KR20160021812A

KR20160021812A - 표적된 통합

Info

Publication number: KR20160021812A
Application number: KR1020167000496A
Authority: KR
Inventors: 스콧 바르; 트리사 보르그슐트; 케빈 카이저
Original assignee: 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨
Priority date: 2013-06-19
Filing date: 2014-06-19
Publication date: 2016-02-26
Also published as: CA2915467A1; RU2016101246A; US20160145645A1; BR112015031639A2; EP3011011A2; WO2014205192A2; CN105555948A; AU2014281472A1; JP2016523084A; WO2014205192A3; MX2015017110A; EP3011011A4; SG11201510297QA; RU2016101246A3

Abstract

본 발명은 예정된 게놈 유전자 자리 내에 위치한 또는 이에 근접한 외인성 핵산 서열을 포함하는 단리된 세포를 아우르고, 여기서 외인성 핵산 서열은 재조합 단백질의 표적된 통합을 위해 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 의해 활용될 수 있는 적어도 하나의 인식 서열을 포함한다. 본 발명은 이러한 세포를 제조하기 위한 방법, 그리고 재조합 단백질의 생산을 위해 이러한 세포를 재표적하기 위한 방법, 그리고 이를 위한 키트를 추가로 제공한다.

Description

표적된 통합{TARGETED INTEGRATION}

분야

본 발명은 관심 세포 내로 재조합 단백질을 인코딩하는 서열의 표적된 통합과 관련된다. 특히, 관심 세포는 예정된 게놈 유전자 자리 내에서 또는 이에 근접하여 위치한 외인성 핵산 서열을 포함하고, 여기서 외인성 핵산 서열은 재조합 단백질을 인코딩하는 서열의 표적된 통합을 위해 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 의해 활용될 수 있는 적어도 하나의 인식 서열을 포팜한다.

배경

최근 몇 년간, 포유류 세포의 게놈 내에서의 한정된 위치에서 재조합 단백질 발현 구조체의 표적된 통합 (TI)은 생물약제학 산업에서 많은 관심을 유발하였다. TI 기술은 세포주 개발 과학자들이 미리 정의되고, 잘 특징화된 게놈 유전자 자리 내로 관심 전이 유전자를 통합하도록 하여, 그렇게 함으로써 증가된 세포주 안정성, 감소된 클론-대-클론(clone-to-clone) 및 분자-대-분자(molecule-to-molecule) 이종 및 전반적으로 감소된 세포주 발달 연대표로 이어질 수 있는 재조합 단백질 발현 특징의 예측을 가능하게 해준다. 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포는 생물치료학적 단백질의 생산을 위해 가장 일반적으로 이용되는 세포주이다. 하지만, 치료학적 단백질 생산에서 그들의 인식되는 유용성에도 불구하고, 지금까지, CHO 세포에서 TI는 제한적인 성공을 보였다. 이에 따라, CHO 및 다른 세포에서 TI를 시행하는 개선된 방법이 요구되고, 이는 생물생성 산업에서 유익할 것이다.

요약

본 발명의 다양한 측면 중에서도 표 2에서 열거된 적어도 게놈 유전자 자리 내에 있는 또는 이에 근접한 게놈 DNA에 위치한 적어도 하나의 외인성 핵산 서열을 포함하는 단리된 세포가 제공되고, 여기서 각각의 외인성 핵산 서열은 폴리뉴클레오티드 변형 효소를 위해 적어도 하나의 인식 서열을 포함한다. 한 가지 구체예에서, 세포는 CHO 세포이다. 또 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인식 서열은 세포 (또는 CHO 세포)의 게놈에서 내인성으로 존재하지 않는 핵산 서열을 포함한다. 추가적인 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 변형 효소는 표적 엔도뉴클레아제 (가령, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN), CRIPSR 엔도뉴클레아제, I-TevI 뉴클레아제 또는 관련된 단량체 하이브리드, 또는 인공 표적된 DNA 이중 가닥 파손 유도제), 부위-특이적 재조합 효소 (가령, 람다 통합 효소, Cre 재조합 효소, FLP 재조합 효소, 감마-델타 해리 효소, Tn3 해리 효소, ΦC31 통합 효소, Bxb1-통합 효소, 또는 R4 통합 효소), 또는 이의 조합이다. 추가적인 구체예에서, 제1 인식 서열은 제1 ZFN 쌍에 의해 인식된다. 또 다른 구체예에서, 제1 인식 서열은 제1 ZFN 쌍에 의해 인식되고 그리고 제2 인식 서열은 ZFN의 제1 쌍과는 다른 제2 ZFN 쌍에 의해 인식된다. 한 번의 반복에서, 제1 및 제2 ZFN 쌍은 hSIRT, hRSK4, 및 hAAVS1로 구성된 군에서 선택된다. 또 다른 구체예에서, 외인성 핵산 서열은 적어도 하나의 선별 마커(selectable marker) 서열, 적어도 하나의 리포터 서열, 적어도 하나의 조절성 제어 서열 요소, 또는 이의 조합을 추가로 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 적어도 하나의 인식 서열을 포함하는 적어도 하나의 외인성 핵산 서열을 포함하는 세포를 제조하기 위한 방법을 포함한다. 상기 방법은 (a) 표 2에서 열거된 게놈 유전자 자리 내에 있는 또는 이에 근접한 서열에 표적되는 적어도 하나의 표적 엔도뉴클레아제를 세포 내로 도입하는 단계; (b) (i) 표적된 게놈 유전자 자리에 대한 실질적인 서열 동일성을 가지는 서열 또는 (ii) 표적 엔도뉴클레아제의 인식 서열이 측면에 있는(flanked) 외인성 핵산을 포함하는 적어도 하나의 공여자 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 단계; 그리고 (c) 외인성 핵산이 세포의 게놈 내로 통합되도록 하는 조건 하에 세포를 유지하는 단계를 포함한다. 한 가지 구체예에서, 세포는 CHO 세포이다. 또 다른 구체예에서, 외인성 핵산은 상동성-유도 과정에 의해 게놈 내로 통합된다. 추가적인 구체예에서, 외인성 핵산은 직접 결찰 과정에 의해 게놈 내로 통합된다. 또 다른 구체예에서, 표적 엔도뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN), CRIPSR 엔도뉴클레아제, I-TevI 뉴클레아제 또는 관련된 단량체 하이브리드, 및 인공 표적된 DNA 이중 가닥 파손 유도제로 구성된 군에서 선택된다.

본 발명의 추가적인 측면은 적어도 하나의 재조합 단백질의 생산을 위한 세포를 재표적하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 표 2에서 열거된 적어도 게놈 유전자 자리 내에서 또는 이에 근접하여 위치한 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 적어도 하나의 외인성 인식 서열을 포함하는 세포를 제공하는 단계; (b) (i) 제1 및 제2 서열이 측면에 있는, 재조합 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 구조체, 및 (ii) 세포에서 적어도 하나의 외인성 인식 서열을 인식하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 변형 효소를 세포 내로 도입하는 단계; 그리고 (c) 재조합 단백질을 인코딩하는 서열이 세포의 게놈 내로 통합되도록 하는 조건 하에 세포를 유지하는 단계를 포함한다. 한 가지 구체예에서, 세포는 CHO 세포이다. 또 다른 구체예에서, 세포의 적어도 하나의 외인성 인식 서열은 표적 엔도뉴클레아제 인식 부위이고; 발현 구조체의 제1 및 제2 서열은 세포내 외인성 인식 서열에 가까운 염색체 서열에 대한 실질적인 서열 동일성을 가진 서열이고; 그리고 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 변형 효소는 표적 엔도뉴클레아제이다. 또 다른 구체예에서, 세포의 적어도 하나의 외인성 인식 서열은 표적 엔도뉴클레아제 인식 부위이고; 발현 구조체의 제1 및 제2 서열 각각은 표적 엔도뉴클레아제의 인식 서열이고; 그리고 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 변형 효소는 표적 엔도뉴클레아제이다. 몇몇 구체예에서, 표적 엔도뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN), CRIPSR 엔도뉴클레아제, I-TevI 뉴클레아제 또는 관련된 단량체 하이브리드, 또는 인공 표적된 DNA 이중 가닥 파손 유도제이다. 추가적인 구체예에서, 세포의 적어도 하나의 외인성 인식 서열은 부위-특이적 재조합 효소 인식 부위이고; 발현 구조체의 제1 및 제2 서열 각각은 부위-특이적 재조합 효소 인식 서열이고; 그리고 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 변형 효소는 부위-특이적 재조합 효소이고, 여기서 부위-특이적 재조합 효소는 람다 통합 효소, Cre 재조합 효소, FLP 재조합 효소, 감마-델타 해리 효소, Tn3 해리 효소, ΦC31 통합 효소, Bxb1-통합 효소, 및 R4 통합 효소로 구성된 군에서 선택된다. 추가적인 구체예에서, 재조합 단백질을 인코딩하는 서열은 적어도 하나의 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 대안적인 구체예에서, 발현 구조체는 적어도 하나의 선별 마커 서열, 적어도 하나의 리포터 서열, 적어도 하나의 조절성 제어 서열 요소, 또는 이의 조합을 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 세포는 적어도 하나의 재조합 단백질의 발현을 위한 조건 하에 유지된다.

본 발명의 또 다른 측면은 재조합 단백질의 생산을 위해 세포를 재표적하기 위한 키트를 포함한다. 상기 키트는 표 2에서 열거되는 적어도 게놈 유전자 자리 내에 있는 또는 이에 근접한 게놈 DNA에 위치한 적어도 하나의 외인성 핵산 서열을 포함하는 세포를 포함하고, 여기서 각각의 외인성 핵산 서열은 인식 서열에 상응하는 폴리뉴클레오티드 변형 효소 및 관심 재조합 단백질을 인코딩하는 서열의 삽입을 위한 구조체와 함께, 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 적어도 하나의 인식 서열을 포함하고, 여기서 구조체는 인식 서열에 상응하는 측면 서열(flanking sequence)의 쌍 및/또는 인식 서열을 측면에 배치하는 게놈 DNA를 추가로 포함한다. 한 가지 구체예에서, 세포는 CHO 세포이다. 또 다른 구체예에서, 키트는 재조합 단백질을 인코딩하는 서열의 표적된 통합을 완료하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 몇몇 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 변형 효소는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN), CRIPSR 엔도뉴클레아제, I-TevI 뉴클레아제 또는 관련된 단량체 하이브리드, 및 인공 표적된 DNA 이중 가닥 파손 유도제로 구성된 군에서 선택된 표적 엔도뉴클레아제이다. 다른 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 변형 효소는 람다 통합 효소, Cre 재조합 효소, FLP 재조합 효소, 감마-델타 해리 효소, Tn3 해리 효소, ΦC31 통합 효소, Bxb1-통합 효소, 및 R4 통합 효소로 구성된 군에서 선택된 부위-특이적 재조합 효소이다.

본 발명의 추가적인 측면 및 반복은 아래에서 상세하게 설명된다.

도면의 간단한 설명
도 1은 CHO 게놈 위치 Refseq. ID NW_003618207.1, 염기쌍 5366-20679 내로 인간 AAVS1 ZFN 인식 서열의 통합에 이용되는 공여자 플라스미드의 도식적인 표현이다.
도 2는 통합된 AAVS 랜딩 패드(landing pad)를 함유한 Refseq. ID NW_003618207.1, 염기쌍 5366-20679의 도식적인 표현이다. 접합 PCR에 이용되는 프라이머 결합 부위가 명시된다.
도 3은 ZFN 매개 표적된 통합에 의해 게놈 내로 재조합 단백질 발현 구조체를 도입하는 데에 이용될 수 있는 2개의 상이한 일반적인 공여자 설계의 도식적인 표현이다. (A) 예를 들어, 재조합 단백질 발현 구조체(들)을 포함하는, 통합되어야 하는 바람직한 서열 (본 명세서에서 "페이로드(payload)" 서열로 언급됨)은 ZFN 인식 서열을 둘러싸는 게놈 DNA 서열에 상동인 서열이 측면에 있다. 이 설계는 고전적인 상동 재조합을 통한 표적된 통합을 허용할 것이다. (B) 페이로드는 숙주 세포 게놈에서 표적되는 것과 동일한 ZFN 인식 서열이 측면에 있다. 따라서, ZFN 쌍으로 형질감염 시, ZFN은 내인성 게놈 DNA 그리고 공여자 DNA를 모두 절단하여, DNA 수선 기작을 통한 페이로드의 표적된 통합을 허용할 접착성의 부착 말단을 남겨둘 것이다. 두 가지 설계 모두에서, 페이로드는 선별 마커에 대한 발현 카세트(expression cassette)와 함께 관심 재조합 단백질에 대한 발현 카세트를 포함할 것이다. 페이로드에서 다른 요소는 리포터, 프로모터, 또는 임의의 다른 외인성 서열을 포함할 수 있었다.

상세한 설명

재조합 단백질, 특히 생물치료학적 단백질 산물을 인코딩하는 서열의 표적된 통합은 바람직한 유전 물질의 혼입의 효율에 대해, 그리고 또한, 통합 후 단백질 발현의 개선된 안정성, 균질성, 및 수준에 대해 무작위 통합보다 매우 바람직하다. 엔도뉴클레아제 기술, 가령 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 기술 그리고 본 명세서에서 논의된 다른 기술은 이제, 표적된 통합의 특정한 선행 방법보다 맞춤화(customization)에 대해 더 큰 효율 및 기회로, 내인성 게놈 서열의 부위-특이적 변형의 도입을 허용한다. 본 발명은 재조합 단백질을 인코딩 하는 서열의 표적된 통합을 위해 유용한 세포를 제공하며, 여기서 세포는 그들의 게놈내 "랜딩 패드" 부위의 혼입으로 인하여 특히 적합하다. 중국 햄스터 난소 (CHO) 또는 다른 포유류 세포는 이러한 랜딩 패드를 받도록 본 명세서에서 설명된 바와 같이 변형될 수 있다, 즉, 폴리뉴클레오티드 변형 효소, 가령 부위-특이적 재조합 효소 및/또는 표적 엔도뉴클레아제에 대한 하나 이상의 인식 서열을 포함하는 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 변형될 수 있다. 랜딩 패드는 재조합 단백질(들)의 발현을 위해 적합한 유전자 자리에서 삽입될 수 있다. 게놈 내에서의 특정한 위치에서 랜딩 패드 (폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 하나 이상의 인식 서열을 포함하는 서열)의 통합 후, 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 서열은 상응하는 재조합 효소 및/또는 표적된 엔도뉴클레아제를 이용하여 하나 이상의 인식 서열을 함유한 위치에서 삽입될 수 있으며, 여기서 이러한 삽입은 무작위 통합 또는 이전에 설명된 다른 방법보다 더 높은 수준의 효능으로 일어난다. 다수의 랜딩 패드는 게놈내 상이한 자리에 위치할 수 있고, 이는 다수의 독자적 단백질 발현 카세트뿐만 아니라 재조합 단백질 발현 구조체 또는 카세트의 다중-복제(copy) 통합을 허용한다는 점이 이해될 것이다.

I. 적어도 하나의 인식 서열을 포함하는 외인성 서열

하나의 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 변형 효소, 가령 부위-특이적 재조합 효소 및/또는 표적 엔도뉴클레아제에 대한 적어도 하나의 인식 서열을 포함하는 외인성 핵산 서열 (즉, 랜딩 패드)을 포함한다. 부위-특이적 재조합 효소는 해당 분야에서 잘 공지되고, 그리고 일반적으로 전화 효소, 해리 효소, 또는 통합 효소로서 언급될 수 있다. 부위-특이적 재조합 효소의 비-제한 예시는 람다 통합 효소, Cre 재조합 효소, FLP 재조합 효소, 감마-델타 해리 효소, Tn3 해리 효소, ΦC31 통합 효소, Bxb1-통합 효소, 및 R4 통합 효소를 포함할 수 있다. 부위-특이적 재조합 효소는 특이적인 인식 서열 (또는 인식 부위) 또는 이의 변이체를 인식하고, 이들 모두 해당 분야에서 잘 공지된다. 예를 들어, Cre 재조합 효소는 LoxP 부위를 인식하고 FLP 재조합 효소는 FRT 부위를 인식한다.

고려되는 표적 엔도뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN), CRIPSR/Cas-유사 엔도뉴클레아제, I-TevI 뉴클레아제 또는 관련된 단량체 하이브리드, 또는 인공 표적된 DNA 이중 가닥 파손 유도제를 포함한다. 이들 표적 엔도뉴클레아제 각각은 아래에서 추가로 설명된다. 예를 들어, 전형적으로, 징크 핑거 뉴클레아제는 DNA 결합 도메인 (즉, 징크 핑거) 및 절단 도메인 (즉, 뉴클레아제)을 포함하고, 상기 도메인 둘 모두 아래에서 설명된다. 해당 분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 다른 유용한 융합 단백질, 가령 DNA 결합 도메인 및 뉴클레아제를 포함할 수 있는 것이 폴리뉴클레오티드 변형 효소의 정의에 또한 포함된다.

랜딩 패드 서열은 특이적인 폴리뉴클레오티드 변형 효소, 가령 부위-특이적 재조합 효소 및/또는 표적 엔도뉴클레아제에 의해 선별적으로 결합되고 변형되는 적어도 하나의 인식 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열이다. 일반적으로, 랜딩 패드 서열에서 인식 서열(들)은 변형되어야 하는 세포의 게놈에서 내인성으로 존재하지 않는다. 예를 들어, 변형되어야 하는 세포가 CHO 세포인 경우, 랜딩 패드 서열에서 인식 서열은 내인성 CHO 게놈에 존재하지 않는다. 표적된 통합의 속도는 표적된 세포의 게놈 내에서 내인성으로 존재하지 않는 고효율 뉴클레오티드 변형 효소에 대한 인식 서열을 선별함으로써 개선될 수 있다. 내인성으로 존재하지 않는 인식 서열의 선별은 또한 잠재적인 오프-타겟(off-target) 통합을 감소시킨다. 다른 측면에서, 변형되어야 할 세포에서 고유한 인식 서열의 용도가 바람직할 수 있다. 예를 들어, 다중 인식 서열이 랜딩 패드 서열에서 이용되는 경우, 하나 이상은 외인성일 수 있고, 그리고 하나 이상은 고유한 것일 수 있다.

해당 분야의 통상의 기술자는 부위-특이적 재조합 효소 및/또는 표적 엔도뉴클레아제에 의해 결합되고 절단되는 서열을 쉽게 결정할 수 있다. 3가지 예시적인 ZFN 인식 서열이 아래 표 1에서 제공된다.

다중 인식 서열은 단일 랜딩 패드에 존재하여, 랜딩 패드가 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 의해 순차적으로 표적되도록 하고 따라서 2개 이상의 독자적 페이로드 서열 (다른 것들 중에서도, 단백질 발현 카세트를 포함)이 삽입될 수 있다. 대안으로, 랜딩 패드에서 다중 인식 서열의 존재는 동일한 페이로드 서열의 다중 복제물이 랜딩 패드 내로 삽입되도록 한다. 2개의 페이로드 서열이 단일 랜딩 패드에 표적될 때, 랜딩 패드는 제1 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 제1 인식 서열 (가령, 제1 ZFN 쌍), 그리고 제2 폴리뉴클레오티드 효소에 대한 제2 인식 서열 (가령, 제2 ZFN 쌍)을 포함한다. 대안으로, 또는 추가적으로, 하나 이상의 인식 서열을 포함하는 개별적인 랜딩 패드는 재조합 단백질 발현 구조체를 포함하는 페이로드 서열의 다중-복제 통합을 허용하기 위해 세포의 게놈 내의 다수 위치에서 통합될 수 있다. 증가된 단백질 발현은 발현 구조체를 포함하는 페이로드 서열의 다중 복제로 형질전환된 세포에서 관찰될 수 있다. 대안으로, 다중 단백질 산물은 동일하거나 상이한 랜딩 패드에서든 상관없이, 상이한 발현 카세트를 포함하는 다수의 독자적 페이로드 서열이 삽입될 때 동시에 발현될 수 있다. 페이로드 서열의 수와 유형에 관계없이, 표적 엔도뉴클레아제가 ZFN일 때, 예시적인 ZFN 쌍은 상기 표 1에서 식별된 바와 같은 수반되는 인식 서열과 함께, hSIRT, hRSK4, 및 hAAVS1을 포함한다.

일반적으로, 랜딩 패드로서 이용되는 외인성 핵산은 적어도 하나의 인식 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개 또는 그 이상의 인식 서열을 포함할 수 있다. 1개보다 더 많은 인식 서열을 포함하는 구체예에서, 인식 서열은 서로 독자적일 수 있고 (즉 상이한 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 의해 인식됨), 동일한 반복된 서열일 수 있고, 또는 반복된 서열과 독자적 서열의 조합일 수 있다.

해당 분야의 통상의 기술자는 랜딩 패드로서 이용되는 외인성 핵산이 또한 인식 서열(들)뿐만 아니라 다른 서열도 포함할 수 있다는 점을 쉽게 이해할 것이다. 예를 들어, 선별 마커, 가령 항생제 내성 유전자, 대사 선별 마커, 또는 형광 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 서열을 포함하는 것이 유리할 수 있다. 다른 보충 서열, 가령 전사 조절 및 제어 요소 (즉, 프로모터, 부분 프로모터, 프로모터 트랩(promoter trap), 시작 코돈, 증폭자, 인트론, 절연체 및 다른 발현 요소)가 또한 존재할 수 있다.

적절한 인식 서열(들)의 선별 외에도, 높은 절단 효율을 가진 표적 엔도뉴클레아제의 선별도 또한 랜딩 패드(들)의 표적된 통합 속도를 개선시킨다. 표적 엔도뉴클레아제의 절단 효율은 예를 들어, 어세이, 가령 CEL-1 어세이 또는 PCR 증폭절(amplicon)에서 삽입/결실의 직접 서열화 (Indels)를 이용하는 것을 비롯하여, 해당 분야에서 잘 공지된 방법을 이용하여 결정될 수 있다.

본 명세서에서 개시된 방법 및 세포에서 이용되는 표적 엔도뉴클레아제의 유형은 달라질 수 있으며 또한 달라질 것이다. 표적 엔도뉴클레아제는 천연-발생 단백질 또는 조작된 단백질일 수 있다. 표적 엔도뉴클레아제의 한 가지 예시는 징크-핑거 뉴클레아제이고, 이는 아래에서 더욱 상세하게 논의된다.

이용될 수 있는 표적 엔도뉴클레아제의 또 다른 예시는 적어도 하나의 핵 위치 신호를 포함하는 RNA-안내(guided) 엔도뉴클레아제이고, 이는 진핵 세포의 핵 내로 엔도뉴클레아제의 유입을 허용한다. RNA-안내 엔도뉴클레아제는 또한, 안내 RNA(guiding RNA)와 상호작용하는 적어도 하나의 도메인 및 적어도 하나의 뉴클레아제 도메인을 포함한다. RNA-안내 엔도뉴클레아제는 안내 RNA에 의해 특이적인 염색체 서열로 유도되고 따라서 RNA-안내 엔도뉴클레아제는 특이적인 염색체 서열을 절단한다. 안내 RNA는 표적된 절단에 대한 특이성을 제공하기 때문에, RNA-안내 엔도뉴클레아제의 엔도뉴클레아제는 보편적이고 그리고 상이한 표적 염색체 서열을 절단하기 위해 상이한 안내 RNA와 함께 이용될 수 있다. 예시적인 RNA-안내 엔도뉴클레아제 단백질이 아래에서 추가로 상세하게 논의된다. 예를 들어, RNA-안내 엔도뉴클레아제는 응집되고 규칙적으로 산재된 짧은 회귀성 반복 (CRISPR)/CRISPR-연관된 (Cas) 시스템으로부터 유래된 RNA-안내 엔도뉴클레아제인, CRISPR/Cas 단백질 또는 CRISPR/Cas-유사 융합 단백질일 수 있다.

표적 엔도뉴클레아제는 또한, 메가뉴클레아제일 수 있다. 메가뉴클레아제는 대형 인식 부위, 즉, 일반적으로 범위가 약 12개의 염기쌍 내지 약 40개의 염기쌍에 이르는 인식 부위로 특징지어지는 엔도데옥시리보뉴클레아제이다. 이 필요요건의 결과로서, 인식 부위는 일반적으로, 임의로 주어진 게놈에서 오로지 한 번 발생한다. 메가뉴클레아제 중에서도, LAGLIDADG라는 명칭의 귀소성 엔도뉴클레아제의 패밀리는 게놈의 연구 및 게놈 조작을 위한 가치있는 도구가 되었다. 메가뉴클레아제는 해당 분야의 통상의 기술자에게 잘 공지된 기술을 이용하여 그들의 인식 서열을 변형시킴으로써 특이적인 염색체 서열에 대해 표적이 될 수 있다. 예를 들어, Epinat et al., 2003, Nuc. Acid Res., 31(11):2952-62 및 Stoddard, 2005, Quarterly Review of Biophysics, pp. 1-47을 참고한다.

이용될 수 있는 표적 엔도뉴클레아제의 또 다른 예시는 전사 활성자-유사 효과기 (TALE) 뉴클레아제이다. TALE는 새로운 DNA 표적을 결합시키도록 쉽게 조작될 수 있는 식물 병원균 산토모나스(Xanthomonas)로부터의 전사 인자이다. TALE 또는 이의 절두 버전은 TALE 뉴클레아제 또는 TALEN으로 불리는 표적 엔도뉴클레아제를 형성하기 위해 엔도뉴클레아제의 촉매성 도메인, 가령 FokI에 연결될 수 있다. 가령, Sanjana et al., 2012, Nature Protocols 7(1):171-192; Bogdanove AJ, Voytas DF., 2011, Science, 333(6051):1843-6; Bradley P, Bogdanove AJ, Stoddard BL., 2013, Curr Opin Struct Biol., 23(1):93-9를 참고한다.

또 다른 예시적인 표적 엔도뉴클레아제는 부위-특이적 뉴클레아제이다. 특히, 부위-특이적 뉴클레아제는 "드문-절단" 엔도뉴클레아제일 수 있고, 이이ㅡ 인식 서열은 게놈에서 드물게 발생한다. 바람직하게, 부위-특이적 뉴클레아제의 인식 서열은 게놈에서 오로지 한 번 발생한다. 대안으로, 표적 뉴클레아제는 인공 표적된 DNA 이중 가닥 파손 유도제일 수 있다.

(a) 징크 핑거 뉴클레아제

비-제한, 예시적인 표적 엔도뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN)이다. 전형적으로, 징크 핑거 뉴클레아제는 DNA 결합 도메인 (즉, 징크 핑거) 및 절단 도메인 (즉, 뉴클레아제)을 포함하고, 이 둘 모두 아래에서 설명된다.

(i) 징크 핑거 결합 도메인

징크 핑거 결합 도메인은 선택되는 임의의 핵산 서열을 인식하고 이에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, Beerli et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; Zhang et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(43):33850-33860; Doyon et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26:702-708; 및 Santiago et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:5809-5814를 참고한다. 조작된 징크 핑거 결합 도메인은 자연적으로-발생한 징크 핑거 단백질과 비교하여 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 합리적 설계 및 여러 가지 유형의 선별법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 합리적 설계는 예를 들어, 이중항, 삼중항, 및/또는 사중항 뉴클레오티드 서열 그리고 개별적인 징크 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 이용하는 것을 포함하며, 여기서 각각의 이중항, 삼중항 또는 사중항 뉴클레오티드 서열은 특정한 삼중항 또는 사중항 서열을 결합시키는 징크 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 연관된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,453,242호 및 제6,534,261호를 참고하고, 이들 개시는 이들 전체로 본 명세서에 참조로서 편입된다. 예시로서, 미국 특허 번호 제6,453,242호에서 설명된 알고리즘은 미리 선별된 서열을 표적하도록 징크 핑거 결합 도메인을 설계하는 데에 이용될 수 있다. 대안적인 방법, 가령 비축퇴 인식 코드 표를 이용하는 합리적인 설계도 또한 특이적인 서열을 표적하도록 징크 핑거 결합 도메인을 설계하는 데에 이용될 수 있다 (Sera et al. (2002) Biochemistry 41:7074-7081). DNA 서열에서 잠재적인 표적 부위를 식별하기 위한 그리고 징크 핑거 결합 도메인을 설계하기 위한 공공으로 이용가능한 웹-기반 도구는 각각, www.zincfingertools.org와 zifit.partners.org/ZiFiT/에서 찾아볼 수 있다 (Mandell et al. (2006) Nuc. Acid Res. 34:W516-W523; Sander et al. (2007) Nuc. Acid Res. 35:W599-W605).

징크 핑거 결합 도메인은 길이의 범위가 약 3개의 뉴클레오티드 내지 약 21개의 뉴클레오티드, 예를 들어 길이의 범위가 약 9개 내지 약 18개의 뉴클레오티드인 DNA 서열을 인식하고 결합시키도록 설계될 수 있다. 각각의 징크 핑거 인식 영역 (즉, 징크 핑거)은 3개의 뉴클레오티드를 인식하고 결합시킨다. 일반적으로, 본 명세서에서 개시된 징크 핑거 뉴클레아제의 징크 핑거 결합 도메인은 적어도 3개의 징크 핑거 인식 영역 (즉, 징크 핑거)을 포함한다. 징크 핑거 결합 도메인은 예를 들어, 4개의 징크 핑거 인식 영역을 포함할 수 있다. 대안으로, 징크 핑거 결합 도메인은 5개 또는 6개의 징크 핑거 인식 영역을 포함할 수 있다. 징크 핑거 결합 도메인은 임의의 적합한 표적 DNA 서열에 결합하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,607,882호; 제6,534,261호 및 제6,453,242호를 참고하고, 이들 개시는 이들 전체로 본 명세서에 참조로서 편입된다.

징크 핑거 인식 영역을 선별하는 예시적인 방법은 파지 디스플레이(phage display) 및 2-하이브리드 시스템(two-hybrid systems)을 포함하고, 그리고 미국 특허 번호 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,410,248호; 제6,140,466호; 제6,200,759호; 및 제6,242,568호; 그리고 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 및 GB 2,338,237에서 개시되고, 이들 각각은 이들 전체로 본 명세서에 참조로서 편입된다. 추가로, 징크 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 향상이 예를 들어, WO 02/077227에서 설명되었고, 이의 개시는 참조로서 본 명세서에 편입된다.

징크 핑거 결합 도메인 그리고 융합 단백질 (및 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 설계와 제작을 위한 방법이 해당 분야의 통상의 기술자에게 공지되고 그리고 미국 특허 출원 공개공보 번호 제20050064474호 및 제20060188987호에서 상세하게 설명되며, 이들 각각은 이의 전체로 본 명세서에서 참조로서 편입된다. 징크 핑거 인식 영역 및/또는 다중-핑거 징크 핑거 단백질은 예를 들어, 길이가 5개 이상의 아미노산의 링커를 비롯하여, 적합한 링커 서열을 이용하여 함께 연결될 수 있다. 길이가 6개 이상의 아미노산의 링커 서열의 비-제한 예시를 위해, 미국 특허 번호 제6,479,626호; 제6,903,185호; 및 제7,153,949호를 참고하고, 이들 개시는 이들 전체로 본 명세서에 참고로서 편입된다. 본 명세서에서 설명된 징크 핑거 결합 도메인은 단백질의 개별적인 징크 핑거 (및 추가적인 도메인) 사이의 적합한 링커의 조합을 포함할 수 있다.

(ii) 절단 도메인

징크 핑거 뉴클레아제는 또한 절단 도메인을 포함한다. 징크 핑거 뉴클레아제의 절단 도메인 부분은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 얻을 수 있다. 절단 도메인이 유래될 수 있는 엔도뉴클레아제의 비-제한 예시는 제한 엔도뉴클레아제 및 귀화성 엔도뉴클레아제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) 카탈로그 (www.neb.com) 및 Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388을 참고한다. DNA를 절단하는 추가적인 효소가 공지된다 (가령, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 미구균 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제). 또한, Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993을 참고한다. 이들 효소 (또는 이의 기능적 단편)들 중 하나 이상은 절단 도메인의 공급원으로서 이용될 수 있다.

절단 도메인은 또한, 상기 설명된 바와 같이, 절단 활성을 위한 이량체화를 요구하는 효소 또는 이의 부분으로부터 유래될 수 있다. 각각의 뉴클레아제가 활성 효소 이량체의 단량체를 포함하므로 절단을 위해 2개의 징크 핑거 뉴클레아제가 요구될 수 있다. 대안으로, 단일 징크 핑거 뉴크레아제는 활성 효소 이량체를 형성하기 위해 두 단량체 모두를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "활성 효소 이량체"는 핵산 분자를 절단할 수 있는 효소 이량체이다. 2개의 절단 단량체는 동일한 엔도뉴클레아제 (또는 이의 기능적인 단편)로부터 유래될 수 있고, 또는 각각의 단량체는 상이한 엔도뉴클레아제 (또는 이의 기능적인 단편)로부터 유래될 수 있다.

2개의 절단 단량체가 활성 효소 이량체를 형성하는 데에 이용될 때, 2개의 징크 핑거 뉴클레아제에 대한 인식 부위는 2개의 징크 핑거 뉴클레아제와 그들 각각의 이식 부위의 결합이 절단 단량체를 서로에 대해 공간적 배향으로 두도록 바람직하게 배치되고, 상기 공간적 배향은 절단 단량체를 가령, 이량체화함으로써 활성 효소 이량체를 형성하도록 한다. 결과로서, 인식 부위의 가까운 모서리는 약 5개 내지 약 18개의 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다. 예를 들면, 가까운 모서리는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다. 하지만, 임의의 정수의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍이 2개의 인식 부위 사이에 개입할 수 있다 (가령, 약 2개 내지 약 50개의 뉴클레오티드 쌍 또는 그 이상)는 점이 이해될 것이다. 예를 들어, 본 명세서에서 상세하게 설명된 것들과 같이, 징크 핑거 뉴클레아제의 인식 부위의 가까운 모서리는 6개의 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다. 일반적으로, 절단 부위는 인식 부위 사이에 놓여있다.

제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소)는 다수의 종에서 존재하고 DNA에 서열-특이적 결합을 할 수 있고 (인식 부위에서), 그리고 결합 부위에서 또는 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정한 절단 효소 (가령, 유형 IIS)는 인식 부위에서 제거된 부위에서 DNA를 절단하고 그리고 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 갖는다. 예를 들어, 유형 IIS 효소 FokI는 하나의 가닥 상의 이의 인식 부위로부터 9개의 뉴클레오티드에서 그리고 다른 가닥 상의 이의 인식 부위로부터 13개의 뉴클레오티드에서, DNA의 이중-가닥 절단을 촉매한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,356,802호; 제5,436,150호 및 제5,487,994호; 그리고 Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31, 978-31, 982를 참고한다. 따라서, 징크 핑거 뉴클레아제는 적어도 하나의 유형 IIS 제한 효소로부터의 절단 도메인 그리고 하나 이상의 징크 핑거 결합 도메인을 포함할 수 있고, 이들은 조작될 수 있고 또는 조작될 수 없다. 예시적인 유형 IIS 제한 효소는 예를 들어 국제 공개공보 WO 07/014,275에서 설명되고, 이의 개시는 이의 전체로 본 명세서에 참조로서 편입된다. 추가적인 제한 효소는 또한, 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 함유하고, 그리고 이들은 또한, 본 발명에 의해 고려된다. 예를 들어, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420을 참고한다.

예시적인 유형 IIS 제한 효소는 FokI이고, 상기 효소의 절단 도메인은 결합 도메인으로붙 분리가능하다. 이 특정한 효소는 이량체로서 활성이다 (Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10, 570-10, 575). 이에 따라, 본 발명의 목적을 위하여, 징크 핑거 뉴클레아제에서 이용되는 FokI 효소의 부분은 절단 단량체로서 간주된다. 따라서, FokI 절단 도메인을 이용하여 표적된 이중-가닥 절단을 위하여, 2개의 징크 핑거 뉴클레아제가 활성 효소 이량체를 재구성하는 데에 이용될 수 있으며, 상기 징크 핑거 뉴클레아제 각각은 FokI 절단 단량체를 포함한다. 대안으로, 징크 핑거 결합 도메인 및 2개의 FokI 절단 단량체를 함유한 단일 폴리펩티드 분자가 또한 이용될 수 있다.

절단 도메인은 예를 들어, 미국 특허 공개공보 번호 제20050064474호, 제20060188987호, 및 제20080131962호에서 설명된 바와 같이, 동질이량체화를 최소화하거나 방지하는 하나 이상의 조작된 절단 단량체를 포함할 수 있으며, 상기 공개공보 각각은 이들 전체로 본 명세서에 참조로서 편입된다. 비-제한 예시로서, FokI의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538에서 아미노산 잔기는 FokI 절단 절반-도메인의 이량체화에 영향을 미치는 모든 표적이다. 불가피한 이질이량체를 형성하는 FokI의 예시적인 조작된 절단 단량체는 제1 절단 단량체가 FokI의 아미노산 잔기 위치 490 및 538에서 돌연변이를 포함하고 제2 절단 단량체가 아미노산 잔기 위치 486 및 499에서 돌연변이를 포함하는 쌍을 포함한다 (Miller et al., 2007, Nat. Biotechnol, 25:778-785; Szczpek et al., 2007, Nat. Biotechnol, 25:786-793). 예를 들어, 하나의 도메인에서 위치 490에서의 Glu (E)는 Lys (K)로 변화될 수 있고 그리고 위치 538에서의 Ile (I)는 K로 변화될 수 있고 (E490K, I538K), 그리고 또 다른 절단 도메인에서 위치 486에서의 Gln (Q)는 E로 변화될 수 있고 위치 499에서의 I는 Leu (L)로 변화될 수 있다 (Q486E, I499L). 다른 측면에서, 변형 FokI 절단 도메인은 3개의 아미노산 변화를 포함할 수 있다 (Doyon et al. 2011, Nat. Methods, 8:74-81). 예를 들어, 하나의 변형 FoKI 도메인 (ELD로 칭함)은 Q486E, I499L, N496D 돌연변이를 포함할 수 있고 다른 변형 FoKI 도메인 (KKR로 칭함)은 E490K, I538K, H537R 돌연변이를 포함할 수 있다.

(iii) 추가적인 도메인

몇몇 측면에서, 징크 핑거 뉴클레아제는 적어도 하나의 핵 위치 신호 또는 서열 (NLS)를 추가로 포함한다. NLS는 염색체내 표적 서열에 이중 가닥 파손을 도입하기 위해 핵 내로 징크 핑거 뉴클레아제 단백질을 표적하는 것을 촉진하는 아미노산 서열이다. 핵 위치 신호는 해당 분야에서 공지된다. 예를 들어, Makkerh et al. (1996) Current Biology 6:1025-1027을 참고한다. NLS는 징크 핑거 뉴클레아제의 N-말단, C-말단, 또는 내부 위치에 위치한다.

다른 측면에서, 징크 핑거 뉴클레아제는 적어도 하나의 세포-침투 도메인을 포함할 수 있다. 세포-침투 도메인은 HIV-1 TAT 단백질로부터 유래된 세포-침투 펩티드 서열, 인간 B형 간염 바이러스로부터 유래된 세포-침투 펩티드 서열, 단순 헤르페스 바이러스로부터 유래된 세포 침투 펩티드, MPG 펩티드, Pep-1 펩티드, 또는 폴리아르기닌 펩티드 서열일 수 있다. 세포-침투 도메인은 징크 핑거 뉴클레아제의 N-말단, C-말단, 또는 내부 위치에 위치할 수 있다.

(b) RNA-안내 엔도뉴클레아제

RNA-안내 엔도뉴클레아제는 응집되고 규칙적으로 산재된 짧은 회귀성 반복 (CRISPR)/CRISPR-연관된 (Cas) 시스템(clustered regularly interspersed short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) system)으로부터 유래될 수 있다. CRISPR/Cas 시스템은 유형 I, 유형 II, 또는 유형 III 시스템일 수 있다. 몇몇 측면에서, RNA-안내 엔도뉴클레아제는 유형 II CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래될 수 있다. 유형 II 시스템은 Csn1 서브패밀리 또는 Csx12 서브패밀리일 수 있다. 예시적인 측면에서, 엔도뉴클레아제는 유형 II 시스템의 Cas9 단백질로부터 유래될 수 있다. 여러 가지 측면에서, 엔도뉴클레아제는 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필레스(Streptococcus thermophiles),스트렙토코커스 에스피.(Streptococcus sp .), 노카르디옵시스 다스손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티나에스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포란지움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포란지움 로세움(Streptosporangium roseum), 알리사이클로바실러스 아시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코데스(Bacillus pseudomycoides), 바실러스 셀렌니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루엑키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 미크로실라 마리나(Microscilla marina), 부르콜데리알레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 에스피.(Polaromonas sp .), 크로코스파에라 왓소니(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 에스피.(Cyanothece sp .), 미크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 시네코코커스 에스피.(Synechococcus sp .), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시룹터 벡시(Caldicelulosiruptor becscii), 칸디다터스 데설포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필루스(Natranaerobius thermophiles), 펠로토마쿨럼 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실러스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오바실러스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 에스피.(Marinobacter sp .), 니트로소코커스 할로필러스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코커스 왓소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로모나스 할로프란크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 케도노박터 라세미퍼(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 이베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나바에나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스퍼미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 에스피.(Nostoc sp.), 아르트로스피라 맥시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 에스피.(Arthrospira sp .), 링비야 에스피.(Lyngbya sp .), 미크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 에스피.(Oscillatoria sp .), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus), 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina)등으로부터의 Cas9 단백질 (또는 Cas9 호모로그)로부터 유래될 수 있다. 예시적인 측면에서, 엔도뉴클레아제는 스트렙토코커스(Streptococcus) 종으로부터의 Cas9 단백질로부터 유래된다.

RNA-안내 엔도뉴클레아제는 야생형 Cas9 단백질 또는 이의 단편으로부터 유래될 수 있다. 다른 측면에서, RNA-안내 엔도뉴클레아제는 변형 Cas9 단백질로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, Cas9 단백질의 아미노산 서열은 단백질의 하나 이상의 특성 (가령, 뉴클레아제 활성, 친화도, 안정성 등)이 개선되도록 변형될 수 있다. 대안으로, RNA-안내 절단에 관여하지 않는 Cas9 단백질의 도메인은 변형 Cas9 단백질이 야생형 Cas9 단백질보다 더 작도록 단백질로부터 제거될 수 있다. 다른 측면에서, RNA-안내 엔도뉴클레아제는 야생형 Cas9 단백질, 변형 Cas9 단백질, 및/또는 다른 단백질의 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 예를 들어, RNA-안내 엔도뉴클레아제는 마커, 가령 GFP 또는 또 다른 형광 단백질을 포함할 수 있었다.

일반적으로, Cas9 단백질은 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인 및 HNH-유사 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 몇몇 측면에서, Cas9-유래 엔도뉴클레아제는 2개의 기능적인 뉴클레아제 도메인, 가령 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인 및 HNH-유사 뉴클레아제 도메인을 포함할 있다. 이러한 측면에서, 엔도뉴클레아제는 이중-가닥 핵산을 절단할 수 있다. 다른 측면에서, Cas9-유래된 엔도뉴클레아제는 오로지 하나의 기능적인 뉴클레아제 도메인 (RuvC-유사 또는 HNH-유사 뉴클레아제 도메인 중 하나)을 포함할 수 있다. 이들 측면에서, 엔도뉴클레아제는 단일-가닥 핵산을 절단할 수 있고 그리고 이중-가닥 핵산 내로 닉(nick)을 도입할 수 있다. RNA-안내 엔도뉴클레아제의 뉴클레아제 도메인은 동일한 Cas9 단백질로부터 유래될 수 있고 또는 그들은 상이한 Cas9 단백질로부터 유래될 수 있다.

본 명세서에서 개시된 Cas9-유래 엔도뉴클레아제는 진핵 세포의 핵 내로 수송을 위해 적어도 한 가지 핵 위치 신호 (NLS)를 포함한다. 일반적으로, NLS는 뻗어있는 염기성 아미노산을 포함한다. 핵 위치 신호는 해당 분야에서 공지된다 (가령, Lange et al., J. Biol. Chem., 2007, 282:5101-5105를 참고). 예를 들어, 한 가지 구체예에서, NLS는 단일분절(monopartite) 서열, 가령 PKKKRKV (서열 번호:4) 또는 PKKKRRV (서열 번호:5)일 수 있다. 또 다른 구체예에서, NLS는 이분절(bipartite) 서열일 수 있다. 또 다른 구체예에서, NLS는 KRPAATKKAGQAKKKK (서열 번호:6)일 수 있다. NLS는 엔도뉴클레아제의 N-말단, C-말단, 또는 내부 위치에 위치할 수 있다. 비-제한 예시에서, NLS는 엔도뉴클레아제의 C-말단에 위치할 수 있다.

일반적으로, RNA-안내 엔도뉴클레아제는 DNA 뉴클레아제이다. 몇몇 측면에서, RNA-안내 엔도뉴클레아제는 이중-가닥 DNA의 한 가닥을 절단할 수 있다. 예시적인 측면에서, RNA-안내 엔도뉴클레아제는 이중-가닥 DNA의 두 가닥을 모두 절단할 수 있다. 예를 들어, DNA는 선형이거나 원형일 수 있다. 예시적인 반복에서, DNA는 염색체 DNA이다 (즉, 히스톤 및 다른 염색체 단백질과 연관됨).

(c) CRISPR / Cas- 유사 융합 단백질

본 발명의 하나의 측면은 효과기 도메인 및 CRISPR/Cas-유사 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 이들 융합 단백질은 RNA-안내 엔도뉴클레아제에 관하여 상기 설명된 측면들 중 어느 하나에서 이용될 수 있다. CRISPR/Cas-유사 단백질은 응집되고 규칙적으로 산재된 짧은 회귀성 반복 (CRISPR)/CRISPR-연관된 (Cas) 시스템 단백질(clustered regularly interspersed short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) system protein)로부터 유래된다. 효과기 도메인은 절단 도메인, 전사 활성화 도메인, 전사 억제자 도메인, 또는 후생적 변형 도메인일 수 있다.

(i) CRISPR / Cas- 유사 단백질 도메인

융합 단백질은 CRISPR/Cas-유사 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. CRISPR/Cas-유사 단백질은 CRISPR/Cas 유형 I, 유형 II, 또는 유형 III 시스템으로부터 유래될 수 있다. 적합한 CRISPR/Cas 단백질의 비-제한 예시는 Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (또는 CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9, Cas10, Cas10d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1 (또는 CasA), Cse2 (또는 CasB), Cse3 (또는 CasE), Cse4 (또는 CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csz1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cu1966을 포함한다.

한 가지 구체예에서, 융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질은 유형 II CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래된다. 예시적인 측면에서, 융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질은 Cas9 단백질로부터 유래된다. Cas9 단백질은 상기 식별된 것들과 같은 임의의 적합한 종으로부터 나온 것일 수 있다.

일반적으로, CRISPR/Cas-유사 단백질은 적어도 하나의 RNA 인식 및/또는 RNA 결합 도메인을 포함한다. RNA 인식 및/또는 RNA 결합 도메인은 안내 RNA와 상호작용한다. CRISPR/Cas 단백질은 또한 뉴클레아제 도메인 (즉, DNase 또는 RNase 도메인), DNA 결합 도메인, 헬리카아제 도메인, RNAse 도메인, 단백질-단백질 상호작용 도메인, 이량체화 도메인, 뿐만 아니라 다른 도메인도 포함할 수 있다.

융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질은 야생형 CRISPR/Cas 단백질, 변형 CRISPR/Cas 단백질, 또는 야생형 또는 변형 CRISPR/Cas 단백질의 단편일 수 있다. CRISPR/Cas 단백질은 결합 친화도 및/또는 특이성을 증가시키고, 효소 활성을 변경시키고, 및/또는 단백질의 또 다른 특성을 변화시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, CRISPR/Cas 단백질의 뉴클레아제 (즉, DNase, RNase) 도메인은 변형될 수 있고 또는 비활성화될 수 있다. 대안으로, CRISPR/Cas 단백질은 융합 단백질의 기능에 필수적이지 않은 도메인을 제거하기 위해 절두될 수 있다. 대안으로, CRISPR/Cas 단백질은 융합 단백질의 효과기 도메인의 활성을 최적화하기 위해 절두되거나 변형될 수 있다.

몇몇 측면에서, 융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질은 야생형 Cas9 단백질 또는 이의 단편으로부터 유래될 수 있다. 다른 측면에서, 융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질은 변형 Cas9 단백질로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, Cas9 단백질의 아미노산 서열은 단백질의 하나 이상의 특성 (가령, 뉴클레아제 활성, 친화도, 안정성 등)을 변경하도록 변형될 수 있다. 대안으로, RNA-안내 절단에 관여하지 않는 Cas9 단백질의 도메인은 변형 Cas9 단백질이 야생형 Cas9 단백질보다 더 작도록 단백질로부터 제거될 수 있다.

일반적으로, Cas9 단백질은 적어도 2개의 뉴클레아제 (즉, DNase) 도메인을 포함한다. 예를 들어, Cas9 단백질은 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인 및 HNH-유사 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. 몇몇 측면에서, Cas9-유래 단백질은 오로지 하나의 기능적인 뉴클레아제 도메인 (RuvC-유사 또는 HNH-유사 뉴클레아제 도메인 중 하나)만을 함유하도록 변형될 수 있다. 이들 측면에서, Cas9-유래 단백질은 이중-가닥 핵산 내로 닉을 도입할 수 있다. 예를 들어, RuvC-유사 도메인에서 아스파르테이트에서 알리닌으로 (D10A) 전환은 Cas9-유래 단백질을 닉카아제(nickase)로 전환시킨다. 다른 측면에서, RuvC-유사 뉴클레아제 도메인 및 HNH-유사 뉴클레아제 도메인 둘 모두 변형되거나 제거될 수 있고 따라서 Cas9-유래 단백질은 이중 가닥 핵산을 절단할 수 없다. 다른 측면에서, Cas9-유래 단백질의 모든 뉴클레아제 도메인이 변형되거나 제거될 수 있고 따라서 Cas9-유래 단백질은 모든 뉴클레아제 활성이 결핍된다. 뉴클레아제 도메인은 결실 돌연변이, 삽입 돌연변이, 및/또는 치환 돌연변이에 의해 비활성화될 수 있다. 비-제한 예시에서, 융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질은 Cas9 단백질로부터 유래되고, 여기서 모든 뉴클레아제 도메인은 비활성화되거나 결실되었다.

융합 단백질은 또한 효과기 도메인을 포함한다. 효과기 도메인은 절단 도메인 또는 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 또 다른 적합한 도메인일 수 있다. 본 발명의 바람직한 측면에서, 효과기 도메인은 절단 도메인이다. 효과기 도메인은 융합 단백질의 카르복시 또는 아미노 말단부에 위치할 수 있다.

(ii) 효과기 도메인

몇몇 측면에서, 효과기 도메인은 절단 도메인이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "절단 도메인"은 DNA를 절단하는 도메인을 나타낸다. 절단 도메인은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 얻을 수 있다. 절단 도메인이 유래되는 엔도뉴클레아제의 비-제한 예시는 제한 엔도뉴클레아제 및 귀화성 엔도뉴클레아제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그(New England Biolabs Catalog) 또는 Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388을 참고한다. DNA를 절단하는 추가적인 효소가 공지된다 (가령, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 미구균 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제). 또한 Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993을 참고한다. 이들 효소 (또는 이의 기능적인 단편)들 중 하나 이상은 절단 도메인의 공급원으로서 이용될 수 있다.

몇몇 측면에서, 절단 도메인은 유형 II-S 엔도뉴클레아제로부터 유래될 수 있다. 유형 II-S 엔도뉴클레아제는 인식 부위에서 전형적으로 여러 개의 염기쌍만큼 떨어진 부위에서 DNA를 절단하고, 이에 따라 분리가능한 인식 및 절단 도메인을 가진다. 이들 효소는 일반적으로, 엇갈린(staggered) 위치에서 DNA의 각각의 가닥을 절단하기 위해 이량체를 형성하는 것과 일시적으로 연관되는 단량체이다. 적합한 유형 II-S 엔도뉴클레아제의 비-제한 예시는 BfiI, BpmI, BsaI, BsgI, BsmBI, BsmI, BspMI, FokI, MboII, 및 SapI를 포함한다. 예시적인 측면에서, 융합 단백질의 절단 도메인은 FokI 절단 도메인 또는 이의 유도체이다.

특정한 측면에서, 유형 II-S 절단은 2개의 상이한 절단 도메인의 이량체화 (이들 각각은 CRISPR/Cas-유사 단백질 또는 이의 단편에 부착됨)를 촉진하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, FokI의 절단 도메인은 특정한 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써 변형될 수 있다. 비-제한 예시로서, FokI 절단 도메인의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538에서 아미노산 잔기는 변형을 위한 표적이다. 예를 들어, 불가피한 이질이량체를 형성하는 FokI의 변형 절단 도메인은 제1 변형 절단 도메인이 아미노산 위치 490 및 538에서 돌연변이를 포함하고 제2 변형 절단 도메인이 아미노산 위치 486 및 499에서 돌연변이를 포함하는 쌍을 포함한다 (Miller et al., 2007, Nat. Biotechnol, 25:778-785; Szczpek et al., 2007, Nat. Biotechnol, 25:786-793). 예를 들어, 하나의 도메인에서 위치 490에서의 Glu (E)는 Lys (K)로 변화될 수 있고 그리고 위치 538에서의 Ile (I)는 K로 변화될 수 있고 (E490K, I538K), 그리고 또 다른 절단 도메인에서 위치 486에서의 Gln (Q)는 E로 변화될 수 있고 위치 499에서의 I는 Leu (L)로 변화될 수 있다 (Q486E, I499L). 다른 측면에서, 변형 FokI 절단 도메인은 3개의 아미노산 변화를 포함할 수 있다 (Doyon et al. 2011, Nat. Methods, 8:74-81). 예를 들어, 하나의 변형 FoKI 도메인 (ELD로 칭함)은 Q486E, I499L, N496D 돌연변이를 포함할 수 있고 다른 변형 FoKI 도메인 (KKR로 칭함)은 E490K, I538K, H537R 돌연변이를 포함할 수 있다.

예시적인 측면에서, 융합 단백질의 효과기 도메인은 FokI 절단 도메인 또는 변형 FokI 절단 도메인이다.

(iii) 추가적인 선택적 도메인

몇몇 측면에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 추가적인 도메인을 추가로 포함한다. 적합한 추가적인 도메인의 비-제한 예시는 핵 위치 신호 (NLS), 세포-침투 또는 전좌 도메인, 및 마커 도메인을 포함한다.

특정한 측면에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 핵 위치 신호를 포함할 수 있다. 일반적으로, NLS는 뻗어있는 염기성 아미노산을 포함한다. 핵 위치 신호는 해당 분야에서 공지된다 (가령, Lange et al., J. Biol. Chem., 2007, 282:5101-5105를 참고). 예를 들어, 한 가지 구체예에서, NLS는 단일분절 서열, PKKKRKV (서열 번호:4) 또는 PKKKRRV (서열 번호:5)일 수 있다. 또 다른 구체예에서, NLS는 이분절 서열일 수 있다. 또 다른 구체예에서, NLS는 KRPAATKKAGQAKKKK (서열 번호:6)일 수 있다. NLS는 융합 단백질의 N-말단, C-말단, 또는 내부 위치에 위치할 수 있다.

몇몇 측면에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 세포-침투 도메인을 포함할 수 있다. 한 가지 구체예에서, 세포-침투 도메인은 HIV-1 TAT 단백질로부터 유래된 세포-침투 펩티드 서열일 수 있다. 예시로서, TAT 세포-침투 서열은 GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV (서열 번호:7)일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 세포-침투 도메인은 인간 B형 간염 바이러스로부터 유래된 세포-침투 펩티드 서열, TLM (PLSSIFSRIGDPPKKKRKV; 서열 번호:8)일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 세포-침투 도메인은 MPG (GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV; 서열 번호:9 또는 GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV; 서열 번호:10)일 수 있다. 추가적인 측면에서, 세포-침투 도메인은 Pep-1 (KETWWETWWTEWSQPKKKRKV; 서열 번호:11), VP22, 헤르페스 바이러스로부터의 세포 침투 펩티드, 또는 폴리아르기닌 펩티드 서열일 수 있다. 세포-침투 도메인은 융합 단백질의 N-말단, C-말단, 또는 내부 위치에 위치할 수 있다.

다른 측면에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 마커 도메인을 포함할 수 있다. 마커 도메인의 비-제한 예시는 형광 단백질, 정제 태그, 및 에피토프 태그를 포함한다. 몇몇 측면에서, 마커 도메인은 형광 단백질일 수 있다. 적합한 형광 단백질의 비-제한 예시는 녹색 형광 단백질 (가령, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, EGFP, Emerald, Azami Green, Monomeric Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), 황색 형광 단백질 (가령 YFP, EYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellow1,), 청색 형광 단백질 (가령 EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1, GFPuv, Sapphire, T-sapphire), 청록색 형광 단백질 (가령 ECFP, Cerulean, CyPet, AmCyan1, Midoriishi-Cyan), 적색 형광 단백질 (mKate, mKate2, mPlum, DsRed monomer, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-Monomer, HcRed-Tandem, HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRasberry, mStrawberry, Jred), 및 주황색 형광 단백질 (mOrange, mKO, Kusabira-Orange, Monomeric Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato) 또는 임의의 다른 적합한 형광 단백질을 포함한다. 다른 측면에서, 마커 도메인은 정제 태그 및/또는 에피토프 태그일 수 있다. 예시적인 태그는 글루타티온-S-전이효소 (GST), 키틴 결합 단백질 (CBP), 말토오스 결합 단백질, 티오레독신 (TRX), 폴리(NANP), 직렬 친화도 정제 (TAP) 태그, myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, HA, nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 6xHis, 비오틴 카르복실 담체 단백질 (BCCP), 및 칼모듈린을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

(iv) 융합 단백질 이량체

본 발명은 또한, 상기 설명된 바와 같은 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하는 이량체의 용도를 고려한다. 이량체는 동질이량체 또는 이질이량체일 수 있다. 몇몇 측면에서, 이질이량체는 2개의 상이한 융합 단백질을 포함한다. 다른 측면에서, 이질이량체는 하나의 융합 단백질 및 추가적인 단백질을 포함한다.

몇몇 측면에서, 이량체는 2개의 융합 단백질 단량체가 일차 아미노산 서열에 관하여 동일한 동질이량체이다. 예를 들어, 각각의 융합 단백질 단량체는 동일한 Cas9 유사 단백질 및 동일한 FokI 절단 도메인을 포함한다.

다른 측면에서, 이량체는 2개의 상이한 융합 단백질의 이질이량체이다. 예를 들어, 각각의 융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질은 상이한 박테리아 종으로부터의 이종상동성 CRISPR/Cas 단백질로부터 또는 상이한 CRISPR/Cas 단백질로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 각각의 융합 단백질은 Cas9-유사 단백질을 포함할 수 있고, 여기서 Cas9-유사 단백질은 상이한 박테리아 종으로부터 유래된다. 이들 측면에서, 각각의 융합 단백질은 상이한 표적 부위 (즉, 프로토스페이서(protospacer) 및/또는 PAM 서열에 의해 구체화됨)를 인식할 것이다. 대안으로, 2개의 융합 단백질은 상이한 효과기 도메인을 가질 수 있다. 효과기 도메인이 절단 도메인인 측면에서, 각각의 융합 단백질은 상기 설명된 바와 같은 상이한 변형 FoKI 절단 도메인을 함유할 수 있다. 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 이질이량체를 형성하는 2개의 융합 단백질은 CRISPR/Cas-유사 단백질 도메인 및 효과기 도메인 둘 모두에 대해 다를 수 있다.

대안으로, 이질이량체는 하나의 융합 단백질 및 추가적인 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가적인 단백질은 징크 핑거 뉴클레아제일 수 있다. 징크 핑거 뉴클레아제는 징크 핑거 DNA 결합 도메인 및 절단 도메인을 포함한다. 징크 핑거는 세 개 (3)의 뉴클레오티드를 인식하고 결합시킨다. 징크 핑거 DNA 결합 도메인은 약 3개의 징크 핑거 내지 약 7개의 징크 핑거를 포함할 수 있다. 징크 핑거 DNA 결합 도메인은 자연적으로 발생한 단백질로부터 유래될 수 있고 또는 조작될 수 있다. 예를 들어, Beerli et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; Zhang et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(43):33850-33860; Doyon et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26:702-708; 및 Santiago et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:5809-5814를 참고한다. 징크 핑거 뉴클레아제의 절단 도메인은 섹션 (I)(c)(ii)에서 상기 상세 설명된 임의의 절단 도메인일 수 있다. 예시적인 측면에서, 징크 핑거 뉴클레아제의 절단 도메인은 FokI 절단 도메인 또는 변형 FokI 절단 도메인이다. 이러한 징크 핑거 뉴클레아제는 FokI 절단 도메인 또는 변형 FokI 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질과 이량체로 될 것이다. 징크 핑거 뉴클레아제는 핵 위치 신호 (NLS), 세포-침투 또는 전좌 도메인으로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 도메인을 포함할 수 있다. 적합한 추가 도메인의 예시는 상기 상세 설명된다.

II. 세포

본 발명의 또 다른 측면은 특정한 게놈 유전자 자리 내에 있는 또는 이에 근접한 게놈 DNA에 위치한 적어도 하나의 외인성 서열을 포함하는 세포를 제공한다. 외인성 서열은 상기 섹션 (I)에서 설명되고 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 인식 서열(들)을 포함한다. 일반적으로, 외인성 핵산 서열은 게놈 내로 안정하게 통합되는데, 즉 이에 따라 세포 자손도 또한 외인성 핵산 서열의 염색체 복제를 포함한다. 안정한 통합을 수득하기 위해 의도되는 형질감염과 배양 프로토콜은 해당 분야에 잘 공지되고, 해당 분야의 통상의 기술자는 안정한 통합이 일어났는지에 대해 쉽게 평가할 수 있다.

적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 인식 서열(들)을 포함하는 외인성 핵산 서열은 표 2에서 열거된 비-제한 예시와 같은 게놈 유전자 자리, 또는 표 2에서 열거된 게놈 유전자 자리의 호모로그, 오쏘로그, 파라로그 내에 위치하거나 이에 근접해질 수 있다. 몇몇 구체예에서, 게놈 유전자 자리는 고수준의 유전자 발현과 연관된다. 본 발명의 외인성 핵산 서열은 본 명세서에서 설명된 바와 같은 적합한 표적 엔도뉴클레아제에 의해 접근가능한 게놈 유전자 자리 내로 통합되거나 이에 근접해질 수 있다. 특정한 구체예에서, 선택된 게놈 유전자 자리는 재조합 유전자 발현에 대하여 공지되거나 공지되지 않은 "핫(hot)" 스팟(spot) 또는 "세이프-하버(safe-harbor)" 스팟이다. 이러한 부위는 안정한 유전자 발현을 허용하기 위해 유전자 침묵 기작에 대해 저항성이고 그리고 전사적으로 활성인 것으로 공지된 게놈내 영역으로서 인식된다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 외인성 핵산 서열은 표 2에서 식별된 게놈 유전자 자리 내로 통합될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 외인성 핵산 서열은 표 2에서 식별된 게놈 유전자 자리에 근접하여 통합될 수 있다.

추가적으로, 다수의 랜딩 패드가 삽입된다면, 각각은 표 2에서 열거된 게놈 유전자 자리에서 또는 이에 가깝게 위치할 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 인식 서열(들)을 함유한 외인성 핵산 서열은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 또는 그 이상의 게놈 위치 내로 통합될 수 있다. 본 명세서에서 언급되는 바와 같이, 외인성 핵산 서열의 다중 복제물이 삽입될 수 있고, 또는 여러 가지 상이한 외인성 핵산 서열이 삽입될 수 있다.

세포는 임의의 적합한 진핵 세포일 수 있다. 예시적인 구체예에서, 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 가령 CHO-K1 라인 또는 임의의 다른 적합한 세포주로부터의 세포이다. CHO 세포가 선택되는 세포일 수 있지만, 여러 가지 다른 세포도 또한 이용될 수 있다. 일반적으로, 세포는 진핵 세포 또는 단세포 진핵 생물일 수 있다.

포유류 세포주가 이용될 때, 세포주는 임의의 확립된 세포주 또는 아직 기술되지 않은 단일 세포주일 수 있다. 세포주는 부착성이거나 비-부착성일 수 있고, 또는 세포주는 해당 분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 기술을 이용하여 부착성, 비-부착성 또는 기관형 성장을 장려하는 조건 하에 성장될 수 있다. CHO 세포 외에도, 적합한 포유류 세포주의 비-제한 예시는 SV40 (COS7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CVI 라인, 인간 배아 신장 라인 293, 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK), 생쥐 세르톨리 세포 (TM4), 원숭이 신장 세포 (CVI-76), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO), 인간 자궁경부 암세포 (HeLa), 개 신장 세포 (MDCK), 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A), 인간 폐 세포 (W138), 인간 간 세포 (Hep G2), 생쥐 유방 종양 세포 (MMT), 랫트 간암 세포 (HTC), HIH/3T3 세포, 인간 U2-OS 골육종 세포, 인간 A549 세포, 인간 K562 세포, 인간 HEK293 세포, 인간 HEK293T 세포, 인간 HCT116 세포, 인간 MCF-7 세포, 및 TRI 세포를 포함한다. 포유류 세포주의 광범위한 목록을 위하여, 해당 분야의 통상의 기술자는 American Type Culture Collection 카탈로그 (ATCC^®, Manassas, VA)를 언급할 수 있다. 특히, 재조합 단백질 생산 및 생물 제약학적 생산에 유용한 세포주, 예를 들어, CHO 세포, 생쥐 골수종 세포 (NS0), HEK293 및 HEK293T가 이용될 수 있다.

다른 구체예에서, 세포는 배양된 세포, 일차 세포, 또는 불멸 세포일 수 있다. 적합한 세포는 곰팡이 또는 효모, 가령, 피치아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 또는 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces); 곤충 세포, 가령 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)로부터의 SF9 세포 또는 드로소필라 멜라노가스테르(Drosophila melanogaster)로부터의 S2 세포; 및 동물 세포, 가령 생쥐, 랫트, 햄스터, 비-인간 영장류, 또는 인간 세포를 포함한다. 예시적인 세포는 포유류 세포이다. 포유류 세포는 일차 세포일 수 있다. 일반적으로, 이중 가닥 파손에 민감한 임의의 일차 세포가 이용될 수 있다. 세포는 여러 가지 세포 유형, 가령 섬유아세포, 근아세포, T 또는 B 세포, 대식세포, 상피 세포 등일 것이다.

다른 구체예에서, 세포는 줄기 세포일 수 있다. 적합한 줄기 세포는 제한 없이, 배아 줄기 세포, ES-유사 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 성인 줄기 세포, 만능(pluripotent) 줄기 세포, 유도만능 줄기세포, 다능(multipotent) 줄기 세포, 소능(oligopoten) 줄기 세포, 및 단능(unipotent) 줄기 세포를 포함한다.

특정한 다른 구체예에서, 세포는 배아일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 배아는 단세포 배아일 수 있다. 배아는 척추동물 또는 무척추동물일 수 있다. 적합한 척추동물은 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 및 어류를 포함한다. 적합한 포유류의 예시는 제한 없이, 설치류, 반려동물, 가축, 및 비-영장류를 포함한다. 설치류의 비-제한 예시는 생쥐, 랫트, 햄스터, 게르빌루스쥐, 및 기니 피그를 포함한다. 적합한 반려 동물은 고양이, 개, 토끼, 고슴도치, 및 페럿을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 가축의 비-제한 예시는 말, 염소, 양, 백조, 소, 라마, 및 알파카를 포함한다. 적합한 비-영장류는 카푸친(capuchin) 원숭이, 침팬지, 리머(lemur), 마카크(macaque), 마모셋(marmoset), 타마린(tamarin), 거미 원숭이, 다람쥐 원숭이, 및 버빗(vervet) 원숭이를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 조류의 비-제한 예씨는 닭, 터키, 오리, 및 거위를 포함한다. 대안으로, 동물은 곤충, 선충 등과 같은 무척추동물일 수 있다. 곤충의 비-제한 예시는 드로소필라(Drosophila), 모기, 및 누에를 포함한다.

III. 외인성 서열을 포함하는 세포를 제조하는 방법

상기 설명된 세포는 해당 분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 하지만, 몇몇 측면에서, 본 명세서에서 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 변형 효소를 위한 적어도 하나의 인식 서열을 포함하는 랜딩 패드를 포함하는 세포를 제조하는 방법은 (a) 표 2에서 열거된 게놈 유전자 자리 내에 있는 또는 이에 근접한 서열에 표적되는 적어도 하나의 표적 엔도뉴클레아제 (또는 표적 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산)를 세포 내로 도입하는 단계; (b) 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 적어도 하나의 인식 서열, 제1 상류 측면 서열, 및 제1 하류 측면 서열을 포함하는 외인성 핵산을 포함하는 적어도 하나의 공여자 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 단계, 여기서 상류 및 하류 서열은 단계 (a)의 표적된 게놈 유전자 자리의 양쪽 옆과 실질적인 서열 동일성을 가짐; 그리고 (c) 표적 엔도뉴클레아제는 표적된 게놈 유전자 자리에서 이중-가닥 파손을 도입하고 이중-가닥 파손은 상동성-유도 과정에 의해 복구되어 외인성 핵산이 게놈 유전자 자리 내에 있는 또는 이에 근접한 표적 부위 내로 통합되도록 하는 조건 하에 세포를 유지하는 단계를 포함한다. 단계 (a) 및 (b)는 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있고; 즉, 표적 엔도뉴클레아제 그리고 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 적어도 하나의 인식 서열을 포함하는 외인성 핵산을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드, 그리고 동일한 시간에 세포에 투여될 수 있고 또는 분리된 단계로 투여될 수 있다.

또 다른 측면에서, 상기 설명된 세포는 (a) 표 2에서 열거된 게놈 유전자 자리 내에 있는 또는 이에 근접한 서열에 표적되는 적어도 하나의 표적 엔도뉴클레아제 (또는 표적 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산)를 세포 내로 도입하는 단계; (b) 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 적어도 하나의 인식 서열, 제1 상류 측면 서열, 및 제1 하류 측면 서열을 포함하는 외인성 핵산을 포함하는 적어도 하나의 공여자 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 단계, 여기서 상류 및 하류 서열은 단계 (a)의 표적 엔도뉴클레아제의 인식 서열을 포함함; 및 (c) 표적 엔도뉴클레아제는 표적된 염색체 서열에 이중 가닥 파손을 도입하고 그리고 공여자 폴리뉴클레오티드에서 이중 가닥 파손을 도입하여 공여자 폴리뉴클레오티드가 선형화되도록 하는 조건 하에 세포를 유지하는 단계, 여기서 외인성 서열을 포함하는 선형화된 공여자 폴리뉴클레오티드는 절단된 염색체 서열에 직접 결찰되고, 따라서 외인성 서열이 세포의 게놈 내로 통합됨,에 의해 제조될 수 있다. 단계 (a) 및 (b)는 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다.

이에 따라, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 적어도 하나의 인식 서열을 포함하는 적어도 하나의 외인성 핵산 서열을 포함하는 세포를 제조하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 표 2에서 열거된 게놈 유전자 자리 내에 있는 또는 이에 근접한 서열에 표적되는 적어도 하나의 표적 엔도뉴클레아제 (또는 표적 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산)를 세포 내로 도입하는 단계; (b) (i) 표적된 유전자 자리에 대한 실질적인 서열 동일성을 갖는 서열 또는 (ii) 표적 엔도뉴클레아제의 인식 서열이 측면에 있는 외인성 핵산을 포함하는 적어도 하나의 공여자 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 단계; 및 (c) 외인성 핵산이 세포의 게놈 내로 통합되도록 하는 조건 하에 세포를 유지하는 단계를 포함한다. 단계 (a) 및 (b)는 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다.

폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 인식 서열을 포함하는 외인성 서열을 함유한 공여자 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥, 선형 또는 원형일 수 있다. 일반적으로, 공여자 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. 공여자 폴리뉴클레오티드는 벡터일 수 있다. 적합한 벡터는 플라스미드 벡터, 파지미드, 코스미드, 인공/미니-염색체, 전이인자(transposon), 및 바이러스 벡터를 포함한다. 공여자 폴리뉴클레오티드는 추가적인 전사 조절 시퀀서 요소, 선별 마커 서열, 및/또는 리포터 서열을 포함한다.

본 명세서에서 논의된 바와 같이, 외인성 핵산에 제공된 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 적어도 하나의 인식 서열은 바람직하게는, 세포의 게놈에서 내인성으로 존재하지 않는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 다른 첨가물 및 외인성 핵산 서열에 대한 변이가 또한, 상기 섹션 I에서 제공된다. 예를 들어, 외인성 핵산 서열은 적어도 하나의 선별 마커, 리포터 유전자에 대한 적어도 하나의 서열, 및/또는 적어도 하나의 조절성 제어 요소 서열을 선택적으로 포함할 수 있다. 추가로, 외인성 핵산 서열은 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 인식 서열의 다중 복제를 포함할 수 있고, 여기서 인식 서열은 동일하거나 상이할 수 있다.

본 발명의 세포를 제조하기 위해 본 명세서에서 설명된 방법은 동시에 다중 인식 부위를 함유한 세포를 제조하는 데에 또한 이용될 수 있다. 하나의 측면에서, 세포 내로 도입되는 외인성 핵산은 추가로, 제2 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 제2 인식 서열을 포함하고, 여기서 제1 인식 서열 및 제2 인식 서열은 각각, 상이한 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 의해 인식된다. 대안으로, 또는 추가로, 상기-설명된 방법의 단계 (a) 내지 단계 (c)는 제2 인식 서열, 제2 상류 측면 서열, 및 제2 하류 측면 서열을 포함하는 제2 외인성 핵산, 그리고 제1 표적 엔도뉴클레아제에 의해 표적되는 것보다는 상이한 게놈 유전자 자리에 표적되는 제2 표적 엔도뉴클레아제를 이용하여 반복될 수 있다. 이 과정은 추가적인 외인성 핵산 서열로 반복될 수 있다. 외인성 핵산은 추가적인 플라스미드에 또는 또 다른 적합한 형식으로 존재할 수 있다. 표적된 유전자 자리는 상기 표 2에 제시된 유전자 자리일 수 있고, 또는 해당 분야의 통상의 기술자에게 공지된 또 다른 적합한 유전자 자리일 수 있다. 이러한 단계는 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 가장 편리한 것으로 간주되는 바와 같이, 단계 (a)-(c)로 순차적으로 또는 동시에 수행될 수 있다. 임의의 사건에서, 추가적인 인식 서열은 본 명세서에서 개시된 바와 같은 임의의 인식 서열일 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 적어도 하나의 인식 서열을 함유한 외인성 핵산을 포함하는 예시적인 플라스미드의 도식적인 실례는 도 1에서 제공된다.

하나의 측면에서, 방법은 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 플라스미드를 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 외인성 핵산은 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 인식 부위를 포함한다. 플라스미드에서 외인성 서열은 상류 서열 및 하류 서열이 측면에 있으며, 여기서 상류 및 하류 서열은 표적된 유전자 자리의 양쪽과 실질적인 서열 동일성을 갖거나 또는 이용된 표적 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위를 포함한다.

논의되는 바와 같이, 한 가지 구체예에서, 외인성 핵산내 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 인식 부위는 염색체 서열에서 표적된 절단 부위의 양쪽과 실질적인 서열 동일성을 공유하는 상류 서열 및 하류 서열이 측면에 있다. 또 다른 구체예에서, 외인성 핵산내 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 인식 부위는 상류 서열 및 하류 서열이 측면에 있고, 이들 각각은 게놈 내로 외인성 핵산을 통합하는 데에 이용되는 표적 엔도뉴클레아제의 인식 서열을 포함한다. 해당 분야의 통상의 기술자는 공공으로 이용가능한 서열에 기반하여 표 2에서 식별된 임의의 유전자 자리에 대해 적합한 측면 서열을 쉽게 제조할 수 있다. 이와 유사하게, 해당 분야의 통상의 기술자는 방법에서 이용된 표적 엔도뉴클레아제의 공지된 인식 서열에 기반하여 적합한 측면 서열을 쉽게 제조할 수 있다.

외인성 서열을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드에서 상류 및 하류 서열은 표적된 염색체 서열 및 공여자 폴리뉴클레오티드 (외인성 서열을 포함)사이에서 재조합을 촉진하기 위해 선별된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 상류 서열은 표적된 절단 부위의 바로 상류의 염색체 서열과 실질적인 서열 동일성을 공유하거나 표적 엔도뉴클레아제의 인식 서열을 포함하는 핵산 서열을 나타낸다. 유사하게, 이 구체예에서 하류 서열은 표적된 절단 부위의 바로 하류의 염색체 서열과 실질적인 서열 동일성을 공유하거나 표적 엔도뉴클레아제의 인식 서열을 포함하는 핵산 서열을 나타낸다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 구절 "실질적인 서열 동일성"은 적어도 약 75% 서열 동일성을 갖는 서열을 나타낸다. 따라서, 외인성 서열을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드에서 상류 및 하류 서열은 표적 엔도뉴클레아제의 인식 서열 또는 표적된 절단 부위에 부착된 염색체 서열 (즉, 상류 또는 하류)과 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다. 예시적인 구체예에서, 외인성 서열을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드에서 상류 및 하류 서열은 표적 엔도뉴클레아제의 인식 서열 또는 표적된 절단 부위에 부착된 염색체 서열과 약 95% 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있다.

상류 또는 하류 측면 서열은 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 2500개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 한 가지 구체예에서, 상류 또는 하류 서열은 약 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 125개, 150개, 175개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 1100개, 1200개, 1300개, 1400개, 1500개, 1600개, 1700개, 1800개, 1900개, 또는 2000개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예시적인 상류 또는 하류 측면 서열은 약 20개 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 25개 내지 약 100개의 뉴클레오티드, 또는 약 40개의 뉴클레오티드 내지 약 60개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정한 구체예에서, 상류 또는 하류 측면 서열은 약 200개 내지 약 500개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

상류 및 하류 서열이 측면에 있는 인식 부위를 포함하는 외인성 핵산의 총 길이는 달라질 수 있으며 또한 달라질 것이다. 외인성 핵산은 길이의 범위가 약 25개의 뉴클레오티드 내지 약 5,500개의 뉴클레오티드일 수 있다. 다양한 구체예에서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 길이가 약 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 800개, 1000개, 1500개, 2000개, 2500개, 3000개, 3500개, 4000개, 또는 5000개의 뉴클레오티드일 수 있다.

몇몇 구체예에서, 본 명세서의 방법에서 이용되는 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 인식 부위를 포함하는 외인성 핵산은 이중-가닥, 단일-가닥, 선형 또는 원형 서열로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산은 플라스미드, 박테리아 인공 염색체 (BAC), 효모 인공 염색체 (YAC), 바이러스 벡터, 올리고뉴클레오티드, 합성 폴리뉴클레오티드, 분해에 의해 선형화된 폴리뉴클레오티드, PCR 단편, 네이키드(naked) 핵산, 리포좀 또는 폴록사머와 같은 전달 비히클과 복합된 핵산일 수 있다. 전형적으로, 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 인식 부위를 포함하는 외인성 핵산은 DNA일 것이다. 몇몇 구체예에서, 외인성 핵산은 리보뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 변형된 퓨린 또는 피리미딘 염기를 가진 뉴클레오티드, 또는 변형된 리보오스 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드를 나타낸다. 뉴클레오티드 유사체는 또한, 디데옥시 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 잠금 핵산 (LNA), 펩티드 핵산 (PNA), 및 모르폴리노를 포함한다. 뉴클레오티드는 포스포디에스테르, 포스포티오에이트, 포스포아미디트, 포스포로디아미데이트 결합, 또는 이의 조합으로 연결될 수 있다.

표적 엔도뉴클레아제 (또는 인코딩 핵산) 및 본 명세서에서 설명된 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 인식 부위를 포함하는 외인성 핵산은 여러 가지 수단에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 적합한 전달 수단은 미세주입법, 전기천공법, 초음파 천공법, 유전자총법, 칼슘 포스페이트-매개 형질감염, 양이온 형질감염, 리포좀 형질감염, 덴드리머 형질감염, 열 충격 형질감염, 뉴클레오펙션 형질감염, 마그네토펙션(magnetofection), 리포펙션(lipofection), 임페일펙션(impalefection), 광학 형질감염, 핵산의 전매 작용제-증진 흡수, 및 리포좀, 면역리포좀, 바이로좀, 또는 인공 비리온을 통한 전달을 포함한다. 한 가지 구체예에서, 표적 엔도뉴클레아제 서열 및 외인성 핵산은 뉴클레오펙션(nucleofection)에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 표적 엔도뉴클레아제 서열 및 외인성 핵산은 미세주입법에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 표적 엔도뉴클레아제 서열 및 외인성 핵산은 세포의 핵 또는 세포질 내로 미세주입될 수 있다. 대안으로, 표적 엔도뉴클레아제 서열 및 외인성 핵산은 하나의 세포 배아의 전핵 내로 미세주입될 수 있다.

폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 인식 부위를 포함하는 1개 초과의 외인성 핵산이 세포 내로 도입된다는 구체예에서, 분자는 동시에 또는 순차적으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 인식 부위를 포함하는 외인성 핵산은 동시에 도입될 수 있으며, 이때 각각의 인식부위는 특정한 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대해 특이적이다. 대안으로, 인식 부위를 포함하는 각각의 외인성 핵산은 순차적으로 도입될 수 있다.

방법은 표적 엔도뉴클레아제에 의해 도입된 이중 가닥 파손이 균질 재조합 또는 직접적인 결찰에 의해 복구되어 적어도 하나의 인식 서열을 포함하는 외인성 핵산이 표적된 게놈 유전자 자리 내로 통합되도록 하는 적절한 조건 하에 세포를 유지하는 단계를 추가로 포함한다.

일반적으로, 세포는 특정한 세포를 위해 적절한 조건 하에 유지될 것이다. 적합한 세포 배양 조건은 해당 분야에 잘 공지되고 예를 들어, Santiago et al. (2008) PNAS 105:5809-5814; Moehle et al. (2007) PNAS 104:3055-3060; Urnov et al. (2005) Nature 435:646-651; 및 Lombardo et al (2007) Nat. Biotechnology 25:1298-1306에서 설명된다. 해당 분야의 통상의 기술자는 세포를 배양하기 위한 방법이 해당 분야에 공지되고 세포 유형에 따라 달라질 수 있으며 또한 달라질 것이라는 점을 인지한다. 일과적인 최적화는 특정한 세포 유형에 대한 최적의 기술을 결정하는 데에, 모든 경우에서, 이용될 수 있다.

세포가 단세포 배아인 구체예에서, 배아는 시험관 내에서 (가령, 세포 배양에서) 배양될 수 있다. 전형적으로, 배아는 이중-가닥 파손의 복구를 허용하고 배아의 발달을 허용하기 위해 필수적인 O₂/CO₂ 비율로 적절한 배지에서 그리고 적절한 온도에서 배양된다. 배지의 적합한 비-제한 예시는 M2, M16, KSOM, BMOC, 및 HTF 배지를 포함한다. 해당 분야의 통상의 기술자는 배양 조건이 배아의 종에 따라 달라질 수 있으며 또한 달라질 것이라는 점을 인지할 것이다. 일과적인 최적화는 배아의 특정한 종에 대한 최적의 배양 조건을 결정하는 데에, 모든 경우에서, 이용될 수 있다.

몇몇 경우에, 배아는 또한, 암컷 숙주의 자궁 내로 배아를 옮김으로써 생체 내에서 배양될 수도 있다. 일반적으로, 암컷 숙주는 배아와 동일하거나 유사한 종이다. 바람직하게, 암컷 숙주는 가상-임신(pseudo-pregnant)이다. 가상-임신 암컷 숙주를 준비하는 방법은 해당 분야에 공지된다. 추가적으로, 암컷 숙주 내로 배아를 옮기는 방법도 공지된다. 생체내 배아를 배양하는 것은 배아가 발달하도록 해주고 배아로부터 유래된 동물의 정상 출산을 야기할 수 있다.

변형된 염색체 서열을 포함하는 동물은 변형된 염색체 서열에 동형인 자손을 만들기 위해 개량될 수 있다. 유사하게, 이형접합 및/또는 동형접합 동물은 관심 유전자형을 가진 다른 동물과 교배될 수 있다.

IV. 외인성 서열을 포함하는 세포를 이용하는 방법

하나 이상의 랜딩 패드 서열, 즉 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 적어도 하나의 인식 서열을 포함하는 하나 이상의 외인성 서열을 함유한 본 명세서에서 설명된 세포는 재조합 단백질, 예를 들어, 생물 제약학적 단백질의 생산에 이용될 수 있다. 구체적으로, 랜딩 패드에서 인식 서열(들)은 관심 단백질을 인코딩하는 서열의 통합을 위해 폴리뉴클레오티드 변형 효소(들) (즉, 표적 엔도뉴클레아제 및/또는 재조합 효소)에 의해 표적될 수 있다. 재조합 단백질의 생산을 위해 재표적될 수 있는 하나 이상의 랜딩 패드를 함유한 본 명세서에서 설명된 세포 및 방법을 이용하는 것에는 여러 가지 이점이 있다. 첫째, 랜딩 패드 서열(들)을 삽입하기 위해 안정한 게놈 유전자 자리 또는 유전자 자리들을 선택함으로써 (차후 재표적을 위함) 표적된 통합 (바람직한 유전 물질의 편입)의 효율을 증가시킴으로써 재조합 단백질의 생산을 증가시킬 수 있다. 게놈에서 공지되고, 안정한 위치 내로 관심 유전적 서열 (즉, 재조합 단백질 서열)을 통합시키기 위해 매우 효율적인 표적 엔도뉴클레아제 또는 재조합 효소의 이용은 재조합 단백질 서열의 효율적인 통합 (게놈 유전자 자리 또는 유전자 자리들은 표적 엔도뉴클레아제 또는 재조합 효소의 통합 효율을 증가시키기 위해 선별될 수 있음)뿐만 아니라, 또한 통합 후 단백질 서열의 지속적이고, 안정한 발현을 야기한다. 결과적으로, 이것은 증가된 세포주 안정성 그리고 감소된 클론-대-클론 및 분자-대-분자 (재조합 단백질) 이질성을 초래하고, 이는 전반적으로 감소된 세포주 발달 시간 및 증가된 단백질 생산을 야기한다. 추가로, 본 명세서에서 설명된 방법을 이용하여, 1개 초과의 상이한 재조합 단백질의 통합 또는 동일한 재조합 단백질의 다중 복제의 표적된 통합을 위한 다수의 랜딩 패드 부위를 포함하는 세포를 발생시키는 것이 가능하고, 그렇게 함으로써 성취될 수 있는 단백질 생산에 관하여 최대 융통성을 제공한다. 추가로, 선택적인 서열, 가령 선별 마커, 리포터 서열, 및/또는 조절성 제어 요소 서열의 포함은 바이오산물의 역량을 추가로 맞춤 제작할 수 있게 한다.

따라서, 추가적인 측면에서, 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 적어도 하나의 인식 서열을 포함하는 외인성 서열(들) 또는 하나 이상의 랜딩 패드를 함유한 본 명세서에서 설명된 세포는 재조합 단백질 또는 관심 단백질의 생산을 위해 재표적될 수 있고, 이 방법은 (a) 상류 측면 서열 및 하류 측면 서열이 측면에 있는, 재조합 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 구조체를 본 발명의 세포 (폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 적어도 하나의 인식 서열을 함유한 통합된 외인성 서열(들)을 포함하는 세포) 내로 도입하는 단계, 여기서 상류 측면 서열 및 하류 측면 서열은 단계 (b)의 표적 엔도뉴클레아제의 인식 서열을 측면에 배치하는 염색체 서열과 실질적으로 동일함; (b) 세포의 염색체 서열에서 통합된 외인성 서열(들)에 존재하는 특이적인 인식 서열에 표적된 적어도 하나의 표적 엔도뉴클레아제를 세포 내로 도입하는 단계, 여기서 표적 엔도뉴클레아제는 인식 서열에서 이중-가닥 파손을 도입함; 및 (c) 이중-가닥 파손은 상동성-유도 과정에 의해 복구되어 재조합 단백질을 인코딩하는 서열이 염색체 내로 통합되도록 하는 조건 하에 세포를 유지하는 단계를 포함한다. 재조합 단백질(들)은 표준 단백질 발현 절차 및 프로토콜을 이용하여 재표적된 세포로부터 발현될 수 있다. 단계 (a) 및 (b)는 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다; 즉, 재조합 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 구조체를 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드 그리고 표적 엔도뉴클레아제는 동시에 세포에 투여될 수 있고 또는 분리된 단계로 투여될 수 있다.

또 다른 측면에서, 하나 이상의 랜딩 패드 서열을 함유한 본 명세서에서 설명된 세포는 (a) 세포의 염색체 서열에서 통합된 외인성 서열에 존재하는 특이적인 인식 서열에 표적된 적어도 하나의 표적 엔도뉴클레아제를 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 적어도 하나의 인식 서열을 포함하는 통합된 외인성 서열을 포함하는 세포 내로 도입함으로써; (b) 표적 엔도뉴클레아제의 인식 서열이 측면에 있는, 재조합 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 구조체를 세포 내로 도입함으로써; 및 (c) 표적 엔도뉴클레아제는 랜딩 패드내 표적된 인식 서열에 이중 가닥 파손을 도입하고 그리고 발현 구조체에서 이중 가닥 파손을 도입하여 발현 구조체가 선형화되도록 하는 조건 하에 세포를 유지함으로써 재조합 단백질의 생산을 위해 재표적될 수 있고, 여기서 선형화된 발현 구조체는 절단된 인식 서열에 직접 결찰되고, 따라서 재조합 단백질을 인코딩하는 서열은 염색체 내로 통합된다. 재조합 단백질(들)은 표준 단백질 발현 절차 및 프로토콜을 이용하여 재표적된 세포로부터 발현될 수 있다. 단계 (a) 및 (b)는 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다.

또 다른 측면에서, 하나 이상의 랜딩 패드를 포함하는 본 명세서에서 설명된 세포는 (a) 적어도 하나의 통합된 외인성 재조합 효소 인식 서열을 포함하는 세포를 제공함으로써; (b) 세포의 염색체 서열에 통합된 재조합 효소 인식 서열을 인식하는 적어도 하나의 재조합 효소를 세포 내로 도입함으로써; (c) 재조합 효소에 대한 인식 부위가 측면에 있는, 재조합 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 구조체를 세포 내로 도입함으로써; (d) 재조합 효소는 염색체 서열 및 발현 구조체 사이의 서열을 교환하여 재조합 단백질을 인코딩하는 서열이 염색체 내로 통합되도록 하는 조건 하에 세포를 유지시킴으로써 재조합 단백질의 생산을 위해 재표적될 수 있다. 재조합 단백질(들)은 표준 단백질 발현 절차 및 프로토콜을 이용하여 재표적된 세포로부터 발현될 수 있다. 단계 (a) 및 (b)는 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다.

현재 방법에서, 발현 구조체는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 해당 분야의 통상의 기술자의 지식과 능력 내에서 달라질 수 있다. 예를 들어, 발현 구조체는 단일 재조합 단백질의 다중 복제를 포함할 수 있다. 발현 구조체는 적어도 2개의 상이한 재조합 단백질을 인코딩하는 서열을 대안으로 또는 추가적으로 포함할 수 있다. 발현 구조체는 적어도 하나의 선별 마커 (아래 논의됨), 적어도 하나의 리포터 유전자 서열, 및/또는 적어도 하나의 조절성 서열 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 단백질을 인코딩하는 서열은 진핵 세포에서의 발현을 위해 적합한 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터 제어 서열은 본질적이거나 조절될 수 있다 (즉, 유도성 또는 조직-특이적). 적합한 구성적 프로모터 제어 서열은 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 프로모터 (CMV), 유인원 바이러스 (SV40) 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 라우스(Rous) 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 생쥐 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 포스포글리세르에이트 키나아제 (PGK) 프로모터, 신장 인자 (ED1)-알파 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 액틴 프로모터, 튜불린 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 이의 단편 또는 임의의 전술한 것의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 적합한 유도성 프로모터 제어 서열의 비-제한 예시는 항생제에 의해 조절되는 것들 (가령, 테트라사이클린-유도성 프로모터), 및 금속 이온에 의해 조절되는 것들 (가령, 메탈로티오네인-1 프로모터), 스테로이드 호르몬, 소분자 (가령, 알코올-조절된 프로모터), 열충격 등을 포함한다. 조직 특이적 프로모터의 비-제한 예시는 B29 프로모터, CD14 프로모터, CD43 프로모터, CD45 프로모터, CD68 프로모터, 데스민 프로모터, 엘라스타아제-1 프로모터, 엔도글린 프로모터, 피브로넥틴 프로모터, Flt-1 프로모터, GFAP 프로모터, GPIIb 프로모터, ICAM-2 프로모터, INF-β 프로모터, Mb 프로모터, NphsI 프로모터, OG-2 프로모터, SP-B 프로모터, SYN1 프로모터, 및 WASP 프로모터를 포함한다. 프로모터 서열은 야생형일 수 있고 또는 이는 더 효율적이거나 효과적인 발현을 위해 변형될 수 있다. 존재할 수 있는 다른 제어 요소는 추가적인 전사 조절 및 제어 요소 (즉, 부분적 프로모터, 프로모터 트랩, 시작 코돈, 증폭자, 인트론, 절연체, 폴리A 신호, 종결 신호 서열, 및 다른 발현 요소)를 포함하고 또한 존재할 수 있다.

재조합 단백질은 생물치료학적 및/또는 진단학적 적용에서 유용한 것들, 이뿐만 아니라 산업 적용에서 유용한 임의의 재조합 단백질을 비롯하여, 임의의 재조합 단백질일 수 있다. 예를 들어, 재조합 단백질은 제한 없이, 항체, 항체 단편, 단일클론 항체, 인간화 항체, 인간화 단일클론 항체, 키메라 항체, IgG 분자, IgG 중쇄, IgG 경쇄, Fc 영역, IgA 분자, IgD 분자, IgE 분자, IgM 분자, Fc 융합 단백질, 백신, 성장 인자, 사이토카인, 인터페론, 인터류킨, 호르몬, 응고 (또는 응집) 인자, 혈액 성분, 효소, 기능식품 단백질, 글리코단백질, 전술한 것들 중 어느 하나의 기능적 단편 또는 기능적 변이체, 또는 전술한 단백질들 중 어느 하나를 포함하는 융합 단백질 및/또는 이의 기능적 단편 또는 변이체일 수 있다. 예시적인 구체예에서, 재조합 단백질은 인간 단백질 또는 인간화 단백질이다.

몇몇 구체예에서, 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 증폭될 수 있는 선별 마커, 가령 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실 전이효소 (HPRT), 디하이드로 폴레이트 환원효소 (DHFR), 및/또는 글루타민 생성효소 (GS)를 인코딩하는 핵산 서열에 연결될 수 있다.

다른 구체예에서, 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 리포터 단백질, 가령 형광 단백질 (적합한 형광 단백질은 상기 섹션 I에서 열거됨), 글루타티온-S-전이효소 (GST), 키틴 결합 단백질 (CBP), 말토오스 결합 단백질, 베타-갈락토시다아제, 티오레독신 (TRX), 비오틴 카르복실 담체 단백질 (BCCP), 또는 칼모듈린을 인코딩하는 핵산 서열에 연결될 수 있다.

V. 키트

본 발명의 추가적인 측면은 관심 재조합 단백질의 발현을 위한 키트를 아우른다. 키트는 상기 설명된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 인식 부위를 포함하는 적어도 하나의 외인성 서열을 포함하는 세포주, 인식 부위에 상응하는 적절한 폴리뉴클레오티드 변형 효소, 및 관심 재조합 단백질을 인코딩하는 서열의 삽입을 위한 구조체를 포함하고, 여기서 구조체는 인식 부위 서열에 상응하는 측면 서열의 쌍 또는 인식 부위 서열을 측면에 배치하는 게놈 DNA를 추가로 포함한다. 키트는 또한 관심 재조합 단백질을 인코딩하는 서열의 표적된 통합을 완료시키기 위한 설명서도 포함한다. 한 가지 구체예에서, 관심 재조합 단백질을 인코딩하는 서열의 삽입을 위한 구조체는 선별 마커에 대한 서열, 리포터 유전자 서열, 및/또는 조절성 제어 서열을 추가로 포함한다. 따라서, 키트는 상기 논의된 바와 같은 재조합 단백질의 발현 및 생산을 위한 재표적 세포에서 유용한 재료 및 시약을 제공한다.

몇몇 측면에서, 키트는 상기 설명된 바과 같은 인식 부위를 포함하는 1개 초과의 외인성 서열을 포함하는 세포주 (즉, 부위가 동일하거나 상이할 수 있는 1개 초과의 인식 부위를 야기함), 그리고 인식 부위(들)에 상응하는 적절한 폴리뉴클레오티드 변형 효소(들)을 포함한다.

몇몇 측면에서, 키트는 관심 재조합 단백질을 인코딩하는 서열의 삽입을 위한 1개 초과의 구조체를 포함하고, 여기서 구조체는 인식 부위 서열에 상응하는 측면 서열의 쌍 및/또는 인식 부위 서열을 측면에 배치하는 게놈 DNA를 추가로 포함한다.

세포주는 소정의 부피의 생존가능 세포를 포함하는 샘플에서 제공되는, CHO 세포주 세포일 수 있다. 몇몇 측면에서 세포는 냉동될 수 있다.

키트는 표적된 통합을 이용하여 단백질의 재조합 발현을 위한 개시된 발명을 실시하기 위해 유용한 하나 이상의 추가적인 시약을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 일반적으로 하나 이상의 분리된 조성물로서, 선택적으로는, 시약의 융화성을 허용할 혼합물로서 시약을 담은 하나 이상의 용기가 포함된 패키지를 포함한다. 키트는 또한, 완충액(들), 희석제(들), 배양 배지/배지들, 표준물(들), 및/또는 상기 상세 설명된 방법의 임의의 단계를 가공처리하거나 수행하는 데에서 유용한 임의의 다른 재료와 같이, 사용자 관찰방식으로부터 바람직할 수 있는, 다른 재료(들)를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 제공된 키트는 바람직하게, 상기 섹션 (I)에서 상세 설명된 바와 같은 재조합 단백질을 발현시키기 위한 설명서를 포함한다. 키트에 포함되는 설명서는 포장 재료에 부착될 수 있고 또는 패키지 삽입물로서 포함될 수 있다. 설명서는 전형적으로 필기 또는 인쇄물이지만, 그들이 이런한 것에 제한되지 않는다. 이러한 설명서를 저장하고 최종 사용자에게 이를 전할 수 있는 임의의 매체가 본 발명에 의해 고려된다. 이러한 매체는 전자식 저장 매체 (가령, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광학 매체 (가령, CD ROM) 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "설명서"는 설명서를 제공하는 인터넷 사이트의 주소를 포함할 수 있다.

정의

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 공통으로 이해되는 의미를 갖는다. 다음 참고문헌은 해당 분야의 통상의 기술자에게 본 발명에서 사용된 다수의 용어의 일반적인 정의를 제공한다: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); 및 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 다음 용어는 달리 명시되지 않는 한 그들이 가진 의미를 나타낸다.

본 발명 또는 이의 바람직한 구체예(들)의 요소를 도입할 때, 관사 "a", "an", "the" 및 "상기"는 요소들 중 하나 이상이 있는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 용어 "포함하는", "비롯한" 및 "갖는"은 포괄적인 것으로 의도되고 열거된 요소 외에도 추가적인 요소가 있을 수 있다는 점을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "유전자"는 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 영역 (엑손과 인트론을 포함), 뿐만 아니라 유전자 산물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역을, 이러한 조절 서열이 코딩 및/또는 전사 서열에 인접하는지에 상관 없이, 나타낸다. 이에 따라, 유전자는 프로모터 서열, 종결자, 번역 조절 서열, 가령 리보좀, 결합 부위 및 내부 리보좀 유입 부위, 증폭자, 침묵자(silencer), 절연체, 경계 요소, 복제 개시점, 매트릭스 부착 부위 및 유전자 자리 조절 영역을 포함하지만, 이에 반드시 제한되지는 않는다.

용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 선형 또는 원형 입체구조의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 폴리머를 나타낸다. 본 발명의 목적을 위하여, 이들 용어는 폴리머의 길이에 관해 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다. 상기 용어는 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티 (가령, 포스포로티오에이트 골격)로 변형되는 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 아우를 수 있다. 일반적으로, 특정한 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기-쌍 특이성을 갖는다; 즉, A의 유사체는 T와 염기-쌍일 것이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드 변형 효소"는 표적 엔도뉴클레아제 또는 부위-특이적 재조합 효소를 나타낸다. 표적 엔도뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN), CRIPSR/Cas-유사 엔도뉴클레아제, I-TevI 뉴클레아제 또는 관련된 단량체 하이브리드, 및 인공 표적된 DNA 이중 가닥 파손 유도제를 포함할 수 있다. 부위-특이적 재조합 효소는 람다 통합 효소, Cre 재조합 효소, FLP 재조합 효소, 감마-델타 해리 효소, Tn3 해리 효소, ΦC31 통합 효소, Bxb1-통합 효소, 및 R4 통합 효소를 포함할 수 있다.

용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 폴리머를 나타내는 데에 호환적으로 이용된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "근접한"은 게놈 유전자 자리에 가까운 위치를 의미한다. 근접한 위치는 소정의 수의 뉴클레오티드, 즉 약 10개, 약 20개, 약 50개, 약 100개, 약 200개 뉴클레오티드 내에 있는 위치, 또는 5 kb, 50 kb, 또는 500 kb 및 사이에 있는 값(intervening value)을 비롯하여 더 먼 거리 내에 있는 위치를 나타낸다. 대안으로, 삽입이 하나의 식별된 유전자 자리에, 또 다른 식별된 유전자 자리, 즉 유전자간 서열보다 상대적으로 더 가깝다면, 삽입은 특정 게놈 유전자 자리에 근접할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "인식 부위"는 결합을 위한 충분한 조건이 존재한다는 조건으로, 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 의해 인식되고 결합되는 핵산 서열을 나타낸다. 폴리뉴클레오티드 변형 효소는 인식 부위를 결합시키고 절단하는 표적 엔도뉴클레아제일 수 있다. 대안으로, 폴리뉴클레오티드 변형 효소는 인식 부위를 함유한 서열 사이에서 교환을 매개하는 재조합 효소일 수 있다.

용어 "상류" 및 "하류"는 고정된 위치와 비교하여 핵산 서열내 위치를 나타낸다. 상류는 위치에 대해 5' (즉, 가닥의 5' 말단 근처)쪽인 영역을 나타내고 그리고 하류는 위치에 대해 3' (즉, 가닥의 3' 말단 근처)쪽인 영역을 나타낸다.

핵산 및 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 기술이 해당 분야에서 공지된다. 전형적으로, 이러한 기술은 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계 및/또는 인코딩된 아미노산 서열을 결정하는 단계, 그리고 그렇게 함으로써, 이들 서열을 제2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 비교하는 단계를 포함한다. 게놈 서열도 또한 이 방식으로 결정되고 비교될 수 있다. 일반적으로 동일성은 각각, 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산 상응을 나타낸다. 2개 이상의 서열 (폴리뉴클레오티드 또는 아미노산)은 그들의 동일성 퍼센트를 결정함으로써 비교될 수 있다. 핵산 또는 아미노산 서열이든 간에, 2개의 서열의 동일성 퍼센트는 더 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한 2개의 정렬된 서열 사이의 정확한 매치(match) 수이다. 핵산 서열에 대한 대략적인 정렬은 Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)의 국부 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 이 알고리즘은 Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USAdp 의해 개발된, 그리고 Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)에 의해 정규화된 스코어링 매트릭스(scoring matrix)를 이용함으로써 아미노산 서열에 적용될 수 있다. 서열의 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 이 알고리즘 예시적인 시행은 "BestFit" 유용성 적용에서 Genetics Computer Group (Madison, Wis.)에 의해 제공된다. 서열 간의 유사성 또는 동일성 퍼센트를 계산하기 위한 다른 적합한 프로그램이 일반적으로 해당 분야에서 공지되고, 예를 들어, 또 다른 정렬 프로그램은 디폴트 파라미터로 이용되는 BLAST이다. 예를 들어, BLASTN 및 BLASTP는 다음 디폴트 파라미터를 사용하여 이용될 수 있다: 유전자 코드=표준; 필터=없음; 가닥=둘 모두; 컷오프(cutoff)=60; 예상=10; 매트릭스(Matrix)=BLOSUM62; 설명=50개 서열; 분류(sort by)=고득점(HIGH SCORE); 데이터베이스=비-중복, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS 번역+Swiss 단백질+Spupdate+PIR. 이들 프로그램의 상세 설명은 GenBank 웹사이트 상에서 찾아볼 수 있다. 본 명세서에서 설명된 서열에 관하여, 서열 동일성의 바람직한 정도의 범위는 대략 80% 내지 100%이고 임의의 정수 값은 그들 사이에 있다. 전형적으로, 서열 간에 서열 동일성은 적어도 70-75%, 바람직하게는 80-82%, 더 바람직하게는 85-90%, 더욱 바람직하게는 92%, 더더욱 바람직하게는 95%, 그리고 가장 바람직하게는 98% 서열 동일성이다.

본 발명을 상세히 설명하여, 변형 및 변이는 첨부된 청구항에서 정의되는 본 발명의 범위에 벗어남이 없이 가능하다는 점을 인지할 것이다. 더욱이, 상기-열거된 구체예 또는 반복들 중 어느 하나는 임의의 조합으로 복합될 수 있다.

실시예

실시예 1: ZFN 인식 랜딩 패드의 삽입

염기쌍 12931-12970에서의 Refseq ID NW_003618207.1, Rosa26, 및 Neu3을 표적하도록 ZFN 쌍을 설계하였다. Refseq ID NW_003618207.1 염기쌍 12931-12970, Rosa26, 또는 Neu3을 표적하는 ZFN을 현탁액 개작된 CHO K1 세포주 내로 형질감염시켰다. 형질감염 후 3일에, CEL-I Surveyor 돌연변이 검출 어세이로 또는 InDels의 직접 서열화 (삽입/결실)로 형질감염 풀에서의 NW_003618207.1, Rosa26, 및 Neu3 부위에서 ZFN 절단 효율을 평가하였다. InDels의 직접 서열화로 ZFN 활성을 계산하였을 때, 각각 개별적인 부위로부터의 적어도 40개 PCR 증폭절이 분석에서 이용되었다. 내인성 CHO 부위 NW_003618207.1, Rosa26, 및 Neu3 부위에서 ZFN 활성은 각각, 대략 16%, 31% 및 41%인 것으로 추정되었다.

ZFN 확인 후, hAAVS1 ZFN 쌍에 대한 인식 서열을 포함하는 랜딩 패드를 CHO 게놈내 이들 3개의 상이한 부위에 도입하였다: Refseq ID NW_003618207.1, Rosa26, 및 Neu3. 도 1에서 나타나는 바와 같이, Refseq ID NW_003618207.1, Rosa26 및 Neu3 서열에 대해 5' 및 3' 상동성 팔(homology arm)이 측면에 있는 AAVS1 ZFN 인식 서열을 함유한 공여자 플라스미드를 제작하였다.

도 1에서 도시된 바와 같이, Refseq ID NW_003618207.1 염기쌍 12931-12970, Rosa26, 또는 Neu3을 표적하는 ZFN으로, 현탁액 개작된 CHO K1 세포주 내로 플라스미드 공여자를 공동형질감염시켰다. 형질감염 후 3일에, CEL-I Surveyor 돌연변이 검출 어세이로 형질감염 풀에서의 NW_003618207.1, Rosa26, 및 Neu3 부위의 각각에서 ZFN 절단 효율을 확인하였다.

양성 CEL-I 결과에 따르면, 3개의 명시된 유전자 자리 내로 AAVS1 랜딩 패드의 표적된 통합이 형질감염 풀에서 발생하였는지에 대해 결정하기 위해 접합 PCR을 수행하였다. 도 2에서 나타난 바와 같이, 왼쪽 (5') 상동성 팔 ("LHA") 또는 오른쪽 (3') 상동성 팔 ("RHA")의 바로 바깥족의 CHO 게놈 DNA에 상응하는 프라이머 그리고 AAVS1 랜딩 패드에 상응하는 상보적 프라이머로 접합 PCR을 수행하였다. 양성 PCR 산물은 ZFN-매개 표적된 통합 (TI) 사건이 유전자 자리의 각각에 대해 형질감염 풀에서 존재하였다는 점을 명시하였다.

실시예 2: ZFN 인식 랜딩 패드의 활성

실시예 1에서 제조된 접합 PCR 양성 형질감염 풀은 한계 희석 클로닝으로 클로닝된 단일 세포였다. 실시예 1에서 설명된 바와 같은 접합 PCR로 NW_003618207.1, Rosa26, 및 Neu3에서 랜딩 패드의 통합에 대해 단일 세포 클론을 스크리닝하였다. 양성 클론의 규모를 확대하였고(scaled up) 그리고 이를 분석하였다.

Refseq ID NW_003618207.1 및 Rosa26 유전자 자리에서의 두 대립 유전자 모두에서 통합된 인간 AAVS1 랜딩 패드를 나타내는 클론을 단리시키고 이의 규모를 확대하였다. 이후 인간 AAVS1 ZFN 쌍으로 AAVS1 TI 클론을 개별적으로 형질감염시켰다. 형질감염 후 3일에, 상기 설명된 TI 클론내 hAAVS 랜딩 패드에서 CEL-I 어세이 또는 PCR 및 InDels의 직접 서열화를 수행하여 외인성 랜딩 패드에서의 AAVS1 ZFN 절단 효율을 평가하였다. AAVS1 ZFN 인식 서열을 측면에 배치하는 정방향 및 역방향 프라이머는 3개의 유전자 자리 (도 2에서 도시된 바와 같이, jPCR F3 및 R2)에서 통합되었다. PCR 산물을 직접 서열화하거나 CEL-I 뉴클레아제로 처리하고 그리고 겔 전기영동으로 분석하였다.

Refseq ID NW_003618207.1 유전자 자리에서의 결과는 PCR 산물을 직접 서열화할 때 52%의 평균 hAAVS1ZFN 절단 효율을 입증하였다. Rosa26 유전자 자리에서 랜딩 패드를 나타내는 것으로 제조된 클론은 Cel1 어세이를 이용할 때 18%의 평균 hAAVS1 ZFN 절단 효율을 입증하였다. Neu3 유전자 자리에서 랜딩 패드를 나타내는 것으로 제조된 클론은 PCR 산물을 직접 서열화함으로써 16%의 평균 hAAVS1 ZFN 절단 효율을 입증하였다. 세포 성장 및 생존 능력에서 불리한 표현형의 변화가 Neu3 유전자 자리에서 통합된 랜딩 패드를 함유한 클론에서 관찰되었고, 이는 Rosa26 및 Refseq ID NW_003618207.1과 비교할 때 더 낮은 효율을 설명할 수 있다.

이들 결과는 외인성 ZFN 인식 서열이 정확한 위치에서 CHO 게놈 내로 통합되어 조작된 랜딩 패드를 발생시킬 수 있다는 점을 입증한다.

실시예 3: ZFN 인식 랜딩 패드에서 재조합 단백질의 통합

Refseq ID NW_003618207.1과 같이, 삽입을 위한 CHO 게놈 유전자 자리는 통합의 용이성 및/또는 바람직한 발현 특징에 기반하여 결정될 수 있다. 표적 엔도뉴클레아제, 가령 ZFN은 선별된 게놈 유전자 자리에 기반하여 선별되거나 설계될 수 있다. 실시예 1과 2에서 설명된 바와 같이, 하나 이상의 인식 서열, 리포터 및/또는 선별 마커, 그리고 하나 이상의 조절 요소를 함유한 적합한 랜딩 패드를 포함하는 플라스미드를 제조할 수 있다. 플라스미드를 표적 엔도뉴클레아제와 함께 CHO 세포 내로 삽입할 수 있고, 그리고 PCR, 서열화, 또는 서던 블롯(Southern blot)과 같은 방법을 이용하여 랜딩 패드의 통합을 확인할 수 있다.

이후, 랜딩 패드 부위에서 표적된 통합을 위해 재조합 단백질 발현 구조체를 제조할 수 있다. 표적된 통합에 바람직한 서열 ("페이로드")은 독립된 발현 카세트 2개 이상, IgG 중쇄 및/또는 IgG 경쇄와 같이, 관심 재조합 단백질(들)에 대해서 1개 또는 2개, 및 선별 마커에 대해서는 또 다른 것을 포함할 수 있다. 페이로드는 5' 및 3' 상동성 팔이 측면에 있어 표적 엔도뉴클레아제 (가령, ZFN의 쌍)를 이용하여 상동성-유도 과정에 의한 통합을 허용할 수 있다. 대안으로, 페이로드는 표적 엔도뉴클레아제 인식 서열 (즉, ZFN 인식 서열), 또는 부위-특이적 재조합 효소 인식 서열이 측면에 있어, 각각 접착성 부착 말단의 직접적인 결찰 또는 재조합 효소-매개 카세트 교환 (RMCE)을 통해 페이로드의 표적된 통합을 허용할 수 있다. 도식적 표현은 도 3에서 제공된다. 이후 세포를 스크리닝하여 통합이 무작위가 아닌 표적된 부위에서 일어났다는 점을 확인할 수 있다. 이후 재조합 단백질 또는 단백질들의 생산을 위해 세포를 이용할 수 있다.

이들 분석의 결과는 표적된 통합이 이용가능한 선별법을 이용할 때 무작위 통합보다 더 큰 속도로 일어난다는 점, 그리고 재조합 단백질의 발현이 안정하고 균일하며 재조합 단백질이 무작위로 통합된 세포와 비교하여 적합한 수준으로 제공된다는 점을 입증한다는 것으로 예상된다.

SEQUENCE LISTING <110> SIGMA-ALDRICH CO. LLC BAHR, Scott BORGSCHULTE, Trissa KAYSER, Kevin <120> TARGETED INTEGRATION <130> 047497-477357 <150> US 61/837,019 <151> 2013-06-19 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 1 atcttgcctg atttgtaaat acaaagttga ctgtgaa 37 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 2 ggctcctact ctgtttgcaa gcgatgcata catgcaa 37 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 3 accccacagt ggggccacta gggacaggat 30 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 4 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 5 Pro Lys Lys Lys Arg Arg Val 1 5 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 6 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 7 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Pro Lys Lys 1 5 10 15 Lys Arg Lys Val 20 <210> 8 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 8 Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp Pro Pro Lys Lys Lys 1 5 10 15 Arg Lys Val <210> 9 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 9 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Trp Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 10 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 10 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 11 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 11 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20

Claims

표 2에서 열거된 적어도 게놈 유전자 자리 내에 있는 또는 이에 근접한 게놈 DNA에 위치한 적어도 하나의 외인성 핵산 서열을 포함하는 단리된 세포에 있어서, 각각의 외인성 핵산 서열은 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 적어도 하나의 인식 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 세포.
제1항에 있어서, 세포는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 단리된 세포.
제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 하나의 인식 서열은 세포의 게놈에서 내인성으로 존재하지 않는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 세포.
제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 변형 효소는 표적 엔도뉴클레아제, 부위-특이적 재조합 효소, 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단리된 세포.
제4항에 있어서, 표적 엔도뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN), CRIPSR 엔도뉴클레아제, I-TevI 뉴클레아제 또는 관련된 단량체 하이브리드, 및 인공 표적된 DNA 이중 가닥 파손 유도제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단리된 세포.
제4항에 있어서, 부위-특이적 재조합 효소는 람다 통합 효소, Cre 재조합 효소, FLP 재조합 효소, 감마-델타 해리 효소, Tn3 해리 효소, ΦC31 통합 효소, Bxb1-통합 효소, 및 R4 통합 효소로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단리된 세포.
전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 인식 서열은 제1 ZFN 쌍에 의해 인식되는 것을 특징으로 하는 단리된 세포.
제7항에 있어서, 제2 인식 서열은 제1 ZFN 쌍과는 다른 제2 ZFN 쌍에 의해 인식되는 것을 특징으로 하는 단리된 세포.
제7항 또는 제8항에 있어서, 제1 및 제2 ZFN 쌍은 hSIRT, hRSK4, 및 hAAVS1로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단리된 세포.
전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 핵산 서열은 적어도 하나의 선별 마커(selectable marker) 서열, 적어도 하나의 리포터 서열, 적어도 하나의 조절성 제어 서열 요소, 또는 이의 조합을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 세포.
폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 적어도 하나의 인식 서열을 포함하는 적어도 하나의 외인성 핵산 서열을 포함하는 세포를 제조하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
a) 표 2에서 열거된 게놈 유전자 자리 내에 있는 또는 이에 근접한 서열에 표적되는 적어도 하나의 표적 엔도뉴클레아제를 세포 내로 도입하는 단계,
b) (i) 표적된 게놈 유전자 자리에 대한 실질적인 서열 동일성을 가지는 서열 또는 (ii) 표적 엔도뉴클레아제의 인식 서열이 측면에 있는(flanked) 외인성 핵산을 포함하는 적어도 하나의 공여자 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 단계; 그리고
c) 외인성 핵산이 세포의 게놈 내로 통합되도록 하는 조건 하에 세포를 유지하는 단계.
제11항에 있어서, 세포는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제11항 또는 제12항에 있어서, 외인성 핵산은 상동성-유도 과정에 의해 게놈 내로 통합되는 것을 특징으로 하는 방법.
제11항 또는 제12항에 있어서, 외인성 핵산은 직접 결찰 과정에 의해 게놈 내로 통합되는 것을 특징으로 하는 방법.
제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 엔도뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN), CRIPSR 엔도뉴클레아제, I-TevI 뉴클레아제 또는 관련된 단량체 하이브리드, 및 인공 표적된 DNA 이중 가닥 파손 유도제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
적어도 하나의 재조합 단백질의 생산을 위해 세포를 재표적하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
a) 표 2에서 열거된 적어도 하나의 게놈 유전자 자리 내에서 또는 이에 근접하여 위치한 폴리뉴클레오티드 변형 효소에 대한 적어도 하나의 외인성 인식 서열을 포함하는 세포를 제공하는 단계;
b) (i) 제1 및 제2 서열이 측면에 있는, 재조합 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 구조체, 및 (ii) 세포에서 적어도 하나의 외인성 인식 서열을 인식하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 변형 효소를 세포 내로 도입하는 단계; 그리고
c) 재조합 단백질을 인코딩하는 서열이 세포의 게놈 내로 통합되도록 하는 조건 하에 세포를 유지하는 단계.
제16항에 있어서, 세포는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제16항 또는 제17항에 있어서, 세포의 적어도 하나의 외인성 인식 서열은 표적 엔도뉴클레아제 인식 부위이고, 발현 구조체의 제1 및 제2 서열은 세포내 외인성 인식 서열에 가까운 염색체 서열에 대한 실질적인 서열 동일성을 가진 서열이고; 그리고 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 변형 효소는 표적 엔도뉴클레아제인 것을 특징으로 하는 방법.
제16항 또는 제17항에 있어서, 세포의 적어도 하나의 외인성 인식 서열은 표적 엔도뉴클레아제 인식 부위이고; 발현 구조체의 제1 및 제2 서열 각각은 표적 엔도뉴클레아제의 인식 서열이고; 그리고 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 변형 효소는 표적 엔도뉴클레아제인 것을 특징으로 하는 방법.
제18항 또는 제19항에 있어서, 표적 엔도뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN), CRIPSR 엔도뉴클레아제, I-TevI 뉴클레아제 또는 관련된 단량체 하이브리드, 및 인공 표적된 DNA 이중 가닥 파손 유도제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제16항 또는 제17항에 있어서, 세포의 적어도 하나의 외인성 인식 서열은 부위-특이적 재조합 효소 인식 부위이고, 발현 구조체의 제1 및 제2 서열 각각은 부위-특이적 재조합 효소 인식 서열이고; 그리고 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 변형 효소는 부위-특이적 재조합 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
제21항에 있어서, 부위-특이적 재조합 효소는 람다 통합 효소, Cre 재조합 효소, FLP 재조합 효소, 감마-델타 해리 효소, Tn3 해리 효소, ΦC31 통합 효소, Bxb1-통합 효소, 및 R4 통합 효소로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질을 인코딩하는 서열은 적어도 하나의 발현 제어 서열과 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 구조체는 적어도 하나의 선별 마커 서열, 적어도 하나의 리보터 서열, 적어도 하나의 조절성 제어 서열 요소 또는 이의 조합을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 적어도 하나의 재조합 단백질의 발현을 위한 조건 하에 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
재조합 단백질의 생산을 위해 세포를 재표적하기 위한 키트에 있어서, 상기 키트는 인식 서열에 상응하는 폴리뉴클레오티드 변형 효소 및 관심 재조합 단백질을 인코딩하는 서열의 삽입을 위한 구조체와 함께, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 세포를 포함하고, 여기서 구조체는 인식 서열에 상응하는 측면 서열(flanking sequence)의 쌍 및/또는 인식 서열을 측면에 배치하는 게놈 DNA를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제26항에 있어서, 재조합 단백질을 인코딩하는 서열의 표적된 통합을 완료시키기 위한 설명서를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제26항 또는 제27항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 변형 효소는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN), CRIPSR 엔도뉴클레아제, I-TevI 뉴클레아제 또는 관련된 단량체 하이브리드, 및 인공 표적된 DNA 이중 가닥 파손 유도제로 구성된 군에서 선택된 표적 엔도뉴클레아제인 것을 특징으로 하는 키트.
제26항 또는 제27항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 변형 효소는 람다 통합 효소, Cre 재조합 효소, FLP 재조합 효소, 감마-델타 해리 효소, Tn3 해리 효소, ΦC31 통합 효소, Bxb1-통합 효소, 및 R4 통합 효소로 구성된 군에서 선택된 부위-특이적 재조합 효소인 것을 특징으로 하는 키트.