CN117417842A - 一种高效表达猪胰蛋白酶重组毕赤酵母菌株及其应用 - Google Patents
一种高效表达猪胰蛋白酶重组毕赤酵母菌株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，具体的说是涉及一种高效表达猪胰蛋白酶重组毕赤酵母菌株构建及其应用。本发明提供了一种高效表达猪胰蛋白酶重组毕赤酵母菌株构建及其应用。以毕赤酵母GS115为宿主细胞，通过对毕赤酵母表达密码子偏好性分析和DNA核酸分子二级结构稳定分析，进行野生型猪胰蛋白酶基因核酸序进行密码子优化，结合多拷贝数基因筛选，以及共表达分子伴侣内质网蛋白ERp44、酿酒酵母a交配因子前导肽(a‑MF)等基因工程技术手段，构建一种表达重组猪胰蛋白酶的毕赤酵母菌株，从而提升重组猪胰蛋白酶分泌表达量、提高重组猪胰蛋白酶的酶活性和稳定性，减少不同摇瓶之间质量差异，降低重组猪胰蛋白酶工业化生产成本。
Description
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体的说是涉及一种高效表达猪胰蛋白酶重组毕赤酵母菌株构建及其应用。
背景技术：
胰蛋白酶(Trypsin)是一种丝氨酸蛋白酶，酶解赖氨酸及精氨酸C末端形成的肽键。作为肽键内切酶，起作消化酶作用，在哺乳动物、细菌、真菌等生物体内广泛存在。胰蛋白酶被广泛应用于皮革加工、生物技术、生物医药和食品加工产业。特别是随着细胞免疫治疗与基因治疗、重组胰岛素、抗体生物大分子药物、疫苗以及临床检测技术等领域科研、产业快速发展，胰蛋白酶作为特异性很强的工具酶之一，对其产品质量与产量的需求越来越高，越来越旺盛。猪源胰蛋白酶相比于其他哺乳动物胰蛋白酶，具有①热稳定性强；②无螯合Ca2+的中心部位，对+的影响不敏感；③在6对二硫键，断裂1～2个键，均不至于破坏酶分子的完整结构，仍能保持酶活性；④酶活性较高，等等优点，其应用更加广泛，倍受行业关注。
传统上胰蛋白酶是从牛、猪、羊的胰脏提取，纯化获得的结晶，再制成的冻干制剂。但传统胰蛋白酶制备存在生产工艺复杂、得率较低、蛋白纯度不均一、酶活性差，酶热稳定性差、不同摇瓶之间产品质量稳定性差、潜在动物源病原微生物污染等等诸多问题，以至于根本不能满足现代生物医药、细胞技术、细胞免疫治疗及临床检验等方面对胰蛋白酶产品质量的需求。利用基因工程技术表达重组胰蛋白酶已有深入且广泛的科学研究以及众多的文献报道，重组胰蛋白酶产品现已成为了市场主流，逐步代替了传统上动物胰脏提取产品。已有专利(赛诺非--安万特德国有限公司，猪胰蛋白酶变体，CN 111989401A)报道利用基因工程蛋白重组技术获得猪胰蛋白酶变体，以提升猪胰蛋白酶产品性能，降低酶的副作用，尤其是有降低的外肽酶活性和/或在PPI切割反应中显示减少的副产物形成；专利(天津大学，一种胰蛋白酶及其制备方法与应用，CN 106350497 B)报道利用基因工程技术改进野生型Sus scrofa猪胰蛋白酶基因，提升猪胰蛋白酶稳定性、活性高，且耐高温等性能；专利(江南大学，一种优化信号肽提高胰蛋白酶胞外分泌表达的方法，CN104312933A)通过与胰蛋白酶融合表达8种毕赤酵母胞外分泌信号肽表达重组胰蛋白酶，以提高酶的活性，解决了胰蛋白酶胞外分泌量低的问题；等等相关专利报道。大多集中在对胰蛋白酶的氨基酸序列进行修改以提升酶的性能或功能。
随着生物技术的不断发展，利用基因工程技术表达重组猪胰蛋白酶已越来越受到人们的青睐。毕赤酵母(Pichia pastoris，P.pastoris)又称巴斯德酵母，是一种以甲醇为唯一碳源的甲基营养型酵母菌，既具有原核生物生长特性、操作简单，又具有真核细胞的翻译后修饰加工特性。毕赤酵母作为成熟的蛋白质表达宿主，其生长的细胞密度非常高，具有强大和严格调控的启动子，可使每升培养细胞产生胞内或胞外分泌的重组蛋白量达到克级，已经广泛应用于生物制药和工业酶的生产。毕赤酵母表达体系目前已成功表达了上千种外源蛋白，其中有70种完成商业化生产。国内高等院校或科研机构就毕赤酵母表达外源蛋白方面开展深入或而较全面的研究，但是不同外源蛋白其表达差异还是很大的，特别不同外源蛋白基因来源、蛋白分泌途径不同，蛋白转录后修饰和折叠不同等等差异，都为构建高效表达外源蛋白毕赤酵母菌株提出较高挑战。国内少有关于构建重组猪胰蛋白酶突变体的毕赤酵母表达菌株专利，但鲜有关于构建高效表达猪胰蛋白酶毕赤酵母表达菌株的科研文献或专利报道。同时在已开展的重组猪胰蛋白酶毕赤酵母表达的科研或制备应用过程中，仍存在有①酶蛋白表达量不高，增加分离纯化难度，提升整体生产成本；②胰蛋白酶原表达过程中不能正确折叠，或二硫键形成差错，造成细胞内质网压力，导致宿主细胞死亡；③重组胰蛋白酶活性低，不同批次之前质量不稳定；等等问题。因此，构建一种高效表达猪胰蛋白酶重组毕赤酵母菌株，用于高效、稳定、低成本地制备高酶活性的重组猪胰蛋白酶，对于促进重组猪胰蛋白酶工业化生产，满足现代生物医药、细胞技术、免疫治疗及临床检验等对胰蛋白酶产品质量和产量的需求具有很重要意义。
发明内容：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高效表达猪胰蛋白酶重组毕赤酵母菌株构建及其应用。以毕赤酵母GS115为宿主细胞，通过对毕赤酵母表达密码子偏好性分析和DNA核酸分子二级结构稳定分析，进行野生型猪胰蛋白酶基因核酸序进行密码子优化，结合多拷贝数基因筛选，以及共表达分子伴侣内质网蛋白ERp44、酿酒酵母a交配因子前导肽(a-MF)等基因工程技术手段，构建一种表达重组猪胰蛋白酶的毕赤酵母菌株，从而提升重组猪胰蛋白酶分泌表达量、提高重组猪胰蛋白酶的酶活性和稳定性，减少不同摇瓶之间质量差异，降低重组猪胰蛋白酶工业化生产成本。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案，
1、根据毕赤酵母表达密码子偏好性和DNA核酸分子二级结构稳定性，结合野生型猪胰蛋白酶基因核酸序列GC含量水平，对在毕赤酵母表达的重组猪胰蛋白酶基因核酸序列进行了优化，将L(Leu)、S(Ser)、G(Gly)、V(Val)、N(Asn)、P(Pro)、Q(Gln)以及A(Ala)的密码子分别优化为TTG、AGT、GGT、GTT、AAT、CCA、CAA以及GCT；优化后猪胰蛋白酶基因cDNA序列，如SEQ IDNO.1所示；
2、改变猪胰蛋白酶基因序列中G+C碱基含量(野生型含量为53.4％)，根据毕赤酵母表达密码子选择性特征以及DNA核酸分子二级结构稳定性要求，将步骤1优化后猪胰蛋白酶cDNA序列中G+C碱基含量控制在43％～48％范围内；
3、将步骤2优化后猪胰蛋白酶基因和酿酒酵母a交配因子前导肽(a-MF)(或毕赤酵母表达体系公知的、非专利权属的其他信号肽)的基因插入质粒pPIC9K(或毕赤酵母表达体系公知的、非专利权属的其他质粒)中AOX1启动子的下游，且猪胰蛋白酶基因于酿酒酵母a交配因子前导肽(a-MF)基因下游，构建重组质粒pPIC9K-αMF-TPS。
酿酒酵母a交配因子前导肽(a-MF)选自于人源内质网蛋白ERp44(endoplasmicreticulum protein44)基因，其核酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明提到的酿酒酵母a交配因子前导肽(a-MF)、质粒pPIC9K、质粒pGAPZA等均已属于毕赤酵母表达体系科学文献公开报道的公知技术，本发明直接引用，不作权利要求，也不存在侵犯知识产权。
利用所述的高效表达猪胰蛋白酶重组毕赤酵母菌株，利用公知的基因工程重组技术，将构建的重组质粒pPIC9K-αMF-TPS和重组质粒pGAPZA-hERp44，酶切后线性化电转导入毕赤酵母GS115(购于Thermofisher)感受态细胞内，经过抗性筛选得到重组猪胰蛋白酶表达毕赤酵母菌株，命名为YJ-GS-TPS菌株。
进一步地利用公知的转化后介导载体扩增法，在不同质量浓度遗传霉素G418 YPD培养基培养YJ-GS-TPS菌株，通过不同YJ-GS-TPS菌株表达分泌重组猪胰蛋白酶的表达量、酶活性、质量稳性等指标进行筛选，利用荧光定量PCR检测重组猪胰蛋白酶基因拷贝数，其中高表达、高酶活、质量稳定性强的YJ-GS-TPS菌株的基因拷贝数在6～10个拷贝范围内，将其命名为YJ-GS-TPS(Plus)菌株。
本发明的有益效果：
本发明以毕赤酵母GS115为出发菌，通过对重组猪胰蛋白酶基因进行毕赤酵母密码子偏好性优化、共表达分子伴侣蛋白内质网ERp44蛋白、基因拷贝水平优选，构建了一种高表达、高酶活、质量稳定性强的重组猪胰蛋白酶毕赤酵母菌株，实现重组猪胰蛋白酶在毕赤酵母表达体系的外泌表达，其特点为：①酶蛋白表达水平提升了3.5倍，摇瓶发酵水平达到了120mg/ml；②酶的活性提高了45％，达到了9000UPS Unti/ml；③不同摇瓶之间酶活性质量稳定性差异小5％。同时整个表达过程，底物为甲醇，发酵成本低，分离纯化过程简单，为大规模制备重组猪胰蛋白酶提供坚实基础。
附图说明：
图1-1-a表达载体重组质粒pPIC9K-αMF-TPS意示图；
图1-1-b表达载体重组质粒pPIC9K-αMF-TPS谱图示意图；
图1-2-a表达载体重组质粒pGAPZA-hERp44意示图；
图1-2-b表达载体重组质粒pGAPZA-hERp44谱图意示图。
图2为本发明构建的重组猪胰蛋白酶毕赤酵母菌株YJ-GS-TPS和通过筛选的多拷贝基因重组猪胰蛋白酶毕赤酵母菌株YJ-GS-TPS(plus)分泌表达重组猪胰蛋白酶的电泳图。
图3重组猪胰蛋白酶毕赤酵母菌株YJ-GS-TPS在转化后介导载体扩增筛选过程中，不同拷贝基因的菌株表达重组猪胰蛋白酶分泌量图。
具体实施方式：
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：
根据毕赤酵母GS115表达体系密码子偏好性，优化重组猪胰蛋白酶基因核酸序列，构建表达载体重组质粒pPIC9K-αMF-TPS。
野型猪胰蛋白酶(Porcine-Trypsin-WT)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO.3)所示：
IVGGYTCAAN SVPYQVSLNS GSHFCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEGNEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG WGNTKSSGSSYPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGKDSCQGDSGGP VVCNGQLQGI VSWGYGCAQKNKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
野型猪胰蛋白酶(Porcine-Trypsin-WT)基因核酸序列如下(SEQ ID NO.4)所示：
Atcgtcgggggttacacctgtgcagcaaattccgttccctaccaggtgtccctgaattctggctcccacttctgtggtgggtccctcatcaacagccagtgggtggtgtctgctgctcactgctacaagtcccgaatccaggtgcgtctgggagaacacaacatcgacgtccttgagggcaatgagcaattcatcaatgccgccaagatcatcacccaccccaatttcaatggaaataccttagataacgacatcatgctgattaaactgagctcacctgccactctcaacagtcgagtagcaactgtctcactgccaaggtcttgtgcagctgctggtaccgagtgtctcatctctggctggggcaacaccaaaagcagtggctccagctacccttcgctcctgcaatgcctgaaggctcccgtcctaagtgacagttcttgcaagagttcctatccaggccagatcaccggaaacatgatctgtgtgggcttcctggagggtggaaaggattcttgccagggtgactctggtggtcccgtggtctgcaatggacagctccagggtattgtctcttggggctatggctgcgcccagaaaaacaagccaggggtctacaccaaggtatgcaactatgtgaactggattcagcagaccatcgctgccaactaa
人工计算野型猪胰蛋白酶(Porcine-Trypsin-WT)的氨基酸密码子分布如下表1：
表1：野生型猪胰蛋白酶的氨基酸密码子分布
优化前G+C含量：53.42％
根据《毕赤酵母的密码子用法分析》(赵翔，复旦大学生命科学院遗传工程国家重点实验室，生物工程学报16卷3期2000年5月)文献报道，对毕赤酵母全基因组(44个基因)基因核苷酸序列进行密码子频率分析，同时对毕赤酵母基因组中高频表达(例如维持能量代谢相关基因)和低频表达(例如膜结合蛋白相关基因)进行密码子优先频率次分析，计算分析毕赤酵母(P.pastaris)密码子偏好性如下表2：
表2：毕赤酵母(P.pastaris)密码子偏好性
根据计算分析毕赤酵母(P.pastaris)密码子偏好性，考虑毕赤酵母对全基因组核酸序列中高表达基因组GC含量在40％～50％范围内，结合DNA核酸分子结构稳定性要求避免长片段出现AT碱基的现象，将重组猪胰蛋白酶的氨基酸密码子优化为如下表3的范围内，同时将优化后的重组猪胰蛋白酶核酸序列中GC含量控制在43％～48％范围内，以适应毕赤酵母(P.pastaris)表达体系的基因高表达。
表3：重组猪胰蛋白在P.pastaris表达体系中密码子优化分布
优化后G+C含量：43％～48％
重组猪胰蛋白酶在毕赤酵母(P.pastaris)密码子优化后核酸序列所SEQ ID NO.1所示，但本发明不限于SEQ ID NO.1所示序列，还应包括按照上述实施例1中表格3原则进行的密码子优化后的序列。
重组猪胰蛋白酶密码子优化后C端加6个His分离纯化签标核酸序列，再在两端分别加上EcoRⅠ或SacⅠ酶切位点，在重组胰蛋白酶密码子优化后基因序列上游融合酿酒酵母a交配因子前导肽(a-MF)基因片段，使其在质粒pPIC9K载体排布如下图1-1所示，委托基因合成单位进行基因合成以及表达载体重组质粒pPIC9K-αMF-TPS构建。重组质粒构建完成后由基因合成单位进行全基因测序，验证重组质粒完整性。
收到基因合成单位构建的表达载体重组质粒pPIC9K-αMF-TPS时核对CoA文件后，将表达载体重组质粒pPIC9K-αMF-TPS导入大肠埃希菌TOP10进行平皿培养，挑选阳性菌落进行摇瓶扩增后收集菌体抽提表达载体重组质粒。采用表4中重组胰蛋白酶和a交配因子前导肽基因引物序列进行PCR扩增检验质粒。
表4：引物序列及酶切位点
实施例2：
构建分子伴侣人源内质网蛋白ERp44表达载体重组质粒pGAPZA-hERp44。
合成人源内质网蛋白ERp44基因全长序列(如SIEIDNO.2所示)，使其在质粒pGAPZA载体排布如下图1-2所示，并构建表达载体重组质粒pGAPZA-hERp44，重组质粒构建完成后由基因合成单位进行全基因测序，验证重组质粒完整性。
合成单位构建的表达载体重组质粒pGAPZA-hERp44时核对CoA文件后，将表达载体重组质粒pGAPZA-hERp44导入大肠埃希菌TOP10进行平皿培养，挑选阳性菌落进行摇瓶扩增后收集菌体抽提表达载体重组质粒。采用表4中内质网ERp44蛋白引物序列进行PCR扩增检验质粒。
实施例3：构建猪胰蛋白酶重组毕赤酵母YJ-GS-TPS菌株。
1、取实施例1中抽提到表达载体重组质粒pPIC9K-αMF-TPS10μg用SacⅠ酶对其进行线性化酶切，并用2倍体积无水乙醇沉淀回收，30μL ddH2O溶解。取100μL毕赤酶酵(P.pastaris)GS115感受态细胞加入30μL线性化酶切后的质粒，混合后转入电转杯中，冰上放置数分钟后，放入电转仪中电击(电压1680V，电击时间5mS)，电击后立即加入1mlD-山梨醇(IM)，冰上放置数分钟，然后将菌液涂布于含100μg/mL G418 YPD平板，放置28℃培养箱内培养。经过抗生筛选和PCR检测重组猪胰蛋白酶和a交配因子前导肽mRNA验证，得到阳性表达重组猪胰蛋白酶的基因工程重组毕赤酵母GS115菌株(命名YJ-GS-TPS(Pre)菌株)，并继续扩增培养，制备感受态细胞，用于后续实验。
2、取实施例2中抽提到表达载体重组质粒pGAPZA-hERp445μg用SacⅠ酶对其进行线性化酶切，并用2倍体积无水乙醇沉淀回收，30μL ddH2O溶解。取100μL基因工程重组毕赤酵母GS115(YJ-GS-TPS(Pre)菌株)感受态细胞加入30μL线性化酶切后的质粒，混合后转入电转杯中，冰上放置数分钟后，放入电转仪中电击(电压1680V，电击时间5mS)，电击后立即加入1mlD-山梨醇(IM)，冰上放置数分钟，然后将菌液涂布于含100μg/mL ZeocinYPD平板，放置28℃培养箱内培养。经过抗生筛选和PCR检测重组猪胰蛋白酶和内质网蛋白ERp44的mRNA验证，得到阳性表达重组猪胰蛋白酶的基因工程重组毕赤酵母GS115菌株(命名YJ-GS-TPS菌株)，并继续扩增培养，用于后续实验。
实施例4:评价YJ-GS-TPS(Pre)菌株和YJ-GS-TPS菌株在表达重组猪胰蛋白酶的性能差异。
将上述两种重组毕赤酵母GS115菌株分别接种于YPD平板30℃培养48h后，挑取单菌落接种含有50mLYPD培养基的250mL摇瓶中，于30℃和220r/min培养至OD600＝7。将发酵液5000r/min离心5min，去除上清液后，用无菌生理盐水洗涤菌体沉淀2次。分别用50mLpH为6.0的BMMY培养基重悬菌体，于30℃和220r/min下继续发酵，每24h补加1％的甲醇。发酵120h后，取发酵上清液测定重组猪胰蛋白酶的浓度、纯度和活力。
通过实施例4发现，重组毕赤酵母GS115 YJ-GS-TPS(Pre)菌株和重组毕赤酵母GS115 YJ-GS-TPS菌株均能表达重组猪胰蛋白酶，结果见下表5和图3。从表达的重组猪胰蛋白酶的浓度水平、酶活力等性能来看，GS115 YJ-GS-TPS菌株要优于GS115 YJ-GS-TPS(Pre)菌株，说明分子伴侣内质网蛋白ERp44发挥了促进重组猪胰白酶分泌表达量(提升17.6％)和提升酶活力(提高45％)的预期。但两种菌株的分泌表达量均有待进一步提升，对不同批次质量稳定性也有待考证，以满足工业化生产需求。
表5：GS115 YJ-GS-TPS(Pre)菌株和GS115 YJ-GS-TPS菌株表达结果
实施例5：构建多拷贝基因重组毕赤酵母GS115(YJ-GS-TPS(Plus)菌株。
将实施例3获得的重组毕赤酵母GS115菌株(YJ-GS-TPS菌株)和菌液分别涂布于含(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8mg/mL)等15个浓度梯度的G418 YPD平板，放置28℃培养箱内培养。挑取单菌落接种含有50mLYPD培养基的250mL摇瓶中于30℃和220r/min培养至OD600＝7。将发酵液于5000r/min离心5min，去除上清液后，用无菌生理盐水洗涤菌体沉淀2次。分别用50mLpH为6.0的BMMY培养基重悬菌体，于30℃和220r/min下继续发酵，每24h补加1％的甲醇。发酵120h后，取发酵上清液测定重组猪胰蛋白酶的浓度、纯度和活力。同时挑取发酵菌体进行q-PCR检测重组猪胰蛋白酶mRNA水平，计算不同发酵菌体中重组猪胰蛋白酶基因拷贝数。
下面表格6是构建多拷贝基因重组毕赤酵母GS115(YJ-GS-TPS(Plus)菌株过程中对重组猪胰蛋白酶的表达浓度、纯度、酶力以及基因拷贝数检测结果。图3为多基因拷贝数与酶表达浓度关系。
表6：构建多拷贝基因重组毕赤酵母GS115YJ-GS-TPS(Plus)菌株检测结果
从上述表格6检测结果来看，基因拷贝数在6～10范围内菌株重组猪胰蛋白酶分泌表达浓度水平较高，摇瓶发酵浓度已达到100～120mg/ml，已达到行业领先水平。同时发现基因拷贝数处于6～10范围的菌株分必表达重组猪胰蛋白酶的酶活性也较高，并且不同发酵瓶之间酶活性差异性变动比较小。因此我们将基因拷贝数在6～10范围的基因工程重组毕赤酵母GS115菌株筛选为“高效、高酶活、稳定性表达重组猪胰蛋白酶毕赤酵母菌株，命名为YJ-GS-TPS(Plus)菌株。
SEQ ID NO.1
SHFCGGSLINSQWVVSAAHCYKSRIQVRLGEHNIDVLEGNEQFINAAKIITHPNFNGN
TLDNDIMLIKLSSPATLNSRVATVSLPRSCAAAGTECLISGWGNTKSSGSSYPSLLQC
LKAPVLSDSSCKSSYPGQITGNMICVGFLEGGKDSCQGDSGGPVVCNGQLQGIVSWGYGCAQKNKPGVYTKVCNYVNWIQQTIAAN"
ORIGIN
密码子优化后的序列：
SEQ ID NO.2
/translation＝"MHPAVFLSLPDLRCSLLLLVTWVFTPVTTEITSLDTENIDEILNNADVALVNFYADWCRFSQMLHPIFEEASDVIKEEFPNENQVVFARVDCDQHSDIAQRYRISKYPTLKLFRNGMMMKREYRGQRSVKALADYIRQQKSDPIQEIRDLAEITTLDRSKRNIIGYFEQKDSDNYRVFERVANILHDDCAFLSAFGDVSKPERYSGDNIIYKPPGHSAPDMVYLGAMTNFDVTYNWIQDKCVPLVREITFENGEELTEEGLPFLILFHMKEDTESLEIFQNEVARQLISEKGTINFLHADCDKFRHPLLHIQKTPADCPVIAIDSFRHMYVFGDFKDVLIPGKLKQFVFDLHSGKLHREFHHGPDPTDTAPGEQAQDVASSPPESSFQKLAPSEYRYTLLRDRDEL"
ORIGIN
/>
Claims (2)
1.一种高效表达猪胰蛋白酶重组毕赤酵母菌株，其特征在于，具体的构建步骤为，
(1)根据毕赤酵母表达密码子偏好性和DNA核酸分子二级结构稳定性，结合野生型猪胰蛋白酶基因核酸序列GC含量水平，对在毕赤酵母表达的重组猪胰蛋白酶基因核酸序列进行了优化，将L(Leu)、S(Ser)、G(Gly)、V(Val)、N(Asn)、P(Pro)、Q(Gln)以及A(Ala)的密码子分别优化为TTG、AGT、GGT、GTT、AAT、CCA、CAA以及GCT；优化后猪胰蛋白酶基因cDNA序列，如SEQID NO.1所示；
(2)改变猪胰蛋白酶基因序列中G+C碱基含量(野生型含量为53.4％)，根据毕赤酵母表达密码子选择性特征以及DNA核酸分子二级结构稳定性要求，将步骤1优化后猪胰蛋白酶cDNA序列中G+C碱基含量控制在43％～48％范围内；
(3)将步骤2优化后猪胰蛋白酶基因和酿酒酵母a交配因子前导肽(a-MF)(或毕赤酵母表达体系公知的、非专利权属的其他信号肽)的基因插入质粒pPIC9K(或毕赤酵母表达体系公知的、非专利权属的其他质粒)中AOX1启动子的下游，且猪胰蛋白酶基因于酿酒酵母a交配因子前导肽(a-MF)基因下游，构建重组质粒pPIC9K-αMF-TPS。
2.一种权利要求1所述的高效表达猪胰蛋白酶重组毕赤酵母菌株的应用，其特征在于，利用所述的高效表达猪胰蛋白酶重组毕赤酵母菌株，利用公知的基因工程重组技术，将构建的重组质粒pPIC9K-αMF-TPS和重组质粒pGAPZA-hERp44，酶切后线性化电转导入毕赤酵母GS115感受态细胞内，经过抗性筛选得到重组猪胰蛋白酶表达毕赤酵母菌株，命名为YJ-GS-TPS菌株；
进一步地利用公知的转化后介导载体扩增法，在不同质量浓度遗传霉素G418 YPD培养基培养YJ-GS-TPS菌株，通过不同YJ-GS-TPS菌株表达分泌重组猪胰蛋白酶的表达量、酶活性、质量稳性等指标进行筛选，利用荧光定量PCR检测重组猪胰蛋白酶基因拷贝数，其中高表达、高酶活、质量稳定性强的YJ-GS-TPS菌株的基因拷贝数在6～10个拷贝范围内，将其命名为YJ-GS-TPS(Plus)菌株。
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