CN110054667B - 一种优化的毕赤酵母GS115交配外激素α-factor信号肽及其应用 - Google Patents

一种优化的毕赤酵母GS115交配外激素α-factor信号肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种优化的毕赤酵母GS115交配外激素α‑factor信号肽及其应用。本发明对具有如SEQID NO:1所示氨基酸序列的毕赤酵母GS115 α‑factor信号肽引入一个N糖基化位点，得到优化后的毕赤酵母GS115交配外激素α‑factor信号肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。本发明优化的α‑factor信号肽特别适用于引导外源蛋白在毕赤酵母中的分泌表达，与优化前信号肽相比，表达水平提高了5‑7倍，其应用有利于筛选到高表达菌株，具有降低生产成本、便于后续纯化等优势。

Description

一种优化的毕赤酵母GS115交配外激素α-factor信号肽及其 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种优化的毕赤酵母GS115交配外激素α-factor信号肽及其应用。
背景技术
近年来，随着生活水平提高，健康意识增强，人们对各种治疗或保健用蛋白类药物（如疫苗、免疫球蛋白、抗体和蛋白质因子等）的需求逐年攀升。然而，许多药用蛋白无法通过天然材料的分离纯化获取，必需利用外源蛋白系统进行表达。
现有的外源蛋白表达系统中，原核生物体系虽然遗传操作简单、培养成本低廉且产物表达高，但不能对外源蛋白进行翻译后修饰。真核生物体系对表达的外源蛋白能进行翻译后加工修饰，因此得到的产物与原核生物体系相比通常具有较高的生物活性。作为单细胞真核生物的毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统由于其兼具真核生物和原核生物的特点，在研究需要加工修饰的分泌性蛋白时倍受科研人员青睐。大多数分泌性蛋白具有重要的生理调节功能，如肽类荷尔蒙、神经多肽、胰岛素及其受体、生长和分化因子、细胞表面受体、胞外金属蛋白酶、凝血因子、粘附分子、血浆蛋白等，其中相当大一部分是药用蛋白候选或已经是成功的蛋白药物。
利用毕赤酵母表达外源分泌蛋白时，需要有一条信号肽引导外源蛋白进入分泌通道，最终蛋白才能得以分泌到细胞外。信号肽的效率决定了外源蛋白分泌表达。因此，开发一条在毕赤酵母中能高效分泌蛋白到胞外的信号肽对外源蛋白的分泌表达至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种优化的毕赤酵母GS115交配外激素α-factor信号肽及其应用，该优化后的信号肽在毕赤酵母中可以高效的引导外源蛋白分泌。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
首先，本发明分析毕赤酵母GS115基因组序列，从中找到一条α-factor基因，从中得到α-factor基因信号肽，所述α-factor信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，编码该α-factor信号肽的核苷酸序列如SEQID NO:2所示。
所述的α-factor信号肽可以引导目的蛋白的分泌表达。
进一步的，通过对所述的α-factor信号肽的氨基酸序列引入一个N糖基化位点，得到优化的α-factor信号肽，所述优化的α-factor信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，编码该优化的α-factor信号肽的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。
所述的N糖基化位点可以引入到毕赤酵母GS115 α-factor信号肽的任何位置，引入的N糖基化位点数可以是1个，也可以是多个。在本发明中N糖基化位点数位点位于第113位氨基酸。
所述优化的α-factor信号肽可以高效引导外源蛋白的分泌表达。
所述的外源蛋白可以为任意蛋白质，在本发明中为绿色荧光蛋白。
本发明优化的α-factor信号肽可以添加于毕赤酵母胞内表达载体，用于引导外源蛋白在毕赤酵母中的分泌表达。
所述的胞内表达载体可以是以下任意一种：pGAPA,B&C，pAO815，pPIC3.5K，pPIC3.5，pFLD1和pPICZA,B&C。在本发明的实施例中，所用的胞内表达载体是pPICZA。
本发明将序列优化前和优化后的毕赤酵母GS115 α-factor信号肽对外源蛋白表达进行比较。表达量的测定结果表明，本发明优化的α-factor信号肽特别适用于毕赤酵母，与优化前信号肽相比，表达水平提高了5-7倍，其应用有利于筛选到高表达菌株，具有降低生产成本、便于后续纯化等优势。
附图说明
图1 为毕赤酵母GS115 α-factor信号肽引导外源蛋白表达图；
图2 为优化前后的毕赤酵母GS115 α-factor信号肽引导外源蛋白表达量对比图。
具体实施方式
下述实施例详细说明本发明，但并不对其发明范围进行限制。
优化前
毕赤酵母GS115交配外激素α-factor信号肽的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。
编码优化前的毕赤酵母GS115交配外激素α-factor信号肽的核苷酸，其核苷酸序列如SEQID NO:2所示。
优化后
优化的毕赤酵母GS115交配外激素α-factor信号肽的氨基酸序列如SEQID NO:3所示。
编码上述优化的毕赤酵母GS115交配外激素α-factor信号肽的核苷酸，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。
实施例1 毕赤酵母GS115 α-factor信号肽编码序列合成
将编码毕赤酵母GS115 α-factor信号肽的编码序列送与生物公司进行人工合成，并将其克隆到T载体中，本实施例中将其命为pT-α-factor。
实施例2 含毕赤酵母GS115 α-factor信号肽毕赤酵母表达载体构建
本实施例以pPICZA为骨架描述含毕赤酵母GS115 α-factor信号肽毕赤酵母表达载体的构建过程。
用Sfu I和EcoR I双酶切载体pPICZA，并且割胶纯化备用。
设计一对引物：
上游引物：ttttcgaaATGAAATCACTCATTTTGAAC (划线部分为Sfu I位点序列)
下游引物：cggaattcTGCTTCTGCTTCTCTCTTGCC (划线部分为EcoR I位点序列)
从载体pT-α-factor中扩增毕赤酵母GS115 α-factor信号肽编码序列，并且分别在两端引入Sfu I和EcoR I酶切位点。PCR扩增产物经纯化后用Sfu I和EcoR I酶进行双酶切，并割胶纯化备用。
将Sfu I和EcoR I双酶切后的载体pPICZA和毕赤酵母GS115 α-factor信号肽编码序列进行连接。连接产物转化大肠杆菌，挑取Zeocin平板中长出的单菌落进行测序确认，序列正确的载体命名为pPICZAGS115-α-factor。
实施例3 含优化的毕赤酵母GS115 α-factor信号肽毕赤酵母表达载体构建
通过对毕赤酵母GS115 α-factor信号肽的氨基酸序列分析，发现毕赤酵母GS115α-factor信号肽第113位丝氨酸（S）可以通过点突变使其成为一个N-糖基修饰位点。故而，设计一对点突变引物：
上游引物：GAAAGACTGGCACAAAATTGGACAAACATCAGG
下游引物：CCTGATGTTTGTCCAATTTTGTGCCAGTCTTTC
以pPICZA GS115-α-factor载体为骨架，利用点突变试剂盒并按说明书操作将毕赤酵母GS115 α-factor信号肽第113位丝氨酸（S）突变为天冬酰胺（N），并将新构成的重组质粒命名为pPICZA GS115-S113N-α-factor。本实施例中所用的点突变试剂盒为北京全式金生物技术（TransGen Biotech）有限公司产品Fast Mutagenesis System。
实施例4 利用优化前后的含毕赤酵母GS115 α-factor信号肽表达载体在毕赤酵母中表达外源蛋白
本实施例以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为报告蛋白检测优化前后的毕赤酵母GS115 α-factor信号肽引导外源蛋白分泌表达的能力。
利用一对5′末端含EcoR I酶切位点的特异引物从商业载体pEGFP-N1中扩增出EGFP片段。
上游引物：cggaattcatggtgagcaagggcgaggag(划线部分为EcoR I位点序列)
下游引物：cggaattcttacttgtacagctcgtccat(划线部分为EcoR I位点序列)
利用DNA重组技术将扩增出的EGFP片段分别克隆到表达载体pPICZA GS115-α-factor和pPICZA GS115-S113N-α-factor EcoR I位点上，载体分别命名为pPICZA GS115-α-factor-EGFP和pPICZA GS115-S113N-α-factor-EGFP。
pPICZA GS115-α-factor-EGFP和pPICZA GS115-S113N-α-factor-EGFP载体用于电转化毕赤酵母之前，先用Sac I酶线性化，并对线性化后的载体进行纯化。
取100μl新鲜制备的感受态毕赤酵母加入1-10 μg线性化载体；转移入电转杯（规格为0.2mm）中；使用Bio-Rad GenePulser 电转化仪，条件为1500V，25µF，200Ω，电击后，即刻加入1ml 1M山梨醇（预冷）吹吸混合，并于28-30℃培养箱中静置培养1-2h。培养后取200-400μl涂布于含Zeocin的YPD平板（10cm）上，置于28-30°C恒温培养箱中倒置培养。
挑选YPD平板上单菌落于5ml BMGY，28-30°C，250r/min恒温摇床中，培养24h；镜检BMGY中观察生长情况以及是否染菌。室温下1500-3000g离心收集菌体，菌体用诱导培养基BMMY重悬，调整BMMY培养基的用量使其最终OD600值约等于1.0。培养液置于28-30°C恒温摇床中培养。每24h ，添加一次甲醇（甲醇添加量为诱导培养体积的1%）；经过甲醇诱导72h后，发酵上清用EGFP抗体进行Western blot检测，结果如图2所示。
图1 为优化前，毕赤酵母GS115 α-factor信号肽引导外源蛋白表达图，可见，Komagataella pastoris酵母α-factor信号肽可以引导外源蛋白分泌，但分泌水平低下。
图2 为优化前后，毕赤酵母GS115 α-factor信号肽引导外源蛋白表达量对比图。由图2表达量的测定结果表明，本发明优化的α-factor信号肽特别适用于引导外源蛋白在毕赤酵母中的分泌表达，与优化前信号肽相比，表达水平提高了5倍以上，其应用有利于筛选到高表达菌株，具有降低生产成本、便于后续纯化等优势。
序列表
<110> 福建师范大学
<120> 一种优化的毕赤酵母GS115交配外激素α-factor信号肽及其应用
<130> 2019
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 130
<212> PRT
<213> 毕赤酵母GS115(Pichia pastoris115 )
<400> 1
Met Lys Ser Leu Ile Leu Asn Ile Ile Ser Val Thr Leu Ala Ile Thr
1 5 10 15
Ser Thr Ala Ala Ser Ala Pro Val Glu Ser Ile Phe Ala Asn Gln Pro
20 25 30
Asp Ser Ser Leu Thr Asp Thr Asn Asp Gly Val Gly Val Gly Met Ser
35 40 45
Thr Ile Lys Glu Glu Asp Phe Gly Lys His Phe Val Glu Asn Gln Ile
50 55 60
Leu Asp Glu Ala Val Ile Met Ser Leu Lys Leu Arg Lys Gly Val Asn
65 70 75 80
Leu Phe Phe Leu Asp Asp Ile Gly Leu Ala Thr Glu Leu Ile Gly Asn
85 90 95
Lys Ile Ala Gln Ile Glu Ala Ile Asp Leu Ser Glu Arg Leu Ala Gln
100 105 110
Ser Trp Thr Asn Ile Arg Lys Asn Arg Leu Phe Gly Lys Arg Glu Ala
115 120 125
Glu Ala
130
<210> 2
<211> 390
<212> DNA
<213> 毕赤酵母GS115(Pichia pastoris115 )
<400> 2
atgaaatcac tcattttgaa catcatttca gtaactttag ctatcacatc aactgcggcc 60
agtgcgccag tggaaagcat ttttgctaac caacctgatt catcactcac tgatactaat 120
gatggtgtcg gcgttggcat gtctacaatc aaagaagaag attttggcaa acattttgtt 180
gaaaaccaaa ttcttgatga ggccgtaatc atgtcattga agttaagaaa gggagtaaac 240
ttgttttttc tagatgacat cggattagct accgagctta taggtaacaa gatagcacag 300
attgaggcta ttgatttgtc agaaagactg gcacaaagtt ggacaaacat caggaagaac 360
cgcctatttg gcaagagaga agcagaagca 390
<210> 3
<211> 130
<212> PRT
<213> 毕赤酵母GS115(Pichia pastoris115 )
<400> 3
Met Lys Ser Leu Ile Leu Asn Ile Ile Ser Val Thr Leu Ala Ile Thr
1 5 10 15
Ser Thr Ala Ala Ser Ala Pro Val Glu Ser Ile Phe Ala Asn Gln Pro
20 25 30
Asp Ser Ser Leu Thr Asp Thr Asn Asp Gly Val Gly Val Gly Met Ser
35 40 45
Thr Ile Lys Glu Glu Asp Phe Gly Lys His Phe Val Glu Asn Gln Ile
50 55 60
Leu Asp Glu Ala Val Ile Met Ser Leu Lys Leu Arg Lys Gly Val Asn
65 70 75 80
Leu Phe Phe Leu Asp Asp Ile Gly Leu Ala Thr Glu Leu Ile Gly Asn
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Lys Ile Ala Gln Ile Glu Ala Ile Asp Leu Ser Glu Arg Leu Ala Gln
100 105 110
Asn Trp Thr Asn Ile Arg Lys Asn Arg Leu Phe Gly Lys Arg Glu Ala
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130
<210> 4
<211> 390
<212> DNA
<213> 毕赤酵母GS115(Pichia pastoris115 )
<400> 4
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agtgcgccag tggaaagcat ttttgctaac caacctgatt catcactcac tgatactaat 120
gatggtgtcg gcgttggcat gtctacaatc aaagaagaag attttggcaa acattttgtt 180
gaaaaccaaa ttcttgatga ggccgtaatc atgtcattga agttaagaaa gggagtaaac 240
ttgttttttc tagatgacat cggattagct accgagctta taggtaacaa gatagcacag 300
attgaggcta ttgatttgtc agaaagactg gcacaaaatt ggacaaacat caggaagaac 360
cgcctatttg gcaagagaga agcagaagca 390

Claims (6)

1.一种优化的毕赤酵母GS115交配外激素α-factor信号肽，其特征在于：其是对具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的毕赤酵母GS115 α-factor信号肽引入一个N糖基化位点而得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的一种优化的毕赤酵母GS115交配外激素α-factor信号肽，其特征在于：所述的N糖基化位点引入到毕赤酵母GS115 α-factor信号肽113位氨基酸上，将第113位丝氨酸突变成天冬酰胺。
3.一种编码如权利要求1所述的优化的毕赤酵母GS115交配外激素α-factor信号肽的核酸，其特征在于：所述核酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.一种如权利要求1所述的优化的毕赤酵母GS115交配外激素α-factor信号肽的用途，其特征在于；所述信号肽用于引导外源蛋白在毕赤酵母中的分泌表达。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于；所述外源蛋白为任意蛋白质。
6.一种毕赤酵母表达载体，其特征在于：所述的载体含有可表达权利要求3所述优化的毕赤酵母GS115交配外激素α-factor信号肽的核酸序列。
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