JP7461463B2 - 大腸菌に基づく組換え株ならびにその構築方法および使用 - Google Patents
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Description
本願出願は、２０１９年０９月２７日に中国国家知的財産局に提出された特許出願番号２０１９１０９２７６００５の先願の優先権、２０１９年０８月２８日に中国国家知的財産局に提出された特許出願番号２０１９１０８０４０３５３の先願の優先権を主張し、前述した先願の全文は、参照により本出願に組み込まれている。
〔技術分野〕
本発明は、遺伝子工学および微生物技術の分野に属し、具体的には、大腸菌に基づく組換え株ならびにその構築方法および使用に関する。
本発明は、遺伝子工学および微生物技術の分野に属し、具体的には、大腸菌に基づく組換え株ならびにその構築方法および使用に関する。
〔背景技術〕
Ｌ－スレオニンは８種類の必須アミノ酸の１種類であり、かつヒトや動物が自分で合成することはできないアミノ酸である。Ｌ－スレオニンは、穀物の吸収を強化し、体内の代謝のバランスを調整し、体の成長と発達を促進することができ、飼料、医薬品および食品業界で広く使用されている。
Ｌ－スレオニンは８種類の必須アミノ酸の１種類であり、かつヒトや動物が自分で合成することはできないアミノ酸である。Ｌ－スレオニンは、穀物の吸収を強化し、体内の代謝のバランスを調整し、体の成長と発達を促進することができ、飼料、医薬品および食品業界で広く使用されている。
現在、Ｌ－スレオニンの生産は、主に化学合成法、タンパク質加水分解法、および、微生物発酵法があり、そのうち、微生物発酵法は生産コストが低く、生産強度が高く、環境汚染が少ないため、Ｌ－スレオニンの工業生産に最も広く採用されている方法になる。Ｌ－スレオニンの微生物発酵生産には、生産株として大腸菌、コリネバクテリウム属、セラチア属などの野生型誘導突然変異株などさまざまな細菌を使用することができる。具体的な例としては、アミノ酸アナログ耐性変異株や、メチオニン、スレオニン、イソロイシンなどのさまざまな栄養要求性変異株がある。しかし、伝統的な誘導突然変異育種では、ランダムな突然変異であるため、株の成長が遅くなり、多くの副産物を生成し、高収量の株を得ることが困難になる。したがって、代謝工学的手法を使用して組換え大腸菌を構築することは、Ｌ－スレオニンを生産する効果的なルールである。現在、大腸菌の遺伝子改変の主な手段として、発現プラスミドを介したアミノ酸合成経路および競合経路におけるキー酵素遺伝子の過剰発現または弱化（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）発現の利用がある。しかしながら、Ｌ－スレオニンをより経済的に高収率で製造する方法の開発は、依然として望まれている。
外来遺伝子発現の宿主として、大腸菌は、遺伝的背景が明確で、技術的な操作や培養条件が簡単で、大規模な発酵が経済的であり、遺伝子工学の専門家からの大きな注目を集めている。大腸菌のゲノムＤＮＡは擬核中の１つの環状分子であり、同時に複数の環状プラスミドＤＮＡを有することができる。大腸菌細胞の擬核には、長さが約４７０００００塩基対である１つのＤＮＡ分子があり、ＤＮＡ分子には約４４００の遺伝子が分布しており、各遺伝子の平均の長さは約１０００塩基対である。分子生物学で一般的に使用される大腸菌株は、いくつかの例外を除いて、ＤＮＡ組換え試験で使用されるほとんどの株は、大腸菌株Ｋ１２とその誘導体である。
〔発明の概要〕
本発明は、大腸菌株Ｋ１２またはその誘導体に基づく組換え株、その組換え構築方法および発酵によるアミノ酸の生産における使用を提供する。
本発明は、大腸菌株Ｋ１２またはその誘導体に基づく組換え株、その組換え構築方法および発酵によるアミノ酸の生産における使用を提供する。
本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株およびその派生株（例えば、ＭＧ１６５５、Ｗ３１１０など）の野生型ｄｅｏＢ遺伝子（ＯＲＦ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＰ０３２６６７．１における配列３９０２３５２－３９０３５７５に示す。）、野生型ｒｈｔＡ遺伝子プロモーター配列ＰｒｈｔＡ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＰ００９０４８．１における配列８５０５２０－８５０８７１に示す。）に焦点を当てて、前記遺伝子を部位特異的変異した後に得られた突然変異遺伝子および前記変異遺伝子を含む組換え株が、Ｌ－スレオニンの生産に使用でき、変異していない野生型株と比べて、得られた株はＬ－スレオニンの生産量を大幅に増加させることができ、かつ株の安定性が優れ、Ｌ－スレオニン生産株として、生産コストが削減され、生産効率が改善されることを見出した。
上記の発明に基づいて、本発明は、以下の２つの部分の構成を提供する。
第一部分として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す野生型ｄｅｏＢ遺伝子コード配列の１０４９番目の塩基の突然変異によって形成された配列を含むヌクレオチド配列を提供する。
本発明によれば、前記突然変異とは、前記部位の塩基／ヌクレオチドが変化することを意味し、前記突然変異の方法は、誘発、ＰＣＲ部位特異的突然変異法、および／または相同組換えなどの方法から選ばれた少なくとも１種であってもよい。
本発明によれば、前記突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１における１０４９番目の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への突然変異であり、具体的には、前記突然変異された後のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す。
本発明は、さらに前述したヌクレオチド配列でコードされる組換えタンパク質を提供する。
本発明の組換えタンパク質によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列を含む。
本発明は、さらに前記ヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供する。
本発明の組換えベクターによれば、前記ヌクレオチド配列をプラスミドに導入することによって構築してなり、１つの実施形態として、前記プラスミドはｐＫＯＶプラスミドである。具体的に、前記ヌクレオチド配列および前記プラスミドを、エンドヌクレアーゼで消化して相補的な粘着末端を形成し、両者を接続して組換えベクターを構築してもよい。
本発明は、さらに，コード配列に点突然変異を有するｄｅｏＢ遺伝子コードヌクレオチド配列を含む組換え株を提供する。
本発明の組換え株によれば、前記の突然変異後のヌクレオチド配列を含む。
本発明の１つの実施形態によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すヌクレオチド配列を含む。
本発明の１つの実施形態によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列を含む。
本発明の組換え株によれば，前述した組換えベクターを宿主株に導入することによって組換えして形成され、前記宿主株は、特に限定されておらず、当業界に周知されたｄｅｏＢ遺伝子が保持されているＬ－スレオニン産生株、例えば、大腸菌から選ばれたものであってもよい。本発明の１つの実施形態によれば、前記宿主株はＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）株、または、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２株である。
本発明の組換え株によれば，ｐＫＯＶプラスミドをベクターとする。
本発明の組換え株によれば，さらに他の改変をさらに含むことができる。
本発明は、さらにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す野生型ｄｅｏＢ遺伝子のオープンリーディングフレーム領域のヌクレオチド配列をその１０４９番目の塩基を突然変異させるように改変し、突然変異されたｄｅｏＢコード遺伝子を含むＬ－スレオニン産生組換え株を得ることを含む組換え株の構築方法を提供する。
本発明の構築方法によれば、前記改変は、誘発、ＰＣＲ部位特異的突然変異法、および／または相同組換えなどの方法のうちの少なくとも１種を含む。
本発明の構築方法によれば，前記突然変異とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１における１０４９番目の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への突然変異を意味し、具体的に、前記突然変異され後のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す。
例示的に、前記構築方法は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す野生型ｄｅｏＢ遺伝子のオープンリーディングフレーム領域のヌクレオチド配列を、その１０４９番目の塩基を突然変異させように改変して、突然変異されたｄｅｏＢ遺伝子のオープンリーディングフレーム領域のヌクレオチド配列を得るステップ、
（２）前記突然変異されたヌクレオチド配列とプラスミドを接続して、組換えベクターを構築するステップ、および、
（３）前記組換えベクターを宿主株に導入して、前記点突然変異を含むＬ－スレオニン産生組換え株を得るステップ、
を含む。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す野生型ｄｅｏＢ遺伝子のオープンリーディングフレーム領域のヌクレオチド配列を、その１０４９番目の塩基を突然変異させように改変して、突然変異されたｄｅｏＢ遺伝子のオープンリーディングフレーム領域のヌクレオチド配列を得るステップ、
（２）前記突然変異されたヌクレオチド配列とプラスミドを接続して、組換えベクターを構築するステップ、および、
（３）前記組換えベクターを宿主株に導入して、前記点突然変異を含むＬ－スレオニン産生組換え株を得るステップ、
を含む。
本発明の構築方法によれば，前記ステップ（１）は、点突然変異されたｄｅｏＢ遺伝子コード領域の構築、すなわち、ｄｅｏＢ遺伝子コード配列に従って、ｄｅｏＢ遺伝子コード領域の断片を増幅するための２対のプライマーを合成し、ＰＣＲ部位特異的突然変異法により、野生型ｄｅｏＢ遺伝子コード領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に点突然変異を導入し、点突然変異されたｄｅｏＢ遺伝子コード領域のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を取り得、ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）と表記されることを含む。
本発明の１つの実施形態において、前記ステップ（１）において、前記プライマーは、下記に示す。
Ｐ１：５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＧＣＴＧＡＡＧ ３’ （下線が引かれた部分は制限エンドヌクレアーゼ切断部位ＢａｍＨ Ｉである。）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
Ｐ２：５’ＧＡＴＣＧＴＡＡＣＣＧＴＧＧＴＣＡＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
Ｐ３：５’ＣＴＧＡＣＣＡＣＧＧＴＴＡＣＧＡＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
Ｐ４：５’ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＴＣＧＴＧＡＧＴＧＣＧＧＡＴＧＴ ３’ （下線が引かれた部分は制限エンドヌクレアーゼ切断部位Ｎｏｔ Ｉである。）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）。
Ｐ１：５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＧＣＴＧＡＡＧ ３’ （下線が引かれた部分は制限エンドヌクレアーゼ切断部位ＢａｍＨ Ｉである。）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
Ｐ２：５’ＧＡＴＣＧＴＡＡＣＣＧＴＧＧＴＣＡＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
Ｐ３：５’ＣＴＧＡＣＣＡＣＧＧＴＴＡＣＧＡＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
Ｐ４：５’ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＴＣＧＴＧＡＧＴＧＣＧＧＡＴＧＴ ３’ （下線が引かれた部分は制限エンドヌクレアーゼ切断部位Ｎｏｔ Ｉである。）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）。
本発明の１つの実施形態において、前記ステップ（１）では、下記を含む。すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２をテンプレートとし、プライマーとしてそれぞれＰ１／Ｐ２、および、Ｐ３／Ｐ４を使用してＰＣＲ増幅を行って、ｄｅｏＢ遺伝子コード領域を含む分離されているサイズがそれぞれ８３６ｂｐ、８９０ｂｐである２つのＤＮＡ断片（ｄｅｏＢ ＵｐとｄｅｏＢ Ｄｏｗｎ）を得ることを含む。上記の２つのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離・精製した後、上記の２つのＤＮＡ断片をテンプレートとして使用し、Ｐ１とＰ４をプライマーとしてオーバーラップＰＣＲ（Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲ）で増幅してｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎを得る。
本発明の１つの実施形態において、前記ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎヌクレオチド配列は、サイズが１７２６ｂｐである。
本発明の１つの実施形態において、前記ＰＣＲ増幅では、９４°Ｃで３０ｓの変性、５２°Ｃで３０ｓのアニーリングおよび７２°Ｃで３０ｓの伸長（３０サイクル）を行う。
本発明の１つの実施形態において、前記オーバーラップＰＣＲ増幅では、９４°Ｃで３０ｓの変性、５２°Ｃで３０ｓのアニーリングおよび７２°Ｃで６０ｓの伸長（３０サイクル）を行う。
本発明の構築方法によれば，前記ステップ（２）は、組換えベクターの構築を含み、すなわち、前記ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片を、アガロースゲル電気泳動で分離・精製した後、これとｐＫＯＶプラスミドをそれぞれＢａｍＨ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉで二重消化し、消化された後のｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片とｐＫＯＶプラスミドをアガロースゲル電気泳動で分離・精製し、かつ接続して、組換えベクターｐＫＯＶ－ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）を得ることを含む。
本発明の構築方法によれば，前記ステップ（３）は、組換え株の構築を含み、すなわち、組換えベクターｐＫＯＶ－ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）を宿主株に形質転換して組換え株を得ることを含む。
本発明の１つの実施形態において、前記ステップ（３）における形質転換は、エレクトロポレーション法で行い、例示的に、前記ステップ（３）において、組換えベクターを前記宿主株に導入する。
本発明の構築方法によれば，さらに組換え株をスクリーニングするステップを含み、例示的に、例えば、クロラムフェニコール培地でスクリーニングすることがある。
本発明は、さらに前述した構築方法で得られた組換え株を提供する。
本発明は、さらにＬ－スレオニンの製造またはＬ－スレオニンの発酵量の向上における前述した組換え株の使用を提供する。
本発明に係るＬ－スレオニンの製造における前記組換え株の使用によれば、前記組換え株を用いて発酵してＬ－スレオニンを製造することを含む。
第二部分として、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示すクレオチド配列の上流の－６７番目の塩基の突然変異によって形成されたヌクレオチド配列を含むプロモーターを提供する。
本発明によれば、前記突然変異とは、前記位点の塩基が変化することを指し、前記突然変異の方法は、誘発、ＰＣＲ部位特異的突然変異法、および／または相同組換えなどの方法から選ばれた少なくとも１種であってもよい。
本発明によれば、前記突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３における－６７番目の塩基のアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への突然変異であり、具体的に、前記点突然変異した後のプロモーターのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示す。
本発明は、前記プロモーターおよびｒｈｔＡ遺伝子のコードヌクレオチド配列を含む発現カセットを提供する。本発明の１つの実施形態によれば，前記プロモーターは、ｒｈｔＡ遺伝子のコードヌクレオチド配列の５’上流に位置し、発現カセットの一部を構成する。
本発明の発現カセットによれば、前記ｒｈｔＡ遺伝子のコードヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示すヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列のコードは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示すアミノ酸配列を含む。
本発明は、前記プロモーターを含む組換えベクターを提供する。
本発明の組換えベクターによれば、前記プロモーターを含むヌクレオチド配列をプラスミドに導入することによって構築してなり、１つの実施形態として、前記プラスミドはｐＫＯＶプラスミドである。具体的に、前記プロモーターを含むヌクレオチド配列と前記プラスミドを、エンドヌクレアーゼで消化して相補的な粘着末端を形成し、両者を接続して組換えベクターを構築する。
本発明は、さらに前記プロモーターを含む組換え株を提供する。
本発明の組換え株によれば，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示すプロモーターヌクレオチド配列を含み、さらに前記組換え株は、前述した発現カセットを含む。
本発明の組換え株によれば、前述した組換えベクターを宿主株に導入して組換えして形成され、前記宿主株は、特に限定されておらず、当業界に周知されたｒｈｔＡ遺伝子が保持されているＬ－スレオニン産生株から選ばれたものであってもよく、例えば、大腸菌から選ばれたものであってもよい。本発明の１つの実施形態によれば、前記宿主株はＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２、または、その派生株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２株である。
本発明の組換え株によれば、前述した組換えベクターを宿主株に導入して組換えして形成され、前記宿主株は、特に限定されておらず、当業界に周知されたｒｈｔＡ遺伝子が保持されているＬ－スレオニン産生株から選ばれたものであってもよく、例えば、大腸菌から選ばれたものであってもよい。本発明の１つの実施形態によれば、前記宿主株はＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２、または、その派生株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２株である。
本発明の組換え株によれば、ｐＫＯＶプラスミドをベクターとする。
本発明の組換え株によれば、さらに他の改変を含んでもよく、含んでいなくでもよい。
本発明は、さらに、下記のステップを含む組換え株の構築方法を提供する。
例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示すプロモーター領域を、その－６７番目の塩基を突然変異させるように改変して、点突然変異されたプロモーターを含む組換え株を得るステップ。
本発明の構築方法によれば，前記改変は、誘発、ＰＣＲ部位特異的突然変異法、及び／または相同組換えなどの方法から選ばれた少なくとも１種を含む。
本発明の構築方法によれば，前記突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３における－６７番目の塩基のアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への突然変異であり、具体的に、前記点突然変異を含むｒｈｔＡ遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示す。
さらに、前記構築方法は、下記のステップを含む。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示すｒｈｔＡ遺伝子の野生型プロモーター領域を、その－６７番目の塩基を突然変異させるように改変して、突然変異されたプロモーター領域ヌクレオチド配列を得るステップ、
（２）前記突然変異されたプロモーター領域ヌクレオチド配列をプラスミドに接続して組換えベクターを構築するステップ、および、
（３）前記組換えベクターを宿主株に導入して突然変異されたプロモーター領域を含む組換え株を得るステップ。
（２）前記突然変異されたプロモーター領域ヌクレオチド配列をプラスミドに接続して組換えベクターを構築するステップ、および、
（３）前記組換えベクターを宿主株に導入して突然変異されたプロモーター領域を含む組換え株を得るステップ。
本発明によれば、前記ステップ（１）において、前記塩基を突然変異させる方法は、誘発、ＰＣＲ部位特異的突然変異法または相同組換えを含むが、好ましくはＰＣＲ部位特異的突然変異法である。
本発明によれば、前記ステップ（１）は、
Ｇｅｎｂａｎｋにおける野生型ｒｈｔＡ遺伝子プロモーター配列に従って、ｒｈｔＡ遺伝子プロモーター領域の断片を増幅するための２対のプライマーを合成し、対立遺伝子によって宿主株のバックグラウンドにあるｒｈｔＡ遺伝子プロモーター領域に置き換える。
Ｇｅｎｂａｎｋにおける野生型ｒｈｔＡ遺伝子プロモーター配列に従って、ｒｈｔＡ遺伝子プロモーター領域の断片を増幅するための２対のプライマーを合成し、対立遺伝子によって宿主株のバックグラウンドにあるｒｈｔＡ遺伝子プロモーター領域に置き換える。
本発明の１つの実施形態において、前記プライマーは、
Ｐ１：５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＴＴＴＧＴＡＧＧ ３’ （下線が引かれた部分は制限エンドヌクレアーゼ切断部位ＢａｍＨ Ｉである。） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）
Ｐ２：５’ＴＡＴＡＣＣＣＡＡＴＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）
Ｐ３：５’ＣＧＡＣＣＡＧＣＡＴＴＧＧＧＴＡＴＡＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）
Ｐ４：５’ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＡＡＡＡＴＴＡＡＣＧＣＴＧＣＡＡＴＣＡＡＣ ３’ （下線が引かれた部分は制限エンドヌクレアーゼ切断部位Ｎｏｔ Ｉである。）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）である。
Ｐ１：５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＴＴＴＧＴＡＧＧ ３’ （下線が引かれた部分は制限エンドヌクレアーゼ切断部位ＢａｍＨ Ｉである。） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）
Ｐ２：５’ＴＡＴＡＣＣＣＡＡＴＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）
Ｐ３：５’ＣＧＡＣＣＡＧＣＡＴＴＧＧＧＴＡＴＡＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）
Ｐ４：５’ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＡＡＡＡＴＴＡＡＣＧＣＴＧＣＡＡＴＣＡＡＣ ３’ （下線が引かれた部分は制限エンドヌクレアーゼ切断部位Ｎｏｔ Ｉである。）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）である。
本発明の１つの実施形態において、前記ステップ（１）では、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２をテンプレートとし、プライマーとしてそれぞれＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４を使用してＰＣＲ増幅を行ってサイズがそれぞれ６９０ｂｐと６４０ｂｐであるｒｈｔＡ遺伝子プロモーター領域を含む分離されている２つのＤＮＡ断片、すなわち、ＰｒｈｔＡ（Ａ（－６７）Ｇ）－ＵｐおよびＰｒｈｔＡ（Ａ（－６７）Ｇ）－Ｄｏｗｎ断片を取り得、前記２つのＤＮＡ断片をテンプレートとし、プライマーとしてＰ１とＰ４を用いて、オーバーラップＰＣＲによる増幅（Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲ）を行い、前記オーバーラップＰＣＲ増幅では、９４℃で３０ｓの変性、５２℃で３０ｓのアニーリングおよび７２℃で６０ｓの伸長（３０サイクル）を行って、ＰｒｈｔＡ（Ａ（－６７）Ｇ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片を得ることを含む。
本発明によれば、前記ステップ（２）では、ＰｒｈｔＡ（Ａ（－６７）Ｇ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片に対してアガロースゲル電気泳動および分離・精製を行い、前記断片をＢａｍＨ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉで二重消化した後、ＥｃｏＲ Ｉ／Ｓｐｈ Ｉで二重消化した後のプラスミドに接続して、対立遺伝子で置換された組換えベクターを得ることを含む。
本発明の１つの実施形態において、前記ステップ（３）の形質転換は、エレクトロポレーション法で行う。
本発明は、さらに前述した構築方法で得られた組換え株を提供する。
本発明は、Ｌ－スレオニン製造における前述した組換え株の使用を提供する。
本発明に係るＬ－スレオニン製造における組換え株の使用によれば、前記組換え株を用いて発酵し、Ｌ－スレオニンを製造することを含む。
〔発明を実施するための形態〕
以下、本発明の実施例の説明を通じて、本発明の上記および他の特徴および利点をより詳細に解釈および説明する。以下の実施例は、本発明の構成を例示的に説明することを意図しており、特許請求の範囲およびそれらの均等物によって定義される本発明の保護範囲を決して制限することを意図するものではないと理解されたい。
以下、本発明の実施例の説明を通じて、本発明の上記および他の特徴および利点をより詳細に解釈および説明する。以下の実施例は、本発明の構成を例示的に説明することを意図しており、特許請求の範囲およびそれらの均等物によって定義される本発明の保護範囲を決して制限することを意図するものではないと理解されたい。
特に明記しない限り、本明細書の材料および試薬はすべて市販の製品であるか、または先行技術に従って当業者によって調製することができる。
実施例１
（１）ｄｅｏＢ遺伝子コード領域の部位特異的突然変異（Ｇ１０４９Ａ）に用いるプラスミドｐＫＯＶ－ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）の構築（対応するコードされるタンパク質のアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３における３５０番目のシステインをチロシン（Ｃ３５０Ｙ）に置き換え、置換した後のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４であった。）
ペントースリン酸ムターゼはｄｅｏＢ遺伝子によってコードされ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ 株およびその派生株（例えばＭＧ１６５５など）において、野生型のｄｅｏＢ遺伝子ＯＲＦ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＰ０３２６６７．１における配列３９０２３５２－３９０３５７５に示した。当該配列に基づいてｄｅｏＢを増幅するための２対のプライマーを設計および合成し、開始株のｄｅｏＢ遺伝子コード領域配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の１０４９番目の塩基ＧをＡ（ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を取り得る）に突然変異させることに用いるベクターを構築した。プライマーは、以下のように設計した（中国上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より合成された）。
（１）ｄｅｏＢ遺伝子コード領域の部位特異的突然変異（Ｇ１０４９Ａ）に用いるプラスミドｐＫＯＶ－ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）の構築（対応するコードされるタンパク質のアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３における３５０番目のシステインをチロシン（Ｃ３５０Ｙ）に置き換え、置換した後のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４であった。）
ペントースリン酸ムターゼはｄｅｏＢ遺伝子によってコードされ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ 株およびその派生株（例えばＭＧ１６５５など）において、野生型のｄｅｏＢ遺伝子ＯＲＦ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＰ０３２６６７．１における配列３９０２３５２－３９０３５７５に示した。当該配列に基づいてｄｅｏＢを増幅するための２対のプライマーを設計および合成し、開始株のｄｅｏＢ遺伝子コード領域配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の１０４９番目の塩基ＧをＡ（ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を取り得る）に突然変異させることに用いるベクターを構築した。プライマーは、以下のように設計した（中国上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より合成された）。
Ｐ１：５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＧＣＴＧＡＡＧ ３’（下線が引かれた部分は制限エンドヌクレアーゼ切断部位ＢａｍＨ Ｉである。）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
Ｐ２：５’ＧＡＴＣＧＴＡＡＣＣＧＴＧＧＴＣＡＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
Ｐ３：５’ＣＴＧＡＣＣＡＣＧＧＴＴＡＣＧＡＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
Ｐ４：５’ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＴＣＧＴＧＡＧＴＧＣＧＧＡＴＧＴ ３’（下線が引かれた部分は制限エンドヌクレアーゼ切断部位Ｎｏｔ Ｉである。）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
構築方法は、野生型株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ゲノムをテンプレートとし、プライマーとしてそれぞれＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４を用いてＰＣＲ増幅を行って長さがそれぞれ８３６ｂｐ、８９０ｂｐの点突然変異を含む２つのＤＮＡ断片（ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）－ＵｐおよびｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ） －Ｄｏｗｎ断片）を得た。ＰＣＲシステム：１０× Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ ｍＭ） ４μＬ、ＭｇＣｌ２（２５ ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐｍ）それぞれ２μＬ、Ｔｅｍｐｌａｔｅ １μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５ Ｕ／μｌ）０．２５μＬ、総体積５０μＬ。前記ＰＣＲ増幅では、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、そして、９４℃で３０ｓの変性、５２℃で３０ｓのアニーリングおよび７２℃で９０ｓの伸長（３０サイクル）を行い、そして、７２℃で１０ｍｉｎの過伸長を行った。前記の２つのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離・精製した後、精製された２つのＤＮＡ断片をテンプレートとし、Ｐ１とＰ４をプライマーとし、ＯｖｅｒｌａｐＰＣＲで長さ約１７２６ｂｐの断片（ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ） －Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片）を増幅した。Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲシステム：１０× Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ ｍＭ）４μＬ、ＭｇＣｌ２（２５ ｍＭ） ４μＬ、プライマー（１０ｐｍ）それぞれ２μＬ、Ｔｅｍｐｌａｔｅ １μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ （５ Ｕ／μｌ）０．２５μＬ、総体積５０μＬ。前記ＰＣＲ増幅では、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、そして、９４℃で３０ｓの変性、５２℃で３０ｓのアニーリングおよび７２℃で９０ｓの伸長（３０サイクル）を行い、そして、７２℃で１０ｍｉｎの過伸長を行った。前記ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片をアガロースゲル電気泳動で分離・精製し、それとｐＫＯＶプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社から購入）を、それぞれＢａｍＨ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉで二重消化し、消化されたｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片とｐＫＯＶプラスミドをアガロースゲル電気泳動で分離・精製し、かつ接続してベクターｐＫＯＶ－ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）を得た。ベクターｐＫＯＶ－ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）が、配列決定のために配列決定会社に送り，得られた配列決定結果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示した。正しい点突然変異（ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ））を含むベクターｐＫＯＶ－ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）を置いておく。
Ｐ２：５’ＧＡＴＣＧＴＡＡＣＣＧＴＧＧＴＣＡＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
Ｐ３：５’ＣＴＧＡＣＣＡＣＧＧＴＴＡＣＧＡＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
Ｐ４：５’ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＴＣＧＴＧＡＧＴＧＣＧＧＡＴＧＴ ３’（下線が引かれた部分は制限エンドヌクレアーゼ切断部位Ｎｏｔ Ｉである。）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
構築方法は、野生型株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ゲノムをテンプレートとし、プライマーとしてそれぞれＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４を用いてＰＣＲ増幅を行って長さがそれぞれ８３６ｂｐ、８９０ｂｐの点突然変異を含む２つのＤＮＡ断片（ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）－ＵｐおよびｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ） －Ｄｏｗｎ断片）を得た。ＰＣＲシステム：１０× Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ ｍＭ） ４μＬ、ＭｇＣｌ２（２５ ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐｍ）それぞれ２μＬ、Ｔｅｍｐｌａｔｅ １μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５ Ｕ／μｌ）０．２５μＬ、総体積５０μＬ。前記ＰＣＲ増幅では、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、そして、９４℃で３０ｓの変性、５２℃で３０ｓのアニーリングおよび７２℃で９０ｓの伸長（３０サイクル）を行い、そして、７２℃で１０ｍｉｎの過伸長を行った。前記の２つのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離・精製した後、精製された２つのＤＮＡ断片をテンプレートとし、Ｐ１とＰ４をプライマーとし、ＯｖｅｒｌａｐＰＣＲで長さ約１７２６ｂｐの断片（ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ） －Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片）を増幅した。Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲシステム：１０× Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ ｍＭ）４μＬ、ＭｇＣｌ２（２５ ｍＭ） ４μＬ、プライマー（１０ｐｍ）それぞれ２μＬ、Ｔｅｍｐｌａｔｅ １μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ （５ Ｕ／μｌ）０．２５μＬ、総体積５０μＬ。前記ＰＣＲ増幅では、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、そして、９４℃で３０ｓの変性、５２℃で３０ｓのアニーリングおよび７２℃で９０ｓの伸長（３０サイクル）を行い、そして、７２℃で１０ｍｉｎの過伸長を行った。前記ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片をアガロースゲル電気泳動で分離・精製し、それとｐＫＯＶプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社から購入）を、それぞれＢａｍＨ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉで二重消化し、消化されたｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片とｐＫＯＶプラスミドをアガロースゲル電気泳動で分離・精製し、かつ接続してベクターｐＫＯＶ－ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）を得た。ベクターｐＫＯＶ－ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）が、配列決定のために配列決定会社に送り，得られた配列決定結果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示した。正しい点突然変異（ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ））を含むベクターｐＫＯＶ－ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）を置いておく。
（２）点突然変異遺伝子ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）を含む操作された株の構築
野生型大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ （Ｗ３１１０）と高生産性でＬ－スレオニンを生産する株Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２（中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託されている）は、いずれも染色体上に野生型のｄｅｏＢ遺伝子が保持されている。構築されたプラスミドｐＫＯＶ－ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）をそれぞれＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）およびＥ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２に形質転換し、対立遺伝子の置き換えによって当該２つの株の染色体のｄｅｏＢ遺伝子配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対する１０４９番目の塩基ＧをＡに改変した。
野生型大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ （Ｗ３１１０）と高生産性でＬ－スレオニンを生産する株Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２（中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託されている）は、いずれも染色体上に野生型のｄｅｏＢ遺伝子が保持されている。構築されたプラスミドｐＫＯＶ－ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）をそれぞれＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）およびＥ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２に形質転換し、対立遺伝子の置き換えによって当該２つの株の染色体のｄｅｏＢ遺伝子配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対する１０４９番目の塩基ＧをＡに改変した。
具体的なプロセスとして、プラスミドｐＫＯＶ－ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）を、エレクトロポレーションによって宿主菌コンピテントセルに形質転換した後、ＳＯＣ液体培地０．５ｍＬを添加し、シェーカーで３０°Ｃ、１００ ｒｐｍで２ｈ蘇生し、培養液１００μＬを取り、クロラムフェニコール含有量３４ｍｇ／ｍＬのＬＢ固体培地に塗り、３０°Ｃで１８ｈ培養し、成長したモノクローナルコロニーを選択し、それらをＬＢ液体培地１０ｍＬに接種し、３７°Ｃ、２００ ｒｐｍで８ｈ培養し、培養液１００μＬをクロラムフェニコール含有量３４ｍｇ／ｍＬのＬＢ固体培地に塗り、４２°Ｃで１２ｈ培養し、１～５個の単一コロニーを選択してＬＢ液体培地１ ｍＬに接種し、３７°Ｃ、２００ｒｐｍで４ｈ培養し、培養液１００μＬを、１０％スクロース含有ＬＢ固体培地に塗り、３０°Ｃで２４ｈ培養し、モノクローナルを選択し、かつ対応したＬＢ固体培地およびクロラムフェニコール含有量３４ｍｇ／ｍＬのＬＢ固体培地に線を引き、対応したＬＢ固形培地で増殖し、かつクロラムフェニコール含有量３４ｍｇ／ｍＬのＬＢ固体培地で増殖しなかった菌株を選択し、ＰＣＲ増幅を行って同定した。ＰＣＲ増幅は、下記のプライマー（中国上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より合成された）を採用した。
Ｐ５：５’ ＴＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＧＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
Ｐ６：５’ ＧＴＣＡＡＣＧＣＴＣＣＧＣＣＣＡＡＡＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
前記ＰＣＲ増幅産物に対してＳＳＣＰ（一本鎖高次構造多型、Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）電気泳動を行い、プラスミドｐＫＯＶ－ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）増幅断片を陽性対照とし、野生型大腸菌増幅断片を陰性対照とし、水をブランクコントロールとして使用した。ＳＳＣＰ電気泳動において、同じ長さで配列が異なる一本鎖オリゴヌクレオチド鎖は、氷浴で形成する空間構造が異なり、電気泳動中の移動度も異なる。したがって、断片の電気泳動位置が陰性対照断片の位置と一致せず、かつ陽性対照断片の位置と一致する株は、対立遺伝子置換が成功した株であった。対立遺伝子置換が成功した株をテンプレートとし、プライマーとしてＰ５とＰ６を用いて再び目的断片をＰＣＲで増幅し、かつ目的断片をｐＭＤ１９－Ｔベクターに接続して配列決定した。配列決定結果を比較すると、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示したように、ｄｅｏＢ遺伝子コード領域配列の１０４９番目の塩基のＧがＡに変更した組換え体は、成功に改変された株であった。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）から由来した組換え体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）を、ＹＰＴｈｒ０９と名付け、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２から由来した組換え体を、ＹＰＴｈｒ１０と名付けた。
Ｐ６：５’ ＧＴＣＡＡＣＧＣＴＣＣＧＣＣＣＡＡＡＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
前記ＰＣＲ増幅産物に対してＳＳＣＰ（一本鎖高次構造多型、Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）電気泳動を行い、プラスミドｐＫＯＶ－ｄｅｏＢ（Ｇ１０４９Ａ）増幅断片を陽性対照とし、野生型大腸菌増幅断片を陰性対照とし、水をブランクコントロールとして使用した。ＳＳＣＰ電気泳動において、同じ長さで配列が異なる一本鎖オリゴヌクレオチド鎖は、氷浴で形成する空間構造が異なり、電気泳動中の移動度も異なる。したがって、断片の電気泳動位置が陰性対照断片の位置と一致せず、かつ陽性対照断片の位置と一致する株は、対立遺伝子置換が成功した株であった。対立遺伝子置換が成功した株をテンプレートとし、プライマーとしてＰ５とＰ６を用いて再び目的断片をＰＣＲで増幅し、かつ目的断片をｐＭＤ１９－Ｔベクターに接続して配列決定した。配列決定結果を比較すると、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示したように、ｄｅｏＢ遺伝子コード領域配列の１０４９番目の塩基のＧがＡに変更した組換え体は、成功に改変された株であった。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）から由来した組換え体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）を、ＹＰＴｈｒ０９と名付け、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２から由来した組換え体を、ＹＰＴｈｒ１０と名付けた。
（３）スレオニン発酵試験
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２株および突然変異株ＹＰＴｈｒ０９、ＹＰＴｈｒ１０を、それぞれ表１に記載した液体培地 ２５ｍＬに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで１２ｈ培養した。そして、各株の培養物１ｍＬをそれぞれ表１に記載の液体培地２５ｍＬに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで３６ｈ発酵培養した。そして、ＨＰＬＣでＬ－スレオニンの含有量を測定し、１株あたり３回の並行試験を行い、平均値を算出し、結果を表２に示した。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２株および突然変異株ＹＰＴｈｒ０９、ＹＰＴｈｒ１０を、それぞれ表１に記載した液体培地 ２５ｍＬに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで１２ｈ培養した。そして、各株の培養物１ｍＬをそれぞれ表１に記載の液体培地２５ｍＬに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで３６ｈ発酵培養した。そして、ＨＰＬＣでＬ－スレオニンの含有量を測定し、１株あたり３回の並行試験を行い、平均値を算出し、結果を表２に示した。
表２の結果から示したように、Ｌ－スレオニン生産が高収率または低収率である元の株（ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓｔｒａｉｎ）にも関わらず、ｄｅｏＢ遺伝子のアミノ酸配列の３５０番目のシステインからチロシンへの置換は、Ｌ－スレオニン収率の向上に寄与した。
実施例２
（１）点突然変異を含むｒｈｔＡ遺伝子プロモーターの形質転換ベクターｐＫＯＶ－ＰｒｈｔＡ（Ａ（－６７）Ｇ）の構築
スレオニンおよびホモセリン排出タンパク質（ＲＨＴＡ酵素）は、ｒｈｔＡ遺伝子によってコードされ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株およびその派生株（例えばＷ３１１０など）において、野生型ｒｈｔＡ遺伝子プロモーター配列ＰｒｈｔＡを、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＰ００９０４８．１における配列８５０５２０－８５０８７１に示した。当該配列に基づいてプロモーターＰｒｈｔＡを増幅するための２対のプライマーを設計および合成し、開始株のＰｒｈｔＡプロモーターの塩基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）上流－６７番目の塩基ＡをＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）に変異させることに用いるベクターを構築した。プライマーは、以下のように設計した（中国上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より合成された）。
（１）点突然変異を含むｒｈｔＡ遺伝子プロモーターの形質転換ベクターｐＫＯＶ－ＰｒｈｔＡ（Ａ（－６７）Ｇ）の構築
スレオニンおよびホモセリン排出タンパク質（ＲＨＴＡ酵素）は、ｒｈｔＡ遺伝子によってコードされ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株およびその派生株（例えばＷ３１１０など）において、野生型ｒｈｔＡ遺伝子プロモーター配列ＰｒｈｔＡを、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＰ００９０４８．１における配列８５０５２０－８５０８７１に示した。当該配列に基づいてプロモーターＰｒｈｔＡを増幅するための２対のプライマーを設計および合成し、開始株のＰｒｈｔＡプロモーターの塩基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）上流－６７番目の塩基ＡをＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）に変異させることに用いるベクターを構築した。プライマーは、以下のように設計した（中国上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より合成された）。
Ｐ１：５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＴＴＴＧＴＡＧＧ ３’ （下線が引かれた部分は、制限エンドヌクレアーゼ切断部位ＢａｍＨ Ｉである。） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）
Ｐ２：５’ＴＡＴＡＣＣＣＡＡＴＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）
Ｐ３：５’ＣＧＡＣＣＡＧＣＡＴＴＧＧＧＴＡＴＡＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）
Ｐ４：５’ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＡＡＡＡＴＴＡＡＣＧＣＴＧＣＡＡＴＣＡＡＣ ３’（下線が引かれた部分は制限エンドヌクレアーゼ切断部位Ｎｏｔ Ｉである。）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）。
Ｐ２：５’ＴＡＴＡＣＣＣＡＡＴＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）
Ｐ３：５’ＣＧＡＣＣＡＧＣＡＴＴＧＧＧＴＡＴＡＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）
Ｐ４：５’ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＡＡＡＡＴＴＡＡＣＧＣＴＧＣＡＡＴＣＡＡＣ ３’（下線が引かれた部分は制限エンドヌクレアーゼ切断部位Ｎｏｔ Ｉである。）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）。
構築方法として、野生型株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ゲノムをテンプレートとし、それぞれＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４をプライマーとして用いてＰＣＲ増幅を行って、長さがそれぞれ６９０ｂｐ、６４０ｂｐである点突然変異を含む２つのＤＮＡ断片（ＰｒｈｔＡ（Ａ（－６７）Ｇ）－ＵｐおよびＰｒｈｔＡ（Ａ（－６７）Ｇ）－Ｄｏｗｎ断片）を得た。ＰＣＲシステム：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）それぞれ２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬ。前記ＰＣＲ増幅では、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、そして９４℃で３０ｓの変性、５２℃で３０ｓのアニーリングおよび７２℃で３０ｓの伸長（３０サイクル）を行い、そして７２℃で１０ｍｉｎの過伸長を行った。
前記の２つのＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動で分離・精製した後、再び精製された２つのＤＮＡ断片をテンプレートとし、Ｐ１とＰ４をプライマーとして用いて、Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲで長さ約１３１０ｂｐの断片（ＰｒｈｔＡ（Ａ（－６７）Ｇ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片）を増幅した。
ＰＣＲシステム：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）それぞれ２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬ。前記Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲは、９４℃で３０ｓの変性、５２℃で３０ｓのアニーリングおよび７２℃で６０ｓの伸長（３０サイクル）を行った。
前記ＰｒｈｔＡ（Ａ（－６７）Ｇ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片をアガロースゲル電気泳動で分離・精製した後、それとｐＫＯＶプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社から購入）を、それぞれＢａｍＨ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉで二重消化し、消化した後のＰｒｈｔＡ（Ａ（－６７）Ｇ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片およびｐＫＯＶプラスミドをアガロースゲル電気泳動で分離・精製し、かつ接続して、ベクターｐＫＯＶ－ＰｒｈｔＡ（Ａ（－６７）Ｇ）を得た。ベクターｐＫＯＶ－ＰｒｈｔＡ（Ａ（－６７）Ｇ）を、配列決定のために配列決定会社に送り、正しい点突然変異（ＰｒｈｔＡ（Ａ（－６７）Ｇ））を含むベクターｐＫＯＶ－ＰｒｈｔＡ（Ａ（－６７）Ｇ）を置いておく。
（２）点突然変異部位ＰｒｈｔＡ（Ａ（－６７）Ｇ）を含む操作された株の構築
野生型大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）と高生産性でＬ－スレオニンを生産する株Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２（中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託されている）は、いずれも染色体上に野生型のＰｒｈｔＡプロモーターが保持されている。構築したプラスミドｐＫＯＶ－ＰｒｈｔＡ（Ａ（－６７）Ｇ）をそれぞれＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）およびＥ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２に形質転換し、対立遺伝子の置き換えによって，２つの株の染色体におけるＰｒｈｔＡプロモーターの塩基配列の上流－６７番目の塩基ＡをＧに変更した。具体的なプロセスとして、プラスミドｐＫＯＶ－ＰｒｈｔＡ（Ａ（－６７）Ｇ）をエレクトロポレーションにより宿主菌コンピテントセルに形質転換し、ＳＯＣ液体培地０．５ｍＬを添加し、シェーカーで３０°Ｃ、１００ ｒｐｍで２ｈ蘇生し、培養液１００μＬを取り、クロラムフェニコール含有量３４ μｇ／ｍＬのＬＢ固体培地に塗り、３０°Ｃで１８ｈ培養し、成長したモノクローナルコロニーを選択し、それらをＬＢ液体培地１０ｍＬに接種し、３７°Ｃ、２００ ｒｐｍで８ｈ培養し、培養液１００μＬをクロラムフェニコール含有量３４ μｇ／ｍＬのＬＢ固体培地に塗り、４２°Ｃで１２ｈ培養し、１～５個の単一コロニーを選択してＬＢ液体培地１ ｍＬに接種し、３７°Ｃ、２００ ｒｐｍで４ｈ培養し、培養液１００μＬを１０％スクロースを含むＬＢ固体培地に塗り、３０°Ｃで２４ｈ培養し、モノクローナルを選択し、かつ対応したＬＢ固体培地およびクロラムフェニコール含有量３４μｇ／ｍＬのＬＢ固体培地に線を引き、対応したＬＢ固形培地で増殖し、かつクロラムフェニコール含有量が３４μｇ／ｍＬのＬＢ固体培地で増殖しなかった株を選択し、ＰＣＲ増幅を行って同定した。ＰＣＲ増幅は、下記のプライマー（中国上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より合成された）を採用した。
野生型大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）と高生産性でＬ－スレオニンを生産する株Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２（中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託されている）は、いずれも染色体上に野生型のＰｒｈｔＡプロモーターが保持されている。構築したプラスミドｐＫＯＶ－ＰｒｈｔＡ（Ａ（－６７）Ｇ）をそれぞれＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）およびＥ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２に形質転換し、対立遺伝子の置き換えによって，２つの株の染色体におけるＰｒｈｔＡプロモーターの塩基配列の上流－６７番目の塩基ＡをＧに変更した。具体的なプロセスとして、プラスミドｐＫＯＶ－ＰｒｈｔＡ（Ａ（－６７）Ｇ）をエレクトロポレーションにより宿主菌コンピテントセルに形質転換し、ＳＯＣ液体培地０．５ｍＬを添加し、シェーカーで３０°Ｃ、１００ ｒｐｍで２ｈ蘇生し、培養液１００μＬを取り、クロラムフェニコール含有量３４ μｇ／ｍＬのＬＢ固体培地に塗り、３０°Ｃで１８ｈ培養し、成長したモノクローナルコロニーを選択し、それらをＬＢ液体培地１０ｍＬに接種し、３７°Ｃ、２００ ｒｐｍで８ｈ培養し、培養液１００μＬをクロラムフェニコール含有量３４ μｇ／ｍＬのＬＢ固体培地に塗り、４２°Ｃで１２ｈ培養し、１～５個の単一コロニーを選択してＬＢ液体培地１ ｍＬに接種し、３７°Ｃ、２００ ｒｐｍで４ｈ培養し、培養液１００μＬを１０％スクロースを含むＬＢ固体培地に塗り、３０°Ｃで２４ｈ培養し、モノクローナルを選択し、かつ対応したＬＢ固体培地およびクロラムフェニコール含有量３４μｇ／ｍＬのＬＢ固体培地に線を引き、対応したＬＢ固形培地で増殖し、かつクロラムフェニコール含有量が３４μｇ／ｍＬのＬＢ固体培地で増殖しなかった株を選択し、ＰＣＲ増幅を行って同定した。ＰＣＲ増幅は、下記のプライマー（中国上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より合成された）を採用した。
Ｐ５： ５’ ＡＴＡＣＡＣＣＧＣＴＡＴＣＣＡＴＣＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）
Ｐ６： ５’ ＡＡＣＣＡＧＧＣＡＴＣＣＴＴＴＣＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）
上述ＰＣＲシステム：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）それぞれ２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬ。前記ＰＣＲ増幅では、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、そして、９４℃で３０ｓの変性、５２℃で３０ｓのアニーリングおよび７２℃で３０ｓの伸長（３０サイクル）を行行い、そして７２℃で１０ｍｉｎの過伸長を行った。ＰＣＲ増幅産物に対して、ＳＳＣＰ（一本鎖高次構造多型、Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）電気泳動を行い、プラスミドｐＫＯＶ－ＰｒｈｔＡ（Ａ（－６７）Ｇ）増幅断片を陽性対照とし、野生型大腸菌増幅断片を陰性対照とし、水をブランクコントロールとして使用した。ＳＳＣＰ電気泳動では、同じ長さで配列が異なる一本鎖オリゴヌクレオチド鎖は、氷浴で形成する空間構造が異なり、電気泳動中の移動度も異なる。したがって、断片の電気泳動位置が陰性対照断片の位置と一致せず、かつ陽性対照断片の位置と一致した株は、対立遺伝子置換が成功した株であった。対立遺伝子置換が成功した株をテンプレートとし、プライマーとしてＰ５とＰ６を用いて再び目的断片をＰＣＲで増幅し、かつ目的断片をｐＭＤ１９－Ｔベクターに接続して配列決定した。配列決定結果を比較したところ、ＰｒｈｔＡプロモーターの塩基配列上流－６７番目の塩基ＡがＧに変更された組換え体は、成功に改変された株であった。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）から由来した組換え体を、ＹＰＴｈｒ０１と名付け、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２から由来した組換え体を、ＹＰＴｈｒ０２と名付けた。
Ｐ６： ５’ ＡＡＣＣＡＧＧＣＡＴＣＣＴＴＴＣＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）
上述ＰＣＲシステム：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）それぞれ２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬ。前記ＰＣＲ増幅では、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、そして、９４℃で３０ｓの変性、５２℃で３０ｓのアニーリングおよび７２℃で３０ｓの伸長（３０サイクル）を行行い、そして７２℃で１０ｍｉｎの過伸長を行った。ＰＣＲ増幅産物に対して、ＳＳＣＰ（一本鎖高次構造多型、Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）電気泳動を行い、プラスミドｐＫＯＶ－ＰｒｈｔＡ（Ａ（－６７）Ｇ）増幅断片を陽性対照とし、野生型大腸菌増幅断片を陰性対照とし、水をブランクコントロールとして使用した。ＳＳＣＰ電気泳動では、同じ長さで配列が異なる一本鎖オリゴヌクレオチド鎖は、氷浴で形成する空間構造が異なり、電気泳動中の移動度も異なる。したがって、断片の電気泳動位置が陰性対照断片の位置と一致せず、かつ陽性対照断片の位置と一致した株は、対立遺伝子置換が成功した株であった。対立遺伝子置換が成功した株をテンプレートとし、プライマーとしてＰ５とＰ６を用いて再び目的断片をＰＣＲで増幅し、かつ目的断片をｐＭＤ１９－Ｔベクターに接続して配列決定した。配列決定結果を比較したところ、ＰｒｈｔＡプロモーターの塩基配列上流－６７番目の塩基ＡがＧに変更された組換え体は、成功に改変された株であった。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）から由来した組換え体を、ＹＰＴｈｒ０１と名付け、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２から由来した組換え体を、ＹＰＴｈｒ０２と名付けた。
（３）スレオニン発酵試験
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２株および突然変異株ＹＰＴｈｒ０１、ＹＰＴｈｒ０２を、それぞれ表１に記載した液体培地 ２５ｍＬに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで１２ｈ培養した。そして、各株の培養物１ｍＬを、それぞれ表１に記載の液体培地２５ｍＬに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで３６ｈ発酵培養した。そして、ＨＰＬＣでＬ－スレオニンの含有量を測定し、１株あたり３回の並行試験を行い、平均値を算出し、結果を表２に示した。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２株および突然変異株ＹＰＴｈｒ０１、ＹＰＴｈｒ０２を、それぞれ表１に記載した液体培地 ２５ｍＬに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで１２ｈ培養した。そして、各株の培養物１ｍＬを、それぞれ表１に記載の液体培地２５ｍＬに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで３６ｈ発酵培養した。そして、ＨＰＬＣでＬ－スレオニンの含有量を測定し、１株あたり３回の並行試験を行い、平均値を算出し、結果を表２に示した。
表２の結果に示したように、Ｌ－スレオニン生産が高収率または低収率である元の株にも関わらず、ｒｈｔＡ遺伝子のプロモーター配列ＰｒｈｔＡのアミノ酸配列の－６７番目の塩基ＡからＧへの突然変異は、Ｌ－スレオニン収率の向上に寄与した。
以上、本発明の具体的な実施形態について説明したが、本発明は、上記の実施形態に限定されるものではない。本発明の要旨および原則の範囲内でのいかなる修正、同等の置換、改善なども、本発明の請求の範囲内に属する。
Claims (9)
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示すヌクレオチド配列の２８９番目の塩基がアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）へ突然変異して形成されたプロモーターヌクレオチド配列ｉｉ、を含むポリヌクレオチド。
- ｉｉにおける前記突然変異後のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示すものである、
請求項１に記載のポリヌクレオチド。 - 請求項１に記載のプロモーターヌクレオチド配列ｉｉ、および、ｒｈｔＡ遺伝子コードヌクレオチド配列を含む発現カセット。
- 前記ｒｈｔＡ遺伝子コードヌクレオチド配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示すヌクレオチド配列を含む、
請求項３に記載の発現カセット。 - 請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
- 前記組換えベクターは、前記ポリヌクレオチドをプラスミドに導入することによって構築されたものである、請求項５に記載の組換えベクター。
- 請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む組換え株。
- （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示す野生型遺伝子のヌクレオチド配列を形質転換して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示す突然変異された後のヌクレオチド配列を得るステップ、
（２）突然変異された後のヌクレオチド配列をプラスミドに接続して組換えベクターを構築するステップ、および、
（３）前記組換えベクターを宿主株に導入して組換え株を得るステップ
を含む、請求項７に記載の組換え株の構築方法。 - Ｌ－スレオニンの発酵調製における、請求項１に記載のポリヌクレオチド、請求項３に記載の発現カセット、請求項５に記載の組換えベクター、または、請求項７に記載の組換え株の使用。
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