JP2022153470A - ゲノムdnaを改変するための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2016年6月21日に出願された米国特許仮出願第62/365,126号の恩典を主張する。参照する出願の全内容は本明細書において参照により組み入れられる。
本発明は全体として、バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本発明は、ゲノムDNAを改変するための新規の方法および組成物に関する。
標的ゲノム工学は、細胞内のDNAに沿った特定の部位において定方向の様式で内因性DNAを編集または変更することを含む。遺伝子修復および相同性定方向遺伝子改変の非常に大きな可能性にもかかわらず、現在のゲノム工学的アプローチでは、修復または編集の非常に低い効率が提供され、有害なまたは望ましくないDNA配列および結果を導入する可能性を有する。
(a)DNAオリゴと(b)DNA消化作用物質と(c)キャップ形成および/またはポリアデニル化されているターゲティングRNAとを含む組成物を、エレクトロポレーションにより細胞にトランスフェクトする工程
を含む、該細胞における標的ゲノムDNA領域の部位特異的な配列改変のための方法であって、
該DNAオリゴが、
(i)該標的ゲノムDNA領域に相同なDNA配列を含む相同領域と、
(ii)配列改変領域と
を含み、かつ
該標的ゲノムDNA領域においてゲノムDNA配列が特異的に改変される、方法。
[本発明1002]
エレクトロポレーションが、フローエレクトロポレーションデバイスを用いるフローエレクトロポレーションである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記DNA消化作用物質がヌクレアーゼである、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記ヌクレアーゼがCas9を含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記ヌクレアーゼが部位特異的なヌクレアーゼである、本発明1003または1004の方法。
[本発明1006]
前記ターゲティングRNAがガイドRNAを含む、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記ターゲティングRNAが、キャップ形成およびポリアデニル化されている、本発明1001~1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記ターゲティングRNAが、インビトロでキャップ形成およびポリアデニル化されている、本発明1001~1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記オリゴが一本鎖である、本発明1001~1006のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記DNAオリゴおよび前記ターゲティングRNAが、前記標的ゲノムDNA領域の同じ鎖に相補的である、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記DNAオリゴが10個超の核酸である、本発明1001~1009のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記DNAオリゴが10~800個の核酸である、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記DNAオリゴが10~600個の核酸である、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記DNAオリゴが10~200個の核酸である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記DNAオリゴが10~100個の核酸である、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記DNAオリゴが10~50個の核酸である、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記組成物中の前記DNAオリゴの濃度が10μg/mLを上回る、本発明1001~1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記組成物中の前記DNAオリゴの濃度が約10μg/mL~約500μg/mLである、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記組成物中の前記DNAオリゴの濃度が約35μg/mL~約300μg/mLである、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記組成物中の前記DNAオリゴの濃度が約35μg/mL~約200μg/mLである、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記組成物が非ウイルス性である、本発明1001~1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記細胞が哺乳動物細胞である、本発明1001~1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記細胞がヒト細胞である、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記細胞が線維芽細胞である、本発明1022の方法。
[本発明1025]
前記哺乳動物細胞が末梢血リンパ球である、本発明1022の方法。
[本発明1026]
前記哺乳動物細胞が、増殖したT細胞である、本発明1022の方法。
[本発明1027]
前記哺乳動物細胞が幹細胞である、本発明1022の方法。
[本発明1028]
前記幹細胞が造血幹細胞である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
前記細胞が間葉系幹細胞である、本発明1027の方法。
[本発明1030]
前記哺乳動物細胞が初代細胞である、本発明1022の方法。
[本発明1031]
前記ゲノムDNA配列が疾患関連遺伝子を含む、本発明1001~1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
前記ゲノムDNA配列がHBB遺伝子を含む、本発明1001~1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記配列改変が前記ゲノムDNAの修正であり、該修正により前記HBB遺伝子の6番目のコドンがグルタミン酸コドンに改変される、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記疾患が慢性肉芽腫性疾患である、本発明1031の方法。
[本発明1035]
前記ゲノムDNA配列がgp91phox遺伝子を含む、本発明1031または1034の方法。
[本発明1036]
前記オリゴが、核酸少なくとも10個の相同配列を含む、本発明1001~1035のいずれかの方法。
[本発明1037]
前記オリゴが、核酸少なくとも20個の相同配列を含む、本発明1036の方法。
[本発明1038]
前記オリゴが、核酸少なくとも30個の相同配列を含む、本発明1037の方法。
[本発明1039]
前記配列改変の効率が3%超である、本発明1001~1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
前記配列改変の効率が5%超である、本発明1039の方法。
[本発明1041]
前記配列改変の効率が10%超である、本発明1040の方法。
[本発明1042]
エレクトロポレーション後の細胞生存率が少なくとも30%である、本発明1001~1041のいずれかの方法。
[本発明1043]
前記エレクトロポレーション後の細胞生存率が少なくとも40%である、本発明1042の方法。
[本発明1044]
前記エレクトロポレーション後の細胞生存率が少なくとも50%である、本発明1043の方法。
[本発明1045]
前記DNA配列改変が、1つまたは複数の終止コドンである、本発明1001~1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
前記組成物が、異なる相同配列を有する2つまたはそれ以上のDNAオリゴを含む、本発明1001~1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
前記組成物が、2つまたはそれ以上のDNA消化作用物質を含む、本発明1046の方法。
[本発明1048]
前記組成物が、2つまたはそれ以上の部位特異的なDNA消化作用物質を含み、該DNA消化作用物質が、異なるゲノム部位を標的にする、本発明1047の方法。
[本発明1049]
前記配列改変により前記ゲノム配列の1塩基対または複数の塩基対が変化する、本発明1001~1048のいずれかの方法。
[本発明1050]
前記配列改変により前記ゲノム配列の1塩基対または複数の塩基対が付加される、本発明1001~1048のいずれかの方法。
[本発明1051]
前記配列改変により前記ゲノム配列の1塩基対または複数の塩基対が欠失する、本発明1001~1048のいずれかの方法。
[本発明1052]
前記細胞が患者から単離された細胞である、本発明1001~1051のいずれかの方法。
[本発明1053]
前記細胞が凍結保存されている、本発明1052の方法。
[本発明1054]
前記細胞のトランスフェクション前1週間以内の時期に該細胞が前記患者から単離された、本発明1052の方法。
[本発明1055]
前記細胞のトランスフェクション前1日以内の時期に該細胞が前記患者から単離された、本発明1052の方法。
[本発明1056]
前記単離された細胞が凍結されていない、本発明1052~1055のいずれかの方法。
[本発明1057]
前記単離された細胞が、2つまたはそれ以上の異なる細胞型を含む、本発明1052~1056のいずれかの方法。
[本発明1058]
前記2つまたはそれ以上の異なる細胞型が、多能性に関する異なる段階における2つまたはそれ以上の細胞型を含む、本発明1052~1056のいずれかの方法。
[本発明1059]
前記配列改変の効率が3%超である、本発明1052~1058のいずれかの方法。
[本発明1060]
前記配列改変の効率が5%超である、本発明1059の方法。
[本発明1061]
前記配列改変の効率が10%超である、本発明1060の方法。
[本発明1062]
前記エレクトロポレーション後の細胞生存率が少なくとも30%である、本発明1052~1061のいずれかの方法。
[本発明1063]
前記エレクトロポレーション後の細胞生存率が少なくとも40%である、本発明1062の方法。
[本発明1064]
前記エレクトロポレーション後の細胞生存率が少なくとも50%である、本発明1063の方法。
[本発明1065]
前記細胞が対象の骨髄から単離されている、本発明1052~1064のいずれかの方法。
[本発明1066]
前記細胞が幹細胞を含む、本発明1052~1065のいずれかの方法。
[本発明1067]
前記幹細胞が造血幹細胞を含む、本発明1066の方法。
[本発明1068]
前記幹細胞が細胞表面マーカーCD34+を含む、本発明1067の方法。
[本発明1069]
前記DNA配列改変を有するクローン細胞を産生するために、単離および選択されたクローン細胞を増殖させる工程をさらに含む、本発明1001~1068のいずれかの方法。
[本発明1070]
大規模製造のために細胞を増殖させる、本発明1069の方法。
[本発明1071]
1L超の体積で細胞を増殖させる、本発明1069または1070の方法。
[本発明1072]
3Lまたはそれ以上の体積で細胞を増殖させる、本発明1071の方法。
[本発明1073]
前記細胞が無血清培地中で培養される、本発明1001~1072のいずれかの方法。
[本発明1074]
前記配列改変について前記細胞をスクリーニングする工程をさらに含む、本発明1001~1073のいずれかの方法。
[本発明1075]
トランスフェクトされた細胞を凍結させる工程をさらに含む、本発明1001~1074のいずれかの方法。
[本発明1076]
以前に凍結させたトランスフェクトされた細胞を増殖させる工程をさらに含む、本発明1001~1075のいずれかの方法。
[本発明1077]
(a)DNAオリゴと(b)DNA消化作用物質と(c)キャップ形成および/またはポリアデニル化されているターゲティングRNAとを含む組成物を、エレクトロポレーションにより細胞にトランスフェクトする工程であって、
ドナーDNAが、
(i)標的ゲノムDNA領域に相同な核酸配列を含む相同領域と、
(ii)配列改変領域と
を含む、工程;および
該標的ゲノムDNA領域におけるゲノムDNA配列改変について、トランスフェクトされた細胞をスクリーニングする工程;
クローン細胞を得るために、スクリーニングしたトランスフェクトされた細胞を限界希釈により単離する工程;
該ゲノムDNA配列改変を含む安定な細胞株を産生するために、単離したトランスフェクトされた細胞を増殖させる工程
を含む、該標的ゲノムDNA配列の該ゲノムDNA配列改変を含む安定な細胞株を産生するための方法。
[本発明1078]
本発明1077の方法により産生された細胞株。
[本発明1079]
本発明1001~1078のいずれかの方法を使用して産生された、エレクトロポレーションされた細胞。
[本発明1080]
本発明1079のエレクトロポレーションされた細胞または本発明1078の細胞株の有効量を投与することにより、疾患もしくは状態を有するかまたは疾患もしくは状態を有することが疑われる対象を処置する方法。
[本発明1081]
本発明1079のエレクトロポレーションされた細胞または本発明1078の細胞株の有効量を投与する工程を含む、臨床研究方法。
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになると考えられる。しかし、本詳細な説明から本発明の精神および範囲内での種々の変更および改変が当業者には明らかになるため、詳細な説明および特定の実施例が、本発明の好ましい態様を示しているが、例示としてのみ提供されることを理解すべきである。
(図1)Maxcyte STXの静的およびフローエレクトロポレーショントランスフェクション技術を用いた安定な細胞株の開発プロセス。図は、安定な細胞生成のワークフローを示す。エレクトロポレーション後、選択無しで細胞をある期間培養して、エレクトロポレーション法からの回復を可能にしてもよい(図中に示していない)。エレクトロポレーション後、選択物質の存在下で細胞を培養することにより選択する(選択段階)。選択段階の後、選択物質の存在下で細胞を低密度で培養して、限界希釈クローニングを可能にする(維持/クローン選択段階)。クローン集団の生成後、クローンを、外因性ポリペプチドの発現についてスクリーニングして、増殖させる(クローンのスクリーニングおよび増殖の段階)。スクリーニング後、所望の活性を有するクローンを、産生の目的のために大規模で成長させ(大規模スケールアップ段階)、凍結保存などの長期保存に供する。
(図2)図2A~C:DNAトランスフェクションは、細胞に対する分化細胞毒性を有する。図2に、DNAおよびmRNAをトランスフェクトされた末梢血液リンパ球(PBL)およびK562細胞の生存率(図2A)、DNAおよびmRNAをトランスフェクトされたPBLおよびK562細胞のGFP発現(図2B)、ならびにDNAおよびmRNAをトランスフェクトされたPBLおよびK562細胞の細胞数(図2C)を示す。データは、DNAトランスフェクションによって、K562への細胞毒性は生じないが、休止PBLにおいて強い細胞毒性を誘導することを実証している。
(図3)K562およびPBLのAAVS1部位でのmRNA-CRISPRトランスフェクション誘導性ゲノムDNA編集。図3に図示するのは、休止PBL細胞とK562細胞のCel-1アッセイ法による遺伝子編集の比較である。細胞は、mRNA-CRISPR(それぞれcas9およびgRNA)を用いてエレクトロポレーションされなかった(-EP)か、またはエレクトロポレーションされた(+EP)。この電気泳動ゲル中の試料を、以下のとおりにロードした:レーン1:マーカー;レーン2:PBLの-EP;レーン3:PBLの+EP;レーン4:K562の-EP;レーン5:K562の+EP。修正されたAAVS-1部位の切断生成物は、298および170塩基対であり、親バンドは468塩基対である。編集率は、(消化バンドの密度)/(消化バンドの密度+親バンドの密度)として算出した。休止のエレクトロポレーションされた休止PBLおよびK562細胞は、それぞれ46%および49%の編集率を示した。
(図4)K562のAAVS1部位でのmRNA-CRISPRトランスフェクション誘導性ゲノムDNA編集。図4に図示するのは、mRNA-CRISPR(Cas9およびガイドRNA)を用いた細胞のエレクトロポレーションによる、遺伝子編集の一貫性を示す重複実験結果の電気泳動ゲルであり、Cel-1アッセイ法により、それぞれ59%および52%のDNA編集が誘導された。修正されたAAVS-1部位の切断生成物は、298および170塩基対であり、親バンドは468塩基対である。編集率は、(消化バンドの密度)/(消化バンドの密度+親バンドの密度)として算出した。
(図5)PBL細胞および増殖したT細胞のAAVS1部位でのmRNA-CRISPRトランスフェクション誘導性ゲノムDNAの編集。図5に図示するのは、休止PBL細胞と増殖したT細胞の比較である。細胞は、トランスフェクトされなかった(-EP)か、GFP-mRNAをトランスフェクトされたか、またはmRNA-CRISPR(Cas9+gRNA、c+g)をトランスフェクトされた。試料は、PBLのマーカー、-EP、GFP、およびc+g、ならびに増殖したT細胞の-EPおよびc+gの順序でロードした。修正されたAAVS-1部位での切断生成物は、298および170塩基対であり、親バンドは468塩基対である。編集率は、(消化バンドの密度)/(消化バンドの密度+親バンドの密度)として算出した。PBLおよび増殖したT細胞は、Cas9を用いてエレクトロポレーションされ、ガイドRNAはそれぞれ32%および45%の編集を示した。
(図6)K562のAAVS1部位におけるmRNA-CRISPRトランスフェクション誘導性Hind III配列組み込みに依存する一本鎖DNAオリゴサイズ。細胞は、トランスフェクトされなかった(-EP)か、mRNA-CRISPR単独(c+g)をトランスフェクトされたか、または、示すとおりの異なるサイズのmRNA-CRISPR+一本鎖DNAオリゴをトランスフェクトされた。試料は、マーカー、c+g、c+g+26mer、c+g+50mer、c+g+70mer、およびc+g+100merの順序でロードした。6個のヌクレオチドを認識するHindIIIが、HindIII消化部位を作製するAAVS1部位中にあった。組み込まれたオリゴドナー配列を伴うAAVS-1部位の切断生成物は、298および170塩基対であり、親バンドは468塩基対である。組み込み率は、(消化バンドの密度)/(消化バンドの密度+親バンドの密度)として算出した。核酸50、70、および100個のドナーオリゴは、それぞれ43%、35%、および34%の組み込みを示し、一方で、核酸20個は0%組み込みを示した。
(図7)mRNA-CRISPRオリゴトランスフェクションによって、増殖したT細胞のAAVS1部位におけるHind III配列の組み込みが誘導された。細胞は、mRNA-CRISPR単独またはmRNA-CRISPR+50mer一本鎖オリゴ(c+g+o)のいずれかをトランスフェクトされた。PCRアンプリコンは、HidIIIを用いて消化された(+H3)か、または消化されなかった(-H3)。試料を、以下のとおりにロードした:(1)マーカー;(2)c+g-H3;(3)c+g+H3;(4)c+g+o-H3;(5)c+g+o+H3。ドナーオリゴによって、HindIII消化部位を作製したAAVS1部位中に6個のヌクレオチドを組み込んだ。組み込んだオリゴドナー配列を伴うAAVS-1部位の切断生成物は、298および170塩基対であり、親バンドは468塩基対である。組み込み率は、(消化バンドの密度)/(消化バンドの密度+親バンドの密度)として算出した。ドナーオリゴをトランスフェクトされた増殖したT細胞は、15~30%の組み込みを示した。
(図8)図8A~C: MaxCyteシステムによるmRNAのトランスフェクションは、ヒトの増殖したT細胞に対して低細胞毒性を有する。図7と同じ増殖したt細胞についての生存率および細胞増殖(図8A)、トランスフェクション後の増殖したT細胞の増殖(図8B)、ならびにトランスフェクション後の増殖したT細胞のGFP発現(図8C)。データは、一本鎖オリゴDNAを伴うmRNAと同様にヌクレアーゼが、6個のヌクレオチドの組み込みを媒介するだけでなく(図7)、増殖したT細胞に対して低い細胞毒性を示したことを実証している。
(図9)造血幹細胞(HSC)の表現型およびGFP発現。エレクトロポレーションは、解凍後2日目に行った。データは、mRNAを用いたトランスフェクションが、CD34+HSCに対してDNAを用いるよりも有効であることを示す。
(図10)図10A~D: HSCのDNA-GFPトランスフェクションは、HSCでのmRNA-GFPトランスフェクションよりもずっと高い細胞毒性を有する。HSC細胞は、解凍後2日目にエレクトロポレーションされた。図10に、mRNA/DNAをトランスフェクトされたCD34+ヒトHSCの生存率(図10A)、増殖(図10B)、GFP発現(図10C)、および平均GFP蛍光強度(MFI)(図10D)を示す。
(図11)図11A~C: mRNA-Cas9/gRNA+サイズの異なる一本鎖ドナーDNAオリゴを用いたHSCのトランスフェクションは、低い細胞毒性を有する。HSC細胞は、解凍後2日目にエレクトロポレーションされた。図11に、mRNA-Cas9/gRNAによりおよび示した核酸長の異なるサイズのDNA一本鎖オリゴによりトランスフェクトされたHSCの生存率(図11A)、標準化された生存率(図11B)、および増殖(図11C)を示す。
(図12)CD34+造血幹細胞のAAVS1部位におけるmRNA-CRISPRトランスフェクション誘導性のゲノムDNA編集。細胞は、トランスフェクトされていない(-EP)か、mRNA-GFPをトランスフェクトされた(GFP)か、または、4個の反復配列を伴うmRNA-CRISPRをトランスフェクトされた(C+G 1、2、3、4)。電気泳動ゲルの試料を、以下のとおりにロードした:(1)マーカー;(2)-EP;(3)GFP;(4)C+G-1;(5)C+G-2;(6)C+G-3;(7)C+G-4。編集したAAVS-1部位の切断生成物は、298および170塩基対であり、親バンドは468塩基対である。編集率は、(消化バンドの密度)/(消化バンドの密度+親バンドの密度)として算出した。Cas9およびガイドRNAをコードするmRNAをトランスフェクトされたHSCは、4つの異なる実験において43%、60%、54%、および52%の編集を示した。
(図13)図13A~B:トランスフェクション後2日目のCD34+造血幹細胞のAAVS1部位におけるmRNA-CRISPRオリゴトランスフェクション誘導性Hind III配列組み込み。細胞は、トランスフェクトされなかった(-EP)か、GFP-mRNA(GFP)をトランスフェクトされたか、mRNA-CRISPR(C+G)単独をトランスフェクトされたか、またはmRNA-CRISPR+異なるサイズのオリゴ(26mer、50mer、70mer、および、100merのオリゴ濃度を示した100mer)をトランスフェクトされた。電気泳動ゲルの試料を、以下のとおりにロードした:(1)マーカー;(2)-EP-H3;(3)-EP+H3;(4)GFP-H3;(5)GFP+H3;(6)C+G-H3;(7)C+G+H3;(8)26mer-H3;(9)26mer+H3;(10)50mer-H3;および(11)50mer+H3。図13B中の試料を、以下のとおりに電気泳動ゲルにロードする:(1)マーカー;(2)70mer-H3;(3)70mer+H3;(4)100mer-30μg/mL-H3;(5)100mer-30μg/mL+H3;(6)100mer-100μg/mL-H3;(7)100mer-100μg/mL+H3;(8)100mer-200μg/mL-H3;(9)100mer-200μg/mL+H3。組み込まれたAAVS-1部位の切断生成物は、298および170塩基対であり、親バンドは468塩基対である。組み込み率は、(消化バンドの密度)/(消化バンドの密度+親バンドの密度)として算出した。25mer核酸DNAオリゴをトランスフェクトされたHSCは0%の組み込みを示し、一方で、50merおよび70mer核酸オリゴをトランスフェクトされたHSCはそれぞれ9%および23%の組み込みを示した。30μg/mLのヌクレオチド100個のオリゴをトランスフェクトされたHSCは、この時点で0%の組み込みを示したが(トランスフェクション後4日目に13%、データ示さず)、一方で、100μg/mLおよび200μg/mLの同じオリゴをトランスフェクトされたHSCはそれぞれ28%および43%の組み込みを示した。
(図14)ガイドRNAは組み込み特異性を与える。gRNAターゲティングAAVS1部位を伴うオリゴは、鎌状赤血球症(SCD)遺伝子座中ではなく、AAVS1中に組み込まれる。細胞は、エレクトロポレーション(-EP)されなかったか、またはmRNA-CRISPR+ドナーオリゴ(c+g+o)を用いてエレクトロポレーションされたかのいずれかであった。-/+Hは、HindIIIエンドヌクレアーゼの非存在(-)または存在(+)を示す。電気泳動ゲルの試料を、以下のとおりにロードした:(1)マーカー;(2)-EP+H;(3)c+g+o-H;(4)c+g+o+H;(5)-EP+H;(6)c+g+o-H;(7)c+g+o+H。レーン2~4は、AAVS1遺伝子座由来のゲノムDNAを表し、レーン5~7は、SCD遺伝子座由来のゲノムDNAを表す。組み込まれたAAVS1部位の切断生成物は、298および170塩基対であり、親バンドは468塩基対である。組み込み率は、(消化バンドの密度)/(消化バンドの密度+親バンドの密度)として算出した。DNAオリゴおよびAAVS1遺伝子座特異的なガイドRNAをトランスフェクトされたK562細胞は、AAVS1部位中に特異的に組み込まれたが、SCD遺伝子座には組み込まれなかった。AAVS1遺伝子座での組み込み率は20%であった。
(図15)図15A~B: AAVS1(図15A)およびSCD遺伝子座(図15B)を標的にする2つのガイドRNAを使用した部位特異的な組み込み。図15Bに示すとおり、ドナーDNAの部位特異的な組み込みは、SCD遺伝子座で達成された。これらの結果は、実施例2においてさらに記載されている。
(図16)図16A~B:配列改変領域(大文字および網掛け無し)および相同領域(小文字および網掛け有り)を有する例示的なドナーDNAオリゴ。図16Aは、標的ゲノムDNAへの付加として終止コドンが挿入されている例を示す。図16Bは、単一塩基が標的ゲノムDNA中で変化している例を示す。
(図17)トランスフェクション後1日目のHSCへのeGFPをコードするmRNAの効率的なトランスフェクション。対照細胞(トランスフェクション無し、左の2枚の顕微鏡写真)およびトランスフェクトされた細胞を提示する(右の2枚の顕微鏡写真)。細胞は、対照細胞およびトランスフェクトされた細胞の両方について生存可能である。eGFPの100%近い発現(下段、右)は、mRNAトランスフェクションを用いた効率的なトランスフェクション効率を実証している。
(図18)HSCにおけるAAVS1部位でのエレクトロポレーション媒介の効率的な遺伝子編集。HSCは、mRNA製剤中のcas9(c)およびgRNA(g)をトランスフェクトされた。Cel-1アッセイ法を、遺伝子編集の分析のために実施した。レーン1はマーカーである。レーン2は対照HSC(-EP)である。レーン3は、GFP-mRNAをトランスフェクトされたHSCである。レーン4~7はCas9/gRNAを用いたHSCのコドラート(quadrate)トランスフェクションである。
(図19)gp91phox中で最も一般的な変異(「ホットスポット」)は、エクソン7における位置676のCからT変異である。修正後にCGD中のアミノ部位226における終止コドンからArgへ、T変異をCに戻して修正するためにCRISPRおよびドナーDNA一本鎖オリゴを用いることで、それはgp91発現を回復させ得る。CGD患者由来のEBV形質転換B細胞を使用することにより、同時トランスフェクションは、トランスフェクション後5日目にpg91に対するFITCコンジュゲート抗体を用いてアッセイした場合、1%基礎ノイズレベル(左下)から10%上方制御されたレベル(右下)までgp91発現を実際に回復させた。トランスフェクションは、細胞を解凍した後2日目に行った。
(図20)図20A~Cは、X連鎖CGD患者に由来するB-LCLにおける単一遺伝子変異修復に対する、gRNAにおけるポリAの効果を示す。(a)に、様々な持続時間で酵素的に付加された種々の長さのポリAを含有するgRNAを用いたCRISPR/ssONDトランスフェクション後の、患者B-LCLの生存率を示す。(b)に、様々な持続時間で酵素的に付加された種々の長さのポリAを含有するgRNAを用いたCRISPR/ssONDトランスフェクション後の患者B-LCLの増殖を示す。(c)に、様々な持続時間で酵素的に付加された種々の長さのポリAを含有するgRNAを用いたCRISPR/ssONDトランスフェクション後の患者B-LCLのGp91修復を示す。全てのgRNAは、ARCA(T7 Ultra)によるキャップ形成を用いて作製した。キャップ形成後、5~40分でのポリA付加は、変異修復効率を改善した。
(図21)図21A~Cは、遺伝子修復におけるキャップ形成およびポリA付加の効果を示す。(a)に、gRNAにおける様々な改変を用いたCRISPR/ssONDトランスフェクション後の患者B-LCLの生存率を示す。(b)に、gRNAにおける様々な改変を用いたCRISPR/ssONDトランスフェクション後の患者B-LCLの増殖を示す。(c)に、gRNAにおける様々な改変を用いたCRISPR/ssONDトランスフェクション後の患者B-LCLのGp91修復を示す。これらの実験において、TranscriptionAidキットを使用した。(ARCAによる)キャップ形成は、生存率および細胞増殖を助長する(細胞増殖において3~4倍の増加)。キャップ形成とポリAテール付加との組み合わせは、テール付加(ポリアデニル化)またはテール付加無しのいずれかと組み合わせたキャップ形成無しと同じ遺伝子修復を有することができる。まとめると、キャップ形成とテール付加との組み合わせは、修復細胞の数を増加させる。
(図22)gRNAにおける様々な改変を用いたCRISPR/ssONDトランスフェクション後の全ての修復細胞を示す。(ARCAによる)キャップ形成は、生存率および細胞増殖を助長する(細胞増殖において5倍の増加)。キャップ形成とポリAテール付加との組み合わせは、テール付加またはテール付加無しのいずれかと組み合わせたキャップ形成無しと同じ遺伝子修復を有することができる。まとめると、gRNAのキャップ形成とテール付加との組み合わせは、修復細胞の数を増加させる。
(図23)ドナーDNAオリゴの設計の模式図である。上のオリゴ1において、gRNAおよびオリゴは、ゲノムDNA二重鎖の同じ鎖に相補的である。下のオリゴ2において、gRNAおよびオリゴは、ゲノムDNA二重鎖の異なる鎖に相補的である。
(図24)変異修復効率に対するssDNAオリゴマーの選択の効果を示す。適用された一本鎖DNA(ssDNA)オリゴマーおよびgRNAがゲノムDNA二重鎖の同じ鎖に相補的である場合に、より高い修復効率が見られた(オリゴ1)。適用されたssDNAオリゴマーおよびgRNAがゲノムDNA二重鎖の異なる鎖に相補的である場合に、より低い修復効率が見られた(オリゴ2)。gRNAは、CGD例においてはセンス、SCID例についてはアンチセンスを標的とする。
(図25)図25A~Cは、異なるキットから作製したgRNAを用いた遺伝子修復における一貫性を示す。(a)に、異なるロット番号を有する3種類のキットから作製したgRNAを用いたCRISPR/ssONDトランスフェクション後の患者B-LCLの生存率を示す。(b)に、異なるロット番号を有する3種類のキットから作製されたgRNAを用いたCRISPR/ssONDトランスフェクション後の患者B-LCLの増殖を示す。(c)に、異なるロット番号を有する3種類のキットから作製したgRNAを用いたCRISPR/ssONDトランスフェクション後の患者B-LCLのgp91修復を示す。一貫したかつ効率的な遺伝子修復が、異なるキットおよび異なるロット番号によって作製したgRNAを用いて実証されている。
(図26)酵素反応無しで付加されたポリAテール付加gRNAを用いたCRISPR/ssONDトランスフェクション後の患者B-LCLのgp91修復を示す。使用したフォワードプライマーは、
であった。20Tについてのリバースプライマーは、
であった。30Tについてのリバースプライマーは、
であった。このデータは、RNA産生用のテンプレートとしてアンプリコンを増幅するために使用されるリバースプライマーにおけるポリTの付加を通して、ポリAを付加することが可能であることを実証している。
本明細書において記載する方法では、DNA配列を改変/補正するために、DNAオリゴおよびDNA消化作用物質を使用する。本明細書において記載する方法は、DNA配列改変の低毒性および取り込みの高い効率を提供することが企図されている。
B.オリゴ
態様は、DNAオリゴとDNA消化作用物質とを含む組成物を用いて細胞をエレクトロポレーションすることによる、標的ゲノムDNA配列の配列改変に関する。一部の態様において、DNAオリゴは一本鎖である。
本発明は、DNAオリゴおよびDNA消化作用物質をエレクトロポレーションにより細胞にトランスフェクトすることにより、標的ゲノムDNA配列を改変するための方法を提供する。「DNA消化作用物質」という用語は、核酸のヌクレオチドサブユニット間の結合(すなわち、ホスホジエステル結合)を切断することが可能な作用物質を指す。特定の態様において、DNA消化作用物質は、RNA上にコードされている。RNA上にDNA消化作用物質を提供することによって、トランスフェクション後の細胞の生存率の向上および配列改変の効率の増加のうちの一方または両方を行い得ることが企図されている。他の態様において、DNA消化作用物質は、タンパク質、酵素、または酵素活性を有する小分子模倣体である。
RはAまたはGであり、KはGまたはTであり、SはGまたはCであり、YはCまたはTであり、MはAまたはCであり、WはAまたはTであり、BはAではなく(C、G、またはTであり)、HはGではなく(A、C、またはTであり)、DはCではなく(A、G、またはTであり)、VはTではなく(A、C、またはGであり)、かつNは任意のヌクレオチドである。
本発明の特定の態様において、ゲノムDNA配列改変を含む細胞、または本発明の組成物をトランスフェクトされた細胞は、組成物中にマーカーを含めることにより、インビトロまたはインビボで同定され得る。そのようなマーカーは、細胞に同定可能な変化を付与して、組成物をトランスフェクトされた細胞の簡単な同定を可能にする。一般的に、選択可能マーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。陽性選択可能マーカーは、その中でのマーカーの存在によって、その選択が可能になるものであり、一方で、陰性選択可能マーカーは、その中でのその存在によって、その選択が妨げられるものである。陽性選択可能マーカーの例は、薬物耐性マーカーまたは抗生物質耐性遺伝子/マーカーである。
ポリペプチドは、組成物中の核酸分子によりコードされ得る。特定の態様において、核酸分子は、核酸ベクターの形態であることができる。「ベクター」という用語を使用して、異種核酸配列を、それが複製され、発現されることができる細胞中への導入のために挿入することができる担体核酸分子を指す。核酸配列は、「異種」であることができ、それは、ベクターが導入される細胞または組み込まれた核酸に対して外来である状況にあることを意味し、それは、細胞または核酸中の配列に相同であるが、それが通常は見出されない宿主細胞または核酸内の位置にある、配列を含む。ベクターは、DNA、RNA、プラスミド、コスミド、ウイルス(バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス)、および人工染色体(例えばYAC)を含む。当業者は、十分に、標準的な組換え技術を介してベクターを構築するために十分に備えていると考えられる(例えば、Sambrook et al., 2001; Ausubel et al., 1996、両方とも参照により本明細書に組み入れられる)。ベクターは、抗体を産生するために宿主細胞中で使用され得る。
本開示の文脈において、「非改変オリゴヌクレオチド」という用語は、一般的にリボ核酸(RNA)またはデオキシリボ核酸(DNA)のオリゴマーまたはポリマーを指す。一部の態様において、核酸分子は、非改変オリゴヌクレオチドである。この用語は、天然の核酸塩基、糖、および共有結合ヌクレオシド間連結で構成される、オリゴヌクレオチドを含む。「オリゴヌクレオチドアナログ」という用語は、オリゴヌクレオチドと類似の様式で機能する1つまたは複数の非天然部分を有するオリゴヌクレオチドを指す。そのような非天然のオリゴヌクレオチドは、望ましい特性、例えば、増強された細胞取り込み、他のオリゴヌクレオチドまたは核酸標的についての増強された親和性、およびヌクレアーゼの存在における増加した安定性のために、天然の形態を上回って選択されることが多い。「オリゴヌクレオチド」という用語を、非改変オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を指すように使用することができる。
A.宿主細胞
本明細書において使用するとおり、「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」という用語は、互換的に使用してもよい。これらの用語の全てが、新たに単離した細胞と、エクスビボで培養された、活性化された、または増殖した細胞との両方を含む。これらの用語の全てが、それらの子孫も含み、それらは、任意のおよび全てのその後の世代である。全ての子孫が、計画的なまたは偶発性の変異のため、同一でなくてもよいことが理解される。異種核酸配列を発現するという文脈において、「宿主細胞」は、原核細胞または真核細胞を指し、それは、ベクターを複製することまたはベクターによりコードされた異種遺伝子を発現することが可能である任意の形質転換生物を含む。宿主細胞は、ベクターまたはウイルスのためのレシピエントとして使用することができかつ使用されてきた。宿主細胞は、「トランスフェクト」または「形質転換」されてもよく、「トランスフェクト」または「形質転換」は、組換えタンパク質をコードする配列などの外因性核酸が、1つのプロセスによって宿主細胞中に移入または導入される、該プロセスを指す。形質転換細胞は、初代対象細胞およびその子孫を含む。
特定の態様において、本明細書において記載する方法により産生される細胞および細胞株は、ひとたびゲノムDNAを改変されると治療的効果を提供するものである。初代細胞は、本明細書において記載する方法により単離、改変され得、処置される対象中への再導入のためにエクスビボで使用され得る。適切な初代細胞は、非限定的なCD4+T細胞またはCD8+T細胞などの、末梢血単核細胞(PBMC)、末梢血リンパ球(PBL)、および他の血液細胞のサブセットを含む。他の適切な初代細胞は、骨髄またはリンパ系前駆細胞などの前駆細胞を含む。適切な細胞はまた、例として胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、筋肉幹細胞、および皮膚幹細胞などの幹細胞を含む。例えば、iPSCは、関連付けられる公知の遺伝子変異に苦しむ患者からエクスビボで誘導することができ、この変異は、本明細書において記載する方法を使用して、野生型対立遺伝子に改変することができる。改変iPSCは次に、ドーパミン作動性ニューロンに分化させて、患者に再移植されることができる。別のエクスビボ治療的適用において、造血幹細胞は、公知の遺伝子変異に苦しむ患者から単離することができ、それを、次に、遺伝子変異を改変するために変更することができる。HSCは次に、治療的効果のために患者に戻して投与されることができるか、または患者への投与前に、より成熟した造血細胞に培養物中で分化させることができる。
において例示されている。下線を引いたグルタミン酸は、タンパク質の6番目のアミノ酸を表す。DNAレベルで、ゲノムDNAは、GAGからGTG変異を含み、それによって、E6V変異タンパク質がもたらされる。
特定の態様は、宿主細胞中への1つまたは複数の核酸分子の侵入を促進するための、エレクトロポレーションの使用を含む。
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれる。以下に続く実施例において開示される技術が、本発明の実施において十分に機能するために、本発明者により発見された技術を代表し、このように、その実施のための好ましい様式を構成すると考えることができることは、当業者により理解されるはずである。しかし、当業者は、本開示に照らして、多くの変化が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示される特定の態様において作られ、依然として同様または類似の結果を得ることができることを理解するはずである。
細胞培養:凍結保存されたPBMCを解凍し、RPMI-1640+10% FBS+100u/ml rhIL-2+抗生物質中で一晩培養した。組織培養フラスコ中の付着細胞を除去した。K562は、RPMI-1640+10%FBS+2mM L-グルタミン+抗生物質中で培養した。線維芽細胞はDMEM+10%FBS+抗生物質中で存在した。増殖させたT細胞は、活性化キットを用いて、プロトコールに従い、DynalbeadsヒトT-アクティベーターCD3/CD28(Invitrogen、Carlsbad CA)により活性化した。細胞は、活性化後に3~6日間トランスフェクトされた。
部位を標的にするCas9およびgRNA用の全キットを、St. Luise Genome Engineering CenterのWashington Universityから購入した。gRNA標的部位を含むゲノムDNAセグメントを増幅するためのプライマー
が、キット中に含まれた。約468bpアンプリコンを、さらなるCel-1アッセイ法およびHindIII消化アッセイ法のために使用し、その消化によって、ゲノムDNA改変が生じた場合、約170および298bpの各々の2つのバンドが与えられる。
本明細書において記載する方法は、遺伝的疾患を治癒させるために、患者の造血幹細胞(HSC)における疾患発症性の変異を修正するために使用してもよい。この実施例では、この疾患を治癒させるための慢性肉芽腫症(CGD)における変異を修正するための方法を記載する。この疾患は、本明細書において記載する遺伝子治療方法の概念証明を実証するだけでなく、またこの疾患のための治療的アプローチを進め、それは、依然として満たされていない課題である。CGDにおける遺伝的変異は周知であるため、疾患を有する細胞のインビトロ機能アッセイ法の技術は成熟しており、CGDの動物モデルが確立され、修正の低いパーセンテージは、有意な臨床的有効性に導くことができる。非ウイルスアプローチが、CRISPR(Cas9およびgRNA対)をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)および、位置676でのエクソン7に位置付けられるgp91phox遺伝子中で最もよく見られる変異(「ホットスポット」)を標的にするDNAオリゴマーを送達するために使用され、「T」(疾患表現型をもたらす)から「C」(つまり、正常細胞中でよく見られる)に変換する。CRISPRの送達は、MaxCyteのcGMPおよび規制準拠クローズシステムフローエレクトロポレーションプラットフォームの使用により促進される。
遺伝的疾患は、我々の社会で満たされていない課題である。CGDまたは鎌状赤血球症などの多くの遺伝的疾患は、抗菌/抗カビ予防法、CGDのためのIFN-rおよび鎌状赤血球症のための輸血を使用するなどの、症状を制御する能力のみを用いて治療されてきた。疾患を治癒する有効な方法の欠如により、CGD患者のために抗生物質/抗菌治療において有意な進歩がなされたが、残念ながらCGDを有する患者は、重篤で致命的でさえある再発性感染症を発症する。幹細胞移植は疾患を治癒することができるが、それは、厳密に適合するドナーが必要であり、ドナーを見つけるのが困難であり、適用可能性が限定される。
遺伝子修復は、特異的なヌクレアーゼおよびドナーDNAを必要とする。遺伝子修復の効率は、ヌクレアーゼのターゲティング部分(CRISPRのためのgRNA)およびドナーDNAの配列部分を最適化することによって達成することができる。gRNAの作製における現在の実施は、gRNA(キャップ形成無しおよびテール付加無し)をインビトロ転写すること、または、gRNAを全体的に(約100mer)もしくは2つのセグメント(二重鎖)で合成することである。gRNAを作製するためのインビトロ転写について、現在の実施においてはキャップ形成またはテール付加がない(技術サポート由来の以前の3枚のスライドを参照されたい)。
SEQUENCE LISTING
<110> MAXCYTE, INC.
<120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODIFYING GENOMIC DNA
<150> US 62/365,126
<151> 2016-07-21
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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atggtgcatc tgactcctgt ggagaagtct gccgttactt accacgtaga ctgaggacac 60
ctcttcagac ggcaatga 78
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Nucleic Acid
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atggtgcatc tgactcctga ggagaagtct gccgttact 39
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<211> 78
<212> DNA
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ctcttcagac ggcaatga 78
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tttttttttt tttttttttt tttttttttt aaaagcaccg actcggtgcc 50
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 26
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1 5 10 15
Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu
20 25 30
Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp
35 40 45
Leu Ser Thr Pro Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His
50 55 60
Gly Lys Lys Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp
65 70 75 80
Asn Leu Lys Gly Thr Phe Ala Thr Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys
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Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val
100 105 110
Cys Val Leu Ala His His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln
115 120 125
Ala Ala Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His
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Lys Tyr His
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<212> PRT
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Met Gly Asn Trp Ala Val Asn Glu Gly Leu Ser Ile Phe Val Ile Leu
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Val Trp Leu Gly Leu Asn Val Phe Leu Phe Val Trp Tyr Tyr Arg Val
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Tyr Asp Ile Pro Pro Lys Phe Phe Tyr Thr Arg Lys Leu Leu Gly Ser
35 40 45
Ala Leu Ala Leu Ala Arg Ala Pro Ala Ala Cys Leu Asn Phe Asn Cys
50 55 60
Met Leu Ile Leu Leu Pro Val Cys Arg Asn Leu Leu Ser Phe Leu Arg
65 70 75 80
Gly Ser Ser Ala Cys Cys Ser Thr Arg Val Arg Arg Gln Leu Asp Arg
85 90 95
Asn Leu Thr Phe His Lys Met Val Ala Trp Met Ile Ala Leu His Ser
100 105 110
Ala Ile His Thr Ile Ala His Leu Phe Asn Val Glu Trp Cys Val Asn
115 120 125
Ala Arg Val Asn Asn Ser Asp Pro Tyr Ser Val Ala Leu Ser Glu Leu
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Gly Asp Arg Gln Asn Glu Ser Tyr Leu Asn Phe Ala Arg Lys Arg Ile
145 150 155 160
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165 170 175
Ile Thr Gly Val Val Ile Thr Leu Cys Leu Ile Leu Ile Ile Thr Ser
180 185 190
Ser Thr Lys Thr Ile Arg Arg Ser Tyr Phe Glu Val Phe Trp Tyr Thr
195 200 205
His His Leu Phe Val Ile Phe Phe Ile Gly Leu Ala Ile His Gly Ala
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Glu Arg Ile Val Arg Gly Gln Thr Ala Glu Ser Leu Ala Val His Asn
225 230 235 240
Ile Thr Val Cys Glu Gln Lys Ile Ser Glu Trp Gly Lys Ile Lys Glu
245 250 255
Cys Pro Ile Pro Gln Phe Ala Gly Asn Pro Pro Met Thr Trp Lys Trp
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Ile Val Gly Pro Met Phe Leu Tyr Leu Cys Glu Arg Leu Val Arg Phe
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Trp Arg Ser Gln Gln Lys Val Val Ile Thr Lys Val Val Thr His Pro
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Phe Lys Thr Ile Glu Leu Gln Met Lys Lys Lys Gly Phe Lys Met Glu
305 310 315 320
Val Gly Gln Tyr Ile Phe Val Lys Cys Pro Lys Val Ser Lys Leu Glu
325 330 335
Trp His Pro Phe Thr Leu Thr Ser Ala Pro Glu Glu Asp Phe Phe Ser
340 345 350
Ile His Ile Arg Ile Val Gly Asp Trp Thr Glu Gly Leu Phe Asn Ala
355 360 365
Cys Gly Cys Asp Lys Gln Glu Phe Gln Asp Ala Trp Lys Leu Pro Lys
370 375 380
Ile Ala Val Asp Gly Pro Phe Gly Thr Ala Ser Glu Asp Val Phe Ser
385 390 395 400
Tyr Glu Val Val Met Leu Val Gly Ala Gly Ile Gly Val Thr Pro Phe
405 410 415
Ala Ser Ile Leu Lys Ser Val Trp Tyr Lys Tyr Cys Asn Asn Ala Thr
420 425 430
Asn Leu Lys Leu Lys Lys Ile Tyr Phe Tyr Trp Leu Cys Arg Asp Thr
435 440 445
His Ala Phe Glu Trp Phe Ala Asp Leu Leu Gln Leu Leu Glu Ser Gln
450 455 460
Met Gln Glu Arg Asn Asn Ala Gly Phe Leu Ser Tyr Asn Ile Tyr Leu
465 470 475 480
Thr Gly Trp Asp Glu Ser Gln Ala Asn His Phe Ala Val His His Asp
485 490 495
Glu Glu Lys Asp Val Ile Thr Gly Leu Lys Gln Lys Thr Leu Tyr Gly
500 505 510
Arg Pro Asn Trp Asp Asn Glu Phe Lys Thr Ile Ala Ser Gln His Pro
515 520 525
Asn Thr Arg Ile Gly Val Phe Leu Cys Gly Pro Glu Ala Leu Ala Glu
530 535 540
Thr Leu Ser Lys Gln Ser Ile Ser Asn Ser Glu Ser Gly Pro Arg Gly
545 550 555 560
Val His Phe Ile Phe Asn Lys Glu Asn Phe
565 570
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Nucleic Acid
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ggggccacta gggacaggat tgg 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Nucleic Acid
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Nucleic Acid
<400> 30
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Nucleic Acid
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, or t
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Nucleic Acid
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<222> (21)..(21)
<223> n is a, c, g, or t
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cacccagatg aattgtacgt ngg 23
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<212> DNA
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<223> n is a, c, g, or t
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tgcccacgta caattcatct ngg 23
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<223> Synthetic Nucleic Acid
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<222> (21)..(21)
<223> n is a, c, g, or t
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agtccagatc atttagtaat ngg 23
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acatttttca cccagatgaa ttgtacgtgg gcagaccgca gagagtttgg c 51
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Nucleic Acid
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ctattactaa atgatctgga cttacatttt tcacccagac gaattgtacg tgggcagacc 60
gcagagagtt tggctgtgca taatataaca gtttgtgaa 99
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Nucleic Acid
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tcttttaata aaacaattta atttcctatt actaaatgat ctggacttac atttttcacc 60
cagatgaatt gtacgtgggc agaccgcaga gagtttggct gtgcataata taacagtttg 120
tgaacaaaaa atctcagaat ggggaa 146
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Nucleic Acid
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cagagcactt aaaatatatg cagaatcttt taataaaaca atttaatttc ctattactaa 60
atgatctgga cttacatttt tcacccagat gaattgtacg tgggcagacc gcagagagtt 120
tggctgtgca taatataaca gtttgtgaac aaaaaatctc agaatgggga aaaataaagg 180
aatgcccaat ccctca 196
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Nucleic Acid
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cacccagatg aattgtacgt ngg 23
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ttaatacgac tcactatagg cacccagatg aattgtacgt 40
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<223> Synthetic Nucleic Acid
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aaaagcaccg actcggtgcc 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Nucleic Acid
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ctattactaa atgatctgga cttacatttt tcacccagac gaattgtacg tgggcagacc 60
gcagagagtt tggctgtgca taatataaca gtttgtgaac 100
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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tgttatatta tgcacagcca aactctctgc ggtctgccca cgtacaattc gtctgggtga 60
aaaatgtaag tccagatcat ttagtaatag gaaattaaat 100
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ttaatacgac tcactatagg ttctcatcga aaagttcccg 40
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aaaagcaccg actcggtgcc 20
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Nucleic Acid
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gttggcagtt gatagactgc agcatgctta tgacagcgtt ctcaccgaaa agttcccgtg 60
gtattcagta acaagatcct ctaggttctt cagggtggga 100
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic Nucleic Acid
<400> 48
tcccaccctg aagaacctag aggatcttgt tactgaatac cacgggaact tttcggtgag 60
aacgctgtca taagcatgct gcagtctatc aactgccaac 100
Claims (81)
- (a)DNAオリゴと(b)DNA消化作用物質と(c)キャップ形成および/またはポリアデニル化されているターゲティングRNAとを含む組成物を、エレクトロポレーションにより細胞にトランスフェクトする工程
を含む、該細胞における標的ゲノムDNA領域の部位特異的な配列改変のための方法であって、
該DNAオリゴが、
(i)該標的ゲノムDNA領域に相同なDNA配列を含む相同領域と、
(ii)配列改変領域と
を含み、かつ
該標的ゲノムDNA領域においてゲノムDNA配列が特異的に改変される、方法。 - エレクトロポレーションが、フローエレクトロポレーションデバイスを用いるフローエレクトロポレーションである、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA消化作用物質がヌクレアーゼである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼがCas9を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが部位特異的なヌクレアーゼである、請求項3または4に記載の方法。
- 前記ターゲティングRNAがガイドRNAを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記ターゲティングRNAが、キャップ形成およびポリアデニル化されている、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ターゲティングRNAが、インビトロでキャップ形成およびポリアデニル化されている、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴが一本鎖である、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DNAオリゴおよび前記ターゲティングRNAが、前記標的ゲノムDNA領域の同じ鎖に相補的である、請求項9に記載の方法。
- 前記DNAオリゴが10個超の核酸である、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DNAオリゴが10~800個の核酸である、請求項11に記載の方法。
- 前記DNAオリゴが10~600個の核酸である、請求項12に記載の方法。
- 前記DNAオリゴが10~200個の核酸である、請求項13に記載の方法。
- 前記DNAオリゴが10~100個の核酸である、請求項14に記載の方法。
- 前記DNAオリゴが10~50個の核酸である、請求項15に記載の方法。
- 前記組成物中の前記DNAオリゴの濃度が10μg/mLを上回る、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物中の前記DNAオリゴの濃度が約10μg/mL~約500μg/mLである、請求項17に記載の方法。
- 前記組成物中の前記DNAオリゴの濃度が約35μg/mL~約300μg/mLである、請求項18に記載の方法。
- 前記組成物中の前記DNAオリゴの濃度が約35μg/mL~約200μg/mLである、請求項19に記載の方法。
- 前記組成物が非ウイルス性である、請求項1~20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項1~21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞がヒト細胞である、請求項22に記載の方法。
- 前記細胞が線維芽細胞である、請求項22に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞が末梢血リンパ球である、請求項22に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞が、増殖したT細胞である、請求項22に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞が幹細胞である、請求項22に記載の方法。
- 前記幹細胞が造血幹細胞である、請求項27に記載の方法。
- 前記細胞が間葉系幹細胞である、請求項27に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞が初代細胞である、請求項22に記載の方法。
- 前記ゲノムDNA配列が疾患関連遺伝子を含む、請求項1~30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ゲノムDNA配列がHBB遺伝子を含む、請求項1~31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記配列改変が前記ゲノムDNAの修正であり、該修正により前記HBB遺伝子の6番目のコドンがグルタミン酸コドンに改変される、請求項32に記載の方法。
- 前記疾患が慢性肉芽腫性疾患である、請求項31に記載の方法。
- 前記ゲノムDNA配列がgp91phox遺伝子を含む、請求項31または34に記載の方法。
- 前記オリゴが、核酸少なくとも10個の相同配列を含む、請求項1~35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴが、核酸少なくとも20個の相同配列を含む、請求項36に記載の方法。
- 前記オリゴが、核酸少なくとも30個の相同配列を含む、請求項37に記載の方法。
- 前記配列改変の効率が3%超である、請求項1~38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記配列改変の効率が5%超である、請求項39に記載の方法。
- 前記配列改変の効率が10%超である、請求項40に記載の方法。
- エレクトロポレーション後の細胞生存率が少なくとも30%である、請求項1~41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記エレクトロポレーション後の細胞生存率が少なくとも40%である、請求項42に記載の方法。
- 前記エレクトロポレーション後の細胞生存率が少なくとも50%である、請求項43に記載の方法。
- 前記DNA配列改変が、1つまたは複数の終止コドンである、請求項1~44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物が、異なる相同配列を有する2つまたはそれ以上のDNAオリゴを含む、請求項1~45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物が、2つまたはそれ以上のDNA消化作用物質を含む、請求項46に記載の方法。
- 前記組成物が、2つまたはそれ以上の部位特異的なDNA消化作用物質を含み、該DNA消化作用物質が、異なるゲノム部位を標的にする、請求項47に記載の方法。
- 前記配列改変により前記ゲノム配列の1塩基対または複数の塩基対が変化する、請求項1~48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記配列改変により前記ゲノム配列の1塩基対または複数の塩基対が付加される、請求項1~48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記配列改変により前記ゲノム配列の1塩基対または複数の塩基対が欠失する、請求項1~48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が患者から単離された細胞である、請求項1~51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が凍結保存されている、請求項52に記載の方法。
- 前記細胞のトランスフェクション前1週間以内の時期に該細胞が前記患者から単離された、請求項52に記載の方法。
- 前記細胞のトランスフェクション前1日以内の時期に該細胞が前記患者から単離された、請求項52に記載の方法。
- 前記単離された細胞が凍結されていない、請求項52~55のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単離された細胞が、2つまたはそれ以上の異なる細胞型を含む、請求項52~56のいずれか一項に記載の方法。
- 前記2つまたはそれ以上の異なる細胞型が、多能性に関する異なる段階における2つまたはそれ以上の細胞型を含む、請求項52~56のいずれか一項に記載の方法。
- 前記配列改変の効率が3%超である、請求項52~58のいずれか一項に記載の方法。
- 前記配列改変の効率が5%超である、請求項59に記載の方法。
- 前記配列改変の効率が10%超である、請求項60に記載の方法。
- 前記エレクトロポレーション後の細胞生存率が少なくとも30%である、請求項52~61のいずれか一項に記載の方法。
- 前記エレクトロポレーション後の細胞生存率が少なくとも40%である、請求項62に記載の方法。
- 前記エレクトロポレーション後の細胞生存率が少なくとも50%である、請求項63に記載の方法。
- 前記細胞が対象の骨髄から単離されている、請求項52~64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が幹細胞を含む、請求項52~65のいずれか一項に記載の方法。
- 前記幹細胞が造血幹細胞を含む、請求項66に記載の方法。
- 前記幹細胞が細胞表面マーカーCD34+を含む、請求項67に記載の方法。
- 前記DNA配列改変を有するクローン細胞を産生するために、単離および選択されたクローン細胞を増殖させる工程をさらに含む、請求項1~68のいずれか一項に記載の方法。
- 大規模製造のために細胞を増殖させる、請求項69に記載の方法。
- 1L超の体積で細胞を増殖させる、請求項69または70に記載の方法。
- 3Lまたはそれ以上の体積で細胞を増殖させる、請求項71に記載の方法。
- 前記細胞が無血清培地中で培養される、請求項1~72のいずれか一項に記載の方法。
- 前記配列改変について前記細胞をスクリーニングする工程をさらに含む、請求項1~73のいずれか一項に記載の方法。
- トランスフェクトされた細胞を凍結させる工程をさらに含む、請求項1~74のいずれか一項に記載の方法。
- 以前に凍結させたトランスフェクトされた細胞を増殖させる工程をさらに含む、請求項1~75のいずれか一項に記載の方法。
- (a)DNAオリゴと(b)DNA消化作用物質と(c)キャップ形成および/またはポリアデニル化されているターゲティングRNAとを含む組成物を、エレクトロポレーションにより細胞にトランスフェクトする工程であって、
ドナーDNAが、
(i)標的ゲノムDNA領域に相同な核酸配列を含む相同領域と、
(ii)配列改変領域と
を含む、工程;および
該標的ゲノムDNA領域におけるゲノムDNA配列改変について、トランスフェクトされた細胞をスクリーニングする工程;
クローン細胞を得るために、スクリーニングしたトランスフェクトされた細胞を限界希釈により単離する工程;
該ゲノムDNA配列改変を含む安定な細胞株を産生するために、単離したトランスフェクトされた細胞を増殖させる工程
を含む、該標的ゲノムDNA配列の該ゲノムDNA配列改変を含む安定な細胞株を産生するための方法。 - 請求項77に記載の方法により産生された細胞株。
- 請求項1~78のいずれか一項に記載の方法を使用して産生された、エレクトロポレーションされた細胞。
- 請求項79に記載のエレクトロポレーションされた細胞または請求項78に記載の細胞株の有効量を投与することにより、疾患もしくは状態を有するかまたは疾患もしくは状態を有することが疑われる対象を処置する方法。
- 請求項79に記載のエレクトロポレーションされた細胞または請求項78に記載の細胞株の有効量を投与する工程を含む、臨床研究方法。
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