JP2022531539A - 編集ヌクレオチド配列を編集するための方法および組成物 - Google Patents

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Abstract

本開示は、プライム編集のための新しいプライム編集因子ガイドRNA、プライム編集のための構築物、および同構築物を使用するための方法を提供する。加えて、本開示は、ヌクレオチド変化および/または標的にされた変異誘発の組み込み(例として、挿入もしくは欠失)を可能にさせる、標的DNA分子(例として、ゲノム)のプライム編集を行うための組成物および方法を提供する。ヌクレオチド変化は、単一ヌクレオチドの変化(例として、いずれのトランジション、もしくはいずれのトランスバージョン)、1以上のヌクレオチドの挿入、または1以上のヌクレオチドの欠失を包含し得る。とりわけ、本開示は、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)とポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)とを含む融合タンパク質を提供するが、これはプライム編集因子RNA(PEgRNA)によって特定のDNA配列へガイドされる。プライム編集因子ガイドRNAは、単鎖DNAフラップをコードするDNA合成鋳型配列を提供する伸長アームを含み、前記フラップは、内生DNA配列と相同であるが、所望の1以上のヌクレオチド変化を含有しており、ポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)による合成後に標的DNA分子中へ組み込まれる。

Description

政府の支援
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金第U01AI142756号、第RM1HG009490号、第R01EB022376号、および第R35GM118062号の下、政府の支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
関連出願および参照による組み込み
この米国仮出願は、以下の出願、つまり、2019年3月19日出願の米国仮出願第62/820,813号(代理人整理番号B1195.70074US00)、2019年6月7日出願の米国仮出願第62/858,958号(代理人整理番号B1195.70074US01)、2019年8月21日出願の米国仮出願第62/889,996号(代理人整理番号B1195.70074US02)、2019年8月21日出願の米国仮出願第62/922,654号(代理人整理番号B1195.70083US00)、2019年10月10日出願の米国仮出願第62/913,553号(代理人整理番号B1195.70074US03)、2019年10月10日出願の米国仮出願第62/973,558号(代理人整理番号B1195.70083US01)、2019年11月5日出願の米国仮出願第62/931,195号(代理人整理番号B1195.70074US04)、2019年12月5日出願の米国仮出願第62/944,231号(代理人整理番号B1195.70074US05)、2019年12月5日出願の米国仮出願第62/974,537号(代理人整理番号B1195.70083US02)、2020年3月17日出願の米国仮出願第62/991,069号(代理人整理番号B1195.70074US06)、および2020年3月17日出願の米国仮出願(これを出願する時点で連番は入手不可能)(代理人整理番号B1195.70083US03)を指し、参照により組み込む。
参照による配列表の組み込み
37CFR§1.52(e)に準じ、本明細書は、本明細書と同時に提出されたコンパクトディスク(2コピー)上の配列表を包含する。37CFR§1.52(e)(5)により必要に応じ、出願人ははっきりと、2020年3月19日に作成されサイズが371.109MBである「B119570083WO00-SEQ.txt」に指定されるファイル中の、コンパクトディスク上に位置付けられる情報および材料のすべてを参照により組み込む。この陳述によって、配列表は本明細書の一部を構成する。コンパクトディスクは他のファイルは含有していない。
本発明の背景
病原性のある単一ヌクレオチド突然変異は、遺伝的要素が存在するヒト疾患のおよそ67％に寄与する7。残念ながら、これら遺伝性障害をもつ患者にとっての処置の選択肢は、数十年に及ぶ遺伝子治療探索に関わらず、依然として極度に限定的である8。おそらく、この治療上の課題への最も簡単な解決策の1つは患者ゲノム中の単一ヌクレオチド突然変異の直接的な修正であって、これは疾患の根本的原因に対処し、かつ永続する恩恵を提供するかもしれない。かかるストラテジーはこれまでに考えられないことであったが、CRISRP/Cas系9の到来によってもたらされたゲノム編集性能における近年の改善は今や、この治療的アプローチを射程圏内に入れる。標的DNA配列に相補的な～20ヌクレオチドを含有するガイドRNA(gRNA)配列の簡単なデザインによって、想定されるほぼ全てのゲノム部位は、CRISPR関連(Cas)ヌクレアーゼによって特異的にアクセスされ得る1,2。今日まで、数種の単量体細菌性Casヌクレアーゼ系が同定されており、ゲノム編集用途に適応された10。このCasヌクレアーゼの天然の多様性は、増え続ける改変バリアントの一群と併せて11～14、新しいゲノム編集技術を開発するための肥沃な土壌を用意する。
CRISPRでの遺伝子破壊は今や成熟した技法であるとはいえ、ヒトゲノム中の単一塩基対の高精度編集は依然として大きな課題である3。相同組み換え修復(Homology directed repair)(HDR)は長い間、ヒト細胞および他の生物において、所望の編集をコードするドナーDNA修復鋳型を使用しDNA配列を二本鎖切断(double strand break)(DSB)の部位にて挿入、修正、または交換(exchange)するために使用されてきた15。しかしながら、既存のHDRは、ほとんどのヒト細胞型において、具体的に非分裂細胞において、極めて低い効率を有し、両立しない非相同末端結合(non-homologous end joining)(NHEJ)は、主として挿入-欠失(インデル(indel))副産物に繋がる16。他の問題点はDSBの生成に関するが、これは標的遺伝子座にて大きな染色体再配置および欠失を生じさせ得るか17、または成長停止(growth arrest)およびアポトーシスに繋がるp53軸を活性化する18,19。
数種のアプローチがHDRの欠点に対処するために探索されてきた。例えば、単鎖DNA破壊(ニック)のオリゴヌクレオチドドナーでの修復は、インデル形成を低減することが示されたが、所望の修復産物の収率は依然として低い20。他のストラテジーは、小分子および生物学的試薬を使用して修復をNHEJよりHDRへ向かうよう偏らせることを試みている21～23。しかしながら、これらの方法の有効性は細胞型に依存しており、正常な細胞状態の撹乱は、望ましくなくかつ予測不可能な効果へ繋がり得る。
近年、Liuらは、DSBを創出することもHDRに頼ることもなく標的ヌクレオチドを編集する技術として塩基編集を開発した4～6,24～27。Cas融合デアミナーゼによるDNA塩基の直接修飾は、高効率の短い標的窓(short target window)(～5～7塩基)におけるC・G→T・AまたはA・T→G・C塩基対変換を可能にさせる。結果として、塩基編集因子(base editors)は科学界によって迅速に採用された。しかしながら、数種の因子は、高精度ゲノム編集のためのそれらの一般性を限定することもある。
したがって、ヌクレオチド挿入または欠失(例として、少なくとも1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、もしくはそれより多くの塩基対の挿入または欠失)を組み入れ得るか、および/または標的部位にてヌクレオチド配列を高い特異性および効率で変更もしくは修飾し得る、所望されるいずれの単一または複数のヌクレオチド変化も導入することが可能なプログラム型編集因子の開発は、CRISPRに基づくゲノム編集技術の範囲(scope)および治療可能性を実質的に拡大するであろう。
本発明の概要
本発明は、本明細書に記載の特化されたアルゴリズムを使用してデザインされたPEgRNAを使用し、治療標的(例として、クリンバー(ClinVar)データベースにおいて同定されたそれら標的)を修復するプライム編集(PE)を使用するための、新しい組成物(例として、新しいPEgRNAおよび同PEgRNAを含むPE複合体)および方法を開示した。よって、一側面において、本出願は、治療標的(例として、クリンバーデータベースに包含される治療標的)を修復するために使用されてもよいPEgRNAの配列を大規模に予測するためのアルゴリズムを開示する。加えて、本出願は、デザインされた治療的PEgRNA、および開示されたアルゴリズムを使用してデザインされ得る治療的PEgRNA、およびプライム編集で治療標的を修復するのに使用されてもよい治療的PEgRNAの、予測される配列を開示する。
本明細書に開示されるアルゴリズムおよび予測されるPEgRNA配列は一般に、プライム編集に関する。よって、本開示はまた、本明細書に開示の治療的PEgRNAとともに使用されてもよい、好適なnapDNAbp(例として、Cas9ニッカーゼ)およびポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)、ならびに他の好適な構成要素(例として、リンカー、NLS)およびPE融合タンパク質を包含する、プライム編集の様々な構成要素および側面のための記載も提供する。
本明細書に開示のとおり、プライム編集は、ポリメラーゼ(すなわち、融合タンパク質の形態であるか、または別様にnapDNAbpとはtransで提供される)と共働する核酸プログラム型DNA結合タンパク質(「napDNAbp」)を使用して、新しい遺伝情報を特定DNA部位中へ直接書き込む多目的かつ正確なゲノム編集方法であるが、プライム編集系は、ガイドRNA上へ(例として、ガイドRNAの5'末もしくは3'末にて、または内部にて)改変される伸長(extension)(DNAまたはRNAのいずれか)を経由する置き換えDNA鎖の形態での所望の編集の合成のための標的部位と鋳型との両方を特定するプライム編集(PE)ガイドRNA(「PEgRNA」)でプログラムされる。所望の編集(例として、単一核酸塩基の置換)を含有する置き換え鎖は、編集されるべき標的部位(それが所望の編集を包含するのは例外として)の内生鎖と同じ配列を共有する。DNA修復および/または複製機構を通して、標的部位の内生鎖は、所望の編集を含有する新しく合成された置き換え鎖によって置き換えられる。いくつかのケースにおいて、本明細書に記載のとおりのプライム編集因子は、編集されるべき所望の標的部位を探査し位置付けるのみならず、同時に、内生DNA鎖の対応する標的部位の代わりに組み入れられる所望の編集を含有する置き換え鎖をコードするところ、プライム編集は「探査-と-置き換え(search-and-replace)」ゲノム編集技術であると考えられることもある。本開示のプライム編集因子は、標的にプライムされた(target-primed)逆転写(TPRT)または「プライム編集」の機序が、効率および遺伝子の融通性(genetic flexibility)が高い高精度CRISPR/Casベースのゲノム編集を(例として、図1A～1Fの様々な態様において描かれているとおり)行うために活用または採用され得るという発見に、一部関する。TPRTは天然には、哺乳動物の非LTRレトロトランスポゾンおよび細菌のグループIIイントロンなどの可動DNA因子(mobile DNA elements)によって使用される28,29。本発明者らは本明細書中、特定のDNA配列をガイドRNAで標的にし、標的部位にて単鎖ニックを生成し、およびニック入りDNAを、ガイドRNAで取り入れられた改変逆転写酵素鋳型の逆転写のためのプライマーとして使用する、Casタンパク質-逆転写酵素の融合体または関連する系を使用している。しかしながら、この概念は逆転写酵素をDNAポリメラーゼの構成要素として使用するプライム編集因子から始まったものの、本明細書に記載のプライム編集因子は逆転写酵素に限定されず、事実上はDNAポリメラーゼの使用を包含していてもよい。実際に本出願は全体を通し「逆転写酵素」をもつプライム編集因子に言及することもあるが、逆転写酵素は、プライム編集で働き得る唯一のタイプのDNAポリメラーゼであることが本明細書に説明されている。よって、本明細書のどこで「逆転写酵素」に言及しようとも、当業者は、いずれの好適なDNAポリメラーゼも逆転写酵素の代わりに使用されてもよいことを解するはずである。よって、一側面において、プライム編集因子は、標的DNA中の相補的なプロトスペーサーとアニールするスペーサー配列を含有する特化されたガイドRNA(すなわち、PEgRNA)とDNA配列を結び付けることによってDNA配列を標的にするようプログラムされているCas9(または等価なnapDNAbp)を含んでいてもよい。特化されたガイドRNAはまた、対応する内生DNA鎖を標的部位にて置き換えるために使用される所望の遺伝子変更を含有するDNAの置き換え鎖をコードする伸長という形態で、新しい遺伝情報も含有する。情報をPEgRNAから標的DNAへ伝達するため、プライム編集の機序は、3'ヒドロキシル基を晒すDNAの一方の鎖中の標的部位にニックを入れることを伴う。晒される3'ヒドロキシル基は次いで、PEgRNA上の、編集をコードする伸長の、標的部位中への直接的なDNA重合をプライムするのに使用され得る。様々な態様において、伸長－これは編集を含有する置き換え鎖の重合のための鋳型を提供する－は、RNAまたはDNAから形成され得る。RNA伸長のケースにおいて、プライム編集因子のポリメラーゼは、RNA依存性DNAポリメラーゼ(逆転写酵素など)であり得る。DNA伸長のケースにおいて、プライム編集因子のポリメラーゼは、DNA依存性DNAポリメラーゼであってもよい。
本明細書に開示のプライム編集因子によって形成された、新しく合成された鎖(すなわち、所望の編集を含有する置き換えDNA鎖)は、所望のヌクレオチド変化(例として、単一ヌクレオチドの変化、欠失、もしくは挿入、またはそれらの組み合わせ)を包含することを除けば、ゲノムの標的配列と相同である(すなわち、これと同じ配列を有する)であろう。新しく合成された(または置き換え)DNAの鎖はまた、単鎖DNAフラップと称されることもあるが、これはハイブリダイゼーションを相補的な相同の内生DNA鎖と競合し、これによって対応する内生鎖に取って代わる。ある態様において、系は、エラーを起こしやすい(error-prone)逆転写酵素(例として、Cas9ドメインとの融合タンパク質として提供されるか、またはCas9ドメインとはtransで提供される)の使用と組み合わせられ得る。エラーを起こしやすい逆転写酵素は、単鎖DNAフラップ合成の最中に変更を導入し得る。よって、ある態様において、エラーを起こしやすい逆転写酵素は、ヌクレオチド変化を標的DNAへ導入するために利用され得る。系とともに使用される、エラーを起こしやすい逆転写酵素に応じて、変化はランダムまたは非ランダムであり得る。
ハイブリダイズされた中間体(内生DNA鎖とハイブリダイズされた逆転写酵素によって合成された単鎖DNAフラップを含む)の分解は、その結果得られる内生DNAの、取って代わられたフラップの(例として、5'末DNAフラップエンドヌクレアーゼ、FEN1での)除去、合成された単鎖DNAフラップの標的DNAへのライゲーション、ならびに細胞のDNA修復および/または複製プロセスの結果としての所望のヌクレオチド変化の同化を包含し得る。鋳型化(templated)DNA合成が、単一ヌクレオチドという高精度を、挿入および欠失を包含する、いずれのヌクレオチドの修飾にも付与することから、このアプローチの幅は極めて広く、基礎科学および治療法における無数の用途に使用され得ることが予見できる。
治療的PEgRNAをデザインするアルゴリズムおよび方法
一側面において、本開示は、単発のPEgRNAデザイン演習とは反対に、治療的PEgRNAを、とりわけ大規模にデザインするための新規アルゴリズムに関する。
結果的に、いくつかの側面は、プライム編集因子ガイドRNA(PEgRNA)の配列を決定するための、コンピュータによる方法に関する。方法は、入力アレル、出力アレル、および核酸プログラム型DNA結合タンパク質とポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)とを含む融合タンパク質を示すデータにアクセスする少なくとも1つのコンピュータハードウェアプロセッサを使用することを包含する。方法は、入力アレル、出力アレル、および融合タンパク質に基づきPEgRNA配列を決定することを包含するが、ここでPEgRNA配列は、入力アレルを出力アレルへ変化させる融合タンパク質と結び付くようにデザインされ、PEgRNA配列について以下の特色の1以上を決定することを包含する:入力アレル中の標的ヌクレオチド配列に相補的なスペーサー(すなわち、図27に定義されるとおりのスペーサー);融合タンパク質と相互作用するためのgRNA主鎖(すなわち、図27に定義されるとおりのgRNAコア);および以下の1以上を含む伸長(すなわち、図27に示されるとおりの伸長アーム):入力アレルを出力アレルへ変化させる所望のヌクレオチド変化を含むDNA合成鋳型(図27に示されるとおり);プライマー結合部位(すなわち、図27に示されるとおりのプライマー結合部位)。PEgRNAはまた、プロモーターからの転写を終止する3'終止シグナルも含んでいてもよい。加えて、PEgRNAは、第1修飾因子(modifier)を伸長アームの5'末にて、および第2修飾因子を伸長アームの3'末にて包含していてもよい。かかる配列(図27中「e1」および「e2」として示される)は、PEgRNAの安定性を増大させることもあるステムループ配列を包含していてもよい。
いくつかの例において、方法は、スペーサーおよび伸長を決定すること、ならびにスペーサーがPEgRNAの5'末にあり、および伸長がPEgRNA構造3'末にあることを決定することを包含する。
いくつかの例において、方法は、スペーサーおよび伸長を決定すること、ならびにスペーサーがPEgRNAの5'末にあり、および伸長がスペーサーに対して3'末にあることを決定することを包含する。
いくつかの例において、入力アレルおよび出力アレルを示すデータにアクセスすることは、入力アレルと関連出力アレル一式を含むデータベースにアクセスすることを含む。データベースにアクセスすることは、複数のエントリーを含む国立バイオテクノロジー情報センターのクリンバーデータベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)にアクセスすることを包含し得るが、各エントリーは、入力アレル一式から入力アレルを、および出力アレル一式から出力アレル(例として、野生型または所望の活性をもつアレル)を含む。PEgRNA配列を決定することは、1以上のPEgRNA配列について、前記一式中の各入力アレルと関連出力アレルを決定することを包含し得る。
いくつかの例において、その融合タンパク質を示すデータにアクセスすることは、複数の融合タンパク質からその融合タンパク質を決定することを包含する。
いくつかの例において、融合タンパク質は、Cas9タンパク質を含む。融合タンパク質は、Cas9-NGタンパク質、Cas9-NGG、saCas9-KKH、またはSpCas9タンパク質を包含し得る。
いくつかの例において、入力アレルを出力アレルへ変化させることは、単一ヌクレオチドの変化、1以上のヌクレオチドの挿入、1以上のヌクレオチドの欠失、またはそれらの組み合わせを包含する。
いくつかの態様において、方法は、スペーサーを決定することを包含するが、ここでスペーサーは、1ヌクレオチドと40ヌクレオチドとの間のヌクレオチド配列を包含する。いくつかの態様において、方法は、スペーサーを決定することを包含するが、ここでスペーサーは、5ヌクレオチドと35ヌクレオチドとの間のヌクレオチド配列を包含する。いくつかの態様において、方法は、スペーサーを決定することを包含するが、ここでスペーサーは、10ヌクレオチドと30ヌクレオチドとの間のヌクレオチド配列を包含する。いくつかの態様において、方法は、スペーサーを決定することを包含するが、ここでスペーサーは、15ヌクレオチドと25ヌクレオチドとの間のヌクレオチド配列を包含する。いくつかの態様において、方法は、スペーサーを決定することを包含するが、ここでスペーサーは、およそ20ヌクレオチドのヌクレオチド配列を包含する。方法は、対応するプロトスペーサーヌクレオチド配列における変化の位置に基づきスペーサーを決定することを包含し得る。変化は、約プロトスペーサー位置-15～プロトスペーサー位置+39の間である編集窓(editing window)に組み入れられ得る。変化は、約プロトスペーサー位置-10～プロトスペーサー位置+34の間である編集窓に組み入れられ得る。変化は、約プロトスペーサー位置-5～プロトスペーサー位置+29の間である編集窓に組み入れられ得る。変化は、約プロトスペーサー位置-1～プロトスペーサー位置+27の間である編集窓に組み入れられ得る。
いくつかの例において、方法は以下を包含し得る:入力アレルおよび融合タンパク質に基づき、初期候補プロトスペーサー一式を決定すること(ここで各初期候補プロトスペーサーは、入力アレル中に融合タンパク質のPAMを含む);初期候補プロトスペーサー一式(各々は不適合のニック位置を含む)から1以上の初期候補プロトスペーサーを決定すること;前記一式から決定された1以上の初期候補プロトスペーサーを除去することで、残存する候補プロトスペーサー一式を生成すること;ここでPEgRNA構造を決定することは、複数のPEgRNA構造を決定することを含み、ここでPEgRNA構造の各々は、残存する候補プロトスペーサー一式からの対応するプロトスペーサーに基づき決定された異なるスペーサーを含む。
いくつかの例において、方法は、伸長およびDNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)を決定することを包含するが、ここでDNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)は、およそ1ヌクレオチド～40ヌクレオチドを含む。いくつかの例において、方法は、伸長およびDNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)を決定することを包含するが、ここでDNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)は、およそ3ヌクレオチド～38ヌクレオチドを含む。いくつかの例において、方法は、伸長およびDNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)を決定することを包含するが、ここでDNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)は、およそ5ヌクレオチド～36ヌクレオチドを含む。いくつかの例において、方法は、伸長およびDNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)を決定することを包含するが、ここでDNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)は、およそ7ヌクレオチド～34ヌクレオチドを含む。
いくつかの例において、PEgRNAを決定することは、入力アレルおよび/または融合タンパク質に基づきスペーサーを決定すること、ならびにスペーサーに基づきDNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)を決定することを包含する。
いくつかの例において、DNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)は、ニック部位に隣接する内生DNA配列に相補的な単鎖DNAフラップをコードするが、ここで単鎖DNAフラップは、所望のヌクレオチド変化を含む。単鎖DNAフラップは、ニック部位に隣接する内生DNA配列とハイブリダイズし、これによって所望のヌクレオチド変化が組み入れられ得る。単鎖DNAフラップは、ニック部位に隣接する内生DNA配列に取って代わることができる。単鎖DNAフラップの細胞修復は、所望のヌクレオチド変化組み入れをもたらし、これによって所望の産物が形成され得る。
いくつかの例において、融合タンパク質は、PEgRNAと複合体化されたとき、標的DNA配列へ結合することが可能である。標的DNA配列は、標的鎖を変化が生じるところにて、および相補的な非標的鎖を包含し得る。
いくつかの例において、入力アレルは、病原性のDNA突然変異を含み、出力アレルは、修正されたDNA配列を含む。
いくつかの態様は、少なくとも1つのプロセッサおよび少なくとも1つのコンピュータ可読記憶媒体(実行されたとき少なくとも1つのプロセッサに、PEgRNA構造を決定するためのコンピュータによる方法を実施させる、前記記憶媒体にコードされる指示を有する)を包含する系に関する。
いくつかの態様は、少なくとも1つのコンピュータ可読記憶媒体であって、実行されたとき少なくとも1つのプロセッサに、PEgRNAの配列を決定するためのコンピュータによる方法を実施させる、前記記憶媒体にコードされる指示を有する、前記コンピュータ可読記憶媒体に関する。
いくつかの態様は、PEgRNAを決定するためのコンピュータによる方法に従って決定されたPEgRNAを使用する塩基編集の方法に関する。
治療的PEgRNA
別の側面において、本開示は、図27および図28によって表されるとおりの本明細書に開示されたアルゴリズムを使用してデザインされた治療的PEgRNAを提供する。
例えば、本明細書の開示において使用されてもよいPEgRNAは、図27に例示される。この図は、本明細書に企図され、かつ例2に定義される方法論に従ってデザインされてもよい、ある態様のPEgRNAの構造を提供する。PEgRNAは、5'→3'方向に順序付けられた3大構成要素(component elements)、つまり:スペーサー、gRNAコア、および3'末にて伸長アームを含む。伸長アームはさらに、5'→3'方向に以下の構造要素、つまり:プライマー結合部位(A)、編集鋳型(B)、および相同アーム(C)に分けられてもよい。加えて、PEgRNAは、任意の3'末修飾領域(modifier region)(e1)および任意の5'末修飾領域(e2)を含んでいてもよい。またさらに、PEgRNAは、PEgRNAの3'末にて転写終止シグナルを含んでいてもよい(描かれず)。これらの構造要素はさらに本明細書に定義される。PEgRNA構造の描画は、限定することを意図しておらず、要素の配置におけるバリエーションを網羅する(embraces)ものである。例えば、任意の配列修飾因子(e1)および(e2)は、示されるいずれの他の領域内またはそれらの間に位置付けられ得るものであって、3'末および5'末にて位置付けられることに限定され得ない。図27に示されるPEgRNAは、本明細書に開示されたアルゴリズムによってデザインされ得る。
別の例において、図28は、本明細書に企図され、かつ例2に定義される方法論に従ってデザインされてもよい、別の態様のPEgRNAの構造を提供する。PEgRNAは、5'→3'方向に順序付けられた3大構成要素、つまり:スペーサー、gRNAコア、および3'末にて伸長アームを含む。伸長アームはさらに、5'→3'方向に以下の構造要素、つまり:プライマー結合部位(A)、編集鋳型(B)、および相同アーム(C)に分けられてもよい。加えて、PEgRNAは、任意の3'末修飾領域(e1)および任意の5'末修飾領域(e2)を含んでいてもよい。またさらに、PEgRNAは、PEgRNAの3'末にて転写終止シグナルを含んでいてもよい(描かれず)。これらの構造要素はさらに本明細書に定義される。PEgRNA構造の描画は、限定することを意図しておらず、要素の配置におけるバリエーションを網羅するものである。例えば、任意の配列修飾因子(e1)および(e2)は、示されるいずれの他の領域内またはそれらの間に位置付けられ得るものであって、3'末および5'末にて位置付けられることに限定され得ない。図27に示されるPEgRNAは、本明細書に開示されたアルゴリズムによってデザインされ得る。
様々な態様において、本開示は、クリンバーデータベースエントリーに対し本明細書に開示されたアルゴリズムを使用してデザインされた配列番号1～135514および813085～880462の治療的PEgRNAを提供する。
様々な他の態様において、クリンバーデータベースに対し本明細書に開示されたアルゴリズムを使用してデザインされた例示のPEgRNAは、本明細書の一部を形成する配列表に包含される。配列表は、配列番号1～135514および813085～880462の完全なPEgRNA配列を包含する。これらの完全なPEgRNAの各々は、各スペーサー(配列番号135515～271028および880463～947840)および伸長アーム(配列番号271029～406542および947841～1015218)から構成される。加えて、各PEgRNAは、gRNAコア、例えば、配列番号1361579～1361580によって定義されるとおりのものを含む。配列番号271029～406542および947841～1015218の伸長アームはさらに、各プライマー結合部位(配列番号406543～542056および1015219～1082596)、編集鋳型(配列番号542057～677570および1082597～1149974)、ならびに相同アーム(配列番号677571～813084および1149975～1217352)から構成される。PEgRNAは任意に、5'末修飾領域および/または3'末修飾領域を含んでいてもよい。PEgRNAはまた、PEgRNAの3'にて逆転写終止シグナル(例として、配列番号1361560～1361566)も含んでいてもよい。本出願はこれら配列のすべてのデザインおよび使用を網羅する。
様々な態様において、プライム編集因子ガイドRNAは、(a)ガイドRNAを、および(b)RNA伸長をガイドRNAの5'末もしくは3'末にて、またはガイドRNA中の分子内のある場所(その例は図3A～Cに描かれる)にて含む。RNA伸長は、(i)所望のヌクレオチド変化を含むDNA合成鋳型、(ii)逆転写プライマー結合部位、および(iii)任意に、リンカー配列を含み得る。様々な態様において、DNA合成鋳型は、ニック部位に隣接する内生DNA配列に相補的な単鎖DNAフラップをコードするが、ここで単鎖DNAフラップは、所望のヌクレオチド変化を含む。
様々な態様において、RNA伸長アームは、長さが少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、または少なくとも25ヌクレオチドである。
ある態様において、プライム編集因子ガイドRNAは、配列番号1361548～1361581のヌクレオチド配列、または配列番号1361548～1361581のいずれか1つと少なくとも85％、もしくは少なくとも90％、もしくは少なくとも95％、もしくは少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様において、プライム編集因子ガイドRNA(PEgRNA)は、配列番号1361548～1361581のヌクレオチド配列と比較して少なくとも1の突然変異を含む、配列番号1361548～1361581のヌクレオチド配列のバリアントを含む。いくつかの態様において、バリアントは、配列番号1361548～1361581のヌクレオチド配列と比較して1より多くの(例として、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、またはそれ以上の)突然変異を含む。
別の側面において、本開示は、ガイドRNAおよび少なくとも1のRNA伸長(すなわち、図27につき、伸長アーム)を含むプライム編集因子ガイドRNAを提供する。RNA伸長は、ガイドRNAの3'末にて位置付けられる。他の態様において、RNA伸長は、ガイドRNAの5'にて位置付けられる。更なる他の態様において、RNA伸長は、ガイドRNA内の分子内のある位置にて位置付けられ、好ましくは、伸長された部分の分子内への位置づけは、プロトスペーサーの機能を妨害しない。
様々な態様において、プライム編集因子ガイドRNA(PEgRNA)は、napDNAbpへ結合すること、およびnapDNAbpを標的DNA配列へ向かわせることが可能である。標的DNA配列は、標的鎖および相補的な非標的鎖を含み得るが、ここでガイドRNAは、標的鎖とハイブリダイズすることでRNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する。
プライム編集因子ガイドRNAの様々な態様において、少なくとも1のRNA伸長は、DNA合成鋳型を含む。様々な他の態様において、RNA伸長は、逆転写プライマー結合部位をさらに含む。更なる他の態様において、RNA伸長は、RNA伸長をガイドRNAへ結び合わせるリンカーまたはスペーサーを含む。
様々な態様において、RNA伸長は、長さが少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも60ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも80ヌクレオチド、少なくとも90ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも150ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、または少なくとも500ヌクレオチドであり得る。
他の態様において、DNA合成鋳型(すなわち、図27につき、編集鋳型)は、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも60ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも80ヌクレオチド、少なくとも90ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、または少なくとも500ヌクレオチドである。
更なる他の態様において、逆転写プライマー結合部位配列(すなわち、図27につき、プライマー結合部位)は、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも60ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも80ヌクレオチド、少なくとも90ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、または少なくとも500ヌクレオチドである。
他の態様において、任意のリンカーまたはスペーサーは、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも60ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも80ヌクレオチド、少なくとも90ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、または少なくとも500ヌクレオチドである。
本明細書に開示の、デザインされたPEgRNAは、プライム編集因子融合タンパク質とともに複合体化されていてもよい。
一側面において、本明細書は、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)と逆転写酵素とを含むプライマー編集因子融合タンパク質を提供する。様々な態様において、融合タンパク質は、プライム編集因子ガイドRNA(PEgRNA)の存在下、標的にプライムされた逆転写によってゲノム編集を遂行することが可能である。
いくつかの態様において、napDNAbpは、Cas9、CasX、CasY、Cpf1、C2c1、C2c2、C2C3、およびアルゴノートからなる群から選択され、任意にニッカーゼ活性を有する。
他の態様において、融合タンパク質は、本明細書に記載のとおりのプライム編集因子ガイドRNAと複合体化されたとき、標的DNA配列(例として、ゲノムDNA)へ結合することが可能である。
更なる他の態様において、標的DNA配列は、標的鎖および相補的な非標的鎖を含む。
他の態様において、プライム編集因子ガイドRNAへ複合体化された融合タンパク質への結合によって、Rループが形成される。Rループは、(i)プライム編集因子ガイドRNAおよび標的鎖を含むRNA-DNAハイブリッド、ならびに(ii)相補的な非標的鎖を含み得る。
更なる他の態様において、相補的な非標的鎖へニックが入れられ、遊離3'末を有する逆転写酵素プライミング配列が形成される。
更なる他の態様において、単鎖DNAフラップは、ニック部位に隣接する内生DNA配列とハイブリダイズし、これによって所望のヌクレオチド変化が組み入れられる。更なる他の態様において、単鎖DNAフラップは、ニック部位に隣接し遊離5'末を有する内生DNA配列に取って代わる。いくつかの態様において、5'末を有する、取って代わられた内生DNAは、細胞によって切除される。
様々な態様において、単鎖DNAフラップの細胞修復は、所望のヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、これによって所望の産物が形成される。
様々な他の態様において、所望のヌクレオチド変化は、PAM配列の約-4～+10の間である編集窓に組み入れられる。
更なる他の態様において、所望のヌクレオチド変化は、ニック部位の約-5～+5ヌクレオチドの間、またはニック部位の約-10～+10の間、またはニック部位の約-20～+20の間、またはニック部位の約-30～+30の間、またはニック部位の約-40～+40の間、またはニック部位の約-50～+50の間、またはニック部位の約-60～+60の間、またはニック部位の約-70～+70の間、またはニック部位の約-80～+80の間、またはニック部位の約-90～+90の間、またはニック部位の約-100～+100の間、またはニック部位の約-200～+200の間である編集窓に組み入れられる。
様々な態様において、napDNAbpは、配列番号1361421のアミノ酸配列を含む。様々な他の態様において、napDNAbpは、配列番号1361421～1361484および1361593～1361596のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％同一のアミノ酸配列を含む。
他の態様において、本開示の逆転写酵素、融合タンパク質および/または組成物は、配列番号1361485～1361514および1361597～1361598のアミノ酸配列のいずれか1つを含んでいてもよい。更なる他の態様において、逆転写酵素は、配列番号1361485～1361514および1361597～1361598のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％同一のアミノ酸配列を含んでいてもよい。これらの配列は、天然に存在する逆転写酵素配列(例として、レトロウイルスもしくはレトロトランスポゾンからの)であってもよく、または配列は、非天然に存在するものであっても、もしくは改変されたものであってもよい。
様々な他の態様において、本明細書に開示された融合タンパク質は、様々な構造上の立体配置を含んでいてもよい。例えば、融合タンパク質は、構造NH2-[napDNAbp]-[逆転写酵素]-COOH;またはNH2-[逆転写酵素]-[napDNAbp]-COOHを含んでいてもよく、ここで「 ]-[ 」の各場合は、任意のリンカー配列の存在を示す。
様々な態様において、リンカー配列は、配列番号1361520～1361530、1361585、および1361603のアミノ酸配列、または配列番号1361520～1361530、1361585、および1361603のリンカーアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも80％、85％、もしくは90％、もしくは95％、もしくは99％同一であるアミノ酸配列を含む。
様々な態様において、標的DNA中へ組み込まれる所望のヌクレオチド変化は、単一ヌクレオチドの変化(例として、トランジションもしくはトランスバージョン)、1以上のヌクレオチドの挿入、1以上のヌクレオチドの欠失、またはそれらの組み合わせであり得る。
あるケースにおいて、挿入は、長さが少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、または少なくとも500である。
他のあるケースにおいて、欠失は、長さが少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、または少なくとも500ヌクレオチドである。
プライム編集因子ガイドRNAの様々な態様において、DNA合成鋳型(すなわち、図27につき、編集鋳型)は、ニック部位に隣接する内生DNA配列に相補的な単鎖DNAフラップをコードしていてもよく、ここで単鎖DNAフラップは、所望のヌクレオチド変化を含む。単鎖DNAフラップは、ニック部位にて内生単鎖DNAに取って代わってもよい。ニック部位にて取って代わられた内生単鎖DNAは、5'末を有しており内生フラップを形成し得るが、これは細胞によって切除され得る。様々な態様において、5'末の内生フラップを除去することは、単鎖3'DNAフラップの対応する相補的なDNA鎖とのハイブリダイゼーション、および単鎖3'DNAフラップが持つ所望のヌクレオチド変化の標的DNA中への組み込みまたは同化を促すことから、5'末の内生フラップの切除は産物形成を推進するのに役立つ。
プライム編集因子ガイドRNAの様々な態様において、単鎖DNAフラップの細胞修復は、所望のヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、これによって所望の産物が形成される。
本発明のもう1つの側面において、本明細書は、本明細書に記載の融合タンパク質および上に記載のいずれのプライム編集因子ガイドRNA(PEgRNA)も含む複合体を提供する。
本発明の更なる他の側面において、本明細書は、napDNAbp(例として、Cas9)およびプライム編集因子ガイドRNAを含む複合体を提供する。napDNAbpは、Cas9ニッカーゼ(例として、spCas9)であり得るか、あるいは配列番号1361421のアミノ酸配列、または配列番号1361421～1361484および1361593～1361596のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％同一のアミノ酸配列であり得る。
複合体を伴う様々な態様において、プライム編集因子ガイドRNAは、napDNAbpを標的DNA配列へ向かわせることが可能である。様々な態様において、逆転写酵素はtransで提供されてもよい、すなわち、複合体自体とは異なる供給源から提供されてもよい。例えば、逆転写酵素は、逆転写酵素を個別にコードする別々のベクターを導入することによって、複合体を有する同じ細胞へ提供され得る。
もう1つの側面において、本明細書は、医薬組成物(例として、本明細書に記載の融合タンパク質、配列番号1～135,514のPEgRNA)を提供する。いくつかの態様において、医薬組成物は、napDNAbp、融合タンパク質、逆転写酵素、およびプライム編集因子ガイドRNAのうち1以上を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の融合タンパク質および薬学的に許容し得る賦形剤。他の態様において、医薬組成物は、本明細書に記載のいずれの伸長ガイドRNAおよび薬学的に許容し得る賦形剤を含む。更なる他の態様において、医薬組成物は、本明細書に記載のいずれの伸長ガイドRNAを、本明細書に記載のいずれの融合タンパク質および薬学的に許容し得る賦形剤と組み合わせて含む。もう1つの他の態様において、医薬組成物は、napDNAbp、融合タンパク質、逆転写酵素、およびプライム編集因子ガイドRNAのうち1以上をコードするいずれのポリヌクレオチド配列も含む。更なる他の態様において、本明細書に開示の様々な構成要素は、1以上の医薬組成物中へ分離されていてもよい。例えば、第1医薬組成物は、融合タンパク質またはnapDNAbpを含んでいてもよく、第2医薬組成物は、逆転写酵素を含んでいてもよく、および第3医薬組成物は、プライム編集因子ガイドRNAを含んでいてもよい。
またさらなる側面において、本開示は、キットを提供する。一態様において、キットは、融合タンパク質、napDNAbp、逆転写酵素、およびプライム編集因子ガイドRNA(例として、配列番号1～135514または813085～880462のいずれか)を包含する1以上の構成要素をコードする1以上のポリヌクレオチドを含む。キットはまた、本明細書に開示のいずれの融合タンパク質、napDNAbp、または逆転写酵素を包含する、ベクター、細胞、およびポリペプチドの単離された調製物も含んでいてよい。
もう1つの側面において、本開示は、開示されたPEgRNA組成物(compositions of matter)を使用する方法を提供する。
一態様において、方法は、本明細書に開示のPEgRNAを使用して二本鎖のDNAに所望のヌクレオチド変化を組み入れるための方法に関する。方法は第1に、二本鎖のDNA配列を、本明細書に記載のとおりの融合タンパク質とプライム編集因子ガイドRNAとを含む複合体に接触させることを含むが、ここで融合タンパク質はnapDNAbpおよび逆転写酵素を含み、ここでプライム編集因子ガイドRNAは所望のヌクレオチド変化を含むDNA合成鋳型を含む。napDNAbpは、非標的鎖上の二本鎖のDNA配列にニックを入れ、これによって3'末を有する遊離の単鎖DNAが生成される。ニック入れに続き、遊離の単鎖DNAの3'末は、DNA合成鋳型とハイブリダイズし、これによって逆転写酵素ドメインがプライムされる。逆転写酵素は次いで、3'末からのDNA重合を進め、これによって所望のヌクレオチド変化を含む単鎖DNAフラップが生成される。単鎖DNAフラップは次いで、切断部位に隣接する内生DNA鎖を置き換え、これによって二本鎖のDNA配列に所望のヌクレオチド変化が組み入れられる。
他の態様において、本開示は、標的遺伝子座にてDNA分子のヌクレオチド配列中に1以上の変化を導入するための方法を提供するが、DNA分子を、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)とnapDNAbpに標的遺伝子座を標的にさせるガイドRNAとに接触させることを含み、ここでガイドRNAは、少なくとも1の所望のヌクレオチド変化を含む逆転写酵素(RT)鋳型配列を含む。napDNAbpは標的遺伝子座にてDNA鎖の3'末を晒すが、これはDNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)とハイブリダイズすることで逆転写をプライムする。次に、DNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)に基づき少なくとも1の所望のヌクレオチド変化を含む単鎖DNAフラップは、逆転写酵素によって合成または重合される。最後に、少なくとも1の所望のヌクレオチド変化は、対応する内生DNA中へ組み込まれ、これによって標的遺伝子座にてDNA分子のヌクレオチド配列中に1以上の変化が導入される。
更なる他の態様において、本開示は、標的にプライムされた逆転写によって、標的遺伝子座にてDNA分子のヌクレオチド配列中に1以上の変化を導入するための方法を提供するが、方法は、標的遺伝子座にてDNA分子を、i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)と逆転写酵素とを含む融合タンパク質、および(ii)所望のヌクレオチド変化(例として、配列番号1～135514または813085～880462のいずれか)を含むRT鋳型を含むガイドRNAに接触させることを含む;その接触は、RT鋳型の標的にプライムされた逆転写に、所望のヌクレオチド変化を含む単鎖DNAを生成させ、かつDNA修復および/または複製プロセスを通して標的遺伝子座にてDNA分子中への所望のヌクレオチド変化を組み込むのを容易にさせる。
いくつかの態様において、内生DNA鎖を置き換えるステップは以下を含む:(i)単鎖DNAフラップを切断部位に隣接する内生DNA鎖とハイブリダイズさせることで、配列ミスマッチを創出すること;(ii)内生DNA鎖を切除すること;および(iii)ミスマッチを修復することで、DNAの両鎖中に所望のヌクレオチド変化を含む所望の産物を形成すること。
本明細書に開示の方法は、ヌクレアーゼ不活性型(dead)Cas9(dCas9)、Cas9ニッカーゼ(nCas9)、またはヌクレアーゼ活性Cas9であるnapDNAbpを有する融合タンパク質を伴っていてもよい。他の態様において、napDNAbpおよび逆転写酵素は、単一の融合タンパク質としてはコードされていないが、むしろ別々の構築物中に提供され得る。よって、いくつかの態様において、逆転写酵素は(融合タンパク質としてよりむしろ)、napDNAbpに対しtransで提供され得る。
方法を伴う様々な態様において、napDNAbpは、配列番号1361421(Cas9)のアミノ酸配列を含んでいてもよい。napDNAbpはまた、配列番号1361421のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％同一のアミノ酸配列も含んでいてよい。
方法を伴う様々な態様において、逆転写酵素は、配列番号1361485～1361514および1361597～1361598のアミノ酸配列のいずれか1つを含んでいてもよい。逆転写酵素はまた、配列番号1361485～1361514および1361597～1361598のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％同一のアミノ酸配列も含んでいてよい。
方法は、配列番号271029～406542および947841～1015218のヌクレオチド配列、またはこれと少なくとも80％、もしくは少なくとも85％、もしくは少なくとも90％、もしくは少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する伸長されたRNAの使用を伴ってもよい。
方法は、3'末にてRNA伸長を含む、プライム編集因子ガイドRNAの使用を含んでいてもよく、ここでRNA伸長はDNA合成鋳型を含み、例えば図3B(5'から3'へ記載されるとおりの以下の構成要素をもつ:スペーサー;gRNAコア;逆転写鋳型;プライマー結合部位)に示されるPEgRNAは、5'から3'へ、逆転写鋳型およびプライマー結合部位を含む伸長アームを有する。
方法は、5'末にてRNA伸長を含む、プライム編集因子ガイドRNAの使用を含んでもよく、ここでRNA伸長はDNA合成鋳型を含み、例えば図3A(5'から3'へ記載されるとおりの以下の構成要素をもつ:逆転写鋳型;プライマー結合部位;リンカー;スペーサー;gRNAコア)に示されるPEgRNAは、5'から3'へ、逆転写鋳型、プライマー結合部位、および5～20ヌクレオチド長リンカーを含む伸長アームを有する。
方法は、ガイドRNA中、分子内のある場所にてRNA伸長を含む、プライム編集因子ガイドRNAの使用を含んでもよく、ここでRNA伸長は、DNA合成鋳型を含む。
方法は、長さが少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、または少なくとも500ヌクレオチドである1以上のRNA伸長を有するプライム編集因子ガイドRNAの使用を含んでもよい。
上記の概念、および下に考察される追加の概念は、いずれの好適な組み合わせでも並べられ得ることが解されるはずである(ただし、本開示はこの点において限定されない)。さらに、本開示の他の利点および新規特色は、添付の図と併せて考慮すれば、以下の様々な非限定的態様の詳細な記載から明らかであろう。
図面の簡単な記載
以下の図面は本明細書の一部を形成するものであって、これらの図面の1以上を、本明細書に提示される特定の態様の詳細な記載と組み合わせて参照することによってより良好に理解され得る、ある本開示の側面をさらに実証するために包含される。
図1A.1は、プライム編集因子ガイドRNAと複合したnapDNAbp(例として、Cas9)タンパク質と融合した逆転写酵素を含む融合タンパク質を使用して、単一ヌクレオチドの変化、挿入、および/または欠失をDNA分子(例として、ゲノム)中へ導入するための例示のプロセスの概略図を提供する。この態様において、ガイドRNAは、3'末にて伸長されていることで、DNA合成鋳型を包含する。概略図は、Cas9ニッカーゼと融合してガイドRNA(gRNA)と複合した逆転写酵素(RT)が、どのようにDNA標的部位に結合し、標的ヌクレオチドに隣接するPAM含有DNA鎖にニックを入れるのかを示す。RT鋳型は、ニック入りDNAを、所望の編集をコードする新しいDNA鎖の合成のための鋳型として使用されるgRNAからのDNA合成のためのプライマーとして使用する。示される編集プロセスは、標的にプライムされた逆転写編集(プライム編集)と称されてもよい。 図1A.2は、プライム編集因子複合体がより一般に、[napDNAbp]-[P]:PEgRNAPEgRNAまたは[P]-[napDNAbp]:PEgRNAPEgRNAとして表されることを除いて、図1A.1と同じ描写を提供するが、ここで「P」は、いずれのポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)を指し、「napDNAbp」は、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(例として、SpCas9)を指し、および「PEgRNAPEgRNA」は、プライム編集ガイドRNAを指し、および「 ]-[ 」は、任意のリンカーを指す。他のどこか、例として図3A～3Gに記載のとおり、PEgRNAPEgRNAは、プライマー結合部位およびDNA合成鋳型を含む5'伸長アームを含む。示されてはいないが、PEgRNAPEgRNAの伸長アーム(すなわち、プライマー結合部位およびDNA合成鋳型を含む)はDNAまたはRNAであり得ることが企図される。この立体配置において企図される具体的なポリメラーゼは、DNA合成鋳型の性質に依存するであろう。実例として、DNA合成鋳型がRNAであると、ポリメラーゼはRNA依存性DNAポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)になり得る。DNA合成鋳型がDNAであると、ポリメラーゼはDNA依存性DNAポリメラーゼになり得る。様々な態様において、PEgRNAは、DNAベースのDNA合成鋳型を組み込むように改変または合成され得る。
図1B.1は、プライム編集因子ガイドRNAと複合したnapDNAbp(例として、Cas9)タンパク質と融合した逆転写酵素を含む融合タンパク質を使用して、単一ヌクレオチドの変化、挿入、および/または欠失をDNA分子(例として、ゲノム)中へ導入するための例示のプロセスの概略図を提供する。この態様において、ガイドRNAは、5'末にて伸長されていることで、DNA合成鋳型を包含する。概略図は、Cas9ニッカーゼと融合してガイドRNA(gRNA)と複合した逆転写酵素(RT)が、どのようにDNA標的部位に結合し、標的ヌクレオチドに隣接するPAM含有DNA鎖にニックを入れるのかを示す。標準的なPAM配列は5'-NGG-3'であるが、異なるPAM配列が、異なる生物からの異なるCas9タンパク質または等価なタンパク質に関連し得る。加えて、所定のCas9ヌクレアーゼ、例として、SpCas9は、代替PAM配列を認識するタンパク質のPAM特異性を変更するように修飾されてもよい。RT酵素は、ニック入りDNAを、所望の編集をコードする新しいDNA鎖の合成のための鋳型として使用されるgRNAからのDNA合成のためのプライマーとして使用する。示される編集プロセスは、標的にプライムされた逆転写編集(TPRT編集因子またはプライム編集)と称されることもある。 図1B.2は、プライム編集因子複合体がより一般に、[napDNAbp]-[P]:PEgRNAPEgRNAまたは[P]-[napDNAbp]:PEgRNAPEgRNAとして表されることを除いて、図1B.1と同じ描写を提供するが、ここで「P」は、いずれのポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)を指し、「napDNAbp」は、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(例として、SpCas9)を指し、および「PEgRNAPEgRNA」は、プライム編集ガイドRNAを指し、および「 ]-[ 」は、任意のリンカーを指す。他のどこか、例として図3A～3Gに記載のとおり、PEgRNAPEgRNAは、プライマー結合部位およびDNA合成鋳型を含む3'伸長アームを含む。示されてはいないが、PEgRNAPEgRNAの伸長アーム(すなわち、プライマー結合部位およびDNA合成鋳型を含む)はDNAまたはRNAであり得ることが企図される。この立体配置において企図される具体的なポリメラーゼは、DNA合成鋳型の性質に依存するであろう。実例として、DNA合成鋳型がRNAであると、ポリメラーゼはRNA依存性DNAポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)になり得る。DNA合成鋳型がDNAであると、ポリメラーゼはDNA依存性DNAポリメラーゼになり得る。
図1Cは、合成された単DNAの鎖(所望のヌクレオチド変化を含む)が、所望のヌクレオチド変化、挿入、および/または欠失がDNA中へ組み込まれるように、どのように分解されるのかという例示のプロセスを描く概略図である。示されるとおり、編集済鎖(または「変異誘発鎖」)の次の合成、内生鎖との平衡、内生鎖のフラップ切断、およびライゲーションは、内生DNA修復および/または複製プロセスの作用を通して、ミスマッチDNA二重鎖の分解後のDNA編集の組み込みに繋がる。
図1Dは、「反対鎖(opposite strand)へのニック入れ」が図1Cの分解方法の中へ組み込まれることで、所望の産物・対・復元産物の形成を推進するのに役立ち得ることを示す概略図である。反対鎖のニック入れにおいて、第2のnapDNAbp/gRNA複合体(例として、Cas9/gRNA複合体)は、最初にニックが入った鎖の反対鎖上に第2ニックを導入するのに使用される。これは、未編集鎖(すなわち、第2ニック部位を含有する鎖)を優先的に置き換えるために、内生細胞のDNA修復および/または複製プロセスを誘導する。
図1Eは、プライム編集因子ガイドRNA(例として、プライム編集)と複合体化された核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)を使用して、標的遺伝子座のDNA分子(例として、ゲノム)中へ少なくとも1のヌクレオチド変化(例として、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、もしくはそれ以上)、挿入、および/または欠失を導入するための例示のプロセスの別の概略図を提供する。プライム編集因子ガイドRNAは、ガイドRNAの3'末もしくは5'末にて、またはガイドRNA中の分子内のある場所にて伸長を含む。ステップ(a)において、napDNAbp/gRNA複合体はDNA分子に接触し、gRNAは標的遺伝子座へ結合するようにnapDNAbpをガイドする。ステップ(b)において、標的遺伝子座のDNA(Rループ鎖、またはPAM含有鎖、または非標的DNA鎖、またはプロトスペーサー鎖)の鎖の一方へニックが導入され(例として、ヌクレアーゼまたは化学剤によって)、これによって標的遺伝子座の鎖の一方に利用可能な3'末が創出される。ある態様において、ニックは、Rループ鎖に対応するDNAの鎖、すなわち、ガイドRNA配列とはハイブリダイズされない鎖に創出される。ステップ(c)において、3'末DNA鎖は、逆転写をプライムするためにガイドRNAの伸長された部分と相互作用する。いくつかの態様において、3'末DNA鎖は、ガイドRNAの伸長された部分上の特定のプライマー結合部位とハイブリダイズする。ステップ(d)において、逆転写酵素が導入されて、プライムされた部位の3'末からガイドRNAの3'末へDNAの単鎖を合成する。これは、所望のヌクレオチド変化(例として、単一のまたは複数の塩基変化(単数もしくは複数)、挿入(単数もしくは複数)、欠失(単数もしくは複数)、あるいはそれらの組み合わせ)を含む単鎖DNAフラップを形成する。ステップ(e)において、napDNAbpおよびガイドRNAは放出される。ステップ(f)および(g)は、所望のヌクレオチド変化が標的遺伝子座中へ組み込まれるように、単鎖DNAフラップの分解に関する。このプロセスは、一旦3'単鎖DNAフラップが侵入して他の鎖上の相補的な配列とハイブリダイズすると、形成された対応の5'内生DNAフラップを除去することによって、所望の産物形成が推進され得る。プロセスはまた、図1Dに例示されるとおり、第2鎖へニックが入れられた産物の形成へも推進され得る。このプロセスは、以下の遺伝子変化:トランスバージョン、トランジション、欠失、および挿入のうち少なくとも1またはそれ以上を導入してもよい。
図1Fは、本明細書に記載の、標的にプライムされた逆転写編集(プライム編集)プロセスに起こり得る遺伝子変化の型を描く概略図である。プライム編集によって達成され得るヌクレオチド変化の型は、欠失(短いおよび長い欠失を包含する)、単一のおよび/または複数のヌクレオチド変化、および挿入(短いおよび長い挿入を包含する)を包含する。
図1Gは、プライム編集因子複合体によって例示される、一時的な(temporal)第2鎖へのニック入れの例を描く概略図である。一時的な第2鎖へのニック入れは、所望の編集済産物の形成を容易にするための、第2鎖へのニック入れのバリアントである。用語「一時的な」は、未編集鎖への第2鎖ニックが、所望の編集が編集済鎖に組み入れられた後にしか生じないという事実を指す。これは、二本鎖DNA切断へ繋がり得る両鎖上の同時のニックを回避する。
図1Hは、napDNAbp(例として、SpCas9ニッカーゼ)を、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)などのいずれのプログラム型ヌクレアーゼドメインにも置き換える、本明細書に企図されるプライム編集のバリエーションを描く。そのため、好適なヌクレアーゼは核酸標的分子(ガイドRNAなど)によって必ずしも「プログラムされる(programmed)」必要はないが、むしろ、とりわけヌクレアーゼなどのDNA結合ドメインの特異性を定義することによってプログラムされてもよいことが企図される。ちょうどnapDNAbp部分とのプライム編集と同じように、代替プログラム型ヌクレアーゼは、標的DNAの一方の鎖のみが切られるように修飾されることが好ましい。換言すれば、プログラム型ヌクレアーゼは、好ましくは、ニッカーゼとして機能するはずである。一旦プログラム型ヌクレアーゼが選択されると(例として、ZFNまたはTALEN)、追加の機能は改変されて、それがプライム編集様機序に従って作動することができる系になってもよい。例えば、プログラム型ヌクレアーゼは、これとRNAまたはDNAの伸長アームとを(例として、化学的リンカーを介して)カップリングすることによって修飾されてもよく、ここで伸長アームは、プライマー結合部位(PBS)およびDNA合成鋳型を含む。プログラム型ヌクレアーゼはまた、ポリメラーゼとも(例として、化学的リンカーまたはアミノ酸リンカーを介して)カップリングされてもよいが、前記ポリメラーゼの性質は、伸長アームがDNAまたはRNAであるかに依存するであろう。RNA伸長アームのケースにおいて、ポリメラーゼはRNA依存性DNAポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)であり得る。DNA伸長アームのケースにおいて、ポリメラーゼは、DNA依存性DNAポリメラーゼ(例として、Pol I、Pol II、もしくはPol IIIを包含する原核生物のポリメラーゼ、またはPol a、Pol b、Pol g、Pol d、Pol e、もしくはPol zを包含する真核生物のポリメラーゼ)であり得る。系はまた、プログラム型ヌクレアーゼとの融合体として加えられるか、または反応全体を容易にするためにtransで加えられた他の機能も包含していてもよい(例として、(a)DNAを切断部位にて巻き戻すことで、プライマーとして利用可能な3'末をもつ切断鎖を作製する、ヘリカーゼ、(b)切断鎖上の内生鎖を除去することで、内生鎖の合成された鎖との置き換えへの反応を推進するのに役立つ、FEN1、または(c)反対鎖上に第2部位ニックを創出する、nCas9:gRNA複合体(これは非編集鎖の好ましい細胞修復を通した合成修復の取り入れを推進するのに役立つこともある))。napDNAbpで編集をプライムする類似したやり方において、別様なプログラム型ヌクレアーゼとのかかる複合体は、合成し、次いで、着目した編集を持つ新しく合成されたDNAの置き換え鎖をDNAの標的部位中へ永続的に組み入れるのに使用され得る。
図1Iは、一態様において、プライム編集によって編集されてもよい標的DNAの解剖学的な特色(anatomical features)を描く。標的DNAは「非標的鎖」および「標的鎖」を含む。標的鎖は、PAM部位(このケースにおいては、標準的なSpCas9ベースのプライム編集因子によって認識されるNGG)を認識するプライム編集因子複合体のPEgRNAのスペーサーとアニールされるようになる鎖である。標的鎖はまた、「非PAM鎖」または「非編集鎖」とも称されることがある。これに反して、非標的鎖(すなわち、プロトスペーサーおよびNGGのPAM配列を含有する鎖)は、「PAM鎖」または「編集鎖」と称されることもある。様々な態様において、PE複合体(例として、SpCas9ベースのPEでの)のニック部位は、PAM鎖上のプロトスペーサー中にあるであろう。ニックの場所は、PEを形成する具体的なCas9の特徴であろう。例えば、SpCas9ベースのPEであると、ニック部位は、塩基3(PAM配列の位置1と比べて「-3」位置)と4(PAM配列の位置1と比べて「-4」位置)との間のホスホジエステル結合中にある。プロトスペーサー中のニック部位は、以下の図に見られるとおりPEgRNAの伸長アームのプライマー結合部位と複合体化する遊離の3'ヒドロキシル基を形成し、PEgRNAの伸長アームのDNA合成鋳型をコードするDNAの単鎖の重合を始める基質を提供する。この重合反応は5'→3'方向に、PE融合タンパク質のポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)によって触媒される。重合は、gRNAコアに達する前に(例として、PEの重合活性を終止するよう機能する重合終止シグナルまたは2次構造の包含によって)終止し、ニック入りのPAM鎖の元の3'ヒドロキシル基から伸長される単鎖DNAフラップを産生する。DNA合成鋳型は、PAM鎖上のニック部位のすぐ後に続く内生DNAの5'末の単鎖と相同な単鎖DNAをコードしており、所望のヌクレオチド変化(例として、単一塩基の置換、挿入、欠失、逆位)を組み入れる。所望の編集の位置は、PAM鎖上のニック部位の下流に続くいずれの位置にもあり得、位置+1、+2、+3、+4(PAM部位の開始)、+5(PAM部位の位置2)、+6(PAM部位の位置3)、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15、+16、+17、+18、+19、+20、+21、+22、+23、+24、+25、+26、+27、+28、+29、+30、+31、+32、+33、+34、+35、+36、+37、+38、+39、+40、+41、+42、+43、+44、+45、+46、+47、+48、+49、+50、+51、+52、+53、+54、+55、+56、+57、+58、+59、+60、+61、+62、+63、+64、+65、+66、+67、+68、+69、+70、+71、+72、+73、+74、+75、+76、+77、+78、+79、+80、+81、+82、+83、+84、+85、+86、+87、+88、+89、+90、+91、+92、+93、+94、+95、+96、+97、+98、+99、+100、+101、+102、+103、+104、+105、+106、+107、+108、+109、+110、+111、+112、+113、+114、+115、+116、+117、+118、+119、+120、+ 121、+122、+123、+124、+125、+126、+127、+128、+129、+130、+131、+132、+133、+134、+135、+136、+137、+138、+139、+140、+141、+142、+143、+144、+145、+146、+147、+148、+149、もしくは+150、またはこれ以上(ニック部位の下流位置に対して)を包含し得る。一旦3'末単鎖DNA(着目する編集を含有する)が内生5'末単鎖DNAを置き換えると、DNA修復および複製プロセスは、PAM鎖上の編集部位の永続的な組み入れを、次いで編集部位に存在する非PAM鎖上のミスマッチの修正をもたらすであろう。このように、編集は、標的DNA部位上のDNAの両鎖へ広がるであろう。「編集済鎖」および「非編集済」鎖への言及が単に、PE機序に関与するDNAの鎖を正確に記述する(delineate)ことを意図するに過ぎないことは解されるであろう。「編集済鎖」は、ニック部位のすぐ下流での5'末の単鎖DNAの、所望の編集を含有する合成された3'末の単鎖DNAとの置き換えによって初めて編集されるようになる鎖である。「非編集済」鎖は編集済鎖との対の鎖であるが、これ自身もまた、修復および/または複製を通して、編集済鎖に相補的になるよう編集(とりわけ、着目する編集)がなされるようになる。
図1Jは、標的DNA、プライム編集因子複合体、およびPEgRNAと標的DNAとの間の相互作用の解剖学的な特色を示すプライム編集の機序を描く。第1に、ポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)およびnapDNAbp(例として、SpCas9ニッカーゼ、例として、HNHヌクレアーゼドメイン中の不活性化突然変異(例として、H840A)またはRuvCヌクレアーゼドメイン中の活性化突然変異(D10A)を有するSpCas9)を有する融合タンパク質を含むプライム編集因子は、PEgRNAおよび編集されるべき標的DNAを有するDNAと複合体化されている。PEgRNAは、スペーサー、gRNAコア(またgRNA骨格もしくはgRNA主鎖としても知られている)(これはnapDNAbpへ結合する)、および伸長アームを含む。伸長アームは、3'末、5'末に、またはPEgRNA分子内のどこかにあり得る。示されるとおり、伸長アームは、PEgRNAの3'末にある。伸長アームは、3'→5'方向において、PAM鎖上のニック部位のすぐ後に続く5'末の単鎖DNAと相同である、プライマー結合部位およびDNA合成鋳型(着目する編集と相同領域(すなわち、相同アーム)との両方を含む)を含む。示されるとおり、一旦ニックが導入され、これによってニック部位のすぐ上流に遊離の3'ヒドロキシル基が産生されると、PAM鎖上のニック部位のすぐ上流の領域は、「プライマー結合部位」と称される伸長アームの3'末にて相補的な配列とアニールし、利用可能な3'ヒドロキシル末をもつ短い二本鎖の領域を創出するが、これによってプライム編集因子複合体のポリメラーゼのための基質が形成される。次いで、ポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)は、DNAの鎖として、3'ヒドロキシル末から伸長アームの末まで重合する。単鎖DNAの配列はDNA合成鋳型によってコードされており、これは、新しいDNAを合成するポリメラーゼによって「読まれる」伸長アームの一部(すなわち、プライマー結合部位を排除する)である。この重合は、最初のニック部位の元の3'ヒドロキシル末の配列まで有効に伸長する。DNA合成鋳型は、所望の編集のみならず、PAM鎖上のニック部位のすぐ下流の内生DNAの単鎖に相同の領域もまた含むDNAの単鎖をコードする。次に、コードされる3'末のDNAの単鎖(すなわち、3'単鎖DNAフラップ)は、PAM鎖上のニック部位のすぐ下流の、対応する相同の内生5'末のDNAの単鎖に取って代わり、5'末の単鎖DNAフラップを有するDNA中間体を形成するが、これは細胞によって(例として、フラップエンドヌクレアーゼによって)除去される。内生5'末の単鎖DNAフラップの相補体とアニールする3'末の単鎖DNAフラップは、5'DNAフラップが除去された後、内生鎖とライゲーションされる。3'末の単鎖DNAフラップ中の所望の編集は、たった今アニールされてライゲーションされたが、相補鎖とのミスマッチを形成し、DNA修復および/または一連の複製を経て、これによって両鎖上に所望の編集が永続的に組み入れられる。
図２は、試験されるであろう3つのCas複合体、ならびにそれらのPAM、gRNA、およびDNA切断特色を示す。図は、SpCas9、SaCas9、およびLbCas12aを伴う複合体のための略図を示す。
図3A～3Cは、改変された5'伸長gRNA(図3A)、3'伸長gRNA(図3B)、および分子内伸長(図3C)のための略図を示すが、これらの各々はプライム編集のために使用されてもよい。態様は、3'、5'、および分子内の伸長gRNAの伸長された部分における、DNA合成鋳型、プライマー結合部位、および任意のリンカー配列の例示の配置、ならびにプロトスペーサーおよびコア領域の配置を描く。開示されるTPRTプロセスは、これらのプライム編集因子ガイドRNAの立体配置に限定されない。 図3B,3Cは、改変された3'伸長gRNA(図3B)および分子内伸長(図3C)のための略図を示すが、これらの各々はプライム編集のために使用されてもよい。態様は、3'、5'、および分子内の伸長gRNAの伸長された部分における、DNA合成鋳型、プライマー結合部位、および任意のリンカー配列の例示の配置、ならびにプロトスペーサーおよびコア領域の配置を描く。開示されるTPRTプロセスは、これらのプライム編集因子ガイドRNAの立体配置に限定されない。
図4A～4Eは、in vitroでのTPRTアッセイを実証する。図4Aは、蛍光標識DNA基質、RT酵素によるgRNA鋳型の伸長、逆転写酵素産物のポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)アッセイの概略図である。 図4Bは、予めニックが入った(pre-nicked)基質、dCas9、および異なる編集鋳型長の5'伸長gRNAでのTPRTを示す。図4Cは、Cas9不在下の、予めニックが入ったDNA基質とのRT反応を示す。 図4Dは、Cas9(H840A)および5'伸長gRNAとの、全長dsDNA基質に対するTPRTを示す。図4Eは、予めニックが入った全長dsDNA基質との3'伸長gRNA鋳型を示す。すべての反応にはM-MLV RTが存在する。
図5は、編集鋳型長を変動させた5'伸長gRNAを使用する、in vitroでの検証結果(validations)を示す。蛍光標識(Cy5)DNA標的を基質として使用し、この実験一式において予めニックを入れた。これらの実験において使用されたCas9は触媒不活性型Cas9(dCas9)であり、使用されたRTは、モロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV)に由来する市販のRTであるSuperscript IIIである。dCas9:gRNA複合体を、精製された構成要素から形成した。次いで、蛍光標識DNA基質をdNTPsおよびRT酵素とともに加えた。37℃での1時間のインキュベーション後、反応産物を変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって分析した。ゲル画像は、元のDNA鎖～逆転写鋳型長と一致する長さの伸長を示す。
図6は、編集鋳型長を変動させた5'伸長gRNAを使用する、in vitroでの検証結果を示すが、これは図5に示されるものと酷似している。しかしながら、DNA基質は、この実験一式においてニックは予め入っていない。これらの実験に使用されたCas9はCas9ニッカーゼ(SpyCas9 H840A突然変異体)であり、使用されたRTは、モロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV)に由来する市販のRTであるSuperscript IIIである。反応産物を変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって分析した。ゲルに示されるとおり、ニッカーゼは、gRNAが使用されたとき、DNA鎖を効率的に切断する(gRNA_0、レーン3)。
図7は、3'伸長がDNA合成を裏付け有意にCas9ニッカーゼ活性に影響を及ぼさないことを実証する。予めニックが入った基質(黒色矢印)は、dCas9またはCas9ニッカーゼのいずれかが使用されたとき、ほぼ定量的にRT産物へ変換される(レーン4および5)。50％超のRT産物への変換(赤色矢印)が全長基質で観察される(レーン3)。Cas9ニッカーゼ(SpyCas9 H840A突然変異体)、触媒不活性型Cas9(dCas9)、およびSuperscript III(モロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV)に由来する市販のRT)を使用した。
図8は、RT反応が優先してgRNAにcisで生じる(同じ複合体中で結合される)かを決定するために使用された二色(dual color)実験を実証する。2つ別々の実験を5'伸長gRNAおよび3'伸長gRNAについて行った。産物をPAGEによって分析した。産物比率は(Cy3cis/Cy3trans)/(Cy5trans/Cy5cis)として算出した。
図9A～9Dは、フラップモデル基質を実証する。図9Aは、フラップ特異的(-directed)変異誘発のための二重FPレポーターを示す。図9Bは、HEK細胞中の停止コドン修復を示す。 図9Cは、フラップ修復後に配列決定された(sequenced)酵母クローンを示す。図9Dは、ヒト細胞中の異なるフラップ特色の試験を示す。
図10は、プラスミド基質上のプライム編集を実証する。二重蛍光レポータープラスミドを酵母(S.cerevisiae)発現のために構築した。酵母中のこの構築物の発現は、GFPのみを産生する。in vitroでのTRT反応は点突然変異を誘導し、親プラスミド、またはin vitroでCas9(H840A)によってニックが入れられたプラスミドを酵母中へ形質転換する。コロニーは蛍光画像化によって可視化される。酵母二重FPプラスミド形質転換体が示されている。親プラスミドまたはin vitroでCas9(H840A)にニックが入ったプラスミドを形質展開することは、緑色GFP発現コロニーのみをもたらす。5'伸長gRNAまたは3'伸長gRNAでのTRT反応は、緑色および黄色の混合コロニーを産生する。後者はGFPとmCherryとの両方を発現する。より多くの黄色コロニーは3'伸長gRNAで観察される。停止コドンを含有しない陽性対照も示されていない。
図11は、図10の実験と同様のプラスミド基質上のプライム編集を示すが、停止コドン中に点突然変異を組み入れる代わりに、プライム編集は、フレームシフト突然変異を修復して下流のmCherryの合成を可能にさせる単一ヌクレオチドの挿入(左)または欠失(右)を組み入れる。両実験ともに3'伸長gRNAsを使用した。
図１２は、サンガー(Sanger)配列決定によって特徴付けられる、プラスミド基質上のプライム編集の編集産物を示す。TRT形質転換からのコロニーを個々に選択し、サンガー配列決定によって分析した。正確な編集が選択コロニーを配列決定することによって観察された。緑色コロニーは元のDNA配列をもつプラスミドを含有していたのに対し、黄色コロニーはプライム編集gRNAによってデザインされた正確な突然変異を含有していた。他の点突然変異またはインデルは一切観察されなかった。
図13は、新しいプライム編集技術の潜在的な範囲を示し、デアミナーゼ媒介塩基編集技術との比較を示す。
図14は、ヒト細胞における編集の概略図を示す。
図15は、gRNA中のプライマー結合部位の伸長を実証する。
図16は、隣接標的化(adjacent targeting)のためにトランケートされたgRNAを示す。
図17A～17Cは、ヒト胚腎臓(HEK)細胞における構成要素のトランスフェクション後の標的ヌクレオチドでの％T→A変換を表示するグラフである。図17Aは、野生型MLV逆転写酵素のCas9(H840A)ニッカーゼ(32アミノ酸リンカー)へのN末融合を使用した結果を提示するデータを示す。図17Bは、RT酵素のC末融合を別にすれば図17Aと同様である。図17Cは、図17Aと同様であるが、MLV RTとCas9との間のリンカーが32アミノ酸の代わりに60アミノ酸長である。
図18は、ハイスループットアンプリコン配列決定によるHEK3部位での高純度T→A編集を示す。配列決定分析の出力は、編集済細胞の最も豊富な遺伝子型を表示する。
図19は、インデル比率(各対のバーの右バー)と並んで標的ヌクレオチドでの編集効率(各対のバーの左バー)を示す。WTは野生型MLV RT酵素を指す。突然変異酵素(M1～M4)は、右へ列挙された突然変異を含有する。編集比率をゲノムDNAアンプリコンのハイスループット配列決定によって定量化した。
図20は、単鎖ニックが標的ヌクレオチドに近接する相補的なDNA鎖中に導入されたときの標的ヌクレオチドの編集効率を示す。標的ヌクレオチドから様々な間隔にてニックを入れるのを試験した(オレンジ色三角形)。標的塩基対(青色バー)での編集効率が、インデル形成比率と並んで示される(オレンジ色バー)。「なし」の例は、相補鎖へニックを入れるガイドRNAを含有しない。編集比率をゲノムDNAアンプリコンのハイスループット配列決定によって定量化した。
図21は、所望のT→Aトランスバージョン突然変異および他の主なゲノム編集副産物の全般的な非存在を示す、処理されたハイスループット配列決定データを実証する。
図22は、プライム編集因子ガイドRNAと複合体化された核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)を使用し、エラーを起こしやすい逆転写酵素で、標的変異誘発(targeted mutagenesis)を標的遺伝子座上に行うための例示のプロセスの概略図を提供する。このプロセスは、標的変異誘発のためのプライム編集の態様と称されることもある。プライム編集因子ガイドRNAは、ガイドRNAの3'末もしくは5'末での、またはガイドRNA中の分子内のある場所での伸長を含む。ステップ(a)において、napDNAbp/gRNA複合体はDNA分子に接触し、gRNAがnapDNAbpを、変異誘発されるべき標的遺伝子座へ結合するようにガイドする。ステップ(b)において、標的遺伝子座のDNAの鎖の一方にニックが導入され(例として、ヌクレアーゼまたは化学剤によって)、これによって標的遺伝子座の鎖の一方に利用可能な3'末が創出される。ある態様において、ニックは、Rループ鎖に対応するDNAの鎖、すなわち、ガイドRNA配列とはハイブリダイズされない鎖中に創出される。ステップ(c)において、3'末DNA鎖は、逆転写をプライムするために、ガイドRNAの伸長部分と相互作用する。いくつかの態様において、3'末のDNA鎖は、ガイドRNAの伸長部分上の特定のプライマー結合部位とハイブリダイズする。ステップ(d)において、エラーを起こしやすい逆転写酵素が導入されるが、これは変異誘発されたDNAの単鎖を、プライムされた部位の3'末からガイドRNAの3'末へ合成する。例示の突然変異は星印「*」で示される。これは、所望の変異誘発領域を含む単鎖DNAフラップを形成する。ステップ(e)において、napDNAbpおよびガイドRNAは放出される。ステップ(f)および(g)は、所望の変異誘発領域が標的遺伝子座中へ組み込まれるように、単鎖DNAフラップ(変異誘発領域を含む)の分解に関する。このプロセスは、一旦3'単鎖DNAフラップが侵入して他の鎖上の相補的な配列とハイブリダイズすると、形成された対応の5'内生DNAフラップを除去することによって、所望の産物形成へ推進され得る。プロセスはまた、図1Dに例示されるとおり、第2鎖にニックが入れられた産物の形成へも推進され得る。内生DNA修復および/または複製プロセスに続き、変異誘発領域は、DNA遺伝子座のDNAの両鎖中へ組み込まれるようになる。
図23は、トリヌクレオチド反復(repeat)配列を縮小するためのgRNAデザインおよびTPRTゲノム編集でのトリヌクレオチド反復の縮小の概略図である。トリヌクレオチド反復拡大は、ハンチントン病、脆弱X症候群、およびフリートライヒ運動失調症を包含する、数多のヒト疾患に関連する。最も一般的なトリヌクレオチド反復はCAGトリプレットを含有するが、GAAトリプレット(フリートライヒ運動失調症)およびCGGトリプレット(脆弱X症候群)もまた生じる。拡大する素因を遺伝するか、または既に拡大された親のアレルを獲得すること(acquiring)は、疾患に罹る(acquiring)可能性を増大させる。トリヌクレオチド反復の病原性の拡大は仮説上、プライム編集を使用して修正され得る。反復領域上流の領域は、RNAにガイドされる(-guided)ヌクレアーゼによってニックが入れられ、次いで、健常な数の反復(これは具体的な遺伝子および疾患に依存する)を含有する新しいDNA鎖の合成をプライムするのに使用され得る。反復配列の後に、反復の他端に隣接する配列の同一性にマッチする、一続きの短い相同(short stretch of homology)が加えられる(赤色鎖)。新しく合成された鎖の侵入、これに続く内生DNAの、新しく合成されたフラップとの置き換えが、縮小された反復アレルへ繋がる。
図24は、プライム編集での正確な10ヌクレオチド欠失を示す概略図である。HEK3遺伝子座が標的にするガイドRNAを、ニック部位の後に10ヌクレオチド欠失をコードする逆転写鋳型でデザインした。トランスフェクトされたHEK細胞における編集効率を、アンプリコン配列決定を使用して査定した。
図25は、内生ゲノム遺伝子座にて遺伝子をペプチドタグ付けする(peptide tagging)ためのgRNAデザインおよびTPRTゲノム編集でのペプチドタグ付けを示す概略図である。FlAsHおよびReAsHのタグ付け系は、2つの部分:(1)フルオロフォア-二ヒ素(biarsenical)プローブ、および(2)テトラシステインモチーフを含有する、遺伝子学的にコードされたペプチドを含み、配列FLNCCPGCCMEP(配列番号1361586)によって例示される。細胞内で発現されたとき、テトラシステインモチーフ含有タンパク質は、フルオロフォア-ヒ素プローブで蛍光標識され得る(参考文献:J.Am.Chem.Soc.,2002,124(21),pp6063-6076を参照。DOI:10.1021/ja017687n)。「ソルタグ付け(sortagging)」系は、標識ペプチドプローブを、好適なペプチド基質を含有するタンパク質へ共有結合的に抱合させる細菌ソルターゼ酵素を採用する(参考文献:Nat.Chem.Biol.2007 Nov;3(11):707-8を参照。DOI:10.1038/nchembio.2007.31)。FLAGタグ(DYKDDDDK(配列番号1361587))、V5タグ(GKPIPNPLLGLDST(配列番号1361588))、GCN4タグ(EELLSKNYHLENEVARLKK(配列番号1361589))、HAタグ(YPYDVPDYA(配列番号1361590))、およびMycタグ(EQKLISEEDL(配列番号1361591))は一般的に、免疫アッセイのためのエピトープタグとして採用される。パイクランプ(pi-clamp)は、ペンタフルオロ-芳香族基質で標識され得るペプチド配列(FCPF(配列番号1361592))をコードする(参考文献:Nat.Chem.2016 Feb;8(2):120-8。doi:10.1038/nchem.2413)。
図26は、ゲノムDNA中へのHis6タグおよびFLAGタグの正確な組み入れを示す。HEK3遺伝子座を標的にするガイドRNAを、18nt Hisタグ挿入または24nt FLAGタグ挿入のいずれかをコードする逆転写鋳型でデザインした。トランスフェクトされたHEK細胞における編集効率を、アンプリコン配列決定を使用して査定した。FLAGタグの全長24nt配列はフレームから見切れている点に留意する(配列決定によって全長の正確な挿入が確認された)。
図27は、本明細書に企図され、例2に定義される方法論に従ってデザインされてもよい、ある態様のPEgRNAの構造を提供する。PEgRNAは、5'→3'方向に順序付けられた3大構成要素、つまり:スペーサー、gRNAコア、および3'末にて伸長アームを含む。伸長アームはさらに、5'→3'方向に以下の構造要素、つまり:プライマー結合部位(A)、編集鋳型(B)、および相同アーム(C)に分けられてもよい。加えて、PEgRNAは、任意の3'末修飾領域(e1)および任意の5'末修飾領域(e2)を含んでいてもよい。またさらに、PEgRNAは、PEgRNAの3'末にて転写終止シグナルを含んでいてもよい(描かれず)。これらの構造要素はさらに本明細書に定義される。PEgRNA構造の描画は、限定することを意図しておらず、要素の配置におけるバリエーションを網羅するものである。例えば、任意の配列修飾因子(e1)および(e2)は、示されるいずれの他の領域内またはそれらの間に位置付けられ得るものであって、3'末および5'末にて位置付けられることに限定され得ない。図27に示されるPEgRNAは、本明細書に開示されたアルゴリズムによってデザインされ得る。PEgRNAPEgRNAは、ある態様において、これらに限定されないが、ヘアピン、ステム/ループ、トウループ、RNA結合タンパク質動員ドメイン(例として、MS2cpタンパク質を動員し、これへ結合するMS2アプタマー)などの2次RNA構造を含み得る。実例として、かかる2次構造は、スペーサー内、gRNAコア内、または伸長アーム内、とりわけ、e1および/またはe2の修飾領域内に位置付けられ得る。2次RNA構造に加えて、PEgRNAPEgRNAは、化学的リンカー、またはポリ(N)リンカーもしくはテール(ここで「N」は,いずれの核酸塩基でもあり得る)を(例として、e1および/またはe2の修飾領域内に)含み得る。いくつかの態様において(例として、図72(c)に示されるとおり)、化学的リンカーは、sgRNA骨格またはコアの逆転写を防止するために機能してもよい。加えて、ある態様において(例として、図72(c)を参照)、伸長アーム(3)は、RNAもしくはDNAから構成され得るか、および/または1以上の核酸塩基類似体を包含し得る(例として、これによって、温度耐性(temperature resilience)などの機能性が付加されてもよい)。またさらに、伸長アーム(3)の配向は、天然の5'→3'方向であり得るか、または3'→5'方向の逆配向で合成されてもよい(PEgRNAPEgRNA分子全体の配向に対して)。当業者が、伸長アームの核酸材料の性質(すなわち、DNAまたはRNA)に応じて、プライム編集における使用のための適切なDNAポリメラーゼを選択することができるであろうことにもまた留意する。ここでプライム編集は、所望の編集を包含する、所望の鋳型にコードされた3'単鎖DNAフラップを合成するために、napDNAbpとの融合体としてかまたは別々の部分としてtransで提供されるかのいずれかとして、実践されてもよい。例えば、伸長アームがRNAであると、DNAポリメラーゼは、逆転写酵素またはいずれか他の好適なRNA依存性DNAポリメラーゼであり得る。しかしながら、伸長アームがDNAであると、DNAポリメラーゼはDNA依存性DNAポリメラーゼであり得る。様々な態様において、DNAポリメラーゼは、例として、RNA-タンパク質動員ドメインの使用(例として、PEgRNAPEgRNA上に(例として、e1領域もしくはe2領域か、または他のどこかにおいて)組み入れられたMS2ヘアピン)、およびDNAポリメラーゼと融合したMS2cpタンパク質の使用(これによってDNAポリメラーゼがPEgRNAPEgRNAと共局在化される)を通して、transで提供され得る。プライマー結合部位は一般に、DNAポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)によって使用される鋳型の一部(その結果得られる3'単鎖DNAフラップ(所望の編集を包含する)をコードする)を形成しないことにも留意する。よって、「DNA合成鋳型」という標示は、DNAポリメラーゼによって鋳型(編集を含有する所望の3'単鎖DNAフラップをコードする)として使用される伸長アーム(3)の領域または部分を指す。いくつかの態様において、DNA合成鋳型は、「編集鋳型」および「相同アーム」を包含する。他の態様において、DNA合成鋳型はまた、e2領域またはこの一部も包含していてもよい。実例として、e2領域がDNAポリメラーゼ活性の終止を引き起こす2次構造を含むと、e2領域のいずれの部分も実際にDNA中へコードされる前にDNAポリメラーゼ機能が終止されるであろうことは起こり得ることである。e2領域のある部分が、またはその全部ですら、DNA中へコードされるであろうこともまた起こり得ることである。e2のどの程度の部分が実際に鋳型として使用されるかは、その構成、およびその構成がDNAポリメラーゼ機能を妨害するかどうかに依存するであろう。
図28は、本明細書に企図され、例2に定義される方法論に従ってされてもよい、別の態様のPEgRNAの構造を提供する。PEgRNAは、5'→3'方向に順序付けられた3大構成要素、つまり:スペーサー、gRNAコア、および3'末にて伸長アームを含む。伸長アームはさらに、5'→3'方向に以下の構造要素、つまり:プライマー結合部位(A)、編集鋳型(B)、および相同アーム(C)に分けられてもよい。加えて、PEgRNAは、任意の3'末修飾領域(e1)および任意の5'末修飾領域(e2)を含んでいてもよい。またさらに、PEgRNAは、PEgRNAの3'末上に転写終止シグナルを含んでいてもよい(描かれず)。これらの構造要素はさらに本明細書に定義される。PEgRNA構造の描画は、限定することを意図しておらず、要素の配置におけるバリエーションを網羅するものである。例えば、任意の配列修飾因子(e1)および(e2)は、示されるいずれの他の領域内またはそれらの間に位置付けられ得るものであって、3'末および5'末にて位置付けられることに限定され得ない。PEgRNAPEgRNAは、ある態様において、これらに限定されないが、ヘアピン、ステム/ループ、トウループ、RNA結合タンパク質動員ドメイン(例として、MS2cpタンパク質を動員し、これへ結合するMS2アプタマー)などの2次RNA構造を含み得る。これらの2次構造は、PEgRNAPEgRNA分子中のどこにでも位置付けられ得る。実例として、かかる2次構造は、スペーサー内、gRNAコア内、または伸長アーム内、とりわけ、e1および/またはe2の修飾領域内に位置付けられ得る。2次RNA構造に加えて、PEgRNAPEgRNAは、化学的リンカー、またはポリ(N)リンカーもしくはテール(ここで「N」は,いずれの核酸塩基でもあり得る)を(例として、e1および/またはe2の修飾領域内に)含み得る。いくつかの(例として、図27に示されるとおりの)態様において、化学的リンカーは、sgRNA骨格またはコアの逆転写を防止するために機能してもよい。加えて、ある態様において(例として、図28を参照)、伸長アーム(3)は、RNAもしくはDNAから構成され得るか、および/または1以上の核酸塩基類似体を包含し得る(例として、これによって、温度耐性などの機能性が付加されてもよい)。またさらに、伸長アーム(3)の配向は、天然の5'→3'方向であり得るか、または3'→5'方向の逆配向で合成されてもよい(PEgRNAPEgRNA分子全体の配向に対して)。当業者が、伸長アームの核酸材料の性質(すなわち、DNAまたはRNA)に応じて、プライム編集における使用のための適切なDNAポリメラーゼを選択することができるであろうことにもまた留意する。ここでプライム編集は、所望の編集を包含する、所望の鋳型にコードされた3'単鎖DNAフラップを合成するために、napDNAbpとの融合体としてかまたは別々の部分としてtransで提供されるかのいずれかとして、実践されてもよい。例えば、伸長アームがRNAであると、DNAポリメラーゼは、逆転写酵素またはいずれか他の好適なRNA依存性DNAポリメラーゼであり得る。しかしながら、伸長アームがDNAであると、DNAポリメラーゼはDNA依存性DNAポリメラーゼであり得る。様々な態様において、DNAポリメラーゼは、例として、RNA-タンパク質動員ドメインの使用(例として、PEgRNAPEgRNA上に(例として、e1領域もしくはe2領域か、または他のどこかにおいて)組み入れられたMS2ヘアピン)、およびDNAポリメラーゼと融合したMS2cpタンパク質の使用(これによってDNAポリメラーゼがPEgRNAPEgRNAと共局在化される)を通して、transで提供され得る。プライマー結合部位は一般に、DNAポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)によって使用される鋳型の一部(その結果得られる3'単鎖DNAフラップ(所望の編集を包含する)をコードする)を形成しないことにも留意する。よって、「DNA合成鋳型」という標示は、DNAポリメラーゼによって鋳型(編集を含有する所望の3'単鎖DNAフラップをコードする)として使用される伸長アーム(3)の領域または部分を指す。いくつかの態様において、DNA合成鋳型は、「編集鋳型」および「相同アーム」を包含する。他の態様において、DNA合成鋳型はまた、e2領域またはこの一部も包含していてもよい。実例として、e2領域がDNAポリメラーゼ活性の終止を引き起こす2次構造を含むと、e2領域のいずれの部分も実際にDNA中へコードされる前にDNAポリメラーゼ機能が終止されるであろうことは起こり得ることである。e2領域のある部分が、またはその全部ですら、DNA中へコードされるであろうこともまた起こり得ることである。e2のどの程度の部分が実際に鋳型として使用されるかは、その構成、およびその構成がDNAポリメラーゼ機能を妨害するかどうかに依存するであろう。
図29は、典型的なPEgRNAの、二本鎖DNAの標的部位との相互作用、および着目する遺伝子変化を含有する3'単鎖DNAフラップの同時産生を描く概略図である。二本鎖DNAは、上の鎖(すなわち、標的鎖)が3'→5'配向であり、下の鎖(すなわち、PAM鎖または非標的鎖)が5'→3'方向であるように示される。上の鎖は「プロトスペーサー」の相補体およびPAM配列の相補体を含み、PEgRNAのスペーサーによって標的にされてこれとアニールする鎖であることから「標的鎖」と称される。相補的な下の鎖は、PAM配列(例として、NGG)およびプロトスペーサーを含有するから、「非標的鎖」または「PAM鎖」または「プロトスペーサー鎖」と称される。示されてはいないが、描かれるPEgRNAは、Cas9またはプライム編集因子融合タンパク質の等価ドメインと複合体化されている。概略図に示されるとおり、PEgRNAのスペーサーは標的鎖上のプロトスペーサーの相補的な領域とアニールするが、これはプロトスペーサーと称され、PAM配列のちょうど下流に位置付けられ、長さがおよそ20ヌクレオチドである。この相互作用は、スペーサーRNAとプロトスペーサーDNAの相補体との間にDNA/RNAハイブリッドとして形成され、プロトスペーサーとは逆の領域中にRループの形成を誘導する。本明細書の他のどこかに教示されるとおり、Cas9タンパク質(示されず)は次いで、示されるとおり、非標的鎖中にニックを誘導する。次いでこれによって、ニック部位のすぐ上流の3'ssDNAフラップ領域の形成へ繋がり、これは*z*に従って、PEgRNAatプライマー結合部位の3'末と相互作用する。ssDNAフラップ(すなわち、逆転写酵素プライマー配列)の3'末は、PEgRNA上のプライマー結合部位(A)とアニールし、これによって逆転写酵素がプライムされる。次に、逆転写酵素(例として、transで提供されるか、または融合タンパク質としてcisで提供され、Cas9構築物へ付着されている)は次いで、DNA合成鋳型(編集鋳型(B)および相同アーム(C)を包含する)によってコードされるDNAの単鎖を重合する。重合は伸長アームの5'末へ続く。ssDNAの重合鎖はssDNA 3'末フラップを形成し、これは、他のどこかに記載されるとおり(例として、図1Eに示されるとおり)、内生DNAに侵入し、対応する内生鎖(これは、内生DNAの5'DNAフラップとして除去される)に取って代わり、天然に存在するDNA修復/一連の複製を通して所望のヌクレオチド編集(単一ヌクレオチド塩基対の変化、欠失、挿入(全ゲノムを包含する)を組み入れる。
図30は、配列表の本開示のPEgRNAを理解するのを助けるものである。図は、2つの例示のPEgRNA配列(配列番号135529(最上列)および配列番号135880(最下列))、ならびに開示された様々な配列サブセットがその上にどのようにマッピングされるのかを示す。配列番号135529について、対応する配列は、スペーサー(配列番号271043)、伸長アーム(配列番号406557)、プライマー結合部位(配列番号542071)、編集鋳型(配列番号677585)、および相同アーム(配列番号813099)である。配列番号135880について、対応する配列は、スペーサー(配列番号880463)、伸長アーム(配列番号947841)、プライマー結合部位(配列番号1015219)、編集鋳型(配列番号1082597)、および相同アーム(配列番号1149975)である。 図30は、配列表の本開示のPEgRNAを理解するのを助けるものである。図は、開示された様々な配列サブセットがその上にどのようにマッピングされるのかを示す。配列番号135529について、対応する配列は、スペーサー(配列番号271043)、伸長アーム(配列番号406557)、プライマー結合部位(配列番号542071)、編集鋳型(配列番号677585)、および相同アーム(配列番号813099)である。配列番号135880について、対応する配列は、スペーサー(配列番号880463)、伸長アーム(配列番号947841)、プライマー結合部位(配列番号1015219)、編集鋳型(配列番号1082597)、および相同アーム(配列番号1149975)である。
図31は、本開示のいくつかの態様に従って伸長されたgRNA構造を決定するための、ハイレベルコンピュータによる例示の方法3100を示すフローチャートである。ステップ3102にて、計算デバイス(例として、図34と併せて記載される計算デバイス3400)は、入力アレルと、出力アレルと、核酸プログラム型DNA結合タンパク質および逆転写酵素を包含する融合タンパク質とを示すデータにアクセスする。ステップ3102が入力アレル、出力アレル、および融合タンパク質の3つすべてへワンステップでアクセスすることを記載するが、これは説明のためであって、かかるデータが1以上のステップを使用してアクセスされ得ることは、本明細書に記載の技法の精神を逸脱せずに解されるはずである。データへアクセスすることは、データを受け取ること、データを記憶すること、データベースへアクセスすること、および/または同種のものを包含し得る。
図32は、いくつかの態様に従って伸長されるgRNA構造の構成要素(伸長の構成要素を包含する)を決定するための、コンピュータによる例示の方法3200を示すフローチャートである。図32が説明を意図しており、したがって、伸長されたgRNAを決定するのに使用される技法が、図32に示されるステップより多いまたは少ないステップを包含し得ることは解されるはずである。
図33は、いくつかの態様に従って、データベース中の各突然変異エントリーについて伸長されたgRNA構造一式を決定するための、コンピュータによる例示の方法3300を示すフローチャートである。ステップ3302にて、計算デバイスは、突然変異エントリー一式を包含するデータベース(例として、www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/にてアクセス可能なクリンバーデータベース)にアクセスするが、前記エントリー一式の各々は、突然変異を表す入力アレルおよび修正された野生型配列を表す出力アレルを包含する。
図34は、本明細書に開示の技法および態様の側面のいずれも実施するのに使用されてもよいコンピュータ系3400の実施態様(illustrative implementation)である。コンピュータ系3400は、1以上のプロセッサ3410、ならびに1以上の非一過性コンピュータ可読記憶媒体(例として、メモリ3420および1以上の不揮発性記憶媒体3430)、ならびにディスプレー3440を包含していてもよい。プロセッサ3410は、いずれの好適なやり方で、メモリ3420および不揮発性記憶装置3430へデータを書込むこと、およびそれらからデータを読取ることを制御してもよいが、本明細書に記載の本発明の側面はこの点で限定されない。
図35Aは、例3と関係するRNAモチーフをコードする配列のPEベースの挿入の概略図である。
図35Bは、例3と関係する、潜在的に挿入され得るいくつかの例のモチーフの列挙(網羅的ではない)、およびそれらの機能である。
図36は、様々な細胞株の種々の標的部位に対してPE2、PE2-trunc、PE3、およびPE3-truncの効率(すなわち、「編集またはインデルが特定された配列決定総読取の％」)を比較したバーグラフを提供する。データは、トランケートされたRTバリアントを含むプライム編集因子が、トランケートされていないRTタンパク質を含むプライム編集因子とほぼ同程度に効率的であったことを示す。
図37Aは、「UGU」中3'末にて終止し、トウループ要素を含有しないSpCas9 PEgRNA分子のヌクレオチド配列を示す(最上列)。図の下側は、同じSpCas9 PEgRNA分子を描くが、「UUU」3'末の直前に挿入された配列5'-「GAAANNNNN」-3'を有するトウループ要素を含有するようさらに修飾されている。「N」は、いずれの核酸塩基でもあり得る。
図37Bは、HEK細胞またはEMX細胞におけるプライム編集の効率がトウループ要素含有PEgRNAを使用して増大される一方で、インデル形成のパーセントは大きく変化はしないことを実証する、例4の結果を示す。
図38は、プライム編集因子の半分のタンパク質各々の終わりまたは始まりにて位置付けられる分裂インテイン半分の自己スプライシング作用を通して、プライム編集因子全体として再生する2つのPEタンパク質の半分として提供されるプライム編集因子の一態様を描く。
図39は、ポリペプチド配列からのインテイン除去の機序およびN末エクステイン配列とC末エクステイン配列との間のペプチド結合の再形成を描く。(a)は、2つのタンパク質半分(各々がインテイン配列の半分を含有する)の一般機序を描き、前記半分が細胞内で接触したとき、完全に機能的なインテインがもたらされ、次いで自己スプライシングおよび切除を経る。切除のプロセスは、Nエクステイン部分およびCエクステイン部分を含む、一体となった単一のポリペプチドを形成する、N末タンパク質半分(または「Nエクステイン」)とC末タンパク質半分(または「Cエクステイン」)との間のペプチド結合の形成をもたらす。様々な態様において、Nエクステインは、分裂プライム編集因子融合タンパク質のN末半分に対応してもよく、Cエクステインは、分裂プライム編集因子のC末半分に対応してもよい。 図39は、ポリペプチド配列からのインテイン除去の機序およびN末エクステイン配列とC末エクステイン配列との間のペプチド結合の再形成を描く。(b)は、インテイン切除、およびNエクステイン半分(赤色の半分)とCエクステイン半分(青色の半分)とを結び合わせるペプチド結合の再形成の、化学力学を示す。分裂インテインの切除(すなわち、分裂インテイ立体配置におけるNインテインおよびCインテイン)はまた、transで提供される2つ別々の構成要素のスプライシング作用を伴うことから、「transスプライシング」とも称されることがある。
定義
アンチセンス鎖
遺伝学において、二本鎖のDNA内のセグメントの「アンチセンス」鎖は、鋳型鎖であって、3'→5'配向に伸びる(runs)と考えられる。これに反して、「センス」鎖は、5'から3'へ伸びる二本鎖のDNA内のセグメントであって、3'から5'へ伸びるDNAのアンチセンス鎖または鋳型鎖に相補的である。タンパク質をコードするDNAセグメントのケースにおいて、センス鎖は、転写の最中にその鋳型としてアンチセンス鎖を取り結局(典型的には、常にではない)翻訳を経てタンパク質になるmRNAと同じ配列を有するDNAの鎖である。よって、アンチセンス鎖は、後にタンパク質へ翻訳されるRNAを担い、一方センス鎖は、mRNAとほぼ同一の組成(makeup)を保有する。dsDNAの各セグメントについて、一方がどの方向から読まれるかに応じて、おそらく(センスおよびアンチセンスは視点に相対するから)センスおよびアンチセンスが2組存在するであろう点に留意する。遺伝子産物またはmRNAは結局、dsDNAの一方のセグメントのどちらかの鎖がセンスまたはアンチセンスと称されることを示す。
Cas9
用語「Cas9」または「Cas9ヌクレアーゼ」は、Cas9ドメインまたはそのフラグメントを含む、RNAにガイドされるヌクレアーゼ(例として、Cas9の活性もしくは不活性なDNA切断ドメインおよび/またはCas9のgRNA結合ドメインを含むタンパク質)を指す。「Cas9ドメイン」は、本明細書に使用されるとき、Cas9の活性もしくは不活性な切断ドメインおよび/またはCas9のgRNA結合ドメインを含むタンパク質フラグメントである。「Cas9タンパク質」は、全長Cas9タンパク質である。Cas9ヌクレアーゼはまた、ときにcasn1ヌクレアーゼまたはCRISPR(クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat))関連ヌクレアーゼとしても言及される。CRISPRは、可動遺伝因子(ウイルス、転移因子、および接合性プラスミド)に対して保護を提供する適応免疫系である。CRISPRクラスターは、スペーサー、先行する可動因子に相補的な配列、および標的化侵入核酸を含有する。CRISPRクラスターは転写され、プロセスを受けて(processed)CRISPR RNA(crRNA)になる。II型CRISPR系において、pre-crRNAの修正プロセシングは、transでコードされた低分子(small)RNA(tracrRNA)、内生リボヌクレアーゼ3(rnc)、およびCas9ドメインを要する。tracrRNAは、pre-crRNAの、リボヌクレアーゼ3に補助された(-aided)プロセシングのためのガイドとして働く。続いて、Cas9/crRNA/tracrRNAは、スペーサーに相補的な線状または環状のdsDNA標的をエンドヌクレアーゼ的に切断する。crRNAに相補的ではない標的鎖は、最初にエンドヌクレアーゼ的に切られ、次いで3'-5'エキソヌクレアーゼ的に切り取られる。本来、DNAの結合および切断は、典型的には、タンパク質および両RNAを要する。しかしながら、単一ガイドRNA(「sgRNA」、または単に「gNRA」)は、crRNAとtracrRNAとの両方の側面を単一RNA種中へ組み込むために、改変され得る。例として、Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)を参照(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)。Cas9は、CRISPR反復配列(PAMまたはプロトスペーサー隣接モチーフ)中の短いモチーフを認識することで、自己・対・非自己を区別するのに役立つ。Cas9ヌクレアーゼ配列および構造は当業者に周知である(例として、"Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes."Ferretti et al.,J.J.,McShan W.M.,Ajdic D.J.,Savic D.J.,Savic G.,Lyon K.,Primeaux C.,Sezate S.,Suvorov A.N.,Kenton S.,Lai H.S.,Lin S.P.,Qian Y.,Jia H.G.,Najar F.Z.,Ren Q.,Zhu H.,Song L.,White J.,Yuan X.,Clifton S.W.,Roe B.A.,McLaughlin R.E.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001);"CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III."Deltcheva E.,Chylinski K.,Sharma C.M.,Gonzales K.,Chao Y.,Pirzada Z.A.,Eckert M.R.,Vogel J.,Charpentier E.,Nature 471:602-607(2011);および"A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity."Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)を参照(これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる))。Cas9オルソログは、これらに限定されないが、S.pyogenesおよびS.thermophilusを包含する様々な種において記載されている。追加の好適なCas9ヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づき当業者に明らかであろう。またかかるCas9ヌクレアーゼおよび配列は、Chylinski, Rhun, and Charpentier,"The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems"(2013)RNA Biology 10:5,726-737(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)に開示された生物および遺伝子座からのCas9配列を包含する。いくつかの態様において、Cas9ヌクレアーゼは、DNA切断ドメインを部分的に損なうかまたは不活性化させる1以上の突然変異を含む。
ヌクレアーゼが不活性化されたCas9ドメインは、互換的に「dCas9」タンパク質(ヌクレアーゼが「不活性型」のCas9を表す)と称されてもよい。不活性なDNA切断ドメインを有するCas9ドメイン(またはそのフラグメント)を生成するための方法は知られている(例として、Jinek et al.,Science.337:816-821(2012);Qi et al.,"Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression"(2013)Cell.28;152(5):1173-83を参照(これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる))。例えば、Cas9のDNA切断ドメインは、2つのサブドメイン、HNHヌクレアーゼサブドメインおよびRuvC1サブドメインを包含することが知られている。HNHサブドメインはgRNAに相補的な鎖を切断するのに対し、RuvC1サブドメインは非相補鎖を切断する。これらのサブドメイン内の突然変異は、Cas9のヌクレアーゼ活性をサイレンシングさせ(silence)得る。例えば、突然変異D10AおよびH840Aは、S.pyogenes Cas9のヌクレアーゼ活性を完全に不活性化する(Jinek et al.,Science.337:816-821(2012);Qi et al.,Cell.28;152(5):1173-83 (2013))。いくつかの態様において、Cas9のフラグメントを含むタンパク質が提供される。例えば、いくつかの態様において、タンパク質は、2つのCas9ドメイン:(1)Cas9のgRNA結合ドメイン;または(2)Cas9のDNA切断ドメインのうち一方を含む。いくつかの態様において、Cas9を含むタンパク質またはそのフラグメントは、「Cas9バリアント」と称される。Cas9バリアントは、Cas9またはそのフラグメントとの相同性を共有する。例えば、Cas9バリアントは、野生型Cas9(例として、配列番号1361421のSpCas9)と、少なくとも約70％同一、少なくとも約80％同一、少なくとも約90％同一、少なくとも約95％同一、少なくとも約96％同一、少なくとも約97％同一、少なくとも約98％同一、少なくとも約99％同一、少なくとも約99.5％同一、少なくとも約99.8％同一、または少なくとも約99.9％同一である。いくつかの態様において、Cas9バリアントは、野生型Cas9(例として、配列番号1361421のSpCas9)と比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはそれ以上のアミノ酸変化を有していてもよい。いくつかの態様において、Cas9バリアントは、そのフラグメントが、野生型Cas9(例として、配列番号1361421のSpCas9)の対応するフラグメントと、少なくとも約70％同一、少なくとも約80％同一、少なくとも約90％同一、少なくとも約95％同一、少なくとも約96％同一、少なくとも約97％同一、少なくとも約98％同一、少なくとも約99％同一、少なくとも約99.5％同一、または少なくとも約99.9％同一となるように、配列番号X Cas9のフラグメント(例として、gRNA結合ドメインまたはDNA切断ドメイン)を含む。いくつかの態様において、フラグメントは、対応する野生型Cas9(例として、配列番号1361421のSpCas9)のアミノ酸の長さの、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％同一の、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％である。
cDNA
用語「cDNA」は、RNA鋳型からコピーされたDNAの鎖を指す。cDNAは、RNA鋳型に相補的である。
循環置換体
本明細書に使用されるとき、用語「循環置換体(circular permutant)」は、タンパク質のアミノ酸配列中に現れるアミノ酸の順序の変化を伴うタンパク質の構造上の立体配置における変化である循環置換(circular permutation)を含むタンパク質またはポリペプチド(例として、Cas9)を指す。換言すれば、循環置換体は、野生型対応物と比較してN末端およびC末端が変更されたタンパク質であり、例として、野生型タンパク質のC末端半分が新しいN末端半分になっている。循環置換(またはCP)は本質的に、そのN末端およびC末端が接続され、しばしばペプチドリンカーをもつ、タンパク質1次配列の形態上の再配置であるが、同時にその配列を異なる位置にて分裂させることで、隣接していた新しいN末端およびC末端が創出される。その結果は、接続が異なるが、しばしば同じか全体的には同様の3次元の(3D)形状を有し得るタンパク質構造であって、おそらく、改善または変更された特徴(タンパク分解への低減された感受性、改善された触媒活性、変更された基質結合もしくはリガンド結合、および/または改善された熱安定性を包含する)を包含する。循環置換タンパク質は天然に存在し得る(例として、コンカナバリンAおよびレクチン)。加えて、循環置換は、翻訳後修飾の結果として生じ得るか、または組換え技法を使用して改変されてもよい。
循環置換されたCas9
用語「循環置換されたCas9」は、循環置換体として生じ、これによってそのN末端およびC末端がタンパク質の1次配列の再配置を通して再構成された、いずれのCas9タンパク質またはそのバリアントも指す。循環置換されたかかるCas9タンパク質(「CP-Cas9」)、またはそれらのバリアントは、ガイドRNA(gRNA)と複合体化されたときのDNAへの結合能を保持している。Oakes et al.,"Protein Engineering of Cas9 for enhanced function,"Methods Enzymol,2014,546:491?511およびOakes et al.,"CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification,"Cell,January10,2019,176:254-267を参照(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)。本開示は、これまでに知られているいずれのCP-Cas9も企図するか、または新しいCP-Cas9を、その結果得られた循環置換タンパク質がガイドRNA(gRNA)と複合体化されたときのDNAへの結合能を保持している限り、使用する。例示のCP-Cas9タンパク質は、配列番号1361475～1361484である。
DNA合成鋳型
本明細書に使用されるとき、用語「DNA合成鋳型」は、プライム編集因子のポリメラーゼによって鋳型鎖(所望の編集を含有しており、次いでプライム編集の機序を通して、対応する内生DNAの鎖を標的部位にて置き換える、3'単鎖DNAフラップをコードする)として利用される、PEgRNAの伸長アームの領域または部分を指す。様々な態様において、DNA合成鋳型は、図3A(5'伸長アームを含むPEgRNAの文脈(context)において)、図3B(3'伸長アームを含むPEgRNAの文脈において)、図3C(内部伸長アームの文脈において)、図3D(3'伸長アームの文脈において)、および図3E(5'伸長アームの文脈において)に示される。伸長アームは、DNA合成鋳型を包含しており、DNAまたはRNAから構成されていてもよい。RNAのケースにおいて、プライム編集因子のポリメラーゼは、RNA依存性DNAポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)であり得る。DNAのケースにおいて、プライム編集因子のポリメラーゼは、DNA依存性DNAポリメラーゼであり得る。様々な(例として、図3D～3Eに描かれるとおりの)態様において、DNA合成鋳型(4)は、「編集鋳型」および「相同アーム」、ならびに任意の5'末修飾領域e2の全部または一部を含んでいてもよい。つまり、e2領域の性質に応じて(例として、これが、ヘアピン、トウループ、またはステム/ループの2次構造を包含するかどうかに関わらず)、ポリメラーゼは、e2領域を何もコードしていなくても、またはその一部もしくは全部をコードしていてもよい。別の言い方をすれば、3'伸長アームのケースにおいて、DNA合成鋳型(3)は、ポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)によるDNAの単鎖の合成のための鋳型として動作してもよい、プライマー結合部位(PBS)の5'末からgRNAコアの3'末までに及ぶ伸長アーム(3)の部分を包含し得る。5'伸長アームのケースにおいて、DNA合成鋳型(3)は、PEgRNA分子の5'末から編集鋳型の3'末までに及ぶ伸長アーム(3)の部分を包含し得る。好ましくは、DNA合成鋳型は、3'伸長アームまたは5'伸長アームのいずれかを有するPEgRNAsのプライマー結合部位(PBS)を排除する。本明細書に記載のある態様(例として、図71A)は、編集鋳型および相同アーム、すなわち、DNA合成の最中に鋳型として実際に使用されるPEgRNA伸長アームの配列を包含する「RT鋳型」を指す。用語「RT鋳型」は、用語「DNA合成鋳型」と等価である。
下流
本明細書に使用されるとき、用語「上流」および「下流」は、5'→3'方向に配向された核酸分子(単鎖または二本鎖であるかに関わらず)中に位置付けられた少なくとも2つの要素の線状の位置を定義する相対的な用語である。とりわけ、第1要素が第2要素に対して5'のどこかに位置付けられている場合、第1要素は、核酸分子中、第2要素の上流にある。例えば、SNPがニック部位の5'側にある場合、SNPは、Cas9に誘導されたニック部位の上流にある。逆に言うと、第1要素が第2要素に対して3'のどこかに位置付けられている場合、第1要素は、核酸分子中、第2要素の下流にある。例えば、SNPがニック部位の3'側にある場合、SNPは、Cas9に誘導されたニック部位の下流にある。核酸分子は、DNA(二本鎖もしくは単鎖)、RNA(二本鎖もしくは単鎖)、またはDNAとRNAとのハイブリッドであり得る。二本鎖分子のどちらの鎖を考慮するのか選択する必要がある場合を除き、上流および下流という用語が核酸分子の単鎖にのみ言及するところ、分析は単鎖核酸分子および二本鎖分子について同じである。しばしば、少なくとも2つの要素の相対的な位置を決定するのに使用され得る二本鎖のDNAの鎖は、「センス」鎖または「コード」鎖である。遺伝学において、「センス」鎖は、5'から3'へ伸びる二本鎖DNA内セグメントであって、3'から5'へ伸びるDNAのアンチセンス鎖または鋳型鎖に相補的である。よって、例として、SNP核酸塩基がセンス鎖またはコード鎖上のプロモーターの3'側にある場合、SNP核酸塩基はゲノムDNA(二本鎖である)中のプロモーター配列の「下流」にある。
CRISPR
CRISPRは、原核生物に侵入したウイルスによる以前の感染の断片(snippets)を表す細菌および古細菌におけるDNA配列のファミリー(すなわち、CRISPRクラスター)である。DNAの断片は、これに続く同様のウイルスによる攻撃からDNAを検出し破壊するために原核細胞によって使用され、CRISPR関連タンパク質(Cas9およびそのホモログを包含する)およびCRISPR関連RNAのアレイとともに原核生物の免疫防御系を有効に構成する。本来、CRISPRクラスターは転写され、プロセスを受けてCRISPR RNA(crRNA)になる。CRISPR系(例として、II型CRISPR系)のある型において、pre-crRNAの修正プロセシングは、transでコードされた低分子RNA(tracrRNA)、内生リボヌクレアーゼ3(rnc)、およびCas9ドメインを要する。tracrRNAは、pre-crRNAの、リボヌクレアーゼ3に補助されたプロセシングのためのガイドとして働く。続いて、Cas9/crRNA/tracrRNAは、RNAに相補的な線状または環状のdsDNA標的をエンドヌクレアーゼ的に切断する。具体的に言うと、crRNAに相補的ではない標的鎖は、最初にエンドヌクレアーゼ的に切られ、次いで3'-5'エキソヌクレアーゼ的に切り取られる。本来、DNAの結合および切断は、典型的には、タンパク質および両RNAを要する。しかしながら、単一ガイドRNA(「sgRNA」、または単に「gNRA」)は、crRNAとtracrRNAとの両方の側面を単一RNA種中へ組み込むために、改変され得る。例として、Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)。Cas9は、CRISPR反復配列(PAMまたはプロトスペーサー隣接モチーフ)中の短いモチーフを認識することで、自己・対・非自己を区別するのに役立つ。CRISPRの生物学、ならびにCas9ヌクレアーゼの配列および構造は、当業者に周知である(例として、"Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes."Ferretti et al.,J.J.,McShan W.M.,Ajdic D.J.,Savic D.J.,Savic G.,Lyon K.,Primeaux C.,Sezate S.,Suvorov A.N.,Kenton S.,Lai H.S.,Lin S.P.,Qian Y.,Jia H.G.,Najar F.Z.,Ren Q.,Zhu H.,Song L.,White J.,Yuan X.,Clifton S.W.,Roe B.A.,McLaughlin R.E.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001);"CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III."Deltcheva E.,Chylinski K.,Sharma C.M.,Gonzales K.,Chao Y.,Pirzada Z.A.,Eckert M.R.,Vogel J.,Charpentier E.,Nature 471:602-607(2011);および"A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity."Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)を参照(これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる))。Cas9オルソログは、これらに限定されないが、S.pyogenesおよびS.thermophilusを包含する様々な種において記載されている。追加の好適なCas9ヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づき当業者に明らかであろう。またかかるCas9ヌクレアーゼおよび配列は、Chylinski,Rhun, and Charpentier,"The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems"(2013)RNA Biology 10:5,726-737(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)に開示された生物および遺伝子座からのCas9配列を包含する。
用語「Cas9」または「Cas9ヌクレアーゼ」は、Cas9ドメインまたはそのフラグメントを含む、RNAにガイドされるヌクレアーゼ(例として、活性あるいは不活性な、Cas9のDNA切断ドメインおよび/またはCas9のgRNA結合ドメインを含むタンパク質)を指す。「Cas9ドメイン」は、本明細書に使用されるとき、活性あるいは不活性な、Cas9の切断ドメインおよび/またはCas9のgRNA結合ドメインを含むタンパク質フラグメントである。「Cas9タンパク質」は全長Cas9タンパク質である。Cas9ヌクレアーゼはまた、ときにcasn1ヌクレアーゼまたはCRISPR(クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat))関連ヌクレアーゼとしても言及される。CRISPRは、可動遺伝因子(ウイルス、転移因子、および接合性プラスミド)に対して保護を提供する適応免疫系である。CRISPRクラスターは、スペーサー、先行する可動因子に相補的な配列、および標的化侵入核酸を含有する。CRISPRクラスターは転写され、プロセスを受けてCRISPR RNA(crRNA)になる。II型CRISPR系において、pre-crRNAの修正プロセシングは、transでコードされた低分子RNA(tracrRNA)、内生リボヌクレアーゼ3(rnc)、およびCas9ドメインを要する。tracrRNAは、pre-crRNAの、リボヌクレアーゼ3に補助されたプロセシングのためのガイドとして働く。続いて、Cas9/crRNA/tracrRNAは、スペーサーに相補的な線状または環状のdsDNA標的をエンドヌクレアーゼ的に切断する。crRNAに相補的ではない標的鎖は、最初にエンドヌクレアーゼ的に切られ、次いで3'-5'エキソヌクレアーゼ的に切り取られる。本来、DNAの結合および切断は、典型的には、タンパク質および両RNAを要する。しかしながら、単一ガイドRNA(「sgRNA」、または単に「gNRA」)は、crRNAとtracrRNAとの両方の側面を単一RNA種中へ組み込むために、改変され得る。例として、Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)を参照。Cas9は、CRISPR反復配列(PAMまたはプロトスペーサー隣接モチーフ)中の短いモチーフを認識することで、自己・対・非自己を区別するのに役立つ。Cas9ヌクレアーゼの配列および構造は当業者に周知である(例として、"Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes."Ferretti et al.,J.J.,McShan W.M.,Ajdic D.J.,Savic D.J.,Savic G.,Lyon K.,Primeaux C.,Sezate S.,Suvorov A.N.,Kenton S.,Lai H.S.,Lin S.P.,Qian Y.,Jia H.G.,Najar F.Z.,Ren Q.,Zhu H.,Song L.,White J.,Yuan X.,Clifton S.W.,Roe B.A.,McLaughlin R.E.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001);"CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III."Deltcheva E.,Chylinski K.,Sharma C.M.,Gonzales K.,Chao Y.,Pirzada Z.A.,Eckert M.R.,Vogel J.,Charpentier E.,Nature 471:602-607(2011);および"A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity."Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)を参照(これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる))。Cas9オルソログは、これらに限定されないが、S.pyogenesおよびS.thermophilusを包含する様々な種において記載されている。追加の好適なCas9ヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づき当業者に明らかであろう。またかかるCas9ヌクレアーゼおよび配列は、Chylinski, Rhun, and Charpentier,"The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems"(2013)RNA Biology 10:5,726-737(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)に開示された生物および遺伝子座からのCas9配列を包含する。いくつかの態様において、Cas9ヌクレアーゼは、DNA切断ドメインを部分的に損なうかまたは不活性化させる1以上の突然変異を含む。
ヌクレアーゼが不活性化されたCas9ドメインは、互換的に「dCas9」タンパク質(ヌクレアーゼが「不活性型」のCas9を表す)と称されてもよい。不活性なDNA切断ドメインを有するCas9ドメイン(またはそのフラグメント)を生成するための方法は知られている(例として、Jinek et al.,Science.337:816-821(2012);Qi et al.,"Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression"(2013)Cell.28;152(5):1173-83を参照(これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる))。例えば、Cas9のDNA切断ドメインは、2つのサブドメイン、HNHヌクレアーゼサブドメインおよびRuvC1サブドメインを包含することが知られている。HNHサブドメインはgRNAに相補的な鎖を切断するのに対し、RuvC1サブドメインは非相補鎖を切断する。これらのサブドメイン内の突然変異は、Cas9のヌクレアーゼ活性をサイレンシングさせ(silence)得る。例えば、突然変異D10AおよびH840Aは、S.pyogenes Cas9のヌクレアーゼ活性を完全に不活性化する(Jinek et al.,Science.337:816-821(2012);Qi et al.,Cell.28;152(5):1173-83(2013))。いくつかの態様において、Cas9のフラグメントを含むタンパク質が提供される。例えば、いくつかの態様において、タンパク質は、2つのCas9ドメイン:(1)Cas9のgRNA結合ドメイン;または(2)Cas9のDNA切断ドメインのうち一方を含む。いくつかの態様において、Cas9を含むタンパク質またはそのフラグメントは、「Cas9バリアント」と称される。Cas9バリアントは、Cas9またはそのフラグメントとの相同性を共有する。例えば、Cas9バリアントは、野生型Cas9(例として、配列番号1361421のSpCas9)と、少なくとも約70％同一、少なくとも約80％同一、少なくとも約90％同一、少なくとも約95％同一、少なくとも約96％同一、少なくとも約97％同一、少なくとも約98％同一、少なくとも約99％同一、少なくとも約99.5％同一、少なくとも約99.8％同一、または少なくとも約99.9％同一である。いくつかの態様において、Cas9バリアントは、野生型Cas9(例として、配列番号1361421のSpCas9)と比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはそれ以上のアミノ酸変化を有していてもよい。いくつかの態様において、Cas9バリアントは、そのフラグメントが、野生型Cas9(例として、配列番号1361421のSpCas9)の対応するフラグメントと、少なくとも約70％同一、少なくとも約80％同一、少なくとも約90％同一、少なくとも約95％同一、少なくとも約96％同一、少なくとも約97％同一、少なくとも約98％同一、少なくとも約99％同一、少なくとも約99.5％同一、または少なくとも約99.9％同一となるように、配列番号X Cas9のフラグメント(例として、gRNA結合ドメインまたはDNA切断ドメイン)を含む。いくつかの態様において、フラグメントは、対応する野生型Cas9(例として、配列番号1361421のSpCas9)のアミノ酸の長さの、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％同一の、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％である。
編集鋳型
用語「編集鋳型」は、ポリメラーゼ(例として、DNA依存性DNAポリメラーゼ、RNA依存性DNAポリメラーゼ(例として、逆転写酵素))によって合成された単鎖3'DNAフラップ中に所望の編集をコードする伸長アームの部分を指す。本明細書に記載のある態様(例として、図71A)は、編集鋳型と相同アームとの両方一緒、すなわち、DNA合成の最中に鋳型として実際に使用されるPEgRNA伸長アームの配列を指す「RT鋳型」を指す。用語「RT編集鋳型」はまた、用語「DNA合成鋳型」とも等価であるが、ここでRT編集鋳型は、逆転写酵素であるポリメラーゼを有するプライム編集因子の使用を反映し、DNA合成鋳型は、いずれのポリメラーゼも有するプライム編集因子の使用をより広く反映する。
エラーを起こしやすい
本明細書に使用されるとき、用語「エラーを起こしやすい」逆転写酵素(またはより広くは、いずれのポリメラーゼ)は、天然に存在するか、または野生型M-MLV逆転写酵素の誤差率未満の誤差率を有する別の逆転写酵素(例として、野生型M-MLV逆転写酵素)に由来する逆転写酵素(またはより広くは、いずれのポリメラーゼ)を指す。野生型M-MLV逆転写酵素の誤差率は、1誤差の範囲が15,000(より高い)～27,000(より低い)にあると報告されている。15,000中の1の誤差率は6.7×10-5の誤差率に相当する。27,000中の1の誤差率は3.7×10-5の誤差率に相当する。Boutabout et al.(2001)"DNA synthesis fidelity by the reverse transcriptase of the yeast retrotransposon Ty1,"Nucleic Acids Res 29(11):2217?2222を参照(これは参照により本明細書に組み込まれる)。よって、本出願の目的において、用語「エラーを起こしやすい」は、15,000核酸塩基の組み込み中1より大きい誤差(6.7×10-5またはこれより高い)、例として、14,000核酸塩基中1誤差(7.14×10-5もしくはこれより高い)、13,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(7.7×10-5もしくはこれより高い)、12,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(7.7×10-5もしくはこれより高い)、11,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(9.1×10-5もしくはこれより高い)、10,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(1×10-4または0.0001もしくはこれより高い)、9,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.00011もしくはこれより高い)、8,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.00013もしくはこれより高い)、7,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.00014もしくはこれより高い)、6,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.00016もしくはこれより高い)、5,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.0002もしくはこれより高い)、4,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.00025もしくはこれより高い)、3,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.00033もしくはこれより高い)、2,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.00050もしくはこれより高い)、あるいは1,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.001もしくはこれより高い)、あるいは500核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.002もしくはこれより高い)、あるいは250核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.004もしくはこれより高い)である誤差率を有する、それらRTを指す。
伸長アーム
用語「伸長アーム」は、数種の機能(逆転写酵素のためのプライマー結合部位および編集鋳型を包含する)を提供するPEgRNAのヌクレオチド配列構成要素を指す。いくつかの態様、例として、図3Dにおいて、伸長アームは、ガイドRNAの3'末にて位置付けられる。他の態様、例として、図3Eにおいて、伸長アームは、ガイドRNAの5’末にて位置付けられる。いくつかの態様において、伸長アームはまた、相同アームも包含する。様々な態様において、伸長アームは、5'→3'方向に以下の構成要素:相同アーム、編集鋳型、およびプライマー結合部位を含む。逆転写酵素の重合活性が5'→3'方向であるから、相同アーム、編集鋳型、およびプライマー結合部位の好ましい配置は、逆転写酵素が、アニールされたプライマー配列によって一旦プライムされると、編集鋳型を相補的な鋳型鎖として使用して単鎖DNAを重合する(polymerases)ように、5'→3'方向にある。伸長アームの長さなどのさらなる詳細は、本明細書に記載の他のどこかに記載されている。
伸長アームはまた、図3G(最上列)に実例として示されるとおり、一般に2つの領域:プライマー結合部位(PBS)およびDNA合成鋳型を含むものとしても記載されていてもよい。プライマー結合部位は、プライム編集因子複合体によってニックが入れられるようになり、これによってニックが入った内生鎖上に3'末が晒されたとき、標的部位の内生DNA鎖から形成されるプライマー配列へ結合する。本明細書に説明されるとおり、プライマー配列の、PEgRNAの伸長アーム上のプライマー結合部位への結合は、晒された3'末(すなわち、プライマー配列の3')をもつ二重鎖領域を創出し、これは次いで、晒された3'末からDNA合成鋳型の長さに沿ってDNAの単鎖を重合し始めるポリメラーゼのための基質を提供する。単鎖DNA産物の配列は、DNA合成鋳型の相補体である。重合は、重合が終止するまでDNA合成鋳型(または伸長アーム)の5'へ続く。よって、DNA合成鋳型は、プライム編集因子複合体のポリメラーゼによって単鎖DNA産物(すなわち、所望の遺伝子編集情報を含有する3'単鎖DNAフラップ)中へコードされる伸長アームの部分を表し、前記単鎖DNA産物は、PEに誘導されたニック部位のすぐ下流にある標的部位の対応する内生DNA鎖に置き換える。理論に拘泥されないが、DNA合成鋳型の重合は、終止という事象まで、伸長アームの5'末へ続く。重合は、これらに限定されないが、(a)PEgRNAの5'末端に達すること(例として、5'伸長アームのケースにおいて、DNAポリメラーゼが単に鋳型を使い果たす)、(b)通り抜けられないRNA2次構造(例として、ヘアピンもしくはステム/ループ)に達すること、あるいは(c)複製終止シグナル、例として、ポリメラーゼを遮断もしくは阻害する特定のヌクレオチド配列、またはスーパーコイル状のDNAもしくはRNAなどの核酸形態上のシグナルに達すること、を包含する様々な形で終止することもある。
有効量
用語「有効量」は、本明細書に使用されるとき、所望の生物学的応答を惹起するのに充分な、生物学的に活性な剤の量を指す。例えば、いくつかの態様において、プライム編集因子の有効量は、標的部位ヌクレオチド配列(例として、ゲノム)を編集するのに充分な、編集因子の量を指してもよい。いくつかの態様において、本明細書に提供されるプライム編集因子の(例として、ニッカーゼCas9ドメインおよび逆転写酵素を含む融合タンパク質の)有効量は、融合タンパク質によって特異的に結合され編集される標的部位の編集を誘導するのに充分な、融合タンパク質の量を指してもよい。当業者には当然のことながら、剤、例として、融合タンパク質、ヌクレアーゼ、ハイブリッドタンパク質、タンパク質二量体、タンパク質(もしくはタンパク質二量体)およびポリヌクレオチドの複合体、またはポリヌクレオチドの有効量は、様々な因子に、例えば、所望の生物学的応答に、例として、編集されるべき特定のアレル、ゲノム、または標的部位に、標的にされている細胞または組織に、および使用されている剤に応じて変動してもよい。
機能的等価物
用語「機能的等価物」は、機能は等価であるが構造は第1生体分子と必ずしも等価ではない第2生体分子を指す。例えば、「Cas9等価物」は、Cas9と同じかまたは実質的に同じ機能を有するが、必ずしも同じアミノ酸配列は有さないタンパク質を指す。本開示の文脈において、本明細書は通してずっと「タンパク質X、またはその機能的等価物」を指す。これに関連して、タンパク質Xの「機能的等価物」は、タンパク質Xの等価機能を担持する、いずれのホモログ、パラログ、フラグメント、天然に存在するバージョン、改変バージョン、突然変異バージョン、または合成バージョンを受け入れる。
融合タンパク質
用語「融合タンパク質」は、本明細書に使用されるとき、少なくとも2つの異なるタンパク質からタンパク質ドメインを含むハイブリッドポリペプチドを指す。あるタンパク質は、融合タンパク質のアミノ末端(N末端)部分にて、またはカルボキシ末端(C末端)タンパク質にて位置付けられ、よって「アミノ末端の融合タンパク質」または「カルボキシ末端の融合タンパク質」の夫々を形成してもよい。タンパク質は、異なるドメイン、例えば、核酸結合ドメイン(例として、タンパク質を標的部位への結合へ向かわせる、Cas9のgRNA結合ドメイン)と、核酸編集タンパク質の核酸切断ドメインまたは触媒ドメインとを含んでいてもよい。別の例は、逆転写酵素と融合したCas9またはその等価物を包含する。本明細書に提供されるタンパク質のいずれも、当該技術分野において知られているいずれの方法によって産生されてもよい。例えば、本明細書に提供されるタンパク質は、ペプチドリンカーを含む融合タンパク質にとくに適した、組換えタンパク質の発現および精製を介して産生されてもよい。組換えタンパク質の発現および精製のための方法は周知であり、Green and Sambrook, Molecular Cloning:A Laboratory Manual(4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012)(これらの内容全体は参照により本明細書に組み込まれる))によって記載されるものを包含する。
遺伝子産物
用語「遺伝子産物」は、本明細書に使用されるとき、核酸配列によってコードされるいずれの産物も指す。結果的に、遺伝子産物は、例えば、1次転写産物、成熟した転写産物、プロセスを受けた転写産物、または# 転写産物によってコードされるタンパク質もしくはペプチドであってもよい。遺伝子産物の例は、結果的に、mRNA、rRNA、tRNA、ヘアピンRNA、マイクロRNA(miRNA)、shRNA、siRNA、ならびにペプチドおよびタンパク質、例えば、レポータータンパク質または治療用タンパク質を包含する。
着目した遺伝子(Gene of interest)(GOI)
用語「着目した遺伝子」または「GOI」は、着目した生体分子(例として、タンパク質またはRNA分子)をコードする遺伝子を指す。着目したタンパク質は、いずれの細胞内タンパク質、膜タンパク質、または細胞外タンパク質、例として、核内タンパク質、転写因子、核膜輸送体、細胞内オルガネラ関連タンパク質、膜受容体、触媒タンパク質、および酵素、治療用タンパク質、膜タンパク質、膜輸送タンパク質、シグナル伝達タンパク質、または免疫学的タンパク質(例として、IgGまたは他の抗体タンパク質)、等々を包含し得る。着目した遺伝子はまた、これらに限定されないが、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、リボソームRNA(rRNA)、低分子核内RNA(snRNA)、アンチセンスRNA、ガイドRNA、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、および無細胞RNA(cfRNA)を包含するRNA分子もコードしていてもよい。
ガイドRNA(「gRNA」)
本明細書に使用されるとき、用語「ガイドRNA」は、大部分が一般的にCRISPR-Cas9のCasタンパク質に関連する具体的な型のガイド核酸であって、Cas9に結び付いて、Cas9タンパク質をDNA分子中の特定の配列(ガイドRNAのプロトスペース配列との相補性を包含する)へ向かわせる。他のどこかに記載のとおり、PEgRNAは、その分子が本明細書に開示のプライム編集因子とともに使用されることを可能にさせるガイドの3'末または5'末上に伸長アームをさらに含む、下位範疇のガイドRNAである。用語「ガイドRNA」はまた、天然に存在するかもしくは天然には存在しない(例として、改変または組換え)かに関わらず、Cas9等価物、ホモログ、オルソログ、またはパラログに結び付き、またCas9等価物を特定の標的ヌクレオチド配列へ局在化するよう別にプログラムする、等価なガイド核酸分子も受け入れる。Cas9等価物は、Cpf1(V型CRISPR-Cas系)、C2c1(V型CRISPR-Cas系)、C2c2(VI型CRISPR-Cas系)およびC2c3(V型CRISPR-Cas系)を包含する、いずれの型のCRISPR系(例として、II型、V型、VI型)からの他のnapDNAbpも包含していてもよい。さらなるCas等価物は、Makarova et al.,"C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector,"Science 2016;353(6299)(この内容は参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。ガイドRNAの例示の配列および構造は本明細書に提供されている。加えて、適切なガイドRNA配列をデザインするための方法も、本明細書に提供されている。本明細書に使用されるとき、「ガイドRNA」はまた、本明細書に開示のプライム編集方法および組成物のために発明された「プライム編集因子ガイドRNA」(または「PEgRNA」)と呼ばれる修飾形態のガイドRNAと対比させるために「既存のガイドRNA」とも称されてもよい。
ガイドRNAまたはPEgRNAは、これらに限定されないが、以下を包含する様々な構造要素を含んでいてもよい:
スペーサー配列－標的DNA中のプロトスペーサー(本明細書の下に定義されるとおりの)へ結合するガイドRNAまたはPEgRNA(長さが約10～約40(例として、約10、約15、約20、約25、約30)ヌクレオチドを有する)中の配列。
gRNAコア(またはgRNA骨格もしくは主鎖配列)－は、napDNAbp(例として、Cas9)結合を担うgRNA内の配列を指し、これは、napDNAbp(例として、Cas9)を標的DNAへガイドするのに使用されるスペーサー/標的化配列を包含していない。
伸長アーム－は、相同アーム、編集鋳型、およびプライマー結合部位を含む、5'末または3'末のいずれかにて伸長されたガイドRNAの部分を指す。この構成要素は他のどこかでさらに定義される。
相同アーム－は、結果として得られる、逆転写酵素にコードされた単鎖DNAフラップ(内生鎖を置き換えることによって標的DNA部位中へ取り入れられる)の部分をコードする伸長アームの部分(単数または複数)を指す。相同アームによってコードされる単鎖DNAフラップの部分は、標的DNA配列の非編集済鎖に相補的であって、内生鎖に取って代わることおよびその場所において単鎖DNAフラップとアニールすることを容易にし、これによって編集が組み入れられる。この構成要素は他のどこかでさらに定義される。
編集鋳型－は、逆転写酵素によって合成された単鎖DNAフラップ中に所望の編集をコードする伸長アームの部分を指す。この構成要素は他のどこかでさらに定義される。
プライマー結合部位－は、標的DNAの鎖から、それへCas9媒介ニッカーゼが作用した後に形成されるプライマー配列とアニールする伸長アームの部分を指す。この構成要素は他のどこかでさらに定義される。
転写ターミネータ－ガイドRNAまたはPEgRNAは、転写終止配列を分子の3'にて含んでいてもよい。典型的には、転写ターミネータ配列(例として、配列番号1361560～1361565)は、長さが約70～約125ヌクレオチドであるが、短いおよびより長い転写ターミネータ配列も企図され、当該技術分野において知られているいずれも使用されてもよい。
フラップエンドヌクレアーゼ(例として、FEN1)
本明細書に使用されるとき、用語「フラップエンドヌクレアーゼ」は、5'単鎖DNAフラップの除去を触媒する酵素を指す。これらは、細胞プロセス(DNA複製を包含する)の最中に形成された5'フラップの除去を処理する、天然に存在する酵素である。本明細書に記載のプライム編集方法は、内生で供給されるフラップエンドヌクレアーゼ、またはプライム編集の最中に標的部位にて形成される内生DNAの5'フラップを除去するのにtransで提供されるものを利用してもよい。フラップエンドヌクレアーゼは、当該技術分野において知られており、Patel et al.,"Flap endonucleases pass 5'-flaps through a flexible arch using a disorder-thread-order mechanism to confer specificity for free 5'-ends,"Nucleic Acids Research,2012,40(10):4507-4519およびTsutakawa et al.,Human flap endonuclease structures,DNA double-base flipping, and a unified understanding of the FEN1 superfamily,"Cell,2011,145(2):198-211、およびBalakrishnan et al.,"Flap Endonuclease 1,"Annu Rev Biochem,2013,Vol 82:119-138(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)の記載から見出され得る。例示のフラップエンドヌクレアーゼは、以下のアミノ酸配列によって表され得るFEN1である:
Figure 2022531539000002
融合タンパク質
用語「融合タンパク質」は、本明細書に使用されるとき、少なくとも2つの異なるタンパク質からタンパク質ドメインを含むハイブリッドポリペプチドを指す。あるタンパク質は、融合タンパク質のアミノ末端(N末端)部分にて、またはカルボキシ末端(C末端)タンパク質にて位置付けられ、よって「アミノ末端の融合タンパク質」または「カルボキシ末端の融合タンパク質」の夫々を形成してもよい。タンパク質は、異なるドメイン、例えば、核酸結合ドメイン(例として、タンパク質を標的部位への結合へ向かわせる、Cas9のgRNA結合ドメイン)と、核酸編集タンパク質(例として、RTドメイン)の核酸切断ドメイン(例として、Cas9ニッカーゼ、napDNAbp)または触媒ドメインとを含んでいてもよい。別の例は、逆転写酵素と融合したnapDNAbp(例として、Cas9)またはその等価物を包含する。本明細書に提供されるタンパク質のいずれも、当該技術分野において知られているいずれの方法によって産生されてもよい。例えば、本明細書に提供されるタンパク質は、ペプチドリンカーを含む融合タンパク質にとくに適した、組換えタンパク質の発現および精製を介して産生されてもよい。組換えタンパク質の発現および精製のための方法は周知であり、Green and Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012)(これらの内容全体は参照により本明細書に組み込まれる))によって記載されるものを包含する。
相同アーム
用語「相同アーム」は、結果として得られる、逆転写酵素にコードされた単鎖DNAフラップ(内生鎖を置き換えることによって標的DNA部位中へ取り入れられる)の配列を包含する伸長アームの部分を指す。相同アームによってコードされる単鎖DNAフラップの部分は、標的DNA配列の非編集済鎖に相補的であって、内生鎖に取って代わることおよびその場所において単鎖DNAフラップとアニールすることを容易にし、これによって編集が組み入れられる。この構成要素は他のどこかでさらに定義される。
宿主細胞
用語「宿主細胞」は、本明細書に使用されるとき、本明細書に記載のベクター、例として、napDNAbpまたはnapDNAbp等価物(例として、Cas9もしくは等価物)と逆転写酵素とを含む融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターの宿主となり(host)複製してこれを発現し得る細胞を指す。
単離された
「単離された」は、自然状態から変更または除去されることを意味する。例えば、生きている動物中に天然に存在する核20酸またはペプチドは「単離され」ていないが、共存材料のその自然状態から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは、「単離され」ている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または非自生(non-native)的環境(例えば、宿主細胞など)で存在し得る。
いくつかの態様において、着目する遺伝子は、単離された核酸によってコードされる。本明細書に使用されるとき、用語「単離された」は、その元のまたは自生(native)の環境(例として、天然に存在する場合は自然環境)から除去されている、本明細書に提供されるとおりの材料の特徴を指す。したがって、生きている動物中に存在する、天然に存在するポリヌクレオチドまたはタンパク質もしくはポリペプチドは単離されていないが、ヒトの介入によって自然系中の共存材料のいくつかまたはすべてから分離されている同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。人工材料または改変材料、例えば、本明細書に記載の発現コンストラクトおよびベクターなどの、天然には存在しない核酸構築物はまた、結果的に、単離されたとも称される。材料は、単離されるために精製される必要はない。結果的に、材料はベクターの一部および/または組成物の一部であってもよく、かかるベクターまたは組成物が、材料が自然界から見出される環境の一部にない点で、依然単離されている。
napDNAbp
本明細書に使用されるとき、用語「核酸プログラム型DNA結合タンパク質」または「napDNAbp」(そのCas9が一例である)は、DNA分子中の特定の配列を標的にし結合するためにRNA:DNAハイブリダイゼーションを使用するタンパク質を指す。各napDNAbpは、ガイド核酸またはこの一部(例として、ガイドRNAのプロトスペーサー)に相補的なDNA鎖(すなわち、標的鎖)を含むDNA配列へnapDNAbpを局在化する、少なくとも1のガイド核酸(例として、ガイドRNA)に結び付けられている。換言すれば、ガイド核酸は、相補的な配列へ局在化し結合するようnapDNAbp(例として、Cas9または等価物)を「プログラム」する。
理論に拘泥されないが、napDNAbp－ガイドRNA複合体の結合機序は、一般に、napDNAbpが二本鎖DNA標的の巻き戻しを誘導するRループを形成する(これによってnapDNAbpによって結合された領域中の鎖が分離される)ステップを包含する。ガイドRNAプロトスペーサーは次いで「標的鎖」とハイブリダイズする。これは、標的鎖に相補的な「非標的鎖」に取って代わり、このことによってRループの単鎖領域が形成される。いくつかの態様において、napDNAbpは1以上のヌクレアーゼ活性を包含しており、次いでDNAを切ることで、様々な型の病変がなくなる。例えば、napDNAbpは、非標的鎖を第1の場所にて切るか、および/または標的鎖を第2の場所にて切る、ヌクレアーゼ活性を含んでいてもよい。ヌクレアーゼ活性に応じて標的DNAが切られることで、両鎖とも切られた「二本鎖切断」が形成され得る。他の態様において、標的DNAは単一の部位でしか切られ得ない、すなわち、DNAは一方の鎖上に「ニックが入れられる(nicked)」。種々のヌクレアーゼ活性をもつ例示のnapDNAbpは、「Cas9ニッカーゼ」(「nCas9」)、およびヌクレアーゼ活性を一切有さない不活性化Cas9(「不活性型Cas9」または「dCas9」)を包含する。これらのおよび他のnapDNAbpへの例示の配列は、本明細書に提供されている。
リンカー
用語「リンカー」は、本明細書に使用されるとき、2つの他の分子または部分を連結する分子を指す。リンカーは当該技術分野において周知であって、核酸またはアミノ酸のいずれの好適な組み合わせを、それらが結び合う構造の正しい機能を容易にするよう含み得る。リンカーは、一連のアミノ酸であり得る。リンカーは、2つの融合タンパク質を結び合わせるリンカーのケースにおいて、アミノ酸配列であり得る。例えば、napDNAbp(例として、Cas9)は、アミノ酸リンカー配列によって逆転写酵素と融合され得る。リンカーはまた、2つのヌクレオチド配列を一緒に結び合わせるケースにおいて、ヌクレオチド配列でもあり得る。例えば、簡単なケースにおいて、既存のガイドRNAは、スペーサーまたはリンカーヌクレオチド配列を介して、DNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)およびプライマー結合部位を含んでいてもよいプライム編集因子ガイドRNAのRNA伸長へ連結されている。他の態様において、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学的成分である。いくつかの態様において、リンカーは、長さが5～100アミノ酸、例えば、長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30～35、35～40、40～45、45～50、50～60、60～70、70～80、80～90、90～100、100～150、または150～200アミノ酸である。いくつかの態様において、リンカーは、長さが5～100ヌクレオチド、例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30～35、35～40、40～45、45～50、50～60、60～70、70～80、80～90、90～100、100～150、150～200、200～300、300～500、500～1000、1000～2000、または2000～5000ヌクレオチドである。より長いリンカーまたはより短いリンカーもまた、企図される。
ニッカーゼ
用語「ニッカーゼ」は、不活性化された2つのヌクレアーゼドメインのうち1つをもつnapDNAbp(例として、Cas9)を指す。この酵素は、標的DNAの一方の鎖のみを切断することが可能である。
核局在化配列(NLS)
用語「核局在化配列」または「NLS」は、タンパク質の細胞核中への、例えば核輸送による、輸入(import)を促進するアミノ酸配列を指す。核局在化配列は当該技術分野において知られており、当業者に明らかであろう。例えば、NLS配列は、2000年11月23日に出願され、2001年5月31日にWO2001/038547として公開された、Plankらの国際PCT出願PCT/EP2000/011690に記載されている(この内容は、例示の核局在化配列のその開示について参照により本明細書に組み込まれる)。いくつかの態様において、NLSは、アミノ酸配列PKKKRKV(配列番号1361531)またはMDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC(配列番号1361533)を含む。
核酸分子
用語「核酸」は、本明細書に使用されるとき、ポリマー(すなわち、複数の、1より多くの、(例として、2、3、4、等々)のヌクレオチド)を指す。ポリマーは、天然のヌクレオシド(すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン)、ヌクレオシド類似体(例として、2-アミノアデノシン、2-チオチミジン、イノシン、ピロロ-ピリミジン、3-メチルアデノシン、5-メチルシチジン、C5ブロモウリジン、C5フルオロウリジン、C5ヨードウリジン、C5プロピニルウリジン、C5プロピニルシチジン、C5メチルシチジン、7デアザアデノシン、7デアザグアノシン、8オキソアデノシン、8オキソグアノシン、O(6)メチルグアニン、4-アセチルシチジン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン、ジヒドロウリジン、メチルシュードウリジン、1-メチルアデノシン、1-メチルグアノシン、N6-メチルアデノシン、および2-チオシチジン)、化学修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基(例として、メチル化された塩基)、インターカレートされた(intercalated)塩基、修飾された糖(例として、2'-フルオロリボース、リボース、2'-デオキシリボース、2'-O-メチルシチジン、アラビノース、およびヘキソース)、または修飾されたホスファート基(例として、ホスホロチオアートおよび5'-Nホスホラミダイト連結)を包含していてもよい。
核酸塩基
本明細書に使用されるとき、用語「核酸塩基」は、また「窒素塩基」もしくはしばしば単に「塩基」とも知られており、窒素含有生物学的化合物であって、ヌクレオシドを、次にヌクレオチドの構成要素を形成し、これら単量体のすべてが核酸の塩基性構成ブロックを構成する。核酸塩基が塩基対を形成する能力およびある核酸塩基が別の核酸塩基へ積み重ねる(stack)能力は直接、リボ核酸(RNA)およびデオキシリボ核酸(DNA)などの長鎖らせん構造へ繋がる。
アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)チミン(T)、およびウラシル(U)の5つの核酸塩基は、1次または標準的と称され得る。それらは遺伝暗号の基本ユニットとして機能し、塩基A、G、C、およびTがDNAから見出されるのに対し、A、G、C、およびUはRNAから見出される。TはUが欠くメチル基を包含するのを除き、チミンおよびウラシルは同一である。DNAおよびRNAはまた、修飾された核酸塩基を含有していてもよい。例えば、アデノシンおよびグアノシンの核酸塩基について、代替核酸塩基は、ヒポキサンチン、キサンチン、または7-メチルグアニンを包含し得、これらは夫々、イノシン、キサントシン、および7-メチルグアノシンの代替ヌクレオシドに対応する。加えて、例えば、シトシン、チミン、またはウリジンの核酸塩基、代替核酸塩基は、5,6ジヒドロウラシル、5-メチルシトシン、または5-ヒドロキシメチルシトシンを包含し得、これらは夫々、ジヒドロウリジン、5-メチルシチジン、および5-ヒドロキシメチルシチジンの代替ヌクレオシドに対応する。核酸塩基はまた、核酸塩基類似体も包含していてもよく、これらについては膨大な数が当該技術分野において知られている。典型的には、類似体核酸塩基は、数ある中でも、種々の塩基対合および塩基積み重ね特性を持つ。例は、ユニバーサル塩基(4つすべての標準的な塩基と対を形成し得る)、および鎖の特性に影響を及ぼすPNA(PNAは三重ヘリックスも形成し得る)などのホスファート－糖主鎖類似体を包含する。核酸類似体はまた、「ゼノ核酸」とも呼ばれ、代わりの生化学(alternative biochemistries)に基づき自然界へ新しい生命の形態(new-to-natural forms of life)をデザインする宇宙生物学(xenobiology)の大きな柱の1つを表す。人工核酸は、ペプチド核酸(PNA)、モルホリノおよびロックド核酸(LNA)、ならびにグリコール核酸(GNA)およびトレオース核酸(TNA)を包含する。これらの各々は、分子の主鎖への変化によって、天然に存在するDNAまたはRNAから区別される。類似体の例は、(例として、2-アミノアデノシン、2-チオチミジン、イノシン、ピロロ-ピリミジン、3-メチルアデノシン、5-メチルシチジン、C5ブロモウリジン、C5フルオロウリジン、C5ヨードウリジン、C5プロピニルウリジン、C5プロピニルシチジン、C5メチルシチジン、7デアザアデノシン、7デアザグアノシン、8オキソアデノシン、8オキソグアノシン、O(6)メチルグアニン、4-アセチルシチジン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン、ジヒドロウリジン、メチルシュードウリジン、1-メチルアデノシン、1-メチルグアノシン、N6-メチルアデノシン、および2-チオシチジン)、化学修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基(例として、メチル化された塩基)、インターカレートされた塩基、修飾された糖(例として、2'-フルオロリボース、リボース、2'-デオキシリボース、2'-O-メチルシチジン、アラビノース、およびヘキソース)、または修飾されたホスファート基(例として、ホスホロチオアートおよび5'-Nホスホラミダイト連結)である。
PEgRNA
本明細書に使用されるとき、用語「プライム編集因子ガイドRNA」または「PEgRNA」または「伸長されたガイドRNA」は、本明細書に記載のプライム編集方法、組成物、および系における使用のための1以上の追加の配列を包含するよう修飾されたガイドRNAの特化された形態を指す。本明細書に記載のとおり、プライム編集因子ガイドRNAは、核酸配列の1以上の「伸長された領域」を含む。伸長された領域は、これらに限定されないが、単鎖RNAを含んでいてもよい。さらに、伸長された領域は、既存のガイドRNAの3'末にて生じていてもよい。他の配置において、伸長された領域は、既存のガイドRNAの5’末にて生じていてもよい。また他の配置において、伸長された領域は、既存のガイドRNAの末端の1つよりむしろ、分子内のある領域にて(例えば、napDNAbpへ結び付きおよび/または結合するgRNAコア領域中)生じていてもよい。伸長された領域は、単鎖相補DNA(cDNA)をコードする単鎖RNA分子である「逆転写酵素鋳型配列」を含むが、前記分子は次に(a)編集されるべき内生標的DNAと相同であるようデザインされており、および(b)内生標的DNA中へ誘導または取り入れられるべき少なくとも1の所望のヌクレオチド変化(例として、トランジション、トランスバージョン、欠失、挿入、もしくはそれらの組み合わせ)を含んでいる。伸長された領域はまた、これらに限定されないが、「プライマー結合部位」および/または「スペーサーもしくはリンカー」配列などの、他の機能的配列要素も含んでいてもよい。本明細書に使用されるとき「プライマー結合部位」は、Rループのニック入りDNAから生成された3'末を有する単鎖DNA配列とハイブリダイズする配列であって、かつ逆転写酵素のためのプライマーを含む配列を含む。
いくつかの態様において、PEgRNAは、5'伸長アーム、スペーサー、およびgRNAコアを有するPEgRNAを示す図3Aによって表されている。5'伸長は、5'→3'方向に逆転写酵素鋳型、プライマー結合部位、およびリンカーをさらに含む。
いくつかの態様において、PEgRNAは、3'伸長アーム、スペーサー、およびgRNAコアを有するPEgRNAを示す図3Bによって表されている。3'伸長は、5'→3'方向に逆転写酵素鋳型およびプライマー結合部位をさらに含む。
更なる他の態様において、PEgRNAは、5'→3'方向にスペーサー(1)、gRNAコア(2)、および伸長アーム(3)を有するPEgRNAを示す図27によって表されている。伸長アーム(3)は、PEgRNAの3'末にある。伸長アーム(3)は、5'→3'方向に「プライマー結合部位」(A)、「編集鋳型」(B)、および「相同アーム」(C)をさらに含む。伸長アーム(3)はまた、3'末および5'末にて、同じ配列であってもまたは異なる配列であってもよい任意の修飾領域も含んでいてもよい。加えて、PEgRNAの3'末は、転写ターミネータ配列を含んでいてもよい。PEgRNAのこれらの配列要素はさらに、本明細書に記載、定義される。加えて、本明細書は、本明細書に開示の方法に従ってデザインされた例示のPEgRNAを添付の配列表中に開示する。
更なる他の態様において、PEgRNAは、5'→3'方向に伸長アーム(3)、スペーサー(1)、およびgRNAコア(2)を有するPEgRNAを示す図28によって表されている。伸長アーム(3)は、PEgRNAの5'末にある。伸長アーム(3)は、3'→5'方向に「プライマー結合部位」(A)、「編集鋳型」(B)、および「相同アーム」(C)をさらに含む。伸長アーム(3)はまた、3'末および5'末にて、同じ配列であってもまたは異なる配列であってもよい任意の修飾領域も含んでいてもよい。PEgRNAはまた、3'末にて転写ターミネータ配列も含んでいてもよい。PEgRNAのこれらの配列要素はさらに、本明細書に記載、定義される。
ペプチドタグ
用語「ペプチドタグ」は、遺伝子学的にタンパク質配列と融合してタンパク質上へ1以上の機能を付与するペプチドアミノ酸配列を指し、これによって可視化、同定、局在化、精製、可溶化、分離等々などの様々な目的でのタンパク質の操作が容易になる。ペプチドタグは、目的または機能によって分類される様々な型のタグを包含し得、これは、「親和性タグ」(タンパク質精製を容易にするための)、「可溶化タグ」(タンパク質の正しい折り畳みを補助するための)、「クロマトグラフィータグ」(タンパク質のクロマトグラフ特性を変更するための)、「エピトープタグ」(高親和性抗体へ結合するための)、「蛍光タグ」(細胞中またはin vitroでのタンパク質の可視化を容易にするための)を包含していてもよい。
PE1
本明細書に使用されるとき、「PE1」は、Cas9(H840A)および野生型MMLV RTを含む融合タンパク質を含み、以下の構造:[NLS]-[Cas9(H840A)]-[リンカー]-[MMLV_RT(wt)]+所望のPEgRNAを有するPE複合体を指し、ここでPE融合体は配列番号1361515のアミノ酸配列を有し、前記配列は以下に示されるとおりである;
Figure 2022531539000003
PE2
本明細書に使用されるとき、「PE2」は、Cas9(H840A)およびバリアントMMLV RTを含む融合タンパク質を含み、以下の構造:[NLS]-[Cas9(H840A)]-[リンカー]-[MMLV_RT(D200N)(T330P)(L603W)(T306K)(W313F)]+所望のPEgRNAを有するPE複合体を指し、ここでPE融合体は配列番号1361516のアミノ酸配列を有し、前記配列は以下に示されるとおりである:
Figure 2022531539000004
PE3
本明細書に使用されるとき、「PE3」は、編集済鎖の優先的な置き換えを誘導するためにPE2と複合体化して非編集済DNA鎖にニックを導入する、第2鎖にニックを入れるガイドRNAにプラスされたPE2を指す。
PE3b
本明細書に使用されるとき、「PE3b」はPE3を指すが、ここで第2鎖にニックを入れるガイドRNAは、第2鎖ニックが所望の編集の組み入れ後まで導入されないように、一時的制御のためにデザインされている。これは、編集済鎖のみにマッチするが元のアレルにはマッチしないスペーサー配列をもつgRNAをデザインすることによって達成される。以後PE3bとして言及されるこのストラテジーを使用すると、プロトスペーサーと未編集アレルとの間のミスマッチによって、PAM鎖上の編集事象が起きた後まで、sgRNAによるニック入れが疎まれるはずである。
短いPE(PE-short)
本明細書に使用されるとき、「短いPE」は、C末端でトランケートされた逆転写酵素と融合したPE構築物を指し、以下のアミノ酸配列を有する:
Figure 2022531539000005
パーセント同一性
配列(例として、核酸またはアミノ酸)の「パーセント同一性」、「配列同一性」、「％同一性」、または「％配列同一性」(本明細書中これらは互換的に使用されてもよい)は、2つの配列(例として、核酸またはアミノ酸)間の類似性の定量測定値を指す。ヒトと他の種との間のゲノムDNA配列、イントロン配列およびエキソン配列、ならびにアミノ酸配列のパーセント同一性は種のタイプによって変動するが、チンパンジーは、各カテゴリーにおけるすべての種のヒトと最も高いパーセント同一性を有する。パーセント同一性は、Karlin and Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993にあるような修飾がなされた、Karlin and Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990のアルゴリズムを使用して決定され得る。かかるアルゴリズムは、Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-10,1990のNBLASTおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)中へ組み込まれている。BLASTタンパク質検索は、着目したタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得るため、XBLASTプログラム、score=50、word length=3で実施され得る。ギャップ(gaps)が2つの配列間に存在する場合、Gapped BLASTは、Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402,1997に記載のとおりに利用され得る。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用するとき、夫々のプログラム(例として、XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトのパラメータが使用され得る。パーセント同一性、またはそれらの範囲(例として、少なくとも、より多い、の間、等々)が規定または列挙されているとき、別様に特定されない限り、エンドポイントは包含されるはずであり、範囲(例として、少なくとも70％の同一性)は、引用された範囲内のすべての範囲(例として、少なくとも71％、少なくとも72％、少なくとも73％、少なくとも74％、少なくとも75％、少なくとも76％、少なくとも77％、少なくとも78％、少なくとも79％、少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも95.5％、少なくとも96％、少なくとも96.5％、少なくとも97％、少なくとも97.5％、少なくとも98％、少なくとも98.5％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.6％、少なくとも99.7％、少なくとも99.8％、少なくとも99.9％の同一性)、それらすべての増分(例として、パーセントの10分の1(すなわち、0.1％)、パーセントの100分の1(すなわち、0.01％)、等々)を包含するはずである。
プライム編集因子
用語「プライム編集因子」は、napDNAbp(例として、Cas9ニッカーゼ)および逆転写酵素を含む本明細書に記載の融合構築物を指し、PEgRNA(または「伸長されたガイドRNA」)の存在下で標的ヌクレオチド配列上にプライム編集を遂行することが可能である。用語「プライム編集因子」は、融合タンパク質またはPEgRNAと複合体化された融合タンパク質を指してもよい。いくつかの態様において、プライム編集因子はまた、本明細書に記載のとおりの非編集済鎖の第2部位へのニック入れステップへ向かうことが可能な、融合タンパク質(napDNAbpと融合した逆転写酵素)、PEgRNA、および定例の(regular)ガイドRNAを含む複合体も指してもよい。ある態様において、「プライマー編集因子」の逆転写酵素構成要素は、transで提供される。
プライマー結合部位
用語「プライマー結合部位」または「PBS」は、伸長アームの構成要素としてPEgRNA上に位置付けられ(典型的には伸長アームの3'末にある)ヌクレオチド配列であって、プライム編集因子による標的配列のnapDNAbp(例として、Cas9)ニック入れ後に形成されるプライマー配列へ結合するのに役立つヌクレオチド配列を指す。他のどこかで詳述されるとおり、プライム編集因子のCas9ニッカーゼ構成要素が標的DNA配列の鎖の一方にニックを入れたとき、3'末のssDNAフラップが形成され、これはPEgRNA上のプライマー結合部位とアニールして逆転写をプライムするプライマー配列として働く。図27および28は、3'および5'伸長アーム上夫々に位置付けられるプライマー結合部位の態様を示す。
タンパク質、ペプチド、およびポリペプチド
用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は本明細書中、互換的に使用され、ペプチド(アミド)結合によって一緒に連結されたアミノ酸残基の重合体を指す。用語は、いずれのサイズ、構造、もしくは機能の、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを指す。典型的には、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、少なくとも3アミノ酸長であろう。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、個々のタンパク質またはタンパク質の一群を指してもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド中のアミノ酸の1以上は、例えば、炭水化物基、ヒドロキシル基、ホスファート基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、抱合のためのリンカー、官能基化、または他の修飾等々などの化学的実体(chemical entity)の付加によって修飾されていてもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドはまた、単一分子であってもよく、または多分子複合体であってもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在するタンパク質またはペプチドのただのフラグメントであってもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在するもの、組換え体、または合成物、またはいずれのそれらの組み合わせであってもよい。本明細書に提供されるタンパク質のいずれも、当該技術分野において知られているいずれの方法によって産生されてもよい。例えば、本明細書に提供されるタンパク質は、ペプチドリンカーを含む融合タンパク質にとくに適した、組換えタンパク質の発現および精製を介して産生されてもよい。組換えタンパク質の発現および精製のための方法は周知であり、Green and Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012)(これらの内容全体は参照により本明細書に組み込まれる))によって記載されるものを包含する。
作動可能に連結された(Operably linked)
用語「作動可能に連結された」は、本明細書に使用され得るとおり、異種の核酸配列(例として、導入遺伝子)の発現をもたらす、調節配列と異種の核酸配列(例として、導入遺伝子)との間の機能的な連結を指す。例えば、第1核酸配列は、第1核酸配列が第2核酸配列と機能的な関係性があるように置かれているとき、第2核酸配列と作動可能に連結されている。実例として、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターはコード配列へ作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結された核酸配列は連続しており、その場合、同じリーディングフレーム中2つのタンパク質をコードする領域を結び合わせるのが必要である。
プロモーター
用語「プロモーター」は当該技術分野において認識されており、細胞の転写機構によって認識される配列をもつ核酸分子を指し、下流遺伝子の転写を開始することができる。プロモーターは、構成的に活性(プロモーターが所定の細胞状況下で常に活性があることを意味する)、または条件付きで活性(プロモーターが特定条件の存在下でしか活性がないことを意味する)であり得る。例えば、条件付きのプロモーターは、プロモーター中の調節要素に関連するタンパク質を基本転写機構へ接続させる特定のタンパク質の存在下でしか、または阻害性分子の不在下でしか、活性がないこともある。条件付きで活性のあるプロモーターのサブクラスは、活性に小分子「誘導因子」の存在を要する誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターの例は、これらに限定されないが、アラビノース誘導性プロモーター、Tet-onプロモーター、およびタモキシフェン誘導性プロモーターを包含する。構成的な、条件付きの、および誘導性の、様々なプロモーターが当業者に周知であり、当業者は、本発明を遂行するのに有用である様々なかかるプロモーターを確かめることができるであろう。また本発明は、この点においても限定されない。
プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)
本明細書に使用されるとき、用語「プロトスペーサー隣接配列」または「PAM」は、Cas9ヌクレアーゼの重要な標的化構成要素である、およそ2～6塩基対DNA配列を指す。典型的には、PAM配列はいずれかの鎖上にあり、5'→3'方向においてCas9切断部位の下流にある。標準的なPAM配列(すなわち、Streptococcus pyogenesのCas9ヌクレアーゼまたはSpCas9に関連するPAM配列)は、5'-NGG-3'であるが、ここで「N」は、いずれかの核酸塩基であり、2個のグアニン(「G」)核酸塩基がこれに続く。種々のPAM配列は、種々の生物からの種々のCas9ヌクレアーゼまたは等価タンパク質に関連し得、例えば、5'-NG-3'(ここで「N」は、いずれかの核酸塩基であり、1つのグアニン(「G」)核酸塩基がこれに続く)、または5'-KKH-3'(ここで2個のリシン(「K」)に続く1つのヒスチジン(「H」)である)。加えて、所定のCas9ヌクレアーゼ(例として、SpCas9)は、ヌクレアーゼが代替のPAM配列を認識するように、ヌクレアーゼのPAM特異性を変更するよう修飾されていてもよい。
例えば、標準的なSpCas9アミノ酸配列の配列番号1361421(SpCas9 M1 QQ99ZW2野生型)を参照すると、PAM配列は、(a)D1135V、R1335Q、およびT1337R「VQRバリアント」(PAM特異性をNGANまたはNGNGへ変更する)、(b)D1135E、R1335Q、およびT1337R「EQRバリアント」(PAM特異性をNGAGへ変更する)、ならびに(c)D1135V、G1218R、R1335E、およびT1337R「VRERバリアント」(PAM特異性をNGCGへ変更する)を包含する、1以上の突然変異を導入することによって修飾され得る。加えて、標準的なSpCas9のD1135Eバリアントは依然としてNGGを認識するが、野生型SpCas9タンパク質と比較してより選択的である。
種々の細菌の種からのCas9酵素(すなわち、Cas9オルソログ)が変動するPAM特異性を有し得ることもまた、解されるであろう。例えば、Staphylococcus aureusからのCas9(SaCas9)は、NGRRTまたはNGRRNを認識する。加えて、Neisseria meningitisからのCas9(NmCas)は、NNNNGATTを認識する。別の例において、Streptococcus thermophilisからのCas9 (StCas9)は、NNAGAAWを認識する。また別の例において、Treponema denticolaからのCas9(TdCas)は、NAAAACを認識する。これらの例は、限定することを意図していない。非SpCas9も様々なPAM配列に結合するが、好適なSpCas9 PAM配列が所望の標的化切断部位にて存在しないとき、それによってこれらが有用になることはさらに解されるであろう。さらにまた、非SpCas9は、これらをSpCas9より有用にさせる他の特徴も有していてもよい。例えば、Staphylococcus aureusからのCas9(SaCas9)は、アデノ随伴ウイルス(AAV)にパッケージされ得るように、SpCas9より約1キロベース小さい。Shah et al.,Protospacer recognition motifs:mixed identities and functional diversity",RNA Biology,10(5):891-899(これは参照により本明細書に組み込まれる)をさらに参照してもよい。
プロトスペーサー
本明細書に使用されるとき、用語「プロトスペーサー」は、ガイドRNAのスペーサー配列と同じ配列を有するPAM(プロトスペーサー隣接モチーフ)配列に隣接するDNA中の配列(～20bp)を指す。ガイドRNAは、標的DNA上のプロトスペーサー配列の相補体(具体的に言うと、その一方の鎖、すなわち、標的配列の「非標的鎖」に対する「標的鎖」)にアニールする。Cas9が機能するために、Cas9遺伝子の細菌の種に応じて変動する特定のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)もまた要される。最も一般的に使用されるCas9ヌクレアーゼは、S.pyogenesに由来するが、非標的鎖上、ゲノムDNA中の標的配列のすぐ下流から見出されるNGGのPAM配列を認識する。当業者は、技術水準を示す文献がときに、「プロトスペーサー」を、これを「スペーサー」として言及するよりむしろ、ガイドRNA自体の～20nt標的化特異的ガイド配列として言及することを解するであろう。よって、いくつかのケースにおいて、用語「プロトスペーサー」は、本明細書に使用されるとき、用語「スペーサー」と相互に変換して使用されてもよい。「プロトスペーサー」または「スペーサー」のいずれかの出現を巡る記載の文脈は、用語がgRNAまたはDNA標的を指すかどうかに関し読者に知らせるのに役立つであろう。これらの用語の両方の利用は、技術水準が両用語をこれらの面(ways)の各々において使用するところ、許容し得る。
逆転写酵素
用語「逆転写酵素」は、RNA依存性DNAポリメラーゼとして特徴付けられるポリメラーゼの類を記載する。知られているすべての逆転写酵素は、RNA鋳型からDNA転写産物を合成するのにプライマーを要する。歴史的に、逆転写酵素はmRNAを転写してcDNAにするのに主に使用されており、cDNAは次いでさらなる操作のためにベクター中へクローニングされ得る。トリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)逆転写酵素が、最初に幅広く使用されたRNA依存性DNAポリメラーゼ(Verma,Biochim.Biophys.Acta 473:1(1977))であった。酵素は、5'-3'RNA特異的(-directed)DNAポリメラーゼ活性、5'-3'DNA特異的DNAポリメラーゼ活性、およびRNase H活性を有する。RNase Hは、RNA-DNAハイブリッドのための、RNA鎖に特異的なプロセス型(processive)5'および3'リボヌクレアーゼである(Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,New York:Wiley & Sons(1984))。知られているウイルスの逆転写酵素は校正に必要な3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠如しているから、転写におけるエラーは逆転写酵素によって修正され得ない(Saunders and Saunders,Microbial Genetics Applied to Biotechnology,London:Croom Helm (1987))。AMV逆転写酵素の活性およびその関連RNase H活性の詳細な研究は、Berger et al.,Biochemistry 22:2365-2372(1983)によって提示されている。分子生物学において広範に使用されている別の逆転写酵素は、モロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV)に由来する逆転写酵素である。例として、Gerard,G.R.,DNA 5:271-279(1986)およびKotewicz,M.L.,et al.,Gene 35:249-258(1985)を参照。RNase H活性を実質的に欠如しているM-MLV逆転写酵素は記載されている。例として米国特許第5,244,797を参照。本発明は、いずれのかかる逆転写酵素、またはそれらのバリアントもしくは突然変異体の使用を企図する。
加えて、本発明は、エラーを起こしやすい、すなわち、エラーを起こしやすい逆転写酵素、または忠実度が高いヌクレオチドの重合最中の組み込みを支持しない逆転写酵素と称されてもよい、逆転写酵素の使用も企図する。ガイドRNAに取り入れられたRT鋳型に基づく単鎖DNAフラップ合成の最中、エラーを起こしやすい逆転写酵素は、DNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)とミスマッチした1以上のヌクレオチドを導入し得、これによって単鎖DNAフラップの誤った重合を通してヌクレオチド配列へ変化が導入される。単鎖DNAフラップ合成の最中に導入されたこれらのエラーは次いで、対応する内生標的鎖とのハイブリダイゼーション、取って代わられた内生鎖の除去、ライゲーションを通して、次いでもう1回(one more rounds)の内生DNA修復および/または複製を通して、二本鎖分子中へ取り入れられるようになる。
逆転写
本明細書に使用されるとき、用語「逆転写」は、鋳型としてRNAを使用してDNA鎖(つまり、相補的なDNAまたはcDNA)を合成する酵素の能力を示す。いくつかの態様において、逆転写は「エラーを起こしやすい逆転写」であり得るが、これは、ある逆転写酵素の、そのDNA重合活性においてエラーを起こしやすい特性を指す。
センス鎖
遺伝学において、「センス」鎖は、5'から3'へ伸びる二本鎖のDNA内のセグメントであって、3'から5'へ伸びるDNAのアンチセンス鎖または鋳型鎖に相補的である。タンパク質をコードするDNAセグメントのケースにおいて、センス鎖は、転写の最中にその鋳型としてアンチセンス鎖を取り結局(典型的には、常にではない)翻訳を経てタンパク質になるmRNAと同じ配列を有するDNAの鎖である。よって、アンチセンス鎖は、後にタンパク質へ翻訳されるRNAを担い、一方センス鎖は、mRNAとほぼ同一の組成(makeup)を保有する。dsDNAの各セグメントについて、一方がどの方向から読まれるかに応じて、おそらく(センスおよびアンチセンスは視点に相対するから)センスおよびアンチセンスが2組存在するであろう点に留意する。遺伝子産物またはmRNAは結局、dsDNAの一方のセグメントのどちらかの鎖がセンスまたはアンチセンスと称されることを示す。
PEgRNAの文脈において、第1ステップは、5'→3'方向に配向される単鎖相補DNA(すなわち、組み込まれることになる3'ssDNAフラップ)の合成であるが、前記合成鎖はPEgRNA伸長アームの鋳型から外れる。3'ssDNAフラップがセンス鎖と見なされるべきかまたはアンチセンス鎖と見なされるべきかについては、DNAの両鎖が転写のための鋳型として働き得る(が同時ではない)ことが十分に許容されているところ、転写の方向に依存する。よって、いくつかの態様において、3'ssDNAフラップ(全体的に5'→3'方向に伸びる)は、コード鎖であることから、センス鎖として働くであろう。他の態様において、3'ssDNAフラップ(全体的に5'→3'方向に伸びる)はアンチセンス鎖として働き、よって転写の鋳型であろう。
第2鎖へのニック入れ(nicking)
本明細書に使用されるとき、この概念は、第1ニック(すなわち、ガイドRNAの伸長された部分上の逆転写酵素のプライミングにおける使用のための遊離3'末を提供する、最初のニック部位)の下流の場所での第2ニックの導入を指す。いくつかの態様において、第1ニックおよび第2ニックは、反対鎖上にある。他の態様において、第1ニックおよび第2ニックは、反対鎖上にある。もう1つの態様において、第1ニックは、非標的鎖(すなわち、Rループの単鎖部分を形成する鎖)上にあり、第2ニックは、標的鎖上にある。第2ニックは、第1ニックの少なくとも5ヌクレオチド下流に、または第1ニックの少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30ヌクレオチド以上下流に位置付けられている。理論に拘泥されないが、第2ニックは、未編集鎖を置き換える細胞の内生DNA修復および複製プロセスを誘導する。いくつかの態様において、編集済鎖は非標的鎖であり、未編集鎖は標的鎖である。他の態様において、編集済鎖は標的鎖であり、未編集鎖は非標的鎖である。
スペーサー配列
本明細書に使用されるとき、ガイドRNAまたはPEgRNAと関係のある用語「スペーサー配列」は、標的DNA配列中のプロトスペーサー配列に相補的なヌクレオチド配列を含有する、約10～約40(例として、約10、約15、約20、約25、約30)ヌクレオチドのガイドRNAまたはPEgRNAの部分を指す。スペーサー配列はプロトスペーサー配列とアニールすることで、標的部位にてssRNA/ssDNAハイブリッド構造が、およびプロトスペーサー配列に相補的な内生DNA鎖の対応するRループssDNA構造が形成される。
対象
用語「対象」は、本明細書に使用されるとき、個々の生物、例えば、個々の哺乳動物を指す。いくつかの態様において、対象は、ヒトである。いくつかの態様において、対象は、非ヒト哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は、霊長目の非ヒト動物である。いくつかの態様において、対象は、齧歯類の動物である。いくつかの態様において、対象は、ヒツジ、ヤギ、畜牛、ネコ、またはイヌである。いくつかの態様において、対象は、脊椎動物、両生類、爬虫類、魚類、昆虫、飛ぶ昆虫(fly)、または線虫である。いくつかの態様において、対象は、研究動物である。いくつかの態様において、対象は、遺伝子学的に改変されており、例として、遺伝子学的に改変された非ヒト対象である。対象は、いずれの性であってもよく、いずれの発生段階にあってもよい。
標的部位
用語「標的部位」は、本明細書に開示のプライム編集因子によって編集される核酸分子内の配列を指す。標的部位はさらに、塩基編集因子とgRNAとの複合体が結合する核酸分子内の配列を指す。
一時的な第2鎖へのニック入れ
本明細書に使用されるとき、用語「一時的な第2鎖へのニック入れ」は、未編集鎖中の第2ニックの組み入れが、所望の編集が編集済鎖に組み入れられた後でしか生じない、第2鎖へのニック入れのバリアントを指す。これによって、二本鎖DNA切断へ繋がり得る両鎖上の同時ニックが回避される。第2鎖にニックを入れるガイドRNAは、第2鎖ニックが所望の編集の組み入れ後まで導入されないように、一時的制御のためにデザインされている。これは、編集済鎖のみにマッチするが元のアレルにはマッチしないスペーサー配列をもつgRNAをデザインすることによって達成される。このストラテジーを使用すると、プロトスペーサーと未編集アレルとの間のミスマッチによって、PAM鎖上の編集事象が起きた後まで、sgRNAによるニック入れが疎まれるはずである。
tPERT
「transプライム編集因子RNA鋳型(tPERT)」についての定義を参照。
一時的な第2鎖へのニック入れ
本明細書に使用されるとき、用語「一時的な第2鎖へのニック入れ」は、未編集鎖中の第2ニックの組み入れが、所望の編集が編集済鎖に組み入れられた後でしか生じない、第2鎖へのニック入れのバリアントを指す。これによって、二本鎖DNA切断へ繋がり得る両鎖上の同時ニックが回避される。第2鎖にニックを入れるガイドRNAは、第2鎖ニックが所望の編集の組み入れ後まで導入されないように、一時的制御のためにデザインされている。これは、編集済鎖のみにマッチするが元のアレルにはマッチしないスペーサー配列をもつgRNAをデザインすることによって達成される。このストラテジーを使用すると、プロトスペーサーと未編集アレルとの間のミスマッチによって、PAM鎖上の編集事象が起きた後まで、sgRNAによるニック入れが疎まれるはずである。
Transプライム編集
本明細書に使用されるとき、用語「transプライム編集」は、分裂PEgRNAを利用するプライム編集の修飾形態を指すが、すなわち、ここでPEgRNAは、2つ別々の分子:sgRNAおよびtransプライム編集RNA鋳型(tPERT)に分離される。sgRNAが、所望のゲノムの標的部位へ、プライム編集因子を標的化させる(またはより一般に、プライム編集因子のnapDNAbp構成要素を標的化させる)よう働く一方で、一旦tPERTが、プライム編集因子上およびtPERT上に位置付けられた結合ドメインの相互作用によって、プライム編集因子へtransに動員されると、tPERTはポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)によって使用されて新しいDNA配列を標的遺伝子座中へ書き込む。一態様において、結合ドメインは、tPERT上に位置付けられたMS2アプタマーおよびプライム編集因子と融合したMS2cpタンパク質などの、RNA-タンパク質動員部分を包含し得る。transプライム編集の利点は、DNA合成鋳型をガイドRNAから分離させることによって、潜在的により長い長さの鋳型を使用できる点である。
transプライム編集の態様は図3Gおよび3Hに示される。図3Gは左に、transプライム編集因子複合体の組成物(「RP-PE:gRNA複合体」)を示すが、これは、ポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)およびrPERT動員タンパク質(例として、MS2sc)の各々と融合したnapDNAbpを含み、ガイドRNAと複合体化されている。図3Gはさらに、DNA合成鋳型およびプライマー結合配列を包含するPEgRNAの伸長アーム特色を含む、別々のtPERT分子を示す。tPERT分子はまた、RNA-タンパク質動員ドメイン(これは、このケースにおいて、ステムループ構造であり、例えば、MS2アプタマーであり得る)も包含する。図3Hに記載のプロセスに描かれるとおり、RP-PE:gRNA複合体は、標的DNA配列へ結合してニックを入れる。次いで、動員タンパク質(RP)は、tPERTを動員して、DNA標的部位へ結合したプライム編集因子複合体へ共局在化させ、それによってプライマー結合部位が、ニックが入った鎖上のプライマー配列へ結合できるようになり、続いて、ポリメラーゼ(例として、RT)が、DNA合成鋳型に対し、tPERTの5'に至るまでDNAの単鎖を合成できるようになる。
tPERTは、RNA-タンパク質動員ドメインの5'末上にPBSおよびDNA合成鋳型を含むように、図3Gおよび図3Hに示されているが、他の立体配置のtPERTも、RNA-タンパク質動員ドメインの3'末上に位置付けられるPBSおよびDNA合成鋳型をもつようデザインされてもよい。しかしながら、5'伸長をもつtPERTは、DNAの単鎖の合成がtPERTの5'末にて自然と終始するであろうという利点を有し、よって、プライム編集のDNA合成段階の最中に、RNA-タンパク質動員ドメインのいずれの部分も鋳型として使用するリスクがない。
Transプライム編集因子RNA鋳型(tPERT)
本明細書に使用されるとき、「transプライム編集因子RNA鋳型(tPERT)」は、transプライム編集に使用される構成要素を指す、プライム編集の修飾バージョンは、PEgRNAを2つの別個の分子:ガイドRNAおよびtPERT分子に分離することによって作動する。tPERT分子は、標的DNA部位にてプライム編集因子複合体と共局在化させて、プライマー結合部位およびDNA合成鋳型をプライム編集因子へtransで連れていくようプログラムされている。例えば、(1)RP-PE:gRNA複合体および(2)プライマー結合部位とRNA-タンパク質動員ドメインへ結び合わされたDNA合成鋳型とを包含するtPERTを含む2構成要素系を示すtransプライム編集因子(tPE)の態様については、図3Gを参照。ここでRP-PE:gRNA複合体のRP(動員タンパク質)構成要素は、tPERTを、編集されるべき標的部位へ動員させ、それによってPBSおよびDNA合成鋳型がプライム編集因子にtransで結び付けられる。別の言い方をすれば、tPERTは、PEgRNAの伸長アーム(の全部または一部)を含有するよう改変されており、これは、プライマー結合部位およびDNA合成鋳型を包含する。
トランジション
本明細書に使用されるとき、「トランジション」は、プリン核酸塩基(A⇔G)の相互変換(interchange)またはピリミジン核酸塩基(C⇔T)の相互変換を指す。このクラスの相互変換は、同様の形状の核酸塩基を伴う。本明細書に開示の組成物および方法は、標的DNA分子において1以上のトランジションを誘導することが可能である。本明細書に開示の組成物および方法はまた、同じ標的DNA分子においてトランジションとトランスバージョンとの両方を誘導することも可能である。これらの変化は、A⇔G、G⇔A、C⇔T、またはT⇔Cを伴う。ワトソン・クリック対の核酸塩基をもつ二本鎖DNAの文脈において、トランスバージョンは、以下の塩基対交換：A:T⇔G:C、G:G⇔A:T、C:G⇔T:A、またはT:A⇔C:Gを指す。本明細書に開示の組成物および方法は、標的DNA分子において1以上のトランジションを誘導することが可能である。本明細書に開示の組成物および方法はまた、同じ標的DNA分子においてトランジションとトランスバージョンとの両方、ならびに欠失および挿入を包含する他のヌクレオチド変化を誘導することも可能である。
トランスバージョン
本明細書に使用されるとき、「トランスバージョン」は、プリン核酸塩基のピリミジン核酸塩基への相互変換、またはその逆を指し、よって、形状が似ていない核酸塩基の相互変換を伴う。これらの変化は、T⇔A、T⇔G、C⇔G、C⇔A、A⇔T、A⇔C、G⇔C、およびG⇔Tを伴う。Watson-Crick対の核酸塩基をもつ二本鎖DNAの文脈において、トランスバージョンは、以下の塩基対交換：T:A⇔A:T、T:A⇔G:C、C:G⇔G:C、C:G⇔A:T、A:T⇔T:A、A:T⇔C:G、G:C⇔C:G、およびG:C⇔T:Aを指す。本明細書に開示の組成物および方法は、標的DNA分子において1以上のトランスバージョンを誘導することが可能である。本明細書に開示の組成物および方法はまた、同じ標的DNA分子においてトランジションとトランスバージョンとの両方、ならびに欠失および挿入を包含する他のヌクレオチド変化を誘導することも可能である。
処置
用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」は、本明細書に記載のとおりの疾患もしくは障害、または1以上のその症状の発病を、食い止め、緩和し、遅延させるか、あるいはその進行を阻害することを目的とした臨床的介入を指す。本明細書に使用されるとき、用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」は、本明細書に記載のとおりの疾患もしくは障害、または1以上のその症状の発病を、食い止め、緩和し、遅延させるか、あるいはその進行を阻害することを目的とした臨床的介入を指す。いくつかの態様において、処置は、1以上の症状が発症した後、および/または疾患と診断された後、施されてもよい。他の態様において、処置は、症状がない中、例として、症状の発病を予防もしくは遅延させるか、または疾患の発病もしくは進行を阻害するために、施されてもよい。例えば、処置は、症状の発現に先立ち(例として、症状の経歴に照らして、および/または遺伝因子もしくは他の感受性因子に照らして)、感受性のある個体へ施されてもよい。処置はまた、症状が消散した後も、例えば、それらの再発を予防または遅延するため、続けられてもよい。
トリヌクレオチド反復(repeat)障害
本明細書に使用されるとき、「トリヌクレオチド反復障害」(または代替的に、「拡大反復障害」もしくは「反復拡大障害」)は、ある種の突然変異(あるトリヌクレオチド反復が、ある遺伝子またはイントロンにある)である「トリヌクレオチド反復拡大」によって引き起こされる、一連の遺伝性障害を指す。トリヌクレオチド反復はかつて、ゲノム中のありふれた反復(iterations)であると考えられていたが、1990年代にこれらの障害に分類された。これらDNAの一見した「良性の」伸展(stretches)はときに、拡大して疾患を引き起こし得る。数種の決定的な特色が、トリヌクレオチド反復拡大によって引き起こされた障害に共通する。第1に、突然変異反復は、体細胞と生殖細胞系列との両方に不安定さを示し、より頻繁にはこれらは代々の遺伝(successive transmissions)で縮小するよりむしろ拡大する。第2に、低年齢の発病およびこれに続く世代における表現型の増大した重症度(予想)は一般に、より大きな反復の長さと相関する。最後に、疾患アレルの親の起源はしばしば、父系の遺伝がこれら障害の多くにとって拡大のより大きなリスクを抱えるという予想に影響を及ぼし得る。
トリプレット拡大は、DNA複製最中のずれ(slippage)によって引き起こされるものと考えられる。これらの領域におけるDNA配列の反復性に起因して、「ループアウト」構造は、合成されている親鎖と娘鎖との間の相補的な塩基対合を維持しながら、DNA複製最中に形成されることもある。ループアウト構造が娘鎖上の配列から形成された場合、これは反復数の増大をもたらすであろう。しかしながら、ループアウト構造が親鎖上に形成された場合、反復数の減少が生じる。これらの反復の拡大は低減より一般的であるようである。一般に拡大がより大きくなればなるほど、これらは、より疾患を引き起こしやすくなるか、またはより疾患の重症度を増大しやすくなる。この特性は、トリヌクレオチド反復障害に見られる予想の特徴をもたらす。予想は、これら反復の拡大に起因する罹患した家族の代々の世代を通して、発病の年齢が低くなる傾向、および症状の重症度が増す傾向を説明する。
ヌクレオチド反復障害は、トリプレット反復が非コード領域において生じる障害(すなわち、非コードトリヌクレオチド反復障害)またはコード領域において生じる障害を包含していてもよい。
本明細書に記載のプライム編集因子(PE)系は、数ある中でも、脆弱X症候群(FRAXA)、脆弱性XE MR(FRAXE)、フリードライヒ運動失調症(FRDA)、筋強直症ジストロフィー(DM)、8型脊髄小脳失調症(SCA8)、および12型脊髄小脳失調症(SCA12)を包含していてもよい、ヌクレオチド反復障害を処置するのに使用されてもよい。
プライム編集または「プライム編集(PE)」
本明細書に使用されるとき、用語「プライム編集」または「プライム編集(PE)」は、本出願に記載のとおりのnapDNAbpsおよび特化されたガイドRNAを使用する遺伝子編集のための新規アプローチを指し、図1A～1Jの態様に例示されている。標的DNA分子が、一態様において、逆転写酵素(または別のポリメラーゼ)によってDNAの鎖の合成をプライムするのに使用されるところ、TPRTは「標的にプライムされた逆転写」を指す。様々な態様において、プライム編集は、標的DNA分子(導入されるべきヌクレオチド配列の変化が所望されるものである)を、プライム編集因子ガイドRNAと複合体化された核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)に接触させることによって作動する。図1Eを参照すると、プライム編集因子ガイドRNAは、ガイドRNAの3'末もしくは5'末にて、またはガイドRNA中の分子内のある場所にて伸長を含み、所望のヌクレオチド変化(例として、単一ヌクレオチドの変化、挿入、または欠失)をコードする。ステップ(a)において、napDNAbp/伸長されたgRNA複合体はDNA分子に接触し、伸長されたgRNAは標的遺伝子座へ結合するようにnapDNAbpをガイドする。ステップ(b)において、標的遺伝子座のDNAの鎖の一方へニックが導入され(例として、ヌクレアーゼまたは化学剤によって)、これによって標的遺伝子座の鎖の一方に利用可能な3'末が創出される。いくつかの態様において、ニックは、Rループ鎖、すなわちガイドRNA配列とはハイブリダイズされない鎖、すなわち「非標的鎖」に対応するDNAの鎖中に創出される。しかしながら、ニックは、いずれの鎖にも導入され得ない。つまり、ニックは、「標的鎖」(すなわち、伸長されたgRNAのスペーサーとハイブリダイズされる鎖)または「非標的鎖」(すなわち、Rループの単鎖部分を形成する鎖であって、標的鎖に相補的である)中へ導入され得る。ステップ(c)において、DNA鎖の3'末(ニックによって形成される)は、逆転写をプライムする(すなわち、「標的にプライムされたRT」)ためにガイドRNAの伸長された部分と相互作用する。いくつかの態様において、3'末DNA鎖は、ガイドRNAの伸長された部分、すなわち、「逆転写酵素プライミング配列」上の特定のプライマー結合部位とハイブリダイズする。ステップ(d)において、逆転写酵素が導入されて、プライムされた部位の3'末から、プライム編集因子ガイドRNAの3'末へDNAの単鎖を合成する。これは、所望のヌクレオチド変化(例として、単一塩基の変化、挿入、もしくは欠失、またはそれらの組み合わせ)を含む(これを含まなければ、ニック部位での内生DNA、またはニック部位に隣接する内生DNAに相同である)単鎖DNAフラップを形成する。ステップ(e)において、napDNAbpおよびガイドRNAは放出される。ステップ(f)および(g)は、所望のヌクレオチド変化が標的遺伝子座中へ組み込まれるように、単鎖DNAフラップの解体に関する。このプロセスは、一旦3'単鎖DNAフラップが侵入して内生DNA配列とハイブリダイズすると、形成された対応の5'内生DNAフラップを除去することによって、所望の産物形成が推進され得る。理論に拘泥されないが、細胞の内生DNA修復および複製プロセスは、ミスマッチしたDNAを分解することでヌクレオチド変化(単数または複数)を組み込み、変更された所望の産物が形成される。プロセスはまた、図1Dに例示されるとおり「第2鎖へのニック入れ」産物の形成も推進され得る。このプロセスは、以下の遺伝子変化:トランスバージョン、トランジション、欠失、および挿入のうち、少なくとも1つまたはそれ以上を導入してもよい。
用語「プライム編集因子(PE)系」または「プライム編集因子」または「PE系」または「PE編集系」は、これらに限定されないが、napDNAbp、逆転写酵素、融合タンパク質(例として、napDNAbpsと逆転写酵素とを含む)、プライム編集因子ガイドRNA、および融合タンパク質とプライム編集因子ガイドRNAとを含む複合体、ならびにプライム編集プロセスを編集済産物形成へ推進するのに役立つ付属要素(accessory elements)(第2鎖へニックを入れる構成要素および5'内生DNAフラップ除去エンドヌクレアーゼなど)を包含する、本明細書に記載の標的にプライムされた逆転写(TPRT)を使用するゲノム編集の方法に関与する組成物を指す。
上流
本明細書に使用されるとき、用語「上流」および「下流」は、5'→3'方向に配向された核酸分子(単鎖または二本鎖であるかに関わらず)中に位置付けられた少なくとも2つの要素の線状の位置を定義する相対的な用語である。とりわけ、第1要素が第2要素に対して5'のどこかに位置付けられている場合、第1要素は、核酸分子中、第2要素の上流にある。例えば、SNPがニック部位の5'側にある場合、SNPは、Cas9に誘導されたニック部位の上流にある。逆に言うと、第1要素が第2要素に対して3'のどこかに位置付けられている場合、第1要素は、核酸分子中、第2要素の下流にある。例えば、SNPがニック部位の3'側にある場合、SNPは、Cas9に誘導されたニック部位の下流にある。核酸分子は、DNA(二本鎖もしくは単鎖)、RNA(二本鎖もしくは単鎖)、またはDNAとRNAとのハイブリッドであり得る。二本鎖分子のどちらの鎖を考慮するのか選択する必要がある場合を除き、上流および下流という用語が核酸分子の単鎖にのみ言及するところ、分析は単鎖核酸分子および二本鎖分子について同じであるしばしば、少なくとも2つの要素の相対的な位置を決定するのに使用され得る二本鎖のDNAの鎖は、「センス」鎖または「コード」鎖である。遺伝学において、「センス」鎖は、5'から3'へ伸びる二本鎖DNA内セグメントであって、3'から5'へ伸びるDNAのアンチセンス鎖または鋳型鎖に相補的である。よって、例として、SNP核酸塩基がセンス鎖またはコード鎖上のプロモーターの3'側にある場合、SNP核酸塩基はゲノムDNA(二本鎖である)中のプロモーター配列の「下流」にある。
バリアント
本明細書に使用されるとき、用語「バリアント」は、天然に存在するものから逸脱したパターンを有する属性(qualities)を呈するものを意味するとして解釈されるはずであり、例として、バリアントCas9は、野生型Cas9アミノ酸配列と比較してアミノ酸残基中に1以上の変化を含むCas9である。用語「バリアント」は、参照配列と少なくとも75％、または少なくとも80％、または少なくとも85％、または少なくとも90％、または少なくとも95％、または少なくとも99％のパーセント同一性を有し、参照配列と同じかまたは実質的に同じ機能活性(単数もしくは複数)を有する、相同のタンパク質を包括する(encompasses)。用語はまた、参照配列の突然変異体、トランケーション体(truncations)、またはドメインであって、参照配列と同じかまたは実質的に同じ機能活性(単数もしくは複数)を呈示するものも包括する。
ベクター
用語「ベクター」は、本明細書に使用されるとき、着目する遺伝子をコードするよう修飾され得る核酸であって、宿主細胞中へ入って宿主細胞内で突然変異または複製する(次いでベクターの複製形態を別の宿主細胞中へ移す)ことができる核酸を指す。例示の好適なベクターは、レトロウイルスベクターまたはバクテリオファージおよび繊維状ファージ、および接合性プラスミドなどの、ウイルスベクターを包含する。追加の好適なベクターは、本開示に基づき当業者に明らかであろう。
野生型
本明細書に使用されるとき、用語「野生型」は、当業者によって理解される専門用語であって、突然変異体もしくはバリアントの形態とは区別されるような、天然に存在するとおりの生物、株、遺伝子、または特徴の典型的な形態を意味する。
5'内生DNAフラップ除去
本明細書に使用されるとき、用語「5'内生DNAフラップ除去」または「5'フラップ除去」は、RTによって合成された単鎖DNAフラップが競合的に侵入して内生DNAとハイブリダイズしたときに形成される5'内生DNAフラップの除去を指し、そのプロセスにおいて内生鎖に取って代わる。取って代わられたこの内生鎖を除去することは、所望のヌクレオチド変化を含む所望の産物を形成する反応を推進し得る。細胞自身のDNA修復酵素は、5'内生フラップの除去または切除を触媒してもよい(例として、EXO1またはFEN1などの、フラップエンドヌクレアーゼ)。また、宿主細胞も、該5'内生フラップの除去を触媒する1以上の酵素を発現するよう形質転換されていてもよく、これによって産物を形成するプロセスが推進される(例として、フラップエンドヌクレアーゼ)。フラップエンドヌクレアーゼは当該技術分野において知られており、Patel et al.,"Flap endonucleases pass 5'-flaps through a flexible arch using a disorder-thread-order mechanism to confer specificity for free 5'-ends,"Nucleic Acids Research,2012,40(10):4507-4519およびTsutakawa et al.,"Human flap endonuclease structures,DNA double-base flipping,and a unified understanding of the FEN1 superfamily,"Cell,2011,145(2):198-211(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)に記載のものから見出され得る。
5'内生DNAフラップ
本明細書に使用されるとき、用語「5'内生DNAフラップ」は、標的DNA中、PEに誘導されたニック部位のすぐ下流に位置したDNAの鎖を指す。PEによる標的DNA鎖のニック入れによって、ニック部位の上流側に3'ヒドロキシル基が、ニック部位の下流側に5'ヒドロキシル基が晒される。3'ヒドロキシル基で終わる内生鎖は、プライム編集因子のDNAポリメラーゼ(例として、ここでDNAポリメラーゼは、逆転写酵素)をプライムするのに使用される。ニック部位の下流側にあり、晒された5'ヒドロキシル基から始まる内生鎖は、「5'内生DNAフラップ」と称されるが、結局は除去されて、PEgRNAの伸長によってコードされる、新しく合成された置き換え鎖(すなわち、「3'置き換えDNAフラップ」)によって置き換えられている。
3'置き換えDNAフラップ
本明細書に使用されるとき、用語「3'置き換えDNAフラップ」、または単に「置き換えDNAフラップ」は、プライム編集因子によって合成され、プライム編集因子PEgRNAの伸長アームによってコードされるDNAの鎖を指す。より具体的には、3'置き換えDNAフラップは、PEgRNAのポリメラーゼ鋳型によってコードされる。3'置き換えDNAフラップは、編集済配列(例として、単一ヌクレオチドの変化)も含有することを除くと、5'内生DNAフラップと同じ配列を含む。3'置き換えDNAフラップは標的DNAとアニールして、5'内生DNAフラップ(これは、例えば、FEN1もしくはEXO1などの5'フラップエンドヌクレアーゼによって、切除され得る)に取って代わるかまたはこれを置き換え、次いで、3'置き換えDNAフラップの3'末を、内生DNAの晒された(5'内生DNAフラップの切除後に晒される)5'ヒドロキシル末と結び合わせるようにライゲートされ、これによってホスホジエステル結合が再形成されて3'置き換えDNAフラップが組み入れられ、1編集済鎖と1未編集鎖とを含有するヘテロ二重鎖DNAが形成される。DNA修復プロセスはヘテロ二重鎖を分解し、編集済鎖の情報を相補鎖へコピーすることによってDNA中へ編集が永続的に組み入れられる。この分解プロセスは、完了まで(to completion)、未編集鎖へニックを入れることによって、すなわち、本明細書に記載のとおりの「第2鎖へのニック入れ」を経由して、さらに推進され得る。
ある態様の詳細な記載
本発明は、本明細書に記載の特化されたアルゴリズムを使用してデザインされたPEgRNAを使用して、治療標的(例として、クリンバーデータベースに同定されたそれら標的)を修復する、新しい組成物(例として、新しいPEgRNAおよび同PEgRNAを含むPE複合体)およびプライム編集(PE)を使用するための方法を開示した。よって、本出願は、治療標的(例として、クリンバーデータベースに包含されるもの)を修復するのに使用されてもよいPEgRNAのための配列を大規模に予測するためのアルゴリズムを開示する。加えて、本出願は、開示されたアルゴリズムを使用してデザインされた治療的PEgRNA(治療標的を修復するプライム編集とともに使用されてもよい)のための予測配列も開示する。
本明細書に開示されたアルゴリズムおよび予測PEgRNA配列は一般に、プライム編集に関する。よって、本開示はまた、本明細書に開示の治療的PEgRNAとともに使用されてもよい、好適なnapDNAbp(例として、Cas9ニッカーゼ)および逆転写酵素、ならびに他の好適な構成要素(例として、リンカー、NLS)およびPE融合タンパク質を包含する、プライム編集の様々な構成要素および側面のための記載も提供する。
ゲノム編集のための、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)系の採用は、生命科学に革命をもたらした1～3。CRISPRを使用する遺伝子の断絶は今やルーチンとなっているが、単一ヌクレオチドの編集の正確な組み入れは、疾患が原因の多数の突然変異を研究または修正するのに必要であるにも関わらず、大きな課題のままである。相同組み換え修復(HDR)は、かかる編集を達成させることは可能ではあるが、低い効率(しばしば＜5％)、ドナーDNA修復鋳型のための要件、および二本鎖DNA破壊(DSB)形成の有害効果に悩まされている。近年、David Liu教授らの実験室が塩基編集を開発したが、これによってDSBのない効率的な単一ヌクレオチドの編集が達成される。塩基編集因子(BE)は、CRISPR系を塩基修飾デアミナーゼ酵素と組み合わせて、標的C・GまたはA・T塩基対を夫々A・TまたはG・Cへ変換する4～6。既に幅広く研究者らによって世界的に使用されているが、現BEは12塩基対の起こり得る変換のうちたった4つしかできず、小さい挿入または欠失を修正することはできない。その上、塩基編集の標的範囲は、標的塩基に隣接する非標的CまたはA塩基の編集(「バイスタンダー(bystander)編集」)によって、およびPAM配列が標的塩基から15±2bpに存在するという要件によって限定されている。したがって、これらの欠点を克服することは、ゲノム編集の基礎研究および治療用途を大幅に広げるであろう。
本開示は、塩基編集の利益の多く－つまり、二本鎖破壊の回避およびドナーDNA修復鋳型－を、その大きな欠点を克服しつつ与える、新しい高精度編集アプローチを提案する。本明細書に記載の提案アプローチは、標的にプライムされた逆転写(TPRT)を使用する標的ゲノムの部位での編集済DNA鎖の直接的な組み入れを達成する。本明細書に考察されるデザインにおいて、CRISPRガイドRNA(gRNA)は、所望のヌクレオチド変化を含む単鎖DNAをコードする逆転写酵素(RT)鋳型配列を持つよう改変されるであろう。CRISPRヌクレアーゼ(Cas9)によってニックが入れられた標的部位DNAは、修飾gRNA上の鋳型配列の逆転写のためのプライマーとして働き、いずれの所望のヌクレオチド編集の直接的な組み込みを可能にするであろう。
結果的に、本発明は、標的にプライムされた逆転写(TPRT)または「プライム編集」の機序が、効率および遺伝子の融通性(genetic flexibility)が高い高精度CRISPR/Casベースのゲノム編集を(例として、図1A～1Gの様々な態様において描かれているとおり)行うために活用または採用され得るという発見に、一部関する。本発明者らは本明細書中、特定のDNA配列を修飾ガイドRNA(「伸長されたガイドRNA」またはPEgRNA)で標的にし、標的部位にて単鎖ニックを生成し、およびPEgRNAの構成要素であるDNA合成鋳型に基づくポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)によるDNAの合成のためのプライマーとして、ニック入りDNAを使用する、napDNAbp-ポリメラーゼ融合体(例として、逆転写酵素と融合したCas9ニッカーゼ)を使用することを提案している。新しく合成された鎖は、所望のヌクレオチド変化(例として、単一ヌクレオチドの変化、欠失、もしくは挿入、またはそれらの組み合わせ)を包含することを除けば、ゲノムの標的配列と相同であろう。新しく合成されたDNAの鎖はまた、単鎖DNAフラップと称されることもあるが、これはハイブリダイゼーションを相補的な相同の内生DNA鎖と競合し、これによって対応する内生鎖に取って代わる。ハイブリダイズされたこの中間体の分解は、その結果得られる内生DNAの、取って代わられたフラップの(例として、5'末DNAフラップエンドヌクレアーゼ、FEN1での)除去、合成された単鎖DNAフラップの標的DNAへのライゲーション、ならびに細胞のDNA修復および/または複製プロセスの結果としての所望のヌクレオチド変化の同化を包含し得る。鋳型化(templated)DNA合成が単一ヌクレオチドという高精度を付与することから、このアプローチの幅は極めて広く、基礎科学および治療法における無数の用途に使用され得ることが予見できる。
I．治療的PEgRNA
本明細書に記載のプライム編集因子(PE)系は、いずれの好適なプライム編集因子ガイドRNAまたはPEgRNAの使用も企図する。本発明者らは、ポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)によって所望のヌクレオチド変化をコードするDNA合成鋳型を含む特別に構成されたガイドRNAの使用を通して、標的にプライムされた逆転写(TPRT)の機序が、高精度および多目的CRISPR/Casベースのゲノム編集を行うために活用または採用され得ることを発見した。本出願は、DNA合成鋳型が標準のまたは既存のガイドRNA分子の伸長として提供され得るから、特別に構成されたこのガイドRNAを「プライム編集因子ガイドRNA」(またはPEgRNA)として言及する。本出願は、プライム編集因子ガイドRNAのための、いずれの好適な立体配置または配置も企図する。
様々な態様において、本開示は、クリンバーデータベースエントリーに対し本明細書に開示されたアルゴリズムを使用してデザインされた配列番号1～135514および813085～880462の治療的PEgRNAを提供する。
様々な他の態様において、本明細書に開示されたアルゴリズムを使用しクリンバーデータベースに対してデザインされた例示のPEgRNAは、本明細書の一部を形成する配列表に包含される。配列表は、配列番号1～135514および813085～880462の完全なPEgRNA配列を包含する。これらの完全なPEgRNAの各々は、スペーサー(配列番号135515～271028および880463～947840)および伸長アーム(配列番号271029～406542および947841～1015218)から各々構成される。加えて、各PEgRNAは、例えば、配列番号1361579～1361580によって定義されるとおりの、gRNAコアも含む。配列番号271029～406542および947841～1015218の伸長アームはさらに、プライマー結合部位(配列番号406543～542056および1015219～1082596)、編集鋳型(配列番号542057～677570および1082597～1149974)、ならびに相同アーム(配列番号677571～813084および1149975～1217352)から各々構成される。PEgRNAは任意に、5'末修飾領域および/または3'末修飾領域を含んでいてもよい。PEgRNAはまた、PEgRNAの3'にて逆転写終止シグナル(例として、配列番号1361560～1361566)も含んでいてもよい。本出願は、これらの配列のすべてのデザインおよび使用を網羅する。
図3Aは、本明細書に開示のプライム編集因子(PE)系に使用可能なプライム編集因子ガイドRNA(「PEgRNA」または「伸長されたgRNA」のいずれかと称される)の一態様を示すが、既存のガイドRNA(緑色部分)は、スペーサーとgRNAコア領域とを包含し、napDNAbpとともに結合する。この態様において、ガイドRNAは、5'末にて伸長されたRNAセグメント、すなわち、5'伸長を包含する。この態様において、5'伸長は、DNA合成鋳型、プライマー結合部位、および任意の5～20ヌクレオチドリンカー配列を包含する。図1Aに示されるとおり、プライマー結合部位の、ニックの後に形成される遊離3'末とのハイブリッドは、Rループの非標的鎖に形成され、これによって5'→3'方向におけるDNA重合のためにポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)がプライムされる。
図3Bは、本明細書に開示のプライム編集因子(PE)系に使用可能なプライム編集因子ガイドRNAの別の態様を示すが、既存のガイドRNA(緑色部分)は、～20ntスペーサーとgRNAコアとを包含し、napDNAbpとともに結合する。この態様において、ガイドRNAは、3'末にて伸長されたRNAセグメント、すなわち、3'伸長を包含する。この態様において、3'伸長は、DNA合成鋳型およびプライマー結合部位を包含する。図1Bに示されるとおり、プライマー結合部位の、ニックの後に形成される遊離3'末とのハイブリッドは、Rループの非標的鎖に形成され、これによって5'→3'方向におけるDNA重合のためにポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)がプライムされる。
図3Cは、本明細書に開示のプライム編集因子(PE)系に使用可能な、伸長されたガイドRNAの別の態様を示すが、既存のガイドRNA(緑色部分)は、～20ntスペーサーとgRNAコアとを包含し、napDNAbpとともに結合する。この態様において、ガイドRNAは、gRNAコア内の分子間のある位置にて伸長されたRNAセグメント、すなわち、分子内伸長を包含する。この態様において、分子内伸長は、DNA合成鋳型およびプライマー結合部位を包含する。プライマー結合部位はニックの後に形成される遊離3'末とハイブリダイズし、Rループの非標的鎖に形成され、これによって5'-3'方向におけるDNA重合のためにポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)がプライムされる。
一態様において、分子内RNA伸長の位置は、ガイドRNAのスペーサー中にある。別の態様において、分子内RNA伸長の位置は、gRNAコア中にある。また別の態様において、分子内RNA伸長の位置は、スペーサー内を除きガイドRNA分子内のどこにでも、またはスペーサーを妨害しない位置にある。
一態様において、分子内RNA伸長は、スペーサーの3'末から下流に挿入される。別の態様において、分子内RNA伸長は、スペーサーの3'末の、少なくとも1ヌクレオチド、少なくとも2ヌクレオチド、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド下流に挿入される。
他の態様において、分子内RNA伸長はgRNA中へ挿入され、これは、tracrRNAに対応するかまたはtracrRNAを含むガイドRNAの部分を指し、これはCas9タンパク質またはその等価物(すなわち、異なるnapDNAbp)に結合するかおよび/またはこれと相互作用する。好ましくは、分子内RNA伸長の挿入は、tracrRNA部分とnapDNAbpとの相互作用を妨害しないか、または妨害しても最小限である。
RNA伸長の長さは、いずれの有用な長さでもあり得る。様々な態様において、RNA伸長は、長さが少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも60ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも80ヌクレオチド、少なくとも90ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、または少なくとも500ヌクレオチドである。
DNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)はまた、いずれの好適な長さでもあり得る。例えば、DNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)は、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも60ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも80ヌクレオチド、少なくとも90ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、または少なくとも500ヌクレオチドであり得る。
更なる他の態様において、逆転写プライマー結合部位配列は、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも60ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも80ヌクレオチド、少なくとも90ヌクレオチド、または少なくとも100ヌクレオチドヌクレオチドである。
他の態様において、任意のリンカーまたはスペーサーは、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも60ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも80ヌクレオチド、少なくとも90ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、または少なくとも400ヌクレオチドである。
DNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)は、いくつかの態様において、単鎖DNA分子をコードするが、これは、非標的鎖と相同である(よって、標的鎖の対応する部位に相補的である)が1以上のヌクレオチド変化を包含する。ヌクレオチド変化は、1以上の単一塩基ヌクレオチド変化、1以上の欠失、1以上の挿入、およびそれらの組み合わせを包含していてもよい。
図1Eに描かれるとおり、DNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)の合成された単鎖DNA産物は、非標的鎖と相同であって、1以上のヌクレオチド変化を含有する。DNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)の単鎖DNA産物は、平衡状態で、相補的な標的鎖配列とハイブリダイズし、これによって相同の内生標的鎖配列に取って代わる。取って代わられた内生鎖は、いくつかの態様において、5'内生DNAフラップ種として言及されてもよい(例として、図1Cを参照)。この5'内生DNAフラップ種は、5'フラップエンドヌクレアーゼ(例として、FEN1)によって除去され得、単鎖DNA産物は、今や内生標的鎖とハイブリダイズされており、ライゲートされて内生配列と新しく合成された鎖との間にミスマッチが創出される。ミスマッチは、細胞固有のDNA修復および/または複製プロセスによって分解されてもよい。
様々な態様において、DNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)のヌクレオチド配列は、5'フラップ種と取って代わられ、かつ編集されるべき部位と重複する、非標的鎖のヌクレオチド配列に対応する。
プライム編集因子ガイドRNAの様々な態様において、DNA合成鋳型は、ニック部位に隣接する内生DNA配列に相補的な単鎖DNAフラップをコードしていてもよく、ここで単鎖DNAフラップは、所望のヌクレオチド変化を含む。単鎖DNAフラップは、ニック部位にて内生単鎖DNAに取って代わってもよい。ニック部位にて取って代わられた内生単鎖DNAは、5'末を有し、内生フラップを形成し得るが、これは細胞によって切除され得る。様々な態様において、5'末内生フラップを除去することが、単鎖3'DNAフラップの、対応する相補的なDNA鎖とのハイブリダイゼーション、および単鎖3'DNAフラップが持つ所望のヌクレオチド変化の標的DNA中への組み込みまたは同化を促すところ、5'末内生フラップの切除は、産物形成を推進するのに役立ち得る。
プライム編集因子ガイドRNAの様々な態様において、単鎖DNAフラップの細胞修復は、所望のヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、これによって所望の産物が形成される。
更なる他の態様において、所望のヌクレオチド変化は、約-5～+5の間のニック部位、または約-10～+10の間のニック部位、または約-20～+20の間のニック部位、または約-30～+30の間のニック部位、または約-40～+40の間のニック部位、または約-50～+50の間のニック部位、または約-60～+60の間のニック部位、または約-70～+70の間のニック部位、または約-80～+80の間のニック部位、または約-90～+90の間のニック部位、または約-100～+100の間のニック部位、または約-200～+200の間のニック部位である編集窓に組み入れられる。
様々な側面において、プライム編集因子ガイドRNAは、ガイドRNAの修飾バージョンである。ガイドRNAは、天然に存在するものであっても、コードする核酸から発現されても、または化学的に合成されてもよい。着目するゲノムの標的部位の標的鎖と相互作用してハイブリダイズするスペーサーを包含する、ガイドRNAを入手またはそうでなければ合成するための方法、およびガイドRNAの適切な配列を決定するための方法は、当該技術分野において周知である。
様々な態様において、ガイドRNA配列の具体的なデザイン側面は、PAM配列の場所、標的配列中のパーセントG/C含量、マイクロ相同領域の程度、2次構造等々などの他の因子の中でも、着目するゲノム標的部位のヌクレオチド配列(すなわち、編集されるべき所望の部位)と、本明細書に記載のプライム編集因子(PE)系に存在するnapDNAbpの型(例として、Cas9タンパク質)とに依存するであろう。
一般に、ガイド配列は、標的ポリヌクレオチド配列との充分な相補性を有するいずれのポリヌクレオチド配列であって、標的配列とハイブリダイズし、かつnapDNAbp(例として、Cas9、Cas9ホモログ、またはCas9バリアント)の標的配列への配列特異的結合に向けるものである。いくつかの態様において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適な整列(alignment)アルゴリズムを使用して最適に整列されたとき、約50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％以上、またはこれらより高い。最適な整列は、配列を整列させるためのいずれか好適なアルゴリズムの使用で決定されてもよく、前記アルゴリズムの非限定例は、Smith-Watermanアルゴリズム、Needleman-Wunschアルゴリズム、Burrows-Wheeler Transform(例として、Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies)、ELAND(Illumina,San Diego,Calif.)、SOAP(soap.genomics.org.cnにて利用可能)、およびMaq(maq.sourceforge.netにて利用可能)に基づくアルゴリズムを包含する。いくつかの態様において、ガイド配列は、長さが約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75ヌクレオチド以上であるか、またはこれらより長い。
いくつかの態様において、ガイド配列は、長さが約75、50、45、40、35、30、25、20、15、12ヌクレオチド未満であるか、またはこれらより短い。ガイド配列の、塩基編集因子の標的配列への配列特異的結合に向ける能力は、いずれの好適なアッセイによっても査定されてもよい。例えば、塩基編集因子の構成要素(試験されるべきガイド配列を包含する)は、本明細書に開示の塩基編集因子の構成要素をコードするベクターでのトランスフェクション、これに続く、本明細書に記載のとおりのSurveyorアッセイなどによる標的配列内の優先的な切断の査定などによって、対応する標的配列を有する宿主細胞へ提供されてもよい。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は試験管中、標的配列、塩基編集因子の構成要素(試験されるべきガイド配列を包含する)、および試験ガイド配列とは異なる制御ガイド配列を提供すること、ならびに試験ガイド配列とおよび制御ガイド配列との間の反応の、標的配列での結合または切断率を比較することによって、評価されてもよい。他のアッセイもなし得、当業者に思い当たるものであろう。
ガイド配列は、いずれの標的配列をも標的にするのに選択されてもよい。いくつかの態様において、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。例示の標的配列は、標的ゲノム中にユニークな配列を包含する。例えば、S.pyogenes Cas9について、ゲノム中のユニークな標的配列は、形態MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG(配列番号1361548)のCas9標的部位を包含していてもよく、ここでNNNNNNNNNNNNXGG(配列番号1361549)(Nは、A、G、T、またはCである;およびXは、何であってもよい)は、ゲノム中の出現がたった1回しか有さない。ゲノム中のユニークな標的配列は、形態MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGG(配列番号1361550)のS.pyogenes Cas9標的部位を包含していてもよく、ここでNNNNNNNNNNNXGG(配列番号1361551)(Nは、A、G、T、またはCである;およびXは、何であってもよい)は、ゲノム中の出現がたった1回しか有さない。S.thermophilus CRISPR1Cas9について、ゲノム中のユニークな標的配列は、形態MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW(配列番号1361552)のCas9標的部位を包含していてもよく、ここでNNNNNNNNNNNNXXAGAAW(配列番号1361553)(Nは、A、G、T、またはCである;Xは、何であってもよい;およびWは、AまたはTである)は、ゲノム中の出現がたった1回しか有さない。ゲノム中のユニークな標的配列は、形態MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW(配列番号1361554)のS.thermophilus CRISPR1 Cas9標的部位を包含していてもよく、ここでNNNNNNNNNNNXXAGAAW(配列番号1361555)(Nは、A、G、T、またはCである;Xは、何であってもよい;およびWは、AまたはTである)は、ゲノム中の出現がたった1回しか有さない。S.pyogenes Cas9について、ゲノム中のユニークな標的配列は、形態MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGGXG(配列番号1361556)のCas9標的部位を包含していてもよく、ここでNNNNNNNNNNNNXGGXG(配列番号1361557)(Nは、A、G、T、またはCである;およびXは、何であってもよい)は、ゲノム中の出現がたった1回しか有さない。ゲノム中のユニークな標的配列は、形態MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGGXG(配列番号1361558)のS.pyogenes Cas9標的部位を包含していてもよく、ここでNNNNNNNNNNNXGGXG(配列番号1361559)(Nは、A、G、T、またはC;およびXは、何であってもよい)は、ゲノム中の出現がたった1回しか有さない。これらの配列の各々において、「M」は、A、G、T、またはCであってもよく、配列をユニークなものとして同定する際に考慮される必要はない。
いくつかの態様において、ガイド配列は、ガイド配列内の2次構造の程度を低減するよう選択される。2次構造は、いずれの好適なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムによっても決定されてもよい。いくつかのプログラムは、最小限のギブス(Gibbs)自由エネルギーを算出することに基づく。かかるアルゴリズムの1つの例は、ZukerおよびStiegler(Nucleic Acids Res.9(1981),133-148)によって記載されるとおりの、mFoldである。別の例の折り畳みアルゴリズムは、重心構造予測アルゴリズムを使用する、ウィーン大学(University of Vienna)の理論化学研究所(Institute for Theoretical Chemistry)にて開発された、オンラインウェブサーバRNA foldである(例として、A.R.Gruber et al.,2008,Cell 106(1):23-24;およびPA Carr and GM Church,2009,Nature Biotechnology 27(12):1151-62を参照)。さらなるアルゴリズムは、米国出願第61/836,080号;Broad参照BI-2013/004A)に見出されるものであってもよい(参照により本明細書に組み込まれる)。
一般に、tracrメイト配列は、以下:(1)tracrメイト配列の脇に配置されるガイド配列の、対応するtracr配列を含有する細胞における切除;および(2)標的配列での複合体の形成(ここで複合体は、tracr配列とハイブリダイズされたtracrメイト配列を含む)、の1以上を促進する、tracr配列と充分な相補性を有するいずれの配列をも包含する。一般に、相補性の程度は、tracrメイト配列およびtracr配列の、2つの配列のより短い長さに沿った最適な整列を参照する。最適な整列は、いずれの好適な整列アルゴリズムによっても決定されてもよく、さらにtracr配列またはtracrメイト配列のいずれかの配列内に自己相補性などの2次構造を構成していてもよい。いくつかの態様において、tracr配列とtracrメイト配列との間の相補性の程度は、その2つのより短い長さに沿って最適に整列されたとき、約25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％以上、またはこれらより高い。いくつかの態様において、tracr配列は、長さが約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50ヌクレオチド以上、またはこれらより長い。いくつかの態様において、tracr配列およびtracrメイト配列は、その2つの間のハイブリダイゼーションがヘアピンなどの2次構造を有する転写産物を産生するように、単一転写産物内に含有される。ヘアピン構造における使用のための好ましいループ形成配列は、長さが4ヌクレオチドであり、最も好ましくは配列GAAAを有する。しかしながら、より長いまたはより短いループ配列も、代替の配列になり得るよう(as may alternative sequences)使用されてもよい。配列は、好ましくは、ヌクレオチドトリプレット(例えば、AAA)、および追加のヌクレオチド(例えばCまたはG)を包含する。ループ形成配列の例は、CAAAおよびAAAGを包含する。本発明の態様において、転写産物または転写されたポリヌクレオチド配列は、少なくとも2つの、またはそれより多くのヘアピンを有する。好ましい一態様において、転写産物は、2、3、4または5つのヘアピンを有する。本発明のさらなる態様において、転写産物は、最大でも5つのヘアピンを有する。いくつかの態様において、単一の転写産物はさらに、転写終止配列を包含する;好ましくは、これは、ポリT配列、例えば6つのTヌクレオチドを包含する。ガイド配列、tracrメイト配列、およびtracr配列を含む単一ポリヌクレオチドのさらなる非限定例は、以下のとおりであるが(5'→3'に列挙)、ここで「N」は、ガイド配列の塩基を表し、第1ブロックの小文字は、tracrブロック配列を表し、および第2ブロックの小文字は、tracr配列を表し、および最後のポリT配列は、転写ターミネータを表す:(1)NNNNNNNNgtttttgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT(配列番号1361560);(2)NNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT(配列番号1361561);(3)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgtTTTTT(配列番号1361562);(4)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcTTTTTT(配列番号1361563);(5)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtgTTTTTTT(配列番号1361564);および(6)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaTTTTTTTT(配列番号1361565)。いくつかの態様において、配列(1)～(3)は、S.thermophilus CRISPR1からのCas9と組み合わせて使用される。いくつかの態様において、配列(4)～(6)は、S.pyogenesからのCas9と組み合わせて使用される。いくつかの態様において、tracr配列は、tracrメイト配列を含む転写産物とは別々の転写産物である。
Cas9ドメインと単鎖DNA結合タンパク質とを含む本明細書に開示のとおりの融合タンパク質のいずれも、標的部位(例として、編集されるべき点突然変異を含む部位)に対して、標的にさせるために、典型的には、融合タンパク質をガイドRNA(例として、sgRNA)と一緒に共発現させることが必要であることは、当業者には明らかであろう。本明細書中、他のどこかでより詳細に説明されるとおり、ガイドRNAは、典型的には、Cas9結合を可能にさせるtracrRNAフレームワークと、配列特異性をCas9:核酸編集酵素/ドメイン融合タンパク質へ付与するガイド配列とを含む。
いくつかの態様において、ガイドRNAは、構造5'-[ガイド配列]-guuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuu-3'(配列番号1361566)を含み、ここでガイド配列は、標的配列に相補的な配列を含む。ガイド配列は、典型的には20ヌクレオチド長である。Cas9:核酸編集酵素/ドメイン融合タンパク質を特定のゲノム標的部位に対して標的にさせるための好適なガイドRNAの配列は、本開示に基づき当業者に明らかであろう。かかる好適なガイドRNA配列は、典型的には、編集されるべき標的ヌクレオチドから50ヌクレオチド以内上流または下流の核酸配列に相補的なガイド配列を含む。提供される融合タンパク質に、特定の標的配列を標的にさせるのに好適ないくつかの例示のガイドRNA配列は、本明細書に提供される。追加のガイド配列は、当該技術分野において周知であり、本明細書に記載の塩基編集因子とともに使用され得る。
他の態様において、PEgRNAは、ガイドRNAおよび3'伸長アームを含む、図27に示される構造によって描かれるものを包含していてもよい。
図27は、本明細書に企図され、例2に定義される方法論に従ってデザインされてもよい、ある態様のPEgRNAの構造を提供する。PEgRNAは、5'→3'方向に順序付けられた3大構成要素、つまり:スペーサー、gRNAコア、および3'末にて伸長アームを含む。伸長アームはさらに、5'→3'方向に以下の構造要素、つまり:プライマー結合部位(A)、編集鋳型(B)、および相同アーム(C)に分けられてもよい。加えて、PEgRNAは、任意の3'末修飾領域(e1)および任意の5'末修飾領域(e2)を含んでいてもよい。またさらに、PEgRNAは、PEgRNAの3'末にて転写終止シグナルを含んでいてもよい(描かれず)。これらの構造要素はさらに本明細書に定義される。PEgRNA構造の描画は、限定することを意図しておらず、要素の配置におけるバリエーションを網羅するものである。例えば、任意の配列修飾因子(e1)および(e2)は、示されるいずれの他の領域内またはそれらの間に位置付けられ得るものであって、3'末および5'末にて位置付けられることに限定され得ない。
更なる他の態様において、PEgRNAは、図28に示される構造によって描画されるものを包含していてもよく、それらは、ガイドRNAおよび5'伸長アームを含む。
図28は、本明細書に企図され、例2に定義される方法論に従ってデザインされてもよい、別の態様のPEgRNAの構造を提供する。PEgRNAは、5'→3'方向に順序付けられた3大構成要素、つまり:スペーサー、gRNAコア、および3'末にて伸長アームを含む。伸長アームはさらに、5'→3'方向に以下の構造要素、つまり:プライマー結合部位(A)(配列番号406543～542056および1015219～1082596)、編集鋳型(B)(配列番号542057～677570および1082597～1149974)、ならびに相同アーム(C)(配列番号677571～813084および1149975～1217352)に分けられてもよい。加えて、PEgRNAは、任意の3'末修飾領域(e1)および任意の5'末修飾領域(e2)を含んでいてもよい。またさらに、PEgRNAは、PEgRNAの3'末にて転写終止シグナルを含んでいてもよい(描かれず)。これらの構造要素はさらに本明細書に定義される。PEgRNA構造の描画は、限定することを意図しておらず、要素の配置におけるバリエーションを網羅するものである。例えば、任意の配列修飾因子(e1)および(e2)は、示されるいずれの他の領域内またはそれらの間に位置付けられ得るものであって、3'末および5'末にて位置付けられることに限定され得ない。
PEgRNAはまた、PEgRNAの特性および/または特徴を修飾してもよい追加のデザイン改善点も包含していてもよく、これによってプライム編集の有効性が改善される。様々な態様において、これらの改善点は、数多の種々のカテゴリーの1以上に属するものであってもよく、これらに限定されないが、以下を包含する:(1)非ポリメラーゼIII(pol III)プロモーターからの機能的PEgRNAの効率的な発現を可能にさせるデザイン(これによって厄介な配列要件もなく、より長いPEgRNAの発現が可能になるであろう);(2)コア、Cas9結合PEgRNA骨格への改善点(これによって有効性が改善され得る);(3)RT処理能力(processivity)を改善する、PEgRNAへの修飾(標的にされたゲノム遺伝子座にてより長い配列の挿入が可能になる);および(4)RNAモチーフの、PEgRNAの5'末端または3'末端への付加(これによって、PEgRNA安定性が改善されるか、RT処理能力が増強されるか、PEgRNAの誤った折り畳みが防止されるか、またはゲノム編集に重要な追加の因子が動員される)。
一態様において、PEgRNAは、より大きな伸長アームをもつより長い長さのPEgRNAの発現を改善するよう、pol IIIプロモーターでデザインされ得る。sgRNAは、典型的には、U6 snRNAプロモーターから発現される。このプロモーターは、pol IIIを動員して関連RNAを発現するものであって、核内に保持される短いRNAの発現に有用である。しかしながら、pol IIIは、処理能力がそれほど高くなく、効率的なゲノム編集に要されるレベルにて長さが数百ヌクレオチドより長いRNAを発現することができない。加えて、pol IIIは、伸展したU(streches of U's)にて失速または終止し、PEgRNAを使用して挿入され得る配列多様性を潜在的に限定し得る。ポリメラーゼII(pCMVなど)またはポリメラーゼI(U1 snRNAプロモーターなど)を動員する他のプロモーターも、それらのより長いsgRNAの発現能について調べられている。しかしながら、これらのプロモーターは、典型的には、部分的に転写され、これによって、発現されたPEgRNA中スペーサーの5'に余分な配列がもたらされ、このことは部位依存的なやり方で著しく低減されたCas9:sgRNA活性をもたらすことが示されている。加えて、pol III転写のPEgRNAは、6～7つ伸びたUにおいて簡単に終止し得るのに対し、pol IIまたはpol Iから転写されたPEgRNAは、異なる終止シグナルを要するであろう。しばしば、かかるシグナルはまた、ポリアデニル化ももたらし、これによってPEgRNAの核からの望ましくない輸送がもたらされるであろう。同様に、pol IIプロモーター(pCMVなど)から発現されるRNAは、典型的には、5'にキャップされており、それらの核外輸送もまたもたらされる。
これまでに、Rinnおよび共同研究者らは、長鎖非コーディングRNA(lncRNA)でタグ付けされたsgRNAの産生のための様々な発現プラットホームをスクリーニングした183。これらのプラットホームは、pCMVから発現され、ヒトのMALAT1 ncRNAからのENE要素184、KSHVからのPAN ENE要素185、またはU1 snRNAからの3'ボックス186において終止するRNAを包含する。注目すべきことに、MALAT1 ncRNAおよびPAN ENEは、ポリAテールを保護する三重ヘリックスを形成する184,187。これらの構築物はまた、RNA安定性をも増強し得る。これらの発現系はまた、より長いPEgRNAの発現も可能にさせるであろうことが企図される。
加えて、一連の方法は、PEgRNAの一部として転写されるであろうpol IIプロモーターの部分の切断のためにデザインされており、自己切断型リボザイム(ハンマーヘッド188、ピストル189、ハチェット189、ヘアピン190、VS191、ツイスター192、もしくはツイスターシスター192リボザイムなど)、または転写されたガイドを処理する他の自己切断型要素、またはCsy4によって認識されまたガイドのプロセシングへも繋がるヘアピン193のいずれかが付加されている。また、複数のENEモチーフの組み込みは、これまでKSHV PAN RNAおよび要素について実証されたとおり185、改善されたPEgRNA発現および安定性へ繋がり得ることも仮定される。PEgRNAを環状イントロンRNA(ciRNA)の形態に環化することはまた、増強されたRNAの発現および安定性、ならびに核局在化へも繋がり得ることもまた、予想される194。
様々な態様において、PEgRNAは、以下の配列によって例示されるとおり、上の様々な要素を包含していてもよい。
非限定例1－pCMV、Csy4ヘアピン、PEgRNA、およびMALAT1 ENEからなるPEgRNA発現プラットホーム
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTAGGGTCATGAAGGTTTTTCTTTTCCTGAGAAAACAACACGTATTGTTTTCTCAGGTTTTGCTTTTTGGCCTTTTTCTAGCTTAAAAAAAAAAAAAGCAAAAGATGCTGGTGGTTGGCACTCCTGGTTTCCAGGACGGGGTTCAAATCCCTGCGGCGTCTTTGCTTTGACT(配列番号1361567)
非限定例2－pCMV、Csy4ヘアピン、PEgRNA、およびPAN ENEからなるPEgRNA発現プラットホーム
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(配列番号1361568)
非限定例3－pCMV、Csy4ヘアピン、PEgRNA、および3×PAN ENEからなるPEgRNA発現プラットホーム
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACACACTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCTCTCTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(配列番号1361569)
非限定例4－pCMV、Csy4ヘアピン、PEgRNA、および3'ボックスからなるPEgRNA発現プラットホーム
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTGTTTCAAAAGTAGACTGTACGCTAAGGGTCATATCTTTTTTTGTTTGGTTTGTGTCTTGGTTGGCGTCTTAAA(配列番号1361570)
非限定例5－pU1、Csy4ヘアピン、PEgRNA、および3'ボックスからなるPEgRNA発現プラットホーム
CTAAGGACCAGCTTCTTTGGGAGAGAACAGACGCAGGGGCGGGAGGGAAAAAGGGAGAGGCAGACGTCACTTCCCCTTGGCGGCTCTGGCAGCAGATTGGTCGGTTGAGTGGCAGAAAGGCAGACGGGGACTGGGCAAGGCACTGTCGGTGACATCACGGACAGGGCGACTTCTATGTAGATGAGGCAGCGCAGAGGCTGCTGCTTCGCCACTTGCTGCTTCACCACGAAGGAGTTCCCGTGCCCTGGGAGCGGGTTCAGGACCGCTGATCGGAAGTGAGAATCCCAGCTGTGTGTCAGGGCTGGAAAGGGCTCGGGAGTGCGCGGGGCAAGTGACCGTGTGTGTAAAGAGTGAGGCGTATGAGGCTGTGTCGGGGCAGAGGCCCAAGATCTCAGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTCAGCAAGTTCAGAGAAATCTGAACTTGCTGGATTTTTGGAGCAGGGAGATGGAATAGGAGCTTGCTCCGTCCACTCCACGCATCGACCTGGTATTGCAGTACCTCCAGGAACGGTGCACCCACTTTCTGGAGTTTCAAAAGTAGACTGTACGCTAAGGGTCATATCTTTTTTTGTTTGGTTTGTGTCTTGGTTGGCGTCTTAAA(配列番号1361571)
様々な他の態様において、PEgRNAは、改善点を骨格またはコア配列へ導入することによって改善されてもよい。これは、知られているものを導入することによってなされ得る。
コア、Cas9結合PEgRNA骨格はおそらく、PE活性を増強するのにも改善され得る。数種のかかるアプローチは既に実証されている。実例として、骨格の第1の対形成要素(P1)は、GTTTT-AAAAC対形成要素を含有する。かかるT(複数)の伸びは、RNA転写産物のpol III休止(pausing)および未成熟終止をもたらすことが示されている。このP1の部分におけるT-A対の1つの、G-C対への合理的な突然変異は、sgRNA活性を増強するのが示されたが、このアプローチもまたPEgRNAに対して実現可能であろうことを示唆する195。加えて、P1の長さを増大することはまた、sgRNAの折り畳みを増強して改善された活性へ繋がることも示されたが195、これはPEgRNA活性の改善のための別の道として示唆される。コアへの改善点の例は以下を包含し得る:
P1まで6nt伸長を含有するPEgRNA
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGCTCATGAAAATGAGCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTTTT(配列番号1361572)
P1内にT-A→G-C突然変異を含有するPEgRNA
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTGAGAGCTAGAAATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTTTT(配列番号1361573)
様々な他の態様において、PEgRNAは、修飾を編集鋳型領域へ導入することによって改善されてもよい。PEgRNAによって鋳型にされた(templated)挿入のサイズが増大するにつれて、エンドヌクレアーゼによって分解されるか、自発的加水分解を経るか、または折り畳まれることで2次構造(RTによって逆転写され得ないか、もしくはPEgRNA骨格の折り畳みおよびこれに続くCas9-RT結合を妨害する)になるか、になる可能性が高い。結果的に、PEgRNAの鋳型への修飾が、遺伝子全体の挿入などの大きな挿入に影響を及ぼす必要もあり得る。そうするためのいくつかのストラテジーは、合成または半合成PEgRNA内の修飾ヌクレオチドの組み込み(RNAを、分解もしくは加水分解に対してより耐性があるようにさせるか、または阻害性の2次構造を採用する可能性を低くさせる)を包含する196。かかる修飾は、Gリッチ配列中のRNA2次構造を低減するであろう、8-アザ-7-デアザグアノシン;分解を低減してある種のRNA2次構造を増強する、ロックド核酸(LNA);RNA安定性を増強する、2'-O-メチル修飾、2'-フルオロ修飾、または2'-O-メトキシエトキシ修飾を包含し得る。かかる修飾はまた、安定性および活性を増強するために、PEgRNA中の他のどこかにも包含され得る。代わりに、または加えて、PEgRNAの鋳型は、所望のタンパク質産物をコードするのとともに、RTによって折り畳まれ得ない単純な2次構造を採用する可能性もまた高くなるように、デザインされ得る。かかる単純な構造は、熱力学的な流し台(sink)として作用するであろうが、これによって逆転写を防止するであろうより複雑な構造が生じる可能性が低くなる。最終的に、鋳型を分裂させて2つ別々のPEgRNAにすることもまたあり得ることである。かかるデザインにおいて、PEは、Cas9と融合したRNA結合タンパク質またはPEgRNA自身上のRNA認識要素(MS2アプタマーなど)を介して、転写を開始すること、また別々の鋳型RNAを標的にされた部位へ動員することにも使用されるであろう。RTは、この別々の鋳型RNAへ直接結合するか、または第2鋳型と入れ替える(swapping to)前に元のPEgRNA上で逆転写を開始するか、のいずれかであり得る。かかるアプローチは、長い鋳型を付加した際にPEgRNAの誤った折り畳みを予防することのみならず、長い挿入を生じさせるのにゲノムからのCas9の解離(おそらくPEベースの長い挿入を阻害している可能性がある)を要さないことによってもまた、長い挿入を可能にさせ得る。
(iv)5'末端または3'末端での追加のRNAモチーフの組み入れ
更なる他の態様において、PEgRNAは、PEgRNAの5'末端または3'末端での追加のRNAモチーフを導入することによって改善されることもある。数種のかかるモチーフ－KSHVからのPAN ENEおよびMALAT1からのENEなどを、非pol IIIプロモーターからのより長いPEgRNAの発現を終止させ得る手段として、上に考察した。これらの要素は、ポリAテールを飲み込むRNA三重ヘリックスを形成し、それらの核内への保持をもたらす184,187。しかしながら、末端ヌクレオチドを塞ぐ複合体構造をPEgRNAの3'末端にて形成することによって、これらの構造はまた、PEgRNAのエキソヌクレアーゼ媒介分解を予防するのにも役立つ可能性があろう。
3'末端にて挿入された他の構造要素もまた、非pol IIIプロモーターからの終止を可能にさせることはせずとも、RNA安定性を増強し得る。かかるモチーフは、3'末端を塞ぐであろうヘアピンもしくはRNA四重鎖197、または3'末端にて2'-3'-環状ホスファートの形成をもたらし、また潜在的にPEgRNAをエキソヌクレアーゼによって分解される可能性を低くもさせるHDVなどの自己切断型リボザイム198を包含し得る。不完全なスプライシングを介してPEgRNAを環化するのに誘導する－ciRNAを形成する－ことはまた、PEgRNA安定性を増大させてPEgRNAが核内に保持されることももたらし得る194。
追加のRNAモチーフはまた、RT処理能力をも改善し得るか、またはDNA-RNA二重鎖へのRTの結合を増強することによってPEgRNA活性をも増強し得る。RTによって結合される自生配列の、その同族のレトロウイルスゲノム中での付加は、RT活性を増強し得る199。これは、レトロウイルスゲノム二量体化および転写開始に関与する、自生プライマー結合部位(PBS)、ポリプリントラクト(PPT)、またはキッシングループを包含し得る199。
二量体化チーフ－キッシングループまたはGNRAテトラループ/テトラループ受容体対200など－の、PEgRNAの5'末端および3'末端での付加はまた、PEgRNAの有効な環状化をももたらし得、安定性が改善される。加えて、これらモチーフの付加は、PEgRNAスペーサーとプライマーとの物理的な分離、PE活性の妨げになるであろうスペーサー閉塞への予防を可能にさせ得ることが想像される。スペーサー領域中に小さいトウホールド(toehold)ヘアピンを形成する、PEgRNAへの短い5'伸長はまた、好ましくは、PEgRNA結合スペーサーのアニーリング領域に対しても競合し得る。最終的に、キッシングループはまた、他の鋳型RNAをゲノム部位へ動員するのにも、あるRNAから他のRNAへのRT活性の入れ替えを可能にさせるのにも、使用され得る。改善例は、これらに限定されないが、以下を包含する:
PEgRNA-HDV融合体
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGACTTTTTTT(配列番号1361574)
PEgRNA-MMLVキッシングループ
GGTGGGAGACGTCCCACCGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTGGTGGGAGACGTCCCACCTTTTTTT(配列番号1361575)
PEgRNA-VSリボザイムキッシングループ
GAGCAGCATGGCGTCGCTGCTCACGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTCCATCAGTTGACACCCTGAGGTTTTTTT(配列番号1361576)
PEgRNA-GNRAテトラループ/テトラループ受容体
GCAGACCTAAGTGGUGACATATGGTCTGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAUACGTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTUACGAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTGCATGCGATTAGAAATAATCGCATGTTTTTTT(配列番号1361577)
2次RNA-HDV融合体を切り替える(switching)PEgRNA鋳型
TCTGCCATCAAAGCTGCGACCGTGCTCAGTCTGGTGGGAGACGTCCCACCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGACTTTTTTT(配列番号1361578)
PEgRNA骨格は、SpCas9および塩基編集因子の改善のされ方に類似した様式で、指向進化を介してさらに改善され得る。指向進化は、Cas9または進化したCas9バリアントによるPEgRNA認識を増強し得る。加えて、種々のPEgRNA骨格配列はおそらく、種々のゲノム遺伝子座にて最適であって、問題になっている部位にてPE活性を増強するか、オフターゲット活性を低減するか、またはその両方のいずれかであろう。最終的に、他のRNAモチーフが付加されたPEgRNA骨格の進化は、未進化の融合RNAと比べて、融合されたPEgRNAの活性をほぼ必ず改善するであろう。実例として、c-ジ-GMP-Iアプタマーおよびハンマーヘッド型リボザイムから構成されるアロステリックリボザイムの進化は、劇的に改善された活性へ繋がったが202、これは進化がハンマーヘッド-PEgRNA融合体の活性も改善するであろうことを示唆する。加えて、目下Cas9は一般にsgRNAの5'伸長の耐性がないものの、指向進化は、この不耐性を和らげることを可能にする突然変異を生成し、追加のRNAモチーフが利用され得るようになる可能性があろう。
本開示は、本明細書に開示されたプライム編集系の有効性をさらに改善するいずれのかかるやり方も企図する。
II．治療的PEgRNAをデザインするアルゴリズムおよび方法
本明細書に記載のとおり、本発明者らは、PEgRNAを使用するプライム編集が、多種多様のヌクレオチド変化(挿入(遺伝子またはタンパク質コード領域全体を包含する、いずれの長さの)、欠失(いずれの長さの)を包含する)を組み入れ、および病原性の突然変異を修正するのに使用され得ることを発見し解した。しかしながら、スペーサー、gRNAコア、ならびに伸長アーム(および本明細書に記載のとおりの伸長という構成要素)などの、PEgRNAの様々な構成要素を特定することを包含する、PEgRNA構造を決定および/または予測する技法は、まだ存在していない。本発明者らは、伸長されたgRNA構造を決定することを包含する、PEgRNAを決定するための、コンピュータによる技法を開発した。伸長された各gRNA構造は、入力アレル(例として、病原性の突然変異を表す)、出力アレル(例として、修正された野生型配列を表す)、および融合タンパク質(例として、PAMモチーフとプライム編集因子のニックの相対的な位置とを包含する、プライム編集のためのCRISPR系)に基づき決定され得る。入力アレルと出力アレルとの差異は、所望の編集(例として、単一ヌクレオチドの変化、挿入、欠失、および/または同種のもの)を表す。決定された構造は、本明細書にさらに記載されるとおり、入力アレルを出力アレルへ変化させる塩基編集を実施するのに創出および使用され得る。
図31は、いくつかの態様に従って、伸長されたgRNA構造を決定するための、ハイレベルコンピュータによる例示の方法3100を示すフローチャートである。ステップ3102にて、計算デバイス(例として、図34と併せて記載される計算デバイス3400)は、核酸プログラム型DNA結合タンパク質および逆転写酵素を包含する、入力アレル、出力アレル、および融合タンパク質を示すデータへアクセスする。ステップ3102は、入力アレル、出力アレル、および融合タンパク質の3つすべてへワンステップでアクセスことが記載されているが、これは説明のためであって、本明細書に記載の技法の精神を逸脱せずに、かかるデータが1以上のステップを使用してアクセスされ得ることは解されるはずである。データへアクセスすることは、データを受け取ること、データを記憶すること、データベースへアクセスすること、および/または同種のものを包含し得る。
ステップ3104にて、計算デバイスは、ステップ3102においてアクセスされた入力アレル、出力アレル、および融合タンパク質に基づき、伸長されたgRNA構造を決定する。伸長されたgRNA構造は、入力アレルを出力アレルへ変化させる融合タンパク質と結び付けられるようにデザインされている。融合タンパク質は、伸長されたgRNAと複合体化されたとき、変化が生じた標的鎖を包含する標的DNA配列と、相補的な非標的鎖とへ結合することが可能となる。本明細書に記載のとおりの、入力アレルは、病原性のDNA突然変異を表し得、出力アレルは、修正されたDNA配列を表し得る。
入力アレルを出力アレルへ変化させることは、単一ヌクレオチドの変化、1以上のヌクレオチドの挿入、1以上のヌクレオチドの欠失、および/または出力アレルを獲得するようデザインされたいずれの他の変化を包含し得る。とりわけ、単一のPEgRNAによって誘導され得る編集の例示のクラスは、単一ヌクレオチドの置換、1ntから最大およそ40ntまでの挿入、1ntから最大およそ30ntまでの欠失、およびそれらの組み合わせを包含する。例えば、プライム編集は、スペーサー位置-3(例として、ニックのすぐ3')からスペーサー位置+27(例として、入力アレル中のニックの30nt 3')までの、これらの型の変化をサポートし得る。他の位置もまた使用され得る。例えば、スペーサー位置-4での編集は、プライム編集をもつSpCas9系を使用して実施され得る(例として、これは、スペーサー位置-5と位置-4との間の偶発的なRuvC切断によって引き起こされ得る)。変化の型、nt数の変化、および/または変化の位置は、コンピュータによる技法が伸長されたgRNA構造を決定するのに使用し得る、設定可能なパラメータ(単数または複数)であり得る。
図3A～3Bおよび図27～28と併せて考察されるとおり、伸長されたgRNAは、入力アレル中の標的ヌクレオチド配列に相補的な、伸長されたgRNAのためのスペーサー、融合タンパク質と相互作用するためのgRNA主鎖、および伸長などの様々な構成要素を包含し得る。さらにステップ3104を参照すると、計算デバイスは、スペーサー、gRNA主鎖、および伸長のうち1以上を決定する。いくつかの態様において、技法は、スペーサー、gRNA主鎖、および/または伸長のいずれの組み合わせを決定することを包含し得るが、いくつかの態様において、かかる構成要素および/またはかかる構成要素の側面の1以上は知られており(例として、予め決定されている、予め特定されている、確定されている、等々)、したがってステップ3104の一部として決定されなくてもよい。
本明細書に記載のとおりの、gRNA伸長は、様々な構成要素を包含し得る。例えば、図3A～3Bおよび27～28に示されるとおり、伸長は、RT鋳型の1以上(RT編集鋳型および相同アームを包含する)、プライマー結合部位、RT終止シグナル、任意の5'末修飾領域、および任意の3'末修飾領域を包含し得る。図32は、いくつかの態様に従って、伸長されたgRNA構造の構成要素(伸長の構成要素を包含する)を決定するための、コンピュータによる例示の方法3200を示すフローチャートである。図32が説明を意図しており、したがって伸長されたgRNAを決定するのに使用される技法が、図32に示されるステップより多いまたは少ないステップを包含し得ることは解されるはずである。
ステップ3202にて、計算デバイスは、両鎖上の入力アレル中の選択されたCRISPR系のPAMモチーフに適合するプロトスペーサー一式を決定する。いくつかの態様において、計算デバイスは、最初にプロトスペーサー一式を決定し、その関連するニック位置が出力アレルへのプライム編集に適合しないプロトスペーサーを取り除いて、残りの候補プロトスペーサー一式を生成する。例えば、計算デバイスは、ニックが鎖上で所望の編集の3'側にあるとのことからプロトスペーサーが不適合であるとの決定をしてもよい。別の例として、計算デバイスは、ニックと所望の編集との間の間隔が大きすぎる(例として、ユーザー定義の閾値、例えば30nt、35ntより大きい、等々)との決定をしてもよい。
ステップ3204にて、計算デバイスは、決定されたプロトスペーサー一式からプロトスペーサーを選択する。ステップ3206にて、計算デバイスは、入力アレルのプロトスペーサー配列、ニックの位置、および所望の編集の配列を使用して、スペーサーおよび編集鋳型配列を決定する。スペーサーは、およそ20ヌクレオチドのヌクレオチド配列を包含し得る。
ステップ3208にて、計算デバイスは、1以上のパラメータ一式を選択するが、ここで各パラメータ一式は、プライマー結合部位長の値(例として、およそ8ntから17ntまでなど、nt数において変動し得る)、相同アーム長の値(例として、およそ2ntから33ntまでなど、nt数において変動し得る)、およびgRNA主鎖配列を包含する。例えば、gRNA主鎖配列は、GTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(配列番号1361579)、GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(配列番号1361580)、および/または野生型RNA2次構造を保持するgRNA主鎖配列などの、他のgRNA主鎖配列でもあり得る。
ステップ3210にて、計算デバイスは、ステップ3208において決定されたパラメータ一式を選択する。ステップ3212にて、計算デバイスは、選択されたパラメータ一式を使用して、相同アーム、プライマー結合部位配列、およびgRNA主鎖を決定する。ステップ3214にて、計算デバイスは次いで、スペーサー、gRNA主鎖、PEgRNA伸長アーム(これは、相同アームおよび編集鋳型を包含する)を連接させること(concatenating)によってもたらされたPEgRNA配列を形成する。加えて、伸長アームは、逆転写の終止を発動させる配列であるターミネータシグナルを包含していてもよい。かかるターミネータ配列は、例えば、TTTTTTGTTTT(配列番号1361581)を包含していてもよい。いくつかの態様において、PEgRNA伸長アームは、終止シグナルを含むことが考慮されていてもよい。他の態様において、PEgRNA伸長アームは、終止シグナルを排除することが考慮されていてもよいが、代わりに伸長アームは、伸長アームの外にある要素としての終止シグナルへ付着されている。
方法3200はステップ3216へ進み、計算デバイスは、より多くのパラメータ一式があるかどうかを決定する。はい(yes)の場合、方法はステップ3210へ進み、計算デバイスは、別のパラメータ一式を選択する。いいえ(no)の場合、方法はステップ3218へ進み、計算デバイスは、より多くのプロトスペーサーがあるかどうかを決定する。
はいの場合、方法はステップ3204へ戻り、計算デバイスは、プロトスペーサー一式から別のプロトスペーサーを選択する。いいえの場合、方法はステップ3220へ進み終了する。
本明細書に記載のとおり、伸長のDNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)は、入力アレルを出力アレルへ変化させる所望のヌクレオチド変化を包含し、RT編集鋳型(例として、ステップ3206において決定される)および相同アーム(例として、ステップ3212にて決定される)を包含する。また本明細書にも記載されるとおり、DNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)は、ニック部位に隣接する内生DNA配列に相補的な単鎖DNAフラップをコードする。単鎖DNAフラップは、所望のヌクレオチド変化(例として、単一ヌクレオチドの変化、1ヌクレオチド以上の挿入、1ヌクレオチド以上の欠失、および/または同種のもの)を含む。いくつかの塩基編集の配置(deployments)において、単鎖DNAフラップは、ニック部位に隣接して所望のヌクレオチド変化を組み入れる内生DNA配列とハイブリダイズし得る。いくつかの塩基編集の配置において、単鎖DNAフラップは、ニック部位に隣接する内生DNA配列に取って代わる。単鎖DNAフラップの細胞修復は、所望のヌクレオチド変化の組み入れをもたらして、所望の出力アレル産物を形成し得る。DNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)は、可変のヌクレオチド数を有し得、およそ7ヌクレオチドから34ヌクレオチドまでに及び得る。
図32には示されていないが、計算デバイスは、伸長されたgRNAの他の構成要素を決定するように構成され得る。例えば、いくつかの態様において、計算デバイスは、RT鋳型に隣接するRT終止シグナルを決定するように構成されている。いくつかの態様において、計算デバイスは、RT終止シグナルに隣接する第1修飾因子を決定するように構成され得る。いくつかの態様において、計算デバイスは、プライマー結合部位に隣接する第2修飾因子を決定するように構成されている。
伸長されたgRNA構成要素は、図3A～3Bおよび図27～28に示される立体配置などの、種々の立体配置で配置され得る。例えば、図3Aを参照すると、伸長は伸長されたgRNA構造の5'末にあり、スペーサーは伸長に対し3'に、かつgRNAコアに対し5'にある。別の例として、図3Bを参照すると、スペーサーは、伸長されたgRNA構造の5'末にあり(かつこれは、gRNAコアに対し5'にあり)、伸長は、伸長されたgRNA構造の3'末にある(かつこれは、gRNAコアに対し3'にある)。
いくつかの態様において、計算デバイスは、入力アレルおよび関連出力アレルの一式を包含するデータベースへアクセスする。例えば、計算デバイスは、数十万の突然変異を包含するクリンバーによって提供されるデータベースへアクセスし得るが、前記突然変異の各々は、病原性の突然変異を表すアレルおよび修正された野生型配列を表すアレルを包含する。技法は、各データベースエントリーについて、1以上の伸長されたgRNA構造を決定するのに使用され得る。図33は、いくつかの態様に従い、データベース中の各突然変異エントリーについて、伸長されたgRNA構造一式を決定するための、コンピュータによる例示の方法3300を示すフローチャートである。ステップ3302にて、計算デバイスは、突然変異エントリー一式(この各々は、突然変異を表す入力アレルおよび修正された野生型配列を表す出力アレルを包含する)を包含するデータベース(例として、クリンバーデータベース)へアクセスする。
ステップ3304にて、計算デバイスは、1以上の融合タンパク質一式へアクセスする。いくつかの態様において、技法は、単一の融合タンパク質について、および/または異なる融合タンパク質の組み合わせについて(例として、異なるCas9タンパク質について)、伸長されたgRNA構造一式を生成することを包含し得る。計算デバイスは、複数の融合タンパク質を示すデータへアクセスするように構成され得、本明細書に記載のとおりの各融合タンパク質(例として、Cas9-NGタンパク質およびSpCas9タンパク質)について、伸長されたgRNA構造一式を創出し得る。
ステップ3306にて、計算デバイスは、融合タンパク質一式から融合タンパク質を選択する。ステップ3308にて、計算デバイスは、データベース中のエントリー一式から突然変異エントリーを選択する。計算デバイスは、例えば、データベース中の各エントリーを通して反復適用して、そのエントリーについて伸長されたgRNA構造一式(例として、具体的な融合タンパク質について一組、および/または複数の融合タンパク質の各々について複数組)を創出するよう構成され得る。いくつかの態様において、計算デバイスは、データベース中のエントリー一式の一部(subset)(予め設定された一式など)、有意性が最も高い突然変異一式(例として、治療上知られている利益をもつもの)、および/または同種のものについて、伸長されたgRNA構造を生成するように構成され得る。いくつかの態様において、データベースが、プライム編集のためのいくつかの融合タンパク質には適合しないエントリーを包含する場合、計算デバイスは、ステップ3304から選択された融合タンパク質を使用してデータベース中のどのエントリーがプライム編集に適合し得るかを決定し、ステップ3308において選択された融合タンパク質に適合するエントリーを選択するように構成され得る。
ステップ3310にて、計算デバイスは、本明細書に記載の技法を使用して、1以上の伸長されたgRNA構造一式を決定する。方法はステップ3310からステップ3312へ進み、計算デバイスは、データベース中に追加のエントリーがあるかどうかを決定する。
はいの場合、計算デバイスは、ステップ3308へ戻って別のエントリーを選択する。いいえの場合、計算デバイスはステップ3314へ進み、より多くの融合タンパク質があるかどうかを決定する。はいの場合、計算デバイスは、ステップ3306へ戻って別の融合タンパク質を選択する。いいえの場合、計算デバイスはステップ3316へ進み、方法3300を終了する。
いくつかの態様において、技法は、非相補的な配列(相同アームの5'に、プライマー結合部位の3'に、またはその両方にある非相補的な配列など)を含有するgRNA伸長をもつPEgRNAをデザインし得る。例えば、非相補的な配列は、RNA安定性のための保護ヘアピンとして作用するキッシングループ相互作用、および/または同種のものを形成するようデザインされ得る。
いくつかの態様において、PEgRNAは、複数のデザイン候補の中から優先順位を決めるストラテジーを使用してデザインされてもよい。例えば、技法は、最も5'側にある(5'-most)ヌクレオチドがシトシンであるPEgRNA伸長を回避するようデザインされ得る(例として、sgRNA:Cas9複合体中の自生ヌクレオチド-タンパク質相互作用を遮断することに起因する)。別の例として、技法は、RNA2次構造予測ツールを使用し、好ましいPBS長さ、フラップ長さ、および/または同種のものを、伸長されたgRNAの他のパラメータ(プロトスペーサー、所望の編集、および/または同種のものなど)に基づき選択し得る。
伸長されたgRNA構造を決定するための、本明細書に記載されるコンピュータによる技法の例示の実践は、以下のとおりである:
Figure 2022531539000006
Figure 2022531539000007
Figure 2022531539000008
Figure 2022531539000009
Figure 2022531539000010
Figure 2022531539000011
本明細書とともに提出された例示の配列表は、入力アレルおよび対応する出力アレルについてクリンバーデータベースを使用する本明細書に記載の技法を使用して生成した。クリンバーデータベース中のエントリーは最初に、病原性のものまたは病原性のようなものとして注釈付きの生殖細胞系列の突然変異に対し、取り除かれた。これらの例について、Cas9-NGおよびSpCas9を使用し、適合性のある突然変異を同定した。取り除かれた突然変異のうち、およそ72,020のユニークなクリンバー突然変異が、Cas9-NGのプライム編集と適合可能なものとして同定され、およそ63,496のユニークなクリンバー突然変異が、NGG PAMをもつSpCas9のプライム編集と適合可能なものとして同定された。他のおよび/または追加の突然変異も、異なるPAM適合性をもつ異なるCas9バリアントを含有するプライム編集因子を使用すれば修正可能であり得ることは解されるはずである。
様々な態様において、アルゴリズムを使用し、配列番号1～135514および813085～880462の治療的PEgRNAをデザインした。これはクリンバーデータベースエントリーに対し本明細書に開示のアルゴリズムを使用してデザインされたものである。
様々な他の態様において、アルゴリズムを使用し、クリンバーデータベースに対してPEgRNAをデザインしたが、使用したアルゴリズムは本明細書に開示され、本明細書の一部を形成する配列表に包含される。配列表は、配列番号1～135514および813085～880462の完全なPEgRNA配列を包含する。これら全長PEgRNAの各々は、スペーサー(配列番号135515～271028および880463～947840)ならびに伸長アーム(配列番号271029～406542および947841～1015218)の各々から構成される。加えて、各PEgRNAは、gRNAコアを含み、例えば、配列番号1361579～1361580によって定義されるとおりである。配列番号271029～406542および947841～1015218の伸長アームはさらに、プライマー結合部位(配列番号406543～542056および1015219～1082596)、編集鋳型(配列番号542057～677570および1082597～1149974)、ならびに相同アーム(配列番号677571～813084および1149975～1217352)の各々から構成される。PEgRNAは任意に、5'末修飾領域および/または3'末修飾領域を含んでいてもよい。PEgRNAはまた、PEgRNAの3'にて逆転写終止シグナル(例として、配列番号1361560～1361566)も含んでいてもよい。本出願は、これら配列のすべてのデザインおよび使用を網羅する。
突然変異を、少数アレルの頻度、登録者数、それらの解釈において矛盾した登録者がいるか否か、および突然変異が有識者によって検閲されたか否かを使用して、臨床上有意性のある4つのクラスに分類した。63,496の中、SpCas9に適合性のある突然変異:4,627の突然変異が最も有意なレベル(4)にて同定された;13,943の突然変異が有意性レベル3または4にて同定された;および44,385の突然変異が有意性レベル2、3または4にて同定された。
提供された配列表は、ユニークな突然変異につき単一のPEgRNAを一覧表にしており、これはニックと編集との間の間隔が最短のPEgRNAとして選択されたものである。13ntの相同アーム長、13ntのプライマー結合部位長、17ntでのgRNAニック位置、および20ntのgRNA長をもつPEgRNAをデザインした。ニック部位が編集まで20ntより遠いプロトスペーサーは無視した。使用されたgRNA主鎖配列は、GTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(配列番号1361579)であった。使用されたターミネータ配列は、TTTTTTGTTTT(配列番号1361581)であった。
本明細書に記載のとおり、提供される例示の配列表は、限定することを意図していない。提供されるPEgRNAデザイン上のバリエーションが、gRNA主鎖配列、プライマー結合部位長、フラップ長、および/または同種のものを変更することを包含する、本明細書に記載のバリエーションを包含し得ることは解されるはずである。
本明細書に開示の技法の側面および態様のいずれも実施するのに使用されてもよいコンピュータ系3400の実施態様は、図34に示される。コンピュータ系3400は、1以上のプロセッサ3410および1以上の非一過性コンピュータ可読記憶媒体(例として、メモリ3420および1以上の不揮発性記憶媒体3430)およびディスプレー3440を包含していてもよい。プロセッサ3410は、いずれの好適なやり方で、メモリ3420および不揮発性記憶装置3430へのデータの書込み、ならびにこれらからのデータの読取りを制御してもよいが、本明細書に記載の本発明の側面はこの点において限定されない。本明細書に記載の機能性および/または技法を実施するのに、プロセッサ3410は、1以上のコンピュータ可読記憶媒体(例として、メモリ3420、記憶媒体、等々)(これは、プロセッサ3410による実行のための指示を記憶する非一過性コンピュータ可読記憶媒体として働いてもよい)に記憶されている1以上の指示を実行してもよい。
本明細書に記載の技法に関係して、使用されるコード、例えば、伸長されたgRNA構造を決定するのに使用されるコードは、コンピュータ系3400の1以上のコンピュータ可読記憶媒体上に記憶されていてもよい。プロセッサ3410は、いずれのかかるコードも実行することで、本明細書に記載のとおりの演習を仕組むためのいずれの技法も提供してもよい。また本明細書に記載のいずれの他のソフトウェア、プログラム、もしくは指示も、コンピュータ系3400によって記憶され実行されてもよい。コンピュータコードが本明細書に記載の方法および技法のいずれの側面にも適用されてもよいことは解されるであろう。例えば、コンピュータコードは、作動系(operating system)と相互作用するために適用されて、従来の作動系の処理を通して伸長されたgRNA構造を決定してもよい。
本明細書に概説される様々な方法またはプロセスは、様々な作動系またはプラットホームのいずれか1つを採用する1以上のプロセッサ上で実行可能なソフトウェアとしてコードされていてもよい。加えて、かかるソフトウェアは、無数の好適なプログラミング言語および/またはプログラミングツールもしくはスクリプトツールのいずれも使用して書かれていてもよく、また仮想機もしくは好適なフレームワーク上で実行される実行可能な機械語コードまたは中間コードとしてもコンパイルされてもよい。
この点において、様々な発明思想は、1以上のコンピュータまたは他のプロセッサ上で実行されたときに本発明の様々な態様を実践する1以上のプログラムがコードされる、少なくとも1の非一過性コンピュータ可読記憶媒体(例として、コンピュータメモリ、1以上のフロッピーディスク、コンパクトディスク、光ディスク、磁気テープ、フラッシュメモリ、フィールドプログラマブルゲートアレイまたは他の半導体デバイスにおける回路構成、等々)として具体化されてもよい。非一過性コンピュータ可読媒体(単数または複数)は、これらに記憶されるプログラムまたはプログラムが、上に考察されるとおりの本発明の様々な側面を実践するいずれのコンピュータリソース上へ読み込まれてもよいように、輸送可能であってもよい。
用語「プログラム」、「ソフトウェア」、および/または「アプリケーション」は、上に考察されるとおりの本発明の様々な側面を実践するコンピュータもしくは他のプロセッサをプログラムするのに採用され得るいずれの型のコンピュータコードまたはコンピュータ実行可能命令一式を指すのに、一般的な意味で本明細書に使用される。加えて、一側面に従うと、実行されたときに本発明の方法を実施する1以上のコンピュータプログラムが、単一のコンピュータまたはプロセッサにある必要はなく、本発明の様々な側面を実践する種々のコンピュータ同士またはプロセッサ同士にモジュール方式で割り振られていてもよいことも解されるはずである。
コンピュータ実行可能命令は、1以上のコンピュータまたは他のデバイスによって実行される、プログラムモジュールなどの多くの形態であってもよい。一般に、プログラムモジュールは、具体的なタスクを実施するかまたは具体的な抽象データ型を実践する、ルーチン、プログラム、オブジェクト、構成要素、データ構造等々を包含する。典型的には、プログラムモジュールの機能性は、様々な態様において所望されるとおりに組み合わせていても、または割り振られていてもよい。
また、データ構造も、いずれの好適な形態の非一過性コンピュータ可読記憶媒体に記憶されていてもよい。データ構造は、データ構造中の場所を通して関係するフィールドを有していてもよい。かかる関係性は同じく、フィールド間の関係性を伝える非一過性コンピュータ可読媒体中に場所をもつフィールドへ記憶を割り当てることによって獲得されてもよい。しかしながら、いずれの好適な機序も、例えば、ポインター、タグ、またはデータ要素間に関係性を確立する他の機序の使用を通して、情報間の関係性をデータ構造のフィールド中に確立するのに使用されてもよい。
様々な発明思想が1以上の方法として具体化されてもよく、その例は提供されている。方法の一部として実施される行為は、いずれの好適な観点で順序付けられてもよい。結果的に、説明とは異なる順序で行為が実施される態様が構築されていてもよく、説明に役立つ態様において逐次的な行為として示されていたとしても、いくつかの行為を同時に実施することも包含していてもよい。
III．治療的PEgRNAとの使用のためのプライム編集因子
本明細書に開示されたアルゴリズムに従ってデザインされた治療的PEgRNAは、プライム編集因子と複合したときにプライム編集を行うのに使用されてもよい。プライム編集因子は、ポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)と融合したnapDNAbp(またはtransで提供されたもの)を含み、任意にその2つのドメインは、リンカーによって結び合わせられており、1以上のNLSをさらに含んでいてもよい。これらの側面は以下の通り、さらに記載される。
A．napDNAbp
本明細書に記載のプライム編集因子は、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)を含んでいてもよい。
一側面において、napDNAbpは、少なくとも1のガイド核酸(例として、ガイドRNAまたはPEgRNA)と結び付けられ得るかまたはこれと複合体化され得、前記ガイド核酸は、napDNAbpを、ガイド核酸に相補的なDNA鎖(すなわち、標的鎖)またはその一部(例として、DNA標的のプロトスペーサーとアニールするガイドRNAのスペーサー)を含むDNA配列へ局在化させる。換言すれば、ガイド核酸は、napDNAbp(例として、Cas9または等価物)を、DNA中のプロトスペーサーの相補配列へ局在化させてこれへ結合するよう「プログラム」する。
いずれの好適なnapDNAbpも、本明細書に記載のプライム編集因子において使用されてもよい。様々な態様において、napDNAbpは、いずれのII型、V型、またはVI型のCRISPR-Cas酵素も包含する、いずれのクラス2 CRISPR-Cas系であってもよい。CRISPR-Casはゲノム編集のためのツールとして急速に開発されているが、Cas9およびCas9オルソログなどのCRISPR-Cas酵素を記載および/または同定するのに使用される命名法の進展も繰り返されている。本出願は、新旧の(may be old and/or new)命名法でCRISPR-Cas酵素を言及する。当業者は、古い(すなわち、「レガシー(legacy)」)または新しい命名法であるかどうかに関わらず使用される命名法に基づき、本出願において言及される特定のCRISPR-Cas酵素を同定することができるであろう。CRISPR-Cas命名法は、Makarova et al.,"Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems:Where from Here?,"The CRISPR Journal,Vol.1,No.5,2018(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)において広範に考察されている。本出願中の所定の実例において使用される具体的なCRISPR-Cas命名法はいずれにしても限定するものではなく、当業者はどのCRISPR-Cas酵素が言及されているか同定することができるであろう。
例えば、以下のII型、V型、およびVI型のクラス2 CRISPR-Cas酵素は、以下の当該技術分野において認識されている古い(すなわち、レガシー)および新しい名称を有する。これらの酵素および/またはそれらのバリアントの各々は、本明細書に記載のプライム編集因子とともに使用されてもよい:
Figure 2022531539000012
理論に拘泥されないが、本明細書に企図されるあるnapDNAbpの作用機序は、napDNAbpが二本鎖DNA標的の巻き戻しを誘導するRループを形成する(これによって、napDNAbpによって結合された領域中の鎖が分離される)ステップを包含する。ガイドRNAスペーサーは次いで、プロトスペーサー配列にて「標的鎖」とハイブリダイズする。これは、標的鎖に相補的な「非標的鎖」に取って代わり、このことによってRループの単鎖領域が形成される。いくつかの態様において、napDNAbpは1以上のヌクレアーゼ活性を包含しており、次いでDNAを切ることで、様々な型の病変がなくなる。例えば、napDNAbpは、非標的鎖を第1の場所にて切るか、および/または標的鎖を第2の場所にて切る、ヌクレアーゼ活性を含んでいてもよい。ヌクレアーゼ活性に応じて標的DNAが切られることで、両鎖とも切られた「二本鎖切断」が形成され得る。他の態様において、標的DNAは単一の部位でしか切られ得ない、すなわち、DNAは一方の鎖上に「ニックが入れられる」。種々のヌクレアーゼ活性をもつ例示のnapDNAbpは、「Cas9ニッカーゼ」(「nCas9」)、およびヌクレアーゼ活性を一切有さない不活性化Cas9(「不活性型Cas9」または「dCas9」)を包含する。
本開示のプライム編集因子に関係して使用され得る様々なnapDNAbpsの下の記載は、いずれにしても限定することを意図していない。プライム編集因子は、標準的なSpCas9、もしくはいずれのオルソログCas9タンパク質、またはいずれのバリアントCas9タンパク質－天然に存在するいずれのバリアント、突然変異体、またはCas9の別様に改変されたバージョンを包含する－を含んでいてもよく、これらは知られているか、あるいは指向進化もしくはそうでなければ変異誘発プロセスを通して作製または進化されたものである。様々な態様において、Cas9またはCas9バリアントは、ニッカーゼ活性を有する、すなわち、標的DNA配列の鎖のみを切断する。他の態様において、Cas9またはCas9バリアントは、不活性なヌクレアーゼを有する、すなわち、「不活性型(dead)」Cas9タンパク質である。使用されてもよい他のバリアントCas9タンパク質は、標準的なSpCas9より小さい分子量を有するもの(例として、より容易な送達のため)、または修飾もしくは再配列一次アミノ酸構造を有するもの(例として、循環置換形式)である。
本明細書に記載のプライム編集因子はまた、収束進化の結果であるCas12a(Cpf1)およびCas12b1タンパク質を包含する、Cas9等価物も含んでいてよい。本明細書に使用されるnapDNAbp(例として、SpCas9、Cas9バリアント、またはCas9等価物)はまた、それらのPAM特異性を変更/増強する様々な修飾も含有していてもよい。最後に、本出願は、参照Cas9配列(参照SpCas9の標準的な配列もしくは参照Cas9の等価物(例として、Cas12a(Cpf1))など)と、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.9％の配列同一性を有する、いずれのCas9、Cas9バリアント、あるいはCas9等価物を企図する。
napDNAbpは、CRISPR(クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート)関連ヌクレアーゼであり得る。CRISPRは、可動遺伝因子(ウイルス、転移因子、および接合性プラスミド)に対して保護を提供する適応免疫系である。CRISPRクラスターは、スペーサー、先行する可動因子に相補的な配列、および標的化侵入核酸を含有する。CRISPRクラスターは転写され、プロセスを受けて(processed)CRISPR RNA(crRNA)になる。II型CRISPR系において、pre-crRNAの修正プロセシングは、transでコードされた低分子RNA(tracrRNA)、内生リボヌクレアーゼ3(rnc)、およびCas9ドメインを要する。tracrRNAは、pre-crRNAの、リボヌクレアーゼ3に補助された(-aided)プロセシングのためのガイドとして働く。続いて、Cas9/crRNA/tracrRNAは、スペーサーに相補的な線状または環状のdsDNA標的をエンドヌクレアーゼ的に切断する。crRNAに相補的ではない標的鎖は、最初にエンドヌクレアーゼ的に切られ、次いで3'-5'エキソヌクレアーゼ的に切り取られる。本来、DNAの結合および切断は、典型的には、タンパク質および両RNAを要する。しかしながら、単一ガイドRNA(「sgRNA」、または単に「gNRA」)は、crRNAとtracrRNAとの両方の側面を単一RNA種中へ組み込むために、改変され得る。例として、Jinek M.et al.,Science 337:816-821(2012)を参照(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)。
いくつかの態様において、napDNAbpは、標的配列内および/または標的配列の相補体内などの標的配列の場所にて、一方または両方の鎖の切断へ向かう。いくつかの態様において、napDNAbpは、標的配列の最初または最後のヌクレオチドから約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500以上の塩基対内で、一方または両方の鎖の切断へ向かう。いくつかの態様において、ベクターは、突然変異napDNAbpが、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖の切断能を欠くように、対応する野生型酵素に関して突然変異しているnapDNAbpをコードする。例えば、S.pyogenesからのCas9のRuvC I触媒ドメイン中のアスパルタート→アラニン置換(D10A)は、Cas9を、両鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ(単鎖を切断する)へ変換する。Cas9ニッカーゼにする突然変異の他の例は、標準的なSpCas9配列、または他のCas9バリアントもしくはCas9等価物における等価なアミノ酸位置を参照すると、限定せずに、H840A、N854A、およびN863Aを包含する。
本明細書に使用されるとき、用語「Casタンパク質」は、自然から得られた全長Casタンパク質、天然に存在するCasタンパク質とは異なる配列を有する組換えCasタンパク質、またはCasタンパク質のいずれのフラグメントを指すが、これらはそれでもなお、開示された方法に必要な必須の基本機能、すなわち、(i)Casタンパク質の、標的DNAへの核酸プログラム型結合の所有、および(ii)一方の鎖上の標的DNA配列へニックを入れる能力のすべてまたは相当量を保持する。本明細書に企図されるCasタンパク質は、CRISPR Cas9タンパク質、ならびにCas9等価物、バリアント(例として、天然に存在するかまたは天然には存在しないかに関わらず(例として、改変または組換え)、Cas9ニッカーゼ(nCas9)もしくはヌクレアーゼ不活性Cas9(dCas9))ホモログ、オルソログ、またはパラログを網羅し、Cas12a(Cpf1)、Cas12e(CasX)、Cas12b1(C2c1)、Cas12b2、Cas12c(C2c3)、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10、C2c9 Cas13a(C2c2)、Cas13d、Cas13c(C2c7)、Cas13b(C2c6)、およびCas13bを包含する、いずれのクラス2 CRISPR系(例として、II型、V型、VI型)からのCas9等価物を包含していてもよい。さらなるCas等価物は、Makarova et al.,"C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector,"Science 2016;353(6299)およびMakarova et al.,"Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here?,"The CRISPR Journal,Vol.1,No.5,2018に記載されている(これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる)。
用語「Cas9」または「Cas9ヌクレアーゼ」または「Cas9部分」または「Cas9ドメイン」は、いずれの生物からの天然に存在するいずれのCas9、天然に存在するいずれのCas9等価物または機能的そのフラグメント、いずれの生物からのいずれのCas9ホモログ、オルソログ、またはパラログ、および天然に存在するかもしくは改変されたCas9のいずれの突然変異体またはバリアントを網羅する。用語Cas9は、具体的に限定することを意図しておらず、「Cas9または等価物」と称されることもある。例示のCas9タンパク質はさらに、本明細書に記載されるか、および/または当該技術分野において記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、本発明のプライム編集因子(PE)に採用される具体的なCas9に関し限定されない。
本明細書に述べたとおり、Cas9ヌクレアーゼの配列および構造は当業者に周知である(例として、"Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes."Ferretti et al.,J.J.,McShan W.M.,Ajdic D.J.,Savic D.J.,Savic G.,Lyon K.,Primeaux C.,Sezate S.,Suvorov A.N.,Kenton S.,Lai H.S.,Lin S.P.,Qian Y.,Jia H.G.,Najar F.Z.,Ren Q.,Zhu H.,Song L.,White J.,Yuan X.,Clifton S.W.,Roe B.A.,McLaughlin R.E.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001);"CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III."Deltcheva E.,Chylinski K.,Sharma C.M.,Gonzales K.,Chao Y.,Pirzada Z.A.,Eckert M.R.,Vogel J.,Charpentier E.,Nature 471:602-607(2011);および"A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity."Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)を参照(これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる))。
Cas9およびCas9等価物の例は以下のとおりに提供される;しかしながら、これらの特定例は限定することを意図していない。本開示のプライマー編集因子は、いずれの好適なCas9またはCas9等価物を包含する、いずれの好適なnapDNAbpも使用してもよい。
（i）野生型標準的SpCas9
一態様において、本明細書に記載のプライマー編集因子構築物は、S.pyogenesからの「標準的なSpCas9」ヌクレアーゼを含んでいてもよく、前記ヌクレアーゼは、ゲノム工学のためのツールとして幅広く使用されており、クラス2 CRISPR-Cas系というII型の下位群酵素として分類される。このCas9タンパク質は、2つ別個のヌクレアーゼドメインを含有する、大きなマルチドメインタンパク質である。点突然変異は、一方または両方のヌクレアーゼ活性を無効にしてニッカーゼCas9(nCas9)または不活性型Cas9(dCas9)(夫々、依然として、sgRNAプログラム型のやり方でDNAに結合するその能力は保持する)をもたらすため、Cas9中へ導入され得る。原則として、別のタンパク質またはドメインと融合したとき、Cas9またはそのバリアント(例として、nCas9)は、単に適切なsgRNAとの共発現によって、そのタンパク質に、事実上いずれのDNA配列をも標的にさせ得る。本明細書に使用されるとき、標準的なSpCas9タンパク質は、以下のアミノ酸配列を有する、Streptococcus pyogenesからの野生型タンパク質を指す:
Figure 2022531539000013
Figure 2022531539000014
本明細書に記載のプライム編集因子は、上に提供される野生型Cas9配列と、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有する標準的なSpCas9またはいずれのそのバリアントを包含していてもよい。これらのバリアントは、SwissProt受託番号Q99ZW2エントリーで報告された、知られているいずれの突然変異を包含する、1以上の突然変異を含有するSpCas9バリアントを包含していてもよく、前記突然変異は以下を包含する:
Figure 2022531539000015
本開示において使用されてもよい他の野生型SpCas9配列は、以下を包含する:
Figure 2022531539000016
Figure 2022531539000017
Figure 2022531539000018
Figure 2022531539000019
Figure 2022531539000020
Figure 2022531539000021
本明細書に記載のプライム編集因子は、上のSpCas9配列のいずれも、またはこれと少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するそのいずれのバリアントを包含していてもよい。
（ii）野生型Cas9オルソログ
他の態様において、Cas9タンパク質は、S.pyogenesからの標準的なCas9とは異なる、別の細菌の種からの野生型Cas9オルソログであり得る。例えば、以下のCas9オルソログは、本明細書に記載のプライム編集因子構築物と関係して使用され得る。加えて、下のオルソログのいずれかと少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％の配列同一性を有するいずれのバリアントCas9オルソログもまた、本プライム編集因子とともに使用されてもよい。
Figure 2022531539000022
Figure 2022531539000023
Figure 2022531539000024
Figure 2022531539000025
Figure 2022531539000026
本明細書に記載のプライム編集因子は、上のCas9オルソログ配列のいずれも、またはこれと少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するそれらのいずれのバリアントを包含していてもよい。
napDNAbpは、Cas9などの、いずれの好適なホモログおよび/またはオルソログ、あるいは天然に存在する酵素を包含していてもよい。Cas9ホモログおよび/またはオルソログは、これらに限定されないが、S.pyogenesおよびS.thermophilusを包含する、様々な種において記載されている。好ましくは、Cas部分は、ニッカーゼ(すなわち、標的二本鎖の単鎖のみを切断することが可能である)として構成されており(例として、変異誘発されているか、組換え改変されているか、またはそうでなければ自然から得られたものである)、好適なCas9ヌクレアーゼおよび配列は本開示に基づき当業者に明らかであり、ならびにかかるCas9ヌクレアーゼおよび配列は、Chylinski,Rhun,and Charpentier,"The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems"(2013)RNA Biology 10:5,726-737(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)に開示された生物および遺伝子座からのCas9配列を包含する。いくつかの態様において、Cas9ヌクレアーゼは、不活性な(例として、不活性化された)DNA切断ドメインを有する、つまり、Cas9は、ニッカーゼである。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、表3のバリアントのいずれか1つによって提供されるとおりのCas9タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、上の表中のCas9オルソログのいずれか1つによって提供されるとおりのCas9タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一のアミノ酸配列を含む。
（iii）不活性型(Dead)Cas9バリアント
いくつかの態様において、本明細書に記載のプライム編集因子は、不活性型Cas9、例として、両方のCas9のヌクレアーゼドメイン、つまりRuvCドメイン(非プロトスペーサーDNA鎖を切断する)とHNHドメイン(プロトスペーサーDNA鎖を切断する)とが不活性である1以上の突然変異に起因し、ヌクレアーゼ活性を一切有さない不活性型SpCas9を包含していてもよい。ヌクレアーゼ不活化は、コードされるタンパク質、またはこれと少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するそれらいずれのバリアントの、アミノ酸配列中、1以上の置換および/または欠失をもたらす1以上の突然変異に起因することもある。
本明細書に使用されるとき、用語「dCas9」は、ヌクレアーゼ不活性Cas9もしくはヌクレアーゼ不活性型Cas9、または機能的そのフラグメントを指し、いずれの生物からの天然に存在するいずれのdCas9、天然に存在するいずれのdCas9等価物もしくはその機能的フラグメント、いずれの生物からのいずれのdCas9ホモログ、オルソログ、またはパラログ、および天然に存在するかもしくは改変されたdCas9のいずれの突然変異体またはバリアントを網羅する。用語dCas9は、具体的に限定することを意図しておらず、「dCas9または等価物」と称されることもある。例示のdCas9タンパク質およびdCas9タンパク質を作製するための方法はさらに、本明細書に記載されているか、および/または当該技術分野において記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
他の態様において、dCas9は、Cas9ヌクレアーゼ活性を不活化する1以上の突然変異を有するCas9アミノ酸配列に対応するか、またはこれを一部もしくは全部含む。他の態様において、完全に不活化されたかまたは部的に不活化された内生Cas9ヌクレアーゼ活性(夫々、例として、nCas9またはdCas9)をもたらす、D10AおよびH840A以外の突然変異を有するCas9バリアントが提供される。かかる突然変異は、一例として、Streptococcus pyogenesからのCas9などの野生型配列(NCBI参照配列:NC_017053.1(配列番号1361424))を参照し、D10およびH820での他のアミノ酸置換、またはCas9のヌクレアーゼドメイン内の他の置換(例として、HNHヌクレアーゼサブドメインおよび/またはRuvC1サブドメインにおける置換)を包含する。いくつかの態様において、NCBI参照配列:NC_017053.1(配列番号1361424)と、少なくとも約70％同一の、少なくとも約80％同一の、少なくとも約90％同一の、少なくとも約95％同一の、少なくとも約98％同一の、少なくとも約99％同一の、少なくとも約99.5％同一の、もしくは少なくとも約99.9％同一の、Cas9のバリアントまたはホモログ(例として、Streptococcus pyogenesからのCas9のバリアント(NCBI参照配列:NC_017053.1(配列番号1361424)))が提供される。いくつかの態様において、NC_017053.1(配列番号1361424)より約5アミノ酸、約10アミノ酸、約15アミノ酸、約20アミノ酸、約25アミノ酸、約30アミノ酸、約40アミノ酸、約50アミノ酸、約75アミノ酸、もしくは約100アミノ酸以上短いかまたは長いアミノ酸配列を有するdCas9のバリアント(例として、NCBI参照配列:NC_017053.1(配列番号1361424)のバリアント)が提供される。
一態様において、不活性型Cas9はQ99ZW2の標準的なSpCas9配列に基づいていてもよく、D10A置換およびH810A置換(下線を付された太字)を含む以下の配列か、またはこれと少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有する配列番号1361444のバリアントを有していてもよい:
Figure 2022531539000027
（iv）Cas9ニッカーゼバリアント
一態様において、本明細書に記載のプライム編集因子は、Cas9ニッカーゼを含む。「nCas9」の「Cas9ニッカーゼ」という用語は、二本鎖DNA分子標的中に単鎖破壊を導入することが可能なCas9のバリアントを指す。いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼは、単一の機能的ヌクレアーゼドメインのみを含む。野生型Cas9(例として、標準的なSpCas9)は、2つ別々のヌクレアーゼドメイン、つまり、RuvCドメイン(非プロトスペーサーDNA鎖を切断する)とHNHドメイン(プロトスペーサーDNA鎖を切断する)とを含む。一態様において、Cas9ニッカーゼは、RuvCヌクレアーゼ活性を不活化する突然変異をRuvCドメイン中に含む。例えば、アスパルタート(D)10、ヒスチジン(H)983、アスパルタート(D)986、またはグルタマート(E)762における突然変異は、RuvCヌクレアーゼドメインの機能喪失型突然変異および機能的Cas9ニッカーゼの創出として報告されている(例として、Nishimasu et al.,"Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA, Cell 156(5),935?949(これは参照により本明細書に組み込まれる))。よって、RuvCドメイン中のニッカーゼ突然変異は、D10X、H983X、D986X、またはE762Xを包含し得るが、ここでXは、野生型アミノ酸以外のいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、ニッカーゼは、D10A、of H983A、もしくはD986A、もしくはE762A、またはそれらの組み合わせであり得る。
様々な態様において、Cas9ニッカーゼはRuvCヌクレアーゼドメイン中に突然変異を有し得、以下のアミノ酸配列の1つ、またはこれと少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するそのバリアントを有する。
Figure 2022531539000028
Figure 2022531539000029
Figure 2022531539000030
Figure 2022531539000031
別の態様において、Cas9ニッカーゼは、HNHヌクレアーゼ活性を不活化する突然変異をHNHドメイン中に含む。例えば、ヒスチジン(H)840またはアスパラギン(R)863のおける突然変異は、HNHヌクレアーゼドメインの機能喪失型突然変異および機能的Cas9ニッカーゼの創出として報告されている(例として、Nishimasu et al.,"Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA",Cell 156(5),935?949(これは参照により本明細書に組み込まれる))。よって、HNHドメイン中のニッカーゼ突然変異は、H840XおよびR863Xを包含し得るが、ここでXは、野生型アミノ酸以外のいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、ニッカーゼは、H840AもしくはR863A、またはそれらの組み合わせであり得る。
様々な態様において、Cas9ニッカーゼは、HNHヌクレアーゼドメイン中に突然変異を有し得、以下のアミノ酸配列の1つ、またはこれと少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するそのバリアントを有し得る。
Figure 2022531539000032
Figure 2022531539000033
（v）他のCas9バリアント
不活性型Cas9およびCas9ニッカーゼバリアントの他にも、本明細書に使用されるCas9タンパク質はまた、いずれの参照Cas9タンパク質と、少なくとも約70％同一の、少なくとも約80％同一の、少なくとも約90％同一の、少なくとも約95％同一の、少なくとも約96％同一の、少なくとも約97％同一の、少なくとも約98％同一の、少なくとも約99％同一の、少なくとも約99.5％同一の、または少なくとも約99.9％同一の他の「Cas9バリアント」も包含していてもよく、いずれの野生型Cas9、または突然変異Cas9(例として、不活性型Cas9もしくはCas9ニッカーゼ)、またはCas9のフラグメント、またはCas9の循環置換体、または本明細書に開示のもしくは当該技術分野において知られているCas9の他のバリアントも包含する。いくつかの態様において、Cas9バリアントは、参照Cas9と比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50以上のアミノ酸変化を有していてもよい。いくつかの態様において、Cas9バリアントは、そのフラグメントが野生型Cas9の対応するフラグメントと少なくとも約70％同一、少なくとも約80％同一、少なくとも約90％同一、少なくとも約95％同一、少なくとも約96％同一、少なくとも約97％同一、少なくとも約98％同一、少なくとも約99％同一、少なくとも約99.5％同一、または少なくとも約99.9％同一であるように、参照Cas9のフラグメント(例として、gRNA結合ドメインまたはDNA切断ドメイン)を含む。いくつかの態様において、フラグメントは、対応する野生型Cas9(例として、配列番号1361421)のアミノ酸長の、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％である。
いくつかの態様において、本開示はまた、本明細書に開示されたいずれのCas9タンパク質のフラグメントであって、それらの機能を保持するCas9フラグメントも利用してもよい。いくつかの態様において、Cas9フラグメントは、長さが少なくとも100アミノ酸である。いくつかの態様において、フラグメントは、長さが少なくとも100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、または少なくとも1300アミノ酸である。
様々な態様において、本明細書に開示のプライム編集因子は、以下に記載のとおりのCas9バリアントの1つ、またはいずれの参照Cas9バリアントと少なくとも約70％同一の、少なくとも約80％同一の、少なくとも約90％同一の、少なくとも約95％同一の、少なくとも約96％同一の、少なくとも約97％同一の、少なくとも約98％同一の、少なくとも約99％同一の、少なくとも約99.5％同一の、または少なくとも約99.9％同一の、そのCas9バリアントを含んでいてもよい。
（vi）小形(Small-sized)Cas9バリアント
いくつかの態様において、本明細書に企図されるプライム編集因子は、標準的なSpCas9配列より小さな分子量のCas9タンパク質を包含し得る。いくつかの態様において、より小形のCas9バリアントは、例として、発現ベクター、ナノ粒子、または他の送達手段によって、細胞への送達を容易にさせ得る。ある態様において、より小形のCas9バリアントは、クラス 2 CRISPR-Cas系のII型酵素として分類される酵素を包含し得る。いくつかの態様において、より小形のCas9バリアントは、クラス 2 CRISPR-Cas系のV型酵素として分類される酵素を包含し得る。他の態様において、より小形のCas9バリアントは、クラス 2 CRISPR-Cas系のVI型酵素として分類される酵素を包含し得る。
標準的なSpCas9タンパク質は、長さが1368アミノ酸であり、158キロダルトンの予測分子量を有する。用語「小形Cas9バリアント」は、本明細書に使用されるとき、いずれのCas9バリアント－天然に存在するものか、改変されたものか、またはそれ以外のもの－をも指し、これは、少なくとも1300アミノ酸未満、または少なくとも1290アミノ酸未満、または1280アミノ酸未満、または1270アミノ酸未満、または1260アミノ酸未満、または1250アミノ酸未満、または1240アミノ酸未満、または1230アミノ酸未満、または1220アミノ酸未満、または1210アミノ酸未満、または1200アミノ酸未満、または1190アミノ酸未満、または1180アミノ酸未満、または1170アミノ酸未満、または1160アミノ酸未満、または1150アミノ酸未満、または1140アミノ酸未満、または1130アミノ酸未満、または1120アミノ酸未満、または1110アミノ酸未満、または1100アミノ酸未満、または1050アミノ酸未満、または1000アミノ酸未満、または950アミノ酸未満、または900アミノ酸未満、または850アミノ酸未満、または800アミノ酸未満、または750アミノ酸未満、または700アミノ酸未満、または650アミノ酸未満、または600アミノ酸未満、または550アミノ酸未満、または500アミノ酸未満であるが、少なくとも約400アミノ酸より大きく、かつCas9タンパク質に要される機能を保持する。Cas9バリアントは、クラス2 CRISPR-Cas系のI型、V型、またはVI型酵素として分類されるものを包含し得る。
様々な態様において、本明細書に開示のプライム編集因子は、以下のとおりに記載の小形Cas9バリアントの1つ、またはいずれの参照小形Cas9タンパク質と少なくとも約70％同一の、少なくとも約80％同一の、少なくとも約90％同一の、少なくとも約95％同一の、少なくとも約96％同一の、少なくとも約97％同一の、少なくとも約98％同一の、少なくとも約99％同一の、少なくとも約99.5％同一の、もしくは少なくとも約99.9％同一の、そのCas9バリアントを含んでいてもよい。
Figure 2022531539000034
Figure 2022531539000035
Figure 2022531539000036
（vii）Cas9等価物
いくつかの態様において、本明細書に記載のプライム編集因子は、いずれのCas9等価物も包含し得る。本明細書に使用されるとき、用語「Cas9等価物」は、そのアミノ酸1次配列および/またはその3次元構造が進化論的な観点から異なり得るかおよび/または関連し得ないにも関わらず、本プライム編集因子においてCas9と同じ機能を果たすいずれのnapDNAbpタンパク質も包括する広い用語である。よって、Cas9等価物が、本明細書に記載もしくは網羅される、進化的に関連するいずれのCas9オルソログ、ホモログ、突然変異体、またはバリアントも包含しながら、Cas9と同じかまたは同様の機能を有するように収束進化プロセスを通して進化したとされるタンパク質のみならず、アミノ酸配列および/または3次元構造の点でどの類似性も必ずしも有さないタンパク質もまた網羅する。本明細書に記載のプライム編集因子は、Cas9等価物が収束進化を通して現れたタンパク質に基づき得るにも関わらず、Cas9と同じかまたは同様の機能を提供するであろういずれのCas9等価物も網羅する。実例として、Cas9がCRISPR-Cas系のII型酵素を指す場合、Cas9等価物は、CRISPR-Cas系のV型またはVI型酵素を指し得る。
例えば、Cas12e(CasX)は、報告によるとCas9と同じ機能を有するが、収束進化を通して進化したCas9当量である。よって、Liu et al.,"CasX enzymes comprises a distinct family of RNA-guided genome editors,"Nature,2019,Vol.566:218-223に記載のCas12e(CasX)タンパク質は、本明細書に記載のプライム編集因子とともに使用されることが企図される。加えて、Cas12e(CasX)のいずれのバリアントまたは修飾も考えられ、本開示の範囲内にある。
Cas9は、多種多様の種において進化した細菌の酵素である。しかしながら、本明細書に企図されるCas9等価物はまた、細菌とは異なる単細胞原核微生物の領域およびその微生物界を構成する古細菌から得られたものであってもよい。
いくつかの態様において、Cas9等価物は、例えば、Burstein et al.,"New CRISPR?Cas systems from uncultivated microbes."Cell Res.2017 Feb 21.doi:10.1038/cr.2017.21(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)に記載される、Cas12e(CasX)またはCas12d(CasY)を指してもよい。ゲノム分解メタゲノム解析(genome-resolved metagenomics)を使用して、古細菌生物領域(archaeal domain of life)において最初に報告されたCas9を包含する、数多のCRISPR-Cas系が同定された。この多岐のCas9タンパク質が、ほとんど研究されていないナノ古細菌から、活性CRISPR-Cas系の一部として見出された。細菌において、これまでに未知の2つの系、CRISPR-Cas12eおよびCRISPR-Cas12dが発見され、これらはこれまでに発見された最もコンパクトな系の一員(among)である。いくつかの態様において、Cas9は、Cas12e、またはCas12eのバリアントを指す。いくつかの態様において、Cas9は、Cas12d、またはCas12dのバリアントを指す。RNAにガイドされる他のDNA結合タンパク質も核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)として使用されてもよく、かつ本開示の範囲内にあることは解されるはずである。またLiu et al.,"CasX enzymes comprises a distinct family of RNA-guided genome editors,"Nature,2019,Vol.566:218-223も参照。これらのCas9等価物のいずれも企図される。
いくつかの態様において、Cas9等価物は、天然に存在するCas12e(CasX)もしくはCas12d(CasY)タンパク質と、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、napDNAbpは、天然に存在するCas12e(CasX)またはCas12d(CasY)タンパク質である。いくつかの態様において、napDNAbpは、野生型Cas部分もしくは本明細書に提供されるいずれのCas部分と、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一のアミノ酸配列を含む。
様々な態様において、核酸プログラム型DNA結合タンパク質は、限定せずに、Cas9(例として、dCas9およびnCas9)、Cas12e(CasX)、Cas12d(CasY)、Cas12a(Cpf1)、Cas12b1(C2c1)、Cas13a(C2c2)、Cas12c(C2c3)、アルゴノート、ならびにCas12b1を包含する。Cas9とは異なるPAM特異性を有する核酸プログラム型DNA結合タンパク質の1つの例は、PrevotellaおよびFrancisella 1からの、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(すなわち、Cas12a(Cpf1))である。Cas9と同様、Cas12a(Cpf1)もまた、クラス2 CRISPRエフェクターであるが、II型の下位群よりむしろ、V型の下位群酵素のメンバーである。Cas12a(Cpf1)は、Cas9とは別の特色をもつ堅固なDNA干渉を媒介することが示されている。Cas12a(Cpf1)は、racrRNAを欠く、RNAにガイドされる単一のエンドヌクレアーゼであって、Tリッチなプロトスペーサー隣接モチーフ(TTN、TTTN、またはYTN)を利用する。その上、Cpf1は、互い違いのDNA二本鎖破壊を介してDNAを切断する。16のCpf1ファミリータンパク質のうち、AcidaminococcusおよびLachnospiraceaeからの2つの酵素は、ヒト細胞において効率的なゲノム編集活性を有することが示されている。Cpf1タンパク質は当該技術分野において知られており、これまでに、例えばYamano et al.,"Crystal structure of Cpf1 in complex with guide RNA and target DNA."Cell(165)2016,p.949-962(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
更なる他の態様において、Casタンパク質は、いずれのCRISPR関連タンパク質も包含していてもよく、これらに限定されないが、Cas12a、Cas12b1、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(またCsn1およびCsx12としても知られている)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、それらのホモログ、またはそれらの修飾バージョンも包含し、好ましくはニッカーゼ突然変異(例として、配列番号1361421の野生型Cas9ポリペプチドのD10A突然変異に対応する突然変異)を含む。
様々な他の態様において、napDNAbpは、以下のタンパク質のいずれでもあり得る:Cas9、Cas12a(Cpf1)、Cas12e(CasX)、Cas12d(CasY)、Cas12b1(C2c1)、Cas13a(C2c2)、Cas12c(C2c3)、GeoCas9、CjCas9、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Cas14、Csn2、xCas9、SpCas9-NG、循環置換されたCas9、もしくはアルゴノート(Ago)ドメイン、またはそのバリアント。
例示のCas9等価タンパク質配列は、以下を包含し得る:
Figure 2022531539000037
Figure 2022531539000038
Figure 2022531539000039
本明細書に記載のプライム編集因子はまた、ガイドヌクレオチド配列－プログラム型DNA結合タンパク質ドメインとして使用されてもよいCas12a/Cpf1(dCpf1)バリアントも含んでいてよい。Cas12a/Cpf1タンパク質は、Cas9のRuvCドメインと同様であるがHNHエンドヌクレアーゼドメインは有さないRuvC様エンドヌクレアーゼドメインを有し、Cpf1のN末は、Cas9のアルファらせん認識ローブ(lobe)を有さない。Cpf1のRuvC様ドメインが両DNA鎖の切断を担い、およびRuvC様ドメインの不活化がCpf1ヌクレアーゼ活性を不活化させることは、Zetsche et al.,Cell,163,759?771,2015(これは参照により本明細書に組み込まれる)に示された。本明細書に記載のプライム編集因子はまた、ガイドヌクレオチド配列－プログラム型DNA結合タンパク質ドメインとして使用されてもよいCas12a(Cpf1)(dCpf1)バリアントも含んでいてよい。Cas12a/Cpf1タンパク質は、Cas9のRuvCドメインと同様であるがHNHエンドヌクレアーゼドメインは有さないRuvC様エンドヌクレアーゼドメインを有し、Cas12a(Cpf1)のN末は、Cas9のアルファらせん認識ローブを有さない。Cas12a(Cpf1のRuvC様ドメインが両DNA鎖の切断を担い、およびRuvC様ドメインの不活化がCas12a(Cpf1)ヌクレアーゼ活性を不活化させることは、Zetsche et al.,Cell,163,759?771,2015(これは参照により本明細書に組み込まれる)に示された。
いくつかの態様において、napDNAbpは、微生物CRISPR-Cas系の単一エフェクターである。微生物CRISPR-Cas系の単一エフェクターは、限定せずに、Cas9、Cas12a(Cpf1)、Cas12b1(C2c1)、Cas13a(C2c2)、およびCas12c(C2c3)を包含する。典型的には、微生物CRISPR-Cas系は、クラス1系およびクラス2系に分けられる。クラス1系がマルチサブユニットエフェクター複合体を有する一方、クラス2系は単一タンパク質エフェクターを有する。例えば、Cas9およびCas12a(Cpf1)は、クラス2エフェクターである。Cas9およびCas12a(Cpf1)に加えて、3つ別個のクラス2 CRISPR-Cas系(Cas12b1、Cas13a、およびCas12c)も、Shmakov et al.,"Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems,"Mol.Cell,2015 Nov 5;60(3):385?397(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)によって記載されている。
系Cas12b1およびCas12cの2つのエフェクターは、Cas12aに関するRuvC様エンドヌクレアーゼドメインを含有する。第3系であるCas13aは、2つの予測HEPN RNaseドメインをもつエフェクターを含有する。成熟したCRISPR RNAの産生は、Cas12b1によるCRISPR RNAの産生とは違って、tracrRNAに依存しない。Cas12b1は、DNA切断のためにCRISPR RNAとtracrRNAとの両方に依存する。細菌のCas13aは、CRISPR RNA成熟のために、そのRNA活性化単鎖RNA分解活性とは別に、ユニークなRNase活性を所有することが示されている。これらのRNase機能は互いに異なり、Cas12aのCRISPR RNAプロセシング挙動とも異なる。例として、East-Seletsky,et al.,"Two distinct RNase activities of CRISPR-Cas13a enable guide-RNA processing and RNA detection",Nature,2016 Oct 13;538(7624):270-273(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)を参照。Leptotrichia shahiiのCas13aのin vitroでの生化学的分析は、Cas13aが単一CRISPR RNAによってガイドされ、相補的なプロトスペーサーを持つssRNA標的を切断するようプログラムされ得ることを示している。保存された2つのHEPNドメイン中の触媒残基は、切断を媒介する。触媒残基中の突然変異は、触媒的に不活性なRNA結合タンパク質を生成する。例として、Abudayyeh et al.,"C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector",Science,2016 Aug 5;353(6299)(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)を参照。
Alicyclobaccillus acidoterrastris Cas12b1(AacC2c1)の結晶構造は、キメラの単一分子ガイドRNA(sgRNA)と複合していることが報告された。例として、Liu et al.,"C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism",Mol.Cell,2017 Jan 19;65(2):310-322(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)を参照。結晶構造はまた、3元複合体として標的DNAへ結合された、Alicyclobacillus acidoterrestris C2c1においても報告されている。例として、Yang et al.,"PAM-dependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2C1 CRISPR-Cas endonuclease",Cell,2016 Dec 15;167(7):1814-1828(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)を参照。標的DNA鎖と非標的DNA鎖との両方との、AacC2cの触媒能のある(catalytically competent)立体配座は、独立して単一RuvC触媒ポケット内に位置付けられたまま捕捉されており、C2c1媒介切断によって、標的DNAの互い違いの7ヌクレオチド破壊がもたらされる。C2c1 3元複合体とこれまでに同定されたCas9およびCpf1の対応物との間での構造上の比較によって、CRISPR-Cas9系によって使用される機序の多様性が実証される。
いくつかの態様において、napDNAbpは、C2c1、C2c2、またはC2c3タンパク質であってもよい。いくつかの態様において、napDNAbpは、C2c1タンパク質である。いくつかの態様において、napDNAbpは、Cas13aタンパク質である。いくつかの態様において、napDNAbpは、Cas12cタンパク質である。いくつかの態様において、napDNAbpは、天然に存在するCas12b1(C2c1)、Cas13a(C2c2)、もしくはCas12c(C2c3)タンパク質と、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、napDNAbpは、天然に存在するCas12b1(C2c1)、Cas13a(C2c2)、またはCas12c(C2c3)タンパク質である。
（viii）Cas9循環置換体
様々な態様において、本明細書に開示のプライム編集因子は、Cas9の循環置換体を含んでいてもよい。
用語「循環置換されたCas9」またはCas9の「循環置換体」または「CP-Cas9」)は、いずれのCas9タンパク質、またはそのバリアント(循環置換体バリアントとして存在しているか、もしくは循環置換体バリアントとして改変するよう修飾されている)も指し、前記循環置換体バリアントは、Cas9タンパク質(例として、野生型Cas9タンパク質)のN末端およびC末端が局所的に再配列されたものを意味する。循環置換されたかかるCas9タンパク質、またはそれらのバリアントは、ガイドRNA(gRNA)と複合体化されたときにDNAへの結合能を保持する。Oakes et al.,"Protein Engineering of Cas9 for enhanced function,"Methods Enzymol,2014, 546:491?511およびOakes et al.,"CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification,"Cell,January 10,2019,176:254-267(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)を参照。本開示は、これまでに知られているいずれのCP-Cas9も企図しているか、または結果として得られた循環置換タンパク質がガイドRNA(gRNA)と複合体化されたときにDNAへの結合能を保持する限り、新しいCP-Cas9を使用する。
本明細書に記載のいずれのCas9のタンパク質は、いずれのそのバリアント、オルソログ、または天然に存在するCas9もしくは等価物も包含するが、循環置換体バリアントとして再構成されていてもよい。
様々な態様において、Cas9の循環置換体は、以下の構造を有していてもよい:
N末端-[元のC末端]-[任意のリンカー]-[元のN末端]-C末端。
例として、本開示は、標準的なS.pyogenes Cas9(UniProtKB-Q99ZW2(CAS9_STRP1)の1368アミノ酸(ナンバリングは、配列番号1361421におけるアミノ酸位置に基づく))の以下の循環置換体を企図する:
N末端-[1268～1368]-[任意のリンカー]-[1～1267]-C末端;
N末端-[1168～1368]-[任意のリンカー]-[1～1167]-C末端;
N末端-[1068～1368]-[任意のリンカー]-[1～1067]-C末端;
N末端-[968～1368]-[任意のリンカー]-[1～967]-C末端;
N末端-[868～1368]-[任意のリンカー]-[1～867]-C末端;
N末端-[768～1368]-[任意のリンカー]-[1～767]-C末端;
N末端-[668～1368]-[任意のリンカー]-[1～667]-C末端;
N末端-[568～1368]-[任意のリンカー]-[1～567]-C末端;
N末端-[468～1368]-[任意のリンカー]-[1～467]-C末端;
N末端-[368～1368]-[任意のリンカー]-[1～367]-C末端;
N末端-[268～1368]-[任意のリンカー]-[1～267]-C末端;
N末端-[168～1368]-[任意のリンカー]-[1～167]-C末端;
N末端-[68～1368]-[任意のリンカー]-[1～67]-C末端;もしくは
N末端-[10～1368]-[任意のリンカー]-[1～9]-C末端、または他のCas9タンパク質(他のCas9オルソログ、バリアント等々を包含する)の対応する循環置換体。
具体的な態様において、循環置換Cas9は、以下の構造(S.pyogenes Cas9(UniProtKB-Q99ZW2(CAS9_STRP1)の1368アミノ酸に基づく(ナンバリングは、配列番号1361421におけるアミノ酸位置に基づく)を有する:
N末端-[102～1368]-[任意のリンカー]-[1～101]-C末端;
N末端-[1028～1368]-[任意のリンカー]-[1～1027]-C末端;
N末端-[1041～1368]-[任意のリンカー]-[1～1043]-C末端;
N末端-[1249～1368]-[任意のリンカー]-[1～1248]-C末端;もしくは
N末端-[1300～1368]-[任意のリンカー]-[1～1299]-C末端、または他のCas9タンパク質(他のCas9オルソログ、バリアント等々を包含する)の対応する循環置換体。
更なる他の態様において、循環置換Cas9は、以下の構造(S.pyogenes Cas9(UniProtKB-Q99ZW2(CAS9_STRP1)の1368アミノ酸に基づく(ナンバリングは、配列番号1361421におけるアミノ酸位置に基づく)を有する:
N末端-[103～1368]-[任意のリンカー]-[1～102]-C末端;
N末端-[1029～1368]-[任意のリンカー]-[1～1028]-C末端;
N末端-[1042～1368]-[任意のリンカー]-[1～1041]-C末端;
N末端-[1250～1368]-[任意のリンカー]-[1～1249]-C末端;もしくは
N末端-[1301～1368]-[任意のリンカー]-[1～1300]-C末端、または他のCas9タンパク質(including 他のCas9 オルソログ、バリアント等々を包含する)の対応する循環置換体。
いくつかの態様において、循環置換体は、直接的にかまたはアミノ酸リンカーなどのリンカーを使用するかのいずれかによって、Cas9のC末端フラグメントをCas9のN末端フラグメントへ連結することによって形成され得る。いくつかの態様において、C末端フラグメントは、Cas9のアミノ酸のC末端95％以上(例として、アミノ酸約1300～1368)、またはCas9(例として、配列番号1361421～1361484および1361593～1361596のいずれか1つ)のC末端90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、もしくは5％以上に対応してもよい。N末端部分は、Cas9のアミノ酸のN末端95％以上(例として、アミノ酸約1～1300)、またはCas9の(例として、配列番号1361421の)N末端90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、もしくは5％以上に対応してもよい。
いくつかの態様において、循環置換体は、直接的にかまたはアミノ酸リンカーなどのリンカーを使用するかのいずれかによって、Cas9のN末端フラグメントをCas9のC末端フラグメントへ連結することによって形成され得る。いくつかの態様において、N末端へ再配列されたC末端フラグメントは、Cas9のアミノ酸のC末端30％以下(例として、配列番号1361421のアミノ酸1012～1368)を包含するか、またはこれに対応する。いくつかの態様において、N末端へ再配列されたC末端フラグメントは、Cas9(例として、配列番号1361421のCas9)のアミノ酸のC末端30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、もしくは1％を包含するか、またはこれに対応する。いくつかの態様において、N末端へ再配列されたC末端フラグメントは、Cas9(例として、配列番号1361421のCas9)のC末端410残基以下を包含するか、またはこれに対応する。いくつかの態様において、N末端へ再配列されたC末端部分は、Cas9(例として、配列番号1361421のCas9)のC末端410、400、390、380、370、360、350、340、330、320、310、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、もしくは10残基を包含するか、またはこれに対応する。いくつかの態様において、N末端へ再配列されたC末端部分は、Cas9(例として、配列番号1361421のCas9)のC末端357、341、328、120、もしくは69残基を包含するか、またはこれに対応する。
他の態様において、循環置換Cas9バリアントは、配列番号1361421のS.pyogenes Cas9に基づくCas9 1次構造の形態上の再配置として、以下の方法に基づき定義されてもよい:(a)Cas9 1次構造の内側のアミノ酸残基に対応する循環置換体(CP)部位を選択すること(これによって元のタンパク質が二分される:N末端領域およびC末端領域);(b)Cas9タンパク質配列を(例として、遺伝子工学技法によって)、元のC末端領域(CP部位アミノ酸を含む)を移動させて元のN末端領域より前に置くことによって修飾すること(これによって、今やCP部位アミノ酸残基で始まるCas9タンパク質の新しいN末端が形成される)。CP部位は、例えば、らせん-IIドメイン、RuvCIIIドメイン、またはCTDドメインを包含する、Cas9タンパク質のいずれのドメインにも位置付けられ得る。例えば、CP部位は、元のアミノ酸残基181、199、230、270、310、1010、1016、1023、1029、1041、1247、1249、または1282にて位置付けられてもよい(配列番号1361421のS.pyogenes Cas9に対して)。よって、再度N末端へ位置付けられると、元のアミノ酸181、199、230、270、310、1010、1016、1023、1029、1041、1247、1249、または1282は、新しいN末端アミノ酸になるであろう。これらのCP-Cas9タンパク質の命名法は夫々、Cas9-CP181、Cas9-CP199、Cas9-CP230、Cas9-CP270、Cas9-CP310、Cas9-CP1010、Cas9-CP1016、Cas9-CP1023、Cas9-CP1029、Cas9-CP1041、Cas9-CP1247、Cas9-CP1249、およびCas9-CP1282と称されてもよい。この記載は、CPバリアントを配列番号1361421から作製することに限定される意図はないが、CPバリアントをいずれのCas9配列においても、これらの位置に対応するCP部位または他のCP部位全体のいずれかにて作製するよう実践されてもよい。この記載は、いずれにしても特定のCP部位に限定する意図はない。事実上いずれのCP部位も、CP-Cas9バリアントを形成するのに使用されてもよい。
例示のCP-Cas9アミノ酸配列は、配列番号1361421のCas9に基づき、下に提供されるが、ここでリンカー配列は下線によって示され、任意のメチオニン(M)残基は太字で示される。本開示が、リンカー配列を包含していないかまたは種々のリンカー配列を包含しているCP-Cas9配列を提供することは解されるはずである。CP-Cas9配列が配列番号1361421以外のCas9配列に基づいていてもよいこと、および本明細書に提供されるいずれの例も限定することを意図していないことは、解されるはずである。
Figure 2022531539000040
Figure 2022531539000041
Figure 2022531539000042
Cas9循環置換体は、本明細書に記載のプライム編集構築物に有用であってもよい。配列番号1361421のCas9に基づく、Cas9の例示のC末端フラグメントは下に提供されるが、これはCas9のN末端へ再配列されていてもよい。Cas9のかかるC末端フラグメントが例示であって、限定することを意図していないことは解されるはずである。
Figure 2022531539000043
（ix）修飾されたPAM特異性をもつCas9バリアント
本開示のプライム編集因子はまた、修飾されたPAM特異性をもつCas9バリアントも含んでいてよい。本開示のいくつかの側面は、標準的なPAM(5'-NGG-3'、ここでNは、A、C、G、またはTである)をその3'末にて含まない標的配列に対して活性を呈するCas9タンパク質を提供する。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、その3'末にて5'-NGG-3'PAM配列を含む標的配列に対して活性を呈する。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、その3'末にて5'-NNG-3'PAM配列を含む標的配列に対して活性を呈する。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、その3'末にて5'-NNA-3'PAM配列を含む標的配列に対して活性を呈する。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、その3'末にて5'-NNC-3'PAM配列を含む標的配列に対して活性を呈する。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、その3'末にて5'-NNT-3'PAM配列を含む標的配列に対して活性を呈する。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、その3'末にて5'-NGT-3'PAM配列を含む標的配列に対して活性を呈する。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、その3'末にて5'-NGA-3'PAM配列を含む標的配列に対して活性を呈する。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、その3'末にて5'-NGC-3'PAM配列を含む標的配列に対して活性を呈する。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、その3'末にて5'-NAA-3'PAM配列を含む標的配列に対して活性を呈する。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、その3'末にて5'-NAC-3'PAM配列を含む標的配列に対して活性を呈する。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、その3'末にて5'-NAT-3'PAM配列を含む標的配列に対して活性を呈する。更なる他の態様において、Cas9タンパク質は、その3'末にて5'-NAG-3'PAM配列を含む標的配列に対して活性を呈する。
(例として、A262T)第1アミノ酸残基(例として、A)から第2アミノ酸残基(例として、T)への、本明細書に記載のアミノ酸突然変異のいずれもまた、第1アミノ酸残基から(例として、保存された)第2アミノ酸残基と同様のアミノ酸残基への突然変異も包含することは解されるはずである。例えば、疎水性側鎖(例として、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファン)をもつアミノ酸の突然変異は、異なる疎水性側鎖(例として、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファン)をもつ第2アミノ酸への突然変異であってもよい。例えば、アラニンのトレオニンへの突然変異(例として、A262T突然変異)はまた、アラニンから、トレオニンとサイズおよび化学特性が同様のアミノ酸(例えば、セリン)への突然変異であってもよい。別の例として、正に帯電した側鎖(例として、アルギニン、ヒスチジン、またはリシン)をもつアミノ酸の突然変異は、正に帯電した異なる側鎖(例として、アルギニン、ヒスチジン、またはリシン)をもつ第2アミノ酸への突然変異であってもよい。別の例として、極性側鎖(例として、セリン、トレオニン、アスパラギン、またはグルタミン)をもつアミノ酸の突然変異は、異なる極性側鎖(例として、セリン、トレオニン、アスパラギン、またはグルタミン)をもつ第2アミノ酸への突然変異であってもよい。追加の同様のアミノ酸対は、これらに限定されないが、以下を包含する:フェニルアラニンおよびチロシン;アスパラギンおよびグルタミン;メチオニンおよびシステイン;アスパラギン酸およびグルタミン酸;ならびにアルギニンおよびリシン。当業者は、かかる保存アミノ酸置換がおそらくタンパク質構造に対して些細な効果を有するであろうこと、および機能を損なうことなく十分耐性がありそうであることを認識するであろう。いくつかの態様において、あるアミノ酸からトレオニンへの、本明細書に提供されるアミノ酸突然変異のいずれかが、セリンに対するアミノ酸突然変異であってもよい。いくつかの態様において、あるアミノ酸からアルギニンへの、本明細書に提供されるアミノ酸突然変異のいずれかが、リシンに対するアミノ酸突然変異であってもよい。いくつかの態様において、あるアミノ酸からイソロイシンへの、本明細書に提供されるアミノ酸突然変異のいずれかが、アラニン、バリン、メチオニン、またはロイシンに対するアミノ酸突然変異であってもよい。いくつかの態様において、あるアミノ酸からリシンへの、本明細書に提供されるアミノ酸突然変異のいずれかが、アルギニンに対するアミノ酸突然変異であってもよい。いくつかの態様において、あるアミノ酸からアスパラギン酸への、本明細書に提供されるアミノ酸突然変異のいずれかが、グルタミン酸またはアスパラギンに対するアミノ酸突然変異であってもよい。いくつかの態様において、あるアミノ酸からバリンへの、本明細書に提供されるアミノ酸突然変異のいずれかが、アラニン、イソロイシン、メチオニン、またはロイシンに対するアミノ酸突然変異であってもよい。いくつかの態様において、あるアミノ酸からグリシンへの、本明細書に提供されるアミノ酸突然変異のいずれかが、アラニンに対するアミノ酸突然変異であってもよい。しかしながら、追加の保存されたアミノ酸残基が当業者によって認識されるであろうこと、および他の保存されたアミノ酸残基へのアミノ酸突然変異のいずれもまた本開示の範囲内にあることは、解されるはずである。
いくつかの態様において、本開示は、本明細書の配列表の節に開示されたCas9バリアントのいずれも利用してもよい。
SpCas9 H840A
DKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(配列番号1361593)

Cas9-NG_H840A
DKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESIRPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFVSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASARFLQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPRAFKYFDTTIDRKVYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(配列番号1361595)

KKH-Cas9 N580A
GKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEEASKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRKLINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYKNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPHIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG(配列番号1361596)
いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、5'-NAA-3'PAM配列をその3'末にて含む標的配列に対して活性を呈する突然変異の組み合わせを含む。いくつかの態様において、突然変異の組み合わせは、表1中に挙げられたクローンのいずれか1つに存在する。いくつかの態様において、突然変異の組み合わせは、表1中に挙げられたクローンの保存的な突然変異である。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、表X中に挙げられたCas9クローンのいずれか1つの突然変異の組み合わせを含む。
表X:NAA PAMクローン
Figure 2022531539000044
Figure 2022531539000045
いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、表1のバリアントのいずれか1つによって提供されるとおりのCas9タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、表Xのバリアントのいずれか1つによって提供されるとおりのCas9タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、配列番号1361421によって提供されるとおりのStreptococcus pyogenes Cas9と比較して、標準的なPAM(5'-NGG-3')をその3'末にて含まない標的配列に対して増大した活性を呈する。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、配列番号1361421によって提供されるとおりのStreptococcus pyogenes Cas9の同じ標的配列に対する活性と比較して、標準的なPAM配列(5'-NGG-3')に直接的には隣接しない3'末を有する標的配列に対し少なくとも5倍増大した活性を呈する。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、配列番号1361421によって提供されるとおりのStreptococcus pyogenes Cas9の同じ標的配列に対する活性と比較して、標準的なPAM配列(5'-NGG-3')に直接的には隣接しない3'末を有する標的配列に対し、少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1,000倍、少なくとも5,000倍、少なくとも10,000倍、少なくとも50,000倍、少なくとも100,000倍、少なくとも500,000倍、または少なくとも1,000,000倍増大した活性を呈する。いくつかの態様において、標的配列の3'末は、AAA、GAA、CAA、またはTAA配列に直接隣接する。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、5'-NAC-3' PAM配列をその3'末にて含む標的配列に対し活性を呈する突然変異の組み合わせを含む。いくつかの態様において、突然変異の組み合わせは、表2中に挙げられたクローンのいずれか1つに存在する。いくつかの態様において、突然変異の組み合わせは、表2中に挙げられたクローンの保存的な突然変異である。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、表Y中に挙げられたCas9クローンのいずれか1つの突然変異の組み合わせを含む。
表Y:NAC PAMクローン
Figure 2022531539000046
Figure 2022531539000047
いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、表2のバリアントのいずれか1つによって提供されるとおりのCas9タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、表Yのバリアントのいずれか1つによって提供されるとおりのCas9タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、配列番号1361421によって提供されるとおりのStreptococcus pyogenes Cas9と比較して、標準的なPAM(5'-NGG-3')をその3'末にて含まない標的配列に対して増大した活性を呈する。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、配列番号1361421によって提供されるとおりのStreptococcus pyogenes Cas9の同じ標的配列に対する活性と比較して、標準的なPAM配列(5'-NGG-3')に直接的には隣接しない3'末を有する標的配列に対し少なくとも5倍増大した活性を呈する。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、配列番号1361421によって提供されるとおりのStreptococcus pyogenes Cas9の同じ標的配列に対する活性と比較して、標準的なPAM配列(5'-NGG-3')に直接的には隣接しない3'末を有する標的配列に対し、少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1,000倍、少なくとも5,000倍、少なくとも10,000倍、少なくとも50,000倍、少なくとも100,000倍、少なくとも500,000倍、または少なくとも1,000,000倍増大した活性を呈する。いくつかの態様において、標的配列の3'末は、AAC、GAC、CAC、またはTAC配列に直接隣接する。
いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、5'-NAT-3' PAM配列をその3'末にて含む標的配列に対し活性を呈する突然変異の組み合わせを含む。いくつかの態様において、突然変異の組み合わせは、表3中に挙げられたクローンのいずれか1つに存在する。いくつかの態様において、突然変異の組み合わせは、表3中に挙げられたクローンの保存的な突然変異である。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、表Z中に挙げられたCas9クローンのいずれか1つの突然変異の組み合わせを含む。
表Z:NAT PAMクローン
Figure 2022531539000048
Figure 2022531539000049
本開示のプライム編集因子に関係して使用され得る様々なnapDNAbpの上の記載は、いずれにしても限定することを意図していない。プライム編集因子は、知られているか、あるいは指向進化プロセスもしくは別様な変異誘発プロセスを通して作製または進化された、標準的なSpCas9、またはいずれのオルソログCas9タンパク質、またはいずれのバリアントCas9タンパク質－Cas9のいずれの天然に存在するバリアント、突然変異体、または別様に改変されたバージョンを包含する－を含んでいてもよい。様々な態様において、Cas9またはCas9バリアントは、ニッカーゼ活性を有する、すなわち、標的DNA配列の鎖のみを切断する。他の態様において、Cas9またはCas9バリアントは、不活性なヌクレアーゼを有する、すなわち、「不活型(dead)」Cas9タンパク質である。使用されてもよい他のバリアントCas9タンパク質は、標準的なSpCas9より小さい分子量を有するもの(例として、より容易な送達のため)、または修飾もしくは再配列一次アミノ酸構造を有するもの(例として、循環置換形式)である。本明細書に記載のプライム編集因子はまた、収束進化の結果であるCas12a(Cpf1)およびCas12b1タンパク質を包含する、Cas9等価物も含んでいてよい。本明細書に使用されるnapDNAbp(例として、SpCas9、Cas9バリアント、またはCas9等価物)はまた、それらのPAM特異性を変更/増強する様々な修飾も含有していてもよい。最後に、本出願は、参照Cas9配列(参照SpCas9の標準的な配列もしくは参照Cas9の等価物(例として、Cas12a(Cpf1))など)と、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.9％の配列同一性を有する、いずれのCas9、Cas9バリアント、あるいはCas9等価物を企図する。
加えて、いずれの利用可能な方法は、バリアントまたは突然変異Cas9タンパク質を得るかまたは構築するために利用されてもよい。用語「突然変異」は、本明細書に使用されるとき、配列(例として、核酸配列もしくはアミノ酸配列)内のある残基の別の残基との置換、または配列内の1以上の残基の欠失もしくは挿入を指す。突然変異は典型的には、元の残基を、これに続き配列内の残基の位置を同定することによること、および新しく置換された残基の同定によることが、本明細書に記載されている。本明細書に提供されるアミノ酸置換(突然変異)を作製するための様々な方法は当該技術分野において周知であって、例えば、Green and Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012))によって提供されている。突然変異は、一塩基多型、微細重複(microduplication)領域、インデル、および逆位などの様々なカテゴリーを包含し得、いずれにしても限定することは意図していない。突然変異は、タンパク質活性を低減または無効する突然変異の正常な結果である「機能喪失型」突然変異を包含し得る。ヘテロ接合体において、第2染色体のコピーが、完全に機能的なタンパク質をコードする遺伝子の未突然変異バージョン(この存在によって突然変異の効果が補われる)を持つことから、ほとんどの機能喪失型突然変異は潜性である。突然変異はまた、タンパク質または細胞に対して正常でない活性(これがなければ正常な状態では存在しない)を付与する「機能獲得型」突然変異も網羅する。多くの機能獲得型突然変異は、コード領域中よりむしろ調節配列中にあり、したがって、数多の因果関係を有し得る。例えば、突然変異は、1以上の遺伝子が不適切な組織中で発現されることへ繋がり得、これらの組織は通常欠如している機能を獲得する。それらの性質のせいで、機能獲得型突然変異は大抵、顕性である。
突然変異は、部位特異的変異誘発を使用して参照Cas9タンパク質中へ導入され得る。当該技術分野において知られている部位特異的変異誘発の古くからある方法は、突然変異させるべき配列の、ベクター(M13バクテリオファージベクターなど)中へのサブクローニングに依存し、これによって単鎖DNA鋳型の単離が可能になる。これらの方法において、変異誘発プライマー(すなわち、突然変異させるべき部位とアニールすることが可能であるが、突然変異させるべき部位にてミスマッチした1以上のヌクレオチドを担持するプライマー)を単鎖鋳型とアニールさせ、次いで変異誘発プライマーの3'末から開始して鋳型の相補体を重合する。その結果得られた二重鎖は次いで宿主細菌中へ形質転換され、溶菌斑は所望の突然変異に対してスクリーニングされる。近年になって、部位特異的変異誘発は、単鎖鋳型を要さないという利点を有するPCR方法論に採用されている。加えて、サブクローニングを要さない方法も開発されている。PCRベースの部位特異的変異誘発が実施されたときに数種の問題点を考慮しなければならない。第1に、これらの方法において、ポリメラーゼによって導入される望ましくない突然変異の拡大を防止するために、PCRサイクル数を低減させることが所望される。第2に、反応にとどまっている、突然変異していない親分子の数を低減させるために、選択を採用しなければならない。第3に、単一のPCRプライマーセットの使用を可能にするために、長さが伸長される(extended-length)PCR法が好ましい。および第4に、いくつかの耐熱性ポリメラーゼの鋳型非依存性の末端伸長活性のせいで、PCRによって生成された突然変異産物の平滑端ライゲーションに先立つ手順中へ、末端ポリッシング(end-polishing)ステップを組み込むことがしばしば必要となる。
突然変異はまた、ファージアシスト(phage-assisted)連続進化(PACE)またはファージアシスト非連続進化(PANCE)などの指向進化プロセスによっても導入されてもよい。用語「ファージアシスト連続進化(PACE)」は、本明細書に使用されるとき、ファージをウイルスベクターとして採用する連続進化を指す。PACE技術の一般の概念は、例えば、2009年9月8日に出願された国際PCT出願PCT/US2009/056194(2010年3月11日にWO2010/028347として公開された);2011年12月22日に出願された国際PCT出願PCT/US2011/066747(2012年6月28日にWO2012/088381として公開された);米国出願の、2015年5月5日に発行された米国特許第9,023,594;2015年1月20日に出願された国際PCT出願PCT/US2015/012022(2015年9月11日にWO2015/134121として公開された);および2016年4月15日に出願された国際PCT出願PCT/US2016/027795(2016年10月20日にWO2016/168631として公開された)(これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。エラーを起こしやすい逆転写酵素もまたファージアシスト非連続進化(PANCE)」によって得られてもよく、これは本明細書に使用されるときファージをウイルスベクターとして採用する非連続進化を指す。PANCEは、進化させるべき着目遺伝子を含有する「選択ファージ」(SP)を進化させる、新たなE.coli宿主細胞にわたって連続的フラスコ移動(serial flask transfers)を使用する、迅速なin vivo指向進化のための簡易技法であって、これによって、SP中に含有される遺伝子が絶えず進化する間ずっと、遺伝子が宿主E.coli内部に持続して保持され得る。連続的フラスコ移動は長いこと微生物の実験室進化のために幅広く利用しやすいアプローチとして役立っていたが、近年になって類似のアプローチがバクテリオファージ進化のために開発された。PANCE系は、PACE系より低いストリンジェンシー(stringency)を特色とする。
Cas9またはCas9等価物に関する上記参考文献のいずれも、それら全体が参照されることにより本明細書に組み込まれる(まだそのように規定されていない場合も)。
いくつかの態様において、napDNAbpは、標準的な(NGG)PAM配列を要さない核酸プログラム型DNA結合タンパク質である。いくつかの態様において、napDNAbpは、アルゴノートタンパク質である。かかる核酸プログラム型DNA結合タンパク質の一例は、Natronobacterium gregoryi(NgAgo)からのアルゴノートタンパク質である。NgAgoは、ssDNAにガイドされるエンドヌクレアーゼである。NgAgoは、～24ヌクレオチド(gDNA)の5'リン酸化ssDNAに結合してこれをその標的部位までガイドし、gDNA部位にてDNA二本鎖破壊をするであろう。Cas9とは対照的に、NgAgo-gDNA系は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を要さない。ヌクレアーゼ不活性NgAgo(dNgAgo)を使用することは、標的にされてもよい塩基を大いに伸長させ得る。NgAgoの特徴付けおよび使用は、Gao et al.,Nat Biotechnol.,2016 Jul;34(7):768-73.PubMed PMID:27136078;Swarts et al.,Nature.507(7491)(2014):258-61;およびSwarts et al.,Nucleic Acids Res.43(10)(2015):5120-9(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
いくつかの態様において、napDNAbpは、アルゴノートタンパク質の原核生物ホモログである。アルゴノートタンパク質の原核生物ホモログは知られており、例えば、Makarova K.,et al.,"Prokaryotic homologs of Argonaute proteins are predicted to function as key components of a novel system of defense against mobile genetic elements",Biol Direct.2009 Aug 25;4:29.doi:10.1186/1745-6150-4-29(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。いくつかの態様において、napDNAbpは、Marinitoga piezophila Argunaute(MpAgo)タンパク質である。CRISPR関連Marinitoga piezophila Argunaute(MpAgo)タンパク質は、5'リン酸化ガイドを使用して単鎖標的配列を切断する。5'ガイドは、知られているすべてのアルゴノートによって使用されている。MpAgo-RNA複合体の結晶構造は、5'ホスファート相互作用を遮断する残基を含むガイド鎖結合部位を示す。このデータは、5'-ヒドロキシル化ガイドへの特異性が標準的ではないアルゴノートサブクラスの進化を示唆する。例として、Kaya et al.,"A bacterial Argonaute with noncanonical guide RNA specificity",Proc Natl Acad Sci U S A.2016 Apr 12;113(15):4057-62(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)を参照。他のアルゴノートタンパク質も使用されてもよく、かつ本開示の範囲内にあることは、解されるはずである。
いくつかの態様において、napDNAbpは、微生物CRISPR-Cas系の単一エフェクターである。微生物CRISPR-Cas系の単一エフェクターは、限定せずに、Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、およびC2c3を包含する。典型的には、微生物CRISPR-Cas系は、クラス1系およびクラス2系に分けられる。クラス1系はマルチサブユニットエフェクター複合体を有するのに対し、クラス2系は単一タンパク質エフェクターを有する。例えば、Cas9およびCpf1は、クラス2エフェクターである。Cas9およびCpf1に加えて、3つ別個のクラス2 CRISPR-Cas系(C2c1、C2c2、およびC2c3)は、Shmakov et al.,"Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems",Mol.Cell,2015 Nov 5;60(3):385?397(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)によって記載されている。2つの系C2c1およびC2c3のエフェクターは、Cpf1に関するRuvC様エンドヌクレアーゼドメインを含有する。第3の系C2c2は、2つの予測HEPN RNaseドメインをもつエフェクターを含有する。成熟したCRISPR RNAの産生は、C2c1によるCRISPR RNAの産生とは違って、tracrRNAに依存しない。C2c1は、DNA切断のためCRISPR RNAとtracrRNAとの両方に依存する。細菌C2c2は、そのRNA活性化単鎖RNA分解活性とは別に、CRISPR RNA成熟のためにユニークなRNase活性を所有することが示されている。これらRNaseの機能は互いに異なり、Cpf1のCRISPR RNAプロセシング挙動とも異なる。例として、East-Seletsky,et al.,"Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection",Nature,2016 Oct 13;538(7624):270-273(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)を参照。Leptotrichia shahiiにおけるC2c2のin vitro生化学的分析によって、C2c2が単一CRISPR RNAによってガイドされ、相補的なプロトスペーサーを持つssRNA標的を切断するようプログラムされ得ることが示された。2つの保存されたHEPNドメインにおける触媒残基は、切断を媒介する。触媒残基中の突然変異は、触媒能のないRNA結合タンパク質を生成する。例として、Abudayyeh et al.,"C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector",Science,2016 Aug 5;353(6299)(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)を参照。
Alicyclobaccillus acidoterrastris C2c1(AacC2c1)の結晶構造は、キメラの単一分子ガイドRNA(sgRNA)と複合していることが報告された。例として、Liu et al.,"C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism",Mol.Cell,2017 Jan 19;65(2):310-322(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)を参照。結晶構造はまた、3元複合体として標的DNAへ結合された、Alicyclobacillus acidoterrestris C2c1においても報告されている。例として、Yang et al.,"PAM-dependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2C1 CRISPR-Cas endonuclease",Cell,2016 Dec 15;167(7):1814-1828(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)を参照。標的DNA鎖と非標的DNA鎖との両方との、AacC2cの触媒能のある(catalytically competent)立体配座は、独立して単一RuvC触媒ポケット内に位置付けられたまま捕捉されており、C2c1媒介切断によって、標的DNAの互い違いの7ヌクレオチド破壊がもたらされる。C2c1 3元複合体とこれまでに同定されたCas9およびCpf1の対応物との間での構造上の比較によって、CRISPR-Cas9系によって使用される機序の多様性が実証される。
いくつかの態様において、napDNAbpは、C2c1、C2c2、またはC2c3タンパク質であってもよい。いくつかの態様において、napDNAbpは、C2c1タンパク質である。いくつかの態様において、napDNAbpは、C2c2タンパク質である。いくつかの態様において、napDNAbpは、C2c3タンパク質である。いくつかの態様において、napDNAbpは、天然に存在するC2c1、C2c2、もしくはC2c3タンパク質と、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、napDNAbpは、天然に存在するC2c1、C2c2、またはC2c3タンパク質である。
本開示のいくつかの側面は、種々のPAM特異性を有するCas9ドメインを提供する。典型的には、S.pyogenes(spCas9)からのCas9などのCas9タンパク質は、具体的な核酸領域に結合するのに標準的なNGG PAM配列を要する。これは、ゲノム内の所望される塩基の編集能を限定することもある。いくつかの態様において、本明細書に提供される塩基編集融合タンパク質は、正確な場所に置かれる必要はない(例えば、標的塩基が、PAMのおよそ15塩基上流にある4塩基領域(例として、「編集窓」)内に置かれる)こともある。Komor,A.C.,et al.,"Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage"Nature 533,420-424(2016)(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)を参照。結果的に、いくつかの態様において、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれも、標準的な(例として、NGG)PAM配列を含有しないヌクレオチド配列に結合することが可能なCas9ドメインを含有していてもよい。標準的でないPAM配列へ結合するCas9ドメインは当該技術分野において記載されており、当業者に明らかであろう。例えば、標準的でないPAM配列へ結合するCas9ドメインは、Kleinstiver,B.P.,et al.,"Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities"Nature 523,481-485(2015);およびKleinstiver,B.P.,et al.,"Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition"Nature Biotechnology 33,1293-1298(2015)(これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
例えば、野生型Francisella novicida Cpf1(配列番号1361472)(D917、E1006、およびD1255は太字かつ下線を付される)と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％の配列同一性をもつドメインなどの、PAM特異性が変更されたnapDNAbpドメインは、使用されてもよい:
MSIYQEFVNKYSLSKTLRFELIPQGKTLENIKARGLILDDEKRAKDYKKAKQIIDKYHQFFIEEILSSVCISEDLLQNYSDVYFKLKKSDDDNLQKDFKSAKDTIKKQISEYIKDSEKFKNLFNQNLIDAKKGQESDLILWLKQSKDNGIELFKANSDITDIDEALEIIKSFKGWTTYFKGFHENRKNVYSSNDIPTSIIYRIVDDNLPKFLENKAKYESLKDKAPEAINYEQIKKDLAEELTFDIDYKTSEVNQRVFSLDEVFEIANFNNYLNQSGITKFNTIIGGKFVNGENTKRKGINEYINLYSQQINDKTLKKYKMSVLFKQILSDTESKSFVIDKLEDDSDVVTTMQSFYEQIAAFKTVEEKSIKETLSLLFDDLKAQKLDLSKIYFKNDKSLTDLSQQVFDDYSVIGTAVLEYITQQIAPKNLDNPSKKEQELIAKKTEKAKYLSLETIKLALEEFNKHRDIDKQCRFEEILANFAAIPMIFDEIAQNKDNLAQISIKYQNQGKKDLLQASAEDDVKAIKDLLDQTNNLLHKLKIFHISQSEDKANILDKDEHFYLVFEECYFELANIVPLYNKIRNYITQKPYSDEKFKLNFENSTLANGWDKNKEPDNTAILFIKDDKYYLGVMNKKNNKIFDDKAIKENKGEGYKKIVYKLLPGANKMLPKVFFSAKSIKFYNPSEDILRIRNHSTHTKNGSPQKGYEKFEFNIEDCRKFIDFYKQSISKHPEWKDFGFRFSDTQRYNSIDEFYREVENQGYKLTFENISESYIDSVVNQGKLYLFQIYNKDFSAYSKGRPNLHTLYWKALFDERNLQDVVYKLNGEAELFYRKQSIPKKITHPAKEAIANKNKDNPKKESVFEYDLIKDKRFTEDKFFFHCPITINFKSSGANKFNDEINLLLKEKANDVHILSIDRGERHLAYYTLVDGKGNIIKQDTFNIIGNDRMKTNYHDKLAAIEKDRDSARKDWKKINNIKEMKEGYLSQVVHEIAKLVIEYNAIVVFEDLNFGFKRGRFKVEKQVYQKLEKMLIEKLNYLVFKDNEFDKTGGVLRAYQLTAPFETFKKMGKQTGIIYYVPAGFTSKICPVTGFVNQLYPKYESVSKSQEFFSKFDKICYNLDKGYFEFSFDYKNFGDKAAKGKWTIASFGSRLINFRNSDKNHNWDTREVYPTKELEKLLKDYSIEYGHGECIKAAICGESDKKFFAKLTSVLNTILQMRNSKTGTELDYLISPVADVNGNFFDSRQAPKNMPQDADANGAYHIGLKGLMLLGRIKNNQEGKKLNLVIKNEEYFEFVQNRNN(配列番号1361472)
野生型Geobacillus thermodenitrificans Cas9(配列番号1361473)と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％の配列同一性を有するドメインなどの、PAM特異性が変更された追加のnapDNAbpドメインも、使用されてもよい。
MKYKIGLDIGITSIGWAVINLDIPRIEDLGVRIFDRAENPKTGESLALPRRLARSARRRLRRRKHRLERIRRLFVREGILTKEELNKLFEKKHEIDVWQLRVEALDRKLNNDELARILLHLAKRRGFRSNRKSERTNKENSTMLKHIEENQSILSSYRTVAEMVVKDPKFSLHKRNKEDNYTNTVARDDLEREIKLIFAKQREYGNIVCTEAFEHEYISIWASQRPFASKDDIEKKVGFCTFEPKEKRAPKATYTFQSFTVWEHINKLRLVSPGGIRALTDDERRLIYKQAFHKNKITFHDVRTLLNLPDDTRFKGLLYDRNTTLKENEKVRFLELGAYHKIRKAIDSVYGKGAAKSFRPIDFDTFGYALTMFKDDTDIRSYLRNEYEQNGKRMENLADKVYDEELIEELLNLSFSKFGHLSLKALRNILPYMEQGEVYSTACERAGYTFTGPKKKQKTVLLPNIPPIANPVVMRALTQARKVVNAIIKKYGSPVSIHIELARELSQSFDERRKMQKEQEGNRKKNETAIRQLVEYGLTLNPTGLDIVKFKLWSEQNGKCAYSLQPIEIERLLEPGYTEVDHVIPYSRSLDDSYTNKVLVLTKENREKGNRTPAEYLGLGSERWQQFETFVLTNKQFSKKKRDRLLRLHYDENEENEFKNRNLNDTRYISRFLANFIREHLKFADSDDKQKVYTVNGRITAHLRSRWNFNKNREESNLHHAVDAAIVACTTPSDIARVTAFYQRREQNKELSKKTDPQFPQPWPHFADELQARLSKNPKESIKALNLGNYDNEKLESLQPVFVSRMPKRSITGAAHQETLRRYIGIDERSGKIQTVVKKKLSEIQLDKTGHFPMYGKESDPRTYEAIRQRLLEHNNDPKKAFQEPLYKPKKNGELGPIIRTIKIIDTTNQVIPLNDGKTVAYNSNIVRVDVFEKDGKYYCVPIYTIDMMKGILPNKAIEPNKPYSEWKEMTEDYTFRFSLYPNDLIRIEFPREKTIKTAVGEEIKIKDLFAYYQTIDSSNGGLSLVSHDNNFSLRSIGSRTLKRFEKYQVDVLGNIYKVRGEKRVGVASSSHSKAGETIRPL(配列番号1361473)
いくつかの態様において、napDNAbpは、標準的な(NGG)PAM配列を要さない核酸プログラム型DNA結合タンパク質である。いくつかの態様において、napDNAbpは、アルゴノートタンパク質である。かかる核酸プログラム型DNA結合タンパク質の一例は、Natronobacterium gregoryi(NgAgo)からのアルゴノートタンパク質である。NgAgoは、ssDNAにガイドされるエンドヌクレアーゼである。NgAgoは、～24ヌクレオチド(gDNA)の5'リン酸化ssDNAに結合してこれをその標的部位までガイドし、gDNA部位にてDNA二本鎖破壊をするであろう。Cas9とは対照的に、NgAgo-gDNA系は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を要さない。ヌクレアーゼ不活性NgAgo(dNgAgo)を使用することは、標的にされてもよい塩基を大いに伸長させ得る。NgAgoの特徴付けおよび使用は、Gao et al.,Nat Biotechnol.,2016 Jul;34(7):768-73.PubMed PMID:27136078;Swarts et al.,Nature.507(7491)(2014):258-61;およびSwarts et al.,Nucleic Acids Res.43(10)(2015):5120-9(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。Natronobacterium gregoryiアルゴノートの配列は、配列番号1361474に提供される。
開示された融合タンパク質は、野生型 Natronobacterium gregoryiアルゴノート(配列番号1361474)と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％の配列同一性を有するnapDNAbpドメインを含んでいてもよい。
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いくつかの態様において、Cas9ドメインは、Staphylococcus aureusからのCas9ドメイン(SaCas9)である。いくつかの態様において、SaCas9ドメインは、ヌクレアーゼ活性SaCas9、ヌクレアーゼ不活性SaCas9(SaCas9d)、またはSaCas9ニッカーゼ(SaCas9n)である。
（x）分裂PE送達のために分けられたnapDNAbp
様々な態様において、本明細書に記載のプライム編集因子は、細胞内部で集合されるようになって(分裂インテイン配列などを使用する、受動的な集合(passive assembly)または能動的な(active)集合のいずれかによって)再構成プライム編集因子になる2以上のフラグメントとして細胞へ送達されてもよい。いくつかのケースにおいて、自己集合は受動的であってもよく、これによって2以上のプライム編集因子フラグメントが細胞内部で共有結合的にまたは非共有結合的に再構成プライム編集因子へ結び付く。他のケースにおいて、自己集合は、各フラグメント上に組み入れられた二量体化ドメインによって触媒されてもよい。二量体化ドメインの例は、本明細書に記載されている。更に他のケースにおいて、自己集合は、各プライム編集因子フラグメント上に組み入れられた分裂インテイン配列によって触媒されてもよい。
分裂PE送達は、種々の送達アプローチの様々なサイズ制約に対処するのに有利なこともある。例えば、送達アプローチは、ウイルスベースの送達方法、メッセンジャーRNAベースの送達方法、またはRNPベースの送達(リボヌクレオタンパク質ベースの送達)を包含していてもよい。ならびに、これら送達の方法の各々は、プライム編集因子を分割してより小さいピース(pieces)にすることによって、より効率的および/または有効であり得る。一旦細胞内部へ入ると、より小さいピースは集合して機能的プライム編集因子になり得る。分裂手段に応じて、分かれたプライム編集因子フラグメントは非共有結合的な様式または共有結合的な様式で最集合されることで、プライム編集因子を形成し得る。一態様において、プライム編集因子は、1以上の分裂部位にて分裂されて、2以上のフラグメントになり得る。フラグメントは、未修飾(分裂される以外)であり得る。一旦フラグメントが細胞へ送達されると(例として、リボヌクレオタンパク質複合体の直接送達によって、または核内送達によって－例として、mRNA送達またはウイルスベクターベースの送達)、フラグメントは、共有結合的または非共有結合的に再集合してプライム編集因子を再構成し得る。別の態様において、プライム編集因子は、1以上の部位にて分裂して2以上のフラグメントになり得る。フラグメントの各々は二量体化ドメインを含むように修飾され得、これによって形成される各フラグメントは二量体化ドメインに対しカップリングされる。一旦細胞内に送達または発現されると、種々のフラグメントの二量体化ドメインは集合し相互に結合して、種々のプライム編集因子フラグメントが一緒になって機能的プライム編集因子を再形成する。もう1つの態様において、プライム編集因子フラグメントは、分裂インテインを含むよう修飾されていてもよい。一旦細胞内に送達または発現されると、種々のフラグメントの分裂インテインドメインは集合し相互に結合して、次いでtrans-スプライシングを経るが、これによってフラグメントの各々からの分裂インテインドメインの切除およびフラグメント同士間のペプチド結合の同時形成がもたらされ、それによってプライム編集因子が復元される。
一態様において、プライム編集因子は、分裂インテインアプローチを使用して送達され得る。
分裂部位の場所は、napDNAbpドメイン内、ポリメラーゼドメイン(例として、RTドメイン)内、napDNAbpドメインとポリメラーゼドメインとを結び合わせるリンカードメイン内を包含する、プライム編集因子中およびそのいずれのドメイン中、いずれの残基の1以上の対の間に位置付けられ得る。
一態様において、図66に描かれるプライム編集因子(PE)は、napDNAbp内の分裂部位にて分けられる。
ある態様において、napDNAbpは、以下のとおり、配列番号1361421の標準的なSpCas9ポリペプチドである:
Figure 2022531539000050
ある態様において、SpCas9は分裂して、残基1と2との間、もしくは2と3との間、もしくは3と4との間、もしくは4と5との間、もしくは5と6との間、もしくは6と7との間、もしくは7と8との間、もしくは8と9との間、もしくは9と10との間に、または配列番号1361421の標準的なSpCas9の残基1～10間、10～20間、20～30間、30～40間、40～50間、50～60間、60～70間、70～80間、80～90間、90～100間、100～200間、200～300間、300～400間、400～500間、500～600間、600～700間、700～800間、800～900間、1000～1100間、1100～1200間、1200～1300間、もしくは1300～1368間のどこかに位置付けられる残基のいずれの2つの対の間に位置付けられる分裂部位にて2つのフラグメントになる。
ある態様において、napDNAbpは分裂して、配列番号1361421の標準的なSpCas9の位置1～10間、10～20間、20～30間、30～40間、40～50間、50～60間、60～70間、70～80間、80～90間、90～100間、100～200間、200～300間、300～400間、400～500間、500～600間、600～700間、700～800間、800～900間、1000～1100間、1100～1200間、1200～1300間、もしくは1300～1368間のどこかに位置付けられる残基のいずれか2つの対に対応する残基の対にて位置付けられる分裂部位にて2つのフラグメントになる。
ある態様において、SpCas9は分裂して、残基1と2との間、もしくは2と3との間、もしくは3と4との間、もしくは4と5との間、もしくは5と6との間、もしくは6と7との間、もしくは7と8との間、もしくは8と9との間、もしくは9と10との間に、または配列番号1361421の標準的なSpCas9の残基1～10間、10～20間、20～30間、30～40間、40～50間、50～60間、60～70間、70～80間、80～90間、90～100間、100～200間、200～300間、300～400間、400～500間、500～600間、600～700間、700～800間、800～900間、1000～1100間、1100～1200間、1200～1300間、もしくは1300～1368間のどこかに位置付けられる残基のいずれか2つの対の間に位置付けられる分裂部位にて2つのフラグメントになる。
ある態様において、分裂部位は、1以上のポリペプチド結合部位(すなわち、「分裂部位または分裂-インテイン分裂部位」)に位置付けられており、分裂インテインと融合されて、次いで個別にコードされた融合タンパク質として細胞へ送達される。一旦分裂インテイン融合タンパク質(すなわち、半分のタンパク質)が細胞内で発現されると、タンパク質はtrans-スプライシングを経て、結び合わされた分裂-インテイン配列が同時に除去されて完全なPEまたはPE全体を形成する。
例えば、図38に示されるとおり、N末端エクステインは第1分裂-インテイン(例として、Nインテイン)と融合され得、C末端エクステインは第2分裂-インテイン(例として、Cインテイン)と融合され得る。N末端エクステインは、C末端エクステインと融合されるようになって、細胞内部でのNインテインとCインテインとの自己集合、これに続くそれらの自己切除、およびプライム編集因子(PE)全体のN末端エクステイン部分とC末端エクステイン部分との間のペプチド結合の同時形成の際に、napDNAbpドメインとポリメラーゼドメイン(例として、RTドメイン)とを含むプライム編集因子融合タンパク質全体を形成する。
分裂-インテインを使用する分裂-PE送達ストラテジーの利点を生かすため、プライム編集因子は、1以上の分裂部位にて分けられて、少なくとも二分された別々のプライム編集因子が創出される必要があり、二分された各々が分裂-インテイン配列と融合されていた場合、これらの各々は細胞内部で再度結び合わされ得る。
ある態様において、プライム編集因子は、単一の分裂部位にて分裂されている。他のある態様において、プライム編集因子は、2つの分裂部位、または3つの分裂部位、または4つの分裂部位、またはそれ以上の分裂部位にて分裂されている。
好ましい態様において、プライム編集因子は単一分裂部位にて分裂し、別々の二分されたプライム編集因子が創出されるが、これらの各々は分裂インテイン配列と融合され得る。
例示の分裂インテインは、2つのサブユニット、つまりDnaE-NおよびDnaE-Cを含む、Ssp DnaEインテインである。2つの異なるサブユニットは、別々の遺伝子、つまりdnaE-nおよびdnaE-cによってコードされており、これらは夫々DnaE-NおよびDnaE-Cサブユニットをコードする。DnaEは、Synechocytis sp.PCC6803における天然に存在する分裂インテインであって、2つ別々のタンパク質をtrans-スプライシングへ向かわせることが可能であるが、各々はDnaE-NまたはDnaE-Cのいずれかとの融合体を含む。
天然に存在するかまたは改変された追加の分裂-インテイン配列は当該技術分野において知られており、本明細書に記載の全インテイン配列または当該技術分野において利用可能なものから作製され得る。分裂-インテイン配列の例は、Stevens et al.,"A promiscuous split intein with expanded protein engineering applications,"PNAS,2017,Vol.114:8538-8543;Iwai et al.,"Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostc punctiforme,FEBS Lett,580:1853-1858(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)から見出され得る。追加の分裂インテイン配列は、例えば、WO2013/045632、WO2014/055782、WO2016/069774、およびEP2877490(これら内容の各々は参照により本明細書に組み込まれる)から見出され得る。
加えて、transでのタンパク質スプライシングは、in vivoおよびin vitro(Shingledecker,et al.,Gene 207:187(1998),Southworth,et al.,EMBO J.17:918(1998);Mills,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:3543-3548(1998);Lew,et al.,J.Biol.Chem.,273:15887-15890(1998);Wu,et al.,Biochim.Biophys.Acta 35732:1(1998b),Yamazaki,et al.,J.Am.Chem.Soc.120:5591(1998),Evans,et al.,J.Biol.Chem.275:9091(2000);Otomo,et al.,Biochemistry 38:16040-16044(1999); Otomo,et al.,J.Biolmol.NMR 14:105-114(1999);Scott,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:13638-13643(1999))で記載されており、例として、図38および39に示されるとおり、個別に発現された2つの半身からの完全なPE融合タンパク質の形成に関し、2つの不活性なフラグメントについて1タンパク質を発現し、これに続くライゲーションを経て、機能的産物を形成する好機を提供する。
本明細書に記載の様々な態様において、連続進化方法(例として、PACE)は、塩基編集因子の第1部分を進化させるのに使用されてもよい。第1部分は、単一の構成要素またはドメイン、例として、Cas9ドメイン、デアミナーゼドメイン、またはUGIドメインを包含し得る。個別に進化した構成要素またはドメインは次いで、分裂-インテインポリペプチドドメインをもつ進化部分と残存する非進化部分との両方を個別に発現することによって、塩基編集因子の残存部分と細胞内で融合され得る。第1部分は、本明細書に記載の連続進化方法を使用して進化されることが所望される塩基編集因子のいずれの第1アミノ酸部分も、より広く包含し得る。第2部分は、この態様において、本明細書に記載の方法を使用して進化されない塩基編集因子の残存するアミノ酸部分を指すであろう。塩基編集因子の進化した第1部分および第2部分は各々、細胞中、分裂-インテインポリペプチドドメインとともに発現され得る。細胞の天然のタンパク質スプライシング機序は、進化した第1部分および進化しない第2部分を再集合させて、塩基編集因子が進化した単一融合タンパク質を形成する。進化した第1部分は、単一融合タンパク質のN末端部分またはC末端部分のいずれかを含んでいてもよい。類似したやり方において、第2の直交する(orthogonal)trans-スプライシングインテイン対の使用は、進化した第1部分に、単一融合タンパク質内部の一部を含むことができるようにさせ得る。
よって、本明細書に記載の塩基編集因子の進化した構成要素および進化しない構成要素のいずれも、細胞内に進化した構成要素と進化しない構成要素とを含む完全な塩基編集因子の形成を容易にさせるために、分裂-インテインタグとともに発現されてもよい。
タンパク質スプライシングプロセスの機序は極めて詳細に研究されており(Chong,et al.,J.Biol.Chem.1996,271,22159-22168;Xu,M-Q & Perler,F.B.EMBO Journal,1996,15,5146-5153)、保存されたアミノ酸は、インテインおよびエクステインスプライシングのポイントにて見出されている(Xu,et al.EMBO Journal,1994,13 5517-522)。本明細書に記載の構築物は、第1遺伝子の5'末端と融合したインテイン配列(例として、塩基編集因子の進化した部分)を含有する。好適なインテイン配列は、タンパク質スプライシング要素を含有することが知られているタンパク質のいずれもから選択され得る。知られているすべてのインテインを含有するデータベースは、ワールドワイドウェブ上から見出され得る(Perler,F.B.Nucleic Acids Research,1999,27,346-347)。インテイン配列は、3'末にて第2遺伝子の5'末と融合されている。この遺伝子の、あるオルガネラへの標的化のため、ペプチドシグナルは、遺伝子のコード配列と融合され得る。第2遺伝子の後にインテイン-遺伝子配列が、同じ細胞中の複数のタンパク質の発現が所望されるのと同程度の頻度で反復され得る。複数インテインを含有する構築物において、異なる供給源からのインテイン要素を使用するのが有用なこともある。発現されるべき最後の遺伝子の配列の後に転写終止配列が挿入されなければならない。一態様において、修飾されたインテインスプライシングユニットは、エクステインのインテインからの切除を触媒することと、エクステインのライゲーションを防止することとの両方をし得るようにデザインされる。Pyrococcus種GB-D DNAポリメラーゼにおけるC末端エクステイン接点の変異誘発が、エクステインおよびインテインの切断を誘導するがこれに続くエクステインのライゲーションを防止する、変更されたスプライシング要素を産生することが見出された(Xu,M-Q & Perler,F.B.EMBO Journal,1996,15,5146-5153)。セリン538の、アラニンまたはグリシンのいずれかへの突然変異は、切断を誘導したがライゲーションを防止した。他のインテインスプライシングユニット中の等価な残基の突然変異はまた、C末端エクステインのインテインへの接点でのアミノ酸の保存に起因して、エクステインのライゲーションも防止するはずである。エンドヌクレアーゼドメインを含有しない好ましいインテインは、Mycobacterium xenopi GyrAタンパク質である(Telenti,et al.J.Bacteriol.1997,179,6378-6382)。他は、自然界から見出されているか、またはエンドヌクレアーゼ含有インテインからエンドヌクレアーゼドメインを除去することによって人工的に創出されている(Chong,et al.J.Biol.Chem.1997,272,15587-15590)。好ましい態様において、Mycobacterium xenopi GyrAタンパク質からのインテインなどのインテインが、スプライシング機能を実施するのに必要とされる最小数のアミノ酸からなるように選択される(Telenti,A.et al.,J.Bacteriol.1997,179,6378-6382)。代替態様において、エンドヌクレアーゼドメインを除去するよう修飾されたMycobacterium xenopi GyrAタンパク質またはSaccharaomyces cerevisiae VMAインテインからのインテインなどの、エンドヌクレアーゼ活性のないインテインが選択される(Chong,1997)。インテインスプライシングユニットのさらなる修飾は、切断反応の反応速度を変更できるようにしてもよく、これによってタンパク質投薬量が、スプライシングユニットの遺伝子配列を単に修飾することによって制御され得る。
インテインはまた、個別に転写および翻訳された2つの遺伝子によってコードされる2つのフラグメントとしても存在し得る。これらの所謂分裂インテインは自己会合し(self-associate)、タンパク質-スプライシング活性をtransで触媒する。分裂インテインは、多様なシアノ細菌および古細菌において同定されている(Caspi et al,Mol Microbiol.50:1569-1577(2003);Choi J.et al,J Mol Biol.556:1093-1106(2006.);Dassa B.et al,Biochemistry.46:322-330(2007.);Liu X. and Yang J.,J Biol Chem.275:26315-26318(2003);Wu H.et al.
Proc Natl Acad Sci USA.￡5:9226-9231(1998.);およびZettler J.et al,FEBS Letters.553:909-914(2009))が、これまでbut have not been found in 真核生物からは見出されていない。近年、環境メタゲノムデータの生物情報学的(bioinformatic)分析から、新規ゲノム配置をもつ26の種々の遺伝子座が明らかにされた。各遺伝子座にて、保存された酵素コード領域は分裂インテインによって遮られており、独立型の(freestanding)エンドヌクレアーゼ遺伝子が、インテインサブドメインをコードする節(sections)間に挿入されている。これらのうち、5つの遺伝子座に完全に集合した:DNAヘリカーゼ(gp41-l、gp41-8);イノシン-5'-一リン酸デヒドロゲナーゼ(IMPDH-1);ならびにリボヌクレオチドレダクターゼ触媒サブユニット(NrdA-2およびNrdJ-1)。このばらばらにされた(fractured)遺伝子の組織化は主にファージにおいて存在するようである(Dassa et al,Nucleic Acids Research.57:2560-2573(2009))。
分裂インテインNpu DnaEは、タンパク質trans-スプライシング反応について報告された最高率を有するものとして特徴付けられた。加えて、Npu DnaEタンパク質スプライシング反応は、種々のエクステイン配列、6℃から37℃までの温度、および最大6Mまでの尿素の存在に関し、堅固であって高収率であると考えられる(Zettler J.et al,FEBS Letters.553:909-914(2009);Iwai I.et al,FEBS Letters 550:1853-1858(2006))。予想どおり、これらのインテインのNドメインでのCysl Ala突然変異が導入されたとき、最初のN→S-アシルシフト、したがってタンパク質スプライシングが遮断された。残念ながら、C末端の切断反応もまた、ほぼ完全に阻害された。C末端スプライシング接点でのアスパラギンの環化の、N末端の切断しやすいペプチド結合でのアシルシフトへの依存は、天然の分裂DnaEインテインアレルに共通するユニークな特性のように見える(Zettler J.et al.FEBS Letters.555:909-914(2009))
タンパク質スプライシングの機序は、典型的には、4つのステップを有する[29～30]:1)上流のペプチド結合を破壊し、Nエクステインとインテインの第1アミノ酸(CysまたはSer)の側鎖との間にエステル結合を形成する、インテインN末端でのN-SまたはN-Oアシルシフト;2)NエクステインをCエクステインの第1アミノ酸(Cys、Ser、またはThr)の側鎖へ連結する新しいエステル結合を形成する、NエクステインをインテインC末端へ再配置する(relocating)エステル交換(transesterification);3)インテインとCエクステインとの間のペプチド結合を破壊する、Asnの環化;ならびに4)エステル結合をNエクステインとCエクステインとの間のペプチド結合に置き換える、S-NまたはO-Nアシルシフト。
分裂インテインによって触媒されるタンパク質trans-スプライシングは、タンパク質ライゲーションのための全面的に酵素による方法を提供する[31]。分裂-インテインは、2つのピース、つまりNインテインとCインテインとの夫々に分裂する、本質的に連続したインテイン(例として、ミニ-インテイン)である。分裂インテインのNインテインおよびCインテインは、非共有結合的に結び付き、活性インテインを形成して、連続したインテインと本質的に同じようにスプライシング反応を触媒し得る。分裂インテインは自然界から見出されており、また実験室において改変もされている[31～35]。本明細書に使用されるとき、用語「分裂インテイン」は、N末端配列およびC末端配列が、非共有結合的に再度結び付くかまたは再構成して、trans-スプライシング反応に対し機能するインテインになり得る別々の分子になるように、1以上のペプチド結合破壊がN末端とC末端とのアミノ酸配列間に存在するいずれのインテインも指す。いずれの触媒活性インテインまたはそのフラグメントも、本発明の方法における使用のための分裂インテインを得るために使用されてもよい。例えば、一側面において、分裂インテインは、真核生物インテインに由来していてもよい。別の側面において、分裂インテインは、細菌インテインに由来していてもよい。別の側面において、分裂インテインは、古細菌インテインに由来していてもよい。好ましくは、そのように得られた分裂インテインは、trans-スプライシング反応を触媒するのに不可欠なアミノ酸配列のみを所有しているであろう。
本明細書に使用されるとき、「N末端分裂インテイン(In)」は、trans-スプライシング反応に対し機能するN末端のアミノ酸配列を含むいずれのインテイン配列も指す。よってInはまた、trans-スプライシングが生じたときにスプライシングによって外れる(spliced out)配列も含む。Inは、天然に存在するインテイン配列のN末端部分の修飾である配列を含み得る。例えば、Inは、追加のアミノ酸残基および/または突然変異した残基を、かかる追加の残基および/または突然変異した残基を包含することによってInがtrans-スプライシングに機能しないことがない限り、含み得る。好ましくは、追加の残基および/または突然変異した残基を包含することによって、Inのtrans-スプライシング活性が改善または増強される。
本明細書に使用されるとき、「C末端分裂インテイン(Ic)」は、trans-スプライシング反応に対し機能するC末端のアミノ酸配列を含むいずれのインテイン配列も指す。一側面において、Icは、4～7個の連続したアミノ酸残基を含むが、これらの少なくとも4アミノ酸は、これに由来するインテインの最後のβ鎖からのものである。よってIcはまた、trans-スプライシングが生じたときにスプライシングによって外れる(spliced out)配列も含む。Icは、天然に存在するインテイン配列のC末端部分の修飾である配列を含み得る。例えば、Icは、追加のアミノ酸残基および/または突然変異した残基を、かかる追加の残基および/または突然変異した残基を包含することによってInがtrans-スプライシングに機能しないことがない限り、含み得る。好ましくは、追加の残基および/または突然変異した残基を包含することによって、Icのtrans-スプライシング活性が改善または増強される。
本発明のいくつかの態様において、IcまたはInへ連結されたペプチドは、数ある中でも、蛍光基、ビオチン、ポリエチレングリコール(PEG)、アミノ酸類似体、非天然アミノ酸、ホスファート基、グリコシル基、放射性同位体標識、および医薬分子を包含する追加の化学的成分を含み得る。他の態様において、Icへ連結されたペプチドは、数ある中でも、ケトン、アルデヒド、Cys残基、およびLys残基を包含する1以上の化学反応基を含み得る。分裂インテインのNインテインおよびCインテインは、「インテイン-スプライシングポリペプチド(ISP)」が存在するとき、非共有結合的に結び付き、活性インテインを形成してスプライシング反応を触媒し得る。本明細書に使用されるとき、「インテイン-スプライシングポリペプチド(ISP)」は、Ic、In、またはその両方が分裂インテインから除去されたときに残存する分裂インテインのアミノ酸配列の部分を指す。ある態様において、Inは、ISPを含む。別の態様において、Icは、ISPを含む。もう1つの態様において、ISPは、InへもIcへも共有結合的に連結されていない別々のペプチドである。
分裂インテインは、非構造化ループ中の1以上の分裂部位を改変するか、またはミニ-インテインの構造から見出される-12の保存されたベータ鎖間のアミノ酸配列に干渉することによって、連続したインテインから創出されてもよい[25～28]。ベータ鎖間の領域内の分裂部位の位置において、ある程度の柔軟性があってもよいが、ただし、分裂の創出によって、タンパク質スプライシング活性が喪失されるのに充分な程度まで、インテインの構造、とりわけ構造化ベータ鎖が妨害されない。
タンパク質trans-スプライシングにおいて、ある前駆体タンパク質はNエクステイン部分と、これに続くNインテインからなり、別の前駆体タンパク質はCインテインと、これに続くCエクステイン部分からなり、trans-スプライシング反応(N-およびCインテインによって一緒に触媒される)は、2つのインテイン配列を切除し、2つのエクステイン配列をペプチド結合で連結する。タンパク質trans-スプライシングは、酵素反応であるが、極めて低い(例として、マイクロモル濃度の)タンパク質濃度で働き得、生理学的条件下で遂行され得る。
B．プログラム型ヌクレアーゼ(非napDNAbp)
本明細書に記載の様々な態様において、プライム編集因子は、Cas9タンパク質などのnapDNAbpを含む。これらのタンパク質は、それらがガイドRNA(または場合によってはPEgRNA)と複合体化されるようになることから「プログラム可能」であって、前記ガイドRNAはCas9タンパク質をDNA上の標的部位へガイドするが、前記DNAは、gRNA(またはPEgRNA)のスペーサー部分に相補的な配列を所有し、また要求されるPAM配列も所有する。しかしながら、ここで想像されるある態様において、napDNAbpは、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)などの異なるタイプのプログラム型タンパク質と置換されてもよい。
図1Hは、napDNAbp(例として、SpCas9ニッカーゼ)を、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)などのいずれのプログラム型ヌクレアーゼドメインにも置き換える、本明細書に企図されるプライム編集のバリエーションを描く。図1Hは、napDNAbp(例として、SpCas9ニッカーゼ)を、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)などのいずれのプログラム型ヌクレアーゼドメインにも置き換える、本明細書に企図されるプライム編集のバリエーションを描く。ちょうどnapDNAbp部分とのプライム編集と同じように、代替プログラム型ヌクレアーゼは、標的DNAの一方の鎖のみが切られるように修飾されることが好ましい。換言すれば、プログラム型ヌクレアーゼは、好ましくは、ニッカーゼとして機能するはずである。一旦プログラム型ヌクレアーゼが選択されると(例として、ZFNまたはTALEN)、追加の機能は改変されて、それがプライム編集様機序に従って作動することができる系になってもよい。例えば、プログラム型ヌクレアーゼは、これとRNAまたはDNAの伸長アームとを(例として、化学的リンカーを介して)カップリングすることによって修飾されてもよく、ここで伸長アームは、プライマー結合部位(PBS)およびDNA合成鋳型を含む。プログラム型ヌクレアーゼはまた、ポリメラーゼとも(例として、化学的リンカーまたはアミノ酸リンカーを介して)カップリングされてもよいが、前記ポリメラーゼの性質は、伸長アームがDNAまたはRNAであるかに依存するであろう。RNA伸長アームのケースにおいて、ポリメラーゼはRNA依存性DNAポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)であり得る。DNA伸長アームのケースにおいて、ポリメラーゼは、DNA依存性DNAポリメラーゼ(例として、Pol I、Pol II、もしくはPol IIIを包含する原核生物のポリメラーゼ、またはPol a、Pol b、Pol g、Pol d、Pol e、もしくはPol zを包含する真核生物のポリメラーゼ)であり得る。系はまた、プログラム型ヌクレアーゼとの融合体として加えられるか、または反応全体を容易にするためにtransで加えられた他の機能も包含していてもよい(例として、(a)DNAを切断部位にて巻き戻すことで、プライマーとして利用可能な3'末をもつ切断鎖を作製する、ヘリカーゼ、(b)切断鎖上の内生鎖を除去することで、内生鎖の合成された鎖との置き換えへの反応を推進するのに役立つ、FEN1、または(c)反対鎖上に第2部位ニックを創出する、nCas9:gRNA複合体(これは非編集鎖の好ましい細胞修復を通した合成修復の取り入れを推進するのに役立つこともある))。napDNAbpで編集をプライムする類似したやり方において、別様なプログラム型ヌクレアーゼとのかかる複合体は、合成し、次いで、着目した編集を持つ新しく合成されたDNAの置き換え鎖をDNAの標的部位中へ永続的に組み入れるのに使用され得る。
好適な代替プログラム型ヌクレアーゼは当該技術分野において周知であるが、これは、DNAの標的部位へ選択的に結合するようプログラムされ得る代替プライム編集因子系を構築するため、napDNAbp:gRNA複合体の代わりに使用されてもよく、上に記載のやり方でポリメラーゼとRNAまたはDNAの伸長アーム(プライマー結合部位およびDNA合成鋳型を含む)とを特定のニック部位へ共局在化させるようにさらに修飾され得る。例えば、また図1Hに表されるとおり、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)は、本明細書に記載のプライム編集方法および組成物(compositions of matter)においてプログラム型ヌクレアーゼとして使用されてもよい。TALENは、TALエフェクターDNA結合ドメインをDNA切断ドメインと融合させることによって生成された人工の制限酵素である。これらの試薬は、効率的でプログラム可能な特定のDNA切断を可能にさせ、in situでのゲノム編集にとって強力なツールに相当する。転写活性化因子様エフェクター(TALE)は、実際的にいずれのDNA配列にも結合するよう急速に改変され得る。本明細書に使用されるときTALENという用語は広く、別のTALENからの助けもなく二本鎖のDNAを切断し得る単量体のTALENを包含する。TALENという用語はまた、DNAを同じ部位にて切断するのに一緒に働くよう改変された対のTALENの一方または両方のメンバーを指すのにも使用される。一緒に働くTALENは、DNAの掌性を参照して左TALENおよび右TALENと称されることもある。米国第12/965,590号;米国第13/426,991号(米国特許第8,450,471号);米国第13/427,040号(米国特許第8,440,431号);米国第13/427,137号(米国特許第8,440,432号);および米国第13/738,381号を参照(これらのすべては、それらの全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)。加えて、TALENSは、WO2015/027134、US9,181,535、Boch et al.,"Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III Effectors",Science,vol.326,pp.1509-1512(2009),Bogdanove et al.,TAL Effectors:Customizable Proteins for DNA Targeting,Science,vol.333,pp.1843-1846 (2011),Cade et al.,"Highly efficient generation of heritable zebrafish gene mutations using homo- and heterodimeric TALENs",Nucleic Acids Research,vol.40,pp.8001-8010(2012),およびCermak et al.,"Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting",Nucleic Acids Research,vol.39,No.17,e82(2011)(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
図1Hに表されるとおり、ジンクフィンガーヌクレアーゼはまた、Cas9ニッカーゼなどのnapDNAbpの代わりに、プライム編集における使用のための代替プログラム型ヌクレアーゼとして使用されてもよい。TALENと同じように、ZFNタンパク質も、ニッカーゼとして機能するように修飾されてもよい、すなわち、ZFNを、本明細書に記載のプライム編集因子とともに使用されるnapDNAbpと同様のやり方で標的DNAの一方の鎖のみを切断するように改変してもよい。ZFNタンパク質は当該技術分野において広範に記載されており、例えば、Carroll et al.,"Genome Engineering with Zinc-Finger Nucleases,"Genetics,Aug 2011,Vol.188:773-782;Durai et al.,"Zinc finger nucleases:custom-designed molecular scissors for genome engineering of plant and mammalian cells,"Nucleic Acids Res,2005,Vol.33:5978-90;およびGaj et al.,"ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering,"Trends Biotechnol.2013,Vol.31:397-405(これらの各々は、それらの全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)に記載されている。
C．ポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)
様々な態様において、本明細書に開示のプライム編集因子(PE)系は、ポリメラーゼ(例として、DNA依存性DNAポリメラーゼ、もしくは逆転写酵素などのRNA依存性DNAポリメラーゼ)、またはそのバリアントを包含するが、これは、napDNAbpもしくは他のプログラム型ヌクレアーゼをもつ融合タンパク質として提供され得るか、またはtransで提供され得る。
いずれのポリメラーゼも、本明細書に開示のプライム編集因子において使用されてもよい。ポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼ、機能的フラグメント、突然変異体、バリアント、またはトランケートされたバリアント等であってもよい。ポリメラーゼは、真核生物、原核生物、古細菌、もしくはウイルスなどの生物からの野生型ポリメラーゼを包含していてもよく、および/またはポリメラーゼは、遺伝子工学、変異誘発、指向進化ベースのプロセスによって修飾されていてもよい。ポリメラーゼは、T7 DNAポリメラーゼ、T5 DNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼ、クレノウフラグメントDNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼIII等を包含していてもよい。ポリメラーゼはまた耐熱性があってもよく、Taq、Tne、Tma、Pfu、Tfl、Tth、Stoffelフラグメント、VENT(登録商標)およびDEEPVENT(登録商標)DNAポリメラーゼ、KOD、Tgo、JDF3、ならびにそれらの突然変異体、バリアント、および誘導体を包含していてもよい(米国特許第5,436,149号;米国特許第4,889,818号;米国特許第4,965,185号;米国特許第5,079,352号;米国特許第5,614,365号;米国特許第5,374,553号;米国特許第5,270,179号;米国特許第5,047,342号;米国特許第5,512,462号;WO92/06188;WO92/06200;WO96/10640;Barnes,W.M.,Gene 112:29-35(1992);Lawyer,F.C.,et al.,PCR Meth.Appl.2:275-287(1993);Flaman,J.-M,et al.,Nuc.Acids Res.22(15):3259-3260(1994)を参照(これらの各々は参照により組み込まれる))。より長い核酸分子(例として、長さが約3～5Kbより長い核酸分子)の合成に、少なくとも2つのDNAポリメラーゼが採用され得る。ある態様において、一方のポリメラーゼは、実質的に3'エキソヌクレアーゼ活性を欠如し得、他方が3'エキソヌクレアーゼ活性を有していてもよい。かかる対形成は、同じかまたは異なるポリメラーゼを包含していてもよい。実質的に3'エキソヌクレアーゼ活性を欠くDNAポリメラーゼの例は、これらに限定されないが、Taq、Tne(exo-)、Tma(exo-)、Pfu(exo-)、Pwo(exo-)、exo-KODおよびTth DNAポリメラーゼ、ならびにそれらの突然変異体、バリアント、および誘導体を包含する。
好ましくは、本明細書に開示のプライム編集因子に使用可能なポリメラーゼは、「鋳型依存性」ポリメラーゼである(なぜならポリメラーゼには、プライム編集最中の合成下でDNA鎖の配列を特定するためのDNA合成鋳型に頼る意図があるから)。本明細書に使用されるとき、用語「鋳型DNA分子」は、相補的な核酸鎖が(例えば、PEgRNAPEgRNAのDNA合成鋳型のプライマー伸長反応における)DNAポリメラーゼによって合成される核酸の鎖を指す。
本明細書に使用されるとき、用語「鋳型依存的なやり方」は、プライマー分子の鋳型依存的な伸長を伴うプロセス(例として、DNAポリメラーゼによるDNA合成)を指すことを意図する。用語「鋳型依存的なやり方」は、RNAまたはDNAのポリヌクレオチド合成を指すが、ここで新しく合成されたポリヌクレオチドの鎖の配列は、相補的な塩基対合の周知の規則によって決定付けられる(例えば、Watson,J.D.et al.,In:Molecular Biology of the Gene,4th Ed.,W.A.Benjamin,Inc.,Menlo Park,Calif.(1987)を参照)。用語「相補的(な)」は、2つのポリヌクレオチド鎖の領域間または塩基対形成による2ヌクレオチド間の配列相補性の広い概念を指す。アデニンヌクレオチドは、チミンまたはウラシルであるヌクレオチドと特定の水素結合(「塩基対合」)を形成することが可能であることが知られている。同様に、シトシンヌクレオチドは、グアニンヌクレオチドとの塩基対合が可能であることが知られている。そのため、プライム編集のケースにおいて、プライム編集因子のポリメラーゼによってDNA合成鋳型に対し合成されたDNAの単鎖が、DNA合成鋳型の配列と「相補的」であると言われることは言えることである。
（i）例示のポリメラーゼ
様々な態様において、本明細書に記載のプライム編集因子は、ポリメラーゼを含む。本開示は、天然に存在するいずれかの生物もしくはウイルスから得られたか、または商業的もしくは非商業的な供給源から得られたいずれの野生型ポリメラーゼも企図する。加えて、本開示のプライム編集因子に使用可能なポリメラーゼは、いずれの天然に存在する突然変異ポリメラーゼ、改変された突然変異ポリメラーゼ、または他のバリアントポリメラーゼ(その機能を保持するトランケートされたバリアント)をも包含し得る。本明細書に使用可能なポリメラーゼはまた、特定のアミノ酸置換(具体的に本明細書に開示されるものなど)を含有するよう改変されていてもよい。好ましいある態様において、本開示のプライム編集因子に使用可能なポリメラーゼは、鋳型ベースのポリメラーゼである、すなわち、これらは鋳型依存的なやり方でヌクレオチド配列を合成する。
ポリメラーゼは、ヌクレオチド鎖を合成する酵素であって、本明細書に記載のプライム編集因子系と関係して使用されてもよい酵素である。ポリメラーゼは、好ましくは「鋳型依存性」ポリメラーゼ(すなわち、鋳型鎖のヌクレオチド塩基の順序に基づきヌクレオチド鎖を合成するポリメラーゼ)である。ある立体配置において、ポリメラーゼはまた、「鋳型に依存しない」(すなわち、鋳型鎖を要求せずにヌクレオチド鎖を合成するポリメラーゼ)でもあり得る。ポリメラーゼはまた、「DNAポリメラーゼ」または「RNAポリメラーゼ」としてさらに分類されてもよい。様々な態様において、プライム編集因子系は、DNAポリメラーゼを含む。様々な態様において、DNAポリメラーゼは、「DNA依存性DNAポリメラーゼ」(すなわち、鋳型分子はDNAの鎖である)であり得る。かかるケースにおいて、DNA鋳型分子はPEgRNAPEgRNAであり得るが、ここで伸長アームはDNAの鎖を含む。かかるケースにおいて、PEgRNAPEgRNAは、RNA部分(すなわち、スペーサーおよびgRNAコアを包含するガイドRNA構成要素)およびDNA部分(すなわち、伸長アーム)を含むキメラまたはハイブリッドPEgRNAPEgRNAと称されることもある。様々な他の態様において、DNAポリメラーゼは、「RNA依存性DNAポリメラーゼ」(すなわち、鋳型分子はRNAの鎖である)であり得る。かかるケースにおいて、PEgRNAPEgRNAはRNAである、すなわち、RNA伸長を包含する。用語「ポリメラーゼ」はまた、ヌクレオチドの重合を触媒(すなわち、ポリメラーゼ活性)する酵素を指すこともある。一般に、酵素は、ポリヌクレオチド鋳型配列とアニールされたプライマー(例として、PEgRNAPEgRNAのプライマー結合部位とアニールされたプライマー配列など)の3'末にて合成を開始して、鋳型鎖の5'末へ進むであろう。「DNAポリメラーゼ」は、デオキシヌクレオチドの重合を触媒する。DNAポリメラーゼを参照して本明細書に使用されるとき、DNAポリメラーゼという用語は、「その機能的フラグメント」を包含する。「その機能的フラグメント」は、ポリメラーゼの全アミノ酸配列未満を包括し、かつ一連の条件のうち少なくとも1の下でポリヌクレオチド重合の触媒能を保持する、野生型または突然変異体のDNAポリメラーゼのいずれの部分も指す。かかる機能的フラグメントは、別々の実体として存在してもよく、または融合タンパク質などのより大きなポリペプチドの構成物質であってもよい。
いくつかの態様において、ポリメラーゼは、バクテリオファージからのものであり得る。バクテリオファージDNAポリメラーゼは一般に、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性がないが、この活性は別個のポリペプチドによってコードされる。好適なDNAポリメラーゼの例は、T4、T7、およびphi29 DNAポリメラーゼである。商業的に利用可能な酵素は以下:T4(多くの供給源、例としてEpicentreから利用可能)およびT7(多くの供給源から利用可能であり、例として未修飾のものについてはEpicentre、および3'→5'エキソT7「Sequenase」DNAポリメラーゼについてはUSB)である。
他の態様、ポリメラーゼは、古細菌ポリメラーゼである。古細菌において同定されたDNAポリメラーゼには異なる2つのクラスがある:1.ファミリーB/pol I型(Pyrococcus furiosusからのPfuのホモログ)および2.pol II型(P.furiosus DP1/DP2 2-サブユニットポリメラーゼのホモログ)。両クラスからのDNAポリメラーゼは、関連する5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を天然に欠くこと、および3'→5'エキソヌクレアーゼ(プルーフリーディング)活性を所有することが示されている。好適なDNAポリメラーゼ(pol Iまたはpol II)は、所望のアッセイ温度と同様の最適な成長温度をもつ古細菌に由来し得る。
耐熱性の古細菌DNAポリメラーゼは、Pyrococcus種(furiosus、種GB-D、woesii、abysii、horikoshii)、Thermococcus種(kodakaraensis KOD1、litoralis、種9 degrees North-7、種JDF-3、gorgonarius)、Pyrodictium occultum、およびArchaeoglobus fulgidusから単離される。
ポリメラーゼはまた、真正細菌種からのものであってもよい。真正細菌DNAポリメラーゼの3つのクラスには、pol I、II、およびIIIがある。Pol I DNAポリメラーゼファミリーの酵素は5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を所有し、あるメンバーはまた、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性も呈する。Pol II DNAポリメラーゼは、天然に5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を欠いているが、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を呈する。Pol III DNAポリメラーゼは、細胞の主要な複製DNAポリメラーゼに相当し、複数のサブユニットから構成される。pol III触媒サブユニットは5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を欠いているが、いくつかのケースにおいて、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性は同じポリペプチド中に位置付けられている。
様々なPol I DNAポリメラーゼが市販されているが、これらのいくつかは、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を低減または無効にするよう修飾されている。
好適な耐熱性pol I DNAポリメラーゼは、Thermus aquaticus(Taq)、Thermus thermophilus(Tth)、およびThermotoga maritima(Tma UlTma)などのThermus種およびThermotoga maritimaを包含する、様々なthermophilic eubacteriaから単離され得る。
追加の真正細菌(eubacteria)は、上に列挙されたものに関し、Thermophilic Bacteria(Kristjansson,J.K.,ed.)CRC Press,Inc.,Boca Raton,Fla.,1992に記載されている。
本発明はさらに、米国特許第5,677,152号、第6,479,264号、および第6,183,998号(これらの内容はそれら全体が参照されることにより本明細書に組み込まれる)に開示された方法に従って化学修飾された、キメラまたは非キメラのDNAポリメラーゼを提供する。
上に列挙されたものに関する追加の古細菌DNAポリメラーゼは、以下の参考文献:Archaea:A Laboratory Manual(Robb,F.T. and Place,A.R.,eds.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1995およびThermophilic Bacteria(Kristjansson,J.K.,ed.)CRC Press,Inc.,Boca Raton,Fla.,1992に記載されている。
（ii）B．例示の逆転写酵素
様々な態様において、本明細書に開示のプライム編集因子(PE)系は、逆転写酵素、またはそのバリアントを包含する。
逆転写酵素は多機能酵素であって、典型的には、RNA-およびDNA依存性DNA重合活性、ならびにRNA-DNAハイブリッド中のRNAの切断を触媒するRNaseH活性を包含する3酵素活性をもつ。逆転写酵素のいくつかの突然変異体は、mRNAへの意図しない損傷を防止する、動作しない(disabled)RNaseH部分を有する。mRNAを鋳型として使用して相補的なDNA(cDNA)を合成するこれらの酵素は、最初にRNAウイルスにおいて同定された。続いて逆転写酵素がウイルス粒子、細胞、または組織から直接単離、精製された。(例として、Kacian et al.,1971,Biochim.Biophys.Acta 46:365-83;Yang et al.,1972,Biochem.Biophys.Res.Comm.47:505-11;Gerard et al.,1975,J.Virol.15:785-97;Liu et al.,1977,Arch.Virol.55 187-200;Kato et al.,1984,J.Virol.Methods 9:325-39;Luke et al.,1990,Biochem.29:1764-69およびLe Grice et al.,1991,J.Virol.65:7004-07を参照(これらの各々は参照により組み込まれる)。近年になって、突然変異体および融合タンパク質が、熱安定性、忠実性(fidelity)、および活性などの改善された特性について探求した際に創出された。当該技術分野において知られているかもしくは当該技術分野において知られている方法を使用して作製され得る逆転写酵素の野生型、バリアント、および/または突然変異型のいずれも、本明細書に企図される。
逆転写酵素(RT)遺伝子(またはこれに含有される遺伝情報)は、数多の種々の供給源から得られ得る。実例として、遺伝子は、レトロウイルスに感染した真核細胞から、またはレトロウイルスゲノムの一部もしくは全部のいずれかを含有する数多のプラスミドから得られてもよい。加えて、RT遺伝子を含有するメッセンジャーRNA様RNAも、レトロウイルスから得られ得る。RTの供給源の例は、これらに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス(M-MLVまたはMLVRT); 1型ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV-1);牛白血病ウイルス(BLV);ラウス肉腫ウイルス(RSV);ヒト免疫不全ウイルス(HIV);Saccharomyces、Neurospora、Drosophilaを包含する酵母;霊長目の動物;および齧歯類の動物を包含する。例えば、Weissら、米国特許第4,663,290号(1987);Gerard,G.R.,DNA:271-79(1986);Kotewicz,M.L.,et al.,Gene 35:249-58(1985);Tanese,N.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA):4944-48(1985);Roth,M.J.,at al.,J.Biol.Chem.260:9326-35(1985);Michel,F.,et al.,Nature 316:641-43(1985);Akins,R.A.,et al.,Cell 47:505-16(1986),EMBO J.4:1267-75(1985);およびFawcett,D.F.,Cell 47:1007-15(1986)を参照(これらの各々は、それらの全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)。
（a）野生型RT
本明細書に開示されたプライム編集因子とともに使用されるための例示の酵素は、これらに限定されないが、M-MLV逆転写酵素およびRSV逆転写酵素を包含し得る。逆転写酵素活性を有する酵素は市販されている。ある態様において、逆転写酵素は、プライム編集因子(PE)系の他の構成要素に対してtransで提供される。つまり、逆転写酵素は発現されるか、または個々の構成要素として、すなわち、napDNAbpをもつ融合タンパク質としてではなく別様に提供される。
当業者は、これらに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV);ヒト免疫不全ウイルス(HIV)逆転写酵素、ならびにトリ肉腫-白血病ウイルス(ASLV)逆転写酵素(これは、これらに限定されないが、ラウス肉腫ウイルス(RSV)逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)逆転写酵素、トリ赤芽球症ウイルス(AEV)ヘルパーウイルスMCAV逆転写酵素、トリ骨髄細胞腫症ウイルスMC29ヘルパーウイルスMCAV逆転写酵素、トリ細網内皮症ウイルス(REV-T)ヘルパーウイルスREV-A逆転写酵素、トリ肉腫ウイルスUR2ヘルパーウイルスUR2AV逆転写酵素、トリ肉腫ウイルスY73ヘルパーウイルスYAV逆転写酵素、ラウス関連ウイルス(RAV)逆転写酵素、および骨髄芽球症関連ウイルス(MAV)逆転写酵素を包含する)を包含する野生型逆転写酵素が、本明細書に記載される対象の方法および組成物において好適に使用されてもよいことを認識するであろう。
例示の野生型RT酵素は以下のとおりである:
Figure 2022531539000051
Figure 2022531539000052
Figure 2022531539000053
（b）バリアントRT
様々な態様において、逆転写酵素は、バリアント逆転写酵素であってもよい。本明細書に使用されるとき、「バリアント逆転写酵素」は、参照配列(例として、参照野生型配列)と比べて1以上の突然変異(唯一の突然変異、逆位、欠失、挿入、および再配置を包含する)を含む、天然に存在するかまたは遺伝子学的に改変されたいずれのバリアントも包含する。RTは、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性、リボヌクレアーゼH活性、およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性を包含する数種の活性を天然に有する。集合的に、これらの活性は、酵素に、単鎖RNAを変換して二本鎖cDNAにすることができるようにさせる。レトロウイルスおよびレトロトランスポゾンにおいて、このcDNAは次いで、宿主ゲノム中へ取り入れられ得、前記ゲノムから新しいRNAコピーが宿主細胞転写を介して作製され得る。バリアントRTは、これらの活性の1以上に影響を与える突然変異(これらの活性を低減もしくは増大させるか、またはこれらの活性すべて合わせて削減させるかのいずれか)を含んでいてもよい。加えて、バリアントRTは、RTを、多かれ少なかれ安定させ、凝集させにくくさせ、ならびに精製および/または検出、および/または特性もしくは特徴への他の修飾を容易にさせる1以上の突然変異を含んでいてもよい。
当業者は、これらに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV);ヒト免疫不全ウイルス(HIV)逆転写酵素、ならびにトリ肉腫-白血病ウイルス(ASLV)逆転写酵素(これは、これらに限定されないが、ラウス肉腫ウイルス(RSV)逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)逆転写酵素、トリ赤芽球症ウイルス(AEV)ヘルパーウイルスMCAV逆転写酵素、トリ骨髄細胞腫症ウイルスMC29ヘルパーウイルスMCAV逆転写酵素、トリ細網内皮症ウイルス(REV-T)ヘルパーウイルスREV-A逆転写酵素、トリ肉腫ウイルスUR2ヘルパーウイルスUR2AV逆転写酵素、トリ肉腫ウイルスY73ヘルパーウイルスYAV逆転写酵素、ラウス関連ウイルス(RAV)逆転写酵素、および骨髄芽球症関連ウイルス(MAV)逆転写酵素を包含する)を包含する他の逆転写酵素に由来するバリアント逆転写酵素が、本明細書に記載される対象の方法および組成物において好適に使用されてもよいことを認識するであろう。
バリアントRTを調製する1つの方法は、遺伝子の修飾による(例として、野生型逆転写酵素のDNA配列を修飾することによる)ものである。DNA配列のランダム突然変異ならびに標的化突然変異を可能にする数多の方法が当該技術分野において知られている(例えば、Ausubel et.al.Short Protocols in Molecular Biology(1995) 3.sup.rd Ed.John Wiley & Sons,Inc.を参照)。加えて、従来法とPCRベースの方法との両方を包含する、部位特異的変異誘発のための市販キットが数多ある。例は、QuikChange部位特異的変異誘発キット(AGILENT(登録商標))、Q5(登録商標)部位特異的変異誘発キット(NEW ENGLAND BIOLABS(登録商標))、およびGeneArt(商標)部位特異的変異誘発システム(THERMOFISHERER SCIENTIFIC(登録商標))を包含する。
加えて、突然変異逆転写酵素は、当業者に知られている方法論に従い、挿入突然変異あるいはトランケーション(N末端の、内部の、もしくはC末端の、挿入またはトランケーション)によって生成されてもよい。用語「突然変異」は、本明細書に使用されるとき、配列(例として、核酸配列もしくはアミノ酸配列)内のある残基の別の残基との置換、または配列内の1以上の残基の欠失もしくは挿入を指す。突然変異は典型的には、元の残基を、これに続き配列内の残基の位置を同定することによること、および新しく置換された残基の同定によることが、本明細書に記載されている。本明細書に提供されるアミノ酸置換(突然変異)を作製するための様々な方法は、当該技術分野において周知であって、例えば、Green and Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012))によって提供されている。突然変異は、一塩基多型、微細重複(microduplication)領域、インデル、および逆位などの様々なカテゴリーを包含し得、いずれにしても限定することは意図していない。突然変異は、タンパク質活性を低減または無効する突然変異の正常な結果である「機能喪失型」突然変異を包含し得る。ヘテロ接合体において、第2染色体のコピーが、完全に機能的なタンパク質をコードする遺伝子の未突然変異バージョン(この存在によって突然変異の効果が補われる)を持つことから、ほとんどの機能喪失型突然変異は潜性である。突然変異はまた、タンパク質または細胞に対して正常でない活性(これがなければ正常な状態では存在しない)を付与する「機能獲得型」突然変異も網羅する。多くの機能獲得型突然変異は、コード領域中よりむしろ調節配列中にあり、したがって、数多の因果関係を有し得る。例えば、突然変異は、1以上の遺伝子が不適切な組織中で発現されることへ繋がり得、これらの組織は通常欠如している機能を獲得する。それらの性質のせいで、機能獲得型突然変異は大抵、顕性である。
当該技術分野において知られている部位特異的変異誘発の古くからある方法は、突然変異させるべき配列の、ベクター(M13バクテリオファージベクターなど)中へのサブクローニングに依存し、これによって単鎖DNA鋳型の単離が可能になる。これらの方法において、変異誘発プライマー(すなわち、突然変異させるべき部位とアニールすることが可能であるが、突然変異させるべき部位にてミスマッチした1以上のヌクレオチドを担持するプライマー)を単鎖鋳型とアニールさせ、次いで変異誘発プライマーの3'末から開始して鋳型の相補体を重合する。その結果得られた二重鎖は次いで宿主細菌中へ形質転換され、溶菌斑は所望の突然変異に対してスクリーニングされる。
近年になって、部位特異的変異誘発は、単鎖鋳型を要さないという利点を有するPCR方法論に採用されている。加えて、サブクローニングを要さない方法も開発されている。PCRベースの部位特異的変異誘発が実施されたときに数種の問題点を考慮しなければならない。第1に、これらの方法において、ポリメラーゼによって導入される望ましくない突然変異の拡大を防止するために、PCRサイクル数を低減させることが所望される。第2に、反応にとどまっている、突然変異していない親分子の数を低減させるために、選択を採用しなければならない。第3に、単一のPCRプライマーセットの使用を可能にするために、長さが伸長される(extended-length)PCR法が好ましい。および第4に、いくつかの耐熱性ポリメラーゼの鋳型非依存性の末端伸長活性のせいで、PCRによって生成された突然変異産物の平滑端ライゲーションに先立つ手順中へ、末端ポリッシング(end-polishing)ステップを組み込むことがしばしば必要となる。
ランダムに位置される(situated)1以上の突然変異を担持する突然変異体の集団(panel)をもたらすであろうランダム変異誘発の方法は、当該技術分野において存在する。突然変異体の集団は次いで、所望の特性、例えば、野生型逆転写酵素と比べて増大した安定性を呈するものについてスクリーニングされてもよい。
ランダム変異誘発のための方法の例は、所謂「エラーを起こしやすいPCR法」である。その名称が暗示するとおり、方法は、DNAポリメラーゼが高忠実度の組み込みをサポートしない条件下で所定の配列を増幅する。種々のDNAポリメラーゼのための、エラーを起こしやすい組み込みを促す条件は変動するが、当業者は、所定の酵素のためのかかる条件を決定し得る。多くのDNAポリメラーゼのための、増幅の忠実度において鍵となる変数は、例えば、緩衝液中の二価金属イオンの種類および濃度である。したがって、マンガンイオンの使用、および/またはマグネシウムイオンもしくはマンガンイオンの濃度バリエーションは、ポリメラーゼの誤差率に影響を及ぼすために適用されてもよい。
様々な側面において、プライム編集因子のRTは、「エラーを起こしやすい」逆転写酵素バリアントであってもよい。当該技術分野において知られているかおよび/または利用可能である、エラーを起こしやすい逆転写酵素は、使用されてもよいものである。加えて、RTは、ファージアシスト(phage-assisted)連続進化(PACE)またはファージアシスト非連続進化(PANCE)などの指向進化プロセスを包含する、変異誘発のこれまでに言及されたいずれの方法も使用して、作製されてもよい。用語「ファージアシスト連続進化(PACE)」は、本明細書に使用されるとき、ファージをウイルスベクターとして採用する連続進化を指す。PACE技術の一般の概念は、例えば、2009年9月8日に出願された国際PCT出願PCT/US2009/056194(2010年3月11日にWO2010/028347として公開された);2011年12月22日に出願された国際PCT出願PCT/US2011/066747(2012年6月28日にWO2012/088381として公開された);米国出願の、2015年5月5日に発行された米国特許第9,023,594;2015年1月20日に出願された国際PCT出願PCT/US2015/012022(2015年9月11日にWO2015/134121として公開された);および2016年4月15日に出願された国際PCT出願PCT/US2016/027795(2016年10月20日にWO2016/168631として公開された)(これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。エラーを起こしやすい逆転写酵素もまたファージアシスト非連続進化(PANCE)」によって得られてもよく、これは本明細書に使用されるときファージをウイルスベクターとして採用する非連続進化を指す。PANCEは、進化させるべき着目遺伝子を含有する「選択ファージ」(SP)を進化させる、新たなE.coli宿主細胞にわたって連続的フラスコ移動(serial flask transfers)を使用する、迅速なin vivo指向進化のための簡易技法であって、これによって、SP中に含有される遺伝子が絶えず進化する間ずっと、遺伝子が宿主E.coli内部に持続して保持され得る。連続的フラスコ移動は長いこと微生物の実験室進化のために幅広く利用しやすいアプローチとして役立っていたが、近年になって類似のアプローチがバクテリオファージ進化のために開発された。PANCE系は、PACE系より低いストリンジェンシー(stringency)を特色とする。
変異誘発または進化プロセスによって生成された所望の突然変異逆転写酵素の遺伝子は、突然変異の部位および数を同定するために配列決定されてもよい。1より多くの突然変異を含むそれら突然変異体のための、所定の突然変異の効果は、同定された突然変異の野生型遺伝子への部位特異的変異誘発による導入、具体的な突然変異体によって負わされた他の突然変異からの単離によって、評価されてもよい。次いで、こうして産生された単一突然変異体のスクリーニングアッセイによって、その突然変異単独での効果の決定が可能になるであろう。
本明細書に使用されるバリアントRT酵素はまた、いずれの参照RTタンパク質と少なくとも約70％同一の、少なくとも約80％同一の、少なくとも約90％同一の、少なくとも約95％同一の、少なくとも約96％同一の、少なくとも約97％同一の、少なくとも約98％同一の、少なくとも約99％同一の、少なくとも約99.5％同一の、もしくは少なくとも約99.9％同一の、他の「RTバリアント」も包含してもよく、いずれの野生型RT、あるいは突然変異体RT、あるいはフラグメントRT、あるいは本明細書に開示もしくは企図されるかまたは当該技術分野において知られているRTの他のバリアントも包含する。
いくつかの態様において、RTバリアントは、参照RTと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、または最大100までの、または最大200までの、または最大300までの、または最大400までの、または最大500までの、またはこれより多くのアミノ酸変化を有していてもよい。いくつかの態様において、RTバリアントは、そのフラグメントが、参照RTの対応するフラグメントと少なくとも約70％同一、少なくとも約80％同一、少なくとも約90％同一、少なくとも約95％同一、少なくとも約96％同一、少なくとも約97％同一、少なくとも約98％同一、少なくとも約99％同一、少なくとも約99.5％同一、または少なくとも約99.9％同一であるように、参照RTのフラグメントを含む。いくつかの態様において、フラグメントは、対応する野生型RT(例として、配列番号1361485)のアミノ酸長の少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％である。
いくつかの態様において、本開示はまた、それらの機能性を保持しかつ本明細書に開示されたいずれのRTタンパク質のフラグメントでもあるRTフラグメントを利用してもよい。いくつかの態様において、RTフラグメントは、長さが少なくとも100アミノ酸である。いくつかの態様において、フラグメントは、長さが少なくとも100、150、200、250、300、350、400、450、500、550アミノ酸、または最大600までのアミノ酸、またはこれより多いアミノ酸である。
更なる他の態様において、本開示はまた、充分なポリメラーゼ機能を依然保持するトランケートされたバリアントをもたらす、あるアミノ酸数の分、N末端もしくはC末端にてまたはその両方にてトランケートされたRTバリアントを利用してもよい。いくつかの態様において、トランケートされたRTバリアントは、タンパク質のN末端にて、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、または250アミノ酸のトランケーションを有する。他の態様において、トランケートされたRTバリアントは、タンパク質のC末端にて、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、または250アミノ酸のトランケーションを有する。更なる他の態様において、トランケートされたRTバリアントは、同じかまたは異なる長さであるN末端およびC末端にてトランケーションを有する。
例えば、本明細書に開示のプライム編集因子は、M-MLV逆転写酵素のトランケートされたバージョンを包含していてもよい。この態様において、逆転写酵素は、4突然変異(D200N、T306K、W313F、T330Pを含有する;PE2に存在するL603W突然変異は、もはやトランケーションに起因して存在するものではないことに留意)。トランケートされたこの編集因子をコードするDNA配列はPE2より522bp小さく、したがって、DNA配列の送達がそのサイズに起因して困難(すなわち、アデノ随伴ウイルスおよびレンチウイルスの送達)となる用途を潜在的に有用なものにさせる。この態様は、MMLV-RT(trunc)と称され、以下のアミノ酸配列を有する:
Figure 2022531539000054
Figure 2022531539000055
様々な態様において、本明細書に開示のプライム編集因子は、以下に記載のとおりのあるCas9のバリアント、またはいずれの参照RTバリアントと少なくとも約70％同一の、少なくとも約80％同一の、少なくとも約90％同一の、少なくとも約95％同一の、少なくとも約96％同一の、少なくとも約97％同一の、少なくとも約98％同一の、少なくとも約99％同一の、少なくとも約99.5％同一の、もしくは少なくとも約99.9％同一のそのRTバリアントを含んでいてもよい。
エラーを起こしやすい他の逆転写酵素は文献に記載されており、それらの各々は本明細書の方法および組成物における使用に企図される。例えば、エラーを起こしやすい逆転写酵素は、Bebenek et al.,"Error-prone Polymerization by HIV-1 Reverse Transcriptase,"J Biol Chem,1993,Vol.268:10324-10334およびSebastian-Martin et al.,"Transcriptional inaccuracy threshold attenuates differences in RNA-dependent DNA synthesis fidelity between retroviral reverse transcriptases,"Scientific Reports,2018,Vol.8:627(これらの各々は参照により組み込まれる)に記載されている。またさらに、エラーを起こしやすい逆転写酵素を包含する逆転写酵素は、商業的供給者から得られ得、ProtoScript(登録商標)(II)逆転写酵素、AMV逆転写酵素、WarmStart(登録商標)逆転写酵素、およびM-MuLV逆転写酵素(すべてNEW ENGLAND BIOLABS(登録商標)から)、またはAMV逆転写酵素XL、SMARTScribe逆転写酵素、GPR ultra-pure MMLV逆転写酵素(すべてTAKARA BIO USA,INC.(かつてのCLONTECH)から)を包含する。
更なる他の態様において、本方法および本組成物は、Effefson et al.,"Synthetic evolutionary origin of a proofreading reverse transcriptase,"Science,June 24,2016,Vol.352:1590-1593(これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるとおり、逆転写酵素に進化させられたDNAポリメラーゼを利用してもよい。
いくつかの態様において、融合タンパク質の構成要素として提供される逆転写酵素はまた、napDNAbpも含む。換言すれば、いくつかの態様において、逆転写酵素は、融合タンパク質として、napDNAbpと融合している。
本開示の様々な態様に従ってnapDNAbpタンパク質と融合され得るかまたは個々のタンパク質として提供され得る、いくつかの例示の逆転写酵素は、下に提供されている。例示の逆転写酵素は、以下の野生型酵素もしくはその酵素部分と、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％の配列同一性をもつバリアントを包含する:
Figure 2022531539000056
Figure 2022531539000057
Figure 2022531539000058
Figure 2022531539000059
様々な態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RT中、または別の野生型RTポリペプチド配列中の対応するアミノ酸位置にて、以下の突然変異の1以上を含むバリアントRTを包含し得る:P51L、S67K、E69K、L139P、T197A、D200N、H204R、F209N、E302K、E302R、T306K、F309N、W313F、T330P、L345G、L435G、N454K、D524G、E562Q、D583N、H594Q、L603W、E607K、またはD653N。
様々な他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RTにおいて、または別の野生型RTポリペプチド配列において対応するアミノ酸位置にて、以下の突然変異:P51X、S67X、E69X、L139X、T197X、D200X、H204X、F209X、E302X、T306X、F309X、W313X、T330X、L345X、L435X、N454X、D524X、E562X、D583X、H594X、L603X、E607X、またはD653Xの1以上を含むバリアントRTを包含し得るが、ここで「X」は、いずれのアミノ酸でもあり得る。
様々な他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RTにおいて、または別の野生型RTポリペプチド配列において対応するアミノ酸位置にて、P51X突然変異を含むバリアントRTを包含し得るが、ここで「X」は、いずれのアミノ酸でもあり得る。いくつかの態様において、Xは、Lである。
様々な他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RTにおいて、または別の野生型RTポリペプチド配列において対応するアミノ酸位置にて、S67X突然変異を含むバリアントRTを包含し得るが、ここで「X」は、いずれのアミノ酸でもあり得る。いくつかの態様において、Xは、Kである。
様々な他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RTにおいて、または別の野生型RTポリペプチド配列において対応するアミノ酸位置にて、E69X突然変異を含むバリアントRTを包含し得るが、ここで「X」は、いずれのアミノ酸でもあり得る。いくつかの態様において、Xは、Kである。
様々な他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RTにおいて、または別の野生型RTポリペプチド配列において対応するアミノ酸位置にて、L139X突然変異を含むバリアントRTを包含し得るが、ここで「X」は、いずれのアミノ酸でもあり得る。いくつかの態様において、Xは、Pである。
様々な他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RTにおいて、または別の野生型RTポリペプチド配列において対応するアミノ酸位置にて、T197X突然変異を含むバリアントRTを包含し得るが、ここで「X」は、いずれのアミノ酸でもあり得る。いくつかの態様において、Xは、Aである。
様々な他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RTにおいて、または別の野生型RTポリペプチド配列において対応するアミノ酸位置にて、D200X突然変異を含むバリアントRTを包含し得るが、ここで「X」は、いずれのアミノ酸でもあり得る。いくつかの態様において、Xは、Nである。
様々な他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RTにおいて、または別の野生型RTポリペプチド配列において対応するアミノ酸位置にて、H204X突然変異を含むバリアントRTを包含し得るが、ここで「X」は、いずれのアミノ酸でもあり得る。いくつかの態様において、Xは、Rである。
様々な他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RTにおいて、または別の野生型RTポリペプチド配列において対応するアミノ酸位置にて、F209X突然変異を含むバリアントRTを包含し得るが、ここで「X」は、いずれのアミノ酸でもあり得る。いくつかの態様において、Xは、Nである。
様々な他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RTにおいて、または別の野生型RTポリペプチド配列において対応するアミノ酸位置にて、E302X突然変異を含むバリアントRTを包含し得るが、ここで「X」は、いずれのアミノ酸でもあり得る。いくつかの態様において、Xは、Kである。
様々な他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RTにおいて、または別の野生型RTポリペプチド配列において対応するアミノ酸位置にて、E302X突然変異を含むバリアントRTを包含し得るが、ここで「X」は、いずれのアミノ酸でもあり得る。いくつかの態様において、Xは、Rである。
様々な他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RTにおいて、または別の野生型RTポリペプチド配列において対応するアミノ酸位置にて、T306X突然変異を含むバリアントRTを包含し得るが、ここで「X」は、いずれのアミノ酸でもあり得る。いくつかの態様において、Xは、Kである。
様々な他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RTにおいて、または別の野生型RTポリペプチド配列において対応するアミノ酸位置にて、F309X突然変異を含むバリアントRTを包含し得るが、ここで「X」は、いずれのアミノ酸でもあり得る。いくつかの態様において、Xは、Nである。
様々な他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RTにおいて、または別の野生型RTポリペプチド配列において対応するアミノ酸位置にて、W313X突然変異を含むバリアントRTを包含し得るが、ここで「X」は、いずれのアミノ酸でもあり得る。いくつかの態様において、Xは、Fである。
様々な他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RTにおいて、または別の野生型RTポリペプチド配列において対応するアミノ酸位置にて、T330X突然変異を含むバリアントRTを包含し得るが、ここで「X」は、いずれのアミノ酸でもあり得る。いくつかの態様において、Xは、Pである。
様々な他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RTにおいて、または別の野生型RTポリペプチド配列において対応するアミノ酸位置にて、L345X突然変異を含むバリアントRTを包含し得るが、ここで「X」は、いずれのアミノ酸でもあり得る。いくつかの態様において、Xは、Gである。
様々な他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RTにおいて、または別の野生型RTポリペプチド配列において対応するアミノ酸位置にて、L435X突然変異を含むバリアントRTを包含し得るが、ここで「X」は、いずれのアミノ酸でもあり得る。いくつかの態様において、Xは、Gである。
様々な他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RTにおいて、または別の野生型RTポリペプチド配列において対応するアミノ酸位置にて、N454X突然変異を含むバリアントRTを包含し得るが、ここで「X」は、いずれのアミノ酸でもあり得る。いくつかの態様において、Xは、Kである。
様々な他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RTにおいて、または別の野生型RTポリペプチド配列において対応するアミノ酸位置にて、D524X突然変異を含むバリアントRTを包含し得るが、ここで「X」は、いずれのアミノ酸でもあり得る。いくつかの態様において、Xは、Gである。
様々な他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RTにおいて、または別の野生型RTポリペプチド配列において対応するアミノ酸位置にて、E562X突然変異を含むバリアントRTを包含し得るが、ここで「X」は、いずれのアミノ酸でもあり得る。いくつかの態様において、Xは、Qである。
様々な他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RTにおいて、または別の野生型RTポリペプチド配列において対応するアミノ酸位置にて、D583X突然変異を含むバリアントRTを包含し得るが、ここで「X」は、いずれのアミノ酸でもあり得る。いくつかの態様において、Xは、Nである。
様々な他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RTにおいて、または別の野生型RTポリペプチド配列において対応するアミノ酸位置にて、H594X突然変異を含むバリアントRTを包含し得るが、ここで「X」は、いずれのアミノ酸でもあり得る。いくつかの態様において、Xは、Qである。
様々な他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RTにおいて、または別の野生型RTポリペプチド配列において対応するアミノ酸位置にて、L603X突然変異を含むバリアントRTを包含し得るが、ここで「X」は、いずれのアミノ酸でもあり得る。いくつかの態様において、Xは、Wである。
様々な他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RTにおいて、または別の野生型RTポリペプチド配列において対応するアミノ酸位置にて、E607X突然変異を含むバリアントRTを包含し得るが、ここで「X」は、いずれのアミノ酸でもあり得る。いくつかの態様において、Xは、Kである。
様々な他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(融合のパートナーとしてかまたはtransで提供されるRTをもつ)は、配列番号1361485の野生型M-MLV RTにおいて、または別の野生型RTポリペプチド配列において対応するアミノ酸位置にて、D653X突然変異を含むバリアントRTを包含し得るが、ここで「X」は、いずれのアミノ酸でもあり得る。いくつかの態様において、Xは、Nである。
本明細書に記載のプライム編集因子(PE)系は、以下の米国特許(これらの各々はそれら全体が参照されることにより組み込まれる):米国特許第10,202,658号;第10,189,831号;第10,150,955号;第9,932,567号;第9,783,791号;第9,580,698号;第9,534,201号;および第9,458,484号のいずれに記載または開示された、公的に利用可能ないずれの逆転写酵素、ならびに突然変異を組み入れるための知られている方法、またはタンパク質を進化させるための知られている方法を使用して作製され得るそのいずれのバリアントを企図する。以下の参考文献は、 describe当該技術分野における逆転写酵素を記載する。それら開示の各々は、それら全体が参照されることにより本明細書に組み込まれる。
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逆転写酵素に関する上記参考文献のいずれも、それら全体が参照されることにより本明細書に組み込まれる(まだそのように規定されていない場合も)。
D．PE融合タンパク質
本明細書に記載のプライム編集因子(PE)系は、napDNAbpとポリメラーゼ(例として、DNA依存性DNAポリメラーゼ、または逆転写酵素などのRNA依存性DNAポリメラーゼ)とを任意にリンカーによって結び合わされて含む融合タンパク質を企図する。本出願は、単一の融合タンパク質において組み合わされるべきいずれの好適なnapDNAbpおよびポリメラーゼ(例として、DNA依存性DNAポリメラーゼ、または逆転写酵素などのRNA依存性DNAポリメラーゼ)も企図する。napDNAbpsおよびポリメラーゼ(例として、DNA依存性DNAポリメラーゼ、または逆転写酵素などのRNA依存性DNAポリメラーゼ)の例は各々、本明細書に定義される。ポリメラーゼは当該技術分野において周知であって、アミノ酸配列は容易に利用可能であることから、本開示が、本明細書に同定されるそれら特定のポリメラーゼに限定されるのは、いずれにしても意図しない。
様々な態様において、融合タンパク質は、いずれも好適な構造上の立体配置を含んでいてもよい。例えば、融合タンパク質は、N末端からC末端の方向へ、ポリメラーゼ(例として、DNA依存性DNAポリメラーゼ、または逆転写酵素などのRNA依存性DNAポリメラーゼ)と融合したnapDNAbpを含んでいてもよい。他の態様において、融合タンパク質は、N末端からC末端の方向へ、napDNAbpと融合したポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)を含んでいてもよい。融合したドメインは任意に、リンカー、例として、アミノ酸配列によって結び合わされていてもよい。他の態様において、融合タンパク質は、構造NH2-[napDNAbp]-[ポリメラーゼ]-COOH;またはNH2-[ポリメラーゼ]-[napDNAbp]-COOHを含んでいてもよく、ここで「 ]-[ 」の各場合は、任意のリンカー配列の存在を示す。ポリメラーゼが逆転写酵素である態様において、融合タンパク質は、構造NH2-[napDNAbp]-[RT]-COOH;またはNH2-[RT]-[napDNAbp]-COOHを含んでいてもよく、ここで「 ]-[ 」の各場合は、任意のリンカー配列の存在を示す。
例示の融合タンパク質は図14に描かれており、リンカー配列を介してニッカーゼCas9(「Cas9(H840A)」)と融合したMLV逆転写酵素(「MLV-RT」)を含む融合タンパク質を示す。この例は、本明細書に記載のプライム編集因子(PE)系に利用されてもよい融合タンパク質の範囲を限定することは意図していない。
様々な態様において、プライム編集因子融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列(本明細書中「PE1」として言及される)を有していてもよく、これは、H840A突然変異を含むCas9バリアント(すなわち、Cas9ニッカーゼ)およびM-MLV RT野生型、ならびにN末端NLS配列(19アミノ酸)およびアミノ酸リンカー(32アミノ酸)(C末端Cas9のニッカーゼドメインをRTドメインのN末端へ結び合わせる)を包含する。PE1融合タンパク質は以下の構造を有する:[NLS]-[Cas9(H840A)]-[リンカー]-[MMLV_RT(wt)]。PE1のアミノ酸配列およびその個々の構成要素は、以下のとおりである:
Figure 2022531539000060
別の態様において、プライム編集因子融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列(本明細書中「PE2」として言及される)を有していてもよく、これは、H840A突然変異を含むCas9バリアント(すなわち、Cas9ニッカーゼ)、および突然変異D200N、T330P、L603W、T306K、およびW313Fを含むM-MLV RT、ならびにN末NLS配列(19アミノ酸)およびアミノ酸リンカー(33アミノ酸)(C末端Cas9のニッカーゼドメインをRTドメインのN末端へ結び合わせる)を包含する。PE2融合タンパク質は以下の構造を有する:[NLS]-[Cas9(H840A)]-[リンカー]-[MMLV_RT(D200N)(T330P)(L603W)(T306K)(W313F)]。PE2のアミノ酸配列は以下のとおりである:
Figure 2022531539000061
更なる他の態様において、プライム編集因子融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列を有していてもよい:
Figure 2022531539000062
Figure 2022531539000063
Figure 2022531539000064
様々な態様において、本明細書に企図されるプライム編集因子融合タンパク質はまた、PE1、PE2、もしくは上に示されるプライム編集因子融合配列のいずれかと、少なくとも約70％同一の、少なくとも約80％同一の、少なくとも約90％同一の、少なくとも約95％同一の、少なくとも約96％同一の、少なくとも約97％同一の、少なくとも約98％同一の、少なくとも約99％同一の、少なくとも約99.5％同一の、または少なくとも約99.9％同一のアミノ酸配列を有する上に開示された配列のいずれのバリアントも包含していてもよい。
いくつかの態様において、リンカーは、本発明のペプチドまたはペプチドドメインもしくは部分のいずれかを連結させるために使用されてもよい(例として、逆転写酵素と連結または融合したnapDNAbp)。
他の態様において、プライム編集因子融合タンパク質は、以下の例示の配列などの、変更されたPAM特異性をもつSaCas9またはSpCas9ニッカーゼに基づき得る:
Figure 2022531539000065
Figure 2022531539000066
Figure 2022531539000067
もう1つの他の態様において、本明細書に企図されるプライム編集因子融合タンパク質は、トランケートされたバージョンのM-MLV逆転写酵素と融合したCas9ニッカーゼ(例として、Cas9(H840A))を包含していてもよい。この態様において、逆転写酵素はまた、4突然変異(D200N、T306K、W313F、T330P; PE2に存在するL603W突然変異は、もはやトランケーションに起因して存在するものではないことに留意)も含有する。トランケートされたこの編集因子をコードするDNA配列はPE2より522bp小さく、したがって、DNA配列の送達がそのサイズに起因して困難(すなわち、アデノ随伴ウイルスおよびレンチウイルスの送達)となる用途を潜在的に有用なものにさせる。この態様は、Cas9(H840A)-MMLV-RT(trunc)または「PE2-短い」もしくは「PE2-trunc」と称され、以下のアミノ酸配列を有する:
Figure 2022531539000068
Figure 2022531539000069
様々な細胞株における種々の標的部位に対するPE2、PE2-trunc、PE3、およびPE3-truncの効率(すなわち、「編集またはインデルが特定された配列決定総読取の％」)を含むバーグラフを提供する図36を参照。データは、トランケートRTバリアントを含むプライム編集因子が、非トランケート型RTタンパク質を含むプライム編集因子とほぼ同程度に効率的であったことを示す。
様々な態様において、本明細書に企図されるプライム編集因子融合タンパク質はまた、PE1、PE2、もしくは上に示されたプライム編集因子融合配列のいずれかと、少なくとも約70％同一の、少なくとも約80％同一の、少なくとも約90％同一の、少なくとも約95％同一の、少なくとも約96％同一の、少なくとも約97％同一の、少なくとも約98％同一の、少なくとも約99％同一の、少なくとも約99.5％同一の、または少なくとも約99.9％同一のアミノ酸配列を有する上に開示された配列のいずれのバリアントも包含していてもよい。
ある態様において、リンカーは、本発明のペプチドまたはペプチドドメインもしくは部分のいずれかを連結させるために使用されてもよい(例として、逆転写酵素と連結または融合したnapDNAbp)。
E．リンカーおよび他の融合タンパク質ドメイン
PE融合タンパク質は、napDNAbp(例として、Cas9ドメイン)およびポリメラーゼドメイン(例として、RTドメイン)の他に、様々な他のドメインを含んでいてもよい。例えば、napDNAbpがCas9でありかつポリメラーゼがRTであるケースにおいて、PE融合タンパク質は、Cas9ドメインをRTドメインと結び合わせる1以上のリンカーを含んでいてもよい。リンカーはまた、核局在化配列(NLS)またはFEN1(もしくは他のフラップエンドヌクレアーゼ)などの他の機能的ドメインも、PE融合タンパク質またはそのドメインへ結び合わせてもよい。
（i）リンカー
上に定義されるとおり、用語「リンカー」は、本明細書に使用されるとき、2つの分子もしくは部分(例として、ヌクレアーゼの結合ドメインおよび切断ドメイン)を連結する化学基または分子を指す。いくつかの態様において、リンカーは、RNAプログラム型ヌクレアーゼのgRNA結合ドメインとポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)の触媒ドメインとを結び合わせる。いくつかの態様において、リンカーは、dCas9と逆転写酵素とを結び合わせる。典型的には、リンカーは、2つの基、2つの分子、もしくは他の2つの部分の間に、またはそれらの脇に位置付けられ、共有結合を介して各々を接続させている(よって2つは接続される)。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸または複数のアミノ酸(例として、ペプチドまたはタンパク質)である。いくつかの態様において、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学的成分である。いくつかの態様において、リンカーは、長さが5～100アミノ酸、例えば、長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30～35、35～40、40～45、45～50、50～60、60～70、70～80、80～90、90～100、100～150、または150～200アミノ酸である。より長いリンカーまたはより短いリンカーもまた、企図される。
リンカーは、共有結合と同程度に単純なものであってもよく、またはポリマーリンカー(長さ方向に多くの原子がある(many atomes in length))であってもよい。いくつかの態様において、リンカーは、ポリペプチドであるか、またはアミノ酸をベースとする。他の態様において、リンカーは、ペプチド様ではない。いくつかの態様において、リンカーは、共有結合(例として、炭素-炭素結合、ジスルフィド結合、炭素-ヘテロ原子結合、等々)である。いくつかの態様において、リンカーは、アミド連結の炭素-窒素結合である。いくつかの態様において、リンカーは、環状または非環式の、置換または非置換の、分枝または非分枝の、脂肪族またはヘテロ脂肪族の、リンカーである。いくつかの態様において、リンカーは、ポリマー(例として、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステル、等々)である。いくつかの態様において、リンカーは、アミノアルカン酸の単量体、二量体、またはポリマーを含む。いくつかの態様において、リンカーは、アミノアルカン酸(例として、グリシン、エタン酸、アラニン、ベータ-アラニン、3-アミノプロパン酸、4-アミノブタン酸、5-ペンタン酸、等々)を含む。いくつかの態様において、リンカーは、アミノヘキサン酸(Ahx)の単量体、二量体、またはポリマーを含む。いくつかの態様において、リンカーは、炭素環式の部分(例として、シクロペンタン、シクロヘキサン)をベースとする。他の態様において、リンカーは、ポリエチレングリコール部分(PEG)を含む。他の態様において、リンカーは、アミノ酸を含む。いくつかの態様において、リンカーは、ペプチドを含む。いくつかの態様において、リンカーは、アリール部分またはヘテロアリール部分を含む。いくつかの態様において、リンカーは、フェニル環をベースとする。リンカーは、求核試薬(例として、チオール、アミノ)のペプチドからリンカーへの付着を容易にさせる官能化された部分を包含していてもよい。いずれの求電子試薬も、リンカーの一部として使用されてもよい。例示の求電子試薬は、これらに限定されないが、活性化エステル、活性化アミド、マイケルアクセプター、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アシル、およびイソチオシアナートを包含する。
いくつかの他の態様において、リンカーは、アミノ酸配列(GGGGS)n(配列番号1361520)、(G)n(配列番号1361521)、(EAAAK)n(配列番号1361522)、(GGS)n(配列番号1361523)、(SGGS)n(配列番号1361524)、(XP)n(配列番号1361525)、またはそれらのいずれの組み合わせを含み、ここでnは、独立して、1と30との間の整数であり、およびここでXは、いずれのアミノ酸でもある。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列(GGS)n(配列番号1361526)を含み、ここでnは、1、3、または7である。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列SGSETPGTSESATPES(配列番号1361527)を含む。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS(配列番号1361528)を含む。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列SGGSGGSGGS(配列番号1361529)を含む。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列SGGS(配列番号1361530)を含む。
とりわけ、以下のリンカーは、プライム編集因子ドメインを相互に結び合わせるために様々な態様において使用され得る:
GGS;
GGSGGS(配列番号1361523);
GGSGGSGGS(配列番号1361523);
SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSS(配列番号1361528);
SGSETPGTSESATPES(配列番号1361527);
SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESAGSYPYDVPDYAGSAAPAAKKKKLDGSGSGGSSGGS(配列番号1361585)。
（ii）核局在化配列(NLS)
様々な態様において、PE融合タンパク質は、タンパク質の細胞核中への転位(translocation)を促進するのに役立つ1以上の核局在化配列(NLS)を含んでいてもよい。かかる配列は、当該技術分野において周知であり、以下の例を包含し得る:
Figure 2022531539000070
Figure 2022531539000071
上のNLSの例は限定されない。PE融合タンパク質は、Cokol et al.,"Finding nuclear localization signals,"EMBO Rep.,2000,1(5):411-415およびFreitas et al.,"Mechanisms and Signals for the Nuclear Import of Proteins,"Current Genomics,2009,10(8):550-7(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)に記載のものをいずれも包含する、知られているいずれのNLS配列も含んでいてもよい。
様々な態様において、本明細書に開示のプライム編集因子およびプライム編集因子をコードする構築物はさらに、1以上の、好ましくは、少なくとも2つの核局在化シグナルを含む。ある態様において、プライム編集因子は、少なくとも2つのNLSを含む。少なくとも2つのNLSをもつ態様において、NLSは、同じNLSであり得るか、またはこれらは、異なるNLSであり得る。加えて、NLSは、融合タンパク質の一部(残る部分はプライム編集因子である)として発現されてもよい。いくつかの態様において、NLSの1以上は、双節型(bipartite)NLS(「bpNLS」)である。ある態様において、開示された融合タンパク質は、2つの双節型NLSを含む。いくつかの態様において、開示された融合タンパク質は、2つより多くの双節型NLSを含む。
NLS融合の場所は、プライム編集因子のN末端、C末端に、または配列内にあり得る(例として、コードされたnapDNAbp構成要素(例として、Cas9)とポリメラーゼドメイン(例として、逆転写酵素ドメイン)との間に挿入される)。
NLSは、当該技術分野において知られているいずれのNLS配列であってもよい。NLSはまた、核局在化のための、今後発見されるいずれのNLSであってもよい。NLSはまた、天然に存在するいずれのNLS、または天然に存在しないいずれのNLS(例として、1以上の所望の突然変異をもつNLS)であってもよい。
用語「核局在化配列」または「NLS」は、タンパク質の細胞核内への(例えば、核輸送による)輸入(import)を促進するアミノ酸配列を指す。核局在化配列は当該技術分野において知られており、当業者に明らかであろう。例えば、NLS配列は、2000年11月23日に出願され、5月31日2001年にWO/2001/038547として公開されたPlankらの国際PCT出願PCT/EP2000/011690(この内容は参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。いくつかの態様において、NLSは、アミノ酸配列PKKKRKV(配列番号1361531)、MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC(配列番号1361533)、KRTADGSEFESPKKKRKV(配列番号1361659)、またはKRTADGSEFEPKKKRKV(配列番号1361660)を含む。他の態様において、NLSは、アミノ酸配列NLSKRPAAIKKAGQAKKKK(配列番号1361661)、PAAKRVKLD(配列番号1361536)、RQRRNELKRSF(配列番号1361662)、NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(配列番号1361663)を含む。
本開示の一側面において、プライム編集因子は、1以上の核局在化シグナル(NLS)、好ましくは少なくとも2つのNLSで修飾されていてもよい。ある態様において、プライム編集因子は、2以上のNLSで修飾されている。本開示は、本開示時点での当該技術分野において知られているいずれの核局在化シグナル、または本願出願後の技術水準において同定されたかもしくは別様に利用可能とされたいずれの核局在化シグナルの使用も企図する。代表的な核局在化シグナルは、タンパク質を、その配列が発現された細胞の核へ向かわせるペプチド配列である。核局在化シグナルは、主として塩基性であって、タンパク質のアミノ酸配列中のほぼどこにでも位置付けられ得、一般には、4アミノ酸(Autieri & Agrawal,(1998)J.Biol.Chem.273:14731-37(参照により本明細書に組み込まれる))～8アミノ酸の短い配列を含み、典型的にはリシン残基およびアルギニン残基に富む(Magin et al.,(2000)Virology 274:11-16(参照により本明細書に組み込まれる))。核局在化シグナルはしばしば、プロリン残基を含む。様々な核局在化シグナルが同定されており、細胞の細胞質から核への生物学的分子の輸送を達成させるのに使用されている。例として、Tinland et al.,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:7442-46;Moede et al.,(1999)FEBS Lett.461:229-34を参照(これらは参照により組み込まれる)。転位は目下、核膜孔タンパク質を伴うと考えられている。
ほとんどのNLSは、3つの一般群に分類され得る:(i)SV40ラージT抗原NLS(PKKKRKV(配列番号1361531))によって例示される単節型(monopartite)NLS;(ii)可変数のスペーサーアミノ酸によって分離された2つの塩基性ドメインからなる双節型モチーフであって、Xenopus nucleoplasmin NLS(KRXXXXXXXXXXKKKL(配列番号1361664))によって例示される;および(iii)hnRNP Alタンパク質のM9、インフルエンザウイルスヌクレオタンパク質NLS、および酵母Gal4タンパク質NLSなどの非標準的な配列(Dingwall and Laskey 1991)。
核局在化シグナルは、タンパク質のアミノ酸配列中の様々なポイントにて現れる。NLSは、タンパク質のN末端、C末端にて、および中央領域中で同定されている。よって、本開示は、プライム編集因子のC末端、N末端にて、ならびにその内部領域中に、1以上のNLSで修飾されていてもよいプライム編集因子を提供する。核局在化シグナル自身に(例えば、局所的にまたは立体的に)干渉しないように、NLS残基の構成要素としては機能しないより長い配列の残基が選択されるはずである。したがって、実際面では、NLSを含む配列の組成に対し厳密な限定はないが、かかる配列は、長さおよび組成において機能的に限定され得る。
本開示は、1以上のNLSを包含するようプライム編集因子を修飾するいずれの好適な手段も企図する。一側面において、プライム編集因子は、そのN末端またはそのC末端(またはその両方)にて1以上のNLSへ翻訳段階で(translationally)融合したプライム編集因子タンパク質を発現するよう、すなわち、プライム編集因子-NLS融合構築物を形成するよう改変されていてもよい。他の態様において、プライム編集因子をコードするヌクレオチド配列は、コードされたプライム編集因子の内部領域中に1以上のNLSをコードするリーディングフレームを組み込むように遺伝子学的に修飾されていてもよい。加えて、NLSは、プライム編集因子と、タンパク質のN末端に、C末端に、もしくは内部(例として、中央領域中)に付着されたNLSアミノ酸配列との間にコードされた、様々なアミノ酸リンカーまたはスペーサー領域を包含していてもよい。よって、本開示はまた、プライム編集因子と1以上のNLSとを含む融合タンパク質を発現するための、ヌクレオチド構築物、ベクター、および宿主細胞も提供する。
本明細書に記載のプライム編集因子はまた、1以上のリンカー(例として、ポリマー、アミノ酸、核酸、多糖類、化学物質、または核酸のリンカー要素)を通してプライム編集因子へ連結されている核局在化シグナルも含んでいてよい。企図される本開示の範囲内のリンカーは、何らの欠点も有することは意図しておらず、好適な型のいずれの分子(例として、ポリマー、アミノ酸、多糖類、核酸、脂質、またはいずれの合成の化学物質リンカードメイン)であり得、プライム編集因子と1以上のNLSとの間での結合(例として、共有結合連結、水素結合)の形成を発効させるいずれの好適なストラテジーによっても、プライム編集因子へ結び合わせられ得る。
（iii）フラップエンドヌクレアーゼ(例として、FEN1)
様々な態様において、PE融合タンパク質は、5'単鎖DNAフラップの除去を触媒する酵素を指す1以上のフラップエンドヌクレアーゼ(例として、FEN1)を含んでいてもよい。これらは、細胞のプロセス(DNA複製を包含する)の最中に形成された5'フラップの除去を処理する、天然に存在する酵素である。本明細書に記載のプライム編集方法は、内生で供給されたフラップエンドヌクレアーゼ、またはプライム編集最中に標的部位にて形成された内生DNAの5'フラップを除去するようtransで提供されたものを利用してもよい。フラップエンドヌクレアーゼは当該技術分野において知られており、Patel et al.,"Flap endonucleases pass 5'-flaps through a flexible arch using a disorder-thread-order mechanism to confer specificity for free 5'-ends,"Nucleic Acids Research,2012,40(10):4507-4519およびTsutakawa et al.,"Human flap endonuclease structures, DNA double-base flipping, and a unified understanding of the FEN1 superfamily,"Cell,2011,145(2):198-211(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)の記載から見出され得る。例示のフラップエンドヌクレアーゼは、以下のアミノ酸配列によって表され得るFEN1である:
Figure 2022531539000072
フラップエンドヌクレアーゼはまた、いずれのFEN1バリアント、突然変異体、または他のフラップエンドヌクレアーゼのオルソログ、ホモログ、もしくはバリアントも包含してもよい。非限定例は以下のとおりである:
Figure 2022531539000073
Figure 2022531539000074
様々な態様において、本明細書に企図されるプライム編集因子融合タンパク質は、上の配列のいずれかと、少なくとも約70％同一の、少なくとも約80％同一の、少なくとも約90％同一の、少なくとも約95％同一の、少なくとも約96％同一の、少なくとも約97％同一の、少なくとも約98％同一の、少なくとも約99％同一の、少なくとも約99.5％同一の、または少なくとも約99.9％同一のアミノ酸配列を有する上に開示された配列のいずれのフラップエンドヌクレアーゼバリアントも包含していてもよい。
5'末単鎖DNAフラップの除去を容易にする本方法によって利用されてもよい他のエンドヌクレアーゼは、これらに限定されないが(1)trex2、(2)exo1エンドヌクレアーゼ(例として、Keijzers et al.,Biosci Rep.2015,35(3):e00206)を包含する。
Trex2
3' 3プライム修復エキソヌクレアーゼ2(TREX2)－ヒト
受託番号NM_080701
MSEAPRAETFVFLDLEATGLPSVEPEIAELSLFAVHRSSLENPEHDESGALVLPRVLDKLTLCMCPERPFTAKASEITGLSSEGLARCRKAGFDGAVVRTLQAFLSRQAGPICLVAHNGFDYDFPLLCAELRRLGARLPRDTVCLDTLPALRGLDRAHSHGTRARGRQGYSLGSLFHRYFRAEPSAAHSAEGDVHTLLLIFLHRAAELLAWADEQARGWAHIEPMYLPPDDPSLEA(配列番号1361665)
3' 3プライム修復エキソヌクレアーゼ2(TREX2)－マウス
受託番号NM_011907
MSEPPRAETFVFLDLEATGLPNMDPEIAEISLFAVHRSSLENPERDDSGSLVLPRVLDKLTLCMCPERPFTAKASEITGLSSESLMHCGKAGFNGAVVRTLQGFLSRQEGPICLVAHNGFDYDFPLLCTELQRLGAHLPQDTVCLDTLPALRGLDRAHSHGTRAQGRKSYSLASLFHRYFQAEPSAAHSAEGDVHTLLLIFLHRAPELLAWADEQARSWAHIEPMYVPPDGPSLEA(配列番号1361666)
3' 3プライム修復エキソヌクレアーゼ2(TREX2)－ラット
受託番号NM_001107580
MSEPLRAETFVFLDLEATGLPNMDPEIAEISLFAVHRSSLENPERDDSGSLVLPRVLDKLTLCMCPERPFTAKASEITGLSSEGLMNCRKAAFNDAVVRTLQGFLSRQEGPICLVAHNGFDYDFPLLCTELQRLGAHLPRDTVCLDTLPALRGLDRVHSHGTRAQGRKSYSLASLFHRYFQAEPSAAHSAEGDVNTLLLIFLHRAPELLAWADEQARSWAHIEPMYVPPDGPSLEA(配列番号1361667)
ExoI
ヒトエキソヌクレアーゼ1(EXO1)は、DNAミスマッチ修復(MMR)、マイクロ媒介末端結合(micro-mediated end-joining、相同組換え(HR)、および複製を包含する、多くの種々のDNA代謝プロセスに関係する。ヒトEXO1は、真核生物ヌクレアーゼRad2/XPGのファミリーに属し、これはまたFEN1およびGEN1も包含する。Rad2/XPGファミリーは、ファージからヒトまでの種を通してヌクレアーゼドメインが保存されている。EXO1遺伝子産物は、5'エキソヌクレアーゼと5'フラップ活性との両方を呈する。加えて、EXO1は、固有の5'RNase H活性も含有する。ヒトEXO1は、二本鎖DNA(dsDNA)、ニック、ギャップ、シュードY構造のプロセシングに対し高親和性を有し、遺伝で受け継いだそのフラップ活性を使用してホリデイ接点を分解し得る。ヒトEXO1はMMRに関係し、MLH1およびMSH2と直接相互作用する保存された結合ドメインを含有する。EXO1核酸分解活性は、PCNA、MutSα(MSH2/MSH6複合体)、14-3-3、MRN、および9-1-1複合体によって正に刺激される。
エキソヌクレアーゼ1(EXO1)受託番号NM_003686(Homo sapiensエキソヌクレアーゼ1(EXO1)、転写産物バリアント3)－アイソフォームA
MGIQGLLQFIKEASEPIHVRKYKGQVVAVDTYCWLHKGAIACAEKLAKGEPTDRYVGFCMKFVNMLLSHGIKPILVFDGCTLPSKKEVERSRRERRQANLLKGKQLLREGKVSEARECFTRSINITHAMAHKVIKAARSQGVDCLVAPYEADAQLAYLNKAGIVQAIITEDSDLLAFGCKKVILKMDQFGNGLEIDQARLGMCRQLGDVFTEEKFRYMCILSGCDYLSSLRGIGLAKACKVLRLANNPDIVKVIKKIGHYLKMNITVPEDYINGFIRANNTFLYQLVFDPIKRKLIPLNAYEDDVDPETLSYAGQYVDDSIALQIALGNKDINTFEQIDDYNPDTAMPAHSRSHSWDDKTCQKSANVSSIWHRNYSPRPESGTVSDAPQLKENPSTVGVERVISTKGLNLPRKSSIVKRPRSAELSEDDLLSQYSLSFTKKTKKNSSEGNKSLSFSEVFVPDLVNGPTNKKSVSTPPRTRNKFATFLQRKNEESGAVVVPGTRSRFFCSSDSTDCVSNKVSIQPLDETAVTDKENNLHESEYGDQEGKRLVDTDVARNSSDDIPNNHIPGDHIPDKATVFTDEESYSFESSKFTRTISPPTLGTLRSCFSWSGGLGDFSRTPSPSPSTALQQFRRKSDSPTSLPENNMSDVSQLKSEESSDDESHPLREEACSSQSQESGEFSLQSSNASKLSQCSSKDSDSEESDCNIKLLDSQSDQTSKLRLSHFSKKDTPLRNKVPGLYKSSSADSLSTTKIKPLGPARASGLSKKPASIQKRKHHNAENKPGLQIKLNELWKNFGFKKF(配列番号1361668)
エキソヌクレアーゼ1(EXO1)受託番号NM_006027(Homo sapiensエキソヌクレアーゼ1(EXO1)、転写産物バリアント3)－アイソフォームB
MGIQGLLQFIKEASEPIHVRKYKGQVVAVDTYCWLHKGAIACAEKLAKGEPTDRYVGFCMKFVNMLLSHGIKPILVFDGCTLPSKKEVERSRRERRQANLLKGKQLLREGKVSEARECFTRSINITHAMAHKVIKAARSQGVDCLVAPYEADAQLAYLNKAGIVQAIITEDSDLLAFGCKKVILKMDQFGNGLEIDQARLGMCRQLGDVFTEEKFRYMCILSGCDYLSSLRGIGLAKACKVLRLANNPDIVKVIKKIGHYLKMNITVPEDYINGFIRANNTFLYQLVFDPIKRKLIPLNAYEDDVDPETLSYAGQYVDDSIALQIALGNKDINTFEQIDDYNPDTAMPAHSRSHSWDDKTCQKSANVSSIWHRNYSPRPESGTVSDAPQLKENPSTVGVERVISTKGLNLPRKSSIVKRPRSAELSEDDLLSQYSLSFTKKTKKNSSEGNKSLSFSEVFVPDLVNGPTNKKSVSTPPRTRNKFATFLQRKNEESGAVVVPGTRSRFFCSSDSTDCVSNKVSIQPLDETAVTDKENNLHESEYGDQEGKRLVDTDVARNSSDDIPNNHIPGDHIPDKATVFTDEESYSFESSKFTRTISPPTLGTLRSCFSWSGGLGDFSRTPSPSPSTALQQFRRKSDSPTSLPENNMSDVSQLKSEESSDDESHPLREEACSSQSQESGEFSLQSSNASKLSQCSSKDSDSEESDCNIKLLDSQSDQTSKLRLSHFSKKDTPLRNKVPGLYKSSSADSLSTTKIKPLGPARASGLSKKPASIQKRKHHNAENKPGLQIKLNELWKNFGFKKDSEKLPPCKKPLSPVRDNIQLTPEAEEDIFNKPECGRVQRAIFQ(配列番号1361669)
エキソヌクレアーゼ1(EXO1)受託番号NM_001319224(Homo sapiensエキソヌクレアーゼ1(EXO1)、転写産物バリアント4)－アイソフォームC
MGIQGLLQFIKEASEPIHVRKYKGQVVAVDTYCWLHKGAIACAEKLAKGEPTDRYVGFCMKFVNMLLSHGIKPILVFDGCTLPSKKEVERSRRERRQANLLKGKQLLREGKVSEARECFTRSINITHAMAHKVIKAARSQGVDCLVAPYEADAQLAYLNKAGIVQAIITEDSDLLAFGCKKVILKMDQFGNGLEIDQARLGMCRQLGDVFTEEKFRYMCILSGCDYLSSLRGIGLAKACKVLRLANNPDIVKVIKKIGHYLKMNITVPEDYINGFIRANNTFLYQLVFDPIKRKLIPLNAYEDDVDPETLSYAGQYVDDSIALQIALGNKDINTFEQIDDYNPDTAMPAHSRSHSWDDKTCQKSANVSSIWHRNYSPRPESGTVSDAPQLKENPSTVGVERVISTKGLNLPRKSSIVKRPRSELSEDDLLSQYSLSFTKKTKKNSSEGNKSLSFSEVFVPDLVNGPTNKKSVSTPPRTRNKFATFLQRKNEESGAVVVPGTRSRFFCSSDSTDCVSNKVSIQPLDETAVTDKENNLHESEYGDQEGKRLVDTDVARNSSDDIPNNHIPGDHIPDKATVFTDEESYSFESSKFTRTISPPTLGTLRSCFSWSGGLGDFSRTPSPSPSTALQQFRRKSDSPTSLPENNMSDVSQLKSEESSDDESHPLREEACSSQSQESGEFSLQSSNASKLSQCSSKDSDSEESDCNIKLLDSQSDQTSKLRLSHFSKKDTPLRNKVPGLYKSSSADSLSTTKIKPLGPARASGLSKKPASIQKRKHHNAENKPGLQIKLNELWKNFGFKKDSEKLPPCKKPLSPVRDNIQLTPEAEEDIFNKPECGRVQRAIFQ(配列番号1361670)
（iv）インテインおよび分裂-インテイン
いくつかの態様(例として、AAV粒子を使用するin vivoでのプライム編集因子の送達)において、ポリペプチド(例として、デアミナーゼもしくはnapDNAbp)または融合タンパク質(例として、プライム編集因子)を分裂させてN末端側の半分およびC末端側の半分にして、これらを個別に送達し、次いで細胞内で完全なタンパク質(または場合によって融合タンパク質)を再形成させるそれらの共局在化を可能にさせるのに有利なこともあることは、理解されるであろう。タンパク質または融合タンパク質が別々に二分されたものは各々、タンパク質transスプライシングの機序によって完全なタンパク質または融合タンパク質の再形成を容易にさせる分裂-インテインタグを含んでいてもよい。
分裂インテインによって触媒されるタンパク質trans-スプライシングは、タンパク質ライゲーションのための全面的に酵素による方法を提供する。分裂-インテインは、2つのピース、つまりNインテインとCインテインとの夫々に分裂する、本質的に連続したインテイン(例として、ミニ-インテイン)である。分裂インテインのNインテインおよびCインテインは、非共有結合的に結び付き、活性インテインを形成して、連続したインテインと本質的に同じようにスプライシング反応を触媒し得る。分裂インテインは自然界から見出されており、また実験室において改変もされている。本明細書に使用されるとき、用語「分裂インテイン」は、N末端配列およびC末端配列が、非共有結合的に再度結び付くかまたは再構成して、trans-スプライシング反応に対し機能するインテインになり得る別々の分子になるように、1以上のペプチド結合破壊がN末端とC末端とのアミノ酸配列間に存在するいずれのインテインも指す。いずれの触媒活性インテインまたはそのフラグメントも、本発明の方法における使用のための分裂インテインを得るために使用されてもよい。例えば、一側面において、分裂インテインは、真核生物インテインに由来していてもよい。別の側面において、分裂インテインは、細菌インテインに由来していてもよい。別の側面において、分裂インテインは、古細菌インテインに由来していてもよい。好ましくは、そのように得られた分裂インテインは、trans-スプライシング反応を触媒するのに不可欠なアミノ酸配列のみを所有しているであろう。
本明細書に使用されるとき、「N末端分裂インテイン(In)」は、trans-スプライシング反応に対し機能するN末端のアミノ酸配列を含むいずれのインテイン配列も指す。よってInはまた、trans-スプライシングが生じたときにスプライシングによって外れる(spliced out)配列も含む。Inは、天然に存在するインテイン配列のN末端部分の修飾である配列を含み得る。例えば、Inは、追加のアミノ酸残基および/または突然変異した残基を、かかる追加の残基および/または突然変異した残基を包含することによってInがtrans-スプライシングに機能しないことがない限り、含み得る。好ましくは、追加の残基および/または突然変異した残基を包含することによって、Inのtrans-スプライシング活性が改善または増強される。
本明細書に使用されるとき、「C末端分裂インテイン(Ic)」は、trans-スプライシング反応に対し機能するC末端のアミノ酸配列を含むいずれのインテイン配列も指す。一側面において、Icは、4～7個の連続したアミノ酸残基を含むが、これらの少なくとも4アミノ酸は、これが由来するインテインの最後のβ鎖からのものである。よってIcはまた、trans-スプライシングが生じたときにスプライシングによって外れる(spliced out)配列も含む。Icは、天然に存在するインテイン配列のC末端部分の修飾である配列を含み得る。例えば、Icは、追加のアミノ酸残基および/または突然変異した残基を、かかる追加の残基および/または突然変異した残基を包含することによってInがtrans-スプライシングに機能しないことがない限り、含み得る。好ましくは、追加の残基および/または突然変異した残基を包含することによって、Icのtrans-スプライシング活性が改善または増強される。
本発明のいくつかの態様において、IcまたはInへ連結されたペプチドは、数ある中でも、蛍光基、ビオチン、ポリエチレングリコール(PEG)、アミノ酸類似体、非天然アミノ酸、ホスファート基、グリコシル基、放射性同位体標識、および医薬分子を包含する追加の化学的成分を含み得る。他の態様において、Icへ連結されたペプチドは、数ある中でも、ケトン、アルデヒド、Cys残基、およびLys残基を包含する1以上の化学反応基を含み得る。分裂インテインのNインテインおよびCインテインは、「インテイン-スプライシングポリペプチド(ISP)」が存在するとき、非共有結合的に結び付き、活性インテインを形成してスプライシング反応を触媒し得る。本明細書に使用されるとき、「インテイン-スプライシングポリペプチド(ISP)」は、Ic、In、またはその両方が分裂インテインから除去されたときに残存する分裂インテインのアミノ酸配列の部分を指す。ある態様において、Inは、ISPを含む。別の態様において、Icは、ISPを含む。もう1つの態様において、ISPは、InへもIcへも共有結合的に連結されていない別々のペプチドである。
分裂インテインは、非構造化ループ中の1以上の分裂部位を改変するか、またはミニ-インテインの構造から見出される-12の保存されたベータ鎖間のアミノ酸配列に干渉することによって、連続したインテインから創出されてもよい。ベータ鎖間の領域内の分裂部位の位置において、ある程度の柔軟性があってもよいが、ただし、分裂の創出によって、タンパク質スプライシング活性が喪失されるのに充分な程度まで、インテインの構造、とりわけ構造化ベータ鎖が妨害されない。
タンパク質trans-スプライシングにおいて、ある前駆体タンパク質はNエクステイン部分と、これに続くNインテインからなり、別の前駆体タンパク質はCインテインと、これに続くCエクステイン部分からなり、trans-スプライシング反応(N-およびCインテインによって一緒に触媒される)は、2つのインテイン配列を切除し、2つのエクステイン配列をペプチド結合で連結する。タンパク質trans-スプライシングは、酵素反応であるが、極めて低い(例として、マイクロモル濃度の)タンパク質濃度で働き得、生理学的条件下で遂行され得る。
例示の配列は以下のとおりである:
名称 リガンド依存性インテインの配列
2-4インテイン:
CLAEGTRIFDPVTGTTHRIEDVVDGRKPIHVVAAAKDGTLLARPVVSWFDQGTRDVIGLRIAGGAIVWATPDHKVLTEYGWRAAGELRKGDRVAGPGGSGNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTSPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQAHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRALDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKYKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAGGSGASRVQAFADALDDKFLHDMLAEELRYSVIREVLPTRRARTFDLEVEELHTLVAEGVVVHNC(配列番号1361671)
3-2インテインCLAEGTRIFDPVTGTTHRIEDVVDGRKPIHVVAVAKDGTLLARPVVSWFDQGTRDVIGLRIAGGAIVWATPDHKVLTEYGWRAAGELRKGDRVAGPGGSGNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTSPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQAHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRALDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKYTNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAGGSGASRVQAFADALDDKFLHDMLAEELRYSVIREVLPTRRARTFDLEVEELHTLVAEGVVVHNC(配列番号1361672)
30R3-1インテインCLAEGTRIFDPVTGTTHRIEDVVDGRKPIHVVAAAKDGTLLARPVVSWFDQGTRDVIGLRIAGGATVWATPDHKVLTEYGWRAAGELRKGDRVAGPGGSGNSLALSLTADQMVSALLDAEPPIPYSEYDPTSPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQAHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRALDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKYKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAGGSGASRVQAFADALDDKFLHDMLAEGLRYSVIREVLPTRRARTFDLEVEELHTLVAEGVVVHNC(配列番号1361673)
30R3-2インテインCLAEGTRIFDPVTGTTHRIEDVVDGRKPIHVVAAAKDGTLLARPVVSWFDQGTRDVIGLRIAGGATVWATPDHKVLTEYGWRAAGELRKGDRVAGPGGSGNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTSPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQAHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRALDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKYKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAGGSGASRVQAFADALDDKFLHDMLAEELRYSVIREVLPTRRARTFDLEVEELHTLVAEGVVVHNC(配列番号1361674)
30R3-3インテインCLAEGTRIFDPVTGTTHRIEDVVDGRKPIHVVAAAKDGTLLARPVVSWFDQGTRDVIGLRIAGGATVWATPDHKVLTEYGWRAAGELRKGDRVAGPGGSGNSLALSLTADQMVSALLDAEPPIPYSEYDPTSPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQAHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRALDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKYKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAGGSGASRVQAFADALDDKFLHDMLAEELRYSVIREVLPTRRARTFDLEVEELHTLVAEGVVVHNC(配列番号1361675)
37R3-1インテインCLAEGTRIFDPVTGTTHRIEDVVDGRKPIHVVAAAKDGTLLARPVVSWFDQGTRDVIGLRIAGGATVWATPDHKVLTEYGWRAAGELRKGDRVAGPGGSGNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYNPTSPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQAHLLERAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRALDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKYKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAGGSGASRVQAFADALDDKFLHDMLAEGLRYSVIREVLPTRRARTFDLEVEELHTLVAEGVVVHNC(配列番号1361676)
37R3-2インテインCLAEGTRIFDPVTGTTHRIEDVVDGRKPIHVVAAAKDGTLLARPVVSWFDQGTRDVIGLRIAGGAIVWATPDHKVLTEYGWRAAGELRKGDRVAGPGGSGNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTSPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQAHLLERAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRALDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKYKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAGGSGASRVQAFADALDDKFLHDMLAEGLRYSVIREVLPTRRARTFDLEVEELHTLVAEGVVVHNC(配列番号1361677)
37R3-3インテインCLAEGTRIFDPVTGTTHRIEDVVDGRKPIHVVAVAKDGTLLARPVVSWFDQGTRDVIGLRIAGGATVWATPDHKVLTEYGWRAAGELRKGDRVAGPGGSGNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTSPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQAHLLERAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRALDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKYKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAGGSGASRVQAFADALDDKFLHDMLAEELRYSVIREVLPTRRARTFDLEVEELHTLVAEGVVVHNC(配列番号13616718)
インテインが、連続したドメインとして最も頻繁に見出されるが、いくつかは天然の分裂形態で存在する。このケースにおいて、2つのフラグメントは、別々のポリペプチドとして発現され、スプライシング(所謂、タンパク質trans-スプライシング)が起こる前に結び付かなければならない。
例示の分裂インテインは、2つのサブユニット、つまりDnaE-NおよびDnaE-Cを含む、Ssp DnaEインテインである。2つの異なるサブユニットは、別々の遺伝子、つまりdnaE-nおよびdnaE-cによってコードされており、これらは夫々DnaE-NおよびDnaE-Cサブユニットをコードする。DnaEは、Synechocytis sp.PCC6803における天然に存在する分裂インテインであって、2つ別々のタンパク質をtrans-スプライシングへ向かわせることが可能であるが、各々はDnaE-NまたはDnaE-Cのいずれかとの融合体を含む。
天然に存在するかまたは改変された追加の分裂-インテイン配列は当該技術分野において知られており、本明細書に記載の全インテイン配列または当該技術分野において利用可能なものから作製され得る。分裂-インテイン配列の例は、Stevens et al.,"A promiscuous split intein with expanded protein engineering applications,"PNAS,2017,Vol.114:8538-8543;Iwai et al.,"Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostc punctiforme,FEBS Lett,580:1853-1858(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)から見出され得る。追加の分裂インテイン配列は、例えば、WO2013/045632、WO2014/055782、WO2016/069774、およびEP2877490(これら内容の各々は参照により本明細書に組み込まれる)から見出され得る。
加えて、transでのタンパク質スプライシングは、in vivoおよびin vitro(Shingledecker,et al.,Gene 207:187(1998),Southworth,et al.,EMBO J.17:918(1998);Mills,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:3543-3548(1998);Lew,et al.,J.Biol.Chem.,273:15887-15890(1998);Wu,et al.,Biochim.Biophys.Acta 35732:1(1998b),Yamazaki,et al.,J.Am.Chem.Soc.120:5591(1998),Evans,et al.,J.Biol.Chem.275:9091(2000);Otomo,et al.,Biochemistry 38:16040-16044(1999); Otomo,et al.,J.Biolmol.NMR 14:105-114(1999);Scott,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:13638-13643(1999))で記載されており、例として、図66および67に示されるとおり、個別に発現された2つの半身からの完全なPE融合タンパク質の形成に関し、2つの不活性なフラグメントについて1タンパク質を発現し、これに続くライゲーションを経て、機能的産物を形成する好機を提供する。
（v）RNA-タンパク質動員系
様々な態様において、2つの別々のタンパク質ドメイン(例として、Cas9ドメインおよびポリメラーゼドメイン)は、「MS2タグ付け技法」などの「RNA-タンパク質動員系」を使用することによって、相互に共局在化して機能的複合体(2つ別々のタンパク質ドメインを含む融合タンパク質の機能に似ている)を形成してもよい。かかる系は一般に、あるタンパク質ドメインを、「RNA-タンパク質相互作用ドメイン」(また「RNA-タンパク質動員ドメイン」としても知られている)で、およびRNA-タンパク質相互作用ドメイン(例として、特異的なヘアピン構造)を特異的に認識しこれへ結合する他の「RNA結合タンパク質」でタグ付けする。これらの型の系は、プライム編集因子のドメインを共局在化させるために、ならびに追加の機能性をUGIドメインなどのプライム編集因子へ動員させるために、生かされ得る。一例において、MS2タグ付け技法は、MS2バクテリオファージコートタンパク質(「MCP」または「MS2cp」)の、ファージゲノム中に存在するステムループ構造またはヘアピン構造(すなわち、「MS2ヘアピン」)との天然の相互作用をベースとする。MS2ヘアピンのケースにおいて、これは、MS2バクテリオファージコートタンパク質(MCP)によって認識、結合される。よって、例示の1シナリオにおいて、デアミナーゼ-MS2融合体は、Cas9-MCP融合体を動員し得る。
他のモジュールRNA-タンパク質相互作用ドメインの総説は、当該技術分野において、例えば、Johansson et al.,"RNA recognition by the MS2 phage coat protein,"Sem Virol.,1997,Vol.8(3):176-185;Delebecque et al.,"Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies,"Science,2011,Vol.333:470-474;Mali et al.,"Cas9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering,"Nat.Biotechnol.,2013,Vol.31:833-838;およびZalatan et al.,"Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds,"Cell,2015,Vol.160:339-350(これらの各々はそれら全体が参照されることにより本明細書に組み込まれる)に記載されている。他の系は、PCPタンパク質を特異的に動員するPP7ヘアピン、およびComタンパク質を特異的に動員する「com」ヘアピンを包含する。Zalatan et al.を参照。
MS2ヘアピン(または「MS2アプタマー」とも等価に称される)のヌクレオチド配列は:GCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCC(配列番号1361679)である。
MCPまたはMS2cpのアミノ酸配列は:
GSASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGEELPVAGWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY(配列番号1361680)である。
（vi）UGIドメイン
他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子は、1以上のウラシルグリコシラーゼインヒビタードメインを含んでいてもよい。用語「ウラシルグリコシラーゼインヒビター(UGI)」または「UGIドメイン」は、本明細書に使用されるとき、ウラシル-DNAグリコシラーゼ塩基-切除修復酵素を阻害することが可能なタンパク質を指す。いくつかの態様において、UGIドメインは、野生型UGIまたは配列番号1361681で表されるUGIを含む。いくつかの態様において、本明細書に提供されるUGIタンパク質は、UGIのフラグメント、およびUGIまたはUGIフラグメントと相同のタンパク質を包含する。例えば、いくつかの態様において、UGIドメインは、配列番号1361681で表されるアミノ酸配列のフラグメントを含む。いくつかの態様において、UGIフラグメントは、配列番号1361681で表されるとおりのアミノ酸配列の、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、UGIは、配列番号1361681で表されるアミノ酸配列と相同のアミノ酸配列、または配列番号1361681で表されるアミノ酸配列のフラグメントと相同のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、UGIまたはUGIのフラグメントまたはUGIのホモログまたはUGIフラグメントを含むタンパク質は、「UGIバリアント」と称される。UGIバリアントは、UGIまたはそのフラグメントとの相同性を共有する。例えば、UGIバリアントは、野生型UGIもしくは配列番号1361681で表されるとおりのUGIと、少なくとも70％同一、少なくとも75％同一、少なくとも80％同一、少なくとも85％同一、少なくとも90％同一、少なくとも95％同一、少なくとも96％同一、少なくとも97％同一、少なくとも98％同一、少なくとも99％同一、少なくとも99.5％同一、または少なくとも99.9％同一である。いくつかの態様において、UGIバリアントは、フラグメントが、野生型UGIもしくは配列番号1361681で表されるとおりのUGIの対応するフラグメントと、少なくとも70％同一、少なくとも80％同一、少なくとも90％同一、少なくとも95％同一、少なくとも96％同一、少なくとも97％同一、少なくとも98％同一、少なくとも99％同一、少なくとも99.5％同一、または少なくとも99.9％同一であるように、UGIのフラグメントを含む。いくつかの態様において、UGIは、以下のアミノ酸配列を含む:
ウラシル-DNAグリコシラーゼインヒビター:
＞sp|P14739|UNGI_BPPB2
MTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML(配列番号1361681)。
本明細書に記載のプライム編集因子は、1より多くのUGIドメインを含んでいてもよく、前記ドメインは、本明細書に記載のとおりの1以上のリンカーによって分離されていてもよい。
（vii）追加のPE要素
ある態様において、本明細書に記載のプライム編集因子は、塩基修復のインヒビターを含んでいてもよい。用語「塩基修復のインヒビター」または「IBR」は、核酸修復酵素(例えば、塩基切除の修復酵素)の活性を阻害することが可能なタンパク質を指す。いくつかの態様において、IBRは、OGG塩基切除を修復するインヒビターである。いくつかの態様において、IBRは、塩基切除を修復するインヒビター(「iBER」)である。塩基切除を修復する例示のインヒビターは、APE1、Endo III、Endo IV、Endo V、Endo VIII、Fpg、hOGG1、hNEIL1、T7 EndoI、T4PDG、UDG、hSMUG1、およびhAAGのインヒビターを包含する。いくつかの態様において、IBRは、Endo VまたはhAAGのインヒビターである。いくつかの態様において、IBRは、触媒不活性グリコシラーゼもしくは触媒不活性ジオキシゲナーゼもしくは小分子もしくはオキシダーゼのペプチドインヒビター、またはそれらのバリアントであってもよいiBERである。いくつかの態様において、IBRは、TDGインヒビター、MBD4インヒビター、またはAlkBH酵素のインヒビターであってもよいiBERである。いくつかの態様において、IBRは、触媒不活性TDGまたは触媒不活性MBD4を含むiBERである。例示の触媒不活性TDGは、配列番号3872(ヒトTDG)のN140A突然変異体である。
いくつかの例示のグリコシラーゼは、下に提供される。これらのグリコシラーゼドメインのいずれかの触媒不活性化バリアントは、本開示に提供されるプライム編集因子のnapDNAbpまたはポリメラーゼドメインと融合していてもよいiBERである。
OGG(ヒト)
MPARALLPRRMGHRTLASTPALWASIPCPRSELRLDLVLPSGQSFRWREQSPAHWSGVLADQVWTLTQTEEQLHCTVYRGDKSQASRPTPDELEAVRKYFQLDVTLAQLYHHWGSVDSHFQEVAQKFQGVRLLRQDPIECLFSFICSSNNNIARITGMVERLCQAFGPRLIQLDDVTYHGFPSLQALAGPEVEAHLRKLGLGYRARYVSASARAILEEQGGLAWLQQLRESSYEEAHKALCILPGVGTKVADCICLMALDKPQAVPVDVHMWHIAQRDYSWHPTTSQAKGPSPQTNKELGNFFRSLWGPYAGWAQAVLFSADLRQSRHAQEPPAKRRKGSKGPEG(配列番号1361682)
MPG(ヒト)
MVTPALQMKKPKQFCRRMGQKKQRPARAGQPHSSSDAAQAPAEQPHSSSDAAQAPCPRERCLGPPTTPGPYRSIYFSSPKGHLTRLGLEFFDQPAVPLARAFLGQVLVRRLPNGTELRGRIVETEAYLGPEDEAAHSRGGRQTPRNRGMFMKPGTLYVYIIYGMYFCMNISSQGDGACVLLRALEPLEGLETMRQLRSTLRKGTASRVLKDRELCSGPSKLCQALAINKSFDQRDLAQDEAVWLERGPLEPSEPAVVAAARVGVGHAGEWARKPLRFYVRGSPWVSVVDRVAEQDTQA(配列番号1361683)
MBD4(ヒト)
MGTTGLESLSLGDRGAAPTVTSSERLVPDPPNDLRKEDVAMELERVGEDEEQMMIKRSSECNPLLQEPIASAQFGATAGTECRKSVPCGWERVVKQRLFGKTAGRFDVYFISPQGLKFRSKSSLANYLHKNGETSLKPEDFDFTVLSKRGIKSRYKDCSMAALTSHLQNQSNNSNWNLRTRSKCKKDVFMPPSSSSELQESRGLSNFTSTHLLLKEDEGVDDVNFRKVRKPKGKVTILKGIPIKKTKKGCRKSCSGFVQSDSKRESVCNKADAESEPVAQKSQLDRTVCISDAGACGETLSVTSEENSLVKKKERSLSSGSNFCSEQKTSGIINKFCSAKDSEHNEKYEDTFLESEEIGTKVEVVERKEHLHTDILKRGSEMDNNCSPTRKDFTGEKIFQEDTIPRTQIERRKTSLYFSSKYNKEALSPPRRKAFKKWTPPRSPFNLVQETLFHDPWKLLIATIFLNRTSGKMAIPVLWKFLEKYPSAEVARTADWRDVSELLKPLGLYDLRAKTIVKFSDEYLTKQWKYPIELHGIGKYGNDSYRIFCVNEWKQVHPEDHKLNKYHDWLWENHEKLSLS(配列番号1361684)
TDG(ヒト)
MEAENAGSYSLQQAQAFYTFPFQQLMAEAPNMAVVNEQQMPEEVPAPAPAQEPVQEAPKGRKRKPRTTEPKQPVEPKKPVESKKSGKSAKSKEKQEKITDTFKVKRKVDRFNGVSEAELLTKTLPDILTFNLDIVIIGINPGLMAAYKGHHYPGPGNHFWKCLFMSGLSEVQLNHMDDHTLPGKYGIGFTNMVERTTPGSKDLSSKEFREGGRILVQKLQKYQPRIAVFNGKCIYEIFSKEVFGVKVKNLEFGLQPHKIPDTETLCYVMPSSSARCAQFPRAQDKVHYYIKLKDLRDQLKGIERNMDVQEVQYTFDLQLAQEDAKKMAVKEEKYDPGYEAAYGGAYGENPCSSEPCGFSSNGLIESVELRGESAFSGIPNGQWMTQSFTDQIPSFSNHCGTQEQEEESHA(配列番号1361685)
いくつかの態様において、本明細書に記載の融合タンパク質は、1以上の異種タンパク質ドメイン(例として、プライム編集因子構成要素に加えて、約1、2、3、4、5、6、7、8、9もしく10以上、またはそれ以上のドメイン)を含んでいてもよい。融合タンパク質は、いずれの追加のタンパク質配列、および任意にいずれの2つのドメイン間にリンカー配列を含んでいてもよい。存在していてもよい他の例示の特色は、細胞質の局在化配列などの局在化配列、核外輸送(nuclear export)配列などの輸出(export)配列、または他の局在化配列、ならびに融合タンパク質の可溶化、精製、もしくは検出に有用な配列タグである。
プライム編集因子またはその構成要素と融合していてもよいタンパク質ドメインの例(例として、napDNAbpドメイン、ポリメラーゼドメイン、またはNLSドメイン)は、限定せずに、エピトープタグ、およびレポーター遺伝子配列を包含する。エピトープタグの非限定例は、ヒスチジン(His)タグ、V5タグ、FLAGタグ、インフルエンザ血球凝集素(HA)タグ、Mycタグ、VSV-Gタグ、およびチオレドキシン(Trx)タグを包含する。レポーター遺伝子の例は、これらに限定されないが、グルタチオン-5-トランスフェラーゼ(GST)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、ベータ-ガラクトシダーゼ、ベータ-グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、HcRed、DsRed、シアン蛍光タンパク質(CFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、および青色蛍光タンパク質(BFP)を包含する自己蛍光タンパク質を包含する。プライム編集因子は、DNA分子もしくは他の細胞分子に結合するタンパク質(これらに限定されないが、マルトース結合タンパク質(MBP)、S-タグ、Lex A DNA結合ドメイン(DBD)融合体、GAL4 DNA結合ドメイン融合体、および単純ヘルペスウイルス(HSV)BP16タンパク質融合体を包含する)またはタンパク質のフラグメントをコードする遺伝子配列と融合していてもよい。プライム編集因子の一部を形成していてもよい追加のドメインは、2011年3月10日に公開された米国特許刊行物第2011/0059502号に記載されており、その全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる。
本開示の側面において、グルタチオン-5-トランスフェラーゼ(GST)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)ベータ-ガラクトシダーゼ、ベータ-グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、HcRed、DsRed、シアン蛍光タンパク質(CFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、および青色蛍光タンパク質(BFP)を包含する自己蛍光タンパク質を包含するが、これらに限定されないレポーター遺伝子は、マーカー(これによって遺伝子産物の発現の変更または修飾を測定する)として働く遺伝子産物をコードするよう細胞中へ導入されてもよい。本開示のある態様において、遺伝子産物は、ルシフェラーゼである。本開示のさらなる態様において、遺伝子産物の発現は、減少されられる。
本明細書に提供される好適なタンパク質タグは、これらに限定されないが、ビオチンカルボキシラーゼ担体タンパク質(BCCP)タグ、myc-タグ、カルモジュリン-タグ、FLAG-タグ、血球凝集素(HA)-タグ、またヒスチジンタグまたはHis-タグとも称されるポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質(MBP)-タグ、nus-タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)-タグ、緑色蛍光タンパク質(GFP)-タグ、チオレドキシン-タグ、S-タグ、Sofタグ(例として、Sofタグ1、Sofタグ3)、strep-タグ、ビオチンリガーゼタグ、FlAsHタグ、V5タグ、およびSBP-タグを包含する。追加の好適な配列は当業者に明らかであろう。いくつかの態様において、融合タンパク質は、1以上のHisタグを含む。
本開示のいくつかの態様において、プライム編集系の活性は、PE系の発現された構成要素の滞留時間、量、および/または活性を調整することによって、時間的に調節されてもよい。例えば、本明細書に記載のとおりの、PEは、PEの細胞内半減期を修飾することが可能なタンパク質ドメインと融合していてもよい。2以上のベクターを伴うある態様(例として、本明細書に記載の構成要素が2以上の別々のベクターにコードされているベクター系)において、PE系の活性は、ベクターが送達されるタイミングを制御することによって時間的に調節されてもよい。例えば、いくつかの態様において、ヌクレアーゼ系をコードするベクターは、鋳型をコードするベクターに先立ち、PEを送達してもよい。他の態様において、PEgRNAをコードするベクターは、PE系をコードするベクターに先立ち、ガイドを送達してもよい。いくつかの態様において、PE系とPEgRNAとをコードするベクターは、同時に送達される。ある態様において、時間的に同時に送達されるベクターは、例として、PE、PEgRNA、および/または第2鎖ガイドRNA構成要素を送達する。さらなる態様において、ベクター上のコード配列から転写されるRNA(例として、ヌクレアーゼ転写産物など)は、RNAの細胞内半減期を修飾すること、および/または翻訳制御をモジュレートすることが可能な少なくとも1つの要素をさらに含んでいてもよい。いくつかの態様において、RNAの半減期は、増大されてもよい。いくつかの態様において、RNAの半減期は、減少されてもよい。いくつかの態様において、要素は、RNAの安定性を増大することが可能であってもよい。いくつかの態様において、要素は、RNAの安定性を減少することが可能であってもよい。いくつかの態様において、要素は、RNAの3'UTR内にあってもよい。いくつかの態様において、要素は、ポリアデニル化シグナル(PA)を包含していてもよい。いくつかの態様において、要素は、キャップ、例として、上流mRNAまたはPEgRNA末を包含していてもよい。いくつかの態様において、RNAは、転写後の細胞中より早い分解に供されるように、PAを一切含まなくてもよい。いくつかの態様において、要素は、少なくとも1つの、AUに富む要素(ARE)を包含していてもよい。AREは、組織型、細胞型、タイミング、細胞の局在化、および環境に依存するやり方で、ARE結合タンパク質(ARE-BP)によって結合されていてもよい。いくつかの態様において、不安定要素は、RNA崩壊を促進しても、RNA安定性に影響を及ぼしても、または翻訳を活性化してもよい。いくつかの態様において、AREは、長さが50～150ヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの態様において、AREは、配列AUUUAの少なくとも1つのコピーを含んでいてもよい。いくつかの態様において、少なくとも1つのAREは、RNAの3'UTRへ付加されていてもよい。いくつかの態様において、要素は、ウッドチャック肝炎ウイルス(WHP)であってもよい。
転写後の調節要素(WPRE)は、転写産物から発現を増強する3次構造を創出する。さらなる態様において、要素は、例えば、Zufferey et al.,J Virol,73(4):2886-92(1999)およびFlajolet et al.,J Virol,72(7):6175-80(1998)に記載されるとおり、転写産物から発現を増強することが可能な修飾および/またはトランケートされたWPRE配列である。いくつかの態様において、WPREまたは等価物は、RNAの3'UTRへ付加されていてもよい。いくつかの態様において、要素は、崩壊が早いまたは遅い転写産物のいずれかに富んだ他のRNA配列モチーフから選択されてもよい。
いくつかの態様において、PEまたはPEgRNAをコードするベクターは、PE系によるベクター上に存在する標的配列の切断を介して自己破壊され(self-destroyed)てもよい。切断は、ベクターからのPEまたはPEgRNAの連続転写を防止することもある。転写は、ある程度の時間、線状化ベクター上で生じることもあるが、細胞内分解へ科される、発現された転写産物またはタンパク質は、コードベクターの発現からの連続供給をせずに、オフターゲット効果を産生する時間をほとんど有さないであろう。
F．PE複合体
様々な態様において、本明細書に開示のプライム編集因子融合タンパク質は、本明細書に開示のPEgRNAと複合体化されていてもよい。よって、さらに本明細書に提供されるのは、(i)本明細書に提供されるPE融合タンパク質のいずれか、および(ii)PE融合タンパク質のnapDNAbp(例として、Cas9ドメイン)へ結合したPEgRNA(例として、配列表の治療的PEgRNA)を含む複合体である。いずれの具体的な理論によっても拘束されることは望まないが、PE融合タンパク質は、所望の突然変異または別様に遺伝子修飾を組み入れるためPE融合タンパク質に、所望のゲノムの標的部位を特異的および効率的に標的にさせる好適なPEgRNAをデザインすることによるプログラム型のやり方で、所望の標的部位へ向かわせられ得る。しかしながら、いくつかのケースにおいて、プライム編集のための標的部位の好適性は、好適に位置付けられたPAMの存在に依存し得る。本明細書に提供されるCas9ドメインの広がったPAM適合性は、塩基編集因子の標的範囲を、標準的な5'-NGG-3'PAM配列のおよそ15ヌクレオチド以内にはないそれらの標的部位まで拡大する潜在力を有する。当業者は、本開示および当該分野における知識に基づき、所望のゲノムの配列を標的にする好適なPEgRNA配列をデザインすることができるであろう。
いくつかの態様において、PE1は、PEgRNAと複合体化されており、以下の組成:[NLS]-[Cas9(H840A)]-[リンカー]-[MMLV_RT(wt)]を有する。構造は以下のとおりに示される:
Figure 2022531539000075
Figure 2022531539000076
いくつかの態様において、PE2は、PEgRNAと複合体化されている。この複合体は「PE3」と称されることもあり、以下の構造:[NLS]-[Cas9(H840A)]-[リンカー]-[MMLV_RT(D200N)(T330P)(L603W)(T306K)(W313F)]+PEgRNAを有する。PE3は以下の構造を有する:
Figure 2022531539000077
Figure 2022531539000078
いくつかの態様において、PEgRNAは、約15～100ヌクレオチド長であって、標的配列に相補的な少なくとも10連続したヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様において、ガイドRNAは、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、ガイドRNAは、標的配列に相補的な、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40連続したヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様において、標的配列は、DNA配列である。いくつかの態様において、標的配列は、生物のゲノム中にある。いくつかの態様において、生物は、原核生物である。いくつかの態様において、原核生物は、細菌である。いくつかの態様において、細菌は、E.coliである。いくつかの態様において、生物は、真核生物である。いくつかの態様において、生物は、植物または真菌である。いくつかの態様において、生物は、脊椎動物である。いくつかの態様において、脊椎動物は、哺乳動物である。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの態様において、生物は、細胞である。いくつかの態様において、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞は、HEK293T細胞またはU2OS細胞である。
いくつかの態様において、標的配列は、疾患または障害に関連する配列を含む。いくつかの態様において、標的配列は、疾患または障害に関連する点突然変異を含む。いくつかの態様において、標的配列は、T→C点突然変異を含む。いくつかの態様において、複合体は、標的C点突然変異を脱アミノ化するが、ここで脱アミノ化は、疾患にも障害にも関連しない配列をもたらす。いくつかの態様において、標的C点突然変異は、ガイドRNAには相補的でないDNA鎖に存在する。いくつかの態様において、標的配列は、T→A点突然変異を含む。いくつかの態様において、複合体は、標的A点突然変異を脱アミノ化するが、ここで脱アミノ化は、疾患にも障害にも関連しない配列をもたらす。いくつかの態様において、標的A点突然変異は、ガイドRNAには相補的でないDNA鎖に存在する。
いくつかの態様において、PE複合体はさらに、第2鎖へのニック入れを遂行するためのガイドRNAを含むが、前記第2鎖へのニック入れは、第1ニック(すなわち、ガイドRNAの伸長された部分上の逆転写酵素のプライミングにおける使用のための遊離3'末を提供する、最初のニック部位)の下流の場所での第2ニックの導入を指す。いくつかの態様において、第1ニックおよび第2ニックは、反対鎖上にある。他の態様において、第1ニックおよび第2ニックは、反対鎖上にある。もう1つの態様において、第1ニックは、非標的鎖(すなわち、Rループの単鎖部分を形成する鎖)上にあり、第2ニックは、標的鎖上にある。第2ニックは、第1ニックの少なくとも5ヌクレオチド下流に、または第1ニックの少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30ヌクレオチド以上下流に位置付けられている。理論に拘泥されないが、第2ニックは、所望の編集済鎖の置き換えよりむしろ、未編集鎖を置き換える細胞の内生DNA修復および複製プロセスを誘導する。いくつかの態様において、編集済鎖は非標的鎖であり、未編集鎖は標的鎖である。他の態様において、編集済鎖は標的鎖であり、未編集鎖は非標的鎖である。
第2鎖ニックは、第2ガイドRNAを使用して組み入れられるが、前記第2ガイドRNAは、第2プロトスペーサー配列すぐ近くにてPE融合タンパク質と複合体化しており、ニックを組み入れる。
いくつかの態様において、第2鎖ニックの挿入は、所望の編集の組み入れ後に生じ得る。この概念は、「一時的な第2鎖へのニック入れ」を指す。これは、二本鎖DNA破壊へ繋がり得る両鎖上への同時ニックを回避する。一時的な第2鎖へのニック入れは、所望の編集がなされた後に第2ガイドRNAを導入することを包含する様々な形で、導入され得る。
一態様において、本開示は、第2鎖へのニック入れのためのガイドRNAがプラスされたPE3複合体を指す「PE3b」複合体を提供する。この複合体は以下の構造を有する:[NLS]-[Cas9(H840A)]-[リンカー]-[MMLV_RT(D200N)(T330P)(L603W)(T306K)(W313F)]+PEgRNA+第2鎖へニックを入れるガイドRNA。PE3bは以下の構造を有する:
Figure 2022531539000079
Figure 2022531539000080
PE複合体は、無傷の融合複合体として細胞へ送達されてもよい。PE複合体はまた、1以上の発現ベクター(例として、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクター)も使用して細胞へ送達されてもよい。例えば、所望のPE複合体の送達は、同じかまたは異なるプロモーターからの、PE融合タンパク質およびPEgRNAと任意の第2鎖ガイドRNAとをコードする単一発現ベクターを包含し得る。別の例において、所望のPE複合体の送達は、第1発現ベクターからPE融合タンパク質を、第2発現ベクターからPEgRNAおよび/または任意の第2鎖ガイドRNAをコードする2以上の発現ベクターを包含し得る。
これら複合体の一部として包含されてもよいPEgRNAは、配列表(例として、配列番号1～135514または813085～880462の全PEgRNA配列)に包含されるそれら治療的PEgRNAのいずれも包含する。
IV．PE方法および処置
別の側面において、本明細書は、標的DNA配列を「プライム編集因子」で編集するための方法を提供する。本明細書に使用されるとき、用語「プライム編集」は、本出願に記載のとおりであって図1A～1Hの態様に例示されるnapDNAbp、ポリメラーゼ、および特化されたガイドRNAを使用する遺伝子編集のための新規アプローチを指す。プライム編集はまた、標的DNA分子がポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)によってDNAの鎖の合成をプライムするのに使用されるから、「標的にプライムされた逆転写」(TPRT)としても記載されてもよい。「標的にプライムされた逆転写」の名の下での用語「逆転写」の使用は、プライム編集を逆転写酵素の使用に限定することを意図していないが、むしろTPRTまたはプライム編集因子は、いずれのポリメラーゼ(例として、DNA依存性DNAポリメラーゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼ)も含んでいてもよい。様々な態様において、プライム編集は、標的DNA分子(ヌクレオチド配列の変化が、導入されるのを所望される)を、プライム編集因子ガイドRNAと複合体化された核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)と接触させることによって作動する。図1Eを参照すると、プライム編集因子ガイドRNAは、ガイドRNAの3'末もしくは5'末にて、またはガイドRNA中の分子内のある場所にて伸長を含み、所望のヌクレオチド変化(例として、単一ヌクレオチドの変化、挿入、または欠失)をコードする。ステップ(a)において、napDNAbp/伸長されたgRNA複合体はDNA分子と接触し、伸長されたgRNAは、napDNAbpを標的遺伝子座へ結合するようガイドする。ステップ(b)において、標的遺伝子座のDNAの鎖の一方におけるニックが導入され(例として、ヌクレアーゼまたは化学剤によって)、これによって標的遺伝子座の鎖の一方において利用可能な3'末が創出される。いくつかの態様において、ニックは、Rループ鎖、すなわちガイドRNA配列とはハイブリダイズされない鎖、すなわち「非標的鎖」に対応するDNAの鎖中に創出される。しかしながら、ニックは、いずれの鎖にも導入され得ない。つまり、ニックは、Rループ「標的鎖」(すなわち、伸長されたgRNAのプロトスペーサーとハイブリダイズされる鎖)または「非標的鎖」(すなわち、Rループの単鎖部分を形成する鎖であって、標的鎖に相補的である)中へ導入され得る。ステップ(c)において、DNA鎖の3'末(ニックによって形成される)は、逆転写をプライムする(すなわち、「標的にプライムされたRT」)ためにガイドRNAの伸長された部分と相互作用する。いくつかの態様において、3'末DNA鎖は、ガイドRNAの伸長された部分、すなわち、「逆転写酵素プライミング配列」上の特定のプライマー結合部位とハイブリダイズする。ステップ(d)において、逆転写酵素が導入されて、プライムされた部位の3'末から、プライム編集因子ガイドRNAの3'末へDNAの単鎖を合成する。これは、所望のヌクレオチド変化(例として、単一塩基の変化、挿入、もしくは欠失、またはそれらの組み合わせ)を含む(これを含まなければ、ニック部位での内生DNA、またはニック部位に隣接する内生DNAに相同である)単鎖DNAフラップを形成する。ステップ(e)において、napDNAbpおよびガイドRNAは放出される。ステップ(f)および(g)は、所望のヌクレオチド変化が標的遺伝子座中へ組み込まれるように、単鎖DNAフラップの分解に関する。このプロセスは、一旦3'単鎖DNAフラップが侵入して内生DNA配列とハイブリダイズすると、形成された対応の5'内生DNAフラップを除去することによって、所望の産物形成が推進され得る。理論に拘泥されないが、細胞の内生DNA修復および複製プロセスは、ミスマッチしたDNAを分解することでヌクレオチド変化(単数または複数)を組み込み、変更された所望の産物が形成される。プロセスはまた、図1Dに例示されるとおり「第2鎖へのニック入れ」産物の形成も推進され得る。このプロセスは、以下の遺伝子変化:トランスバージョン、トランジション、欠失、および挿入のうち、少なくとも1つまたはそれ以上を導入してもよい。
用語「プライム編集因子(PE)」または「プライム編集因子」は、これらに限定されないが、napDNAbp、逆転写酵素、融合タンパク質(例として、napDNAbpsと逆転写酵素とを含む)、プライム編集因子ガイドRNA、および融合タンパク質とプライム編集因子ガイドRNAとを含む複合体、ならびにプライム編集プロセスを編集済産物形成へ推進するのに役立つ付属要素(第2鎖へニックを入れる構成要素および5'内生DNAフラップ除去エンドヌクレアーゼなど)を包含する、本明細書に記載の標的にプライムされた逆転写(TPRT)を使用するゲノム編集の方法に関与する組成物を指す。
様々な態様において、プライム編集因子(PE)系は、標的変異誘発(targeted mutagenesis)を実施する、すなわち、ゲノムまたは細胞中の他のDNA要素において明確に定義された一続きのDNAのみを変異させるための、エラーを起こしやすい逆転写酵素の使用を包含していてもよい。図22は、プライム編集因子ガイドRNAと複合体化された核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)を使用し、エラーを起こしやすい逆転写酵素で、標的変異誘発を標的遺伝子座上に行うための例示のプロセスの概略図を提供する。このプロセスは、標的変異誘発のためのプライム編集の態様と称されることもある。プライム編集因子ガイドRNAは、ガイドRNAの3'末もしくは5'末での、またはガイドRNA中の分子内のある場所での伸長を含む。ステップ(a)において、napDNAbp/gRNA複合体はDNA分子に接触し、gRNAがnapDNAbpを、変異誘発されるべき標的遺伝子座へ結合するようにガイドする。ステップ(b)において、標的遺伝子座のDNAの鎖の一方にニックが導入され(例として、ヌクレアーゼまたは化学剤によって)、これによって標的遺伝子座の鎖の一方に利用可能な3'末が創出される。ある態様において、ニックは、Rループ鎖に対応するDNAの鎖、すなわち、ガイドRNA配列とはハイブリダイズされない鎖中に創出される。ステップ(c)において、3'末DNA鎖は、逆転写をプライムするために、ガイドRNAの伸長部分と相互作用する。いくつかの態様において、3'末のDNA鎖は、ガイドRNAの伸長部分上の特定のプライマー結合部位とハイブリダイズする。ステップ(d)において、エラーを起こしやすい逆転写酵素が導入されるが、これは変異誘発されたDNAの単鎖を、プライムされた部位の3'末からガイドRNAの3'末へ合成する。例示の突然変異は星印「*」で示される。これは、所望の変異誘発領域を含む単鎖DNAフラップを形成する。ステップ(e)において、napDNAbpおよびガイドRNAは放出される。ステップ(f)および(g)は、所望の変異誘発領域が標的遺伝子座中へ組み込まれるように、単鎖DNAフラップ(変異誘発領域を含む)の分解に関する。このプロセスは、一旦3'単鎖DNAフラップが侵入して他の鎖上の相補的な配列とハイブリダイズすると、形成された対応の5'内生DNAフラップを除去することによって、所望の産物形成へ推進され得る。プロセスはまた、図1Dに例示されるとおり、第2鎖にニックが入れられた産物の形成へも推進され得る。内生DNA修復および/または複製プロセスに続き、変異誘発領域は、DNA遺伝子座のDNAの両鎖中へ組み込まれるようになる。
他の態様において、PEgRNAは、遺伝子変化を標的DNA配列中へ組み込むために本明細書に記載のプライム編集系において使用されてもよい。例示のかかるプロセスは、図29に描かれている。図は、典型的なPEgRNAの、二本鎖のDNAの標的部位との相互作用の概略図を提供する。二本鎖DNAは、上の鎖が3'→5'配向であり、下の鎖が5'→3'方向であるように示される。上の鎖は「プロトスペーサー」およびPAM配列を含み、「標的鎖」と称される。相補的な下の鎖は「非標的鎖」と称される。示されてはいないが、描かれるPEgRNAは、Cas9または等価物と複合体化されるであろう。概略図に示されるとおり、PEgRNAのスペーサーは、プロトスペーサーと称される標的鎖上の相補的な領域とアニールするが、これはPAM配列のちょうど下流に位置付けられ、長さがおよそ20ヌクレオチドである。この相互作用は、スペーサーRNAとプロトスペーサーDNAとの間にDNA/RNAハイブリッドとして形成され、プロトスペーサーとは逆の領域中にRループの形成を誘導する。本明細書の他のどこかに教示されるとおり、Cas9タンパク質(示されず)は次いで、示されるとおり、非標的鎖中にニックを誘導する。次いでこれによって、3'ssDNAフラップ領域の形成へ繋がり、これは*z*に従って、PEgRNAatプライマー結合部位にてPEgRNAの3'末と相互作用する。ssDNAフラップ(すなわち、逆転写酵素プライマー配列)の3'末は、PEgRNA上のプライマー結合部位(A)とアニールし、これによって逆転写酵素がプライムされる。次に、逆転写酵素(例として、transで提供されるか、または融合タンパク質としてcisで提供され、Cas9構築物へ付着されている)は次いで、編集鋳型(B)および相同アーム(C)によってコードされるDNAの単鎖を重合する。重合は伸長アームの5'末へ続く。ssDNAの重合鎖はssDNA 3'末フラップを形成し、これは、他のどこかに記載されるとおり(例として、図1Eに示されるとおり)、内生DNAに侵入し、対応する内生鎖(これは、内生DNAの5'DNAフラップとして除去される)に取って代わり、天然に存在するDNA修復/一連の複製を通して所望のヌクレオチド編集(単一ヌクレオチド塩基対の変化、欠失、挿入(全遺伝子を包含する)を組み入れる。
本開示は、本明細書に提供されるプライム編集因子(PE)系によって修正され得る点突然変異に関連するかまたはこれによって引き起こされる疾患と診断された対象の処置のための方法を提供する。例えば、いくつかの態様において、かかる疾患(例として、上に記載のとおりの点突然変異に関連するがん)を有する対象へ、有効量の、本明細書に記載のプライム編集因子(PE)系(所望の遺伝子変化を含むドナーDNA分子の存在下での相同特異的(homology-directed)修復によって媒介されるとおりに、点突然変異を修正するかまたは疾患関連遺伝子中へ不活性化突然変異を導入する)を投与することを含む方法が提供される。いくつかの態様において、かかる疾患(例として、上に記載のとおりの点突然変異に関連するがん)を有する対象へ、有効量の、本明細書に記載のプライム編集因子(PE)系(点突然変異を修正するかまたは疾患関連遺伝子中へ不活性化突然変異を導入する)を投与することを含む方法が提供される。いくつかの態様において、疾患は、増殖性疾患である。いくつかの態様において、疾患は、遺伝的疾患である。いくつかの態様において、疾患は、新生物疾患である。いくつかの態様において、疾患は、代謝疾患である。いくつかの態様において、疾患は、リソソーム蓄積症である。点突然変異を修正するかまたは疾患関連遺伝子中へ不活性化突然変異を導入することによって処置され得る他の疾患は当業者に知られており、本開示はこの点において限定されない。
本開示は、追加の疾患または障害(例として、TPRT媒介の遺伝子編集によって修正され得る点突然変異に関連するかもしくはこれによって引き起こされる疾患または障害)の処置のための方法を提供する。いくつかのかかる疾患は本明細書に記載されており、本明細書に提供されるストラテジーおよび融合タンパク質で処置され得る追加の好適な疾患は本開示に基づき当業者に明らかであろう。例示の好適な疾患および障害は下に列挙される。夫々の配列における特定の位置または残基のナンバリングが、使用される具体的なタンパク質およびナンバリングスキームに依存することは、理解されるであろう。ナンバリングは、例として、成熟したタンパク質の前駆体および成熟したタンパク質それ自体において異なることもあり、種ごと(from species to species)の配列の差異はナンバリングに影響を及ぼすこともある。当業者は、当該技術分野において周知である方法によって(例として、配列の整列および相同の残基の決定によって)、いずれの相同のタンパク質および夫々のコード核酸における夫々の残基を同定することができるであろう。例示の好適な疾患および障害は、限定せずに以下を包含する:2-メチル-3-ヒドロキシ酪酸尿症;3ベータ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ欠損症;3-メチルグルタコン酸尿症;3-オキソ-5アルファ-ステロイドデルタ4-デヒドロゲナーゼ欠損症;46,XY性転換、1型,3型および5型;5-オキソプロリナーゼ欠損症;6-ピルボイル-テトラヒドロプテリンシンターゼ欠損症;アースコグ症候群;アーセ症候群;2型軟骨無発生症;色覚異常2および7;後天性QT延長症候群;シンゲル(Schinzel)型先端脳梁症候群;先端大腿骨頭異形成症;ホルモン耐性の有無に関わらない先端骨形成不全症2;先端紅斑角皮症(Acroerythrokeratoderma);先端短肢異形成症;Acth-非依存性の副腎皮質大結節性過形成2;活性化PI3K-delta症候群;急性間欠性ポルフィリン症;アシル-CoAデヒドロゲナーゼファミリー、メンバー9の欠損症;アダムス-オリバー症候群5および6;アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症;アデニル酸キナーゼ欠損症;アデニロコハク酸リアーゼ欠損症に起因する溶血性貧血;青年期のネフロン癆;腎・肝・膵異形成症;7型メッケル症候群;副腎白質ジストロフィー;成人接合部型表皮水疱症;表皮水疱症、接合部型、限局性バリアント;成人神経セロイドリポフスチン症;成人神経セロイドリポフスチン症;成人発症の、眼球運動失効を伴う運動失調症;ADULT症候群;無フィブリノーゲン血症および先天性無フィブリノーゲン血症;常染色体潜性無ガンマグロブリン血症2;加齢性黄斑変性症3,6,11および12;アイカルディ・グティエール症候群1,4および5;凍傷状狼瘡1;アラジール症候群1および2;アレキサンダー病;アルカプトン尿症;アラン・ハーンドン・ダドリー症候群;先天性の汎発性脱毛症;アルパース脳症;アルファ-1-抗トリプシン欠損症;常染色体優性の、常染色体劣性の、およびX連鎖劣性のアルポート症候群;アルツハイマー病、家族性、3、痙性対麻痺および運動失行あり;アルツハイマー病、1型,3型および4型;低石灰化型および低成熟型、IIA1遺伝性エナメル質形成不全症;アミノアシラーゼ1欠損症;アーミッシュ小児てんかん症候群;アミロイド形成性トランスサイレチンアミロイドーシス;トランスサイレチンに関する、アミロイド心筋症;心筋症;筋萎縮性側索硬化症1型,6型,15型(前頭側頭型認知症の有無に関わらない),22型(前頭側頭型認知症の有無に関わらない),および10型;TARDBPに関する、TDP43封入体を伴う前頭側頭型認知症;アンダーマン(Andermann)症候群;アンダーセン・タウィル症候群;先天性QT延長症候群;G6PD欠損症に起因する非球形溶血性の貧血症;アンジェルマン(Angelman)症候群;小頭症を伴う、新生児発症の重症脳症;自閉症、X連鎖性3に対する感受性;腎症、動脈瘤、および筋痙攣を伴う遺伝性の血管症;アンジオテンシンi変換酵素、穏やかな血清増加;無虹彩症、小脳性運動失調症、および精神遅滞;無爪症;アンチトロンビンIII欠損症;性器奇形およびステロイド産生異常を伴うアントレー・ビクスラー症候群;家族性胸部大動脈瘤4,6および9;胸部大動脈瘤および大動脈解離;多臓器平滑筋機能障害症候群(multisystemic smooth muscle dysfunction syndrome);もやもや病5;再生不良性貧血;見かけの鉱質コルチコイド過剰;アルギナーゼ欠損症;アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症;アロマターゼ欠損症;5型,8型および10型不整脈原性右室心筋症;原発性家族性肥大型心筋症;先天性多発性関節拘縮症、末梢の、X連鎖性;関節拘縮-腎機能障害-胆汁うっ滞症候群;関節拘縮、腎機能障害、および胆汁うっ滞2;アスパラギン合成酵素欠損症;神経細胞移動の異常性;ビタミンE欠損症を伴う運動失調症;感覚性の、常染色体優性の、運動失調症;運動失調症-毛細血管拡張症候群;遺伝性がん素因症候群(hereditary cancer-predisposing syndrome);無トランスフェリン血症;家族性の心房細動11,12,13および16;心房中隔欠損症2,4および7(心室伝導欠陥の有無に関わらない);心房停止2;房室中隔欠損症4;遺伝性眼球萎縮;ATR-X症候群;耳介下顎骨症候群2;自己免疫疾患、多臓器、小児発症;1a型自己免疫リンパ増殖性症候群;常染色体優性の無汗性外胚葉形成不全症;ミトコンドリアDNA欠失1および3を伴う、常染色体優性の進行性外眼筋麻痺;常染色体優性の捻転ジストニア4;常染色体劣性の中心核ミオパチー;常染色体劣性の先天性魚鱗癬1,2,3,4Aおよび4B;常染色体劣性のIA型および1B型皮膚弛緩症;常染色体劣性の無汗性外胚葉形成不全症候群;外胚葉異形成症11b;発汗低下/毛髪/歯型、常染色体劣性;常染色体劣性低リン酸血症性の骨疾患;3型アクセンフェルト・リーガー症候群;ベインブリッジ・ロパーズ症候群;バナヤン・ライリー・ルバルカ症候群;PTEN過誤腫症候群;バライスター(Baraitser)・ウインター症候群1および2;バラカート症候群;バルデ・ビードル症候群1,11,16および19;2型裸リンパ球症候群、相補群E;出生前2型バーター症候群;バーター症候群の3型,低カルシウム尿を伴う3型,および4型;特発性基底核石灰化症4;連珠毛;良性家族性血尿;良性家族性新生児発作1および2;発作、良性家族性新生児1、および/またはミオキミア;発作、早期小児てんかん性脳症7;良性家族性新生児-小児発作;良性遺伝性舞踏病;心筋症を伴う良性肩甲骨骨膜筋ジストロフィー;A1型およびA2型(常染色体優性)ベルナール・スーリエ症候群;ベストロフィノパチー(常染色体劣性);ベータ サラセミア;ベスレムミオパチーおよびベスレムミオパチー2;ビエッティ結晶性角膜網膜ジストロフィー;胆汁酸合成欠損症、先天性2;ビオチニダーゼ欠損症;バーク・バレル(Birk Barel)精神遅滞異形症候群;眼裂縮小、眼瞼下垂症、および眼瞼内反症;ブルーム症候群;ベルエソン・フォルスマン・レーマン症候群;バウチャー・ノイハウザー(Boucher Neuhauser)症候群;A1型およびA2型乳頭症;高血圧症を伴う乳頭症;出血を伴う脳小血管疾患;分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ欠損症;分岐鎖症候群2および3;乳がん、早期発症;乳房卵巣がん、家族性1,2および4;角膜脆性症候群2;ブロディミオパチー;汗の塩化物上昇の有無に関わらない気管支拡張症3;ブラウン・ビアレット・ヴァン レアレ症候群およびブラウン・ビアレット・ヴァン レアレ症候群2;ブルガダ症候群;ブルガダ症候群1;心室細動;発作性家族性心室細動;ブルガダ症候群およびブルガダ症候群4;QT延長症候群;心臓性突然死;標的(Bull eye)黄斑ジストロフィー;スターガート病4;錐体桿体ジストロフィー12;水疱性魚鱗癬様紅皮症;バーン・マッキューン(Burn-Mckeown)症候群;家族性カンジダ症2,5,6および8;I型およびII型糖タンパク質糖鎖不全症候群;高アンモニア血症に起因する炭酸脱水酵素VA欠損症;結腸癌;心筋不整脈;QT延長症候群、LQT1亜型;チトクロームcオキシダーゼ欠損症に起因する致死性乳児心臓脳筋症;心筋症;ダノン病;肥大型心筋症;左心室非圧縮心筋症;カルネヴァーレ症候群;1型カーニー複合体;カルニチンアシルカルニチントランスロカーゼ欠損症;カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼI,II,II(遅発性)およびII(小児性)欠損症;白内障1,4、常染色体優性、常染色体優性の多型、微小角膜を伴う、コポック様、若年性、微小角膜と糖尿を伴う、および核びまん性非進行性;カテコラミン作動性多形心室頻拍;尾状回帰症候群;家族性Cd8欠損症;中心核疾患;1,9および16番染色体の中心核不安定性ならびに免疫不全;進行性外眼筋を伴う小児小脳性運動失調症および小脳性運動失調症、精神遅滞、ならびに平衡障害症候群2;APPに関する脳アミロイド血管症;大脳皮質下梗塞および白質脳症を伴う、脳の常染色体優性および劣性の動脈症;脳海綿状奇形2;脳・眼・顔・骨格症候群2;脳-眼-顔-骨格症候群;石灰化および嚢胞を伴う脳網膜微小血管症;セロイドリポフスチン症神経細胞2,6,7および10;Ch＼xc3＼xa9diak・東症候群;成人型チェディアック・東症候群;シャルコー・マリー・トゥース病の1B型,2B2型,2C型,2F型,2I型,2U型(軸索性),1C型(脱髄性),優性中間C型,劣性中間A型,2A2型,4C型,4D型,4H型,IF型,IVF型およびX型;肩甲骨腹側脊髄筋萎縮症;遠位型脊髄性筋萎縮症、先天性非進行性;脊髄筋萎縮症、遠位型、常染色体劣性、5;CHARGE関連;小児低リン酸塩症;成人低リン酸塩症;胆嚢炎;進行性家族性肝内胆汁うっ滞3;妊娠性肝内胆汁うっ滞3;コレスタノール蓄積症;コレステロールモノオキシゲナーゼ(側鎖切断)欠損症;ブロムストランド型軟骨異形成症;穿刺性軟骨異形成症1、X連鎖劣性および2 X連鎖優性;CHOPS症候群;慢性肉芽腫性疾患、常染色体劣性チトクロームb陽性、1型および2型;チュドリー・マッカラー症候群; 原発性毛様体ジスキネジア、7,11,15,20および22;I型シトルリン血症;I型およびII型シトルリン血症;頭蓋骨裂傷症;C様症候群;A型コケイン症候群;原発性補酵素Q10欠乏症、1,4および7;コフィン・シリス/知的障害;コフィン・ローリー症候群;コーエン症候群;寒冷時発汗症候群1;コール・カーペンター症候群2;肉芽腫を伴う、細胞性および体液性免疫複合欠損症;d-2-およびl-2-ヒドロキシグルタル酸複合尿症;マロン酸およびメチルマロン酸複合尿症;酸化的リン酸化複合欠損症1,3,4,12,15および25;一部および全部の17-アルファ-ヒドロキシラーゼ/17,20-リアーゼ複合欠損症;共通可変性免疫不全症9;c1インヒビターの機能不全に起因する補体成分4の部分欠損;補体因子B欠損症;錐体単色症;錐体桿体ジストロフィー2および6;錐体桿体ジストロフィー遺伝性エナメル質形成不全症;先天性副腎過形成および先天性副腎低形成、X連鎖性;先天性無巨核球性血小板減少症;先天性無虹彩症;先天性中枢性低換気;ヒルシュスプルング病3;先天性収縮性腕十二指腸症;四肢および顔面の先天性拘縮、低緊張、および発育遅延;グリコシル化の先天性障害1B型,1D型,1G型,1H型,1J型,1K型,1N型,1P型,2C型,2J型,2K型,IIm型;I型およびII型先天性赤血球異形成貧血;顔面の先天性外胚葉異形成症;先天性赤血球生成性ポルフィリン症;2型先天性全身性リポジストロフィー;先天性心疾患、多発型2;先天性心疾患;大動脈弓離断症;先天性脂肪腫性過成長、血管奇形、および表皮母斑;非小細胞肺がん;卵巣の新生物;心伝導系障害、非特異性;先天性微絨毛萎縮症;先天性筋ジストロフィー;LAMA2の部分的欠損に起因する先天性筋ジストロフィー;先天性筋ジストロフィー－脳および眼の異常を伴うジストログリカノパチー、A2型,A7型,A8型,A11型およびA14型;先天性筋ジストロフィー－精神遅滞を伴うジストログリカノパチー、B2型,B3型,B5型およびB15型;先天性筋ジストロフィー－精神遅滞を伴わないジストログリカノパチー、B5型;先天性筋肥大－大脳症候群;先天性筋無力症候群、アセタゾールアミド反応性;繊維型不均衡を伴う先天性ミオパチー;先天性眼球コロボマ;先天性静止型夜盲症、1A型,1B型,1C型,1E型,1F型および2A型;コプロポルフィリン症;角膜平板症2;角膜ジストロフィー、フックス内皮性4;2型角膜内皮性ジストロフィー;角膜脆弱性ケラトグロブ、青色強膜、および関節過度可動性;コーネリア ド ランゲ症候群1および5;常染色体優性の冠動脈疾患2;冠状動脈疾患;高αリポタンパク質血症2; 皮質異形成症(他の脳奇形との複合)5および6;後頭部の皮質奇形;コルチコステロイド結合グロブリン欠損症;2型コルチコステロンメチルオキシダーゼ欠損症;コステロ症候群;カウデン症候群1;扁平股;常染色体優性の頭蓋骨異形成症;頭蓋縫合早期癒合症1お
よび4;頭蓋縫合早期癒合症および歯異常;クレアチン欠損症、X連鎖;クルーゾン症候群;潜在眼球症候群;停留精巣、片側または両側;クッシング指節癒合症;皮膚悪性黒色腫1;骨異栄養症と、肺、胃腸、および泌尿器の重度の異常とを伴う皮膚弛緩症;チアノーゼ、一過的な新生児のおよび非定型の腎症;嚢胞性線維症;シスチン尿症;シトクロムcオキシダーゼi欠損症;シトクロムcオキシダーゼ欠損症;D-2-ヒドロキシグルタル酸尿症2;分節性ダリエー病;内耳形成不全、小耳症、および小歯症(LAMM)を伴う難聴;難聴、常染色体優性3a,4,12,13,15、常染色体優性の非症候性感音性17,20および65;難聴、常染色体劣性1A,2,3,6,8,9,12,15,16,18b,22,28,31,44,49,63,77,86および89;難聴、蝸牛の、近視および知的障害あり、前庭障害なし、常染色体優性、X連鎖2;2-メチルブチリル-CoA脱水素酵素の欠損症;3-ヒドロキシアシル-CoA脱水素酵素の欠損症;アルファ-マンノシダーゼの欠損症;芳香族-L-アミノ酸脱炭酸酵素の欠損症;ビスホスホグリセリン酸ムターゼの欠損症;ブチリル-CoA脱水素酵素の欠損症;フェロキシダーゼの欠損症;ガラクトキナーゼの欠損症;グアニジノ酢酸メチルトランスフェラーゼの欠損症;ヒアルロノグルコサミニダーゼの欠損症;リボース-5-リン酸イソメラーゼの欠損症;ステロイド11-ベータ-モノオキシゲナーゼの欠損症;UDPグルコース-ヘキソース-1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの欠損症;キサンチンオキシダーゼの欠損症;デジェリン・ソッタス病;シャルコー・マリー・トゥース病、ID型およびIVF型;デジェリン・ソッタス症候群、常染色体優性;樹状細胞、単球、Bリンパ球、およびナチュラルキラーリンパ球の欠損症;デビュクワ(Desbuquois)異形成症2; デビュクワ症候群;DFNA 2非症候性の聴力低下;視神経萎縮および難聴を伴う糖尿病および尿崩症;2型糖尿病、およびインスリン依存性20;ダイアモンド・ブラックファン貧血1,5,8および10;下痢3(分泌性ナトリウム、先天性、症候性)、および5(タフティング腸症(tufting enteropathy)を伴う、先天性);ジカルボキシルアミノ酸尿症;びまん性掌蹠角化症、ボスニア型;デジトレノ脳症候群;ジヒドロプテリジン還元酵素欠損症;拡張型心筋症1A,1AA,1C,1G,1BB,1DD,1FF,1HH,1I,1KK,1N,1S,1Yおよび3B;左心室非圧縮3;シトクロムp450酸化還元酵素欠損症に起因するステロイド産生異常;遠位型関節拘縮2B型;遠位型遺伝性運動ニューロン症2B型;遠位型ミオパチーMarkesbery-Griggs型;遠位型脊髄性筋萎縮症、X連鎖3;二重睫毛・リンパ浮腫症候群;皮膚の欠如を伴う、優性栄養傷害性表皮水疱症;優性遺伝性視神経萎縮症;ドンナイ・バロウ症候群;ドーパミン ベータ水酸化酵素欠損症;ドーパミン受容体d2、脳内密度低下;ダウリング・デゴス病4;ドイン蜂巣状網膜ジストロフィー;マラティア・レベンチーヌ(Malattia leventinese);2型デュアン症候群;デュビン・ジョンソン症候群;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ベッカー型筋ジストロフィー;異常フィブリノーゲン血症;常染色体優性の先天性角化異常症および常染色体優性、3;常染色体劣性の先天性角化異常症1,3,4および5;X連鎖性の先天性角化異常症;顔面ミオキミアを伴う、家族性ジスキネジア;プラスミノーゲン分子異常症;ジストニア2(捻転、常染色体劣性),3(捻転、X連鎖),5(ドーパ反応型),10,12,16,25,26(ミオクロニー);良性家族性乳児の発作2;早期乳児てんかん性脳症2,4,7,9,10,11,13および14;非定型レット症候群;初期T細胞前駆体急性リンパ性白血病;外胚葉性異形成表皮水疱症候群;外胚葉性異形成-合指症候群1;偏位水晶体、単独で(isolated)常染色体劣性および優性;裂手裂足(Ectrodactyly)、外胚葉性異形成、および口唇口蓋裂症候群3;エーラス・ダンロス症候群7型(常染色体劣性)、古典型、2型(早老性)、ヒドロキシリジン欠損型、4型、4型バリアント、およびテナシンX欠損に起因するもの;アイヒスフェルト型先天性筋ジストロフィー;内分泌-大脳骨異形成症(cerebroosteodysplasia);S錐体増強症候群;拡大前庭水管症候群;エンテロキナーゼ欠損症;疣贅状表皮発育異常症;単純型表皮水疱症および肢帯筋ジストロフィー、斑状色素沈着(mottled pigmentation)を伴う単純型、幽門閉鎖を伴う単純型、単純型、常染色体劣性、および幽門閉鎖を伴う;表皮剥離性掌蹠角化症;家族性熱性痙攣8;てんかん、小児欠神2,12(特発性全身、感受性),5(夜間前頭葉型)、夜間前頭葉型1、部分性、可変の病巣があるもの(with variable foci)、進行性ミオクロニー3、およびX連鎖性、可変の学習障害および行動障害があるもの;てんかん性脳症、小児期発症、乳児期早期、1,19,23,25,30および32;骨端異形成症、多発性、近視および伝音難聴を伴う;一過性運動失調症2型;一過性疼痛症候群、家族性、3;エプスタイン症候群;フェクトナー症候群;赤芽球増殖性プロトポルフィリン症;エストロゲン抵抗性;滲出性硝子体網膜症6;ファブリー病、およびファブリー病、心臓変異型;第H因子、第VII因子、第X因子、第v因子、および第viii因子の、2つの複合欠損症、第xiii因子、サブユニット、欠損症;家族性腺腫性ポリポーシス1および3;蕁麻疹および難聴を伴う家族性アミロイド腎症;家族性寒冷蕁麻疹;家族性の小脳虫部無発生;家族性良性天疱瘡;家族性乳がん;乳がん感受性(Breast cancer, susceptibility to);骨肉腫;膵臓がん3;家族性心筋症;家族性寒冷自己炎症性症候群2;家族性大腸がん;家族性滲出性硝子体網膜症、X連鎖性;家族性片麻痺性片頭痛1型および2型;家族性高コレステロール血症;家族性肥大型心筋症1,2,3,4,7,10,23および24;家族性低カリウム血症-低マグネシウム血症;家族性低形成の、糸球体嚢胞腎;家族性乳児筋無力症;家族性若年性痛風;家族性地中海熱、および家族性地中海熱、常染色体優性;家族性多弁症;家族性晩発性皮膚ポルフィリン症;家族性肺毛細血管腫症;家族性腎性糖尿;家族性腎性低尿酸血症;家族性拘束性心筋症1;家族性1型および3型高リポ蛋白血症;ファンコニー貧血，補欠群E,I,NおよびO;ファンコニー・ビッケル症候群;ファビズム感受性(Favism, susceptibility to);熱性痙攣、家族性、11;フェインゴールド症候群1;胎児ヘモグロビン量的形質遺伝子座1;FG症候群およびFG症候群4;眼球外筋の線維症、先天性、1,2,3a(眼球外病変の有無に関わらない),3b;魚眼病;フレック角膜ジストロフィー;フローティング・ハーバー症候群;精神遅滞の有無に関わらない、言語障害を伴う焦点てんかん;巣状分節性糸球体硬化症5;前脳欠損症;フランク・テル・ハール症候群;Borrone Di Rocco Crovato症候群;フレイジャー症候群;ウィルムス腫瘍1;フリーマン・シェルドン症候群;前頭骨幹端異形成症1および3;前頭側頭型認知症;前頭側頭型認知症および/または筋萎縮性側索硬化症3および4;前頭側頭型認知症第3染色体連鎖性および前頭側頭型認知症ユビキチン陽性;フルクトース-ビホスファターゼ欠損症;フールマン(Fuhrmann)症候群;ガンマ-アミノ酪酸トランスアミナーゼ欠損症;ガムストープ・ウォールファールト(Gamstorp-Wohlfart)症候群; ゴーシェ病1型および亜急性神経障害性;進行性の脊椎側弯症を伴う、家族性水平注視麻痺;全般性優性ジストロフィー型表皮水疱症;全般性てんかん、熱性痙攣プラス3,1型,2型を伴う;レノックス・ガストー型てんかん脳症;巨大軸索ニューロパチー;グランツマン血栓症;緑内障1、開放角、e,FおよびG;緑内障3、原発性先天性、d;先天性緑内障、および先天性緑内障、コロボマ;緑内障、原発性開放角、若年性発症;神経膠腫感受性1;グルコーストランスポーター1型欠損症候群;ルコース-6-リン酸輸送欠損症;GLUT1欠損症候群2;特発性全般性てんかん感受性、12;グルタミン酸ホルミノトランスフェラーゼ欠損症;グルタル酸血症IIAおよびIIB;グルタル酸尿症1型;グルタチオン合成酵素欠損症;糖原病0(筋肉),II(成人形),IXa2,IXc,1A型;II型,IV型,IV(肝とミオパチーとの複合),V型およびVI型;ゴールドマン・ファーブル症候群;ゴードン症候群;ゴーリン症候群;全前脳胞症シークエンス;全前脳胞症7;顆粒腫性疾患、慢性、X連鎖性、バリアント;卵巣の顆粒膜細胞腫瘍;灰色血小板症候群;グリセリ症候群3型;グレーノー角膜ジストロフィーI型;成長および精神遅滞、下顎顔面異形症、小頭症、および口蓋裂;下垂体異常を伴う成長ホルモン欠損症;免疫不全を伴う成長ホルモン不感受性;GTPシクロハイドロラーゼI欠損症;ハジュ・チーニー症候群;手足子宮症候群;聴覚障害;小児毛細血管腫;血液腫瘍;ヘモクロマトーシス1型,2B型および3型;糖尿病の微小血管合併症7;トランスフェリン血清レベル量的形質座2;ヘモグロビンH病、無欠損;グルコースリン酸イソメラーゼ欠損症に起因する、溶血性貧血、非球状赤血球性;血球貪食性リンパ組織球症、家族性、2;血球貪食性リンパ組織球症、家族性、3;ヘパリン補因子II欠損症;遺伝性腸性先端皮膚炎;遺伝性乳がん・卵巣がん症候群;運動失調・毛細血管拡張症様障害;遺伝性びまん性胃がん;スフェロイドを伴う遺伝性びまん性白質脳症;遺伝性第II,第IX,第VIII因子欠損症;遺伝性出血性毛細血管拡張症2型;無汗症を伴う遺伝性無痛症;遺伝性リンパ浮腫I型;視神経萎縮を伴う遺伝性運動・感覚神経症;早期呼吸不全を伴う遺伝性ミオパチー;遺伝性神経痛性筋萎縮症;遺伝性非ポリポーシス大腸新生物;リンチ症候群IおよびII;遺伝性膵炎;慢性膵炎感受性;遺伝性感覚・自律神経障害IIB型およびIIA型;遺伝性鉄芽球性貧血;ヘルマンスキー・ポドラック症候群1,3,4および6;内臓錯位、2,4および6、常染色体;内臓錯位、X連鎖性;組織球性髄様細網症;異所形成;組織球症-リンパ節腫大プラス症候群;ホロカルボキシラーゼ合成酵素欠損症;全前脳胞症2,3,7および9;ホルト・オラム症候群;MTHFR欠損症、CBS欠損症、およびホモシステイン尿症に起因するホモシステイン血症、ピリドキシン応答性;コバラミン代謝異常に起因する、ホモシステイン尿症-巨赤芽球性貧血、cblE相補型;ハウエル・エバンス(Howel-Evans)症候群;ハーラー症候群;ハッチンソン・ギルフォード症候群;水頭症;高アンモニア血症、III型;高コレステロール血症、および高コレステロール血症、常染色体劣性;過剰驚愕症2および遺伝性の過剰驚愕症;高フェリチン血症白内障症候群;高グリシン尿症;周期性発熱を伴う高免疫グロブリンD;メバロン酸尿症;高免疫グロブリンE症候群;家族性の高インスリン血症性低血糖症3,4および5;高インスリン血症-高アンモニア血症症候群;高リシン血症;ジストニア、赤血球増加症、および肝硬変を伴う高マンガン血症;高オルニチン血症-高アンモニア血症-ホモシトルリン尿症症候群;副甲状腺機能亢進症1および2;副甲状腺機能亢進症、新生児重度;部分的pts欠損症、BH4欠損症、D、非pkuに起因する、高フェニルアラニン血症、bh4欠損症、a;精神遅滞症候群2,3および4を伴う高リン酸血症;多毛性骨軟骨異形成症;apob32に関連する、低ベータリポ蛋白血症、家族性;低カルシウム血症、常染色体優性1;低カルシウム尿性高カルシウム血症、家族性、1型および3型;低軟骨形成症;鉄過剰症を伴う低クロム小球性貧血;肝臓中グリコーゲン合成酵素の欠損症を伴う低血糖症;臭覚障害の有無に関わらない低ゴナドトロピン性性腺機能低下症11;免疫不全を伴う無汗性外胚葉形成不全症;発汗低下のX連鎖性外胚葉異形成;低カリウム性周期性四肢麻痺1および2;低マグネシウム血症1、腸の;低マグネシウム血症、発作、および精神遅滞;低髄性白質ジストロフィー7;左心低形成症候群;房室中隔欠損症および共通房室接合部;尿道下裂1および2、X連鎖性;甲状腺機能低下症、先天性非甲状腺腫、1;減毛症8および12;減毛症-リンパ浮腫-血管拡張症候群;I血液型系;シーメンス型水疱性魚鱗癬;剥脱性魚鱗癬;未熟児魚鱗癬症候群;特発性基底核石灰化症5;特発性線維性肺胞炎、慢性型;先天性角化不全症、常染色体優性、2および5;乳児期の特発性高カルシウム血症;カルシウム流入障害2に起因するT細胞不活性化を伴う免疫機能障害; 1型および2型高IgMを伴う、cd3-ゼータの欠陥に起因する、免疫不全15,16,19,30,31C,38,40,8、ならびにマグネシウム欠陥を伴う、X連鎖性、エプスタイン・バーウイルス感染、および新形成;免疫不全-動原体不安定性-顔面奇形症候群2;封入体ミオパチー2および3;野中ミオパチー;乳児痙攣および発作性舞踏症、家族性;乳児皮質過骨症;乳児GM1ガングリオシドーシス;乳児低ホスファタシアーゼ血症;乳児ネフロン癆;乳児眼振、X連鎖性;乳児パーキンソン病-ジストニア;多尾性精子および過剰なDNAに関連する不妊症;イ
ンスリン抵抗性;インスリン抵抗性糖尿病および黒色表皮腫;インスリン依存性糖尿病分泌性下痢症候群;間質性腎炎、核巨大化(karyomegalic);子宮内発育遅延、骨幹端異形成症、先天性副腎低形成、および性器奇形;ヨードチロシン結合欠損症;IRAK4欠損症;虹彩隅角異発生優性型および1型;脳内鉄蓄積;坐骨膝蓋骨異形成;膵島細胞過形成;17,20-リアーゼ単独欠損症;ルトロピン単独欠損症;イソバレリル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症;ヤンコヴィッチ・リベラ症候群;ジャーベルおよびランゲ・ニールセン症候群2;ジュベール症候群1,6,7,9/15(2遺伝子性),14,16および17、ならびに口顔面指症候群xiv;ヘルリッツの接合部表皮水疱症;若年性GM＞1＜ガングリオシドーシス;若年性ポリポーシス症候群;若年性ポリポーシス/遺伝性出血性毛細血管拡張症症候群;若年性網膜炎;歌舞伎メーキャップ症候群;カルマン症候群1,2および6;思春期遅延症;神崎病;カラック症候群;カルタゲナー症候群;ケニー・ケイフィ症候群2型;ケッペン・ルビンスキー(Keppen-Lubinsky)症候群;円錐角膜1;毛包性角化症;掌蹠膿疱症1;キンドラー症候群;L-2-ヒドロキシグルタル酸尿症;ラーセン症候群、優性型;格子状角膜ジストロフィーIII型;レーバー黒内障;ツェルウェガー症候群;ペルオキシソーム生合成異常症;ツェルウェガー症候群スペクトラム;レーバー先天性黒内障11,12,13,16,4,7および9;レーバー視神経萎縮症;アミノグリコシド誘発性難聴;難聴、非症候性感音性、ミトコンドリア;左心室非圧縮症5;左右軸奇形;リー病;ミトコンドリア短鎖エノイル-CoAヒドラターゼ1欠損症;ミトコンドリア複合体I欠損症に起因するリー症候群;ライナー病;レリー・ワイル軟骨骨異形成症;致死性先天性拘縮症候群6;白血球接着不全症I型およびIII型;白骨ジストロフィー、ミエリン形成不全性、11および6;白質脳症、運動失調を伴う、脳幹・脊髄障害と乳酸値上昇とを伴う、白質の消失を伴う、および進行性の、卵巣不全を伴う;全白爪;レビー小体型認知症;リヒテンシュタイン・クノール症候群;リー・フラウメニ症候群1;Lig4症候群;肢帯筋ジストロフィー1B型,2A型,2B型,2D型,C1型,C5型,C9型,C14型;脳および眼の異常を伴う先天性筋ジストロフィー-ジストログリカノパチー、A14型およびB14型;複合型リパーゼ欠損症;脂肪蛋白症;リポジストロフィー、家族性部分的、2型および3型;脳回欠損1,2(X連鎖性),3,6(小頭症を伴う),X連鎖性;皮質下帯状ヘテロトピア、X連鎖性;急性乳児肝不全;ロイス・ディーツ症候群1,2,3;QT延長症候群1,2,2/9,2/5,(2遺伝子性),3,5および5、後天性、感受性;肺がん;リンパ浮腫、遺伝性、id;リンパ浮腫、原発性、骨髄異形成を伴う;リンパ増殖症候群1,1(X連鎖性)および2;リソソーム酸リパーゼ欠損症;大頭症、巨人症、顔面異形症候群;黄斑変性症、卵黄様、成人期に発症;悪性高熱感受性1型;悪性リンパ腫、非ホジキン;悪性黒色腫;前立腺の悪性腫瘍;下顎骨異形成症;A型またはB型リポジストロフィーを伴う下顎骨異形成症、非定型;下顎顔面異形成症、トレーチャー・コリンズ型、常染色体劣性;マンノース結合タンパク質欠乏症;メープルシロップ尿症1A型および3型;マルデン・ウォーカー様症候群;マルファン症候群;マリネスコ・Sj＼xc3＼xb6gren症候群;マートソフル(Martsolf)症候群;成熟期に発症する若年性糖尿病、1型,2型,11型,3型および9型;メイ・ヘグリン異常症;MYH9関連疾患;セバスチャン症候群;マキュン・オルブライト症候群;体細胞腺腫;性索-間質性腫瘍;クッシング症候群;マクシック・カウフマン症候群;マクラウド神経赤血球症症候群;メッケル・グルーバー症候群;中鎖アシル-補酵素A脱水素酵素欠損症;髄芽腫;皮質下嚢胞1および2aを伴う大脳白質脳症;大頭-先天性大理石様皮膚;PIK3CA関連過成長スペクトラム;巨脳-多小脳回-多指-水頭症候群2;巨大芽球性貧血、チアミン反応性、糖尿病および感音性難聴を伴う;マイヤー・ゴーリン症候群1および4;メルニック・ニードルズ症候群;髄膜腫;精神遅滞、X連鎖性、3,21,30および72;精神遅滞および小頭症、脳橋および小脳の低形成を伴う;X連鎖精神遅滞症候群5;精神遅滞、上顎前突、および斜視;精神遅滞、常染色体優性12,13,15,24,3,30,4,5,6および9;精神遅滞、常染色体劣性15,44,46および5;精神遅滞、定型動作、てんかん、および/または脳奇形;精神遅滞、症候群性、クラース・ジェンセン(Claes-Jensen)型、X連鎖性;精神遅滞、X連鎖、非特異的、症候性、ヘデラ(Hedera)型、および症候性、ウー(wu)型;メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー;異染性白質ジストロフィー若年型、乳児期後期型、および成人型;異染性白質ジストロフィー;変容性骨異形成症;メトヘモグロビン血症I型および2型;メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ欠損症、常染色体優性;ホモシスチン尿症を伴うメチルマロン酸血症;メチルマロン酸尿症cblB型;メチルマロニル-CoAムターゼ欠損症に起因するメチルマロン酸尿症;メチルマロン酸尿症mut(0)型;小頭症性骨異形成原基性小人症2型;絨毛網膜症、リンパ浮腫、または精神遅滞の有無に関わらない小頭症;小頭症、裂孔ヘルニア、およびネフローゼ症候群;小頭症;脳梁の低形成症;痙性対麻痺50、常染色体劣性;全身性発育遅延;CNSミエリン形成不全症;脳萎縮;小頭症、正常な知能および免疫不全;小頭症-毛細血管奇形症候群;小球性貧血;症候群性小眼球症5,7および9;小眼球症、単独3,5,6,8、およびコロボマ6を伴う;微小球症;片頭痛、家族性片麻痺性;ミラー症候群;外眼筋麻痺を伴うミニコアミオパチー;コアを伴う先天性ミオパチー;ミッチェル・ライリー症候群;ミトコンドリア3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA合成酵素欠損症;ミトコンドリア複合体I,II,III,III(核型2,4または8)欠損症;ミトコンドリアDNA枯渇症候群11,12(心筋症型),2,4B(MNGIE型),8B(MNGIE型);ミトコンドリアDNA枯渇症候群3および7,肝脳型および13(脳筋症型);ミトコンドリアリン酸担体およびピルビン酸担体欠損症;ミトコンドリア三機能性タンパク質欠損症;長鎖3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症;三好型筋ジストロフィー1;遠位型ミオパチー、前脛骨発症を伴う;モーア・トラネジャーグ(Mohr-Tranebjaerg)症候群;モリブデン補因子欠損症、相補群A;モワット・ウィルソン症候群;ムコリピドーシスIIIガンマ;ムコ多糖症VI型,VI型(重症)およびVII型;ムコ多糖症、MPS-I-H/S,MPS-II,MPS-III-A,MPS-III-B,MPS-III-C、MPS-IV-A,MPS-IV-B;網膜色素変性症73;ガングリオシドーシスGM1型1(心臓障害を伴う)3;多中心性骨溶解腎症;多中心性骨溶解、結節症、および関節症;多発性先天異常;心房中隔欠損症2;多発性先天異常-筋緊張低下-発作症候群3;多発性の皮膚および粘膜静脈奇形;多発性内分泌腺新形成1型および4型;多発性骨端異形成症5型または優性;多発性腸管閉鎖症;多発性翼状片症候群エスコバール型;多発性スルファターゼ欠損症;多発性骨癒合症症候群3;筋AMPグアニンオキシダーゼ欠損症;筋眼脳疾患;筋ジストロフィー、先天性、巨円錐体型;筋無力症、家族性小児、1;アセチルコリン受容体欠損症に関連する、先天性筋無力症症候群11;先天性筋無力症症候群17,2A(スローチャネル),4B(ファストチャネル)および管状集合体を伴わない;ミエロペルオキシダーゼ欠損症;MYH関連ポリポーシス;子宮内膜癌;心筋梗塞1;ミオクローヌス性ジストニア;ミオクローヌス性-無緊張性てんかん;赤色ボロ繊維・ミオクローヌスてんかん;筋原線維ミオパチー1およびZASP関連;ミオグロビン尿、急性再発性、常染色体劣性;筋神経胃腸管性脳症症候群;進行性外眼筋麻痺を伴う小児小脳性運動失調症;ミトコンドリアDNA枯渇症候群4B、MNGIE型;ミオパチー、中心核、1、先天性、過剰の筋紡錘を伴う、遠位の、1、乳酸アシドーシス、および鉄芽球性貧血1、先天性白内障を伴うミトコンドリア進行性の、聴覚消失、および発育遅延、および管状集合体、2;近視6;筋硬化症、常染色体劣性;先天性筋強直症;先天性筋強直症、常染色体優性型および劣性型;爪膝蓋骨症候群;ナンス・ホラン症候群;小眼球症2;ナバホ神経肝障害;ネマリンミオパチー3および9;新生児筋緊張低下;知的障害;痙攣;言語発達遅延;精神遅滞、常染色体優性31;シトリン欠損症によって引き起こされる新生児肝内胆汁うっ滞;腎性尿崩症、腎性尿崩症、X連鎖性;腎結石症/骨粗鬆症、低リン酸血症性、2;ネフロン癆13,15および4;不妊症;脳-眼-腎症候群(ネフロン癆、眼球運動失効、および小脳異常);ネフローゼ症候群、3型,5型、眼球異常の有無に関わらない、7型および9型;ネスター・グレルモプロジェリア症候群;ノイ・ラクソバ(Neu-Laxova)症候群1;脳鉄蓄積を伴う神経変性症4および6;神経フェリチン症;神経線維腫症、1型および2型;神経線維肉腫;神経下垂体性尿崩症;ニューロパチー、遺伝性感覚性、IC型;中性1アミノ酸輸送障害;ミオパチーを伴う中性脂質蓄積症;好中球免疫不全症候群;ニコライデス・バライスター症候群;ニーマン・ピック病C1型,C2型,A型およびC1、成人型;非ケトーシス性高グリシン血症;ヌーナン症候群1および4、LEOPARD症候群1;若年性骨髄単球性白血病の有無に関わらないヌーナン症候群様障害;正常カリウム血性周期性四肢麻痺、カリウム感受性;ノルム病;てんかん、聴覚消失、および精神遅滞症候群;精神遅滞、X連鎖性102および症候性13;肥満;眼白子症、I型;眼皮膚白子症1B型,3型および4型;眼歯指異形成症;歯限局型低ホスファターゼ症;歯-毛髪-四肢症候群(Odontotrichomelic syndrome);大口病;減歯症-大腸直腸癌症候群;オピッツG/BBB症候群;視神経萎縮症9;口腔顔面指趾症候群;オルニチンアミノトランスフェラーゼ欠損症;口腔顔面裂11および7、口唇/口蓋外胚葉異形成症候群;オルスタビック・リンデマン・ソルベルグ症候群;軽度の軟骨異形成症を伴う骨関節炎;離断性骨軟骨炎;骨形成不全症12型,5型,7型,8型,I型,III型、正常な強膜を伴う、優性型、劣性周産期致死性;頭蓋骨硬化症を伴う線条骨症;常染色体優性の大理石骨症1型および2型,劣性4型,劣性1型,劣性6型;偽神経膠腫を伴う骨粗鬆症;耳口蓋指症候群I型およびII型;卵巣形成不全1;卵巣白質脳症;先天性爪肥厚症4および2型;骨パジェット病、家族性;パリスター・ホール症候群;掌蹠角化症、非表皮剥離性、局所性またはびまん性;膵臓無形成および先天性心疾患;パピロン・Lef＼xc3＼xa8vre症候群;傍神経膠節腫3;フォン・オレインブルグ(von Eulenburg)の先天性異常筋強直症;副甲状腺癌;パーキンソン病14,15,19(若年性発症),2,20(早期発症),6,(常染色体劣性の早期発症)および9;限局性白皮証;ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ部分欠損症;網膜色素上皮の模様ジストロフィー;PC-K6a;ペリザウス・メルツバッハー病;ペンドレッド症候群;末梢性脱髄性神経障害、中枢性脱髄性;ヒルシュスプルング病;永続型新生児糖尿病;永続型新生児糖尿病、神経学的特色を伴う;新生児インスリン依存性糖尿病;若年発症成人型糖尿病、2型;ペルオキシソーム生合成障害14B,2A,4A,5B,6A,7Aおよび7B;ペロー症候群4;ペリー症候群;新生児の持続性高インスリン性低血糖症;家族性高インスリン症;表現型;フェニルケトン尿症;褐色細胞腫;遺伝性パラガングリオーマ-褐色細胞腫症候群;パラガングリオーマ1;腸のカルチノイド腫瘍;カウデン症候群3;ホスホグリセリン酸脱水素酵素欠損症;ホスホグリセリン酸キナーゼ1欠損症;光感受性硫黄欠乏性毛髪発育異常症;フィタン酸蓄積病;ピック病;ピアソン症候群;色素性網膜ジストロフィー;色素性結節状副腎皮質病変、原発性、1;石灰化上皮腫;ピット・ホプキンス症候群;下垂体依存性高コルチゾール症;下垂体ホルモン欠損症、複合型1,2,3および4;プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1型欠損症;プラスミノーゲン欠損症、I型;血小板型出血障害15および8;多形皮膚萎縮症、遺伝性線維化、腱性拘縮、ミオパチー、および肺線維症を伴う;多発性嚢胞腎疾患2、成人型および乳児型;硬化性白質脳症を伴う多嚢胞性脂肪膜性骨異形成症;免疫不全の有無に関わらないポリグルコサン体ミオパチー1;多小脳回、非対称性、両側性前頭頭頂部;多発性神経炎、聴覚消失、運動失調、網膜色素変性、および白内障;4型橋小脳形成不全症;膝窩部贅皮症候群;孔脳症2;汗孔角化症8、伝染性表層化学活性型;ポルフォビリノーゲン合成酵素欠損症;晩発性皮膚ポルフィリン症;網膜色素変性症を伴う脊髄後索性失調症;後極白内障2型;プラダー・ウィリー様症候群;早発卵巣不全4,5,7および9;原発性常染色体劣性小頭症10,2,3および5;原発性線毛機能不全24;原発性拡張
型心筋症;左心緻密化障害6;4、左心緻密化障害10;発作性心房細動;原発性高シュウ酸尿症、I型およびIII型;原発性肥大性骨関節症、常染色体劣性2;原発性低マグネシウム血症;原発性開放隅角緑内障若年発症1;原発性肺高血圧症;プリムローズ症候群;進行性家族性心ブロック1B型;進行性家族性肝内胆汁うっ滞2および3;進行性肝内胆汁うっ滞;運動失調症を伴う進行性ミオクローヌスてんかん;進行性偽リウマチ性異形成症;進行性硬化性灰白異栄養症;プロリダーゼ欠損症;プロリン脱水素酵素欠損症;統合失調症4;プロパジン欠損症、X連鎖性;プロピオン酸血症;プロタンパク質変換酵素1/3欠損症;前立腺がん、遺伝性、2;プロタン欠損症;蛋白尿;フィンランド型先天性ネフローゼ症候群;プロテウス症候群;乳腺癌;偽軟骨発育不全脊椎骨端異形成症;偽性低アルドステロン症1型常染色体優性および劣性および2型;偽性副甲状腺機能低下症1A型;偽性偽性副甲状腺機能低下症;仮性新生児副腎白質ジストロフィー;偽原発性高アルドステロン症;弾性線維性仮性黄色腫;乳児の全身性動脈石灰化症2;多発性凝固因子欠損症を伴う弾性線維性仮性黄色腫様障害;乾癬感受性2;PTEN過誤腫症候群;遺伝性出血性毛細血管拡張症に関連する肺動脈性高血圧症;肺線維症および/または骨髄不全、テロメアに関連する、1および3;遺伝性出血性毛細血管拡張症を伴う、肺高血圧症、原発性、1;プリン-ヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症;ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症;ピルビン酸脱水素酵素E1-アルファ欠損症;赤血球のピルビン酸キナーゼ欠損症;レイン症候群;ラスオパチー;劣性栄養障害性表皮水疱症;爪障害、非症候性先天性、8;ライフェンスタイン症候群;腎欠損症;腎カルニチン輸送障害;腎コロボマ症候群;腎異形成症;腎異形成症、網膜色素性ジストロフィー、小脳性運動失調症、および骨格異形成症;遅発性感音性聴覚消失を伴うか、または溶血性貧血を伴う、腎尿細管性アシドーシス、遠位型、常染色体劣性;眼球異常および精神遅滞を伴う、腎尿細管性アシドーシス、近位型;網膜錐体ジストロフィー3B;網膜色素変性症;網膜色素変性症10,11,12,14,15,17および19;網膜色素変性症2,20,25,35,36,38,39,4,40,43,45,48,66,7,70,72;網膜芽細胞腫;レット障害;ラブドイド腫瘍素因症候群2;裂孔原生網膜剥離、常染色体優性;肢根型点状軟骨異形成症2型および3型;ロバーツ-SCあざらし肢奇形症候群;ロビノー・ソラウフ(Robinow Sorauf)症候群;ロビノー症候群、常染色体劣性、短合多指症を伴う常染色体劣性;ロスムンド・トムソン症候群;ラパデリノ症候群;RRM2B関連ミトコンドリア病;ルービンシュタイン・タイビ症候群;サラ病;サンドホフ病、成人型および乳児型;サルコイドーシス、早期発症;ブラウ症候群;シンドラー病、1型;裂脳症;統合失調症15;蝸牛様骨盤異形成症;神経鞘腫症2;シュワルツ・ヤンペル症候群1型;角膜硬化、常染色体劣性;硬結性骨化症;二次性甲状腺機能低下症;瀬川症候群、常染色体劣性;セニオール・ローケン症候群4および5;感覚性運動失調型ニューロパチー、構音障害、および眼麻痺;セピアプテリン還元酵素欠損症;SeSAME症候群;小頭症、成長遅延、電離放射線感受性を伴う、ADA欠損症に起因する重症複合免疫不全症、非定型、常染色体劣性、T細胞陰性、B細胞陽性、NK細胞陽性のNK細胞陰性;重症先天性好中球減少症;重症先天性好中球減少症3、常染色体劣性または優性;重症先天性好中球減少症および6、常染色体劣性;乳児期の重篤なミオクロニーてんかん;熱性痙攣プラスの全般てんかん、1型および2型;重篤なX連鎖性筋細管ミオパチー;QT短縮症候群3型;非特異的な骨格異常を伴う低身長;低身長、耳道狭窄症、下顎形成不全、骨格異常;低身長、爪甲形成不全、顔異形、および貧毛症;原基性小人症;多指症の有無に関わらない短肋胸郭異形成症11または3;シアリドーシスI型およびII型;シルバー痙性対麻痺症候群;神経伝導速度遅延、常染色体優性;スミス・レムリ・オピッツ症候群;スナイダー・ロビンソン症候群;成長ホルモン分泌腺腫;プロラクチノーマ;家族性、下垂体腺腫素因;ソトス症候群1または2;痙性失調症5、常染色体劣性、シャルルボワ・サグネ型、1,10または11、常染色体劣性;筋萎縮性側索硬化症5型;痙性対麻痺15,2,3,35,39,4、常染色体優性、55、常染色体劣性、および5A;胆汁酸合成障害、先天性、3;精子形成不全11,3および8;球状赤血球症4型および5型;球状体ミオパチー;脊髄性筋萎縮症、下肢優位2、常染色体優性;脊髄性筋萎縮症、II型;脊髄小脳失調症14,21,35,40および6;脊髄小脳失調症、常染色体劣性1および16;脾臓低形成;脊椎手根骨足根骨癒合症候群;脊椎手掌異形成、エーラス・ダンロス症候群様、免疫調節異常を伴う、アグリカン型、先天性関節脱臼を伴う、短肢-手型、セダガッテン(Sedaghatian)型、錐体桿体ジストロフィーを伴う、およびコズロウスキー型; 捩れ小人症;シュタルガルト病1;錐体桿体ジストロフィー3;スティックラー症候群1型;クニースト(Kniest)異形成症;スティックラー症候群、1型(非症候性眼性)および4型;スティング関連脈管障害、小児期発症;ストームオルケン症候群;スタージ・ウェーバー症候群、毛細血管奇形、先天性、1;サクシニル-CoAアセト酢酸転移酵素欠損症;スクラーゼ-イソマルターゼ欠損症;乳児突然死症候群;亜硫酸酸化酵素欠損症、独立型;大動脈弁上狭窄;肺サーファクタント代謝機能障害、2および3;指節癒合症、近位、1b;セナニー・レンツ型合指症;3型合指症;症候性X連鎖性精神遅滞16;内反尖足;タンジール病;TARP症候群;テイ・サックス病、B1バリアント、Gm2ガングリオシドーシス(成人)、Gm2ガングリオシドーシス(成人発症);テムタリー(Temtamy)症候群;テノリオ症候群;肢端骨異形成;テストステロン17-ベータ-デヒドロゲナーゼ欠損症;無四肢症、常染色体劣性;ファロー四徴症;左心低形成症候群2;動脈瘤;心臓および大血管の奇形;心室中隔欠損症1;ティール・ベーンケ(Thiel-Behnke)角膜ジストロフィー;胸部大動脈瘤および大動脈解離;マルファン様体型;3M症候群2;血小板減少症、血小板機能障害、溶血、およびグロビン合成不均衡;血小板減少症、X連鎖性;血栓症、遺伝性、プロテインC欠損症に起因、常染色体優性および劣性;甲状腺無形成;甲状腺がん、濾胞性;甲状腺ホルモン代謝異常;甲状腺ホルモン抵抗性、汎発性、常染色体優性;甲状腺中毒性周期性四肢麻痺および甲状腺中毒性周期性四肢麻痺2;サイトロピン放出ホルモン抵抗性、汎発性;チモシー症候群;TNF受容体関連周期熱症候群(TRAPS);歯無発生、選択的、3および4;多形性心室頻拍(Torsades de pointes);タウンズ・ブロックス鰓弓耳腎様症候群;新生児の一過性表皮水疱症;トリーチャー・コリンズ症候群1;精神遅滞、小人症、および網膜の色素変性を伴う長睫毛症;三叉神経節異形成症I型;三叉神経節症候群3型;トリメチルアミン尿症;結節性硬化症症候群;リンパ管筋腫症;結節性硬化症1および2;チロシナーゼ陰性眼皮膚白皮症;チロシナーゼ陽性眼皮膚白皮症;チロシン血症I型;UDPグルコース-4-エピメラーゼ欠損症;ウルリッヒ型先天性筋ジストロフィー;重度の四肢欠損を伴う尺骨・腓骨欠損症;アップショー・シュールマン症候群;ウロカニン酸加水酵素欠損症;アッシャー症候群、1型,1B型,1D型,1G型,2A型,2C型および2D型;網膜色素変性症39;紫外線感受性症候群;ファン・デル・ウーデ(Van der Woude)症候群;ヴァン・マルダーゲム(Van Maldergem)症候群2;ヘンカムリンパ管拡張症-リンパ浮腫症候群2;異型ポルフィリン症;嚢胞性腎疾患を伴う脳室拡大;ヴェルヘイ(Verheij)症候群;超長鎖アシル-CoA脱水素酵素欠損症;膀胱尿管逆流症8;内臓逆位5、常染色体;腹部ミオパチー;ビタミンD依存性くる病、1型および2型;卵黄型ジストロフィー;フォン・ヴィルブランド病2M型および3型;ワールデンブルグ症候群1型,4C型および2E型(神経学的病変を伴う);クライン・ワールデンブルグ症候群;ウォーカー・ワールブルグ先天性筋ジストロフィー;ワールブルグ・マイクロ症候群2および4;イボ、低ガンマグロブリン血症、感染症、および骨髄性細胞貯留;ウィーバー症候群;ヴァイユ・マルケザーニ症候群1および3;ヴァイユ・マルケザーニ様症候群;ワイセンバッハー・ツウェイミュラー(Weissenbacher-Zweymuller)症候群;ウェルドニッヒ・ホフマン病;シャルコー・マリー・トゥース病;ウェルナー症候群;WFS1関連障害;ウィデマン・スタイナー症候群;ウィルソン病;ウォルフラム様症候群、常染色体優性;ワース(Worth)病;ファン・ブッヘム病2型;色素性乾皮症、相補群b,群D,群Eおよび群G;X連鎖無ガンマグロブリン血症;X連鎖性 遺伝性運動感覚性ニューロパチー;ステリルスルファターゼ欠損症を伴うX連鎖性魚鱗癬;X連鎖性脳室周囲異所性灰白質;耳口蓋指症候群、I型;X連鎖性重症複合免疫不全症;チンメルマン・レーバンド(Zimmermann-Laband)症候群およびチンメルマン・レーバンド症候群2;ならびに小帯(Zonular)粉状白内障3。
具体的な側面において、本開示は、拡大反復障害(また反復拡大障害もしくはトリヌクレオチド反復障害としても知られている)と診断された対象の処置のためのTPRTベースの方法を提供する。拡大反復障害は、マイクロサテライト反復が長さ閾値を超えて拡大したときに生じる。目下、少なくとも30の遺伝的疾患は、反復拡大によって引き起こされるものと考えられている。この多様な群の障害への科学的理解は、1990年代初頭に、トリヌクレオチド反復が、脆弱X、球脊髄性筋萎縮症、筋強直症ジストロフィー、およびハンチントン病(Nelson et al,"The unstable repeats?3 evolving faces of neurological disease,"Neuron,March 6,2013,Vol.77;825-843(これは参照により本明細書に組み込まれる))、ならびにホー・リバー(Haw River)症候群、ヤコブセン症候群、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症(DRPLA)、マシャド・ジョセフ病、合多指症(SPD II)、手足生殖器症候群(HFGS)、鎖骨頭蓋異形成症(CCD)、全前脳欠損障害(HPE)、先天性中枢性低換気症候群(CCHS)、ARX非症候性のX連鎖精神遅滞(XLMR)、および眼咽頭型筋ジストロフィー(OPMD)(参照を包含する、数種の主要な遺伝性疾病にあるという発見で明るみに出た。マイクロサテライト反復の不安定性は、反復拡大が、後に続く各世代に生じ得、子孫におけるより重度の表現型および発症の低年齢へ繋がるという現象が予想されたとおり、これらの疾病の証であることが見出された。反復拡大は、数種の異なる機序を介して疾患を引き起こすものと考えられている。つまり、拡大は、遺伝子、mRNA転写産物、および/またはコードされたタンパク質のレベルにて機能する細胞に干渉し得る。いくつかの疾病において、突然変異は、反復含有遺伝子をサイレンシングすることによる機能喪失型の機序を介して作用する。その他において、疾患は、mRNA転写産物またはタンパク質のいずれかが新しい異常な機能を帯びるようになる機能獲得型の機序の結果として生じる。
一態様において、トリヌクレオチド反復障害を処置する方法は、図23に描かれている。一般に、アプローチは、プライム編集プロセスの機序を通して内生の罹患トリヌクレオチド反復配列を置き換えることが意図される、所望されかつ健常な置き換えトリヌクレオチド反復配列をコードする領域を含む伸長されたgRNAと組み合わせて、TPRTゲノム編集を使用することを伴う。例示の、トリヌクレオチド反復配列を縮小するためのgRNAデザインおよびTPRTゲノム編集でのトリヌクレオチド反復縮小の概略図が、図23に示される。
トリヌクレオチド反復拡大は、ハンチントン病、脆弱X症候群、およびフリートライヒ運動失調症を包含する、数多のヒト疾患に関連する。最も一般的なトリヌクレオチド反復はCAGトリプレットを含有するが、GAAトリプレット(フリートライヒ運動失調症)およびCGGトリプレット(脆弱X症候群)もまた生じる。拡大する素因を遺伝すること、または既に拡大した親アレルを獲得することは、疾患に罹患する可能性が増大する。トリヌクレオチド反復の病原性の拡大は、仮説上はプライム編集を使用して修正され得る。
反復領域の上流領域は、図1Eまたは図22に概説される生成機序に従い、RNAにガイドされるヌクレアーゼによってニックが入れられ、次いで、健常な数の反復(これは具体的な遺伝子および疾患に依存する)を含有する新しいDNA鎖の合成をプライムするために使用され得る。反復配列の後に、反復(赤鎖)の他の末端に隣接する配列の同一性がマッチする、一続きの短い相同が付加される。TPRT系による新しく合成された鎖の侵入、およびこれに続く内生DNAの新しく合成されたフラップとの置き換えは、縮小した反復アレルへ繋がる。用語「縮小した」は、ヌクレオチド反復領域の長さの短縮化を指し、これによってトリヌクレオチド反復領域の修復がもたらされる。
様々な態様において、所望のヌクレオチド変化は、単一ヌクレオチドの置換(例として、トランジション変化もしくはトランスバージョン変化)、欠失、または挿入であり得る。例えば、所望のヌクレオチド変化は、(1)G→T置換、(2)G→A置換、(3)G→C置換、(4)T→G置換、(5)T→A置換、(6)T→C置換、(7)C→G置換、(8)C→T置換、(9)C→A置換、(10)A→T置換、(11)A→G置換、または(12)A→C置換であり得る。
他の態様において、所望のヌクレオチド変化は、(1)G:C塩基対→T:A塩基対、(2)G:C塩基対→A:T塩基対、(3)G:C塩基対→C:G塩基対、(4)T:A塩基対→G:C塩基対、(5)T:A塩基対→A:T塩基対、(6)T:A塩基対→C:G塩基対、(7)C:G塩基対→G:C塩基対、(8)C:G塩基対→T:A塩基対、(9)C:G塩基対→A:T塩基対、(10)A:T塩基対→T:A塩基対、(11)A:T塩基対→G:C塩基対、または(12)A:T塩基対→C:G塩基対の変換をし得る。
更なる他の態様において、方法は、挿入である所望のヌクレオチド変化を導入する。あるケースにおいて、挿入は、長さが少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、または少なくとも500ヌクレオチドである。
他の態様において、方法は、欠失である所望のヌクレオチド変化を導入する。他のあるケースにおいて、欠失は、長さが少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、または少なくとも500ヌクレオチドである。
様々な態様において、所望のヌクレオチド変化は、疾患関連遺伝子を修正する。疾患関連遺伝子は、アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症;アルファ-1アンチトリプシン欠損症;嚢胞性線維症;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ガラクトース血症;ヘモクロマトーシス;ハンチントン病;メープルシロップ尿症;マルファン症候群;1型神経線維腫症;先天性爪肥厚症;フェニルケトン尿症;重症複合免疫不全症;鎌状赤血球病;スミス・レムリ・オピッツ症候群;およびテイ・サックス病からなる群から選択される単一遺伝子障害に関連し得る。他の態様において、疾患関連遺伝子は、心臓疾患;高血圧;アルツハイマー病;関節炎;糖尿病;がん;および肥満からなる群から選択される多遺伝子性障害に関連し得る。
標的ヌクレオチド配列は、疾患、障害、または疾病に関連する標的配列(例として、点突然変異)を含んでいてもよい。標的配列は、疾患、障害、または疾病に関連するT→C(もしくはA→G)点突然変異を含んでいてもよく、ここで突然変異体C塩基の脱アミノ化は、疾患にも障害にも疾病にも関連しない配列へのミスマッチ修復媒介修正をもたらす。標的配列は、疾患、障害、または疾病に関連するG→A(もしくはC→T)点突然変異を含んでいてもよく、ここで突然変異体A塩基の脱アミノ化は、疾患にも障害にも疾病にも関連しない配列へのミスマッチ修復媒介修正をもたらす。標的配列は、点突然変異がコドンにあるタンパク質(野生型コドンと比較して、突然変異体コドンによってコードされるアミノ酸に変化がもたらされている)をコードしていてもよい。標的配列はまた、スプライシング部位にもあってよく、点突然変異は、野生型転写産物と比較してmRNA転写産物のスプライシングに変化をもたらす。加えて、標的は、プロモーターなどの遺伝子のノンコーディング配列にあってもよく、点突然変異は、遺伝子の増大または減少した発現をもたらす。
よって、いくつかの側面において、突然変異体Cの脱アミノ化は、突然変異体コドンによってコードされるアミノ酸の変化をもたらすが、いくつかのケースにおいては、野生型アミノ酸の発現をもたらし得る。他の側面において、突然変異体Aの脱アミノ化は、突然変異体コドンによってコードされるアミノ酸の変化をもたらすが、いくつかのケースにおいては、野生型アミノ酸の発現をもたらし得る。
細胞を組成物またはrAAV粒子と接触させることを伴う本明細書に記載の方法は、in vitro、ex vivo、またはin vivoで生じ得る。ある態様において、接触させるステップは、対象中に生じる。ある態様において、対象は、疾患、障害、または疾病と診断されている。
いくつかの態様において、本明細書に開示の方法は、哺乳動物の細胞を組成物またはrAAV粒子と接触させることを伴う。具体的な態様において、方法は、網膜細胞、皮質細胞、または小脳細胞を接触させることを伴う。
本明細書に記載の方法を使用して送達される分裂Cas9タンパク質または分裂プライム編集因子は、好ましくは、元のCas9タンパク質またはプライム編集因子(すなわち、細胞へ送達されるかまたはその全体が細胞に発現される未分裂タンパク質)と比較して同等の活性を有する。例えば、分裂Cas9タンパク質または分裂プライム編集因子は、元のCas9タンパク質またはプライム編集因子の活性の少なくとも50％(例として、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、もしくは100％)を保持する。いくつかの態様において、分裂Cas9タンパク質または分裂プライム編集因子は、元のCas9タンパク質またはプライム編集因子の活性より(例として、2倍、5倍、10倍、100倍、1000倍、もしくはそれ以上)活性がある。
本明細書に記載の組成物は、これを必要とする対象へ、対象が患う疾患もしくは障害処置および/または予防するのに治療的有効量で、投与されてもよい。CRISPR/Cas9ベースのゲノム編集技術を使用して処置および/または予防されてもよいいずれの疾患または障害も、本明細書に記載の分裂Cas9タンパク質または分裂プライム編集因子によって処置されてもよい。分裂Cas9タンパク質またはプライム編集因子をコードするヌクレオチド配列がさらにgRNAをコードする場合、gRNAをコードする別々の核酸ベクターが本明細書に記載の組成物と一緒に投与されてもよいことは、理解されるべきである。
例示の好適な疾患、障害、または疾病は、限定せずに、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、表皮溶解性角化症(EHK)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、4J型シャルコー・マリー・トゥース病、神経芽細胞腫(NB)、フォン・ヴィレブランド病(vWD)、先天性筋強直症、遺伝性腎アミロイドーシス、拡張型心筋症、遺伝性リンパ浮腫、家族性アルツハイマー病、プリオン病、慢性乳児神経皮膚関節症候群(CINCA)、先天性難聴、ニーマン・ピック病C型(NPC)疾患、およびデスミン関連ミオパチー(DRM)からなる群から選択される疾患または障害を包含する。具体的な態様において、疾患または疾病は、ニーマン・ピック病C型(NPC)疾患である。
いくつかの態様において、疾患、障害、または疾病は、NPC遺伝子、DNMT1遺伝子、PCSK9遺伝子、またはTMC1遺伝子の点突然変異に関連する。ある態様において、点突然変異は、NPCの、I1061Tアミノ酸置換をもたらすT3182C突然変異である。
ある態様において、点突然変異は、TMC1の、Y182Cアミノ酸置換をもたらすA545G突然変異である。TMC1は、内耳の感覚有毛細胞において機械受容イオンチャネルを形成するタンパク質をコードし、正常な聴覚機能に要求されるものである。Y182Cアミノ酸置換は、先天性難聴に関連する。
いくつかの態様において、疾患、障害、または疾病は、停止コドン、例えば、遺伝子のコード領域内の未成熟の停止コドンを生成する点突然変異に関連する。
追加の例示の疾患、障害、および疾病は、嚢胞性線維症(例として、Schwank et al.,Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.Cell stem cell.2013;13:653-658;およびWu et.al.,Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9.Cell stem cell.2013;13:659-662を参照、どれも遺伝子欠陥を修正するのにデアミナーゼ融合タンパク質を使用しない);フェニルケトン尿症－例として、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子中の位置835(マウス)もしくは240(ヒト)または相同残基でのフェニルアラニン→セリン突然変異(T＞C突然変異)－例として、McDonald et al.,Genomics.1997;39:402-405を参照;ベルナール・スーリエ症候群(BSS)－例として、血小板膜糖タンパク質IX中の、位置55もしくは相同残基でのフェニルアラニン→セリン突然変異、または残基24もしくは相同残基でのシステイン→アルギニン(T＞C突然変異)－例として、Noris et al.,British Journal of Haematology.1997;97:312-320、およびAli et al.,Hematol.2014;93:381-384を参照;表皮溶解性角化症(EHK)－例として、ケラチン1中の、位置160もしくは161(開始メチオニンから数える場合)または相同残基でのロイシン→プロリン突然変異(T＞C突然変異)－例として、Chipev et al.,Cell.1992;70:821-828を参照、またwww[dot]uniprot[dot]orgでのUNIPROTデータベース中の受託番号P04264も参照;慢性閉塞性肺疾患(COPD)－例として、α1-アンチトリプシンのプロセシングされた形態中の位置54もしくは55(開始メチオニンから数える場合)または相同残基での、あるいは未プロセシング形態の残基78または相同残基での、ロイシン→プロリン突然変異(T＞C突然変異)－例として、Poller et al.,Genomics.1993;17:740-743を参照、またUNIPROTデータベース中の受託番号P01011も参照;4J型シャルコー・マリー・トゥース病－例として、FIG4中の位置41または相同残基でのイソロイシン→トレオニン突然変異(T＞C突然変異)－例として、Lenk et al.,PLoS Genetics.2011;7:e1002104を参照;神経芽細胞腫(NB)－例として、カスパーゼ-9中の位置197または相同残基でのロイシン→プロリン突然変異(T＞C突然変異)－例として、Kundu et al.,3 Biotech.2013,3:225-234を参照;フォン・ヴィレブランド病(vWD)－例として、フォン・ヴィレブランド因子のプロセシングされた形態中の位置509もしくは相同残基での、またはフォン・ヴィレブランド因子の未プロセシング形成の位置1272もしくは相同残基での、システイン→アルギニン突然変異(T＞C突然変異)－例として、Lavergne et al.,Br.J.Haematol.1992;82:66-72を参照、またUNIPROTデータベース中の受託番号P04275も参照;先天性筋強直症－例として、筋肉の塩化物チャネル遺伝子CLCN1中の位置277または相同残基でのシステイン→アルギニン突然変異(T＞C突然変異)－例として、Weinberger et al.,The J.of Physiology.2012;590:3449-3464を参照;遺伝性腎アミロイドーシス－例として、アポリポタンパク質AIIのプロセシンされた形態中の位置78もしくは相同残基での、または未プロセシング形態中の位置101もしくは相同残基での、停止コドン→アルギニン突然変異(T＞C突然変異)－例として、Yazaki et al.,Kidney Int.2003;64:11-16を参照;拡張型心筋症(DCM)－例として、FOXD4遺伝子中の位置148または相同残基でのトリプトファン→アルギニン突然変異(T＞C突然変異)、例として、Minoretti et. al.,Int.J.of Mol.Med.2007;19:369-372を参照;遺伝性リンパ浮腫－例として、VEGFR3チロシンキナーゼ中の位置1035または相同残基でのヒスチジン→アルギニン突然変異(A＞G突然変異)、例として、Irrthum et al.,Am.J.Hum.Genet.2000;67:295-301を参照;家族性アルツハイマー病－例として、プレセニレン1中の位置143または相同残基でのイソロイシン→バリン突然変異(A＞G突然変異)、例として、Gallo et.al.,J.Alzheimer's disease.2011;25:425-431を参照;プリオン病－例として、プリオンタンパク質中の位置129または相同残基でのメチオニン→バリン突然変異(A＞G突然変異)－例として、Lewis et.al.,J.of General Virology.2006;87:2443-2449を参照;慢性乳児神経皮膚関節症候群(CINCA)－例として、クリオピリン中の位置570または相同残基でのチロシン→システイン突然変異(A＞G突然変異)－例として、Fujisawa et.al.Blood.2007;109:2903-2911を参照;ならびに、デスミン関連ミオパチー(DRM)－例として、αβクリスタリン中の位置120または相同残基でのアルギニン→グリシン突然変異(A＞G突然変異)－例として、Kumar et al.,J.Biol.Chem.1999;274:24137-24141を参照、を包含する。すべての参照およびデータベースエントリーの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
V．医薬組成物
他の本開示の側面は、本明細書に記載のプライム編集因子(PE)系の様々な構成要素のいずれも(例として、これらに限定されないが、napDNAbp、逆転写酵素、融合タンパク質(例として、napDNAbpsと逆転写酵素とを含む)、プライム編集因子ガイドRNA、第2鎖へニックを入れるガイドRNAおよび融合タンパク質とプライム編集因子ガイドRNAとを含む複合体、ならびに第2鎖へニックを入れる構成要素および5'内生DNAフラップ除去エンドヌクレアーゼなどの、編集済産物形成へのプライム編集プロセスを推進するのに役立つ付属要素を包含する)含む医薬組成物に関する。かかる組成物は、PE1、PE2、PE3、またはPE3bを包含していてもよい。
用語「医薬組成物」は、本明細書に使用されるとき、医薬使用のために製剤化された組成物を指す。いくつかの態様において、医薬組成物はさらに、薬学的に許容し得る担体を含む。いくつかの態様において、医薬組成物は、追加の剤(例として、特定の送達、半減期の増大、または他の治療的化合物のための)を含む。
ここで使用されるとき、用語「薬学的に許容し得る担体」は、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造補助剤(例として、潤滑剤、タルクマグネシウム、カルシウム、またはステアリン酸亜鉛もしくはステアリン酸)、あるいは身体のある部位(例として、送達部位)から別の部位(例として、器官、組織、もしくは身体部分)へ化合物を運搬または輸送することに関与する溶媒封入材料などの、薬学的に許容し得る材料、組成物、またはビヒクルを意味する。薬学的に許容し得る担体は、製剤の他の成分と相溶性があるが対象の組織に対しては傷害性がない(例として、生理学的に相溶性のある、滅菌された、生理学的なpH、等々)という意味で「許容し得る」ものである。薬学的に許容し得る担体として働き得る材料のいくつかの例は以下を包含する:(1)ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの、糖;(2)コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどの、デンプン;(3)ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、および酢酸セルロースなどの、セルロースおよびその誘導体;(4)粉末状トラガカント;(5)麦芽;(6)ゼラチン;(7)ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルクなどの、平滑剤;(8)カカオバターおよび坐薬蝋などの、賦形剤;(9)落花生油、綿実油、紅花油、ゴマ 油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油などの、油;(10)プロピレングリコールなどの、グリコール;(11)グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール(PEG)などの、ポリオール;(12)オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどの、エステル;(13)寒天;(14)水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの、緩衝剤;(15)アルギン酸;(16)パイロジェンフリー水;(17)等浸透圧の生理食塩水;(18)リンガー溶液;(19)エチルアルコール;(20)pH緩衝溶液;(21)ポリエステル、ポリカーボネート、および/またはポリ酸無水物;(22)ポリペプチドおよびアミノ酸などの、増量剤;(23)血清アルブミン、HDL、およびLDLなどの、血清構成要素;(22)エタノールなどの、C2～C12アルコール;ならびに(23)医薬製剤に採用される、相溶性のある他の非毒性物質。湿潤剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、保存料、および抗酸化剤もまた、製剤中に存在し得る。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容し得る担体」または同種のものなどの用語は本明細書中、互換的に使用される。
いくつかの態様において、医薬組成物は、対象への送達のために、例として、遺伝子編集のために、製剤化される。本明細書に記載の医薬組成物を投与する好適なルートは、限定せずに、以下を包含する:局所、皮下、経皮、皮内、病巣内、関節内、腹腔内、膀胱内、経粘膜、歯肉、歯内(intradental)、蝸牛内、経鼓膜、器官内、硬膜外、髄腔内、筋肉内、静脈内、血管内、骨内、眼周囲、腫瘍内、脳内、および脳室内の投与。
いくつかの態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、罹患部位(例として、腫瘍部位)へ局部的に投与される。いくつかの態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、注射によって、カテーテルを用いて、坐薬を用いて、あるいは移植片(多孔性材料、非多孔性材料、またはゼラチン材料(シラスティック膜などの膜もしくは繊維を包含する)の移植片)を用いて、対象へ投与される。
他の態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、制御放出系において送達される。一態様において、ポンプが使用されてもよい(例として、Langer,1990,Science 249:1527-1533;Sefton,1989,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201;Buchwald et al.,1980,Surgery 88:507;Saudek et al.,1989,N.Engl.J.Med.321:574を参照)。別の態様において、ポリマー材料が使用され得る。(例として、Langer and Wise eds.,CRC Press,Boca Raton,Fla.,1974);Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance(Smolen and Ball eds.,Wiley,New York,1984);Ranger and Peppas,1983,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61を参照。またLevy et al.,1985,Science 228:190;During et al.,1989,Ann.Neurol.25:351;Howard et al.,1989,J.Neurosurg.71:105も参照。)他の制御放出系も、例えば、Langer(上記を参照)において考察されている。
いくつかの態様において、医薬組成物は、対象(例として、ヒト)への静脈内投与または皮下投与に適した組成物として、定型的な手順に従って製剤化される。いくつかの態様において、注射による投与のための医薬組成物は、滅菌された等浸透圧の水性緩衝液中の溶液である。必要なら、医薬はまた、可溶化剤、および注射部位での疼痛を和らげるリグノカインなどの局所麻酔薬も包含し得る。一般に、成分は、個別にまたは一緒に混合されて、例えば、活性剤の分量を示したアンプルもしくは小袋(sachette)などの密閉容器中の凍結乾燥された(dry liophilized)粉末または水がない濃縮物として単位剤形で供給される。医薬が注入によって投与されることになっている場合、滅菌医薬グレードの水または生理食塩水を含有する注入瓶で分配され得る。医薬組成物が注射によって投与される場合、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルは、成分が投与に先立ち混合され得るように、提供され得る。
全身投与のための医薬組成物は、液体、例として、滅菌された生理食塩水、乳酸リンガー溶液またはハンクス溶液であってもよい。加えて、医薬組成物は固体形態であって、使用に先立ち即時に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥された形態もまた企図される。
医薬組成物は、非経口投与にも好適なリポソームもしくはマイクロ結晶などの脂質粒子またはベシクル内に含有され得る。粒子は、組成物がこれに含有される限り、単層(unilamellar)または多層(plurilamellar)などの、いずれの好適な構造でもあり得る。化合物は、膜融合(fusogenic)脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、低レベル(5～10mol％)のカチオン性脂質を含有し、かつポリエチレングリコール(PEG)コーティングによって安定化された「安定化プラスミド-脂質粒子」(SPLP)に封入され得る(Zhang Y.P.et al.,Gene Ther.1999,6:1438-47)。N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチル-アンモニウムメチルスルファート、または「DOTAP」などの、正に帯電した脂質は、かかる粒子およびベシクルにとって具体的に好ましい。かかる脂質粒子の調製は周知である。例として、米国特許第4,880,635号;第4,906,477号;第4,911,928号;第4,917,951号;第4,920,016号;および第4,921,757号を参照;これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、単位用量として投与またはパッケージされてもよい。用語「単位用量」は、本開示の医薬組成物に関して使用されるとき、まとまった投薬量として対象に好適な、物理的に不連続な単位を指し、予め決められた分量の活性材料を含有する各単位は、要求される希釈剤;すなわち、担体またはビヒクルを伴って所望の治療効果を産生するよう算出される。
さらに、医薬組成物は、(a)本発明の化合物を凍結乾燥形態で含有する容器、および(b)注射のための薬学的に許容し得る希釈剤(例として、滅菌水)を含有する第2容器を含む医薬のキットとして提供され得る。薬学的に許容し得る希釈剤は、凍結乾燥された本発明の化合物の再構成または希釈のために使用され得る。任意に、かかる容器(単数または複数)に関連する通知は、医薬もしくは生物学的産物の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定される形態であり得、前記通知は、ヒト投与のための製造、使用、または販売の機関による承認を反映する。
別の側面において、上に記載の疾患の処置に有用な材料を含有する製造物品が、包含される。いくつかの態様において、製造物品は、容器およびラベルを含む。好適な容器は、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、および試験管を包含する。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。いくつかの態様において、容器は、本明細書に記載の疾患を処置するのに有効であって滅菌アクセスポートを有していてもよい組成物をとどめておく。例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってもよい。組成物中の活性剤は本発明の化合物である。いくつかの態様において、容器上のまたはこれに関連したラベルは、組成物が、選んだ疾患を処置するのに使用されることを示す。製造物品はさらに、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、またはデキストロース溶液などの薬学的に許容し得る緩衝液を含む第2容器を含んでもよい。これはさらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用のための指示がある添付文書を包含する、商業的観点およびユーザーの観点から所望される他の材料も包含していてもよい。
VI．ウイルス送達方法
いくつかの側面において、本発明は、本明細書に記載のプライム編集因子(PE)系の1以上の構成要素、それらの1以上の転写産物、および/またはそれらから転写される1以上のタンパク質をコードする1以上のベクターなどの、本明細書に記載のとおりの1以上のポリヌクレオチドを宿主細胞へ送達することを含む方法を提供する。いくつかの側面において、本発明はさらに、かかる方法によって産生される細胞、およびかかる細胞を含むかまたはかかる細胞から産生される生物(動物、植物、もしくは真菌など)を提供する。いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりの塩基編集因子は、ガイド配列と組み合わせて(任意にこれと複合化されて)、細胞へ送達される。従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子移動(transfer)方法は、哺乳動物の細胞または標的組織中に核酸を導入するのに使用され得る。かかる方法は、塩基編集因子の構成要素をコードする核酸を、培養中の細胞または宿主生物中の細胞へ投与するのに使用され得る。非ウイルスベクター送達系は、DNAプラスミド、RNA(例として、本明細書に記載のベクターの転写産物)、裸の核酸、および送達ビヒクル(リポソームなど)と複合体化された核酸を包含する。ウイルスベクター送達系はDNAウイルスおよびRNAウイルスを包含するが、これらはエピソームを有するか、または細胞への送達後にゲノムに取り入れられるかのいずれかである。遺伝子治療手順の総説について、Anderson,Science 256:808-813(1992);Nabel & Felgner,TIBTECH 11:211-217(1993);Mitani & Caskey,TIBTECH 11:162-166(1993);Dillon,TIBTECH 11:167-175(1993);Miller,Nature 357:455-460(1992);Van Brunt,Biotechnology 6(10):1149-1154(1988);Vigne,Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36(1995);Kremer & Perricaudet,British Medical Bulletin 51(1):31-44(1995);Haddada et al.,in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bihm(eds)(1995);およびYu et al.,Gene Therapy 1:13-26(1994)を参照。
核酸の非ウイルス送達の方法は、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロ注射、微粒子銃(biolistics)、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質:核酸抱合体、裸のDNA、人工ビリオン、およびDNAの取り込みを増強する剤を包含する。リポフェクションは、例として、米国特許第5,049,386号、第4,946,787号;および第4,897,355号に記載されており、リポフェクション試薬は商業的に販売されている(例として、Transfectam(商標)およびLipofectin(商標))。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性脂質および中性脂質は、Feigner、WO91/17424;WO91/16024の脂質を包含する。送達は、細胞(例として、in vitro投与もしくはex vivo投与)、または標的組織(例として、in vivo投与)に対するものであり得る。
イムノ脂質複合体などの標的化リポソームを包含する脂質:核酸複合体の調製は、当業者に周知である(例として、Crystal,Science 270:404-410(1995);Blaese et al.,Cancer Gene Ther.2:291-297(1995);Behr et al.,Bioconjugate Chem.5:382-389(1994);Remy et al.,Bioconjugate Chem.5:647-654(1994);Gao et al.,Gene Therapy 2:710-722(1995);Ahmad et al.,Cancer Res.52:4817-4820(1992);米国特許第4,186,183号、第4,217,344号、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号、および第4,946,787号を参照)。
核酸送達のためのRNAウイルスまたはDNAウイルスベースの系の使用は、ウイルスに身体の特定細胞を標的にさせてウイルスのペイロードを核へ輸送する(trafficking)のに高度に進化したプロセスの利点を生かす。ウイルスベクターは患者へ(in vivoで)直接投与され得るか、またはこれらは細胞をin vitroで処置するのに使用され得、修飾された細胞は任意に、患者へ(ex vivoで)投与されてもよい。従来のウイルスベースの系は、遺伝子移動のために、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターを包含し得る。宿主ゲノムへの取り入れは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスの遺伝子移動方法でなし得、しばしば挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。加えて、形質導入の高効率も、多くの異なる細胞型および標的組織において観察されている。
ウイルスの指向性は、外来のエンベロープタンパク質を組み込むことによって変更され得、これによって標的細胞の潜在的な標的集団が拡大される。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染でき、典型的には高ウイルス力価を産生できるレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルス遺伝子移動系の選択は、標的組織に依存するであろう。レトロウイルスベクターは、外来配列の最大6～10kbまでのパッケージング能をもつシス作用性の長期反復から構成される。最小のシス作用性LTRは、ベクターの複製およびパッケージングに充分であって、これは次いで治療的遺伝子を標的細胞中へ取り入れるのに使用されて永続的な導入遺伝子発現を提供する。幅広く使用されるレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス(MuLV)、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、およびそれらの組み合わせをベースにしたものを包含する(例として、Buchscher et al.,J.Virol.66:2731-2739(1992);Johann et al.,J.Virol.66:1635-1640(1992);Sommnerfelt et al.,Virol.176:58-59(1990);Wilson et al.,J.Virol.63:2374-2378(1989);Miller et al.,J.Virol.65:2220-2224(1991);PCT/US94/05700を参照)。一過性発現が好ましい用途において、アデノウイルスベースの系が使用されてもよい。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において極めて高い形質導入効率を可能にするものであって、細胞分裂を要さない。かかるベクターを用いると、高い力価および発現レベルが得られる。このベクターは、相対的に単純な系において大量に産生され得る。アデノ随伴ウイルス(「AAV」)ベクターもまた、例として、核酸およびペプチドのin vitroでの産生において、ならびにin vivoおよびex vivoでの遺伝子治療手順のために、細胞を標的核酸で形質導入するのに使用されてもよい(例として、West et al.,Virology 160:38-47(1987);米国特許第4,797,368号;WO93/24641; Kotin,Human Gene Therapy 5:793-801(1994);Muzyczka,J.Clin.Invest.94:1351(1994)を参照)。組換えAAVベクターの構築は、米国特許第5,173,414号;Tratschin et al.,Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985);Tratschin,et al.,Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1984);Hermonat & Muzyczka,PNAS 81:6466-6470(1984);およびSamulski et al.,J.Virol.63:03822-3828(1989)を包含する、数多の刊行物に記載されている。
パッケージング細胞は、典型的には、宿主細胞に感染することが可能なウイルス粒子を形成するのに使用される。かかる細胞は、アデノウイルスをパッケージする293細胞、およびレトロウイルスをパッケージするψ2細胞またはPA317細胞を包含する。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは大抵、核酸ベクターをウイルス粒子中へパッケージする細胞株を産生することによって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびこれに続く宿主中への取り入れに要求される最小限のウイルス配列、発現されるべきポリヌクレオチド(単数または複数)のための発現カセットによって置き換えられている他のウイルス配列を含有する。失われたウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞株によってtransで供給される。例えば、遺伝子治療に使用されるAAVベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノム中への取り入れに要求されるAAVゲノムからのITR配列のみを所有する。ウイルスDNAは、ITR配列を欠く以外、他のAAV遺伝子(つまり、repおよびcap)をコードするヘルパープラスミドを含有する細胞株においてパッケージされる。細胞株はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスにも感染されていてもよい。ヘルパーウイルスは、ヘルパープラスミドからのAAVベクターの複製およびAAV遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ITR配列の欠如に起因して、有意な量ではパッケージされない。アデノウイルスの汚染は、例として、熱処理(アデノウイルスはAAVより高感度である)によって低減され得る。核酸の細胞への送達のための追加の方法は当業者に知られている。例えば、US20030087817(参照により本明細書に組み込まれる)を参照。
VII．キット、ベクター、細胞、および送達
本開示のいくつかの側面は、本明細書に記載のプライム編集因子(PE)系の様々な構成要素(例として、これらに限定されないが、napDNAbp、逆転写酵素、融合タンパク質(例として、napDNAbpsと逆転写酵素とを含む)、プライム編集因子ガイドRNA、および融合タンパク質とプライム編集因子ガイドRNAとを含む複合体、ならびに第2鎖へニックを入れる構成要素および5'内生DNAフラップ除去エンドヌクレアーゼなどの付属要素(編集済産物形成へのプライム編集プロセスを推進するのに役立つ)を包含する)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含むキットを提供する。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、プライム編集因子(PE)系構成要素の発現を推進する異種プロモーターを含む。
本開示のいくつかの側面は、本明細書に記載のプライム編集因子(PE)系の様々な構成要素(例として、標的DNA配列を修飾することが可能なプライム編集因子(PE)系の構成要素をコードするヌクレオチド配列を含む)をコードする1以上の核酸構築物を含むキットを提供する。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、プライム編集因子(PE)系構成要素の発現を推進する異種プロモーターを含む。
本開示のいくつかの側面は、(a)逆転写酵素と融合したnapDNAbp(例として、Cas9ドメイン)をコードするヌクレオチド配列、および(b)(a)の配列の発現を推進する異種プロモーターを含む核酸構築物を含むキットを提供する。
キット
本開示の組成物は、キット中へ集められ得る。いくつかの態様において、キットは、本明細書に記載のプライム編集因子の発現のための核酸ベクターを含む。他の態様において、キットはさらに、適切なガイドヌクレオチド配列(例として、PEgRNAおよび第2部位gRNA)、またはかかるガイドヌクレオチド配列(Cas9タンパク質またはプライム編集因子に所望の標的配列を標的にさせる)の発現のための核酸ベクターを含む。
本明細書に記載のキットは、本明細書に記載の方法を実施するための構成要素および任意に使用のための指示を収納する1以上の容器を包含していてもよい。本明細書に記載のキットのいずれも、アッセイ方法を実施するのに必要とされる構成要素をさらに含んでいてもよい。キットの各構成要素は、適用可能であれば、液体形態(例として、溶液中)で、または固体形態(例として、乾燥粉末)で提供されてもよい。あるケースにおいて、構成要素のいくつかは、例えば、好適な溶媒または他の種(例えば、水)(これらはキットとともに提供されてもまたはされなくてもよい)の添加によって、再構成可能または別様に(例として、活性形態へ)処理可能であってもよい。
いくつかの態様において、キットは任意に、提供される構成要素の使用のための指示および/または促進(promotion)を包含していてもよい。本明細書に使用されるとき、「指示」は、指示および/または促進の構成要素を定義し得るものであって、典型的には、本開示のパッケージング上にまたはこれに関連して書面の指示を伴い得る。指示はまた、ユーザーが明確に、指示がキットに関連するものであることを認識できるように(例えば、視聴覚に訴えるもの(例として、ビデオテープ、DVD、等々)、インターネット、および/またはウェブベースの連絡、等々)、形はどうあれ、いずれの口授または電子的指示も包含し得る。書面の指示は、医薬もしくは生物学的産物の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定される形態であってもよく、これは動物投与のための製造、使用、または販売の機関による承認も反映し得る。本明細書に使用されるとき、「促進された」は、本開示に関連する、教育方法、病院のおよび他の臨床の指示、科学研究、薬物の発見または開発、学術研究、医薬産業活動(医薬販売を包含する)、ならびにいずれの広告活動または他の宣伝活動(いずれの形態の書面の、口述の、および電子的な連絡を包含する)を包含する、営業行為のすべての方法を包含する。加えて、キットは、本明細書に記載のとおりの特定の用途に応じて、他の構成要素も包含していてもよい。
キットは、1以上の容器中に、本明細書に記載のいずれの構成要素の1以上を含有していてもよい。構成要素は、滅菌的に調製され、シリンジ中にパッケージされ、および冷凍保存されて出荷されてもよい。代替的に、これは、バイアルまたは保管のための他の容器に収納されてもよい。第2容器は、滅菌的に調製された他の構成要素も有していてもよい。代替的に、キットは、予め混合されて、バイアル、管、または他の容器中で出荷される活性剤を包含していてもよい。
キットは、パウチ、1以上の管、容器、箱、または袋内に緩くパックされた付属物とともに、ブリスターパウチ(blister pouch)、収縮包装パウチ、真空シール可能なパウチ、シール可能な熱成形トレイ、または同様のパウチもしくはトレイの形態などの様々な形態を有してもよい。キットは、付属物が加えられた後に滅菌されてもよく、これによって容器中の個々の付属物が別様に開封され得る。キットは、放射線滅菌、加熱滅菌、または当該技術分野において知られている他の滅菌方法などの、いずれの適切な滅菌技法も使用して滅菌され得る。キットはまた、特定の用途に応じて、他の構成要素、例えば、容器、細胞培地、塩、緩衝剤、試薬、シリンジ、針、殺菌剤を適用または除去するための生地(ガーゼなど)、使い捨て手袋、投与に先立ち剤を支持するためのもの等々も包含していてもよい。本開示のいくつかの側面は、本明細書に記載のプライム編集系の様々な構成要素(例として、これらに限定されないが、napDNAbp、逆転写酵素、ポリメラーゼ、融合タンパク質(例として、napDNAbpと逆転写酵素(またはより広くは、ポリメラーゼ)とを含む)、伸長されたガイドRNA、および融合タンパク質と伸長されたガイドRNAとを含む複合体、ならびに第2鎖へニックを入れる構成要素(例として、第2鎖へニックを入れるgRNA)および5'内生DNAフラップ除去エンドヌクレアーゼなどの付属要素(編集済産物形成へのプライム編集プロセスを推進するのに役立つ)を包含する)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含むキットを提供する。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列(単数または複数)は、プライム編集系構成要素の発現を推進する異種プロモーター(または単一のプロモーターより多く)を含む。
本開示の他の側面は、本明細書に記載のプライム編集因子系の様々な構成要素(例として、標的DNA配列を修飾することが可能なプライム編集因子系の構成要素をコードするヌクレオチド配列を含む)をコードする1以上の核酸構築物を含むキットを提供する。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、プライム編集因子系構成要素の発現を推進する異種プロモーターを含む。
本開示のいくつかの側面は、(a)逆転写酵素と融合したnapDNAbp(例として、Cas9ドメイン)をコードするヌクレオチド配列、および(b)(a)の配列の発現を推進する異種プロモーターを含む核酸構築物を含むキットを提供する。
細胞
本明細書に記載の組成物のいずれも含有していてもよい細胞は、原核細胞および真核細胞を包含する。本明細書に記載の方法は、Cas9タンパク質またはプライム編集因子を真核細胞(例として、ヒト細胞などの哺乳動物の細胞)中へ送達するのに使用される。いくつかの態様において、細胞は、in vitroにある(例として、培養された細胞)。いくつかの態様において、細胞は、in vivoにある(例として、ヒト対象などの対象中にある)。いくつかの態様において、細胞は、ex vivoにある(例として、対象から単離され、同じ対象へ戻すかまたは異なる対象へ投与されてもよい)。
本開示の哺乳動物の細胞は、ヒト細胞、霊長目の動物細胞(例として、ベロ細胞)、ラット細胞(例として、GH3細胞、OC23細胞)、またはマウス細胞(例として、MC3T3細胞)を包含する。様々なヒト細胞株には、限定せずに、ヒト胚性腎臓(HEK)細胞、HeLa細胞、国立癌研究所の60のがん細胞株(NCI60)からのがん細胞、DU145(前立腺がん)細胞、Lncap(前立腺がん)細胞、MCF-7(乳がん)細胞、MDA-MB-438(乳がん)細胞、PC3(前立腺がん)細胞、T47D(乳がん)細胞、THP-1(急性骨髄性白血病)細胞、U87(膠芽腫)細胞、SHSY5Yヒト神経芽細胞腫細胞(骨髄腫からクローン化)、およびSaos-2(骨がん)細胞が包含される。いくつかの態様において、rAAVベクターは、ヒト胚性腎臓(HEK)細胞(例として、HEK293またはHEK 293T細胞)中へ送達される。いくつかの態様において、rAAVベクターは、例えば、多能性幹細胞(例として、ヒト人工(induced)多能性幹細胞(hiPSC)を包含するヒト多能性幹細胞)などの、幹細胞(例として、ヒト幹細胞)中へ送達される。幹細胞は培養中、無期限に分裂して、特化された細胞を生じさせる能力をもつ細胞を指す。多能性幹細胞は、分化して生物のすべての組織になることが可能であるが、完全な生物の発生を単独では支えることが可能でないある種の幹細胞を指す。ヒト人工多能性幹細胞は、胚性幹細胞を定義する特性を維持するのに重要な遺伝子および因子の発現が強いられることによって胚性幹細胞様状態へ再プログラムされる体細胞(例として、成熟した(mature)細胞または成熟(adult)細胞)を指す(例として、Takahashi and Yamanaka,Cell 126(4):663-76,2006を参照(参照により本明細書に組み込まれる))。ヒト人工多能性幹細胞は、幹細胞マーカーを発現しており、全3種の胚葉(外胚葉、内胚葉、中胚葉)の細胞特徴を生成するのが可能である。
本開示に従って使用されてもよい追加の細胞株の非限定例は、293-T、293-T、3T3、4T1、721、9L、A-549、A172、A20、A253、A2780、A2780ADR、A2780cis、A431、ALC、B16、B35、BCP-1、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR 293、BxPC3、C2C12、C3H-10T1/2、C6、C6/36、Cal-27、CGR8、CHO、CML T1、CMT、COR-L23、COR-L23/5010、COR-L23/CPR、COR-L23/R23、COS-7、COV-434、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、E14Tg2a、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、Hepa1c1c7、High Five細胞、HL-60、HMEC、HT-29、HUVEC、J558L細胞、Jurkat、JY細胞、K562細胞、KCL22、KG1、Ku812、KYO1、LNCap、Ma-Mel 1、2、3....48、MC-38、MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468、MDCK II、MG63、MONO-MAC 6、MOR/0.2R、MRC5、MTD-1A、MyEnd、NALM-1、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NW-145、OPCN/OPCT Peer、PNT-1A/PNT 2、PTK2、Raji、RBL細胞、RenCa、RIN-5F、RMA/RMAS、S2、Saos-2細胞、Sf21、Sf9、SiHa、SKBR3、SKOV-3、T-47D、T2、T84、THP1、U373、U87、U937、VCaP、WM39、WT-49、X63、YAC-1、およびYAR細胞を包含する。
本開示のいくつかの側面は、本明細書に開示される構築物のいずれも含む細胞を提供する。いくつかの態様において、宿主細胞は、本明細書に記載の1以上のベクターで一過的または非一過的にトランスフェクトされている。いくつかの態様において、細胞は、対象中に天然に存在するとき、トランスフェクトされる。いくつかの態様において、トランスフェクトされる細胞は、対象から採られる。いくつかの態様において、細胞は、細胞株などの、対象から採られた細胞に由来する。組織培養のための多種多様の細胞株が当該技術分野において知られている。細胞株の例は、これらに限定されないが、C8161、CCRF-CEM、MOLT、mIMCD-3、NHDF、HeLa-S3、Huh1、Huh4、Huh7、HUVEC、HASMC、HEKn、HEKa、MiaPaCell、Panc1、PC-3、TF1、CTLL-2、C1R、Rat6、CV1、RPTE、A10、T24、J82、A375、ARH-77、Calu1、SW480、SW620、SKOV3、SK-UT、CaCo2、P388D1、SEM-K2、WEHI-231、HB56、TIB55、Jurkat、J45.01、LRMB、Bcl-1、BC-3、IC21、DLD2、Raw264.7、NRK、NRK-52E、MRC5、MEF、Hep G2、HeLa B、HeLa T4、COS、COS-1、COS-6、COS-M6A、BS-C-1サル腎臓上皮、BALB/3T3マウス胚線維芽細胞、3T3 Swiss、3T3-L1、132-d5ヒト胎児線維芽細胞;10.1マウス線維芽細胞、293-T、3T3、721、9L、A2780、A2780ADR、A2780cis、A 172、A20、A253、A431、A-549、ALC、B16、B35、BCP-1細胞、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR 293.BxPC3.C3H-10T1/2、C6/36、Cal-27、CHO、CHO-7、CHO-IR、CHO-K1、CHO-K2、CHO-T、CHO Dhfr ?/?、COR-L23、COR-L23/CPR、COR-L23/5010、COR-L23/R23、COS-7、COV-434、CML T1、CMT、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、HEK-293、HeLa、Hepa1c1c7、HL-60、HMEC、HT-29、Jurkat、JY細胞、K562細胞、Ku812、KCL22、KG1、KYO1、LNCap、Ma-Mel 1-48、MC-38、MCF-7、MCF-10A、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435、MDCK II、MDCK 11、MOR/0.2R、MONO-MAC 6、MTD-1A、MyEnd、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NALM-1、NW-145、OPCN/OPCT細胞株、Peer、PNT-1A/PNT 2、RenCa、RIN-5F、RMA/RMAS、Saos-2細胞、Sf-9、SkBr3、T2、T-47D、T84、THP1細胞株、U373、U87、U937、VCaP、Vero細胞、WM39、WT-49、X63、YAC-1、YAR、およびそれらのトランスジェニック種を包含する。
細胞株は、当業者に知られている様々な供給源から利用可能である(例として、American Type Culture Collection(ATCC)(Manassus,Va.)を参照)。いくつかの態様において、本明細書に記載の1以上のベクターでトランスフェクトされた細胞は、1以上のベクター由来配列を含む新しい細胞株を確立するのに使用される。いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりのCRISPR系の構成要素で(1以上のベクターの一過的なトランスフェクション、またはRNAでのトランスフェクションなどによって)一過的にトランスフェクトされて、CRISPR複合体の活性を通して修飾された細胞は、修飾は含有するが他の外来配列のいずれも欠く細胞を含む新しい細胞株を確立するのに使用される。いくつかの態様において、本明細書に記載の1以上のベクターで一過的もしくは非一過的にトランスフェクトされた細胞、またはかかる細胞に由来する細胞株は、1以上の試験化合物を査定するのに使用される。
ベクター
本開示のいくつかの側面は、本明細書に記載のプライム編集因子またはその構成要素(例として、分裂Cas9タンパク質もしくは分裂核酸塩基プライム編集因子)の細胞中への送達のための、組換えウイルスベクター(例として、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクター)の使用に関する。分裂-PEアプローチのケースにおいて、全長Cas9タンパク質またはプライム編集因子が様々なウイルスベクター(例として、rAAV(～4.9kb))のパッケージング限界を超えることから、PE融合タンパク質のN末端部分およびPE融合のC末端部分は、別々の組換えウイルスベクター(例として、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクター)によって同じ細胞中へ送達される。
よって、一態様において、本開示は、分裂プライム編集因子融合タンパク質またはそれらの分裂構成要素を送達するのか可能なベクターを企図する。いくつかの態様において、分裂Cas9タンパク質または分裂プライム編集因子を細胞(例として、哺乳動物の細胞、ヒト細胞)中へ送達するための組成物が提供される。いくつかの態様において、本開示の組成物は以下を含む:(i)そのC末端にてインテイン-Nと融合したCas9タンパク質またはプライム編集因子のN末端部分をコードする第1ヌクレオチド配列を含む第1組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子;および(ii)Cas9のタンパク質またはプライム編集因子のC末端部分のN末端と融合したインテイン-Cをコードする第2ヌクレオチド配列を含む第2組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子。本開示のrAAV粒子は、ウイルスのカプシドタンパク質で包まれた(encapsidated)rAAVベクター(すなわち、rAAVの組換えゲノム)を含む。
いくつかの態様において、rAAVベクターは以下を含む:(1)本明細書に記載のとおりのいずれの形態の分裂Cas9タンパク質もしくは分裂プライム編集因子のN末端部分またはC末端部分をコードする第1あるいは第2ヌクレオチド配列を含む異種核酸領域、(2)異種核酸領域の発現を容易にさせる配列(例として、プロモーター)を含む1以上のヌクレオチド配列、および(3)異種核酸領域(任意に、発現を容易にさせる配列を含む1以上の核酸領域をもつ)の細胞ゲノム中への組み入れを容易にさせる配列を含む1以上の核酸領域。いくつかの態様において、組み入れを容易にさせるウイルスの配列は、逆方向末端反復(ITR)配列を含む。いくつかの態様において、分裂Cas9タンパク質もしくは分裂プライム編集因子のN末端部分またはC末端部分をコードする第1あるいは第2ヌクレオチド配列は、ITR配列によって両側から挟まれている。いくつかの態様において、核酸ベクターはさらに、本明細書に記載のとおりのAAV Repタンパク質をコードする領域を含むが、前記領域は、ITRによって挟まれる領域内またはその領域外のいずれかに含有される。ITR配列は、いずれかのAAV血清型(例として、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10)に由来し得るか、または1より多くの血清型に由来し得る。いくつかの態様において、ITR配列は、AAV2またはAAV6に由来する。
よって、いくつかの態様において、本明細書に開示のrAAV粒子は、少なくとも1のrAAV2粒子、rAAV6粒子、rAAV8粒子、rPHP.B粒子、rPHP.eB粒子、もしくはrAAV9粒子、またはそのバリアントを含む。具体的な態様において、開示されたrAAV粒子は、rPHP.B粒子、rPHP.eB粒子、rAAV9粒子である。
ITR配列およびITR配列含有プラスミドは当該技術分野において知られており、市販されている(例として、Vector Biolabs,Philadelphia,PA;Cellbiolabs,San Diego,CA;Agilent Technologies,Santa Clara,Ca;およびAddgene,Cambridge,MAから利用可能な製品ならびにサービス;ならびに、骨格筋への遺伝子送達は治療用タンパク質の持続発現および全身送達をもたらす。Kessler PD,Podsakoff GM,Chen X,McQuiston SA,Colosi PC,Matelis LA,Kurtzman GJ,Byrne BJ.Proc Natl Acad Sci USA.1996 Nov 26;93(24):14082-7;およびCurtis A.Machida.Methods in Molecular MedicineTM.Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols.10.1385/1-59259-304-6:201cHumana Press Inc.2003.Chapter 10.Targeted Integration by Adeno-Associated Virus.Matthew D.Weitzman,Samuel M.Young Jr.,Toni Cathomen and Richard Jude Samulski;米国特許第5,139,941号および第5,962,313号を参照(これらすべては参照により本明細書に組み込まれる))。
いくつかの態様において、本開示のrAAVベクターは、異種核酸領域の発現を制御する1以上の調節要素(例として、プロモーター、転写ターミネータ、および/または他の調節要素)を含む。いくつかの態様において、第1および/または第2ヌクレオチド配列は、1以上の(例として、1、2、3、4、5、またはそれ以上の)転写ターミネータへ作動可能に(operably)連結されている。本開示に従って使用されてもよい転写ターミネータの非限定例は、ウシ成長ホルモン遺伝子(bGH)、ヒト成長ホルモン遺伝子(hGH)、SV40、CW3、φ、またはそれらの組み合わせの転写ターミネータを包含する。数種の転写ターミネータの効率が試験され、分裂Cas9タンパク質または分裂プライム編集因子の発現レベルにおけるそれら夫々の効果を決定した。いくつかの態様において、本開示に使用される転写ターミネータは、bGH転写ターミネータである。いくつかの態様において、rAAVベクターはさらに、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素(WPRE)を含む。ある態様において、WPREは、「W3」などのトランケートされたWPRE配列である。いくつかの態様において、WPREは、転写ターミネータの5'に挿入されている。かかる配列は、転写されたとき、発現、とりわけウイルスベクターからの発現を増強する3次構造を創出する。
いくつかの態様において、本明細書に使用されるベクターは、PE融合タンパク質、またはそれら構成要素(例として、napDNAbp、リンカー、もしくはポリメラーゼ)のいずれもコードしていてもよい。加えて、本明細書に使用されるベクターは、PEgRNA、および/または第2鎖へニックを入れるための付属(accessory)gRNAをコードしていてもよい。ベクターは、細胞中の1以上のコード配列の発現を推進するのが可能であってもよい。いくつかの態様において、細胞は、例として細菌性細胞などの、原核細胞であってもよい。いくつかの態様において、細胞は、例として、酵母、植物、昆虫、または哺乳動物の細胞などの、真核細胞であってもよい。いくつかの態様において、真核細胞は、哺乳動物の細胞であってもよい。いくつかの態様において、真核細胞は、齧歯類の動物の細胞であってもよい。いくつかの態様において、真核細胞は、ヒトの細胞であってもよい。種々の型の細胞中の発現を推進する好適なプロモーターは当該技術分野において知られている。いくつかの態様において、プロモーターは、野生型であってもよい。他の態様において、プロモーターは、より効率的またはより効果的な発現のために修飾されていてもよい。もう1つの他の態様において、プロモーターは、トランケートされていてもよいが、依然としてその機能を保持する。例えば、プロモーターは、正常なサイズ、またはベクターのウイルス中への正しいパッケージングに好適な低減されたサイズを有していてもよい。
いくつかの態様において、プライム編集因子ベクターに使用されてもよいプロモーターは、構成的、誘導的、または組織特異的であってもよい。いくつかの態様において、プロモーターは、構成的プロモーターであってもよい。非限定的な例示の構成的プロモーターは、サイトメガロウイルス前初期プロモーター(CMV)、サルウイルス(SV40)プロモーター、アデノウイルス主要後期(MLP)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス(MMTV)プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーター、伸長(elongation)因子-アルファ(EFla)プロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、それらの機能的フラグメント、または上記のいずれの組み合わせを包含する。いくつかの態様において、プロモーターは、CMVプロモーターであってもよい。いくつかの態様において、プロモーターは、トランケートされたCMVプロモーターであってもよい。他の態様において、プロモーターは、EFlaプロモーターであってもよい。いくつかの態様において、プロモーターは、誘導性プロモーターであってもよい。非限定的な例示の誘導性プロモーターは、熱ショック、光、化学物質、ペプチド、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールによって誘導可能なものを包含する。いくつかの態様において、誘導性プロモーターは、基底(非誘導)発現レベルが低いもの、例として、Tet-On(登録商標)プロモーター(Clontech)などであってもよい。いくつかの態様において、プロモーターは、組織特異的プロモーターであってもよい。いくつかの態様において、組織特異的プロモーターは、専らまたは主として、肝臓組織に発現される。非限定的な例示の組織特異的プロモーターは、B29プロモーター、CD14プロモーター、CD43プロモーター、CD45プロモーター、CD68プロモーター、デスミンプロモーター、エラスターゼ-1プロモーター、エンドグリンプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、Flt-1プロモーター、GFAPプロモーター、GPIIbプロモーター、ICAM-2プロモーター、INF-βプロモーター、Mbプロモーター、Nphslプロモーター、OG-2プロモーター、SP-Bプロモーター、SYN1プロモーター、およびWASPプロモーターを包含する。
いくつかの態様において、プライム編集因子ベクター(例として、プライム編集因子融合タンパク質および/またはPEgRNA、および/または第2鎖へニックを入れる付属gRNAをコードするいずれのベクターも包含する)は、標的細胞へ送達された後にしか発現を開始しない誘導性プロモーターを含んでいてもよい。非限定的な例示の誘導性プロモーターは、熱ショック、光、化学物質、ペプチド、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールによって誘導可能なものを包含する。いくつかの態様において、誘導性プロモーターは、基底(非誘導)発現レベルが低いもの、例として、Tet-On(登録商標)プロモーター(Clontech)などであってもよい。
追加の態様において、プライム編集因子ベクター(例として、プライム編集因子融合タンパク質および/またはPEgRNA、および/または第2鎖へニックを入れる付属gRNAをコードするいずれのベクターも包含する)は、特定の組織へ送達された後にしか発現を開始しない組織特異的なプロモーターを含んでいてもよい。非限定的な例示の組織特異的プロモーターは、B29プロモーター、CD14プロモーター、CD43プロモーター、CD45プロモーター、CD68プロモーター、デスミンプロモーター、エラスターゼ-1プロモーター、エンドクリンプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、Flt-1プロモーター、GFAPプロモーター、GPIIbプロモーター、ICAM-2プロモーター、INF-βプロモーター、Mbプロモーター、Nphslプロモーター、OG-2プロモーター、SP-Bプロモーター、SYN1プロモーター、およびWASPプロモーターを包含する。
いくつかの態様において、PEgRNA(またはプライム編集に関係して使用されるいずれのガイドRNA)をコードするヌクレオチド配列は、少なくとも1の転写または翻訳制御配列へ作動可能に連結されていてもよい。いくつかの態様において、ガイドRNAをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも1のプロモーターへ作動可能に連結されていてもよい。いくつかの態様において、プロモーターは、RNAポリメラーゼ III(Pol III)によって認識されてもよい。Pol IIIプロモーターの非限定例は、U6、HI、およびtRNAプロモーターを包含する。いくつかの態様において、ガイドRNAをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトU6プロモーターへ作動可能に連結されていてもよい。他の態様において、ガイドRNAをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトHIプロモーターへ作動可能に連結されていてもよい。いくつかの態様において、ガイドRNAをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトtRNAプロモーターへ作動可能に連結されていてもよい。1より多くのガイドRNAを用いる態様において、発現を推進するのに使用されるプロモーターは、同じであっても、または異なっていてもよい。いくつかの態様において、ガイドRNAのcrRNAをコードするヌクレオチド、およびガイドRNAのtracr RNAをコードするヌクレオチドは、同じベクター上に提供されていてもよい。いくつかの態様において、crRNAをコードするヌクレオチド、およびtracr RNAをコードするヌクレオチドは、同じプロモーターによって推進されてもよい。いくつかの態様において、crRNAおよびtracr RNAは、転写されて単一の転写産物になってもよい。例えば、crRNAおよびtracr RNAは、単一の転写産物からプロセシングされて二本鎖分子(double-molecule)ガイドRNAを形成してもよい。代替的に、crRNAおよびtracr RNAは、転写されて単一分子ガイドRNAになってもよい。
いくつかの態様において、ガイドRNAをコードするヌクレオチド配列は、PE融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む同じベクター上に位置付けられていてもよい。いくつかの態様において、ガイドRNAの発現およびPE融合タンパク質の発現は、それらの対応するプロモーターによって推進されてもよい。いくつかの態様において、ガイドRNAの発現は、PE融合タンパク質の発現を推進する同じプロモーターによって推進されてもよい。いくつかの態様において、ガイドRNAおよびPE融合タンパク質の転写産物は、単一の転写産物内に含有されていてもよい。例えば、ガイドRNAは、Cas9タンパク質転写産物の非翻訳領域(UTR)内にあってもよい。いくつかの態様において、ガイドRNAは、PE融合タンパク質転写産物の5'UTR内にあってもよい。他の態様において、ガイドRNAは、PE融合タンパク質転写産物の3'UTR内にあってもよい。いくつかの態様において、PE融合タンパク質転写産物の細胞内半減期は、ガイドRNAをその3'UTR内に含有することによって低減されることもあり、これによってその3'UTRの長さが短縮される。追加の態様において、ガイドRNAは、PE融合タンパク質転写産物のイントロン内にあってもよい。いくつかの態様において、好適なスプライシング部位は、ガイドRNAが転写産物から正しくスプライシングされるように、ガイドRNAが位置付けられるイントロンに付加されてもよい。いくつかの態様において、同じベクター上の極めて近いところにあるCas9タンパク質およびガイドRNAの発現は、CRISPR複合体のより効率的な形成を容易にさせることもある。
プライム編集因子ベクター系は、1つのベクター、もしくは2つのベクター、もしくは3つのベクター、もしくは4つのベクター、もしくは5つのベクター、またはこれ以上を含んでいてもよい。いくつかの態様において、ベクター系は、PE融合タンパク質とPEgRNAとの両方をコードする1つの単一ベクターを含んでいてもよい。他の態様において、ベクター系は2つのベクターを含んでいてもよいが、ここで一方のベクターはPE融合タンパク質をコードし、他方がPEgRNAをコードする。追加の態様において、ベクター系は3つのベクターを含んでいてもよいが、ここで第3ベクターは、本明細書の方法に使用される、第2鎖へニックを入れるgRNAをコードする。
いくつかの態様において、rAAV粒子を含む組成物(本明細書に企図されるいずれの形態)はさらに、薬学的に許容し得る担体を含む。いくつかの態様において、組成物は、ヒトまたは動物の対象への投与に適切な医薬ビヒクル中で製剤化される。
薬学的に許容し得る担体として働き得る材料のいくつかの例は以下を包含する:(1)ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの、糖;(2)コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどの、デンプン;(3)ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、および酢酸セルロースなどの、セルロースおよびその誘導体;(4)粉末状トラガカント;(5)麦芽;(6)ゼラチン;(7)ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルクなどの、平滑剤;(8)カカオバターおよび坐薬蝋などの、賦形剤;(9)落花生油、綿実油、紅花油、ゴマ 油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油などの、油;(10)プロピレングリコールなどの、グリコール;(11)グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール(PEG)などの、ポリオール;(12)オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどの、エステル;(13)寒天;(14)水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの、緩衝剤;(15)アルギン酸;(16)パイロジェンフリー水;(17)等浸透圧の生理食塩水;(18)リンガー溶液;(19)エチルアルコール;(20)pH緩衝溶液;(21)ポリエステル、ポリカーボネート、および/またはポリ酸無水物;(22)ポリペプチドおよびアミノ酸などの、増量剤;(23)血清アルブミン、HDL、およびLDLなどの、血清構成要素;(22)エタノールなどの、C2～C12アルコール;ならびに(23)医薬製剤に採用される、相溶性のある他の非毒性物質。湿潤剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、保存料、および抗酸化剤もまた、製剤中に存在し得る。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容し得る担体」または同種のものなどの用語は本明細書中、互換的に使用される。
送達方法
いくつかの側面において、本発明は、それらの1以上の転写産物、および/またはそれらから転写される1以上のタンパク質をコードする1以上のベクターなどの、本明細書に記載のとおりの1以上のポリヌクレオチドを宿主細胞へ送達することを含む方法を提供する。いくつかの側面において、本発明はさらに、かかる方法によって産生される細胞、およびかかる細胞を含むかまたはかかる細胞から産生される生物(動物、植物、もしくは真菌など)を提供する。いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりの塩基編集因子は、ガイド配列と組み合わせて(任意にこれと複合化されて)、細胞へ送達される。
例示の送達ストラテジーは、本明細書のどこかに記載されるが、ベクターベースのストラテジー、PEリボヌクレオタンパク質複合体の送達、およびmRNA方法によるPEの送達を包含する。
いくつかの態様において、提供される送達方法は、ヌクレオフェクション、マイクロ注射、微粒子銃(biolistics)、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質:核酸抱合体、裸のDNA、人工ビリオン、およびDNAの取り込みを増強する剤を包含する。
例示の核酸送達方法は、リポフェクション、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、安定したゲノム組み入れ(例として、piggybac)、マイクロ注射、微粒子銃(biolistics)、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質:核酸抱合体、裸のDNA、人工ビリオン、およびDNAの取り込みを増強する剤を包含する。リポフェクションは、例として、米国特許第5,049,386号、第4,946,787号;および第4,897,355号)に記載されており、リポフェクション試薬は商業的に販売されている(例として、Transfectam(商標)、Lipofectin(商標)、およびSF細胞株4D-Nucleofector X Kit(商標)(Lonza))。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性脂質および中性脂質は、Feigner、WO91/17424;WO91/16024の脂質を包含する。送達は、細胞(例として、in vitro投与もしくはex vivo投与)、または標的組織(例として、in vivo投与)に対するものであり得る。送達は、RNP複合体の使用を通して達成されてもよい。
イムノ脂質複合体などの標的化リポソームを包含する脂質:核酸複合体の調製は、当業者に周知である(例として、Crystal,Science 270:404-410(1995);Blaese et al.,Cancer Gene Ther.2:291-297(1995);Behr et al.,Bioconjugate Chem.5:382-389(1994);Remy et al.,Bioconjugate Chem.5:647-654(1994);Gao et al.,Gene Therapy 2:710-722(1995);Ahmad et al.,Cancer Res.52:4817-4820(1992);米国特許第4,186,183号、第4,217,344号、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号、および第4,946,787号を参照)。
他の態様において、本明細書に提供される送達方法およびベクターは、RNP複合体である。融合タンパク質のRNP送達は、塩基編集のDNA特異性を著しく増大させる。融合タンパク質のRNP送達は、オン-およびオフ-ターゲットDNA編集の分断(decoupling)へ繋がる。RNP送達は、プラスミド送達に匹敵するオン-ターゲット編集を維持しながら、非反復部位にてオフターゲット編集を小さくし(ablates)、高度に反復したVEGFA部位2でさえもオフ-ターゲットDNA編集を大いに低減させる。Rees,H.A.et al.,Improving the DNA specificity and applicability of base editing through protein engineering and protein delivery,Nat.Commun.8,15790(2017)、2016年12月27日に発行された米国特許第9,526,784号、および2017年8月22日に発行された米国特許第9,737,604号を参照(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)。
細胞への核酸送達のための追加の方法は当業者に知られている。例えば、US 2003/0087817を参照(参照により本明細書に組み込まれる)。
他の本開示の側面は、プライム編集因子構築物を細胞中へ送達して、完全かつ機能的なプライム編集因子を細胞内に形成する方法を提供する。例えば、いくつかの態様において、細胞は、本明細書に記載の組成物(例として、分裂Cas9もしくは分裂プライム編集因子をコードするヌクレオチド配列、またはかかるヌクレオチド配列を含む核酸ベクターを含有するAAV粒子を含む組成物)と接触させられる。いくつかの態様において、接触させることは、かかるヌクレオチド配列の細胞中への送達をもたらすが、ここでCas9タンパク質またはプライム編集因子のN末端部分、およびCas9タンパク質またはプライム編集因子のC末端部分は、細胞中で発現され結び合わされて、完全なCas9タンパク質または完全なプライム編集因子を形成する。
本明細書に提供されるいずれのrAAV粒子、核酸分子、または組成物も、安定的または一過的のいずれかのいずれか好適なやり方で、細胞中へ導入されてもよいことは解されるはずである。いくつかの態様において、開示されたタンパク質は、細胞中へトランスフェクトされてもよい。いくつかの態様において、細胞は、核酸分子で形質導入またはトランスフェクトされてもよい。例えば、細胞は、分裂タンパク質をコードする核酸分子、もしくは1以上の核酸分子をコードするウイルスのゲノムを含有するrAAV粒子で、形質導入されても(例として、分裂タンパク質をコードするウイルスで)、またはトランスフェクトされてもよい(例として、分裂タンパク質をコードするプラスミドで)。かかる形質導入は、安定的な形質導入または一過的な形質導入であってもよい。いくつかの態様において、分裂タンパク質を発現するかまたは分裂タンパク質を含有する細胞は、例えば、分裂Cas9(例として、nCas9)タンパク質の送達において、1以上のガイドRNA配列で形質導入またはトランスフェクトされてもよい。いくつかの態様において、分裂タンパク質を発現するプラスミドは、電気穿孔法、一過的な(例として、リポフェクション)および安定したゲノム取り入れ(例として、piggybac)、およびウイルスの形質導入または当業者に知られている他の方法を通して、細胞中へ導入されてもよい。
ある態様において、本明細書に提供される組成物は、脂質および/またはポリマーを含む。ある態様において、脂質および/またはポリマーはカチオン性である。かかる脂質粒子の調製は周知である。例として、米国特許第4,880,635号;第4,906,477号;第4,911,928号;第4,917,951号;第4,920,016号;第4,921,757号;および第9,737,604号を参照(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)。
ガイドRNA配列は長さが15～100ヌクレオチドであってもよく、標的ヌクレオチド配列に相補的な少なくとも10、少なくとも15、または少なくとも20の連続したヌクレオチドの配列を含む。ガイドRNAは、標的ヌクレオチド配列に相補的な15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40の連続したヌクレオチドの配列を含んでいてもよい。ガイドRNAは、長さが15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチドであってもよい。
いくつかの態様において、標的ヌクレオチド配列は、ゲノム(例として、真核生物のゲノム)中のDNA配列である。ある態様において、標的ヌクレオチド配列は、哺乳類の動物(例として、ヒト)ゲノム中にある。
本開示の組成物は、例えば、単位用量として投与またはパッケージされてもよい。用語「単位用量」は、本開示の医薬組成物に関して使用されるとき、まとまった投薬量として対象に好適な、物理的に不連続な単位を指し、予め決められた分量の活性材料を含有する各単位は、要求される希釈剤;すなわち、担体またはビヒクルを伴って所望の治療効果を産生するよう算出される。
疾患または障害の処置は、疾患の発症もしくは進行を遅延させるか、または疾患の重症度を低減させることを包含する。疾患を処置することは、根治した(curative)結果を必ずしも要さない。
そこで使用されたとおり、疾患の発症を「遅延すること」は、疾患の進行を、先送りする(defer)、妨げる(hinder)、遅らせる(slow)、妨害する(retard)、留める(stabilize)、および/または延ばす(postpone)ことを意味する。この遅延は、病歴および/または処置される個体に応じて、時間の長さを変動させることでもあり得る。疾患の発症を「遅延」もしくは緩和する方法、または疾患の発病を遅延する方法は、この方法を使用しない場合と比較して、所定の時間枠での疾患の1以上の症状を発症する確率を低減するか、および/または所定の時間枠での症状の程度を低減する方法である。かかる比較は、典型的には、統計的に有意な結果を与えるのに充分数多の対象を使用する臨床研究に基づく。
疾患の「発症」または「進行」は、最初の兆候および/またはその後の疾患の進行を意味する。疾患の発症は、当該技術分野において周知のとおりの標準の臨床技法を使用し検出可能であり、かつ査定され得る。しかしながら、発症はまた、検出不能なこともある進行も指す。本開示の目的上、発症または進行は、症状の生物学的な経過を指す。「発症」は、発生、再発、および発病を包含する。
本明細書に使用されるとき、疾患の「発病」または「発生」は、最初の発病および/または再発を包含する。医学の当業者に知られている従来の方法は、処置されるべき疾患の型または疾患の部位に応じて、単離されたポリペプチドまたは医薬組成物を対象へ投与するのに使用され得る。
さらなる詳細化はしないが、当業者は、上の記載に基づき、本開示を最大限に利用し得るものと思われる。したがって、以下の特定の態様は、単なる説明として解釈されるべきであって、いずれにしても本開示の残りを何ら限定するものではない。本明細書に引用されるすべての刊行物は、本明細書に言及される目的または主題のため、参照により組み込まれる。
配列
本出願は至る所で、例示のCas9配列、逆転写酵素配列、融合タンパク質配列、リンカー、ガイドRNA、および他の配列を包含する、本開示の様々な側面に関する様々なアミノ酸およびヌクレオチド配列を記載する。加えて、例2(および本明細書の他のどこか)は、クリンバーデータベースからの例示配列を修復するための数千もの例示プライム編集因子ガイドRNA(PEgRNA)の配列をデザインおよび/または決定するためのプロセスおよびアルゴリズムを記載する。
本出願は配列表とともに出願されている。配列表は、例2に従って決定されたPEgRNAの各々の記載を包含する。例2は全体で、133515の例示PEgRNA完全配列の配列を決定する。配列表に提示/包含されるこれらの配列の各々は、配列番号1～135514および813085～880462として同定される。加えて、および他のどこかに記載されるとおり、PEgRNAは、スペーサー(配列番号135515～271028および880463～947840)ならびに伸長アーム(配列番号271029～406542および947841～1015218)の各々から構成される。加えて、各PEgRNAは、例えば、配列番号1361579～1361580によって同定されるとおりのgRNAコアを含む。配列番号271029～406542および947841～1015218の伸長アームはさらに、プライマー結合部位(配列番号406543～542056および1015219～1082596)、編集鋳型(配列番号542057～677570および1082597～1149974)、ならびに相同アーム(配列番号677571～813084および1149975～1217352)の各々から構成される。PEgRNAは任意に、5'末修飾領域および/または3'末修飾領域を含んでいてもよい。PEgRNAはまた、PEgRNAの3'にて逆転写終止シグナル(例として、配列番号1361560～1361566)も含んでいてもよい。
配列表に提供される各全長PEgRNA配列(配列番号1～135514)について、配列表は、5つの(5)対応する部分配列(subsequences)一式を包含する:つまり、(1)スペーサー、(2)伸長アーム、(3)プライマー結合部位、(4)編集鋳型、および(5)相同アーム。いずれの所定PEgRNA全長配列のための部分配列一式は、以下の数学演算によって決定されてもよい。
各PEgRNAのための部分配列一式を決定すること
配列表中の各PEgRNA配列(例として、配列番号1)について、配列表中の以下の配列は、対応する部分配列一式を構成する:
配列番号1～813084について:(1)スペーサー、(2)伸長アーム、(3)プライマー結合部位、(4)編集鋳型、および(5)相同アームは、以下に関する:
スペーサー:所定の各PEgRNA配列について、対応するスペーサー配列は、係数135514へ足されるPEgRNA配列識別子の数字(例として、配列番号1には数字「1」)として同定される。例えば、配列番号1のPEgRNAに対応するスペーサーは、配列番号135515である。
伸長アーム:所定の各PEgRNA配列について、対応する伸長アームは、係数271028(135514×2)へ足されるPEgRNA配列識別子の数字(例として、配列番号1には数字「1」)として同定される。例えば、配列番号1のPEgRNAに対応する伸長アームは、配列番号271029である。
プライマー結合部位:所定の各PEgRNA配列について、対応するプライマー結合部位は、係数406542(135514×3)へ足されるPEgRNA配列識別子の数字(例として、配列番号1には数字「1」)として同定される。例えば、配列番号1のPEgRNAに対応するプライマー結合部位は、配列番号406542である。
編集鋳型:所定の各PEgRNA配列について、対応する編集鋳型は、係数542056(135514×4)へ足されるPEgRNA配列識別子の数字(例として、配列番号1には数字「1」)として同定される。例えば、配列番号1のPEgRNAに対応する編集鋳型は、配列番号542057である。
相同アーム:所定の各PEgRNA配列について、対応する相同アームは、係数677570(135514×5)へ足されるPEgRNA配列識別子の数字(例として、配列番号1には数字「1」)として同定される。例えば、配列番号1のPEgRNAに対応する編集鋳型は、配列番号677571である。
他のPEgRNA配列一式の例(すなわち、配列1～813084からのいずれの所定PEgRNAも含み、これらの各々はSpCas9(NG)(配列番号1361594)またはSpCas9(NGG)(配列番号1361593)、および対応するスペーサー、伸長アーム、プライマー結合部位、編集鋳型、および相同アームに対してデザインされた)は、以下の表に提示される:
Figure 2022531539000081
Figure 2022531539000082
カラム「完全なPEgRNA」配列を参照しつつ、以下の配列がSpCas9(NG)に対してデザインされた:配列番号1～5647、11805～16732、22103～25050、28363～29187、30093～32319、35189～36933、38922～39997、41226～42469、43878～44208、44586～46456、48645～49697、50844～52070、53532～54670、55949～57576、59335～60913、62672～64332、66233～67299、68520～69273、70195～72171、74385～74390、74398～77256、80717～81275、81899～81962、82033～82033、82036～82044、82057～82063、82072～82075、82080～82084、82090～82092、82096～82100、82106～82110、82117～82122、82129～82405、82715～84431、86323～86687、87092～87715、88417～88800、89256～89791、90405～92752、95411～98661、102329～103777、105393～107009、108826～109348、109932～110356、110863～111265、111744～112224、112822～113854、115060～115952、116995～117667、118418～118426、118436～119980、121698～121921、122175～122445、122774～124123、125657～126486、127395～127872、128428～128931、129509～130164、130892～131784、132784～134059。
カラム「完全なPEgRNA」配列を参照しつつ、以下の配列がSpCas9(NGG)に対してデザインされた:配列番号5648～11804、16733～22102、25051～28362、29188～30092、32320～35188、36934～38921、39998～41225、42470～43877、44209～44585、46457～48644、49698～50843、52071～53531、54671～55948、57577～59334、60914～62671、64333～66232、67300～68519、69274～70194、72172～74384、74391～74397、77257～80716、81276～81898、81963～82032、82034～82035、82045～82056、82064～82071、82076～82079、82085～82089、82093～82095、82101～82105、82111～82116、82123～82128、82406～82714、84432～86322、86688～87091、87716～88416、88801～89255、89792～90404、92753～95410、98662～102328、103778～105392、107010～108825、109349～109931、110357～110862、111266～111743、112225～112821、113855～115059、115953～116994、117668～118417、118427～118435、119981～121697、121922～122174、122446～122773、124124～125656、126487～127394、127873～128427、128932～129508、130165～130891、131785～132783、134060～135514。
配列番号813085～1217352について:(1)スペーサー、(2)伸長アーム、(3)プライマー結合部位、(4)編集鋳型、および(5)相同アームは、以下のものに関する:
スペーサー:所定の各PEgRNA配列について、対応するスペーサー配列は、係数67378へ足されるPEgRNA配列識別子の数字(例として、配列番号813085には数字「813085)として同定される。例えば、配列番号813085のPEgRNAに対応するスペーサーは、配列番号880463である。
伸長アーム:所定の各PEgRNA配列について、対応する伸長アームは、係数134756(67378×2)へ足されるPEgRNA配列識別子の数字(例として、配列番号813085には数字「813085)として同定される。例えば、配列番号813085のPEgRNAに対応する伸長アームは、配列番号947841である。
プライマー結合部位:所定の各PEgRNA配列について、対応するプライマー結合部位は、係数202134(67378×3)へ足されるPEgRNA配列識別子の数字(例として、配列番号813085には数字「813085)として同定される。例えば、配列番号813085のPEgRNAに対応するプライマー結合部位は、配列番号1015219である。
編集鋳型:所定の各PEgRNA配列について、対応する編集鋳型は、係数269512(67378×4)へ足されるPEgRNA配列識別子の数字(例として、配列番号813085には数字「813085)として同定される。例えば、配列番号813085のPEgRNAに対応する編集鋳型は、配列番号1082597である。
相同アーム:所定の各PEgRNA配列について、対応する相同アームは、係数336890(67378×5)へ足されるPEgRNA配列識別子の数字(例として、配列番号813085には数字「813085)として同定される。例えば、配列番号813085のPEgRNAに対応する編集鋳型は、配列番号1149975である。
配列表に提供される配列の総数は1217352である。PEgRNA完全配列(各々、少なくともスペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含む)は総計202892である。上のとおり定義された各々の一式である(1)スペーサー、(2)伸長アーム、(3)プライマー結合部位、(4)編集鋳型、および(5)相同アームも同数ある。
他のPEgRNA配列一式の例(すなわち、配列813085～1217352からのいずれの所定PEgRNA、および対応するスペーサー、伸長アーム、プライマー結合部位、編集鋳型、および相同アームを含む)は、以下の表に提示される:
Figure 2022531539000083
Figure 2022531539000084
配列番号813,085～1,217,352の配列の各々は、SaCas9-KKH(配列番号1361596)に対してデザインされた。
本明細書とともに出願された配列表は、当初出願されたとおりの本明細書の一部を形成する意図があり、現にこれを形成する。
配列表の内容の概要(すなわち、一覧表)は、表XY中に示されるとおりである:
Figure 2022531539000085
Figure 2022531539000086
Figure 2022531539000087

PAM認識部位
PEgRNAの各々について、Cas9は、これと結び付けられるPAM認識部位を有していてもよい。いくつかの態様において、PAM認識部位はNGGである。いくつかの態様において、PAM認識部位はNGである。いくつかの態様において、PAM認識部位はKKHである。以下の表は、本開示のPEgRNAによって標的にされ結び付けられるPAM部位を説明するものである:
表:XX:PAMの関連付け
Figure 2022531539000088
Figure 2022531539000089
例
例1．ゲノム中に正確なヌクレオチド変化を組み入れるためのプライム編集(PE)
目的は、正確なゲノム編集の変革技術を開発すること、および哺乳動物ゲノム中の単一ヌクレオチドの変化の組み入れを生成することである。この技術は、研究者らに、事実上いずれの哺乳動物遺伝子においても、単一ヌクレオチドのバリエーションの効果を研究できるようにさせ、ヒト患者における病原性の点突然変異を修正するための治療的介入を潜在的に可能にさせるであろう。
ゲノム編集のための、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)系の採用は、生命科学に革命をもたらした1～3。CRISPRを使用する遺伝子の断絶は今やルーチンとなっているが、単一ヌクレオチドの編集の正確な組み入れは、疾患が原因の多数の突然変異を研究または修正するのに必要であるにも関わらず、大きな課題のままである。相同組み換え修復(HDR)は、かかる編集を達成させることは可能ではあるが、低い効率(しばしば＜5％)、ドナーDNA修復鋳型のための要件、および二本鎖DNA破壊(DSB)形成の有害効果に悩まされている。近年、Liu実験室が塩基編集を開発したが、これによってDSBのない効率的な単一ヌクレオチドの編集が達成される。塩基編集因子(BE)は、CRISPR系を塩基修飾デアミナーゼ酵素と組み合わせて、標的C・GまたはA・T塩基対を夫々A・TまたはG・Cへ変換する4～6。研究者らによって既に幅広く世界的に使用されているが(Addgeneによって流通された＞5,000 Liu実験室のBE構築物)、最新のBEは12塩基対の起こり得る変換のうちたった4つしかできず、小さい挿入または欠失を修正することはできない。その上、塩基編集の標的範囲は、標的塩基に隣接する非標的CまたはA塩基の編集(「バイスタンダー(bystander)編集」)によって、およびPAM配列が標的塩基から15±2bpに存在するという要件によって限定されている。したがって、これらの欠点を克服することは、ゲノム編集の基礎研究および治療用途を大幅に広げるであろう。
ここで、塩基編集の利益の多く－つまり、二本鎖破壊の回避およびドナーDNA修復鋳型－を、その大きな欠点を克服しつつ与える、新しい高精度編集アプローチを開発することが提案される。この意欲的な目標を達成するため、標的にプライムされた逆転写(TPRT)を使用して、標的ゲノムの部位にて編集済DNA鎖を直接組み入れることを目的とする。本明細書に考察されるデザインにおいて、CRISPRガイドRNA(gRNA)は、結び付けられた逆転写酵素(RT)鋳型配列によって実行される、変異誘発DNA鎖合成をコードする鋳型を持つよう改変されるであろう。CRISPRヌクレアーゼ(Cas9)によってニックが入れられた標的部位DNAは、修飾gRNA上の鋳型配列の逆転写のためのプライマーとして働き、いずれの所望のヌクレオチド編集の直接的な組み込みを可能にするであろう。
実験1
変異原性DNA鎖の、ガイドRNAを鋳型にした逆転写を確立する。先行研究によって、DNA切断の後であって複合体解離の前に、Cas9が非標的DNA鎖を放出して遊離の3'末端を晒すことが示された。このDNA鎖が、ポリメラーゼ酵素による伸長へアクセス可能であって、gRNAが、それらの5'末端または3'末端の伸長を通してDNA合成の鋳型として働くよう改変され得るものと仮定する。in vitroでの予備研究において、Cas9:gRNA結合複合体内のニックが入ったDNA鎖が、結合したgRNAを鋳型として使用する逆転写(transのRT酵素)を実際にプライムし得ることが確立された。次に、種々のgRNAリンカー、プライマー結合部位、および編集鋳型を、in vitroでの最適なデザイン規則を決定するために詳しく研究する。次いで、transで作用するかまたはCas9との融合体として作用する種々のRT酵素をin vitroで評価する。最終的に、細胞中の効率的な結合および切断活性を保持する改変gRNAデザインを同定する。これを目的とした実証実験の成功によって、細胞中の変異誘発鎖合成を遂行するための基盤が提供される。
実験2
ヒト細胞中のプライム編集を確立する。DNAプロセシングおよび修復機序に基づき、変異原性DNA鎖(単鎖フラップ)は、標的ヌクレオチドの特異的かつ効率的な編集に向かうのに使用し得るものと仮定する。有望な予備研究において、このストラテジーの実現性を、変異原性フラップを含有するモデルプラスミド基質での編集を実証することによって確立した。実験1と同時に、修復成果を、変異原性フラップの長さ、配列組成、標的ヌクレオチドの同一性、および3'末端を系統的に変動させることによってさらに評価する。1～3ヌクレオチドの小さい挿入および欠失もまた試験する。実験1と並行して実験1から組み立て、融合タンパク質および非共有結合動員ストラテジーを包含するCas9-RT構造を評価する。Cas9-RT構造および伸長されたgRNAを、ヒトゲノム中の複数の標的部位での細胞の編集についてアッセイし、次いで高効率のために最適化する。成功した場合、この目的によって、基礎科学への適用のためのTPRTゲノム編集が即時に確立される。
実験3
培養ヒト細胞中の病原性の突然変異の部位特異的編集を達成する。この技術の潜在的な普遍性は、目下BEによっては修正不能なトランスバージョン突然変異およびインデルの編集を可能にし得る。実験1および実験2の結果によって導かれて、鎌状赤血球病の創始者突然変異をベータグロビン中に(修正にはA・T→T・Aトランスバージョンを要する)および最も蔓延しているウィルソン病の突然変異をATP7B中に(修正にはG・C→T・Aトランスバージョンを要する)包含する培養ヒト細胞中の病原性のトランスバージョン突然変異を標的にする。嚢胞性線維症を引き起こすCFTR中の3ヌクレオチド?F508欠失を包含する、小さい挿入および欠失の突然変異の修正もまた調べる。成功した場合、これは、これらの重要なヒト疾患に対処する強力な治療的アプローチを開発するための基盤を据える。
アプローチ
目標は、標的にされたゲノム部位にて点突然変異を直接組み入れるゲノム編集ストラテジーを開発することである。技術開発段階において、CRISPR/Cas系中へTPRT機能性を組み込む努力が、タンパク質およびRNA工学に注がれる。TPRTの各ステップの機能を慎重に探り、基礎から組み立てるのにIn vitroアッセイを使用する(実験1)。第2集中領域は、モデル基質と改変CRISPR/Cas系との組み合わせを使用して哺乳動物の細胞中の編集成果を評価する(実験2)。最終的に、適用段階は、他の方法によるゲノム編集では解決困難な突然変異を修正する技術を使用する(実験3)。
一般的な編集デザインを図1A～1Bに示す。Cas9ニッカーゼは、PAM含有鎖(非標的鎖)へのDNA切断を制限する、HNHヌクレアーゼドメインに対する不活性化突然変異(Spy Cas9 H840AまたはN863A)を含有する。ガイドRNA(gRNA)を、逆転写のための鋳型を含有するよう改変する。示されるのはgRNAの5'伸長であるが、3'伸長でも実践できる。Cas9ニッカーゼを、C末端またはN末端のいずれかを通して、逆転写酵素(RT)酵素と融合させる。gRNA:Cas9-RT複合体は、着目するDNA領域を標的にし、非標的鎖に取って代わった後にRループを形成する。Cas9は非標的DNA鎖へニックを入れる。ニックが入った鎖の放出によって遊離の3'-OH末端が晒されるが、前記末端は、伸長されたgRNAを鋳型として使用する逆転写のプライム能がある。このDNA合成反応は、融合されたRT酵素によって遂行される。gRNA鋳型は、編集が標的にするヌクレオチドを除いて、元のDNA二重鎖と相同のDNA配列をコードする。逆転写産物は、所望の編集をコードする単鎖DNAフラップである。遊離の3'末端を含有するこのフラップは、隣接するDNA鎖と平衡化でき、5'フラップ種がもたらされる。後者の種は、FEN1(フラップエンドヌクレアーゼ1)の効率的な基質として働くものと仮定されており、前記酵素は、ラギング鎖DNA合成の最中に岡崎フラグメントから5'フラップを天然に切除し、長いパッチ(long-patch)の塩基切除修復の最中に生じる鎖置き換え合成の後に5'フラップを除去する。ニックが入ったDNAのライゲーションは、ミスマッチした塩基対を産生する。この中間体は、ミスマッチ修復(MMR)プロセスを介して、元の塩基対への復元または所望される編集済塩基対への変換のいずれかを経ることができる。代替的に、半保存的DNA複製によって、復元と編集との各1コピーが生み出され得る。
1．変異原性DNA鎖の、ガイドRNAを鋳型にした逆転写を確立する。
背景および論拠
提案されたゲノム編集ストラテジーにおいて、Cas9によってニックが入れられた非標的DNA鎖(Rループを形成するPAM含有鎖)は、DNA合成のためのプライマーとして作用する。これは生化学的データおよび構造のデータの数種の実例(pieces)に基づき起こり得るものと仮定される。ヌクレアーゼ保護実験32、結晶学的研究33、および塩基編集窓4,24は、Cas9結合複合体の所謂Rループ内の非標的鎖ヌクレオチド-20～-10について、柔軟性および障害のかなりの程度を実証した(ナンバリングは第1PAMヌクレオチドの5'からの距離を示す)。その上、相補的なssDNAが加えられたとき、切断された非標的鎖のPAM遠位部分は、緊密に結合した3元複合体から外され得る20。これらの研究によって、非標的鎖が高度に柔軟であって酵素へのアクセスが可能であること、およびニックが入った後にPAM遠位フラグメントの3'末端がCas9解離に先立ち放出されることが支持される。さらにまた、gRNAが、鋳型DNA合成まで伸長され得るものと仮定される。先行研究によって、SpCas9、SaCas9、およびLbCas12a(かつてはCpf1)のためのgRNAが、RNAアプタマー34、リガンド誘導性自己切断型リボザイム35、および長鎖ノンコーディングRNA36でのgRNA伸長を許容することが示された。生かされる2つの主要な特色に対し、この文献によって前例が確立される。このストラテジーの査定において、数種のCRISPR-Cas系を、in vitroでのアッセイと細胞アッセイとの組み合わせを使用し5'および3'伸長されたgRNAデザインと併せて評価する(図2A～2C)。
プライム編集のための改変gRNAのためのデザインを図3A～3Bに示す。DNA合成は5'→3'に進み、よってRNA鋳型を3'→5'方向にコピーする。5'伸長のためのデザインは、リンカー領域、ニックが入ったDNA鎖がアニールするプライマー結合部位、および逆転写によるDNA合成のための鋳型を含有する。3'伸長されたgRNAは、プライマー結合部位および逆転写鋳型を含有する。in vitroでの実験によって、逆転写が、3'伸長されたgRNA構築物のgRNAコア中へ、～3ヌクレオチド伸長することが示されたところ、いくつかのケースにおいて、gRNAコアの3'RNAヘアピンをDNA標的配列とマッチするよう修飾する(ヘアピンRNA構造の維持を代償する変化がなされる限り、ヘアピン配列の修飾には十分耐性があるように見える)。DNA合成は、ヌクレオチドが成長するDNA鎖の3'OHへ付加されながら5'→3'に進む。
予備実験結果
Cas9によってニックが入れられたDNAは、gRNA鋳型の逆転写をプライムする。ニックが入れられた非標的DNA鎖へのアクセス可能性を評価するため、in vitroでの生化学的アッセイを、S.pyogenes(SpCas9)からのCas9ヌクレアーゼおよびCy5蛍光標識二重鎖DNA基質(51塩基対)を使用して実施した。第1に、編集鋳型の長さが変動する一連の5'伸長含有gRNAを、in vitroでの転写によって調製した(全体的なデザインは図2Bに示される)。ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)を用いた電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)によって、5'伸長されたgRNAが標的への結合親和性を維持することが確立された(データは示さず)。次に、TPRT活性を、dCas9、5'伸長されたgRNA、およびモロニー-マウス白血病ウイルス(M-MLV)逆転写酵素(Superscript III)を使用して、予めニックが入れられたCy5標識二重鎖DNA基質に対し試験した。37℃での1時間のインキュベーション後、産物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって評価し、Cy5蛍光を使用して撮像した(図4A)。5'伸長されたgRNAバリアントは各々、有意な産物形成をもたらし、観察されたDNA産物サイズは伸長鋳型の長さと一致した(図4B)。重要なことに、dCas9の不在下で、予めニックが入れられた基質はDNA基質の全長51bpまで伸長されたが、これは相補的なDNA鎖(gRNAではない)が、dCas9が存在しないときにDNA合成のための鋳型として使用されたことを強く示唆する(図4C)。注目すべきは、新しく合成されたDNA鎖が、標的部位の編集に要求される産物(単一ヌクレオチドの変化と相同の鎖)を映し出す(mirrors)ように、系をデザインした。この結果は、Cas9:gRNA結合によってニックが入れられた非標的鎖の3'末が晒されること、および非標的鎖が逆転写へアクセス可能であることを確立する。
次に、ニックが入れられていないdsDNA基質を、非標的DNA鎖へニックを入れるCas9(H840A)突然変異体を使用して評価した。第1に、5'伸長されたgRNAを用いてCas9(H840A)ニッカーゼ活性を試験するため、in vitroでの切断アッセイを、これまでに記載されたとおりに実施した37。ニックを入れることは、標準のgRNAと比較すると損なわれていたが、相当の切断産物が形成されていた(図4D)。重要なことに、TPRT反応を5'伸長されたgRNAおよびCas9(H840A)で遂行したとき、より低い収率(ニックを入れる活性の減少によって説明可能)ではあるがRT産物もまた観察された(図4D)。この結果によって、5'伸長されたgRNA:Cas9(H840A)複合体がDNAへニックを入れ、逆転写の鋳型となり得ることが確立される。
最終的に、3'gRNA伸長を、Cas9(H840A)のニック入れおよびTPRTについて評価した。5'伸長されたgRNAと比較すると、3'伸長されたgRNAによるDNA切断は、標準のgRNAと比較していずれも検出可能な程度までには損なわれていなかった。有意に、3'伸長されたgRNA鋳型もまた、M-MLV RTがtransで供給されたとき、予めニックが入れられた二重鎖DNA基質と無傷の二重鎖DNA基質との両方で効率的な逆転写を支持した(図4E)。驚くべきことに、3'伸長された鋳型について単一産物のみが観察されたが、これは逆転写がgRNA骨格に沿った特定の場所にて終止することを示す。末端トランスフェラーゼでの産物のホモポリマーテール化(Homopolymer tailing)、これに続くクレノウ伸長およびサンガー配列決定によって、全gRNA編集鋳型がgRNAコアの末端3ヌクレオチドが付加されてコピーされたことが明らかにされた。今後、フラップ末端は、末端gRNA配列を修飾することによって再プログラムされるであろう38,39。この結果は、3'伸長されたgRNAが、効率的なヌクレアーゼ標的化ガイドとして働き、逆転写の鋳型となり得ることを実証する。
Cas9-TPRTは、ニックが入ったDNAおよびgRNAをcisで使用する。二色実験を、RT反応が優先的にgRNAとともにcisで(同じ複合体中に結合されている)生じるかを決定するのに使用した(図8を参照)。2つ別々の実験を、5'伸長されたgRNAおよび3'伸長されたgRNAについて行った。所定の実験について、dCas9、gRNA、およびDNA基質の3元複合体を別々の管中に形成させた。一方の管中、gRNAは長いRT産物をコードし、DNA基質はCy3(赤色)で標識されている;他方の管中、gRNAは短いRT産物をコードし、DNA基質はCy5(青色)で標識されている。短いインキュベーションの後、複合体を混合し、次いでRT酵素およびdNTPsで処置する。産物を尿素-変性PAGEによって分離し、Cy3およびCy5チャネルの蛍光によって視覚化した。反応産物は、予めDNA基質と複合体化されたgRNA鋳型を使用して優先的に形成されることが見出されたが、これはRT反応がcisで生じ得る可能性があることを示す。この結果は、単一のCas9:gRNA複合体がDNA部位を標的にし、変異原性DNA鎖の逆転写の鋳型になり得ることを支持する。
(viii)TPRTを他のCas系で試験する
先のセクションにおいて提示されたものと同様の実験を、S.aureusからのCas9およびL.bacteriumからCas12aを包含する他のCas系を使用して、遂行する(図2A～2Cを参照)。TRPTもまた、これらのCasバリアントについて実証され得る場合、潜在的な編集範囲および細胞において全般的に成功する可能性が増大するであろう。
(ix)TPRTをRT-Cas9融合タンパク質で試験する
第1に、商業的に入手可能または精製可能な一連のRT酵素をTPRT活性についてtransで評価する。M-MLVからの既に試験されたRTに加えて、トリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)、Geobacillus stearothermophilusグループIIイントロン(GsI-IIC)41,42、およびEubacterium rectaleグループIIイントロン(Eu.re.I2)43,44からのRTを評価する。有意に、後者2つのRTは、それら天然の生物学的な文脈において、TPRTを実施する。関係のある場合、RNAse不活性化突然変異および他の潜在的に有益なRT酵素修飾も試験する。transで供給されたとき機能的RTが同定されたら、各々を融合タンパク質としてCas9バリアントに対し評価する。N末端融合配向とC末端融合配向との両方を、様々なリンカー長さおよび構造と併せて試験する。速度論的な時間経過実験を、TPRTがRT酵素をcisで使用して生じ得るか決定するのに使用する。効率的なTPRT化学を可能にするRT-Cas9融合構造体が構築され得る場合、これは、細胞という文脈における機能的編集の可能性を大いに増大するであろう。
(x)細胞中の改変gRNAでのCas9標的化
先の副目的(sub-aims)において開発された改変gRNA候補を、Cas9標的化効率を確認するため、ヒト細胞培養実験(HEK293)において評価する。野生型SpCas9を採用する、確立されたインデル形成アッセイ45を使用して、改変gRNAを、ヒトゲノム中5部位またはそれ以上の部位にわたり、標準のgRNAと並べて(side-by-side)比較する。ゲノム編集効率を、実験室に収納されているIllumina MiSeqプラットホームを使用する多重アンプリコン配列決定によって特徴付ける。本セクションおよび先行するセクションからの結果から、これに続くデザイン-組み立て-試験サイクルの反復(iterations)という情報を与える洞察力が生み出されることが予想されるが、ここでgRNAは細胞中、逆転写の鋳型化と効率的なCas9標的化との両方に最適化され得る。
in vitroでの検証結果を図5～7に示す。In vitroでの実験は、ニックが入れられた非標的DNA鎖がDNA合成をプライムするのに柔軟かつ利用可能であること、およびgRNA伸長が逆転写のための鋳型として働き得ることを実証した(図5を参照)。この一連の実験は、編集鋳型の長さを変動させた(左側へ列挙)、5'伸長されたgRNA(図3A～3Bに示されるとおりにデザインされた)を使用した。蛍光標識(Cy5)DNA標的を基質として使用し、この一連の実験においてこれへ予めニックを入れた。これらの実験に使用されたCas9は触媒不活性型Cas9(dCas9)であり、そのためDNAは切れないが、依然として効率的に結合することはできる。モロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV)に由来する商業的RTであるSuperscript IIIをtransで供給した。第1に、dCas9:gRNA複合体を精製された構成要素から構成させた。次いで、蛍光標識DNA基質をdNTPsおよびRT酵素と一緒に加えた。37Cでの1時間のインキュベーション後、反応産物を変性尿素-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって分析した。ゲル画像は、逆転写鋳型の長さと一致する長さまで元のDNA鎖が伸長したことを示す。注目すべきことに、dCas9の不在下で遂行された反応は、使用されたgRNAを問わず、51ヌクレオチド長のDNA産物を産生した。この産物は、DNA合成のための鋳型として相補的なDNA(RNAではない)鎖の使用に対応する(データは示さず)。よって、Cas9結合は、DNA合成をRNA鋳型へ向けるのに要される。この一連のin vitroでの実験は、DNA基質へ予めニックが入れられておらず、かつCas9ニッカーゼ(SpyCas9 H840A 突然変異体)を使用する以外は、図5に示されるものと厳密に類似する(closely parallels)。ゲルに示されるとおり、ニッカーゼは、標準のgRNAを使用したときDNA鎖を効率的に切断する(gRNA_0、レーン3)。複数の切断産物が観察されるが、SpyCas9の先行する生化学的研究と一致する。5'伸長はニックを入れる活性(レーン4～8)を損なうが、あるRT産物は依然として観察される。図7は、3'伸長がDNA合成を支持し、Cas9ニッカーゼ活性を有意には生じさせないことを示す。予めニックが入れられた基質(黒色矢印)は、dCas9またはCas9ニッカーゼのいずれかを使用したとき、ほぼ定量的にRT産物へ変換される(レーン4および5)。RT産物(赤色矢印)への50％超の変換が全基質で観察される(レーン3)。RT産物の長さおよび配列を決定するため、産物バンドをゲルから切除し、抽出して配列決定した。これはRTがgRNAコアの3'末端ヘアピン中へ3ヌクレオチド伸長したことを明らかにした。これに続く実験は、これらの3ヌクレオチドが、ヘアピンRNA構造を維持する相補的な変化がなされる限り、標的DNA配列とマッチするために変化され得ることを実証した。
(xi)潜在的な困難および代替手段
(1)RTは、融合体としては機能しない:分子密集および/または好ましくない形状(geometries)は、Cas9融合RT酵素によるポリメラーゼ伸長を妨げ得る。第1に、リンカー最適化は試験できる。DNAプライマーとgRNAとRT酵素との間の空間的な関係性を再配向し得るCas9の循環置換バリアントを評価する。実験2に詳述したとおりの非共有結合のRT動員ストラテジーは試験できる。(2)伸長されたgRNAバリアントによって減少したCas標的化効率:これは、最も5'伸長されたgRNAの問題点になり得るものである。構造データ24に基づき、Cas9突然変異体をデザイン、スクリーニングし、gRNA伸長に対してより耐性があるバリアントを同定できる。加えて、gRNAライブラリは、標的化活性を改善するリンカーについて細胞中でスクリーニングできる。
有意性
これらの予備実験結果は、Cas9ニッカーゼおよび伸長されたgRNAが、transで供給された逆転写酵素を使用して、結合したDNA標的上、標的にプライムされた逆転写を開始し得ることを確立する。重要なことに、Cas9結合は、産物形成にとって極めて重要であることが見出された。おそらく細胞中のゲノム編集にとって絶対的な要件ではないが、RT酵素機能をcisで組み込む系のさらなる開発は、細胞ベースの適用において成功する可能性を有意に増大させるであろう。この目的の残りの側面を達成すると、ヒトゲノムという文脈における高精度ゲノム編集を遂行するための分子基盤が提供されるであろう。
2．ヒト細胞中のプライム編集を確立する。
背景および論拠
提案のストラテジーにおいて、改変RT-Cas9:gRNA複合体は、変異原性3'DNAフラップをゲノムの標的部位にて導入する。単一ミスマッチを含有する変異原性3'フラップは、エネルギー的に利用しやすい隣接5'フラップ(これは優先的に除去される)との平衡を通して、DNA修復機構によって組み込まれるものと仮定する(図1B)。DNA複製および修復機構は、岡崎フラグメントをプロセシングするとき46かつ長いパッチの塩基切除修復(LP-BER)の最中47、5'ssDNAフラップに遭遇する。5'フラップは、幅広く発現されるフラップエンドヌクレアーゼFEN1の好ましい基質であって、前記酵素は、ホモ三量体のスライド型(sliding)クランプ複合体PCNAによってDNA修復部位へ動員される48。PCNAはまた、他の修復因子(DNAリガーゼLig1を包含する)も同時に動員するための骨格としても働く49。PCNAは、「ツールベルト(toolbelt)」として作用すると、細胞分裂の最中ごとに生成される数百万の岡崎フラグメントをプロセシングするのに不可欠である連続フラップ切断およびライゲーションを加速させる50,51。これら天然のDNA中間体との類似点に基づき、変異誘発鎖は、5'フラップとの平衡、これに続く5'フラップ切除とライゲーションとの連携を通して組み込まれるものと仮定される。次いで、ミスマッチ修復(MMR)が、いずれかの鎖上に等しい確率で生じるはずであって、編集または復元へ繋がる(図1B)。代替的に、DNA複製が最初に生じ、新しく合成された娘鎖中の編集の組み込みへ直接繋がり得る。このプロセスから期待される最も高い収率は50％ではあるが、複数の基質編集を試みることによって、編集修復の不可逆性に起因して完成へ向かう反応が推進され得る。
予備実験結果
DNAフラップは、酵母およびHEK細胞中のプラスミドモデル基質中に部位特異的変異誘発を包含する。提案の編集ストラテジーを試験するため、TPRT産物と似ている変異原性3'フラップ含有モデルプラスミド基質で研究を始めた。GFPとmCherryとの間に停止コドンをコードする二重蛍光タンパク質レポーターを創出した。変異原性フラップは停止コドンへの修正をコードしており(図9A)、mCherry合成を可能にさせる。よって、変異誘発効率はGFP:mCherry比率によって定量化できる。プラスミド基質をin vitroで調製し、酵母(S.cerevisiae)またはヒト細胞(HEK293)中へ導入した。高頻度変異誘発が両系ともに観察され(図9B)、単離された酵母コロニーは、元の状態の(reverted)塩基、突然変異塩基、または両産物の混合物のいずれかを含有していた(図9C)。後者の検出は、これらのケースにおいてプラスミド複製がMMRに先立ち生じたことを示唆し、さらに、フラップ切除およびライゲーションがMMRに先行することを示唆する。この結果は、3'変異誘発鎖を使用するDNA編集の実現性を確立する。
(i)モデルラップ基質での系統的な研究
上に記載の予備実験結果に基づき、効率的な編集の原理を推察するため、より広範囲のフラップ基質をHEK細胞において評価する。ミスマッチ対形成の影響、フラップに沿った変異原性ヌクレオチドの場所、および末端ヌクレオチドの同一性を決定するため、3'ssDNAフラップを系統的に変動させる(図9D)。単一ヌクレオチドの挿入および欠失もまた試験する。編集高精度を分析するため、アンプリコン配列決定を使用する。これらの結果は、gRNA逆転写鋳型のデザイン情報を与えるのに役立つ。
プラスミド基質上のIn vitroでのTPRTは、効率的な編集成果へ繋がる。実験1において開発されたTPRT反応を、プラスミド基質内に変異誘発を導入するのに使用した。反応を環状DNAプラスミド基質上で遂行した(図10を参照)。これは、先のin vitroでの実験におけるRT伸長の機序としてDNA鎖が解離する可能性を除外する。これはまた、細胞中のフラップ基質のDNA修復も可能にさせる。二重蛍光レポータープラスミドを酵母(S.cerevisiae)発現のために構築した。このプラスミドは、停止コドン(TGA)を介在してGFP(緑色蛍光タンパク質)およびmCherry(赤色蛍光タンパク質)をコードする。この構築物の酵母中の発現は、GFPしか産生しない。プラスミドを、in vitroでのTRT[Cas9(H840A)ニッカーゼ、改変gRNA、MLV RT酵素、dNTPS]のための基質として使用した。gRNA伸長は、停止コドンに対する突然変異をコードする。フラップ鎖を停止コドンの修復のために使用すると、GFPとmCherryとの両方を発現するプラスミドを融合タンパク質として産生するものと予想される。酵母二重FPプラスミド形質転換体を図10に示す。親プラスミドまたはin vitroでCas9(H840A)がニックを入れたプラスミドを形質転換すると、緑色GFP発現コロニーのみがもたらされる。5'伸長されたgRNAまたは3'伸長されたgRNAでのTRT反応は、緑色コロニーと黄色コロニーとの混合を産生する。後者はGFPとmCherryとの両方を発現する。より多くの黄色コロニーが3'伸長されたgRNAで観察される。停止コドンを含有しない陽性対照も示す。
この結果は、長い二本鎖の基質がTPRTを経り得ること、およびTPRT産物が真核細胞中に編集を誘導することを確立する。
上記のプライム編集実験と同様の別の実験も遂行したが、停止コドン中に点突然変異を組み入れる代わりに、プライム編集は、フレームシフト突然変異を修復しかつ下流mCherryの合成を可能にさせる単一ヌクレオチドの挿入(左)または欠失(右)を取り入れる(図11を参照)。両実験とも、3'伸長されたgRNAを使用した。TRT形質転換体からの個々のコロニーを選択し、サンガー配列決定によって分析した(図12を参照)。緑色コロニーは元のDNA配列をもつプラスミドを含有し、一方黄色コロニーは、プライム編集gRNAによってデザインされた正確な突然変異を含有していた。他の点突然変異もインデルも観察されなかった。
(ii)RT-Cas9構造体を使用するHEK細胞中のプライム編集を確立する
先の目的から最適化された構築物を、哺乳動物発現およびヒトゲノム中の標的部位での編集のために適合させる。複数のRT酵素および融合構造体を、2次gRNA(ニックが入れられるのを防止するためにトランケートされた)での隣接標的化に加えて、試験する。非共有結合のRT動員もまた、Sun-Tag系52およびMS2アプタマー系53を使用して評価する。インデル形成アッセイを、標準のgRNAおよびRT-Cas9融合体(上のとおり)での標的化効率を評価するのに使用する。次いで、各ゲノムの部位について、伸長されたgRNAとRT-Cas9との対を、単一ヌクレオチドの編集についてアッセイする。編集成果をMiSeqで評価する。
HEK細胞における最初の実験を、Cas9-RT融合体を使用して実施した。細胞内に発現される構成要素による編集には、Cas9(H840A)ニッカーゼ、逆転写酵素(融合体として発現されるか、またはtransで供給される)、および3'伸長をもつ改変gRNAを要する(図14を参照)。予備研究は、gRNA伸長内のプライマー結合部位の長さがヒト細胞中の編集の効率を増大させるのに重要であることを示した(図15を参照)。
(iii)HEK細胞中のプライム編集パラメータを最適化する
細胞中でプライム編集を実施できるCas9-RT構造体を同定した後、構成要素およびデザインを、高効率編集を達成するのに最適化する。コードされた点突然変異の場所およびヌクレオチド同一性、ならびに新しく合成されたDNA鎖の全長を、編集範囲および潜在的な欠点を評価するために変動させる。短い挿入および欠失の突然変異もまた評価する。タンパク質発現構築物をコドン最適化する。成功した場合、これは、哺乳動物細胞中の効率的なプライム編集を確立するであろう。
予備実験結果。
万一、融合RT酵素による分子内逆転写が起こり得なかったという場合には、追加のgRNAを、RT酵素が編集遺伝子座にてより高い局所濃度になるようデザインした。これらの補助ガイドを5'末にてトランケートするが(14～15ntスペーサー)、これによってCas9切断は防止されるが結合は保持されることがこれまでに示されている(図16を参照)。HEK3遺伝子座を、このストラテジーを探索するために選んだ。
(iv)潜在的な困難および代替手段
(1)細胞中のgRNA分解:伸長されたgRNA末端が細胞中でトランケートされた場合、安定化2次構造を組み入れるか、または安定化修飾をもつ合成gRNAを試験できる。(2)ヒト細胞中で編集が観察されない:RT-Cas9融合体の隣接ゲノム部位への2次標的化を包含する、追加のストラテジーを探索する54。加えて、E.coliまたはS.cerevisiae中の潜在的な指向進化ストラテジーも探索できる。
有意性
プライム編集を実験の細胞株中で確立できた場合、これは、ヒト遺伝子中の多数の点突然変異の迅速な生成および特徴付けを可能にすることによって、生物医学の基礎研究に直接の影響を有するであろう。塩基編集因子に関する方法の一般論、およびその直交する編集窓は、目下アクセス不能な多くの突然変異を取り入れるアプローチを提供する。その上、プライム編集を高い効率および産物純度に最適化できた場合、他のヒト細胞型中の疾患突然変異を修正することへのその潜在的な適用性は意義深い。
3．培養ヒト細胞中の病原性の突然変異の部位特異的編集を達成する。
背景および論拠。
多数の病原性の突然変異は、PAMの制限に起因する最新の塩基編集因子によっては修正できない、すなわちトランスバージョンまたはインデル突然変異の修正が必要とされる。プライム編集で、すべてのトランジションおよびトランスバージョンは、挿入および欠失が小さい場合ではあるが、理論上起こり得る。その上、PAMとの関係において、プライム編集窓(-3～+4と予想される)は、塩基編集因子(-18～-12)とは違う(図13)。目下、塩基編集因子によって修正不能であるメンデル型疾病は、以下を包含する:(1)ヘモグロビンベータ中の鎌状赤血球病Glu6Val創始者突然変異(A・T→T・Aトランスバージョンを要する);(2)ATP7B中の最も一般的なウィルソン病バリアントHis1069Gln(G・C→T・Aトランスバージョンを要する);および(3)嚢胞性線維症を引き起こすCFTR中の?Phe508突然変異(3ヌクレオチド挿入を要する)。これらの標的の各々は、SpCas9標的化およびプライム編集にとって適切に位置付けられたPAMを含有する。
予備実験結果。
(i)HEK3細胞中のT→A編集は、最新の塩基編集では達成できないが、TRPT編集では達成できる(図17A～17Cを参照)。
図17Aは、ヒト胚性腎臓(HEK)細胞中の構成要素のトランスフェクション後の標的ヌクレオチドでの％T→A変換を表示するグラフを示す。このデータは、野生型MLV逆転写酵素のCas9(H840A)ニッカーゼ(32アミノ酸リンカー)とのN末端融合体を使用する結果を提示する。編集効率は、プライマー結合部位の長さが7ヌクレオチドから11または12ヌクレオチドまで伸長されたとき劇的に改善した。加えて、編集遺伝子座のちょうど上流に位置付けられる補助(auxiliary)ガイドAは(図16を参照)、具体的にはプライマー結合部位の長さがより短い場合に、編集活性を有意に改善する。編集効率を、MiSeqプラットホームを使用するアンプリコン配列決定によって定量化した。図17Bはまた、ヒト胚性腎臓(HEK)細胞中の構成要素のトランスフェクション後の標的ヌクレオチドでの％T→A変換も示すが、このデータは、RT酵素のC末端融合体を使用する結果を提示する。ここで、補助ガイドAはそれほどの(as much of)効果を有さず、編集効率全体はより高い。図17Cは、図17Aにおいて使用されたものと同様の野生型MLV逆転写酵素のCas9(H840A)ニッカーゼとのN末端融合体を使用する結果を提示するデータを示す;しかしながら、MLV RTとCas9との間のリンカーは、32アミノ酸の代わりに60アミノ酸長である。
(ii)TRPT編集結果によるHEK3部位でのT→A編集は高純度を表示する。
図18は、ハイスループットアンプリコン配列決定による配列決定分析の入力を示す。入力は、編集済細胞の最も豊富な遺伝子型を表示する。注目すべきことに、主要なインデル産物は得られず、所望の点突然変異(T→A)は、バイスタンダー編集をせずとも明確に取り入れられる。第1配列は参照遺伝子型を示す。上側2つの産物は、内生多型を含有する出発遺伝子型(GまたはA)である。下側2つの産物は、修正して編集された遺伝子型を表す。
(iii)MLV RT突然変異体は編集を改善する。
Baranauskasら(doi:10.1093/protein/gzs034)に記載される突然変異逆転写酵素を、ヒト胚性腎臓(HEK)細胞中の標的ヌクレオチド編集について、Cas9(H840A)ニッカーゼとのC末端融合体として試験した。Cas9-RT編集因子プラスミドを、逆転写の鋳型となる3'プライム編集因子ガイドRNAをコードするプラスミドとともに共トランスフェクトした。図19において標的ヌクレオチドでの編集効率(青色バー)を、インデル率(オレンジ色バー)と並べて示す。WTは野生型MLV RT酵素を指す。突然変異酵素(M1～M4)は、右に列挙された突然変異を含有する。編集率をゲノムDNAアンプリコンのハイスループット配列決定によって定量化した。
(iv)第2gRNAで相補鎖へニックを入れることは編集を改善する。
この実験は、単鎖ニックが、標的ヌクレオチドに近接する相補的なDNA鎖中に導入されたときの、標的ヌクレオチドの編集効率を評価する(これがミスマッチ修復へ指向して、元のヌクレオチドを優先的に除去しかつ塩基対を所望の編集へ変換するとの仮説から)。Cas9(H840A)-RT編集構築物を、2つのガイドRNA(その一方が逆転写反応の鋳型になり、他方が、ニックを入れるための相補的なDNA鎖を標的にする)をコードするプラスミドとともに共トランスフェクトした。標的ヌクレオチドから様々な距離にてニックを入れることを試験した(オレンジ色三角形)(図20を参照)。標的塩基対での編集効率(青色バー)を、インデル率(オレンジ色バー)と並べて示す。「なし」の例は、相補鎖へニックを入れるガイドRNAを含有しない。編集率をゲノムDNAアンプリコンのハイスループット配列決定によって定量化した。
図21は、所望のT→Aトランスバージョン突然変異と、他の主要ゲノム編集副産物が全体的に存在しないこととを示す、処理済ハイスループット配列決定データを示す。
範囲。
新しい編集技術のための潜在的な範囲を図13に示し、デアミナーゼ媒介の塩基編集因子技術と比較する。これまでに開発された塩基編集因子は、PAMの上流、～15±2bp領域を標的にする。標的CまたはAヌクレオチドを夫々、TまたはGへ変換することによって、これまでに開発された塩基編集因子は、すべてのトランジション突然変異(A:T→G:C変換)を可能にする。しかしながら、これまでに開発された塩基編集因子は、トランスバージョン突然変異(A→T、A→C、G→T、G→C、T→A、T→G、C→A、C→G)を取り入れることはできない。その上、編集窓に複数の標的ヌクレオチドがある場合、望ましくない追加の編集をもたらすことがある。
新しいプライム編集技術は理論上、いずれのヌクレオチドおよび塩基対の変換も、潜在的に小さい挿入および欠失の編集も取り入れられる。PAMに関し、プライム編集窓は、DNAへニックを入れる部位(PAMの3塩基上流)にて始まり、PAMの下流の、これまでのところ決定されていない位置にて終わる。注目すべきことに、この編集窓は、デアミナーゼ塩基編集因子とは違う。TPRT系は、DNAポリメラーゼ酵素を使用して編集を実施することから、一般性、高精度、および忠実度を包含するそれら利益のすべてを有する。
(v)患者由来細胞株中の病原性の突然変異を修正する。
関係のある突然変異を内包する細胞株(鎌状赤血球病:CD34+造血幹細胞;ウィルソン病:培養線維芽細胞;嚢胞性線維症:培養気管支上皮)を、ATCC、Coriell Biobank、またはハーバード/ブロード連携共同研究所(collaborating Harvard/Broad affiliate laboratories)から得る。編集効率をハイスループット配列決定によって評価し、修正された遺伝子型の有効性を、表現型アッセイ(ヘモグロビンHPLC、ATP7B免疫染色、およびCFTR膜電位アッセイ)を使用して試験する。
(vi)オフターゲット編集活性を特徴付けする。
潜在的なオフターゲット編集を、野生型Cas9と対になった標的gRNAを使用し、GUIDE-seq55およびCIRCLE-seq56などの確立された方法でスクリーニングする。潜在的なオフターゲットが同定された場合、これらの遺伝子座をTPRT編集済細胞から探り、真のオフターゲット編集事象を同定する。
(vii)潜在的な困難および代替手段。
(1)低い編集効率:プライム編集因子は各標的について最適化を要することがある。このケースにおいて、gRNAライブラリは、特定の用途への最高機能バリアントを同定するのに試験できる。RT-Cas融合体の発現および核局在化は最適化できる。リポソームRNP送達を、オフターゲット編集を制限するのに使用できる。
(viii)次の実験。
gRNAデザインの最適化は、プライマー結合部位の長さおよび編集鋳型の伸長のさらなる探査によって達成できる。範囲および一般性を試験することは、種々のヌクレオチド変換、小さい挿入および欠失、ならびに、PAMに関する種々の編集位置、およびヒトゲノム中の複数部位を包含する。RT構成要素の最適化は、MLV RT中の活性(Rnase Hの不活化、プライマー-鋳型結合親和性の増大、処理能力(processivity)の調整)を増強する突然変異、および新しいRT酵素(グループIIイントロンRT、他のレトロウイルスのRT)中の突然変異を探査することを包含する。
有意性。
無数の遺伝性障害は、個々の遺伝子中の単一ヌクレオチドの変化からもたらされる。ここに記載のゲノム編集技術を開発すること、およびこれを疾患に関係のある細胞型に適用することは、臨床へ移行するための基礎を確立するであろう。鎌状赤血球病などのいくつかの疾患について、単一の点突然変異は、その集団全体にわたって優性遺伝子型を表す。しかしながら、多くの他の遺伝性障害について、単一遺伝子内の種々の点突然変異の大きな不均一性は、患者集団(この各々は同様の疾患表現型を生じている)全体にわたって観察される。したがって、一般のゲノム編集方法は理論上かかる多数の突然変異を標的にできるところ、この技術はこれら患者および彼らの家族の多くへ莫大な潜在的利益を提供できる。これら適用のための原理の証明が細胞中で確立できた場合、疾患の動物モデルにおいて研究するための基盤を確立するであろう。
利点
高精度:所望の編集は、核酸配列にコード、指向される。一般性:理論上、トランスバージョン編集、ならびに小さい挿入または欠失を包含する、いずれの塩基対変換もなし得る。Cas9プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列に関する塩基編集因子とは違う編集窓がある。この方法は相同組み換え修復(HDR)の編集能の多くを獲得するが、HDRの主な欠点(ほとんどの細胞型において非効率であって、大抵、インデルなどの望ましくない過剰の副産物が付随する)がない。前記方法はまた、二本鎖DNA破壊(DSB)、極少数のインデル、転座、大きな欠失、p53活性化等々もない。
例2．治療的プライム編集因子ガイドRNA(PEGRNA)をデザインするためのプロセスならびにプライム編集で病原性ヒト遺伝子バリアントを修正するための潜在的な標的およびPEGRNA
導入
プライム編集はゲノム編集のため斬新なツールである。その多くのなし得る適用のうち、プライム編集は、潜在的な治療上の利益のある、病原性の突然変異を修正するための新規ストラテジーを表す。クリンバー(Clinvar)は、疾患に関連し得ると報告されたヒト突然変異の公的にアクセス可能なデータベースである。
この例は、単純な手順を使用してPEgRNA配列を決定するコンピュータプログラム/アルゴリズムのデザインを実証し、これを436,042のユニークなクリンバー突然変異へ適用した。この例はまず、PEgRNA構造および機能的要素を記載し、次いで定義を包含するデザイン手順を記載し、以下の、潜在的に治療効果のある(curative)PEgRNAをデザインするための単純な手順を使用するコンピュータプログラム/アルゴリズムに寄与する記載、およびPEgRNAデザインのバリエーションへの考察を提供する。
加えて、本例は、クリンバーからの潜在的に病原性の突然変異を修正するための例示のPEgRNA配列を含む、本明細書とともに出願された配列表を提供する。配列表の説明は上に提供される。
PEgRNA構造
図27および図28は、本例に従ってデザインされ得るPEgRNAの2つの起こり得る立体配置の概略図を提供する。
図27は、本明細書に企図され、かつ例2に定義される方法論に従ってデザインされてもよい、ある態様のPEgRNAの構造を提供する。PEgRNAは、5'→3'方向に順序付けられた3大構成要素(component elements)、つまり:スペーサー、gRNAコア、および3'末にて伸長アームを含む。伸長アームはさらに、5'→3'方向に以下の構造要素、つまり:プライマー結合部位(A)、編集鋳型(B)、および相同アーム(C)に分けられてもよい。加えて、PEgRNAは、任意の3'末修飾領域(e1)および任意の5'末修飾領域(e2)を含んでいてもよい。またさらに、PEgRNAは、PEgRNAの3'末にて転写終止シグナルを含んでいてもよい(描かれず)。これらの構造要素はさらに本明細書に定義される。これらの構造要素はさらに本明細書に定義される。PEgRNA構造の描画は、限定することを意図しておらず、要素の配置におけるバリエーションを網羅するものである。例えば、任意の配列修飾因子(e1)および(e2)は、示されるいずれの他の領域内またはそれらの間に位置付けられ得るものであって、3'末および5'末にて位置付けられることに限定され得ない。
図28は、本明細書に企図され、かつ例2に定義される方法論に従ってデザインされてもよい、別の態様のPEgRNAの構造を提供する。PEgRNAは、5'→3'方向に順序付けられた3大構成要素、つまり:スペーサー、gRNAコア、および3'末にて伸長アームを含む。伸長アームはさらに、5'→3'方向に以下の構造要素、つまり:プライマー結合部位(A)、編集鋳型(B)、および相同アーム(C)に分けられてもよい。加えて、PEgRNAは、任意の3'末修飾領域(e1)および任意の5'末修飾領域(e2)を含んでいてもよい。またさらに、PEgRNAは、PEgRNAの3'末にて転写終止シグナルを含んでいてもよい(描かれず)。これらの構造要素はさらに本明細書に定義される。PEgRNA構造の描画は、限定することを意図しておらず、要素の配置におけるバリエーションを網羅するものである。例えば、任意の配列修飾因子(e1)および(e2)は、示されるいずれの他の領域内またはそれらの間に位置付けられ得るものであって、3'末および5'末にて位置付けられることに限定され得ない。
PEgRNA構造要素は、以下のとおりに記載され得る:
スペーサー:ゲノム中の標的DNA配列に相補的なgRNAの部分、典型的には長さが20ntである。スペーサーはDNA中のプロトスペーサーに相補的である。スペーサーは様々な非限定的なやり方で修飾され得る。例えば、スペーサーは、最も5'側にあるヌクレオチドがGでないとき、5'-Gを付加して21ntスペーサーを形成するように修飾されてもよい。この修飾はU6プロモーターからの転写を改善する。
gRNAコアまたは「gRNA主鎖」:gRNAの部分は、一般にスペーサーの3'側に位置付けられ、Cas9タンパク質と相互作用する数個のヘアピンを包含する。例示のgRNAコアは、例えば、以下を包含し得る:
gRNA主鎖配列1:
GTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(86nt)(配列番号1361579)。
gRNA主鎖配列2:
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(76nt)(配列番号1361580)。
本明細書に企図されるPEgRNAは、同じかまたは同様のgRNAのCas9への結合能を維持する他のgRNAコア配列も採用し得る。
伸長アーム:本明細書に企図されるPEgRNAは、プライマー結合部位、編集鋳型、および相同アームを包含する様々な機能的要素を含む伸長アームを含む。伸長アームは、gRNAコアの3'末にて位置付けられ得る。他の態様において、伸長アームは、スペーサーの5'末にて位置付けられ得る。伸長アームはゲノム配列という文脈とほとんど相補的であって、所望の編集は非相補的なセクションを表す。伸長アームの配列は、以下のバリエーションを包含するように変動され得る:プライマー結合部位の長さのバリエーション(下を参照);コード領域の長さのバリエーション。
プライマー結合部位:プライマー結合部位は、PEgRNA伸長アームの3'末にあり、ssDNAフラップ(Cas媒介ニック後にスペーサーによって取って代わられる)に相補的である。ssDNA:RNAハイブリッドは、PEgRNA伸長の残りの5'→3'重合方向の逆転写のためのプライマーとして働く。SpCas9について、RuvCニックは、プロトスペーサーの位置-4と-3との間に位置付けられ、ここで20ntスペーサーのうち、-1は、最も3'側にある(3'-most)ヌクレオチドであり、-20は、最も5'側にあるヌクレオチドである。長さXのプライマー結合部位は、スペーサーの位置-4を包含するスペーサーの位置-4以降の3'から始まるXヌクレオチドとしてデザインされる。一般的なバリエーションは、約8nt～約20ntの間(例として、8ntと17ntとの間)に及ぶ種々の長さを包含する。
編集鋳型:編集鋳型は、プライマー結合部位の5'末に隣接し、所望の編集済配列(例として、単一ヌクレオチドの変化、欠失、または挿入)をコードする。
相同アーム:相同アームは、編集鋳型の5'末に位置し、自生ゲノムという文脈と相補的である。
逆転写鋳型または内生DNA中へ組み込まれることになるssDNAフラップをコードする領域:プライマー結合部位を除くPEgRNA伸長(プライマー結合部位は、逆転写酵素によるssDNA重合のための鋳型にはならないため)。逆転写酵素鋳型は、編集鋳型および相同アームを含有する。プロトスペーサーからスペーサーを解離した後、逆転写酵素プライマーssDNA配列は、その自生ゲノムという文脈へ再結合し、逆転写酵素鋳型を3'ssDNAフラップとして放出する。一般的なバリエーションは以下を包含する:フラップ長さは、例として、7ntから34ntまで変動し得る(が、本明細書に記載のとおり、広範なフラップ長さも企図される);フラップ内の編集位置も変動し得る。成功した編集は、2ntと同程度に短い相同アーム長さで観察される。編集は、典型的には(そうする必要もないが)、可能な限りニックの近くへ位置付けられる。
転写ターミネータ配列:例として、U6プロモーターまたは他のプロモーターから発現されたとき、PEgRNA産生の最中に転写を終止する、PEgRNAの3'末にある配列である。例示のターミネータ配列は、TTTTTTGTTTT(配列番号1361581)である。
PEgRNAデザインへの追加のバリエーションは、実現可能であって、本明細書に企図される。例えば、非相補的な配列と5'の相同アームもしくは3'のプライマー結合部位またはその両方とを含有するPEgRNA伸長アームをもつPEgRNAが、実例として、キッシングループ相互作用を形成するように、またはRNA安定性のためヘアピンを保護する機能を果たすようにデザインされてもよいことは想定される。これらの配列は、図27および28中、配列要素e1およびe2にて表され、「任意の3'または5'末修飾領域」と称される。加えて、PEgRNAが、複数のデザイン候補間で優先順位を決めるストラテジーおよび方法を使用してデザインされてもよいことは想定される。例は、sgRNA:Cas9複合体中の自生ヌクレオチド-タンパク質相互作用を遮断すること、またはスペーサーおよび所望の編集に与えられる、好ましいPBS長さおよびフラップ長さを選択するRNA2次構造予測ツールを使用することによって、最も5'側にあるヌクレオチドがシトシンであるPEgRNA伸長を回避することを包含する。
PEgRNAデザインアルゴリズム
プライム編集のための入力アレル、出力アレル、およびCRISPR系(重要なことには、PAMモチーフおよびプライム編集因子のニックの相対的な位置)を前提として、アルゴリズムは、入力アレルを出力アレルへ編集することが可能なPEgRNAまたはPEgRNA一覧をデザインする。出力アレルと入力アレルとの配列の差異は、所望の編集と称される。この態様は、病原性の突然変異を表す入力アレルおよび修正された野生型配列を表す出力アレルであってもよい。
単一PEgRNAによって誘導され得る編集のクラスは、単一ヌクレオチドの置換、1ntから最大およそ40ntまでの挿入、1ntから最大およそ30ntまでの欠失、および上のすべての組み合わせまたは混合物を包含する。プライム編集は、主にスペーサー位置-3(ニックのすぐ3')からスペーサー位置+27(入力アレル中ニックの3'から30nt)までのこの種の編集をサポートすることが知られている。これら特定数の各々は、プライム編集についての知識が増すにつれ経時的に変化し得るアルゴリズムのパラメータを表す。余談として、SpCas9系を使用するプロトスペーサー位置-4での編集は、プロトスペーサー位置-5と-4との間の偶発的なRuvC切断によって引き起こされそうなプライム編集で観察される。
アルゴリズムは、両鎖上の入力アレル中の選択されたCRISPR系のPAMモチーフに適合するすべてのスペーサーを数え上げ、次いで、ニックがその鎖上の所望の編集の3'側にあること、またはニックと所望の編集との間の距離が遠すぎる(ユーザー定義の閾値(例えば、30nt)より大きい)ことのいずれかから、関連するニック位置が出力アレルへのプライム編集に適合しないプロトスペーサーを取り除く。
各スペーサーに対し、アルゴリズムは、入力アレルの配列、ニックの位置、および所望の編集の配列を使用して、スペーサーおよび編集鋳型の配列を構築する。次いで、アルゴリズムは、8ntから17ntまで変動し得るプライマー結合部位長さ;2ntから33ntまで変動し得る相同アーム長さ;およびGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(配列番号1361579)もしくはGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(配列番号1361580)、または野生型RNA2次構造を保持する別のgRNA主鎖配列であり得るgRNA主鎖配列、に対して1以上の値を選択する。選択された各パラメータの組み合わせに対し、アルゴリズムは、所定のパラメータを使用して、相同アーム、プライマー結合部位配列、およびgRNA主鎖を構築する。次いで、アルゴリズムは、プロトスペーサー、gRNA主鎖、PEgRNA伸長、およびターミネータ配列を連接させることによって、PEgRNA配列を形成する。
病原性があるかまたは病原性がありそうなものとしての注釈が付された生殖細胞系列の突然変異を簡易的に取り除いた後、Cas9-NGでのプライム編集に適合する72,020のユニークなクリンバー(Clinvar)突然変異、およびNGG PAMをもつSpCas9でのプライム編集に適合する63,496のユニークなクリンバー突然変異を同定した。なお、追加の突然変異も、異なるPAM適合性をもつ異なるCas9バリアントを含有するプライム編集因子を使用すれば、修正可能である。
これらの突然変異を、少数アレルの頻度、登録者数、それらの解釈において矛盾した登録者がいるか否か、および突然変異が有識者によって検閲されたか否かを使用して、臨床上有意性のある4つのクラスに分類した。
63,496のSpCas9に適合性のある突然変異のうち:
●4,627の突然変異は、最も有意なレベル(4)にて同定される。
●13,943の突然変異は、有意なレベル3または4にて同定される。
●44,385の突然変異は、有意なレベル2、3または4にて同定される。
提供された配列表は、ユニークな突然変異につき単一のPEgRNAを一覧表にしており、これはニックと編集との間の間隔が最短のPEgRNAとして選択されたものである。13の相同アーム長および13のプライマー結合部位長をもつPEgRNAをデザインした。ニック部位が編集まで20ntより遠いスペーサーは無視した。使用されたgRNA主鎖配列は、GTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(配列番号1361579)であった。使用されたターミネータ配列は、TTTTTTGTTTT(配列番号1361581)であった。
配列表は、例2に従って決定されたPEgRNAの各々の説明を包含する。合計で、例2は、133515の例示PEgRNA完全配列の配列を決定する。これら配列の各々は配列表中に提示/包含され、配列番号1～135514として同定される。加えて、および他のどこかに記載のとおり、PEgRNAは各々、スペーサー(配列番号135515～271028)および伸長アーム(配列番号271029～406542)から構成される。加えて、各PEgRNAは、例えば、配列番号1361579～1361580によって定義されるとおりの、gRNAコアを含む。配列番号271029～406542の伸長アームは各々さらに、プライマー結合部位(配列番号406543～542056)、編集鋳型(配列番号542057～677570)、および相同アーム(配列番号677571～813084)から構成される。PEgRNAは任意に、5'末修飾領域(配列番号EE-EE)および/または3'末修飾領域(配列番号FF-FF)を含んでいてもよい。PEgRNAはまた、PEgRNAの3'にて逆転写終止シグナル(例として、配列番号1361560～1361565)も含んでいてもよい。
配列表に提供される各全長PEgRNA配列(配列番号1～135514)について、配列表は、5つの(5)対応する部分配列(subsequences)一式を包含する:つまり、(1)スペーサー、(2)伸長アーム、(3)プライマー結合部位、(4)編集鋳型、および(5)相同アーム。いずれの所定PEgRNA全長配列のための部分配列一式は、以下の数学演算によって決定されてもよい。
配列表中の各PEgRNA配列(例として、配列番号1)について、配列表中の以下の配列は、対応する部分配列一式を構成する:以下のとおり、(1)スペーサー、(2)伸長アーム、(3)プライマー結合部位、(4)編集鋳型、および(5)相同アーム:
スペーサー:所定の各PEgRNA配列について、対応するスペーサー配列は、係数135514へ足されるPEgRNA配列識別子の数字(例として、配列番号1には数字「1」)として同定される。例えば、配列番号1のPEgRNAに対応するスペーサーは、配列番号135515である。
伸長アーム:所定の各PEgRNA配列について、対応する伸長アームは、係数271028(135514×2)へ足されるPEgRNA配列識別子の数字(例として、配列番号1には数字「1」)として同定される。例えば、配列番号1のPEgRNAに対応する伸長アームは、配列番号271029である。
プライマー結合部位:所定の各PEgRNA配列について、対応するプライマー結合部位は、係数406542(135514×3)へ足されるPEgRNA配列識別子の数字(例として、配列番号1には数字「1」)として同定される。例えば、配列番号1のPEgRNAに対応するプライマー結合部位は、配列番号406542である。
編集鋳型:所定の各PEgRNA配列について、対応する編集鋳型は、係数542056(135514×4)へ足されるPEgRNA配列識別子の数字(例として、配列番号1には数字「1」)として同定される。例えば、配列番号1のPEgRNAに対応する編集鋳型は、配列番号542057である。
相同アーム:所定の各PEgRNA配列について、対応する相同アームは、係数677570(135514×5)へ足されるPEgRNA配列識別子の数字(例として、配列番号1には数字「1」)として同定される。例えば、配列番号1のPEgRNAに対応する編集鋳型は、配列番号677571である。
配列表に提供される配列の総数は813084である。合計135514のPEgRNA完全配列(各々、少なくとも、スペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含む)がある。上のとおりに定義される各一式に、同数の(1)スペーサー、(2)伸長アーム、(3)プライマー結合部位、(4)編集鋳型、および(5)相同アームがある。
他のPEgRNA配列の組(すなわち、いずれの所定のPEgRNAおよび対応するスペーサー、伸長アーム、プライマー結合部位、編集鋳型、ならびに相同アームを含む)の例は、以下の表中に提示される:
Figure 2022531539000090
提供されるPEgRNAデザインのバリエーションは、これまでに考察されたすべてのバリエーションを包含し、gRNA主鎖配列、プライマー結合部位長さ、フラップ長さ等々を変動することも包含する。
参考文献(例2について)
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例3．プライム編集のためのPEGRNAのデザインおよび改変
概要
本明細書に記載されるのは、プライム編集(PE)効率を改善し得る一連のPEgRNAデザインおよびストラテジーである。
背景
プライム編集(PE)は、プライム編集因子ガイドRNA(PEgRNA)内にコードされた情報を使用して、標的にされた遺伝子座内の定義されたDNA配列を置き換え得、挿入し得、または除去し得るゲノム編集技術である。プライム編集因子(PE)は、逆転写酵素(RT)酵素と融合したヌクレアーゼ活性(Cas9)をもつ配列-プログラム型DNA結合タンパク質からなる。PEはPEgRNAと複合体を形成するが、前記複合体は、それらのスペーサー配列内に標的化特定DNA遺伝子座のための情報、ならびに標準のsgRNA骨格中へ備えられた改変伸長中に所望の編集を特定する情報を含有する。PE:PEgRNA複合体は、プログラムされた標的DNA遺伝子座に結合しニックを入れるが、これによってニックが入れられたDNA鎖の、PEgRNAの改変プライマー結合配列(PBS)とのハイブリダイゼーションが可能になる。次いで、逆転写酵素ドメインは、ニックが入れられたゲノムDNAをDNA重合のためのプライマーとして使用して、PEgRNAのRT鋳型部分内の編集コード情報をコピーする。これに続くDNA修復プロセスは、新しく合成された編集済DNA鎖をゲノム遺伝子座中へ組み込む。プライム編集の多用途性は、研究ツールおよび潜在的な治療薬として前途有望ではあるものの、効率および範囲における数種の限界が、編集に要される多段階プロセスに起因して存在する。例えば、PEgRNA内に形成される好ましくないRNA構造は、PEgRNAからゲノム遺伝子座へのDNA編集のコピーを阻害し得る。PE技術を改善する潜在的な1つのやり方は、不可欠なPEgRNA構成要素の再デザインおよび改変を介する。これらPEgRNAのデザインへの改善は、改善されたPE効率に必要とされそうであって、挿入されるより長い配列のゲノム中への組み入れを可能にさせそうである。
記載
本明細書に記載されるのは、PEの有効性を改善するのを思い描いた一連のPEgRNAデザインである。これらのデザインは、sgRNAの有効性および/または安定性を改善するための、これまでに公開された数多のアプローチ利点を生かし、ならびに数多の新規ストラテジーを利用する。これらの改善点は、数多の種々のカテゴリーの1以上に属し得る:i)非ポリメラーゼIII(pol III)プロモーターからの機能的PEgRNAの効率的な発現を可能にさせるデザイン(これによって厄介な配列要件もなく、より長いPEgRNAの発現が可能になるであろう);ii)コア、Cas9結合PEgRNA骨格への改善点(これによって有効性が改善され得る);iii)RT処理能力(processivity)を改善する、PEgRNAへの修飾(標的にされたゲノム遺伝子座にてより長い配列の挿入が可能になる);iv)RNAモチーフの、PEgRNAの5'末端または3'末端への付加(これによって、PEgRNA安定性が改善されるか、RT処理能力が増強されるか、PEgRNAの誤った折り畳みが防止されるか、またはゲノム編集に重要な追加の因子が動員される)。本明細書に記載されるのは、各カテゴリーにおける数多の潜在的なかかるPEgRNAデザインである。これらのデザインの数種は、Cas9をもつsgRNA活性を改善するためにこれまでにも記載されており、それ自体示されている。また本明細書に記載されるのには、PEgRNA骨格の洗練化(polishing)を可能にさせてPE活性(v)を増強させる、所定の配列標的のためのPEgRNAの進化のためのプラットホームもある。注目すべきことに、これらのデザインはまた、いずれのCas9またはその進化バリアントによって認識されるPEgRNAを改善するのにも容易に適用され得る。
(i)非pol IIIプロモーターからのPEgRNAの発現
sgRNAは、典型的には、U6 snRNAプロモーターから発現される。このプロモーターは、pol IIIを動員して関連RNAを発現するものであって、核内に保持される短いRNAの発現に有用である。しかしながら、pol IIIは、処理能力がそれほど高くなく、効率的なゲノム編集に要されるレベルにて長さが数百ヌクレオチドより長いRNAを発現することができない183。加えて、pol IIIは、伸展したUにて失速または終止し、PEgRNAを使用して挿入され得る配列多様性を潜在的に限定し得る。ポリメラーゼII(pCMVなど)またはポリメラーゼI(U1 snRNAプロモーターなど)を動員する他のプロモーターも、それらのより長いsgRNAの発現能について調べられている183。しかしながら、これらのプロモーターは、典型的には、部分的に転写され、これによって、発現されたPEgRNA中スペーサーの5'に余分な配列がもたらされ、このことは部位依存的なやり方で著しく低減されたCas9:sgRNA活性をもたらすことが示されている。加えて、pol III転写のPEgRNAは、6～7つ伸びたUにおいて簡単に終止し得るのに対し、pol IIまたはpol Iから転写されたPEgRNAは、異なる終止シグナルを要するであろう。しばしば、かかるシグナルはまた、ポリアデニル化ももたらし、これによってPEgRNAの核からの望ましくない輸送がもたらされるであろう。同様に、pol IIプロモーター(pCMVなど)から発現されるRNAは、典型的には、5'にキャップされており、それらの核外輸送もまたもたらされる。
これまでに、Rinnおよび共同研究者らは、長鎖非コーディングRNA(lncRNA)でタグ付けされたsgRNAの産生のための様々な発現プラットホームをスクリーニングした183。これらのプラットホームは、pCMVから発現され、ヒトのMALAT1 ncRNAからのENE要素184、KSHVからのPAN ENE要素185、またはU1 snRNAからの3'ボックス186において終止するRNAを包含する。注目すべきことに、MALAT1 ncRNAおよびPAN ENEは、ポリAテールを保護する三重ヘリックスを形成する184,187。これらの構築物はまた、RNAの発現を可能にさせることに加え、RNA安定性をも増強し得ることが予想される(セクションivを参照)。U1 snRNAからのプロモーターを使用すると、これらのより長いsgRNAの発現が可能になることもまた183、探索した。これらの発現系はまた、より長いPEgRNAの発現も可能にさせるであろうことが予想される。加えて、一連の方法は、PEgRNAの一部として転写されるであろうpol IIプロモーターの部分の切断のためにデザインされており、自己切断型リボザイム(ハンマーヘッド188、ピストル189、ハチェット189、ヘアピン190、VS191、ツイスター192、もしくはツイスターシスター192リボザイムなど)、または転写されたガイドを処理する他の自己切断型要素、またはCsy4によって認識されまたガイドのプロセシングへも繋がるヘアピン193のいずれかが付加されている。また、複数のENEモチーフの組み込みは、これまでKSHV PAN RNAおよび要素について実証されたとおり185、改善されたPEgRNA発現および安定性へ繋がり得ることも仮定される。PEgRNAを環状イントロンRNA(ciRNA)の形態に環化することはまた、増強されたRNAの発現および安定性、ならびに核局在化へも繋がり得ることもまた、予想される194。
配列:
pCMV、Csy4ヘアピン、PEgRNA、およびMALAT1 ENEからなるPEgRNA発現プラットホーム
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTAGGGTCATGAAGGTTTTTCTTTTCCTGAGAAAACAACACGTATTGTTTTCTCAGGTTTTGCTTTTTGGCCTTTTTCTAGCTTAAAAAAAAAAAAAGCAAAAGATGCTGGTGGTTGGCACTCCTGGTTTCCAGGACGGGGTTCAAATCCCTGCGGCGTCTTTGCTTTGACT(配列番号1361567)
pCMV、Csy4ヘアピン、PEgRNA、およびPAN ENEからなるPEgRNA発現プラットホーム
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(配列番号1361568)
pCMV、Csy4ヘアピン、PEgRNA、および3×PAN ENEからなるPEgRNA発現プラットホーム
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACACACTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCTCTCTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(配列番号1361569)
pCMV、Csy4ヘアピン、PEgRNA、および3'ボックスからなるPEgRNA発現プラットホーム
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTGTTTCAAAAGTAGACTGTACGCTAAGGGTCATATCTTTTTTTGTTTGGTTTGTGTCTTGGTTGGCGTCTTAAA(配列番号1361570)
pU1、Csy4ヘアピン、PEgRNA、および3'ボックスからなるPEgRNA発現プラットホーム
CTAAGGACCAGCTTCTTTGGGAGAGAACAGACGCAGGGGCGGGAGGGAAAAAGGGAGAGGCAGACGTCACTTCCCCTTGGCGGCTCTGGCAGCAGATTGGTCGGTTGAGTGGCAGAAAGGCAGACGGGGACTGGGCAAGGCACTGTCGGTGACATCACGGACAGGGCGACTTCTATGTAGATGAGGCAGCGCAGAGGCTGCTGCTTCGCCACTTGCTGCTTCACCACGAAGGAGTTCCCGTGCCCTGGGAGCGGGTTCAGGACCGCTGATCGGAAGTGAGAATCCCAGCTGTGTGTCAGGGCTGGAAAGGGCTCGGGAGTGCGCGGGGCAAGTGACCGTGTGTGTAAAGAGTGAGGCGTATGAGGCTGTGTCGGGGCAGAGGCCCAAGATCTCAGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTCAGCAAGTTCAGAGAAATCTGAACTTGCTGGATTTTTGGAGCAGGGAGATGGAATAGGAGCTTGCTCCGTCCACTCCACGCATCGACCTGGTATTGCAGTACCTCCAGGAACGGTGCACCCACTTTCTGGAGTTTCAAAAGTAGACTGTACGCTAAGGGTCATATCTTTTTTTGTTTGGTTTGTGTCTTGGTTGGCGTCTTAAA(配列番号1361571)
(ii)PEgRNA骨格に対する改善
コア、Cas9結合PEgRNA骨格はおそらく、PE活性を増強するのにも改善され得る。数種のかかるアプローチは既に実証されている。実例として、骨格の第1の対形成要素(P1)は、GTTTT-AAAAC対形成要素を含有する。かかるT(複数)の伸びは、RNA転写産物のpol III休止(pausing)および未成熟終止をもたらすことが示されている。このP1の部分におけるT-A対の1つの、G-C対への合理的な突然変異は、sgRNA活性を増強するのが示されたが、このアプローチもまたPEgRNAに対して実現可能であろうことを示唆する195。加えて、P1の長さを増大することはまた、sgRNAの折り畳みを増強して改善された活性へ繋がることも示されたが195、これはPEgRNA活性の改善のための別の道として示唆される。最終的に、所定DNA標的上のPEgRNAの指向進化を通じたPEgRNA骨格の洗練化がまた、改善された活性ももたらす可能性がある。これはセクション(v)に記載される。
配列:
P1まで6ntの伸長を含有するPEgRNA
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGCTCATGAAAATGAGCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTTTT(配列番号1361572)
P1内にT-A→G-C突然変異を含有するPEgRNA
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTGAGAGCTAGAAATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTTTT(配列番号1361573)
(iii)PEgRNAの鋳型領域への修飾を介したRT処理能力の改善
PEgRNAによって鋳型にされた(templated)挿入のサイズが増大するにつれて、エンドヌクレアーゼによって分解されるか、自発的加水分解を経るか、または折り畳まれることで2次構造(RTによって逆転写され得ないか、もしくはPEgRNA骨格の折り畳みおよびこれに続くCas9-RT結合を妨害する)になるか、になる可能性が高い。結果的に、PEgRNAの鋳型への修飾が、遺伝子全体の挿入などの大きな挿入に影響を及ぼす必要もあり得る。そうするためのいくつかのストラテジーは、合成または半合成PEgRNA内の修飾ヌクレオチドの組み込み(RNAを、分解もしくは加水分解に対してより耐性があるようにさせるか、または阻害性の2次構造を採用する可能性を低くさせる)を包含する196。かかる修飾は、Gリッチ配列中のRNA2次構造を低減するであろう、8-アザ-7-デアザグアノシン;分解を低減してある種のRNA2次構造を増強する、ロックド核酸(LNA);RNA安定性を増強する、2'-O-メチル修飾、2'-フルオロ修飾、または2'-O-メトキシエトキシ修飾を包含し得る。かかる修飾はまた、安定性および活性を増強するために、PEgRNA中の他のどこかにも包含され得る。代わりに、または加えて、PEgRNAの鋳型は、所望のタンパク質産物をコードするのとともに、RTによって折り畳まれ得ない単純な2次構造を採用する可能性もまた高くなるように、デザインされ得る。かかる単純な構造は、熱力学的な流し台(sink)として作用するであろうが、これによって逆転写を防止するであろうより複雑な構造が生じる可能性が低くなる。最終的に、鋳型を分裂させて2つ別々のPEgRNAにすることもまたあり得ることである。かかるデザインにおいて、PEは、Cas9と融合したRNA結合タンパク質またはPEgRNA自身上のRNA認識要素(MS2アプタマーなど)を介して、転写を開始すること、また別々の鋳型RNAを標的にされた部位へ動員することにも使用されるであろう。RTは、この別々の鋳型RNAへ直接結合するか、または第2鋳型と入れ替える前に元のPEgRNA上で逆転写を開始するか、のいずれかであり得る。かかるアプローチは、長い鋳型を付加した際にPEgRNAの誤った折り畳みを予防することのみならず、長い挿入を生じさせるのにゲノムからのCas9の解離(おそらくPEベースの長い挿入を阻害している可能性がある)を要さないことによってもまた、長い挿入を可能にさせ得る。
(iv)追加のRNAモチーフの5'末端または3'末端での組み入れ
PEgRNAデザインはまた、追加のモチーフの、RNAの末端のいずれかの末での組み入れを介しても改善され得る。数種のかかるモチーフ－KSHVからのPAN ENEおよびMALAT1からのENEなどを、非pol IIIプロモーターからのより長いPEgRNAの発現を終止させ得る手段として、前にパート(i)において考察した184,185。これらの要素は、ポリAテールを飲み込むRNA三重ヘリックスを形成し、それらの核内への保持をもたらす184,187。しかしながら、末端ヌクレオチドを塞ぐ複合体構造をPEgRNAの3'末端にて形成することによって、これらの構造はまた、PEgRNAのエキソヌクレアーゼ媒介分解を予防するのにも役立つ可能性があろう。3'末端にて挿入された他の構造要素もまた、非pol IIIプロモーターからの終止を可能にさせることはせずとも、RNA安定性を増強し得る。かかるモチーフは、3'末端を塞ぐであろうヘアピンもしくはRNA四重鎖197、または3'末端にて2'-3'-環状ホスファートの形成をもたらし、また潜在的にPEgRNAをエキソヌクレアーゼによって分解される可能性を低くもさせるHDVなどの自己切断型リボザイム198を包含し得る。不完全なスプライシングを介してPEgRNAを環化するのに誘導する－ciRNAを形成する－ことはまた、PEgRNA安定性を増大させてPEgRNAが核内に保持されることももたらし得る194。
追加のRNAモチーフはまた、RT処理能力をも改善し得るか、またはDNA-RNA二重鎖へのRTの結合を増強することによってPEgRNA活性をも増強し得る。RTによって結合される自生配列の、その同族のレトロウイルスゲノム中での付加は、RT活性を増強し得る199。これは、レトロウイルスゲノム二量体化および転写開始に関与する、自生プライマー結合部位(PBS)、ポリプリントラクト(PPT)、またはキッシングループを包含し得る199。二量体化チーフ－キッシングループまたはGNRAテトラループ/テトラループ受容体対200など－の、PEgRNAの5'末端および3'末端での付加はまた、PEgRNAの有効な環状化をももたらし得、安定性が改善される。加えて、これらモチーフの付加は、PEgRNAスペーサーとプライマーとの物理的な分離、PE活性の妨げになるであろうスペーサー閉塞への予防を可能にさせ得ることが想像される。スペーサー領域中に小さいトウホールド(toehold)ヘアピンを形成する、PEgRNAへの短い5'伸長はまた、好ましくは、PEgRNA結合スペーサーのアニーリング領域に対しても競合し得る。最終的に、キッシングループはまた、他の鋳型RNAをゲノム部位へ動員するのにも、あるRNAから他のセクションiii)のRT活性の入れ替えを可能にさせるのにも、使用され得る。
配列
PEgRNA-HDV融合体
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGACTTTTTTT(配列番号1361574)
PEgRNA-MMLVキッシングループ
GGTGGGAGACGTCCCACCGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTGGTGGGAGACGTCCCACCTTTTTTT(配列番号1361575)
PEgRNA-VSリボザイムキッシングループ
GAGCAGCATGGCGTCGCTGCTCACGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTCCATCAGTTGACACCCTGAGGTTTTTTT(配列番号1361576)
PEgRNA-GNRAテトラループ/テトラループ受容体
GCAGACCTAAGTGGUGACATATGGTCTGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAUACGTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTUACGAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTGCATGCGATTAGAAATAATCGCATGTTTTTTT(配列番号1361577)
2次RNA-HDV融合体を切り替える(switching)PEgRNA鋳型
TCTGCCATCAAAGCTGCGACCGTGCTCAGTCTGGTGGGAGACGTCCCACCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGACTTTTTTT(配列番号1361578)
(v)PEgRNAの進化
PEgRNA骨格は、SpCas9および塩基編集因子の改善のされ方に類似した様式で、指向進化を介してさらに改善され得る。指向進化は、Cas9または進化したCas9バリアントによるPEgRNA認識を増強し得る。加えて、種々のPEgRNA骨格配列はおそらく、種々のゲノム遺伝子座にて最適であって、問題になっている部位にてPE活性を増強するか、オフターゲット活性を低減するか、またはその両方のいずれかであろう。最終的に、他のRNAモチーフが付加されたPEgRNA骨格の進化は、未進化の融合RNAと比べて、融合されたPEgRNAの活性をほぼ必ず改善するであろう。実例として、c-ジ-GMP-Iアプタマーおよびハンマーヘッド型リボザイムから構成されるアロステリックリボザイムの進化は、劇的に改善された活性へ繋がったが202、これは進化がハンマーヘッド-PEgRNA融合体の活性も改善するであろうことを示唆する。加えて、目下Cas9は一般にsgRNAの5'伸長の耐性がないものの、指向進化は、この不耐性を和らげることを可能にする突然変異を生成し、追加のRNAモチーフが利用され得るようになる可能性があろう。
競合アプローチ
本明細書に記載のとおり、数多のこれらアプローチは既に、Cas9:sgRNA複合体との使用のために記載されているが、PEgRNA活性を改善するためのデザインは報告されていない。プログラム可能な突然変異をゲノム中へ組み入れるための他のストラテジーも、塩基編集、相同組み換え修復(HDR)、正確なマイクロ相同媒介末端結合(MMEJ)、またはトランスポサーゼ媒介編集を包含する。しかしながら、これらアプローチのすべてが、PEと比較すると著しい難点を有する。最新の塩基編集因子は、現行のPEより効率的ではあるが、あるクラスのゲノム突然変異しか組み入れられず、着目部位にて、望ましくない追加のヌクレオチド変換をもたらし得る。HDRは、極少数の細胞型にしか実現可能でなく、比較的高比率のランダムな挿入および欠失の突然変異(インデル)をもたらす。正確なMMEJは、二本鎖破壊の予測可能な修復へ繋がり得るが、欠失の組み入れに大きく限定されており、極めて部位依存性であって、また比較的高比率の望ましくないインデルも有し得る。トランスポサーゼ媒介編集は、今日まで、細菌において機能することしか示されていない。してみると、PEへの改善点は、ゲノム突然変異の広範な見本の治療的修正へのおそらく最良の道を表す。
例4．プライマー結合部位(PBS)中の3'トウループの組み込みはPEgRNA活性を改善する
さらにPE活性を改善するために、本発明者らは、3'伸長アームを有するPEgRNAの3'末にてトウループ配列を付加することを企図した。図37Aは、3'伸長アームを有する全体的な(generic)SpCas9 PEgRNAの例(上の分子)を提供する。次に、3'伸長アームは、RT鋳型(これは、その所望の編集を包含する)および分子の3'末にてプライマー結合部位(PBS)を含む。分子は、3つのU核酸塩基を含むポリ(U)配列(すなわち、5'-UUU-3')で終止する。
これに反して、図37Aの下部は、図37Aの上部と同じPEgRNA分子を示すが、ここで5'-GAAANNNNN-3'の9核酸塩基配列は、プライマー結合部位の3'末と末端ポリ(U)配列の5'末との間に挿入されている。この構造は、自身を180?まで後方へ折り畳み「トウループ」RNA構造を形成するが、ここで9核酸塩基挿入の5'-NNNNN-3'の配列はプライマー結合部位中の相補的な配列とアニールし、5'-GAAA-3'部分は180?のひねり(turn)を形成する。図37Aに描かれるトウループ配列の特色は、その場所において使用され得るトウループの範囲を限定も制限もする意図はない。さらに、トウループの配列は、プライマー結合部位の相補的な配列に依存するであろう。とは言え、本質的にはトウループ配列は、様々な態様において、180?を形成する第1配列部分、およびプライマー結合部位の部分に相補的な配列を有する第2配列部分を有していてもよい。
理論によって拘泥されないが、トウループ配列は、別様には可能性が十二分にあるものより(than would otherwise be possible)、プライマー結合部位が益々長くなるPEgRNAの使用をPEgRNAに可能にさせると考えられる。次に、より長いPBS配列は、PE活性を改善すると考えられる。PEgRNAのより具体的には、トウループのあり得る機能は、PBSを塞ぐか、または少なくともスペーサーと相互作用するPBSを最小化することである。PBSとスペーサーとの間の安定したヘアピン形成は、不活性なPEgRNAへ繋がり得る。トウループがないと、この相互作用は、PBSの長さ制限を要することになり得る。3'末トウループを使用してスペーサーとPBSとの間の相互作用を遮断または最小化することは、PE活性の改善へ繋がることもある。
図37Bは例4の結果を示すが、これは、インデル形成のパーセントは大きく変化しないが、HEK細胞またはEMX細胞中のプライム編集の効率が、トウループ要素を含有するPEgRNAを使用して増大することを実証する。
態様
以下の態様は本開示の範囲内にある。しかも、本開示は、列挙された態様の1以上からの1以上の限定、要素、節、および記述用語(descriptive terms)が、本セクション中に列挙された別の態様中へ導入される、すべてのバリエーション、組み合わせ、および順列を包括する。例えば、列挙された別の態様に従属する、列挙されたいずれの態様も、同じ基本態様に従属する、本セクション中に列挙されたいずれか他の態様中に見出される1以上の限定を包含するように修飾され得る。要素が、例として、マーカッシュ群形式において列挙されたものとして提示されている場合、要素の各下位群もまた開示されており、いずれの要素(単数または複数)も群から除去され得る。一般に、本開示、または本開示の側面が、具体的な要素および/または特色を含むものとして見なされる場合、本発明のある態様または本発明の側面は、かかる要素および/または特色からなるか、あるいは実質的にそれらからなると理解されるはずである。用語「含むこと(comprising)」および「含有すること(containing)」が、オープンであることを意図し、追加の要素またはステップの包含を容認することにもまた留意する。範囲が与えられるとき、エンドポイントも包含される。しかも、別段の指示がないか、またはそれとは別に、文脈および当業者の理解から明らかでない場合に限り、範囲として表現された値は、いずれか具体的な値、または本発明の異なる態様において述べられた範囲内の部分範囲を、文脈が明確に別段の指図をしない限り範囲の下限の単位の10倍まで、想定し得る。
1．スペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含むガイドRNAであって、ガイドRNAは、配列番号1～135514からなる群から選択される配列、または配列番号1～135514のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有する配列を含む、前記ガイドRNA。
2．スペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含むガイドRNAであって、スペーサーは、配列番号135515～271028からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または配列番号135515～271028のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するスペーサーを含む、前記ガイドRNA。
3．スペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含むガイドRNAであって、伸長アームは、配列番号271029～406542からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または配列番号271029～406542のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する伸長アームを有する、前記ガイドRNA。
4．スペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含むガイドRNAであって、伸長アームは、(i)プライマー結合部位、(ii)編集鋳型、および(iii)相同アームを含む、前記ガイドRNA。
5．スペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含むガイドRNAであって、伸長アームは、配列番号406543～542056からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するプライマー結合部位、または配列番号406543～542056のいずれかと少なくとも90％配列が同一であるヌクレオチド配列を有するプライマー結合部位を含む、前記ガイドRNA。
6．スペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含むガイドRNAであって、伸長アームは、配列番号542057～677570からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む編集鋳型、または配列番号542057～677570のいずれかと少なくとも90％同一であるヌクレオチド配列を有する編集鋳型を含む、前記ガイドRNA。
7．スペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含むガイドRNAであって、伸長アームが、配列番号677571～813084からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する相同アーム、または配列番号677571～813084のいずれかと少なくとも90％同一であるヌクレオチド配列を有する相同アームを含む、前記ガイドRNA。
8．(i)配列番号135515～271028からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するスペーサー、または配列番号135515～271028のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するスペーサー、および
(ii)配列番号271029～406542からなる群から選択される伸長アーム、または配列番号271029～406542と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する伸長アーム
を含む、ガイドRNA。
9．(i)配列番号135515～271028からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するスペーサー、または配列番号135515～271028のいずれかと少なくとも90％同一であるヌクレオチド配列を有するスペーサー、および
(ii)配列番号406543～542056からなる群から選択されるプライマー結合部位、または配列番号406543～542056のいずれかと少なくとも90％同一であるヌクレオチド配列を有するプライマー結合部位
を含む、ガイドRNA。
10．(i)配列番号135515～271028からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するスペーサー、または配列番号135515～271028のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するスペーサー、および
(ii)配列番号542057～677570からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する編集鋳型、または配列番号542057～677570のいずれかと少なくとも90％同一であるヌクレオチド配列を有する編集鋳型
を含む、ガイドRNA。
11．(i)配列番号135515～271028からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するスペーサー、または配列番号135515～271028のいずれかと少なくとも90％同一であるヌクレオチド配列を有するスペーサー、および
(ii)配列番号677571～813084からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する相同アーム、または配列番号677571～813084のいずれかと少なくとも90％同一であるヌクレオチド配列を有するスペーサー
を含む、ガイドRNA。
12．配列番号813086の終止シグナル、または配列番号813086と少なくとも90％の配列同一性を有する終止シグナルをさらに含む、態様1～11のいずれかに記載のガイドRNA。
13．ヘアピン配列、ステム/ループ配列、またはトウループ配列を含む5'末修飾領域をさらに含む、態様1～12のいずれかに記載のガイドRNA。
14．ヘアピン配列、ステム/ループ配列、またはトウループ配列を含む3'末修飾領域をさらに含む、態様1～13のいずれかに記載のガイドRNA。
15．配列番号813085を含むgRNAコア、または配列番号813085と少なくとも90％の配列同一性を有するgRNAコアをさらに含む、態様1～14のいずれかに記載のガイドRNA。
16．ガイドRNAは、プライム編集に好適なnapDNAbpへ結合すること、およびnapDNAbpを標的DNA配列へ向かわせることが可能である、態様1～15のいずれかに記載のガイドRNA。
17．標的核酸配列は、標的鎖(またはPAM鎖)および相補的な非標的鎖(または非PAM鎖)を含み、ガイドRNAのスペーサーが、相補的な非標的鎖(非PAM鎖)とハイブリダイズすることでRNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する、態様16に記載のガイドRNA。
18．プライマー結合部位は、長さがおよそ8ヌクレオチドと、およそ20ヌクレオチドとの間である、態様1～17のいずれかに記載のガイドRNA。
19．プライマー結合部位は、長さが8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチドである、態様1～18のいずれかに記載のガイドRNA。
20．プライマー結合部位は、長さが少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、または少なくとも20ヌクレオチドである、上の態様のいずれかに記載のガイドRNA。
21．相同アームは、標的DNAの鎖に相補的である、態様1～20のいずれかに記載のガイドRNA。
22．伸長アームは、長さがおよそ7ヌクレオチドと、およそ500ヌクレオチドとの間である、態様1～10のいずれかに記載のガイドRNA。
23．伸長アームは、長さが少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも26ヌクレオチド、少なくとも27ヌクレオチド、少なくとも28ヌクレオチド、少なくとも29ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも31ヌクレオチド、少なくとも32ヌクレオチド、少なくとも33ヌクレオチド、少なくとも34ヌクレオチド、少なくとも35ヌクレオチド、少なくとも36ヌクレオチド、少なくとも37ヌクレオチド、少なくとも38ヌクレオチド、少なくとも39ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、または少なくとも100ヌクレオチドである、上の態様のいずれかに記載のガイドRNA。
24．編集鋳型は、長さが少なくとも1ヌクレオチド、少なくとも2ヌクレオチド、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも26ヌクレオチド、少なくとも27ヌクレオチド、少なくとも28ヌクレオチド、少なくとも29ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも31ヌクレオチド、少なくとも32ヌクレオチド、少なくとも33ヌクレオチド、少なくとも34ヌクレオチド、少なくとも35ヌクレオチド、少なくとも36ヌクレオチド、少なくとも37ヌクレオチド、少なくとも38ヌクレオチド、少なくとも39ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、または少なくとも100ヌクレオチドである、上の態様のいずれかに記載のガイドRNA。
25．相同アームは、少なくとも1ヌクレオチド、少なくとも2ヌクレオチド、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも26ヌクレオチド、少なくとも27ヌクレオチド、少なくとも28ヌクレオチド、少なくとも29ヌクレオチド、または少なくとも30ヌクレオチドである、上の態様のいずれかに記載のガイドRNA。
26．編集鋳型および相同アームは、逆転写酵素によって、3'末を有する対応の単鎖DNAフラップの合成のための鋳型配列として使用され得、DNAフラップは、ニック部位に隣接する内生標的DNA配列の鎖に相補的であり、および単鎖DNAフラップは、編集鋳型によってコードされるヌクレオチド変化を含む、上の態様のいずれかに記載のガイドRNA。
27．単鎖DNAフラップは、ニックが入った標的DNA配列において、5'末を有する内生単鎖DNAに取って代わる、態様26に記載のガイドRNA。
28．遊離5’末を有する内生単鎖DNAは、細胞によって切除される、態様26に記載のガイドRNA。
29．それによって、単鎖DNAフラップの細胞修復が、ヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、これによって所望の産物が形成される、態様27に記載のガイドRNA。
30．所望のヌクレオチド変化が、挿入である、態様28に記載のガイドRNA。
31．挿入は、長さが少なくとも1ヌクレオチド、少なくとも2ヌクレオチド、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも26ヌクレオチド、少なくとも27ヌクレオチド、少なくとも28ヌクレオチド、少なくとも29ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも31ヌクレオチド、少なくとも32ヌクレオチド、少なくとも33ヌクレオチド、少なくとも34ヌクレオチド、少なくとも35ヌクレオチド、少なくとも36ヌクレオチド、少なくとも37ヌクレオチド、少なくとも38ヌクレオチド、少なくとも39ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、または少なくとも100ヌクレオチドである、態様29に記載のガイドRNA。
32．挿入は、ポリペプチドをコードする配列である、態様29に記載のガイドRNA。
33．napDNAbp、逆転写酵素、および態様1～32に記載のガイドRNAのいずれか1つを含む、プライム編集複合体。
34．napDNAbpおよび逆転写酵素は、融合タンパク質として形成されている、態様32に記載のプライム編集複合体。
35．napDNAbpは、Cas9である、態様32に記載のプライム編集複合体。
36．Cas9は、Cas9ニッカーゼまたはそれらのバリアントからなる群から選択される、態様34に記載のプライム編集複合体。
37．Cas9は、配列番号1～135514からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、態様34に記載のプライム編集複合体。
38．融合タンパク質は、配列番号1～135514からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、態様33に記載のプライム編集複合体。
39．融合タンパク質は、napDNAbpと逆転写酵素とを結び合わせるリンカーを含む、態様33に記載のプライム編集複合体。
40．リンカーは、配列番号1～135514からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、態様38に記載のプライム編集複合体。
41．態様32～39のいずれかに記載のプライム編集複合体をコードする、1以上のポリヌクレオチド。
42．態様41に記載のポリヌクレオチドと、プライム編集複合体のガイドRNAおよび融合タンパク質の発現を推進する1以上のプロモーターとを含む、ベクター。
43．態様41に記載のベクターを含む、細胞。
44．態様32～39のいずれかに記載のプライム編集複合体を含む、細胞。
45．(i)態様1～31のいずれかに記載のガイドRNA、態様32～39のいずれかに記載のプライム編集複合体、態様40に記載のポリヌクレオチド、または態様41に記載のベクター;および(ii)薬学的に許容し得る賦形剤を含む、医薬組成物。
46．核酸配列においてヌクレオチド変化を組み入れるための方法であって、方法は、核酸配列を、融合タンパク質および態様1～31のいずれかまたは態様83～85のいずれかに記載のガイドRNAを含む複合体と接触させること(ここで融合タンパク質は、napDNAbpおよびポリメラーゼを含み、ならびにここでガイドRNAが、スペーサー、gRNAコア、および伸長アーム(ヌクレオチド変化をコードする編集鋳型を含む)を含む);これによって
(i)標的鎖(またはPAM鎖)上の二本鎖DNA配列にニックを入れ、および3'末を有する遊離の単鎖DNAを生成すること;
(ii)遊離の単鎖DNAの3'末をプライマー結合部位にてガイドRNAとハイブリダイズさせ、これによってポリメラーゼがプライムされること;
(iii)DNAの鎖を3'末から重合させ、これによってヌクレオチド変化を含む単鎖DNAフラップが生成されること;ならびに
(iv)標的鎖(またはPAM鎖)上の切断部位の下流に直接隣接する内生DNA鎖を単鎖DNAフラップに置き換え、これによって二本鎖のDNA配列において所望のヌクレオチド変化が組み入れられること
47．ヌクレオチド変化は、単一ヌクレオチドの置換、欠失、挿入、またはそれらの組み合わせである、態様46に記載の方法。
48．単一ヌクレオチドの置換が、トランジションまたはトランスバージョンである、態様46に記載の方法。
49．ヌクレオチド変化は、(1)G→T置換、(2)G→A置換、(3)G→C置換、(4)T→G置換、(5)T→A置換、(6)T→C置換、(7)C→G置換、(8)C→T置換、(9)C→A置換、(10)A→T置換、(11)A→G置換、または(12)A→C置換である、態様46に記載の方法。
50．ヌクレオチド変化は、(1)G:C塩基対→T:A塩基対、(2)G:C塩基対→A:T塩基対、(3)G:C塩基対→C:G塩基対、(4)T:A塩基対→G:C塩基対、(5)T:A塩基対→A:T塩基対、(6)T:A塩基対→C:G塩基対、(7)C:G塩基対→G:C塩基対、(8)C:G塩基対→T:A塩基対、(9)C:G塩基対→A:T塩基対、(10)A:T塩基対→T:A塩基対、(11)A:T塩基対→G:C塩基対、または(12)A:T塩基対→C:G塩基対の変換である、態様46に記載の方法。
51．ヌクレオチド変化は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、もしくは25ヌクレオチドの挿入または欠失である、態様46に記載の方法。
52．ヌクレオチド変化は、ポリペプチドコード配列の挿入である、態様46に記載の方法。
53．ヌクレオチド変化は、疾患関連遺伝子を修正する、態様46に記載の方法。
54．疾患関連遺伝子は、アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症;アルファ1アンチトリプシン欠損症;嚢胞性線維症;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ガラクトース血症;ヘモクロマトーシス;ハンチントン病;メープルシロップ尿症;マルファン症候群;1型神経線維腫症;先天性爪肥厚症;フェニルケトン尿症;重症複合免疫不全症;鎌状赤血球病;スミス・レムリ・オピッツ症候群;およびテイ・サックス病からなる群から選択される単一遺伝子障害に関連する、態様46に記載の方法。
55．疾患関連遺伝子は、心臓疾患;高血圧;アルツハイマー病;関節炎;糖尿病;がん;および肥満からなる群から選択される多遺伝子性障害に関連する、態様46に記載の方法。
56．プライム編集因子ガイドRNA(PEgRNA)構造を決定するための、コンピュータによる方法であって、方法は、少なくとも1つのコンピュータハードウェアプロセッサを使用して以下を実施することを含む:
以下を示すデータへアクセスすること:
入力アレル;
出力アレル;および
核酸プログラム型DNA結合タンパク質とポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)とを含む融合タンパク質;ならびに
入力アレル、出力アレル、および融合タンパク質に基づき、PEgRNA構造を決定すること(ここでPEgRNA構造は、入力アレルを出力アレルへ変化させる融合タンパク質と結び付けられるようにデザインされている)、ここで前記決定はPEgRNA構造について以下の特色のうち1以上を決定することを含む:
入力アレル中の標的ヌクレオチド配列に相補的なスペーサー;
融合タンパク質と相互作用するためのgRNA主鎖;および
以下のうち1以上を含む伸長:
入力アレルを出力アレルへ変化させる所望のヌクレオチド変化を含むDNA合成鋳型配列;
プライマー結合部位;
任意に、DNA合成鋳型に隣接する終止シグナル;
任意に、終止シグナルに隣接する第1修飾因子;および
任意に、プライマー結合部位に隣接する第2修飾因子。
57．スペーサーおよび伸長を決定すること、ならびにスペーサーがPEgRNA構造の5'末にあり、伸長がEgRNA構造の3'末にあることを決定することをさらに含む、態様56に記載の方法。
58．スペーサーおよび伸長を決定することをさらに含み、スペーサーはPEgRNA構造の5'末にあり、伸長はスペーサーに対して3'にある、態様56に記載の方法。
59．入力アレルおよび出力アレルを示すデータへアクセスすることは、入力アレルおよび関連出力アレルの一式を含むデータベースへアクセスすることを含む、態様56に記載の方法。
60．データベースへアクセスすることは、複数のエントリーを含むクリンバーデータベースへアクセスすることを含み、各エントリーは、入力アレル一式から入力アレルおよび出力アレル一式から出力アレルを含む、態様59に記載の方法。
61．PEgRNA構造を決定することは、一式における各入力アレルおよび関連出力アレルについて1以上のPEgRNA構造を決定することを含む、態様59に記載の方法。
62．融合タンパク質を示すデータへアクセスすることは、複数の融合タンパク質から融合タンパク質を決定することを含む、態様56に記載の方法。
63．融合タンパク質は、Cas9タンパク質を含む、態様56に記載の方法。
64．融合タンパク質は、Cas9-NGタンパク質またはSpCas9タンパク質を含む、態様63に記載の方法。
65．入力アレルを出力アレルへ変化させることは、単一ヌクレオチドの変化、1以上のヌクレオチドの挿入、1以上のヌクレオチドの欠失、またはそれらの組み合わせを含む、態様56に記載の方法。
66．スペーサーを決定することをさらに含み、スペーサーはおよそ20ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、態様56に記載の方法。
67．対応するプロトスペーサーヌクレオチド配列における変化の位置に基づきスペーサーを決定することをさらに含む、態様66に記載の方法。
68．変化は、約プロトスペーサー位置-3～プロトスペーサー位置+27の間である編集窓に組み入れられる、態様67に記載の方法。
69．初期候補プロトスペーサー一式を、入力アレルおよび融合タンパク質に基づき決定すること(ここで各初期候補プロトスペーサーは、入力アレル中に融合タンパク質のPAMを含む);初期候補プロトスペーサー一式から1以上の初期候補プロトスペーサーを決定すること(ここで各々は、不適合のニック位置を含む);一式から決定された1以上の初期候補プロトスペーサーを除去することで、残存する候補プロトスペーサー一式を生成することをさらに含み、ここでPEgRNA構造を決定することは、複数のPEgRNA構造を決定することを含み、ここでPEgRNA構造の各々は、残存する候補プロトスペーサー一式から対応のプロトスペーサーに基づき決定された異なるスペーサーを含む、態様67に記載の方法。
70．伸長およびDNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)を決定することをさらに含み、ここでDNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)は、およそ7ヌクレオチド～およそ34ヌクレオチドを含む、態様55に記載の方法。
71．PEgRNAを決定することは、入力アレルおよび/または融合タンパク質に基づき、スペーサーを決定すること;ならびにスペーサーに基づき、DNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)を決定することを含む、態様56に記載の方法。
72．DNA合成鋳型(例として、RT鋳型配列)は、ニック部位に隣接する内生DNA配列に相補的な単鎖DNAフラップをコードしており、ここで単鎖DNAフラップは、所望のヌクレオチド変化を含む、態様56に記載の方法。
73．単鎖DNAフラップは、ニック部位に隣接する内生DNA配列とハイブリダイズすることが可能であり、それによって所望のヌクレオチド変化の組み入れへ繋がる、態様72に記載の方法。
74．単鎖DNAフラップは、ニック部位に隣接する内生DNA配列に取って代わることが可能である、態様72に記載の方法。
75．それによって、単鎖DNAフラップの細胞修復は、ヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、これによって所望の産物が形成される、態様72に記載の方法。
76．融合タンパク質は、PEgRNAと複合体化されたとき、標的DNA配列へ結合することが可能である、態様56に記載の方法。
77．標的DNA配列は、変化が生じている標的鎖および相補的な非標的鎖を含む、態様76に記載の方法。
78．入力アレルは、病原性のDNA突然変異を含み、および出力アレルは、修正されたDNA配列を含む、態様56に記載の方法。
79．入力アレルは、配列番号1217353～1289387の疾患アレルのいずれか1つである、態様56に記載の方法。
80．出力アレルは、配列番号1289388～1361420の健常アレルのいずれか1つである、態様56に記載の方法。
81．少なくとも1つのプロセッサ;および少なくとも1つのコンピュータ可読記憶媒体(実行されたとき少なくとも1つのプロセッサに態様56～81のいずれかに記載の方法を実施させる、前記記憶媒体にコードされる指示を有する)を含む、系。
82．少なくとも1つのコンピュータ可読記憶媒体であって、実行されたとき少なくとも1つのプロセッサに態様56～81のいずれかに記載の方法を実施させる、前記記憶媒体にコードされる指示を有する、前記記憶媒体。
83．態様56～81のいずれかに記載の方法に従って決定されたPEgRNA構造を使用する塩基編集の方法。
84．態様56～81のいずれか1つに記載の方法に従って決定された、PEgRNA。
85．標的DNA配列にて疾患アレルを修正することで健常アレルを形成するプライム編集における使用のためのガイドRNAであって、該ガイドは、スペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含み、ここでスペーサーは、配列番号1217353～1289387またはその相補鎖の内、～20ヌクレオチド領域へ結合することが可能である、前記ガイドRNA。
86．スペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含むガイドRNAであって、伸長アームは、プライム編集を行うのに有効なDNA合成鋳型およびプライマー結合部位を含む、前記ガイドRNA。
87．配列番号1217353～1289387のヌクレオチド配列のいずれかにおける編集部位は、5'→3'配向における位置201にて始まる、態様85に記載のガイドRNA。
88．スペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含むプライム編集のためのガイドRNAであって、伸長アームは、プライマー結合部位およびDNA合成鋳型を含む、前記ガイドRNA。
89．プライマー結合部位は、配列番号406543～542056からなる群から選択されるヌクレオチド配列(プライマー結合部位)、または配列番号406543～542056のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する、態様88に記載のガイドRNA。
90．DNA合成鋳型は、配列番号542057～677570のヌクレオチド配列(編集鋳型)、または配列番号542057～677570のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、態様88に記載のガイドRNA。
91．DNA合成鋳型は、配列番号677571～813084のヌクレオチド配列(相同アーム)、または配列番号677571～813084のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、態様88に記載のガイドRNA。
92．DNA合成鋳型は、編集鋳型および相同アームを含み、編集鋳型が、配列番号542057～677570のヌクレオチド配列を含み、および相同アームが、配列番号677571～813084のヌクレオチド配列を含む、態様88に記載のガイドRNA。
93．配列番号813086の終止シグナル、または配列番号813086と少なくとも90％の配列同一性を有する終止シグナルをさらに含む、態様86～92のいずれかに記載のガイドRNA。
94．ヘアピン配列、ステム/ループ配列、またはトウループ配列を含む5'末修飾領域をさらに含む、態様86～93のいずれか一項に記載のガイドRNA。
95．ヘアピン配列、ステム/ループ配列、またはトウループ配列を含む3'末修飾領域をさらに含む、態様86～94のいずれかに記載のガイドRNA。
96．配列番号813085を含むgRNAコア、または配列番号813085と少なくとも90％の配列同一性を有するgRNAコアをさらに含む、態様86～95のいずれかに記載のガイドRNA。
97．ガイドRNAは、プライム編集に好適なnapDNAbpへ結合すること、およびnapDNAbpを標的DNA配列へ向かわせることが可能である、態様86～96のいずれかに記載のガイドRNA。
98．標的核酸配列は、標的鎖(またはPAMもしくは編集鎖)および相補的な非標的鎖(または非PAMもしくは非編集鎖)を含み、ガイドRNAのスペーサーは、非PAM鎖とハイブリダイズすることでRNA-DNAハイブリッドおよびRループが形成される、態様97に記載のガイドRNA。
99．プライマー結合部位は、長さがおよそ8クレオチドと、およそ20ヌクレオチドとの間である、態様86～98のいずれかに記載のガイドRNA。
100．プライマー結合部位は、長さが8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチドである、態様86～99のいずれかに記載のガイドRNA。
101．伸長アームは、長さが少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも26ヌクレオチド、少なくとも27ヌクレオチド、少なくとも28ヌクレオチド、少なくとも29ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも31ヌクレオチド、少なくとも32ヌクレオチド、少なくとも33ヌクレオチド、少なくとも34ヌクレオチド、少なくとも35ヌクレオチド、少なくとも36ヌクレオチド、少なくとも37ヌクレオチド、少なくとも38ヌクレオチド、少なくとも39ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチドである、態様86～100のいずれかに記載のガイドRNA。
102．プライマー結合部位は、長さが少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、または少なくとも20ヌクレオチドである、態様86～101のいずれかに記載のガイドRNA。
103．DNA合成鋳型が、長さが少なくとも1ヌクレオチド、少なくとも2ヌクレオチド、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも26ヌクレオチド、少なくとも27ヌクレオチド、少なくとも28ヌクレオチド、少なくとも29ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも31ヌクレオチド、少なくとも32ヌクレオチド、少なくとも33ヌクレオチド、少なくとも34ヌクレオチド、少なくとも35ヌクレオチド、少なくとも36ヌクレオチド、少なくとも37ヌクレオチド、少なくとも38ヌクレオチド、少なくとも39ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチドである、態様86～102のいずれかに記載のガイドRNA。
104．DNA合成鋳型は、RNA依存性DNAポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)によって、3'末を有する対応の単鎖DNAフラップの合成のための鋳型として使用され得、DNAフラップは、ニック部位に隣接する内生標的DNA配列の鎖に相補的であり、および単鎖DNAフラップは、DNA合成鋳型によってコードされる所望のヌクレオチド変化を含む、態様86～103のいずれかに記載のガイドRNA。
105．単鎖DNAフラップは、ニックが入った標的DNA配列において、5'末を有する内生単鎖DNAに取って代わる、態様104に記載のガイドRNA。
106．遊離5'末を有する内生単鎖DNAは、細胞によって切除される、態様105に記載のガイドRNA。
107．それによって、単鎖DNAフラップの細胞修復は、ヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、これによって編集済DNA産物が形成される、態様105記載のガイドRNA。
108．所望のヌクレオチド変化は、挿入である、態様107に記載のガイドRNA。
109．挿入は、長さが少なくとも1ヌクレオチド、少なくとも2ヌクレオチド、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも26ヌクレオチド、少なくとも27ヌクレオチド、少なくとも28ヌクレオチド、少なくとも29ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも31ヌクレオチド、少なくとも32ヌクレオチド、少なくとも33ヌクレオチド、少なくとも34ヌクレオチド、少なくとも35ヌクレオチド、少なくとも36ヌクレオチド、少なくとも37ヌクレオチド、少なくとも38ヌクレオチド、少なくとも39ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチドである、態様108に記載のガイドRNA。
110．挿入は、ポリペプチドをコードする配列である、態様108に記載のガイドRNA。
111．napDNAbp、RNA依存性DNAポリメラーゼ、および態様86～110のいずれか1つに記載のガイドRNAのいずれか1つを含む、プライム編集複合体。
112．napDNAbpおよびRNA依存性DNAポリメラーゼは、融合タンパク質として形成されている、態様111に記載のプライム編集複合体。
113．napDNAbpは、Cas9である、態様111に記載のプライム編集複合体。
114．Cas9は、Cas9ニッカーゼまたはそのバリアントである、態様113に記載のプライム編集複合体。
115．Cas9は、配列番号1～135514からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、態様113に記載のプライム編集複合体。
116．融合タンパク質が、配列番号1～135514からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、態様112に記載のプライム編集複合体。
117．融合タンパク質は、napDNAbpとRNA依存性DNAポリメラーゼとを結び合わせるリンカーを含む、態様112に記載のプライム編集複合体。
118．リンカーは、配列番号1～135514からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、態様117に記載のプライム編集複合体。
119．態様111～118のいずれかに記載のプライム編集複合体をコードする、1以上のポリヌクレオチド。
120．態様119に記載のポリヌクレオチドと、プライム編集複合体のガイドRNAおよび融合タンパク質の発現を推進する1以上のプロモーターとを含む、ベクター。
121．態様120に記載のベクターを含む、細胞。
122．態様111～118のいずれかに記載のプライム編集複合体を含む、細胞。
123．(i)態様84～110のいずれかに記載のガイドRNA、態様111～118のいずれかに記載のプライム編集複合体、態様119に記載のポリヌクレオチド、または態様120に記載のベクター;および(ii)薬学的に許容し得る賦形剤を含む、医薬組成物。
124．核酸配列にヌクレオチド変化を組み入れるための方法であって、方法は、核酸配列を、融合タンパク質および態様109～116のいずれかに記載のガイドRNAを含む複合体と接触させること(ここで融合タンパク質は、napDNAbpおよびRNA依存性DNAポリメラーゼを含み、ここでガイドRNAは、スペーサー、gRNAコア、および伸長アーム(DNA合成鋳型およびプライマー結合部位を含み、該DNA合成鋳型はヌクレオチド変化をコードする)を含み、ならびにここでスペーサーは、利用可能なPAMおよびプロトスペーサーの近位にある非PAM鎖とアニールすることが可能である);これによって
(i)PAM鎖上の二本鎖DNA配列にニックを入れ、これによって3'末を有する遊離の単鎖DNAが生成されること;
(ii)遊離の単鎖DNAの3'末をプライマー結合部位にてガイドRNAとハイブリダイズさせ、これによってRNA依存性DNAポリメラーゼがプライムされること;
(iii)DNA合成鋳型をコードするDNAの鎖をDNAの3'末から重合させ、これによってDNAの3'末から伸長される単鎖DNAフラップが生成されること、ここでフラップが、ヌクレオチド変化を含む;
(iv)PAM鎖上の切断部位の下流に直接隣接する内生DNA鎖を単鎖DNAフラップと置き換え、これによって二本鎖のDNA配列において所望のヌクレオチド変化が組み入れられること
を含む、前記方法。
125．ステップ(v)が細胞内で完了したとき、細胞は、細胞のDNA修復および/または複製を通して非編集鎖を修復する、態様124に記載の方法。
126．ヌクレオチド変化は、単一ヌクレオチドの置換、欠失、挿入、またはそれらの組み合わせである、態様124に記載の方法。
127．単一ヌクレオチドの置換は、トランジションまたはトランスバージョンである、態様124に記載の方法。
128．単一ヌクレオチドの置換は、(1)G→T置換、(2)G→A置換、(3)G→C置換、(4)T→G置換、(5)T→A置換、(6)T→C置換、(7)C→G置換、(8)C→T置換、(9)C→A置換、(10)A→T置換、(11)A→G置換、または(12)A→C置換である、態様124に記載の方法。
129．単一ヌクレオチドの置換は、(1)G:C塩基対→T:A塩基対、(2)G:C塩基対→A:T塩基対、(3)G:C塩基対→C:G塩基対、(4)T:A塩基対→G:C塩基対、(5)T:A塩基対→A:T塩基対、(6)T:A塩基対→C:G塩基対、(7)C:G塩基対→G:C塩基対、(8)C:G塩基対→T:A塩基対、(9)C:G塩基対→A:T塩基対、(10)A:T塩基対→T:A塩基対、(11)A:T塩基対→G:C塩基対、または(12)A:T塩基対→C:G塩基対の変換である、態様124に記載の方法。
130．ヌクレオチド変化は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、もしくは25ヌクレオチドの挿入または欠失である、態様124に記載の方法。
131．ヌクレオチド変化は、ポリペプチドコード配列の挿入である、態様124に記載の方法。
132．ヌクレオチド変化は、疾患関連遺伝子を修正する、態様124に記載の方法。
133．疾患関連遺伝子は、アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症;アルファ1アンチトリプシン欠損症;嚢胞性線維症;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ガラクトース血症;ヘモクロマトーシス;ハンチントン病;メープルシロップ尿症;マルファン症候群;1型神経線維腫症;先天性爪肥厚症;フェニルケトン尿症;重症複合免疫不全症;鎌状赤血球病;スミス・レムリ・オピッツ症候群;およびテイ・サックス病からなる群から選択される単一遺伝子障害に関連する、態様132に記載の方法。
134．疾患関連遺伝子は、心臓疾患;高血圧;アルツハイマー病;関節炎;糖尿病;がん;および肥満からなる群から選択される多遺伝子性障害に関連する、態様132に記載の方法。
135．標的DNA分子のヌクレオチド配列を挿入、欠失、逆位、置換、またはそれらの組み合わせで変更させることで対応の編集済DNA分子を産生するプライム編集における使用のためのガイドRNAであって、ここで:
(i)ガイドRNAは、napDNAbpおよびRNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメインを含む融合タンパク質をもつ複合体を形成することが可能である;
(ii)ガイドRNAは、(a)標的DNA分子上PAM鎖上の利用可能なPAMおよびプロトスペーサーの近位にある非PAM鎖とアニールすることが可能なスペーサー、および(b)gRNAコアを含む;
(iii)ガイドRNAは、伸長アームをガイドRNAの5'末または3'末にてさらに含む;
(iv)伸長アームは、(a)プライマー結合部位および(b)DNA合成鋳型を含み、ここでDNA合成鋳型は、PAM鎖上の切断部位のすぐ下流に内生鎖の代わりに取り入れられる編集を包含する単鎖DNAフラップをコードする;
(v)標的DNA分子は、配列番号配列番号1217353～1289387からなる群から選択される;ならびに
(vi)対応の編集済DNA分子は、配列番号1289388～1361420からなる群から選択される、前記ガイドRNA。
136．標的DNA分子は、クリンバーバリアント配列である、態様135に記載のガイドRNA。
137．napDNAbpは、Cas9、Cas12e、Cas12d、Cas12a、Cas12b1、Cas13a、Cas12c、もしくはアルゴノート、またはCas9、Cas12e、Cas12d、Cas12a、Cas12b1、Cas13a、Cas12c、もしくはアルゴノートのバリアントである、態様135に記載のガイドRNA。
138．napDNAbpドメインは、ニッカーゼ活性を含む、態様135に記載のガイドRNA。
139．napDNAbpは、Cas9またはそのバリアントである、態様135に記載のガイドRNA。
140．napDNAbpは、ヌクレアーゼ活性Cas9、ヌクレアーゼ不活性Cas9(dCas9)、またはCas9ニッカーゼ(nCas9)である、態様135に記載のガイドRNA。
141．napDNAbpは、Cas9ニッカーゼ(nCas9)である、態様135に記載のガイドRNA。
142．napDNAbpは、アミノ酸を含む、態様135に記載のガイドRNA。
143．napDNAbpは、アミノ酸配列1361421～1361428のいずれか1つのSpCas9野生型もしくはそのバリアント、または配列番号1361421～1361428のいずれかと少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、態様135に記載のガイドRNA。
144．napDNAbpは、アミノ酸配列1361429～1361442のいずれか1つのSpCas9オルソログ、または配列番号1361429～1361442のいずれかと少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、態様135に記載のガイドRNA。
145．napDNAbpは、アミノ酸配列1361421～1361484のいずれか1つ、または配列番号1361421～1361484のいずれかと少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、態様135に記載のガイドRNA。
146．RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメインは、逆転写酵素である、態様135に記載のガイドRNA。
147．逆転写酵素は、配列番号1361485～1361496のいずれか1つのアミノ酸配列、または配列番号1361485～1361496のいずれかと少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、天然に存在する野生型逆転写酵素である、態様146に記載のガイドRNA。
148．逆転写酵素は、配列番号1361497～1361514のいずれか1つのアミノ酸配列、または配列番号1361497～1361514のいずれかと少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、逆転写酵素のバリアントである、態様146に記載のガイドRNA。
149．融合タンパク質は、配列番号1361515～1361519のいずれか1つのアミノ酸配列、または配列番号1361515～1361519のいずれかと少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様135に記載のガイドRNA。
150．融合タンパク質は、配列番号1361515(PE1)もしくは1361516(PE2)のアミノ酸配列、または配列番号1361515もしくは1361516のいずれかと少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様135に記載のガイドRNA。
151．利用可能なPAM配列は、ステップ(i)に使用されるnapDNAbpに応じる、態様135に記載のガイドRNA。
152．利用可能なPAM配列は、(a)5'-NGG-3'(標準的なPAM配列)、(b)5'-NNG-3'、(c)5'-NNA-3'、(d)5'-NNC-3'、(e)5'-NNT-3'、(f)5'-NGT-3'、(g)5'-NGA-3'、(h)5'-NGC-3'、(i)5'-NAA-3'、(j)5'-NAC-3'、(k)5'-NAG-3'、および(l)5'-NAT-3'からなる群から選択されるが、これらの選択はnapDNAbpの選択に応じる、態様135に記載のガイドRNA。
153．ステップ(v)の配列番号1217353～1289387のヌクレオチド配列のいずれかにおける編集部位は、5'→3'配向における位置201にて始まる、態様135に記載のガイドRNA。
154．ヌクレオチド変化は、ヌクレオチドの置換、欠失、挿入、またはそれらの組み合わせである、態様135に記載のガイドRNA。
155．ヌクレオチド置換は、トランジションまたはトランスバージョンである、態様135に記載のガイドRNA。
156．単一ヌクレオチドの置換は、(1)G→T置換、(2)G→A置換、(3)G→C置換、(4)T→G置換、(5)T→A置換、(6)T→C置換、(7)C→G置換、(8)C→T置換、(9)C→A置換、(10)A→T置換、(11)A→G置換、または(12)A→C置換である、態様135に記載のガイドRNA。
157．単一ヌクレオチドの置換は、(1)G:C塩基対→T:A塩基対、(2)G:C塩基対→A:T塩基対、(3)G:C塩基対→C:G塩基対、(4)T:A塩基対→G:C塩基対、(5)T:A塩基対→A:T塩基対、(6)T:A塩基対→C:G塩基対、(7)C:G塩基対→G:C塩基対、(8)C:G塩基対→T:A塩基対、(9)C:G塩基対→A:T塩基対、(10)A:T塩基対→T:A塩基対、(11)A:T塩基対→G:C塩基対、または(12)A:T塩基対→C:G塩基対の変換である、態様135に記載のガイドRNA。
158．所望のヌクレオチド変化は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、もしくは25ヌクレオチドの挿入または欠失である、態様135に記載のガイドRNA。
159．ヌクレオチド変化は、ポリペプチドコード配列の挿入である、態様135に記載のガイドRNA。
160．ヌクレオチド変化は、疾患関連遺伝子を修正する、態様135に記載のガイドRNA。
161．疾患関連遺伝子は、アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症;アルファ1アンチトリプシン欠損症;嚢胞性線維症;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ガラクトース血症;ヘモクロマトーシス;ハンチントン病;メープルシロップ尿症;マルファン症候群;1型神経線維腫症;先天性爪肥厚症;フェニルケトン尿症;重症複合免疫不全症;鎌状赤血球病;スミス・レムリ・オピッツ症候群;およびテイ・サックス病からなる群から選択される単一遺伝子障害に関連する、態様160に記載のガイドRNA。
162．疾患関連遺伝子は、心臓疾患;高血圧;アルツハイマー病;関節炎;糖尿病;がん;および肥満からなる群から選択される多遺伝子性障害に関連する、態様160に記載のガイドRNA。
163．核酸配列にヌクレオチド変化を組み入れるための方法であって、方法は、核酸配列を、融合タンパク質と態様1～32または135～162のいずれかに記載のガイドRNAとを含む複合体に接触させることを含む、前記方法。
164．融合タンパク質は、napDNAbpおよびRNA依存性DNAポリメラーゼを含む、態様163に記載の方法。
165．ガイドRNAが、スペーサーと、gRNAコアと、DNA合成鋳型およびプライマー結合部位を含む伸長アームとを含む、態様163に記載の方法。
166．DNA合成鋳型は、ヌクレオチド変化をコードする、態様165に記載の方法。
167．ガイドRNAは、プライム編集に好適なnapDNAbpへ結合すること、およびnapDNAbpを標的DNA配列へ向かわせることが可能である、態様163～166のいずれかに記載の方法。
168．標的核酸配列は、標的鎖(またはPAMもしくは編集鎖)および相補的な非標的鎖(または非PAMもしくは非編集鎖)を含み、ガイドRNAのスペーサーは、非PAM鎖とハイブリダイズすることでRNA-DNAハイブリッドおよびRループが形成される、態様167に記載の方法。
169．プライマー結合部位は、長さがおよそ8クレオチドと、およそ20ヌクレオチドとの間である、態様165に記載の方法。
170．プライマー結合部位は、長さが8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチドである、態様165に記載の方法。
171．伸長アームは、長さが少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも26ヌクレオチド、少なくとも27ヌクレオチド、少なくとも28ヌクレオチド、少なくとも29ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも31ヌクレオチド、少なくとも32ヌクレオチド、少なくとも33ヌクレオチド、少なくとも34ヌクレオチド、少なくとも35ヌクレオチド、少なくとも36ヌクレオチド、少なくとも37ヌクレオチド、少なくとも38ヌクレオチド、少なくとも39ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチドである、態様165に記載の方法。
172．プライマー結合部位は、長さが少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、または少なくとも20ヌクレオチドである、態様165に記載の方法。
173．DNA合成鋳型は、長さが少なくとも1ヌクレオチド、少なくとも2ヌクレオチド、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも26ヌクレオチド、少なくとも27ヌクレオチド、少なくとも28ヌクレオチド、少なくとも29ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも31ヌクレオチド、少なくとも32ヌクレオチド、少なくとも33ヌクレオチド、少なくとも34ヌクレオチド、少なくとも35ヌクレオチド、少なくとも36ヌクレオチド、少なくとも37ヌクレオチド、少なくとも38ヌクレオチド、少なくとも39ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチドである、態様165に記載の方法。
174．DNA合成鋳型は、RNA依存性DNAポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)によって、3'末を有する対応の単鎖DNAフラップの合成のための鋳型として使用され得、DNAフラップは、ニック部位に隣接する内生標的DNA配列の鎖に相補的であり、および単鎖DNAフラップは、DNA合成鋳型によってコードされる所望のヌクレオチド変化を含む、態様165に記載の方法。
175．単鎖DNAフラップは、ニックが入った標的DNA配列において、5'末を有する内生単鎖DNAに取って代わる、態様174に記載の方法。
176．遊離5'末を有する内生単鎖DNAは、細胞によって切除される、態様175に記載の方法。
177．それによって、単鎖DNAフラップの細胞修復は、ヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、これによって編集済DNA産物が形成される、態様175に記載の方法。
178．ヌクレオチド変化は、挿入である、態様177に記載の方法。
179．挿入は、長さが少なくとも1ヌクレオチド、少なくとも2ヌクレオチド、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも26ヌクレオチド、少なくとも27ヌクレオチド、少なくとも28ヌクレオチド、少なくとも29ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも31ヌクレオチド、少なくとも32ヌクレオチド、少なくとも33ヌクレオチド、少なくとも34ヌクレオチド、少なくとも35ヌクレオチド、少なくとも36ヌクレオチド、少なくとも37ヌクレオチド、少なくとも38ヌクレオチド、少なくとも39ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチドである、態様178に記載の方法。
180．挿入は、ポリペプチドをコードする配列である、態様178に記載の方法。
参考文献
以下の参考文献は各々、それらの全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる。
Figure 2022531539000091
Figure 2022531539000092
Figure 2022531539000093
Figure 2022531539000094
Figure 2022531539000095
均等物および範囲
クレームにおいて、「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、1または1より多いことを意味してもよいが、それと反する指示がないか、またはそれとは別に、文脈から明らかでない場合に限る。ある群の1以上のメンバー間に「または」を包含するクレームまたは記載は、その群のメンバーのうち、1つ、1つより多いか、または、すべてが、所定の生成物またはプロセスに存在するか、それに採用されるか、またはそれとは別に、それに関係があるか、を満たすと考えるが、それと反する指示がないか、またはそれとは別に、文脈から明らかでない場合に限る。本発明は、その群のうち、正確に1つのメンバーが、所定の生成物またはプロセスに存在するか、それに採用されるか、またはそれとは別に、それに関係がある態様を包含する。本発明は、その群のメンバーのうち、1つより多いかまたはすべてが、所定の生成物またはプロセスに存在するか、それに採用されるか、またはそれとは別に、それに関係がある態様を包含する。
しかも、本発明は、列挙されたクレームの1以上からの1以上の限定、要素、節、および記述用語(descriptive terms)が、別のクレーム中へ導入される、すべての変動、組み合わせ、および順列を包括する。例えば、別のクレームに従属するいずれのクレームも、同じ基本クレームに従属するいずれか他のクレーム中に見出される1以上の限定を包含するように修飾され得る。要素が、例として、マーカッシュ群形式において列挙されたものとして提示されている場合、要素の各下位群もまた開示されており、いずれの要素(単数または複数)も群から除去され得る。一般に、本発明、または本発明の側面が、特定の要素および/または特長を含むとして見なされる場合、本発明のある態様または本発明のある側面は、かかる要素および/または特長からなるか、または実質的にそれからなると理解されるべきである。簡潔さを目的として、それらの態様は、本明細書中、in haec verbaで具体的に表明されていない。用語「含むこと(comprising)」および「含有すること(containing)」が、オープンであることを意図し、追加の要素またはステップの包含を容認することにもまた留意する。範囲が与えられるとき、エンドポイントも包含される。しかも、別段の指示がないか、またはそれとは別に、文脈および当業者の理解から明らかでない場合に限り、範囲として表現された値は、いずれか具体的な値、または本発明の異なる態様において述べられた範囲内の部分範囲を、文脈が明確に別段の指図をしない限り範囲の下限の単位の10倍まで、想定し得る。
本出願は、種々の発行済み特許、公開特許出願、雑誌記事、および他の公刊物を参照し、これらのすべては参照によって本明細書に組み込まれる。組み込まれる参照のいずれかと本明細書との間に矛盾がある場合、本明細書がコントロールする(control)ものとする。加えて、先行技術に属する本発明のいずれか特定の態様は、クレームのいずれかの1以上からはっきりと除外され得る。かかる態様は当業者に知られていると思われるので、それらは、除外が本明細書においてはっきりと表明されていない場合であっても、除外され得る。本発明のいずれか特定の態様は、先行技術の存在に関するか否かにかかわらず、いずれかのクレームから、いずれかの理由で除外され得る。
当業者は、本明細書に記載の具体的な態様の多くの均等物を認識するか、またはせいぜいルーチンな実験法を使用して確かめる能力があるであろう。本明細書に記載の本態様の範囲は、上の記載に限定されることを意図せず、むしろ添付のクレームに表明されているとおりである。当業者は、以下のクレームにおいて定義されるとおり、本発明の精神または範囲から逸脱せずに、この記載への種々の変化および修飾がなされてもよいことを解するであろう。

Claims (151)

  1. スペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含むガイドRNAであって、ガイドRNAが、配列番号1～135514からなる群から選択される配列、または配列番号1～135514のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有する配列を含む、前記ガイドRNA。
  2. スペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含むガイドRNAであって、スペーサーが、配列番号135515～271028からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または配列番号135515～271028のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するスペーサーを含む、前記ガイドRNA。
  3. スペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含むガイドRNAであって、伸長アームが、配列番号271029～406542からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または配列番号271029～406542のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する伸長アームを有する、前記ガイドRNA。
  4. スペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含むガイドRNAであって、伸長アームが、(i)プライマー結合部位、(ii)編集鋳型、および(iii)相同アームを含む、前記ガイドRNA。
  5. スペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含むガイドRNAであって、伸長アームが、配列番号406543～542056からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するプライマー結合部位、または配列番号406543～542056のいずれかと少なくとも90％配列が同一であるヌクレオチド配列を有するプライマー結合部位を含む、前記ガイドRNA。
  6. スペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含むガイドRNAであって、伸長アームが、配列番号542057～677570からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む編集鋳型、または配列番号542057～677570のいずれかと少なくとも90％同一であるヌクレオチド配列を有する編集鋳型を含む、前記ガイドRNA。
  7. スペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含むガイドRNAであって、伸長アームが、配列番号677571～813084からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する相同アーム、または配列番号677571～813084のいずれかと少なくとも90％同一であるヌクレオチド配列を有する相同アームを含む、前記ガイドRNA。
  8. (i)配列番号135515～271028からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するスペーサー、または配列番号135515～271028のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するスペーサー、および
    (ii)配列番号271029～406542からなる群から選択される伸長アーム、または配列番号271029～406542と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する伸長アーム
    を含む、ガイドRNA。
  9. (i)配列番号135515～271028からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するスペーサー、または配列番号135515～271028のいずれかと少なくとも90％同一であるヌクレオチド配列を有するスペーサー、および
    (ii)配列番号406543～542056からなる群から選択されるプライマー結合部位、または配列番号406543～542056のいずれかと少なくとも90％同一であるヌクレオチド配列を有するプライマー結合部位
    を含む、ガイドRNA。
  10. (i)配列番号135515～271028からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するスペーサー、または配列番号135515～271028のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するスペーサー、および
    (ii)配列番号542057～677570からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する編集鋳型、または配列番号542057～677570のいずれかと少なくとも90％同一であるヌクレオチド配列を有する編集鋳型
    を含む、ガイドRNA。
  11. (i)配列番号135515～271028からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するスペーサー、または配列番号135515～271028のいずれかと少なくとも90％同一であるヌクレオチド配列を有するスペーサー、および
    (ii)配列番号677571～813084からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する相同アーム、または配列番号677571～813084のいずれかと少なくとも90％同一であるヌクレオチド配列を有するスペーサー
    を含む、ガイドRNA。
  12. 配列番号813086の終止シグナル、または配列番号813086と少なくとも90％の配列同一性を有する終止シグナルをさらに含む、請求項1～11のいずれか一項に記載のガイドRNA。
  13. ヘアピン配列、ステム/ループ配列、またはトウループ配列を含む5'末修飾領域をさらに含む、請求項1～12のいずれか一項に記載のガイドRNA。
  14. ヘアピン配列、ステム/ループ配列、またはトウループ配列を含む3'末修飾領域をさらに含む、請求項1～13のいずれか一項に記載のガイドRNA。
  15. 配列番号813085を含むgRNAコア、または配列番号813085と少なくとも90％の配列同一性を有するgRNAコアをさらに含む、請求項1～14のいずれか一項に記載のガイドRNA。
  16. ガイドRNAが、プライム編集に好適なnapDNAbpへ結合すること、およびnapDNAbpを標的DNA配列へ向かわせることが可能である、請求項1～15のいずれか一項に記載のガイドRNA。
  17. 標的核酸配列が、標的鎖(またはPAM鎖)および相補的な非標的鎖(または非PAM鎖)を含み、ガイドRNAのスペーサーが、相補的な非標的鎖(非PAM鎖)とハイブリダイズすることでRNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する、請求項16に記載のガイドRNA。
  18. プライマー結合部位が、長さがおよそ8ヌクレオチドと、およそ20ヌクレオチドとの間にある、請求項1～17のいずれか一項に記載のガイドRNA。
  19. プライマー結合部位が、長さが8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチドである、請求項1～18のいずれか一項に記載のガイドRNA。
  20. プライマー結合部位が、長さが少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、または少なくとも20ヌクレオチドである、請求項1～19のいずれか一項に記載のガイドRNA。
  21. 相同アームが、標的DNAの鎖に相補的である、請求項1～20のいずれか一項に記載のガイドRNA。
  22. 伸長アームが、長さがおよそ7ヌクレオチドと、およそ500ヌクレオチドとの間にある、請求項1～21のいずれか一項に記載のガイドRNA。
  23. 伸長アームが、長さが少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも26ヌクレオチド、少なくとも27ヌクレオチド、少なくとも28ヌクレオチド、少なくとも29ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも31ヌクレオチド、少なくとも32ヌクレオチド、少なくとも33ヌクレオチド、少なくとも34ヌクレオチド、少なくとも35ヌクレオチド、少なくとも36ヌクレオチド、少なくとも37ヌクレオチド、少なくとも38ヌクレオチド、少なくとも39ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、または少なくとも100ヌクレオチドである、請求項1～22のいずれか一項に記載のガイドRNA。
  24. 編集鋳型が、長さが少なくとも1ヌクレオチド、少なくとも2ヌクレオチド、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも26ヌクレオチド、少なくとも27ヌクレオチド、少なくとも28ヌクレオチド、少なくとも29ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも31ヌクレオチド、少なくとも32ヌクレオチド、少なくとも33ヌクレオチド、少なくとも34ヌクレオチド、少なくとも35ヌクレオチド、少なくとも36ヌクレオチド、少なくとも37ヌクレオチド、少なくとも38ヌクレオチド、少なくとも39ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、または少なくとも100ヌクレオチドである、請求項1～23のいずれか一項に記載のガイドRNA。
  25. 相同アームが、少なくとも1ヌクレオチド、少なくとも2ヌクレオチド、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも26ヌクレオチド、少なくとも27ヌクレオチド、少なくとも28ヌクレオチド、少なくとも29ヌクレオチド、または少なくとも30ヌクレオチドである、請求項1～24のいずれか一項に記載のガイドRNA。
  26. 編集鋳型および相同アームが、逆転写酵素によって、3'末を有する対応の単鎖DNAフラップの合成のための鋳型配列として使用され得、
    DNAフラップが、ニック部位に隣接する内生標的DNA配列の鎖に相補的であり、および
    単鎖DNAフラップが、編集鋳型によってコードされるヌクレオチド変化を含む、
    請求項1～25のいずれか一項に記載のガイドRNA。
  27. 単鎖DNAフラップが、ニックが入れられた標的DNA配列中の5'末を有する内生単鎖DNAに取って代わる、請求項26に記載のガイドRNA。
  28. 遊離5'末を有する内生単鎖DNAが、細胞によって切除される、請求項27に記載のガイドRNA。
  29. それによって、単鎖DNAフラップの細胞修復が、ヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、これによって所望の産物が形成される、請求項27に記載のガイドRNA。
  30. 所望のヌクレオチド変化が、挿入である、請求項29に記載のガイドRNA。
  31. 挿入が、長さが少なくとも1ヌクレオチド、少なくとも2ヌクレオチド、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも26ヌクレオチド、少なくとも27ヌクレオチド、少なくとも28ヌクレオチド、少なくとも29ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも31ヌクレオチド、少なくとも32ヌクレオチド、少なくとも33ヌクレオチド、少なくとも34ヌクレオチド、少なくとも35ヌクレオチド、少なくとも36ヌクレオチド、少なくとも37ヌクレオチド、少なくとも38ヌクレオチド、少なくとも39ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、または少なくとも100ヌクレオチドである、請求項30に記載のガイドRNA。
  32. 挿入が、ポリペプチドをコードする配列である、請求項30に記載のガイドRNA。
  33. napDNAbp、逆転写酵素、および請求項1～32に記載のガイドRNAのいずれか1つを含む、プライム編集複合体。
  34. napDNAbpおよび逆転写酵素が、融合タンパク質として形成されている、請求項33に記載のプライム編集複合体。
  35. napDNAbpが、Cas9である、請求項33に記載のプライム編集複合体。
  36. Cas9が、Cas9ニッカーゼまたはそれらのバリアントからなる群から選択される、請求項35に記載のプライム編集複合体。
  37. Cas9が、配列番号1～135514からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項35に記載のプライム編集複合体。
  38. 融合タンパク質が、配列番号1～135514からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項34に記載のプライム編集複合体。
  39. 融合タンパク質が、napDNAbpと逆転写酵素とを結び合わせるリンカーを含む、請求項34に記載のプライム編集複合体。
  40. リンカーが、配列番号1～135514からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項39に記載のプライム編集複合体。
  41. 請求項33～40のいずれか一項に記載のプライム編集複合体をコードする、1以上のポリヌクレオチド。
  42. 請求項41に記載のポリヌクレオチドと、プライム編集複合体のガイドRNAおよび融合タンパク質の発現を推進する1以上のプロモーターとを含む、ベクター。
  43. 請求項42に記載のベクターを含む、細胞。
  44. 請求項33～40のいずれか一項に記載のプライム編集複合体を含む、細胞。
  45. (i)請求項1～32のいずれか一項に記載のガイドRNA、請求項33～40のいずれか一項に記載のプライム編集複合体、請求項41に記載のポリヌクレオチド、または請求項42に記載のベクター;および(ii)薬学的に許容し得る賦形剤を含む、医薬組成物。
  46. 核酸配列にヌクレオチド変化を組み入れるための方法であって、方法が、
    核酸配列を、融合タンパク質および請求項1～32のいずれか一項または請求項56～81のいずれか一項に記載のガイドRNAを含む複合体と接触させること(ここで融合タンパク質が、napDNAbpおよびポリメラーゼを含み、ならびにここでガイドRNAが、スペーサー、gRNAコア、および伸長アーム(ヌクレオチド変化をコードする編集鋳型を含む)を含む);これによって
    (i)標的鎖(またはPAM鎖)上の二本鎖DNA配列へニックを入れ、および3'末を有する遊離の単鎖DNAを生成すること;
    (ii)遊離の単鎖DNAの3'末をプライマー結合部位にてガイドRNAとハイブリダイズさせ、これによってポリメラーゼがプライムされること;
    (iii)DNAの鎖を3'末から重合させ、これによってヌクレオチド変化を含む単鎖DNAフラップが生成されること;ならびに
    (iv)標的鎖(またはPAM鎖)上の切断部位の下流に直接隣接する内生DNA鎖を単鎖DNAフラップに置き換え、これによって二本鎖のDNA配列において所望のヌクレオチド変化が組み入れられること
    を含む、前記方法。
  47. ヌクレオチド変化が、単一ヌクレオチドの置換、欠失、挿入、またはそれらの組み合わせである、請求項46に記載の方法。
  48. 単一ヌクレオチドの置換が、トランジションまたはトランスバージョンである、請求項46に記載の方法。
  49. ヌクレオチド変化が、(1)G→T置換、(2)G→A置換、(3)G→C置換、(4)T→G置換、(5)T→A置換、(6)T→C置換、(7)C→G置換、(8)C→T置換、(9)C→A置換、(10)A→T置換、(11)A→G置換、または(12)A→C置換である、請求項46に記載の方法。
  50. ヌクレオチド変化が、(1)G:C塩基対→T:A塩基対、(2)G:C塩基対→A:T塩基対、(3)G:C塩基対→C:G塩基対、(4)T:A塩基対→G:C塩基対、(5)T:A塩基対→A:T塩基対、(6)T:A塩基対→C:G塩基対、(7)C:G塩基対→G:C塩基対、(8)C:G塩基対→T:A塩基対、(9)C:G塩基対→A:T塩基対、(10)A:T塩基対→T:A塩基対、(11)A:T塩基対→G:C塩基対、または(12)A:T塩基対→C:G塩基対の変換である、請求項46に記載の方法。
  51. ヌクレオチド変化が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、もしくは25ヌクレオチドの挿入または欠失である、請求項46に記載の方法。
  52. ヌクレオチド変化が、ポリペプチドコード配列の挿入である、請求項46に記載の方法。
  53. ヌクレオチド変化が、疾患関連遺伝子を修正する、請求項46に記載の方法。
  54. 疾患関連遺伝子が、アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症;アルファ1アンチトリプシン欠損症;嚢胞性線維症;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ガラクトース血症;ヘモクロマトーシス;ハンチントン病;メープルシロップ尿症;マルファン症候群;1型神経線維腫症;先天性爪肥厚症;フェニルケトン尿症;重症複合免疫不全症;鎌状赤血球病;スミス・レムリ・オピッツ症候群;およびテイ・サックス病からなる群から選択される単一遺伝子障害に関連する、請求項46に記載の方法。
  55. 疾患関連遺伝子が、心疾患;高血圧;神経学的疾患;自己免疫障害;関節炎;糖尿病;がん;および肥満からなる群から選択される多遺伝子性障害に関連する、請求項46に記載の方法。
  56. 標的DNA配列中の編集部位にて疾患アレルを修正することで健常アレルを形成するプライム編集における使用のためのガイドRNAであって、該ガイドが、スペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含み、スペーサーが、配列番号1217353～1289387の内、～20ヌクレオチド領域またはその相補鎖へ結合することが可能である、前記ガイドRNA。
  57. スペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含むガイドRNAであって、伸長アームが、プライム編集を行うのに有効なDNA合成鋳型およびプライマー結合部位を含む、前記ガイドRNA。
  58. 配列番号1217353～1289387のヌクレオチド配列のいずれにおいても編集部位が、5'→3'配向で位置201にて始まる、請求項56に記載のガイドRNA。
  59. スペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含むプライム編集のためのガイドRNAであって、伸長アームが、プライマー結合部位およびDNA合成鋳型を含む、前記ガイドRNA。
  60. プライマー結合部位が、配列番号406543～542056からなる群から選択されるヌクレオチド配列(プライマー結合部位)、または配列番号406543～542056のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する、請求項59に記載のガイドRNA。
  61. DNA合成鋳型が、配列番号542057～677570のヌクレオチド配列(編集鋳型)、または配列番号542057～677570のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項59に記載のガイドRNA。
  62. DNA合成鋳型が、配列番号677571～813084のヌクレオチド配列(相同アーム)、または配列番号677571～813084のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項59に記載のガイドRNA。
  63. DNA合成鋳型が、編集鋳型および相同アームを含み、編集鋳型が、配列番号542057～677570のヌクレオチド配列を含み、および相同アームが、配列番号677571～813084のヌクレオチド配列を含む、請求項59に記載のガイドRNA。
  64. 配列番号813086の終止シグナル、または配列番号813086と少なくとも90％の配列同一性を有する終止シグナルをさらに含む、請求項56～63のいずれか一項に記載のガイドRNA。
  65. ヘアピン配列、ステム/ループ配列、またはトウループ配列を含む5'末修飾領域をさらに含む、請求項56～64のいずれか一項に記載のガイドRNA。
  66. ヘアピン配列、ステム/ループ配列、またはトウループ配列を含む3'末修飾領域をさらに含む、請求項56～65のいずれか一項に記載のガイドRNA。
  67. 配列番号813085を含むgRNAコア、または配列番号813085と少なくとも90％の配列同一性を有するgRNAコアをさらに含む、請求項56～66のいずれか一項に記載のガイドRNA。
  68. ガイドRNAが、プライム編集に好適なnapDNAbpへ結合すること、およびnapDNAbpを標的DNA配列へ向かわせることが可能である、請求項56～67のいずれか一項に記載のガイドRNA。
  69. 標的核酸配列が、標的鎖(またはPAMもしくは編集鎖)および相補的な非標的鎖(または非PAMもしくは非編集鎖)を含み、ガイドRNAのスペーサーが、非PAM鎖とハイブリダイズすることでRNA-DNAハイブリッドおよびRループが形成される、請求項68に記載のガイドRNA。
  70. プライマー結合部位が、長さがおよそ8クレオチドと、およそ20ヌクレオチドとの間にある、請求項56～69のいずれか一項に記載のガイドRNA。
  71. プライマー結合部位が、長さが8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチドである、請求項56～70のいずれか一項に記載のガイドRNA。
  72. 伸長アームが、長さが少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも26ヌクレオチド、少なくとも27ヌクレオチド、少なくとも28ヌクレオチド、少なくとも29ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも31ヌクレオチド、少なくとも32ヌクレオチド、少なくとも33ヌクレオチド、少なくとも34ヌクレオチド、少なくとも35ヌクレオチド、少なくとも36ヌクレオチド、少なくとも37ヌクレオチド、少なくとも38ヌクレオチド、少なくとも39ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチドである、請求項56～71のいずれか一項に記載のガイドRNA。
  73. プライマー結合部位が、長さが少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、または少なくとも20ヌクレオチドである、請求項56～72のいずれか一項に記載のガイドRNA。
  74. DNA合成鋳型が、長さが少なくとも1ヌクレオチド、少なくとも2ヌクレオチド、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも26ヌクレオチド、少なくとも27ヌクレオチド、少なくとも28ヌクレオチド、少なくとも29ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも31ヌクレオチド、少なくとも32ヌクレオチド、少なくとも33ヌクレオチド、少なくとも34ヌクレオチド、少なくとも35ヌクレオチド、少なくとも36ヌクレオチド、少なくとも37ヌクレオチド、少なくとも38ヌクレオチド、少なくとも39ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチドである、請求項56～73のいずれか一項に記載のガイドRNA。
  75. DNA合成鋳型が、RNA依存性DNAポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)によって、3'末を有する対応の単鎖DNAフラップの合成のための鋳型として使用され得、
    DNAフラップが、ニック部位に隣接する内生標的DNA配列の鎖に相補的であり、および
    単鎖DNAフラップが、DNA合成鋳型によってコードされる所望のヌクレオチド変化を含む、請求項56～74のいずれか一項に記載のガイドRNA。
  76. 単鎖DNAフラップが、ニックを入れられた標的DNA配列において、5'末を有する内生単鎖DNAに取って代わる、請求項75に記載のガイドRNA。
  77. 遊離5'末を有する内生単鎖DNAが、細胞によって切除される、請求項76に記載のガイドRNA。
  78. それによって、単鎖DNAフラップの細胞修復が、ヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、これによって編集済DNA産物が形成される、請求項77記載のガイドRNA。
  79. 所望のヌクレオチド変化が、挿入である、請求項78に記載のガイドRNA。
  80. 挿入が、長さが少なくとも1ヌクレオチド、少なくとも2ヌクレオチド、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも26ヌクレオチド、少なくとも27ヌクレオチド、少なくとも28ヌクレオチド、少なくとも29ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも31ヌクレオチド、少なくとも32ヌクレオチド、少なくとも33ヌクレオチド、少なくとも34ヌクレオチド、少なくとも35ヌクレオチド、少なくとも36ヌクレオチド、少なくとも37ヌクレオチド、少なくとも38ヌクレオチド、少なくとも39ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチドである、請求項79に記載のガイドRNA。
  81. 挿入が、ポリペプチドをコードする配列である、請求項79に記載のガイドRNA。
  82. napDNAbp、RNA依存性DNAポリメラーゼ、および請求項56～81のいずれか一項に記載のガイドRNAのいずれか1つを含む、プライム編集複合体。
  83. napDNAbpおよびRNA依存性DNAポリメラーゼが、融合タンパク質として形成されている、請求項82に記載のプライム編集複合体。
  84. napDNAbpが、Cas9である、請求項82に記載のプライム編集複合体。
  85. Cas9が、Cas9ニッカーゼまたはそのバリアントである、請求項84に記載のプライム編集複合体。
  86. Cas9が、配列番号1～135514からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項84に記載のプライム編集複合体。
  87. 融合タンパク質が、配列番号1～135514からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項83に記載のプライム編集複合体。
  88. 融合タンパク質が、napDNAbpとRNA依存性DNAポリメラーゼとを結び合わせるリンカーを含む、請求項83に記載のプライム編集複合体。
  89. リンカーが、配列番号1～135514からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項88に記載のプライム編集複合体。
  90. 請求項82～89のいずれか一項に記載のプライム編集複合体をコードする、1以上のポリヌクレオチド。
  91. 請求項90に記載のポリヌクレオチドと、プライム編集複合体のガイドRNAおよび融合タンパク質の発現を推進する1以上のプロモーターとを含む、ベクター。
  92. 請求項91に記載のベクターを含む、細胞。
  93. 請求項82～89のいずれか一項に記載のプライム編集複合体を含む、細胞。
  94. (i)請求項56～81のいずれか一項に記載のガイドRNA、請求項82～89のいずれか一項に記載のプライム編集複合体、請求項90に記載のポリヌクレオチド、または請求項91に記載のベクター;および(ii)薬学的に許容し得る賦形剤を含む、医薬組成物。
  95. 核酸配列にヌクレオチド変化を組み入れるための方法であって、方法が、
    核酸配列を、融合タンパク質および請求項56～81のいずれか一項に記載のガイドRNAを含む複合体と接触させること(ここで融合タンパク質が、napDNAbpおよびRNA依存性DNAポリメラーゼを含み、ここでガイドRNAが、スペーサー、gRNAコア、および伸長アーム(DNA合成鋳型およびプライマー結合部位を含み、該DNA合成鋳型がヌクレオチド変化をコードする)を含み、ならびにここでスペーサーが、利用可能なPAMおよびプロトスペーサーの近位にある非PAM鎖とアニールすることが可能である);これによって
    (i)PAM鎖上の二本鎖DNA配列へニックを入れ、これによって3'末を有する遊離の単鎖DNAが生成されること;
    (ii)遊離の単鎖DNAの3'末をプライマー結合部位にてガイドRNAとハイブリダイズさせ、これによってRNA依存性DNAポリメラーゼがプライムされること;
    (iii)DNA合成鋳型をコードするDNA鎖をDNAの3'末から重合させ、これによってDNAの3'末から伸長される単鎖DNAフラップが生成されること、ここでフラップが、ヌクレオチド変化を含む;
    (iv)PAM鎖上の切断部位の下流に直接隣接する内生DNA鎖を単鎖DNAフラップと置き換え、これによって二本鎖のDNA配列において所望のヌクレオチド変化が組み入れられること
    を含む、前記方法。
  96. ステップ(v)が細胞内で完了したとき、細胞が、細胞のDNA修復および/または複製を通して非編集鎖を修復する、請求項95に記載の方法。
  97. ヌクレオチド変化が、単一ヌクレオチドの置換、欠失、挿入、またはそれらの組み合わせである、請求項95に記載の方法。
  98. 単一ヌクレオチドの置換が、トランジションまたはトランスバージョンである、請求項97に記載の方法。
  99. 単一ヌクレオチドの置換が、(1)G→T置換、(2)G→A置換、(3)G→C置換、(4)T→G置換、(5)T→A置換、(6)T→C置換、(7)C→G置換、(8)C→T置換、(9)C→A置換、(10)A→T置換、(11)A→G置換、または(12)A→C置換である、請求項97に記載の方法。
  100. 単一ヌクレオチドの置換が、(1)G:C塩基対→T:A塩基対、(2)G:C塩基対→A:T塩基対、(3)G:C塩基対→C:G塩基対、(4)T:A塩基対→G:C塩基対、(5)T:A塩基対→A:T塩基対、(6)T:A塩基対→C:G塩基対、(7)C:G塩基対→G:C塩基対、(8)C:G塩基対→T:A塩基対、(9)C:G塩基対→A:T塩基対、(10)A:T塩基対→T:A塩基対、(11)A:T塩基対→G:C塩基対、または(12)A:T塩基対→C:G塩基対の変換である、請求項97に記載の方法。
  101. ヌクレオチド変化が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、もしくは25ヌクレオチドの挿入または欠失である、請求項97に記載の方法。
  102. ヌクレオチド変化が、ポリペプチドコード配列の挿入である、請求項97に記載の方法。
  103. ヌクレオチド変化が、疾患関連遺伝子を修正する、請求項97に記載の方法。
  104. 疾患関連遺伝子が、アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症;アルファ1アンチトリプシン欠損症;嚢胞性線維症;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ガラクトース血症;ヘモクロマトーシス;ハンチントン病;メープルシロップ尿症;マルファン症候群;1型神経線維腫症;先天性爪肥厚症;フェニルケトン尿症;重症複合免疫不全症;鎌状赤血球病;スミス・レムリ・オピッツ症候群;およびテイ・サックス病からなる群から選択される単一遺伝子障害に関連する、請求項103に記載の方法。
  105. 疾患関連遺伝子が、心臓疾患;高血圧;アルツハイマー病;関節炎;糖尿病;がん;および肥満からなる群から選択される多遺伝子性障害に関連する、請求項103に記載の方法。
  106. 標的DNA分子のヌクレオチド配列を挿入、欠失、逆位、置換、またはそれらの組み合わせで変更させることで対応の編集済DNA分子を産生するプライム編集における使用のためのガイドRNAであって、ここで:
    (i)ガイドRNAが、napDNAbpおよびRNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメインを含む融合タンパク質をもつ複合体を形成することが可能である;
    (ii)ガイドRNAが、(a)標的DNA分子上PAM鎖上の利用可能なPAMおよびプロトスペーサーの近位にある非PAM鎖とアニールすることが可能なスペーサー、および(b)gRNAコアを含む;
    (iii)ガイドRNAが、伸長アームをガイドRNAの5'末または3'末にてさらに含む;
    (iv)伸長アームが、(a)プライマー結合部位および(b)DNA合成鋳型を含み、ここでDNA合成鋳型が、PAM鎖上の切断部位のすぐ下流に内生鎖の代わりに取り入れられる編集を包含する単鎖DNAフラップをコードする;
    (v)標的DNA分子が、配列番号配列番号1217353～1289387からなる群から選択される;ならびに
    (vi)対応の編集済DNA分子が、配列番号1289388～1361420からなる群から選択される、前記ガイドRNA。
  107. 標的DNA分子が、クリンバー(Clinvar)バリアント配列である、請求項106に記載のガイドRNA。
  108. napDNAbpが、Cas9、Cas12e、Cas12d、Cas12a、Cas12b1、Cas13a、Cas12c、もしくはアルゴノート、またはCas9、Cas12e、Cas12d、Cas12a、Cas12b1、Cas13a、Cas12c、もしくはアルゴノートのバリアントである、請求項106に記載のガイドRNA。
  109. napDNAbpドメインが、ニッカーゼ活性を含む、請求項106に記載のガイドRNA。
  110. napDNAbpが、Cas9またはそのバリアントである、請求項106に記載のガイドRNA。
  111. napDNAbpが、ヌクレアーゼ活性Cas9、ヌクレアーゼ不活性Cas9(dCas9)、またはCas9ニッカーゼ(nCas9)である、請求項106に記載のガイドRNA。
  112. napDNAbpが、Cas9ニッカーゼ(nCas9)である、請求項106に記載のガイドRNA。
  113. napDNAbpが、アミノ酸を含む、請求項106に記載のガイドRNA。
  114. napDNAbpが、アミノ酸配列1361421～1361428のいずれか1つのSpCas9野生型もしくはそのバリアント、または配列番号1361421～1361428のいずれかと少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、請求項106に記載のガイドRNA。
  115. napDNAbpが、アミノ酸配列1361429～1361442のいずれか1つのSpCas9オルソログ、または配列番号1361429～1361442のいずれかと少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、請求項106に記載のガイドRNA。
  116. napDNAbpが、アミノ酸配列1361421～1361484のいずれか1つ、または配列番号1361421～1361484のいずれかと少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、請求項106に記載のガイドRNA。
  117. RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメインが、逆転写酵素である、請求項106に記載のガイドRNA。
  118. 逆転写酵素が、配列番号1361485～1361496のいずれか1つのアミノ酸配列、または配列番号1361485～1361496のいずれかと少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、天然に存在する野生型逆転写酵素である、請求項117に記載のガイドRNA。
  119. 逆転写酵素が、配列番号1361497～1361514のいずれか1つのアミノ酸配列、または配列番号1361497～1361514のいずれかと少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、逆転写酵素のバリアントである、請求項117に記載のガイドRNA。
  120. 融合タンパク質が、配列番号1361515～1361519のいずれか1つのアミノ酸配列、または配列番号1361515～1361519のいずれかと少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項106に記載のガイドRNA。
  121. 融合タンパク質が、配列番号1361515(PE1)もしくは1361516(PE2)のアミノ酸配列、または配列番号1361515もしくは1361516のいずれかと少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項106に記載のガイドRNA。
  122. 利用可能なPAM配列が、ステップ(i)に使用されるnapDNAbpに応じる、請求項106に記載のガイドRNA。
  123. 利用可能なPAM配列が、(a)5'-NGG-3'(標準的なPAM配列)、(b)5'-NNG-3'、(c)5'-NNA-3'、(d)5'-NNC-3'、(e)5'-NNT-3'、(f)5'-NGT-3'、(g)5'-NGA-3'、(h)5'-NGC-3'、(i)5'-NAA-3'、(j)5'-NAC-3'、(k)5'-NAG-3'、および(l)5'-NAT-3'からなる群から選択されるが、これらの選択はnapDNAbpの選択に応じる、請求項106に記載のガイドRNA。
  124. ステップ(v)の配列番号1217353～1289387のヌクレオチド配列のいずれにおいても編集部位が、5'→3'配向で位置201にて始まる、請求項106に記載のガイドRNA。
  125. ヌクレオチド変化が、ヌクレオチドの置換、欠失、挿入、またはそれらの組み合わせである、請求項106に記載のガイドRNA。
  126. ヌクレオチド置換が、トランジションまたはトランスバージョンである、請求項106に記載のガイドRNA。
  127. 単一ヌクレオチドの置換が、(1)G→T置換、(2)G→A置換、(3)G→C置換、(4)T→G置換、(5)T→A置換、(6)T→C置換、(7)C→G置換、(8)C→T置換、(9)C→A置換、(10)A→T置換、(11)A→G置換、または(12)A→C置換である、請求項106に記載のガイドRNA。
  128. 単一ヌクレオチドの置換が、(1)G:C塩基対→T:A塩基対、(2)G:C塩基対→A:T塩基対、(3)G:C塩基対→C:G塩基対、(4)T:A塩基対→G:C塩基対、(5)T:A塩基対→A:T塩基対、(6)T:A塩基対→C:G塩基対、(7)C:G塩基対→G:C塩基対、(8)C:G塩基対→T:A塩基対、(9)C:G塩基対→A:T塩基対、(10)A:T塩基対→T:A塩基対、(11)A:T塩基対→G:C塩基対、または(12)A:T塩基対→C:G塩基対の変換である、請求項106に記載のガイドRNA。
  129. 所望のヌクレオチド変化が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、もしくは25ヌクレオチドの挿入または欠失である、請求項106に記載のガイドRNA。
  130. ヌクレオチド変化が、ポリペプチドコード配列の挿入である、請求項106に記載のガイドRNA。
  131. ヌクレオチド変化が、疾患関連遺伝子を修正する、請求項106に記載のガイドRNA。
  132. 疾患関連遺伝子が、アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症;アルファ1アンチトリプシン欠損症;嚢胞性線維症;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ガラクトース血症;ヘモクロマトーシス;ハンチントン病;メープルシロップ尿症;マルファン症候群;1型神経線維腫症;先天性爪肥厚症;フェニルケトン尿症;重症複合免疫不全症;鎌状赤血球病;スミス・レムリ・オピッツ症候群;およびテイ・サックス病からなる群から選択される単一遺伝子障害に関連する、請求項131に記載のガイドRNA。
  133. 疾患関連遺伝子が、心臓疾患;高血圧;アルツハイマー病;関節炎;糖尿病;がん;および肥満からなる群から選択される多遺伝子性障害に関連する、請求項131に記載のガイドRNA。
  134. 核酸配列にヌクレオチド変化を組み入れるための方法であって、方法が、核酸配列を、融合タンパク質と請求項56～81のいずれか一項に記載のガイドRNAとを含む複合体に接触させることを含む、前記方法。
  135. 融合タンパク質が、napDNAbpおよびRNA依存性DNAポリメラーゼを含む、請求項134に記載の方法。
  136. ガイドRNAが、スペーサーと、gRNAコアと、DNA合成鋳型およびプライマー結合部位を含む伸長アームとを含む、請求項134に記載の方法。
  137. DNA合成鋳型が、ヌクレオチド変化をコードする、請求項136に記載の方法。
  138. ガイドRNAが、プライム編集に好適なnapDNAbpへ結合すること、およびnapDNAbpを標的DNA配列へ向かわせることが可能である、請求項134～137のいずれか一項に記載の方法。
  139. 標的核酸配列が、標的鎖(またはPAMもしくは編集鎖)および相補的な非標的鎖(または非PAMもしくは非編集鎖)を含み、ガイドRNAのスペーサーが、非PAM鎖とハイブリダイズすることでRNA-DNAハイブリッドおよびRループが形成される、請求項138に記載の方法。
  140. プライマー結合部位が、長さがおよそ8クレオチドと、およそ20ヌクレオチドとの間である、請求項136に記載の方法。
  141. プライマー結合部位が、長さが8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチドである、請求項136に記載の方法。
  142. 伸長アームが、長さが少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも26ヌクレオチド、少なくとも27ヌクレオチド、少なくとも28ヌクレオチド、少なくとも29ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも31ヌクレオチド、少なくとも32ヌクレオチド、少なくとも33ヌクレオチド、少なくとも34ヌクレオチド、少なくとも35ヌクレオチド、少なくとも36ヌクレオチド、少なくとも37ヌクレオチド、少なくとも38ヌクレオチド、少なくとも39ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチドである、請求項136に記載の方法。
  143. プライマー結合部位が、長さが少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、または少なくとも20ヌクレオチドである、請求項136に記載の方法。
  144. DNA合成鋳型が、長さが少なくとも1ヌクレオチド、少なくとも2ヌクレオチド、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも26ヌクレオチド、少なくとも27ヌクレオチド、少なくとも28ヌクレオチド、少なくとも29ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも31ヌクレオチド、少なくとも32ヌクレオチド、少なくとも33ヌクレオチド、少なくとも34ヌクレオチド、少なくとも35ヌクレオチド、少なくとも36ヌクレオチド、少なくとも37ヌクレオチド、少なくとも38ヌクレオチド、少なくとも39ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチドである、請求項136に記載の方法。
  145. DNA合成鋳型が、RNA依存性DNAポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)によって、3'末を有する対応の単鎖DNAフラップの合成のための鋳型として使用され得、
    DNAフラップが、ニック部位に隣接する内生標的DNA配列の鎖に相補的であり、および
    単鎖DNAフラップが、DNA合成鋳型によってコードされる所望のヌクレオチド変化を含む、請求項136に記載の方法。
  146. 単鎖DNAフラップが、ニックが入った標的DNA配列において、5'末を有する内生単鎖DNAに取って代わる、請求項145に記載の方法。
  147. 遊離5'末を有する内生単鎖DNAが、細胞によって切除される、請求項146に記載の方法。
  148. それによって、単鎖DNAフラップの細胞修復が、ヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、これによって編集済DNA産物が形成される、請求項145に記載の方法。
  149. ヌクレオチド変化が、挿入である、請求項148に記載の方法。
  150. 挿入が、長さが少なくとも1ヌクレオチド、少なくとも2ヌクレオチド、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも26ヌクレオチド、少なくとも27ヌクレオチド、少なくとも28ヌクレオチド、少なくとも29ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも31ヌクレオチド、少なくとも32ヌクレオチド、少なくとも33ヌクレオチド、少なくとも34ヌクレオチド、少なくとも35ヌクレオチド、少なくとも36ヌクレオチド、少なくとも37ヌクレオチド、少なくとも38ヌクレオチド、少なくとも39ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチドである、請求項149に記載の方法。
  151. 挿入が、ポリペプチドをコードする配列である、請求項149に記載の方法。
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