CN106554943A - 一种重组过表达Creb3L1基因的CHO细胞株CHO-Creb3L1 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过在CHO细胞株中稳定过表达Creb3L1基因提高CHO细胞分泌能力。主要利用谷氨酰胺合成酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO‑GS‑/‑)为宿主细胞，转染外源包含Creb3L1序列的真核表达载体，经压力筛选后得到定点插入的稳定高效表达Creb3L1蛋白的CHO细胞株。通过本方法获得的CHO‑Creb3L1细胞提高了CHO细胞的分泌能力，可用于生产，提高蛋白产量。

Description

一种重组过表达Creb3L1基因的CHO细胞株CHO-Creb3L1

技术领域

本发明属于基因工程和细胞工程领域，涉及一种稳定过表达Creb3L1基因的CHO重组细胞株及其构建方法。具体说是构建一株稳定过表达Creb3L1蛋白的哺乳动物细胞系，通过压力筛选获得稳定过表达Creb3L1基因的细胞株。

背景技术

抗体及蛋白类药物的生物工程具有极大的研究和应用价值以及巨大的市场潜力。CHO表达系统是外源蛋白的最佳表达系统之一，在生物制药中得到广泛的应用。经过多年来对CHO细胞株的不断优化，尤其是通过各种方法增加外源基因的拷贝数，已经极大地提高了蛋白的表达量。然而由于细胞内ER stress的存在，使得拷贝数提高到一定数量，细胞分泌水平达到一个极限，表达量不但无法再提高，反而会下降。

真核细胞从内质网到细胞核具有其自身的信号通路以避免过多的未折叠蛋白在内质网中的积累。研究表明，CREB3L1(CAMP Responsive Element Binding Protein 3-Like 1)为一种新型的压力转换器，参与调控未折叠蛋白应答的信号通路，在对抗内质网压力中发挥着重要的作用。CREB3L1又被称为OASIS(old astrocyte specifically induced substance)，在长期培养的鼠星形细胞中首次被确定。CREB3L1是CREB/ATF(激活转录因子)家族的一个转录因子，主要分布在内质网膜上，具有跨膜结构域。细胞内CREB3L1蛋白主要通过被RIP(调控的膜内蛋白质水解)处理来应对内质网压力，调控细胞或组织的未折叠蛋白反应的信号通路。

目前，针对CREB3L1蛋白对CHO细胞分泌的影响尚无明确研究，也无稳定高效表达CREB3L1蛋白的CHO重组细胞株的报道。本发明通过自主研发的一种能够直接评价外源蛋白能否对CHO细胞的分泌能力产生影响的评价载体，将CREB3L1基因在CHO细胞中进行定点插入，获得了稳定过表达Creb3L1蛋白的CHO细胞株，确定了该重组细胞CHO-Creb3L1提高了CHO细胞的分泌能力。

发明内容

本发明的目的主要在于提供了一株能够稳定过表达Creb3L1蛋白的重组CHO细胞株。本发明所述的CHO-Creb3L1细胞株是利用谷氨酰胺合成酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-GS-/-) 为宿主细胞，经过压力筛选，扩增后获得稳定高效表达外源Creb3L1蛋白的CHO细胞株。

本发明的另一个目的是公开了重组CHO细胞株CHO-Creb3L1在提高CHO细胞分泌能力，促进药物蛋白分泌表达水平方面的应用。

本发明通过建立重组CHO-Creb3L1细胞株的方法，建立了一种可应用于表达其他活性蛋白的技术平台。

本发明所述的稳定过表达外源Creb3L1蛋白的重组CHO细胞株CHO-Creb3L1，其特征在于，利用谷氨酰胺合成酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-GS-/-)为宿主细胞，利用TALEN技术向基因组中定点插入重组片段，经过压力筛选后得到定点插入的稳定高效表达Creb3L1蛋白的CHO细胞株，获得的重组CHO-Creb3L1细胞，提高了CHO细胞的分泌能力。

本发明所述的可评价细胞分泌能力的真核表达载体，包含谷氨酰胺合成酶筛选标记以及GFP-luciferase融合报道基因，在其两端引入了piggy序列，GS筛选单元和报道基因单元在插入到细胞基因组后，在PiggyBac转座酶的作用下把GS筛选单元和报道基因单元从基因组中切除下来。

本发明表达外源Creb3L1蛋白的重组CHO细胞株CHO-Creb3L1的构建方法如下：

1.采用PCR扩增以及gibson连接技术，构建Ef1a-Creb3L1-polyA表达框架。

2.将Ef1a-Creb3L1-polyA表达框架克隆到真核表达载体pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)中，构建出重组真核表达载体pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)-Creb3L1

3.将重组真核表达载体pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)-Creb3L1进行线性化处理。

4.将3xGCN4-CHOActb-6K-L和CHOActb-6k-R与线性化的质粒pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)-Creb3L1通过电转法共转染进CHO-GS-/-细胞中，获得表达Creb3L1蛋白的CHO细胞株。

5.用不含L-谷氨酰胺的MDEM/F12选择培养基筛选整合了pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)-Creb3L1片段的稳定转染细胞株。

6.通过有限稀释法从混合细胞库中分离到定点插入pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)-Creb3L1片段的单克隆细胞。

7.Creb3L1蛋白对细胞分泌影响分析：使用酶标仪检测细胞培养上清以及细胞内luciferase的含量。通过比较重组细胞与对照细胞上清中luciferase的含量，判断目的蛋白是否会在细胞分泌过程中发挥作用。

8.通过电转法向重组细胞中转入Piggy-BAC质粒，将插入到基因组中的筛选标记去除，最后获得只含有Creb3L1基因的重组细胞株CHO-Creb3L1。

本发明通过在CHO细胞株中定点插入Creb3L1基因，获得了一株稳定过表达Creb3L1蛋白的CHO细胞株CHO-Creb3L1。通过本方法获得的CHO-Creb3L1细胞提高了CHO细胞的分泌能力，可用于生产，提高蛋白产量。

附图说明

图 1为pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)-Creb3L1重组质粒构建示意图；

图 2为mGS-2x(HG-VL)-Creb3L1定点插入CHO基因组的PCR检测结果；

图 3为CHO-p2x(HG-VL)-Creb3L1与CHO-p2x(HG-VL)细胞luciferase分泌量的比较。

图 4为CHO-Creb3L1细胞与野生型CHO细胞luciferase分泌量的比较。

具体实施方式

以下将通过具体的实施例说明本发明，但是这些具体的实施例不应当理解为对本发明的限制，对某些细节进行修改将仍然落入本发明的保护范围之内。

一.细胞的培养

谷氨酰胺合成酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-GS-/-)为本公司自主构建。CHO-GS-/-以F12(11765-054by life technologies)培养基培养并添加20mM L-谷氨酰胺(0374Amresco)以及10％胎牛血清(16000-044by life technologies)。细胞在含有5％CO2的37度细胞培养箱中培养。

二.真核表达质粒的构建

1.PCR扩增Creb3L1蛋白cDNA的全长序列，Ef1a启动子序列，以及polyA序列，采用gibson连接法将Ef1a、Creb3L1，polyA序列串联起来，构建Ef1a-Creb3L1-polyA表达框架，Ef1a-Creb3L1-polyA表达框架两端分别引入EcoRI和XhoI酶切位点。

2.EcoRI和XhoI酶将Ef1a-Creb3L1-polyA表达框架从载体中切下，连接到EcoRI和XhoI酶切的真核表达载体pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)中，构建出重组真核表达载体pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)-Creb3L1(图 1)。

三.细胞转染及阳性克隆筛选

将构建好的质粒pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)-Creb3L1用EcoRI限制性内切酶进行线性化处理。TALEN质粒对3xGCN4-CHOActb-6K-L和CHOActb-6k-R与线性化的重组质粒pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)-Creb3L1按照1∶1∶5混合，通过电转法共转染到CHO-GS-/-细胞中。细胞转染24小时后更换新鲜的不含谷氨酰胺的DMEM/F12培养基培养，每三天换一次液，直至细胞克隆形成。

四.阳性克隆的筛选：

将上步所形成的克隆用细胞消化液胰蛋白酶消化下来，接种到细胞培养皿中，继续在不含L-谷氨酰胺的培养基中混合加压培养。待细胞长至90％时，将细胞消化下来，按照1∶3接种到新的培养皿中，继续在不含L-谷氨酰胺的培养基中培养。约两周后，待细胞生长稳定，取部分混合细胞检测pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)片段在基因组中的插入是否正确。

检测方法：分别在插入位点的基因组上和插入序列上设计引物进行PCR，PCR产物测序确认片段插入正确。PCR引物设计如下：

Actb-6K-F1：GAGACAGACTTTCTATGCACC

Actb-6K-R1：GAGTGAGCCACACATAACAAC

Creb3L1-test：CAACTTCTCGGGGACTGTGGG

野生型CHO细胞PCR条带为500bp，定点插入带有目的基因片段的CHO细胞将产生650bp或750bp的条带(图 2)。

采用梯度稀释法对混合细胞铺单克隆，待单克隆细胞在96孔板中长至50％左右，取部分单克隆细胞按照上述方法进行PCR检测，直至挑选到在CHO-GS-/-细胞中定点插入了pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)片段的单克隆细胞。所获得的单克隆细胞进行扩大培养，形成稳定细胞株CHO-p2x(HG-VL)-Creb3L1。

五.Creb3L1重组蛋白对细胞分泌能力的影响分析：

接种一定数目的细胞株CHO-p2x(HG-VL)-Creb3L1至24孔细胞培养版中，同时接种等量的野生型细胞以及转染的不含Creb3L1基因的pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)空白质粒细胞株CHO-p2x(HG-VL)作为对照。培养24小时后，分别收集样品上清液，加入细胞裂解液完全裂解细胞。使用酶标仪检测细胞培养上清以及细胞内luciferase的含量。分析比较重组细胞与对照细胞上清中luciferase的含量，结果显示包含Creb3L1目的基因的重组细胞株CHO-Creb3L1上清中luciferase的含量比空白对照细胞株高20％(图 3)。

六.报道基因的去除：

电转法将pCS7-piggyBAC质粒转染到细胞株CHO-p2x(HG-VL)-Creb3L1中。转染后的细胞接种到含有L-谷氨酰胺的细胞培养皿中继续混合培养。有限稀释法对混合细胞铺单克隆，待 单克隆细胞长至50％左右，荧光显微镜下观察，选取不带有荧光的单克隆细胞，PCR验证报道基因已经去除。成功去除了报道基因的细胞株扩大培养，获得稳定表达Creb3L1蛋白的重组CHO细胞株CHO-Creb3L1。

七.CHO-Creb3L1细胞株分泌能力能力检测：

使用电转法将pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)空载质粒瞬时转染到CHO-Creb3L1重组细胞中，同时转染等量的野生型CHO-GS细胞作为对照。细胞转染24小时后，分别收集样品上清液，使用酶标仪检测细胞培养上清中luciferase的含量。分析比较重组细胞与对照细胞瞬时转染pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)质粒后上清中luciferase的含量，结果显示CHO-Creb3L1重组细胞株上清中luciferase的含量高于野生型CHO细胞(图 4)。

综上所述，本发明提供了一株过表达Creb3L1蛋白的重组CHO细胞株CHO-Creb3L1。Creb3L1蛋白在CHO细胞中的过表达，提高了CHO细胞的分泌能力。该重组细胞株可直接用于蛋白药物的生产，提高蛋白产量。

Claims (6)

1.一株重组CHO细胞株CHO-Creb3L1，其特征在于，稳定过表达Creb3L1基因。

2.根据权利要求1所述的重组CHO细胞株CHO-Creb3L1，其特征在于，稳定过表达的Creb3L1基因为以下任意一种：人类、猴子、猪、牛、狗、兔、小鼠、大鼠等物种的Creb3L1基因。

3.根据权利要求1所述的重组CHO细胞株CHO-Creb3L1，其特征在于，使用CMV启动子或者EF1a启动子进行过表达Creb3L1基因。

4.根据权利要求1所述的重组CHO细胞株CHO-Creb3L，其特征在于，Creb3L1基因的表达框架稳定地定点整合，或者随机整合到CHO细胞基因组中。

5.根据权利要求1所述的重组CHO细胞株CHO-Creb3L1，其特征在于，利用谷氨酰胺合成酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-GS-/-)为宿主细胞，经压力筛选后得到定点插入的稳定高效表达Creb3L1蛋白的CHO细胞株，并且通过瞬时转染PiggyBac转座酶表达质粒，将抗体表达报道基因和筛选标记基因删除获得所述重组细胞株CHO-Creb3L1。

6.权利要求1-5任一项所述的重组CHO细胞株CHO-Creb3L1，其特征在于，应用于提高蛋白药物或者抗体生产中。