CN115960802A - 高产重组蛋白的需钠弧菌工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高产重组蛋白的需钠弧菌工程菌及其应用，该工程菌包括需钠弧菌和导入需钠弧菌内的重组质粒，所述需钠弧菌的基因组中T7RNA聚合酶的上游序列发生替换；替换方式为：上游启动子替换成tet启动子；或RBS序列替换成RBS1序列，RBS3序列，RBS4序列，RBS5序列，RBS6序列，RBS8序列，RBS10序列，RBS11序列或RBS12序列；或两者同时发生替换；所述重组质粒中包含有外源重组蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种高产重组蛋白的需钠弧菌工程菌及其应用。
背景技术
微生物系统的不断发展，使得重组蛋白的生产技术发生了革命性的变化。高效、新型的微生物重组蛋白表达系统能够进一步降低重组蛋白的生产成本。大肠杆菌作为一种广泛使用的重组蛋白表达底盘，可以用于表达多种蛋白，其中BL21(DE3)及其衍生物是最常用的蛋白表达菌株。大肠杆菌作为重组蛋白的表达底盘有明显的优点：大肠杆菌自身带有T7表达系统，能够表达pET等表达载体。大肠杆菌很容易获得高细胞密度培养，所需的营养成分简单易得，异源DNA转化大肠杆菌效率高且简单快速。但是其仍存在一些缺点，比如缺乏生物活性、产物不稳定,而且大肠杆菌并不能表达任何我们想表达的蛋白，比如膜蛋白、有毒性蛋白等。
pET系统被广泛用来表达外源重组蛋白。一般将目标蛋白基因置于T7启动子下游，而T7启动子只能由T7RNA聚合酶起始转录。T7RNA聚合酶具备高催化活力，它的转录速度比大肠杆菌内源的RNA聚合酶的转录速度快约8倍。当T7RNA聚合酶被充分诱导时，能够利用细胞中的大部分材料来起始目的蛋白的转录，且在数小时后，目标蛋白能够超过细胞总蛋白的50％。
需钠弧菌是一种革兰氏阴性、对人类非致病的海洋细菌。其倍增时间在7～10分钟之间，传代速度比大肠杆菌快一倍，是已知代时最短的自由生活细菌，或可发展为一个特色表达系统。研究发现需钠弧菌单个细胞核糖体数量高达115000个，而大肠杆菌只有约70000～90000个，这意味着其具有更快的生物量合成速度和更强的蛋白表达能力。需钠弧菌的高生长和高底物摄取速率在作为宿主表达外源蛋白时，有望在前期快速生长，缩短发酵延滞期，在工业生产中节约能量和时间成本。野生型需钠弧菌没有T7 RNA聚合酶，所以无法使用T7表达系统。但是已有研究者将T7 RNA聚合酶表达框整合到需钠弧菌染色体中，并用GFP去测试T7表达系统，结果符合预期，这说明需钠弧菌有潜力成为快速重组表达的底盘。但是目前T7表达系统的强度是固定的，但不同的蛋白有其自身适合的表达强度，目前的固定强度并不适用于任何蛋白的高效表达。
到目前为止，尚未有研究报道需钠弧菌在T7表达系统中T7 RNAP的适当表达强度。
发明内容
本发明提供了一种高产重组蛋白的需钠弧菌工程菌及其应用，该工程菌能够高效表达外源导入的重组质粒上的重组蛋白，从而显著提高工程菌蛋白质产量。
具体技术方案如下：
一种高产重组蛋白的需钠弧菌工程菌，包括需钠弧菌和在需钠弧菌内表达且自我复制的重组质粒，所述需钠弧菌的基因组中T7 RNA聚合酶的上游序列发生替换；
替换方式为下列之一：
1)，上游启动子替换成tet启动子；
2)，RBS序列替换成RBS1序列，RBS3序列，RBS4序列，RBS5序列，RBS6序列，RBS8序列，RBS10序列，RBS11序列或RBS12序列；
3)，1)和2)同时发生替换；
所述重组质粒中包含有外源重组蛋白，且外源重组蛋白的上游含有T7启动子；所述上游启动子的碱基序列如SEQ ID NO.16所示，RBS序列的碱基序列如SEQ ID NO.17所示；
所述tet启动子的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；所述RBS1的碱基序列如SEQ IDNO.2所示；所述RBS3的碱基序列如SEQ ID NO.4所示；所述RBS4的碱基序列如SEQ ID NO.5所示；所述RBS5的碱基序列如SEQ ID NO.6所示；所述RBS6的碱基序列如SEQ ID NO.7所示；所述RBS8的碱基序列如SEQ ID NO.9所示；所述RBS10的碱基序列如SEQ ID NO.11所示；所述RBS11的碱基序列如SEQ ID NO.12所示；所述RBS12的碱基序列如SEQ ID NO.13所示。
进一步地，所述需钠弧菌的株型为需钠弧菌(Vibrio natriegens)ATCC14048，其为市售产品，可购于ATCC。
进一步地，所述外源重组蛋白为葡萄糖脱氢酶。
进一步地，所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
进一步地，所述T7 RNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
本发明提供了所述的需钠弧菌工程菌在高产外源重组蛋白中的应用。
进一步地，所述的外源重组蛋白为葡萄糖脱氢酶。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过对需钠弧菌基因组中T7 RNA聚合酶的上游序列进行天然转化，获得了能够高表达外源导入重组质粒上的重组蛋白(尤其是葡萄糖脱氢酶)，可显著提高工程菌外源蛋白的产量，具有推广应用前景。
附图说明
图1为T7 RNA聚合酶启动子突变菌株摇瓶培养后的葡萄糖脱氢酶酶活测定对比柱形图。
图2为T7 RNA聚合酶RBS突变菌株摇瓶培养后的葡萄糖脱氢酶酶活测定对比柱形图。
图3为同时将T7RNA聚合酶启动子替换为tet启动子、原RBS替换为RBS12后的葡萄糖脱氢酶酶活测定对比柱形图。
图4为需钠弧菌VnDX/pET24a-GDH示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
下列实施例所涉及的材料和方法如下：
实施例中的引物合成及测序皆由生物公司完成。实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。需钠弧菌天然感受态细胞转化方法及感受态制备方法均参照文献(Dalia,T.N.,et al.Multiplex GenomeEditing by Natural Transformation(MuGENT)for Synthetic Biology in Vibrionatriegens.ACS Synth Biol.2017)公开方法进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。需钠弧菌ATCC14048在ATCC购买。
实施例1构建T7 RNA聚合酶启动子突变库
参照文献(Dalia,T.N.,et al.Multiplex Genome Editing by NaturalTransformation(MuGENT)for Synthetic Biology in Vibrio natriegens.ACS SynthBiol.2017)公开的方法，运用天然转化和同源重组技术将需钠弧菌VnDX(即需钠弧菌(Vibrionatriegens)ATCC14048)中T7 RNA聚合酶的启动子序列进行替换。基因改造后的需钠弧菌VnDX中的T7 RNA聚合酶具有不同的表达强度，能够高效表达外源蛋白。
具体步骤包括：
1.1构建pdnsaLR-T7RNAP-tet-SpecR质粒
以pdnsaLR-T7RNAP-SpecR质粒为模板，采用引物对dnsaR-R和tet-F进行PCR，得到长度约为7.4kb的DNA片段，采用引物对dnsaL-F和tet-R进行PCR，得到长度约为6.7kb的DNA片段。
dnsaR-R：5’-gtcagtgagcgagggatctagacaatctaggggaacagt-3’；
tet-F：5’-gttattttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaatgtggaattgtgagcggataacaa-3’；
dnsaL-F：5’-ccctcgctcactgactcgct-3’；
tet-R：5’-gagtggtaaaataactctatcaatgatagagtgtcaacaagcctggggtgcctaatgagt-3’。
电泳凝胶回收2个DNA片段，然后将2个克隆片段通过Gibson组装，化学转化法转入DH5α转感受态细胞中，涂布壮观霉素加氨苄青霉素双抗性LB平板，37℃培养过夜，次日挑菌落接试管保菌即可。
1.2修复模板的获得
抽提pdnsaLR-T7RNAP-tet-SpecR质粒，用限制性内切酶XbaI酶切，获得线性化片段pdnsaLR-T7RNAP-tet-SpecR。
1.3含Ptet的T7RNA聚合酶表达盒的需钠弧菌获得
a.参照文献(Dalia,T.N.,et al.,ACS Synth Biol.2017)，电转质粒pTfoX至宿主菌VnDX中，涂Carb平板，30℃培养。
b.挑取阳性克隆子，制备天然转化感受态细胞，在试管培养天然转化感受态细胞时加入0.3mM IPTG诱导TFOX的表达。
c.天然转化法转入步骤1.2中所得的片段dnsaLR-T7RNAP-SpecR，30℃复苏1小时后，以carb+spec平板进行筛选。
d.过夜培养后对克隆子进行验证，得到需钠弧菌VnDX-tet，其基因组中的DNS位点已经整合了含Ptet的T7 RNA聚合酶表达盒。以该需钠弧菌VnDX-tet为宿主，进行外源重组蛋白质的表达生产。
1.4突变菌株VnDX-trc、VnDX-J23102、VnDX-J23114的构建同上。
实施例2构建T7 RNA聚合酶RBS突变库
参照文献(Dalia,T.N.,et al.Multiplex Genome Editing by NaturalTransformation(MuGENT)for Synthetic Biology in Vibrio natriegens.ACS SynthBiol.2017)公开的方法，运用天然转化和同源重组技术将需钠弧菌VnDX中T7 RNA聚合酶的RBS序列进行替换。基因改造后的需钠弧菌VnDX中的T7 RNA聚合酶具有不同的表达强度，能够高效表达外源蛋白。
具体步骤包括：
1.1构建pdnsaLR-T7RNAP-B0029-SpecR质粒
以pdnsaLR-T7RNAP-SpecR质粒为模板，采用引物对dnsaR-R和B0029-F进行PCR，得到长度约为6.8kb的DNA片段，采用引物对dnsaL-F和B0029-R进行PCR,得到长度约为7.2kb的DNA片段。
dnsaR-R：5’-gtcagtgagcgagggatctagacaatctaggggaacagt-3’；
B0029-F：5’-ttcacacaggaaacccactaaatgaacacgattaacatcg-3’；
dnsaL-F：5’-ccctcgctcactgactcgct-3’；
B0029-R：5’-ggtttcctgtgtgaaagttagtaaatccggatcagatccc-3’。
电泳凝胶回收2个DNA片段，然后将2个克隆片段通过Gibson组装，化学转化法转入DH5α转感受态细胞中，涂布壮观霉素加氨苄青霉素双抗性LB平板，37℃培养过夜，次日挑菌落接试管保菌即可。
1.2修复模板的获得
抽提pdnsaLR-T7RNAP-B0029-SpecR质粒，用限制性内切酶XbaI酶切，获得线性化片段pdnsaLR-T7RNAP-B0029-SpecR。
1.3含RBS B0029的T7RNA聚合酶表达盒的需钠弧菌获得
a.参照文献(Dalia,T.N.,et al.,ACS Synth Biol.2017)，电转质粒pTfoX至宿主菌VnDX中，涂Carb平板，30℃培养。
b.挑取阳性克隆子，制备天然转化感受态细胞，在试管培养天然转化感受态细胞时加入03mM IPTG诱导TFOX的表达。
c.天然转化法转入步骤1.2中所得的片段pdnsaLR-T7RNAP-B0029-SpecR，30℃复苏1小时后，以carb+spec平板进行筛选。
d.过夜培养后对克隆子进行验证，得到需钠弧菌VnDX-B0029，其基因组中的DNS位点已经整合了含RBS B0029的T7RNA聚合酶表达盒。以该需钠弧菌VnDX-B0029为宿主，进行外源重组蛋白质的表达生产。
1.4突变菌株VnDX-B0030、VnDX-B0031、VnDX-B0032、VnDX-B0033、VnDX-B0034、VnDX-B0035、VnDX-RBS1、VnDX-RBS2、VnDX-RBS3、VnDX-RBS4、VnDX-RBS5、VnDX-RBS6、VnDX-RBS7、VnDX-RBS8、VnDX-RBS9、VnDX-RBS10、VnDX-RBS11、VnDX-RBS12的构建同上，RBS1～RBS12的碱基序列依次如SEQ ID NO.2～13所示。
实施例3同时替换T7 RNA聚合酶的启动子和RBS序列
参照文献(Dalia,T.N.,et al.Multiplex Genome Editing by NaturalTransformation(MuGENT)for Synthetic Biology in Vibrio natriegens.ACS SynthBiol.2017)公开的方法，运用天然转化和同源重组技术同时将需钠弧菌VnDX中T7 RNA聚合酶的启动子和RBS序列进行替换。基因改造后的需钠弧菌VnDX中的T7 RNA聚合酶具有不同的表达强度，能够高效表达外源蛋白。
具体步骤包括：
3.1构建pdnsaLR-T7RNAP-tet-SpecR质粒
以pdnsaLR-T7RNAP-tet-SpecR质粒为模板，采用引物对dnsaR-R和RBS12-F进行PCR，得到长度约为6.8kb的DNA片段，采用引物对dnsaL-F和RBS12-R进行PCR,得到长度约为7.3kb的DNA片段。
dnsaR-R：5’-gtcagtgagcgagggatctagacaatctaggggaacagt-3’；
RBS12-F：5’-atccggATTTACTAACTGGAAGAGTCTTACAatgaacacgattaaca-3’；
dnsaL-F：5’-ccctcgctcactgactcgct-3’；
RBS12-R：5’-ttcatTGTAAGACTCTTCCAGTTAGTAAATccggatcagatc-3’。
电泳凝胶回收2个DNA片段，然后将2个克隆片段通过Gibson组装，化学转化法转入DH5α转感受态细胞中，涂布壮观霉素加氨苄青霉素双抗性LB平板，37℃培养过夜，次日挑菌落接试管保菌即可。
3.2修复模板的获得
抽提pdnsaLR-T7RNAP-tet-RBS12-SpecR质粒，用限制性内切酶XbaI酶切，获得线性化片段pdnsaLR-T7RNAP-tet-RBS12-SpecR。
3.3含tet和RBS12的T7RNA聚合酶表达盒的需钠弧菌获得
a.参照文献(Dalia,T.N.,et al.,ACS Synth Biol.2017)，电转质粒pTfoX至宿主菌VnDX中，涂Carb平板，30℃培养。
b.挑取阳性克隆子，制备天然转化感受态细胞，在试管培养天然转化感受态细胞时加入0.3mM IPTG诱导TFOX的表达。
c.天然转化法转入步骤1.2中所得的片段pdnsaLR-T7RNAP-tet-RBS12-SpecR，30℃复苏1小时后，以carb+spec平板进行筛选。
d.过夜培养后对克隆子进行验证，得到需钠弧菌VnDX-tet-RBS12，其基因组中的DNS位点已经整合了含启动子tet和RBS RBS12的T7RNA聚合酶表达盒。以该需钠弧菌VnDX-tet-RBS12为宿主，进行外源重组蛋白质的表达生产。。
实施例4构建含pET24a-GDH质粒的需钠弧菌
构建葡萄糖脱氢酶的质粒，并将其转入大肠杆菌DH5α中，构建正确的质粒命名为pET24a-GDH。参照文献(Weinstock,M.T.,et al.Vibrio natriegens as a fast-growinghost for molecular biology.Nat Methods 13(10):849-851.2016)公开的方法，将前述质粒电转入需钠弧菌工程菌VnDX-tet和VnDX-trc、VnDX-J23102、VnDX-J23114中，将菌株命名为VnDX-tet/pET24a-GDH和VnDX-trc/pET24a-GDH、VnDX-J23102/pET24a-GDH、VnDX-J23114pET24a-GDH。
具体步骤包括：
参照文献(Weinstock,M.T.,et al.Nat Methods 13(10):849-851.2016)，将从DH5α中抽提的质粒pET24a-GDH电转至工程菌菌VnDX-tet和VnDX-trc、VnDX-J23102、VnDX-J23114中，涂Kan平板，30℃培养。挑取转化子接试管，过夜培养后保藏菌种，获得菌株VnDX-tet/pET24a-GDH、VnDX-trc/pET24a-GDH、VnDX-J23102/pET24a-GDH、VnDX-J23114pET24a-GDH。
实施例5需钠弧菌突变株测定GDH酶活的表达
5.1菌体培养
固体平板划线活化VnDX-tet等突变菌株，挑取单克隆接种于5ml含有200ug/mlkan的BHIv2培养基的试管，30℃，220rpm培养过夜。各取0.3ml过夜菌液，接种至30ml含有200ug/ml kan的BHIv2培养基中，30℃，220rpm摇床培养10小时，再加入终浓度为0.3mM的IPTG进行诱导，28℃，220rpm摇床培养10小时。
5.2葡萄糖脱氢酶检测
将上述发酵的每个摇瓶取4mL的菌液，加入4mL的Tris HCI缓冲液，并用超声细胞破碎机(操作3s，暂停7s，30次)裂解菌体，得到粗酶液。
用紫外分光光度计来测定GDH的酶活。使用反应体系为1ml，包括8mM的NAD+、400nM的葡萄糖、50mM的Tris HCL(pH 7.5)和25μl稀释后的粗酶液，用OD340nm处吸光度的增加来读取GDH的酶活，计算公式为U/mL＝[△A/min]×[1/ε]×[1/d]×[Vt/Vs]。
5.3实验结果
从葡萄糖脱氢酶的数据可知，当T7 RNAP的启动子从PlacUV5变成Ptet后，GDH的酶活提高了109％。当原本的RBS更换为RBS12的系列后，突变菌株VnDX-RBS12的催化效率高于VnDX，GDH酶活最高，达262.94U/mL，比VnDX高10.9％。这说明改变T7 RNA聚合酶的启动子和RBS，调整T7表达系统的强度能增强需钠弧菌重组蛋白质的表达量。
以上实施例表明，本发明通过天然转化和同源重组获得不同T7表达系统强度的需钠弧菌突变库，外源重组蛋白质比如葡萄糖脱氢酶在突变库中的表达水平有了一定程度的提高，具有商业应用推广价值。
Claims (8)
1.一种高产重组蛋白的需钠弧菌工程菌，其特征在于，包括需钠弧菌和在需钠弧菌内表达且自我复制的重组质粒，所述需钠弧菌的基因组中T7 RNA聚合酶的上游序列发生替换；
替换方式为下列之一：
1)，上游启动子替换成tet启动子；
2)，RBS序列替换成RBS1序列，RBS3序列，RBS4序列，RBS5序列，RBS6序列，RBS8序列，RBS10序列，RBS11序列或RBS12序列；
3)，1)和2)同时发生替换；
所述重组质粒中包含有外源重组蛋白，且外源重组蛋白的上游含有T7启动子；
所述tet启动子的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；所述RBS1的碱基序列如SEQ ID NO.2所示；所述RBS3的碱基序列如SEQ ID NO.4所示；所述RBS4的碱基序列如SEQ ID NO.5所示；所述RBS5的碱基序列如SEQ ID NO.6所示；所述RBS6的碱基序列如SEQ ID NO.7所示；所述RBS8的碱基序列如SEQ ID NO.9所示；所述RBS10的碱基序列如SEQ ID NO.11所示；所述RBS11的碱基序列如SEQ ID NO.12所示；所述RBS12的碱基序列如SEQ ID NO.13所示。
2.如权利要求1所述的高产重组蛋白的需钠弧菌工程菌，其特征在于，所述需钠弧菌的株型为需钠弧菌(Vibrio natriegens)ATCC14048。
3.如权利要求1所述的高产重组蛋白的需钠弧菌工程菌，其特征在于，所述外源重组蛋白为葡萄糖脱氢酶。
4.如权利要求1所述的高产重组蛋白的需钠弧菌工程菌，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
5.如权利要求1所述的高产重组蛋白的需钠弧菌工程菌，其特征在于，所述T7RNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
6.如权利要求1所述的高产重组蛋白的需钠弧菌工程菌，其特征在于，所述重组质粒的原始表达载体为pET载体。
7.如权利要求1～5任一项所述的需钠弧菌工程菌在高产外源重组蛋白中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的外源重组蛋白为葡萄糖脱氢酶。
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