案中，电穿孔装置的出口26.2可用于除去高导电性缓冲液，例如生长培养基或PBS，并且入口26.1可用于引入低电导率缓冲液，以在流过电穿孔区26.4时最大程度地减少液体样品的热量。这种缓冲液交换将导致更高的细胞活力和更高的转染效率，最终将产生大量成功工程化的细胞。然后可以在电穿孔区后在出口中提取低电导率缓冲液，并在电穿孔区后与入口接触后补充生长培养基。
实施例9-在新型螺旋电极中对电场进行建模
已经对具有特定电极构型以帮助增加流动池的转化/转染效率的Flowfect装置进行了设计和计算建模。图27A展示了电极构型的螺旋性质，它在细胞流过电穿孔区时负责旋转电场。不受理论的束缚，这种构型允许较大部分的细胞表面被电穿孔，并从而需要较低的电场来获得等同的效果。图27B-27F示出了从不同的轴观察的电穿孔区的横截面面积。通电和接地的电极垂直于流向，而不是平行于流向，例如，如图1A-1C所示。该设计允许较低的样品体积和较低的施加电压，这是所期望的，例如，在诸如原代人细胞(例如，免疫细胞或干细胞)电穿孔的应用中，其中细胞数量受到限制。在另一个实施方案中，螺旋电极不与电穿孔区流体接触；使用高频脉冲可以在电穿孔区内诱导电场(例如，通过中间介质)，从而将组合物递送到细胞中。
实施例10-用于制造可扩展性的本发明的两部分装置
图28A-28C示出了本发明的装置的实施方案，所述装置被被构造为由两个单独的部件制造，所述两个单独的部件配合在一起以形成能够与商购获得液体处理系统一起使用的完整装置。在这种构型中，然后嵌件模塑的电极(在图28A-28B中的两个部件的连接点附近以小点示出)将通过已建立的行业过程(例如，旋焊、声波，例如，超声、热热焊，例如，热板或激光)焊接在一起。在这种设计中，样品(例如，细胞-DNA样品)通过装置的流体流与电穿孔所需的电场解耦。
图29A和29B示出了图28A-28C所示的装置，例如相同的内部尺寸，在直径700μm的电穿孔区上方和下方的嵌件模塑的电极之间有4mm的距离。本发明的装置的该实施方案与图28A-28C所示的实施方案之间的区别在于，在该概念中，流体流控制与电场暴露耦合。具体而言，套管(显示在图29A-29B的装置顶部)是本发明的液体处理系统和电穿孔装置之间的接口。一旦本发明的电穿孔装置互锁到套管中，嵌入电极(在图29A和29B的装置中以红色示出)将与电源电连接，以用于电压脉冲递送。在图29A-29B所示的实施方案中，示出了单个套管，但是可以在本发明的系统中按比例放大，以包括本发明的多个电穿孔装置，例如，含有被构造为对悬浮于流体的细胞进行并联电穿孔的本发明的4个(图29C)、8个、12个、24个、36个、64个、96个或384个电穿孔装置的系统。图29C展示了这种可以增加使用多个盒或多个控制器进行的同时或顺序转染的数量的方法/装置。具体而言，它包括组合/单独使用多个流体约束边界/约束来修饰细胞的多个入口，其暴露相似/不同的电信号和相似/不同的位移速度。或者，用于细胞修饰的空腔是整合进一个/多个控制器系统中的独立盒，或者控制器系统可以容纳一个/多个盒。
实施例11-壳体和接口实施例
图30A和30B提供了本发明的装置的示例性实施方案，该图示出了包括使用者接口的外壳(图30A)和与液体分配歧管和样品板流体连接的本发明的多个装置(图30B)。
图30A是连续流转染/转化系统的实施方案。3D建模示出了独立的电穿孔系统，该系统包含触摸屏使用者接口(30.1)或另一个替代性使用者接口，允许使用者能够选择参数，诸如流速、波形、施加的电势、电穿孔体积、时间延迟、冷却特征部、加热特征部、电穿孔状态、进程以及用于优化电穿孔方案的其他参数。接口还包含预先设定的参数选择，允许使用者能够在标准条件下操作系统，该标准条件此前已由使用者验证或由制造商推荐。接口可以连接至程序，以允许系统的自动运行和/或运行算法，以针对已知细胞类型的给定样品优化电穿孔。装置还包含盒(30.2)，所述盒包封一个或多个前述发明或用于连续流电穿孔的另一个电穿孔装置。装置还包含冷却/加热区域/壳体(30.3)，用于在样本的电穿孔期间、之前和之后储存细胞/缓冲液。系统由外部通电。系统还包含算法，如果使用者选择此功能，则所述算法具有独立/自主调整参数的能力。这允许连续调整在电穿孔过程中使用的参数，该参数可以取决于细胞类型、电导率、悬浮液的体积、粘度、电穿孔盒的寿命、悬浮液的物理状态或电穿孔装置的状态。
图30B示出了此前在文件中描述的电穿孔装置的阵列。30.4是液体处理歧管，它使本发明通过液体处理平台运输并使装置能够抽吸流体。30.5是图1A-1C所示的装置。30.6是用于在样品转移之前、期间和/或之后储存样品的孔板。
实施例12-优化电穿孔参数的流式细胞术的门控策略
图31提供了比较两种门控策略的实施例。过去，电穿孔技术的开发人员一直使用规范的“淋巴细胞”预门控，其忽略了不在“淋巴细胞”群体内的细胞，诸如那些形态改变或发生细胞凋亡的细胞。如图31所示，这通过选择用于分析的特定细胞亚群而人为增加了活力指标。“全细胞”预门控是对电穿孔实验结果的更准确描述。因此，下表中所示的报道的活力可能似乎低于该领域的预期活力，但是已经对数据进行了处理以专注于性能指标，这些性能指标描述了本发明的电穿孔装置对所有输入细胞的影响。在图31中，FSC代表前向散 射，并且SSC是侧向散射，这表明细胞形态数据如何在流式细胞术分析过程中收集。
使用本文所述的门控策略，Jurkat细胞、活化的原代人T细胞、THP-1单核细胞、原代人单核细胞和分化的原代人巨噬细胞的性能数据如下表2所示。在表2中，收率表示存活的并表示所关注的有效负载的细胞数与进入该过程的输入细胞数的比率。例如，0.5X的收率意味着一半的输入细胞是存活的，并表示在分析时所期望的有效负载。为了便于理解，如果收获时病毒递送的收率大于约0.1X，则将细胞治疗产品施用于患者。
表2.使用本发明的装置在具有多种有效负载的不同原代细胞和细胞系中实现的代表性性能指标。
实施例13-至中国仓鼠卵巢(CHO)-K1)细胞和人胚肾(HEK-293T)细胞中的电穿孔
已经进行了CHO-K1(中国仓鼠卵巢细胞)和HEK-293T(人胚肾细胞)细胞系的电穿孔。本发明的装置可用于已提起并重悬于电穿孔缓冲液中的贴壁细胞的电穿孔。CHO-K1(图32A和32B)和HEK-293T咽33A-33D)细胞可以使用本发明的装置用GFP质粒DNA成功转染。在电穿孔后培养48小时后，观察到HEK-293T细胞中的峰值转染效率。不受理论的束缚，减少的细胞活力可能是由于提起贴壁细胞并将它们置于悬浮液中经由流式细胞仪进行分析，而显微术方法示出了具有正常形态的健康GFP+细胞(图34A、34B、35A和35B)。
实施例14-原代T细胞的转染
已经对原代T细胞进行了研究。主要用于电穿孔效率分析的荧光报告基因包括荧光小分子(例如，FITC标记的葡聚糖)、从质粒DNA表达的基因(例如，GFP)和从mRNA表达的基因(例如，GFP)。这些报告基因的递送和表达使用流式细胞术确定，其中活细胞使用如本文所述的门控策略进行预门控，以单细胞为基础确定荧光检测。这些测定法展示了荧光报告基因的细胞间检测，并且在一些情况下，还可以进行直接细胞核递送。由于使用本发明的装置进行电穿孔的性质温和，因此与商业化系统(例如，Lonza 4D-NUCLEOFECTOR系统或
转染系统(Thermo Fisher，Carlsbad，CA))相比，在转染后可实现更高的细胞计数。
a.扩增的T细胞展示
使用本发明的装置进行转染，以将荧光标记的(FITC)葡聚糖分子(40kDa)递送到原代人T细胞(从106个细胞/实验条件的细胞密度开始)，并针对商购获得的台式电穿孔装置(例如，Thermo Fisher
转染系统)进行四个指标的分析：总细胞计数(在EP后)、细胞活力、转染效率和活的转染细胞的总数。结果示于图36A-36D中。除图36A-36D使用荧光标记的分子所示的数据外，还使用本发明的装置测试了编码GFP的质粒DNA(3.5kB)至原代人T细胞的递送(在106个细胞/实验条件的细胞密度下)。这些实验再次展示了对
转染系统的优越性，显示为图37所示的24小时温育后表达GFP的T细胞的总数。重要的是，从DNA质粒表达GFP还展示了遗传信息(即，核酸)有效地递送至细胞核中，在其中DNA转录为RNA，然后翻译为最终的GFP蛋白。
b.通过平台比较进行mRNA递送
还使用本发明的装置展示了将mRNA递送至细胞。这些实验是使用商业来源的mRNA在两种操作细胞密度下进行的。然后在两个商购获得的系统(Lonza 4D-NUCLEOFECTOR和Thermo Fisher
转染系统)和本发明的装置上进行比较以完成实验，如图38A-38D所示。就活力、效率和收率而言，本发明的装置优于商购获得的系统。另外，与商购获得的系统不同，本发明的装置的性能与细胞浓度无关，如图38A-38D所示的实验结果所示。
实施例15-非瞬时有效负载的递送
实施例13和14中描述的每个有效负载在递送后都是瞬时的。为了展示稳定基因组修饰(即，CRISPR基因敲除)试剂的递送，使用Cas9核糖核蛋白复合物(RNP)在原代细胞中进行CRISPR敲除实验。如图39A-39D所示，使用本发明的装置成功地通过单细胞表面受体染色证实了原代T细胞中的内源性基因的敲除，并使用流式细胞术进行了确认。本发明的装置还可以用于外源性基因的同时CRISPR整合，以通过Cas9 RNP的电穿孔展示稳定的基因组整合。
实施例16-单核细胞(THP-1)和自然杀伤(NK-92MI)细胞系转染
图40A和40B显示柱状图，这些图比较了分别使用本发明的装置和商业化
转染系统将GFP质粒和FITC标记的葡聚糖递送至THP-1和NK-92MI细胞。如图40A和40B所示，对于产生具有任一种有效负载的任一种类型的活的转染细胞，使用本发明的装置进行的电穿孔始终优于
作为另一个比较实例，图41A和41B示出了含有THP-1单核细胞的样品中的细胞活力和转染效率的提高，其中与
转染系统相比，使用本发明的装置递送GFP mRNA。
永生化单核细胞系THP-1被另外用于使用单核细胞和巨噬细胞两者的比较研究。用LPS(脂多糖)内毒素进行的THP-1细胞的活化诱导了巨噬细胞样THP1-Mac永生化细胞。如图42A-42C和图43A和43B所示，使用本发明的装置用GFP mRNA成功转染了THP-1(图42A-42C)和THP1-Mac(图43A和43B)细胞两者。
实施例17-原代单核细胞和分化的巨噬细胞转染
已经使用本发明的装置成功转染了原代人单核细胞，这是通过常规方法转染的极具挑战性的细胞类型。如图44A-44D所示，使用本发明的装置，用FITC标记的葡聚糖分子和GFP mRNA成功转染了从外周血分离的原代人单核细胞。
图45A和45B示出了使用本发明的装置的在用GFP mRNA转染的原代外周血单核细胞中的特异性标志物的表达。如图45A和45B所示，在LPS刺激后，CD86+单核细胞(对活的GFP+细胞进行门控)被活化(在此处表示为CD80表达)的能力维持96小时，这表明电穿孔不会对活化标志物CD80(图45A)或谱系标志物CD86(图45B)的表达产生不利影响。
此外，使用本发明的装置电穿孔的原代单核细胞保持了分化为巨噬细胞的能力，如图46A-46C所示，这表明细胞在电穿孔后仍保持其功能。如图47A-47D所示，使用本发明的装置，用FITC标记的葡聚糖分子(图47A-47B)和GFP mRNA(图47C-47D)成功转染了分化的人巨噬细胞。使用本发明的装置电穿孔的巨噬细胞极化为M1或M2表型(如图48A-48B所示)，这表明使用本发明的装置在电穿孔后保持了细胞健康和功能。使用本发明的装置将电穿孔的巨噬细胞极化为M1(图48A)或M2(图48B)表型，并且在电穿孔后72小时保持GFP mRNA表达。
本发明的装置可以优于用于原代单核细胞的电穿孔的商业化转染系统。如图49A-49C所示，对于原代人细胞，使用本发明的装置将FITC标记的葡聚糖递送至原代单核细胞超过了
转染系统的性能，成功转染的输出活细胞总数显著增加。
实施例18-本发明的连续流装置：大体积和高细胞数的细胞制造
本发明的装置可以以真正连续流动方式用于大体积和高细胞数的悬浮液的电穿孔。现有技术(诸如Lonza 4D-NUCLEOFECTORTM LV单元和Maxcyte可扩展转染系统(STX、VLX或GT))依靠流体流将样品分别上样至其NUCLEOCUVETTETM盒或处理组装件。然而，在电脉冲递送期间，细胞和有效负载悬浮液是静止的。商购获得的电穿孔系统处理静态或静止细胞悬浮液，这是与本发明的装置的关键区别。本发明的装置允许在暴露于电场期间细胞和有效负载悬浮液的连续流。具体而言，快速流动的细胞暴露于足够的电场，以破坏细胞膜并使所关注的遗传有效负载内化，但立即分配到其生长培养基中，以进行细胞回收。另外，由于对流传热，电穿孔过程中产生的任何热量都会消散，而对流传热则通过将流动的样品直接带入回收培养基来促进。这项研究大大扩展了所产生的数据，无论是细胞类型还是电穿孔规模。
a.Jurkat细胞中的初步展示
使用一定范围的细胞密度和电穿孔体积来展示连续流平台相对于使用本发明的装置的单个装置平台的可扩展性。在这些实验中，展示了本发明的可扩展平台在广泛的Jurkat细胞密度范围内工作，如图50A-50D所示。
b.本发明的平台之间的比较研究
进行后续实验以针对Jurkat和原代T细胞，使用相同的递送条件来比较本发明的装置和本发明的连续流电穿孔平台的电穿孔性能。在这些比较实验中，通过连续流平台处理500万个细胞，显示出本发明的单通道装置针对Jurkat细胞和原代T细胞的比较结果，如图51A和51B所示。
c.T细胞电穿孔的扩大规模
为了测试电穿孔是否依赖于细胞密度，将图51A和51B描述的电穿孔实验扩大至包含多达1亿个原代T细胞的细胞悬浮液。在第一实验中，以相同的细胞密度处理越来越多的T细胞，规模从500万个增加(如图51B所示)至多达1亿个T细胞(如图52A-52D所示)，而不造成收率损失。然后评估所期望的细胞密度，以显示可以通过本发明的可扩展平台以高达100×106个细胞/mL处理T细胞，如图53A-53D所示。重要的是，与以最低细胞密度处理的T细胞相比，以低5倍的mRNA量成功处理了1亿个T细胞，这展示了以高细胞密度递送的有效负载可以节省潜在的成本。在此实验中，1亿个T细胞的总处理时间为2.4至24秒。
d.与Lonza大体积(LV)系统的比较研究
我们使用含有FITC-葡聚糖和EGFP mRNA有效负载的原代T细胞，将本发明的可扩展平台与Lonza 4D LV系统进行比较。实验用5000万个T细胞进行。在24小时时，细胞染色显示，Lonza处理的细胞的形态和表型与未经处理的细胞显著不同(如图54的流式细胞术图所示)。另外，用Lonza LV处理的细胞观察到大量死细胞。这些结果在用本发明的连续流平台电穿孔的T细胞中未出现，表明本发明的连续流平台通过电穿孔过程维持T细胞形态。如图55所示，使用本发明的连续流平台的总细胞收率高于Lonza 4D LV系统，而与所递送的有效负载无关，例如FITC标记的葡聚糖或GFP mRNA。
本发明的连续流平台已经显示出有效负载成功电穿孔达到非常高的密度，例如10亿个细胞的悬浮液。如图56A和56B所示，使用本发明的连续流平台用40kDa FITC标记的葡聚糖分子成功转染了10mL体积(浓度为100×106个细胞/mL)的10亿个THP-1细胞。图57示出了收率，所述收率表示为活的FITC细胞计数，对于图图56A和56B所示的实验，在电穿孔后最多72小时进行测量。在这个时间点，从输入细胞计数10亿获得的FITC阳性细胞数为约5亿，这表明在72小时本发明的连续流平台能够每2个输入细胞中的1个作为经修饰的细胞产物递送。
实施例19-脉冲波形、DC电压、高压-低压组合以及它们的组合
用脉冲和直流(DC)电源对本发明的装置进行了测试，如图58A-58D所示。在更高的测试电压下，两个电源在Jurkat细胞中均显示出相似的FITC-葡聚糖递送效率。另外，针对同一系统以高压和低压组合测试了初始电穿孔。如图59A-59D所示，我们已经首先使用FITC-葡聚糖分析了改进的波形对电穿孔的增强作用，所述增强使用本发明的装置以高压和低压组合来优化原代人T细胞递送。重复图59A-59D的实验，以递送编码eGFP荧光报告蛋白的商购获得的mRNA有效负载，如图60A-60D所示。
实施例20-Dynabead电穿孔
为了展示本发明的装置与某些T细胞扩增方案的兼容性，使用本发明的装置对已经用CD3/CD28 Dynabead扩增的T细胞进行电穿孔。通过立即将珠粒添加(在电穿孔前5分钟)至100万个原代人T细胞的悬浮液，或者在过夜(OVN)处理后进行Dynabead扩增样品的电穿孔，这两个时间期都展示了当磁珠存在时与不存在磁珠时的等同效率结果(图61)。
实施例21-用于使本发明的装置通电的外部结构
本发明提供了一种外部结构，所述外部结构拟合并固定在本发明的装置上，被设计为在使用本发明的装置进行电穿孔期间增强其易用性、效率和安全性。外部结构由外表面上的非导电聚合物制成，可保护使用者免受高压暴露的伤害，并在电穿孔工作流程中将对使用者的电击风险降至最低。外部结构容纳本发明的装置的当前设计，并且可以被修改以容纳本发明的装置的未来设计变化。外部结构容纳从电源或高压放大器提供的电信号，并且通过将装置包裹在外部结构内而将信号重新分配给本发明的装置的电极。通过最小化暴露的高压表面，本发明的装置的电极的包裹为装置的使用者产生了更安全的工作环境。外部结构还使得在不移除电气连接的情况下更容易重复进行实验。本发明的外部结构的实施方案的特征在于蛤壳型铰链和扣环，如图62A和62B所示。在图62A中，62.1是用于连接至电源的正/负电极通孔。
62.2是用于连接至电源的第二正/负电极通孔。62.3是蛤壳型铰链。例如，铰链可以是活动铰链，从而使外部结构能够自身闭合并接合锁定机构。这种包裹机构允许外部结构包裹本发明的装置的电极，从而确保两个装置之间的电接触。62.4是用于确保在电穿孔过程中外部结构封闭的闩锁或其他机械紧固件。通过使闩锁机构暂时接合，该设计还使外部结构可重复使用。62.5是对齐销，它确保外部结构以正确的对齐折叠，以最小化使外部结构与本发明的装置之间的电极连接变形的任何偏移。62.6是用于本发明的装置的电极的凹部。62.7和62.8分别是本发明的装置的主体和第一电极和第二电极，它们限定了本发明的装置的电穿孔区。
在使用中，当使用不具有外部结构的本发明的装置进行电穿孔时，与本发明的装置连接的外部结构在转染效率或活力方面未显示出显著的损失。如图63A-63B所示，使用在装置的电极上具有或不具有外部结构的本发明的装置，用FITC标记的葡聚糖转染的THP-1单核细胞的活力和效率大致相同。
实施例22-一次性装置的制造材料
本发明的装置由Formlabs(Somerville，MAUSA)生产和销售的树脂制剂制成。具体而言，本发明的装置由“透明树脂”或Formlabs销售的“耐用树脂”制成。耐用树脂和透明树脂之间的主要区别是机械性质。透明树脂在机械性能方面更脆，而耐用树脂具有更大的延展性，以至于机械性能更类似于聚丙烯，聚丙烯是传统移液器吸头的制造材料。
出于原型设计的目的，使用立体光刻技术对本发明的装置进行3D打印。对于大规模加工，诸如注射模塑，本发明的装置将由其他树脂制造，诸如耐用树脂，它紧密地模拟聚丙烯的机械性质。为了检查树脂材料是否影响电穿孔，图64A和64B示出了使用由Formlabs的透明树脂和耐用树脂制造的本发明的装置，将FITC标记的葡聚糖递送至THP-1单核细胞中。材料的选择使本发明的装置的性能无显著变化。
实施例23-自动化转染vs.手动(电子)样品驱动
本发明的装置已经实现了人细胞的快速、高通量和自动化工程。该技术的应用广泛，从细胞生理学的基础研究到细胞疗法新靶标的发现。仅细胞疗法的应用就可以为发展中的数十亿美元产业做出贡献。在研究规模上，遗传操纵的目前技术水平是手动密集型的，并且难以与自动化液体处理系统结合。本发明的装置可以容易地结合到各种各样的液体处理平台中。这种整合将使学术界和工业界的研究人员快速探索与遗传学有关的各种问题。本发明的装置有潜力以比目前技术快数千倍的速度促进研究规模的细胞工程，从而给医疗保健和基础生物科学领域带来颠覆性的发现。
本文所述的T细胞实验最初使用本发明的一次性装置进行。利用结合本发明的装置的自动化系统，可以以高通量方式简化和构造转染。对八个独立控制的注射器进行编程，以驱动细胞悬浮液进入本发明的一次性装置中。在每个装置的电穿孔区上抽吸100μL样品，并在主动分配到回收生长培养基的过程中通电。比较了使用空气置换(手动电子移液器)或流体置换(自动化系统)驱动样品的三种自动化转染方法。当使用评估3个系统的淋巴细胞门控方法时，所得的活力保持高水平(＞90％)(如图65A和65B所示)。然而，在查看转染效率时，显然，采用流体置换技术精确控制流速的自动化系统优于手动方式。
实施例24-mRNA试剂至原代T细胞中的共递送
使用本发明的装置评估两种mRNA类型至T细胞中的共递送。这些实验使用两种商业来源的编码GFP或mCherry的mRNA进行。实验以平行(同一天)或连续(相隔两天)方式完成。本发明的装置能够成功递送两种mRNA，如在图66A-66E中观察到的GFP和mCherry表达所展示。
实施例25-混合群体外周血单核细胞的转染
还使用本发明的装置展示了mRNA至原代人混合细胞群(即，PBMC)中的递送。这些实验使用商购获得的编码GFP的mRNA来进行，然后对表面受体进行表型染色以鉴定特定细胞群。实现了mRNA至初始(CD45RA+)和记忆(CD45RO+)T细胞的递送，如图67A所示。另外，实现了从混合群体至B细胞(CD19+)和自然杀伤NK细胞(CD56+)的mRNA递送，如图67B所示。
实施例26-原代贴壁iPSC的mRNA转染
使用本发明的装置(FLOWFECTTM)，用悬浮中的eGFP-mRNA转染诱导性多能干细胞(iPSC)。在转染后24小时使用荧光显微术对细胞进行阳性转染的指标评估。将图像描绘为GFP和明场的叠加图像，以捕获贴壁、细胞形态和eGFP-mRNA的表达(代表性图像以10×放大率显示；图69A)。在转染后96小时，还经由流式细胞仪评估细胞中活细胞(7AAD-)和阳性转染(GFP+7AAD-)细胞的比例(代表性数据显示为平均值±SEM；图69B和69C)。
实施例27-原代人自然杀伤细胞的mRNA转染
用编码GFP的mRNA电穿孔分离的NK细胞(CD56+)。在24小时后，分析细胞的活力和效率。NK计数和活力如图70A-70B所示。本发明的装置能够成功递送mRNA，如在图70C中观察到的～95％GFP表达所展示。与活的未经处理的细胞相比，在24小时活的GFP+细胞的总收率为～57％，如图70D所示。
实施例28-跨平台比较
使用本发明的装置ThermoFisher的Neon转染平台(2100V/1脉冲/20ms)或Lonza4D-Nucleofector(程序：EO115)，使用所列出的制造商推荐设置，利用报告分子来转染人原代T细胞。图71A和71B示出了转染后24小时的活力和转染效率。使用相同的设置，在不存在有效负载的情况下处理人原代T细胞，并且在处理后六小时评估基因失调(图71C)。
实施例29-电压-流速特征曲线
使用多个流速和施加能量组合，用GFP报告子mRNA来转染人原代T细胞。图72A-72D和73A-73D示出了在转染后24小时每个反应的相对细胞计数、活力(7AAD-细胞百分比)、效率(活GFP+细胞百分比)和细胞收率计数(活GFP+细胞计数)的热图，显示为不同的Vrms(y轴)和流速(x轴)的函数。
图74示出了不同的施加能量(Vrms2/R)和流速的活细胞收率。使用多个流速(FR)和施加能量组合(VV)利用FITC葡聚糖来转染人原代T细胞。展示了显示在不同流速下相同的施加能量产生不同的收率计数(活FITC+细胞计数)的密度图。
编号实施方案
可以根据以下编号段落中任一项定义本文所述的技术的一些实施方案：
1.一种用于将组合物机电递送到悬浮于液体中的多个细胞中的装置，所述装置包括：
(a)第一电极，所述第一电极包括第一入口、第一出口和包含最小横截面尺寸的第一管腔；
(b)第二电极，所述第二电极包括第二入口、第二出口和包含最小横截面尺寸的第二管腔；以及
(c)电穿孔区，所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，其中所述电穿孔区包含的最小横截面尺寸大于约100μm，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面面积；
其中所述第一出口、所述电穿孔区和所述第二入口流体连通，其中所述组合物在进入所述电穿孔区后被递送至悬浮于所述流体中的所述多个细胞。
2.一种用于将组合物电穿孔到悬浮于流体中的多个细胞中的装置，所述装置包括：
(a)第一电极，所述第一电极包括第一入口和第一出口，其中所述第一电极的管腔包括进入区；
(b)第二电极，所述第二电极包括第二入口和第二出口，其中所述第二电极的管腔包括回收区；以及
(c)电穿孔区，其中所述电穿孔区与所述第一电极的所述第一出口和所述第二电极的所述第二入口流体连接，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面尺寸，并且其中将电势差施加于所述第一电极和所述第二电极在所述电穿孔区中产生电场，
其中悬浮于所述流体中的所述多个细胞在进入所述电穿孔区后被电穿孔。
3.如第1段或第2段所述的装置，还包括与所述进入区流体连接的第一储集器。
4.如第1段或第2段所述的装置，还包括与所述回收区流体连接的第二储集器。
5.如第1段或第2段所述的装置，其中所述电穿孔区的横截面选自由以下各项组成的组：圆形、圆柱体、椭圆形、多边形、星形、平行四边形、梯形和不规则形状。
6.如第1段或第2段所述的装置，其中所述进入区的横截面尺寸在所述电穿孔区的横截面尺寸的0.01％和100,000％之间。
7.如第1段或第2段所述的装置，其中所述回收区的横截面尺寸在所述电穿孔区的最大横截面尺寸的0.01％和100,000％之间。
8.如第1段或第2段所述的装置，其中所述电穿孔区的横截面尺寸在0.005mm和50mm之间。
9.如第1段或第2段所述的装置，其中所述电穿孔区的长度在0.005mm和50mm之间。
10.如第1段或第2段所述的装置，其中所述第一电极或所述第二电极中的任一者的横截面尺寸在0.01mm和500mm之间。
11.如第1段或第2段所述的装置，其中所述进入区、回收区或电穿孔区均不能减小悬浮于所述流体中的所述多个细胞中的任一个的横截面尺寸。
12.如第1段或第2段所述的装置，其中相对于在离开所述电穿孔区时细胞表型的基线测量值而言，所述多个细胞具有从0％至约25％的表型变化。
13.如第1段或第2段所述的装置，所述多个细胞在离开所述电穿孔区时无表型变化。
14.如第1段或第2段所述的装置，还包括外部结构，所述外部结构包括壳体，所述壳体被构造为包裹所述装置的所述第一电极、第二电极和所述电穿孔区。
15.如第14段所述的装置，其中所述外部结构包括可操作地耦合至所述第一电极的第一电输入和可操作地耦合至所述第二电极的第二电输入。
16.如第14段或第15段所述的装置，其中所述外部结构整合至所述装置。
17.如第14段或第15段所述的装置，其中所述外部结构可释放地连接至所述装置。
18.一种用于将组合物机电递送到悬浮于流体中的多个细胞中的装置，所述装置包括：
(a)第一电极，所述第一电极包括第一入口和第一出口，其中所述第一电极的管腔包括进入区；
(b)第二电极，所述第二电极包括第二入口和第二出口，其中所述第二电极的管腔包括回收区；
(c)第三入口和第三出口，其中所述第三入口和所述第三出口与在所述第一入口和所述第一出口之间的所述第一电极相交；
(d)第四入口和第四出口，其中所述第四入口和所述第四出口与在所述第二入口和所述第二出口之间的所述第二电极相交；
(e)电穿孔区，其中所述电穿孔区与所述进入区的所述第一出口和所述回收区的所述第二入口流体连接，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面尺寸，并且其中将电势差施加于所述第一电极和所述第二电极之间在所述电穿孔区中产生电场，
其中所述组合物在进入所述电穿孔区后被递送至悬浮于所述流体中的所述多个细胞。
19.一种用于将组合物电穿孔到悬浮于流体中的多个细胞中的装置，所述装置包括：
(a)第一电极，所述第一电极包括第一入口和第一出口，其中所述第一电极的管腔包括进入区；
(b)第二电极，所述第二电极包括第二入口和第二出口，其中所述第二电极的管腔包括回收区，
(c)第三入口和第三出口，其中所述第三入口和所述第三出口与在所述第一入口和所述第一出口之间的所述第一电极相交；
(d)第四入口和第四出口，其中所述第四入口和所述第四出口与在所述第二入口和所述第二出口之间的所述第二电极相交；
(e)电穿孔区，其中所述电穿孔区与所述进入区的所述第一出口和所述回收区的所述第二入口流体连接，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面尺寸，并且其中将电势差施加于所述第一电极和所述第二电极之间时在所述电穿孔区中产生电场，
其中悬浮于所述流体中的所述多个细胞在进入所述电穿孔区后被电穿孔。
20.如第18段或第19段所述的装置，还包括与所述进入区流体连接的第一储集器。
21.如第18段或第19段所述的装置，还包括与所述回收区流体连接的第二储集器。
22.如第18段或第19段所述的装置，还包括与所述第三入口和所述第三出口流体连接的第三储集器。
23.如第18段或第19段所述的装置，还包括与所述第四入口和所述第四出口流体连接的第四储集器。
24.如第18段或第19段所述的装置，其中所述电穿孔区的横截面选自由以下各项组成的组：圆形、椭圆形、多边形(例如，正多边形、不规则多边形)、星形、平行四边形、梯形和不规则形状。
25.如第18段或第19段所述的装置，其中所述进入区的横截面尺寸在所述电穿孔区的横截面尺寸的0.01％和100,000％之间。
26.如第18段或第19段所述的装置，其中所述回收区的横截面尺寸在所述电穿孔区的横截面尺寸的0.01％和100,000％之间。
27.如第18段或第19段所述的装置，其中所述电穿孔区的横截面尺寸在0.005mm和50mm之间。
28.如第18段或第19段所述的装置，其中所述电穿孔区的长度在0.005mm和50mm之间。
29.如第18段或第19段所述的装置，其中所述第一电极或所述第二电极中的任一者的横截面尺寸在0.1mm和5mm之间。
30.如第18段或第19段所述的装置，其中所述第一电极或所述第二电极中的任一者是多孔的。
31.如第18段或第19段所述的装置，其中所述进入区、回收区或电穿孔区均不能减小悬浮于所述流体中的所述多个细胞中的任一个的横截面尺寸。
32.如第18段或第19段所述的装置，其中相对于在离开所述电穿孔区时细胞表型的基线测量值而言，所述多个细胞具有从0％至约25％的表型变化。
33.如第18段或第19段所述的装置，其中所述多个细胞在离开所述电穿孔区时无表型变化。
34.如第18段或第19段所述的装置，还包括外部结构，所述外部结构包括壳体，所述壳体被构造为包裹所述装置的所述第一电极、第二电极和所述电穿孔区。
35.如第34段所述的装置，其中所述外部结构包括可操作地耦合至所述第一电极的第一电输入和可操作地耦合至所述第二电极的第二电输入。
36.如第34段或第35段所述的装置，其中所述外部结构整合至所述装置。
37.如第34段或第35段所述的装置，其中所述外部结构可释放地连接至所述装置。
38.一种用于将组合物机电递送到悬浮于流体中的多个细胞中的系统，所述系统包括：
(a)一种装置，所述装置包括：
(i)第一电极，所述第一电极包括第一入口和第一出口，其中所述第一电极的管腔包括进入区；
(ii)第二电极，所述第二电极包括第二入口和第二出口，其中所述第二电极的管腔包括回收区；以及
(iii)电穿孔区，其中所述电穿孔区与所述第一电极的所述第一出口和所述第二电极的所述第二入口流体连接，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面尺寸，并且其中将电势差施加于所述第一电极和所述第二电极在所述电穿孔区中产生电场；
(b)电势源，其中所述装置的所述第一电极和所述第二电极可释放地连接至所述电势源，
其中所述组合物在进入所述电穿孔区后被递送至悬浮于所述流体中的所述多个细胞。
39.一种用于将组合物电穿孔到悬浮于流体中的多个细胞中的系统，所述系统包括：
(a)一种装置，所述装置包括：
(i)第一电极，所述第一电极包括第一入口和第一出口，其中所述第一电极的管腔包括进入区；
(ii)第二电极，所述第二电极包括第二入口和第二出口，其中所述第二电极的管腔包括回收区；以及
(iii)电穿孔区，其中所述电穿孔区与所述第一电极的所述第一出口和所述第二电极的所述第二入口流体连接，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面尺寸，并且其中将电势差施加于所述第一电极和所述第二电极时在所述电穿孔区中产生电场；
(b)电势源，其中所述装置的所述第一电极和所述第二电极可释放地连接至所述电势源，
其中悬浮于所述流体中的所述多个细胞在进入所述电穿孔区后被电穿孔。
40.如第38段或第39段所述的系统，其中相对于在离开所述装置的所述电穿孔区时细胞表型的基线测量值而言，所述多个细胞具有从0％至约25％的表型变化。
41.如第38段或第39段所述的系统，其中所述多个细胞在离开所述电穿孔区时无表型变化。
42.如第38段或第39段所述的系统，其中所述装置还包括外部结构，所述外部结构包括壳体，所述壳体被构造为包裹所述装置的所述第一电极、第二电极和所述电穿孔区。
43.如第38段或第39段所述的系统，其中所述外部结构包括可操作地耦合至所述第一电极的第一电输入和可操作地耦合至所述第二电极的第二电输入。
44.如第43段所述的系统，其中所述电势源可释放地连接至所述外部结构的所述第一电输入和所述第二电输入。
45.如第44段所述的系统，其中所述第一电输入或所述第二电输入与所述电势源之间的可释放连接选自由以下各项组成的组：钳子、夹子、弹簧、护套、钢丝刷或它们的组合。
46.如第38段或第39段所述的系统，其中所述外部结构整合至所述装置。
47.如第38段或第39段所述的系统，其中所述外部结构可释放地连接至所述装置。
48.如第38段或第39段所述的系统，其中所述电穿孔是基本上非热可逆电穿孔。
49.如第38段或第39段所述的系统，其中所述电穿孔是基本上非热不可逆电穿孔。
50.如第38段或第39段所述的系统，其中所述电穿孔是基本上热不可逆电穿孔。
51.如第38段或第39段所述的系统，其中所述装置和所述电势源之间的可释放连接选由以下各项组成的组：钳子、夹子、弹簧、护套、钢丝刷或它们的组合。
52.如第51段所述的系统，其中所述装置和所述电势源之间的可释放连接是弹簧。
53.如第38段或第39段所述的系统，还包括与所述进入区流体连接的第一储集器。
54.如第38段或第39段所述的系统，还包括与所述回收区流体连接的第二储集器。
55.如第38段或第39段所述的系统，其中所述电穿孔区的横截面选自由以下各项组成的组：圆形、椭圆形、多边形、星形、平行四边形、梯形和不规则形状。
56.如第38段或第39段所述的系统，其中所述进入区的横截面尺寸在所述电穿孔区的横截面尺寸的0.01％和100,000％之间。
57.如第38段或第39段所述的系统，其中所述回收区的横截面尺寸在所述电穿孔区的横截面尺寸的0.01％和100,000％之间。
58.如第38段或第39段所述的系统，其中所述进入区、回收区或电穿孔区均不能减小悬浮于流体中的所述多个细胞中的任一个的横截面尺寸。
59.如第38段或第39段所述的系统，其中所述电穿孔的占空比在0.001％和100％之间。
60.如第38段或第39段所述的系统，其中所述电穿孔区的横截面尺寸在0.005mm和50mm之间。
61.如第38段或第39段所述的系统，其中所述电穿孔区的长度在0.005mm和50mm之间。
62.如第38段或第39段所述的系统，其中所述第一电极或所述第二电极中的任一者的横截面尺寸在0.1mm至5mm之间。
63.如第38段或第39段所述的系统，还包括与所述进入区流体连接的流体递送源，其中所述流体递送源被构造为将悬浮于所述流体中的所述多个细胞通过所述进入区递送至所述回收区。
64.如第63段所述的系统，其中来自所述流体递送源的递送速率在0.001mL/min和1,000mL/min之间。
65.如第38段或第39段所述的系统，其中悬浮于所述流体中的所述多个细胞中的任一个的停留时间在0.5ms和50ms之间。
66.如第38段或第39段所述的系统，还包括控制器，所述控制器可操作地耦合至所述电势源，以将电压脉冲递送至所述第一电极和所述第二电极，以在所述第一电极和所述第二电极之间产生电势差。
67.如第66段所述的系统，其中所述电压脉冲具有的幅度在0.01kV和3kV之间。
68.如第66段所述的系统，其中所述电压脉冲具有的持续时间在0.01ms和1,000ms之间。
69.如第66段所述的系统，其中所述电压脉冲以在1Hz和50,000Hz之间的频率施加于所述第一电极和所述第二电极。
70.如第66段所述的系统，其中所述电压脉冲的波形选自由以下各项组成的组：DC波形、方波波形、脉冲波形、双极波形、正弦波形、斜坡波形、不对称双极波形、任意波形以及它们的任何叠加或组合。
71.如第66段所述的系统，其中由所述电压脉冲产生的所述电场具有的大小在1V/cm和50,000V/cm之间。
72.如第38段至第71段中任一项所述的系统，其中所述流体具有的电导率在0.001mS/cm和500mS/cm之间。
73.如第36段至第68段中任一项所述的系统，还包括被构造为容纳所述装置的壳体。
74.如第73段所述的系统，其中所述壳体还包括被构造为增加或减少所述壳体的温度的热控制器。
75.如第74段所述的系统，其中所述热控制器是加热元件，所述加热元件选自由以下各项组成的组：加热块、液体流、电池供电的加热器和薄膜加热器。
76.如第74段所述的系统，其中所述热控制器是冷却元件，所述冷却元件选自由以下各项组成的组：液体流、蒸发冷却器和帕尔贴装置。
77.如第38段至第76段中任一项所述的系统，还包括多个细胞穿孔装置。
78.如第77段所述的系统，还包括多个外部结构。
79.一种用于将组合物机电递送到悬浮于流体中的多个细胞中的系统，所述系统包括：
(a)一种装置，所述装置包括：
(i)第一电极，所述第一电极包括第一入口和第一出口，其中所述第一电极的管腔包括进入区；
(ii)第二电极，所述第二电极包括第二入口和第二出口，其中所述第二电极的管腔包括回收区，
(iii)第三入口和第三出口，其中所述第三入口和所述第三出口与在所述第一入口和所述第一出口之间的所述第一电极相交；
(iv)第四入口和第四出口，其中所述第四入口和所述第四出口与在所述第二入口和所述第二出口之间的所述第二电极相交；
(v)电穿孔区，其中所述电穿孔区与所述进入区的所述第一出口和所述回收区的所述第二入口流体连接，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面尺寸，并且其中将电势施加于所述第一电极和所述第二电极时在所述电穿孔区中产生电场；以及
(b)电势源，其中所述装置的所述第一电极和所述第二电极可释放地连接至所述电势源，
其中所述组合物在进入所述电穿孔区后被递送至悬浮于所述流体中的所述多个细胞。
80.一种用于将组合物电穿孔到悬浮于流体中的多个细胞中的系统，所述系统包括：
(a)一种装置，所述装置包括：
(i)第一电极，所述第一电极包括第一入口和第一出口，其中所述第一电极的管腔包括进入区；
(ii)第二电极，所述第二电极包括第二入口和第二出口，其中所述第二电极的管腔包括回收区，
(iii)第三入口和第三出口，其中所述第三入口和所述第三出口与在所述第一入口和所述第一出口之间的所述第一电极相交；
(iv)第四入口和第四出口，其中所述第四入口和所述第四出口与在所述第二入口和所述第二出口之间的所述第二电极相交；
(v)电穿孔区，其中所述电穿孔区与所述进入区的所述第一出口和所述回收区的所述第二入口流体连接，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面尺寸，并且其中将电势施加于所述第一电极和所述第二电极时在所述电穿孔区中产生电场；以及
(b)电势源，其中所述装置的所述第一电极和所述第二电极可释放地连接至所述电势源，
其中悬浮于所述流体中的所述多个细胞在进入所述电穿孔区后被电穿孔。
81.如第79段或第80段所述的系统，其中相对于在离开所述装置的所述电穿孔区时细胞表型的基线测量值而言，所述多个细胞具有从0％至约25％的表型变化。
82.如第79段或第80段所述的系统，其中所述多个细胞在离开所述电穿孔区时无表型变化。
83.如第79段或第80段所述的系统，其中所述装置还包括外部结构，所述外部结构包括壳体，所述壳体被构造为包裹所述装置的所述第一电极、第二电极和所述电穿孔区。
84.如第79段或第80段所述的系统，其中所述外部结构包括可操作地耦合至所述第一电极的第一电输入和可操作地耦合至所述第二电极的第二电输入。
85.如第79段或第80段所述的系统，其中所述电势源可释放地连接至所述外部结构的所述第一电输入和所述第二电输入。
86.如第85段所述的系统，其中所述第一电输入或所述第二电输入与所述电势源之间的可释放连接选自由以下各项组成的组：钳子、夹子、弹簧、护套、钢丝刷或它们的组合。
87.如第83段所述的系统，其中所述外部结构整合至所述装置。
88.如第83段所述的系统，其中所述外部结构可释放地连接至所述装置。
89.如第79段或第80段所述的系统，其中所述电穿孔是基本上非热可逆电穿孔。
90.如第79段或第80段所述的系统，其中所述电穿孔是基本上非热不可逆电穿孔。
91.如第79段或第80段所述的系统，其中所述电穿孔是基本上热不可逆电穿孔。
92.如第79段或第80段所述的系统，还包括与所述进入区流体连接的第一储集器。
93.如第79段或第80段所述的系统，还包括与所述回收区流体连接的第二储集器。
94.如第79段或第80段所述的系统，还包括与所述第三入口和所述第三出口流体连接的第三储集器。
95.如第79段或第80段所述的系统，还包括与所述第四入口和所述第四出口流体连接的第四储集器。
96.如第79段或第80段所述的装置，其中所述电穿孔区的横截面选自由以下各项组成的组：圆形、椭圆形、多边形、星形、平行四边形、梯形和不规则形状。
97.如第79段或第80段所述的系统，其中所述进入区的横截面尺寸在所述电穿孔区的横截面尺寸的0.01％和100,000％之间。
98.如第79段或第80段所述的系统，其中所述回收区的横截面尺寸在所述电穿孔区的横截面尺寸的0.01％和100,000％之间。
99.如第79段或第80段所述的系统，其中所述进入区、回收区或电穿孔区均不能减小悬浮于流体中的所述多个细胞中的任一个的横截面尺寸。
100.如第79段或第80段所述的系统，其中所述电穿孔的占空比在0.001％和100％之间。
101.如第79段或第80段所述的系统，其中所述电穿孔区的横截面尺寸在0.005mm和50mm之间。
102.如第79段或第80段所述的系统，其中所述电穿孔区的长度在0.005mm和50mm之间。
103.如第79段或第80段所述的系统，其中所述第一电极或所述第二电极中的任一者的横截面尺寸在0.1mm至5mm之间。
104.如第79段或第80段所述的系统，还包括与所述进入区流体连接的流体递送源，其中所述流体递送源被构造为将悬浮于所述流体中的所述多个细胞通过所述进入区递送至所述回收区。
105.如第104段所述的系统，其中来自所述流体递送源的递送速率在0.001mL/min和1,000mL/min之间。
106.如第79段或第80段所述的系统，其中悬浮于所述流体中的所述多个细胞中的任一个的停留时间在0.5ms和50ms之间。
107.如第79段或第80段所述的系统，还包括控制器，所述控制器可操作地耦合至所述电势源，以将电压脉冲递送至所述第一电极和所述第二电极，以在所述第一电极和所述第二电极之间产生电势差。
108.如第107段所述的系统，其中所述电压脉冲具有的幅度在0.01kV和3kV之间。
109.如第107段所述的系统，其中所述电压脉冲具有的持续时间在0.01ms和1,000ms之间。
110.如第107段所述的系统，其中所述电压脉冲以在1Hz和50,000Hz之间的频率施加于所述第一电极和所述第二电极。
111.如第107段所述的系统，其中所述电压脉冲的波形选自由以下各项组成的组：DC波形、方波波形、脉冲波形、双极波形、正弦波形、斜坡波形、不对称双极波形、任意波形以及它们的任何叠加或组合。
112.如第107段所述的系统，其中由所述电压脉冲产生的所述电场具有的大小在1V/cm和50,000V/cm之间。
113.如第79段或第80段所述的系统，其中所述流体具有的电导率在0.001mS/cm和500mS/cm之间。
114.如第79段至第113段中任一项所述的系统，还包括多个细胞转染装置。
115.如第114段所述的系统，其还包括多个外部结构。
116.一种将组合物机电递送到悬浮于流体中的多个细胞的至少一部分中的方法，所述方法包括：
(a)提供一种装置，所述装置包括：
(i)第一电极，所述第一电极包括第一入口和第一出口，其中所述第一电极的管腔包括进入区；
(ii)第二电极，所述第二电极包括第二入口和第二出口，其中所述第二电极的管腔包括回收区；以及
(iii)电穿孔区，其中所述电穿孔区与所述第一电极的所述第一出口和所述第二电极的所述第二入口流体连接，并且其中将电势差施加于所述第一电极和所述第二电极时在所述电穿孔区中产生电场，
(b)使所述第一电极和所述第二电极通电，以在所述第一电极和所述第二电极之间产生电势差，从而在所述电穿孔区中产生电场；以及
(c)使悬浮于具有所述组合物的所述流体中的所述多个细胞通过所述装置的所述电穿孔区中的所述电场；
其中悬浮于具有所述组合物的流体中的所述多个细胞通过所述电穿孔区中的所述电场的流动增强了所述多个细胞的暂时渗透性，从而将所述组合物引入所述多个细胞的至少一部分。
117.一种将组合物电穿孔到悬浮于流体中的多个细胞的至少一部分中的方法，所述方法包括：
(a)提供一种装置，所述装置包括：
(i)第一电极，所述第一电极包括第一入口和第一出口，其中所述第一电极的管腔包括进入区；
(ii)第二电极，所述第二电极包括第二入口和第二出口，其中所述第二电极的管腔包括回收区；以及
(iii)电穿孔区，其中所述电穿孔区与所述第一电极的所述第一出口和所述第二电极的所述第二入口流体连接，并且其中将电势差施加于所述第一电极和所述第二电极在所述电穿孔区中产生电场，
(b)使所述第一电极和所述第二电极通电，以在所述第一电极和所述第二电极之间产生电势差，从而在所述电穿孔区中产生电场；以及
(c)使悬浮于具有所述组合物的所述流体中的所述多个细胞通过所述装置的所述电穿孔区中的所述电场；
其中悬浮于具有所述组合物的流体中的所述多个细胞通过所述电穿孔区中的所述电场的流动增强了所述多个细胞的暂时渗透性，从而将所述组合物电穿孔到所述多个细胞的至少一部分中。
118.如第116段或第117段所述的方法，还包括评估悬浮于所述流体中的所述多个细胞的一部分的健康状况。
119.如第118段所述的方法，其中所述评估包括测量悬浮于所述流体中的所述多个细胞的一部分的活力。
120.如第118段所述的方法，其中所述评估包括测量悬浮于所述流体中的所述多个细胞的一部分的转染效率。
121.如第118段所述的方法，其中所述评估包括测量悬浮于所述流体中的所述多个细胞的一部分的细胞回收率。
122.如第118段所述的方法，其中所述评估包括细胞表面标志物表达的流式细胞术分析。
123.如第116段或第117段所述的方法，其中相对于在离开所述装置的所述电穿孔区时细胞表型的基线测量值而言，所述多个细胞具有从0％至约25％的表型变化。
124.如第116段或第117段所述的方法，其中所述多个细胞在离开所述装置的所述电穿孔区时无表型变化。
125.如第116段或第117段所述的方法，其中所述电穿孔是基本上非热可逆电穿孔。
126.如第116段或第117段所述的方法，其中所述电穿孔是基本上非热不可逆电穿孔。
127.如第116段或第117段所述的方法，其中所述电穿孔是基本上热不可逆电穿孔。
128.如第116段或第117段所述的方法，其中所述装置的所述电穿孔区具有均一的横截面尺寸。
129.如第116段或第117段所述的方法，其中所述装置的所述电穿孔区具有不均一的横截面尺寸。
130.如第116段或第117段所述的方法，其中所述装置还包括多个电穿孔区。
131.如第130段所述的方法，其中所述多个电穿孔区中的每个具有均一的横截面。
132.如第130段所述的方法，其中所述多个电穿孔区中的每个具有不均一的横截面。
133.如第116段或第117段所述的方法，其中部分c)通过施加正压而出现。
134.如第116段或第117段所述的方法，其中所述样品中的所述多个细胞中的所述细胞选自由以下各项组成的组：哺乳动物细胞、真核生物细胞、合成细胞、人细胞、动物细胞、植物细胞、原代细胞、细胞系、悬浮细胞、贴壁细胞、免疫细胞、干细胞、血细胞、红细胞、T细胞、B细胞、中性粒细胞、树突细胞、抗原呈递细胞(APC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、外周血单核细胞(PBMC)、人胚肾(HEK-293)细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
135.如第134段所述的方法，其中所述细胞包括Jurkat细胞。
136.如第134段所述的方法，其中所述细胞包括原代人T细胞。
137.如第134段所述的方法，其中所述细胞包括THP-1细胞。
138.如第134段所述的方法，其中所述细胞包括原代人巨噬细胞。
139.如第134段所述的方法，其中所述细胞包括原代人单核细胞。
140.如第134段所述的方法，其中所述细胞包括自然杀伤细胞。
141.如第134段所述的方法，其中所述细胞包括人胚肾细胞。
142.如第134段所述的方法，其中所述细胞包括B细胞。
143.如第116段或第117段所述的方法，其中所述组合物包含至少一种选自由以下各项组成的组的化合物：治疗剂、维生素、纳米颗粒、带电的分子、不带电的分子、DNA、RNA、CRISPR-Cas复合物、蛋白质、病毒、聚合物、核糖核蛋白(RNP)和多糖。
144.如第116段或第117段所述的方法，其中所述组合物具有的在所述流体中的浓度在0.0001μg/mL和1000μg/mL之间。
145.如第116段或第117段所述的方法，还包括与所述进入区流体连接的第一储集器。
146.如第116段或第117段所述的方法，还包括与所述回收区流体连接的第二储集器。
147.如第116段或第117段所述的方法，其中所述电穿孔区的横截面选自由以下各项组成的组：圆形、椭圆形、多边形、星形、平行四边形、梯形和不规则形状。
148.如第116段或第117段所述的方法，其中所述进入区的横截面尺寸在所述电穿孔区的横截面尺寸的0.01％和100,000％之间。
149.如第116段或第117段所述的方法，其中所述回收区的横截面尺寸在所述电穿孔区的横截面尺寸的0.01％和100,000％之间。
150.如第116段或第117段所述的方法，其中所述进入区、回收区或电穿孔区均不能减小悬浮于所述流体中的所述多个细胞中的任一个的横截面尺寸。
151.如第116段或第117段所述的方法，其中所述电穿孔的占空比在0.001％和100％之间。
152.如第116段或第117段所述的方法，其中所述电穿孔区的最大横截面尺寸在0.005mm和50mm之间。
153.如第116段或第117段所述的方法，其中所述电穿孔区的长度在0.005mm和50mm之间。
154.如第116段或第117段所述的方法，其中所述第一电极或所述第二电极中的任一者的横截面尺寸在0.1mm和5mm之间。
155.如第116段或第117段所述的方法，其中所述装置还包括外部结构，所述外部结构包括壳体，所述壳体被构造为包裹所述装置的所述第一电极、第二电极和所述电穿孔区。
156.如第155段所述的方法，其中所述外部结构包括可操作地耦合至所述第一电极的第一电输入和可操作地耦合至所述第二电极的第二电输入。
157.如第155段所述的方法，其中所述外部结构整合至所述装置。
158.如第155段所述的方法，其中所述外部结构可释放地连接至所述装置。
159.如第116段或第117段所述的方法，其中步骤c)的递送速率在0.001mL/min和1,000mL/min之间。
160.如第116段或第117段所述的方法，其中悬浮于所述流体中的所述多个细胞中的任一个的停留时间在0.5ms至50ms之间。
161.如第116段或第117段所述的方法，还包括控制器，所述控制器可操作地耦合至所述电势源，以将电压脉冲递送至所述第一电极和所述第二电极，以在所述第一电极和所述第二电极之间产生电势差。
162.如第161段所述的方法，其中所述电压脉冲具有的幅度在0.01kV至3kV之间。
163.如第161段所述的方法，其中所述电压脉冲具有的持续时间在0.01ms和1,000ms之间。
164.如第161段所述的方法，其中所述电压脉冲以在1Hz和50,000Hz之间的频率施加于所述第一电极和所述第二电极。
165.如第161段所述的方法，其中所述电压脉冲的波形选自由以下各项组成的组：DC波形、方波波形、脉冲波形、双极波形、正弦波形、斜坡波形、不对称双极波形、任意波形以及它们的任何叠加和组合。
166.如第161段所述的方法，其中由所述电压脉冲产生的所述电场具有的大小在1V/cm和50,000V/cm之间。
167.如第116段或第117段所述的方法，其中所述流体具有的电导率在0.001mS/cm和500mS/cm之间。
168.如第116段或第117段所述的方法，还包括被构造为容纳所述装置的壳体。
169.如第168段所述的方法，其中所述壳体还包括被构造为增加或减少所述壳体的温度的热控制器。
170.如第169段所述的方法，其中所述热控制器是加热元件，所述加热元件选自由以下各项组成的组：加热块、液体流、电池供电的加热器和薄膜加热器。
171.如第169段所述的方法，其中所述热控制器是冷却元件，所述冷却元件选自由以下各项组成的组：液体流、蒸发冷却器和帕尔贴装置。
172.如第118段至第171段中任一项所述的方法，其中悬浮于所述流体中的所述多个细胞的温度在0℃至50℃之间。
173.如第116段至第172段中任一项所述的方法，其中所述装置包括多个细胞穿孔装置。
174.如第173段所述的方法，其中所述装置包括多个外部结构。
175.如第116段至第174段中任一项所述的方法，还包括在穿孔后将悬浮于所述流体中的所述多个细胞储存于回收缓冲液中。
176.如第116段至第175段中任一项所述的方法，其中所述电穿孔的细胞在所述组合物的引入后具有的活力在0.1％和99.9％之间。
177.如第116段至第176段中任一项所述的方法，其中所述组合物引入所述细胞的效率在0.1％和99.9％之间。
178.如第116段至第177段中任一项所述的方法，其中回收的细胞的数量在104个细胞和1012个细胞之间。
179.如第116段至第178段中任一项所述的方法，其中所述活的经工程化的细胞的收率在0.1％和500％之间。
180.一种用于将组合物机电递送到悬浮于流体中的多个细胞中的套件，所述套件包括：
(a)多个装置，所述穿孔装置中的每个包括：
(i)第一电极，所述第一电极包括第一入口和第一出口，其中所述第一电极的管腔包括进入区；
(ii)第二电极，所述第二电极包括第二入口和第二出口，其中所述第二电极的管腔包括回收区；以及
(iii)电穿孔区，其中所述电穿孔区与所述第一电极的所述第一出口和所述第二电极的所述第二入口流体连接，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面尺寸，并且其中将电势差施加于所述第一电极和所述第二电极时在所述电穿孔区中产生电场；
(b)多个外部结构，所述外部结构被构造为包裹所述多个装置，其中所述多个外部结构中的每个包括：
(i)壳体，所述壳体被构造为机电接合所述至少一个装置的所述第一电极、所述第二电极和所述电穿孔区；
(ii)第一电输入，所述第一电输入可操作地耦合至所述第一电极；以及
(iii)第二电输入，所述第二电输入可操作地耦合至所述第二电极；以及
(c)转染缓冲液，用于将所述组合物机电递送到悬浮于所述流体中的所述多个细胞。
181.一种用于将组合物电穿孔到悬浮于流体中的多个细胞中的套件，所述套件包括：
(a)多个装置，所述穿孔装置中的每个包括：
(i)第一电极，所述第一电极包括第一入口和第一出口，其中所述第一电极的管腔包括进入区；
(ii)第二电极，所述第二电极包括第二入口和第二出口，其中所述第二电极的管腔包括回收区；以及
(iii)电穿孔区，其中所述电穿孔区与所述第一电极的所述第一出口和所述第二电极的所述第二入口流体连接，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面尺寸，并且其中将电势差施加于所述第一电极和所述第二电极在所述电穿孔区中产生电场；
(b)多个外部结构，所述外部结构被构造为包裹所述多个装置，其中所述多个外部结构中的每个包括：
(i)壳体，所述壳体被构造为机电接合所述至少一个装置的所述第一电极、所述第二电极和所述电穿孔区；
(ii)第一电输入，所述第一电输入可操作地耦合至所述第一电极；以及
(iii)第二电输入，所述第二电输入可操作地耦合至所述第二电极；以及
(c)转染缓冲液，所述转染缓冲液用于对悬浮于所述液体中的所述多个细胞进行电穿孔。
182.如第180段或第181段所述的套件，其中所述外部结构整合至所述装置。
183.如第180段或第181段所述的套件，其中所述外部结构可释放地连接至所述多个装置。
可以根据以下编号段落中任一项定义本文所述的技术的其他实施方案：
1.一种用于将组合物电穿孔到悬浮于液体中的多个细胞中的装置，所述装置包括：
(a)第一电极，所述第一电极包括第一入口、第一出口和包含最小横截面尺寸的第一管腔；
(b)第二电极，所述第二电极包括第二入口、第二出口和包含最小横截面尺寸的第二管腔；以及
(c)电穿孔区，所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，其中所述电穿孔区包含的最小横截面尺寸大于约100μm，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面面积；
其中所述第一出口、所述电穿孔区和所述第二入口流体连通。
2.一种用于将组合物机电递送到悬浮于液体中的多个细胞中的装置，所述装置包括：
(a)第一电极，所述第一电极包括第一入口、第一出口和包含最小横截面尺寸的第一管腔；
(b)第二电极，所述第二电极包括第二入口、第二出口和包含最小横截面尺寸的第二管腔；以及
(c)电穿孔区，所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，其中所述电穿孔区包含的最小横截面尺寸大于约100μm，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面面积；
其中所述第一出口、所述电穿孔区和所述第二入口流体连通。
3.如第1段或第2段所述的装置，其中所述电穿孔区的横向横截面是选自由以下各项组成的组的形状：圆形、圆盘形、椭圆形、正多边形、不规则多边形、曲线形、星形、平行四边形、梯形和不规则形状。
4.如第1段至第3段中任一项所述的装置，其中所述电穿孔区具有基本上圆形的横向横截面。
5.如第1段至第4段中任一项所述的装置，其中所述电穿孔区具有的最小横截面尺寸在0.1mm和50mm之间。
6.如第1段至第5段中任一项所述的装置，其中所述电穿孔区具有的横向横截面面积在约7850μm2和约2000mm2之间。
7.如第1段至第6段中任一项所述的装置，其中所述电穿孔区具有的长度在0.1mm和50mm之间。
8.如第1段至第7段中任一项所述的装置，其中所述第一电极和/或所述第二电极中的任一者的管腔具有的最小横截面尺寸在0.01mm和500mm之间。
9.如第1段至第8段中任一项所述的装置，其中所述第一或第二电极中的任一者的管腔的最小横截面尺寸与所述电穿孔区的最小横截面尺寸的比率在1∶10和10∶1之间。
10.如第1段至第9段中任一项所述的装置，其中所述电穿孔区的最小横截面尺寸与所述电穿孔区的长度的比率在1∶100和100∶1之间。
11.如第1段至第10段中任一项所述的装置，其中所述第一电极和/或所述第二电极中的任一者的管腔的横截面面积与所述电穿孔区的横截面面积的比率在1∶10和10∶1之间。
12.如第1段至第11段中任一项所述的装置，其还包括与所述第一入口流体连通的第一储集器和/或与所述第二出口流体连通的第二储集器。
13.如第1段至第12段中任一项所述的装置，其还包括与所述第一管腔或所述第二管腔流体连通的第三储集器。
14.如第13段所述的装置，其中所述第一电极或所述第二电极中的任一者具有用于与所述第三储集器流体连通的附加入口或出口。
15.如第1段至第14段中任一项所述的装置，其中所述装置还包括一个或多个附加电穿孔区。
16.一种用于将组合物电穿孔到悬浮于液体中的多个细胞中的系统，所述系统包括：
(a)一种装置，所述装置包括：
(i)第一电极，所述第一电极包括第一入口、第一出口和包含最小横截面尺寸的第一管腔；
(ii)第二电极，所述第二电极包括第二入口、第二出口和包含最小横截面尺寸的第二管腔；以及
(iii)电穿孔区，所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，其中所述电穿孔区包含的最小横截面尺寸大于约100μm，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面面积；
其中所述第一出口、所述电穿孔区和所述第二入口流体连通；以及
(b)电势源，其中所述装置的第一电极和第二电极可释放地与所述电势源可操作地接触。
17.一种用于将组合物机电递送到悬浮于液体中的多个细胞中的系统，所述系统包括：
(a)一种装置，所述装置包括：
(i)第一电极，所述第一电极包括第一入口、第一出口和包含最小横截面尺寸的第一管腔；
(ii)第二电极，所述第二电极包括第二入口、第二出口和包含最小横截面尺寸的第二管腔；以及
(iii)电穿孔区，所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，其中所述电穿孔区包含的最小横截面尺寸大于约100μm，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面面积；
其中所述第一出口、所述电穿孔区和所述第二入口流体连通；以及
(b)电势源，其中所述装置的第一电极和第二电极可释放地与所述电势源可操作地接触。
18.如第16段或第17段所述的系统，其还包括与所述第一入口流体连通的第一储集器。
19.如第16段至第18段中任一项所述的系统，其还包括与所述第二出口流体连通的第二储集器。
20.如第16段至第19段中任一项所述的系统，其还包括与所述第一电极或所述第二电极中的任一者的管腔流体连通的第三储集器，其中所述第一电极或所述第二电极中的任一者具有用于与所述第三储集器流体连通的附加入口。
21.如第16段至第20段中任一项所述的系统，其还包括与所述第一入口流体连通的流体递送源，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。
22.如第16段至第21段中任一项所述的系统，其还包括控制器，所述控制器可操作地耦合至所述电势源，以将电压脉冲递送至所述第一电极和所述第二电极，其中所述电压脉冲在所述第一电极和所述第二电极之间产生电势差，从而在所述电穿孔区中产生电场。
23.如第16段至第22段中任一项所述的系统，其中所述装置还包括一个或多个附加电穿孔区。
24.如第23段所述的系统，其还包括壳体，所述壳体被构造为使所述电穿孔区并联地、串联地或在时间上偏移地通电，其中所述壳体还包括容纳多个电穿孔装置的托盘，其中所述托盘被两个栅网电极改装，其中第一栅网电极与第二栅网电极电绝缘，其中所述多个装置中的每个的第一电极的外部可释放地与第一弹簧加载的电极、第一机械连接的电极或第一感应连接的电极中的任一者可操作地接触，其中所述多个装置中的每个的第二电极的外部可释放地与第二弹簧加载的电极、第二机械连接的电极或第二感应耦合的电极中的任一者可操作地接触，其中所述多个装置中的每个可释放地通过栅网电极中的开口进入所述壳体，其中每个装置的第一弹簧加载的电极、第一机械连接的电极或第一感应连接的电极中的任一者与第一栅网电极可操作地接触，并且每个装置的第二弹簧加载的电极、第二机械连接的电极或第二感应连接的电极中的任一者与第二栅网电极可操作地接触，其中所述栅网电极连接至所述电势源。
25.如第24段所述的系统，其中所述电势源将电压脉冲递送至所述栅网电极，其中所述第一栅网电极以特定的施加电压通电，而所述第二栅网电极以特定的施加电压通电，其中所述多个装置中的每个由所述栅网电极以相同的施加电压脉冲通电，以使得在每个装置的至少一个电穿孔区中的每个内产生的电场的大小基本上相等。
26.如第25段所述的系统，其中所述电势源包括被构造为调节电压脉冲至所述栅网电极的递送的附加电路或程序，其中所述多个装置中的每个接收来自所述栅网电极的不同电压，其中在每个装置的所述至少一个电穿孔区中的每个内产生的电场的大小不相等。
27.一种用于将组合物电穿孔到悬浮于液体中的多个细胞中的系统，所述系统包括：
(a)一种装置，所述装置包括：
(i)第一电极，所述第一电极包括第一入口、第一出口和第一管腔；
(ii)第二电极，所述第二电极包括第二入口、第二出口和第二管腔；
(iii)第三入口和第三出口，其中所述第三入口和所述第三出口与所述第一管腔流体连通，其中所述第三入口和所述第三出口与在所述第一入口和所述第一出口之间的所述第一电极相交；
(iv)第四入口和第四出口，其中所述第四入口和所述第四出口与所述第二管腔流体连通，其中所述第四入口和所述第四出口与在所述第二入口和所述第二出口之间的所述第二电极相交；以及
(v)电穿孔区，所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，其中所述电穿孔区具有的长度在0.1mm和50mm之间，并且包含的最小横截面尺寸大于约100μm，其中所述电穿孔区的横向横截面面积是基本上均一的；
其中所述第一管腔的最小横截面尺寸与所述电穿孔区的最小横截面尺寸的比率在1∶10和10∶1之间，其中所述第二管腔的最小横截面尺寸与所述电穿孔区的最小横截面尺寸的比率在1∶10和10∶1之间，并且其中所述第一出口、所述电穿孔区和所述第二入口流体连通；以及
(b)电势源，其中所述装置的所述第一电极和所述第二电极可释放地与所述电势源可操作地接触。
28.一种用于将组合物机电递送到悬浮于液体中的多个细胞中的系统，所述系统包括：
(a)一种装置，所述装置包括：
(i)第一电极，所述第一电极包括第一入口、第一出口和第一管腔；
(ii)第二电极，所述第二电极包括第二入口、第二出口和第二管腔；
(iii)第三入口和第三出口，其中所述第三入口和所述第三出口与所述第一管腔流体连通，其中所述第三入口和所述第三出口与在所述第一入口和所述第一出口之间的所述第一电极相交；
(iv)第四入口和第四出口，其中所述第四入口和所述第四出口与所述第二管腔流体连通，其中所述第四入口和所述第四出口与在所述第二入口和所述第二出口之间的所述第二电极相交；以及
(v)电穿孔区，所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，其中所述电穿孔区具有的长度在0.1mm和50mm之间，并且包含的最小横截面尺寸大于约100μm，其中所述电穿孔区的横向横截面面积是基本上均一的；
其中所述第一管腔的最小横截面尺寸与所述电穿孔区的最小横截面尺寸的比率在1∶10和10∶1之间，其中所述第二管腔的最小横截面尺寸与所述电穿孔区的最小横截面尺寸的比率在1∶10和10∶1之间，并且其中所述第一出口、所述电穿孔区和所述第二入口流体连通；以及
(b)电势源，其中所述装置的所述第一电极和所述第二电极可释放地与所述电势源可操作地接触。
29.一种将组合物电穿孔到悬浮于流动液体中的多个细胞中的方法，所述方法包括：
(a)提供一种装置，所述装置包括：
(i)第一电极，所述第一电极包括第一出口、第一入口和包含最小横截面尺寸的第一管腔；
(ii)第二电极，所述第二电极包括第二出口、第二入口和包含最小横截面尺寸的第二管腔；以及
(iii)电穿孔区，所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，其中所述电穿孔区包含的最小横截面尺寸大于约100μm，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面面积；
并且其中所述第一出口、所述电穿孔区和所述第二入口流体连通；
(b)在所述第一和第二电极之间施加电势差，从而在所述电穿孔区中产生电场；以及
(c)使所述多个细胞和所述组合物通过所述电穿孔区，从而增强所述多个细胞的渗透性，以及将所述组合物引入所述多个细胞中。
30.一种将组合物机电递送到悬浮于流动液体中的多个细胞中的方法，所述方法包括：
(a)提供一种装置，所述装置包括：
(i)第一电极，所述第一电极包括第一出口、第一入口和包含最小横截面尺寸的第一管腔；
(ii)第二电极，所述第二电极包括第二出口、第二入口和包含最小横截面尺寸的第二管腔；以及
(iii)电穿孔区，所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二出口之间，其中所述电穿孔区包含的最小横截面尺寸大于约100μm，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面面积；
并且其中所述第一出口、所述电穿孔区和所述第二入口流体连通；
(b)在所述第一和第二电极之间施加电势差，从而在所述电穿孔区中产生电场；以及
(c)使所述多个细胞和所述组合物通过所述电穿孔区，从而增强所述多个细胞的渗透性，以及将所述组合物引入所述多个细胞中。
31.如第29段或第30段所述的方法，其中与步骤(b)之前的所述组合物相比，所述多个细胞在单独的液体中。
32.如第30段或第31段所述的方法，其中步骤(b)包括施加流体驱动的正压。
33.如第30段至第32段中任一项所述的方法，其中所述第一管腔、第二管腔或电穿孔区均不具有最小横截面尺寸，所述最小横截面尺寸使得悬浮于所述液体中的所述多个细胞中的任一个的横截面尺寸被暂时压缩。
34.如第30段至第33段中任一项所述的方法，其中从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的流速在0.001mL/min和1,000mL/min之间，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。
35.如第30段至第34段中任一项所述的方法，其中从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的雷诺数在0.04和2.43×104之间，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。
36.如第30段至第35段中任一项所述的方法，其中从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的最大速度在5×10-5m/s和32.7m/s之间，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。
37.如第30段至第36段中任一项所述的方法，其中从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的剪切速率在0.11/s和2×1061/s之间，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。
38.如第30段至第37段中任一项所述的方法，其中从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的峰值压力在1×10-3Pa和9.5×104Pa之间，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。
39.如第30段至第38段中任一项所述的方法，其中从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的平均速度在1.5×10-5m/s和15.9m/s之间，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。
40.如第30段至第39段中任一项所述的方法，其中从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的运动粘度在1×10-6m2/s和15×10-4m2/s之间，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。
41.如第30段至第40段中任一项所述的方法，其中悬浮于所述液体中的所述多个细胞在所述电穿孔区中的停留时间在0.5ms和50ms之间。
42.如第30段至第41段中任一项所述的方法，其中使所述多个细胞和所述组合物通过所述电穿孔区在所述流动液体上诱导机械应力，从而进一步增强所述多个细胞的渗透性，以及将所述组合物引入所述多个细胞中。
43.如第30段至第41段中任一项所述的方法，其中所述电场由电压脉冲产生。
44.如第43段所述的方法，其中所述电压脉冲以第一施加电压使所述第一电极通电，而所述第二电极以第二施加电压通电，从而在所述第一和第二电极之间施加电势差。
45.如第43段或第44段所述的方法，其中所述电压脉冲各自具有的幅度在-3kV和3kV之间。
46.如第43段至第45段中任一项所述的方法，其中所述电压脉冲具有的持续时间在0.01ms和1,000ms之间。
47.如第43段至第46段中任一项所述的方法，其中所述电压脉冲以在1Hz和50,000Hz之间的频率施加于所述第一和第二电极。
48.如第43段至第47段中任一项所述的方法，其中所述电压脉冲包括选自由以下各项组成的组的波形：DC波形、方波波形、脉冲波形、双极波形、正弦波形、斜坡波形、不对称双极波形、任意波形以及它们的任何叠加或组合。
49.如第43段至第48段中任一项所述的方法，其中由所述电压脉冲产生的所述电场具有的大小在1V/cm和50,000V/cm之间。
50.如第43段至第49段中任一项所述的方法，其中所述电压脉冲的占空比在0.001％和100％之间。
51.如第30段至第50段中任一项所述的方法，其中所述液体具有的电导率在0.001mS/cm和500mS/cm之间。
52.如第30段至第51段中任一项所述的方法，其中所述液体的温度在0℃和50℃之间。
53.如第30段至第52段中任一项所述的方法，还包括在所述组合物的机电递送之后将所述多个细胞储存于回收缓冲液中。
54.如第30段至第53段中任一项所述的方法，其中所述组合物包含至少一种选自由以下各项组成的组的化合物：治疗剂、维生素、纳米颗粒、带电的分子、不带电的分子、DNA、RNA、CRISPR-Cas复合物、蛋白质、酶、肽、病毒、聚合物、核糖核蛋白、多糖、经工程化的核酸酶、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、归巢核酸酶、大范围核酸酶(MN)、大范围TAL和转座子。
55.如第30段至第54段中任一项所述的方法，其中所述组合物具有的在所述液体中的浓度在0.0001μg/mL和1000μg/mL之间。
56.如第30段至第55段中任一项所述的方法，其中所述多个细胞包括真核细胞、植物细胞、原核细胞或合成细胞。
57.如第56段所述的方法，其中所述多个细胞包括人细胞或动物细胞。
58.如第30段至第57段中任一项所述的方法，其中所述多个细胞包括原代细胞、来自细胞系的细胞、贴壁细胞、未刺激的细胞、刺激的细胞、活化的细胞、干细胞、血细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、免疫细胞、红细胞或外周血单核细胞(PBMC)。
59.如第58段所述的方法，其中所述多个细胞包括适应性免疫细胞和/或先天免疫细胞。
60.如第30段至第58段中任一项所述的方法，其中所述多个细胞包括抗原呈递细胞(APC)、单核细胞、T细胞、B细胞、树突细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞、Jurkat细胞、THP-1细胞、人胚肾(HEK-293)细胞、或胚胎干细胞(ESC)、间充质干细胞(MSC)或造血干细胞(HSC)。
61.如第30段至第58段中任一项所述的方法，其中所述多个细胞包括原代人NK细胞、原代人诱导性多能干细胞(iPSC)、原代人巨噬细胞或原代人单核细胞。
62.一种用于将组合物电穿孔到悬浮于液体中的多个细胞中的套件，所述套件包括：
(a)多个装置，所述穿孔装置中的每个包括：
(i)第一电极，所述第一电极包括第一出口、第一入口和包含最小横截面尺寸的第一管腔；
(ii)第二电极，所述第二电极包括第二出口、第二入口和包含最小横截面尺寸的第二管腔；以及
(iii)电穿孔区，所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，其中所述电穿孔区包含的最小横截面尺寸大于约100μm，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面面积；以及
其中对所述第一和第二电极施加电势差在所述电穿孔区中产生电场；以及
(b)多个外部结构，所述外部结构被构造为包裹所述多个装置，其中所述多个外部结构中的每个包括：
(i)壳体，所述壳体被构造为包裹所述至少一个装置的所述第一电极、所述第二电极和所述电穿孔区；
(ii)第一电输入，所述第一电输入可操作地耦合至所述第一电极；以及
(iii)第二电输入，所述第二电输入可操作地耦合至所述第二电极。
63.一种用于将组合物机电递送到悬浮于液体中的多个细胞中的套件，所述套件包括：
(a)多个装置，所述穿孔装置中的每个包括：
(i)第一电极，所述第一电极包括第一出口、第一入口和包含最小横截面尺寸的第一管腔；
(ii)第二电极，所述第二电极包括第二出口、第二入口和包含最小横截面尺寸的第二管腔；以及
(iii)电穿孔区，所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，其中所述电穿孔区包含的最小横截面尺寸大于约100μm，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面面积；以及
其中对所述第一和第二电极施加电势差在所述电穿孔区中产生电场；以及
(b)多个外部结构，所述外部结构被构造为包裹所述多个装置，其中所述多个外部结构中的每个包括：
(i)壳体，所述壳体被构造为包裹所述至少一个装置的所述第一电极、所述第二电极和所述电穿孔区；
(ii)第一电输入，所述第一电输入可操作地耦合至所述第一电极；以及
(iii)第二电输入，所述第二电输入可操作地耦合至所述第二电极。
64.一种用于将组合物电穿孔到悬浮于液体中的多个细胞中的套件，所述套件包括：
(a)多个装置，如第1段至第15段中任一项所述的所述多个装置中的每个；以及
(b)多个外部结构，所述外部结构被构造为包裹所述多个装置，其中所述多个外部结构中的每个包括：
(i)壳体，所述壳体被构造为包裹所述至少一个装置的所述第一电极、所述第二电极和所述电穿孔区；
(ii)第一电输入，所述第一电输入可操作地耦合至所述第一电极；以及
(vi)第二电输入，所述第二电输入可操作地耦合至所述第二电极。
65.一种用于将组合物机电递送到悬浮于液体中的多个细胞中的套件，所述套件包括：
(a)多个装置，如第1段至第15段中任一项所述的所述多个装置中的每个；以及
(b)多个外部结构，所述外部结构被构造为包裹所述多个装置，其中所述多个外部结构中的每个包括：
(i)壳体，所述壳体被构造为包裹所述至少一个装置的所述第一电极、所述第二电极和所述电穿孔区；
(ii)第一电输入，所述第一电输入可操作地耦合至所述第一电极；以及
(vi)第二电输入，所述第二电输入可操作地耦合至所述第二电极。
其他实施方案
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用并入，就如每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入本文的程度一样。如果此定义与本文引用的任何参考文献之间存在冲突，则以本文提供的定义为准。
虽然已经结合本公开的具体实施方案描述了本公开，但应理解，本发明能够进一步修改，并且本申请旨在覆盖本公开的任何变化、使用或改编，所述变化、使用或改编通常遵循本公开的原理，并且包括在本公开所属领域内的已知或常规实践中的对本公开的所述偏离，并且可应用于上文所示的基本特征，并且在权利要求的范围内。
其它实施方案在权利要求内。
Claims (59)
1.一种用于将组合物机电递送到悬浮于液体中的多个细胞中的装置，所述装置包括：
(a)第一电极，所述第一电极包括第一入口、第一出口和包含最小横截面尺寸的第一管腔；
(b)第二电极，所述第二电极包括第二入口、第二出口和包含最小横截面尺寸的第二管腔；以及
(c)电穿孔区，所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，其中所述电穿孔区包含的最小横截面尺寸大于约100μm，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面面积；
其中所述第一出口、所述电穿孔区和所述第二入口流体连通。
2.如权利要求1所述的装置，其中所述电穿孔区的横向横截面是选自由以下各项组成的组的形状：圆形、圆盘形、椭圆形、正多边形、不规则多边形、曲线形、星形、平行四边形、梯形和不规则形状。
3.如权利要求1或2所述的装置，其中所述电穿孔区具有基本上圆形的横向横截面。
4.如权利要求1-3中任一项所述的装置，其中所述电穿孔区具有的最小横截面尺寸在0.1mm和50mm之间。
5.如权利要求1-4中任一项所述的装置，其中所述电穿孔区具有的横截面面积在约7850μm2和约2000mm2之间。
6.如权利要求1-5中任一项所述的装置，其中所述电穿孔区具有的长度在0.1mm和50mm之间。
7.如权利要求1-6中任一项所述的装置，其中所述第一电极和/或所述第二电极中的任一者的管腔具有的最小横截面尺寸在0.01mm和500mm之间。
8.如权利要求1-7中任一项所述的装置，其中所述第一或第二电极中的任一者的管腔的最小横截面尺寸与所述电穿孔区的最小横截面尺寸的比率在1∶10和10∶1之间。
9.如权利要求1-8中任一项所述的装置，其中所述电穿孔区的最小横截面尺寸与所述电穿孔区的长度的比率在1∶100和100∶1之间。
10.如权利要求1-9中任一项所述的装置，其中所述第一电极和/或所述第二电极中的任一者的管腔的横向横截面面积与所述电穿孔区的横向横截面面积的比率在1∶10和10∶1之间。
11.如权利要求1-10中任一项所述的装置，其还包括与所述第一入口流体连通的第一储集器和/或与所述第二出口流体连通的第二储集器。
12.如权利要求1-11中任一项所述的装置，其还包括与所述第一管腔或所述第二管腔流体连通的第三储集器。
13.如权利要求12所述的装置，其中所述第一电极或所述第二电极中的任一者具有用于与所述第三储集器流体连通的附加入口或出口。
14.如权利要求1-13中任一项所述的装置，其中所述装置还包括一个或多个附加电穿孔区。
15.一种用于将组合物机电递送到悬浮于液体中的多个细胞中的系统，所述系统包括：
(a)一种装置，所述装置包括：
(i)第一电极，所述第一电极包括第一入口、第一出口和包含最小横截面尺寸的第一管腔；
(ii)第二电极，所述第二电极包括第二入口、第二出口和包含最小横截面尺寸的第二管腔；以及
(iii)电穿孔区，所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，其中所述电穿孔区包含的最小横截面尺寸大于约100μm，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面面积；
其中所述第一出口、所述电穿孔区和所述第二入口流体连通；以及
(b)电势源，其中所述装置的第一电极和第二电极可释放地与所述电势源可操作地接触。
16.如权利要求15所述的系统，其还包括与所述第一入口流体连通的第一储集器。
17.如权利要求15或16所述的系统，其还包括与所述第二出口流体连通的第二储集器。
18.如权利要求15-17中任一项所述的系统，其还包括与所述第一电极或所述第二电极中的任一者的管腔流体连通的第三储集器，其中所述第一电极或所述第二电极中的任一者具有用于与所述第三储集器流体连通的附加入口。
19.如权利要求15-18中任一项所述的系统，其还包括与所述第一入口流体连通的流体递送源，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。
20.如权利要求15-19中任一项所述的系统，其还包括控制器，所述控制器可操作地耦合至所述电势源，以将电压脉冲递送至所述第一电极和所述第二电极，其中所述电压脉冲在所述第一电极和所述第二电极之间产生电势差，从而在所述电穿孔区中产生电场。
21.如权利要求15-20中任一项所述的系统，其中所述装置还包括一个或多个附加电穿孔区。
22.如权利要求21所述的系统，其还包括壳体，所述壳体被构造为使所述电穿孔区并联地、串联地或在时间上偏移地通电，其中所述壳体还包括容纳多个电穿孔装置的托盘，其中所述托盘被两个栅网电极改装，其中第一栅网电极与第二栅网电极电绝缘，其中所述多个装置中的每个的第一电极的外部可释放地与第一弹簧加载的电极、第一机械连接的电极或第一感应连接的电极中的任一者可操作地接触，其中所述多个装置中的每个的第二电极的外部可释放地与第二弹簧加载的电极、第二机械连接的电极或第二感应耦合的电极中的任一者可操作地接触，其中所述多个装置中的每个可释放地通过栅网电极中的开口进入所述壳体，其中每个装置的第一弹簧加载的电极、第一机械连接的电极或第一感应连接的电极中的任一者与第一栅网电极可操作地接触，并且每个装置的第二弹簧加载的电极、第二机械连接的电极或第二感应连接的电极中的任一者与第二栅网电极可操作地接触，其中所述栅网电极连接至所述电势源。
23.如权利要求22所述的系统，其中所述电势源将电压脉冲递送至所述栅网电极，其中所述第一栅网电极以特定的施加电压通电，而所述第二栅网电极以特定的施加电压通电，其中所述多个装置中的每个由所述栅网电极以相同的施加电压脉冲通电，以使得在每个装置的至少一个电穿孔区中的每个内产生的电场的大小基本上相等。
24.如权利要求23所述的系统，其中所述电势源包括被构造为调节电压脉冲至所述栅网电极的递送的附加电路或程序，其中所述多个装置中的每个接收来自所述栅网电极的不同电压，其中在每个装置的所述至少一个电穿孔区中的每个内产生的电场的大小不相等。
25.一种用于将组合物机电递送到悬浮于液体中的多个细胞中的系统，所述系统包括：
(a)一种装置，所述装置包括：
(i)第一电极，所述第一电极包括第一入口、第一出口和第一管腔；
(ii)第二电极，所述第二电极包括第二入口、第二出口和第二管腔；
(iii)第三入口和第三出口，其中所述第三入口和所述第三出口与所述第一管腔流体连通，其中所述第三入口和所述第三出口与在所述第一入口和所述第一出口之间的所述第一电极相交；
(iv)第四入口和第四出口，其中所述第四入口和所述第四出口与所述第二管腔流体连通，其中所述第四入口和所述第四出口与在所述第二入口和所述第二出口之间的所述第二电极相交；以及
(v)电穿孔区，所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，其中所述电穿孔区具有的长度在0.1mm和50mm之间，并且包含的最小横截面尺寸大于约100μm，其中所述电穿孔区的横向横截面面积是基本上均一的；
其中所述第一管腔的最小横截面尺寸与所述电穿孔区的最小横截面尺寸的比率在1∶10和10∶1之间，其中所述第二管腔的最小横截面尺寸与所述电穿孔区的最小横截面尺寸的比率在1∶10和10∶1之间，并且其中所述第一出口、所述电穿孔区和所述第二入口流体连通；以及
(b)电势源，其中所述装置的所述第一电极和所述第二电极可释放地与所述电势源可操作地接触。
26.一种将组合物机电递送到悬浮于流动液体中的多个细胞中的方法，所述方法包括：
(a)提供一种装置，所述装置包括：
(i)第一电极，所述第一电极包括第一出口、第一入口和包含最小横截面尺寸的第一管腔；
(ii)第二电极，所述第二电极包括第二出口、第二入口和包含最小横截面尺寸的第二管腔；以及
(iii)电穿孔区，所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，其中所述电穿孔区包含的最小横截面尺寸大于约100μm，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面面积；
并且其中所述第一出口、所述电穿孔区和所述第二入口流体连通；
(b)在所述第一和第二电极之间施加电势差，从而在所述电穿孔区中产生电场；以及
(c)使所述多个细胞和所述组合物通过所述电穿孔区，从而增强所述多个细胞的渗透性，以及将所述组合物引入所述多个细胞中。
27.如权利要求26所述的方法，其中与步骤(b)之前的所述组合物相比，所述多个细胞在单独的液体中。
28.如权利要求26或27所述的方法，其中步骤(b)包括施加流体驱动的正压。
29.如权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述第一管腔、第二管腔或电穿孔区均不具有最小横截面尺寸，所述最小横截面尺寸使得悬浮于所述液体中的所述多个细胞中的任一个的横截面尺寸被暂时压缩。
30.如权利要求26-29中任一项所述的方法，其中从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的流速在0.001mL/min和1,000mL/min之间，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。
31.如权利要求26-30中任一项所述的方法，其中从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的雷诺数在0.04和2.43×104之间，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。
32.如权利要求26-31中任一项所述的方法，其中从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的最大速度在5×10-5m/s和32.7m/s之间，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。
33.如权利要求26-32中任一项所述的方法，其中从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的剪切速率在0.1s-1和2×106s-1之间，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。
34.如权利要求26-33中任一项所述的方法，其中从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的峰值压力在1×10-3Pa和9.5×104Pa之间，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。
35.如权利要求26-34中任一项所述的方法，其中从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的平均速度在1.5×10-5m/s和15.9m/s之间，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。
36.如权利要求26-35中任一项所述的方法，其中从流体递送源从所述第一管腔递送至所述电穿孔区的液体和/或悬浮中的所述多个细胞的运动粘度在1×10-6m2/s和15×10-4m2/s之间，其中所述流体递送源被构造为将所述液体和/或悬浮中的所述多个细胞通过所述第一管腔递送至所述第二出口。
37.如权利要求26-36中任一项所述的方法，其中悬浮于所述液体中的所述多个细胞在所述电穿孔区中的停留时间在0.5ms和50ms之间。
38.如权利要求26所述的方法，其中使所述多个细胞和所述组合物通过所述电穿孔区在所述流动液体上诱导机械应力，从而进一步增强所述多个细胞的渗透性，以及将所述组合物引入所述多个细胞中。
39.如权利要求26-37中任一项所述的方法，其中所述电场由电压脉冲产生。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述电压脉冲以第一施加电压使所述第一电极通电，并且所述第二电极以第二施加电压通电，从而在所述第一和第二电极之间施加电势差。
41.如权利要求39或40所述的方法，其中所述电压脉冲各自具有的幅度在-3kV和3kV之间。
42.如权利要求39-41中任一项所述的方法，其中所述电压脉冲具有的持续时间在0.01ms和1,000ms之间。
43.如权利要求39-42中任一项所述的方法，其中所述电压脉冲以在1Hz和50,000Hz之间的频率施加于所述第一和第二电极。
44.如权利要求39-43中任一项所述的方法，其中所述电压脉冲包括选自由以下各项组成的组的波形：DC波形、方波波形、脉冲波形、双极波形、正弦波形、斜坡波形、不对称双极波形、任意波形以及它们的任何叠加或组合。
45.如权利要求39-44中任一项所述的方法，其中由所述电压脉冲产生的所述电场具有的大小在1V/cm和50,000V/cm之间。
46.如权利要求39-45中任一项所述的方法，其中所述电压脉冲的占空比在0.001％和100％之间。
47.如权利要求26-46中任一项所述的方法，其中所述液体具有的电导率在0.001mS/cm和500mS/cm之间。
48.如权利要求26-47中任一项所述的方法，其中所述液体的温度在0℃和50℃之间。
49.如权利要求26-48中任一项所述的方法，其还包括在所述组合物的机电递送之后将所述多个细胞储存于回收缓冲液中。
50.如权利要求26-49中任一项所述的方法，其中所述组合物包含至少一种选自由以下各项组成的组的化合物：治疗剂、维生素、纳米颗粒、带电的分子、不带电的分子、DNA、RNA、CRISPR-Cas复合物、蛋白质、酶、肽、病毒、聚合物、核糖核蛋白、多糖、经工程化的核酸酶、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、归巢核酸酶、大范围核酸酶(MN)、大范围TAL和转座子。
51.如权利要求26-50中任一项所述的方法，其中所述组合物具有的在所述液体中的浓度在0.0001μg/mL和1000μg/mL之间。
52.如权利要求26-51中任一项所述的方法，其中所述多个细胞包括真核细胞、植物细胞、原核细胞或合成细胞。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述多个细胞包括人细胞或动物细胞。
54.如权利要求26-53中任一项所述的方法，其中所述多个细胞包括原代细胞、来自细胞系的细胞、贴壁细胞、未刺激的细胞、刺激的细胞、活化的细胞、干细胞、血细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、免疫细胞、红细胞或外周血单核细胞(PBMC)。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述多个细胞包括适应性免疫细胞和/或先天免疫细胞。
56.如权利要求26-54中任一项所述的方法，其中所述多个细胞包括抗原呈递细胞(APC)、单核细胞、T细胞、B细胞、树突细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞、Jurkat细胞、THP-1细胞、人胚肾(HEK-293)细胞、或胚胎干细胞(ESC)、间充质干细胞(MSC)或造血干细胞(HSC)。
57.如权利要求26-54中任一项所述的方法，其中所述多个细胞包括原代人NK细胞、原代人诱导性多能干细胞(iPSC)、原代人巨噬细胞或原代人单核细胞。
58.一种用于将组合物机电递送到悬浮于液体中的多个细胞中的套件，所述套件包括：
(a)多个装置，所述装置中的每个包括：
(i)第一电极，所述第一电极包括第一出口、第一入口和包含最小横截面尺寸的第一管腔；
(ii)第二电极，所述第二电极包括第二出口、第二入口和包含最小横截面尺寸的第二管腔；以及
(iii)电穿孔区，所述电穿孔区设置在所述第一出口和所述第二入口之间，其中所述电穿孔区包含的最小横截面尺寸大于约100μm，其中所述电穿孔区具有基本上均一的横截面面积；以及
其中对所述第一和第二电极施加电势差在所述电穿孔区中产生电场；以及
(b)多个外部结构，所述外部结构被构造为包裹所述多个装置，其中所述多个外部结构中的每个包括：
(i)壳体，所述壳体被构造为包裹所述至少一个装置的所述第一电极、所述第二电极和所述电穿孔区；
(ii)第一电输入，所述第一电输入可操作地耦合至所述第一电极；以及
(iii)第二电输入，所述第二电输入可操作地耦合至所述第二电极。
59.一种用于将组合物机电递送到悬浮于液体中的多个细胞中的套件，所述套件包括：
(a)多个装置，如权利要求1-14中任一项所述的所述多个装置中的每个；以及
(b)多个外部结构，所述外部结构被构造为包裹所述多个装置，其中所述多个外部结构中的每个包括：
(i)壳体，所述壳体被构造为包裹所述至少一个装置的所述第一电极、所述第二电极和所述电穿孔区；
(ii)第一电输入，所述第一电输入可操作地耦合至所述第一电极；以及
(vi)第二电输入，所述第二电输入可操作地耦合至所述第二电极。
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