KR20240006027A - 순차적인 전기천공 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시의 양태는 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 조직, 또는 이들의 유도체로의 하나 이상의 관심 제제의 진입 효율을 증가시키고, 전기 아크 또는 열 충격에 의한 손상을 최소화하고; 관심 제제의 로딩 효율을 증가시키고; 세포, 세포 입자, 지질 소포, 또는 조직의 생존력 및 임상 효과를 생성하는 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 또는 조직의 능력을 유지하기 위해, 시간에 따라 분리된 다수의 전기 펄스를 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜에 전달하는 순차적인 전기천공 기술에 관한 것이다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
[0001]
본 출원은 2021년 4월 29일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 63/181,583에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
배경
I.
발명의 분야
[0002]
본 개시는 일반적으로 제제를 살아있는 세포 또는 세포 입자 또는 지질 소포에 도입하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.
II.
배경
[0003]
전기천공은 박테리아, 효모, 식물 원형질체, 배양된 세포, 다른 세포, 세포 입자, 리포솜, 소포, 조직, 또는 다른 생물학적 비히클을 형질전환시키기 위해 짧은 지속기간 동안 제어된 전기 펄스를 적용하는 것이다. 펄스는 세포막의 가역적 파괴를 유발하는 막횡단 전위를 유도한다. 이러한 작용은 세포막의 침투 또는 "기공 형성"을 초래하여, 소분자(예를 들어, 분자 프로브, 약물, 염료, 올리고뉴클레오티드, 또는 펩티드) 또는 큰 분자(예를 들어, 단백질, DNA 및 RNA)와 같은 세포외 제제의 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 또는 조직 내로의 도입을 허용한다. 이 절차는 또한 조직 배양 세포 또는 일차 세포, 특히 포유동물 세포에서 분자 경로에 특이적으로 개입하는 화학적 또는 생물학적 제제의 도입에 매우 효율적이다. 예를 들어, 전기천공은 녹아웃 마우스를 생산하는 과정 뿐만 아니라 종양 치료, 유전자 요법, 및 세포-기반 요법에 사용된다.
[0004]
세포의 트랜스펙션과 관련하여, 많은 인자가 트랜스펙션의 어려움 또는 성공에 기여한다. 예를 들어, 시약-유전자 복합체의 세포 결합 및 내재화, 세포질로의 핵산의 방출, 유전자(들)의 핵 흡수 및 발현; 건강, 대사 활성, 세포내이입 속도, 및 세포 분열 속도; 배양된 세포의 연령, 컨플루언스(confluence), 및 계대 수는 모두 세포를 트랜스펙션시키기 어렵게 만들 수 있는 인자이다. 줄기 세포 및 미확정(uncommitted) 전구 세포를 포함하는 미성숙 세포에는 이러한 특성이 없다. 유사하게, 약물 발견, 독성학, 및 기초 연구에서 모델로 점점 더 많이 사용되는 일차 세포는 분열하지 않고, 더 낮은 내재화 능력을 가지며, 종종 트랜스펙션 복합체에 결합하는 능력이 부족하다.
[0005]
전기천공 과정의 결과는 인가된 전기장(EF) 펄스의 크기 및 펄스의 지속기간에 의해 크게 제어된다. 펄스 크기가 특정 임계값 수준을 초과하는 한, 펄스의 크기 또는 지속기간의 증가는 일반적으로 세포 내부에 세포외 분자의 더 큰 축적을 초래한다.
[0006]
세포 현탁액에 가해지는 각각의 전기 펄스는 전극 상의 전압, 완충제를 통한 전류, 및 고전압 펄스의 지속기간의 곱과 동일한 특정 양의 에너지를 특징으로 할 수 있다. 그러나, 가해진 전기 에너지의 단지 작은 백분율만이 지질 막을 변형시키고 세포외 물질을 세포로 이동시키는 유용한 작업에 소비된다. 나머지 전기 에너지는 주변 매질에서 생성되는 열의 형태로 소산된다. 가열 자체가 세포의 투과를 유발하지 않더라도, 세포 현탁액을 약간 가열하는 전력 소실은 EF 적용의 불가피한 결과이다. 전기천공 완충제의 전도성이 높을수록, 열 생성에 더 많은 에너지가 낭비된다. 주위 온도보다 20-24도 더 높은 온도로의 열 축적은 세포 및 세포 성분에 영구적인 손상을 야기하고 전기천공 과정의 효율을 감소시킬 수 있고; 이는 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 또는 조직의 성공적인 전기천공에 사용될 수 있는 에너지의 양을 제한한다.
[0007]
전기천공 샘플의 온도 증가는 또한 샘플의 전기 전도도의 증가와 관련이 있으며, 이는 단순한 염 용액에서 ℃ 당 약 2%만큼 증가한다. 인가된 전기장은 세포 또는 입자 현탁액을 통한 전류 흐름을 유발하고, 이는 전도도 증가로 해석되는 온도 상승 및 전원에서 더 큰 전류 소모 등을 야기한다. 이러한 포지티브 피드백 과정이 중단되지 않으면(예를 들어, 펄스를 끔으로써), 전류 증가는 눈사태와 같은 방식으로 진행되어 아킹(arcing) 및 샘플 손실을 초래한다. 이러한 효과는 주로 비교적 높은 전계 강도(>2 kV/cm)에서 관찰된다.
[0008]
예를 들어, 미성숙 또는 일차 세포와 같은 트랜스펙션하기 어려운 세포의 전기천공은 강한 전기장을 필요로 하므로, 완충제 전도도 또는 펄스 폭이 제한되어야 한다. 그러나, 세포는 환경 생화학적 변화에 매우 민감하고, 세포, 세포 입자, 지질 소포, 또는 조직에 전기장의 인가와 관련된 환경의 물리-화학적 변화는 생리학적 상태, 활성화 특성, 및 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 또는 조직의 생물학적 기능을 조절하여, 임상 효과를 전달하는 전기천공 물질의 능력에 영향을 미칠 수 있다.
[0009]
따라서, 본 발명자들은 임상 효과를 생성하는 능력을 넘어서 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜 또는 조직을 손상시키지 않고 관심 제제를 사용하여 트랜스펙션하기 어려운 세포, 세포 입자, 지질 소포 또는 조직을 고효율로 전기천공하는 방법이 필요하다고 생각한다.
개요
[0010]
일부 양태에서, 순차적인 전기 펄스를 포함하는 신규한 전기천공 프로토콜을 사용하여 관심 제제로 트랜스펙션하기 어려운 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 또는 조직의 효율적인 전기천공을 위한 방법 및 장치가 본원에 기재된다. 특정 양태에서, 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 또는 조직의 순차적인 전기천공은 놀랍게도 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 또는 조직의 단일 전기천공에 비해 유의하게 더 높은 트랜스진 발현을 초래한다. 특정 양태에서, 본원에 기재된 방법 및 장치는 세포, 세포 입자, 지질 소포, 또는 조직의 생존력을 유지하고 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 또는 조직이 임상 효과를 생성하는 능력을 유지하면서, 세포, 세포 입자, 지질 소포, 또는 조직으로의 관심 제제의 로딩 효율을 증가시킬 수 있기 때문에 독특하다. 특정 양태에서, 본원에 개시된 방법 및 장치는 각 라운드의 전기천공 동안 사용되는 전기천공 에너지를 변화시킴으로써 순차적인 전기천공 후 효율 및 생존력을 최적화할 수 있다.
[0011]
본 개시의 양태는 관심 제제를 트랜스펙션시키는 방법; 막을 통해 관심 제제의 수송을 가능하게 하기 위해 막을 일시적으로 투과시키는 방법; 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 또는 조직을 전기천공하는 방법; 전기천공된 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 또는 조직을 생산하는 방법; 및 전기천공된 물질의 임상 효과를 유지하면서 전기천공의 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 개시에서 논의된 단계 및 양태는 임의의 이러한 방법의 일부로서 고려된다. 일부 양태에서, 본원에서 고려되는 방법은 하기 단계 중 1, 2, 3, 4, 5개 이상을 포함하거나 제외할 수 있다: 하나 이상의 온전한 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 포함하는 샘플에 제1 프로토콜에 따른 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 샘플에 제2 프로토콜에 따른 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계; 샘플에 제1 전기 펄스와 제2 전기 펄스 사이에 시간 지연을 두는 단계; 샘플에 핵산, 폴리펩티드, 단백질 또는 소분자를 제공하는 단계; 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 전기천공하기에 충분한 조건으로 세포, 세포 입자 또는 지질 소포를 조건화하는 단계; 세포에서 전기천공된 핵산, 폴리펩티드, 단백질을 발현시키는 단계; 및 전기적 매개변수 및/또는 샘플에 적용되는 전기 펄스 사이의 시간 지연을 변형함으로써 샘플(들)로의 제제(들)의 로딩 효율, 전기천공된 샘플(들)의 임상 효과, 및/또는 샘플 생존력을 변형시키는 단계. 임의의 하나 이상의 이러한 단계는 개시된 방법으로부터 제외될 수 있다.
[0012]
본 개시의 양태는 다음을 포함하는 전기천공 방법을 포함한다:
[0013]
(1)
하나 이상의 온전한 세포, 세포 입자 또는 지질 소포를 포함하는 샘플에 제1 프로토콜에 따른 제1 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 및 샘플에 제2 프로토콜에 따른 제2 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계; 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 2 펄스 지속기간과 상이함;
[0014]
(2)
하나 이상의 온전한 세포, 세포 입자 또는 지질 소포를 포함하는 샘플에 제1 프로토콜에 따른 제1 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및 샘플에 제2 프로토콜에 따른 제2 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계;
[0015]
(3)
하나 이상의 온전한 세포, 세포 입자 또는 지질 소포를 포함하는 샘플에 제1 프로토콜에 따른 제1 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및 샘플에 제2 프로토콜에 따른 제2 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계; 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 2 펄스 지속기간과 상이함;
[0016]
(4) 하나 이상의 온전한 세포, 세포 입자 또는 지질 소포를 포함하는 샘플에 제1 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 및 샘플에 제2 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계; 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 2 펄스 지속기간과 상이함;
[0017]
(5) 하나 이상의 온전한 세포, 세포 입자 또는 지질 소포를 포함하는 샘플에 제1 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및 샘플에 제2 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계; 또는
[0018]
(6) 하나 이상의 온전한 세포, 세포 입자 또는 지질 소포를 포함하는 샘플에 제1 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및 샘플에 제2 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계; 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 2 펄스 지속기간과 상이함.
[0019]
본 개시의 양태는 다음을 포함하는 세포 유전자를 연속적으로 편집하는 방법을 포함한다:
[0020]
(1)
하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 샘플에 제1 프로토콜에 따른 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 및 샘플에 제2 프로토콜에 따른 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계; 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 2 펄스 지속기간과 상이함;
[0021]
(2)
하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 샘플에 제1 프로토콜에 따른 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및 샘플에 제2 프로토콜에 따른 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계;
[0022]
(3)
하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 샘플에 제1 프로토콜에 따른 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및 샘플에 제2 프로토콜에 따른 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계; 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 2 펄스 지속기간과 상이함;
[0023]
(4) 하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 샘플에 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 및 샘플에 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계; 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 2 펄스 지속기간과 상이함;
[0024]
(5) 하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 샘플에 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및 샘플에 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계; 또는
[0025]
(6) 하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 샘플에 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및 샘플에 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계; 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 2 펄스 지속기간과 상이함.
[0026]
본 개시의 추가 양태는 다음을 포함하는 전기천공 방법을 포함한다:
[0027]
(1)
하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 세포 샘플에 제1 프로토콜에 따른 RNA를 포함하는 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 세포 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및 세포 샘플에 제2 프로토콜에 따른 RNA를 포함하는 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계; 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 2 펄스 지속기간과 상이함;
[0028]
(2)
하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 세포 샘플에 제1 프로토콜에 따른 DNA를 포함하는 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 세포 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및 세포 샘플에 제2 프로토콜에 따른 DNA를 포함하는 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계; 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 2 펄스 지속기간과 상이함;
[0029]
(3)
하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 세포 샘플에 제1 프로토콜에 따른 하나 이상의 단백질을 포함하는 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 세포 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및 세포 샘플에 제2 프로토콜에 따른 하나 이상의 단백질을 포함하는 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계; 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 2 펄스 지속기간과 상이함;
[0030]
(4)
하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 세포 샘플에 제1 프로토콜에 따른 리보핵단백질을 포함하는 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 세포 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및 세포 샘플에 제2 프로토콜에 따른 리보핵단백질을 포함하는 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계; 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 2 펄스 지속기간과 상이함;
[0031]
(5)
하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 세포 샘플에 RNA를 포함하는 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 세포 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및 세포 샘플에 RNA를 포함하는 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계; 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 2 펄스 지속기간과 상이함;
[0032]
(6)
하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 세포 샘플에 DNA를 포함하는 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 세포 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및 세포 샘플에 DNA를 포함하는 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계; 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 2 펄스 지속기간과 상이함; 또는
[0033]
(7)
하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 세포 샘플에 하나 이상의 단백질을 포함하는 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 세포 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및 세포 샘플에 하나 이상의 단백질을 포함하는 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계; 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 2 펄스 지속기간과 상이함; 또는
[0034]
(8)
하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 세포 샘플에 리보핵단백질을 포함하는 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 세포 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및 세포 샘플에 리보핵단백질을 포함하는 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계; 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 2 펄스 지속기간과 상이함.
[0035]
일부 양태에서, 제1 및 제2 제제는 동일한 제제이다. 일부 양태에서, 제1 및 제2 제제는 상이한 제제이다. 일부 양태에서, 제1 및 제2 제제는 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자이다. 일부 양태에서, 핵산은 RNA이고, 여기서 RNA는 mRNA, miRNA, shRNA, siRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, 핵산은 DNA이고, 여기서 DNA는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 벡터, 또는 이중 센스 선형 DNA이다. 일부 양태에서, 단백질은 리보핵단백질이다. 일부 양태에서, 리보핵단백질은 Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 포함한다.
[0036]
일부 양태에서, 상기 방법은 제1 및/또는 제2 전기 펄스 후에 휴지 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 휴지 단계는 10-30분 동안 샘플의 인큐베이션을 포함한다. 일부 양태에서, 휴지 단계는 25-50℃에서 샘플의 인큐베이션을 포함한다. 일부 양태에서, 휴지 단계는 3-8% CO2에서 샘플의 인큐베이션을 포함한다. 일부 양태에서, 샘플은 제1 및/또는 제2 전기 펄스 후에 휴지 단계를 거치지 않는다.
[0037]
일부 양태에서, 제1 전계 강도는 제2 전계 강도와 동일하고, 제1 펄스 지속기간은 제2 펄스 지속기간보다 길다. 일부 양태에서, 제1 전계 강도는 제2 전계 강도와 동일하고, 제1 펄스 지속기간은 제2 펄스 지속기간보다 짧다. 일부 양태에서, 제1 전계 강도는 제2 전계 강도와 동일하고, 제1 펄스 지속기간은 제2 펄스 지속기간과 동일하다. 일부 양태에서, 제1 전계 강도는 제2 전계 강도 미만이고, 제1 펄스 지속기간은 제2 펄스 지속기간과 동일하다. 일부 양태에서, 제1 전계 강도는 제2 전계 강도보다 크고, 제1 펄스 지속기간은 제2 펄스 지속기간과 동일하다. 일부 양태에서, 제1 전계 강도는 제2 전계 강도 미만이고, 제1 펄스 지속기간은 제2 펄스 지속기간보다 길다. 일부 양태에서, 제1 전계 강도는 제2 전계 강도보다 크고, 제1 펄스 지속기간은 제2 펄스 지속기간보다 길다. 일부 양태에서, 제1 전계 강도는 제2 전계 강도 미만이고, 제1 펄스 지속기간은 제2 펄스 지속기간보다 짧다. 일부 양태에서, 제1 전계 강도는 제2 전계 강도보다 크고, 제1 펄스 지속기간은 제2 펄스 지속기간보다 짧다.
[0038]
일부 양태에서, 제1 전기 펄스의 전계 강도 및 제1 전기 펄스의 펄스 지속기간은 제1 총 인가된 전기 에너지를 생성하고, 제2 전기 펄스의 전계 강도 및 제2 전기 펄스의 펄스 지속기간은 제2 총 인가된 전기 에너지를 생성하며, 제1 총 인가된 전기 에너지는 제2 총 인가된 전기 에너지보다 크다. 일부 양태에서, 제1 총 인가된 전기 에너지는 제2 총 인가된 전기 에너지 미만이다.
[0039]
일부 양태에서, 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도는 전기 펄스의 전압 크기, 전기 펄스의 지속기간, 및 샘플의 전도도의 함수이다. 전기 펄스의 전압 크기는 0.001 볼트 내지 10,000 볼트, 0.01 볼트 내지 10,000 볼트, 0.1 볼트 내지 10,000 볼트, 1 볼트 내지 10,000 볼트, 1 볼트 내지 9,000 볼트, 1 볼트 내지 8,000 볼트, 1 볼트 내지 7,000 볼트, 1 볼트 내지 6,000 볼트, 1 볼트 내지 5,000 볼트, 1 볼트 내지 4,000 볼트, 1 볼트 내지 3,000 볼트, 1 볼트 내지 2,000 볼트, 또는 1 볼트 내지 1,000 볼트일 수 있다. 일부 양태에서, 전기 펄스의 전압 크기는 100 볼트 내지 900 볼트이다. 일부 양태에서, 샘플의 전도도는 전기천공 완충제의 이온 조성, 세포에 로딩되는 제제의 농도, 세포 밀도, 온도, 및 압력을 포함하는 매개변수의 함수이다. 샘플의 전도도는 0.01 지멘스/미터 내지 10 지멘스/미터, 0.01 지멘스/미터 내지 1 지멘스/미터, 0.1 지멘스/미터 내지 10 지멘스/미터, 0.1 지멘스/미터 내지 1 지멘스/미터, 또는 1 지멘스/미터 내지 10 지멘스/미터일 수 있다. 일부 양태에서, 샘플의 전도도는 1.0 내지 3.0 지멘스/미터이다. 일부 양태에서, 제1 및 제2 전계 강도는 추가로 전기천공 챔버의 기하학적 구조의 함수이다. 전기천공 챔버는 0.001 cm 내지 10 cm, 0.001 cm 내지 1 cm, 0.01 cm 내지 10 cm, 0.01 cm 내지 1 cm, 0.1 cm 내지 10 cm, 0.1 cm 내지 1 cm, 또는 1 cm 내지 10 cm의 전극 갭을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 전기천공 챔버는 0.01 cm 내지 1 cm의 전극 갭을 포함한다.
[0040]
제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도는 0.01 kV/cm 내지 10 kV/cm, 0.01 kV/cm 내지 1 kV/cm, 0.1 kV/cm 내지 10 kV/cm, 0.1 kV/cm 내지 1 kV/cm, 또는 1 kV/cm 내지 10 kV/cm일 수 있다. 일부 양태에서, 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도는 0.3 kV/cm 내지 3 kV/cm이다.
[0041]
제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 펄스 지속기간은 10-6초 내지 10초, 10-6초 내지 1초, 10-3초 내지 10초, 또는 10-3초 내지 1초일 수 있다. 일부 양태에서, 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 펄스 지속기간은 1 마이크로초 내지 100 밀리초이다.
[0042]
일부 양태에서, 제1 및 제2 전기 펄스는 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성과 관련된 특성을 추가로 포함한다. 펄스 수는 1 펄스 내지 1000 펄스, 1 펄스 내지 900 펄스, 1 펄스 내지 800 펄스, 1 펄스 내지 700 펄스, 1 펄스 내지 600 펄스, 1 펄스 내지 500 펄스, 1 펄스 내지 400 펄스, 1 펄스 내지 300 펄스, 1 펄스 내지 200 펄스, 1 펄스 내지 100 펄스, 1 펄스 내지 90 펄스, 1 펄스 내지 80 펄스, 1 펄스 내지 70 펄스, 1 펄스 내지 60 펄스, 1 펄스 내지 50 펄스, 1 펄스 내지 40 펄스, 1 펄스 내지 30 펄스, 1 펄스 내지 20 펄스, 또는 1 펄스 내지 10 펄스일 수 있다. 일부 양태에서, 펄스 수는 1 펄스 내지 130 펄스이다.
[0043]
일부 양태에서, 펄스 폭은 지수 감쇠율의 함수이다. 일부 양태에서, 지수 감쇠율은 샘플의 저항 및 전기천공을 수행하는데 사용되는 파워 서플라이의 커패시턴스의 함수이다. 샘플의 저항은 1 옴 내지 10000 옴, 1 옴 내지 9000 옴, 1 옴 내지 8000 옴, 1 옴 내지 7000 옴, 1 옴 내지 6000 옴, 1 옴 내지 5000 옴, 1 옴 내지 4000 옴, 1 옴 내지 3000 옴, 1 옴 내지 2000 옴, 1 옴 내지 1000 옴, 1 옴 내지 900 옴, 1 옴 내지 800 옴, 1 옴 내지 700 옴, 1 옴 내지 600 옴, 1 옴 내지 500 옴, 1 옴 내지 400 옴, 1 옴 내지 300 옴, 1 옴 내지 200 옴, 1 옴 내지 100 옴, 1 옴 내지 90 옴, 1 옴 내지 80 옴, 1 옴 내지 70 옴, 1 옴 내지 60 옴, 1 옴 내지 50 옴, 1 옴 내지 40 옴, 1 옴 내지 30 옴, 1 옴 내지 20 옴, 또는 1 옴 내지 10 옴일 수 있다. 일부 양태에서, 샘플의 저항은 1 옴 내지 1000 옴이다. 파워 서플라이 커패시턴스는 1 μF 내지 1,000,000 μF, 1 μF 내지 100,000 μF, 1 μF 내지 10,000 μF, 1 μF 내지 1,000 μF, 또는 1 μF 내지 100 μF일 수 있다. 일부 양태에서, 파워 서플라이 커패시턴스는 1000 μF 내지 5000 μF이다.
[0044]
일부 양태에서, 펄스 형상은 구형파 펄스 또는 지수 감쇠파 펄스이다. 일부 양태에서, 펄스 패턴은 제1 또는 제2 펄스의 지속기간에 상응하는 단일 펄스를 포함한다. 일부 양태에서, 펄스 패턴은 다수의 펄스를 포함하고, 여기서 다수의 펄스의 조합된 지속기간은 제1 또는 제2 펄스의 지속기간에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 및 제2 전기 펄스의 극성은 포지티브 또는 네거티브이다.
[0045]
일부 양태에서, 샘플에 제1 펄스를 가한지 적어도 12시간 내지 적어도 48시간 후에 샘플에 제2 전기 펄스를 가한다. 일부 양태에서, 샘플에 제1 펄스를 가한지 적어도 24시간 후에 샘플에 제2 전기 펄스를 가한다.
[0046]
상기 방법은 프로세서에 의해 실행될 때, 프로세서로 하여금 샘플을 전기천공하도록 제1 및 제2 프로토콜을 실행하게 하는 명령을 포함하는 비일시적 컴퓨터 판독 가능 매체를 갖는 전기천공 시스템에 의해 수행될 수 있다. 일부 양태에서, 전기천공 시스템은 유동 전기천공 장치를 포함하고, 샘플이 유동 전기천공 장치 내에서 흐르는 동안 샘플에 전기 펄스가 가해진다.
[0047]
일부 양태에서, 세포는 포유동물 세포일 수 있고, 일부 양태에서, 세포는 인간 세포, 뮤린 세포, 래트 세포, 햄스터 세포, 또는 영장류 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 일차 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 배양된 세포이고, 배양된 세포는 3T3, 697, 10T½, 1321N1, A549, AHR77, B-LCL, B16, B65, Ba/F3, BHK, C2C12, C6, CaCo-2, CAP, CaSki, ChaGo-K-1, CHO, COS, DG75, DLD-1, EL4, H1299, HaCaT, HAP1, HCT116, HEK, HeLa, HepG2, HL60, HOS, HT1080, HT29, Huh-7, HUVEC, INS-1/GRINCH, Jurkat, K46, K562, KG1, KHYG-1, L5278Y, L6, LNCaP, LS180, MCF7, MDA-MB-231, ME-180, MG-63, Min-6, MOLT4, Nalm6, ND7/23, Neuro2a, NK92, NS/0, P3U1, Panc-1, PC-3, PC12, PER.C6, PM1, Ramos, RAW 264.7, RBL, Renca, RLE, SH-SY5Y, SK-BR-3, SK-MES-1, SK-N-SH, SK-OV-3, SP2/0, SW403, THP-1, U2OS, U937, Vero, YB2/0, 또는 이들의 유도체를 포함할 수 있는 배양된 세포주일 수 있다. 세포는 지방세포, 연골세포, 내피 세포, 상피 세포, 섬유모세포, 간세포, 각질세포, 근육세포, 뉴런, 골세포, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 비장세포, 줄기 세포, 또는 흉선세포를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, PBMC는 자연 살해(NK) 세포, T 세포, 또는 B 세포일 수 있는 말초 혈액 림프구(PBL)이다. 일부 양태에서, PBMC는 대식세포 또는 수지상 세포일 수 있는 단핵구이고, 대식세포는 미세아교세포일 수 있다. 일부 양태에서, 줄기 세포는 지방 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 신경 줄기 세포이다.
[0048]
일부 양태에서, 제제의 로딩 효율은 적어도 50, 60, 70, 80, 또는 90%이다.
[0049]
일부 양태에서, 세포 생존율은 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 적어도 50%; 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 적어도 60%; 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 적어도 70%; 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 적어도 80%; 또는 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 적어도 90%일 수 있다.
[0050]
일부 양태에서, 전기천공된 세포는 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 대략 50% 내지 90% 생존하거나; 제2 전기 펄스 12 내지 72시간 후 대략 50% 내지 90% 생존하거나; 제2 전기 펄스 12 내지 48시간 후 대략 50% 내지 90% 생존하거나; 제2 전기 펄스 24시간 후 대략 50% 내지 90% 생존하거나; 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 대략 60% 내지 90% 생존하거나; 제2 전기 펄스 12 내지 72시간 후 대략 60% 내지 90% 생존하거나; 제2 전기 펄스 12 내지 48시간 후 대략 60% 내지 90% 생존하거나; 제2 전기 펄스 24시간 후 대략 60% 내지 90% 생존할 수 있다.
[0051]
본 개시의 양태는 또한 프로세서에 의해 실행될 때, 프로세서로 하여금 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스와 관련된 제1 프로토콜을 선택하고; 하나 이상의 온전한 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 포함하는 샘플에 제1 프로토콜에 따른 제1 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제1 프로토콜에 의해 정의된 제1 전기 펄스를 가하고; 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스와 관련된 제2 프로토콜을 선택하고; 샘플에 제2 프로토콜에 따른 제2 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제2 프로토콜에 의해 정의된 제2 전기 펄스를 가하게 하는 명령을 포함하는 비일시적 컴퓨터 판독 가능 매체를 갖는 전기천공 시스템에 관한 것이고, 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 제2 펄스 지속기간과 상이하다.
[0052]
본 개시의 양태는 또한 본원에 기재된 임의의 방법을 사용하여 생산되거나 프로세서에 의해 실행될 때 프로세서가 본원에 기재된 임의의 방법을 실행하게 하는 명령을 포함하는 비일시적 컴퓨터 판독 가능 매체를 갖는 임의의 전기천공 시스템을 사용하여 생산된 전기천공된 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 포함한다.
[0053]
본 개시의 추가 양태는 기재된 임의의 방법의 생성물을 질병 또는 질환을 완화시키는 양으로 투여하는 것을 포함하는 질병 또는 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법을 포함한다. 특정 양태에서, 방법의 생성물은 약물 전달 비히클이고, 매우 다양한 공지된 약물이 기재된 방법에 의해 생산된 로딩된 입자를 통해 전달될 수 있는 것으로 고려된다. 질병 또는 질환은 전기천공 방법을 사용하여 제조(예를 들어, 로딩)되는 리포솜 입자, 세포 입자, 또는 유사한 전달 비히클을 통해 약물 또는 제제의 전달이 가능한 임의의 질병 또는 질환을 포함할 수 있다.
[0054]
본 개시의 또 다른 양태는 기재된 방법에 의해 생산된 입자에 포함된 유효량의 약물, 생물학제 또는 다른 생물활성 분자를 투여함으로써 질환 또는 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법을 포함한다. 특정 양태에서, 질환은 박테리아, 진균, 기생충, 또는 바이러스 감염을 포함하나 이에 제한되지 않는 감염성 질환이다. 추가의 양태에서, 박테리아 감염은 마이코박테리아 감염이다. 또한 추가의 양태에서, 바이러스 감염은 HIV 감염을 포함하나 이에 제한되지 않는 레트로바이러스 감염이다. 또 다른 양태에서, 질환은 염증성 질환 또는 암 또는 혈관 폐쇄성 질환이다.
[0055]
본 개시의 양태는 기재된 임의의 방법을 수행하도록 구성된 전기천공 시스템을 포함한다.
[0056]
또한, 본 개시의 하기 양태 1 내지 201이 개시된다.
[0057]
양태 1은 하나 이상의 온전한 세포, 세포 입자 또는 지질 소포를 포함하는 샘플에 제1 프로토콜에 따른 제1 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 및 샘플에 제2 프로토콜에 따른 제2 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계를 포함하는 전기천공 방법이고; 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 2 펄스 지속기간과 상이하다.
[0058]
양태 2는 하나 이상의 온전한 세포, 세포 입자 또는 지질 소포를 포함하는 샘플에 제1 프로토콜에 따른 제1 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및 샘플에 제2 프로토콜에 따른 제2 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계를 포함하는 전기천공 방법이다.
[0059]
양태 3은 하나 이상의 온전한 세포, 세포 입자 또는 지질 소포를 포함하는 샘플에 제1 프로토콜에 따른 제1 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및 샘플에 제2 프로토콜에 따른 제2 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계를 포함하는 전기천공 방법이고; 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 2 펄스 지속기간과 상이하다.
[0060]
양태 4는 하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 샘플에 제1 프로토콜에 따른 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 및 샘플에 제2 프로토콜에 따른 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계를 포함하는 세포 유전자를 연속적으로 편집하는 방법이고; 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 2 펄스 지속기간과 상이하다.
[0061]
양태 5는 하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 샘플에 제1 프로토콜에 따른 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및 샘플에 제2 프로토콜에 따른 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계를 포함하는 세포 유전자를 연속적으로 편집하는 방법이다.
[0062]
양태 6은 하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 샘플에 제1 프로토콜에 따른 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및 샘플에 제2 프로토콜에 따른 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계를 포함하는 세포 유전자를 연속적으로 편집하는 방법이고; 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 2 펄스 지속기간과 상이하다.
[0063]
양태 7은 제1 및 제2 제제가 동일한 제제인 양태 1 내지 6의 방법이다. 양태 8은 제1 및 제2 제제가 상이한 제제인 양태 1 내지 7의 방법이다. 양태 9는 제1 및 제2 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자인 양태 1 내지 8의 방법이다. 양태 10은 제1 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자이고, 제2 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자인 양태 1 내지 9의 방법이다. 양태 11은 제1 제제가 핵산이고, 제2 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자인 양태 1 내지 10의 방법이다. 양태 12는 제1 제제가 폴리펩티드이고, 제2 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자인 양태 1 내지 10의 방법이다. 양태 13은 제1 제제가 단백질이고, 제2 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자인 양태 1 내지 10의 방법이다. 양태 14는 제1 제제가 소분자이고, 제2 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자인 양태 1 내지 10의 방법이다. 양태 15는 제1 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자이고, 제2 제제가 핵산인 양태 1 내지 14의 방법이다. 양태 16은 제1 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자이고, 제2 제제가 폴리펩티드인 양태 1 내지 14의 방법이다. 양태 17은 제1 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자이고, 제2 제제가 단백질인 양태 1 내지 14의 방법이다. 양태 18은 제1 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자이고, 제2 제제가 소분자인 양태 1 내지 14의 방법이다. 양태 19는 핵산이 RNA이고, RNA가 mRNA, miRNA, shRNA, siRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 양태 1 내지 18의 방법이다. 양태 20은 핵산이 DNA이고, DNA가 안티센스 올리고뉴클레오티드, 벡터, 또는 이중 센스 선형 DNA인 양태 1 내지 19의 방법이다. 양태 21은 단백질이 리보핵단백질인 양태 1 내지 20의 방법이다. 양태 22는 리보핵단백질이 Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 포함하는 양태 1 내지 21의 방법이다.
[0064]
양태 23은 (a) 하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 세포 샘플에 제1 프로토콜에 따른 RNA를 포함하는 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; (b) 세포 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및 (c) 세포 샘플에 제2 프로토콜에 따른 RNA를 포함하는 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계를 포함하는 전기천공 방법이고; 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 2 펄스 지속기간과 상이하다.
[0065]
양태 24는 (a) 하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 세포 샘플에 제1 프로토콜에 따른 DNA를 포함하는 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; (b) 세포 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및 (c) 세포 샘플에 제2 프로토콜에 따른 DNA를 포함하는 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계를 포함하는 전기천공 방법이고; 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 2 펄스 지속기간과 상이하다.
[0066]
양태 25는 (a) 하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 세포 샘플에 제1 프로토콜에 따른 하나 이상의 단백질을 포함하는 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; (b) 세포 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및 (c) 세포 샘플에 제2 프로토콜에 따른 하나 이상의 단백질을 포함하는 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계를 포함하는 전기천공 방법이고; 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 2 펄스 지속기간과 상이하다.
[0067]
양태 26은 (a) 하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 세포 샘플에 제1 프로토콜에 따른 리보핵단백질을 포함하는 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; (b) 세포 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및 (c) 세포 샘플에 제2 프로토콜에 따른 리보핵단백질을 포함하는 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계를 포함하는 세포를 연속적으로 편집하는 방법이고; 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 2 펄스 지속기간과 상이하다.
[0068]
양태 27은 제1 및 제2 제제가 동일한 제제인 양태 23 내지 26의 방법이다. 양태 28은 제1 및 제2 제제가 상이한 제제인 양태 23 내지 26의 방법이다. 양태 29는 제1 및 제2 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자인 양태 23 내지 28의 방법이다. 양태 30은 제1 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자이고, 제2 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자인 양태 23 내지 29의 방법이다. 양태 31은 제1 제제가 핵산이고, 제2 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자인 양태 23 내지 30의 방법이다. 양태 32는 제1 제제가 폴리펩티드이고, 제2 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자인 양태 23 내지 30의 방법이다. 양태 33은 제1 제제가 단백질이고, 제2 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자인 양태 23 내지 30의 방법이다. 양태 34는 제1 제제가 소분자이고, 제2 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자인 양태 23 내지 30의 방법이다. 양태 35는 제1 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자이고, 제2 제제가 핵산인 양태 23 내지 34의 방법이다. 양태 36은 제1 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자이고, 제2 제제가 폴리펩티드인 양태 23 내지 34의 방법이다. 양태 37은 제1 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자이고, 제2 제제가 단백질인 양태 23 내지 34의 방법이다. 양태 38은 제1 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자이고, 제2 제제가 소분자인 양태 23 내지 34의 방법이다. 양태 39는 핵산이 RNA이고, RNA가 mRNA, miRNA, shRNA, siRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 양태 23 내지 38의 방법이다. 양태 40은 핵산이 DNA이고, DNA가 안티센스 올리고뉴클레오티드, 벡터, 또는 이중 센스 선형 DNA인 양태 23 내지 39의 방법이다. 양태 41은 단백질이 리보핵단백질인 양태 23 내지 40의 방법이다. 양태 42는 리보핵단백질이 Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 포함하는 양태 23 내지 41의 방법이다.
[0069]
양태 43은 제1 및/또는 제2 전기 펄스 후에 휴지 단계를 추가로 포함하는 양태 1 내지 42의 방법이다. 양태 44는 제1 및/또는 제2 전기 펄스 후에 휴지 단계를 추가로 포함하고, 휴지 단계가 10-30분 동안 샘플의 인큐베이션을 포함하는 양태 1 내지 43의 방법이다. 양태 45는 제1 및/또는 제2 전기 펄스 후에 휴지 단계를 추가로 포함하고, 휴지 단계가 25-50℃에서 샘플의 인큐베이션을 포함하는 양태 1 내지 44의 방법이다. 양태 46은 제1 및/또는 제2 전기 펄스 후에 휴지 단계를 추가로 포함하고, 휴지 단계가 3-8% CO2에서 샘플의 인큐베이션을 포함하는 양태 1 내지 45의 방법이다. 양태 47은 샘플이 제1 및/또는 제2 전기 펄스 후에 휴지 단계를 거치지 않는 양태 1 내지 46의 방법이다. 양태 48은 제1 전계 강도가 제2 전계 강도와 동일하고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간보다 긴 양태 1 내지 47의 방법이다. 양태 49는 제1 전계 강도가 제2 전계 강도와 동일하고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간보다 짧은 양태 1 내지 47의 방법이다. 양태 50은 제1 전계 강도가 제2 전계 강도 미만이고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간과 동일한 양태 1 내지 47의 방법이다. 양태 51은 제1 전계 강도가 제2 전계 강도보다 크고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간과 동일한 양태 1 내지 47의 방법이다. 양태 52는 제1 전계 강도가 제2 전계 강도 미만이고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간보다 긴 양태 1 내지 47의 방법이다. 양태 53은 제1 전계 강도가 제2 전계 강도보다 크고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간보다 긴 양태 1 내지 47의 방법이다. 양태 54는 제1 전계 강도가 제2 전계 강도 미만이고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간보다 짧은 양태 1 내지 47의 방법이다. 양태 55는 제1 전계 강도가 제2 전계 강도보다 크고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간보다 짧은 양태 1 내지 47의 방법이다. 양태 56은 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간이 제1 총 인가된 전기 에너지를 생성하고, 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간이 제2 총 인가된 전기 에너지를 생성하며, 제1 총 인가된 전기 에너지가 제2 총 인가된 전기 에너지와 상이한 양태 1 내지 55의 방법이다. 양태 57은 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간이 제1 총 인가된 전기 에너지를 생성하고, 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간이 제2 총 인가된 전기 에너지를 생성하며, 제1 총 인가된 전기 에너지가 제2 총 인가된 전기 에너지와 상이하고, 제1 총 인가된 전기 에너지가 제2 총 인가된 전기 에너지보다 큰 양태 1 내지 56의 방법이다. 양태 58은 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 전기 펄스의 전압 크기, 전기 펄스의 지속기간, 및 샘플의 전도도의 함수인 양태 1 내지 57의 방법이다. 양태 59는 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 전기 펄스의 전압 크기, 전기 펄스의 지속기간, 및 샘플의 전도도의 함수이고, 전기 펄스의 전압 크기가 0.001 볼트 내지 10,000 볼트, 0.01 볼트 내지 10,000 볼트, 0.1 볼트 내지 10,000 볼트, 1 볼트 내지 10,000 볼트, 1 볼트 내지 9,000 볼트, 1 볼트 내지 8,000 볼트, 1 볼트 내지 7,000 볼트, 1 볼트 내지 6,000 볼트, 1 볼트 내지 5,000 볼트, 1 볼트 내지 4,000 볼트, 1 볼트 내지 3,000 볼트, 1 볼트 내지 2,000 볼트, 또는 1 볼트 내지 1,000 볼트인 양태 1 내지 58의 방법이다. 양태 60은 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 전기 펄스의 전압 크기, 전기 펄스의 지속기간, 및 샘플의 전도도의 함수이고, 전기 펄스의 전압 크기가 100 볼트 내지 900 볼트인 양태 1 내지 59의 방법이다. 양태 61은 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 전기 펄스의 전압 크기, 전기 펄스의 지속기간, 및 샘플의 전도도의 함수이고, 샘플의 전도도가 전기천공 완충제의 이온 조성, 세포에 로딩되는 제제의 농도, 세포 밀도, 온도, 및 압력을 포함하는 매개변수의 함수인 양태 1 내지 60의 방법이다. 양태 62는 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 전기 펄스의 전압 크기, 전기 펄스의 지속기간, 및 샘플의 전도도의 함수이고, 샘플의 전도도가 0.01 지멘스/미터 내지 10 지멘스/미터, 0.01 지멘스/미터 내지 1 지멘스/미터, 0.1 지멘스/미터 내지 10 지멘스/미터, 0.1 지멘스/미터 내지 1 지멘스/미터, 또는 1 지멘스/미터 내지 10 지멘스/미터인 양태 1 내지 61의 방법이다. 양태 63은 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 전기 펄스의 전압 크기, 전기 펄스의 지속기간, 및 샘플의 전도도의 함수이고, 샘플의 전도도가 1.0 내지 3.0 지멘스/미터인 양태 1 내지 62의 방법이다. 양태 64는 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 전기 펄스의 전압 크기, 전기 펄스의 지속기간, 및 샘플의 전도도의 함수이고, 제1 및 제2 전계 강도가 추가로 전기천공 챔버의 기하학적 구조의 함수인 양태 1 내지 63의 방법이다. 양태 65는 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 전기 펄스의 전압 크기, 전기 펄스의 지속기간, 및 샘플의 전도도의 함수이고, 제1 및 제2 전계 강도가 추가로 전기천공 챔버의 기하학적 구조의 함수이며, 전기천공 챔버가 0.001 cm 내지 10 cm, 0.001 cm 내지 1 cm, 0.01 cm 내지 10 cm, 0.01 cm 내지 1 cm, 0.1 cm 내지 10 cm, 0.1 cm 내지 1 cm, 또는 1 cm 내지 10 cm의 전극 갭을 포함하는 양태 1 내지 64의 방법이다. 양태 66은 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 전기 펄스의 전압 크기, 전기 펄스의 지속기간, 및 샘플의 전도도의 함수이고, 제1 및 제2 전계 강도가 추가로 전기천공 챔버의 기하학적 구조의 함수이며, 전기천공 챔버가 0.01 cm 내지 1 cm의 전극 갭을 포함하는 양태 1 내지 65의 방법이다. 양태 67은 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 0.01 kV/cm 내지 10 kV/cm, 0.01 kV/cm 내지 1 kV/cm, 0.1 kV/cm 내지 10 kV/cm, 0.1 kV/cm 내지 1 kV/cm, 또는 1 kV/cm 내지 10 kV/cm인 양태 1 내지 66의 방법이다. 양태 68은 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 0.3 kV/cm 내지 3 kV/cm인 양태 1 내지 67의 방법이다. 양태 69는 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 펄스 지속기간이 10-6초 내지 10초, 10-6초 내지 1초, 10-3초 내지 10초, 또는 10-3초 내지 1초인 양태 1 내지 68의 방법이다. 양태 70은 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 펄스 지속기간이 1 마이크로초 내지 100 밀리초인 양태 1 내지 69의 방법이다. 양태 71은 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성에 관한 특성을 추가로 포함하는 양태 1 내지 70의 방법이다. 양태 72는 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성에 관한 특성을 추가로 포함하고, 펄스 수가 1 펄스 내지 1000 펄스, 1 펄스 내지 900 펄스, 1 펄스 내지 800 펄스, 1 펄스 내지 700 펄스, 1 펄스 내지 600 펄스, 1 펄스 내지 500 펄스, 1 펄스 내지 400 펄스, 1 펄스 내지 300 펄스, 1 펄스 내지 200 펄스, 1 펄스 내지 100 펄스, 1 펄스 내지 90 펄스, 1 펄스 내지 80 펄스, 1 펄스 내지 70 펄스, 1 펄스 내지 60 펄스, 1 펄스 내지 50 펄스, 1 펄스 내지 40 펄스, 1 펄스 내지 30 펄스, 1 펄스 내지 20 펄스, 또는 1 펄스 내지 10 펄스인 양태 1 내지 71의 방법이다. 양태 73은 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성에 관한 특성을 추가로 포함하고, 펄스 수가 1 펄스 내지 130 펄스인 양태 1 내지 72의 방법이다. 양태 74는 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성에 관한 특성을 추가로 포함하고, 펄스 폭이 지수 감쇠율의 함수인 양태 1 내지 73의 방법이다. 양태 75는 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성에 관한 특성을 추가로 포함하고, 펄스 폭이 지수 감쇠율의 함수이며, 지수 감쇠율이 샘플의 저항 및 전기천공을 수행하는데 사용되는 파워 서플라이의 커패시턴스의 함수인 양태 1 내지 74의 방법이다. 양태 76은 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성에 관한 특성을 추가로 포함하고, 펄스 폭이 지수 감쇠율의 함수이며, 지수 감쇠율이 샘플의 저항 및 전기천공을 수행하는데 사용되는 파워 서플라이의 커패시턴스의 함수이며, 샘플의 저항이 1 옴 내지 10000 옴, 1 옴 내지 9000 옴, 1 옴 내지 8000 옴, 1 옴 내지 7000 옴, 1 옴 내지 6000 옴, 1 옴 내지 5000 옴, 1 옴 내지 4000 옴, 1 옴 내지 3000 옴, 1 옴 내지 2000 옴, 1 옴 내지 1000 옴, 1 옴 내지 900 옴, 1 옴 내지 800 옴, 1 옴 내지 700 옴, 1 옴 내지 600 옴, 1 옴 내지 500 옴, 1 옴 내지 400 옴, 1 옴 내지 300 옴, 1 옴 내지 200 옴, 1 옴 내지 100 옴, 1 옴 내지 90 옴, 1 옴 내지 80 옴, 1 옴 내지 70 옴, 1 옴 내지 60 옴, 1 옴 내지 50 옴, 1 옴 내지 40 옴, 1 옴 내지 30 옴, 1 옴 내지 20 옴, 또는 1 옴 내지 10 옴인 양태 1 내지 75의 방법이다. 양태 77은 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성에 관한 특성을 추가로 포함하고, 펄스 폭이 지수 감쇠율의 함수이며, 지수 감쇠율이 샘플의 저항 및 전기천공을 수행하는데 사용되는 파워 서플라이의 커패시턴스의 함수이며, 샘플의 저항이 1 옴 내지 1000옴인 양태 1 내지 76의 방법이다. 양태 78은 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성에 관한 특성을 추가로 포함하고, 펄스 폭이 지수 감쇠율의 함수이며, 지수 감쇠율이 샘플의 저항 및 전기천공을 수행하는데 사용되는 파워 서플라이의 커패시턴스의 함수이며, 파워 서플라이 커패시턴스가 1 μF 내지 1,000,000 μF, 1 μF 내지 100,000 μF, 1 μF 내지 10,000 μF, 1 μF 내지 1,000 μF, 또는 1 μF 내지 100 μF인 양태 1 내지 77의 방법이다. 양태 79는 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성에 관한 특성을 추가로 포함하고, 펄스 폭이 지수 감쇠율의 함수이며, 지수 감쇠율이 샘플의 저항 및 전기천공을 수행하는데 사용되는 파워 서플라이의 커패시턴스의 함수이며, 파워 서플라이 커패시턴스가 1000 μF 내지 5000 μF인 양태 1 내지 78의 방법이다. 양태 80은 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성에 관한 특성을 추가로 포함하고, 펄스 형상이 구형파 펄스 또는 지수 감쇠파 펄스인 양태 1 내지 79의 방법이다. 양태 81은 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성에 관한 특성을 추가로 포함하고, 펄스 패턴이 제1 또는 제2 펄스의 지속기간에 상응하는 단일 펄스를 포함하는 양태 1 내지 80의 방법이다. 양태 82는 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성에 관한 특성을 추가로 포함하고, 펄스 패턴이 다수의 펄스를 포함하며, 여기서 다수의 펄스의 조합된 지속기간이 제1 또는 제2 펄스의 지속기간에 상응하는 양태 1 내지 81의 방법이다. 양태 83은 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성에 관한 특성을 추가로 포함하고, 제1 및 제2 전기 펄스의 극성이 포지티브 또는 네거티브인 양태 1 내지 82의 방법이다. 양태 84는 샘플에 제1 펄스를 가한지 적어도 12시간 내지 적어도 48시간 후에 샘플에 제2 전기 펄스를 가하는 양태 1 내지 83의 방법이다. 양태 85는 샘플에 제1 펄스를 가한지 적어도 24시간 후에 샘플에 제2 전기 펄스를 가하는 양태 1 내지 84의 방법이다. 양태 86은 상기 방법이 프로세서에 의해 실행될 때, 프로세서로 하여금 샘플을 전기천공하도록 제1 및 제2 프로토콜을 실행하게 하는 명령을 포함하는 비일시적 컴퓨터 판독 가능 매체를 갖는 전기천공 시스템에 의해 수행되는 양태 1 내지 85의 방법이다. 양태 87은 전기천공 시스템이 유동 전기천공 장치를 포함하는 양태 1 내지 86의 방법이다. 양태 88은 전기천공 시스템이 유동 전기천공 장치를 포함하고, 샘플이 유동 전기천공 장치 내에서 흐르는 동안 샘플에 전기 펄스가 가해지는 양태 1 내지 87의 방법이다. 양태 89는 세포가 포유동물 세포인 양태 1 내지 88의 방법이다. 양태 90은 세포가 인간 세포, 뮤린 세포, 래트 세포, 햄스터 세포, 또는 영장류 세포인 양태 1 내지 89의 방법이다. 양태 91은 세포가 일차 세포인 양태 1 내지 90의 방법이다. 양태 92는 세포가 배양된 세포인 양태 1 내지 91의 방법이다. 양태 93은 세포가 배양된 세포이고, 배양된 세포가 배양된 세포주인 양태 1 내지 92의 방법이다. 양태 94는 세포가 배양된 세포주이고, 배양된 세포주가 3T3, 697, 10T½, 1321N1, A549, AHR77, B-LCL, B16, B65, Ba/F3, BHK, C2C12, C6, CaCo-2, CAP, CaSki, ChaGo-K-1, CHO, COS, DG75, DLD-1, EL4, H1299, HaCaT, HAP1, HCT116, HEK, HeLa, HepG2, HL60, HOS, HT1080, HT29, Huh-7, HUVEC, INS-1/GRINCH, Jurkat, K46, K562, KG1, KHYG-1, L5278Y, L6, LNCaP, LS180, MCF7, MDA-MB-231, ME-180, MG-63, Min-6, MOLT4, Nalm6, ND7/23, Neuro2a, NK92, NS/0, P3U1, Panc-1, PC-3, PC12, PER.C6, PM1, Ramos, RAW 264.7, RBL, Renca, RLE, SH-SY5Y, SK-BR-3, SK-MES-1, SK-N-SH, SK-OV-3, SP2/0, SW403, THP-1, U2OS, U937, Vero, YB2/0, 또는 이들의 유도체를 포함하는 양태 1 내지 93의 방법이다. 양태 95는 세포가 지방세포, 연골세포, 내피 세포, 상피 세포, 섬유모세포, 간세포, 각질세포, 근육세포, 뉴런, 골세포, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 비장세포, 줄기 세포, 또는 흉선세포를 포함하는 양태 1 내지 94의 방법이다. 양태 96은 세포가 PBMC를 포함하고, PBMC가 말초 혈액 림프구(PBL)인 양태 1 내지 95의 방법이다. 양태 97은 세포가 PBMC를 포함하고, PBMC가 PBL을 포함하고, PBL이 자연 살해(NK) 세포, T 세포, 또는 B 세포인 양태 1 내지 95의 방법이다. 양태 98은 세포가 PBMC를 포함하고, PBMC가 단핵구인 양태 1 내지 95의 방법이다. 양태 99는 세포가 PBMC를 포함하고, PBMC가 단핵구이고, 단핵구가 대식세포 또는 수지상 세포인 양태 1 내지 95의 방법이다. 양태 100은 세포가 PBMC를 포함하고, PBMC가 단핵구이고, 단핵구가 대식세포 또는 수지상 세포이고, 대식세포가 미세아교세포인 양태 1 내지 95의 방법이다. 양태 101은 세포가 줄기 세포를 포함하고, 줄기 세포가 지방 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 신경 줄기 세포인 양태 1 내지 95의 방법이다. 양태 102는 제제의 로딩 효율이 적어도 50, 60, 70, 80, 또는 90%인 양태 1 내지 101의 방법이다. 양태 103은 세포 생존율이 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 적어도 50%인 양태 1 내지 102의 방법이다. 양태 104는 세포 생존율이 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 적어도 60%인 양태 1 내지 103의 방법이다. 양태 105는 세포 생존율이 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 적어도 70%인 양태 1 내지 104의 방법이다. 양태 106은 세포 생존율이 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 적어도 80%인 양태 1 내지 105의 방법이다. 양태 107은 세포 생존율이 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 적어도 90%인 양태 1 내지 106의 방법이다. 양태 108은 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 대략 50% 내지 90% 생존하는 양태 1 내지 107의 방법이다. 양태 109는 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 12 내지 72시간 후 대략 50% 내지 90% 생존하는 양태 1 내지 108의 방법이다. 양태 110은 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 12 내지 48시간 후 대략 50% 내지 90% 생존하는 양태 1 내지 109의 방법이다. 양태 111은 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 24시간 후 대략 50% 내지 90% 생존하는 양태 1 내지 110의 방법이다. 양태 112는 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 대략 60% 내지 90% 생존하는 양태 1 내지 111의 방법이다. 양태 113은 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 12 내지 72시간 후 대략 60% 내지 90% 생존하는 양태 1 내지 112의 방법이다. 양태 114는 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 12 내지 48시간 후 대략 60% 내지 90% 생존하는 양태 1 내지 113의 방법이다. 양태 115은 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 24시간 후 대략 60% 내지 90% 생존하는 양태 1 내지 114의 방법이다.
[0070]
양태 116은 양태 1-115의 방법을 사용하여 생산된 전기천공된 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포이다.
[0071]
양태 117은 프로세서에 의해 실행될 때, 프로세서로 하여금 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스와 관련된 제1 프로토콜을 선택하고; 하나 이상의 온전한 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 포함하는 샘플에 제1 프로토콜에 따른 제1 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제1 프로토콜에 의해 정의된 제1 전기 펄스를 가하고; 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스와 관련된 제2 프로토콜을 선택하고; 샘플에 제2 프로토콜에 따른 제2 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제2 프로토콜에 의해 정의된 제2 전기 펄스를 가하게 하는 명령을 포함하는 비일시적 컴퓨터 판독 가능 매체를 갖는 전기천공 시스템이고; 여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 제2 펄스 지속기간과 상이하다. 양태 118은 제1 전계 강도가 제2 전계 강도와 동일하고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간보다 긴 양태 117의 전기천공 시스템이다. 양태 119는 제1 전계 강도가 제2 전계 강도와 동일하고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간보다 짧은 양태 117의 전기천공 시스템이다. 양태 120은 제1 전계 강도가 제2 전계 강도 미만이고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간과 동일한 양태 117의 전기천공 시스템이다. 양태 121은 제1 전계 강도가 제2 전계 강도보다 크고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간과 동일한 양태 117의 전기천공 시스템이다. 양태 122는 제1 전계 강도가 제2 전계 강도 미만이고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간보다 긴 양태 117의 전기천공 시스템이다. 양태 123은 제1 전계 강도가 제2 전계 강도보다 크고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간보다 긴 양태 117의 전기천공 시스템이다. 양태 124는 제1 전계 강도가 제2 전계 강도 미만이고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간보다 짧은 양태 117의 전기천공 시스템이다. 양태 125는 제1 전계 강도가 제2 전계 강도보다 크고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간보다 짧은 양태 117의 전기천공 시스템이다. 양태 126은 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간이 제1 총 인가된 전기 에너지를 생성하고, 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간이 제2 총 인가된 전기 에너지를 생성하며, 제1 총 인가된 전기 에너지가 제2 총 인가된 전기 에너지와 상이한 양태 117 내지 양태 125의 전기천공 시스템이다. 양태 127은 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간이 제1 총 인가된 전기 에너지를 생성하고, 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간이 제2 총 인가된 전기 에너지를 생성하며, 제1 총 인가된 전기 에너지가 제2 총 인가된 전기 에너지와 상이하고, 제1 총 인가된 전기 에너지가 제2 총 인가된 전기 에너지보다 큰 양태 117 내지 양태 126의 전기천공 시스템이다. 양태 128은 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 전기 펄스의 전압 크기, 전기 펄스의 지속기간, 및 샘플의 전도도의 함수인 양태 117 내지 양태 127의 전기천공 시스템이다. 양태 129는 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 전기 펄스의 전압 크기, 전기 펄스의 지속기간, 및 샘플의 전도도의 함수이고, 전기 펄스의 전압 크기가 0.001 볼트 내지 10,000 볼트, 0.01 볼트 내지 10,000 볼트, 0.1 볼트 내지 10,000 볼트, 1 볼트 내지 10,000 볼트, 1 볼트 내지 9,000 볼트, 1 볼트 내지 8,000 볼트, 1 볼트 내지 7,000 볼트, 1 볼트 내지 6,000 볼트, 1 볼트 내지 5,000 볼트, 1 볼트 내지 4,000 볼트, 1 볼트 내지 3,000 볼트, 1 볼트 내지 2,000 볼트, 또는 1 볼트 내지 1,000 볼트인 양태 117 내지 양태 128의 전기천공 시스템이다. 양태 130은 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 전기 펄스의 전압 크기, 전기 펄스의 지속기간, 및 샘플의 전도도의 함수이고, 전기 펄스의 전압 크기는 100 볼트 내지 900 볼트인 양태 117 내지 양태 129의 전기천공 시스템이다. 양태 131은 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 전기 펄스의 전압 크기, 전기 펄스의 지속기간, 및 샘플의 전도도의 함수이고, 샘플의 전도도가 전기천공 완충제의 이온 조성, 세포에 로딩되는 제제의 농도, 세포 밀도, 온도, 및 압력을 포함하는 매개변수의 함수인 양태 117 내지 양태 130의 전기천공 시스템이다. 양태 132는 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 전기 펄스의 전압 크기, 전기 펄스의 지속기간, 및 샘플의 전도도의 함수이고, 샘플의 전도도가 0.01 지멘스/미터 내지 10 지멘스/미터, 0.01 지멘스/미터 내지 1 지멘스/미터, 0.1 지멘스/미터 내지 10 지멘스/미터, 0.1 지멘스/미터 내지 1 지멘스/미터, 또는 1 지멘스/미터 내지 10 지멘스/미터인 양태 117 내지 양태 131의 전기천공 시스템이다. 양태 133은 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 전기 펄스의 전압 크기, 전기 펄스의 지속기간, 및 샘플의 전도도의 함수이고, 샘플의 전도도가 1.0 내지 3.0 지멘스/미터인 양태 117 내지 양태 132의 전기천공 시스템이다. 양태 134는 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 전기 펄스의 전압 크기, 전기 펄스의 지속기간, 및 샘플의 전도도의 함수이고, 제1 및 제2 전계 강도가 추가로 전기천공 챔버의 기하학적 구조의 함수인 양태 117 내지 양태 133의 전기천공 시스템이다. 양태 135는 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 전기 펄스의 전압 크기, 전기 펄스의 지속기간, 및 샘플의 전도도의 함수이고, 제1 및 제2 전계 강도가 추가로 전기천공 챔버의 기하학적 구조의 함수이며, 전기천공 챔버가 0.001 cm 내지 10 cm, 0.001 cm 내지 1 cm, 0.01 cm 내지 10 cm, 0.01 cm 내지 1 cm, 0.1 cm 내지 10 cm, 0.1 cm 내지 1 cm, 또는 1 cm 내지 10 cm의 전극 갭을 포함하는 양태 117 내지 양태 134의 전기천공 시스템이다. 양태 136은 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 전기 펄스의 전압 크기, 전기 펄스의 지속기간, 및 샘플의 전도도의 함수이고, 제1 및 제2 전계 강도가 추가로 전기천공 챔버의 기하학적 구조의 함수이며, 전기천공 챔버가 0.01 cm 내지 1 cm의 전극 갭을 포함하는 양태 117 내지 양태 135의 전기천공 시스템이다. 양태 137은 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 0.01 kV/cm 내지 10 kV/cm, 0.01 kV/cm 내지 1 kV/cm, 0.1 kV/cm 내지 10 kV/cm, 0.1 kV/cm 내지 1 kV/cm, 또는 1 kV/cm 내지 10 kV/cm인 양태 117 내지 양태 136의 전기천공 시스템이다. 양태 138은 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 0.3 kV/cm 내지 3 kV/cm인 양태 117 내지 양태 137의 전기천공 시스템이다. 양태 139는 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 펄스 지속기간이 10-6초 내지 10초, 10-6초 내지 1초, 10-3초 내지 10초, 또는 10-3초 내지 1초인 양태 117 내지 양태 138의 전기천공 시스템이다. 양태 140은 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 펄스 지속기간이 1 마이크로초 내지 100 밀리초인 양태 117 내지 양태 139의 전기천공 시스템이다. 양태 141은 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성에 관한 특성을 추가로 포함하는 양태 117 내지 양태 140의 전기천공 시스템이다. 양태 142는 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성에 관한 특성을 추가로 포함하고, 펄스 수가 1 펄스 내지 1000 펄스, 1 펄스 내지 900 펄스, 1 펄스 내지 800 펄스, 1 펄스 내지 700 펄스, 1 펄스 내지 600 펄스, 1 펄스 내지 500 펄스, 1 펄스 내지 400 펄스, 1 펄스 내지 300 펄스, 1 펄스 내지 200 펄스, 1 펄스 내지 100 펄스, 1 펄스 내지 90 펄스, 1 펄스 내지 80 펄스, 1 펄스 내지 70 펄스, 1 펄스 내지 60 펄스, 1 펄스 내지 50 펄스, 1 펄스 내지 40 펄스, 1 펄스 내지 30 펄스, 1 펄스 내지 20 펄스, 또는 1 펄스 내지 10 펄스인 양태 117 내지 양태 141의 전기천공 시스템이다. 양태 143은 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성에 관한 특성을 추가로 포함하고, 펄스 수가 1 펄스 내지 130 펄스인 양태 117 내지 양태 142의 전기천공 시스템이다. 양태 144는 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성에 관한 특성을 추가로 포함하고, 펄스 폭이 지수 감쇠율의 함수인 양태 117 내지 양태 143의 전기천공 시스템이다. 양태 145는 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성에 관한 특성을 추가로 포함하고, 펄스 폭이 지수 감쇠율의 함수이며, 지수 감쇠율이 샘플의 저항 및 전기천공을 수행하는데 사용되는 파워 서플라이의 커패시턴스의 함수인 양태 117 내지 양태 144의 전기천공 시스템이다. 양태 146은 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성에 관한 특성을 추가로 포함하고, 펄스 폭이 지수 감쇠율의 함수이며, 지수 감쇠율이 샘플의 저항 및 전기천공을 수행하는데 사용되는 파워 서플라이의 커패시턴스의 함수이며, 샘플의 저항이 1 옴 내지 10000 옴, 1 옴 내지 9000 옴, 1 옴 내지 8000 옴, 1 옴 내지 7000 옴, 1 옴 내지 6000 옴, 1 옴 내지 5000 옴, 1 옴 내지 4000 옴, 1 옴 내지 3000 옴, 1 옴 내지 2000 옴, 1 옴 내지 1000 옴, 1 옴 내지 900 옴, 1 옴 내지 800 옴, 1 옴 내지 700 옴, 1 옴 내지 600 옴, 1 옴 내지 500 옴, 1 옴 내지 400 옴, 1 옴 내지 300 옴, 1 옴 내지 200 옴, 1 옴 내지 100 옴, 1 옴 내지 90 옴, 1 옴 내지 80 옴, 1 옴 내지 70 옴, 1 옴 내지 60 옴, 1 옴 내지 50 옴, 1 옴 내지 40 옴, 1 옴 내지 30 옴, 1 옴 내지 20 옴, 또는 1 옴 내지 10 옴인 양태 117 내지 양태 145의 전기천공 시스템이다. 양태 147은 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성에 관한 특성을 추가로 포함하고, 펄스 폭이 지수 감쇠율의 함수이며, 지수 감쇠율이 샘플의 저항 및 전기천공을 수행하는데 사용되는 파워 서플라이의 커패시턴스의 함수이며, 샘플의 저항이 1 옴 내지 1000옴인 양태 117 내지 양태 146의 전기천공 시스템이다. 양태 148은 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성에 관한 특성을 추가로 포함하고, 펄스 폭이 지수 감쇠율의 함수이며, 지수 감쇠율이 샘플의 저항 및 전기천공을 수행하는데 사용되는 파워 서플라이의 커패시턴스의 함수이며, 파워 서플라이 커패시턴스가 1 μF 내지 1,000,000 μF, 1 μF 내지 100,000 μF, 1 μF 내지 10,000 μF, 1 μF 내지 1,000 μF, 또는 1 μF 내지 100 μF인 양태 117 내지 양태 147의 전기천공 시스템이다. 양태 149는 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성에 관한 특성을 추가로 포함하고, 펄스 폭이 지수 감쇠율의 함수이며, 지수 감쇠율이 샘플의 저항 및 전기천공을 수행하는데 사용되는 파워 서플라이의 커패시턴스의 함수이며, 파워 서플라이 커패시턴스가 1000 μF 내지 5000 μF인 양태 117 내지 양태 148의 전기천공 시스템이다. 양태 150은 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성에 관한 특성을 추가로 포함하고, 펄스 형상이 구형파 펄스 또는 지수 감쇠파 펄스인 양태 117 내지 양태 149의 전기천공 시스템이다. 양태 151은 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성에 관한 특성을 추가로 포함하고, 펄스 패턴이 제1 또는 제2 펄스의 지속기간에 상응하는 단일 펄스를 포함하는 양태 117 내지 양태 150의 전기천공 시스템이다. 양태 152는 펄스 패턴이 다수의 펄스를 포함하며, 여기서 다수의 펄스의 조합된 지속기간이 제1 또는 제2 펄스의 지속기간에 상응하는 양태 117 내지 150의 전기천공 시스템이다. 양태 153은 제1 및 제2 전기 펄스의 극성이 포지티브 또는 네거티브인 양태 117 내지 152의 전기천공 시스템이다. 양태 154는 샘플에 제1 펄스를 가한지 적어도 12시간 내지 적어도 48시간 후에 샘플에 제2 전기 펄스를 가하는 양태 117 내지 153의 전기천공 시스템이다. 양태 155는 샘플에 제1 펄스를 가한지 적어도 24시간 후에 샘플에 제2 전기 펄스를 가하는 양태 117 내지 154의 전기천공 시스템이다. 양태 156은 전기천공 시스템이 유동 전기천공 장치를 포함하는 양태 117 내지 155의 전기천공 시스템이다. 양태 157은 전기천공 시스템이 유동 전기천공 장치를 포함하고, 샘플이 유동 전기천공 장치 내에서 흐르는 동안 샘플에 전기 펄스가 가해지는 양태 117 내지 156의 전기천공 시스템이다. 양태 158은 세포가 포유동물 세포인 양태 117 내지 157의 전기천공 시스템이다. 양태 159는 세포가 인간 세포, 뮤린 세포, 래트 세포, 햄스터 세포, 또는 영장류 세포인 양태 117 내지 158의 전기천공 시스템이다. 양태 160은 세포가 일차 세포인 양태 117 내지 159의 전기천공 시스템이다. 양태 161은 세포가 배양된 세포인 양태 117 내지 160의 전기천공 시스템이다. 양태 162는 세포가 배양된 세포이고, 배양된 세포가 배양된 세포주인 양태 117 내지 161의 전기천공 시스템이다. 양태 163은 세포가 배양된 세포주이고, 배양된 세포주가 3T3, 697, 10T½, 1321N1, A549, AHR77, B-LCL, B16, B65, Ba/F3, BHK, C2C12, C6, CaCo-2, CAP, CaSki, ChaGo-K-1, CHO, COS, DG75, DLD-1, EL4, H1299, HaCaT, HAP1, HCT116, HEK, HeLa, HepG2, HL60, HOS, HT1080, HT29, Huh-7, HUVEC, INS-1/GRINCH, Jurkat, K46, K562, KG1, KHYG-1, L5278Y, L6, LNCaP, LS180, MCF7, MDA-MB-231, ME-180, MG-63, Min-6, MOLT4, Nalm6, ND7/23, Neuro2a, NK92, NS/0, P3U1, Panc-1, PC-3, PC12, PER.C6, PM1, Ramos, RAW 264.7, RBL, Renca, RLE, SH-SY5Y, SK-BR-3, SK-MES-1, SK-N-SH, SK-OV-3, SP2/0, SW403, THP-1, U2OS, U937, Vero, YB2/0, 또는 이들의 유도체를 포함하는 양태 117 내지 162의 전기천공 시스템이다. 양태 164는 세포가 지방세포, 연골세포, 내피 세포, 상피 세포, 섬유모세포, 간세포, 각질세포, 근육세포, 뉴런, 골세포, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 비장세포, 줄기 세포, 또는 흉선세포를 포함하는 양태 117 내지 163의 전기천공 시스템이다. 양태 165는 세포가 PBMC를 포함하고, PBMC가 말초 혈액 림프구(PBL)인 양태 117 내지 164의 전기천공 시스템이다. 양태 166은 세포가 PBMC를 포함하고, PBMC가 PBL을 포함하고, PBL이 자연 살해(NK) 세포, T 세포, 또는 B 세포인 양태 117 내지 164의 전기천공 시스템이다. 양태 167은 세포가 PBMC를 포함하고, PBMC가 단핵구인 양태 117 내지 164의 전기천공 시스템이다. 양태 168은 세포가 PBMC를 포함하고, PBMC가 단핵구이고, 단핵구가 대식세포 또는 수지상 세포인 양태 117 내지 164의 전기천공 시스템이다. 양태 169는 세포가 PBMC를 포함하고, PBMC가 단핵구이고, 단핵구가 대식세포 또는 수지상 세포이고, 대식세포가 미세아교세포인 양태 117 내지 164의 전기천공 시스템이다. 양태 170은 세포가 줄기 세포를 포함하고, 줄기 세포가 지방 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 신경 줄기 세포인 양태 117 내지 164의 전기천공 시스템이다. 양태 171은 제1 및 제2 제제가 동일한 제제인 양태 117 내지 170의 전기천공 시스템이다. 양태 172는 제1 및 제2 제제가 상이한 제제인 양태 117 내지 170의 전기천공 시스템이다. 양태 173는 제1 및 제2 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자인 양태 117 내지 172의 방법이다. 양태 174는 제1 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자이고, 제2 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자인 양태 117 내지 173의 방법이다. 양태 175은 제1 제제가 핵산이고, 제2 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자인 양태 117 내지 174의 방법이다. 양태 176은 제1 제제가 폴리펩티드이고, 제2 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자인 양태 117 내지 174의 방법이다. 양태 177은 제1 제제가 단백질이고, 제2 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자인 양태 117 내지 174의 방법이다. 양태 178은 제1 제제가 소분자이고, 제2 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자인 양태 117 내지 174의 방법이다. 양태 179는 제1 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자이고, 제2 제제가 핵산인 양태 117 내지 178의 방법이다. 양태 180은 제1 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자이고, 제2 제제가 폴리펩티드인 양태 117 내지 178의 방법이다. 양태 181은 제1 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자이고, 제2 제제가 단백질인 양태 117 내지 178의 방법이다. 양태 182는 제1 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자이고, 제2 제제가 소분자인 양태 117 내지 178의 방법이다. 양태 183은 핵산이 RNA이고, RNA가 mRNA, miRNA, shRNA, siRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 양태 117 내지 182의 방법이다. 양태 184는 핵산이 DNA이고, DNA가 안티센스 올리고뉴클레오티드, 벡터, 또는 이중 센스 선형 DNA인 양태 117 내지 183의 방법이다. 양태 185는 단백질이 리보핵단백질인 양태 117 내지 184의 방법이다. 양태 186은 리보핵단백질이 Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 포함하는 양태 117 내지 185의 방법이다. 양태 187은 제제의 로딩 효율이 적어도 50, 60, 70, 80, 또는 90%인 양태 117 내지 186의 방법이다. 양태 188은 세포 생존율이 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 적어도 50%인 양태 117 내지 187의 방법이다. 양태 189는 세포 생존율이 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 적어도 60%인 양태 117 내지 188의 방법이다. 양태 190은 세포 생존율이 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 적어도 70%인 양태 117 내지 189의 방법이다. 양태 191은 세포 생존율이 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 적어도 80%인 양태 117 내지 190의 방법이다. 양태 192는 세포 생존율이 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 적어도 90%인 양태 117 내지 191의 방법이다. 양태 193은 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 대략 50% 내지 90% 생존하는 양태 117 내지 192의 방법이다. 양태 194는 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 12 내지 72시간 후 대략 50% 내지 90% 생존하는 양태 117 내지 193의 방법이다. 양태 195는 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 12 내지 48시간 후 대략 50% 내지 90% 생존하는 양태 117 내지 194의 방법이다. 양태 196은 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 24시간 후 대략 50% 내지 90% 생존하는 양태 117 내지 195의 방법이다. 양태 197은 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 대략 60% 내지 90% 생존하는 양태 117 내지 196의 방법이다. 양태 198은 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 12 내지 72시간 후 대략 60% 내지 90% 생존하는 양태 117 내지 197의 방법이다. 양태 199는 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 12 내지 48시간 후 대략 60% 내지 90% 생존하는 양태 117 내지 198의 방법이다. 양태 200은 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 24시간 후 대략 60% 내지 90% 생존하는 양태 117 내지 199의 방법이다.
[0072]
양태 201은 양태 117 내지 200의 전기천공 시스템을 사용하여 생산된 전기천공된 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포이다.
[0073]
본 출원 전반에 걸쳐, 전기천공의 표적 또는 제제, 약물, 또는 치료제의 전달을 위한 비히클을 지칭하는 용어 "세포" 또는 "전달 비히클"은 생물학적 의미에서 인간 또는 동물 세포를 포함하는 것을 의미한다.
[0074]
본원에서 사용되는 용어 "에너지"는 샘플에 인가된 전기 펄스(또는 조합된 펄스) 동안 생성된 열을 지칭하고, 이는 전기 펄스(또는 조합된 펄스) 동안 샘플에 인가된 전계 강도 및 펄스 지속기간(또는 조합된 펄스 지속기간) 둘 모두에 비례한다. 따라서, 샘플에 "고에너지" 펄스를 인가하기 위해, 완충 조성물, 처리 조립체, 및 샘플 부피가 일정하게 유지되는 경우, "중간 에너지" 또는 "저에너지" 전기 펄스(또는 조합된 펄스)가 샘플에 인가될 때와 비교하여 전기 펄스(또는 조합된 펄스) 동안 더 많은 양의 열이 생성되도록 전계 강도 및 펄스 지속기간(또는 조합된 펄스 지속기간)을 포함하는 변수의 비율이 수정된다. 반대로, 샘플에 "저에너지" 펄스를 인가하기 위해, 완충 조성물, 처리 조립체, 및 샘플 부피가 일정하게 유지되는 경우, "고에너지" 또는 "중간 에너지" 전기 펄스(또는 조합된 펄스)가 샘플에 인가될 때와 비교하여 전기 펄스(또는 조합된 펄스) 동안 더 적은 양의 열이 생성되도록 전계 강도 및 펄스 지속기간(또는 조합된 펄스 지속기간)을 포함하는 변수의 비율이 수정된다.
[0075]
본 출원 전반에 걸쳐, 용어 "약", "실질적으로" 및 "대략"은 값이 측정 또는 정량화 방법에 대한 고유한 오차 변동을 포함하는 것을 나타내기 위해 사용된다.
[0076]
"포함하는"이라는 용어와 함께 사용될 때 단수 형태의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, "하나 이상", "적어도 하나", 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와도 일치한다.
[0077]
어구 "및/또는"은 "그리고"나 "또는"을 의미한다. 예시를 위해, A, B, 및/또는 C는 A 단독, B 단독, C 단독, A와 B의 조합, A와 C의 조합, B와 C의 조합, 또는 A, B와 C의 조합을 포함한다. 다시 말해, "및/또는"은 포괄적인 또는을 의미한다.
[0078]
조성물 및 이들의 사용을 위한 방법은 명세서 전체에 걸쳐 개시된 임의의 성분 또는 단계를 "포함"하거나, "필수적 요소로 하여 구성(consist essentially of)"되거나, "구성"될 수 있다. 개시된 임의의 성분 또는 단계를 "필수적 요소로 하여 구성된" 조성물 및 방법은 본 개시의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 특정 물질 또는 단계로 청구범위의 범위를 제한한다. 본 명세서 및 청구 범위(들)에 사용된 바와 같이, 단어 "포함하는"(및 "~들이 포함하는", "~이 포함하는"과 같은 포함하는의 임의의 형태), "갖는"(및 "~들이 갖는" 및 "~이 갖는"과 같은 갖는의 임의의 형태), "포함하는"(및 "~들이 포함하는", "~이 포함하는"과 같은 포함하는의 임의의 형태), 또는 "함유하는"(및 "~들이 함유하는", "~이 함유하는"과 같은 함유하는의 임의의 형태)은 포괄적이거나 개방형이며, 언급되지 않은 추가 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 용어 "포함하는"의 맥락에서 본원에 기재된 양태는 용어 "구성되는" 또는 "필수적 요소로 하여 구성되는"의 맥락에서도 구현될 수 있는 것으로 고려된다.
[0079]
본 개시의 한 양태와 관련하여 논의된 임의의 제한은 본 개시의 임의의 다른 양태에 적용될 수 있는 것으로 구체적으로 고려된다. 또한, 본 개시의 임의의 조성물은 본 개시의 임의의 방법에서 사용될 수 있고, 본 개시의 임의의 방법은 본 개시의 임의의 조성물을 생산하거나 활용하기 위해 사용될 수 있다. 실시예에 제시된 측면의 양태는 또한 상이한 실시예의 다른 곳 또는 본 출원의 다른 곳, 예를 들어, 개요, 상세한 설명, 청구범위, 및 도면의 간단한 설명에서 논의된 측면의 맥락에서 구현될 수 있는 양태이다.
[0080]
본 개시의 다른 목적, 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 개시의 특정 양태를 나타내지만, 단지 예시로서 제공된 것으로 이해되어야 하는데, 그 이유는 본 개시의 사상 및 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 이 상세한 설명을 통해 당업자에게 명백해질 것이기 때문이다.
도면의 간단한 설명
[0081]
다음의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 개시의 특정 양태를 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 개시는 본원에 제시된 특정 양태의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.
[0082]
도 1은 본 개시의 양태에 따른, 폐쇄 위치의 전기천공 처리 조립체의 좌측 상부 사시도를 예시한다;
[0083]
도 2는 본 개시의 양태에 따른, 개방 위치의 도 1의 처리 조립체의 좌측 상부 사시도를 예시한다;
[0084]
도 3은 본 개시의 양태에 따른, 개방 위치의 도 1의 처리 조립체의 후방 상부 우측 사시도를 예시한다;
[0085]
도 4는 본 개시의 양태에 따른, 개방 위치의 도 1의 처리 조립체의 후방 상부 우측 사시도를 예시한다;
[0086]
도 5는 본 개시의 양태에 따른, 도 4의 처리 조립체의 분해 사시도를 예시한다;
[0087]
도 6는 본 개시의 양태에 따른, 도 4의 처리 조립체의 분해 사시도를 예시한다;
[0088]
도 7은 본 개시의 양태에 따른, 라벨을 갖는 도 1의 처리 조립체의 상부 우측 사시도를 예시한다;
[0089]
도 8은 본 개시의 양태에 따른, 라벨을 갖는 도 1의 처리 조립체의 상부 좌측 사시도를 예시한다;
[0090]
도 9는 본 개시의 양태에 따른, 로딩 장치가 삽입된 도 1의 처리 조립체의 상부 우측 사시도를 예시한다;
[0091]
도 10은 본 개시의 양태에 따른, 처리 조립체의 어셈블리의 부분들이 시야에서 제거된 도 9의 처리 조립체의 상부 우측 사시도를 예시한다;
[0092]
도 11은 본 개시의 양태에 따른, 전기천공 처리 조립체를 보유하는 트레이의 상부 우측 사시도를 예시한다;
[0093]
도 12는 본 개시의 양태에 따른, 전기천공 처리 조립체를 보유하는 트레이의 정면도를 예시한다;
[0094]
도 13은 본 개시의 양태에 따른, 전기천공 처리 조립체를 보유하는 트레이의 상부 우측 사시도를 예시한다;
[0095]
도 14는 본 개시의 양태에 따른, 복수의 개스킷의 정면도를 예시한다;
[0096]
도 15는 본 개시의 양태에 따른, 개스킷의 어레이의 평면도 및 개스킷의 정면도를 예시한다;
[0097]
도 16은 본 개시의 양태에 따른 백 및 처리 장치의 정면도를 예시한다;
[0098]
도 17은 본 개시의 양태에 따른, 개스킷의 정면도를 예시한다;
[0099]
도 18은 본 개시의 양태에 따른, 폐쇄 위치의 또 다른 전기천공 처리 조립체의 우측 상부 사시도를 예시한다;
[0100]
도 19는 본 개시의 양태에 따른, 개방 위치의 도 18의 처리 조립체의 우측 상부 사시도를 예시한다;
[0101]
도 20은 본 개시의 양태에 따른, 도 18의 처리 조립체의 분해 사시도를 예시한다;
[0102]
도 21은 본 개시의 양태에 따른, 복수의 전기천공 처리 조립체를 보유하는 트레이를 예시한다;
[0103]
도 22는 본 개시의 양태에 따른, 전기천공 처리 조립체를 예시한다;
[0104]
도 23은 본 개시의 양태에 따른, 복수의 전기천공 처리 조립체를 보유하기 위한 트레이를 예시한다;
[0105]
도 24는 본 개시의 양태에 따른, 복수의 전기천공 처리 조립체를 보유하기 위한 트레이를 예시한다;
[0106]
도 25는 본 개시의 양태에 따른, 복수의 전기천공 처리 조립체를 보유하기 위한 랙을 예시한다;
[0107]
도 26는 본 개시의 양태에 따른, 복수의 전기천공 처리 조립체를 보유하기 위한 랙을 예시한다;
[0108]
도 27은 본 개시의 양태에 따른, 전기천공 시스템을 예시한다;
[0109]
도 28은 본 개시의 양태에 따른, 전기천공 처리 조립체가 제거된 개방 위치의 도킹 스테이션을 예시한다;
[0110]
도 29는 본 개시의 양태에 따른, 처리 조립체가 삽입된 개방 위치의 도 28의 도킹 스테이션을 예시한다;
[0111]
도 30는 본 개시의 양태에 따른, 처리 조립체가 삽입된 폐쇄 위치의 도 28의 도킹 스테이션을 예시한다;
[0112]
도 31은 본 개시의 양태에 따른, 개방 위치, 폐쇄 위치, 및 전기천공 시스템에 연결된 도킹 스테이션을 예시한다;
[0113]
도 32는 본 개시의 양태에 따른, 전기천공 시스템에 연결된 도킹 스테이션을 예시한다;
[0114]
도 33은 본 개시의 양태에 따른, 전기천공 장치, 처리 조립체, 도킹 스테이션, 트레이, 및 충전 장치를 예시한다;
[0115]
도 34a-34c는 본 개시의 양태에 따른, 전기천공 시스템으로의 전달을 위한 예시적인 용기를 예시한다;
[0116]
도 35는 2개의 상이한 GFP mRNA 농도(100 μg/mL 및 200 μg/mL)로 확장된 림프구의 순차적인 전기천공을 위한 실험 설계를 예시한다;
[0117]
도 36은 GFP mRNA로 확장된 림프구 세포의 순차적인 전기천공 후 3일 및 4일의 유세포 분석 데이터를 보여준다.
[0118]
도 37a-37b는 순차적인 전기천공을 거친 림프구의 림프구 게이팅 및 생존력을 보여준다.
[0119]
도 38a-38b는 순차적으로 전기천공된 림프구에 대한 GFP 발현 및 GFP 평균 형광 강도(MFI)를 보여준다.
[0120]
도 39a-39e는 2개의 상이한 GFP mRNA 농도(100 μg/mL 및 200 μg/mL)로 상이한 전기천공 에너지에서 확장된 림프구의 순차적인 전기천공을 위한 실험 설계를 예시한다.
[0121]
도 40a-40b는 2개의 상이한 GFP mRNA 농도(100 μg/mL 및 200 μg/mL)로 상이한 전기천공(EP) 에너지에서 확장된 림프구의 순차적인 전기천공 후 세 상이한 시점(24 hr, 48 hr, 및 72 hr)에 GFP mRNA를 발현하는 림프구의 집단을 보여준다.
[0122]
도 41a-41b는 림프구 생존력이 도 39a-39e에 예시된 모든 4개의 에너지 조합에 대해 상이한 전기천공(EP) 에너지에서 확장된 림프구의 순차적인 전기천공 후에 유사하였음을 보여준다.
[0123]
도 42a-42b는 2개의 상이한 GFP mRNA 농도(100 μg/mL 및 200 μg/mL)로 상이한 전기천공(EP) 에너지에서 확장된 림프구의 순차적인 전기천공 후 세 상이한 시점(24 hr, 48 hr, 및 72 hr)에 림프구에 의한 GFP 발현을 보여준다.
[0124]
도 43a-43b는 2개의 상이한 GFP mRNA 농도(100 μg/mL 및 200 μg/mL)로 상이한 전기천공(EP) 에너지에서 확장된 림프구의 순차적인 전기천공 후 세 상이한 시점(24 hr, 48 hr, 및 72 hr)에 림프구에 대한 GFP 평균 형광 강도(MFI)를 보여준다.
[0125]
도 44a-44b는 TRAC 및 PD1을 녹아웃시키기 위해 2개의 상이한 리보핵단백질(RNP) 작제물을 사용한 활성화된 T-세포의 순차적인 전기천공을 위한 세포 배양(도 44a) 및 전기천공(도 44b) 조건을 포함하는 실험 설계를 예시한다.
[0126]
도 45는 2일 동안 사이토카인과 함께 인큐베이션 후 T-세포의 활성화를 보여준다.
[0127]
도 46a-46f는 림프구에서 TRAC 및 PD1 녹아웃 효율을 측정하기 위한 FACS 게이팅 전략을 보여준다.
[0128]
도 47a-47e는 TRAC를 녹아웃시키기 위해 RNP 작제물을 사용한 전기천공 후 총 세포 및 림프구 수를 측정하기 위한 FACS 게이팅 전략을 보여준다.
[0129]
도 48은 본 전기천공 시스템의 한 가지 양태의 개략도이다.
[0130]
도 49는 도 48의 전기천공 시스템을 사용하여 구현될 수 있는, 샘플에 2개 이상의 전기 펄스를 가하기 위한 본 방법의 양태를 도시한다.
상세한 설명
[0131]
본 개시의 특정 양태는 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 조직, 또는 이들의 유도체로의 하나 이상의 관심 제제의 진입 효율을 증가시키고, 전기 아크 또는 열 충격에 의한 손상을 최소화하기 위해 시간에 따라 분리된 다수의 라운드의 전기천공 전달을 제공하는 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 또는 조직의 순차적인 전기천공을 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.
I.
전기천공
[0132]
본원에서 사용되는 전기천공 또는 전기부하(electroloading)는 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 조직, 또는 이들의 유도체로의 관심 제제의 진입을 용이하게 하기 위한 전류 또는 전기장의 인가를 지칭한다. 당업자는 전기천공의 임의의 방법 및 기술이 본 개시에 의해 고려된다는 것을 이해할 것이다.
[0133]
전기천공의 과정은 일반적으로 세포, 소포, 또는 리포솜을 함유하는 액체 세포 현탁액에 걸쳐 전기장 펄스를 인가함으로써, 세포막, 또는 소포 또는 리포솜에서 기공의 형성을 포함한다. 전기천공 과정 동안, 세포는 종종 액체 매질에 현탁된 다음 전기장 펄스를 받는다. 매질은 전해질, 비-전해질, 또는 전해질과 비-전해질의 혼합물일 수 있다. 현탁액에 인가된 전계 강도 및 펄스의 길이(전기장이 세포 현탁액에 인가되는 시간)는 세포 유형에 따라 다르다. 세포의 외막에 기공을 생성하기 위해, 전기장은 관심 제제가 세포에 진입할 수 있도록 세포막의 투과성을 증가시키는 시간의 길이와 전압으로 인가되어야 한다.
[0134]
전기천공 매개변수는 인가된 전계 강도 및/또는 노출 지속기간을 최적화하여 전기 펄스에 의해 막에 형성된 기공이 짧은 기간 후에 재밀봉되고, 그 동안 세포외 화합물이 세포 내로 진입할 기회를 갖도록 조정될 수 있다. 그러나, 전기장에 대한 살아있는 세포의 과도한 노출은 아폽토시스 및/또는 괴사를 야기하여 세포 사멸을 초래할 수 있다. 이는 부분적으로, 전기천공 과정 동안, 전도성 매질을 통해 흐르는 전류가 매질의 가열 및 매질의 전도도의 후속 증가를 야기하기 때문이다. 적절하게 제어되지 않으면, 이러한 전도도 증가는 전원으로부터 훨씬 더 많은 전류를 끌어들이고, 이는 아킹 및 샘플의 손실을 초래할 수 있다. 이러한 효과는 전형적으로 비교적 높은 전계 강도(>2 kV/cm)에서 관찰된다. 그러나, 예를 들어, 트랜스펙션하기 어려운 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 또는 조직의 전기천공은 비교적 강한 전기장을 필요로 한다.
[0135]
예로서, 전기천공을 위해 개발된 완충제는 전형적으로 비교적 높은 전도도를 가지며, 매우 짧은 전기 펄스가 사용된다. 그러나, 관심 제제를 트랜스펙션하기 어려운 세포 또는 리포솜에 효율적으로 로딩하기 위해, 비교적 긴 시간 간격 동안 고전압을 고전도성 배지에 인가해야 할 수 있다. 이러한 세 가지 조건은 동시에 쉽게 충족되지 않으며, 그렇게 하면 세포 또는 리포솜에 비가역적 손상이 발생할 수 있다. 본원에 기재된 실험을 수행하기 전에, 본 발명자들은 다수의 라운드의 전기천공이 관심 제제로 트랜스펙션하기 어려운 세포 또는 리포솜의 효율적인 로딩을 제공할 수 있다고 가정하였다. 그러나, 현재, 비교적 긴 시간 간격 동안 고전도성 매질에 고전압을 인가하는 것과 마찬가지로, 다수의 라운드의 전기천공이 세포 또는 리포솜을 비가역적으로 손상시키고 세포 사멸을 초래하는 것으로 알려져 있기 때문에, 순차적인 전기천공은 일반적으로 회피된다. 예를 들어, O'Dea 등(Vector-free intracellular delivery by reversible permeabilization. PLoS ONE. 2017; 12(3):e0174779)은 다수의 라운드의 전기천공이 세포 사멸을 초래하기 때문에 다중 투여가 불가능한 전기천공과 같은 기술과 달리, 기술된 벡터-비함유 가역적 세포 투과화 방법은 세포에 유전 물질을 여러 번 투여하는 것을 가능하게 한다고 명시적으로 언급하고 있다. 실제로, Plews 등(Activation of Pluripotency Genes in Human Fibroblast Cells by a Novel mRNA Based Approach. PLoS ONE. 2010; 5(12): e14397)은 다수의 라운드의 전기천공 시도가 대규모 세포 사멸을 야기함을 실제로 입증하였다. 유사하게, Rols 및 Teissie(Electropermeabilization of Mammalian Cells to Macromolecules: Control by Pulse Duration. Biophys. J. 1998; 75(3): 1415-1423)는 도 2A 및 2C에서 펄스 지속기간 또는 순차적으로 인가된 펄스의 수가 증가하면 세포 생존력이 급격히 감소하는 것을 보여준다.
[0136]
이러한 문제에 대한 해결책은 전기 아크 또는 열 충격에 의한 세포, 세포 입자, 지질 소포, 또는 조직에 대한 손상을 최소화하고; 관심 제제의 로딩 효율을 증가시키고; 세포, 세포 입자, 지질 소포, 또는 조직의 생존력 및 임상 효과를 생성하는 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 또는 조직의 능력을 유지하면서 순차적인 라운드의 전기천공을 제공하는 개시된 방법 및 장치를 포함한다. 본 발명자들은 하나 이상의 온전한 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 포함하는 샘플에 상이한 전계 강도 및/또는 상이한 펄스 지속기간을 갖는 2개 이상의 전기 펄스를 가하는 단계, 및 추가로 또는 대안적으로, 샘플이 2개 이상의 전기 펄스 사이에서 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계를 포함하는 전기천공 방법을 개발하였다. 본 발명자들은 놀랍게도 이러한 전기천공 방법이 이전에 기재된 방법과 비교하여 샘플 무결성 또는 세포 샘플의 경우, 세포 생존력을 감소시키지 않으면서 관심 제제로 트랜스펙션하기 어려운 샘플을 보다 효율적으로 로딩할 수 있음을 발견하였다.
[0137]
일부 양태는 관심 제제를 캡슐화하는 방법; 막을 통해 관심 제제의 수송을 가능하게 하기 위해 막을 일시적으로 투과시키는 방법; 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 또는 조직을 전기천공하는 방법; 전기천공된 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 또는 조직을 생산하는 방법; 및 전기천공된 물질의 임상 효과를 유지하면서 전기천공의 효율을 증가시키는 방법을 포함한다. 일부 양태는 또한 본원에 개시된 임의의 전기천공 방법 또는 장치를 사용하여 생산된 전기천공된 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 포함한다.
[0138]
본 방법의 일부는 하나 이상의 온전한 세포, 세포 입자 또는 지질 소포를 포함하는 샘플에 제1 프로토콜에 따른 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계 및 샘플에 제2 프로토콜에 따른 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계를 포함한다. 이러한 일부 방법에서, 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 제2 펄스 지속기간과 상이하다. 추가로 또는 대안적으로, 일부 방법은 샘플에 제1 전기 펄스를 가한 후 적어도 24시간 동안 샘플이 회복되도록 하는 단계를 포함한다.
[0139]
일부 양태에서, 제제는 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자이다. 일부 양태에서, 핵산은 RNA이고, RNA는 mRNA, miRNA, shRNA, siRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, 핵산은 DNA이고, DNA는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 벡터, 또는 이중 센스 선형 DNA이다. 일부 양태에서, 단백질은 리보핵단백질이다. 일부 양태에서, 리보핵단백질은 Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 포함한다.
[0140]
일부 양태에서, 본원에 기재된 방법은 프로세서에 의해 실행될 때, 프로세서로 하여금 샘플을 전기천공하도록 제1 및 제2 프로토콜을 실행하게 하는 명령을 포함하는 비일시적 컴퓨터 판독 가능 매체를 갖는 전기천공 시스템에 의해 수행된다. 일부 양태에서, 전기천공 시스템은 유동 전기천공 장치를 포함하고, 샘플이 유동 전기천공 장치 내에서 흐르는 동안 샘플에 전기 펄스가 가해진다.
[0141]
일부 양태에서, 제1 및 제2 전기 펄스의 타이밍 및/또는 2개 이상의 전기 펄스에 의해 제공되는 인가된 전기장 및/또는 노출 지속기간은 전기 아크 또는 열 충격에 의한 세포, 세포 입자, 지질 소포, 또는 조직에 대한 손상을 최소화하고; 관심 제제의 로딩 효율을 증가시키고; 세포, 세포 입자, 지질 소포, 또는 조직의 생존력 및 임상 효과를 생성하는 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 또는 조직의 능력을 유지하도록 조정될 수 있다.
[0142]
일부 양태에서, 샘플은 전기 펄스(예를 들어, 제1 및/또는 제2 전기 펄스) 후에 휴지된다. 일부 양태에서, 샘플은 전기 펄스 후에 25-50℃ 및 3-8% CO2에서 10-30분 동안 휴지된다. 따라서, 일부 양태에서, 샘플은 전기 펄스 후에 최대, 적어도, 또는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30분, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값 동안 휴지된다. 일부 양태에서, 샘플은 전기 펄스 후에 적어도, 최대, 또는 약 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50℃, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값에서 휴지된다. 일부 양태에서, 샘플은 전기 펄스 후에 적어도, 최대, 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8% CO2, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값에서 휴지된다. 특정 양태에서, 샘플은 전기 펄스 후에 37℃ 및 5% CO2에서 20분 동안 휴지된다. 일부 양태에서, 샘플은 전기 펄스(예를 들어, 제1 및/또는 제2 전기 펄스) 후에 휴지되지 않는다.
[0143]
일부 양태에서, 하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 샘플은 샘플에 제1 펄스를 가한 후, 세포를 적어도, 최대, 또는 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102, 108, 114, 또는 120시간, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값 동안 배양함으로써 회복된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 샘플은 샘플에 제1 펄스를 가한 후, 세포를 최대 또는 적어도 6시간 내지 120시간, 6시간 내지 96시간, 6시간 내지 72시간, 6시간 내지 48시간, 6시간 내지 24시간, 6시간 내지 12시간, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값 동안 배양함으로써 회복된다. 따라서, 일부 양태에서, 샘플에 제1 펄스를 가한지 적어도, 최대, 또는 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102, 108, 114, 또는 120시간, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값 후에 샘플에 제2 전기 펄스를 가한다. 일부 양태에서, 샘플에 제1 펄스를 가한지 최대 또는 적어도 6시간 내지 120시간, 6시간 내지 96시간, 6시간 내지 72시간, 6시간 내지 48시간, 6시간 내지 24시간, 6시간 내지 12시간, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값 후에 샘플에 제2 전기 펄스를 가한다. 일부 양태에서, 샘플에 제1 펄스를 가한지 6시간 내지 120시간, 6시간 내지 96시간, 6시간 내지 72시간, 6시간 내지 48시간, 6시간 내지 24시간, 6시간 내지 12시간, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값 후에 샘플에 제2 전기 펄스를 가한다. 일부 양태에서, 샘플에 제1 펄스를 가한지 적어도 약 12시간 내지 적어도 약 48시간 후에 샘플에 제2 전기 펄스를 가한다. 일부 양태에서, 샘플에 제1 펄스를 가한지 적어도 약 24시간 후에 샘플에 제2 전기 펄스를 가한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 샘플은 샘플에 제1 펄스를 가한 후 세포를 배양함으로써 회복되지 않는다.
[0144]
샘플을 회복시키거나 샘플이 회복되도록 하는 것은 개선되거나 원하는 상태 또는 조건으로 세포의 복원 또는 복구를 촉진하기에 적절하고 충분한 본원에 기재된 것과 같은 조건 하에 본원에 기재된 임의의 세포-배양 용기 및 세포 배양 배지에서 샘플의 세포를 배양하는 것을 의미한다. 예를 들어, 배양물에서의 회복은 세포가, 예를 들어, 세포벽을 복구함으로써 전기천공의 외상으로부터 회복되고, 세포의 전기천공시 세포에 로딩된 제제를 발현 또는 대사시키기 시작하도록 할 수 있다.
[0145]
전계 강도 및 펄스 지속기간과 관련하여, 일부 양태에서, 제1 전기 펄스의 전계 강도는 제2 전기 펄스의 전계 강도와 동일하고, 제1 전기 펄스의 펄스 지속기간은 제2 전기 펄스의 펄스 지속기간보다 길다. 일부 양태에서, 제1 전기 펄스의 전계 강도는 제2 전기 펄스의 전계 강도와 동일하고, 제1 전기 펄스의 펄스 지속기간은 제2 전기 펄스의 펄스 지속기간보다 짧다. 일부 양태에서, 제1 전기 펄스의 전계 강도는 제2 전기 펄스의 전계 강도와 동일하고, 제1 전기 펄스의 펄스 지속기간은 제2 전기 펄스의 펄스 지속기간과 동일하다. 일부 양태에서, 제1 전기 펄스의 전계 강도는 제2 전기 펄스의 전계 강도보다 크고, 제1 전기 펄스의 펄스 지속기간은 제2 전기 펄스의 펄스 지속기간과 동일하다. 일부 양태에서, 제1 전기 펄스의 전계 강도는 제2 전기 펄스의 전계 강도보다 크고, 제1 전기 펄스의 펄스 지속기간은 제2 전기 펄스의 펄스 지속기간보다 길다. 일부 양태에서, 제1 전기 펄스의 전계 강도는 제2 전기 펄스의 전계 강도보다 크고, 제1 전기 펄스의 펄스 지속기간은 제2 전기 펄스의 펄스 지속기간보다 짧다. 일부 양태에서, 제1 전기 펄스의 전계 강도는 제2 전기 펄스의 전계 강도 미만이고, 제1 전기 펄스의 펄스 지속기간은 제2 전기 펄스의 펄스 지속기간과 동일하다. 일부 양태에서, 제1 전기 펄스의 전계 강도는 제2 전기 펄스의 전계 강도 미만이고, 제1 전기 펄스의 펄스 지속기간은 제2 전기 펄스의 펄스 지속기간보다 길다. 일부 양태에서, 제1 전기 펄스의 전계 강도는 제2 전기 펄스의 전계 강도 미만이고, 제1 전기 펄스의 펄스 지속기간은 제2 전기 펄스의 펄스 지속기간보다 짧다.
[0146]
일부 양태에서, 제1 전기 펄스의 전계 강도 및 제1 전기 펄스의 펄스 지속기간은 제1 총 인가된 전기 에너지를 생성하고, 제2 전기 펄스의 전계 강도 및 제2 전기 펄스의 펄스 지속기간은 제2 총 인가된 전기 에너지를 생성한다. 일부 양태에서, 제1 총 인가된 전기 에너지는 제2 총 인가된 전기 에너지와 상이하다. 일부 양태에서, 제1 총 인가된 전기 에너지는 제2 총 인가된 전기 에너지보다 크다. 일부 양태에서, 제1 총 인가된 전기 에너지는 제2 총 인가된 전기 에너지 미만이다.
[0147]
제2 전계 강도 및/또는 제2 펄스 지속기간과 동일하거나, 미만이거나, 더 큰 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간을 달성하기 위해, 하나 이상의 전기천공 변수 또는 매개변수는 본원에 기재된 절차 및 방법을 이용하여 최적화될 수 있다. 본 개시의 양태는 정적 및 유동 전기천공 시스템과 관련하여 사용될 수 있다.
1.
전계 강도
[0148]
전계 강도는 전극 갭에 걸쳐 전달된 전압으로 측정되며 kV/cm로 표현될 수 있다. 전계 강도는 세포막에서 일시적인 가역적 투과 또는 기공 형성이 일어나도록 하기 위해 세포막의 전위를 초과하는 것이 중요하며, 본 개시의 방법은 세포에 다양한 전기장 강도를 가할 수 있다. 일부 양태에서, 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도는 정확히, 적어도 또는 최대 0.01, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 또는 10 kV/cm, 또는 그로부터 유도가능한 임의의 범위 또는 값일 수 있다. 일부 양태에서, 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도는 최대 또는 적어도 약 0.01 kV/cm 내지 10 kV/cm, 0.01 kV/cm 내지 1 kV/cm, 0.1 kV/cm 내지 10 kV/cm, 0.1 kV/cm 내지 1 kV/cm, 1 kV/cm 내지 10 kV/cm, 또는 0.01 kV/cm 내지 10 kV/cm의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위이다. 일부 양태에서, 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도는 0.01 kV/cm 내지 10 kV/cm, 0.01 kV/cm 내지 1 kV/cm, 0.1 kV/cm 내지 10 kV/cm, 0.1 kV/cm 내지 1 kV/cm, 1 kV/cm 내지 10 kV/cm, 또는 0.01 kV/cm 내지 10 kV/cm의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위이다. 일부 양태에서, 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도는 0.3 kV/cm 내지 3 kV/cm, 0.3 kV/cm 내지 3 kV/cm의 임의의 값, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값이다.
[0149]
전계 강도는 인가된 전기 펄스의 전압 크기, 전기 펄스의 지속기간, 및 전기천공되는 샘플의 전도도를 포함하는 여러 인자의 함수이다. 따라서, 일부 양태에서, 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도는 전기 펄스의 전압 크기, 전기 펄스의 지속기간, 및 샘플의 전도도의 함수이다.
[0150]
일부 양태에서, 전기 펄스의 전압 크기는 정확히, 대략, 적어도, 또는 최대 0.001, 0.010, 0.020, 0.030, 0.040, 0.050, 0.060, 0.070, 0.080, 0.090, 0.100, 0.110, 0.120, 0.130, 0.140, 0.150, 0.160, 0.170, 0.180, 0.190, 0.200, 0.210, 0.220, 0.230, 0.240, 0.250, 0.260, 0.270, 0.280, 0.290, 0.300, 0.310, 0.320, 0.330, 0.340, 0.350, 0.360, 0.370, 0.380, 0.390, 0.400, 0.410, 0.420, 0.430, 0.440, 0.450, 0.460, 0.470, 0.480, 0.490, 0.500, 0.510, 0.520, 0.530, 0.540, 0.550, 0.560, 0.570, 0.580, 0.590, 0.600, 0.610, 0.620, 0.630, 0.640, 0.650, 0.660, 0.670, 0.680, 0.690, 0.700, 0.710, 0.720, 0.730, 0.740, 0.750, 0.760, 0.770, 0.780, 0.790, 0.800, 0.810, 0.820, 0.830, 0.840, 0.850, 0.860, 0.870, 0.880, 0.890, 0.900, 0.910, 0.920, 0.930, 0.940, 0.950, 0.960, 0.970, 0.980, 0.990, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900, 6000, 6100, 6200, 6300, 6400, 6500, 6600, 6700, 6800, 6900, 7000, 7100, 7200, 7300, 7400, 7500, 7600, 7700, 7800, 7900, 8000, 8100, 8200, 8300, 8400, 8500, 8600, 8700, 8800, 8900, 9000, 9100, 9200, 9300, 9400, 9500, 9600, 9700, 9800, 9900, 또는 10000 볼트, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값일 수 있다. 일부 양태에서, 전기 펄스의 전압 크기는 최대 또는 적어도 약 0.001 볼트 내지 10,000 볼트, 0.01 볼트 내지 10,000 볼트, 0.1 볼트 내지 10,000 볼트, 1 볼트 내지 10,000 볼트, 1 볼트 내지 9,000 볼트, 1 볼트 내지 8,000 볼트, 1 볼트 내지 7,000 볼트, 1 볼트 내지 6,000 볼트, 1 볼트 내지 5,000 볼트, 1 볼트 내지 4,000 볼트, 1 볼트 내지 3,000 볼트, 1 볼트 내지 2,000 볼트, 1 볼트 내지 1,000 볼트, 또는 0.001 볼트 내지 10,000 볼트의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위이다. 일부 양태에서, 전기 펄스의 전압 크기는 0.001 볼트 내지 10,000 볼트, 0.01 볼트 내지 10,000 볼트, 0.1 볼트 내지 10,000 볼트, 1 볼트 내지 10,000 볼트, 1 볼트 내지 9,000 볼트, 1 볼트 내지 8,000 볼트, 1 볼트 내지 7,000 볼트, 1 볼트 내지 6,000 볼트, 1 볼트 내지 5,000 볼트, 1 볼트 내지 4,000 볼트, 1 볼트 내지 3,000 볼트, 1 볼트 내지 2,000 볼트, 1 볼트 내지 1,000 볼트, 또는 0.001 볼트 내지 10,000 볼트의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위이다. 일부 양태에서, 전기 펄스의 전압 크기는 100 볼트 내지 900 볼트, 100 볼트 내지 900 볼트의 임의의 값, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값이다.
[0151]
일부 양태에서, 샘플의 전도도는 전기천공 완충제의 이온 조성, 세포에 로딩되는 제제의 농도, 세포 밀도, 온도, 및 압력을 포함하는 매개변수의 함수이다. 일부 양태에서, 샘플의 전도도는 정확히, 적어도 또는 최대 0.01, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 또는 10 지멘스/미터, 또는 그로부터 유도가능한 임의의 범위 또는 값일 수 있다. 일부 양태에서, 샘플의 전도도는 최대 또는 적어도 약 0.01 지멘스/미터 내지 10 지멘스/미터, 0.01 지멘스/미터 내지 1 지멘스/미터, 0.1 지멘스/미터 내지 10 지멘스/미터, 0.1 지멘스/미터 내지 1 지멘스/미터, 1 지멘스/미터 내지 10 지멘스/미터, 또는 0.01 지멘스/미터 내지 10 지멘스/미터의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위이다. 일부 양태에서, 샘플의 전도도는 0.01 지멘스/미터 내지 10 지멘스/미터, 0.01 지멘스/미터 내지 1 지멘스/미터, 0.1 지멘스/미터 내지 10 지멘스/미터, 0.1 지멘스/미터 내지 1 지멘스/미터, 1 지멘스/미터 내지 10 지멘스/미터, 또는 0.01 지멘스/미터 내지 10 지멘스/미터의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위이다. 일부 양태에서, 샘플의 전도도는 1.0 내지 3.0 지멘스/미터, 1.0 지멘스/미터 내지 3.0 지멘스/미터의 임의의 값, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값이다.
[0152]
전기천공에 사용되는 완충제의 이온 조성은 세포 유형에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 혈청을 함유할 수 있는 PBS(포스페이트 완충된 염수 <30 옴) 및 HBSS(Hepes 완충제 <30 옴)와 같은 고전도성 완충제 또는 표준 배양 배지가 사용될 수 있다. 다른 완충제는 세포가 전기 펄스 직전에 물을 흡수하는 저삼투압 완충제를 포함하며, 이는 세포 팽윤을 야기할 수 있고 막이 더 쉽게 투과되도록 하면서 최적 투과 전압을 낮출 수 있다. 고저항 완충제(>3000 옴)의 사용을 필요로 하는 세포는 아킹 및 샘플 손실의 기회를 줄이기 위해 과도한 염 이온을 제거하기 위해 세포의 준비 및 세척을 필요로 할 수 있다. 전기천공 완충제의 이온 강도는 샘플의 저항에 직접적인 영향을 미치며, 이는 차례로 펄스 길이 또는 펄스의 시간 상수에 영향을 미친다. 전극과 접촉하는 액체의 부피는 또한 이온 용액에 대한 샘플 저항에 상당한 영향을 미치며, 샘플의 저항은 용액의 부피 및 pH에 반비례한다. 부피가 증가함에 따라 저항이 감소하여 아킹 및 샘플 손실의 가능성이 증가하는 반면, 부피를 낮추면 저항이 증가하고 아크 전위가 감소한다.
[0153]
제제의 크기 및 농도는 세포를 트랜스펙션하는데 사용되는 전기적 매개변수에 영향을 미칠 것이다. 더 작은 분자(예를 들어, siRNA 또는 miRNA)는 마이크로초 펄스 길이로 더 높은 전압을 필요로 할 수 있는 반면, 더 큰 분자(예를 들어, DNA 및 단백질)는 더 긴 펄스 길이로 더 낮은 전압을 필요로 할 수 있다. 전기천공 절차 동안 올리고뉴클레오티드의 농도는 약 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300 내지 약 350, 400, 500, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 또는 5000 μg/mL, 또는 0.01 μg/mL 내지 5000 μg/mL의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위일 수 있다. 특정 양태에서, 올리고뉴클레오티드의 농도는 적어도 1 μg/mL이다. 추가 양태에서, 올리고뉴클레오티드의 농도는 적어도, 최대, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 또는 300 μg/mL, 또는 1 μg/mL 내지 300 μg/mL의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위이다. 전기천공 절차 동안 폴리펩티드의 농도는 약 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300 내지 약 350, 400, 500, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 또는 5000 μg/mL, 또는 0.01 μg/mL 내지 5000 μg/mL의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위일 수 있다. 특정 양태에서, 폴리펩티드의 농도는 적어도 1 μg/mL이다. 추가 양태에서, 폴리펩티드의 농도는 적어도, 최대, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 또는 300 μg/mL, 또는 1 μg/mL 내지 300 μg/mL의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위이다.
[0154]
세포 밀도는 세포 크기와 관련될 수 있다. 일반적으로, 성공적인 세포막 투과를 위해 더 작은 세포 크기는 더 높은 전압을 필요로 하는 반면 더 큰 세포 크기는 더 낮은 전압을 필요로 한다.
[0155]
전기천공 동안 세포가 유지되는 온도는 전기천공의 효율에 영향을 미칠 수 있다. 고전압에서 펄스화되거나 다수의 펄스 및 긴 펄스 지속기간에 노출된 샘플은 샘플 가열을 야기할 수 있으며, 이는 세포 사멸 증가 및 트랜스펙션 효율 감소의 원인이 될 수 있다. 샘플을 더 낮은 온도에서 유지하면 세포 생존율 및 효율에 대한 과열의 영향을 감소시킬 수 있다. 일반적으로, 실온에서 세포에 사용되는 표준 펄스 전압은 세포막을 효과적으로 투과시키기 위해 4℃에서의 전기천공에 대해 대략 2배가 되어야 한다.
[0156]
일부 양태에서, 전기천공 챔버의 기하학적 구조는 전계 강도를 조정하기 위해 조정될 수 있다. 전계 강도는 전압을 갭 크기로 나누어 계산한다. 전기천공 챔버의 기하학적 구조는 전극 사이의 거리, 또는 "갭 크기"의 함수일 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 전기천공 챔버 내의 전극의 갭 크기는 전계 강도를 조정하기 위해 제어될 수 있다. 갭 크기를 증가시킴으로써, 전계 강도는 전압을 변화시키지 않고 증가될 수 있다. 원하는 전계 강도 및 갭 크기가 알려진 경우 전기천공을 달성하는데 필요한 전압을 도출하기 위해, 전계 강도(kV)에 갭 크기(cm)를 곱한다. 전기천공 챔버의 전극은 2개 이상의 "플레이트" 전극을 포함할 수 있다. 전극 플레이트는 알루미늄, 티타늄, 및 금을 포함하는 임의의 유용한 생체적합성 및 전도성 물질을 포함할 수 있다. 전극 플레이트는 본 개시에 의해 결정된 바와 같이 전기 펄스로 어드레싱될 수 있다. 전극은 1 내지 100개의 캐소드 및 1 내지 100개의 애노드의 어레이를 포함할 수 있고, 짝수개의 캐소드 및 애노드가 존재하여 양극 및 음극의 쌍을 형성한다. 플레이트는 일반적으로 대향 전극 사이의 거리 또는 갭보다 크거나, 갭 거리의 2배보다 큰 폭 치수를 포함할 수 있다.
[0157]
캐소드 및 애노드 전극은 전기천공 챔버가 적어도, 최대, 또는 약 0.001, 0.010, 0.020, 0.030, 0.040, 0.050, 0.060, 0.070, 0.080, 0.090, 0.100, 0.110, 0.120, 0.130, 0.140, 0.150, 0.160, 0.170, 0.180, 0.190, 0.200, 0.210, 0.220, 0.230, 0.240, 0.250, 0.260, 0.270, 0.280, 0.290, 0.300, 0.310, 0.320, 0.330, 0.340, 0.350, 0.360, 0.370, 0.380, 0.390, 0.400, 0.410, 0.420, 0.430, 0.440, 0.450, 0.460, 0.470, 0.480, 0.490, 0.500, 0.510, 0.520, 0.530, 0.540, 0.550, 0.560, 0.570, 0.580, 0.590, 0.600, 0.610, 0.620, 0.630, 0.640, 0.650, 0.660, 0.670, 0.680, 0.690, 0.700, 0.710, 0.720, 0.730, 0.740, 0.750, 0.760, 0.770, 0.780, 0.790, 0.800, 0.810, 0.820, 0.830, 0.840, 0.850, 0.860, 0.870, 0.880, 0.890, 0.900, 0.910, 0.920, 0.930, 0.940, 0.950, 0.960, 0.970, 0.980, 0.990, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 또는 10 cm, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값의 전극 갭 크기를 포함하도록 전기천공 챔버의 대향하는 내부 측면에 이격될 수 있다. 캐소드 및 애노드 전극은 전기천공 챔버가 최대 또는 적어도 약 0.001 cm 내지 10 cm, 0.001 cm 내지 1 cm, 0.01 cm 내지 10 cm, 0.01 cm 내지 1 cm, 0.1 cm 내지 10 cm, 0.1 cm 내지 1 cm, 1 cm 내지 10 cm, 또는 0.001 cm 내지 10 cm의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위의 전극 갭 크기를 포함하도록 전기천공 챔버의 대향하는 내부 측면에 이격될 수 있다. 도 5는 일부 양태에서, 전기천공 챔버(108) 주위에 위치하고 챔버(108) 내의 개스킷(130)을 둘러싸는 대향하는 알루미늄 전극 버스(120)에 의해 형성된 전기천공 챔버(108)를 도시하며; 전극 갭은 개스킷(130)의 두께를 포함하고, 개스킷의 두께는 대향하는 전극 버스(120) 사이에서 연장되는 개스킷(130)의 측면에 상응한다. 전기천공 챔버(108)가 전극 버스(120), 및 금-코팅된 플라스틱 필름(128)이 대향하는 전극 버스(120) 사이에 개재되도록 대향하는 전극 버스(120)와 마주 보게 위치한 금-코팅된 플라스틱 필름(128)에 의해 형성되는 양태에서, 전극 갭을 포함하는 개스킷의 두께는 전극 버스(120), 및 대향하는 전극 버스(120)와 마주 보게 위치한 금-코팅된 플라스틱 필름(128) 사이에서 연장되는 개스킷(130)의 측면에 상응한다. 일부 양태에서, 전기천공 챔버는 정확히, 적어도, 또는 최대 0.001, 0.010, 0.020, 0.030, 0.040, 0.050, 0.060, 0.070, 0.080, 0.090, 0.100, 0.110, 0.120, 0.130, 0.140, 0.150, 0.160, 0.170, 0.180, 0.190, 0.200, 0.210, 0.220, 0.230, 0.240, 0.250, 0.260, 0.270, 0.280, 0.290, 0.300, 0.310, 0.320, 0.330, 0.340, 0.350, 0.360, 0.370, 0.380, 0.390, 0.400, 0.410, 0.420, 0.430, 0.440, 0.450, 0.460, 0.470, 0.480, 0.490, 0.500, 0.510, 0.520, 0.530, 0.540, 0.550, 0.560, 0.570, 0.580, 0.590, 0.600, 0.610, 0.620, 0.630, 0.640, 0.650, 0.660, 0.670, 0.680, 0.690, 0.700, 0.710, 0.720, 0.730, 0.740, 0.750, 0.760, 0.770, 0.780, 0.790, 0.800, 0.810, 0.820, 0.830, 0.840, 0.850, 0.860, 0.870, 0.880, 0.890, 0.900, 0.910, 0.920, 0.930, 0.940, 0.950, 0.960, 0.970, 0.980, 0.990, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 또는 10 cm, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값일 수 있는 전극 갭을 포함한다. 일부 양태에서, 전기천공 챔버는 0.001 cm 내지 10 cm, 0.001 cm 내지 1 cm, 0.01 cm 내지 10 cm, 0.01 cm 내지 1 cm, 0.1 cm 내지 10 cm, 0.1 cm 내지 1 cm, 1 cm 내지 10 cm 또는 0.001 cm 내지 10 cm의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위의 전극 갭을 포함한다. 일부 양태에서, 전기천공 챔버는 0.01 cm 내지 1 cm, 0.01 cm 내지 1 cm의 임의의 값, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위의 전극 갭을 포함한다. 일부 양태에서, 전기천공 챔버는 0.4 cm 내지 1 cm, 0.4 cm 내지 1 cm의 임의의 값, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위의 전극 갭을 포함한다. 상기 애노드 및 캐소드의 각각의 쌍은 챔버 크기에 따라 부하 저항(옴 단위)으로 에너지를 공급받을 수 있다.
2.
전기 펄스 특성
[0158]
펄스 지속기간 또는 펄스 길이는 샘플이 전기 펄스에 노출되는 시간의 지속기간이며, 전형적으로 마이크로초 내지 밀리초 범위의 시간으로 측정된다. 펄스 길이는 전계 강도와 간접적으로 작용하여 기공 형성을 증가시키고 이에 따라 표적 분자의 흡수를 증가시킨다. 일반적으로, 전압의 증가 뒤에는 펄스 길이의 점진적인 감소가 온다. 전압을 낮추면 그 반대가 된다.
[0159]
본원에 기재된 샘플에 적용되는 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 펄스 지속기간은 약, 적어도 대략, 또는 최대 약 10-6, 10-5, 10-4, 10-3, 10-2, 10-1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10초, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값일 수 있다. 본원에 기재된 샘플에 적용되는 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 펄스 지속기간은 최대 약 또는 적어도 대략 10-6초 내지 10초, 10-6초 내지 1초, 10-3초 내지 10초, 10-3초 내지 1초, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값일 수 있다. 일부 양태에서, 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 펄스 지속기간은 10-6초 내지 10초, 10-6초 내지 1초, 10-3초 내지 10초, 10-3초 내지 1초이고, 또는 10-6초 내지 10초의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위이다. 일부 양태에서, 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 펄스 지속기간은 1 마이크로초 내지 100 밀리초, 1 마이크로초 내지 100 밀리초의 임의의 값, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위이다. 일부 양태에서, 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 펄스 지속기간은 6 마이크로초 내지 65 밀리초, 6 마이크로초 내지 65 밀리초의 임의의 값, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위이다.
[0160]
펄스 지속기간 이외에, 전기 펄스는 또한 펄스 수, 펄스 폭, 펄스 형상, 펄스 패턴, 및 펄스 극성을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 제1 및 제2 전기 펄스는 펄스 수, 펄스 폭, 펄스 형상, 펄스 패턴, 또는 펄스 극성과 관련된 특성을 추가로 포함한다.
[0161]
전기천공은 최대 트랜스펙션 효율을 달성하기 위해 본원에 개시된 바와 같이 단일 펄스 또는 다수의 펄스로서 수행될 수 있다. 일부 양태에서, 펄스 수는 정확히, 적어도, 또는 최대 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 또는 1000 펄스, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위일 수 있다. 일부 양태에서, 펄스 수는 최대 또는 적어도 1 펄스 내지 1000 펄스, 1 펄스 내지 900 펄스, 1 펄스 내지 800 펄스, 1 펄스 내지 700 펄스, 1 펄스 내지 600 펄스, 1 펄스 내지 500 펄스, 1 펄스 내지 400 펄스, 1 펄스 내지 300 펄스, 1 펄스 내지 200 펄스, 1 펄스 내지 100 펄스, 1 펄스 내지 90 펄스, 1 펄스 내지 80 펄스, 1 펄스 내지 70 펄스, 1 펄스 내지 60 펄스, 1 펄스 내지 50 펄스, 1 펄스 내지 40 펄스, 1 펄스 내지 30 펄스, 1 펄스 내지 20 펄스, 1 펄스 내지 10 펄스, 또는 1 펄스 내지 1000 펄스의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위일 수 있다. 일부 양태에서, 펄스 수는 1 펄스 내지 1000 펄스, 1 펄스 내지 900 펄스, 1 펄스 내지 800 펄스, 1 펄스 내지 700 펄스, 1 펄스 내지 600 펄스, 1 펄스 내지 500 펄스, 1 펄스 내지 400 펄스, 1 펄스 내지 300 펄스, 1 펄스 내지 200 펄스, 1 펄스 내지 100 펄스, 1 펄스 내지 90 펄스, 1 펄스 내지 80 펄스, 1 펄스 내지 70 펄스, 1 펄스 내지 60 펄스, 1 펄스 내지 50 펄스, 1 펄스 내지 40 펄스, 1 펄스 내지 30 펄스, 1 펄스 내지 20 펄스, 또는 1 펄스 내지 10 펄스, 또는 1 펄스 내지 1000 펄스의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위이다. 일부 양태에서, 펄스 수는 1 내지 130 펄스, 1 내지 130 펄스의 임의의 값, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위이다.
[0162]
펄스 폭은 전기천공 시스템의 펄스 발생기에 의해 생성된 파형에 의존한다. 펄스 형상 또는 파형은 일반적으로 구형파 또는 지수 감쇠파의 두 가지 범주로 분류된다. 구형파 펄스는 설정 전압 레벨로 빠르게 상승하고 설정된 펄스 길이의 지속기간 동안 이 레벨을 유지한 후 빠르게 꺼진다. 일부 양태에서, 펄스 발생기는 구형파 펄스를 생성하고, 펄스 폭은 직접 입력될 수 있다. 지수 감쇠파는 커패시터가 완전히 방전되도록 함으로써 전기 펄스를 생성한다. 펄스가 샘플로 방전되고, 전압은 설정된 피크 전압으로 빠르게 상승한 다음 시간이 지남에 따라 감소한다. 일부 양태에서, 펄스 발생기는 지수 감쇠파 펄스를 생성하고, 펄스 폭은 지수 감쇠율의 함수이다.
[0163]
지수 감쇠파 시스템에서 펄스 폭은 시간 상수에 상응하며, 펄스 에너지 또는 전압이 원래 설정 전압의 1/3로 감쇠되는 속도를 특징으로 한다. 시간 상수는 지수 감쇠의 저항 및 커패시턴스 값을 조정함으로써 수정되고, 시간에 대한 계산은 T = RC이며, 여기서 T는 시간이고 R은 샘플의 저항이고 C는 전기천공 시스템 파워 서플라이의 커패시턴스이다. 따라서, 일부 양태에서, 지수 감쇠율은 샘플의 저항 및 전기천공을 수행하는데 사용되는 파워 서플라이의 커패시턴스의 함수이다.
[0164]
샘플의 저항은 정확히, 적어도, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900, 6000, 6100, 6200, 6300, 6400, 6500, 6600, 6700, 6800, 6900, 7000, 7100, 7200, 7300, 7400, 7500, 7600, 7700, 7800, 7900, 8000, 8100, 8200, 8300, 8400, 8500, 8600, 8700, 8800, 8900, 9000, 9100, 9200, 9300, 9400, 9500, 9600, 9700, 9800, 9900, 또는 10000 옴, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값일 수 있다. 샘플의 저항은 최대 또는 적어도 1 옴 내지 10000 옴, 1 옴 내지 9000 옴, 1 옴 내지 8000 옴, 1 옴 내지 7000 옴, 1 옴 내지 6000 옴, 1 옴 내지 5000 옴, 1 옴 내지 4000 옴, 1 옴 내지 3000 옴, 1 옴 내지 2000 옴, 1 옴 내지 1000 옴, 1 옴 내지 900 옴, 1 옴 내지 800 옴, 1 옴 내지 700 옴, 1 옴 내지 600, 옴, 1 옴 내지 500 옴, 1 옴 내지 400 옴, 1 옴 내지 300 옴, 1 옴 내지 200 옴, 1 옴 내지 100 옴, 1 옴 내지 90 옴, 1 옴 내지 80 옴, 1 옴 내지 70 옴, 1 옴 내지 60 옴, 1 옴 내지 50 옴, 1 옴 내지 40 옴, 1 옴 내지 30 옴, 1 옴 내지 20 옴, 1 옴 내지 10 옴, 또는 1 옴 내지 10000 옴의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위일 수 있다. 일부 양태에서, 샘플의 저항은 1 옴 내지 10000 옴, 1 옴 내지 9000 옴, 1 옴 내지 8000 옴, 1 옴 내지 7000 옴, 1 옴 내지 6000 옴, 1 옴 내지 5000 옴, 1 옴 내지 4000 옴, 1 옴 내지 3000 옴, 1 옴 내지 2000 옴, 1 옴 내지 1000 옴, 1 옴 내지 900 옴, 1 옴 내지 800 옴, 1 옴 내지 700 옴, 1 옴 내지 600 옴, 1 옴 내지 500 옴, 1 옴 내지 400 옴, 1 옴 내지 300 옴, 1 옴 내지 200 옴, 1 옴 내지 100 옴, 1 옴 내지 90 옴, 1 옴 내지 80 옴, 1 옴 내지 70 옴, 1 옴 내지 60 옴, 1 옴 내지 50 옴, 1 옴 내지 40 옴, 1 옴 내지 30 옴, 1 옴 내지 20 옴, 1 옴 내지 10 옴, 또는 1 옴 내지 10000 옴의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위이다. 일부 양태에서, 샘플의 저항은 1 옴 내지 1000 옴, 1 옴 내지 1000 옴의 임의의 값, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위이다.
[0165]
파워 서플라이 커패시턴스는 정확히, 적어도, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900, 6000, 6100, 6200, 6300, 6400, 6500, 6600, 6700, 6800, 6900, 7000, 7100, 7200, 7300, 7400, 7500, 7600, 7700, 7800, 7900, 8000, 8100, 8200, 8300, 8400, 8500, 8600, 8700, 8800, 8900, 9000, 9100, 9200, 9300, 9400, 9500, 9600, 9700, 9800, 9900, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000, 20000, 21000, 22000, 23000, 24000, 25000, 26000, 27000, 28000, 29000, 30000, 31000, 32000, 33000, 34000, 35000, 36000, 37000, 38000, 39000, 40000, 41000, 42000, 43000, 44000, 45000, 46000, 47000, 48000, 49000, 50000, 51000, 52000, 53000, 54000, 55000, 56000, 57000, 58000, 59000, 60000, 61000, 62000, 63000, 64000, 65000, 66000, 67000, 68000, 69000, 70000, 71000, 72000, 73000, 74000, 75000, 76000, 77000, 78000, 79000, 80000, 81000, 82000, 83000, 84000, 85000, 86000, 87000, 88000, 89000, 90000, 91000, 92000, 93000, 94000, 95000, 96000, 97000, 98000, 99000, 100000, 110000, 120000, 130000, 140000, 150000, 160000, 170000, 180000, 190000, 200000, 210000, 220000, 230000, 240000, 250000, 260000, 270000, 280000, 290000, 300000, 310000, 320000, 330000, 340000, 350000, 360000, 370000, 380000, 390000, 400000, 410000, 420000, 430000, 440000, 450000, 460000, 470000, 480000, 490000, 500000, 510000, 520000, 530000, 540000, 550000, 560000, 570000, 580000, 590000, 600000, 610000, 620000, 630000, 640000, 650000, 660000, 670000, 680000, 690000, 700000, 710000, 720000, 730000, 740000, 750000, 760000, 770000, 780000, 790000, 800000, 810000, 820000, 830000, 840000, 850000, 860000, 870000, 880000, 890000, 900000, 910000, 920000, 930000, 940000, 950000, 960000, 970000, 980000, 990000, 또는 1000000 μF, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값일 수 있다. 파워 서플라이 커패시턴스는 최대 또는 적어도 1 μF 내지 1,000,000 μF, 1 μF 내지 100,000 μF, 1 μF 내지 10,000 μF, 1 μF 내지 1,000 μF, 1 μF 내지 100 μF, 또는 1 μF 내지 1,000,000 μF의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위일 수 있다. 일부 양태에서, 파워 서플라이 커패시턴스는 1 μF 내지 1,000,000 μF, 1 μF 내지 100,000 μF, 1 μF 내지 10,000 μF, 1 μF 내지 1,000 μF, 1 μF 내지 100 μF, 또는 1 μF 내지 1,000,000 μF의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위이다. 일부 양태에서, 파워 서플라이 커패시턴스는 1000 μF 내지 5000 μF, 1000 μF 내지 5000 μF의 임의의 값, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위이다.
[0166]
일부 양태에서, 펄스 패턴은 제1 및/또는 제2 펄스의 지속기간에 상응하는 단일 펄스를 포함한다. 일부 양태에서, 펄스 패턴은 다수의 펄스를 포함하고, 다수의 펄스의 조합된 지속기간은 제1 및/또는 제2 펄스의 지속기간에 상응한다. 따라서, 일부 양태에서, 펄스 지속기간은 다수의 펄스의 부가 효과의 결과이다.
[0167]
본원에 기재된 샘플에 적용될 수 있는 제1 및 제2 전기 펄스의 극성은 포지티브 또는 네거티브일 수 있다. 일부 양태에서, 제1 및 제2 펄스의 극성은 포지티브이다. 일부 양태에서, 제1 및 제2 펄스의 극성은 네거티브이다. 일부 양태에서, 제1 펄스의 극성은 포지티브이고, 제2 펄스의 극성은 네거티브이다. 일부 양태에서, 제1 펄스의 극성은 네거티브이고, 제2 펄스의 극성은 포지티브이다.
[0168]
특정 양태에서, 전기부하는 미국특허 번호 5,612,207(구체적으로 본원에 참조로 포함됨), 미국특허 번호 5,720,921(구체적으로 본원에 참조로 포함됨), 미국 특허 번호 6,074,605(구체적으로 본원에 참조로 포함됨); 미국 특허 번호 6,090,617(구체적으로 본원에 참조로 포함됨); 미국 특허 번호 6,485,961(구체적으로 본원에 참조로 포함됨); 미국 특허 번호 7,029,916(구체적으로 본원에 참조로 포함됨), 미국 특허 번호 7,141,425(구체적으로 본원에 참조로 포함됨), 미국 특허 번호 7,186,559(구체적으로 본원에 참조로 포함됨), 미국 특허 번호 7,771,984(구체적으로 본원에 참조로서 포함됨), 및/또는 미국 공개 번호 2011/0065171(구체적으로 본원에 참조로 포함됨)에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
[0169]
본 개시의 맥락에서 사용될 수 있는 전기부하를 위한 다른 방법 및 장치는 또한, 예를 들어, 공개된 PCT 출원 번호 WO 03/018751 및 WO 2004/031353; 미국 특허 출원 일련 번호 2004/0214333 및 2004/0115784; 및 미국 특허 번호 6,773,669, 6,090,617, 6,617,154, 및 7,029,916에 개시되어 있으며, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다.
[0170]
본 개시의 특정 양태에서, 전기천공은 2006년 11월 28일에 등록된 미국 특허 번호 7,141,425에 개시되어 있으며, 이의 전체 개시는 본원에 참조로 구체적으로 포함된다.
II.
대표적인 전기천공 장치의 설명
[0171]
도 48에 도시된 바와 같이, 본 개시의 일부 양태는 또한 프로세서(808)에 의해 실행될 때, 프로세서(808)가 본원에 기재된 임의의 방법을 실행하게 하는 명령을 포함(예를 들어, 저장)하는 비일시적 컴퓨터 판독 가능 매체(예를 들어, 하나 이상의 저장 장치, 804) 및 장치(예를 들어, 제어기, 800)를 포함하는 전기천공 시스템(300)을 포함할 수 있다.
[0172]
제어기(800)는 전기천공 시스템(300)의 하나 이상의 다른 구성요소에 물리적으로 또는 무선으로 커플링될 수 있고, 하나 이상의 사용자-개시 또는 자동 명령어 또는 매개변수를 통해 전기천공 시스템(300)의 작동을 제어하도록 구성될 수 있다. 제어기(800)는 프로세서(808)(예를 들어, 마이크로컨트롤러/마이크로프로세서, 중앙 처리 장치(CPU), 필드-프로그래밍 게이트 어레이(FPGA) 장치, 특정 용도용 집적 회로(ASIC), 다른 하드웨어 장치, 펌웨어 장치, 또는 이들의 임의의 조합) 및 명령, 하나 이상의 데이터 세트 등을 저장하도록 구성된(및 저장하는) 비일시적 컴퓨터 판독 가능 매체(예를 들어, 메모리)(804)를 포함할 수 있다. 비일시적 컴퓨터 판독 가능 매체는 전자, 자기, 또는 광학 매체와 같은 임의의 유형의(tangible) 또는 비일시적 저장 매체 또는 메모리 매체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "유형의" 및 "비일시적"은 전자기 신호 전파를 제외한 비일시적 컴퓨터 판독 가능 매체(예를 들어, 메모리)를 설명하기 위한 것이지만, 비일시적 컴퓨터-판독 가능 매체 또는 메모리라는 어구에 포함되는 컴퓨터-판독 가능한 물리적 저장 장치의 타입을 달리 제한하려는 의도가 아니다. 예를 들어, 용어 "비일시적 컴퓨터-판독 가능 매체" 또는 "유형의 메모리"는, 예를 들어, 랜덤 액세스 메모리(RAM)를 포함하는 정보를 반드시 영구적으로 저장할 필요가 없는 저장 장치의 타입을 포함하는 것으로 의도된다. 유형의 컴퓨터-액세스 가능한 저장 매체에 비일시적인 형태로 저장된 프로그램 명령 및 데이터는 네트워크 및/또는 무선 링크와 같은 통신 매체를 통해 전달될 수 있는 전기, 전자기, 또는 디지털 신호와 같은 신호 또는 전송 매체에 의해 추가로 전송될 수 있다.
[0173]
메모리의 명령은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 동작 또는 기능을 수행하거나 개시하기 위해 프로세서(808)에 의해 실행될 수 있다. 일부 양태에서, 제어기(800)는 하나 이상의 인터페이스(들), 하나 이상의 I/0 장치(들), 전원, 하나 이상의 센서(들), 신호 발생기(예를 들어, RF 발생기), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제어기(800)는 사용자가 전기천공 시스템(300)의 작동을 제어하기 위해 정보(예를 들어, 원하는 프로토콜)를 입력할 수 있는 I/O 장치를 포함할 수 있다.
[0174]
이제 도 49를 참조하면, 도 48에 도시된 전기천공 시스템(300)을 사용하여 구현될 수 있는, 샘플에 2개 이상의 전기 펄스를 가하기 위한 본 방법의 양태(900)가 도시되어 있다. 도시된 양태에서, 단계 904에서, 전기천공 시스템(300)의 비일시적 컴퓨터 판독 가능 매체(804)는 프로세서(808)에 의해 실행될 때, 프로세서(808)가 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스와 관련된 제1 프로토콜을 선택하게 하는 명령을 포함한다. 단계 908에서, 이러한 양태에서, 제어기(800)는 제1 프로토콜에 의해 정의된 제1 전기 펄스의 전류를 생성하고 이를 하나 이상의 온전한 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 포함하는 샘플을 통해 보내도록 전기천공 시스템(300)을 제어하고, 제1 전기 펄스는 제1 프로토콜에 따른 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분하다. 선택적으로, 단계 908 후, 샘플은 적어도, 최대, 또는 약 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102, 108, 114, 또는 120시간, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값 동안 배양물에서 회복된다. 일부 양태에서, 단계 908 후, 샘플은 최대 또는 적어도 6시간 내지 120시간, 6시간 내지 96시간, 6시간 내지 72시간, 6시간 내지 48시간, 6시간 내지 24시간, 6시간 내지 12시간, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값 동안 배양물에서 회복된다. 단계 912에서, 이러한 양태에서, 전기천공 시스템(300)의 비일시적 컴퓨터 판독 가능 매체(804)는 프로세서(808)에 의해 실행될 때, 프로세서(808)가 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스와 관련된 제2 프로토콜을 선택하게 하는 명령을 포함한다. 단계 916에서, 이러한 양태에서, 제어기(800)는 제2 프로토콜에 의해 정의된 제2 전기 펄스의 전류를 생성하고 이를 하나 이상의 온전한 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 포함하는 샘플을 통해 보내도록 전기천공 시스템(300)을 제어한다. 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간은 제2 전계 강도 및/또는 제2 펄스 지속기간과 상이하며, 하나 이상의 온전한 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 포함하는 샘플에 제2 프로토콜에 따른 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제2 전기 펄스를 가한다.
[0175]
일부 양태에서, 전기천공 시스템(300)은 전류를 생성하고 이를 세포 용액을 통해 보내도록 제어기(800)에 의해 제어될 수 있다. 일부 양태에서, 현재의 방법은 정적 전기천공 장치를 사용한다. 일부 양태에서, 현재의 방법은 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 조직, 또는 이들의 유도체의 현탁액의 전기적 자극을 위한 전류를 생성하기 위해 제어기(800)에 의해 제어될 수 있는 유동 전기천공 장치를 사용하며, 유동 전기천공 장치는 하나 이상의 입구 흐름 포털, 하나 이상의 출구 흐름 포털, 및 하나 이상의 흐름 채널을 갖고, 흐름 채널은 2개 이상의 벽으로 구성되고, 흐름 채널은 입구 흐름 포털로부터 현탁액 중의 입자의 연속 흐름을 수용하고 일시적으로 함유하도록 추가로 구성되고; 쌍을 이루는 전극은 각각의 전극이 흐름 채널의 적어도 하나의 벽을 형성하도록 흐름 채널과 관련하여 배치되고, 전극은 전기 에너지원과 전기적으로 소통하도록 전극을 배치하는 것을 추가로 포함하며, 이에 의해 채널을 통해 흐르는 현탁액이 전극 사이에 형성된 전기장으로 처리될 수 있다.
[0176]
일부 양태에서, 유동 전기천공은 MaxCyte STX®, MaxCyte VLX®, 또는 MaxCyte GT® 유동 전기천공 기기를 사용하여 수행된다. 일부 양태에서, 유동 전기천공은 MaxCyte ExPERT STx®, MaxCyte ExPERT ATx®, MaxCyte ExPERT GTx®, 또는 MaxCyte ExPERT VLx™을 사용하여 수행된다. 특정 양태에서, 정적 또는 유동 전기천공은 본 개시 전체에 걸쳐 기재된 매개변수와 함께 사용된다.
[0177]
일부 양태에서, 유동 전기천공의 사용은 전기천공될 수 있는 세포의 수, 이들이 전기천공될 수 있는 시간, 및 정적 또는 배치 전기천공 방법에 사용되는 이들이 현탁된 용액의 부피에 관한 실질적인 한계를 극복하는데 도움이 될 수 있다. 이 방법으로, 세포 현탁액은 일회용일 수 있는 플로우 셀에 함유된 평행 막대 전극을 통과한다. 상이한 구성의 플로우 셀이 본 개시에서 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 이 통과 동안, 세포에 미리 결정된 특성을 갖는 전기 펄스가 가해진다. 이후, 관심 분자는 농도 및/또는 전기적 구배에 따라 세포 내로 확산된다. 또한, 림프구 집단은 5시간 미만, 바람직하게는 4시간 미만, 보다 바람직하게는 3시간 미만, 및 가장 바람직하게는 2시간 미만 내에 샘플을 전기천공함으로써 트랜스펙션될 수 있다. 전기천공 시간은 샘플이 유동 전기천공 과정에 의해 처리되는 시간이다. 특정 양태에서, 1E10 세포는 유동 전기천공을 사용하여 30분 이내에 트랜스펙션된다. 추가의 양태에서, 2E11 세포는 유동 전기천공을 사용하여 30분 또는 60분 이내에 트랜스펙션될 수 있다.
[0178]
유동 전기천공 과정은, 예를 들어, (예를 들어, 튜빙을 통해) 용기 내에 용액 및 세포 현탁액과 유체 소통하는 전기천공 챔버를 배치함으로써 개시될 수 있고, 이는 무균 또는 멸균 환경에서 수행될 수 있다. 세포 현탁액 및/또는 다른 시약은 하나 이상의 펌프, 진공, 밸브, 전기천공 챔버 내부의 공기 압력 또는 부피를 변화시키는 다른 기계적 장치 및 이들의 조합을 사용하여 전기천공 챔버에 도입될 수 있고, 이들은 세포 현탁액 및/또는 다른 시약을 원하는 시간 및 원하는 속도로 전기천공 챔버로 흐르게 할 수 있다. 세포 현탁액 및/또는 다른 시약의 일부가 전기천공 챔버에 위치하는 경우, 원하는 전압, 지속기간, 및/또는 간격의 전기 펄스가 세포 현탁액 및/또는 다른 시약에 인가된다. 전기천공 후, 처리된 세포 현탁액 및/또는 다른 시약은 전기천공 챔버 내부의 변위, 압력 또는 부피를 변화시키는 하나 이상의 펌프, 진공, 밸브, 다른 전기적, 기계적, 공압, 또는 미세유체 장치, 및 이들의 조합을 사용하여 전기천공 챔버로부터 제거될 수 있다. 특정 양태에서, 중력 또는 수동 이동을 사용하여 샘플 또는 처리된 샘플을 전기천공 챔버 내로 또는 밖으로 이동시킬 수 있다. 원하는 경우, 새로운 세포 현탁액 및/또는 다른 시약이 전기천공 챔버에 도입될 수 있다. 전기천공된 샘플은 아직 전기천공되지 않은 샘플과 별도로 수집될 수 있다. 선행하는 일련의 이벤트는, 예를 들어, (예를 들어, 전기 펄스를 제공하는) 전자 회로, 펌프, 진공, 밸브, 이들의 조합, 및 전기천공 챔버 내로 및 밖으로 샘플의 흐름에 영향을 주고 제어하는 다른 구성요소에 연결된 컴퓨터에 의해 일시적으로 조정될 수 있다. 예로서, 전기천공 과정은 스크린(예를 들어, 모니터) 및/또는 키보드 상의 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 작업자를 포함하는 컴퓨터에 의해 구현될 수 있다. 적합한 밸브의 예는 핀치 밸브, 버터플라이 밸브, 및/또는 볼 밸브를 포함한다. 적합한 펌프의 예는 원심 또는 용적식 펌프를 포함한다.
[0179]
예로서, 유동 전기천공 장치는 스페이서에 의해 분리된 적어도 2개의 전극을 포함할 수 있고, 여기서 스페이서 및 적어도 2개의 전극은 챔버를 정의한다. 일부 양태에서, 전기천공 챔버는 스페이서를 가로지르는 적어도 3개의 포트를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 제1 포트는 챔버로의 샘플 흐름을 위한 것이고, 제2 포트는 챔버 밖으로의 처리된 샘플 흐름을 위한 것이고, 제3 포트는 챔버 내로 또는 밖으로의 비-샘플 유체 흐름을 위한 것이다. 일부 양태에서, 비-샘플 유체는 샘플이 챔버 내로 흐를 때 챔버 밖으로 흐르고, 비-샘플 유체는 처리된 샘플이 챔버 밖으로 흐를 때 챔버 내로 흐른다. 또 다른 예로서, 유동 전기천공 장치는 적어도 2개의 평행한 전극을 포함하는 상부 및 하부 부분을 갖는 전기천공 챔버를 포함할 수 있고, 상기 챔버는 2개의 전극 사이에 형성되고 전기천공 챔버의 바닥 부분에 2개의 챔버 포트 및 전기천공 챔버의 상단 부분에 2개의 챔버 포트를 갖는다. 이러한 장치는 챔버의 바닥 부분에서 제1 챔버 포트를 통해 전기천공 챔버와 유체 소통하는 적어도 하나의 샘플 용기를 추가로 포함할 수 있고, 전기천공 챔버는 챔버의 상단 부분에서 제2 챔버 포트를 통해 샘플 용기와 유체 소통하여, 제1 유체 경로를 형성할 수 있다. 또한, 적어도 하나의 생성물 용기는 챔버의 바닥 부분에서 제3 챔버 포트를 통해 전기천공 챔버와 유체 소통할 수 있고, 전기천공 챔버는 챔버의 상단 부분에서 제4 챔버 포트를 통해 생성물 용기와 유체 소통하여, 제2 유체 경로를 형성할 수 있다. 일부 양태에서, 단일 포트 전기천공 챔버가 사용될 수 있다. 다른 양태에서, 전극, 스페이서, 포트, 및 용기의 다양한 다른 적합한 조합이 사용될 수 있다. 전기천공 챔버는 약 1-10 mL의 내부 부피를 포함할 수 있고; 그러나, 다른 양태에서, 전기천공 챔버는 더 적은 내부 부피(예를 들어, 0.75 mL, 0.5 mL, 0.25 mL, 또는 그 미만) 또는 더 큰 내부 부피(예를 들어, 15 mL, 20 mL, 25 mL, 또는 그 초과)를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 전기천공 챔버 및 관련 구성요소는 일회용(예를 들어, 의료 등급 클래스 VI 물질), 예를 들어, PVC 백, PVC 튜빙, 커넥터, 실리콘 펌프 튜빙 등일 수 있다.
[0180]
임의의 수의 용기(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상)가 전기천공 챔버와 유체 소통할 수 있다. 용기는 접을 수 있거나, 확장 가능하거나, 고정 부피 용기일 수 있다. 예를 들어, 제1 용기(예를 들어, 샘플 공급원 또는 샘플 용기)는 세포 현탁액을 포함할 수 있고, 전기천공 동안 세포 현탁액에서 세포 내로 통과할 물질을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 상기 물질이 포함되지 않은 경우, 이 물질을 포함하는 제2 용기를 포함시켜 물질은 전기천공 챔버 내로 또는 전기천공 챔버에서의 진입 전에 인라인으로 혼합될 수 있다. 추가 구성에서, 폐기될 유체를 보유할 수 있는 또 다른 용기가 부착될 수 있다. 하나 이상의 추가 용기가 처리된 샘플 또는 생성물 용기로서 사용될 수 있다. 처리된 샘플 또는 생성물 용기는 전기천공 과정으로부터 생산된 세포 또는 다른 생성물을 보유할 것이다. 또한, 하나 이상의 추가 용기는 샘플을 개별 부피 또는 단위 부피로 분리하는데 사용될 수 있는 다양한 비-샘플 유체 또는 가스를 포함할 수 있다. 비-샘플 유체 또는 가스 용기는 제3 및/또는 제4 포트를 통해 전기천공 챔버와 유체 소통할 수 있다. 비-샘플 유체 또는 가스 용기는 처리된 샘플 용기 또는 샘플 용기에 혼입될 수 있고(예를 들어, 비-샘플 유체 용기는 처리된 샘플 용기 또는 샘플 용기의 일부를 포함할 수 있음); 따라서, 비-샘플 유체 또는 가스는 샘플의 처리 동안 처리된 샘플 용기로부터 다른 용기(샘플 용기를 포함할 수 있음)로 옮겨질 수 있다. 비-샘플 유체 또는 가스 용기는 비-샘플 유체 또는 가스의 압축이 전기천공에 영향을 미치지 않는 한, 챔버에 혼입될 수 있다. 본 개시의 추가 양태는 샘플 용기에 결합되어 시약 또는 다른 샘플을 챔버에 공급할 수 있는 다른 용기를 포함할 수 있다.
[0181]
본 개시와 함께 사용될 수 있는 유동 전기천공 장치는, 일 양태에서, 다음으로 구성된다: 전기천공 과정을 실시간으로 실행하고 전기천공 과정-관련 데이터 및 그래픽 사용자 인터페이스를 표시하고 사용자 상호작용을 가능하게 하는 모니터(예를 들어, 모바일 장치 또는 책상, 테이블, 카트 등에서 사용하도록 설계된 장치의 일부일 수 있음)를 관리하기 위해 전자 모듈과 통신하는 컴퓨터를 갖는 전기천공 시스템. 작업자는 원하는 전압 및 다른 매개변수를 유동 전기천공 시스템에 입력한다. 상기 언급된 바와 같이, 다양한 설정이 선택적으로 이용 가능하다. 컴퓨터는 전자 모듈과 통신하여 커패시터 뱅크를 원하는 전압으로 충전한다. 이후, 적절한 스위치는 전압이 흐름 경로에 전달되어 전기장을 생성하기 전에 전압을 조작한다. 스위치는 전기장에 장기간 노출되어 발생하는 전극 마모를 최소화하기 위해 교대 펄스 또는 버스트를 제공한다. 전압은 설정된 지속기간 및 빈도 매개변수에 따라 작동자에 의해 유동 전기천공 시스템으로 전달된다. 유동 전기천공 시스템의 예의 세부사항은 미국 특허 번호 7,186,559에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
[0182]
본 발명의 전기천공 시스템 및 방법은 또한 전기천공 시스템으로의 전달을 위한 처리 조립체, 트레이, 개스킷, 도킹 스테이션, 랙, 및 용기를 포함할 수 있다.
[0183]
도 1-10은 본 개시의 양태에 따른 처리 조립체(100)를 예시한다. 처리 조립체(100)는 전기천공 시스템 및 장치에서의 사용을 위해 제공될 수 있다. 처리 조립체(100)는 하우징(102) 및 챔버(108)에 대한 개구(106)를 덮는 덮개(104)를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 챔버(108)는 처리 조립체(100)가 호환될 수 있는 전기천공 시스템 또는 장치에 제공될 수 있는 샘플, 배양물, 액체 배지 등을 수용할 수 있다.
[0184]
덮개(104)는 덮개(104)가 개구(106)를 덮고 하우징(102)에 연결되는 폐쇄 위치(도 1)와 덮개가 개구(106)로부터 멀리 힌지 연결되어 개구(106)를 노출시키는 개방 위치(도 2) 사이에서 이동할 수 있게 하는 하우징(102)에 대한 힌지 연결부(110)를 가질 수 있다. 덮개(104)의 힌지 연결부(110)는 처리 조립체(100)의 개선된 취급 및 사용 용이성을 제공할 수 있다. 폐쇄 위치에서, 덮개(104)는 처리 조립체(100)의 오염을 방지할 수 있다. 일부 양태에서, 덮개(104)는 힌지 연결부(110)에 대해 180°까지 회전할 수 있고 하우징(102)에 연결될 수 있다. 일부 양태에서, 덮개(104)는 덮개(104)가 하우징(102)에 클립 고정되는 억지 끼워맞춤(interference fit)을 통해 하우징(102)에 연결될 수 있다. 예를 들어, 억지 끼워맞춤은 폐쇄 위치의 연결부(109) 및 개방 위치의 연결부(111)에서 덮개(104)를 하우징(102)에 연결할 수 있다. 억지 끼워맞춤은 덮개(104)가 닫힐 때 챔버(108) 내의 웰을 가로질러 단단한 밀봉을 유지할 수 있다. 덮개(104)는 개구(106)에 연결되어 이를 덮고 오염되지 않은 밀봉을 유지할 수 있는 윤곽 표면(112)을 추가로 포함할 수 있다.
[0185]
처리 조립체(100)는 챔버(108) 주위에 위치된 알루미늄 전극 버스(120)를 추가로 포함할 수 있고, 챔버(108) 내의 개스킷(예를 들어, 개스킷(130))을 둘러쌀 수 있다. 하우징(102)은 하우징(102)을 형성하기 위해 서로 연결되는 좌측 핸들(122) 및 우측 핸들(124)을 포함할 수 있다. 좌측 핸들(122) 및 우측 핸들(124)은 서로 대향하여 위치될 수 있고 좌측 핸들(122)과 우측 핸들(124)을 연결할 수 있는 핀(125)에 의해 이격될 수 있다. 일부 양태에서, 전극 버스(120)는 우측 핸들(124) 주위를 감쌀 수 있다. 다른 양태에서, 전극 버스(120)는 금-코팅된 플라스틱 필름(128) 맞은편에 있는 챔버(108)의 한 측면에 위치될 수 있다.
[0186]
처리 조립체(100)는 좌측 핸들(122)과 우측 핸들(124) 사이에 수용될 수 있고 전극 버스(120) 및 프레임 개스킷(130)과 마주 보게 위치될 수 있는 금-코팅된 플라스틱 필름(128)을 추가로 포함할 수 있다. 금-코팅된 플라스틱 필름(128)은 크기에 맞게 다이 절단되고 처리 조립체(100)에 설치될 수 있는 플라스틱 필름의 큰 롤 상에 진공 증착된 금을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 금-코팅된 필름(128), 알루미늄 전극 버스(120), 및 접착제 층 롤이 결합될 수 있다.
[0187]
처리 조립체(100)는 챔버(108)에 수용될 수 있는 개스킷(130) 및 플라스틱 스페이서를 포함할 수 있다. 개스킷(130)은 하기에 더 상세히 설명되는 바와 같이 여러 형상 및 크기 중 적어도 하나를 취할 수 있다. 예를 들어, 개스킷(130)은 특히, 1000 μL, 400 μL, 100 μL, 100 μL x 2, 50 μL x 3, 및 25 μL x 3 이형으로 크기 조정된 샘플을 포함하는 다양한 크기의 샘플을 수용하도록 크기 조정될 수 있다. 일부 양태에서, 개스킷(130)은 실리콘 고무 또는 다른 가요성 재료로 제조될 수 있다. 처리 조립체(100)는 처리 조립체(100)가 임의의 수의 크기 조정된 개스킷(130)에 사용될 수 있도록 본원에 기재된 개스킷 크기 및 배열 중 임의의 하나와 함께 사용되도록 구성될 수 있다.
[0188]
처리 조립체(100)는 전극 버스(120)로부터 멀리 하우징(102) 주위로 연장되는 장치 라벨(140)을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 장치 라벨(140)은 고유한 제품 일련 번호, 크기, 설명서, 로고 등을 포함할 수 있다. 일부 양태는 또한 처리 조립체(100)의 끝 부분에 기록 공간(141)을 제공할 수 있다.
[0189]
처리 조립체는 챔버(108) 및 개스킷(130) 내의 샘플의 증가된 부피 범위, 개선된 사용 용이성, 및 세포 회복 및 일관된 성능의 개선을 포함하는 여러 이점을 제공할 수 있다. 일부 양태에서, 금-코팅된 플라스틱 필름(128)은 제조 비용 감소를 제공할 수 있고, 다양한 개스킷을 사용하여, 25-1000 μL, 예를 들어, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 또는 1000 μL, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값의 반응 부피를 허용할 수 있다.
[0190]
도 9 및 10은 처리 조립체(100)가 개방 위치의 덮개(104)를 갖는 개구(106)를 통해 챔버(108) 내로 삽입될 수 있는 로딩 장치(144)를 통해 충전되도록 구성될 수 있음을 도시한다. 로딩 장치(144)는 전기천공 시스템에서의 시험 또는 처리를 위해 챔버(108)를 샘플로 채울 수 있다. 로딩 장치(144)가 샘플을 챔버(108)에 제공한 후, 로딩 장치(144)는 제거될 수 있고, 덮개(104)는 샘플의 오염을 방지하기 위해 닫힐 수 있다.
[0191]
도 11-13은 또한 하나 이상의 트레이(160)를 제공할 수 있는 본 개시의 양태를 예시한다. 트레이(160)는 트레이(106)를 가로질러 이격된 슬롯(162)에 하나 이상의 처리 조립체(예를 들어, 처리 조립체(100) 또는 다른 처리 조립체)를 수용할 수 있다. 일부 양태에서, 트레이(160)는 직사각형 형상일 수 있고, 각각의 슬롯(160)은 다른 슬롯(160)에 평행하게 배열될 수 있다. 다른 양태에서, 트레이(160)는 곡선형, 원형, 또는 반원형일 수 있고, 트레이(160) 주위에 방사형 패턴으로 배열된 슬롯(160)을 가질 수 있다.
[0192]
트레이(160)는 처리 조립체를 수용하기 위한 하나 이상의 위치를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 트레이는 제1 위치 및 제2 위치가 사용자로 하여금 트레이(160)에 배치된 처리 조립체의 상태(예를 들어, 완료 대 미완료, 시험 대 미시험, 샘플 유형 구별)를 구별할 수 있도록 하는 하나 이상의 위치(164)를 포함할 수 있다. 트레이(160)는 하나 이상의 트레이(160)가 서로의 상부에 적층되게 하면서 트레이에 로딩된 처리 조립체에 대한 간극을 제공할 수 있는 레그(166)를 가질 수 있다. 트레이(160)는 처리 조립체의 운반성 및 구성을 개선할 수 있고, 처리 조립체의 어레이를 한 번에 멸균할 수 있다.
[0193]
도 14는 전술한 처리 조립체(100) 내에서 개스킷(130)으로서 구현될 수 있는 복수의 개스킷을 예시한다. 개스킷(130)은 특히 4 x 50 μL, 3 x 25 μL, 2 x 100 μL, 100 μL, 400 μL, 및 1 mL 크기의 샘플을 포함하는 다양한 크기의 샘플을 수용하도록 크기 조정될 수 있다. 일부 양태에서, 400 μL 및 1 mL 크기의 개스킷은 샘플의 개선된 로딩 및 언로딩을 제공할 수 있는 경사진 바닥 표면을 가질 수 있다.
[0194]
일부 양태에서, 개스킷은 단일/다중-웰 선택이 워크플로우를 최적화하도록 설계되는 유연성을 제공할 수 있다. 개스킷은 또한 단일 플랫폼에서 소규모와 대규모 사이를 원활하게 전환하여 확장성을 제공할 수 있다. 개스킷은 또한 사용 용이성을 제공하면서 기능적 설계가 샘플의 오염을 방지하는 개선된 기능성을 제공할 수 있다.
[0195]
도 15는 본 개시의 양태에 따른, 개스킷 어레이의 평면도 및 개스킷의 정면도를 예시하며, 여기서 각 개스킷은 8개의 웰을 갖는다.
[0196]
도 16은 본 개시의 양태에 따른 백 및 처리 장치의 정면도를 예시한다. 처리 장치는 세포 회수를 위해 V-형상 설계를 가질 수 있다. 또한, 처리 조립체는 갭을 메우기 위해 5-10 mL 백, 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 mL, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값의 백을 포함할 수 있다.
[0197]
도 17은 8개의 웰(172)을 갖는 개스킷(170)을 도시하며, 이는 각각의 웰(172)에서 50 μL의 샘플에 대해 크기 조정될 수 있다. 개스킷(170)은 다중-웰 처리 조립체(200)에 수용되거나 삽입되도록 구성될 수 있다. 도 18-20은 전기천공 시스템에 의해 다수의 로딩된 웰(예를 들어, 웰(172))의 처리를 허용하도록 구성될 수 있는 다중-웰 처리 조립체(200)를 예시한다.
[0198]
다중-웰 처리 조립체(200)는 하우징의 길이를 따라 연장되고 챔버(208)에 대한 개구(206)를 덮는 덮개(204)를 갖는 하우징(202)을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 챔버(108)는 처리 조립체(200)가 호환될 수 있는 전기천공 시스템 또는 장치에 제공될 수 있는 샘플, 배양물, 액체 배지 등을 수용할 수 있다.
[0199]
덮개(204)는 덮개(204)가 개구(206)를 덮고 하우징(202)에 연결되는 폐쇄 위치(도 18)와 덮개가 개구(206)로부터 멀리 힌지 연결되어 개구(206)를 노출시키는 개방 위치(도 19) 사이에서 이동할 수 있게 하는 하우징(202)의 한 측면에 힌지 연결부(210)를 가질 수 있다. 폐쇄 위치에서, 덮개(204)는 처리 조립체(200)의 오염을 방지할 수 있다. 일부 양태에서, 덮개(204)는 덮개(204)가 하우징(202)에 클립 고정되는 억지 끼워맞춤을 통해 하우징(202)에 연결될 수 있다. 일부 양태에서, 덮개(204)는 하우징(202)으로부터 제거될 수 있다. 일부 양태에서, 처리 조립체(200)는 하우징(202)이 자체적으로 설 수 있게 하는 베이스(205)를 가질 수 있고, 이는 사용의 용이성, 로딩, 및 로딩 동안 안정성을 제공할 수 있다.
[0200]
처리 조립체(200)는 챔버(208) 주위에 위치된 알루미늄 전극 버스(220)를 추가로 포함할 수 있고, 챔버(208) 내의 개스킷(예를 들어, 개스킷(170))을 둘러쌀 수 있다. 하우징(202)은 하우징(202)을 형성하기 위해 서로 연결되는 좌측 핸들(222) 및 우측 핸들(224)을 포함할 수 있다(예를 들어, 도 20). 좌측 핸들(222) 및 우측 핸들(224)은 서로 대향하여 위치될 수 있고 좌측 핸들(222)과 우측 핸들(224)을 연결할 수 있는 핀(225)에 의해 이격될 수 있다. 일부 양태에서, 전극 버스(220)는 우측 핸들(224) 주위를 감쌀 수 있다. 다른 양태에서, 전극 버스(220)는 금-코팅된 플라스틱 필름(228) 맞은편에 있는 챔버(208)의 한 측면에 위치될 수 있다.
[0201]
처리 조립체(200)는 좌측 핸들(122)과 우측 핸들(124) 사이에 수용될 수 있고 전극 버스(120) 및 프레임 개스킷(130)과 마주 보게 위치될 수 있는 금-코팅된 플라스틱 필름(228)을 추가로 포함할 수 있다. 금-코팅된 플라스틱 필름(128)은 크기에 맞게 다이 절단되고 처리 조립체(100)에 설치될 수 있는 플라스틱 필름의 큰 롤 상에 진공 증착된 금을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 금-코팅된 필름(128), 알루미늄 전극 버스(120), 및 접착제 층 롤이 결합될 수 있다. 일부 양태에서, 금-코팅된 플라스틱 필름(228)은 개스킷(170)의 형상을 반영하거나 이를 따르는 형상으로 배열된 금 코팅을 가질 수 있다.
[0202]
처리 조립체(200)는 챔버(208)에 수용될 수 있는 개스킷(170) 및 플라스틱 스페이서를 포함할 수 있다. 개스킷(170)은 여러 형상들 중 적어도 하나를 취할 수 있다. 예를 들어, 개스킷(170)은 8개의 웰(172)을 가질 수 있고, 이는 각각의 웰(172)에서 50 μL의 샘플에 대해 크기 조정될 수 있다. 일부 양태에서, 개스킷(170)은 실리콘 고무 또는 다른 가요성 재료로 제조될 수 있다. 처리 조립체(200)는 처리 조립체(200)가 임의의 수의 크기 조정된 개스킷(170)에 사용될 수 있도록 본원에 기재된 임의의 개스킷 크기 및 배열과 함께 사용되도록 구성될 수 있다.
[0203]
도 21은 복수의 다중-웰 처리 조립체(200)를 수용하도록 구성된 트레이(260)를 예시한다. 도 21 및 22에 예시된 바와 같이, 다중-웰 처리 조립체는 덮개 없이 트레이(260)에 로딩될 수 있다. 트레이(260)는 12개의 처리 조립체(200)를 수용할 수 있고, 각각의 처리 조립체는 8개의 웰(예를 들어, 웰(172))을 포함할 수 있다. 따라서, 각각의 트레이(260)는 96개의 웰을 포함할 수 있다.
[0204]
도 23은 수동 워크플로우에서 사용될 수 있는 6개의 처리 조립체(200)를 수용하도록 구성된 트레이(261), 및 커버 또는 덮개 마개(270)를 포함할 수 있는 12개의 처리 조립체 또는 12개의 개별 개스킷 샘플을 수용하도록 구성된 트레이(262)를 도시한다.
[0205]
도 24는 복수의 처리 조립체(200)를 수용할 수 있고 처리 조립체(200)의 로딩, 언로딩, 및 구성을 제공할 수 있는 다중-웰 랙(280)을 예시한다.
[0206]
도 25 및 26은 커버 또는 덮개 마개(270)를 갖는 트레이(260) 및 트레이(260)로의 처리 조립체(200)의 로딩 및 언로딩을 예시한다.
[0207]
도 27은 개시된 양태가 호환될 수 있는 예시적인 전기천공 시스템(300)을 예시한다.
[0208]
도 28-32는 처리 조립체(예를 들어, 처리 조립체(200))를 전기천공 시스템(예를 들어, 전기천공 시스템(300))에 연결할 수 있는 도킹 스테이션(320)을 예시한다. 도킹 스테이션(320)은 힌지 연결을 통해 도킹 스테이션(320)에 연결될 수 있는 덮개(322)를 포함할 수 있다. 덮개(322)는 개방 위치(도 28 및 29)와 폐쇄 위치(도 30) 사이에서 이동하도록 구성될 수 있다. 도킹 스테이션(320)은 하나 이상의 처리 조립체(200)를 수용하도록 구성된 포트(324)를 가질 수 있다. 도킹 스테이션(320)은 또한 전기천공 시스템(예를 들어, 전기천공 시스템(300)) 상의 리셉터클에 연결될 수 있는 전기 접점(326)을 가질 수 있다.
[0209]
도 33은 다중-웰 처리 조립체(200), 전기천공 시스템(300), 도킹 스테이션(320), 트레이(260), 로딩 장치(144), 및 랙(280)을 도시한다.
[0210]
도 34a-34c는 유동 전기천공 조립체에 사용하기 위한 백의 예시적인 양태를 예시한다. 도 34a에 도시된 바와 같이, 백(450)은 복수의 커넥터(453)를 가질 수 있는 출구(452)로 배수되는 V-형상 내부를 포함할 수 있다. 도 34b에 도시된 바와 같이, 백(460)은 각진 하부 표면(462)을 갖는 더 좁은 내부 챔버를 포함할 수 있고, 하부 표면(462) 중 하나는 하나 이상의 커넥터(464)를 포함할 수 있고, 백(460)은 또한 중앙에 위치된 출구(466)를 포함할 수 있다. 도 34c에 도시된 바와 같이, 백(470)은 넓은 상부 챔버(472) 및 좁은 하부 챔버(474)를 포함할 수 있고, 하부 챔버(474)는 각각의 각진 바닥 표면에 커넥터(476) 및 중앙에 위치된 출구(478)를 포함할 수 있다. 백(450, 460, 470)은 루어 핏팅, 루어-활성화 포트, 튜빙, 튜브 클램프 및 라벨을 포함할 수 있다(다이어그램 참조). 백은 샘플 백, 수집 백, 및 에어 백으로 사용될 수 있다.
III.
전기천공 표적
[0211]
전기천공을 위한 표적은 다수의 유기체 및 공급원으로부터 유래된 다수의 세포 유형 또는 입자를 포함한다. 일부 양태에서, 표적은 유핵 또는 무핵 세포 또는 입자일 수 있다. 본 개시의 세포 또는 입자는 일차 세포 또는 세포주 또는 이로부터 유래된 입자일 수 있다. 예를 들어, 표적은 원핵생물, 효모, 곤충, 포유동물, 설치류, 햄스터, 영장류, 인간, 조류, 식물 세포, 또는 이들의 부분/단편일 수 있다. 특정 양태에서, 본 개시는 다양한 유형의 살아있는 세포 또는 세포 입자 또는 합성 소포 또는 리포솜에 관심 제제를 도입하기 위한 조성물, 방법, 및 장치에 관한 것이다. 보다 특히, 본 개시는 관심 제제를 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 조직, 또는 이들의 유도체로 도입하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 이러한 전기천공 표적은 감염, 전이, 또는 다른 병리학적 병변의 부위를 표적화하기 위한 제제 전달 시스템으로 활용될 수 있다.
A.
세포 배양
[0212]
본원에서 사용되는 용어 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이러한 용어 모두는 또한 새로 분리된 세포 및 생체외 배양, 활성화 또는 확장된 세포 둘 모두를 포함한다. 이러한 모든 용어는 또한 임의의 모든 후속 세대인 이들의 자손을 포함한다. 모든 자손은 고의적이거나 부주의한 돌연변이로 인해 동일하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 이종성 핵산 서열을 발현시키는 맥락에서, "숙주 세포"는 원핵 또는 진핵 세포를 지칭하고, 이는 벡터를 복제하거나 벡터에 의해 인코딩된 이종성 유전자를 발현할 수 있는 임의의 형질전환 가능한 유기체를 포함한다. 숙주 세포는 벡터 또는 바이러스에 대한 수용체일 수 있고, 수용체였고, 수용체로 사용될 수 있다. 숙주 세포는 "트랜스펙션"되거나 "형질전환"될 수 있고, 이는 재조합 단백질-인코딩 서열과 같은 외인성 핵산이 숙주 세포로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. 형질전환된 세포는 일차 대상체 세포 및 이의 자손을 포함한다.
[0213]
특정 양태에서, 전기천공은 임의의 원핵 또는 진핵 세포에서 수행될 수 있다. 일부 양태에서, 전기천공은 포유동물 세포의 전기천공을 포함한다. 일부 양태에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다. 다른 양태에서, 포유동물 세포는 동물 세포, 예를 들어, 뮤린 세포, 래트 세포, 햄스터 세포, 또는 영장류 세포이다.
[0214]
특정 양태에서, 전기천공은 세포주 또는 하이브리드 세포 유형의 전기천공을 포함한다. 일부 양태에서, 전기천공되는 세포 또는 세포들은 암 세포, 종양 세포, 또는 불멸화 세포이다. 일부 예에서, 종양, 암, 불멸화 세포, 또는 세포주가 유도되고, 다른 예에서, 종양, 암, 불멸화 세포 또는 세포주는 자연적으로 이들의 각각의 상태 또는 병태로 들어간다.
[0215]
특정 양태에서, 전기천공된 세포 또는 세포주는 697, 10T½, 1321N1, A549, AHR77, B-세포, B-LCL, B16, B65, Ba/F3, BHK, C2C12, C6, CaCo-2, CAP/, CAP-T, CaSki, ChaGo-K-1, CHO, CHO2, CHO-DG44, CHO-K1, COS, COS-1, Cos-7, CV-1, 수지상 세포, DG75, DLD-1, EL4, 배아 줄기(ES) 세포 또는 유도체, H1299, HaCaT, HAP1, HCT116, HEK, 293, 293T, 293FT, HeLa, Hep G2, HL60, 조혈 줄기 세포, HOS, HT1080, HT29, Huh-7, HUVEC, 유도된 만능 줄기(iPS) 세포 또는 유도체, INS-1/GRINCH, Jurkat, K46, K562, KG1, KHYG-1, L5278Y, L6, LNCaP, LS180, MCF7, MDA-MB-231, MDCK, ME-180, 중간엽 세포, MG-63, Min-6, 단핵구 세포, MOLT4, Nalm6, ND7/23, Neuro2a, NK92, NIH 3T3, NIH3T3L1, NS/0, NK-세포, P3U1, Panc-1, PC12, PC-3, PER.C6, PM1, 말초 혈액 세포, 혈장 세포, 일차 섬유모세포, Ramos, RAW 264.7, RBL, Renca, RLE, SF21, SF9, SH-SY5Y, SK-BR-3, SK-MES-1, SK-N-SH, SK-OV-3, SP3/0, SL3, SW403, 자극-유발 만능성 획득(STAP) 세포 또는 유도체 SW403, T-세포, THP-1, 종양 세포, U2OS, U205, U937, 말초 혈액 림프구, 확장된 T 세포, 조혈 줄기 세포, YB2/0, Vero 세포, 또는 이들의 유도체일 수 있다.
[0216]
일부 양태에서, 세포는 지방세포, 연골세포, 내피 세포, 상피 세포, 섬유모세포, 간세포, 각질세포, 근육세포, 뉴런, 골세포, 말초 혈액 림프구, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 확장된 T 세포, 비장세포, 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 또는 흉선세포이다. 일부 양태에서, 세포는 일차 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 배양된 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 배양된 세포주이다. 일부 양태에서, PBMC는 말초 혈액 림프구(PBL)이다. 일부 양태에서, PBL은 자연 살해(NK) 세포, T 세포, 또는 B 세포이다. 일부 양태에서, PBMC는 단핵구이다. 일부 양태에서, 단핵구는 대식세포 또는 수지상 세포이다. 일부 양태에서, 대식세포는 미세아교세포이다. 일부 양태에서, 줄기 세포는 지방 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 신경 줄기 세포이다. 상기 개시된 세포 중 하나 이상이 일부 양태에서 제외된다.
[0217]
일부 양태에서, 세포는 환자로부터 분리된 일차 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 새로 분리된다. 분리된 세포는 동종이계 세포일 수 있고, 표준 공급원, 예를 들어, 병원 서비스로부터 수득될 수 있다. 공여자는 병력 및 표준 혈액 검사를 사용하여 스크리닝될 수 있다. 일부 양태에서, 세포는 정확히 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1일 또는 그 미만 또는 20 내지 1일의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위, 또는 정확히 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2, 1시간 또는 그 미만 또는 24 내지 1시간의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위의 기간에 트랜스펙션된다. 일부 양태에서, 분리된 세포는 동결된 적이 없다. 일부 양태에서, 분리된 세포는 시험관내에서 계대배양되거나 배양된 적이 없다. 일부 양태에서, 분리된 세포는 정확히 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회 또는 그 미만, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 동안 계대배양되거나 배양되었다. 용어 "계대배양된"은 기존의 세포로부터 많은 수의 세포를 생산하기 위해 세포를 배양하고 분열시키는 과정을 지칭하는 것으로 의도된다. 계대배양은 세포를 분열시키고 배양을 위해 소수의 세포를 각각의 새로운 용기에 옮기는 것을 포함한다. 부착 배양의 경우, 세포를 먼저 분리해야 하며, 일반적으로 트립신-EDTA의 혼합물로 수행된다. 소수의 분리된 세포는 이후 새로운 배양물을 시딩하는데 사용될 수 있고, 나머지는 폐기된다. 또한, 배양된 세포의 양은 모든 세포를 새로운 플라스크에 분배함으로써 용이하게 확대될 수 있다.
[0218]
특정 양태에서, 세포는 당 분야에서 트랜스펙션하기 어려운 것으로 공지된 것이다. 이러한 세포는 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 일차 세포, 곤충 세포, SF9 세포, Jurkat 세포, CHO 세포, 줄기 세포, 천천히 분열하는 세포, 및 비-분열 세포를 포함한다. 일부 양태에서, 세포는 난 세포 또는 정자 세포와 같은 생식 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 수정된 배아이다. 일부 양태에서, 세포는 수정된 인간 배아이다.
[0219]
일부 양태에서, 세포는 순차적인 전기천공 과정 동안 및 이후에 높은 생존력을 유지한다. 세포 생존력은 당 분야에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 세포는 세포 계수기 장치에 의해 전기천공 전 및 후에 계수될 수 있다. 다른 양태에서, 아폽토시스가 측정된다. 다량의 핵산의 도입은 아폽토시스를 유도할 수 있는 것으로 여겨진다. 본원에 기재된 방법은 당 분야의 다른 방법보다 더 적은 아폽토시스를 발생시킬 것으로 고려된다. 특정 양태에서, 순차적인 전기천공 후 아폽토시스를 나타내는 세포의 양은 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5% 미만이다. 아폽토시스는 프로그램된 세포 사멸의 특정 과정을 지칭하며 당 분야에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 아폽토시스는 아넥신 V 검정, 활성화된 카스파제 3/7 검출 검정, 및 Vybrant® Apoptosis Assay(Life Technologies)에 의해 측정될 수 있다.
[0220]
생존율은 통상적으로 50% 초과이거나 그보다 크다. 순차적으로 전기천공된 세포의 생존율은 전기천공되지 않은 출발 집단 또는 대조 작제물로 트랜스펙션된 전기천공된 집단의 생존율의 최대 또는 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%(또는 5% 내지 95%의 값 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위)일 수 있다. 일부 양태에서, 세포 생존율은 하나 이상의 온전한 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 포함하는 샘플에 제1 프로토콜에 따른 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 및 샘플에 제2 프로토콜에 따른 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계를 포함하는 전기천공 방법에 따라 투여된 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 정확히, 적어도, 또는 최대 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 또는 90%일 수 있다. 일부 양태에서, 세포 생존율은 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 적어도 50%이다. 일부 양태에서, 세포 생존율은 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 적어도 60%이다. 일부 양태에서, 세포 생존율은 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 적어도 70%이다. 일부 양태에서, 세포 생존율은 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 적어도 80%이다. 일부 양태에서, 세포 생존율은 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 적어도 90%이다.
[0221]
일부 양태에서, 전기천공된 세포는 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 대략 50% 내지 90% 생존한다. 일부 양태에서, 전기천공된 세포는 제2 전기 펄스 12 내지 72시간 후 대략 50% 내지 90% 생존한다. 일부 양태에서, 전기천공된 세포는 제2 전기 펄스 12 내지 48시간 후 대략 50% 내지 90% 생존한다. 일부 양태에서, 전기천공된 세포는 제2 전기 펄스 24시간 후 대략 50% 내지 90% 생존한다. 일부 양태에서, 전기천공된 세포는 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 대략 60% 내지 90% 생존한다. 일부 양태에서, 전기천공된 세포는 제2 전기 펄스 12 내지 72시간 후 대략 60% 내지 90% 생존한다. 일부 양태에서, 전기천공된 세포는 제2 전기 펄스 12 내지 48시간 후 대략 60% 내지 90% 생존한다. 일부 양태에서, 전기천공된 세포는 제2 전기 펄스 24시간 후 대략 60% 내지 90% 생존한다.
[0222]
일부 양태에서, 세포는 세포의 클론 집단의 확장을 가능하게 하기 위해 제한 희석 방법을 거칠 수 있다. 제한 희석 클로닝 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 하이브리도마에 대해 기술되었지만, 모든 세포에 적용될 수 있다. 이러한 방법은 문헌["Cloning hybridoma cells by limiting dilution," Journal of Tissue Culture Methods, 1985, Volume 9, Issue 3, pp 175-177, by Joan C. Rener, Bruce L. Brown, and Roland M. Nardone]에 기재되어 있고, 이는 본원에 참조로 포함된다.
[0223]
일부 양태에서, 세포는 전기천공 전 또는 전기천공 후에 배양된다. 일부 양태에서, 세포는 전기천공 전 또는 전기천공 후에 배양물에서 회복된다. 본원에서 사용되는 "샘플이 회복되도록 하는 것", "샘플을 회복시키는 것" 또는 "배양물에서 회복시키는 것"은 개선되거나 원하는 상태 또는 조건으로 세포의 복원 또는 복구를 촉진하기에 적절하고 충분한 본원에 기재된 것과 같은 조건 하에 본원에 기재된 임의의 세포-배양 용기 및 세포 배양 배지에서 샘플의 세포를 비제한적으로 포함하는 세포를 배양하는 것을 의미한다. 예를 들어, 배양물에서의 회복은 세포가, 예를 들어, 세포벽을 복구함으로써 전기천공의 외상으로부터 회복되고, 세포의 전기천공시 세포에 로딩된 제제를 발현 또는 대사시키기 시작하도록 할 수 있다.
[0224]
다른 양태에서, 세포는 전기천공 후 선택 단계 동안 배양된다. 또 다른 양태에서, 세포는 유지 및 클론 선택 및 초기 확장 단계 동안 배양된다. 또 다른 양태에서, 세포는 스크리닝 단계 동안 배양된다. 다른 양태에서, 세포는 대규모 생산 단계 동안 배양된다. 현탁액 및 부착성 세포를 배양하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
[0225]
특정 양태에서, 전기천공 동안 세포의 밀도는 제어된 변수이다. 전기천공 동안 세포의 세포 밀도는 비제한적으로 세포 유형, 원하는 전기천공 효율 또는 생성된 전기천공된 세포의 원하는 생존력에 따라 변하거나 달라질 수 있다. 특정 양태에서, 세포 밀도는 전기천공 내내 일정하다. 다른 양태에서, 세포 밀도는 전기천공 과정 동안 달라진다. 특정 양태에서, 전기천공 전 세포 밀도는 1×104개 세포/mL 내지 (y)×104의 범위일 수 있고, 여기서 y는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 수 있다(또는 2 내지 10의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위). 다른 양태에서, 전기천공 전 세포 밀도는 1×105개 세포/mL 내지 (y)×105의 범위일 수 있고, 여기서 y는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다(또는 2 내지 10의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위). 또 다른 양태에서, 전기천공 전 세포 밀도는 1×106개 세포/mL 내지 (y)×106의 범위일 수 있고, 여기서 y는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 수 있다(또는 2 내지 10의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위). 특정 양태에서, 전기천공 전 세포 밀도는 1×107개 세포/mL 내지 (y)×107의 범위일 수 있고, 여기서 y는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 수 있다(또는 2 내지 10의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위). 또 다른 양태에서, 전기천공 전 세포 밀도는 1x107개 세포/mL 내지 1x108개 세포/mL, 1x108개 세포/mL 내지 1x109개 세포/mL, 1x109개 세포/mL 내지 1x1010개 세포/mL, 1x1010개 세포/mL 내지 1x1011개 세포/mL, 1x1011개 세포/mL 내지 1x1012개 세포/mL의 범위, 또는 1x107개 세포/mL 내지 1x1012개 세포/mL의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위일 수 있다. 특정 양태에서, 전기천공 전 세포 밀도는 (y) x 106일 수 있고, 여기서 y는 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 0.01 내지 100의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위 중 임의의 것일 수 있다. 특정 양태에서, 전기천공 전 세포 밀도는 (y) x 1010일 수 있고, 여기서 y는 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000(또는 0.01 내지 1000의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위) 중 임의의 것일 수 있다.
[0226]
특정 양태에서, 전기천공 동안 세포의 밀도는 제어된 변수이다. 전기천공 동안 세포의 세포 밀도는 비제한적으로 세포 유형, 원하는 전기천공 효율 또는 생성된 전기천공된 세포의 원하는 생존력에 따라 변하거나 달라질 수 있다. 특정 양태에서, 세포 밀도는 전기천공 내내 일정하다. 다른 양태에서, 세포 밀도는 전기천공 과정 동안 달라진다. 특정 양태에서, 전기천공 동안 세포 밀도는 1×104개 세포/mL 내지 (y)×104의 범위일 수 있고, 여기서 y는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 수 있다(또는 2 내지 10의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위). 다른 양태에서, 전기천공 동안 세포 밀도는 1×105개 세포/mL 내지 (y)×105의 범위일 수 있고, 여기서 y는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다(또는 2 내지 10의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위). 또 다른 양태에서, 전기천공 동안 세포 밀도는 1×106개 세포/mL 내지 (y)×106의 범위일 수 있고, 여기서 y는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 수 있다(또는 2 내지 10의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위). 특정 양태에서, 전기천공 동안 세포 밀도는 1×107개 세포/mL 내지 (y)×107의 범위일 수 있고, 여기서 y는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 수 있다(또는 2 내지 10의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위). 또 다른 양태에서, 전기천공 동안 세포 밀도는 1x107개 세포/mL 내지 1x108개 세포/mL, 1x108개 세포/mL 내지 1x109개 세포/mL, 1x109개 세포/mL 내지 1x1010개 세포/mL, 1x1010개 세포/mL 내지 1x1011개 세포/mL, 1x1011개 세포/mL 내지 1x1012개 세포/mL의 범위, 또는 1x107개 세포/mL 내지 1x1012개 세포/mL의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위일 수 있다. 특정 양태에서, 전기천공 동안 세포 밀도는 (y) x 106일 수 있고, 여기서 y는 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 0.01 내지 100의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위 중 임의의 것일 수 있다. 특정 양태에서, 전기천공 동안 세포 밀도는 (y) x 1010일 수 있고, 여기서 y는 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000(또는 0.01 내지 1000의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위) 중 임의의 것일 수 있다.
[0227]
특정 양태에서, 전기천공 후 세포 밀도는 1×104개 세포/mL 내지 (y)×104의 범위일 수 있고, 여기서 y는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 수 있다(또는 2 내지 10의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위). 다른 양태에서, 전기천공 후 세포 밀도는 1×105개 세포/mL 내지 (y)×105의 범위일 수 있고, 여기서 y는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다(또는 2 내지 10의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위). 또 다른 양태에서, 전기천공 후 세포 밀도는 1×106개 세포/mL 내지 (y)×106의 범위일 수 있고, 여기서 y는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 수 있다(또는 2 내지 10의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위). 특정 양태에서, 전기천공 후 세포 밀도는 1×107개 세포/mL 내지 (y)×107의 범위일 수 있고, 여기서 y는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 수 있다(또는 2 내지 10의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위). 또 다른 양태에서, 전기천공 후 세포 밀도는 1x107개 세포/mL 내지 1x108개 세포/mL, 1x108개 세포/mL 내지 1x109개 세포/mL, 1x109개 세포/mL 내지 1x1010개 세포/mL, 1x1010개 세포/mL 내지 1x1011개 세포/mL, 1x1011개 세포/mL 내지 1x1012개 세포/mL의 범위, 또는 1x107개 세포/mL 내지 1x1012개 세포/mL의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위일 수 있다. 특정 양태에서, 전기천공 후 세포 밀도는 (y)×106일 수 있고, 여기서 y는 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 0.01 내지 100의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위 중 임의의 것일 수 있다. 특정 양태에서, 전기천공 후 세포 밀도는 (y)×1010일 수 있고, 여기서 y는 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000(또는 0.01 내지 1000의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위) 중 임의의 것일 수 있다.
[0228]
일부 예에서, 특정 수의 세포가 특정 시간 내에 전기천공될 수 있다. 기재된 플랫폼의 유연성, 일관성 및 재현성을 고려할 때, 대략 최대 또는 (y)×104, (y)×105, (y)×106, (y)×107, (y)×108, (y)×109, (y)×1010, (y)×1011, (y)×1012, (y)×1013, (y)×1014, 또는 (y)×1015 초과의 세포(또는 (y)×104 내지 (y)×1015의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위)가 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100초 미만(또는 0.01초 내지 100초의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위) 내에 전기천공될 수 있고, 여기서 y는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 중 임의의 것일 수 있다(또는 1 내지 9의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위). 다른 예에서, 대략 최대 또는 (y)×104, (y)×105, (y)×106, (y)×107, (y)×108, (y)×109, (y)×1010, (y)×1011, (y)×1012, (y)×1013, (y)×1014, 또는 (y)×1015 초과의 세포(또는 (y)×104 세포 내지 (y)×1015 세포의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위)가 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 또는 120분 미만(또는 0.01분 내지 120분의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위) 내에 전기천공될 수 있고, 여기서 y는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 중 임의의 것일 수 있다(또는 1 내지 9의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위). 또 다른 예에서, 대략 최대 또는 (y)×104, (y)×105, (y)×106, (y)×107, (y)×108, (y)×109, (y)×1010, (y)×1011, (y)×1012, (y)×1013, (y)×1014, 또는 (y)×1015 초과의 세포(또는 (y)×104 세포 내지 (y)×1015 세포의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위)가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간 미만(또는 1시간 내지 24시간의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위) 내에 전기천공될 수 있고, 여기서 y는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 중 임의의 것일 수 있다(또는 1 내지 9의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위).
[0229]
표현 '(y)×10e'는 임의의 수치 값을 가질 수 있는 변수 'y'에 10을 곱하여 지수 값, e로 승산되는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, (y)×104(여기서, y는 2임)는 2×104를 의미하는 것으로 이해되며, 이는 2×10,000과 동일하며, 20,000이다. (y)×10e4는 또한 (y)*10e4 또는 (y)×104 또는 (y)*104로 기재될 수 있다.
[0230]
세포 또는 배지의 부피는 전기천공될 세포의 양, 스크리닝될 세포의 수, 스크리닝될 세포의 유형, 생산될 단백질의 유형, 원하는 단백질의 양, 세포 생존율, 및 바람직한 세포 농도와 관련된 특정 세포 특성에 따라 달라질 수 있다. 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 부피의 예는 0.01, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000 mL 또는 L(또는 0.01 mL 또는 L 내지 1000 mL 또는 L의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위), 및 그로부터 유도 가능한 임의의 범위를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 부피를 보유할 수 있는 용기가 본원에 기재된 양태에서의 사용을 위해 고려된다. 이러한 용기는 세포 배양 디쉬, 페트리 디쉬, 플라스크, 바이오백, 바이오컨테이너, 생물반응기, 또는 통을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 10 L 이상을 보유할 수 있는 것과 같은 대규모 부피를 위한 용기가 특히 고려된다. 특정 양태에서, 100 L 이상의 부피가 사용된다.
[0231]
일부 양태에서, 세포는 상업적으로 이용 가능한 세포 배양 용기 및 세포 배양 배지를 사용하여 현탁액으로 배양된다. 일부 양태에서 사용될 수 있는 상업적으로 이용 가능한 배양 용기의 예는 ADME/TOX 플레이트(GIBCO™), 세포 챔버 슬라이드 및 커버슬립(Cell Chamber Slides and Coverslips), 세포 계수 장비, 세포 배양 표면, HYPERFLASK® 세포 배양 용기(CORNING®), 코팅된 배양 용기, NALGENE® Cryoware, 배양 챔버, 배양 디쉬, 유리 배양 플라스크, 플라스틱 배양 플라스크, 3D 배양 포맷, 배양 멀티웰 플레이트, 배양 플레이트 삽입물, 유리 배양 튜브, 플라스틱 배양 튜브, 적층형 세포 배양 용기, 저산소 배양 챔버, 페트리 디쉬 및 플라스크 캐리어, Quickfit 배양 용기, 롤러 병을 사용한 스케일-업 세포 배양, 스피너 플라스크, 3D 세포 배양, 또는 세포 배양 백을 포함한다.
[0232]
다른 양태에서, 배지는 당업자에게 잘 알려진 성분을 사용하여 제형화될 수 있다. 세포를 배양하는 제형 및 방법은 다음 참고문헌에 상세히 기술되어 있다: Short Protocols in Cell Biology, J. Bonifacino, et al., ed., John Wiley & Sons, 2003, 826 pp; Live Cell Imaging: A Laboratory Manual, D. Spector & R. Goldman, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2004, 450 pp.; Stem Cells Handbook, S. Sell, ed., Humana Press, 2003, 528 pp.; Animal Cell Culture: Essential Methods, John M. Davis, John Wiley & Sons, Mar 16, 2011; Basic Cell Culture Protocols, Cheryl D. Helgason, Cindy Miller, Humana Press, 2005; Human Cell Culture Protocols, Series: Methods in Molecular Biology, Vol. 806, Mitry, Ragai R.; Hughes, Robin D. (Eds.), 3rd ed. 2012, XIV, 435 p. 89, Humana Press; Cancer Cell Culture: Method and Protocols, Cheryl D. Helgason, Cindy Miller, Humana Press, 2005; Human Cell Culture Protocols, Series: Methods in Molecular Biology, Vol. 806, Mitry, Ragai R.; Hughes, Robin D. (Eds.), 3rd ed. 2012, XIV, 435 p. 89, Humana Press; Cancer Cell Culture: Method and Protocols, Simon P. Langdon, Springer, 2004; Molecular Cell Biology. 4th edition., Lodish H, Berk A, Zipursky S L, et al., New York: W. H. Freeman; 2000, Section 6.2 Growth of Animal Cells in Culture, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다.
[0233]
일부 양태에서, 스크리닝 및 확장 단계 동안 및/또는 대규모 생산 단계(유가식 및 비교로도 지칭됨) 동안, 선택 또는 스크리닝으로부터 생성된 확장된 전기천공된 세포는 관심 제제를 포함할 수 있다.
B.
표적 제조 및 수집
[0234]
본원에 기재된 조성물은 치료적 적용에 사용될 수 있다. 본원에 기재된 조성물의 치료적 사용의 한 가지 예는 적절한 완충제에서 필요한 농도의 관심 치료제를 제형화하고 본원에 기재된 전기천공 시스템과 같은 시스템을 사용하여 제형을 처리하는 것이다. 관심 치료제 및 전기천공 표적이 적절한 포트(들)를 갖는 용기로 멸균-여과되는 경우, 관심 치료제는 일상적인 실험실 환경에서 폐쇄된 멸균 시스템을 통해 실행될 수 있다. 과정은 2 내지 3시간 이내에 완료될 수 있다. 시스템의 성능 변수는 실시간으로 생성되며 품질 관리 작업에 도움이 될 수 있다.
[0235]
전형적으로, 제제-로딩된 표적의 제조는 중앙 시설 또는 진료 현장(들)에서 수행될 수 있다. 중앙 시설(또는 여러 지역 시설)이 있어야 하는 경우, 제제-로딩된 표적의 안정성이 중요한 요소이다. 적어도 며칠 동안의 안정성은 맞춤-주문 작업을 지원할 수 있다. 현장 진료 시스템에서, 제형화된 관심 치료제는 요법이 필요한 부위에 공급될 것이다. 표적 또는 전달 비히클은 이들 현장에서 수득될 수 있고, 최종 제조 단계는 상세한 표준 작업 절차를 사용하여 기술 인력에 의해 처리 시설에서 수행될 수 있다. 이는 현장에서 수혈 제품을 최종 준비하는 것과 유사할 것이다. 이 경우, 최종 생성물 안정성은 중요하지 않다.
C.
치료적 적용
[0236]
본 개시는 전달 비히클로서 전기천공된 실체 또는 표적(예를 들어, 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 조직, 또는 이들의 유도체)을 사용하여 관심 치료제를 전달하기 위한 방법을 추가로 포함한다. 본 개시는 또한 관심 치료제를 함유하는 유효량의 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 또는 조직을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 관심 치료제를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법을 포함한다.
[0237]
본원에 기재된 방법을 사용하여 생산된 활성제 제형은 전형적으로 지속된 효과 및 더 낮은 독성을 가져, 덜 빈번한 투여 및 향상된 치료 지수를 가능하게 한다. 치료제는 먼저 본원에 기재된 방법에 따라 수득된, 적어도 하나의 관심 치료제가 로딩된 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 조직, 또는 이들의 유도체를 제조함으로써 생성된다.
[0238]
본 개시의 특정 양태에서, 관심 제제는 전달 비히클(즉, 전기천공 표적, 예를 들어, 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 조직, 또는 이들의 유도체)에 로딩되거나 도입될 수 있다. 적합한 관심 제제의 예는 약물; 안정화제, 트레이서, 형광 태그 및 방사성표지와 같은 다른 영상화 물질; 동결방지제; 핵산; 폴리펩티드; 소분자; 탄수화물; 및 생물활성 물질을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 전기천공 표적으로의 혼입에 특히 적합한 생물활성 물질은 치료제 및 예방제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 생물활성 물질의 예는 단백질 및 펩티드(합성, 천연, 및 모방체), 올리고뉴클레오티드(안티-센스, 리보자임 등), 핵산(예를 들어, 이중 센스 선형 DNA, 억제성 RNA, siRNA, miRNA, shRNA, 발현 벡터 등), 리보핵단백질, 벡터, 소분자, 탄수화물, 사이토카인, 혈액치료제, 항암 약물, 항염증 약물, 항진균 약물, 항바이러스 약물, 항미생물 약물, 혈전조절제, 면역조절제 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 관심 제제가 또한 손상된 조직으로의 전달을 위해 전달 비히클 또는 다른 세포에 도입될 수 있음이 이해되어야 한다. 이러한 관심 제제는 평활근 억제제, 항감염제(예를 들어, 항생제, 항진균제, 항박테리아제, 항바이러스제), 화학요법/항신생물제 등을 포함나 이에 제한되지 않는다.
[0239]
관심 제제는 다양한 방법에 의해 전달 비히클에 도입될 수 있으며, 가장 바람직한 방법은 본 개시의 장치 및/또는 방법에 따른 것이다. 일부 양태에서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 관심 제제가 전달 비히클에 연속적으로 도입된다. 일부 양태에서, 전달 비히클에 연속적으로 도입되는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 제제는 동일한 제제, 상이한 제제, 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 전달 비히클에 연속적으로 도입되는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 제제는 동일한 제제일 수 있다. 일부 양태에서, 전달 비히클에 연속적으로 도입되는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 제제는 상이한 제제일 수 있다. 일부 양태에서, 전달 비히클에 연속적으로 도입되는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 제제는 동일한 제제 및 상이한 제제의 조합일 수 있다(예를 들어, 제2, 제3, 및 제4 제제는 모두 동일한 제제일 수 있는 반면, 제5-제10 제제는 상이한 제제 또는 상이한 제제의 조합일 수 있다).
[0240]
일부 양태에서, 유동 전기천공와 같은 전기천공에 의해 세포를 트랜스펙션시키는 청구된 방법은 적어도, 최대, 또는 약 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 또는 90%, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값의 관심 제제의 로딩 또는 트랜스펙션 효율을 달성한다. 유동 전기천공과 같은 전기천공에 의해 세포를 트랜스펙션시키는 청구된 방법은 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과 또는 90% 초과(또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값)의 관심 제제의 로딩 또는 트랜스펙션 효율을 달성할 수 있다. 일부 양태에서, 관심 제제의 로딩 효율은 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%이다. 트랜스펙션 효율은 유전자의 생성물을 발현하는 세포의 백분율 또는 유전자에 의해 발현되는 생성물의 분비 수준에 의해 측정될 수 있다.
[0241]
본 개시의 임의의 조성물의 투여량은 증상, 환자의 연령 및 체중, 치료 또는 예방될 장애의 특성 및 중증도, 투여 경로, 및 대상 조성물의 형태에 따라 달라질 것이다. 임의의 대상 제형은 단일 용량 또는 분할 용량으로 투여될 수 있다. 본 개시의 조성물에 대한 투여량은 당업자에게 공지된 기술에 의해 또는 본원에 교시된 바와 같이 용이하게 결정될 수 있다.
[0242]
일부 양태에서, 대상 화합물의 투여량은 정확히, 최대, 또는 적어도 체중 kg 당 0.001, 0.010, 0.020, 0.030, 0.040, 0.050, 0.060, 0.070, 0.080, 0.090, 0.100, 0.110, 0.120, 0.130, 0.140, 0.150, 0.160, 0.170, 0.180, 0.190, 0.200, 0.210, 0.220, 0.230, 0.240, 0.250, 0.260, 0.270, 0.280, 0.290, 0.300, 0.310, 0.320, 0.330, 0.340, 0.350, 0.360, 0.370, 0.380, 0.390, 0.400, 0.410, 0.420, 0.430, 0.440, 0.450, 0.460, 0.470, 0.480, 0.490, 0.500, 0.510, 0.520, 0.530, 0.540, 0.550, 0.560, 0.570, 0.580, 0.590, 0.600, 0.610, 0.620, 0.630, 0.640, 0.650, 0.660, 0.670, 0.680, 0.690, 0.700, 0.710, 0.720, 0.730, 0.740, 0.750, 0.760, 0.770, 0.780, 0.790, 0.800, 0.810, 0.820, 0.830, 0.840, 0.850, 0.860, 0.870, 0.880, 0.890, 0.900, 0.910, 0.920, 0.930, 0.940, 0.950, 0.960, 0.970, 0.980, 0.990, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.100, 2.200, 2.300, 2.400, 2.500, 2.600, 2.700, 2.800, 2.900, 3.000, 3.100, 3.200, 3.300, 3.400, 3.500, 3.600, 3.700, 3.800, 3.900, 4.000, 4.100, 4.200, 4.300, 4.400, 4.500, 4.600, 4.700, 4.800, 4.900, 5.000, 5.100, 5.200, 5.300, 5.400, 5.500, 5.600, 5.700, 5.800, 5.900, 6.000, 6.100, 6.200, 6.300, 6.400, 6.500, 6.600, 6.700, 6.800, 6.900, 7.000, 7.100, 7.200, 7.300, 7.400, 7.500, 7.600, 7.700, 7.800, 7.900, 8.000, 8.100, 8.200, 8.300, 8.400, 8.500, 8.600, 8.700, 8.800, 8.900, 9.000, 9.100, 9.200, 9.300, 9.400, 9.500, 9.600, 9.700, 9.800, 9.900, 또는 10.000 pg/ng/mg/g, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값일 수 있다. 특정 양태에서, 대상 화합물의 투여량은 일반적으로 체중 kg 당 약 0.001, 0.01, 1, 5, 10 pg/ng/mg 내지 약 0.1, 1, 5, 10 pg/ng/mg/g의 범위일 것이며, 그 사이의 모든 값 및 범위를 포함한다.
1.
항감염제
[0243]
일 양태에서, 관심 제제는 항감염제이다. 항감염제는 박테리아, 마이코박테리아, 진균, 바이러스, 또는 원충 감염과 같은 감염에 대해 작용하는 제제이다. 본 개시에 포함되는 항감염제는 아미노글리코시드(예를 들어, 스트렙토마이신, 겐타마이신, 토브라마이신, 아미카신, 네틸마이신, 카나마이신 등), 테트라사이클린(예를 들어, 클로르테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 메타사이클린, 독시사이클린, 미노사이클린 등), 설폰아미드(예를 들어, 설파닐아미드, 설파디아진, 설파메타옥사졸, 설프이속사졸, 설프아세트아미드 등), 파라아미노벤조산, 디아미노피리미딘(예를 들어, 종종 설파메톡사졸과 함께 사용되는 트리메토프림, 피라진아미드 등), 퀴놀론(예를 들어, 날리딕산, 시녹사신, 시프로플록사신 및 노르플록사신 등), 페니실린(예를 들어, 페니실린 G, 페니실린 V, 암피실린, 아목시실린, 바캄피실린, 카르베니실린, 카르베니실린 인다닐, 티카르실린, 아즐로실린, 메즐로실린, 피페라실린 등), 페니실리나제 내성 페니실린(예를 들어, 메티실린, 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 나프실린 등), 1세대 세팔로스포린(예를 들어, 세파드록실, 세팔렉신, 세프라딘, 세팔로틴, 세파피린, 세파졸린 등), 2세대 세팔로스포린(예를 들어, 세파클로르, 세파만돌, 세포니시드, 세폭시틴, 세포테탄, 세푸록심, 세푸록심 악세틸, 세프메타졸, 세프프로질, 로라카르베프, 세포라니드 등), 3세대 세팔로스포린(예를 들어, 세페핌, 세포페라존, 세포탁심, 세프티족심, 세프트리악손, 세프타지딤, 세픽심, 세프포독심, 세프티부텐 등), 다른 베타-락탐(예를 들어, 이미페넴, 메로페넴, 아즈트레오남, 클라불란산, 설박탐, 타조박탐 등), 베타락타마제 억제제(예를 들어, 클라불란산), 클로람페리콜, 마크롤리드(예를 들어, 에리트로마이신, 아지트로마이신, 클라리트로마이신 등), 링코마이신, 클린다마이신, 스펙티노마이신, 폴리믹신 B, 폴리믹신(예를 들어, 폴리믹신 A, B, C, D, E1(콜리스틴 A), 또는 E2, 콜리스틴 B 또는 C 등), 콜리스틴, 반코마이신, 바시트라신, 이소니아지드, 리팜핀, 에탐부톨, 에티온아미드, 아미노살리실산, 사이클로세린, 카프레오마이신, 설폰(예를 들어, 답손, 설폭손 소듐 등), 클로파지민, 탈리도미드, 및 지질 캡슐화될 수 있는 임의의 다른 항박테리아제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
[0244]
특정 양태에서, 항미생물제는 이소니아지드, 리팜핀, 스트렙토마이신, 리파부틴, 에탐부톨, 피라진아미드, 에티온아미드, 아미노살리실산, 및 사이클로세린을 포함하나 이에 제한되지 않는 항마이코박테리아제를 포함한다.
[0245]
항감염제는 폴리엔 항진균제(예를 들어, 암포테리신 B, 니스타틴, 나타마이신 등), 플루시토신, 이미다졸(예를 들어, n-티코나졸, 클로트리마졸, 에코나졸, 케토코나졸 등), 트리아졸(예를 들어, 이트라코나졸, 플루코나졸 등), 그리세오풀빈, 테르코나졸, 부토코나졸 시클로피락스, 시클로피록스 올라민, 할로프로긴, 톨나프테이트, 나프티핀, 테르비나핀, 및 지질 캡슐화되거나 복합체화될 수 있는 임의의 다른 항진균제를 포함하는 항진균제를 포함할 수 있다. 약물의 조합이 사용될 수 있다.
[0246]
특정 양태에서, 항감염제는 아시클로버, 팜시클로버, 포스카메트, 간시클로버, 아시클로버, 이독수리딘, 소리부딘, 트리플루리딘, 발라사이클로버 및 비다라빈과 같은 항헤르페스제; 리토나버, 디다노신, 스타부딘, 잘시타빈, 테노보버 및 지도부딘과 같은 항레트로바이러스제; 및 비제한적으로 아만타딘, 인터페론-알파, 리바비린, 및 리만타딘과 같은 다른 항바이러스제를 포함하나 이에 제한되지 않는 항바이러스제를 포함한다.
[0247]
또한, 약물의 약학적으로 허용되는 부가 염 및 복합체가 본 개시의 제형에 사용되는 적합한 항감염제로서 포함된다. 화합물이 하나 이상의 키랄 중심을 가질 수 있는 경우, 명시되지 않는 한, 본 개시는 각각의 독특한 라세미 화합물 뿐만 아니라 각각의 독특한 비-라세미 화합물을 포함한다.
2.
항신생물제
[0248]
일 양태에서, 활성제는 항신생물 약물이다. 현재, 약 20개의 인정된 부류의 승인된 항신생물 약물이 있다. 분류는 특정 약물에 의해 공유되는 공통 구조에 기초한 일반화이거나, 약물에 의한 공통 작용 메커니즘에 기초한다. 분류별로 일반적으로 공지된 일부 항신생물제의 부분 목록은 다음과 같다:
[0249]
구조-기반 부류는 플루오로피리미딘 - 5-FU, 플루오로데옥시우리딘, Ftorafur, 5'-데옥시플루오로우리딘, UFT, S-1 카페시타빈; 피리미딘 뉴클레오시드 - 데옥시시티딘, 시토신 아라비노시드, 5-아자시토신, 젬시타빈, 5-아자시토신-아라비노시드; 퓨린 - 6-메르캅토퓨린, 티오구아닌, 아자티오프린, 알로퓨리놀, 클라드리빈, 플루다라빈, 펜토스타틴, 2-클로로 아데노신; 백금 유사체 - 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 테트라플라틴, 백금-DACH, 오르마플라틴, CI-973, JM-216; 안트라사이클린/안트라세네디온 - 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론; 에피포도필로톡신 - 에토포시드, 테니포시드; 캄프토테신 - 이리노테칸, 토포테칸, 9-아미노 캄프토테신, 10,11-메틸렌디옥시 캄프토테신, 9-니트로 캄프토테신, TAS 103, 7-(4-메틸-피페라지노-메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신, 7-(2-N-이소프로필아미노)에틸)-20(S)-캄프토테신; 호르몬 및 호르몬 유사체 - 디에틸스틸베스트롤, 타목시펜, 토레메핀, 톨무덱스, 티미탁, 플루타미드, 비칼루타미드, 피나스테리드, 에스트라디올, 트리옥시펜, 드롤록시펜, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스테롤 아세테이트, 아미노글루테티미드, 테스토락톤 등; 효소, 단백질 및 항체 - 아스파라기나제, 인터루킨, 인터페론, 류프롤리드, 페가스파가제 등; 빈카 알칼로이드 - 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신; 탁산 - 파클리탁셀, 및 도세탁셀을 포함한다.
[0250]
메커니즘-기반 부류는 항호르몬제 - 아나스트로졸; 항폴레이트 - 메토트렉세이트, 아미노프테린, 트리메트렉세이트, 트리메토프림, 피리트렉심, 피리메타민, 에다트렉세이트, MDAM; 항미세소관제 - 탁산 및 빈카 알칼로이드; 알킬화제(고전적 및 비고전적)-질소 머스타드(메클로레타민, 클로람부실, 멜팔란, 우라실 머스타드), 옥사자포스포린(이포스파미드, 사이클로포스파미드, 퍼포스파미드, 트로포스파미드), 알킬설포네이트(부술판), 니트로소우레아(카르무스틴, 로무스틴, 스트렙토조신), 티오테파, 다카르바진 등; 항대사물질 - 상기 열거된 퓨린, 피리미딘 및 뉴클레오시드; 항생제 - 안트라사이클린/안트라세네디온, 블레오마이신, 닥티노마이신, 미토마이신, 플리카마이신, 펜토스타틴, 스트렙토조신; 토포이소머라제 억제제 - 캄프토테신(Topo I), 에피포도필로톡신, m-AMSA, 엘립티신(Topo II); 항바이러스제 - AZT, 잘시타빈, 젬시타빈, 디다노신 등; 다양한 세포독성제 - siRNA, miRNA, 하이드록시우레아, 미토탄, 융합 독소, PZA, 브리오스타틴, 레티노이드, 부티르산 및 유도체, 펜토산, 푸마길린 등을 포함한다.
3.
항혈관형성제
[0251]
항혈관형성제는 전기천공 표적에 혼입될 수 있다. 항혈관형성 약물은 AGM-1470(TNP-470) 또는 이의 수용체 중 하나에 대한 길항제인 MetAP-2; 성장 인자 길항제, 또는 성장 인자에 대한 항체(VEGF 또는 bFGF 포함); 성장 인자 수용체 길항제 또는 성장 인자 수용체에 대한 항체; TIMP, 바티마스타트(BB-94), 및 마리마스타트를 포함하는 메탈로프로테이나제의 억제제; 제니스테인 및 SU5416을 포함하는 티로신 키나제 억제제; 길항제 alphaVbeta3/5 또는 인테그린에 대한 항체를 포함하는 인테그린 길항제; 레티노산 또는 합성 레티노이드 펜레티나이드를 포함하는 레티노이드; 스테로이드 11α-에피하이드로코르티솔, 코르텔록손, 테트라하이드로코르티손 및 17α-하이드록시프로게스테론; 스타우로스포린 및 MDL 27032를 포함하는 단백질 키나제 억제제; 22-옥사-1 알파, 및 25-디하이드록시비타민 D3를 포함하는 비타민 D 유도체; 인도메타신 및 술린닥을 포함하는 아라키돈산 억제제; 미노사이클린을 포함하는 테트라사이클린 유도체; 탈리도미드 및 탈리도미드 유사체 및 유도체; 2-메톡시에스트라디올; 종양 괴사 인자-알파; 인터페론-감마-유도성 단백질 10(IP-10); 인터루킨 1 및 인터루킨 12; 인터페론 알파, 베타 또는 감마; 안지오스타틴 단백질 또는 플라스미노겐 단편; 엔도스타틴 단백질 또는 콜라겐 18 단편; 프롤리페린-관련 단백질; 그룹 B 스트렙토코쿠스 독소; CM101; CAI; 트로포닌 I; 스쿠알라민; L-NAME을 포함하는 산화질소 신타제 억제제; 트롬보스폰딘; 워트만닌; 아밀로리드; 스피로노락톤; 우르소데옥시콜산; 부팔린; 수라민; 테코갈란 소듐; 리놀레산; 캡토프릴; 이르소글라딘; FR-118487; 트리테르펜산; 카스타노스페르민; 백혈병 억제 인자; 라벤더스틴 A; 혈소판 인자-4; 허비마이신 A; 디아미노안트라퀴논; 탁솔; 아우린트리카르복실산; DS-4152; 펜토산 폴리설파이트; 라디시콜; 인간 프로락틴의 단편; 에르브스타틴; 에포네마이신; 상어 연골; 프로타민; 루이지아닌 A, C 및 D; PAF 길항제 WEB 2086; 아우라노핀; 아스코르브 에테르; 및 설페이트화된 다당류 D 4152를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
4.
생체분자 제제
[0252]
본 개시의 방법을 사용하여 핵산 제제로 표적화되는 유전자는 그 발현이 바람직하지 않은 표현형 형질과 상관관계가 있는 것을 비제한적으로 포함한다. 따라서, 예를 들어, 암 및 바이러스와 관련된 유전자가 표적화될 수 있다. 암-관련 유전자는 종양유전자(예를 들어, K-ras, c-myc, bcr/abl, c-myb, c-fms, c-fos 및 cerb-B), 성장 인자 유전자(예를 들어, 표피 성장 인자 및 이의 수용체, 섬유모세포 성장 인자-결합 단백질을 인코딩하는 유전자), 매트릭스 메탈로프로테이나제 유전자(예를 들어, MMP-9를 인코딩하는 유전자), 부착-분자 유전자(예를 들어, VLA-6 인테그린을 인코딩하는 유전자), 종양 억제 유전자(예를 들어, bcl-2 및 bcl-X1), 혈관형성 유전자, 및 전이성 유전자를 포함한다. 바이러스 유전자는 인간 유두종 바이러스 유전자(예를 들어, 자궁경부암과 관련됨), B형 및 C형 간염 유전자, 및 거대세포바이러스(CMV) 유전자(예를 들어, 망막염과 관련됨)를 포함한다. 이러한 질병 등과 관련된 다수의 다른 유전자가 또한 표적화될 수 있다. 특정 양태에서, 핵산은 c-myc, VEGF, CD4, CCRS, gag, MDM2, Apex, Ku70, 또는 ErbB2를 인코딩하는 mRNA를 표적화할 수 있다.
[0253]
유전자 조절 방법은 siRNA, miRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 다른 억제성 핵산의 투여 및/또는 치료적 폴리뉴클레오티드, 단백질, 리보핵단백질, 또는 펩티드를 인코딩하는 벡터 또는 핵산의 투여를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 치료적 억제성 올리고뉴클레오티드 또는 핵산(안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, siRNA, shRNA, miRNA, dsRNA) 분자의 투여량을 제조 및/또는 대상체에게 투여하는 방법을 제공하며, 여기서 투여된 핵산은 전사 또는 번역과 같은 생물학적 과정을 억제한다. 본 개시는 대상체에게 치료적 이익을 가져오기 위해, 기재된 방법을 사용하여 제조된 핵산 전달 비히클을 사용하여, 하나 이상의 치료적 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용되는 "치료적 핵산 분자" 또는 "치료적 핵산"은, 핵산으로서 또는 발현된 핵산 또는 폴리펩티드로서, 대상체에게 치료적 이익을 부여하는 임의의 핵산(예를 들어, DNA, RNA, 비-자연 발생 핵산 및 이들의 유사체, 예를 들어, 펩티드 핵산, 및 이들의 화학적 컨쥬게이트)이다. 대상체는 포유동물, 예를 들어, 마우스, 또는 인간일 수 있다.
[0254]
유전자 조절 방법은 또한 세포에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 내인성 유전자를 제거하기 위한 세포의 유전자 편집을 포함한다. 유전자 편집 방법은 RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)(예를 들어, 리보핵단백질), 제한 효소, 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 및 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 세포의 하나 이상의 내인성 유전자는 변형되고, 예를 들어, 발현이 파괴되어 발현이 부분적으로 또는 전체적으로 감소된다. 특정 양태에서, 하나 이상의 유전자는 본 개시의 과정을 사용하여 녹다운되거나 녹아웃된다. 유전자 발현의 파괴 또는 유전자 녹아웃 또는 녹다운은 본 개시의 전기천공 장치 및/또는 방법에 따라 세포를 전기천공하여 하나 이상의 RGEN, 제한 효소, ZFN, 또는 TALEN을 도입함으로써 달성될 수 있다. 일부 양태에서, 세포는 하나 이상의 RGEN, 제한 효소, ZFN, 또는 TALEN이 순차적으로 도입되어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 유전자를 순차적으로 파괴, 녹아웃 또는 녹다운함에 따라 세포의 연속 편집을 가능하게 하도록 순차적으로 전기천공된다. 세포에서 편집되는 유전자는 임의의 종류일 수 있지만, 특정 양태에서, 유전자는 유전자 생성물이 본원에 기재된 바와 같이 바람직하지 않은 표현형 형질과 상관관계가 있는 유전자이다.
a.
핵산
[0255]
양태는 치료적 핵산을 포함하는 조성물로 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 조직, 또는 이들의 유도체를 전기천공하는 것에 관한 것이다. 특정 양태에서, 핵산 분자는 올리고뉴클레오티드의 형태일 수 있다.
[0256]
용어 "올리고" 또는 "올리고뉴클레오티드"는 데옥시리보핵산(DNA), 및 적절한 경우, 리보핵산(RNA)과 같은 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 상기 용어는 또한 뉴클레오티드 유사체로부터 제조된 RNA 또는 DNA의 등가물, 유도체, 변이체 및 유사체, 및 기술되는 양태에 적용 가능한 바와 같이, 단일(센스 또는 안티센스) 및 이중-가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 데옥시리보뉴클레오티드는 데옥시아데노신, 데옥시시티딘, 데옥시구아노신, 및 데옥시티미딘을 포함한다. 명확성을 위해, 본원에서 DNA 또는 RNA일 수 있는 핵산의 뉴클레오티드를 지칭할 때, 용어 "아데노신", "시티딘", "구아노신", 및 "티미딘"이 사용된다. 핵산이 RNA인 경우, 우라실 염기를 갖는 뉴클레오티드는 우리딘인 것으로 이해된다.
[0257]
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용되며, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 이들의 유사체인 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 공지되거나 공지되지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편(예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 트랜스퍼 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 분리된 DNA, 임의의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재시, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 폴리뉴클레오티드의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후, 예를 들어, 표지 성분과의 컨쥬게이션에 의해 추가로 변형될 수 있다. 상기 용어는 또한 이중-가닥 및 단일-가닥 분자 둘 모두를 지칭한다. 달리 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오티드인 본 개시의 임의의 양태는 이중-가닥 형태 및 이중-가닥 형태를 구성하는 것으로 공지되거나 예측되는 각각의 2개의 상보적인 단일-가닥 형태 둘 모두를 포함한다.
[0258]
DNA 올리고뉴클레오티드는 적어도, 최대, 또는 약 10, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 또는 600개의 뉴클레오티드 내지 적어도, 최대, 또는 약 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4750, 또는 5000개의 뉴클레오티드 길이, 또는 10개 뉴클레오티드 내지 5000개 뉴클레오티드의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위일 수 있다. 특정 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 10개 초과의 뉴클레오티드, 또는 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 또는 40개 초과의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 약 30 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 15 내지 약 150개의 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 100개의 뉴클레오티드, 또는 약 40 내지 약 100개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 코딩 서열의 길이에 관계없이, 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 다른 코딩 세그먼트 등과 같은 다른 핵산 서열과 조합될 수 있어, 이들의 전체 길이는 상당히 다를 수 있다.
[0259]
전기천공 절차 동안 올리고뉴클레오티드의 농도는 전기천공 챔버 및/또는 샘플 용기에서 올리고뉴클레오티드의 최종 농도일 수 있다. 올리고뉴클레오티드 농도는 적어도, 최대, 또는 약 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 또는 300 내지 약 350, 400, 500, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 또는 5000 μg/mL, 또는 0.01 μg/mL 내지 5000 μg/mL의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위일 수 있다. 특정 양태에서, 올리고뉴클레오티드 농도는 적어도 1 μg/mL이다. 추가 양태에서, 올리고뉴클레오티드의 농도는 적어도, 최대, 또는 정확히 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 또는 300 μg/mL, 또는 1 μg/mL 내지 300 μg/mL의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위이다.
[0260]
본 개시의 맥락에서, 용어 "비변형된 올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA)의 올리고머 또는 중합체를 지칭한다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 비변형된 올리고뉴클레오티드이다. 이 용어는 자연 발생 핵염기, 당, 및 공유 뉴클레오시드간 연결로 구성된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "올리고뉴클레오티드 유사체"는 올리고뉴클레오티드와 유사한 방식으로 기능하는 하나 이상의 비-자연 발생 부분을 갖는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 이러한 비-자연 올리고뉴클레오티드는 종종, 예를 들어, 향상된 세포 흡수, 다른 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 표적에 대한 향상된 친화성, 및 뉴클레아제의 존재 하에 증가된 안정성과 같은 바람직한 특성 때문에 자연 발생 형태보다 선택된다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 비변형된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 지칭하는데 사용될 수 있다.
[0261]
핵산 분자의 특정 예는 변형된, 즉, 비-자연 발생 뉴클레오시드간 연결을 함유하는 핵산 분자를 포함한다. 이러한 비-자연 뉴클레오시드간 연결은 종종, 예를 들어, 향상된 세포 흡수, 다른 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 표적에 대한 향상된 친화성, 및 뉴클레아제의 존재 하에 증가된 안정성과 같은 바람직한 특성 때문에 자연 발생 형태보다 선택된다. 특정 양태에서, 변형은 메틸 기를 포함한다.
[0262]
핵산 분자는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결을 가질 수 있다. 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 변형된 뉴클레오시드간 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드는 인 원자를 보유하는 뉴클레오시드간 연결 뿐만 아니라 인 원자를 갖지 않는 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 본 명세서의 목적을 위해, 그리고 때때로 당 분야에서 참조되는 바와 같이, 뉴클레오시드간 백본에 인 원자를 갖지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드도 올리고뉴클레오시드로 간주될 수 있다.
[0263]
핵산 분자에 대한 변형은 하나 또는 둘 모두의 말단 뉴클레오티드가 변형된 변형을 포함할 수 있다.
[0264]
하나의 적합한 인-함유 변형된 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다. 다수의 다른 변형된 올리고뉴클레오티드 백본(뉴클레오시드간 연결)이 당 분야에 공지되어 있으며, 이러한 양태의 맥락에서 유용할 수 있다. 인-함유 뉴클레오시드간 연결의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 번호 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243, 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,194,599; 5,565,555; 5,527,899; 5,721,218; 5,672,697; 5,625,050; 5,489,677; 및 5,602,240을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
[0265]
내부에 인 원자를 포함하지 않는 변형된 올리고뉴클레오시드 백본(뉴클레오시드간 연결)은 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 혼합된 헤테로원자와 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오시드간 연결에 의해 형성된 뉴클레오시드간 연결을 갖는다. 이들은 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 것들을 포함하여, 아미드 백본을 갖는 것들; 및 기타를 포함한다. 상기 인-비함유 올리고뉴클레오시드의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 번호 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 5,792,608; 5,646,269; 및 5,677,439를 포함하나 이에 제한되지 않으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
[0266]
올리고머 화합물은 또한 올리고뉴클레오티드 모방체를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드에 적용될 때 용어 모방체는 올리고머 화합물을 포함하는 것으로 의도되며, 여기서 푸라노스 고리만 또는 푸라노스 고리와 뉴클레오티드간 연결 둘 모두가 신규한 기로 대체되고, 푸라노스 고리만이, 예를 들어, 모르폴리노 고리로 대체되는 것은 또한 당 분야에서 당 대용물인 것으로 지칭된다. 헤테로사이클릭 염기 모이어티 또는 변형된 헤테로사이클릭 염기 모이어티는 적절한 표적 핵산과의 하이브리드화를 위해 유지된다. 올리고뉴클레오티드 모방체는 올리고머 화합물, 예를 들어, 펩티드 핵산(PNA) 및 사이클로헥세닐 핵산(CeNA로 공지됨, 문헌[Wang et al., J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 8595-8602] 참조)을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 모방체의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 번호 5,539,082; 5,714,331; 및 5,719,262를 포함하나 이에 제한되지 않으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 올리고뉴클레오티드 모방체의 또 다른 부류는 포스포노모노에스테르 핵산으로 지칭되며, 백본에 인 기를 포함한다. 이러한 부류의 올리고뉴클레오티드 모방체는 핵산의 검출을 위한 프로브로서 및 분자 생물학에서 사용하기 위한 보조제로서, 유전자 발현 억제(안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 센스 올리고뉴클레오티드 및 삼중-형성 올리고뉴클레오티드) 영역에서 유용한 물리적 및 생물학적 및 약리학적 특성을 갖는 것으로 보고된다. 푸라노실 고리가 사이클로부틸 모이어티로 대체된 또 다른 올리고뉴클레오티드 모방체가 보고되었다.
[0267]
핵산 분자는 또한 하나 이상의 변형되거나 치환된 당 모이어티를 함유할 수 있다. 염기 모이어티는 적절한 핵산 표적 화합물과의 하이브리드화를 위해 유지된다. 당 변형은 올리고머 화합물에 뉴클레아제 안정성, 결합 친화성 또는 일부 다른 이로운 생물학적 특성을 부여할 수 있다.
[0268]
대표적인 변형된 당은 카르보사이클릭 또는 비사이클릭 당, 2', 3' 또는 4' 위치 중 하나 이상에 치환기를 갖는 당, 당의 하나 이상의 수소 원자 대신에 치환기를 갖는 당, 및 당의 임의의 2개의 다른 원자 사이에 연결을 갖는 당을 포함한다. 다수의 당 변형이 당 분야에 공지되어 있으며, 2' 위치에서 변형된 당 및 당의 임의의 2개 원자 사이에 브릿지를 갖는 당(당이 바이사이클릭이 되도록 함)이 이러한 양태에서 특히 유용하다. 이러한 양태에서 유용한 당 변형의 예는 OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; 또는 O-알킬-O-알킬로부터 선택된 당 치환기를 포함하는 화합물을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 여기서 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 비치환된 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. 2-메톡시에톡시(2'-O-메톡시에틸, 2'-MOE, 또는 2'-OCH2CH2OCH3로도 공지됨), 2'-O-메틸(2'-O-CH3), 2'-플루오로(2'-F), 또는 4' 탄소 원자를 2' 탄소 원자에 연결하는 브릿지 기를 갖는 바이사이클릭 당 변형된 뉴클레오시드가 특히 적합하며, 여기서 예시적인 브릿지 기는 -CH2-O-, -(CH2)2-O- 또는 -CH2-N(R3)-O를 포함하고, 여기서 R3은 H 또는 C1-C12 알킬이다.
[0269]
뉴클레오티드에 증가된 뉴클레아제 내성 및 매우 높은 결합 친화성을 부여하는 한 가지 변형은 2'-MOE 측쇄이다(Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). 2'-MOE 치환의 즉각적인 이점 중 하나는 결합 친화성의 개선이며, 이는 O-메틸, O-프로필, 및 O-아미노프로필과 같은 많은 유사한 2' 변형보다 크다. 2'-MOE 치환기를 갖는 올리고뉴클레오티드는 또한 생체내 사용을 위한 유망한 특징을 갖는 유전자 발현의 안티센스 억제제인 것으로 나타났다(Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; and Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
[0270]
2'-당 치환기는 아라비노(위) 위치 또는 리보(아래) 위치에 존재할 수 있다. 하나의 2'-아라비노 변형은 2'-F이다. 유사한 변형이 또한 올리고머 화합물 상의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오시드 위 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오티드 내의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 이루어질 수 있다. 올리고머 화합물은 또한 펜토푸라노실 당 대신에 사이클로부틸 모이어티와 같은 당 모방체를 가질 수 있다. 이러한 변형된 당 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 번호 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747; 및 5,700,920을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
[0271]
대표적인 당 치환기는 명칭 "Capped 2'-Oxyethoxy Oligonucleotides"의 미국 특허 번호 6,172,209에 기재되어 있으며, 그 전체는 본원에 참조로 포함된다. 대표적인 사이클릭 당 치환기는 명칭 "RNA Targeted 2'-Oligomeric compounds that are Conformationally Preorganized"의 미국 특허 번호 6,271,358에 기재되어 있으며, 그 전체는 본원에 참조로 포함된다. 대표적인 구아니디노 치환기는 명칭 "Functionalized Oligomers"의 미국 특허 번호 6,593,466에 기재되어 있으며, 그 전체는 본원에 참조로 포함된다. 대표적인 아세트아미도 치환기는 미국 특허 번호 6,147,200에 기재되어 있으며, 그 전체는 본원에 참조로 포함된다.
[0272]
핵산 분자는 또한 자연 발생 또는 합성 비변형된 핵염기와 구조적으로 구별되지만 기능적으로 상호교환 가능한 하나 이상의 핵염기(종종 당 분야에서 간단히 "염기"로 지칭됨) 변형 또는 치환을 함유할 수 있다. 이러한 핵염기 변형은 올리고머 화합물에 뉴클레아제 안정성, 결합 친화성 또는 일부 다른 이로운 생물학적 특성을 부여할 수 있다. 본원에서 사용되는 "비변형된" 또는 "자연" 핵염기는 퓨린 염기 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 본원에서 헤테로사이클릭 염기 모이어티로도 지칭되는 변형된 핵염기는 다른 합성 및 자연 핵염기를 포함하며, 그 중 많은 예는 특히 예를 들어 5-메틸시토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌이다.
[0273]
헤테로사이클릭 염기 모이어티는 또한 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클, 예를 들어, 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈으로 대체된 것을 포함할 수 있다. 일부 핵염기는 미국 특허 번호 3,687,808에 기재된 것들, 문헌[The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990]에 기재된 것들, 문헌[Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613]에 기재된 것들, 및 문헌[Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993]에 기재된 것들을 포함한다. 이러한 핵염기 중 일부는 올리고머 화합물의 결합 친화성을 증가시키는데 특히 유용하다. 이들은 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, 예를 들어, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함한다.
[0274]
핵산 분자에 대한 추가 변형은 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 2009/0221685에 개시되어 있다. 또한, 핵산 분자에 대한 추가적인 적합한 컨쥬게이트가 본원에 개시된다.
b.
단백질
[0275]
양태는 치료적 단백질 또는 펩티드를 포함하는 조성물로 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 조직, 또는 이들의 유도체를 전기천공하는 것에 관한 것이다.
[0276]
본원에서 사용되는 "단백질" 또는 "펩티드" 또는 "폴리펩티드"는 적어도 2개의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "야생형"은 유기체에서 자연적으로 발생하는 분자의 내인성 버전을 지칭한다. 일부 양태에서, 단백질 또는 폴리펩티드의 야생형 버전이 사용되지만, 본 개시의 많은 양태에서, 변형된 단백질 또는 폴리펩티드가 면역 반응을 생성하기 위해 사용된다. 상기 기재된 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있다. "변형된 단백질" 또는 "변형된 폴리펩티드" 또는 "변이체"는 이의 화학 구조, 특히 이의 아미노산 서열이 야생형 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여 변경된 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 양태에서, 변형된/변이체 단백질 또는 폴리펩티드는 적어도 하나의 변형된 활성 또는 기능을 갖는다(단백질 또는 폴리펩티드가 다수의 활성 또는 기능을 가질 수 있음을 인지함). 변형된/변이체 단백질 또는 폴리펩티드는 하나의 활성 또는 기능과 관련하여 변경될 수 있지만 면역원성과 같은 다른 측면에서 야생형 활성 또는 기능을 보유할 수 있는 것으로 구체적으로 고려된다.
[0277]
단백질이 본원에서 구체적으로 언급되는 경우, 이는 일반적으로 천연(야생형) 또는 재조합(변형된) 단백질, 또는 선택적으로 임의의 신호 서열이 제거된 단백질에 대한 언급이다. 단백질은 본래의 유기체로부터 직접 분리되거나, 재조합 DNA/외인성 발현 방법에 의해 생산되거나, 고체-상 펩티드 합성(SPPS) 또는 다른 시험관내 방법에 의해 생산될 수 있다. 특정 양태에서, 폴리펩티드(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 세그먼트 및 재조합 벡터가 존재한다. 용어 "재조합"은 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드의 명칭과 함께 사용될 수 있고, 이는 일반적으로 시험관내에서 조작된 핵산 분자로부터 생산된 폴리펩티드 또는 이러한 분자의 복제 생성물을 지칭한다.
[0278]
특정 양태에서, 단백질 또는 폴리펩티드 크기(야생형 또는 변형된)는 적어도, 최대, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500개 이상의 아미노산 잔기, 또는 1개 아미노산 내지 2500개 아미노산의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위, 또는 본원에 기술되거나 언급된 상응하는 아미노 서열의 유도체를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 폴리펩티드는 트렁케이션에 의해 돌연변이되어, 이들을 상응하는 야생형보다 짧게 만들 수 있고, 또한 이들은 특정 기능(예를 들어, 표적화 또는 국소화를 위해, 강화된 면역원성을 위해, 정제 목적 등)을 갖는 이종성 단백질 또는 폴리펩티드 서열을 융합하거나 컨쥬게이션함으로써 변경될 수 있는 것으로 고려된다. 본원에서 사용되는 용어 "도메인"은 단백질 또는 폴리펩티드의 임의의 별개의 기능적 또는 구조적 단위를 지칭하고, 일반적으로 당업자에 의해 인식될 수 있는 구조 또는 기능을 갖는 아미노산의 서열을 지칭한다.
[0279]
뉴클레오티드 뿐만 아니라 다양한 유전자에 대한 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드 서열은 이전에 개시되었으며, 인정된 컴퓨터 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 일반적으로 사용되는 2개의 데이터베이스는 National Center for Biotechnology Information의 GENEBANK® 및 GENPEPT® 데이터베이스(on the World Wide Web at ncbi.nlm.nih.gov) 및 The Universal Protein Resource(UNIPROT®; on the World Wide Web at uniprot.org)이다. 이러한 유전자에 대한 코딩 영역은 본원에 개시된 기술을 사용하여 또는 당업자에게 공지된 바와 같이 전기천공될 수 있다.
[0280]
전기천공 절차 동안 단백질 또는 폴리펩티드의 농도는 전기천공 챔버 및/또는 샘플 용기에서 단백질의 최종 농도일 수 있다. 전기천공 절차 동안 폴리펩티드의 농도는 적어도, 최대, 또는 약 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300 내지 적어도, 최대, 또는 약 350, 400, 500, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 또는 5000 μg/mL, 또는 0.01 μg/mL 내지 5000 μg/mL의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위일 수 있다. 특정 양태에서, 폴리펩티드의 농도는 적어도 1 μg/mL이다. 추가 양태에서, 폴리펩티드의 농도는 적어도, 최대, 또는 정확히 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 또는 300 μg/mL, 또는 1 μg/mL 내지 300 μg/mL의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위이다.
[0281]
본 개시의 단백질은 또한 야생형 단백질과 비교하여 단백질의 대안적인 아미노산 서브유닛을 포함하여 동등하거나 심지어 개선된 2세대 변이체 폴리펩티드 또는 펩티드를 생성할 수 있다. 기능적 활성을 정의하는 것은 단백질의 상호작용 능력 및 특성이기 때문에, 특정 아미노산 치환이 단백질 서열 및 이의 상응하는 DNA 코딩 서열에서 이루어질 수 있지만, 그럼에도 불구하고 유사하거나 바람직한 특성을 갖는 단백질을 생산할 수 있다.
[0282]
용어 "기능적으로 동등한 코돈"은 아르기닌에 대한 6개의 상이한 코돈과 같이, 동일한 아미노산을 인코딩하는 코돈을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 생물학적으로 동등한 아미노산을 인코딩하는 코돈 또는 코돈들의 변화를 지칭하는 "중성 치환" 또는 "중성 돌연변이"가 또한 고려된다.
[0283]
본 개시의 아미노산 서열 변이체는 치환, 삽입, 또는 결실 변이체일 수 있다. 본 개시의 폴리펩티드의 변이는 야생형과 비교하여, 단백질 또는 폴리펩티드의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 비-인접 또는 인접 아미노산에 영향을 미칠 수 있다. 변이체는 야생형 단백질 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%, 예를 들어, 그 사이의 모든 값 및 범위만큼 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 변이체는, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 치환 아미노산을 포함할 수 있다.
[0284]
아미노산 및 핵산 서열은 추가 N- 또는 C-말단 아미노산, 또는 5' 또는 3' 핵산 서열과 같은 추가 잔기를 각각 포함할 수 있지만, 단백질 발현과 관련하여 서열이 생물학적 단백질 활성을 유지하는 한 여전히 야생형 서열과 본질적으로 동일하다는 것도 이해될 것이다. 말단 서열의 첨가는 특히, 예를 들어, 코딩 영역의 5' 또는 3' 부분 중 하나에 측접하는 다양한 비-코딩 서열을 포함할 수 있는 핵산 서열에 적용된다.
[0285]
결실 변이체는 전형적으로 천연 또는 야생형 단백질의 하나 이상의 잔기가 결여되어 있다. 개별 잔기가 결실될 수 있거나 다수의 인접 아미노산이 결실될 수 있다. 정지 코돈은 (치환 또는 삽입에 의해) 인코딩 핵산 서열로 도입되어 트렁케이션된 단백질을 생성할 수 있다.
[0286]
삽입 돌연변이체는 전형적으로 폴리펩티드의 비-말단 지점에서 아미노산 잔기의 첨가를 포함한다. 이는 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입을 포함할 수 있다. 말단 첨가도 생성될 수 있고, 본원에 기술되거나 언급된 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드의 다량체 또는 연쇄체(concatemer)인 융합 단백질을 포함할 수 있다.
[0287]
치환 변이체는 전형적으로 단백질 또는 폴리펩티드 내의 하나 이상의 부위에서 한 아미노산의 다른 아미노산으로의 교환을 함유하고, 다른 기능 또는 특성의 손실과 함께 또는 손실 없이 폴리펩티드의 하나 이상의 특성을 조절하도록 설계될 수 있다. 치환은 보존적일 수 있으며, 즉, 하나의 아미노산이 유사한 화학적 특성의 아미노산으로 대체된다. "보존적 아미노산 치환"은 한 아미노산 부류의 구성원과 동일한 부류의 또 다른 구성원의 교환을 포함할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 비-자연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며, 이는 전형적으로 생물학적 시스템에서의 합성보다는 화학적 펩티드 합성에 의해 혼입된다. 이들은 펩티드모방체 또는 다른 반전되거나 역전된 형태의 아미노산 모이어티를 포함한다.
[0288]
대안적으로, 치환은 "비-보존적"(또한 "비보존적")일 수 있다. 일부 양태에서, 비-보존적 치환은 폴리펩티드의 기능 또는 활성에 영향을 미친다. 일부 양태에서, 비-보존적 치환은 폴리펩티드의 기능 또는 활성에 영향을 미치지 않는다. 비-보존적 변화는 전형적으로 아미노산 잔기를 화학적으로 같지 않은 것으로 치환하는 것을 포함하고, 예를 들어, 비극성 또는 비하전된 아미노산 대신 극성 또는 하전된 아미노산으로 대체하는 경우, 및 그 반대의 경우이다. 비-보존적 치환은 아미노산 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류로부터의 구성원으로 교환하는 것을 포함할 수 있다.
c.
리보핵단백질
[0289]
양태는 세포의 유전자 편집을 위한 RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)(예를 들어, 리보핵단백질)를 통한 변경과 같이, 하나 이상의 DNA-결합 핵산을 포함하는 조성물로 세포를 전기천공하는 것에 관한 것이다. 특정 양태에서, 리보핵단백질은 클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 회문 반복부(CRISPR) 및 CRISPR-관련(Cas) 단백질을 포함한다.
[0290]
일반적으로, "CRISPR 시스템"은 Cas 유전자를 인코딩하는 서열, tracr(트랜스-활성화 CRISPR) 서열(예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "직접 반복부" 및 tracrRNA-처리된 부분 직접 반복부를 포함함), 가이드 서열(또한 내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서"로도 지칭됨), 및/또는 CRISPR 유전자좌로부터의 다른 서열 및 전사체를 포함하여, CRISPR-관련("Cas") 유전자의 발현에 관여하거나 활성을 지시하는 전사체 및 다른 요소를 집합적으로 지칭한다.
[0291]
CRISPR/Cas 뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은 DNA에 서열-특이적으로 결합하는 비-코딩 RNA 분자(가이드) RNA, 및 뉴클레아제 기능성(예를 들어, 2개의 뉴클레아제 도메인)을 갖는 Cas 단백질(예를 들어, Cas9)을 포함할 수 있다. CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는, 예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)와 같은 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체로부터 유래된 타입 I, 타입 II, 또는 타입 III CRISPR 시스템으로부터 유래될 수 있다.
[0292]
일부 양태에서, Cas 뉴클레아제 및 gRNA는 세포 내로 도입된다. 일반적으로, gRNA의 5' 말단에 있는 표적 부위는 상보적 염기쌍 형성을 사용하여 Cas 뉴클레아제를 표적 부위, 예를 들어, 유전자로 표적화한다. 표적 부위는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열, 예를 들어, 전형적으로 NGG 또는 NAG의 바로 5' 위치에 기반하여 선택될 수 있다. 이와 관련하여, gRNA는 표적 DNA 서열에 상응하도록 가이드 RNA의 처음 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 또는 10개의 뉴클레오티드를 변형시킴으로써 원하는 서열로 표적화된다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 요소를 특징으로 한다. 전형적으로, "표적 서열"은 일반적으로 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열을 지칭하며, 여기서 표적 서열과 가이드 서열 사이의 하이브리드화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 하이브리드화를 야기하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 제공된다면, 완전한 상보성이 반드시 필요한 것은 아니다.
[0293]
CRISPR 시스템은 표적 부위에서 이중 가닥 파손(DSB)을 유도한 후, 본원에 논의된 바와 같이 파괴 또는 변경을 유발할 수 있다. 다른 양태에서, "닉카제"로 간주되는 Cas9 변이체는 표적 부위에서 단일 가닥을 닉킹(nick)하는데 사용된다. 쌍을 이룬 닉카제는, 예를 들어, 특이성을 개선시키기 위해 사용될 수 있으며, 각각은 닉의 도입시 동시에 5' 오버행이 도입되도록 한 쌍의 상이한 gRNA 표적화 서열에 의해 지시된다. 다른 양태에서, 촉매적으로 불활성인 Cas9는 유전자 발현에 영향을 미치기 위해 전사 억제제 또는 활성제와 같은 이종성 이펙터 도메인에 융합된다.
[0294]
표적 서열은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드와 같은 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 표적 서열은 세포의 소기관 내와 같이 세포의 핵 또는 세포질에 위치할 수 있다. 일반적으로, 표적 서열을 포함하는 표적화된 유전자좌로의 재조합에 사용될 수 있는 서열 또는 주형은 "편집 주형" 또는 "편집 폴리뉴클레오티드" 또는 "편집 서열"로 지칭된다. 일부 양태에서, 외인성 주형 폴리뉴클레오티드는 편집 주형으로 지칭될 수 있다. 일부 양태에서, 재조합은 상동성 재조합이다.
[0295]
전형적으로, 내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서, CRISPR 복합체(표적 서열에 하이브리드화되고 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체화된 가이드 서열을 포함함)의 형성은 표적 서열 내 또는 근처(예를 들어, 표적 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50개 이상의 염기쌍 내)에서 하나 또는 둘 모두의 가닥의 절단을 초래한다. 야생형 tracr 서열의 전부 또는 일부(예를 들어, 야생형 tracr 서열의 최대, 적어도, 또는 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85개 이상의 뉴클레오티드)를 포함하거나 이로 구성될 수 있는 tracr 서열은 또한, 예를 들어, tracr 서열의 적어도 일부를 따라 가이드 서열에 작동 가능하게 연결된 tracr 메이트 서열의 전부 또는 일부에 하이브리드화됨으로써 CRISPR 복합체의 일부를 형성할 수 있다. tracr 서열은 tracr 메이트 서열에 하이브리드화되고 CRISPR 복합체의 형성에 참여하기에 충분한 상보성, 예를 들어, 최적으로 정렬될 때 tracr 메이트 서열의 길이를 따라 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 상보성을 갖는다.
[0296]
CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 유도하는 하나 이상의 벡터는 CRISPR 시스템의 요소의 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 지시하도록 세포 내로 (예를 들어, 전기천공에 의해) 도입될 수 있다. 성분은 또한 단백질 및/또는 RNA 및/또는 리보핵단백질로서 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas 효소, tracr-메이트 서열에 연결된 가이드 서열, 및 tracr 서열은 각각 별도의 벡터 상의 별도의 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, 동일하거나 상이한 조절 요소로부터 발현된 요소 중 2개 이상은 단일 벡터에서 조합될 수 있고, 하나 이상의 추가 벡터는 제1 벡터에 포함되지 않은 CRISPR 시스템의 임의의 성분을 제공한다. 벡터는 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열과 같은 하나 이상의 삽입 부위("클로닝 부위"로도 지칭됨)를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 하나 이상의 삽입 부위는 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열 요소의 상류 및/또는 하류에 위치한다. 다수의 상이한 가이드 서열이 사용될 때, 단일 발현 작제물은 세포 내의 다수의 상이한 상응하는 표적 서열에 CRISPR 활성을 표적화하는데 사용될 수 있다.
[0297]
벡터는 Cas 단백질과 같은 CRISPR 효소를 인코딩하는 효소-코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함할 수 있다. Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(Csn1 및 Csx12로도 공지됨), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csfl, Csf2, Csf3, Csf4, 이들의 상동체, 또는 이들의 변형된 버전을 포함한다. 이러한 효소가 알려져 있다; 예를 들어, S. 피오게네스 Cas9 단백질의 아미노산 서열은 수탁 번호 Q99ZW2 하에 SWISSPROT® 데이터베이스에서 찾을 수 있다.
[0298]
CRISPR 효소는 Cas9(예를 들어, S. 피오게네스 또는 S. 뉴모니아로부터 유래됨)일 수 있다. CRISPR 효소는 표적 서열의 위치에서, 예를 들어, 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 보체 내에서 하나 또는 둘 모두의 가닥의 절단을 지시할 수 있다. 벡터는 돌연변이된 CRISPR 효소가 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 둘 모두의 가닥을 절단하는 능력이 결여되도록 상응하는 야생형 효소에 대해 돌연변이된 CRISPR 효소를 인코딩할 수 있다. 예를 들어, S. 피오게네스로부터 Cas9의 RuvC I 촉매 도메인에서 아스파르테이트에서 알라닌으로의 치환(D10A)은 Cas9를 둘 모두의 가닥을 절단하는 뉴클레아제에서 닉카제(단일 가닥 절단)로 전환시킨다. 일부 양태에서, Cas9 닉카제는 DNA 표적의 센스 및 안티센스 가닥을 각각 표적화하는 가이드 서열(들), 예를 들어, 2개의 가이드 서열과 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 조합은 둘 모두의 가닥이 닉킹되고 NHEJ 또는 HDR을 유도하는데 사용될 수 있게 한다.
[0299]
일부 양태에서, CRISPR 효소를 인코딩하는 효소 코딩 서열은 특정 세포, 예를 들어, 진핵 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 진핵 세포는 인간, 마우스, 래트, 토끼, 개, 또는 비인간 영장류를 포함하나 이에 제한되지 않는 포유동물과 같은 특정 유기체의 세포이거나 이로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 천연 서열의 적어도 하나의 코돈을 천연 아미노산 서열을 유지하면서 해당 숙주 세포의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써 관심 숙주 세포에서 향상된 발현을 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정 편향을 나타낸다. 코돈 편향(유기체 간의 코돈 사용의 차이)은 종종 메신저 RNA(mRNA)의 번역 효율과 상관관계가 있으며, 이는 차례로, 그 중에서도 특히, 번역되는 코돈의 특성 및 특정 트랜스퍼 RNA(tRNA) 분자의 이용 가능성에 따라 달라지는 것으로 여겨진다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩티드 합성에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈의 반영이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기반하여 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤화될 수 있다.
[0300]
일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 하이브리드되고 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 지시하기 위해 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 충분한 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 양태에서, 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬될 때, 가이드 서열과 상응하는 표적 서열 사이의 상보성의 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 이상이거나 이를 초과한다.
[0301]
최적의 정렬은 서열을 정렬하기 위한 임의의 적합한 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있으며, 이의 비제한적인 예는 Smith-Waterman 알고리즘, Needleman-Wunsch 알고리즘, Burrows-Wheeler Transform에 기반한 알고리즘(예를 들어, Burrows Wheeler Aligner), Clustal W, Clustal X, BLAT, Novoalign(Novocraft Technologies), ELAND(ILLUMINA®, San Diego, Calif.), SOAP(soap.genomics.org.cn에서 이용 가능함), 및 Maq(maq.sourceforge.net에서 이용 가능함)을 포함한다.
[0302]
CRISPR 효소는 하나 이상의 이종성 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질의 일부일 수 있다. CRISPR 효소 융합 단백질은 임의의 추가적인 단백질 서열, 및 선택적으로 임의의 2개의 도메인 사이에 링커 서열을 포함할 수 있다. CRISPR 효소에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예는 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열, 및 하기 활성 중 하나 이상을 갖는 단백질 도메인을 비제한적으로 포함한다: 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성. 에피토프 태그의 비제한적인 예는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그, 및 티오레독신(Trx) 태그를 포함한다. 리포터 유전자의 예는 글루타티온-5-트랜스퍼라제(GST), 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타 갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시페라제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 시안 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP), 및 청색 형광 단백질(BFP)을 포함하는 자가형광 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는다. CRISPR 효소는 말토스 결합 단백질(MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인(DBD) 융합체, GAL4A DNA 결합 도메인 융합체, 및 단순 포진 바이러스(HSV) BP16 단백질 융합체를 포함하나 이에 제한되지 않는 DNA 분자에 결합하거나 다른 세포 분자에 결합하는 단백질 또는 단백질의 단편을 인코딩하는 유전자 서열에 융합될 수 있다. CRISPR 효소를 포함하는 융합 단백질의 일부를 형성할 수 있는 추가 도메인은 본원에 참조로 포함되는 US 20110059502에 기술되어 있다.
d.
벡터
[0303]
치료적 폴리뉴클레오티드, 단백질, 리보핵단백질, 또는 펩티드는 조성물에서 핵산 분자에 의해 인코딩될 수 있다. 특정 양태에서, 핵산 분자는 핵산 벡터의 형태일 수 있다.
[0304]
용어 "벡터"는 복제 및 발현될 수 있는 세포로의 도입을 위해 이종성 핵산 서열이 삽입될 수 있는 담체 핵산 분자를 지칭하는데 사용된다. 핵산 서열은 "이종성"일 수 있으며, 이는 벡터가 도입되는 세포 또는 혼입되는 핵산에 대해 외래의 맥락임을 의미하며, 이는 세포 또는 핵산의 서열과 상동성이지만 일반적으로 발견되지 않는 숙주 세포 또는 핵산 내의 위치에 있는 서열을 포함한다. 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스, 및 식물 바이러스), 및 인공 염색체(예를 들어, YAC)를 포함한다. 당업자는 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 작제할 장비를 잘 갖추고 있을 것이다(예를 들어, Sambrook et al., 2001; Ausubel et al., 1996, 둘 모두는 본원에 참조로 포함됨).
[0305]
용어 "발현 벡터"는 전사되거나 숙주 세포의 게놈으로 안정적으로 통합되고 후속하여 전사될 수 있는 유전자 생성물의 적어도 일부를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 지칭한다. 일부 경우에, 핵산 분자는 이후 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드로 번역된다. 폴리뉴클레오티드, 단백질, 리보핵단백질, 또는 펩티드를 발현시키기 위해, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 리보핵단백질, 또는 펩티드를 인코딩하는 DNA는 유전자 영역이 전사 및 번역 "제어 서열"에 작동 가능하게 연결되도록 발현 벡터에 삽입된다. 발현 벡터는 특정 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 전사 및 가능하게는 번역에 필요한 핵산 서열을 지칭하는 다양한 "제어 서열"을 함유할 수 있다. 전사 및 번역을 지배하는 제어 서열에 추가하여, 벡터 및 발현 벡터는 또한 다른 기능을 제공하고 본원에 기재된 핵산 서열을 함유할 수 있다.
[0306]
전형적으로, 임의의 숙주 세포에서 사용되는 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 유지 및 외인성 뉴클레오티드 서열의 클로닝 및 발현을 위한 서열을 함유한다. 집합적으로 "플랭킹 서열"로 지칭되는 이러한 서열은 전형적으로 하기 작동적으로 연결된 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상을 포함한다: 프로모터, 하나 이상의 인핸서 서열, 복제 기점, 전사 종결 서열, 공여체 및 수용체 스플라이스 부위를 함유하는 완전한 인트론 서열, 폴리펩티드 분비를 위한 리더 서열을 인코딩하는 서열, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 서열, 발현될 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 삽입하기 위한 폴리링커 영역, 및 선택 가능한 마커 요소. 이러한 서열 및 이를 사용하는 방법은 당 분야에 잘 알려져 있다.
[0307]
"프로모터"는 제어 서열이다. 프로모터는 전형적으로 전사의 개시 및 속도가 제어되는 핵산 서열의 영역이다. 이는 RNA 폴리머라제 및 다른 전사 인자와 같은 조절 단백질 및 분자가 결합할 수 있는 유전 요소를 함유할 수 있다. 어구 "작동적으로 위치된", "작동적으로 연결된", "제어 하에" 및 "전사 제어 하에"는 프로모터가 해당 서열의 전사 개시 및 발현을 제어하기 위해 핵산 서열과 관련하여 정확한 기능적 위치 및/또는 배향에 있음을 의미한다. 프로모터는 핵산 서열의 전사 활성화에 관여하는 시스-작용 조절 서열을 지칭하는 "인핸서"와 함께 사용되거나 사용되지 않을 수 있다.
[0308]
폴리뉴클레오티드를 인코딩하는 펩티드 또는 단백질의 발현을 제어하기 위해 사용되는 특정 프로모터는 표적화된 세포, 바람직하게는 박테리아 세포에서 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 한 중요하지 않은 것으로 생각된다. 인간 세포가 표적화되는 경우, 폴리뉴클레오티드 코딩 영역을 인간 세포에서 발현될 수 있는 프로모터에 인접하게 및 그 프로모터의 제어 하에 위치시키는 것이 바람직하다. 일반적으로 말해서, 이러한 프로모터는 박테리아, 인간 또는 바이러스 프로모터를 포함할 수 있다.
[0309]
특정 개시 신호는 또한 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 필요할 수 있다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 또는 인접 서열을 포함한다. ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 번역 제어 신호가 제공되어야 할 수 있다. 당업자는 이를 용이하게 결정하고 필요한 신호를 제공할 수 있을 것이다.
[0310]
벡터는 다중 제한 효소 부위를 함유하는 핵산 영역인 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함할 수 있으며, 이들 중 임의의 부위는 벡터를 분해하기 위해 표준 재조합 기술과 함께 사용될 수 있다. (본원에 참조로 포함된 Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, and Cocea, 1997 참조).
[0311]
대부분의 전사된 진핵생물 RNA 분자는 일차 전사체로부터 인트론을 제거하기 위해 RNA 스플라이싱을 거칠 것이다. 게놈 진핵생물 서열을 함유하는 벡터는 단백질 발현을 위한 전사체의 적절한 처리를 보장하기 위해 공여체 및/또는 수용체 스플라이싱 부위를 필요로 할 수 있다. (본원에 참조로 포함된 Chandler et al., 1997 참조).
[0312]
벡터 또는 작제물은 일반적으로 적어도 하나의 종결 신호를 포함할 것이다. "종결 신호" 또는 "종결자"는 RNA 폴리머라제에 의한 RNA 전사체의 특정 종결에 관여하는 DNA 서열로 구성된다. 따라서, 특정 양태에서, RNA 전사체의 생산을 종료시키는 종결 신호가 고려된다. 종결자는 바람직한 메시지 수준을 달성하기 위해 생체내에서 필요할 수 있다. 진핵생물 시스템에서, 종결자 영역은 또한 폴리아데닐화 부위를 노출시키기 위해 새로운 전사체의 부위-특이적 절단을 허용하는 특정 DNA 서열을 포함할 수 있다. 이는 전사체의 3' 말단에 약 200 A 잔기(polyA)의 스트레치를 첨가하기 위해 특수화된 내인성 폴리머라제에 신호를 보낸다. 이 polyA 꼬리로 변형된 RNA 분자는 더 안정한 것으로 보이며 더 효율적으로 번역된다. 따라서, 진핵생물과 관련된 다른 양태에서, 종결자는 RNA의 절단을 위한 신호를 포함하는 것이 바람직하고, 종결자 신호는 메시지의 폴리아데닐화를 촉진하는 것이 보다 바람직하다. 유전자 발현, 특히 진핵생물 유전자 발현에서, 전형적으로 전사체의 적절한 폴리아데닐화를 수행하기 위해 폴리아데닐화 신호를 포함할 것이다.
[0313]
숙주 세포에서 벡터를 증식시키기 위해, 벡터는 또한 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제 부위의 하나 이상의 기점(종종 "ori"로 명명됨)을 함유할 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포가 효모인 경우 자율 복제 서열(ARS)이 사용될 수 있다.
[0314]
일부 벡터는 벡터가 원핵 및 진핵 세포 둘 모두에서 복제 및/또는 발현되도록 하는 제어 서열을 사용할 수 있다. 당업자는 상기 기재된 모든 숙주 세포를 인큐베이션하여 이들을 유지하고 벡터의 복제를 허용하는 조건을 추가로 이해할 것이다. 또한, 벡터의 대규모 생산 뿐만 아니라 벡터 및 이의 동족 폴리펩티드, 단백질, 또는 펩티드에 의해 인코딩된 핵산의 생산을 가능하게 하는 기술 및 조건이 이해되고 공지되어 있다.
[0315]
전기천공 절차 동안 벡터의 농도는 전기천공 챔버 및/또는 샘플 용기에서 벡터의 최종 농도일 수 있다. 벡터 농도는 정확히, 적어도, 또는 최대 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300 내지 약 350, 400, 500, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000 μg/mL, 또는 0.01 μg/mL 내지 5000 μg/mL의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위일 수 있다. 특정 양태에서, 벡터의 농도는 적어도 10 μg/mL이다. 추가 양태에서, 벡터의 농도는 적어도, 최대, 또는 정확히 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 또는 300 μg/mL, 또는 1 μg/mL 내지 300 μg/mL의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위이다.
[0316]
마커를 발현하는 발현 벡터가 본 개시에 유용할 수 있는 것으로 고려된다. 다른 양태에서, 마커는 발현 벡터가 아니라 mRNA 상에서 인코딩된다.
[0317]
특정한 구체적인 양태에서, 전기천공에 의해 전달 비히클 내로 트랜스펙션된 조성물은 비-바이러스성이다(즉, 임의의 바이러스 성분을 함유하지 않음). 비-바이러스 방법은 독성을 감소시키고/시키거나 방법의 안전성을 개선시킬 수 있는 것으로 고려된다.
e.
마커
[0318]
특정 양태에서, 본 개시의 조성물로 트랜스펙션된 세포, 세포 입자, 지질 소포, 리포솜, 조직, 또는 이들의 유도체는 조성물에 마커를 포함시킴으로써 시험관내 또는 생체내에서 식별될 수 있다. 이러한 마커는 세포에 식별 가능한 변화를 부여하여, 조성물로 트랜스펙션된 세포의 용이한 식별을 가능하게 할 것이다.
[0319]
일반적으로, 선택 가능한 마커는 선택을 가능하게 하는 특성을 부여하는 것이다. 양성 선택 가능한 마커는 마커의 존재로 인해 선택이 가능한 것이고, 음성 선택 가능한 마커는 이의 존재가 선택을 방해하는 것이다. 특정 양태에서, 전기천공 후, 전기천공된 조성물을 내재화한 전달 비히클은 음성 선택에 의해 선택된다. 다른 양태에서, 전기천공 후, 전기천공 작제물을 내재화한 세포는 양성 선택에 의해 선택된다.
[0320]
양성 선택 가능한 마커의 예는 약물 내성 마커 또는 항생제 내성 유전자/마커이다. 일반적으로, 약물 선택 마커의 포함은 형질전환체의 클로닝 및 식별에 도움이 되며; 예를 들어, 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신, G418, 플레오마이신, 블라스티시딘, 및 히스티디놀에 대한 내성을 부여하는 유전자는 유용한 선택 가능한 마커이다.
[0321]
일부 양태에서, 선택은 전기천공 동안 선택 내성 유전자를 발현하지 않거나 선택 내성 유전자를 흡수하지 않은 세포의 생존력을 손상시킬 선택 제제의 농도에 세포를 노출시키는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 선택은 세포를 조건부 치사 농도의 선택 제제에 노출시키는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 선택 제제 또는 화합물은 항생제이다. 다른 양태에서, 선택 제제는 단독으로 또는 조합하여 G418(게네티신 및 G418 설페이트로도 공지됨), 퓨로마이신, 제오신, 하이그로마이신, 플레오마이신 또는 블라스티시딘이다. 특정 양태에서, 선택 제제의 농도는 정확히, 적어도, 또는 최대 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 또는 500 μg/L, mg/L, 또는 g/L, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위 또는 값일 수 있다. 특정 양태에서, 선택 제제의 농도는 0.1 μg/L 내지 0.5 μg/L, 0.5 μg/L 내지 1 μg/L, 1 μg/L 내지 2 μg/L, 2 μg/L 내지 5 μg/L, 5 μg/L 내지 10 μg/L, 10 μg/L 내지 100 μg/L, 100 μg/L 내지 500 μg/L, 0.1 mg/L 내지 0.5 mg/L, 0.5 mg/L 내지 1 mg/L, 1 mg/L 내지 2 mg/L, 2 mg/L 내지 5 mg/L, 5 mg/L 내지 10 mg/L, 10 mg/L 내지 100 mg/L, 100 mg/L 내지 500 mg/L, 0.1 g/L 내지 0.5 g/L, 0.5 g/L 내지 1 g/L, 1 g/L 내지 2 g/L, 2 g/L 내지 5 g/L, 5 g/L 내지 10 g/L, 10 g/L 내지 100 g/L, 또는 100 g/L 내지 500 g/L의 범위, 또는 0.1 μg/L 내지 500 g/L의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위이다. 특정 양태에서, 선택 제제의 농도는 (y)g/L이며, 여기서 'y'는 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 0.01 내지 100의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위를 비제한적으로 포함하는 임의의 값일 수 있다. 일부 양태에서, 선택 제제는 적어도, 최대, 또는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 또는 10 g/L, 또는 0.1 g/L 내지 10 g/L의 임의의 값 또는 그로부터 유도 가능한 범위의 조건부 치사 농도로 배양 배지에 존재한다.
[0322]
조건의 구현에 기반하여 형질전환체의 구별을 가능하게 하는 표현형을 부여하는 마커 이외에, GFP와 같은 스크리닝 가능한 마커를 포함하는 다른 유형의 마커가 또한 고려된다. 특정 양태에서, 마커는 형광 마커, 효소 마커, 발광 마커, 광활성 마커, 광전환 마커, 또는 비색 마커이다. 형광 마커는, 예를 들어, GFP 및 변이체, 예를 들어, YFP, RFP 등, 및 다른 형광 단백질, 예를 들어, DsRed, mPlum, mCherry, YPet, Emerald, CyPet, T-Sapphire, 및 Venus를 포함한다. 광활성 마커는, 예를 들어, KFP, PA-mRFP, 및 Dronpa를 포함한다. 광전환 마커는, 예를 들어, mEosFP, KikGR, 및 PS-CFP2를 포함한다. 발광 단백질은, 예를 들어, Neptune, FP595, 및 피알리딘(phialidin)을 포함한다. 대안적으로, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)와 같은 스크리닝 가능한 효소가 활용될 수 있다. 당업자는 또한 아마도 FACS 분석과 함께 면역학적 마커를 사용하는 방법을 알 것이다. 선택 가능하고 스크리닝 가능한 마커의 추가 예는 당업자에게 잘 알려져 있다.
[0323]
사용된 마커는 RNA 또는 DNA 상에 인코딩될 수 있다. 일부 양태에서, 마커는 RNA 상에 인코딩된다.
IV.
실시예
[0324]
다음 실시예는 본 개시의 바람직한 양태를 입증하기 위해 포함된다. 하기 실시예에 개시된 기술은 본 개시의 실시에서 잘 기능하는 것으로 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내고, 따라서 이의 실시를 위한 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시에 비추어, 개시된 특정 양태에서 많은 변경이 이루어질 수 있고, 본 개시의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 이해해야 한다.
A.
실시예 1 - mRNA를 이용한 확장된 T 세포의 반복된 전기천공
[0325]
도 35는 2개의 상이한 GFP mRNA 농도(100 μg/mL 및 200 μg/mL)로 확장된 림프구의 순차적인 전기천공을 위한 실험 설계를 예시한다. 0일에, CD3/CD28 비드로 3일 동안 확장시킨 후, 5 x 107개 T 세포/mL를 전기천공(EP) 완충제에 현탁시켰다. 전기천공을 +/- 녹색 형광 단백질(GFP) mRNA로 수행하고, 세포를 플레이팅하였다. 1일 또는 2일에, GFP-발현 세포를 EP 완충제에 재현탁시키고 GFP로 두 번째 전기천공하고, 세포를 플레이팅하였다. 세포 생존력을 1-5일에 Nucleocounter를 통해 측정하고, GFP 발현을 3 및 4일에 유세포 분석을 통해 검정하였다.
[0326]
도 36은 GFP mRNA로 확장된 림프구 세포의 순차적인 전기천공 후 3일 및 4일의 유세포 분석 데이터를 보여준다. 모든 mRNA 트랜스펙션된 세포는 > 95% GFP+였다.
[0327]
도 37a-37b는 순차적인 전기천공을 거친 림프구의 림프구 게이팅 및 세포 생존력을 보여준다. 연속 일에 mRNA가 있거나 없는 순차적인 전기천공은 림프구 및 염료 배제의 백분율에 의해 평가되는 바와 같이 세포 적합도(cell fitness)에 최소한의 영향을 미쳤다. EP 펄스 사이의 갭을 48시간으로 증가시키면(0일 및 2일의 순차적인 전기천공) 0일 및 1일에 EP 한 번 또는 순차적인 EP와 비교하여 약간 더 낮은 세포 적합도를 초래하였다.
[0328]
도 38a는 순차적으로 전기천공된 림프구에 의한 GFP 발현을 보여주고, 도 38b는 순차적으로 전기천공된 림프구에 대한 GFP 평균 형광 강도(MFI)를 보여준다. mRNA의 순차적인 EP는 단일 EP와 비교하여 트랜스진 발현의 수준 및 지속기간을 유의하게 증가시켰다.
B.
실시예 2 - mRNA를 이용한 확장된 T 세포의 반복된 전기천공, 전기천공 에너지의 효과
[0329]
본원에 기재된 실험의 경우, 용어 "에너지"는 샘플에 인가된 전기 펄스(또는 조합된 펄스) 동안 생성된 열을 지칭하고, 이는 전기 펄스(또는 조합된 펄스) 동안 샘플에 인가된 전계 강도 및 펄스 지속기간(또는 조합된 펄스 지속기간) 둘 모두에 비례한다. 따라서, 샘플에 "고에너지" 펄스를 인가하기 위해, 완충 조성물, 처리 조립체, 및 샘플 부피가 일정하게 유지되는 경우, "중간 에너지" 또는 "저에너지" 전기 펄스(또는 조합된 펄스)가 샘플에 인가될 때와 비교하여 전기 펄스(또는 조합된 펄스) 동안 더 많은 양의 열이 생성되도록 전계 강도 및 펄스 지속기간(또는 조합된 펄스 지속기간)을 포함하는 변수의 비율이 수정된다. 반대로, 샘플에 "저에너지" 펄스를 인가하기 위해, 완충 조성물, 처리 조립체, 및 샘플 부피가 일정하게 유지되는 경우, "고에너지" 또는 "중간 에너지" 전기 펄스(또는 조합된 펄스)가 샘플에 인가될 때와 비교하여 전기 펄스(또는 조합된 펄스) 동안 더 적은 양의 열이 생성되도록 전계 강도 및 펄스 지속기간(또는 조합된 펄스 지속기간)을 포함하는 변수의 비율이 수정된다.
[0330]
도 39a-39e는 2개의 상이한 GFP mRNA 농도(100 μg/mL 및 200 μg/mL)로 상이한 EP 에너지에서 확장된 림프구의 순차적인 전기천공을 위한 실험 설계를 예시한다. 도 39a에서, 림프구는 0일에 제1 중간 에너지 전기 펄스, 이어서 1일에 제2 저에너지 전기 펄스에 적용되었다. 0일의 제1 중간 에너지 전기 펄스는 1.5 kV/cm의 초기 전계 강도를 사용하였고, 1일의 제2 저에너지 전기 펄스는 1.3 kV/cm의 초기 전계 강도를 사용하였다. 도 39b에서, 림프구는 0일에 제1 중간 에너지 전기 펄스, 이어서 1일에 제2 고에너지 전기 펄스에 적용되었다. 0일의 제1 중간 에너지 전기 펄스는 1.5 kV/cm의 초기 전계 강도를 사용하였고, 1일의 제2 고에너지 전기 펄스는 1.88 kV/cm의 초기 전계 강도를 사용하였다. 도 39c에서, 림프구는 0일에 제1 중간 에너지 전기 펄스, 이어서 1일에 제2 중간 에너지 전기 펄스에 적용되었다. 0일의 제1 중간 에너지 전기 펄스는 1.5 kV/cm의 초기 전계 강도를 사용하였고, 1일의 제2 중간 에너지 전기 펄스는 1.5 kV/cm의 초기 전계 강도를 사용하였다. 도 39d에서, 림프구는 0일에 제1 고에너지 전기 펄스, 이어서 1일에 제2 저에너지 전기 펄스에 적용되었다. 0일의 제1 고에너지 전기 펄스는 1.88 kV/cm의 초기 전계 강도를 사용하였고, 1일의 제2 저에너지 전기 펄스는 1.3 kV/cm의 초기 전계 강도를 사용하였다. 도 39e에서, 림프구는 0일에 제1 고에너지 전기 펄스, 이어서 1일에 제2 중간 에너지 전기 펄스에 적용되었다. 0일의 제1 고에너지 전기 펄스는 1.88 kV/cm의 초기 전계 강도를 사용하였고, 1일의 제2 중간 에너지 전기 펄스는 1.5 kV/cm의 초기 전계 강도를 사용하였다.
[0331]
도 40a-40b는 2개의 상이한 GFP mRNA 농도(100 μg/mL 및 200 μg/mL)로 상이한 EP 에너지에서 확장된 림프구의 순차적인 전기천공 후 세 상이한 시점(24 hr, 48 hr, 및 72 hr)에 GFP mRNA를 발현하는 림프구의 집단을 보여준다.
[0332]
제1 중간 에너지 전기 펄스가 적용된 세포의 림프구 집단은 도 40a(Ex-T cell 2)에 도시되어 있다. 림프구에 도 39a에 기술되고 예시된 바와 같은 제1 중간 에너지 전기 펄스, 및 제2 저에너지 전기 펄스(도 40a, Ex-T cell 1); 도 39b에 기술되고 예시된 바와 같은 제1 중간 에너지 전기 펄스, 및 제2 고에너지 전기 펄스(도 40a, Ex-T cell 3); 및 도 39c에 기술되고 예시된 바와 같은 제1 중간 에너지 전기 펄스, 및 제2 중간 에너지 전기 펄스(도 40a, Ex-T cell 2)를 가하였다.
[0333]
제1 고에너지 전기 펄스가 적용된 세포의 림프구 집단은 도 40b(Ex-T cell 3)에 도시되어 있다. 림프구에 도 39d에 기술되고 예시된 바와 같은 제1 고에너지 전기 펄스, 및 제2 저에너지 전기 펄스(도 40b, Ex-T cell 1); 및 도 39e에 기술되고 예시된 바와 같은 제1 고에너지 전기 펄스, 및 제2 중간 에너지 전기 펄스(도 40b, Ex-T cell 2)를 가하였다.
[0334]
세포에 제1 중간 에너지 전기 펄스 또는 제1 고에너지 전기 펄스 및 저, 중간, 또는 고에너지의 제2 전기 펄스를 가한 후 림프구 집단 데이터를 비교하면, 림프구 회복은 도 39a-39e에 대해 기술되고 예시된 모든 5개의 에너지 조합에 대해 상이한 EP 에너지에서 확장된 림프구의 순차적인 전기천공 후 유사하였다.
[0335]
도 41a-41b는 림프구 생존력이 도 39a-39e에 기술되고 예시된 모든 5개의 EP 에너지 조합에 대해 상이한 EP 에너지에서 확장된 림프구의 순차적인 전기천공 후 유사하였음을 보여준다.
[0336]
도 42a-42b는 2개의 상이한 GFP mRNA 농도(100 μg/mL 및 200 μg/mL)로 상이한 EP 에너지에서 확장된 림프구의 순차적인 전기천공 후 세 상이한 시점(24 hr, 48 hr, 및 72 hr)에 림프구에 의한 GFP 발현을 보여준다.
[0337]
제1 중간 에너지 전기 펄스가 적용된 림프구에 의한 GFP 발현은 도 42a(Ex-T cell 2)에 도시되어 있다. 도 42a는 도 39a에 기술되고 예시된 바와 같은 제1 중간 에너지 전기 펄스, 및 제2 저에너지 전기 펄스(Ex-T cell 1)가 적용된 림프구에 의한 GFP 발현을 제공한다. 도 42a는 도 39b에 기술되고 예시된 바와 같은 제1 중간 에너지 전기 펄스, 및 제2 고에너지 전기 펄스(Ex-T cell 3)가 적용된 림프구에 의한 GFP 발현을 제공한다. 마지막으로, 도 42a는 도 39c에 기술되고 예시된 바와 같은 제1 중간 에너지 전기 펄스, 및 제2 중간 에너지 전기 펄스(Ex-T cell 2)가 적용된 림프구에 의한 GFP 발현을 제공한다.
[0338]
제1 고에너지 전기 펄스가 적용된 림프구에 의한 GFP 발현은 도 42b(Ex-T cell 3)에 도시되어 있다. 도 42b는 도 39d에 기술되고 예시된 바와 같은 제1 고에너지 전기 펄스, 및 제2 저에너지 전기 펄스(Ex-T cell 1)가 적용된 림프구에 의한 GFP 발현을 제공한다. 도 42b는 도 39e에 기술되고 예시된 바와 같은 제1 고에너지 전기 펄스, 및 제2 중간 에너지 전기 펄스(Ex-T cell 2)가 적용된 림프구에 의한 GFP 발현을 제공한다.
[0339]
세포에 제1 중간 에너지 전기 펄스 또는 제1 고에너지 전기 펄스 및 저, 중간, 또는 고에너지의 제2 전기 펄스를 가한 후 림프구에 의한 GPF 발현을 비교하면, GFP 발현은 도 39a-39e에 대해 기술되고 예시된 모든 5개의 EP 에너지 조합에 대해 상이한 EP 에너지에서 확장된 림프구의 순차적인 전기천공 후 유사하였다.
[0340]
도 43a-43b는 2개의 상이한 GFP mRNA 농도(100 μg/mL 및 200 μg/mL)로 상이한 EP 에너지에서 확장된 림프구의 순차적인 전기천공 후 세 상이한 시점(24 hr, 48 hr, 및 72 hr)에 림프구에 대한 GFP 평균 형광 강도(MFI)를 보여준다.
[0341]
제1 중간 에너지 전기 펄스가 적용된 림프구에 대한 GFP MFI는 도 43a(Ex-T cell 2)에 도시되어 있다. 도 43a는 도 39a에 기술되고 예시된 바와 같은 제1 중간 에너지 전기 펄스, 및 제2 저에너지 전기 펄스(Ex-T cell 1)가 적용된 림프구에 의한 GFP MFI를 제공한다. 도 43a는 또한 도 39b에 기술되고 예시된 바와 같은 제1 중간 에너지 전기 펄스, 및 제2 고에너지 전기 펄스(Ex-T cell 3)가 적용된 림프구에 의한 GFP MFI를 제공한다. 마지막으로, 도 43a는 도 39c에 기술되고 예시된 바와 같은 제1 중간 에너지 전기 펄스, 및 제2 중간 에너지 전기 펄스(Ex-T cell 2)가 적용된 림프구에 의한 GFP MFI를 제공한다.
[0342]
제1 고에너지 전기 펄스가 적용된 림프구에 대한 GFP MFI는 도 43b(Ex-T cell 3)에 도시되어 있다. 도 43b는 도 39d에 기술되고 예시된 바와 같은 제1 고에너지 전기 펄스, 및 제2 저에너지 전기 펄스(Ex-T cell 1)가 적용된 림프구에 의한 GFP MFI를 제공한다. 도 43b는 또한 도 39e에 기술되고 예시된 바와 같은 제1 고에너지 전기 펄스, 및 제2 중간 에너지 전기 펄스(Ex-T cell 2)가 적용된 림프구에 의한 GFP MFI를 제공한다. 제1 고에너지 전기 펄스가 적용된 림프구에서 더 높은 MFI가 관찰되었다.
[0343]
이러한 데이터는 연속 일에 mRNA로 세포의 반복된 전기천공이 단일 전기천공에 비해 유의하게 더 높은 트랜스진 발현을 초래한다는 것을 입증한다. 다양한 에너지 전기 펄스 순열에 대한 림프구 집단, 세포 생존력, 및 GFP 발현 사이에 주요 차이가 없기 때문에 활성화된 T 세포는 기재된 에너지 전기 펄스 순열을 사용하여 순차적으로 전기천공될 수 있다.
C.
실시예 3 - 활성화된 T 세포의 반복된 전기천공 및 연속 유전자 편집
[0344]
도 44는 TRAC 및 PD1을 녹아웃시키기 위한 2개의 상이한 리보핵단백질(RNP) 작제물을 사용한 활성화된 T 세포의 순차적인 전기천공을 위한 실험 설계를 예시한다. 도 44a 및 44b에 도시된 바와 같이, PBMC를 해동시키고, T 세포는 0일에 2x106개/mL 세포를 100 IU/mL IL2, 10 ng/mL IL-7, 및 5 ng/mL IL-15 뿐만 아니라 1:2.5 세포/비드의 비율로 항-CD3/CD28-컨쥬게이션된 자성 비드와 함께 2일 동안 배양함으로써 활성화되었다. 도 45는 2일 동안 사이토카인 및 CD3/CD28 비드와 함께 인큐베이션 후 CD3+- 및 CD25+-염색된 T 세포에 대한 형광-활성화 세포 분류(FACS)에 의해 측정된 T-세포의 활성화를 보여준다.
[0345]
2일 동안 활성화 후, 2일에 1x108개 T 세포/mL를 세척하고, 50 μL 총 반응 부피(5x106개 세포)에 대해 전기천공 완충제에 현탁시키고, 61 μM 야생형 Cas9(GENSCRIPT®)를 122 μM TRAC sgRNA(SYNTHEGO®)와 혼합함으로써 제조된 1:2 Cas9:sgRNA를 포함하는 TRAC RNP의 30.5 μM 스톡으로부터의 2 μM TRAC 리보핵단백질(RNP)로 전기천공하였다. 2일에 제1 고에너지 전기천공은 1.7 kV/cm의 초기 전계 강도를 갖는 전기 펄스를 사용하였다(T cell 3 프로토콜). TRAC 녹아웃을 위한 전기천공 후, T 세포를 37℃, 5% CO2에서 20분 동안 회수하였다. 이후, 2x106개의 전기천공된 T 세포/mL를 24시간 동안 배양한 후, 100 IU/mL IL2, 10 ng/mL IL-7, 및 5 ng/mL IL-15를 첨가하였다. 또한, TRAC 녹아웃에 대한 전기천공-후, 세포를 37℃, 5% CO2에서 20분 동안 휴지시키지 않고 대신 24시간 동안 배양을 위해 즉시 옮기는 비-휴지 조건을 시험하였다.
[0346]
3일에, 4x107개 T 세포/mL를 세척하고, 50 μL 총 반응 부피(2x106개 세포)에 대해 전기천공 완충제에 현탁시키고, 61 μM 야생형 Cas9(GENSCRIPT®)를 122 μM PD1 sgRNA(SYNTHEGO®)와 혼합함으로써 제조된 1:2 Cas9:sgRNA를 포함하는 PD1 RNP의 30.5 μM 스톡으로부터의 2 μM PD1 리보핵단백질(RNP)로 전기천공하였다. 3일에 제2 중간 에너지 전기천공은 1.5 kV/cm의 초기 전계 강도를 갖는 전기 펄스를 사용하였다(T cell 2 프로토콜). PD1 녹아웃을 위한 전기천공 후, T 세포를 37℃, 5% CO2에서 20분 동안 회수하였다. 이후, 2x106개의 전기천공된 T 세포/mL를 24시간 동안 배양한 후, 100 IU/mL IL2, 10 ng/mL IL-7, 및 5 ng/mL IL-15를 첨가하고, 세포를 1:2.5 세포/비드 비율의 CD3/CD28 비드로 재자극하였다.
[0347]
실험 대조군은 활성화되었지만 전기천공을 거치지 않은 T 세포 및 1.7 kV/cm의 초기 전계 강도를 갖는 전기 펄스를 사용하여 2일에 RNP 또는 다른 제제 없이 제1 고에너지 전기천공을 거친 활성화된 T 세포를 포함하였다(T cell 3 프로토콜).
[0348]
6일에, TRAC 녹아웃의 경우 전기천공 4일 후 및 PD1 녹아웃의 경우 전기천공 3일 후에, 100 IU/mL IL2, 10 ng/mL IL-7, 및 5 ng/mL IL-15를 첨가하고, 30000개의 수집된 이벤트에 대해 TRAC 및 PD1 녹아웃 효율을 평가하기 위해 FACS를 수행하였다. 도 46a는 염색되지 않은 T 세포에 대한 대표적인 게이팅을 보여준다. 도 46b는 T 세포가 TRAC 및 PD1 녹아웃을 위해 RNP로 전기천공되지 않은 실험에 대한 TRAC+ 및 PD1+ T 세포에 대한 대표적인 게이팅을 보여준다. 도 46c는 T 세포가 TRAC 및 PD1 녹아웃을 위해 RNP로 전기천공된 실험에 대한 TRAC+ 및 PD1+ T 세포에 대한 대표적인 게이팅을 보여준다. 도 44a-44b에 기재된 각각의 전기천공 조건에 대해 6일에 수득된 FACS 데이터를 정량화하여 도 46d에서 T 세포 집단 대 T 세포 생존력 및 도 46e에서 TRAC 및 PD1 녹아웃 효율을 나타내었다. 도 46d에 도시된 바와 같이, T 세포 생존력은 연속적으로 세포를 편집하기 위한 순차적인 전기천공에 의한 영향을 최소로 받으며, 이는 제1 및 제2 전기천공 이벤트 둘 모두 후의 세포 생존력이 전기천공이 수행되지 않은 대조군과 유사하였기 때문이다. 도 46e에 도시된 바와 같이, 2개의 상이한 RNP의 순차적인 전기천공은 TRAC 및 PD1 유전자좌에 대해 높은 녹아웃 효율을 생성할 수 있으며, TRAC 및 PD1 발현 둘 모두는 RNP 전기천공 후 5% 미만으로 감소하였다. 또한, 도 46f에 도시된 바와 같이, TRAC RNP-전기천공된 T 세포를 전기천공 후 37℃, 5% CO2에서 20분 동안 휴지시킨 후 24시간 동안 배양하는 것은 전기천공 후 37℃, 5% CO2에서 20분 동안 휴지시키지 않고 대신 24시간 동안 배양을 위해 즉시 옮겨진 TRAC RNP-전기천공된 T 세포와 비교하여 TRAC 녹아웃 효율을 증가시키지 않았다.
[0349]
FACS를 또한 6일에 수행하여 30 μL의 배양된 세포로부터의 총 세포 및 림프구 수를 측정함으로써 TRAC를 녹아웃시키기 위해 RNP 작제물을 사용한 전기천공 후 세포 생존력에 대한 37℃, 5% CO2에서 20분 동안의 세포 휴지 기간의 영향을 평가하였다. 염색되지 않은 T 세포 및 살아있는/죽은 7-아미노액티노마이신 D(7-AAD) 염색된 T 세포에 대한 게이팅은 도 47a에 도시되어 있다. 도 47b-47e에 도시된 바와 같이, 림프구 집단(도 47b), 림프구 생존력(도 47c), 총 세포 수(도 47d), 및 총 생존하는 림프구 수(도 47e)가 또한 최소로 영향을 받았으며, 여기서 비-휴지 조건은 전기천공 후 37℃, 5% CO2에서 20분 동안 휴지된 T 세포와 비교하여 약 5% 더 적은 살아있는 림프구 수를 가졌다.
* * *
[0350]
상기 명세서 및 실시예는 예시적인 양태의 구조 및 용도의 완전한 설명을 제공한다. 특정 양태가 어느 정도 구체적으로 또는 하나 이상의 개별 양태를 참조하여 상술되었지만, 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 개시된 양태에 대해 다수의 변경을 할 수 있다. 이와 같이, 방법 및 시스템의 다양한 예시적인 양태는 개시된 특정 형태로 제한되지 않도록 의도된다. 오히려, 이들은 청구범위의 범위 내에 속하는 모든 수정 및 대안을 포함하고, 제시된 것 이외의 양태는 제시된 양태의 특징의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 요소는 생략되거나 단일 구조로서 조합될 수 있고/있거나 연결이 대체될 수 있다. 또한, 적절한 경우, 상기 기재된 임의의 예의 양태는 기재된 다른 예 중 임의의 것의 양태와 조합되어 유사하거나 상이한 특성 및/또는 기능을 갖고 동일하거나 상이한 문제를 해결하는 추가의 예를 형성할 수 있다. 유사하게, 상기 기재된 이익 및 이점은 하나의 양태와 관련될 수 있거나 여러 양태와 관련될 수 있음이 이해될 것이다.
[0351]
청구범위는 수단을 더하거나 단계를 더한 기능 제한이 "~을 위한 수단" 또는 "~를 위한 단계"라는 문구(들)를 사용하여 특정 청구범위에 명시적으로 언급되지 않는 한, 이러한 제한을 포함하려는 의도가 아니며 포함하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
Claims (172)
- 하나 이상의 온전한 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 포함하는 샘플에 제1 프로토콜에 따른 제1 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 및
샘플에 제2 프로토콜에 따른 제2 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계를 포함하는 전기천공 방법으로서,
여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간이 제2 전계 강도 및/또는 제2 펄스 지속기간과 상이한, 방법. - 하나 이상의 온전한 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 포함하는 샘플에 제1 프로토콜에 따른 제1 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계;
샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및
샘플에 제2 프로토콜에 따른 제2 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계를 포함하는 전기천공 방법. - 하나 이상의 온전한 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 포함하는 샘플에 제1 프로토콜에 따른 제1 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계;
샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및
샘플에 제2 프로토콜에 따른 제2 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계를 포함하는 전기천공 방법으로서,
여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간이 제2 전계 강도 및/또는 제2 펄스 지속기간과 상이한, 방법. - 하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 샘플에 제1 프로토콜에 따른 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계; 및
샘플에 제2 프로토콜에 따른 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계를 포함하는 세포 유전자를 연속적으로 편집하는 방법으로서,
여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간이 제2 전계 강도 및/또는 제2 펄스 지속기간과 상이한, 방법. - 하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 샘플에 제1 프로토콜에 따른 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계;
샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및
샘플에 제2 프로토콜에 따른 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계를 포함하는 세포 유전자를 연속적으로 편집하는 방법. - 하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 샘플에 제1 프로토콜에 따른 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계;
샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및
샘플에 제2 프로토콜에 따른 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계를 포함하는 세포 유전자를 연속적으로 편집하는 방법으로서,
여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간이 제2 전계 강도 및/또는 제2 펄스 지속기간과 상이한, 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 제제가 동일한 제제인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 제제가 상이한 제제인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자인 방법.
- 제9항에 있어서, 핵산이 RNA이고, RNA가 mRNA, miRNA, shRNA, siRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 방법.
- 제9항에 있어서, 핵산이 DNA이고, DNA가 안티센스 올리고뉴클레오티드, 벡터, 또는 이중 센스 선형 DNA인 방법.
- 제9항에 있어서, 단백질이 리보핵단백질인 방법.
- 제12항에 있어서, 리보핵단백질이 Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 포함하는 방법.
- (a) 하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 세포 샘플에 제1 프로토콜에 따른 RNA를 포함하는 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계;
(b) 세포 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및
(c) 세포 샘플에 제2 프로토콜에 따른 RNA를 포함하는 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계를 포함하는 전기천공 방법으로서,
여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간이 제2 전계 강도 및/또는 제2 펄스 지속기간과 상이한, 방법. - (a) 하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 세포 샘플에 제1 프로토콜에 따른 DNA를 포함하는 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계;
(b) 세포 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및
(c) 세포 샘플에 제2 프로토콜에 따른 DNA를 포함하는 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계를 포함하는 전기천공 방법으로서,
여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간이 제2 전계 강도 및/또는 제2 펄스 지속기간과 상이한, 방법. - (a) 하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 세포 샘플에 제1 프로토콜에 따른 하나 이상의 단백질을 포함하는 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계;
(b) 세포 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및
(c) 세포 샘플에 제2 프로토콜에 따른 하나 이상의 단백질을 포함하는 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계를 포함하는 전기천공 방법으로서,
여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간이 제2 전계 강도 및/또는 제2 펄스 지속기간과 상이한, 방법. - (a) 하나 이상의 온전한 세포를 포함하는 세포 샘플에 제1 프로토콜에 따른 리보핵단백질을 포함하는 제1 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스를 가하는 단계;
(b) 세포 샘플이 적어도 24시간 동안 회복되도록 하는 단계; 및
(c) 세포 샘플에 제2 프로토콜에 따른 리보핵단백질을 포함하는 제2 제제로 세포를 로딩하기에 충분한 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스를 가하는 단계를 포함하는 세포를 연속적으로 편집하는 방법으로서,
여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간이 제2 전계 강도 및/또는 제2 펄스 지속기간과 상이한, 방법. - 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 제제가 동일한 제제인 방법.
- 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 제제가 상이한 제제인 방법.
- 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자인 방법.
- 제20항에 있어서, 핵산이 RNA이고, RNA가 mRNA, miRNA, shRNA, siRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 방법.
- 제20항에 있어서, 핵산이 DNA이고, DNA가 안티센스 올리고뉴클레오티드, 벡터, 또는 이중 센스 선형 DNA인 방법.
- 제20항에 있어서, 단백질이 리보핵단백질인 방법.
- 제23항에 있어서, 리보핵단백질이 Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 전기 펄스 후에 휴지 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제25항에 있어서, 휴지 단계가 10-30분 동안 샘플의 인큐베이션을 포함하는 방법.
- 제25항 또는 제26항에 있어서, 휴지 단계가 25-50℃에서 샘플의 인큐베이션을 포함하는 방법.
- 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 휴지 단계가 3-8% CO2에서 샘플의 인큐베이션을 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 제1 및/또는 제2 전기 펄스 후에 휴지 단계를 거치지 않는 방법.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 전계 강도가 제2 전계 강도와 동일하고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간보다 긴 방법.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 전계 강도가 제2 전계 강도와 동일하고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간보다 짧은 방법.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 전계 강도가 제2 전계 강도 미만이고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간과 동일한 방법.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 전계 강도가 제2 전계 강도보다 크고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간과 동일한 방법.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 전계 강도가 제2 전계 강도 미만이고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간보다 긴 방법.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 전계 강도가 제2 전계 강도보다 크고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간보다 긴 방법.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 전계 강도가 제2 전계 강도 미만이고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간보다 짧은 방법.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 전계 강도가 제2 전계 강도보다 크고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간보다 짧은 방법.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간이 제1 총 인가된 전기 에너지를 생성하고, 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간이 제2 총 인가된 전기 에너지를 생성하며, 제1 총 인가된 전기 에너지가 제2 총 인가된 전기 에너지와 상이한 방법.
- 제38항에 있어서, 제1 총 인가된 전기 에너지가 제2 총 인가된 전기 에너지보다 큰 방법.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 전기 펄스의 전압 크기, 전기 펄스의 지속기간, 및 샘플의 전도도의 함수인 방법.
- 제40항에 있어서, 전기 펄스의 전압 크기가 0.001 볼트 내지 10,000 볼트, 0.01 볼트 내지 10,000 볼트, 0.1 볼트 내지 10,000 볼트, 1 볼트 내지 10,000 볼트, 1 볼트 내지 9,000 볼트, 1 볼트 내지 8,000 볼트, 1 볼트 내지 7,000 볼트, 1 볼트 내지 6,000 볼트, 1 볼트 내지 5,000 볼트, 1 볼트 내지 4,000 볼트, 1 볼트 내지 3,000 볼트, 1 볼트 내지 2,000 볼트, 또는 1 볼트 내지 1,000 볼트인 방법.
- 제40항 또는 제41항에 있어서, 전기 펄스의 전압 크기가 100 볼트 내지 900 볼트인 방법.
- 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플의 전도도가 전기천공 완충제의 이온 조성, 세포에 로딩되는 제제의 농도, 세포 밀도, 온도, 및 압력을 포함하는 매개변수의 함수인 방법.
- 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플의 전도도가 0.01 지멘스/미터 내지 10 지멘스/미터, 0.01 지멘스/미터 내지 1 지멘스/미터, 0.1 지멘스/미터 내지 10 지멘스/미터, 0.1 지멘스/미터 내지 1 지멘스/미터, 또는 1 지멘스/미터 내지 10 지멘스/미터인 방법.
- 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플의 전도도가 1.0 내지 3.0 지멘스/미터인 방법.
- 제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 전계 강도가 추가로 전기천공 챔버의 기하학적 구조의 함수인 방법.
- 제46항에 있어서, 전기천공 챔버가 0.001 cm 내지 10 cm, 0.001 cm 내지 1 cm, 0.01 cm 내지 10 cm, 0.01 cm 내지 1 cm, 0.1 cm 내지 10 cm, 0.1 cm 내지 1 cm, 또는 1 cm 내지 10 cm의 전극 갭을 포함하는 방법.
- 제46항 또는 제47항에 있어서, 전기천공 챔버가 0.01 cm 내지 1 cm의 전극 갭을 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 0.01 kV/cm 내지 10 kV/cm, 0.01 kV/cm 내지 1 kV/cm, 0.1 kV/cm 내지 10 kV/cm, 0.1 kV/cm 내지 1 kV/cm, 또는 1 kV/cm 내지 10 kV/cm인 방법.
- 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 0.3 kV/cm 내지 3 kV/cm인 방법.
- 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 펄스 지속기간이 10-6초 내지 10초, 10-6초 내지 1초, 10-3초 내지 10초, 또는 10-3초 내지 1초인 방법.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 펄스 지속기간이 1 마이크로초 내지 100 밀리초인 방법.
- 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성과 관련된 특성을 추가로 포함하는 방법.
- 제53항에 있어서, 펄스 수가 1 펄스 내지 1000 펄스, 1 펄스 내지 900 펄스, 1 펄스 내지 800 펄스, 1 펄스 내지 700 펄스, 1 펄스 내지 600 펄스, 1 펄스 내지 500 펄스, 1 펄스 내지 400 펄스, 1 펄스 내지 300 펄스, 1 펄스 내지 200 펄스, 1 펄스 내지 100 펄스, 1 펄스 내지 90 펄스, 1 펄스 내지 80 펄스, 1 펄스 내지 70 펄스, 1 펄스 내지 60 펄스, 1 펄스 내지 50 펄스, 1 펄스 내지 40 펄스, 1 펄스 내지 30 펄스, 1 펄스 내지 20 펄스, 또는 1 펄스 내지 10 펄스인 방법.
- 제53항 또는 제54항에 있어서, 펄스 수가 1 펄스 내지 130 펄스인 방법.
- 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 펄스 폭이 지수 감쇠율의 함수인 방법.
- 제56항에 있어서, 지수 감쇠율이 샘플의 저항 및 전기천공을 수행하는데 사용되는 파워 서플라이의 커패시턴스의 함수인 방법.
- 제57항에 있어서, 샘플의 저항이 1 옴 내지 10000 옴, 1 옴 내지 9000 옴, 1 옴 내지 8000 옴, 1 옴 내지 7000 옴, 1 옴 내지 6000 옴, 1 옴 내지 5000 옴, 1 옴 내지 4000 옴, 1 옴 내지 3000 옴, 1 옴 내지 2000 옴, 1 옴 내지 1000 옴, 1 옴 내지 900 옴, 1 옴 내지 800 옴, 1 옴 내지 700 옴, 1 옴 내지 600 옴, 1 옴 내지 500 옴, 1 옴 내지 400 옴, 1 옴 내지 300 옴, 1 옴 내지 200 옴, 1 옴 내지 100 옴, 1 옴 내지 90 옴, 1 옴 내지 80 옴, 1 옴 내지 70 옴, 1 옴 내지 60 옴, 1 옴 내지 50 옴, 1 옴 내지 40 옴, 1 옴 내지 30 옴, 1 옴 내지 20 옴, 또는 1 옴 내지 10 옴인 방법.
- 제57항 또는 제58항에 있어서, 샘플의 저항이 1 옴 내지 1000 옴인 방법.
- 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 파워 서플라이 커패시턴스가 1 μF 내지 1,000,000 μF, 1 μF 내지 100,000 μF, 1 μF 내지 10,000 μF, 1 μF 내지 1,000 μF, 또는 1 μF 내지 100 μF인 방법.
- 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 파워 서플라이 커패시턴스가 1000 μF 내지 5000 μF인 방법.
- 제53항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 펄스 형상이 구형파 펄스 또는 지수 감쇠파 펄스인 방법.
- 제53항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 펄스 패턴이 제1 또는 제2 펄스의 지속기간에 상응하는 단일 펄스를 포함하는 방법.
- 제53항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 펄스 패턴이 다수의 펄스를 포함하고, 여기서 다수의 펄스의 조합된 지속기간이 제1 또는 제2 펄스의 지속기간에 상응하는 방법.
- 제53항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 전기 펄스의 극성이 포지티브 또는 네거티브인 방법.
- 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에 제1 펄스를 가한지 적어도 12시간 내지 적어도 48시간 후에 샘플에 제2 전기 펄스를 가하는 방법.
- 제66항에 있어서, 샘플에 제1 펄스를 가한지 적어도 24시간 후에 샘플에 제2 전기 펄스를 가하는 방법.
- 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 프로세서에 의해 실행될 때, 프로세서로 하여금 샘플을 전기천공하도록 제1 및 제2 프로토콜을 실행하게 하는 명령을 포함하는 비일시적 컴퓨터 판독 가능 매체를 갖는 전기천공 시스템에 의해 방법이 수행되는 방법.
- 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 전기천공 시스템이 유동 전기천공 장치를 포함하고, 샘플이 유동 전기천공 장치 내에서 흐르는 동안 샘플에 전기 펄스가 가해지는 방법.
- 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 방법.
- 제70항에 있어서, 세포가 인간 세포, 뮤린 세포, 래트 세포, 햄스터 세포, 또는 영장류 세포인 방법.
- 제70항 또는 제71항에 있어서, 세포가 일차 세포인 방법.
- 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 배양된 세포인 방법.
- 제73항에 있어서, 배양된 세포가 배양된 세포주인 방법.
- 제74항에 있어서, 배양된 세포주가 3T3, 697, 10T½, 1321N1, A549, AHR77, B-LCL, B16, B65, Ba/F3, BHK, C2C12, C6, CaCo-2, CAP, CaSki, ChaGo-K-1, CHO, COS, DG75, DLD-1, EL4, H1299, HaCaT, HAP1, HCT116, HEK, HeLa, HepG2, HL60, HOS, HT1080, HT29, Huh-7, HUVEC, INS-1/GRINCH, Jurkat, K46, K562, KG1, KHYG-1, L5278Y, L6, LNCaP, LS180, MCF7, MDA-MB-231, ME-180, MG-63, Min-6, MOLT4, Nalm6, ND7/23, Neuro2a, NK92, NS/0, P3U1, Panc-1, PC-3, PC12, PER.C6, PM1, Ramos, RAW 264.7, RBL, Renca, RLE, SH-SY5Y, SK-BR-3, SK-MES-1, SK-N-SH, SK-OV-3, SP2/0, SW403, THP-1, U2OS, U937, Vero, YB2/0, 또는 이들의 유도체를 포함하는 방법.
- 제70항 내지 제74항에 있어서, 세포가 지방세포, 연골세포, 내피 세포, 상피 세포, 섬유모세포, 간세포, 각질세포, 근육세포, 뉴런, 골세포, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 비장세포, 줄기 세포, 또는 흉선세포를 포함하는 방법.
- 제76항에 있어서, PBMC가 말초 혈액 림프구(PBL)인 방법.
- 제77항에 있어서, PBL이 자연 살해(NK) 세포, T 세포, 또는 B 세포인 방법.
- 제76항에 있어서, PBMC가 단핵구인 방법.
- 제79항에 있어서, 단핵구가 대식세포 또는 수지상 세포인 방법.
- 제80항에 있어서, 대식세포가 미세아교세포인 방법.
- 제76항에 있어서, 줄기 세포가 지방 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 신경 줄기 세포인 방법.
- 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 제제의 로딩 효율이 적어도 50, 60, 70, 80, 또는 90%인 방법.
- 제1항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 생존율이 제2 전기 펄스 12시간 내지 96시간 후 적어도 50%인 방법.
- 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 생존율이 제2 전기 펄스 12시간 내지 96시간 후 적어도 60%인 방법.
- 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 생존율이 제2 전기 펄스 12시간 내지 96시간 후 적어도 70%인 방법.
- 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 생존율이 제2 전기 펄스 12시간 내지 96시간 후 적어도 80%인 방법.
- 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 생존율이 제2 전기 펄스 12시간 내지 96시간 후 적어도 90%인 방법.
- 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 대략 50% 내지 90% 생존하는 방법.
- 제89항에 있어서, 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 12 내지 72시간 후 대략 50% 내지 90% 생존하는 방법.
- 제89항에 있어서, 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 12 내지 48시간 후 대략 50% 내지 90% 생존하는 방법.
- 제89항에 있어서, 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 24시간 후 대략 50% 내지 90% 생존하는 방법.
- 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 대략 60% 내지 90% 생존하는 방법.
- 제93항에 있어서, 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 12 내지 72시간 후 대략 60% 내지 90% 생존하는 방법.
- 제93항에 있어서, 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 12 내지 48시간 후 대략 60% 내지 90% 생존하는 방법.
- 제93항에 있어서, 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 24시간 후 대략 60% 내지 90% 생존하는 방법.
- 제1항 내지 제96항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 생산된 전기천공된 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포.
- 프로세서에 의해 실행될 때, 프로세서로 하여금
제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간을 갖는 제1 전기 펄스와 관련된 제1 프로토콜을 선택하고;
하나 이상의 온전한 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 포함하는 샘플에 제1 프로토콜에 따른 제1 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제1 프로토콜에 의해 정의된 제1 전기 펄스를 가하고;
제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간을 갖는 제2 전기 펄스와 관련된 제2 프로토콜을 선택하고;
샘플에 제2 프로토콜에 따른 제2 제제로 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포를 로딩하기에 충분한 제2 프로토콜에 의해 정의된 제2 전기 펄스를 가하게 하는 명령을 포함하는 비일시적 컴퓨터 판독 가능 매체를 갖는 전기천공 시스템으로서,
여기서 제1 전계 강도 및/또는 제1 펄스 지속기간이 제2 전계 강도 및/또는 제2 펄스 지속기간과 상이한, 전기천공 시스템. - 제98항에 있어서, 제1 전계 강도가 제2 전계 강도와 동일하고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간보다 긴 전기천공 시스템.
- 제98항에 있어서, 제1 전계 강도가 제2 전계 강도와 동일하고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간보다 짧은 전기천공 시스템.
- 제98항에 있어서, 제1 전계 강도가 제2 전계 강도 미만이고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간과 동일한 전기천공 시스템.
- 제98항에 있어서, 제1 전계 강도가 제2 전계 강도보다 크고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간과 동일한 전기천공 시스템.
- 제98항에 있어서, 제1 전계 강도가 제2 전계 강도 미만이고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간보다 긴 전기천공 시스템.
- 제98항에 있어서, 제1 전계 강도가 제2 전계 강도보다 크고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간보다 긴 전기천공 시스템.
- 제98항에 있어서, 제1 전계 강도가 제2 전계 강도 미만이고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간보다 짧은 전기천공 시스템.
- 제98항에 있어서, 제1 전계 강도가 제2 전계 강도보다 크고, 제1 펄스 지속기간이 제2 펄스 지속기간보다 짧은 전기천공 시스템.
- 제98항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 전계 강도 및 제1 펄스 지속기간이 제1 총 인가된 전기 에너지를 생성하고, 제2 전계 강도 및 제2 펄스 지속기간이 제2 총 인가된 전기 에너지를 생성하며, 제1 총 인가된 전기 에너지가 제2 총 인가된 전기 에너지와 상이한 전기천공 시스템.
- 제107항에 있어서, 제1 총 인가된 전기 에너지가 제2 총 인가된 전기 에너지보다 큰 전기천공 시스템.
- 제98항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 전기 펄스의 전압 크기, 전기 펄스의 지속기간, 및 샘플의 전도도의 함수인 전기천공 시스템.
- 제109항에 있어서, 전기 펄스의 전압 크기가 0.001 볼트 내지 10,000 볼트, 0.01 볼트 내지 10,000 볼트, 0.1 볼트 내지 10,000 볼트, 1 볼트 내지 10,000 볼트, 1 볼트 내지 9,000 볼트, 1 볼트 내지 8,000 볼트, 1 볼트 내지 7,000 볼트, 1 볼트 내지 6,000 볼트, 1 볼트 내지 5,000 볼트, 1 볼트 내지 4,000 볼트, 1 볼트 내지 3,000 볼트, 1 볼트 내지 2,000 볼트, 또는 1 볼트 내지 1,000 볼트인 전기천공 시스템.
- 제109항 또는 제110항에 있어서, 전기 펄스의 전압 크기가 100 볼트 내지 900 볼트인 전기천공 시스템.
- 제109항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플의 전도도가 전기천공 완충제의 이온 조성, 세포에 로딩되는 제제의 농도, 세포 밀도, 온도, 및 압력을 포함하는 매개변수의 함수인 전기천공 시스템.
- 제109항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플의 전도도가 0.01 지멘스/미터 내지 10 지멘스/미터, 0.01 지멘스/미터 내지 1 지멘스/미터, 0.1 지멘스/미터 내지 10 지멘스/미터, 0.1 지멘스/미터 내지 1 지멘스/미터, 또는 1 지멘스/미터 내지 10 지멘스/미터인 전기천공 시스템.
- 제109항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플의 전도도가 1.0 내지 3.0 지멘스/미터인 전기천공 시스템.
- 제109항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 전계 강도가 추가로 전기천공 챔버의 기하학적 구조의 함수인 전기천공 시스템.
- 제115항에 있어서, 전기천공 챔버가 0.001 cm 내지 10 cm, 0.001 cm 내지 1 cm, 0.01 cm 내지 10 cm, 0.01 cm 내지 1 cm, 0.1 cm 내지 10 cm, 0.1 cm 내지 1 cm, 또는 1 cm 내지 10 cm의 전극 갭을 포함하는 전기천공 시스템.
- 제115항 또는 제116항에 있어서, 전기천공 챔버가 0.01 cm 내지 1 cm의 전극 갭을 포함하는 전기천공 시스템.
- 제98항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 0.01 kV/cm 내지 10 kV/cm, 0.01 kV/cm 내지 1 kV/cm, 0.1 kV/cm 내지 10 kV/cm, 0.1 kV/cm 내지 1 kV/cm, 또는 1 kV/cm 내지 10 kV/cm인 전기천공 시스템.
- 제98항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 전계 강도가 0.3 kV/cm 내지 3 kV/cm인 전기천공 시스템.
- 제98항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 펄스 지속기간이 10-6초 내지 10초, 10-6초 내지 1초, 10-3초 내지 10초, 또는 10-3초 내지 1초인 전기천공 시스템.
- 제98항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 전기 펄스의 제1 및 제2 펄스 지속기간이 1 마이크로초 내지 100 밀리초인 전기천공 시스템.
- 제98항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 전기 펄스가 펄스 수, 폭, 형상, 패턴, 또는 극성과 관련된 특성을 추가로 포함하는 전기천공 시스템.
- 제122항에 있어서, 펄스 수가 1 펄스 내지 1000 펄스, 1 펄스 내지 900 펄스, 1 펄스 내지 800 펄스, 1 펄스 내지 700 펄스, 1 펄스 내지 600 펄스, 1 펄스 내지 500 펄스, 1 펄스 내지 400 펄스, 1 펄스 내지 300 펄스, 1 펄스 내지 200 펄스, 1 펄스 내지 100 펄스, 1 펄스 내지 90 펄스, 1 펄스 내지 80 펄스, 1 펄스 내지 70 펄스, 1 펄스 내지 60 펄스, 1 펄스 내지 50 펄스, 1 펄스 내지 40 펄스, 1 펄스 내지 30 펄스, 1 펄스 내지 20 펄스, 또는 1 펄스 내지 10 펄스인 전기천공 시스템.
- 제122항 또는 제123항에 있어서, 펄스 수가 1 펄스 내지 130 펄스인 전기천공 시스템.
- 제122항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 펄스 폭이 지수 감쇠율의 함수인 전기천공 시스템.
- 제125항에 있어서, 지수 감쇠율이 샘플의 저항 및 전기천공을 수행하는데 사용되는 파워 서플라이의 커패시턴스의 함수인 전기천공 시스템.
- 제126항에 있어서, 샘플의 저항이 1 옴 내지 10000 옴, 1 옴 내지 9000 옴, 1 옴 내지 8000 옴, 1 옴 내지 7000 옴, 1 옴 내지 6000 옴, 1 옴 내지 5000 옴, 1 옴 내지 4000 옴, 1 옴 내지 3000 옴, 1 옴 내지 2000 옴, 1 옴 내지 1000 옴, 1 옴 내지 900 옴, 1 옴 내지 800 옴, 1 옴 내지 700 옴, 1 옴 내지 600 옴, 1 옴 내지 500 옴, 1 옴 내지 400 옴, 1 옴 내지 300 옴, 1 옴 내지 200 옴, 1 옴 내지 100 옴, 1 옴 내지 90 옴, 1 옴 내지 80 옴, 1 옴 내지 70 옴, 1 옴 내지 60 옴, 1 옴 내지 50 옴, 1 옴 내지 40 옴, 1 옴 내지 30 옴, 1 옴 내지 20 옴, 또는 1 옴 내지 10 옴인 전기천공 시스템.
- 제125항 또는 제126항에 있어서, 샘플의 저항이 1 옴 내지 1000 옴인 전기천공 시스템.
- 제126항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 파워 서플라이 커패시턴스가 1 μF 내지 1,000,000 μF, 1 μF 내지 100,000 μF, 1 μF 내지 10,000 μF, 1 μF 내지 1,000 μF, 또는 1 μF 내지 100 μF인 전기천공 시스템.
- 제126항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 파워 서플라이 커패시턴스가 1000 μF 내지 5000 μF인 전기천공 시스템.
- 제122항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 펄스 형상이 구형파 펄스 또는 지수 감쇠파 펄스인 전기천공 시스템.
- 제122항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 펄스 패턴이 제1 또는 제2 펄스의 지속기간에 상응하는 단일 펄스를 포함하는 전기천공 시스템.
- 제122항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 펄스 패턴이 다수의 펄스를 포함하고, 여기서 다수의 펄스의 조합된 지속기간이 제1 또는 제2 펄스의 지속기간에 상응하는 전기천공 시스템.
- 제122항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 전기 펄스의 극성이 포지티브 또는 네거티브인 전기천공 시스템.
- 제98항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에 제1 펄스를 가한지 적어도 12시간 내지 적어도 48시간 후에 샘플에 제2 전기 펄스를 가하는 전기천공 시스템.
- 제135항에 있어서, 샘플에 제1 펄스를 가한지 적어도 24시간 후에 샘플에 제2 전기 펄스를 가하는 전기천공 시스템.
- 제98항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 전기천공 시스템이 유동 전기천공 장치를 포함하고, 샘플이 유동 전기천공 장치 내에서 흐르는 동안 샘플에 전기 펄스가 가해지는 전기천공 시스템.
- 제98항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 전기천공 시스템.
- 제138항에 있어서, 세포가 인간 세포, 뮤린 세포, 래트 세포, 햄스터 세포, 또는 영장류 세포인 전기천공 시스템.
- 제138항 또는 제139항에 있어서, 세포가 일차 세포인 전기천공 시스템.
- 제138항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 배양된 세포인 전기천공 시스템.
- 제141항에 있어서, 배양된 세포가 배양된 세포주인 전기천공 시스템.
- 제142항에 있어서, 배양된 세포주가 3T3, 697, 10T½, 1321N1, A549, AHR77, B-LCL, B16, B65, Ba/F3, BHK, C2C12, C6, CaCo-2, CAP, CaSki, ChaGo-K-1, CHO, COS, DG75, DLD-1, EL4, H1299, HaCaT, HAP1, HCT116, HEK, HeLa, HepG2, HL60, HOS, HT1080, HT29, Huh-7, HUVEC, INS-1/GRINCH, Jurkat, K46, K562, KG1, KHYG-1, L5278Y, L6, LNCaP, LS180, MCF7, MDA-MB-231, ME-180, MG-63, Min-6, MOLT4, Nalm6, ND7/23, Neuro2a, NK92, NS/0, P3U1, Panc-1, PC-3, PC12, PER.C6, PM1, Ramos, RAW 264.7, RBL, Renca, RLE, SH-SY5Y, SK-BR-3, SK-MES-1, SK-N-SH, SK-OV-3, SP2/0, SW403, THP-1, U2OS, U937, Vero, YB2/0, 또는 이들의 유도체를 포함하는 전기천공 시스템.
- 제138항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 지방세포, 연골세포, 내피 세포, 상피 세포, 섬유모세포, 간세포, 각질세포, 근육세포, 뉴런, 골세포, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 비장세포, 줄기 세포, 또는 흉선세포를 포함하는 전기천공 시스템.
- 제144항에 있어서, PBMC가 말초 혈액 림프구(PBL)인 전기천공 시스템.
- 제145항에 있어서, PBL이 자연 살해(NK) 세포, T 세포, 또는 B 세포인 전기천공 시스템.
- 제144항에 있어서, PBMC가 단핵구인 전기천공 시스템.
- 제147항에 있어서, 단핵구가 대식세포 또는 수지상 세포인 전기천공 시스템.
- 제148항에 있어서, 대식세포가 미세아교세포인 전기천공 시스템.
- 제144항에 있어서, 줄기 세포가 지방 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 신경 줄기 세포인 전기천공 시스템.
- 제98항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 제제가 동일한 제제인 전기천공 시스템.
- 제98항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 제제가 상이한 제제인 전기천공 시스템.
- 제98항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 제제가 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 또는 소분자인 전기천공 시스템.
- 제153항에 있어서, 핵산이 RNA이고, RNA가 mRNA, miRNA, shRNA, 또는 siRNA인 전기천공 시스템.
- 제153항에 있어서, 핵산이 DNA이고, DNA가 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 벡터인 전기천공 시스템.
- 제153항에 있어서, 단백질이 리보핵단백질인 전기천공 시스템.
- 제156항에 있어서, 리보핵단백질이 Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 포함하는 전기천공 시스템.
- 제98항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 제제의 로딩 효율이 적어도 50, 60, 70, 80, 또는 90%인 전기천공 시스템.
- 제98항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 생존율이 제2 전기 펄스 12시간 내지 96시간 후 적어도 50%인 전기천공 시스템.
- 제98항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 생존율이 제2 전기 펄스 12시간 내지 96시간 후 적어도 60%인 전기천공 시스템.
- 제98항 내지 제160항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 생존율이 제2 전기 펄스 12시간 내지 96시간 후 적어도 70%인 전기천공 시스템.
- 제98항 내지 제161항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 생존율이 제2 전기 펄스 12시간 내지 96시간 후 적어도 80%인 전기천공 시스템.
- 제98항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 생존율이 제2 전기 펄스 12시간 내지 96시간 후 적어도 90%인 전기천공 시스템.
- 제98항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 대략 50% 내지 90% 생존하는 전기천공 시스템.
- 제164항에 있어서, 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 12 내지 72시간 후 대략 50% 내지 90% 생존하는 전기천공 시스템.
- 제164항에 있어서, 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 12 내지 48시간 후 대략 50% 내지 90% 생존하는 전기천공 시스템.
- 제164항에 있어서, 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 24시간 후 대략 50% 내지 90% 생존하는 전기천공 시스템.
- 제98항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 12 내지 96시간 후 대략 60% 내지 90% 생존하는 전기천공 시스템.
- 제168항에 있어서, 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 12 내지 72시간 후 대략 60% 내지 90% 생존하는 전기천공 시스템.
- 제168항에 있어서, 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 12 내지 48시간 후 대략 60% 내지 90% 생존하는 전기천공 시스템.
- 제168항에 있어서, 전기천공된 세포가 제2 전기 펄스 24시간 후 대략 60% 내지 90% 생존하는 전기천공 시스템.
- 제98항 내지 제171항 중 어느 한 항의 전기천공 시스템을 사용하여 생산된 전기천공된 세포, 세포 입자, 또는 지질 소포.
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