CN117441022A - 顺序电穿孔方法 - Google Patents
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Abstract
本公开内容的一些方面涉及用于顺序电穿孔的技术,所述技术提供了将在时间上隔开的多个电脉冲递送至细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体,或者提高一种或更多种目的药剂进入到细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体、组织、或其衍生物中的效率,并使电弧或热休克的损伤最小化;提高目的药剂的加载效率;并且维持所述细胞、细胞颗粒、脂质囊泡或组织的生存力以及所述细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织产生临床作用的能力。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年4月29日提交的美国临时申请序列No.63/181,583的优先权,其通过引用整体并入本文。
背景
I.技术领域
本公开内容一般地涉及用于将药剂引入到活的细胞或细胞颗粒或脂质囊泡中的方法和设备。
II.背景技术
电穿孔是在短的持续时间内施加受控电脉冲以转化细菌、酵母、植物原生质体、经培养细胞、其他细胞、细胞颗粒、脂质体、囊泡、组织或其他生物载剂。脉冲诱导跨膜电位(transmembrane potential),其导致细胞膜的可逆破坏。该作用导致细胞膜的渗透或“孔形成”,这允许将胞外药剂,例如小分子(例如分子探针、药物、染料、寡核苷酸或肽)或大分子(例如蛋白质、DNA和RNA)引入到细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织中。该程序对于引入化学或生物学药剂而言也是高效的,所述化学或生物学药剂特异性地干预组织培养细胞或原代细胞尤其是哺乳动物细胞中的分子途径。例如,电穿孔用于产生敲除小鼠的过程,以及用于肿瘤治疗、基因治疗和基于细胞的治疗。
关于细胞的转染,许多因素促成转染的困难或成功。例如,试剂-基因复合物的细胞结合和内化、核酸向细胞质中的释放、基因的表达和核摄取;细胞的健康、代谢活性、内吞作用速率和分裂速率;以及经培养细胞的年龄、汇合和传代数都是可使细胞难以转染的因素。未成熟细胞,包括干细胞和未定向的祖细胞(uncommitted progenitor cell)缺乏这些特征。类似地,在药物发现、毒理学和基础研究中越来越多地用作模型的原代细胞不分裂,具有较低的内化能力,并且通常缺乏与转染复合物结合的能力。
电穿孔过程的结局在很大程度上由所施加的电场(electrical field,EF)脉冲的大小和脉冲的持续时间来控制。只要脉冲大小高于一定阈值水平,脉冲的大小或持续时间的提高一般导致胞外分子在细胞内的较高累积。
施加至细胞悬液的每个电脉冲可以通过一定量的能量来表征,所述能量等于电极上的电压、通过缓冲液的电流和高压脉冲的持续时间的乘积。然而,仅小百分比的所施加电能消耗在修饰脂质膜和将胞外物质移动到细胞中的有用工作上。剩余电能以在周围介质中产生的热的形式消散。尽管加热本身不导致细胞的透化,但稍微加热细胞悬液的功率消散是施加EF的不可避免的结果。电穿孔缓冲液的导电性越强,在热产生上浪费的能量越多。将热积聚到比高于环境温度20至24度更大的温度可对细胞和细胞组分造成永久性损伤并降低电穿孔过程的效率;这限制了能够用于对细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织进行成功电穿孔的能量的量。
经电穿孔样品的温度升高还与样品电导率的提高相关,在简单的盐溶液中,样品电导率每℃提高约2%。所施加的电场导致电流通过细胞或颗粒悬液,这导致温度上升,其转化为电导率提高和从电源汲取(draw)更大的电流等。如果这样的正反馈过程没有中断(例如,通过关闭脉冲),则电流提高以雪崩样(avalanche-like)方式进行并导致电弧和样品损失。该作用主要在相对高的场强(>2kV/cm)下观察到。
对难以转染的细胞(例如未成熟细胞或原代细胞)的电穿孔,例如需要强电场,并且因此必须限制缓冲液电导率或脉冲宽度。然而,细胞对环境生物化学变化极其敏感,并且与向细胞、细胞颗粒、脂质囊泡或组织的电场施加相关的在环境中的物理化学变化可以调节细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织的生理状态、活化特性和生物功能,影响经电穿孔物质发挥临床作用的能力。
因此,本发明人认为,需要这样的方法:用目的药剂对难以转染的细胞、细胞颗粒、脂质囊泡或组织高效地进行电穿孔,而不损伤细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织使其超出产生临床作用的能力。
发明内容
在一些方面中,本文中描述了用于使用包括连续电脉冲的新的电穿孔方案用目的药剂对难以转染的细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织进行有效电穿孔的方法和设备。在某些方面中,与对细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织进行单次电穿孔相比,对细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织进行顺序电穿孔出乎意料地导致显著更高的转基因表达。在某些方面中,本文中所述的方法和设备是独特的,因为它们可以提高目的药剂进入到细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织中的加载效率,同时维持细胞、细胞颗粒、脂质囊泡或组织的生存力并维持细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织产生临床作用的能力。在某些方面中,本文中公开的方法和设备可以通过改变在每轮电穿孔期间使用的电穿孔能量来优化在顺序电穿孔之后的效率和生存力。
本公开内容的一些方面涉及转染目的药剂的方法;使膜暂时透化以允许目的药剂转运通过膜的方法;对细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织进行电穿孔的方法;产生经电穿孔的细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织的方法;以及提高电穿孔的效率同时维持经电穿孔物质的临床作用的方法。本公开内容中所讨论的步骤和方面被考虑为这些方法中的任意者的一部分。在一些方面中,本文中考虑的方法可以包括或不包括以下步骤中的1、2、3、4、5个或更多个:根据第一方案,使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;根据第二方案,使样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;使样品经受在第一电脉冲与第二电脉冲之间的时间延迟;在样品中提供核酸、多肽、蛋白质或小分子;使细胞、细胞颗粒或脂质囊泡经受足以对细胞、细胞颗粒或脂质囊泡进行电穿孔的条件;在细胞中表达经电穿孔的核酸、多肽、蛋白质;以及通过调节样品所经受的电脉冲的电参数和/或电脉冲之间的时间延迟来调节药剂进入到样品中的加载效率、经电穿孔样品的临床作用、和/或样品生存力。这些步骤中的任何一个或更多个均可以从所公开方法中排除。
本公开内容的一些方面包括电穿孔方法,其包括:
(1)根据第一方案,使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;以及根据第二方案,使所述样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间;
(2)根据第一方案,使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;允许所述样品恢复至少24小时;以及根据第二方案,使所述样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;
(3)根据第一方案,使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;允许所述样品恢复至少24小时;以及根据第二方案,使所述样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间;
(4)使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;以及使所述样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间;
(5)使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;允许所述样品恢复至少24小时;以及使所述样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;或者
(6)使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;允许所述样品恢复至少24小时;以及使所述样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间。
本公开内容的一些方面包括连续编辑细胞基因的方法,其包括:
(1)根据第一方案,使包含一个或更多个完整细胞的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使所述细胞加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;以及根据第二方案,使所述样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使所述细胞加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间;
(2)根据第一方案,使包含一个或更多个完整细胞的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使所述细胞加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;允许所述样品恢复至少24小时;以及根据第二方案,使所述样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使所述细胞加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;
(3)根据第一方案,使包含一个或更多个完整细胞的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使所述细胞加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;允许所述样品恢复至少24小时;以及根据第二方案,使所述样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使所述细胞加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间;
(4)使包含一个或更多个完整细胞的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使所述细胞加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;以及使所述样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使所述细胞加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间;
(5)使包含一个或更多个完整细胞的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使所述细胞加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;允许所述样品恢复至少24小时;以及使所述样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使所述细胞加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;或者
(6)使包含一个或更多个完整细胞的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使所述细胞加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;允许所述样品恢复至少24小时;以及使所述样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使所述细胞加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间。
本公开内容的另一些方面包括电穿孔方法,其包括:
(1)根据第一方案,使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含RNA的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;允许所述细胞样品恢复至少24小时;以及根据第二方案,使所述细胞样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含RNA的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间;
(2)根据第一方案,使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含DNA的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;允许所述细胞样品恢复至少24小时;以及根据第二方案,使所述细胞样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含DNA的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间;或者
(3)根据第一方案,使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含一种或更多种蛋白质的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;允许所述细胞样品恢复至少24小时;以及根据第二方案,使所述细胞样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含一种或更多种蛋白质的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间;或者
(4)根据第一方案,使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含核糖核蛋白的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;允许所述细胞样品恢复至少24小时;以及根据第二方案,使所述细胞样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含核糖核蛋白的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间;或者
(5)使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含RNA的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;允许所述细胞样品恢复至少24小时;以及使所述细胞样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含RNA的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间;
(6)使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含DNA的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;允许所述细胞样品恢复至少24小时;以及使所述细胞样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含DNA的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间;或者
(7)使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含一种或更多种蛋白质的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;允许所述细胞样品恢复至少24小时;以及使所述细胞样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含一种或更多种蛋白质的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间;或者
(8)使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含核糖核蛋白的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;允许所述细胞样品恢复至少24小时;以及使所述细胞样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含核糖核蛋白的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间。
在一些方面中,第一药剂和第二药剂是相同的药剂。在一些方面中,第一药剂和第二药剂是不同的药剂。在一些方面中,第一药剂和第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。在一些方面中,核酸是RNA,并且其中所述RNA是mRNA、miRNA、shRNA、siRNA或反义寡核苷酸。在一些方面中,核酸是DNA,并且其中所述DNA是反义寡核苷酸、载体或双义线性DNA。在一些方面中,蛋白质是核糖核蛋白。在一些方面中,核糖核蛋白包含Cas9蛋白和指导RNA。
在一些方面中,所述方法还包括在第一和/或第二电脉冲之后的静置步骤。在一些方面中,静置步骤包括将样品孵育10至30分钟。在一些方面中,静置步骤包括在25℃至50℃下孵育样品。在一些方面中,静置步骤包括在3%至8%CO2下孵育样品。在一些方面中,样品在第一和/或第二电脉冲之后不经受静置步骤。
在一些方面中,第一场强等于第二场强,并且第一脉冲持续时间长于第二脉冲持续时间。在一些方面中,第一场强等于第二场强,并且第一脉冲持续时间短于第二脉冲持续时间。在一些方面中,第一场强等于第二场强,并且第一脉冲持续时间等于第二脉冲持续时间。在一些方面中,第一场强小于第二场强,并且第一脉冲持续时间等于第二脉冲持续时间。在一些方面中,第一场强大于第二场强,并且第一脉冲持续时间等于第二脉冲持续时间。在一些方面中,第一场强小于第二场强,并且第一脉冲持续时间长于第二脉冲持续时间。在一些方面中,第一场强大于第二场强,并且第一脉冲持续时间长于第二脉冲持续时间。在一些方面中,第一场强小于第二场强,并且第一脉冲持续时间短于第二脉冲持续时间。在一些方面中,第一场强大于第二场强,并且第一脉冲持续时间短于第二脉冲持续时间。
在一些方面中,第一电脉冲的场强和第一电脉冲的脉冲持续时间产生第一总施加电能并且第二电脉冲的场强和第二电脉冲的脉冲持续时间产生第二总施加电能,并且第一总施加电能大于第二总施加电能。在一些方面中,第一总施加电能小于第二总施加电能。
在一些方面中,第一和第二电脉冲的第一和第二场强是电脉冲的电压幅值、电脉冲的持续时间和样品的电导率的函数。电脉冲的电压幅值可以为0.001伏特至10,000伏特、0.01伏特至10,000伏特、0.1伏特至10,000伏特、1伏特至10,000伏特、1伏特至9,000伏特、1伏特至8,000伏特、1伏特至7,000伏特、1伏特至6,000伏特、1伏特至5,000伏特、1伏特至4,000伏特、1伏特至3,000伏特、1伏特至2,000伏特、或1伏特至1,000伏特。在一些方面中,电脉冲的电压幅值为100伏特至900伏特。在一些方面中,样品的电导率是这样的参数的函数,所述参数包括电穿孔缓冲液的离子组成、待被加载到细胞中的药剂的浓度、细胞密度、温度和压力。样品的电导率可以为0.01西门子/米至10西门子/米、0.01西门子/米至1西门子/米、0.1西门子/米至10西门子/米、0.1西门子/米至1西门子/米、或1西门子/米至10西门子/米。在一些方面中,样品的电导率为1.0至3.0西门子/米。在一些方面中,第一和第二场强还是电穿孔室的几何形状的函数。电穿孔室可以包含0.001cm至10cm、0.001cm至1cm、0.01cm至10cm、0.01cm至1cm、0.1cm至10cm、0.1cm至1cm、或1cm至10cm的电极间隙。在一些方面中,电穿孔室包含0.01cm至1cm的电极间隙。
第一和第二电脉冲的第一和第二场强可以为0.01kV/cm至10kV/cm、0.01kV/cm至1kV/cm、0.1kV/cm至10kV/cm、0.1kV/cm至1kV/cm、或1kV/cm至10kV/cm。在一些方面中,第一和第二电脉冲的第一和第二场强为0.3kV/cm至3kV/cm。
第一和第二电脉冲的第一和第二脉冲持续时间可以为10-6秒至10秒、10-6秒至1秒、10-3秒至10秒、或10-3秒至1秒。在一些方面中,第一和第二电脉冲的第一和第二脉冲持续时间为1微秒至100毫秒。
在一些方面中,第一和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征。脉冲数可以为1个脉冲至1000个脉冲、1个脉冲至900个脉冲、1个脉冲至800个脉冲、1个脉冲至700个脉冲、1个脉冲至600个脉冲、1个脉冲至500个脉冲、1个脉冲至400个脉冲、1个脉冲至300个脉冲、1个脉冲至200个脉冲、1个脉冲至100个脉冲、1个脉冲至90个脉冲、1个脉冲至80个脉冲、1个脉冲至70个脉冲、1个脉冲至60个脉冲、1个脉冲至50个脉冲、1个脉冲至40个脉冲、1个脉冲至30个脉冲、1个脉冲至20个脉冲、或1个脉冲至10个脉冲。在一些方面中,脉冲数为1个脉冲至130个脉冲。
在一些方面中,脉冲宽度是指数衰减率的函数。在一些方面中,指数衰减率是样品的电阻和用于实现电穿孔的电源的电容的函数。样品的电阻可以为1欧姆至10000欧姆、1欧姆至9000欧姆、1欧姆至8000欧姆、1欧姆至7000欧姆、1欧姆至6000欧姆、1欧姆至5000欧姆、1欧姆至4000欧姆、1欧姆至3000欧姆、1欧姆至2000欧姆、1欧姆至1000欧姆、1欧姆至900欧姆、1欧姆至800欧姆、1欧姆至700欧姆、1欧姆至600欧姆、1欧姆至500欧姆、1欧姆至400欧姆、1欧姆至300欧姆、1欧姆至200欧姆、1欧姆至100欧姆、1欧姆至90欧姆、1欧姆至80欧姆、1欧姆至70欧姆、1欧姆至60欧姆、1欧姆至50欧姆、1欧姆至40欧姆、1欧姆至30欧姆、1欧姆至20欧姆、或1欧姆至10欧姆。在一些方面中,样品的电阻为1欧姆至1000欧姆。电源电容可以为1μF至1,000,000μF、1μF至100,000μF、1μF至10,000μF、1μF至1,000μF、或1μF至100μF。在一些方面中,电源电容为1000μF至5000μF。
在一些方面中,脉冲形状是方波脉冲或指数衰减波脉冲。在一些方面中,脉冲模式包括与第一或第二脉冲的持续时间相对应的单脉冲。在一些方面中,脉冲模式包括多脉冲,其中多脉冲的组合持续时间与第一或第二脉冲的持续时间相对应。在一些方面中,第一和第二电脉冲的极性为正或负。
在一些方面中,在样品经受第一脉冲之后至少12小时至至少48小时使所述样品经受第二电脉冲。在一些方面中,在样品经受第一脉冲之后至少24小时使所述样品经受第二电脉冲。
所述方法可以通过具有包含指令的非暂态计算机可读介质的电穿孔系统进行,所述指令当由处理器执行时引起所述处理器执行第一和第二方案以对样品进行电穿孔。在一些方面中,电穿孔系统包含流式电穿孔设备并且当样品在流式电穿孔设备内流动时使所述样品经受电脉冲。
在一些方面中,细胞可以是哺乳动物细胞,并且在一些方面中,细胞是人细胞、鼠细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞或灵长类细胞。在一些方面中,细胞是原代细胞。在一些方面中,细胞是经培养细胞,并且所述经培养细胞可以是经培养细胞系,其可以包括3T3,697,10T1/2,1321N1,A549,AHR77,B-LCL,B16,B65,Ba/F3,BHK,C2C12,C6,CaCo-2,CAP,CaSki,ChaGo-K-1,CHO,COS,DG75,DLD-1,EL4,H1299,HaCaT,HAP1,HCT116,HEK,HeLa,HepG2,HL60,HOS,HT1080,HT29,Huh-7,HUVEC,INS-1/GRINCH,Jurkat,K46,K562,KG1,KHYG-1,L5278Y,L6,LNCaP,LS180,MCF7,MDA-MB-231,ME-180,MG-63,Min-6,MOLT4,Nalm6,ND7/23,Neuro2a,NK92,NS/0,P3U1,Panc-1,PC-3,PC12,PER.C6,PM1,Ramos,RAW 264.7,RBL,Renca,RLE,SH-SY5Y,SK-BR-3,SK-MES-1,SK-N-SH,SK-OV-3,SP2/0,SW403,THP-1,U2OS,U937,Vero,YB2/0,或其衍生物。细胞可以包括脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、角质形成细胞、肌细胞、神经元、骨细胞、外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)、脾细胞、干细胞或胸腺细胞。在一些方面中,PBMC是外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL),其可以是自然杀伤(natural killer,NK)细胞、T细胞或B细胞。在一些方面中,PBMC是单核细胞,其可以是巨噬细胞或树突细胞,并且巨噬细胞可以是小胶质细胞。在一些方面中,干细胞是脂肪干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞或神经干细胞。
在一些方面中,药剂的加载效率为至少50%、60%、70%、80%或90%。
在一些方面中,细胞生存力在第二电脉冲之后12至96小时可以为至少50%;在第二电脉冲之后12至96小时可以为至少60%;在第二电脉冲之后12至96小时可以为至少70%;在第二电脉冲之后12至96小时可以为至少80%;或者在第二电脉冲之后12至96小时可以为至少90%。
在一些方面中,经电穿孔细胞在第二电脉冲之后12至96小时有约50%至90%有生存力;在第二电脉冲之后12至72小时有约50%至90%有生存力;在第二电脉冲之后12至48小时有约50%至90%有生存力;在第二电脉冲之后24小时有约50%至90%有生存力;在第二电脉冲之后12至96小时有约60%至90%有生存力;在第二电脉冲之后12至72小时有约60%至90%有生存力;在第二电脉冲之后12至48小时有约60%至90%有生存力;或者在第二电脉冲之后24小时有约60%至90%有生存力。
本公开内容的一些方面还涉及电穿孔系统,其具有包含指令的非暂态计算机可读介质,所述指令当由处理器执行时引起所述处理器进行以下:选择与具有第一场强和第一脉冲持续时间的第一电脉冲相关的第一方案;根据第一方案,使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受由第一方案限定的第一电脉冲,所述第一电脉冲足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂;选择与具有第二场强和第二脉冲持续时间的第二电脉冲相关的第二方案;以及根据第二方案,使样品经受由第二方案限定的第二电脉冲,所述第二电脉冲足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂;其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间。
本公开内容的一些方面还包括使用本文中所述的任何方法产生的或者使用任何具有包含指令的非暂态计算机可读介质的电穿孔系统产生的经电穿孔的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡,所述指令当由处理器执行时引起所述处理器执行本文中所述的任何方法。
本公开内容的另一些方面包括治疗患有或疑似患有疾病或病症的对象的方法,其包括以减轻疾病或病症的量施用任何所述方法的产品。在某些方面中,所述方法的产品是药物递送载剂,并且考虑了广泛多种已知药物可以通过由所述方法产生的加载颗粒来递送。疾病或病症可以包括适于通过使用电穿孔方法制备(例如加载)的脂质体颗粒、细胞颗粒或类似递送载剂来递送药物或药剂的任何疾病或病症。
本公开内容的又一些方面包括通过施用有效量的包含在通过所述方法产生的颗粒中的药物、生物分子或其他生物活性分子来治疗患有或疑似患有疾病或病症的对象的方法。在某些方面中,疾病是感染性疾病,包括但不限于细菌感染、真菌感染、寄生虫感染或病毒感染。在另一方面中,细菌感染是分枝杆菌(mycobacterial)感染。在又一方面中,病毒感染是逆转录病毒感染,包括但不限于HIV感染。在另一方面中,疾病是炎性疾病或癌症或血管闭塞性疾病。
本公开内容的一些方面包括被配置成进行任何所述方法的电穿孔系统。
还公开了本公开内容的以下方面1至201。
方面1是电穿孔方法,其包括:根据第一方案,使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;以及根据第二方案,使所述样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。
方面2是电穿孔方法,其包括:根据第一方案,使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;允许所述样品恢复至少24小时;以及根据第二方案,使所述样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间。
方面3是电穿孔方法,其包括:根据第一方案,使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;允许所述样品恢复至少24小时;以及根据第二方案,使所述样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。
方面4是连续编辑细胞基因的方法,其包括:根据第一方案,使包含一个或更多个完整细胞的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使所述细胞加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;以及根据第二方案,使所述样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使所述细胞加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。
方面5是连续编辑细胞基因的方法,其包括:根据第一方案,使包含一个或更多个完整细胞的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使所述细胞加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;允许所述样品恢复至少24小时;以及根据第二方案,使所述样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使所述细胞加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间。
方面6是连续编辑细胞基因的方法,其包括:根据第一方案,使包含一个或更多个完整细胞的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使所述细胞加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;允许所述样品恢复至少24小时;以及根据第二方案,使所述样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使所述细胞加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。
方面7是方面1至6所述的方法,其中所述第一药剂和第二药剂是相同的药剂。方面8是方面1至7所述的方法,其中所述第一药剂和第二药剂是不同的药剂。方面9是方面1至8所述的方法,其中所述第一药剂和第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面10是方面1至9所述的方法,其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子,并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面11是方面1至10所述的方法,其中所述第一药剂是核酸,并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面12是方面1至10所述的方法,其中所述第一药剂是多肽,并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面13是方面1至10所述的方法,其中所述第一药剂是蛋白质,并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面14是方面1至10所述的方法,其中所述第一药剂是小分子,并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面15是方面1至14所述的方法,其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子,并且其中所述第二药剂是核酸。方面16是方面1至14所述的方法,其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子,并且其中所述第二药剂是多肽。方面17是方面1至14所述的方法,其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子,并且其中所述第二药剂是蛋白质。方面18是方面1至14所述的方法,其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子,并且其中所述第二药剂是小分子。方面19是方面1至18所述的方法,其中所述核酸是RNA,并且其中所述RNA是mRNA、miRNA、shRNA、siRNA或反义寡核苷酸。方面20是方面1至19所述的方法,其中所述核酸是DNA,并且其中所述DNA是反义寡核苷酸、载体或双义线性DNA。方面21是方面1至20所述的方法,其中所述蛋白质是核糖核蛋白。方面22是方面1至21所述的方法,其中所述核糖核蛋白包含Cas9蛋白和指导RNA。
方面23是电穿孔方法,其包括:(a)根据第一方案,使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含RNA的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;(b)允许所述细胞样品恢复至少24小时;以及(c)根据第二方案,使所述细胞样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含RNA的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。
方面24是电穿孔方法,其包括:(a)根据第一方案,使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含DNA的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;(b)允许所述细胞样品恢复至少24小时;以及(c)根据第二方案,使所述细胞样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含DNA的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。
方面25是电穿孔方法,其包括:(a)根据第一方案,使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含一种或更多种蛋白质的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;(b)允许所述细胞样品恢复至少24小时;以及(c)根据第二方案,使所述细胞样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含一种或更多种蛋白质的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。
方面26是连续编辑细胞的方法,其包括:(a)根据第一方案,使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含核糖核蛋白的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;(b)允许所述细胞样品恢复至少24小时;以及(c)根据第二方案,使所述细胞样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含核糖核蛋白的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。
方面27是方面23至26所述的方法,其中所述第一药剂和第二药剂是相同的药剂。方面28是方面23至26所述的方法,其中所述第一药剂和第二药剂是不同的药剂。方面29是方面23至28所述的方法,其中所述第一药剂和第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面30是方面23至29所述的方法,其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子,并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面31是方面23至30所述的方法,其中所述第一药剂是核酸,并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面32是方面23至30所述的方法,其中所述第一药剂是多肽,并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面33是方面23至30所述的方法,其中所述第一药剂是蛋白质,并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面34是方面23至30所述的方法,其中所述第一药剂是小分子,并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面35是方面23至34所述的方法,其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子,并且其中所述第二药剂是核酸。方面36是方面23至34所述的方法,其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子,并且其中所述第二药剂是多肽。方面37是方面23至34所述的方法,其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子,并且其中所述第二药剂是蛋白质。方面38是方面23至34所述的方法,其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子,并且其中所述第二药剂是小分子。方面39是方面23至38所述的方法,其中所述核酸是RNA,并且其中所述RNA是mRNA、miRNA、shRNA、siRNA或反义寡核苷酸。方面40是方面23至39所述的方法,其中所述核酸是DNA,并且其中所述DNA是反义寡核苷酸、载体或双义线性DNA。方面41是方面23至40所述的方法,其中所述蛋白质是核糖核蛋白。方面42是方面23至41所述的方法,其中所述核糖核蛋白包含Cas9蛋白和指导RNA。
方面43是方面1至42所述的方法,其还包括在所述第一电脉冲和/或第二电脉冲之后的静置步骤。方面44是方面1至43所述的方法,其还包括在所述第一电脉冲和/或第二电脉冲之后的静置步骤,其中所述静置步骤包括将所述样品孵育10至30分钟。方面45是方面1至44所述的方法,其还包括在所述第一电脉冲和/或第二电脉冲之后的静置步骤,其中所述静置步骤包括在25℃至50℃下孵育所述样品。方面46是方面1至45所述的方法,其还包括在所述第一电脉冲和/或第二电脉冲之后的静置步骤,其中所述静置步骤包括在3%至8%CO2下孵育所述样品。方面47是方面1至46所述的方法,其中所述样品在所述第一电脉冲和/或第二电脉冲之后不经受静置步骤。方面48是方面1至47所述的方法,其中所述第一场强等于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间长于所述第二脉冲持续时间。方面49是方面1至47所述的方法,其中所述第一场强等于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间短于所述第二脉冲持续时间。方面50是方面1至47所述的方法,其中所述第一场强小于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间等于所述第二脉冲持续时间。方面51是方面1至47所述的方法,其中所述第一场强大于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间等于所述第二脉冲持续时间。方面52是方面1至47所述的方法,其中所述第一场强小于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间长于所述第二脉冲持续时间。方面53是方面1至47所述的方法,其中所述第一场强大于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间长于所述第二脉冲持续时间。方面54是方面1至47所述的方法,其中所述第一场强小于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间短于所述第二脉冲持续时间。方面55是方面1至47所述的方法,其中所述第一场强大于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间短于所述第二脉冲持续时间。方面56是方面1至55所述的方法,其中所述第一场强和第一脉冲持续时间产生第一总施加电能并且所述第二场强和第二脉冲持续时间产生第二总施加电能,并且其中所述第一总施加电能不同于所述第二总施加电能。方面57是方面1至56所述的方法,其中所述第一场强和第一脉冲持续时间产生第一总施加电能并且所述第二场强和第二脉冲持续时间产生第二总施加电能,其中所述第一总施加电能不同于所述第二总施加电能,并且其中所述第一总施加电能大于所述第二总施加电能。方面58是方面1至57所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数。方面59是方面1至58所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数,并且其中所述电脉冲的电压幅值为0.001伏特至10,000伏特、0.01伏特至10,000伏特、0.1伏特至10,000伏特、1伏特至10,000伏特、1伏特至9,000伏特、1伏特至8,000伏特、1伏特至7,000伏特、1伏特至6,000伏特、1伏特至5,000伏特、1伏特至4,000伏特、1伏特至3,000伏特、1伏特至2,000伏特、或1伏特至1,000伏特。方面60是方面1至59所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数,并且其中所述电脉冲的电压幅值为100伏特至900伏特。方面61是方面1至60所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数,并且其中所述样品的电导率是这样的参数的函数,所述参数包括电穿孔缓冲液的离子组成、待被加载到所述细胞中的药剂的浓度、细胞密度、温度和压力。方面62是方面1至61所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数,并且其中所述样品的电导率为0.01西门子/米至10西门子/米、0.01西门子/米至1西门子/米、0.1西门子/米至10西门子/米、0.1西门子/米至1西门子/米、或1西门子/米至10西门子/米。方面63是方面1至62所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数,并且其中所述样品的电导率为1.0至3.0西门子/米。方面64是方面1至63所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数,并且其中所述第一场强和第二场强还是电穿孔室的几何形状的函数。方面65是方面1至64所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数,其中所述第一场强和第二场强还是电穿孔室的几何形状的函数,并且其中所述电穿孔室包含0.001cm至10cm、0.001cm至1cm、0.01cm至10cm、0.01cm至1cm、0.1cm至10cm、0.1cm至1cm、或1cm至10cm的电极间隙。方面66是方面1至65所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数,其中所述第一场强和第二场强还是电穿孔室的几何形状的函数,并且其中所述电穿孔室包含0.01cm至1cm的电极间隙。方面67是方面1至66所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强为0.01kV/cm至10kV/cm、0.01kV/cm至1kV/cm、0.1kV/cm至10kV/cm、0.1kV/cm至1kV/cm、或1kV/cm至10kV/cm。方面68是方面1至67所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强为0.3kV/cm至3kV/cm。方面69是方面1至68所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一脉冲持续时间和第二脉冲持续时间为10-6秒至10秒、10-6秒至1秒、10-3秒至10秒、或10-3秒至1秒。方面70是方面1至69所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一脉冲持续时间和第二脉冲持续时间为1微秒至100毫秒。方面71是方面1至70所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征。方面72是方面1至71所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征,并且其中所述脉冲数为1个脉冲至1000个脉冲、1个脉冲至900个脉冲、1个脉冲至800个脉冲、1个脉冲至700个脉冲、1个脉冲至600个脉冲、1个脉冲至500个脉冲、1个脉冲至400个脉冲、1个脉冲至300个脉冲、1个脉冲至200个脉冲、1个脉冲至100个脉冲、1个脉冲至90个脉冲、1个脉冲至80个脉冲、1个脉冲至70个脉冲、1个脉冲至60个脉冲、1个脉冲至50个脉冲、1个脉冲至40个脉冲、1个脉冲至30个脉冲、1个脉冲至20个脉冲、或1个脉冲至10个脉冲。方面73是方面1至72所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征,并且其中所述脉冲数为1个脉冲至130个脉冲。方面74是方面1至73所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征,并且其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数。方面75是方面1至74所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征,其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数,并且其中所述指数衰减率是所述样品的电阻和用于实现电穿孔的电源的电容的函数。方面76是方面1至75所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征,其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数,其中所述指数衰减率是所述样品的电阻和用于实现电穿孔的电源的电容的函数,并且其中所述样品的电阻为1欧姆至10000欧姆、1欧姆至9000欧姆、1欧姆至8000欧姆、1欧姆至7000欧姆、1欧姆至6000欧姆、1欧姆至5000欧姆、1欧姆至4000欧姆、1欧姆至3000欧姆、1欧姆至2000欧姆、1欧姆至1000欧姆、1欧姆至900欧姆、1欧姆至800欧姆、1欧姆至700欧姆、1欧姆至600欧姆、1欧姆至500欧姆、1欧姆至400欧姆、1欧姆至300欧姆、1欧姆至200欧姆、1欧姆至100欧姆、1欧姆至90欧姆、1欧姆至80欧姆、1欧姆至70欧姆、1欧姆至60欧姆、1欧姆至50欧姆、1欧姆至40欧姆、1欧姆至30欧姆、1欧姆至20欧姆、或1欧姆至10欧姆。方面77是方面1至76所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征,其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数,其中所述指数衰减率是所述样品的电阻和用于实现电穿孔的电源的电容的函数,并且其中所述样品的电阻为1欧姆至1000欧姆。方面78是方面1至77所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征,其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数,其中所述指数衰减率是所述样品的电阻和用于实现电穿孔的电源的电容的函数,并且其中所述电源电容为1μF至1,000,000μF、1μF至100,000μF、1μF至10,000μF、1μF至1,000μF、或1μF至100μF。方面79是方面1至78所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征,其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数,其中所述指数衰减率是所述样品的电阻和用于实现电穿孔的电源的电容的函数,并且其中所述电源电容为1000μF至5000μF。方面80是方面1至79所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征,并且其中所述脉冲形状是方波脉冲或指数衰减波脉冲。方面81是方面1至80所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征,并且其中所述脉冲模式包括与所述第一脉冲或第二脉冲的持续时间相对应的单脉冲。方面82是方面1至81所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征,并且其中所述脉冲模式包括多脉冲,其中所述多脉冲的组合持续时间与所述第一脉冲或第二脉冲的持续时间相对应。方面83是方面1至82所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征,并且其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的极性为正或负。方面84是方面1至83所述的方法,其中在所述样品经受所述第一脉冲之后至少12小时至至少48小时使所述样品经受所述第二电脉冲。方面85是方面1至84所述的方法,其中在所述样品经受所述第一脉冲之后至少24小时使所述样品经受所述第二电脉冲。方面86是方面1至85所述的方法,其中所述方法通过具有包含指令的非暂态计算机可读介质的电穿孔系统进行,所述指令当由处理器执行时引起所述处理器执行所述第一方案和第二方案以对所述样品进行电穿孔。方面87是方面1至86所述的方法,其中所述电穿孔系统包含流式电穿孔设备。方面88是方面1至87所述的方法,其中所述电穿孔系统包含流式电穿孔设备,并且其中当所述样品在所述流式电穿孔设备内流动时使所述样品经受所述电脉冲。方面89是方面1至88所述的方法,其中所述细胞是哺乳动物细胞。方面90是方面1至89所述的方法,其中所述细胞是人细胞、鼠细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞或灵长类细胞。方面91是方面1至90所述的方法,其中所述细胞是原代细胞。方面92是方面1至91所述的方法,其中所述细胞是经培养细胞。方面93是方面1至92所述的方法,其中所述细胞是经培养细胞,并且其中经培养细胞是经培养细胞系。方面94是方面1至93所述的方法,其中所述细胞是经培养细胞系,并且其中所述经培养细胞系包括3T3,697,10T1/2,1321N1,A549,AHR77,B-LCL,B16,B65,Ba/F3,BHK,C2C12,C6,CaCo-2,CAP,CaSki,ChaGo-K-1,CHO,COS,DG75,DLD-1,EL4,H1299,HaCaT,HAP1,HCT116,HEK,HeLa,HepG2,HL60,HOS,HT1080,HT29,Huh-7,HUVEC,INS-1/GRINCH,Jurkat,K46,K562,KG1,KHYG-1,L5278Y,L6,LNCaP,LS180,MCF7,MDA-MB-231,ME-180,MG-63,Min-6,MOLT4,Nalm6,ND7/23,Ncuro2a.NK92,NS/θ,P3U1,Panc-1,PC-3,PCI2,PER.C6,PM1,Ramos,RAW 264.7,RBL,Renca,RLE,SH-SY5Y,SK-BR-3,SK-MES-1,SK-N-SH,SK-OV-3,SP2/0,SW403,THP-1,U2OS,U937,Vero,YB2/0,或其衍生物。方面95是方面1至94所述的方法,其中所述细胞包括脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、角质形成细胞、肌细胞、神经元、骨细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、脾细胞、干细胞或胸腺细胞。方面96是方面1至95所述的方法,其中所述细胞包括PBMC,并且其中所述PBMC是外周血淋巴细胞(PBL)。方面97是方面1至95所述的方法,其中所述细胞包括PBMC,其中所述PBMC包括PBL,并且其中所述PBL是自然杀伤(NK)细胞、T细胞或B细胞。方面98是方面1至95所述的方法,其中所述细胞包括PBMC,并且其中所述PBMC是单核细胞。方面99是方面1至95所述的方法,其中所述细胞包括PBMC,其中所述PBMC是单核细胞,并且其中所述单核细胞是巨噬细胞或树突细胞。方面100是方面1至95所述的方法,其中所述细胞包括PBMC,其中所述PBMC是单核细胞,其中所述单核细胞是巨噬细胞或树突细胞,并且其中所述巨噬细胞是小胶质细胞。方面101是方面1至95所述的方法,其中所述细胞包括干细胞,并且其中所述干细胞是脂肪干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞或神经干细胞。方面102是方面1至101所述的方法,其中所述药剂的加载效率为至少50%、60%、70%、80%或90%。方面103是方面1至102所述的方法,其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少50%。方面104是方面1至103所述的方法,其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少60%。方面105是方面1至104所述的方法,其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少70%。方面106是方面1至105所述的方法,其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少80%。方面107是方面1至106所述的方法,其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少90%。方面108是方面1至107所述的方法,其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后12至96小时有约50%至90%有生存力。方面109是方面1至108所述的方法,其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后12至72小时有约50%至90%有生存力。方面110是方面1至109所述的方法,其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后12至48小时有约50%至90%有生存力。方面111是方面1至110所述的方法,其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后24小时有约50%至90%有生存力。方面112是方面1至111所述的方法,其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后12至96小时有约60%至90%有生存力。方面113是方面1至112所述的方法,其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后12至72小时有约60%至90%有生存力。方面114是方面1至113所述的方法,其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后12至48小时有约60%至90%有生存力。方面115是方面1至114所述的方法,其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后24小时有约60%至90%有生存力。
方面116是使用方面1至115所述的方法产生的经电穿孔的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡。
方面117是电穿孔系统,其具有包含指令的非暂态计算机可读介质,所述指令当由处理器执行时引起所述处理器进行以下:选择与具有第一场强和第一脉冲持续时间的第一电脉冲相关的第一方案;根据所述第一方案,使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受由所述第一方案限定的所述第一电脉冲,所述第一电脉冲足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂;选择与具有第二场强和第二脉冲持续时间的第二电脉冲相关的第二方案;以及根据所述第二方案,使所述样品经受由所述第二方案限定的所述第二电脉冲,所述第二电脉冲足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂;其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。方面118是方面117所述的电穿孔系统,其中所述第一场强等于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间长于所述第二脉冲持续时间。方面119是方面117所述的电穿孔系统,其中所述第一场强等于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间短于所述第二脉冲持续时间。方面120是方面117所述的电穿孔系统,其中所述第一场强小于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间等于所述第二脉冲持续时间。方面121是方面117所述的电穿孔系统,其中所述第一场强大于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间等于所述第二脉冲持续时间。方面122是方面117所述的电穿孔系统,其中所述第一场强小于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间长于所述第二脉冲持续时间。方面123是方面117所述的电穿孔系统,其中所述第一场强大于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间长于所述第二脉冲持续时间。方面124是方面117所述的电穿孔系统,其中所述第一场强小于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间短于所述第二脉冲持续时间。方面125是方面117所述的电穿孔系统,其中所述第一场强大于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间短于所述第二脉冲持续时间。方面126是方面117至方面125所述的电穿孔系统,其中所述第一场强和第一脉冲持续时间产生第一总施加电能并且所述第二场强和第二脉冲持续时间产生第二总施加电能,并且其中所述第一总施加电能不同于所述第二总施加电能。方面127是方面117至方面126所述的电穿孔系统,其中所述第一场强和第一脉冲持续时间产生第一总施加电能并且所述第二场强和第二脉冲持续时间产生第二总施加电能,其中所述第一总施加电能不同于所述第二总施加电能,并且其中所述第一总施加电能大于所述第二总施加电能。方面128是方面117至方面127所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数。方面129是方面117至方面128所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数,并且其中所述电脉冲的电压幅值为0.001伏特至10,000伏特、0.01伏特至10,000伏特、0.1伏特至10,000伏特、1伏特至10,000伏特、1伏特至9,000伏特、1伏特至8,000伏特、1伏特至7,000伏特、1伏特至6,000伏特、1伏特至5,000伏特、1伏特至4,000伏特、1伏特至3,000伏特、1伏特至2,000伏特、或1伏特至1,000伏特。方面130是方面117至方面129所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数,并且其中所述电脉冲的电压幅值为100伏特至900伏特。方面131是方面117至方面130所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数,并且其中所述样品的电导率是这样的参数的函数,所述参数包括电穿孔缓冲液的离子组成、待被加载到细胞中的药剂的浓度、细胞密度、温度和压力。方面132是方面117至方面131所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数,并且其中所述样品的电导率为0.01西门子/米至10西门子/米、0.01西门子/米至1西门子/米、0.1西门子/米至10西门子/米、0.1西门子/米至1西门子/米、或1西门子/米至10西门子/米。方面133是方面117至方面132所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数,并且其中所述样品的电导率为1.0至3.0西门子/米。方面134是方面117至方面133所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数,并且其中所述第一场强和第二场强还是电穿孔室的几何形状的函数。方面135是方面117至方面134所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数,其中所述第一场强和第二场强还是电穿孔室的几何形状的函数,并且其中所述电穿孔室包含0.001cm至10cm、0.001cm至1cm、0.01cm至10cm、0.01cm至1cm、0.1cm至10cm、0.1cm至1cm、或1cm至10cm的电极间隙。方面136是方面117至方面135所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数,其中所述第一场强和第二场强还是电穿孔室的几何形状的函数,并且其中所述电穿孔室包含0.01cm至1cm的电极间隙。方面137是方面117至方面136所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强为0.01kV/cm至10kV/cm、0.01kV/cm至1kV/cm、0.1kV/cm至10kV/cm、0.1kV/cm至1kV/cm、或1kV/cm至10kV/cm。方面138是方面117至方面137所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强为0.3kV/cm至3kV/cm。方面139是方面117至方面138所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一脉冲持续时间和第二脉冲持续时间为10-6秒至10秒、10-6秒至1秒、10-3秒至10秒、或10-3秒至1秒。方面140是方面117至方面139所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一脉冲持续时间和第二脉冲持续时间为1微秒至100毫秒。方面141是方面117至方面140所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征。方面142是方面117至方面141所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征,并且其中所述脉冲数为1个脉冲至1000个脉冲、1个脉冲至900个脉冲、1个脉冲至800个脉冲、1个脉冲至700个脉冲、1个脉冲至600个脉冲、1个脉冲至500个脉冲、1个脉冲至400个脉冲、1个脉冲至300个脉冲、1个脉冲至200个脉冲、1个脉冲至100个脉冲、1个脉冲至90个脉冲、1个脉冲至80个脉冲、1个脉冲至70个脉冲、1个脉冲至60个脉冲、1个脉冲至50个脉冲、1个脉冲至40个脉冲、1个脉冲至30个脉冲、1个脉冲至20个脉冲、或1个脉冲至10个脉冲。方面143是方面117至方面142所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征,并且其中所述脉冲数为1个脉冲至130个脉冲。方面144是方面117至方面143所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征,并且其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数。方面145是方面117至方面144所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征,其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数,并且其中所述指数衰减率是所述样品的电阻和用于实现电穿孔的电源的电容的函数。方面146是方面117至方面145所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征,其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数,其中所述指数衰减率是所述样品的电阻和用于实现电穿孔的电源的电容的函数,并且其中所述样品的电阻为1欧姆至10000欧姆、1欧姆至9000欧姆、1欧姆至8000欧姆、1欧姆至7000欧姆、1欧姆至6000欧姆、1欧姆至5000欧姆、1欧姆至4000欧姆、1欧姆至3000欧姆、1欧姆至2000欧姆、1欧姆至1000欧姆、1欧姆至900欧姆、1欧姆至800欧姆、1欧姆至700欧姆、1欧姆至600欧姆、1欧姆至500欧姆、1欧姆至400欧姆、1欧姆至300欧姆、1欧姆至200欧姆、1欧姆至100欧姆、1欧姆至90欧姆、1欧姆至80欧姆、1欧姆至70欧姆、1欧姆至60欧姆、1欧姆至50欧姆、1欧姆至40欧姆、1欧姆至30欧姆、1欧姆至20欧姆、或1欧姆至10欧姆。方面147是方面117至方面146所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征,其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数,其中所述指数衰减率是所述样品的电阻和用于实现电穿孔的电源的电容的函数,并且其中所述样品的电阻为1欧姆至1000欧姆。方面148是方面117至方面147所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征,其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数,其中所述指数衰减率是所述样品的电阻和用于实现电穿孔的电源的电容的函数,并且其中所述电源电容为1μF至1,000,000μF、1μF至100,000μF、1μF至10,000μF、1μF至1,000μF、或1μF至100μF。方面149是方面117至方面148所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征,其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数,其中所述指数衰减率是所述样品的电阻和用于实现电穿孔的电源的电容的函数,并且其中所述电源电容为1000μF至5000μF。方面150是方面117至方面149所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征,其中所述脉冲形状是方波脉冲或指数衰减波脉冲。方面151是方面117至方面150所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征,其中所述脉冲模式包括与所述第一脉冲或第二脉冲的持续时间相对应的单脉冲。方面152是方面117至方面150所述的电穿孔系统,其中所述脉冲模式包括多脉冲,其中所述多脉冲的组合持续时间与所述第一脉冲或第二脉冲的持续时间相对应。方面153是方面117至方面152所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的极性为正或负。方面154是方面117至方面153所述的电穿孔系统,其中在所述样品经受所述第一脉冲之后至少12小时至至少48小时使所述样品经受所述第二电脉冲。方面155是方面117至方面154所述的电穿孔系统,其中在所述样品经受所述第一脉冲之后至少24小时使所述样品经受所述第二电脉冲。方面156是方面117至方面155所述的电穿孔系统,其中所述电穿孔系统包含流式电穿孔设备。方面157是方面117至方面156所述的电穿孔系统,其中所述电穿孔系统包含流式电穿孔设备,并且其中当所述样品在所述流式电穿孔设备内流动时使所述样品经受所述电脉冲。方面158是方面117至方面157所述的电穿孔系统,其中所述细胞是哺乳动物细胞。方面159是方面117至方面158所述的电穿孔系统,其中所述细胞是人细胞、鼠细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞或灵长类细胞。方面160是方面117至方面159所述的电穿孔系统,其中所述细胞是原代细胞。方面161是方面117至方面160所述的电穿孔系统,其中所述细胞是经培养细胞。方面162是方面117至方面161所述的电穿孔系统,其中所述细胞是经培养细胞,并且其中所述经培养细胞是经培养细胞系。方面163是方面117至方面162所述的电穿孔系统,其中所述细胞是经培养细胞系,并且其中所述经培养细胞系包括3T3,697,10T1/2,1321N1,A549,AHR77,B-LCL,B16,B65,Ba/F3,BHK,C2C12,C6,CaCo-2,CAP,CaSki,ChaGo-K-1,CHO,COS,DG75,DLD-1,EL4,H1299,HaCaT,HAP1,HCT116,HEK,HeLa,HepG2,HL60,HOS,HT1080,HT29,Huh-7,HUVEC,INS-1/GRINCH,Jurkat,K46,K562,KG1,KHYG-1,L5278Y,L6,LNCaP,LS180,MCF7,MDA-MB-231,ME-180,MG-63,Min-6,MOLT4,Nalm6,ND7/23,Neuro2a,NK92,NS/0,P3U1,Panc-1,PC-3,PC12,PER.C6,PM1,Ramos,RAW 264.7,RBL,Renca,RLE,SH-SY5Y,SK-BR-3,SK-MES-1,SK-N-SH,SK-OV-3,SP2/0,SW403,THP-1,U2OS,U937,Vero,YB2/0,或其衍生物。方面164是方面117至方面163所述的电穿孔系统,其中所述细胞包括脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、角质形成细胞、肌细胞、神经元、骨细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、脾细胞、干细胞或胸腺细胞。方面165是方面117至方面164所述的电穿孔系统,其中所述细胞包括PBMC,并且其中所述PBMC是外周血淋巴细胞(PBL)。方面166是方面117至方面164所述的电穿孔系统,其中所述细胞包括PBMC,其中所述PBMC是PBL,并且其中所述PBL是自然杀伤(NK)细胞、T细胞或B细胞。方面167是方面117至方面164所述的电穿孔系统,其中所述细胞包括PBMC,并且其中所述PBMC是单核细胞。方面168是方面117至方面164所述的电穿孔系统,其中所述细胞包括PBMC,其中所述PBMC是单核细胞,并且其中所述单核细胞是巨噬细胞或树突细胞。方面169是方面117至方面164所述的电穿孔系统,其中所述细胞包括PBMC,其中所述PBMC是单核细胞,其中所述单核细胞是巨噬细胞或树突细胞,并且其中所述巨噬细胞是小胶质细胞。方面170是方面117至方面164所述的电穿孔系统,其中所述细胞包括干细胞,其中所述干细胞是脂肪干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞或神经干细胞。方面171是方面117至方面170所述的电穿孔系统,其中所述第一药剂和第二药剂是相同的药剂。方面172是方面117至方面170所述的电穿孔系统,其中所述第一药剂和第二药剂是不同的药剂。方面173是方面117至172所述的方法,其中所述第一药剂和第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面174是方面117至173所述的方法,其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子,并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面175是方面117至174所述的方法,其中所述第一药剂是核酸,并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面176是方面117至174所述的方法,其中所述第一药剂是多肽,并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面177是方面117至174所述的方法,其中所述第一药剂是蛋白质,并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面178是方面117至174所述的方法,其中所述第一药剂是小分子,并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面179是方面117至178所述的方法,其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子,并且其中所述第二药剂是核酸。方面180是方面117至178所述的方法,其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子,并且其中所述第二药剂是多肽。方面181是方面117至178所述的方法,其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子,并且其中所述第二药剂是蛋白质。方面182是方面117至178所述的方法,其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子,并且其中所述第二药剂是小分子。方面183是方面117至182所述的方法,其中所述核酸是RNA,并且其中所述RNA是mRNA、miRNA、shRNA、siRNA或反义寡核苷酸。方面184是方面117至183所述的方法,其中所述核酸是DNA,并且其中所述DNA是反义寡核苷酸、载体或双义线性DNA。方面185是方面117至184所述的方法,其中所述蛋白质是核糖核蛋白。方面186是方面117至185所述的方法,其中所述核糖核蛋白包含Cas9蛋白和指导RNA。方面187是方面117至186所述的方法,其中所述药剂的加载效率为至少50%、60%、70%、80%或90%。方面188是方面117至187所述的方法,其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少50%。方面189是方面117至188所述的方法,其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少60%。方面190是方面117至189所述的方法,其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少70%。方面191是方面117至190所述的方法,其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少80%。方面192是方面117至191所述的方法,其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少90%。方面193是方面117至192所述的方法,其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后12至96小时有约50%至90%有生存力。方面194是方面117至193所述的方法,其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后12至72小时有约50%至90%有生存力。方面195是方面117至194所述的方法,其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后12至48小时有约50%至90%有生存力。方面196是方面117至195所述的方法,其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后24小时有约50%至90%有生存力。方面197是方面117至196所述的方法,其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后12至96小时有约60%至90%有生存力。方面198是方面117至197所述的方法,其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后12至72小时有约60%至90%有生存力。方面199是方面117至198所述的方法,其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后12至48小时有约60%至90%有生存力。方面200是方面117至199所述的方法,其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后24小时有约60%至90%有生存力。
方面201是使用方面117至200所述的电穿孔系统产生的经电穿孔的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡。
在本申请通篇,如涉及电穿孔靶标或用于递送药剂、药物或治疗剂的载剂的术语“细胞”或“递送载剂”意指包括生物学意义上的人或动物细胞。
本文中使用的术语“能/能量”是指在向样品施加电脉冲(或组合脉冲)期间产生的热,并且其与在电脉冲(或组合脉冲)期间向样品施加的场强和脉冲持续时间(或组合脉冲持续时间)二者均成比例。因此,为了向样品施加“高能量”脉冲,对变量包括场强和脉冲持续时间(或组合脉冲持续时间)的比例进行修改,使得与当向样品施加“中等能量”或“低能量”电脉冲(或组合脉冲)时相比,在电脉冲(或组合脉冲)期间产生更大量的热,前提是缓冲液组成、处理组件和样品体积保持恒定。相反地,为了向样品施加“低能量”脉冲,对变量包括场强和脉冲持续时间(或组合脉冲持续时间)的比例进行修改,使得与当向样品施加“高能量”或“中等能量”电脉冲(或组合脉冲)时相比,在电脉冲(或组合脉冲)期间产生更少量的热,前提是缓冲液组成、处理组件和样品体积保持恒定。
在本申请通篇,术语“约”、“基本上”和“大约”用于指示这样的值,所述值包括用于测量或定量方法的误差的固有变化。
当与术语“包含/包括”结合使用时,没有数量词修饰的名词的使用可意指“一个/种”,但是其也符合“一个/种或更多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义。
短语“和/或”意指“和”或者“或”。为了举例说明,A、B和/或C包括:单独的A、单独的B、单独的C、A和B的组合、A和C的组合、B和C的组合、或A、B和C的组合。换言之,“和/或”作为包含性的或来使用。
组合物及其使用方法可以“包含/包括”在本说明书通篇公开的任何成分或步骤、“基本上由其组成”或“由其组成”。“基本上由”任何公开的成分或步骤组成的组合物和方法将权利要求书的范围限制在不实质影响本公开内容的基本特征和新特征的特定材料或步骤。如在本说明书和权利要求书中使用的,词语“包含(comprising)”(及其任何形式,例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(及其任何形式,例如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(及其任何形式,例如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(及其任何形式,例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包含性的或开放式的,并且不排除另外的未记载的要素或方法步骤。预期在术语“包含/包括”的背景下的本文中所述的一些方面也可以在术语“由......组成”或“基本上由......组成”的背景下实施。
特别预期了关于本公开内容的一个方面所讨论的任何限制均可应用于本公开内容的任何其他方面。此外,本公开内容的任何组合物均可用于本公开内容的任何方法中,并且本公开内容的任何方法均可用于产生或利用本公开内容的任何组合物。在实例中阐述的方面中的一些方面也是可以在不同实例中的其他地方或在本申请的其他地方(例如在发明内容、具体实施方式、权利要求书和附图说明中)讨论的方面的背景下实施的方面。
根据以下详细描述,本公开内容的其他目的、特征和优点将变得明显。然而,应当理解,详细描述和具体实例虽然指示了本公开内容的一些具体方面,但仅通过举例说明的方式给出,因为根据该详细描述,在本公开内容的精神和范围内的多种改变和修改对于本领域技术人员将变得明显。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分并且被包括在内以进一步表明本公开内容的某些方面。通过参照这些附图中的一幅或更多幅并结合本文中所示的具体方面的详细描述,可以更好地理解本公开内容。
图1示出了与本公开内容的一些方面一致的处于闭合位置的电穿孔处理组件(assembly)的左视、俯视透视图;
图2示出了与本公开内容的一些方面一致的处于打开位置的图1的处理组件的左视、俯视透视图;
图3示出了与本公开内容的一些方面一致的处于打开位置的图1的处理组件的后视、俯视、右视透视图;
图4示出了与本公开内容的一些方面一致的处于打开位置的图1的处理组件的后视、俯视、右视透视图;
图5示出了与本公开内容的一些方面一致的图4的处理组件的分解透视图;
图6示出了与本公开内容的一些方面一致的图4的处理组件的分解透视图;
图7示出了与本公开内容的一些方面一致的具有标签的图1的处理组件的俯视、右视透视图;
图8示出了与本公开内容的一些方面一致的具有标签的图1的处理组件的俯视、左视透视图;
图9示出了与本公开内容的一些方面一致的插入有加载装置的图1的处理组件的俯视、右视透视图;
图10示出了与本公开内容的一些方面一致的图9的处理组件的俯视、右视透视图,其中处理组件的一部分被移出视图;
图11示出了与本公开内容的一些方面一致的持有电穿孔处理组件的托盘的俯视右视透视图;
图12示出了与本公开内容的一些方面一致的持有电穿孔处理组件的托盘的前视图;
图13示出了与本公开内容的一些方面一致的持有电穿孔处理组件的托盘的俯视右视透视图;
图14示出了与本公开内容的一些方面一致的多个衬垫(gasket)的前视图;
图15示出了与本公开内容的一些方面一致的衬垫阵列的俯视图和衬垫的前视图;
图16示出了与本公开内容的一些方面一致的处理设备和袋(bag)的前视图;
图17示出了与本公开内容的一些方面一致的衬垫的前视图;
图18示出了与本公开内容的一些方面一致的处于闭合位置的另一电穿孔处理组件的右视、俯视透视图;
图19示出了与本公开内容的一些方面一致的处于打开位置的图18的处理组件的右视、俯视透视图;
图20示出了与本公开内容的一些方面一致的图18的处理组件的分解透视图;
图21示出了与本公开内容的一些方面一致的持有多个电穿孔处理组件的托盘;
图22示出了与本公开内容的一些方面一致的电穿孔处理组件;
图23示出了与本公开内容的一些方面一致的用于持有多个电穿孔处理组件的托盘;
图24示出了与本公开内容的一些方面一致的用于持有多个电穿孔处理组件的托盘;
图25示出了与本公开内容的一些方面一致的用于持有多个电穿孔处理组件的支架;
图26示出了与本公开内容的一些方面一致的用于持有多个电穿孔处理组件的支架;
图27示出了与本公开内容的一些方面一致的电穿孔系统;
图28示出了与本公开内容的一些方面一致的处于打开位置的对接站(dockingstation),其中电穿孔处理组件被移出;
图29示出了与本公开内容的一些方面一致的插入有处理组件的处于打开位置的图28的对接站;
图30示出了与本公开内容的一些方面一致的插入有处理组件的处于闭合位置的图28的对接站;
图31示出了与本公开内容的一些方面一致的处于打开位置、处于闭合位置、以及与电穿孔系统连接的对接站;
图32示出了与本公开内容的一些方面一致的与电穿孔系统连接的对接站;
图33示出了与本公开内容的一些方面一致的电穿孔装置、处理组件、对接站、托盘和填充设备;
图34A至34C示出了与本公开内容的一些方面一致的用于向电穿孔系统递送的示例性容器。
图35示出了用两种不同GFP mRNA浓度(100μg/mL和200μg/mL)对经扩增淋巴细胞进行顺序电穿孔的实验设计。
图36示出了在用GFP mRNA对经扩增淋巴细胞进行顺序电穿孔之后第3天和第4天的流式细胞术数据。
图37A至37B示出了经受顺序电穿孔的淋巴细胞的生存力和淋巴细胞设门。
图38A至38B示出了经顺序电穿孔的淋巴细胞的GFP表达和GFP平均荧光强度(meanfluorescence intensity,MFI)。
图39A至39E示出了用两种不同GFP mRNA浓度(100μg/mL和200μg/mL)在不同电穿孔能量下对经扩增淋巴细胞进行顺序电穿孔的实验设计。
图40A至40B示出了在用两种不同GFP mRNA浓度(100μg/mL和200μg/mL)在不同电穿孔(electroporation,EP)能量下对经扩增淋巴细胞进行顺序电穿孔之后三个不同时间点(24小时、48小时和72小时)时表达GFP mRNA的淋巴细胞群。
图41A至41B示出了对于图39A至39E中所示的所有四种能量组合,在不同电穿孔(EP)能量下对经扩增淋巴细胞进行顺序电穿孔之后,淋巴细胞生存力是相当的。
图42A至42B示出了在用两种不同GFP mRNA浓度(100μg/mL和200μg/mL)在不同电穿孔(EP)能量下对经扩增淋巴细胞进行顺序电穿孔之后三个不同时间点(24小时、48小时和72小时)时淋巴细胞的GFP表达。
图43A至43B示出了在用两种不同GFP mRNA浓度(100μg/mL和200μg/mL)在不同电穿孔(EP)能量下对经扩增淋巴细胞进行顺序电穿孔之后三个不同时间点(24小时、48小时和72小时)时淋巴细胞的GFP平均荧光强度(MFI)。
图44A至44B示出了用两种不同的核糖核蛋白(RNP)构建体对经活化T细胞进行顺序电穿孔以敲除TRAC和PD1的实验设计,其包括细胞培养(图44A)和电穿孔(图44B)条件。
图45示出了在与细胞因子一起孵育2天之后T细胞的活化。
图46A至46F示出了用于测量淋巴细胞中TRAC和PD1敲除效率的FACS设门策略。
图47A至47E示出了用于在用RNP构建体进行电穿孔以敲除TRAC之后测量总细胞和淋巴细胞计数的FACS设门策略。
图48是本电穿孔系统的一个方面的示意图。
图49示出了用于使样品经受两个或更多个电脉冲的本方法的一个方面,其可以使用图48的电穿孔系统来实施。
具体实施方式
本公开内容的某些方面涉及用于对细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织进行顺序电穿孔的方法和设备,其提供了对在时间上隔开的多轮电穿孔的递送以提高一种或更多种目的药剂进入到细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体、组织、或其衍生物中的效率,并使电弧或热休克的损伤最小化。
I.电穿孔
本文中使用的电穿孔或电加载(electroloading)是指施加电流或电场以促进目的药剂进入到细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体、组织、或其衍生物中。本领域技术人员将理解,本公开内容考虑了电穿孔的任何方法和技术。
电穿孔的过程一般涉及通过对包含细胞、囊泡或脂质体的液体细胞悬液施加电场脉冲来在细胞膜中或者在囊泡或脂质体中形成孔。在电穿孔过程期间,细胞通常悬浮在液体介质中并随后经受电场脉冲。介质可以是电解质、非电解质、或电解质与非电解质的混合物。施加于悬液的电场的强度和脉冲的长度(电场施加至细胞悬液的时间)根据细胞类型而变化。为了在细胞的外膜中产生孔,必须持续这样的时间长度并在这样的电压下施加电场,以提高细胞膜的通透性,从而允许目的药剂进入细胞。
可以调节电穿孔参数以优化所施加电场的强度和/或暴露的持续时间,使得通过电脉冲在膜中形成的孔在短时间之后重新密封,在该短时间期间,胞外化合物有机会进入到细胞中。然而,活细胞过度暴露于电场可导致凋亡和/或坏死,这导致细胞死亡。这部分地是因为,在电穿孔过程期间,流过导电介质的电流导致介质的加热以及随后介质电导率的提高。如果控制不当,这样的电导率提高导致甚至更多的电流从电源中流出,这可导致电弧和样品损失。该作用通常在相对高的场强(>2kV/cm)下被观察到。然而,对难以转染的细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织的电穿孔例如需要相对强的电场。
作为一个实例,被开发用于电穿孔的缓冲液通常具有相对高的电导率,并且使用非常短的电脉冲。然而,为了使难以转染的细胞或脂质体有效地加载有目的药剂,可能需要在相对长的时间间隔内向高度导电的介质施加高电压。这三个条件不容易同时满足,并且这样做可对细胞或脂质体造成不可逆的损伤。在进行本文中所述的实验之前,本发明人假定多轮电穿孔可以提供使难以转染的细胞或脂质体对目的药剂进行的有效加载。然而,目前一般避免顺序电穿孔,因为与在相对长的时间间隔内向高度导电的介质施加高电压一样,已知多轮电穿孔会不可逆地损伤细胞或脂质体并且导致细胞死亡。例如,O’Dea等人(Vector-free intracellular delivery by reversible permeabilization.PLoSONE.2017;12(3):e0174779)明确指出,所描述的无载体可逆细胞透化方法使得将遗传物质多次给药至细胞成为可能,这与技术例如电穿孔相反,对于技术例如电穿孔,多次给药是不可能的,因为多轮电穿孔导致细胞死亡。实际上,Plews等人(Activation of PluripotencyGenes in Human Fibroblast Cells by a Novel mRNA Based Approach.PLoS ONE.2010;5(12):e14397)实际上表明了尝试多轮电穿孔导致大量的细胞死亡。类似地,Rols和Teissie(Electropermeabilization of Mammalian Cells to Macromolecules:Controlby Pulse Duration.Biophys.J.1998;75(3):1415-1423)在图2A和2C中示出,随着脉冲持续时间或按顺序施加的脉冲数的提高,细胞生存力显著降低。
该问题的解决方案涉及所公开的用于电穿孔的方法和设备,其提供顺序轮次的电穿孔,同时使电弧或热休克对细胞、细胞颗粒、脂质囊泡或组织的损伤最小化;提高目的药剂的加载效率;并且维持细胞、细胞颗粒、脂质囊泡或组织的生存力以及细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织产生临床作用的能力。本发明人已经开发了电穿孔方法,其包括使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受两个或更多个具有不同电场强和/或不同脉冲持续时间的电脉冲,并且作为补充或替代,允许样品在两个或更多个电脉冲之间恢复至少24小时。本发明人出乎意料地发现,与先前描述的方法相比,这些电穿孔方法可以更有效地使难以转染的样品加载有目的药剂而不降低样品完整性或者对于细胞样品而言不降低细胞生存力。
一些方面包括包封目的药剂的方法;使膜暂时透化以允许目的药剂转运通过膜的方法;对细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织进行电穿孔的方法;产生经电穿孔的细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织的方法;以及在维持经电穿孔物质的临床作用的同时提高电穿孔效率的方法。一些方面还包括使用本文中公开的电穿孔方法或设备中任一者产生的经电穿孔的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡。
本发明方法中的一些包括:根据第一方案,使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有药剂的第一场强和第一脉冲持续时间,以及根据第二方案,使样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有药剂的第二场强和第二脉冲持续时间。在一些这样的方法中,第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间。作为补充或替代,一些方法包括在使样品经受第一电脉冲之后允许样品恢复至少24小时。
在一些方面中,药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。在一些方面中,核酸是RNA,并且RNA是mRNA、miRNA、shRNA、siRNA或反义寡核苷酸。在一些方面中,核酸是DNA,并且DNA是反义寡核苷酸、载体或双义线性DNA。在一些方面中,蛋白质是核糖核蛋白。在一些方面中,核糖核蛋白包含Cas9蛋白和指导RNA。
在一些方面中,本文中公开的方法通过具有包含指令的非暂态计算机可读介质的电穿孔系统进行,所述指令当由处理器执行时引起处理器执行第一和第二方案以对样品进行电穿孔。在一些方面中,电穿孔系统包含流式电穿孔设备,并且当样品在流式电穿孔设备内流动时使样品经受电脉冲。
在一些方面中,可以调节第一和第二电脉冲的时机(timing)和/或由两个或更多个电脉冲提供的所施加电场和/或暴露持续时间,使得电弧或热休克对细胞、细胞颗粒、脂质囊泡或组织的损伤最小化;提高目的药剂的加载效率;并且维持细胞、细胞颗粒、脂质囊泡或组织的生存力以及细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织产生临床作用的能力。
在一些方面中,允许样品在电脉冲(例如,第一和/或第二电脉冲)之后静置。在一些方面中,样品在电脉冲之后在25℃至50℃和3%至8%CO2下静置10至30分钟。因此,在一些方面中,样品在电脉冲之后静置至多,至少或10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30分钟、或者其中可推导出的任何范围或值。在一些方面中,样品在电脉冲之后在至少,至多或约25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃、或者其中可推导出的任何范围或值下静置。在一些方面中,样品在电脉冲之后在至少,至多或约3%、4%、5%、6%、7%或8%CO2、或者其中可推导出的任何范围或值下静置。在一些具体方面中,样品在电脉冲之后在37℃和5%CO2下静置20分钟。在一些方面中,样品在电脉冲(例如,第一和/或第二电脉冲)之后不静置。
在一些方面中,允许在样品经受第一脉冲之后通过将细胞培养至少,至多或6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114或120小时、或者其中可推导出的任何范围或值来使包含一个或更多个完整细胞的样品恢复。在一些方面中,允许在样品经受第一脉冲之后通过将细胞培养至多或至少6小时至120小时、6小时至96小时、6小时至72小时、6小时至48小时、6小时至24小时、6小时至12小时、或者其中可推导出的任何范围或值来使包含一个或更多个完整细胞的样品恢复。因此,在一些方面中,在样品经受第一脉冲之后至少,至多或6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114或120小时、或者其中可推导出的任何范围或值时使样品经受第二电脉冲。在一些方面中,在样品经受第一脉冲之后至多或至少6小时至120小时、6小时至96小时、6小时至72小时、6小时至48小时、6小时至24小时、6小时至12小时、或者其中可推导出的任何范围或值时使样品经受第二电脉冲。在一些方面中,在样品经受第一脉冲之后6小时至120小时、6小时至96小时、6小时至72小时、6小时至48小时、6小时至24小时、6小时至12小时、或者其中可推导出的任何范围或值时使样品经受第二电脉冲。在一些方面中,在样品经受第一脉冲之后至少约12小时至至少约48小时时使样品经受第二电脉冲。在一些方面中,在样品经受第一脉冲之后至少约24小时时使样品经受第二电脉冲。在一些方面中,在样品经受第一脉冲之后不通过培养细胞来使包含一个或更多个完整细胞的样品恢复。
使样品恢复或允许样品恢复意指在这样的条件下在本文中公开的细胞培养容器和细胞培养介质中的任一者中培养样品的细胞,所述条件例如适合且足以促进细胞恢复或返回到改善的或期望的状态或状况的本文中公开的那些。例如,在培养中恢复可以允许细胞通过例如修复细胞壁来从电穿孔的创伤中恢复,并在对细胞的电穿孔之后开始表达或代谢被加载到细胞中的药剂。
关于场强和脉冲持续时间,在一些方面中,第一电脉冲的场强等于第二电脉冲的场强,并且第一电脉冲的脉冲持续时间长于第二电脉冲的脉冲持续时间。在一些方面中,第一电脉冲的场强等于第二电脉冲的场强,并且第一电脉冲的脉冲持续时间短于第二电脉冲的脉冲持续时间。在一些方面中,第一电脉冲的场强等于第二电脉冲的场强,并且第一电脉冲的脉冲持续时间等于第二电脉冲的脉冲持续时间。在一些方面中,第一电脉冲的场强大于第二电脉冲的场强,并且第一电脉冲的脉冲持续时间等于第二电脉冲的脉冲持续时间。在一些方面中,第一电脉冲的场强大于第二电脉冲的场强,并且第一电脉冲的脉冲持续时间长于第二电脉冲的脉冲持续时间。在一些方面中,第一电脉冲的场强大于第二电脉冲的场强,并且第一电脉冲的脉冲持续时间短于第二电脉冲的脉冲持续时间。在一些方面中,第一电脉冲的场强小于第二电脉冲的场强,并且第一电脉冲的脉冲持续时间等于第二电脉冲的脉冲持续时间。在一些方面中,第一电脉冲的场强小于第二电脉冲的场强,并且第一电脉冲的脉冲持续时间长于第二电脉冲的脉冲持续时间。在一些方面中,第一电脉冲的场强小于第二电脉冲的场强,并且第一电脉冲的脉冲持续时间短于第二电脉冲的脉冲持续时间。
在一些方面中,第一电脉冲的场强和第一电脉冲的脉冲持续时间产生第一总施加电能并且第二电脉冲的场强和第二电脉冲的脉冲持续时间产生第二总施加电能。在一些方面中,第一总施加电能不同于第二总施加电能。在一些方面中,第一总施加电能大于第二总施加电能。在一些方面中,第一总施加电能小于第二总施加电能。
为了实现等于、小于或大于第二场强和/或第二脉冲持续时间的第一场强和/或第一脉冲持续时间,可以使用本文中所述的程序和方法来优化一个或更多个电穿孔变量或参数。本公开内容的一些方面可以在具有静态和流式电穿孔系统的背景下使用。
1.电场强
场强被测量为穿过电极间隙递送的电压并且可表示为kV/cm。场强对于超过细胞膜电位以允许在细胞膜中出现暂时的可逆渗透或孔形成而言是至关重要的,并且本公开内容的方法能够使细胞经受一定范围的电场强。在一些方面中,第一和第二电脉冲的第一和第二场强可以为,为至少,或为至多0.01,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9,4,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9,5,5.1,5.2,5.3,5.4,5.5,5.6,5.7,5.8,5.9,6,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9,7,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6,7.7,7.8,7.9,8,8.1,8.2,8.3,8.4,8.5,8.6,8.7,8.8,8.9,9,9.1,9.2,9.3,9.4,9.5,9.6,9.7,9.8,9.9,或10kV/cm、或者其中可推导出的任何范围或值。在一些方面中,第一和第二电脉冲的第一和第二场强为至多或至少约0.01kV/cm至10kV/cm、0.01kV/cm至1kV/cm、0.1kV/cm至10kV/cm、0.1kV/cm至1kV/cm、1kV/cm至10kV/cm或者0.01kV/cm至10kV/cm中的任何值或其中可推导出的范围。在一些方面中,第一和第二电脉冲的第一和第二场强为0.01kV/cm至10kV/cm、0.01kV/cm至1kV/cm、0.1kV/cm至10kV/cm、0.1kV/cm至1kV/cm、1kV/cm至10kV/cm、或者0.01kV/cm至10kV/cm中的任何值或其中可推导出的范围。在一些方面中,第一和第二电脉冲的第一和第二场强为0.3kV/cm至3kV/cm、0.3kV/cm至3kV/cm中的任何值、或者其中可推导出的任何范围或值。
场强是数个因素的函数,所述因素包括所施加的电脉冲的电压幅值、电脉冲的持续时间和电穿孔样品的电导率。因此,在一些方面中,第一和第二电脉冲的第一和第二场强是电脉冲的电压幅值、电脉冲的持续时间和样品的电导率的函数。
在一些方面中,电脉冲的电压幅值可以为,可以为约,为至少或为至多0.001,0.010,0.020,0.030,0.040,0.050,0.060,0.070,0.080,0.090,0.100,0.110,0.120,0.130,0.140,0.150,0.160,0.170,0.180,0.190,0.200,0.210,0.220,0.230,0.240,0.250,0.260,0.270,0.280,0.290,0.300,0.310,0.320,0.330,0.340,0.350,0.360,0.370,0.380,0.390,0.400,0.410,0.420,0.430,0.440,0.450,0.460,0.470,0.480,0.490,0.500,0.510,0.520,0.530,0.540,0.550,0.560,0.570,0.580,0.590,0.600,0.610,0.620,0.630,0.640,0.650,0.660,0.670,0.680,0.690,0.700,0.710,0.720,0.730,0.740,0.750,0.760,0.770,0.780,0.790,0.800,0.810,0.820,0.830,0.840,0.850,0.860,0.870,0.880,0.890,0.900,0.910,0.920,0.930,0.940,0.950,0.960,0.970,0.980,0.990,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200,210,220,230,240,250,260,270,280,290,300,310,320,330,340,350,360,370,380,390,400,410,420,430,440,450,460,470,480,490,500,510,520,530,540,550,560,570,580,590,600,610,620,630,640,650,660,670,680,690,700,710,720,730,740,750,760,770,780,790,800,810,820,830,840,850,860,870,880,890,900,910,920,930,940,950,960,970,980,990,1000,1100,1200,1300,1400,1500,1600,1700,1800,1900,2000,2100,2200,2300,2400,2500,2600,2700,2800,2900,3000,3100,3200,3300,3400,3500,3600,3700,3800,3900,4000,4100,4200,4300,4400,4500,4600,4700,4800,4900,5000,5100,5200,5300,5400,5500,5600,5700,5800,5900,6000,6100,6200,6300,6400,6500,6600,6700,6800,6900,7000,7100,7200,7300,7400,7500,7600,7700,7800,7900,8000,8100,8200,8300,8400,8500,8600,8700,8800,8900,9000,9100,9200,9300,9400,9500,9600,9700,9800,9900,或10000伏特、或者其中可推导出的任何范围或值。在一些方面中,电脉冲的电压幅值为至多或至少约0.001伏特至10,000伏特、0.01伏特至10,000伏特、0.1伏特至10,000伏特、1伏特至10,000伏特、1伏特至9,000伏特、1伏特至8,000伏特、1伏特至7,000伏特、1伏特至6,000伏特、1伏特至5,000伏特、1伏特至4,000伏特、1伏特至3,000伏特、1伏特至2,000伏特、1伏特至1,000伏特、或者0.001伏特至10,000伏特中的任何值或其中可推导出的范围。在一些方面中,电脉冲的电压幅值为0.001伏特至10,000伏特、0.01伏特至10,000伏特、0.1伏特至10,000伏特、1伏特至10,000伏特、1伏特至9,000伏特、1伏特至8,000伏特、1伏特至7,000伏特、1伏特至6,000伏特、1伏特至5,000伏特、1伏特至4,000伏特、1伏特至3,000伏特、1伏特至2,000伏特、1伏特至1,000伏特、或者0.001伏特至10,000伏特中的任何值或其中可推导出的范围。在一些方面中,电脉冲的电压幅值为100伏特至900伏特、100伏特至900伏特中的任何值、或者其中可推导出的任何范围或值。
在一些方面中,样品的电导率是这样的参数的函数,所述参数包括电穿孔缓冲液的离子组成、待被加载到细胞中的药剂的浓度、细胞密度、温度和压力。在一些方面中,样品的电导率可以为,为至少或为至多0.01,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6.0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9,4,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9,5,5.1,5.2,5.3,5.4,5.5,5.6,5.7,5.8,5.9,6,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9,7,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6,7.7,7.8,7.9,8,8.1,8.2,8.3,8.4,8.5,8.6,8.7,8.8,8.9,9,9.1,9.2,9.3,9.4,9.5,9.6,9.7,9.8,9.9或10西门子/米、或者其中可推导出的任何范围或值。在一些方面中,样品的电导率为至多或至少约0.01西门子/米至10西门子/米、0.01西门子/米至1西门子/米、0.1西门子/米至10西门子/米、0.1西门子/米至1西门子/米、1西门子/米至10西门子/米、或者0.01西门子/米至10西门子/米中的任何值或其中可推导出的范围。在一些方面中,样品的电导率为0.01西门子/米至10西门子/米、0.01西门子/米至1西门子/米、0.1西门子/米至10西门子/米、0.1西门子/米至1西门子/米、1西门子/米至10西门子/米、或者0.01西门子/米至10西门子/米中的任何值或其中可推导出的范围。在一些方面中,样品的电导率为1.0至3.0西门子/米、1.0西门子/米至3.0西门子/米中的任何值、或者其中可推导出的任何范围或值。
用于电穿孔的缓冲液的离子组成可以根据细胞类型而变化。例如,可以使用高度导电的缓冲液,例如PBS(磷酸缓冲盐水(Phosphate Buffered Saline)<30欧姆)和HBSS(Hepes缓冲液<30欧姆)或可以含有血清的标准培养基。另一些缓冲液包括低渗缓冲液(hypoosmolar buffer),其中细胞在电脉冲之前不久吸收水,这可以导致细胞肿胀并可以降低最佳渗透电压同时确保膜更容易渗透。需要使用高电阻缓冲液(>3000欧姆)的细胞可需要对细胞进行制备和洗涤以除去过量的盐离子从而降低电弧和样品损失的机会。电穿孔缓冲液的离子强度对样品的电阻有直接作用,其继而影响脉冲的脉冲长度或时间常数。与电极接触的液体体积对离子溶液的样品电阻也有显著作用,并且样品的电阻与溶液体积和pH成反比。随着体积提高,电阻降低,这提高了电弧和样品损失的可能性,而降低体积则提高电阻并降低电弧电位。
药剂的尺寸和浓度将对用于转染细胞的电参数有作用。较小分子(例如,siRNA或miRNA)可能需要具有微秒脉冲长度的较高电压,而较大分子(例如,DNA和蛋白质)可能需要具有较长脉冲长度的较低电压。在电穿孔过程期间寡核苷酸的浓度可以为约0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,30,50,75,100,150,200,250,300至约350,400,500,1000,1500,2000,3000,4000,或5000μg/mL,或者0.01μg/mL至5000μg/mL中的任何值或其中可推导出的范围。在某些方面中,寡核苷酸的浓度为至少1μg/mL。在另一些方面中,寡核苷酸的浓度为至少,至多或约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100,150,125,150,175,200,225,250,275,或300μg/mL,或者1μg/mL至300μg/mL中的任何值或其中可推导出的范围。在电穿孔过程期间多肽的浓度可以为约0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,30,50,75,100,150,200,250,300至约350,400,500,1000,1500,2000,3000,4000,或5000μg/mL,或者0.01μg/mL至5000μg/mL中的任何值或其中可推导出的范围。在某些方面中,多肽的浓度为至少1μg/mL。在另一些方面中,多肽的浓度为至少,至多或约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100,125,150,175,200,225,250,275,或300μg/mL,或者1μg/mL至300μg/mL中的任何值或其中可推导出的范围。
细胞密度可与细胞尺寸相关。一般而言,较小的细胞尺寸需要较高的电压,而较大的细胞尺寸需要较低的电压以用于成功的细胞膜渗透。
在电穿孔期间使细胞维持的温度可影响电穿孔的效率。在高电压下经脉冲的或暴露于多脉冲和长脉冲持续时间的样品可导致样品加热,这可促成提高的细胞死亡和降低的转染效率。使样品维持在较低温度下可降低过热对细胞生存力和效率的作用。一般而言,在室温下用于细胞的标准脉冲电压应约加倍以用于在4℃下进行电穿孔以有效渗透细胞膜。
在一些方面中,可以调节电穿孔室的几何形状以调节电场强。场强使用电压除以间隙尺寸来计算。电穿孔室的几何形状可以是电极之间的距离或“间隙尺寸”的函数。因此,在一些方面中,可以控制电穿孔室内电极的间隙尺寸以调节电场强。通过提高间隙尺寸,可以在不改变电压的情况下提高场强。为了获得完成电穿孔所需的电压,如果期望的场强和间隙尺寸是已知的,则将场强(kV)乘以间隙尺寸(cm)。电穿孔室的电极可以包含两个或更多个“板”电极。电极板可以包含任何可用的生物相容性和导电性材料,包括铝、钛和金。电极板可以用如通过本公开内容所确定的电脉冲来寻址(addressable)。电极可以包含1至100个阴极和1至100个阳极的阵列,存在偶数个阴极和阳极以便形成正电极和负电极的对。板可以包括这样的宽度尺寸,所述宽度尺寸通常大于相对电极之间的距离或间隙,或者大于间隙距离的两倍。
阴极和阳极电极可以在电穿孔室的相对内侧上间隔开,使得电穿孔室包含至少、至多、或约0.001,0.010,0.020,0.030,0.040,0.050,0.060,0.070,0.080,0.090,0.100,0.110,0.120,0.130,0.140,0.150,0.160,0.170,0.180,0.190,0.200,0.210,0.220,0.230,0.240,0.250,0.260,0.270,0.280,0.290,0.300,0.310,0.320,0.330,0.340,0.350,0.360,0.370,0.380,0.390,0.400,0.410,0.420,0.430,0.440,0.450,0.460,0.470,0.480,0.490,0.500,0.510,0.520,0.530,0.540,0.550,0.560,0.570,0.580,0.590,0.600,0.610,0.620,0.630,0.640,0.650,0.660,0.670,0.680,0.690,0.700,0.710.0.720,0.730,0.740,0.750,0.760,0.770,0.780,0.790,0.800,0.810,0.820,0.830,0.840,0.850,0.860,0.870,0.880,0.890,0.900,0.910,0.920,0.930,0.940,0.950,0.960,0.970,0.980,0.990,1.0,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9,4,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9,5,5.1,5.2,5.3,5.4,5.5,5.6,5.7,5.8,5.9,6,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9,7,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6,7.7,7.8,7.9,8,8.1,8.2,8.3,84,8.5,8.6,8.7,8.8,8.9,9,9.1,9.2,9.3,9.4,9.5,9.6,9.7,9.8,9.9,或10cm、或者其中可推导出的任何范围或值的电极间隙尺寸。阴极和阳极电极可以在电穿孔室的相对内侧上间隔开,使得电穿孔室包含至多或至少约0.001em至10em、0.001cm至1cm、0.01cm至10cm、0.01cm至1cm、0.1cm至10cm、0.1cm至1cm、1cm至10cm、或者0.001cm至10cm的任何值或其中可推导出的范围的电极间隙尺寸。在一些方面中,图5示出了电穿孔室108,该电穿孔室由相对铝电极总线120形成,该相对铝电极总线120位于电穿孔室108周围并包围室108内的衬垫130;电极间隙包含衬垫130的厚度,该衬垫的厚度与衬垫130在相对电极总线120之间延伸的一侧对应。在一些方面中,其中电穿孔室108是由电极总线120和与相对电极总线120相对定位的金涂覆的塑料膜128形成的,使得金涂覆的塑料膜128插入相对电极总线120之间,包含电极间隙的衬垫的厚度与衬垫130在电极总线120和与相对电极总线120相对定位的金涂覆的塑料膜128之间延伸的一侧对应。在一些方面中,电穿孔室包含这样的电极间隙,其可以为、为至少、或为至多0.001,0.010,0.020,0.030,0.040,0.050,0.060,0.070,0.080,0.090,0.100,0.110,0.120,0.130,0.140,0.150,0.160,0.170,0.180,0.190,0.200,0.210,0.220,0.230,0.240,0.250,0.260,0.270,0.280,0.290,0.300,0.310,0.320,0.330,0.340,0.350,0.360,0.370,0.380,0.390,0.400,0.410,0.420,0.430,0.440,0.450,0.460,0.470,0.480,0.490,0.500,0.510,0.520,0.530,0.540,0.550,0.560,0.570,0.580,0.590,0.600,0.610,0.620,0.630,0.640,0.650,0.660,0.670,0.680,0.690,0.700,0.710,0.720,0.730,0.740,0.750,0.760,0.770,0.780,0.790,0.800,0.810,0.820,0.830,0.840,0.850,0.860,0.870,0.880,0.890,0.900,0.910,0.920,0.930,0.940,0.950,0.960,0.970,0.980,0.990,1.0,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2,2.1.2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9,4,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9,5,5.1,5.2,5.3,5.4,5.5,5.6,5.7,5.8,5.9,6,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9,7,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6,7.7,7.8,7.9,8,8.1,8.2,8.3,8.4,8.5,8.6,8.7,8.8,8.9,9,9.1,9.2,9.3,9.4,9.5,9.6,9.7,9.8,9.9,或10cm或者其中可推导出的任何范围或值。在一些方面中,电穿孔室包含0.001cm至10cm、0.001cm至1cm、0.01cm至10cm、0.01cm至1cm、0.1cm至10cm、0.1cm至1cm、1cm至10cm、或者0.001cm至10cm的任何值或其中可推导出的范围的电极间隙。在一些方面中,电穿孔室包含0.01cm至1cm、0.01cm至1cm的任何值、或其中可推导出的任何范围的电极间隙。在一些方面中,电穿孔室包含0.4cm至1cm、0.4cm至1cm的任何值、或其中可推导出的任何范围的电极间隙。所述阳极和阴极中的每对可以根据室尺寸以加载电阻(以欧姆计)进行通电。
2.电脉冲特征
脉冲持续时间或脉冲长度是样品暴露于电脉冲的持续时间,并且通常测量为微秒至毫秒范围的时间。脉冲长度与场强间接作用,以提高孔形成并且因此提高靶分子的摄取。一般而言,电压的提高随后应是脉冲长度的逐渐降低。降低电压,反之亦然。
本文中所述的样品所经受的第一电脉冲和第二电脉冲的第一脉冲持续时间和第二脉冲持续时间可以是约、可以是至少约、或可以是至多约10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒,或者其中可推导出的任何范围或值。本文中所述的样品所经受的第一电脉冲和第二电脉冲的第一脉冲持续时间和第二脉冲持续时间可以是至多约或至少约10-6秒至10秒、10-6秒至1秒、10-3秒至10秒、10-3秒钟至1秒,或者其中可推导出的任何范围或值。在一些方面中,第一电脉冲和第二电脉冲的第一脉冲持续时间和第二脉冲持续时间为10-6秒至10秒、10-6秒至1秒、10-3秒至10秒、10-3秒至1秒,或者10-6秒至10秒的任何值或其中可推导出的范围。在一些方面中,第一电脉冲和第二电脉冲的第一脉冲持续时间和第二脉冲持续时间为1微秒至100毫秒、1微秒至100毫秒的任何值、或其中可推导出的任何范围。在一些方面中,第一电脉冲和第二电脉冲的第一脉冲持续时间和第二脉冲持续时间为6微秒至65毫秒、6微秒至65毫秒的任何值、或其中可推导出的任何范围。
除了脉冲持续时间之外,电脉冲的特征还可以在于脉冲数、脉冲宽度、脉冲形状、脉冲模式和脉冲极性。因此,在一些方面中,第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、脉冲宽度、脉冲形状、脉冲模式或脉冲极性相关的特征。
电穿孔可以作为如本文中所公开的单脉冲或多脉冲进行,以实现最大转染效率。在一些方面中,脉冲数可以为、为至少、或为至多1,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200,210,220,230,240,250,260,270,280,290,300,310,320,330,340,350,360,370,380,390,400,410,420,430,440,450,460,470,480,490,500,510,520,530,540,550,560,570,580,590,600,610,620,630,640,650,660,670,680,690,700,710,720,730,740,750,760,770,780,790,800,810,820,830,840,850,860,870,880,890,900,910,920,930,940,950,960,970,980,990,或1000个脉冲,或其中可推导出的任何范围。在一些方面中,脉冲数可以是至多或至少1个脉冲至1000个脉冲、1个脉冲至900个脉冲、1个脉冲至800个脉冲、1个脉冲至700个脉冲、1个脉冲至600个脉冲、1个脉冲至500个脉冲、1个脉冲至400个脉冲、1个脉冲至300个脉冲、1个脉冲至200个脉冲、1个脉冲至100个脉冲、1个脉冲至90个脉冲、1个脉冲至80个脉冲、1个脉冲至70个脉冲、1个脉冲至60个脉冲、1个脉冲至50个脉冲、1个脉冲至40个脉冲、1个脉冲至30个脉冲、1个脉冲至20个脉冲、1个脉冲至10个脉冲,或者1个脉冲至1000个脉冲的任何值或其中可推导出的范围。在一些方面中,脉冲数为1个脉冲至1000个脉冲、1个脉冲至900个脉冲、1个脉冲至800个脉冲、1个脉冲至700个脉冲、1个脉冲至600个脉冲、1个脉冲至500个脉冲、1个脉冲至400个脉冲、1个脉冲至300个脉冲、1个脉冲至200个脉冲、1个脉冲至100个脉冲、1个脉冲至90个脉冲、1个脉冲至80个脉冲、1个脉冲至70个脉冲、1个脉冲至60个脉冲、1个脉冲至50个脉冲、1个脉冲至40个脉冲、1个脉冲至30个脉冲、1个脉冲至20个脉冲、或1个脉冲至10个脉冲、或者1个脉冲至1000个脉冲的任何值或其中可推导出的范围。在一些方面中,脉冲数是1至130个脉冲、1至130个脉冲的任何值、或其中可推导出的任何范围。
脉冲宽度取决于电穿孔系统的脉冲发生器所产生的波形。脉冲形状或波形通常落入两个类别:方波或指数衰减波。方波脉冲快速上升至设定电压等级并在设定脉冲长度的持续时间期间维持该等级,然后快速关闭。在一些方面中,脉冲发生器产生方波脉冲,并且脉冲宽度可以直接输入。指数衰减波通过允许电容器完全放电而产生电脉冲。脉冲被放电到样品中,并且电压迅速上升至设定峰值电压,然后随时间下降。在一些方面中,脉冲发生器产生指数衰减波脉冲,并且脉冲宽度是指数衰减率的函数。
指数衰减波系统中的脉冲宽度与时间常数对应,并且其特征在于脉冲能量或电压衰减至原始设定电压的1/3的速率。通过调整指数衰减中的电阻和电容值来修改时间常数,并且时间的计算为T=RC,其中T是时间并且R是样品的电阻并且C是电穿孔系统电源的电容。因此,在一些方面中,指数衰减率是样品的电阻和用于实现电穿孔的电源的电容的函数。
样品的电阻可以是、可以是至少或可以是至多
1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80.81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200,210,220,230,240,250,260,270,280,290,300,310,320,330,340,350,360,370,380,390,400,410,420,430,440,450,460,470,480,490,500,510,520,530,540,550,560,570,580,590,600,610,620,630,640,650,660,670,680,690,700,710,720,730,740,750,760,770,780,790,800,810,820,830,840,850,860,870,880,890,900,910,920,930,940,950,960,970,980,990,1000,1100,1200,1300,1400,1500,1600,1700,1800,1900,2000,2100,2200,2300,2400,2500,2600,2700,2800,2900,3000,3100,3200,3300,3400,3500,3600,3700,3800,3900,4000,4100,4200,4300,4400,4500,4600,4700,4800,4900,5000,5100,5200,5300,5400,5500,5600,5700,5800,5900v6000,6100,6200,6300,6400,6500,6600,6700,6800,6900,7000,7100,7200,7300,7400,7500,7600,7700,7800,7900,8000,8100,8200,8300,8400,8500,8600,8700,8800,8900,9000,9100,9200,9300,9400,9500,9600,9700,9800,9900,或10000欧姆,或者其中可推导出的任何范围或值。样品的电阻可以是至多或至少1欧姆至10000欧姆、1欧姆至9000欧姆、1欧姆至8000欧姆、1欧姆至7000欧姆、1欧姆至6000欧姆、1欧姆至5000欧姆、1欧姆至4000欧姆、1欧姆至3000欧姆、1欧姆至2000欧姆、1欧姆至1000欧姆、1欧姆至900欧姆、1欧姆至800欧姆、1欧姆至700欧姆、1欧姆至600欧姆、1欧姆至500欧姆、1欧姆至400欧姆、1欧姆至300欧姆、1欧姆至200欧姆、1欧姆至100欧姆、1欧姆至90欧姆、1欧姆至80欧姆、1欧姆至70欧姆、1欧姆至60欧姆、1欧姆至50欧姆、1欧姆至40欧姆、1欧姆至30欧姆、1欧姆至20欧姆、1欧姆至10欧姆、或者1欧姆至10000欧姆的任何值或其中可推导出的范围。在一些方面中,样品的电阻为1欧姆至10000欧姆、1欧姆至9000欧姆、1欧姆至8000欧姆、1欧姆至7000欧姆、1欧姆至6000欧姆、1欧姆至5000欧姆、1欧姆至4000欧姆、1欧姆至3000欧姆、1欧姆至2000欧姆、1欧姆至1000欧姆、1欧姆至900欧姆、1欧姆至800欧姆、1欧姆至700欧姆、1欧姆至600欧姆、1欧姆至500欧姆、1欧姆至400欧姆、1欧姆至300欧姆、1欧姆至200欧姆、1欧姆至100欧姆、1欧姆至90欧姆、1欧姆至80欧姆、1欧姆至70欧姆、1欧姆至60欧姆、1欧姆至50欧姆、1欧姆至40欧姆、1欧姆至30欧姆、1欧姆至20欧姆、1欧姆至10欧姆、或者1欧姆至10000欧姆的任何值或其中可推导出的范围。在一些方面中,样品的电阻是1欧姆至1000欧姆、1欧姆至1000欧姆的任何值、或其中可推导出的任何范围。
电源电容可以是、可以是至少、或可以是至多1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88.89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200,210,220,230,240,250,260,270,280,290,300,310,320,330,340,350,360,370,380,390,400,410,420,430,440,450,460,470,480,490,500,510,520,530,540,550,560,570,580,590,600,610,620,630,640,650,660,670,680,690,700,710,720,730,740,750,760,770,780,790,800,810,820,830,840,850,860,870,880,890,900,910,920,930,940,950,960,970,980,990,1000,1100,1200,1300,1400,1500,1600,1700,1800,1900,2000,2100,2200,2300,2400,2500,2600,2700,2800,2900,3000,3100,3200,3300,3400,3500,3600,3700,3800,3900,4000,4100,4200,4300,4400,4500,4600,4700,4800,4900,5000,5100,5200,5300,5400,5500,5600,5700,5800,5900,6000,6100,6200,6300,6400,6500,6600,6700,6800,6900,7000,7100,7200,7300,7400,7500,7600,7700,7800,7900,8000,8100,8200,8300,8400,8500,8600,8700,8800,8900,9000,9100,9200,9300,9400,9500,9600,9700,9800,9900,10000,11000,12000,13000,14000,15000,16000,17000,18000,19000,20000,21000,22000,23000,24000,25000,26000,27000,28000,29000,30000,31000,32000,33000,34000,35000,36000,37000,38000,39000,40000,41000,42000,43000,44000,45000,46000,47000,48000,49000,50000,51000,52000,53000,54000,55000,56000,57000,58000,59000,60000,61000,62000,63000,64000,65000,66000,67000,68000,69000,70000,71000,72000,73000,74000,75000,76000,77000,78000,79000,80000,81000,82000,83000,84000,85000,86000,87000,88000,89000,90000,91000,92000,93000,94000,95000,96000,97000,98000,99000,100000,110000,120000,130000,140000,150000,160000,170000,180000,190000,200000,210000,220000,230000,240000,250000,260000,270000,280000,290000,300000,310000,320000,330000,340000,350000,360000,370000,380000,390000,400000,410000,420000,430000,440000,450000,460000,470000,480000,490000,500000,510000,520000,530000,540000,550000,560000,570000,580000,590000,600000,610000,620000,630000,640000,650000,660000,670000,680000,690000,700000,710000,720000,730000,740000,750000,760000,770000,780000,790000,800000,810000,820000,830000,840000,850000,860000,870000,880000,890000,900000,910000,920000,930000,940000,950000,960000,970000,980000,990000,或1000000μF,或者其中可推导出的任何范围或值。电源电容可以是至多或至少1μF至1,000,000μF、1μF至100,000μF、1μF至10,000μF、1μF至1,000μF、1μF至100μF、或者1μF至1,000,000μF的任何值或其中可推导出的范围。在一些方面中,电源电容为1μF至1,000,000μF、1μF至100,000μF、1μF至10,000μF、1μF至1,000μF、1μF至100μF、或者1μF至1,000,000μF的任何值或其中可推导出的范围。在一些方面中,电源电容为1000μF至5000μF、1000μF至5000μF的任何值、或其中可推导出的任何范围。
在一些方面中,脉冲模式包括与第一和/或第二脉冲的持续时间对应的单脉冲。在一些方面中,脉冲模式包括多脉冲,并且多脉冲的组合持续时间与第一和/或第二脉冲的持续时间对应。因此,在一些方面中,脉冲持续时间是多脉冲的累加作用的结果。
本文中所述的样品可经受的第一和第二电脉冲的极性可以是正的或负的。在一些方面中,第一脉冲和第二脉冲的极性是正的。在一些方面中,第一脉冲和第二脉冲的极性是负的。在一些方面中,第一脉冲的极性是正的,并且第二脉冲的极性是负的。在一些方面中,第一脉冲的极性是负的,并且第二脉冲的极性是正的。
在某些方面中,可如以下中所述进行电加载:美国专利No.5,612,207(特别地通过引用并入本文)、美国专利No.5,720,921(特别地通过引用并入本文)、美国专利No.6,074,605(特别地通过引用并入本文);美国专利No.6,090,617(特别地通过引用并入本文);美国专利No.6,485,961(特别地通过引用并入本文);美国专利No.7,029,916(特别地通过引用并入本文)、美国专利No.7,141,425(特别地通过引用并入本文)、美国专利No.7,186,559(特别地通过引用并入本文)、美国专利No.7,771,984(特别地通过引用并入本文)和/或美国公开No.2011/0065171(特别地通过引用并入本文)。
可用于本公开内容的背景中的其他电加载方法和装置还在以下中描述:例如,已公开的PCT申请No.WO 03/018751和WO 2004/031353;美国专利申请序列No.2004/0214333和2004/0115784;以及美国专利No.6,773,669、6,090,617、6,617,154和7,029,916,其所有都通过引用并入本文。
在本公开内容的某些方面中,可如于2006年11月28日授予的美国专利No.7,141,425中所述的进行电穿孔,其全部公开内容特别地通过引用并入本文。
II.代表性电穿孔设备的描述
如图48中所示,本公开内容的一些方面还可以包括电穿孔系统300,该电穿孔系统包含装置(例如,控制器800)和包含(例如,存储)指令的非暂态计算机可读介质(例如,一个或更多个装置804),该指令当由处理器808执行时引起处理器808执行本文中所述的任何方法。
控制器800可以物理地或无线地与电穿孔系统300的其他组件中的一个或更多个耦合,并且可以被配置成通过一个或更多个用户发起的或自动的命令或参数来控制电穿孔系统300的操作。控制器800可以包含处理器808(例如,微控制器/微处理器、中央处理单元(central processing unit,CPU)、现场可编程门阵列(field-programmable gate array,FPGA)装置、专用集成电路(application-specific integrated circuit,ASIC)、另外的硬件装置、固件装置、或其任意组合)和被配置成(并且确实)存储指令、一个或更多个数据集等的非暂态计算机可读介质(例如存储器)804。非暂态计算机可读介质可以包括任何有形或非暂态存储介质(storage media)或存储介质(memory media),例如电子、磁性、或光学介质。本文中使用的术语“有形”和“非暂态”旨在描述不包括传播电磁信号的非暂态计算机可读介质(例如存储器),但不旨在以其他方式限制由短语非暂态计算机可读介质或存储器所涵盖的物理计算机可读存储装置的类型。例如,术语“非暂态计算机可读介质”或“有形存储器”旨在涵盖不一定永久存储信息的存储装置的类型,包括例如随机存取存储器(randomaccess memory,RAM)。以非暂态形式存储在有形计算机可访问存储介质上的程序指令和数据还可以通过传输介质或信号(例如,电信号、电磁信号或数字信号)来传输,所述介质或信号可以通过通信介质(例如,网络和/或无线链路)来传送。
存储器的指令可以由处理器808执行,以进行或发起如本文中所述的一个或更多个操作或功能。在一些方面中,控制器800可以包含一个或更多个界面、一个或更多个I/0装置、电源、一个或更多个传感器、信号发生器(例如,RF发生器)、或其组合。例如,控制器800可以包含这样的I/O装置,所述I/O装置允许用户输入信息(例如,期望的方案)以控制电穿孔系统300的操作。
现在参考图49,示出了用于使样品经受两个或更多个电脉冲的本方法的方面900,其可以使用图48中所示的电穿孔系统300来实施。在所示的方面中,在步骤904下,电穿孔系统300的非暂态计算机可读介质804包含这样的指令,所述指令当由处理器808执行时引起处理器808选择与具有第一场强和第一脉冲持续时间的第一电脉冲相关的第一方案。在步骤908下,在该方面中,根据第一方案,控制器800控制电穿孔系统300以产生由第一方案限定的第一电脉冲的电流,并将其发送穿过包含一个或更多个完整细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品,所述第一电脉冲足以使细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有药剂。任选地,在步骤908之后,允许样品在培养物中恢复至少、至多、或约6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114或120小时,或者其中可推导出的任何范围或值。在一些方面中,在步骤908之后,允许样品在培养物中恢复至多或至少6小时至120小时、6小时至96小时、6小时至72小时、6小时至48小时、6小时至24小时、6小时至12小时、或者其中可推导出的任何范围或值。在步骤912下,在该方面中,电穿孔系统300的非暂态计算机可读介质804包含这样的指令,所述指令当由处理器808执行时引起处理器808选择与具有第二场强和第二脉冲持续时间的第二电脉冲相关的第二方案。在步骤916下,在该方面中,控制器800控制电穿孔系统300以产生由第二方案限定的第二电脉冲的电流,并将其发送穿过包含一个或更多个完整细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品。第一场强和/或第一脉冲持续时间与第二场强和/或第二脉冲持续时间不同,并且根据第二方案使包含一个或更多个完整细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲足以使细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有药剂。
在一些方面中,电穿孔系统300可以由控制器800控制以产生电流并将其发送穿过细胞溶液。在一些方面中,本方法使用静态电穿孔设备。在一些方面中,本方法使用流式电穿孔设备,其可由控制器800控制以产生用于电刺激细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体、组织、或其衍生物的悬液的电流,该流式电穿孔设备具有:一个或更多个入口流体端口;一个或更多个出口流体端口;和一个或更多个流动通道,该流动通道包含两个或更多个壁,其中流动通道还被配置成接收并短暂容纳来自入口流体端口的在悬液中的颗粒的连续流体;和相对于流动通道设置的使得每个电极形成流动通道的至少一个壁的成对电极,该电极还包含将电极放置成与电能来源电连通,从而流动通过通道的悬液可经受在电极之间形成的电场。
在一些方面中,使用MaxCyteMaxCyte/>或MaxCyte/>流式电穿孔仪器进行流式电穿孔。在一些方面中,使用MaxCyte ExPERT/>MaxCyte ExPERTMaxCyte ExPERT/>或MaxCyte ExPERT VLxTM进行流式电穿孔。在一些具体方面中,使用具有整个本公开内容中所述的参数的静态电穿孔或流式电穿孔。
在一些方面中,流式电穿孔的使用可以帮助克服关于伴随静态电穿孔或分批电穿孔方法的可以电穿孔的细胞的数目、可以电穿孔细胞的时间、以及细胞悬浮在其中的溶液的体积的实际限制。使用该方法,使细胞悬液穿过包含在可以是一次性的流动池中的平行棒状电极。应当理解,在本公开内容中可使用不同配置的流动池。在该过程期间,使细胞经受具有预定特征的电脉冲。目的分子随后随着浓度梯度和/或电梯度扩散到细胞中。另外,可以通过将样品电穿孔小于5小时、优选小于4小时、更优选小于3小时、并且最优选小于2小时来转染淋巴细胞群。电穿孔的时间是通过流式电穿孔过程来处理样品的时间。在某些方面中,使用流式电穿孔在30分钟或更短时间内转染1E10个细胞。在另一些方面中,可使用流式电穿孔在30分钟或者60分钟或更短时间内转染2E11个细胞。
流式电穿孔过程可以通过例如放置与容器中的溶液和细胞悬液流体连通(例如,通过管)的电穿孔室来启动,这可在无菌或灭菌环境中进行。可使用以下来将细胞悬液和/或其他试剂引入电穿孔室:一个或更多个泵、真空器、阀、其他改变电穿孔室内的空气压力或体积的机械装置、及其组合,其可以导致细胞悬液和/或其他试剂以期望的时间和期望的速率流入电穿孔室中。如果细胞悬液和/或其他试剂的一部分位于电穿孔室中,则向细胞悬液和/或其他试剂施加期望电压、持续时间和/或间隔的电脉冲。在电穿孔之后,可以使用一个或更多个泵,真空器,阀,其他改变电穿孔室内的位移(displacement)、压力或体积的电、机械、气动或微流控装置,及其组合从电穿孔室移出经处理的细胞悬液和/或其他试剂。在某些方面中,可使用重力或手动转移来将样品或经处理的样品移入或移出电穿孔室。如果期望的话,可将新的细胞悬液和/或其他试剂引入到电穿孔室中。经电穿孔的样品可以与尚未经电穿孔的样品分开收集。前述的一系列事件可以暂时通过与例如电子电路(例如,提供电脉冲的)、泵、真空器、阀、其组合、以及影响和控制样品流入和流出电穿孔室的其他组件耦合的计算机来协调。作为一个实例,电穿孔过程可以通过计算机,包括由操作者通过屏幕(例如监视器)上的图形用户界面和/或键盘来实施。合适的阀的一些实例包括夹管阀、蝶阀和/或球阀。合适的泵的一些实例包括离心泵或正位移泵。
作为一个实例,流式电穿孔装置可包含由间隔物(spacer)隔开的至少两个电极,其中间隔物和至少两个电极限定了室。在一些方面中,电穿孔室还可包含至少三个穿过间隔物的端口,其中第一端口用于样品流入室中,第二端口用于经处理样品流出室,并且第三端口用于非样品流体流入或流出室。在一些方面中,当样品流入室中时,非样品流体流出室,并且当经处理样品流出室时,非样品流体流入室中。作为另一个实例,流式电穿孔装置可包含具有包含至少两个平行电极的顶部部分和底部部分的电穿孔室,该室在两个电极之间形成并且具有在电穿孔室底部部分中的两个室端口以及在电穿孔室顶部部分中的两个室端口。这样的装置还可以包含至少一个通过室底部部分中的第一室端口与电穿孔室流体连通的样品容器、以及可以通过室顶部部分中的第二室端口与样品容器流体连通的电穿孔室,从而形成第一流体路径。此外,至少一个产物容器可以通过室底部部分中的第三室端口与电穿孔室流体连通,并且电穿孔室可以通过室顶部部分中的第四室端口与产物容器流体连通,从而形成第二流体路径。在一些方面中,可使用单端口电穿孔室。在另一些方面中,可以使用电极、间隔物、端口和容器的多种其他合适的组合。电穿孔室可以包含约1至10mL的内部体积;然而,在另一些方面中,电穿孔室可以包含较小的内部体积(例如,0.75mL、0.5mL、0.25mL或更小)或较大的内部体积(例如,15mL、20mL、25mL或更大)。在一些方面中,电穿孔室及相关组件可以是一次性的(例如,医用级VI类材料),例如PVC袋、PVC管、连接器、有机硅泵管等。
可以将任何数目的容器(例如,1、2、3、4、5、6或更多个)与电穿孔室流体连通。容器可以是可收缩(collapsible)、可膨胀或固定体积的容器。例如,第一容器(例如,样品源或样品容器)可以包含细胞悬液,并且可包含或可不包含在电穿孔期间将进入到在细胞悬液中的细胞中的物质。如果不包含该物质,则可以包含含有该物质的第二容器,使得在进入到电穿孔室中之前在线(inline)混合该物质或在电穿孔室中混合该物质。在一个另外的配置中,可以连接另一容器,其可保留将丢弃的流体。可使用一个或更多个另外的容器作为经处理的样品或产物的容器。经处理的样品或产物的容器将保留由电穿孔过程产生的细胞或其他产物。此外,一个或更多个另外的容器可以包含可用于将样品分隔成离散体积或单位体积的多种非样品流体或气体。非样品流体或气体容器可以通过第三端口和/或第四端口与电穿孔室流体连通。可以将非样品流体或气体容器并入到经处理样品容器或样品容器中(例如,非样品流体容器可以包含经处理样品容器或样品容器的一部分);并且因此,在处理样品期间,非样品流体或气体可以从经处理样品容器转移到另一容器(其可包含样品容器)。可将非样品流体或气体容器并入到室中,只要非样品流体或气体的压缩不影响电穿孔即可。本公开内容的另外的方面可包括与样品容器耦合并且可向室供应试剂或其他样品的其他容器。
在一个方面中,可与本公开内容结合使用的流式电穿孔设备包含以下:电穿孔系统,该系统具有与电子模块通信以实时运行电穿孔过程并管理电穿孔过程相关数据的计算机、以及显示图形用户界面并能够实现用户交互的监视器(例如,其可以是移动装置或设计成在书桌(desk)、桌子(table)、推车(cart)等上使用的装置的一部分)。操作者将期望的电压和其他参数输入到流式电穿孔系统中。如上所述,一系列设置是任选地可用的。计算机与电子模块通信以将电容器组充电到期望的电压。然后,在将电压递送至流体路径以产生电场之前适当开关操纵电压。开关提供交替的脉冲(pulse)或脉冲(burst)以使由延长的在电场的暴露引起的电极损耗最小化。根据由操作员设置到流式电穿孔系统中的持续时间和频率参数来递送电压。流式电穿孔系统的一个实例的细节在美国专利No.7,186,559中描述,其通过引用整体并入本文。
本电穿孔系统和方法还可以包含处理组件、托盘、衬垫、对接站、支架和容器,其用于递送至电穿孔系统。
图1至10示出了与本公开内容的一些方面一致的处理组件100。处理组件100可以被提供用于电穿孔系统和装置。处理组件100可以包含壳体(housing)102和覆盖至室108的开口106的盖104。在一些方面中,室108可以接收样品、培养物、液体介质等,所述样品、培养物、液体介质可提供至可以与处理组件100相容的电穿孔系统或装置。
盖104可以具有与壳体102的铰链连接110,该铰链连接110允许盖104在其中盖覆盖开口106并与壳体102连接的闭合位置(图1)与其中盖经铰链远离开口106并允许开口106暴露的打开位置(图2)之间移动。盖104的铰链连接110可以提供处理组件100的经改进的操作性和易用性。在闭合位置,盖104可以阻止处理组件100污染。在一些方面中,盖104可以围绕铰链连接110旋转高至180°,并且可以与壳体102连接。在一些方面中,盖104可以通过过盈配合与壳体102连接,其中盖104夹在壳体102上。例如,过盈配合可以在闭合位置在连接109处和在打开位置在连接111处将盖104与壳体102连接。当盖104闭合时,过盈配合可以维持室108内的孔中的紧密密封。盖104还可以包含轮廓表面112,其可以与开口106连接并覆盖开口106并且维持未受污染的密封。
处理组件100还可以包含铝电极总线120,所述铝电极总线位于室108周围并且可以围绕室108内的衬垫(例如衬垫130)。壳体102可以包含彼此连接以形成壳体102的左柄122和右柄124。左柄122和右柄124可以由销125间隔开,销125可以彼此相对定位并且可以连接左柄122与右柄124。在一些方面中,电极总线120可以缠绕在右柄124周围。在另一些方面中,电极总线120可以位于与金涂覆的塑料膜128相对的室108一侧上。
处理组件100还可以包含金涂覆的塑料膜128,所述金涂覆的塑料膜可被接收在左柄122与右柄124之间并且位于与电极总线120和框架衬垫130的对面。金涂覆的塑料膜128可将金真空沉积在大卷塑料膜(large rolls of plastic film)上,其可以按尺寸模切并安装在处理组件100上。在一些方面中,金涂覆的膜128、铝电极总线120和黏合层辊(adhesive layer roll)可以连接。
处理组件100可以包含衬垫130和塑料间隔物,其可以被接收在室108中。衬垫130可以采用如以下更详细描述的数种形状和尺寸中的至少一种。例如,衬垫130可被定尺寸以接收多种尺寸的样品,包括定尺寸为1000μL、400μL、100μL、100μL×2、50μL×3、和25μL×3变体等的样品。在一些方面中,衬垫130可以由硅橡胶或其他柔性材料制成。处理组件100可以被配置成与本文中所述的衬垫尺寸和布置中的任何一种一起使用,使得处理组件100可用于任何数目的定尺寸的衬垫130。
处理组件100还可以包含围绕远离电极总线120的外壳102延伸的装置标签140。在一些方面中,装置标签140可以包含唯一的产品序列号、尺寸、说明、标识等。一些方面还可以在处理组件100的末端上提供书写空间141。
处理组件可以提供数个优点,包括室108和衬垫130内的样品的体积范围的提高、易用性的改善、以及细胞恢复和一致性能的改善。在一些方面中,金涂覆的塑料膜128可使用多种衬垫来提供制造成本的降低并且可以允许反应体积为25至1000μL,例如25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975或1000μL,或者其中可推导出的任何范围或值。
图9和图10示出了处理组件100可以被配置成经由加载装置144填充,所述加载装置144可以在盖104处于打开位置的情况下通过开口106插入到室108中。加载装置144可以用样品填充室108,用于在电穿孔系统中进行测试或处理。在加载装置144将样品提供至室108之后,加载装置144可以被移出并且盖104可以闭合以阻止样品的污染。
图11至13示出了本公开内容的还可以提供一个或更多个托盘160的一些方面。托盘160可以在托盘106中间隔开的槽162中接收一个或更多个处理组件(例如,处理组件100或其他处理组件)。在一些方面中,托盘160的形状可以是矩形的,并且每个槽160可以平行于其他槽160布置。在另一些方面中,托盘160可以是弯曲的、圆形的或半圆形的,并且可以具有围绕托盘160以径向模式布置的槽160。
托盘160可以包含用于接收处理组件的一个或更多个位置。在一些方面中,托盘可以包含一个或更多个位置164,使得第一位置和第二位置可以允许用户区分放置在托盘160中的处理组件的状态(例如,在样品类型之间区分完成的vs.未完成的、经测试的vs.未经测试的)。托盘160可以具有腿166,其可以允许一个或更多个托盘160堆叠在彼此的顶部上,同时为已加载到托盘中的处理组件提供间隙。托盘160可以提供处理组件的运输性和组织的改善,并且可以允许同时对处理组件阵列进行灭菌。
图14示出了可以作为上述处理组件100内的衬垫130应用的多个衬垫。衬垫130可被定尺寸以接收多种尺寸的样品,包括定尺寸为4×50μL、3×25μL、2×100μL、100μL、400μL和1mL等的样品。在一些方面中,400μL和1mL尺寸的衬垫可以具有倾斜的底部表面,其可以提供改善的样品加载和卸载。
在一些方面中,衬垫可以提供其中设计单孔/多孔选择以优化工作流程的灵活性。衬垫还可以通过在单个平台上在小规模与大规模之间无缝移动来提供可扩展性。衬垫还可以提供改善的功能,其中功能性设计阻止样品的污染同时提供易用性。
图15示出了与本公开内容的一些方面一致的衬垫阵列的俯视图和衬垫的前视图,其中每个衬垫具有八个孔。
图16示出了与本公开内容的一些方面一致的袋和处理设备的前视图。处理设备可以具有用于细胞检索的V形设计。另外,处理组件可以包含5至10mL的袋,例如,5、6、7、8、9或10mL或者其中可推导出的任何范围或值的袋,以桥接间隙。
图17示出了具有八个孔172的衬垫170,其可被定尺寸以用于每个孔172中有50μL的样品。衬垫170可以被配置成被多孔处理组件200接收或插入到多孔处理组件200中。图18至20示出了可以被配置成允许通过电穿孔系统处理多个加载孔(例如孔172)的多孔处理组件200。
多孔处理组件200可以包含具有盖204的壳体202,盖204沿壳体的长度延伸并且覆盖至室208的开口206。在一些方面中,室108可以接收样品、培养物、液体介质等,所述样品、培养物、液体介质可被提供至可与处理组件200相容的电穿孔系统或装置。
盖204可以具有与壳体202一侧的铰链连接210,该铰链连接210允许盖204在其中盖覆盖开口206并与壳体202连接的闭合位置(图18)与其中盖经铰链远离开口206并允许开口206暴露的打开位置(图19)之间移动。在闭合位置,盖204可以阻止处理组件200污染。在一些方面中,盖204可以通过过盈配合与壳体202连接,其中盖204夹在壳体202上。在一些方面中,盖204可以是可从壳体202移出的。在一些方面中,处理组件200可以具有允许壳体202自身站立的基座205,其可以在加载期间提供易用性、加载性和稳定性。
处理组件200还可以包含铝电极总线220,所述铝电极总线位于室208周围并且可以围绕室208内的衬垫(例如衬垫170)。壳体202可以包含彼此连接以形成壳体202的左柄222和右柄224(例如,图20)。左柄222和右柄224可以由销225间隔开,销225可以彼此相对定位并且可以连接左柄222与右柄224。在一些方面中,电极总线220可以缠绕在右柄224周围。在另一些方面中,电极总线220可以位于与金涂覆的塑料膜228相对的室208一侧上。
处理组件200还可以包含金涂覆的塑料膜228,所述金涂覆的塑料膜可被接收在左柄122与右柄124之间并且位于与电极总线120和框架衬垫130的对面。金涂覆的塑料膜128可将金真空沉积在大卷塑料膜上,其可以按尺寸模切并安装在处理组件100上。在一些方面中,金涂覆的膜128、铝电极总线120和黏合层辊可以连接。在一些方面中,金涂覆的塑料膜228可以具有以与衬垫170的形状成镜像或按照衬垫170的形状的形状布置的金涂层。
处理组件200可以包含衬垫170和塑料间隔物,其可以被接收在室208中。衬垫170可以采用数种形状中的至少一种。例如衬垫170可以具有八个孔172,其被定尺寸以用于每个孔172中有50μL的样品。在一些方面中,衬垫170可以由硅橡胶或其他柔性材料制成。处理组件200可以被配置成与本文中所述的任何衬垫尺寸和布置一起使用,使得处理组件200可用于任何数目的定尺寸的衬垫170。
图21示出了配置成接收多个多孔处理组件200的托盘260。如图21和图22所示,多孔处理组件可以在没有盖的情况下加载到托盘260中。托盘260可以接收十二个处理组件200,并且每个处理组件可以包含八个孔(例如,孔172)。因此,每个托盘260可以包含九十六个孔。
图23示出了可以在手动工作流程中使用的配置成接收六个处理组件200的托盘261,以及可以包含盖或盖闭合件270的配置成接收十二个处理组件或十二个单独的衬垫样品的托盘262。
图24示出了可以接收多个处理组件200并且可以提供处理组件200的加载、卸载和组织的多孔支架280。
图25和26示出了具有盖或盖闭合件270的托盘260以及将处理组件200加载到托盘260中和从托盘260中卸载。
图27示出了所公开的一些方面可以与其相容的示例性电穿孔系统300。
图28至32示出了对接站320,其可以将处理组件(例如,处理组件200)与电穿孔系统(例如,电穿孔系统300)连接。对接站320可以包含盖322,其可以通过铰链连接与对接站320连接。盖322可以配置成在打开位置(图28和29)与闭合位置(图30)之间移动。对接站320可以具有端口324,其被配置成接收一个或更多个处理组件200。对接站320还可以具有电接触件326,其可以与电穿孔系统(例如电穿孔系统300)上的插座连接。
图33示出了多孔处理组件200、电穿孔系统300、对接站320、托盘260、加载装置144和支架280。
图34A至34C示出了用于流式电穿孔组件的袋的一些示例性方面。如图34A中所示,袋450可包含V形内部,其引流到可具有多个连接器453的出口452中。如图34B中所示,袋460可包含具有成角度的下表面462的较窄内室,下表面462之一可包含一个或更多个连接器464,并且袋460还可包含位于中央的出口466。如图34C所示,袋470可包含宽的上部室472和窄的下部室474,下部室474可包含在每个成角度的底部表面处的连接器476和位于中央的出口478。袋450、460、470可包含鲁尔(Luer)配件、鲁尔激活端口、管、管夹和标签(参见示意图)。袋可以用作样品袋、收集袋和空气袋。
III.电穿孔靶标
电穿孔的靶标包括来源于许多生物体和来源的许多细胞类型或颗粒。在一些方面中,靶标可以是有核或无核的细胞或颗粒。本公开内容的细胞或颗粒可以是原代细胞或细胞系或来源于其的颗粒。例如,靶标可以是原核细胞、酵母、昆虫、哺乳动物、啮齿动物、仓鼠、灵长类、人、鸟、植物细胞、或其部分/片段。在某些方面中,本公开内容涉及用于将目的药剂引入到多种类型的活细胞或细胞颗粒或合成囊泡或脂质体中的组合物、方法和设备。更特别地,本公开内容涉及用于将目的药剂引入到细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体、组织、或其衍生物中的方法和设备。这些电穿孔靶标可以用作药剂递送系统,以靶向感染、转移或其他病理性病变的部位。
A.细胞培养
本文中使用的术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用。所有这些术语还包括新鲜分离的细胞和离体培养、活化或扩增的细胞二者。所有这些术语还包括其后代,为任何和所有的后代。应理解的是由于有意或无意的突变,所有后代可不相同。在表达异源核酸序列的背景中,“宿主细胞”是指原核或真核细胞,并且其包括能够复制载体或表达载体编码的异源基因的任何可转化生物体。宿主细胞可以并已经用作载体或病毒的接受体。宿主细胞可以是“经转染的”或“经转化的”,这是指通过其将外源核酸(例如重组蛋白编码序列)转移或引入到宿主细胞中的过程。经转化的细胞包括原代对象细胞及其后代。
在某些方面中,电穿孔可以在任何原核或真核细胞上进行。在一些方面中,电穿孔涉及哺乳动物细胞的电穿孔。在一些方面中,哺乳动物细胞是人细胞。在另一些方面中,哺乳动物细胞是动物细胞,例如,鼠细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞或灵长类细胞。
在某些方面中,电穿孔涉及细胞系或杂交细胞类型的电穿孔。在一些方面中,电穿孔的一种或更多种细胞是癌细胞、肿瘤细胞或永生化细胞。在一些情况下,肿瘤、癌、永生化细胞或细胞系被诱导,并且在另一些情况下,肿瘤、癌、永生化细胞或细胞系天然地进入其各自的状态或状况。
在某些方面中,电穿孔的细胞或细胞系可以为697、10T1/2、1321N1、A549、AHR77、B细胞、B-LCL、B16、B65、Ba/F3、BHK、C2C12、C6、CaCo-2、CAP/、CAP-T、CaSki、ChaGo-K-1、CHO、CHO2、CHO-DG44、CHO-K1、COS、COS-1、Cos-7、CV-1、树突细胞、DG75、DLD-1、EL4、胚胎干(Embryonic Stem,ES)细胞或衍生物、H1299、HaCaT、HAP1、HCT116、HEK、293、293T、293FT、HeLa、Hep G2、HL60、造血干细胞、HOS、HT1080、HT29、Huh-7、HUVEC、诱导多能干(inducedpluripotent stem,iPS)细胞或衍生物、INS-1/GRINCH、Jurkat、K46、K562、KG1、KHYG-1、L5278Y、L6、LNCaP、LS180、MCF7、MDA-MB-231、MDCK、ME-180、间充质细胞、MG-63、Min-6、单核细胞、MOLT4、Nalm6、ND7/23、Neuro2a、NK92、NIH 3T3、NIH3T3L1、NS/0、NK-细胞、P3U1、Panc-1、PC12、PC-3、PER.C6、PM1、外周血细胞、浆细胞、原代成纤维细胞、Ramos、RAW 264.7、RBL、Renca、RLE、SF21、SF9、SH-SY5Y、SK-BR-3、SK-MES-1、SK-N-SH、SK-OV-3、SP3/0、SL3、SW403、刺激触发获得性多能(Stimulus-triggered Acquisition of Pluripotency,STAP)细胞或衍生物SW403、T细胞、THP-1、肿瘤细胞、U2OS、U205、U937、外周血淋巴细胞、经扩增T细胞、造血干细胞、YB2/0、Vero细胞、或其衍生物。
在一些方面中,细胞是脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、角质形成细胞、肌细胞、神经元、骨细胞、外周血淋巴细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、经扩增T细胞、脾细胞、干细胞、造血干细胞或胸腺细胞。在一些方面中,细胞是原代细胞。在一些方面中,细胞是经培养细胞。在一些方面中,细胞是经培养细胞系。在一些方面中,PBMC是外周血淋巴细胞(PBL)。在一些方面中,PBL是自然杀伤(NK)细胞、T细胞或B细胞。在一些方面中,PBMC是单核细胞。在一些方面中,单核细胞是巨噬细胞或树突细胞。在一些方面中,巨噬细胞是小胶质细胞。在一些方面中,干细胞是脂肪干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞或神经干细胞。上文公开的细胞中的一种或更多种在一些方面中被排除。
在一些方面中,细胞是从患者分离的原代细胞。在一些方面中,细胞是新鲜分离的。分离的细胞可以是同种异体细胞,并且可以从标准来源例如医院服务获得。供体可以使用病史和标准血液测试进行筛选。在一些方面中,在以下时间下转染细胞:小于或恰好20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1天、或20天至1天的任何值或其中可推导出的任何范围,或者小于或恰好24、22、20、18、16、14、12、10、8、6、4、2、1小时、或24至1小时的任何值或其中可推导出的任何范围。在一些方面中,分离的细胞从未被冷冻。在一些方面中,分离的细胞从未在体外传代或培养。在一些方面中,分离的细胞已经传代或培养少于或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次、或者其中可推导出的任何范围。术语“传代”旨在是指培养和分裂细胞以从预先存在的细胞产生大量细胞的过程。传代涉及分裂细胞并将少量细胞转移到每个用于培养的新的容器中。对于贴壁培养,首先需要分离细胞,通常用胰蛋白酶-EDTA的混合物进行。然后可以使用少量分离的细胞来接种新的培养物,而丢弃其余的。此外,通过将所有细胞分配到新鲜烧瓶中,可以容易地扩大培养细胞的量。
在某些方面中,细胞是本领域已知的难以转染的细胞。这样的细胞是本领域已知的并且包括例如原代细胞、昆虫细胞、SF9细胞、Jurkat细胞、CHO细胞、干细胞、缓慢分裂细胞和非分裂细胞。在一些方面中,细胞是生殖细胞,例如卵细胞或精细胞。在一些方面中,细胞是受精胚胎。在一些方面中,细胞是人受精胚胎。
在一些方面中,在顺序电穿孔过程期间和之后,细胞维持高的生存力。细胞生存力可以通过本领域已知的方法来测量。例如,可以通过细胞计数器设备在电穿孔之前和之后计数细胞。在另一些方面中,测量凋亡。认为大量核酸的引入可诱导凋亡。考虑了本文中所述的方法将导致比本领域其他方法更少的凋亡。在某些方面中,在顺序电穿孔之后表现出凋亡的细胞的量小于50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%。凋亡是指程序性细胞死亡的特定过程,并且可以通过本领域已知的方法来测量。例如,凋亡可通过膜联蛋白V测定、经活化的胱天蛋白酶3/7检测测定和凋亡测定(LifeTechnologies)来测量。
生存力常规地超过50%或更高。经顺序电穿孔细胞的生存力可以是起始的未经电穿孔群体或用对照构建体转染的经电穿孔群体的生存力的至多或至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%(或者5%至95%的值或其中可推导出的任何范围)。在一些方面中,在根据电穿孔方法施用第二电脉冲之后12至96小时细胞生存力可以是、可以是至少、或可以是至多50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或90%,所述电穿孔方法包括:根据第一方案,使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;以及根据第二方案,使样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间。在一些方面中,细胞生存力在第二电脉冲之后12至96小时为至少50%。在一些方面中,细胞生存力在第二电脉冲之后12至96小时为至少60%。在一些方面中,细胞生存力在第二电脉冲之后12至96小时为至少70%。在一些方面中,细胞生存力在第二电脉冲之后12至96小时为至少80%。在一些方面中,细胞生存力在第二电脉冲之后12至96小时为至少90%。
在一些方面中,经电穿孔的细胞在第二电脉冲之后12至96小时有约50%至90%有生存力。在一些方面中,经电穿孔的细胞在第二电脉冲之后12至72小时有约50%至90%有生存力。在一些方面中,经电穿孔的细胞在第二电脉冲之后12至48小时有约50%至90%有生存力。在一些方面中,经电穿孔的细胞在第二电脉冲之后24小时有约50%至90%有生存力。在一些方面中,经电穿孔的细胞在第二电脉冲之后12至96小时有约60%至90%有生存力。在一些方面中,经电穿孔的细胞在第二电脉冲之后12至72小时有约60%至90%有生存力。在一些方面中,经电穿孔的细胞在第二电脉冲之后12至48小时有约60%至90%有生存力。在一些方面中,经电穿孔的细胞在第二电脉冲之后24小时有约60%至90%有生存力。
在一些方面中,细胞可进行有限稀释法以使克隆的细胞群能够扩增。有限稀释克隆的方法是本领域技术人员公知的。这样的方法已经被描述例如用于杂交瘤细胞,但其可以应用于任何细胞。这样的方法在“Cloning hybridoma cells by limiting dilution,”Journal of Tissue Culture Methods,1985,第9卷,第3期,第175-177页,Joan C.Rener,Bruce L.Brown,and Roland M.Nardone中被描述,其通过引用并入本文。
在一些方面中,在电穿孔之前或在电穿孔之后培养细胞。在一些方面中,允许细胞在电穿孔之前或在电穿孔之后在培养物中恢复。本文中使用的“允许样品恢复”、“恢复样品”、或“在培养物中恢复”意指在条件例如本文中所公开的适合且足以促进细胞恢复或返回至改善或期望的状态或状况的条件下,在本文中所公开的细胞培养容器和细胞培养基中的任一者中培养细胞,包括但不限于样品的细胞。例如,在培养中恢复可以允许细胞从电穿孔的创伤中恢复例如修复细胞壁,并在细胞电穿孔之后开始表达或代谢已加载到细胞中的药剂。
在另一些方面中,在电穿孔之后的选择阶段期间培养细胞。在又一些方面中,在维持和克隆选择和初始扩增阶段期间培养细胞。在又一些方面中,在筛选阶段期间培养细胞。在另一些方面中,在大规模生产阶段期间培养细胞。培养悬浮和贴壁细胞的方法是本领域技术人员公知的。
在某些方面中,细胞的密度在电穿孔期间是受控变量。细胞的细胞密度在电穿孔期间可不同或者可根据但不限于细胞类型、期望的电穿孔效率或所得经电穿孔细胞的期望生存力而变化。在某些方面中,细胞密度在整个电穿孔中是恒定的。在另一些方面中,细胞密度在电穿孔过程期间是变化的。在某些方面中,细胞密度在电穿孔之前可以为1×104个细胞/mL至(y)×104,其中y可以为2、3、4、5、6、7、8、9或10(或者2至10的任何值或其中可推导出的范围)。在另一些方面中,细胞密度在电穿孔之前可以为1×105个细胞/mL至(y)×105,其中y为2、3、4、5、6、7、8、9或10(或者2至10的任何值或其中可推导出的范围)。在又一些方面中,细胞密度在电穿孔之前可以为1×106个细胞/mL至(y)×106,其中y可以为2、3、4、5、6、7、8、9或10(或者2至10的任何值或其中可推导出的范围)。在某些方面中,细胞密度在电穿孔之前可以为1×107个细胞/mL至(y)×107,其中y可以为2、3、4、5、6、7、8、9或10(或者2至10的任何值或其中可推导出的范围)。在又一些方面中,细胞密度在电穿孔之前可以为1×107个细胞/mL至1×108个细胞/mL、1×108个细胞/mL至1×109个细胞/mL、1×109个细胞/mL至1×1010个细胞/mL、1×1010个细胞/mL至1×1011个细胞/mL、1×1011个细胞/mL至1×1012个细胞/mL、或者1×107个细胞/mL至1×1012个细胞/mL的任何值或其中可推导出的范围。在某些方面中,细胞密度在电穿孔之前可以为(y)×106,其中y可以为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100中的任一者,或者0.01至100的任何值或其中可推导出的范围。在某些方面中,细胞密度在电穿孔之前可以为(y)×1010,其中y可以为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000中的任一者(或者0.01至1000的任何值或其中可推导出的范围)。
在某些方面中,细胞的密度在电穿孔期间是受控变量。细胞的细胞密度在电穿孔期间可不同或者可根据但不限于细胞类型、期望的电穿孔效率或所得经电穿孔细胞的期望生存力而变化。在某些方面中,细胞密度在整个电穿孔中是恒定的。在另一些方面中,细胞密度在电穿孔过程期间是变化的。在某些方面中,细胞密度在电穿孔期间可以为1×104个细胞/mL至(y)×104,其中y可以为2、3、4、5、6、7、8、9或10(或者2至10的任何值或其中可推导出的范围)。在另一些方面中,细胞密度在电穿孔期间可以为1×105个细胞/mL至(y)×105,其中y为2、3、4、5、6、7、8、9或10(或者2至10的任何值或其中可推导出的范围)。在又一些方面中,细胞密度在电穿孔期间可以为1×106个细胞/mL至(y)×106,其中y可以为2、3、4、5、6、7、8、9或10(或者2至10的任何值或其中可推导出的范围)。在某些方面中,细胞密度在电穿孔期间可以为1×107个细胞/mL至(y)×107,其中y可以为2、3、4、5、6、7、8、9或10(或者2至10的任何值或其中可推导出的范围)。在又一些方面中,细胞密度在电穿孔期间可以为1×107个细胞/mL至1×108个细胞/mL、1×108个细胞/mL至1×109个细胞/mL、1×109个细胞/mL至1×1010个细胞/mL、1×1010个细胞/mL至1×1011个细胞/mL、1×1011个细胞/mL至1×1012个细胞/mL、或者1×107个细胞/mL至1×1012个细胞/mL的任何值或其中可推导出的范围。在某些方面中,细胞密度在电穿孔期间可以为(y)×106,其中y可以为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100中的任一者,或者0.01至100的任何值或其中可推导出的范围。在某些方面中,细胞密度在电穿孔期间可以为(y)×1010,其中y可以为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000中的任一者(或者0.01至1000的任何值或其中可推导出的范围)。
在某些方面中,细胞密度在电穿孔之后可以为1×104个细胞/mL至(y)×104,其中y可以为2、3、4、5、6、7、8、9或10(或者2至10的任何值或其中可推导出的范围)。在另一些方面中,细胞密度在电穿孔之后可以为1×105个细胞/mL至(y)×105,其中y为2、3、4、5、6、7、8、9或10(或者2至10的任何值或其中可推导出的范围)。在又一些方面中,细胞密度在电穿孔之后可以为1×106个细胞/mL至(y)×106,其中y可以为2、3、4、5、6、7、8、9或10(或者2至10的任何值或其中可推导出的范围)。在某些方面中,细胞密度在电穿孔之后可以为1×107个细胞/mL至(y)×107,其中y可以为2、3、4、5、6、7、8、9或10(或者2至10的任何值或其中可推导出的范围)。在又一些方面中,细胞密度在电穿孔之后可以为1×107个细胞/mL至1×108个细胞/mL、1×108个细胞/mL至1×109个细胞/mL、1×109个细胞/mL至1×1010个细胞/mL、1×1010个细胞/mL至1×1011个细胞/mL、1×1011个细胞/mL至1×1012个细胞/mL、或者1×107个细胞/mL至1×1012个细胞/mL的任何值或其中可推导出的范围。在某些方面中,细胞密度在电穿孔之后可以为(y)×106,其中y可以为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100中的任一者、或者0.01至100的任何值或其中可推导出的范围。在某些方面中,细胞密度在电穿孔之后可以为(y)×1010,其中y可以为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000中的任一者(或者0.01至1000的任何值或其中可推导出的范围)。
在一些情况下,可以在一定量的时间内对一定量的细胞进行电穿孔。鉴于所述的平台的灵活性、一致性和再现性,可以在小于0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100秒(或者0.01秒至100秒的任何值或其中可推导出的范围)内对多至或超过约(y)×104、(y)×105、(y)×106、(y)×107、(y)×108、(y)×109、(y)×1010、(y)×1011、(y)×1012、(y)×1013、(y)×1014或(y)×1015(或者(y)×104至(y)×1015的任何值或其中可推导出的范围)个细胞进行电穿孔,其中y可以为1、2、3、4、5、6、7、8或9中任一者(或者1至9的值或其中可推导出的范围)。在另一些情况下,可以在小于0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或120分钟(或者0.01分钟至120分钟的任何值或其中可推导出的范围)内对多至或超过约(y)×104、(y)×105、(y)×106、(y)×107、(y)×108、(y)×109、(y)×1010、(y)×1011、(y)×1012、(y)×1013、(y)×1014或(y)×1015个细胞(或者(y)×104个细胞至(y)×1015个细胞的任何值或其中可推导出的范围)进行电穿孔,其中y可以为1、2、3、4、5、6、7、8或9中任一者(或者1至9的值或其中可推导出的范围)。在又一些方面中,可以在小于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时(或者1小时至24小时的任何值或其中可推导出的范围)内对多至或超过约(y)×104、(y)×105、(y)×106、(y)×107、(y)×108、(y)×109、(y)×1010、(y)×1011、(y)×1012、(y)×1013、(y)×1014或(y)×1015个细胞(或者(y)×104个细胞至(y)×1015个细胞的任何值或其中可推导出的范围)进行电穿孔,其中y可以为1、2、3、4、5、6、7、8或9中任一者(或者1至9的值或其中可推导出的范围)。
表达式“(y)×10e”被理解为意指可以取任意数值的变量“y”乘以升高至指数值e的10。例如,(y)×104,其中y为2,被理解为意指2×104,其等同于2×10,000,等于20,000。(y)×10e4还可以书写为(y)*10e4或(y)×104或(y)*104。
细胞或培养基的体积可根据待电穿孔的细胞的量、待筛选的细胞的量、待筛选的细胞的类型、待产生的蛋白质的类型、期望的蛋白质的量、细胞生存力和与期望的细胞浓度相关的某些细胞特征而变化。可以用于方法和组合物的体积的一些实例包括但不限于0.01,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200,210,220,230,240,250,260,270,280,290,300,310,320,330,340,350,360,370,380,390,400,410,420,430,440,441,450,460,470,480,490,500,510,520,530,540,550,560,570,580,590,600,610,620,630,640,650,660,670,680,690,700,710,720,730,740,750,760,770,780,790,800,810,820,830,840,850,860,870,880,890,900,910,920,930,940,950,960,970,980,990,1000mL或L(或者0.01mL或L至1000mL或L的任何值或其中可推导出的范围)、以及其中可推导出的任何范围。可容纳这样的体积的容器被考虑用于本文中所述的一些方面中。这样的容器包括但不限于细胞培养皿、陪替氏培养皿(petri dish)、烧瓶、生物袋(biobag)、生物容器、生物反应器或桶(vat)。特别考虑了用于大规模体积的容器,例如能够容纳大于10L或更大的那些容器。在某些方面中,使用100L或更大的体积。
在一些方面中,使用可商购的细胞培养容器和细胞培养基来悬浮培养细胞。可用于一些方面的可商购的培养容器的一些实例包括ADME/TOX板(GIBCOTM)、细胞室载片和盖玻片、细胞计数设备、细胞培养表面、细胞培养容器/>经包被的培养皿、/>Cryoware、培养室、培养皿、玻璃培养瓶、塑料培养瓶、3D培养形式、培养多孔板、培养板插入物、玻璃培养管、塑料培养管、可堆叠的细胞培养容器、低氧培养室、陪替氏培养皿和瓶载体、Quickfit培养容器、使用滚瓶(Roller Bottle)的扩大规模细胞培养、旋转烧瓶、3D细胞培养或细胞培养袋。
在另一些方面中,培养基可使用本领域技术人员公知的组分来配制。培养细胞的制剂和方法在以下参考文献中详细地描述:Short Protocols in Cell Biology,J.Bonifacino,等,编辑,John Wiley&Sons,2003,第826页;Live Cell Imaging:ALaboratory Manual,D.Spector&R.Goldman,编辑,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,2004,第450页;Stem Cells Handbook,S.Sell,编辑,Humana Press,2003,第528页;Animal Cell Culture:Essential Methods,John M.Davis,John Wiley&Sons,2011年3月16日;Basic Cell Culture Protocols,Cheryl D.Helgason,Cindy Miller,HumanaPress,2005;Human Cell Culture Protocols,Series:Methods in Molecular Biology,第806卷,Mitry,Ragai R.;Hughes,Robin D.(编辑),第三版2012,XIV,435第89页,HumanaPress;Cancer Cell Culture:Method and Protocols,Cheryl D.Helgason,CindyMiller,Humana Press,2005;Human Cell Culture Protocols,Series:Methods inMolecular Biology,第806卷,Mitry,Ragai R.;Hughes,Robin D.(编辑),第三版2012,XIV,435第89页,Humana Press;Cancer Cell Culture:Method and Protocols,SimonP.Langdon,Springer,2004;Molecular Cell Biology.第四版,Lodish H,Berk A,Zipursky S L,等,New York:W.H.Freeman;2000,第6.2部分Growth of Animal Cells inCulture,其所有都通过引用并入本文。
在一些方面中,在筛选和扩增阶段期间和/或在大规模生产阶段(也被称为补料分批和比较)期间,通过选择或筛选产生的扩增的经电穿孔细胞可包含目的药剂。
B.靶标制造和收集
本文中所述的组合物可用于治疗性应用中。本文中所述组合物的治疗性用途的一个实例是在合适的缓冲液中以所需浓度配制目的治疗剂,并使用系统例如本文中所述的电穿孔系统的处理该制剂。如果将目的治疗剂和电穿孔靶标无菌过滤到具有合适端口的容器中,则可以在常规实验室环境中使目的治疗剂运行通过闭合的无菌系统。该过程可在2至3小时内完成。系统的性能变量是实时生成的,并且可帮助质量控制操作。
通常,加载药剂的靶标的制造可以在中心设施或护理点进行。如果为中心设施(或数个区域性设施),则加载药剂的靶标的稳定性是重要因素。持续至少数天的稳定性可以支持定制订单操作。在护理点系统中,将所配制的目的治疗剂供应至需要治疗的部位。靶标或递送载剂可以在这些部位获得,并且最终制造步骤由技术人员使用详细的标准操作程序在处理设施进行。这将与现场输注产品的最终制备类似。在该情况下,最终产品的稳定性不关键。
C.治疗性应用
本公开内容还涵盖使用经电穿孔实体或靶标(例如,细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体、组织、或其衍生物)作为递送载剂来递送目的治疗剂的方法。本公开内容还包括治疗需要目的治疗剂的患者的方法,所述方法包括向患者施用有效量的含有目的治疗剂的细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织。
使用本文中所述的方法产生的活性剂制剂通常具有持续的作用和较低的毒性,允许较少的施用频率和增强的治疗指数。治疗剂是通过首先制备加载有根据本文中所述的方法获得的至少一种目的治疗剂的细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体、组织、或其衍生物而产生的。
在本公开内容的某些方面中,可以将目的药剂加载或引入到递送载剂(即电穿孔靶标,例如细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体、组织、或其衍生物)中。合适的目的药剂的一些实例包括但不限于:药物;稳定剂、示踪剂、荧光标签和其他成像物质例如放射性标记;冷冻保护剂;核酸;多肽;小分子;碳水化合物;以及生物活性物质。特别适合并入到电穿孔靶标中的生物活性物质包括但不限于治疗剂和预防剂。生物活性物质的一些实例包括但不限于蛋白质和肽(合成的、天然的和模拟物)、寡核苷酸(反义、核酶等)、核酸(例如,双义线性DNA、抑制性RNA、siRNA、miRNA、shRNA、表达载体等)、核糖核蛋白、载体、小分子、碳水化合物、细胞因子、血液治疗剂(hemotherapeutic agent)、抗癌药物、抗炎药物、抗真菌药物、抗病毒药物、抗微生物药物、血栓调节剂(thrombomodulating agent)、免疫调节剂等。应当理解,也可以将其他目的药剂引入到递送载剂或其他细胞中,用于递送至受损组织。这些目的药剂包括但不限于平滑肌抑制剂、抗感染剂(例如,抗生素、抗真菌剂、抗细菌剂、抗病毒剂)、化学治疗/抗肿瘤剂等。
可以通过多种方法将目的药剂引入到递送载剂中,其中最优选的方法是根据本公开内容的设备和/或方法。在一些方面中,将2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种目的药剂连续引入到递送载剂中。在一些方面中,连续引入到递送载剂中的2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种药剂可以是相同的药剂、不同的药剂、或其组合。例如,在一些方面中,连续引入到递送载剂中的2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种药剂可以是相同的药剂。在一些方面中,连续引入到递送载剂中的药剂中的2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种可以是不同的药剂。在一些方面中,连续引入到递送载剂中的2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种药剂可以是相同和不同药剂的组合(例如,第二、第三和第四药剂可以全部是相同药剂,而第五至第十药剂可以是不同药剂或不同药剂的结合)。
在一些方面中,所要求保护的通过电穿孔(例如流式电穿孔)转染细胞的方法实现了目的药剂的加载或转染效率为至少、至多、或约40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或90%,或者其中可推导出的任何范围或值。所要求保护的通过电穿孔(例如流式电穿孔)转染细胞的方法能够实现大于40%、大于50%、大于60%、大于70%、大于80%或大于90%(或者其中可推导出的任何范围或值)的目的药剂的加载或转染效率。在一些方面中,目的药剂的加载效率为至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。转染效率可以通过表达基因产物的细胞的百分比或通过由基因表达的产物的分泌水平来测量。
本公开内容的任何组合物的剂量将根据患者的症状、年龄和体重、待治疗或预防的病症的性质和严重程度、施用途径、和对象组合物的形式而变化。任何对象制剂都可以以单剂量或以分剂量施用。本公开内容的组合物的剂量可以通过本领域技术人员已知的技术或如本文中所教导的技术容易地确定。
在一些方面中,对象化合物的剂量可以是、可以是至多或可以是至少每千克体重0.001,0.010,0.020,0.030,0.040,0.050,0.060,0.070,0.080,0.090,0.100,0.110,0.120,0.130,0.140,0.150,0.160,0.170,0.180,0.190,0.200,0.210,0.220,0.230,0.240,0.250,0.260,0.270,0.280,0.290,0.300,0.310,0.320,0.330,0.340,0.350,0.360,0.370,0.380,0.390,0.400,0.410,0.420,0.430,0.440,0.450,0.460,0.470,0.480,0.490,0.500,0.510,0.520,0.530,0.540,0.550,0.560,0.570,0.580,0.590,0.600,0.610,0,620,0.630,0.640,0.650,0.660,0.670,0.680,0.690,0,700,0.710,0.720,0.730,0.740,0.750,0.760,0.770,0.780,0.790,0.800,0.810,0.820,0.830,0.840,0.850,0.860,0.870,0.880,0.890,0.900,0.910,0.920,0.930,0.940,0.950,0.960,0.970,0.980,0.990,1.000,1.100,1.200,1.300,1.400,1.500,1.600,1.700,1.800,1.900,2.000,2.100,2.200,2.300,2.400,2.500,2.600,2.700,2.800,2.900,3.000,3.100,3.200,3.300,3.400,3.500,3.600,3.700,3.800,3.900,4.000,4.100,4.200,4.300,4.400,4.500,4.600,4.700,4.800,4.900,5.000,5.100,5.200,5.300,5.400,5.500,5.600,5.700,5.80005.900,6.000,6.100,6.200,6.300,6.400,6.500,6.600,6.700,6.800,6.900,7.000,7.100,7.200,7.300,7.400,7.500,7.600,7.700,7.800,7.900,8.000,8.100,8.200,8.300,8.400,8.500,8.600,8.700,8.800,8.900,9.000,9.100,9.200,9.300,9.400,9.500,9.600,9.700,9.800,9.900,或10.000pg/ng/mg/g,或者其中可推导出的任何范围或值。在某些方面中,对象化合物的剂量将通常为每千克体重约0.001、0.01、1、5、10pg/ng/mg至约0.1、1、5、10pg/ng/mg/g,包括其间的所有值和范围。
1.抗感染剂
在一个方面中,目的药剂是抗感染剂。抗感染剂是对抗感染的药剂,例如细菌、分枝杆菌、真菌、病毒或原生动物感染。本公开内容所涵盖的抗感染剂包括但不限于:氨基糖苷类(例如,链霉素(streptomycin)、庆大霉素(gentamicin)、妥布霉素(tobramycin)、阿米卡星(amikacin)、奈替米星(netilmicin)、卡那霉素(kanamycin)等),四环素类(例如,金霉素(chlortetracycline)、土霉素(oxytetracycline)、美他环素(methacycline)、多西环素(doxycycline)、米诺环素(minocycline)等),磺胺类(例如,磺胺、磺胺嘧啶、磺胺甲唑(sulfamethaoxazole)、磺胺异/>唑、磺胺醋酰等),对氨基苯甲酸,二氨基嘧啶类(例如,甲氧苄啶,其通常与磺胺甲/>唑、吡嗪酰胺等结合使用),喹诺酮类(例如,萘啶酸、西诺沙星(cinoxacin)、环丙沙星(ciprofloxacin)和诺氟沙星(norfloxacin)等),青霉素类(例如青霉素G、青霉素V、氨苄青霉素、阿莫西林(amoxicillin)、巴氨西林(bacampicillin)、羧苄西林(carbenicillin)、羧苄西林茚满(carbenicillin indanyl)、替卡西林(ticarcillin)、阿洛西林(azlocillin)、美洛西林(mezlocillin)、哌拉西林(piperacillin)等),青霉素酶抗性青霉素(例如,甲氧西林(methicillin)、苯唑西林(oxacillin)、氯唑西林(cloxacillin)、双氯西林(dicloxacillin)、萘夫西林(nafcillin)等),第一代头孢菌素(例如,头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢氨苄(cephalexin)、头孢拉定(cephradine)、头孢噻吩(cephalothin)、头孢匹林(cephapirin)、头孢唑啉(cefazolin)等),第二代头孢菌素(例如,头孢克洛(cefaclor)、头孢孟多(cefamandole)、头孢尼西(cefonicid)、头孢西丁(cefoxitin)、头孢替坦(cefotetan)、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢呋辛酯(cefuroximeaxetil)、头孢美唑(cefmetazole)、头孢丙烯(cefprozil)、氯碳头孢(loracarbef)、头孢雷特(ceforanide)等),第三代头孢菌素(例如,头孢吡肟(cefepime)、头孢哌酮(cefoperazone)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢唑肟(ceftizoxime)、头孢曲松(ceftriaxone)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢克肟(cefixime)、头孢泊肟(cefpodoxime)、头孢布坦(ceftibuten)等),其他β-内酰胺类(例如,亚胺培南(imipenem)、美洛培南(meropenem)、氨曲南(aztreonam)、克拉维酸(clavulanic acid)、舒巴坦(sulbactam)、他唑巴坦(tazobactam)等),β内酰胺酶抑制剂(例如,克拉维酸),氯霉素,大环内酯类(例如,红霉素(erythromycin)、阿奇霉素(azithromycin)、克拉霉素(clarithromycin)等),林可霉素(lincomycin),克林霉素(clindamycin),大观霉素(spectinomycin),多黏菌素B(polymyxin B),多黏菌素类(例如,多黏菌素A、B、C、D、E1(黏菌素A)、或E2、黏菌素B或C等),黏菌素,万古霉素(vancomycin),杆菌肽,异烟肼,利福平(rifampin),乙胺丁醇,乙硫异烟胺,氨基水杨酸,环丝氨酸,卷曲霉素(capreomycin),砜类(例如,氨苯砜、阿地砜钠等),氯法齐明(clofazimine),沙利度胺(thalidomide)和任何其他可以脂质包封的抗细菌剂。
在某些方面中,抗微生物剂包括抗分枝杆菌剂,包括但不限于异烟肼、利福平、链霉素、利福布汀(rifabutin)、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、乙硫异烟胺、氨基水杨酸和环丝氨酸。
抗感染剂可以包括抗真菌剂,其包括多烯类抗真菌剂(例如,两性霉素B(amphotericin B)、制霉菌素(nystatin)、那他霉素(natamycin)等)、氟胞嘧啶、咪唑类(例如,n-噻康唑(n-ticonazole)、克霉唑(clotrimazole)、益康唑(econazole)、酮康唑(ketoconazole)等)、三唑类(例如,伊曲康唑(itraconazole)、氟康唑(fluconazole)等)、灰黄霉素(griseofulvin)、特康唑(terconazole)、布康唑(butoconazole)ciclopirax、环吡酮胺(ciclopirox olamine)、氯丙炔碘(haloprogin)、托萘酯(tolnaftate)、萘替芬(naftifine)、特比萘芬(terbinafine)和任何其他可以脂质包封或复合的抗真菌剂。可以使用药物的组合。
在某些方面中,抗感染剂包括抗病毒剂,其包括但不限于:抗疱疹剂,例如阿昔洛韦(acyclovir)、泛昔洛韦(famciclovir)、膦甲酸(foscamet)、更昔洛韦(ganciclovir)、阿昔洛韦(acyclovir)、碘苷(idoxuridine)、索利夫定(sorivudine)、三氟尿苷(trifluridine)、伐昔洛韦(valacyclovir)和阿糖腺苷(vidarabine);抗逆转录病毒剂,例如利托那韦(ritonavir)、去羟肌苷(didanosine)、司他夫定(stavudine)、扎西他滨(zalcitabine)、泰诺福韦(tenovovir)和齐多夫定(zidovudine);以及其他抗病毒剂,例如但不限于金刚烷胺(amantadine)、干扰素α、利巴韦林(ribavirin)和金刚乙胺(rimantadine)。
作为本公开内容的制剂中使用的合适的抗感染剂,还包括药物的可药用加成盐和复合物。在其中化合物可以具有一个或更多个手性中心的情况下,除非特别说明,否则本公开内容包括每种独特的外消旋化合物以及每种独特的非外消旋化合物。
2.抗肿瘤剂
在一个方面中,活性剂是抗肿瘤药物。目前,有约20种公认的已批准的抗肿瘤药物类别。这些类别是基于特定药物共有的共同结构或基于药物的共同作用机制的概括。按类别的一些通常已知的抗肿瘤剂的部分列表如下:
基于结构的类别包括:氟尿嘧啶类—5-FU、氟脱氧尿苷、替加氟、5’-脱氧氟尿苷、UFT、S-1卡培他滨(S-1Capecitabine);嘧啶核苷类—脱氧胞苷、阿糖胞苷、5-氮杂胞嘧啶、吉西他滨(Gemcitabine)、5-氮杂胞嘧啶-阿拉伯糖苷;嘌呤类—6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤、别嘌呤醇、克拉屈滨(Cladribine)、氟达拉滨(Fludarabine)、喷司他丁(Pentostatin)、2-氯腺苷;铂类似物—顺铂、卡铂、奥沙利铂、四铂、铂-DACH、奥马铂(Ormaplatin)、CI-973、JM-216;蒽环类/蒽二酮类—多柔比星(Doxorubicin)、柔红霉素(Daunorubicin)、表柔比星(Epirubicin)、伊达比星(Idarubicin)、米托蒽醌(Mitoxantrone);表鬼臼毒素类(Epipodophyllotoxins)—依托泊苷(Etoposide)、替尼泊苷(Teniposide);喜树碱类—伊立替康(Irinotecan)、拓扑替康(Topotecan)、9-氨基喜树碱、10,11-亚甲基二氧基喜树碱、9-硝基喜树碱、TAS103、7-(4-甲基-哌嗪-亚甲基)-10,11-亚乙基二氧基-20(S)-喜树碱、7-(2-N-异丙基氨基)乙基)-20(S)-喜树碱;激素和激素类似物—己烯雌酚(Diethylstilbestrol)、他莫昔芬(Tamoxifen)、托雷美芬(Toremefine)、Tolmudex、Thymitaq、氟他胺(Flutamide)、比卡鲁胺(Bicalutamide)、非那雄胺(Finasteride)、雌二醇、曲沃昔芬(Trioxifene)、屈洛昔芬(Droloxifene)、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、氨鲁米特(Aminoglutethimide)、睾内酯等;酶、蛋白质和抗体—天门冬酰胺酶、白介素、干扰素、亮丙瑞林、培门冬酶等;长春花生物碱类—长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛;紫杉烷类—紫杉醇和多西他赛(Docetaxel)。
基于机制的类别包括:抗激素类—阿那曲唑(Anastrozole);抗叶酸类—甲氨蝶呤(Methotrexate)、氨基蝶呤(Aminopterin)、三甲曲沙(Trimetrexate)、甲氧苄啶(Trimethoprim)、普利曲西(Pyritrexim)、乙胺嘧啶、依达曲沙(Edatrexate)、MDAM;抗微管剂—紫杉烷和长春花生物碱;烷化剂(经典和非经典的)-氮芥(二氯甲基二乙胺、苯丁酸氮芥、美法仑(Melphalan)、乌拉莫司汀(Uracil Mustard))、氧氮磷杂环己烷(Oxazaphosphorine)(异环磷酰胺、环磷酰胺、培磷酰胺、氯乙环磷酰胺(Trophosphamide))、烷基磺酸盐(白消安(Busulfan))、亚硝基脲(卡莫司汀(Carmustine)、洛莫司丁(Lomustine)、链脲佐菌素(Streptozocin))、噻替派(Thiotepa)、达卡巴嗪(Dacarbazine)等;抗代谢物—上文列出的嘌呤、嘧啶和核苷;抗生素—蒽环类/蒽二酮类、博来霉素(Bleomycin)、放线菌素(Dactinomycin)、丝裂霉素(Mitomycin)、普卡霉素(Plicamycin)、喷司他丁(Pentostatin)、链脲霉素(Streptozocin);拓扑异构酶抑制剂—喜树碱(Topo I)、表鬼臼毒素、间-AMSA、玫瑰树碱(Topo II);抗病毒剂—AZT、扎西他滨、吉西他滨、去羟肌苷等;其他细胞毒性剂—siRNA、miRNA、羟基脲、米托坦(Mitotane)、融合毒素、PZA、苔藓抑素、类视黄醇、丁酸及衍生物、戊聚糖、烟曲霉素等。
3.抗血管生成剂
抗血管生成剂可以并入到电穿孔靶标中。抗血管生成药物包括但不限于:AGM-1470(TNP-470)或其受体之一的拮抗剂MetAP-2;生长因子拮抗剂、或生长因子抗体(包括VEGF或bFGF);生长因子受体拮抗剂或生长因子受体的抗体;金属蛋白酶抑制剂,包括TIMP、巴马司他(batimastat)(BB-94)和马立马司他(marimastat);酪氨酸激酶抑制剂,包括染料木素(genistein)和SU5416;整合素拮抗剂,包括拮抗剂αVβ3/5或整合素抗体;类视黄醇,包括视黄酸或合成的类视黄醇维甲酰酚胺(retinoid fenretinide);类固醇11α-表氢化可的松(steroids11α-epihydrocortisol)、corteloxone、四氢可的松和17α-羟孕酮;蛋白激酶抑制剂,包括星形孢菌素(staurosporine)和MDL 27032;维生素D衍生物,包括22-氧杂-1α和25-二羟基维生素D3;花生四烯酸抑制剂,包括吲哚美辛(indomethacin)和舒林酸(sulindac);四环素衍生物,包括米诺环素;沙利度胺(thalidomide)和沙利度胺类似物和衍生物;2-甲氧基雌二醇;肿瘤坏死因子α;干扰素γ诱导蛋白10(IP-10);白介素1和白介素12;干扰素α、β或γ;血管抑素蛋白或血纤维蛋白溶酶原片段;内皮抑素蛋白或胶原蛋白18片段;增殖蛋白相关蛋白(proliferin-related protein);B组链球菌毒素(group Bstreptococcus toxin);CM101;CAI;肌钙蛋白I;角鲨胺;一氧化氮合酶抑制剂,包括L-NAME;血小板反应蛋白;渥曼青霉素(wortmannin);阿米洛利(amiloride);螺内酯;熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid);蟾毒灵(bufalin);苏拉明(suramin);替可加兰钠(tecogalan sodium);亚油酸;卡托普利(captopril);伊索拉定(irsogladine);FR-118487;三萜酸;粟精胺(castanospermine);白血病抑制因子;薰草菌素A(lavendustinA);血小板因子-4;除莠霉素A(herbimycin A);二氨基蒽醌;紫杉醇;金精三羧酸(aurintricarboxylic acid);DS-4152;戊聚糖聚硫酸盐(pentosan polysulphite);根赤壳菌素(radicicol);人催乳素片段;制表菌素(erbstatin);环氧内霉素(eponemycin);鲨鱼软骨;鱼精蛋白;Louisianin A、C和D;PAF拮抗剂WEB 2086;金诺芬(auranofin);抗坏血酸醚;和硫酸多糖D 4152。
4.生物分子制剂
使用本公开内容的方法用核酸药剂靶向的基因包括但不限于其表达与不期望的表型性状相关的基因。因此,例如,可以靶向与癌症和病毒相关的基因。癌症相关基因包括癌基因(例如K-ras、c-myc、bcr/abl、c-myb、c-fms、c-fos和cerb-B)、生长因子基因(例如,编码表皮生长因子及其受体、成纤维细胞生长因子结合蛋白的基因)、基质金属蛋白酶基因(例如,编码MMP-9的基因)、黏附分子基因(例如,编码VLA-6整合素的基因)、肿瘤抑制基因(例如bcl-2和bcl-X1)、血管生成基因、和转移基因。病毒基因包括人乳头瘤病毒基因(例如与宫颈癌相关)、乙型肝炎和丙型肝炎基因、以及巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)基因(例如,与视网膜炎相关)。也可以靶向与这些疾病或其他疾病相关的许多其他基因。在某些方面中,核酸可以靶向编码c-myc、VEGF、CD4、CCRS、gag、MDM2、Apex、Ku70或ErbB2的mRNA。
基因调节的方法包括施用siRNA、miRNA、shRNA、反义寡核苷酸和其他抑制性核酸,和/或施用编码治疗性多核苷酸、蛋白质、核糖核蛋白或肽的载体或核酸。在另一个方面中,本公开内容提供了制备和/或向对象施用一定剂量的治疗性抑制寡核苷酸或核酸(反义寡核苷酸、核酶、siRNA、shRNA、miRNA、dsRNA)分子的方法,其中所施用的核酸抑制生物过程,例如转录或翻译。本公开内容提供了使用核酸递送载剂向对象施用一种或更多种治疗性核酸分子以向对象带来治疗益处的方法,所述核酸递送载剂是使用所述方法所制备的。本文中使用的“治疗性核酸分子”或“治疗性核酸”是任何核酸(例如,DNA、RNA、非天然存在的核酸及其类似物,例如肽核酸、及其化学缀合物),其作为核酸或已表达的核酸或多肽,赋予对象治疗益处。对象可以是哺乳动物,例如小鼠或人。
基因调节的方法还包括对细胞进行基因编辑以除去细胞中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个内源性基因。基因编辑的方法包括但不限于RNA指导内切核酸酶(RNA-guided endonuclease,RGEN)(例如核糖核蛋白)、限制酶、锌指核酸酶(zinc fingernuclease,ZFN)、和转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-likeeffector nuclease,TALEN)。在一些具体方面中,细胞的一个或更多个内源性基因被修饰,例如表达被干扰,其中表达部分或全部降低。在一些具体方面中,使用本公开内容的过程来敲低或敲除一个或更多个基因。根据本公开内容的电穿孔设备和/或方法,可以通过电穿孔细胞以引入一种或更多种RGEN、限制酶、ZFN或TALEN来实现基因表达的干扰或者基因敲除或敲低。在一些方面中,当一个或更多个RGEN、限制酶、ZFN或TALEN被顺序引入以顺序干扰、敲除或敲低2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个基因时,细胞被顺序电穿孔以允许对细胞进行连续编辑。在细胞中编辑的基因可以是任何种类的,但在一些具体方面中,基因是其基因产物与不期望的表型性状相关的基因,如本文中所述。
a.核酸
一些方面涉及用包含治疗性核酸的组合物对细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体、组织、或其衍生物进行电穿孔。在某些方面中,核酸分子可以是寡核苷酸的形式。
术语“寡核苷酸”是指多核苷酸,例如脱氧核糖核酸(DNA),并且在适当的情况下是指核糖核酸(RNA)。该术语还应理解为包括作为等同方案的由核苷酸类似物制成的RNA或DNA的衍生物、变体和类似物,以及作为适用于所述的方面的单链(有义或反义)和双链多核苷酸。脱氧核糖核苷酸包括脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷和脱氧胸苷。出于清楚的目的,当在本文中提及其可以是DNA或RNA的核酸的核苷酸时,使用术语“腺苷”、“胞苷”、“鸟苷”和“胸苷”。应理解,如果核酸是RNA,则具有尿嘧啶碱基的核苷酸是尿苷。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用,并且是指任何长度的核苷酸的聚合物形式,其是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或者其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的一些非限制性实例:基因或基因片段(例如,探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸,例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话,可以在多核苷酸组装之前或之后赋予核苷酸结构修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可在聚合之后进一步修饰,例如通过与标记组分缀合。该术语还是指双链和单链分子二者。除非另有说明或要求,否则本公开内容的为多核苷酸的任何实施方案涵盖双链形式,也涵盖已知或预测构成双链形式的两个互补单链形式中的每一个。
DNA寡核苷酸的长度可以是至少、至多或约10、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或600个核苷酸至至少、至多、或约100,125,150,175,200,225,250,275,300,325,350,375,400,425,450,475,500,525,550,575,600,625,650,675,700,725,750,775,800,825,850,875,900,925,950,975,1000,1100,1200,1300,1400,1500,1600,1700,1800,1900,2000,2250,2500,2750,3000,3250,3500,3750,4000,4250,4500,4750,或5000个核苷酸,或者10个核苷酸至5000个核苷酸的任何值或其可推导出的范围。在某些方面中,寡核苷酸多于10个核苷酸,或多于11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或40个核苷酸。在一些具体方面中,寡核苷酸为约30至约300个核苷酸、约20至约200个核苷酸、约15至约150个核苷酸、约10至约100个核苷酸、或约40至约100个核苷酸。在某些方面中,不管编码序列的长度如何,寡核苷酸可与另一些核酸序列(例如启动子、多腺苷酸化信号、限制酶位点、多克隆位点、另一些编码区段等)组合,使得其总长度可以有很大变化。
在电穿孔过程期间寡核苷酸的浓度可以是寡核苷酸在电穿孔室和/或样品容器中的最终浓度。寡核苷酸浓度可以为至少、至多、或约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50、75、100、150、200、250或300至约350、400、500、1000、1500、2000、3000、4000或5000μg/mL,或者0.01μg/mL至5000μg/mL的任何值或其中可推导出的范围。在某些方面中,寡核苷酸浓度为至少1μg/mL。在另一些方面中,寡核苷酸的浓度为至少、至多、或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275或300μg/mL,或者1μg/mL至300μg/mL的任何值或其中可推导出的范围。
在本公开内容的上下文中,术语“未经修饰的寡核苷酸”通常是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的寡聚物或聚合物。在一些方面中,核酸分子是未经修饰的寡核苷酸。该术语包括由天然存在的核碱基、糖和共价核苷间键联构成的寡核苷酸。术语“寡核苷酸类似物”是指具有一个或更多个以与寡核苷酸类似的方式发挥作用的非天然存在部分的寡核苷酸。由于所期望的特性例如如增强的细胞摄取、增强的对其他寡核苷酸或核酸靶标的亲和力、以及在存在核酸酶的情况下提高的稳定性,相比于天然存在形式,经常选择这样的非天然存在的寡核苷酸。术语“寡核苷酸”可用于是指未经修饰的寡核苷酸或寡核苷酸类似物。
核酸分子的一些具体实例包括含有经修饰的即非天然存在的核苷间键联的核酸分子。由于所期望的特性例如如增强的细胞摄取、增强的对其他寡核苷酸或核酸靶标的亲和力、以及在存在核酸酶的情况下提高的稳定性,相比于天然存在形式,经常选择这样的非天然核苷间键联。在一个具体方面中,修饰包含甲基。
核酸分子可以具有一个或更多个经修饰的核苷间键联。如本说明书中所限定的,具有经修饰的核苷间键联的寡核苷酸包含保留磷原子的核苷间键联和不具有磷原子的核苷间键联。出于本说明书的目的并且如在本领域中有时参考的,在其核苷间骨架中不具有磷原子的经修饰的寡核苷酸也可被认为是寡核苷酸。
对核酸分子的修饰可以包含其中修饰一个或两个末端核苷酸的修饰。
一种合适的含磷的经修饰的核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。许多其他经修饰的寡核苷酸骨架(核苷间键联)是本领域已知的,并且可用于该方面的背景中。教导制备含磷的核苷间键联的一些代表性美国专利包括但不限于美国专利No.3,687,808;4,469,863;4,476,301;5,023,243,5,177,196;5,188,897;5,264,423;5,276,019;5,278,302;5,286,717;5,321,131;5,399,676;5,405,939;5,453,496;5,455,233;5,466,677;5,476,925;5,519,126;5,536,821;5,541,306;5,550,111;5,563,253;5,571,799;5,587,361;5,194,599;5,565,555;5,527,899;5,721,218;5,672,697;5,625,050;5,489,677;和5,602,240,其各自通过引用并入本文。
其中不包含磷原子的经修饰的寡核苷酸骨架(核苷间键联)具有通过短链烷基或环烷基核苷间键联、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键联、或者一个或更多个短链杂原子或杂环核苷间键联形成的核苷间键联。这些包括具有酰胺骨架的那些;并且包括具有混合N、O、S和CH2组分部分的那些。教导制备上述非含磷的寡核苷的一些代表性美国专利包括但不限于美国专利No.5,034,506;5,166,315;5,185,444;5,214,134;5,216,141;5,235,033;5,264,562;5,264,564;5,405,938;5,434,257;5,466,677;5,470,967;5,489,677;5,541,307;5,561,225;5,596,086;5,602,240;5,610,289;5,602,240;5,608,046;5,610,289;5,618,704;5,623,070;5,663,312;5,633,360;5,677,437;5,792,608;5,646,269;和5,677,439其各自通过引用并入本文。
寡聚化合物还可以包括寡核苷酸模拟物。术语模拟物当应用于寡核苷酸时旨在包括其中仅呋喃糖环或呋喃糖环和核苷酸间键联二者被新的基团替代的寡聚化合物,仅呋喃糖环被例如吗啉代环替代在本领域中还被称为糖替代(sugar surrogate)。维持杂环碱基部分或经修饰的杂环碱基部分以用于与合适的靶核酸杂交。寡核苷酸模拟物可以包括寡聚化合物,例如肽核酸(PNA)和环己烯基核酸(被称为CeNA,参见Wang等,J.Am.Chem.Soc.,2000,122,8595-8602)。教导制备寡核苷酸模拟物的一些代表性美国专利包括但不限于美国专利No.5,539,082;5,714,331和5,719,262,其各自通过引用并入本文。另一类寡核苷酸模拟物被称为磷酸单酯核酸并且在骨架中并入磷基团。据报道该类寡核苷酸模拟物在抑制基因表达领域中(反义寡核苷酸、核酶、有义寡核苷酸和形成三联体的寡核苷酸)具有可用的物理学和生物学和药理学特性,作为用于检测核酸的探针和作为用于分子生物学的辅助物。已经报道了其中呋喃糖基环被环丁基部分替代的另外的寡核苷酸模拟物。
核酸分子还可以包含一个或更多个经修饰或经取代的糖部分。维持碱基部分以用于与合适的核酸靶化合物杂交。糖修饰可以赋予寡聚化合物核酸酶稳定性、结合亲和力或一些其他有益生物学特性。
代表性经修饰的糖包括碳环或非环糖,糖在其2’、3’或4’位置中的一个或更多个处具有取代基,糖具有替代糖中的一个或更多个氢原子的取代基,并且糖具有在糖中的任何两个其他原子之间的键联。许多糖修饰是本领域已知的,在2’位置处被修饰的糖和在糖的任何2个原子之间具有桥联(使得糖是双环的)的那些特别可用于该方面中。在该方面中可用的糖修饰的一些实例包括但不限于包含选自以下的糖取代基的化合物:OH;F;O-、S-或N-烷基;或者O-烷基-O-烷基,其中烷基、烯基和炔基可以是经取代或未经取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。特别合适的是:2-甲氧基乙氧基(也被称为2’-O-甲氧基乙基、2’-MOE或2’-OCH2CH2OCH3)、2’-O-甲基(2’-O-CH3)、2’-氟(2’-F)或具有连接4’碳原子与2’碳原子的桥基团的经双环糖修饰的核苷,其中一些示例性桥基团包括—CH2-O—、—(CH2)2-O—或—CH2-N(R3)-O,其中R3为H或C1至C12烷基。
赋予提高的核酸酶抗性和对核苷酸非常高的结合亲和力的一种修饰是2’-MOE侧链(Baker等,J.Biol.Chem.,1997,272,11944-12000)。2’-MOE取代的直接优点之一是结合亲和力的提高,其大于许多类似的2’修饰,例如O-甲基、O-丙基和O-氨基丙基。具有2’-MOE取代基的寡核苷酸也已显示出用于体内使用的有前景特征的基因表达的反义抑制剂(Martin,P.,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504;Altmann等,Chimia,1996,50,168-176;Altmann等,Biochem.Soc.Trans.,1996,24,630-637;和Altmann等,NucleosidesNucleotides,1997,16,917-926)。
2’-糖取代基可以在阿拉伯糖(arabino)(上)位置或核糖(ribo)(下)位置中。一种2’-阿拉伯糖修饰是2’-F。类似的修饰也可在寡聚化合物的其他位置处进行,特别是在3’末端核苷上糖的3’位置或2’-5’键联的寡核苷酸中和5’末端核苷酸的5’位置处进行。寡聚化合物还可具有糖模拟物例如环丁基部分来替代戊呋糖基糖。教导制备这样的经修饰的糖结构的一些代表性美国专利包括但不限于美国专利No.4,981,957;5,118,800;5,319,080;5,359,044;5,393,878;5,446,137;5,466,786;5,514,785;5,519,134;5,567,811;5,576,427;5,591,722;5,597,909;5,610,300;5,627,053;5,639,873;5,646,265;5,658,873;5,670,633;5,792,747;和5,700,920其各自通过引用整体并入本文。
代表性的糖取代基在题为“Capped 2’-Oxyethoxy Oligonucleotides”的美国专利No.6,172,209中公开,其在此通过引用整体并入。代表性的环状糖取代基在题为“RNATargeted 2’-Oligomeric compounds that are Conformationally Preorganized”的美国专利No.6,271,358中公开,其在此通过引用整体并入。代表性的胍基取代基在题为“Functionalized Oligomers”的美国专利No.6,593,466中公开,其在此通过引用整体并入。代表性的乙酰氨基取代基在美国专利No.6,147,200中公开,其在此通过引用整体并入。
核酸分子还可包含一种或更多种核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代,其与天然存在或合成的未经修饰的核碱基在结构上可区分,但在功能上可互换。这样的核碱基修饰可以赋予寡聚化合物核酸酶稳定性、结合亲和力或一些其他有益的生物学特性。本文中使用的“未经修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。在本文中还被称为杂环碱基部分的经修饰的核碱基包括其他合成和天然的核碱基,其许多实例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤等。
杂环碱基部分还可以包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环替代的那些,例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。一些核碱基包括在美国专利No.3,687,808中公开的那些、在The Concise Encyclopedia Of Polymer Science AndEngineering,第858-859页,Kroschwitz,J.I.,编辑John Wiley&Sons,1990中公开的那些、由Englisch等,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613公开的那些,以及由Sanghvi,Y.S.,第15章,Antisense Research and Applications,第289-302页,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编辑,CRC Press,1993公开的那些。这些核碱基中的某些特别可用于提高寡聚化合物的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶,6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤,包括2氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。
对核酸分子的另外的修饰在美国专利公开2009/0221685中公开,其在此通过引用并入。本文还公开了另外的针对核酸分子的合适的缀合物。
b.蛋白质
一些方面涉及用包含治疗性蛋白质或肽的组合物对细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体、组织、或其衍生物进行电穿孔。
本文中使用的“蛋白质”或“肽”或“多肽”是指包含至少两个氨基酸残基的分子。本文中使用的术语“野生型”是指在生物体中天然存在的分子的内源性形式。在一些方面中,使用蛋白质或多肽的野生型形式,然而,在本公开内容的许多方面中,使用经修饰的蛋白质或多肽以产生免疫应答。上述术语可以互换使用。“经修饰的蛋白质”或“经修饰的多肽”或“变体”是指这样的蛋白质或多肽,其化学结构特别是其氨基酸序列相对于野生型蛋白质或多肽发生改变。在一些方面中,经修饰的/变体蛋白质或多肽具有至少一种经修饰的活性或功能(识别蛋白质或多肽可具有多种活性或功能)。特别考虑了经修饰/变体蛋白质或多肽可在一种活性或功能方面改变,但在另一些方面(例如免疫原性)保留野生型活性或功能。
在本文中具体提及蛋白质的情况下,其通常是指天然(野生型)或重组(经修饰的)蛋白质,或者任选地,其中任何信号序列已被除去的蛋白质。蛋白质可以从其天然的生物体直接分离,通过重组DNA/外源表达方法产生,或通过固相肽合成(solid-phase peptidesynthesis,SPPS)或其他体外方法产生。在一些具体方面中,存在并入编码多肽(例如,抗体或其片段)的核酸序列的分离的核酸区段和重组载体。术语“重组”可与多肽或特定多肽的名称联合使用,并且这通常是指由核酸分子产生的多肽,其已在体外操作或者是这样的分子的复制产物。
在某些方面中,蛋白质或多肽尺寸(野生型或经修饰的)可包含但不限于至少、至多、或约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,12,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66《67《68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200,210,220,230,240,250,275,300,325,350,375,400,425,450,475,500,525,550,575,600,625,650,675,700,725,750,775,800,825,850,875,900,925,950,975,1000,1100,1200,1300,1400,1500,1750,2000,2250,2500个氨基酸残基或更大,或者1个氨基酸至2500个氨基酸的任何值或其中可推导出的范围,或者本文中所述或提及的相应氨基酸序列的衍生物。考虑了多肽可以通过截短进行突变,使其比其对应的野生型形式更短,而且,其可通过融合或缀合具有特定功能(例如,用于靶向或定位,用于增强免疫原性、用于纯化目的等)的异源蛋白质或多肽序列而改变。本文中使用的术语“结构域”是指蛋白质或多肽的任何不同的功能或结构单元,并且通常是指具有本领域技术人员可识别的结构或功能的氨基酸的序列。
多种基因的核苷酸以及蛋白质、多肽、和肽序列先前已经公开,并且可见于公认的计算机化数据库中。两个常用的数据库是美国国家生物技术信息中心的和/>数据库(在万维网ncbi.nlm.nih.gov上)以及全球蛋白质资源(在万维网uniprot.org上)艺术。这些基因的编码区可以使用本文中所公开的技术或本领域普通技术人员已知的技术进行电穿孔。
在电穿孔过程期间蛋白质或多肽的浓度可以是蛋白质在电穿孔室和/或样品容器中的最终浓度。在电穿孔过程期间多肽的浓度可以为至少、至多或约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50、75、100、150、200、250、300至至少、至多、或约350、400、500、1000、1500、2000、3000、4000或5000μg/mL,或者0.01μg/mL至5000μg/mL的任何值或其中可推导出的范围。在某些方面中,多肽的浓度为至少1μg/mL。在另一些方面中,多肽的浓度为至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275或300μg/mL,或者1μg/mL至300μg/mL的任何值或其中可推导出的范围。
与野生型蛋白质相比,本公开内容的蛋白质还可以包含蛋白质的替代氨基酸亚基,以产生等同的或甚至改进的第二代变体多肽或肽。由于是蛋白质的相互作用能力和性质限定了其功能活性,因此可以在蛋白质序列及其相应的DNA编码序列中进行某些氨基酸替换,但仍产生具有类似或所期望的特性的蛋白质。
本文中使用的术语“功能等同的密码子”是指编码相同氨基酸的密码子,例如针对精氨酸的六个不同的密码子。还考虑了“中性替换”或“中性突变”,其是指编码生物等同氨基酸的一个或更多个密码子的改变。
本公开内容的氨基酸序列变体可以是替换、插入或缺失变体。与野生型相比,本公开内容的多肽的变化可影响蛋白质或多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个非连续或连续氨基酸。变体可以包含与野生型蛋白质序列具有至少50%、60%、70%、80%或90%(包括其间的所有值和范围)同一性的氨基酸序列。例如,变体可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个替换氨基酸。
还将理解的是,氨基酸和核酸序列可分别包含另外的残基,例如另外的N或C端氨基酸,或者5’或3’核酸序列,并且仍然与野生型序列基本相同,只要该序列在涉及蛋白质表达的情况下维持生物蛋白质活性即可。末端序列的添加特别适用于这样的核酸序列,其可例如包括位于编码区的5’或3’部分侧翼的多个非编码序列。
缺失变体通常缺乏天然或野生型蛋白质的一个或更多个残基。可以缺失单个残基,或者可以缺失许多连续氨基酸。可以(通过替换或插入)将终止密码子引入到编码核酸序列中以产生截短的蛋白质。
插入突变体通常涉及在多肽的非末端点添加氨基酸残基。这可以包括插入一个或更多个氨基酸残基。还可以产生末端添加,并且可以包括融合蛋白,其是本文中所述或提及的一种或更多种肽或多肽的多聚体或多联体。
替换变体通常包含在蛋白质或多肽内的一个或更多个位点处的一个氨基酸与另一个氨基酸的交换,并且可以被设计成在损失或不损失其他功能或特性的情况下调节多肽的一个或更多个特性。替换可以是保守的,即一个氨基酸被具有类似化学特性的一个氨基酸替换。“保守氨基酸替换”可涉及一个氨基酸类别的成员与同一类别的另一成员的交换。保守氨基酸替换可涵盖非天然存在的氨基酸残基,其通常通过化学肽合成而不是通过在生物系统中的合成来并入。这些包括肽模拟物或其他反转或倒转形式的氨基酸部分。
或者,替换可以是“非保守的”(也可以是“不保守的”)。在一些方面中,非保守替换影响多肽的功能或活性。在一些方面中,非保守替换不影响多肽的功能或活性。非保守变化通常涉及用化学上相异的氨基酸残基替换氨基酸残基,例如用极性或带电荷的氨基酸替换非极性或不带电荷的氨基酸,并且反之亦然。非保守替换可涉及将一种氨基酸类别的成员替换为来自另一类别的成员。
c.核糖核蛋白
一些方面涉及用包含一种或更多种DNA结合核酸的组合物对细胞进行电穿孔,例如通过RNA指导内切核酸酶(RGEN)(例如核糖核蛋白)对细胞的基因编辑的改变。在某些方面中,核糖核蛋白包含成簇规则间隔短回文重复(clustered regularly interspacedshort palindromic repeat,CRISPR)和CRISPR相关(CRISPR-associated,Cas)蛋白。
一般而言,“CRISPR系统”总体上是指涉及CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或对其活性进行指导的转录物和其他元件,包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如,tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr伴侣(tracr-mate)序列(包括“同向重复序列(direct repeat)”,以及在内源性CRISPR系统背景下经tracrRNA加工的部分同向重复序列)、指导序列(在内源性CRISPR系统的背景下也称为“间隔区”)和/或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。
CRISPR/Cas核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶系统可以包含序列特异性地与DNA结合的非编码RNA分子(指导)RNA和具有核酸酶功能(例如,两个核酸酶结构域)的Cas蛋白(例如,Cas9)。CRISPR系统的一个或更多个元件可来源于I型、II型或III型CRISPR系统,例如来源于包含内源性CRISPR系统的特定生物体,例如酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。
在一些方面中,将Cas核酸酶和gRNA引入到细胞中。一般而言,使用互补碱基配对,gRNA的5’末端处的靶位点将Cas核酸酶靶向至靶位点,例如基因。靶位点可基于其紧邻原间隔区邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM)序列(例如通常为NGG或NAG)的5’的位置来选择。在该方面中,通过对指导RNA的前20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个核苷酸进行修饰以对应于靶DNA序列来将gRNA靶向到所期望的序列。一般而言,CRISPR系统的特征在于促进靶序列位点处CRISPR复合物形成的元件。通常来说,“靶序列”通常是指指导序列被设计为具有互补性的序列,其中靶序列与指导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。如果存在足够的互补性以引起杂交并促进CRISPR复合物的形成,则并非必须需要完全互补性。
CRISPR系统可以在靶位点处诱导双链断裂(double stranded break,DSB),随后如本文中所述进行破坏或改变。在另一些方面中,被认为是“切口酶”的Cas9变体用于在靶位点处使单链产生切口。可使用成对的切口酶,例如以提高特异性,每种酶均由不同的gRNA靶向序列对来指导,以使得在同时引入切口时,引入5’突出端。在另一些方面中,将无催化活性的Cas9与异源效应物结构域例如转录阻遏物或激活物融合,以影响基因表达。
靶序列可包含任何多核苷酸,例如DNA或RNA多核苷酸。靶序列可位于细胞的核或胞质中,例如在细胞的细胞器内。一般而言,可用于重组为包含靶序列的靶基因座的序列或模板被称为“编辑模板”或“编辑多核苷酸”或“编辑序列”。在一些方面中,外源模板多核苷酸可被称为编辑模板。在一些方面中,重组是同源重组。
通常来说,在内源性CRISPR系统的背景下,CRISPR复合物(包含与靶序列杂交并与一种或更多种Cas蛋白复合的指导序列)的形成导致靶序列中或其附近(例如,距靶序列1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多个碱基对内)的一条或两条链的切割。可包含野生型tracr序列的全部或一部分(例如,野生型tracr序列的至多、至少或约20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,个或更多个核苷酸)或者由其组成的tracr序列也可形成CRISPR复合物的一部分,例如通过沿tracr序列的至少一部分与和指导序列可操作地连接的tracr伴侣序列的全部或一部分进行杂交。tracr序列与tracr伴侣序列具有足够的互补性以进行杂交并参与CRISPR复合物的形成,例如当进行最佳比对时,沿tracr伴侣序列的长度至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的序列互补性。
可以将驱动CRISPR系统的一个或更多个元件表达的一个或更多个载体引入到细胞中(例如,通过电穿孔),使得CRISPR系统的元件的表达在一个或更多个靶位点处指导CRISPR复合物的形成。一些组件也可以作为蛋白质和/或RNA和/或核糖核蛋白递送至细胞。例如,Cas酶、与tracr伴侣序列连接的指导序列以及tracr序列可各自可操作地连接至单独载体上的单独调节元件。或者,可将由相同或不同调节元件表达的两个或更多个元件组合在单一载体中,同时一个或更多个另外的载体提供不包含在第一载体中的CRISPR系统的任何组件。载体可包含一个或更多个插入位点,例如限制性内切核酸酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在一些方面中,一个或更多个插入位点位于一个或更多个载体的一个或更多个序列元件的上游和/或下游。当使用多个不同的指导序列时,可使用单一表达构建体以将CRISPR活性靶向到细胞内的多个不同的相应靶序列。
载体可包含可操作地连接至编码CRISPR酶(例如Cas蛋白)的酶编码序列的调节元件。Cas蛋白的一些非限制性实例包括Cas1,Cas1B,Cas2,Cas3,Cas4,Cas5,Cas6,Cas7,Cas8,Cas9(也称为Csn1和Csx12),Cas10,Csy1,Csy2,Csy3,Cse1,Cse2,Csc1,Csc2,Csa5,Csn2,Csm2,Csm3,Csm4,Csm5,Csm6,Cmr1,Cmr3,Cmr4,Cmr5,Cmr6,Csb1,Csb2,Csb3,Csx17,Csx14,Csx10,Csx16,CsaX,Csx3,Csx1,Csx15,Csf1,Csf2,Csf3,Csf4,其同源物,或其经修饰的形式。这些酶是已知的;例如,酿脓链球菌(S.pyogenes)Cas9蛋白的氨基酸序列可以以登录号Q99ZW2见于数据库中。
CRISPR酶可以是Cas9(例如来自酿脓链球菌或肺炎链球菌(S.pneumonia))。CRISPR酶可指导在靶序列的位置处,例如在靶序列内和/或在靶序列的互补序列内的一条或两条链的切割。载体可编码相对于相应的野生型酶突变的CRISPR酶,以使得突变的CRISPR酶缺乏切割包含靶序列的靶多核苷酸的一条或两条链的能力。例如,来自酿脓链球菌的Cas9的RuvC I催化结构域中的天冬氨酸至丙氨酸的替换(D10A)将Cas9从切割两条链的核酸酶转换为切口酶(切割单链)。在一些方面中,Cas9切口酶可与指导序列(例如两个指导序列)组合使用,所述指导序列分别靶向DNA靶标的有义和反义链。该组合允许这两条链均产生切口并用于诱导NHEJ或HDR。
在一些方面中,对编码CRISPR酶的酶编码序列进行密码子优化以在特定细胞,例如真核细胞中表达。真核细胞可以是特定生物体的那些或者源自所述特定生物体,例如哺乳动物,其包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗或非人灵长类。一般而言,密码子优化是指在维持天然氨基酸序列的同时,通过用目的宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天然序列的至少一个密码子来修饰核酸序列以在该宿主细胞中增强表达的过程。多种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏好。密码子偏倚(生物体之间密码子使用的差异)通常与信使RNA(messenger RNA,mRNA)的翻译效率相关,而信使RNA(mRNA)的翻译效率又被认为取决于被翻译的密码子的性质和特定转移RNA(transfer RNA,tRNA)分子的可用性等。细胞中所选tRNA的优势通常反映了肽合成中最常使用的密码子。因此,可以基于密码子优化来定制基因以在给定生物体中实现最佳基因表达。
一般而言,指导序列是与靶多核苷酸序列具有足够互补性以与靶序列杂交并且引导CRISPR复合物与靶序列序列特异性地结合的任何多核苷酸序列。在一些方面中,当使用合适的比对算法进行最佳比对时,指导序列与其对应的靶序列之间的互补性程度为约或大于约50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更高。
最佳比对可通过使用用于比对序列的任何合适的算法来确定,所述算法的一些非限制性实例包括史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman algorithm);内德勒曼-温施算法(Needleman-Wunsch algorithm);基于伯劳斯-惠勒变换(Burrows-Wheeler Transform)的算法(例如,伯劳斯-惠勒比对器(Burrows Wheeler Aligner));Clustal W;Clustal X;BLAT;Novoalign(Novocraft Technologies);ELAND(San Diego,Calif.);SOAP(可在soap.genomics.org.cn上获得)以及Maq(可在maq.sourceforge.net上获得)。
CRISPR酶可以是包含一个或更多个异源蛋白质结构域的融合蛋白的一部分。CRISPR酶融合蛋白可包含任何另外的蛋白质序列,以及任选地在任何两个结构域之间的接头序列。可与CRISPR酶融合的蛋白质结构域的一些实例包括但不限于表位标签、报道基因序列和具有以下活性中的一种或更多种的蛋白质结构域:甲基化酶活性、去甲基化酶活性、转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。表位标签的一些非限制性实例包括组氨酸(histidine,His)标签、V5标签、FLAG标签、流感血凝素(influenza hemagglutinin,HA)标签、Myc标签、VSV-G标签和硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)标签。报道基因的一些实例包括但不限于谷胱甘肽-5-转移酶(glutathione-5-transferase,GST)、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)、氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)β半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein,CFP)、黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)和自发荧光蛋白,包括蓝色荧光蛋白(blue fluorescent protein,BFP)。CRISPR酶可与编码结合DNA分子或结合其他细胞分子的蛋白质或蛋白质片段的基因序列融合,所述蛋白质或蛋白质片段包括但不限于麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)、S标签、Lex A DNA结合结构域(DNA binding domain,DBD)融合体、GAL4A DNA结合结构域融合体以及单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)BP16蛋白质融合体。可形成包含CRISPR酶的融合蛋白的一部分的另外结构域描述于US 20110059502中,其通过引用并入本文。
d.载体
治疗性多核苷酸、蛋白质、核糖核蛋白或肽可通过组合物中的核酸分子来编码。在某些方面中,核酸分子可以是核酸载体的形式。
术语“载体”是用于指其中可以插入异源核酸序列以用于引入到其可以被复制和表达的细胞中的载体核酸分子。核酸序列可以是“异源的”,这意味着核酸序列在对其中已引入载体的细胞或其被并入的核酸而言是外来的背景中,其包含与该细胞中的序列或该核酸同源的但在宿主细胞或核酸内其通常不存在的位置中的序列。载体包括DNA、RNA、质粒、黏粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如,YAC)。本领域技术人员通过标准重组技术(例如,Sambrook等,2001;Ausubel等,1996,二者都通过引用并入本文)将很熟练地构建载体。
术语“表达载体”是指包含编码至少部分基因产物的核酸序列的载体,其能够被转录或稳定地整合到宿主细胞的基因组中并随后被转录。在一些情况下,然后将核酸分子翻译成蛋白质、多肽或肽。为了表达多核苷酸、蛋白质、核糖核蛋白或肽,将编码多核苷酸、蛋白质、核糖核蛋白或肽的DNA插入到表达载体中,使得基因区域与转录和翻译“控制序列”有效连接。表达载体可以包含多种“控制序列”,其是指在特定宿主生物体中转录并可以翻译可操作地连接的编码序列所需的核酸序列。除了控制转录和翻译的控制序列之外,载体和表达载体还可包含用于其他功能的并且在本文中所述的核酸序列。
通常,在任何宿主细胞中使用的表达载体包含用于质粒或病毒维持以及用于外源核苷酸序列的克隆和表达的序列。统称为“侧翼序列”的这样的序列通常包含以下有效地连接的核苷酸序列中的一种或更多种:启动子、一种或更多种增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和接受体剪接位点的完整内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、多腺苷酸化序列、用于插入编码待表达多肽的核酸的多接头区、以及选择标志物元件。这样的序列和使用它们的方法是本领域公知的。
“启动子”是控制序列。启动子通常是核酸序列中控制转录起始和速率的区域。启动子可包含调节蛋白和分子(例如RNA聚合酶和其他转录因子)可结合的基因元件。短语“有效定位”,“有效连接”、“在控制下”和“在转录控制下”意指启动子相对于核酸序列处于正确的功能位置和/或取向以控制该序列的转录起始和表达。启动子可与或可不与“增强子”联合使用,所述“增强子”是指参与核酸序列的转录激活的顺式作用调节序列。
用于控制肽或蛋白质表达的编码多核苷酸的特定启动子不被认为是关键的,只要其能够在靶细胞,优选细菌细胞中表达多核苷酸即可。在靶向人细胞的情况下,优选将多核苷酸编码区域定位在能够在人细胞中表达的启动子附近并在其控制下。一般而言,这样的启动子可包括细菌、人或病毒启动子。
特定起始信号也可以是编码序列的有效翻译所需要的。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可能需要提供外源翻译控制信号,包括ATG起始密码子。本领域普通技术人员将能够容易地确定这一点并提供必要的信号。
载体可包含多克隆位点(multiple cloning site,MCS),其是包含多个限制酶位点的核酸区域,其中任一个可以与标准重组技术结合使用来消化载体。(参见Carbonelli等,1999,Levenson等,1998和Cocea,1997,通过引用并入本文)。
大多数转录的真核RNA分子将经历RNA剪接以从初级转录物中去除内含子。包含基因组真核序列的载体可需要供体和/或接受体剪接位点以确保转录物的正确加工用于蛋白质表达。(参见Chandler等,1997,通过引用并入本文)。
载体或构建体一般将包含至少一个终止信号。“终止信号”或“终止子”由通过RNA聚合酶参与RNA转录物的特异性终止的DNA序列构成。因此,在某些方面中,考虑了终止RNA转录物产生的终止信号。终止子可以是在体内必需的以达到期望的信息水平。在真核系统中,终止子区域还可包含允许对新转录物进行位点特异性切割以暴露多腺苷酸化位点的特异性DNA序列。其发出信号使特化的内源聚合酶将一段约200个A残基(polyA)添加至转录物的3’端。用该polyA尾修饰的RNA分子显示出更稳定并且翻译效率更高。因此,在涉及真核生物的另一些方面中,优选该终止子包含用于RNA切割的信号,并且更优选地终止子信号促进信使的多腺苷酸化。在基因表达,特别是真核基因表达中,通常包含多腺苷酸化信号以实现转录物的适当多腺苷酸化。
为了在宿主细胞中增殖载体,所述载体还可包含一个或更多个复制起始位点(一般被称为“ori”),其是在此处起始复制的特异性核酸序列。或者,如果宿主细胞是酵母,则可以使用自主复制序列(autonomously replicating sequence,ARS)。
一些载体可利用允许所述载体在原核和真核细胞二者中均复制和/或表达的控制序列。本领域技术人员还将理解孵育所有上述的宿主细胞以维持它们和允许载体复制的条件。还理解和已知允许大规模产生载体以及产生由载体编码的核酸及其同源多肽、蛋白质或肽的技术和条件。
在电穿孔过程期间载体的浓度可以是载体在电穿孔室和/或样品容器中的最终浓度。载体浓度可以为、可以为至少或可以为至多0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50、75、100、150、200、250、300至约350、400、500、1000、1500、2000、3000、4000、5000μg/mL,或者0.01μg/mL至5000μg/mL的任何值或其中可推导出的范围。在某些方面中,载体的浓度为至少10μg/mL。在另一些方面中,载体的浓度为至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275或300μg/mL,或者1μg/mL至300μg/mL的任何值或其中可推导出的范围。
考虑了表达标志物的表达载体可用于本公开内容。在另一些方面中,标志物在mRNA上而不是表达载体中编码。
在某些具体方面中,通过电穿孔转染到递送载剂中的组合物是非病毒的(即,不包含任何病毒组分)。考虑了非病毒方法可以降低毒性和/或改善方法的安全性。
e.标志物
在某些方面中,已经用本公开内容的组合物转染的细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体、组织、或其衍生物可通过在组合物中包含标志物来在体外或体内鉴定。这样的标志物赋予细胞可鉴定的变化,允许容易地鉴定已经用组合物转染的细胞。
一般来说,选择标志物是赋予允许选择的特性的标志物。阳性选择标志物是其中标志物的存在允许其选择的标志物,而阴性选择标志物是其中标志物的存在阻止其选择的标志物。在某些方面中,在电穿孔之后,通过阴性选择来选择已经将电穿孔组合物内化的递送载剂。在另一些方面中,在电穿孔之后,通过阳性选择来选择已经将电穿孔构建体内化的细胞。
阳性选择标志物的一个实例为药物抗性标志物或抗生素抗性基因/标志物。通常包含药物选择标志物有助于转化体的克隆和鉴定,例如赋予对新霉素(neomycin)、嘌呤霉素(puromycin)、潮霉素(hygromycin)、DHFR、GPT、博来霉素(zeocin)、G418、phleomycin、杀稻瘟素(blasticidin)和组氨醇的抗性的基因是可用的选择标志物。
在一些方面中,选择涉及使细胞暴露于一定浓度的选择剂,其将损害在电穿孔期间不表达选择抗性基因或不摄取选择抗性基因的细胞的生存力。在一些方面中,选择涉及使细胞暴露于条件性致死浓度的选择剂。在某些方面中,选择剂或化合物是抗生素。在另一些方面中,选择剂是单独或组合的G418(也被称为遗传霉素(geneticin)和G418硫酸酯)、嘌呤霉素、博来霉素(zeocin)、潮霉素、phleomycin或杀稻瘟素。在某些方面中,选择剂的浓度可以是、可以是至少、或可以是至多0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9,4,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9,5,5.1,5.2,5.3,5.4,5.5,5.6,5.7,5.8,5.9,6,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7.6.8,6.9,7,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6,7.7,7.8,7.9,8,8.1,8.2,8.3,8.4,8.5,8.6,8.7,8.8,8.9,9,9.1,9.2,9.3,9.4,9.5,9.6,9.7,9.8,9.9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200,210,220,230,240,250,260,270,280,290,300,310,320,330,340,350,360,370,380,390,400,410,420,430,440,450,460,470,480,490,或500μg/L,mg/L,或g/L,,或其中可推导出的任何范围或值。在某些方面中,选择剂的浓度为0.1μg/L至0.5μg/L、0.5μg/L至1μg/L、1μg/L至2μg/L、2μg/L至5μg/L、5μg/L至10μg/L、10μg/L至100μg/L、100μg/L至500μg/L、0.1mg/L至0.5mg/L、0.5mg/L至1mg/L、1mg/L至2mg/L、2mg/L至5mg/L、5mg/L至10mg/L、10mg/L至100mg/L、100mg/L至500mg/L、0.1g/L至0.5g/L、0.5g/L至1g/L、1g/L至2g/L、2g/L至5g/L、5g/L至10g/L、10g/L至100g/L、或100g/L至500g/L,或者0.1μg/L至500g/L的任何值或其中可推导出的范围。在某些方面中,选择剂的浓度为(y)g/L,其中“y”可以是任何值,包括但不限于0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100,或者0.01至100的任何值或其中可推导出的范围。在一些方面中,选择剂以至少、至多或约0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9,4,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9,5,5.1,5.2,5.3,5.4,5.5,5.6,5.7,5.8,5.9,6,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9,7,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6,7.7,7.8,7.9,8,8.1,8.2,8.3,8.4,8.5,8.6,8.7,8.8,8.9,9,9.1,9.2,9.3,9.4.9.5,9.6,9.7,9.8,9.9,或10g/L,或者0.1g/L至10g/L的任何值或其中可推导出的范围的条件性致死浓度存在于培养基中。
除了赋予允许基于条件的实施来区分转化体的表型的标志物之外,还考虑了其他类型的标志物,包括可筛选标志物(例如GFP)。在某些方面中,标志物为荧光标志物、酶标志物、发光标志物、可光活化标志物、光转化标志物或比色标志物。荧光标志物包括例如GFP和变体(例如YFP、RFP等)以及其他荧光蛋白(例如DsRed、mPlum、mCherry、YPet、Emerald、CyPet、T-Sapphire和Venus)。可光活化标志物包括例如KFP、PA-mRFP和Dronpa。光转化标志物包括例如mEosFP、KikGR和PS-CFP2。发光蛋白包括例如Neptune、FP595和phialidin。或者,可使用筛选酶,例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(thymidine kinase,tk)或氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)。本领域技术人员也知道如何使用免疫学标志物,其可以与FACS分析联合使用。选择标志物和筛选标志物的另外的实例是本领域技术人员公知的。
所使用的标志物可在RNA或DNA上编码。在一些方面中,标志物在RNA上编码。
IV.实施例
包括以下实施例以表明本公开内容的一些优选方面。本领域技术人员应理解,以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本公开内容的实践中发挥良好作用的技术,并且因此可以被认为是构成用于其实践的优选模式。然而,根据本公开内容,本领域技术人员应理解在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下,可以对所公开的具体方面进行许多改变,并且仍然获得相同或相似的结果。
A.实施例1-用mRNA对经扩增T细胞进行的重复电穿孔
图35示出了用两种不同的GFP mRNA浓度(100μg/mL和200μg/mL)对经扩增淋巴细胞进行顺序电穿孔的实验设计。在第0天,在用CD3/CD28珠扩增3天之后,将5×107个T细胞/mL悬浮在电穿孔(EP)缓冲液中。用+/-绿色荧光蛋白(GFP)mRNA进行电穿孔,并平板接种细胞。在第1天或第2天,将GFP表达细胞重悬于EP缓冲液中,并用GFP第二次进行电穿孔,并平板接种细胞。在第1至5天通过Nucleocounter测量细胞生存力,并在第3天和第4天通过流式细胞术测定GFP表达。
图36示出了在用GFP mRNA对经扩增淋巴细胞进行顺序电穿孔之后第3天和第4天的流式细胞术数据。所有经mRNA转染的细胞均为>95%GFP+。
图37A至37B示出了经受顺序电穿孔的淋巴细胞的细胞生存力和淋巴细胞设门。如通过淋巴细胞百分比和染料排除所评估的,连续数天在有或没有mRNA的情况下顺序电穿孔对细胞适合度产生的影响最小。将EP脉冲之间的间隙提高至48小时(第0天和第2天的顺序电穿孔)导致与在第0天和第1天的单次EP或顺序EP相比细胞适合度略低。
图38A示出了经顺序电穿孔的淋巴细胞的GFP表达,并且图38B示出了经顺序电穿孔的淋巴细胞的GFP平均荧光强度(MFI)。与单次EP相比,mRNA的顺序EP显著提高了转基因表达的水平和持续时间。
B.实施例2-用mRNA对经扩增T细胞进行的重复电穿孔,电穿孔能量的作用
针对本文中所述的实验,术语“能/能量”是指在向样品施加电脉冲(或组合脉冲)期间所产生的热,并且其与在电脉冲(或组合脉冲)期间向样品施加的场强和脉冲持续时间(或组合脉冲持续时间)二者均成比例。因此,为了向样品施加“高能量”脉冲,对变量包括场强和脉冲持续时间(或组合脉冲持续时间)的比例进行修改,使得与当向样品施加“中等能量”或“低能量”电脉冲(或组合脉冲)时相比,在电脉冲(或组合脉冲)期间产生更大量的热,前提是缓冲液组成、处理组件和样品体积保持恒定。相反,为了向样品施加“低能量”脉冲,对变量包括场强和脉冲持续时间(或组合脉冲持续时间)的比例进行修改,使得与当向样品施加“高能量”或“中等能量”电脉冲(或组合脉冲)时相比,在电脉冲(或组合脉冲)期间产生更少量的热,前提是缓冲液组成、处理组件和样品体积保持恒定。
图39A至39E示出了用两种不同的GFP mRNA浓度(100μg/mL和200μg/mL)在不同EP能量下对经扩增淋巴细胞进行顺序电穿孔的实验设计。在图39A中,淋巴细胞在第0天经受第一中等能量电脉冲,随后在第1天经受第二低能量电脉冲。在第0天的第一中等能量电脉冲使用1.5kV/cm的初始场强,并且在第1天的第二低能量电脉冲使用1.3kV/cm的初始场强。在图39B中,淋巴细胞在第0天经受第一中等能量电脉冲,随后在第1天经受第二高能量电脉冲。在第0天的第一中等能量电脉冲使用1.5kV/cm的初始场强,并且在第1天的第二高能量电脉冲使用1.88kV/cm的初始场强。在图39C中,淋巴细胞在第0天经受第一中等能量电脉冲,随后在第1天经受第二中等能量电脉冲。在第0天的第一中等能量电脉冲使用1.5kV/cm的初始场强,并且在第1天的第二中等能量电脉冲使用1.5kV/cm的初始场强。在图39D中,淋巴细胞在第0天经受第一高能量电脉冲,随后在第1天经受第二低能量电脉冲。在第0天的第一高能量电脉冲使用1.88kV/cm的初始场强,并且在第1天的第二低能量电脉冲使用1.3kV/cm的初始场强。在图39E中,淋巴细胞在第0天经受第一高能量电脉冲,随后在第1天经受第二中等能量电脉冲。在第0天的第一高能量电脉冲使用1.88kV/cm的初始场强,并且在第1天的第二中等能量电脉冲使用1.5kV/cm的初始场强。
图40A至40B示出了在用两种不同的GFP mRNA浓度(100μg/mL和200μg/mL)在不同的EP能量下对经扩增淋巴细胞进行顺序电穿孔之后三个不同的时间点(24小时、48小时和72小时)时表达GFP mRNA的淋巴细胞群。
经受第一中等能量电脉冲的细胞的淋巴细胞群在图40A(Ex-T细胞2)中示出。淋巴细胞经受了如图39A所述和所示的第一中等能量电脉冲和第二低能量电脉冲(图40A,Ex-T细胞1);如图39B所述和所示的第一中等能量电脉冲和第二高能量电脉冲(图40A,Ex-T细胞3);以及如图39C所述和所示的第一中等能量电脉冲和第二中等能量电脉冲(图40A,Ex-T细胞2)。
经受第一高能量电脉冲的细胞的淋巴细胞群在图40B(Ex-T细胞3)中示出。淋巴细胞经受了如图39D所述和所示的第一高能量电脉冲和第二低能量电脉冲(图40B,Ex-T细胞1);以及如图39E所述和所示的第一高能量电脉冲和第二中等能量电脉冲(图40B,Ex-T细胞2)。
将在细胞经受第一中等能量电脉冲或第一高能量电脉冲和经受第二低、中等、或高能量电脉冲之后的淋巴细胞群数据进行比较,对于图39A至39E所述和所示的所有五种能量组合,在不同EP能量下对经扩增淋巴细胞进行顺序电穿孔之后,淋巴细胞恢复是相当的。
图41A至41B示出了对于图39A至39E所述和所示的所有五种EP能量组合,在不同EP能量下对经扩增淋巴细胞进行顺序电穿孔之后,淋巴细胞生存力是相当的。
图42A至42B示出了在用两种不同的GFP mRNA浓度(100μg/mL和200μg/mL)在不同的EP能量下对经扩增淋巴细胞进行顺序电穿孔之后三个不同的时间点(24小时、48小时和72小时)时淋巴细胞的GFP表达。
经受第一中等能量电脉冲的淋巴细胞的GFP表达在图42A(Ex-T细胞2)中示出。图42A提供了经受如图39A所述和所示的第一中等能量电脉冲和第二低能量电脉冲(Ex-T细胞1)的淋巴细胞的GFP表达。图42A提供了经受如图39B所述和所示的第一中等能量电脉冲和第二高能量电脉冲(Ex-T细胞3)的淋巴细胞的GFP表达。最后,图42A提供了经受如图39C所述和所示的第一中等能量电脉冲和第二中等能量电脉冲(Ex-T细胞2)的淋巴细胞的GFP表达。
经受第一高能量电脉冲的淋巴细胞的GFP表达在图42B(Ex-T细胞3)中示出。图42B提供了经受如图39D所述和所示的第一高能量电脉冲和第二低能量电脉冲(Ex-T细胞1)的淋巴细胞的GFP表达。图42B还提供了经受如图39E所述和所示的第一高能量电脉冲和第二中等能量电脉冲(Ex-T细胞2)的淋巴细胞的GFP表达。
将在细胞经受第一中等能量电脉冲或第一高能量电脉冲和经受第二低、中等或高能量电脉冲之后的淋巴细胞GFP表达进行比较,对于图39A至39E所述和所示的所有五种EP能量组合,在不同EP能量下对经扩增淋巴细胞进行顺序电穿孔之后,GFP表达是相当的。
图43A至43B示出了在用两种不同的GFP mRNA浓度(100μg/mL和200μg/mL)在不同的EP能量下对经扩增淋巴细胞进行顺序电穿孔之后三个不同的时间点(24小时、48小时和72小时)时淋巴细胞的GFP平均荧光强度(MFI)。
经受第一中等能量电脉冲的淋巴细胞的GFP MFI在图43A(Ex-T细胞2)中示出。图43A提供了经受如图39A所述和所示的第一中等能量电脉冲和第二低能量电脉冲(Ex-T细胞1)的淋巴细胞的GFP MFI。图43A还提供了经受如图39B所述和所示的第一中等能量电脉冲和第二高能量电脉冲(Ex-T细胞3)的淋巴细胞的GFP MFI。最后,图43A提供了经受如图39C所述和所示的第一中等能量电脉冲和第二中等能量电脉冲(Ex-T细胞2)的淋巴细胞的GFPMFI。
经受第一高能量电脉冲的淋巴细胞的GFP MFI在图43B(Ex-T细胞3)中示出。图43B提供了经受如图39D所述和所示的第一高能量电脉冲和第二低能量电脉冲(Ex-T细胞1)的淋巴细胞的GFP MFI。图43B还提供了经受如图39E所述和所示的第一高能量电脉冲和第二中等能量电脉冲(Ex-T细胞2)的淋巴细胞的GFP MFI。在淋巴细胞经受第一高能量电脉冲的情况下观察到较高的MFI。
这些数据表明,相较于单次电穿孔,连续数天用mRNA对细胞进行重复电穿孔导致显著更高的转基因表达。经活化T细胞可以使用所述的能量电脉冲排列进行顺序电穿孔,因为对于多种能量电脉冲排列,在淋巴细胞群、细胞生存力和GFP表达之间没有重大差异。
C.实施例3-经活化T细胞的重复电穿孔和序列基因编辑
图44示出了用两种不同的核糖核蛋白(RNP)构建体对经活化T细胞进行顺序电穿孔以敲除TRAC和PD1的实验设计。如图44A和44B中所示,将PBMC解冻,并在第0天通过用100IU/mL IL2、10ng/mL IL-7和5ng/mL IL-15以及1:2.5的细胞/珠之比的抗CD3/CD28缀合磁珠来培养2×106个/mL的细胞两天来使T细胞活化。图45示出了CD3+-和CD25+-染色的T细胞在用细胞因子和CD3/CD28珠孵育2天之后,如通过荧光激活细胞分选(Fluorescence-activated cell sorting,FACS)测量的T细胞的活化。
在活化两天之后,在第2天,将1×108个T细胞/mL洗涤,悬浮在50μL总反应体积的电穿孔缓冲液中(5×106个细胞),并用来自TRAC RNP的30.5μM储备液的2μM TRAC核糖核蛋白(RNP)进行电穿孔,所述TRAC RNP的30.5μM储备液包含通过将61μM野生型Cas9与122μM TRAC sgRNA/>混合而制备的1:2的Cas9:sgRNA。在第2天的第一高能量电穿孔使用了初始场强为1.7kV/cm的电脉冲(T细胞3方案)。在用于TRAC敲除的电穿孔之后,使T细胞在37℃、5%CO2下恢复20分钟。然后,将2×106个经电穿孔的T细胞/mL培养24小时,在此之后添加100IU/mL IL2、10ng/mL IL-7和5ng/mL IL-15。还测试了无静置条件,在所述无静置条件下在用于TRAC敲除的电穿孔之后,细胞未在37℃、5%CO2下静置20分钟而是立即转移以培养24小时。
在第3天,将4×107个T细胞/mL洗涤,悬浮在50μL总反应体积的电穿孔缓冲液中(2×106个细胞),并用来自PD1RNP的30.5μM储备液的2μM PD1核糖核蛋白(RNP)进行电穿孔,所述PD1RNP的30.5μM储备液包含通过将61μM野生型Cas9与122μMPD1sgRNA/>混合而制备的1:2的Cas9:sgRNA。在第3天的第二中等能量电穿孔使用了初始场强为1.5kV/cm的电脉冲(T细胞2方案)。在用于PD1敲除的电穿孔之后,使T细胞在37℃、5%CO2下恢复20分钟。然后,将2×106个经电穿孔的T细胞/mL培养24小时,在此之后添加100IU/mL IL2、10ng/mL IL-7和5ng/mL IL-15,并用CD3/CD28珠以1:2.5的细胞/珠之比重新刺激细胞。
实验对照包括经活化但未经受电穿孔的T细胞、以及经受在第2天使用初始场强为1.7kV/cm的电脉冲在没有RNP或其他药剂的情况下进行的第一高能量电穿孔的经活化T细胞(T细胞3方案)。
在第6天,在用于TRAC敲除的电穿孔之后4天和在用于PD1敲除的电穿孔之后3天,添加100IU/mL IL2、10ng/mL IL-7和5ng/mL IL-15,并进行FACS以评估超过30000个已收集事件的TRAC和PD1敲除效率。图46A示出了未染色T细胞的代表性设门。图46B示出了用于实验的TRAC+和PD1+T细胞的代表性设门,其中T细胞没有针对TRAC和PD1敲除用RNP进行电穿孔。图46C示出了用于实验的TRAC+和PD1+T细胞的代表性设门,其中T细胞针对TRAC和PD1敲除用RNP进行了电穿孔。对针对图44A至44B中所述的每种电穿孔条件在第6天获得的FACS数据进行定量,以显示图46D中的T细胞群与T细胞生存力以及图46E中的TRAC和PD1敲除效率。如图46D中所示,T细胞生存力受用于连续编辑细胞的顺序电穿孔的影响最小,因为在第一和第二电穿孔事件二者之后的细胞生存力与其中未进行电穿孔的对照类似。如图46E中所示,两种不同RNP的顺序电穿孔可对TRAC和PD1基因座产生高敲除效率,其中在RNP电穿孔之后TRAC和PD1表达二者都降低至小于5%。另外,如图46F中所示,与在TRAC RNP电穿孔之后未在37℃、5%CO2下静置20分钟而是立即转移以培养24小时的经TRAC RNP电穿孔的T细胞相比,在电穿孔之后允许经TRAC RNP电穿孔的T细胞在37℃、5%CO2下静置20分钟然后培养24小时没有提高TRAC敲除效率。
在第6天还进行了FACS以测量来自30μL经培养细胞的总细胞和淋巴细胞计数,以评估在37℃、5%CO2下持续20分钟的细胞静置期对在用RNP构建体进行电穿孔以敲除TRAC之后细胞生存力的作用。未染色和活/死的7-氨基放线菌素D(7-aminoactinomycin D,7-AAD)染色的T细胞的设门在图47A中示出。如图47B至47E中所示,对淋巴细胞群(图47B)、淋巴细胞生存力(图47C)、总细胞计数(图47D)和总的有生存力的淋巴细胞计数(图47E)的影响也最小,其中与在电穿孔之后在37℃、5%CO2下静置20分钟的T细胞相比,在无静置条件下具有约5%更少的活淋巴细胞计数。
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以上说明书和实例提供了对说明性方面的结构和使用的完整描述。尽管上面已经以一定程度的特定性或参考一个或更多个单独的方面描述了某些方面,但本领域技术人员可以在不脱离本发明的范围的情况下对所公开的方面进行许多改变。因此,该方法和系统的多个说明性方面不旨在限于所公开的特定形式。相反,其包括落入权利要求书范围内的所有修改和替代方案,并且除了所示方面之外的一些方面可以包括所描述的方面的一些或全部特征。例如,一些要素可以被省略或组合为单一的结构,和/或连接可以被替换。此外,在合适的情况下,上述任何实例的一些方面可以与所描述的任何其他实例的一些方面组合,以形成具有相当的或不同的特性和/或功能,并解决相同或不同问题的另一些实例。类似地,将理解,上述益处和优点可以涉及一个方面或者可以涉及数个方面。
权利要求书不旨在包括、并且不应被解释为包括手段加功能限制或步骤加功能限制,除非在给定的权利要求书中分别使用短语“用于……的手段”或“用于……的步骤”明确陈述了这样的限制。
Claims (172)
1.电穿孔方法,其包括:
根据第一方案,使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;以及
根据第二方案,使所述样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;
其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。
2.电穿孔方法,其包括:
根据第一方案,使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;
允许所述样品恢复至少24小时;以及
根据第二方案,使所述样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间。
3.电穿孔方法,其包括:
根据第一方案,使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;
允许所述样品恢复至少24小时;以及
根据第二方案,使所述样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;
其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。
4.连续编辑细胞基因的方法,其包括:
根据第一方案,使包含一个或更多个完整细胞的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使所述细胞加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;以及
根据第二方案,使所述样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使所述细胞加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;
其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。
5.连续编辑细胞基因的方法,其包括:
根据第一方案,使包含一个或更多个完整细胞的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使所述细胞加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;
允许所述样品恢复至少24小时;以及
根据第二方案,使所述样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使所述细胞加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间。
6.连续编辑细胞基因的方法,其包括:
根据第一方案,使包含一个或更多个完整细胞的样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使所述细胞加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;
允许所述样品恢复至少24小时;以及
根据第二方案,使所述样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使所述细胞加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;
其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法,其中所述第一药剂和第二药剂是相同的药剂。
8.权利要求1至6中任一项所述的方法,其中所述第一药剂和第二药剂是不同的药剂。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法,其中所述第一药剂和第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。
10.权利要求9所述的方法,其中所述核酸是RNA,并且其中所述RNA是mRNA、miRNA、shRNA、siRNA或反义寡核苷酸。
11.权利要求9所述的方法,其中所述核酸是DNA,并且其中所述DNA是反义寡核苷酸、载体或双义线性DNA。
12.权利要求9所述的方法,其中所述蛋白质是核糖核蛋白。
13.权利要求12所述的方法,其中所述核糖核蛋白包含Cas9蛋白和指导RNA。
14.电穿孔方法,其包括:
(a)根据第一方案,使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含RNA的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;
(b)允许所述细胞样品恢复至少24小时;以及
(c)根据第二方案,使所述细胞样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含RNA的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;
其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。
15.电穿孔方法,其包括:
(a)根据第一方案,使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含DNA的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;
(b)允许所述细胞样品恢复至少24小时;以及
(c)根据第二方案,使所述细胞样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含DNA的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;
其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。
16.电穿孔方法,其包括:
(a)根据第一方案,使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含一种或更多种蛋白质的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;
(b)允许所述细胞样品恢复至少24小时;以及
(c)根据第二方案,使所述细胞样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含一种或更多种蛋白质的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;
其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。
17.连续编辑细胞的方法,其包括:
(a)根据第一方案,使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲,所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含核糖核蛋白的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间;
(b)允许所述细胞样品恢复至少24小时;以及
(c)根据第二方案,使所述细胞样品经受第二电脉冲,所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含核糖核蛋白的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间;
其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。
18.权利要求14至17中任一项所述的方法,其中所述第一药剂和第二药剂是相同的药剂。
19.权利要求14至17中任一项所述的方法,其中所述第一药剂和第二药剂是不同的药剂。
20.权利要求14至19中任一项所述的方法,其中所述第一药剂和第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。
21.权利要求20所述的方法,其中所述核酸是RNA,并且其中所述RNA是mRNA、miRNA、shRNA、siRNA或反义寡核苷酸。
22.权利要求20所述的方法,其中所述核酸是DNA,并且其中所述DNA是反义寡核苷酸、载体或双义线性DNA。
23.权利要求20所述的方法,其中所述蛋白质是核糖核蛋白。
24.权利要求23所述的方法,其中所述核糖核蛋白包含Cas9蛋白和指导RNA。
25.权利要求1至24中任一项所述的方法,其还包括在所述第一电脉冲和/或第二电脉冲之后的静置步骤。
26.权利要求25所述的方法,其中所述静置步骤包括将所述样品孵育10至30分钟。
27.权利要求25或权利要求26所述的方法,其中所述静置步骤包括在25℃至50℃下孵育所述样品。
28.权利要求25至27中任一项所述的方法,其中所述静置步骤包括在3%至8%CO2下孵育所述样品。
29.权利要求1至19中任一项所述的方法,其中所述样品在所述第一电脉冲和/或第二电脉冲之后不经受静置步骤。
30.权利要求1至29中任一项所述的方法,其中所述第一场强等于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间长于所述第二脉冲持续时间。
31.权利要求1至29中任一项所述的方法,其中所述第一场强等于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间短于所述第二脉冲持续时间。
32.权利要求1至29中任一项所述的方法,其中所述第一场强小于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间等于所述第二脉冲持续时间。
33.权利要求1至29中任一项所述的方法,其中所述第一场强大于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间等于所述第二脉冲持续时间。
34.权利要求1至29中任一项所述的方法,其中所述第一场强小于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间长于所述第二脉冲持续时间。
35.权利要求1至29中任一项所述的方法,其中所述第一场强大于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间长于所述第二脉冲持续时间。
36.权利要求1至29中任一项所述的方法,其中所述第一场强小于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间短于所述第二脉冲持续时间。
37.权利要求1至29中任一项所述的方法,其中所述第一场强大于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间短于所述第二脉冲持续时间。
38.权利要求1至37中任一项所述的方法,其中所述第一场强和第一脉冲持续时间产生第一总施加电能并且所述第二场强和第二脉冲持续时间产生第二总施加电能,并且其中所述第一总施加电能不同于所述第二总施加电能。
39.权利要求38所述的方法,其中所述第一总施加电能大于所述第二总施加电能。
40.权利要求1至39中任一项所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数。
41.权利要求40所述的方法,其中所述电脉冲的电压幅值为0.001伏特至10,000伏特、0.01伏特至10,000伏特、0.1伏特至10,000伏特、1伏特至10,000伏特、1伏特至9,000伏特、1伏特至8,000伏特、1伏特至7,000伏特、1伏特至6,000伏特、1伏特至5,000伏特、1伏特至4,000伏特、1伏特至3,000伏特、1伏特至2,000伏特、或1伏特至1,000伏特。
42.权利要求40或权利要求41所述的方法,其中所述电脉冲的电压幅值为100伏特至900伏特。
43.权利要求40至42中任一项所述的方法,其中所述样品的电导率是这样的参数的函数,所述参数包括电穿孔缓冲液的离子组成、待被加载到所述细胞中的药剂的浓度、细胞密度、温度和压力。
44.权利要求40至43中任一项所述的方法,其中所述样品的电导率为0.01西门子/米至10西门子/米、0.01西门子/米至1西门子/米、0.1西门子/米至10西门子/米、0.1西门子/米至1西门子/米、或1西门子/米至10西门子/米。
45.权利要求40至44中任一项所述的方法,其中所述样品的电导率为1.0至3.0西门子/米。
46.权利要求40至45中任一项所述的方法,其中所述第一场强和第二场强还是电穿孔室的几何形状的函数。
47.权利要求46所述的方法,其中所述电穿孔室包含0.001cm至10cm、0.001cm至1cm、0.01cm至10cm、0.01cm至1cm、0.1cm至10cm、0.1cm至1cm、或1cm至10cm的电极间隙。
48.权利要求46或权利要求47所述的方法,其中所述电穿孔室包含0.01cm至1cm的电极间隙。
49.权利要求1至48中任一项所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强为0.01kV/cm至10kV/cm、0.01kV/cm至1kV/cm、0.1kV/cm至10kV/cm、0.1kV/cm至1kV/cm、或1kV/cm至10kV/cm。
50.权利要求1至49中任一项所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强为0.3kV/cm至3kV/cm。
51.权利要求1至50中任一项所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一脉冲持续时间和第二脉冲持续时间为10-6秒至10秒、10-6秒至1秒、10-3秒至10秒、或10-3秒至1秒。
52.权利要求1至51中任一项所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一脉冲持续时间和第二脉冲持续时间为1微秒至100毫秒。
53.权利要求1至52中任一项所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征。
54.权利要求53所述的方法,其中所述脉冲数为1个脉冲至1000个脉冲、1个脉冲至900个脉冲、1个脉冲至800个脉冲、1个脉冲至700个脉冲、1个脉冲至600个脉冲、1个脉冲至500个脉冲、1个脉冲至400个脉冲、1个脉冲至300个脉冲、1个脉冲至200个脉冲、1个脉冲至100个脉冲、1个脉冲至90个脉冲、1个脉冲至80个脉冲、1个脉冲至70个脉冲、1个脉冲至60个脉冲、1个脉冲至50个脉冲、1个脉冲至40个脉冲、1个脉冲至30个脉冲、1个脉冲至20个脉冲、或1个脉冲至10个脉冲。
55.权利要求53或权利要求54所述的方法,其中所述脉冲数为1个脉冲至130个脉冲。
56.权利要求53至55中任一项所述的方法,其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数。
57.权利要求56所述的方法,其中所述指数衰减率是所述样品的电阻和用于实现电穿孔的电源的电容的函数。
58.权利要求57所述的方法,其中所述样品的电阻为1欧姆至10000欧姆、1欧姆至9000欧姆、1欧姆至8000欧姆、1欧姆至7000欧姆、1欧姆至6000欧姆、1欧姆至5000欧姆、1欧姆至4000欧姆、1欧姆至3000欧姆、1欧姆至2000欧姆、1欧姆至1000欧姆、1欧姆至900欧姆、1欧姆至800欧姆、1欧姆至700欧姆、1欧姆至600欧姆、1欧姆至500欧姆、1欧姆至400欧姆、1欧姆至300欧姆、1欧姆至200欧姆、1欧姆至100欧姆、1欧姆至90欧姆、1欧姆至80欧姆、1欧姆至70欧姆、1欧姆至60欧姆、1欧姆至50欧姆、1欧姆至40欧姆、1欧姆至30欧姆、1欧姆至20欧姆、或1欧姆至10欧姆。
59.权利要求57或权利要求58所述的方法,其中所述样品的电阻为1欧姆至1000欧姆。
60.权利要求57至59中任一项所述的方法,其中所述电源电容为1μF至1,000,000μF、1μF至100,000μF、1μF至10,000μF、1μF至1,000μF、或1μF至100μF。
61.权利要求57至60中任一项所述的方法,其中所述电源电容为1000μF至5000μF。
62.权利要求53至61中任一项所述的方法,其中所述脉冲形状是方波脉冲或指数衰减波脉冲。
63.权利要求53至62中任一项所述的方法,其中所述脉冲模式包括与所述第一脉冲或第二脉冲的持续时间相对应的单脉冲。
64.权利要求53至62中任一项所述的方法,其中所述脉冲模式包括多脉冲,其中所述多脉冲的组合持续时间与所述第一脉冲或第二脉冲的持续时间相对应。
65.权利要求53至64中任一项所述的方法,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的极性为正或负。
66.权利要求1至65中任一项所述的方法,其中在所述样品经受所述第一脉冲之后至少12小时至至少48小时使所述样品经受所述第二电脉冲。
67.权利要求66所述的方法,其中在所述样品经受所述第一脉冲之后至少24小时使所述样品经受所述第二电脉冲。
68.权利要求1至67中任一项所述的方法,其中所述方法通过具有包含指令的非暂态计算机可读介质的电穿孔系统进行,所述指令当由处理器执行时引起所述处理器执行所述第一方案和第二方案以对所述样品进行电穿孔。
69.权利要求1至68中任一项所述的方法,其中所述电穿孔系统包含流式电穿孔设备,并且其中当所述样品在所述流式电穿孔设备内流动时使所述样品经受所述电脉冲。
70.权利要求1至69中任一项所述的方法,其中所述细胞是哺乳动物细胞。
71.权利要求70所述的方法,其中所述细胞是人细胞、鼠细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞或灵长类细胞。
72.权利要求70或权利要求71所述的方法,其中所述细胞是原代细胞。
73.权利要求70至72中任一项所述的方法,其中所述细胞是经培养细胞。
74.权利要求73所述的方法,其中所述经培养细胞是经培养细胞系。
75.权利要求74所述的方法,其中所述经培养细胞系包括
3T3,697,10T1/2,1321N1,A549,AHR77,B-LCL,B16,B65,Ba/F3,BHK,C2C12,C6,CaCo-2,CAP,CaSki,ChaGo-K-1,CHO,COS,DG75,DLD-1,EL4,H1299,HaCaT,HAP1,HCT116,HEK,HeLa,HepG2,HL60,HOS,HT 1080,HT29,Huh-7,HUVEC,INS-1/GRINCH,Jurkat,K46,K562,KG1,KHYG-1,L5278Y,L6,LNCaP,LS180,MCF7,MDA-MB-231,ME-180,MG-63,Min-6,MOLT4,Nalm6,ND7/23,Neuro2a,NK92,NS/0,P3U1,Panc-1,PC-3,PC12,PER.C6,PM1,Ramos,RAW 264.7,RBL,Renca,RLE,SH-SY5Y,SK-BR-3,SK-MES-1,SK-N-SH,SK-OV-3,SP2/0,SW403,THP-1,U2OS,U937,Vero,YB2/0,或其衍生物。
76.权利要求70至74中任一项所述的方法,其中所述细胞包括脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、角质形成细胞、肌细胞、神经元、骨细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、脾细胞、干细胞或胸腺细胞。
77.权利要求76所述的方法,其中所述PBMC是外周血淋巴细胞(PBL)。
78.权利要求77所述的方法,其中所述PBL是自然杀伤(NK)细胞、T细胞或B细胞。
79.权利要求76所述的方法,其中所述PBMC是单核细胞。
80.权利要求79所述的方法,其中所述单核细胞是巨噬细胞或树突细胞。
81.权利要求80所述的方法,其中所述巨噬细胞是小胶质细胞。
82.权利要求76所述的方法,其中所述干细胞是脂肪干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞或神经干细胞。
83.权利要求1至82中任一项所述的方法,其中所述药剂的加载效率为至少50%、60%、70%、80%或90%。
84.权利要求1至83中任一项所述的方法,其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少50%。
85.权利要求1至84中任一项所述的方法,其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少60%。
86.权利要求1至85中任一项所述的方法,其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少70%。
87.权利要求1至86中任一项所述的方法,其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少80%。
88.权利要求1至87中任一项所述的方法,其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少90%。
89.权利要求1至88中任一项所述的方法,其中经电穿孔的细胞在所述第二电脉冲之后12至96小时有约50%至90%有生存力。
90.权利要求89所述的方法,其中所述经电穿孔的细胞在所述第二电脉冲之后12至72小时有约50%至90%有生存力。
91.权利要求89所述的方法,其中所述经电穿孔的细胞在所述第二电脉冲之后12至48小时有约50%至90%有生存力。
92.权利要求89所述的方法,其中所述经电穿孔的细胞在所述第二电脉冲之后24小时有约50%至90%有生存力。
93.权利要求1至89中任一项所述的方法,其中经电穿孔的细胞在所述第二电脉冲之后12至96小时有约60%至90%有生存力。
94.权利要求93所述的方法,其中所述经电穿孔的细胞在所述第二电脉冲之后12至72小时有约60%至90%有生存力。
95.权利要求93所述的方法,其中所述经电穿孔的细胞在所述第二电脉冲之后12至48小时有约60%至90%有生存力。
96.权利要求93所述的方法,其中所述经电穿孔的细胞在所述第二电脉冲之后24小时有约60%至90%有生存力。
97.经电穿孔的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡,其使用权利要求1至96中任一项所述的方法产生。
98.电穿孔系统,其具有包含指令的非暂态计算机可读介质,所述指令当由处理器执行时引起所述处理器进行以下:
选择与具有第一场强和第一脉冲持续时间的第一电脉冲相关的第一方案;
根据所述第一方案,使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受由所述第一方案限定的所述第一电脉冲,所述第一电脉冲足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂;
选择与具有第二场强和第二脉冲持续时间的第二电脉冲相关的第二方案;以及
根据所述第二方案,使所述样品经受由所述第二方案限定的所述第二电脉冲,所述第二电脉冲足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂;
其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。
99.权利要求98所述的电穿孔系统,其中所述第一场强等于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间长于所述第二脉冲持续时间。
100.权利要求98所述的电穿孔系统,其中所述第一场强等于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间短于所述第二脉冲持续时间。
101.权利要求98所述的电穿孔系统,其中所述第一场强小于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间等于所述第二脉冲持续时间。
102.权利要求98所述的电穿孔系统,其中所述第一场强大于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间等于所述第二脉冲持续时间。
103.权利要求98所述的电穿孔系统,其中所述第一场强小于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间长于所述第二脉冲持续时间。
104.权利要求98所述的电穿孔系统,其中所述第一场强大于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间长于所述第二脉冲持续时间。
105.权利要求98所述的电穿孔系统,其中所述第一场强小于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间短于所述第二脉冲持续时间。
106.权利要求98所述的电穿孔系统,其中所述第一场强大于所述第二场强,并且其中所述第一脉冲持续时间短于所述第二脉冲持续时间。
107.权利要求98至106中任一项所述的电穿孔系统,其中所述第一场强和第一脉冲持续时间产生第一总施加电能并且所述第二场强和第二脉冲持续时间产生第二总施加电能,并且其中所述第一总施加电能不同于所述第二总施加电能。
108.权利要求107所述的电穿孔系统,其中所述第一总施加电能大于所述第二总施加电能。
109.权利要求98至108中任一项所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数。
110.权利要求109所述的电穿孔系统,其中所述电脉冲的电压幅值为0.001伏特至10,000伏特、0.01伏特至10,000伏特、0.1伏特至10,000伏特、1伏特至10,000伏特、1伏特至9,000伏特、1伏特至8,000伏特、1伏特至7,000伏特、1伏特至6,000伏特、1伏特至5,000伏特、1伏特至4,000伏特、1伏特至3,000伏特、1伏特至2,000伏特、或1伏特至1,000伏特。
111.权利要求109或权利要求110所述的电穿孔系统,其中所述电脉冲的电压幅值为100伏特至900伏特。
112.权利要求109至111中任一项所述的电穿孔系统,其中所述样品的电导率是这样的参数的函数,所述参数包括电穿孔缓冲液的离子组成、待被加载到细胞中的药剂的浓度、细胞密度、温度和压力。
113.权利要求109至111中任一项所述的电穿孔系统,其中所述样品的电导率为0.01西门子/米至10西门子/米、0.01西门子/米至1西门子/米、0.1西门子/米至10西门子/米、0.1西门子/米至1西门子/米、或1西门子/米至10西门子/米。
114.权利要求109至113中任一项所述的电穿孔系统,其中所述样品的电导率为1.0至3.0西门子/米。
115.权利要求109至114中任一项所述的电穿孔系统,其中所述第一场强和第二场强还是电穿孔室的几何形状的函数。
116.权利要求115所述的电穿孔系统,其中所述电穿孔室包含0.001cm至10cm、0.001cm至1cm、0.01cm至10cm、0.01cm至1cm、0.1cm至10cm、0.1cm至1cm、或1cm至10cm的电极间隙。
117.权利要求115或权利要求116所述的电穿孔系统,其中所述电穿孔室包含0.01cm至1cm的电极间隙。
118.权利要求98至117中任一项所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强为0.01kV/cm至10kV/cm、0.01kV/cm至1kV/cm、0.1kV/cm至10kV/cm、0.1kV/cm至1kV/cm、或1kV/cm至10kV/cm。
119.权利要求98至118中任一项所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强为0.3kV/cm至3kV/cm。
120.权利要求98至119中任一项所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一脉冲持续时间和第二脉冲持续时间为10-6秒至10秒、10-6秒至1秒、10-3秒至10秒、或10-3秒至1秒。
121.权利要求98至120中任一项所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一脉冲持续时间和第二脉冲持续时间为1微秒至100毫秒。
122.权利要求98至121中任一项所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征。
123.权利要求122所述的电穿孔系统,其中所述脉冲数为1个脉冲至1000个脉冲、1个脉冲至900个脉冲、1个脉冲至800个脉冲、1个脉冲至700个脉冲、1个脉冲至600个脉冲、1个脉冲至500个脉冲、1个脉冲至400个脉冲、1个脉冲至300个脉冲、1个脉冲至200个脉冲、1个脉冲至100个脉冲、1个脉冲至90个脉冲、1个脉冲至80个脉冲、1个脉冲至70个脉冲、1个脉冲至60个脉冲、1个脉冲至50个脉冲、1个脉冲至40个脉冲、1个脉冲至30个脉冲、1个脉冲至20个脉冲、或1个脉冲至10个脉冲。
124.权利要求122或权利要求123所述的电穿孔系统,其中所述脉冲数为1个脉冲至130个脉冲。
125.权利要求122至124中任一项所述的电穿孔系统,其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数。
126.权利要求125所述的电穿孔系统,其中所述指数衰减率是所述样品的电阻和用于实现电穿孔的电源的电容的函数。
127.权利要求126所述的电穿孔系统,其中所述样品的电阻为1欧姆至10000欧姆、1欧姆至9000欧姆、1欧姆至8000欧姆、1欧姆至7000欧姆、1欧姆至6000欧姆、1欧姆至5000欧姆、1欧姆至4000欧姆、1欧姆至3000欧姆、1欧姆至2000欧姆、1欧姆至1000欧姆、1欧姆至900欧姆、1欧姆至800欧姆、1欧姆至700欧姆、1欧姆至600欧姆、1欧姆至500欧姆、1欧姆至400欧姆、1欧姆至300欧姆、1欧姆至200欧姆、1欧姆至100欧姆、1欧姆至90欧姆、1欧姆至80欧姆、1欧姆至70欧姆、1欧姆至60欧姆、1欧姆至50欧姆、1欧姆至40欧姆、1欧姆至30欧姆、1欧姆至20欧姆、或1欧姆至10欧姆。
128.权利要求125或权利要求126所述的电穿孔系统,其中所述样品的电阻为1欧姆至1000欧姆。
129.权利要求126至128中任一项所述的电穿孔系统,其中所述电源电容为1μF至1,000,000μF、1μF至100,000μF、1μF至10,000μF、1μF至1,000μF、或1μF至100μF。
130.权利要求126至129中任一项所述的电穿孔系统,其中所述电源电容为1000μF至5000μF。
131.权利要求122至130中任一项所述的电穿孔系统,其中所述脉冲形状是方波脉冲或指数衰减波脉冲。
132.权利要求122至131中任一项所述的电穿孔系统,其中所述脉冲模式包括与所述第一脉冲或第二脉冲的持续时间相对应的单脉冲。
133.权利要求122至131中任一项所述的电穿孔系统,其中所述脉冲模式包括多脉冲,其中所述多脉冲的组合持续时间与所述第一脉冲或第二脉冲的持续时间相对应。
134.权利要求122至133中任一项所述的电穿孔系统,其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的极性为正或负。
135.权利要求98至134中任一项所述的电穿孔系统,其中在所述样品经受所述第一脉冲之后至少12小时至至少48小时使所述样品经受所述第二电脉冲。
136.权利要求135所述的电穿孔系统,其中在所述样品经受所述第一脉冲之后至少24小时使所述样品经受所述第二电脉冲。
137.权利要求98至136中任一项所述的电穿孔系统,其中所述电穿孔系统包含流式电穿孔设备,并且其中当所述样品在所述流式电穿孔设备内流动时使所述样品经受所述电脉冲。
138.权利要求98至137中任一项所述的电穿孔系统,其中所述细胞是哺乳动物细胞。
139.权利要求138所述的电穿孔系统,其中所述细胞是人细胞、鼠细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞或灵长类细胞。
140.权利要求138或权利要求139所述的电穿孔系统,其中所述细胞是原代细胞。
141.权利要求138至140中任一项所述的电穿孔系统,其中所述细胞是经培养细胞。
142.权利要求141所述的电穿孔系统,其中所述经培养细胞是经培养细胞系。
143.权利要求142所述的电穿孔系统,其中所述经培养细胞系包括3T3,697,10T1/2,1321N1,A549,AHR77,B-LCL,B16,B65,Ba/F3,BHK,C2C12,C6,CaCo-2,CAP,CaSki,ChaGo-K-1,CHO,COS,DG75,DLD-1,EL4,H1299,HaCaT,HAP1,HCT116,HEK,HcLa,HcpG2,HL60,HOS,HT1080,HT29,Huh-7,HUVEC,INS-1/GRINCH,Jurkat,K46,K562,KG1,KHYG-1,L5278Y,L6,LNCaP,LS180,MCF7,MDA-MB-231,ME-1 80,MG-63,Min-6,MOLT4,Nalm6,ND7/23,Neuro2a,NK92,NS/0,P3U1,Panc-1,PC-3,PC12,PER.C6,PM1,Ramos,RAW 264.7,RBL,Renca,RLE,SH-SY5Y,SK-BR-3,SK-MES-1,SK-N-SH,SK-OV-3,SP2/0,SW403,THP-1,U2OS,U937,Vero,YB2/0,或其衍生物。
144.权利要求138至142中任一项所述的电穿孔系统,其中所述细胞包括脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、角质形成细胞、肌细胞、神经元、骨细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、脾细胞、干细胞或胸腺细胞。
145.权利要求144所述的电穿孔系统,其中所述PBMC是外周血淋巴细胞(PBL)。
146.权利要求145所述的电穿孔系统,其中所述PBL是自然杀伤(NK)细胞、T细胞或B细胞。
147.权利要求144所述的电穿孔系统,其中所述PBMC是单核细胞。
148.权利要求147所述的电穿孔系统,其中所述单核细胞是巨噬细胞或树突细胞。
149.权利要求148所述的电穿孔系统,其中所述巨噬细胞是小胶质细胞。
150.权利要求144所述的电穿孔系统,其中所述干细胞是脂肪干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞或神经干细胞。
151.权利要求98至150中任一项所述的电穿孔系统,其中所述第一药剂和第二药剂是相同的药剂。
152.权利要求98至150中任一项所述的电穿孔系统,其中所述第一药剂和第二药剂是不同的药剂。
153.权利要求98至152中任一项所述的电穿孔系统,其中所述第一药剂和第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。
154.权利要求153所述的电穿孔系统,其中所述核酸是RNA,并且其中所述RNA是mRNA、miRNA、shRNA或siRNA。
155.权利要求153所述的电穿孔系统,其中所述核酸是DNA,并且其中所述DNA是反义寡核苷酸或载体。
156.权利要求153所述的电穿孔系统,其中所述蛋白质是核糖核蛋白。
157.权利要求156所述的电穿孔系统,其中所述核糖核蛋白包含Cas9蛋白和指导RNA。
158.权利要求98至157中任一项所述的电穿孔系统,其中所述药剂的加载效率为至少50%、60%、70%、80%或90%。
159.权利要求98至158中任一项所述的电穿孔系统,其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少50%。
160.权利要求98至159中任一项所述的电穿孔系统,其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少60%。
161.权利要求98至160中任一项所述的电穿孔系统,其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少70%。
162.权利要求98至161中任一项所述的电穿孔系统,其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少80%。
163.权利要求98至162中任一项所述的电穿孔系统,其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少90%。
164.权利要求98至163中任一项所述的电穿孔系统,其中经电穿孔的细胞在所述第二电脉冲之后12至96小时有约50%至90%有生存力。
165.权利要求164所述的电穿孔系统,其中所述经电穿孔的细胞在所述第二电脉冲之后12至72小时有约50%至90%有生存力。
166.权利要求164所述的电穿孔系统,其中所述经电穿孔的细胞在所述第二电脉冲之后12至48小时有约50%至90%有生存力。
167.权利要求164所述的电穿孔系统,其中所述经电穿孔的细胞在所述第二电脉冲之后24小时有约50%至90%有生存力。
168.权利要求98至164中任一项所述的电穿孔系统,其中经电穿孔的细胞在所述第二电脉冲之后12至96小时有约60%至90%有生存力。
169.权利要求168所述的电穿孔系统,其中所述经电穿孔的细胞在所述第二电脉冲之后12至72小时有约60%至90%有生存力。
170.权利要求168所述的电穿孔系统,其中所述经电穿孔的细胞在所述第二电脉冲之后12至48小时有约60%至90%有生存力。
171.权利要求168所述的电穿孔系统,其中所述经电穿孔的细胞在所述第二电脉冲之后24小时有约60%至90%有生存力。
172.经电穿孔的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡,其使用权利要求98至171中任一项所述的电穿孔系统产生。
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---|---|---|---|
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