JP2022546709A - 大腸菌に基づく組換え株ならびにその構築方法および使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、遺伝子工学および微生物技術の分野に属し、具体的には、大腸菌に基づく組換え株ならびにその構築方法および使用に関する。
L-スレオニンは8種類の必須アミノ酸の1種類であり、かつヒトや動物が自分で合成することはできないアミノ酸である。L-スレオニンは、穀物の吸収を強化し、体内の代謝のバランスを調整し、体の成長と発達を促進することができ、飼料、医薬品および食品業界で広く使用されている。
本発明は、大腸菌株K12またはその誘導体に基づく組換え株、その組換え構築方法および発酵によるアミノ酸の生産における使用を提供する。
(1)SEQ ID NO:1に示す野生型deoB遺伝子のオープンリーディングフレーム領域のヌクレオチド配列を、その1049番目の塩基を突然変異させように改変して、突然変異されたdeoB遺伝子のオープンリーディングフレーム領域のヌクレオチド配列を得るステップ、
(2)前記突然変異されたヌクレオチド配列とプラスミドを接続して、組換えベクターを構築するステップ、および、
(3)前記組換えベクターを宿主株に導入して、前記点突然変異を含むL-スレオニン産生組換え株を得るステップ、
を含む。
P1:5’CGGGATCCATGGACGGCAACGCTGAAG 3’ (下線が引かれた部分は制限エンドヌクレアーゼ切断部位BamH Iである。)(SEQ ID NO:5)
P2:5’GATCGTAACCGTGGTCAG 3’(SEQ ID NO:6)
P3:5’CTGACCACGGTTACGATC 3’(SEQ ID NO:7)
P4:5’AAGGAAAAAAGCGGCCGCGCTCGTGAGTGCGGATGT 3’ (下線が引かれた部分は制限エンドヌクレアーゼ切断部位Not Iである。)(SEQ ID NO:8)。
本発明の組換え株によれば、前述した組換えベクターを宿主株に導入して組換えして形成され、前記宿主株は、特に限定されておらず、当業界に周知されたrhtA遺伝子が保持されているL-スレオニン産生株から選ばれたものであってもよく、例えば、大腸菌から選ばれたものであってもよい。本発明の1つの実施形態によれば、前記宿主株はE.coli K12、または、その派生株E.coli K12(W3110)株、E.coli CGMCC 7.232株である。
(2)前記突然変異されたプロモーター領域ヌクレオチド配列をプラスミドに接続して組換えベクターを構築するステップ、および、
(3)前記組換えベクターを宿主株に導入して突然変異されたプロモーター領域を含む組換え株を得るステップ。
Genbankにおける野生型rhtA遺伝子プロモーター配列に従って、rhtA遺伝子プロモーター領域の断片を増幅するための2対のプライマーを合成し、対立遺伝子によって宿主株のバックグラウンドにあるrhtA遺伝子プロモーター領域に置き換える。
P1:5’CGGGATCCTCGCTGGTGTCGTGTTTGTAGG 3’ (下線が引かれた部分は制限エンドヌクレアーゼ切断部位BamH Iである。) (SEQ ID NO:17)
P2:5’TATACCCAATGCTGGTCGAG 3’(SEQ ID NO:18)
P3:5’CGACCAGCATTGGGTATATC 3’(SEQ ID NO:19)
P4:5’AAGGAAAAAAGCGGCCGCCGAAAATTAACGCTGCAATCAAC 3’ (下線が引かれた部分は制限エンドヌクレアーゼ切断部位Not Iである。)(SEQ ID NO:20)である。
以下、本発明の実施例の説明を通じて、本発明の上記および他の特徴および利点をより詳細に解釈および説明する。以下の実施例は、本発明の構成を例示的に説明することを意図しており、特許請求の範囲およびそれらの均等物によって定義される本発明の保護範囲を決して制限することを意図するものではないと理解されたい。
(1)deoB遺伝子コード領域の部位特異的突然変異(G1049A)に用いるプラスミドpKOV-deoB(G1049A)の構築(対応するコードされるタンパク質のアミノ酸配列SEQ ID NO:3における350番目のシステインをチロシン(C350Y)に置き換え、置換した後のアミノ酸配列はSEQ ID NO:4であった。)
ペントースリン酸ムターゼはdeoB遺伝子によってコードされ、E.coli K12 株およびその派生株(例えばMG1655など)において、野生型のdeoB遺伝子ORF配列は、Genbankアクセッション番号CP032667.1における配列3902352-3903575に示した。当該配列に基づいてdeoBを増幅するための2対のプライマーを設計および合成し、開始株のdeoB遺伝子コード領域配列(SEQ ID NO:1)の1049番目の塩基GをA(ヌクレオチド配列SEQ ID NO:2を取り得る)に突然変異させることに用いるベクターを構築した。プライマーは、以下のように設計した(中国上海invitrogen社より合成された)。
P2:5’GATCGTAACCGTGGTCAG 3’(SEQ ID NO:6)
P3:5’CTGACCACGGTTACGATC 3’(SEQ ID NO:7)
P4:5’AAGGAAAAAAGCGGCCGCGCTCGTGAGTGCGGATGT 3’(下線が引かれた部分は制限エンドヌクレアーゼ切断部位Not Iである。)(SEQ ID NO:8)
構築方法は、野生型株E.coli K12ゲノムをテンプレートとし、プライマーとしてそれぞれP1とP2、P3とP4を用いてPCR増幅を行って長さがそれぞれ836bp、890bpの点突然変異を含む2つのDNA断片(deoB(G1049A)-UpおよびdeoB(G1049A) -Down断片)を得た。PCRシステム:10× Ex Taq Buffer 5μL、dNTP Mixture(それぞれ2.5 mM) 4μL、MgCl2(25 mM)4μL、プライマー(10pm)それぞれ2μL、Template 1μL、Ex Taq(5 U/μl)0.25μL、総体積50μL。前記PCR増幅では、94℃で5min予備変性し、そして、94℃で30sの変性、52℃で30sのアニーリングおよび72℃で90sの伸長(30サイクル)を行い、そして、72℃で10minの過伸長を行った。前記の2つのDNA断片をアガロースゲル電気泳動で分離・精製した後、精製された2つのDNA断片をテンプレートとし、P1とP4をプライマーとし、OverlapPCRで長さ約1726bpの断片(deoB(G1049A) -Up-Down断片)を増幅した。Overlap PCRシステム:10× Ex Taq Buffer 5μL、dNTP Mixture(それぞれ2.5 mM)4μL、MgCl2(25 mM) 4μL、プライマー(10pm)それぞれ2μL、Template 1μL、Ex Taq (5 U/μl)0.25μL、総体積50μL。前記PCR増幅では、94℃で5min予備変性し、そして、94℃で30sの変性、52℃で30sのアニーリングおよび72℃で90sの伸長(30サイクル)を行い、そして、72℃で10minの過伸長を行った。前記deoB(G1049A)-Up-Down断片をアガロースゲル電気泳動で分離・精製し、それとpKOVプラスミド(Addgene社から購入)を、それぞれBamH I/Not Iで二重消化し、消化されたdeoB(G1049A)-Up-Down断片とpKOVプラスミドをアガロースゲル電気泳動で分離・精製し、かつ接続してベクターpKOV-deoB(G1049A)を得た。ベクターpKOV-deoB(G1049A)が、配列決定のために配列決定会社に送り,得られた配列決定結果は、SEQ ID NO:11に示した。正しい点突然変異(deoB(G1049A))を含むベクターpKOV-deoB(G1049A)を置いておく。
野生型大腸菌株E.coli K12 (W3110)と高生産性でL-スレオニンを生産する株E.coli CGMCC 7.232(中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託されている)は、いずれも染色体上に野生型のdeoB遺伝子が保持されている。構築されたプラスミドpKOV-deoB(G1049A)をそれぞれE.coli K12(W3110)およびE.coli CGMCC 7.232に形質転換し、対立遺伝子の置き換えによって当該2つの株の染色体のdeoB遺伝子配列のSEQ ID NO:1に対する1049番目の塩基GをAに改変した。
P6:5’ GTCAACGCTCCGCCCAAAT 3’(SEQ ID NO:10)
前記PCR増幅産物に対してSSCP(一本鎖高次構造多型、Single-Strand Conformation Polymorphism)電気泳動を行い、プラスミドpKOV-deoB(G1049A)増幅断片を陽性対照とし、野生型大腸菌増幅断片を陰性対照とし、水をブランクコントロールとして使用した。SSCP電気泳動において、同じ長さで配列が異なる一本鎖オリゴヌクレオチド鎖は、氷浴で形成する空間構造が異なり、電気泳動中の移動度も異なる。したがって、断片の電気泳動位置が陰性対照断片の位置と一致せず、かつ陽性対照断片の位置と一致する株は、対立遺伝子置換が成功した株であった。対立遺伝子置換が成功した株をテンプレートとし、プライマーとしてP5とP6を用いて再び目的断片をPCRで増幅し、かつ目的断片をpMD19-Tベクターに接続して配列決定した。配列決定結果を比較すると、SEQ ID NO:12に示したように、deoB遺伝子コード領域配列の1049番目の塩基のGがAに変更した組換え体は、成功に改変された株であった。E.coli K12(W3110)から由来した組換え体(recombinant)を、YPThr09と名付け、E.coli CGMCC 7.232から由来した組換え体を、YPThr10と名付けた。
E.coli K12(W3110)株、E.coli CGMCC 7.232株および突然変異株YPThr09、YPThr10を、それぞれ表1に記載した液体培地 25mLに接種し、37℃、200rpmで12h培養した。そして、各株の培養物1mLをそれぞれ表1に記載の液体培地25mLに接種し、37℃、200rpmで36h発酵培養した。そして、HPLCでL-スレオニンの含有量を測定し、1株あたり3回の並行試験を行い、平均値を算出し、結果を表2に示した。
(1)点突然変異を含むrhtA遺伝子プロモーターの形質転換ベクターpKOV-PrhtA(A(-67)G)の構築
スレオニンおよびホモセリン排出タンパク質(RHTA酵素)は、rhtA遺伝子によってコードされ、E.coli K12株およびその派生株(例えばW3110など)において、野生型rhtA遺伝子プロモーター配列PrhtAを、Genbankアクセッション番号AP009048.1における配列850520-850871に示した。当該配列に基づいてプロモーターPrhtAを増幅するための2対のプライマーを設計および合成し、開始株のPrhtAプロモーターの塩基配列(SEQ ID NO:13)上流-67番目の塩基AをG(SEQ ID NO:14)に変異させることに用いるベクターを構築した。プライマーは、以下のように設計した(中国上海invitrogen社より合成された)。
P2:5’TATACCCAATGCTGGTCGAG 3’(SEQ ID NO:18)
P3:5’CGACCAGCATTGGGTATATC 3’(SEQ ID NO:19)
P4:5’AAGGAAAAAAGCGGCCGCCGAAAATTAACGCTGCAATCAAC 3’(下線が引かれた部分は制限エンドヌクレアーゼ切断部位Not Iである。)(SEQ ID NO:20)。
野生型大腸菌株E.coli K12(W3110)と高生産性でL-スレオニンを生産する株E.coli CGMCC 7.232(中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託されている)は、いずれも染色体上に野生型のPrhtAプロモーターが保持されている。構築したプラスミドpKOV-PrhtA(A(-67)G)をそれぞれE.coli K12(W3110)およびE.coli CGMCC 7.232に形質転換し、対立遺伝子の置き換えによって,2つの株の染色体におけるPrhtAプロモーターの塩基配列の上流-67番目の塩基AをGに変更した。具体的なプロセスとして、プラスミドpKOV-PrhtA(A(-67)G)をエレクトロポレーションにより宿主菌コンピテントセルに形質転換し、SOC液体培地0.5mLを添加し、シェーカーで30°C、100 rpmで2h蘇生し、培養液100μLを取り、クロラムフェニコール含有量34 μg/mLのLB固体培地に塗り、30°Cで18h培養し、成長したモノクローナルコロニーを選択し、それらをLB液体培地10mLに接種し、37°C、200 rpmで8h培養し、培養液100μLをクロラムフェニコール含有量34 μg/mLのLB固体培地に塗り、42°Cで12h培養し、1~5個の単一コロニーを選択してLB液体培地1 mLに接種し、37°C、200 rpmで4h培養し、培養液100μLを10%スクロースを含むLB固体培地に塗り、30°Cで24h培養し、モノクローナルを選択し、かつ対応したLB固体培地およびクロラムフェニコール含有量34μg/mLのLB固体培地に線を引き、対応したLB固形培地で増殖し、かつクロラムフェニコール含有量が34μg/mLのLB固体培地で増殖しなかった株を選択し、PCR増幅を行って同定した。PCR増幅は、下記のプライマー(中国上海invitrogen社より合成された)を採用した。
P6: 5’ AACCAGGCATCCTTTCTC 3’(SEQ ID NO:22)
上述PCRシステム:10×Ex Taq Buffer 5μL、dNTP Mixture(それぞれ2.5mM)4μL、Mg2+(25mM)4μL、プライマー(10pM)それぞれ2μL、Ex Taq(5U/μL)0.25μL、総体積50μL。前記PCR増幅では、94℃で5min予備変性し、そして、94℃で30sの変性、52℃で30sのアニーリングおよび72℃で30sの伸長(30サイクル)を行行い、そして72℃で10minの過伸長を行った。PCR増幅産物に対して、SSCP(一本鎖高次構造多型、Single-Strand Conformation Polymorphism)電気泳動を行い、プラスミドpKOV-PrhtA(A(-67)G)増幅断片を陽性対照とし、野生型大腸菌増幅断片を陰性対照とし、水をブランクコントロールとして使用した。SSCP電気泳動では、同じ長さで配列が異なる一本鎖オリゴヌクレオチド鎖は、氷浴で形成する空間構造が異なり、電気泳動中の移動度も異なる。したがって、断片の電気泳動位置が陰性対照断片の位置と一致せず、かつ陽性対照断片の位置と一致した株は、対立遺伝子置換が成功した株であった。対立遺伝子置換が成功した株をテンプレートとし、プライマーとしてP5とP6を用いて再び目的断片をPCRで増幅し、かつ目的断片をpMD19-Tベクターに接続して配列決定した。配列決定結果を比較したところ、PrhtAプロモーターの塩基配列上流-67番目の塩基AがGに変更された組換え体は、成功に改変された株であった。E.coli K12(W3110)から由来した組換え体を、YPThr01と名付け、E.coli CGMCC 7.232から由来した組換え体を、YPThr02と名付けた。
E.coli K12(W3110)株、E.coli CGMCC 7.232株および突然変異株YPThr01、YPThr02を、それぞれ表1に記載した液体培地 25mLに接種し、37℃、200rpmで12h培養した。そして、各株の培養物1mLを、それぞれ表1に記載の液体培地25mLに接種し、37℃、200rpmで36h発酵培養した。そして、HPLCでL-スレオニンの含有量を測定し、1株あたり3回の並行試験を行い、平均値を算出し、結果を表2に示した。
Claims (10)
- SEQ ID NO:1に示す野生型deoB遺伝子コード配列の1049番目の塩基が突然変異して形成された配列i、または、
SEQ ID NO:13に示すクレオチド配列の上流の-67番目の塩基が突然変異して形成されたプロモーターヌクレオチド配列ii、
から選ばれた配列を含むヌクレオチド配列。 - iにおける前記突然変異は、SEQ ID NO:1における1049番目の塩基のグアニン(G)からアデニン(A)への突然変異であり、好ましくは、前記突然変異された後のヌクレオチド配列がSEQ ID NO:2に示し、あるいは、
iiにおける前記突然変異は、SEQ ID NO:13における-67番目の塩基のアデニン(A)からグアニン(G)への突然変異であり、好ましくは、前記突然変異後のヌクレオチド配列がSEQ ID NO:14に示すものである、
請求項1に記載のヌクレオチド配列。 - 請求項1に記載のプロモーターヌクレオチド配列ii、および、rhtA遺伝子コードヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、
好ましくは、前記rhtA遺伝子コードヌクレオチド配列がSEQ ID NO:15に示すクレオチド配列を含む、
発現カセット。 - SEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列を含む組換えタンパク質であって、
好ましくは請求項1に記載のヌクレオチド配列iによってコードされる組換えタンパク質。 - 請求項1に記載のヌクレオチド配列を含む組換えベクター。
- 前記組換えベクターは、前記ヌクレオチド配列をプラスミドに導入することによって構築されたものである、請求項5に記載の組換えベクター。
- 請求項1に記載のヌクレオチド配列を含む組換え株。
- 前記組換え株は、請求項5に記載の組換えベクターを宿主株に導入し、組換えして形成されたものであり、前記宿主株は、大腸菌から選択されたものであり、例えば、前記宿主株は、E.coli K12、その派生株であるE.coli K12(W3110)、または、E.coli CGMCC 7.232株である、請求項7に記載の組換え株。
- (1)SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:13に示す野生型遺伝子のヌクレオチド配列を形質転換して、SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:14に示す突然変異された後のヌクレオチド配列を得るステップ、
(2)突然変異された後のヌクレオチド配列をプラスミドに接続して組換えベクターを構築し、好ましくは、前記プラスミドがpKOVプラスミドであるステップ、および、
(3)前記組換えベクターを宿主株に導入して組換え株を得るステップ
を含む、請求項7に記載の組換え株の構築方法。 - L-スレオニンの発酵調製における、請求項1に記載のヌクレオチド配列、請求項3に記載の発現カセット、請求項4に記載の組換えタンパク質、請求項5に記載の組換えベクター、または、請求項7に記載の組換え株の使用。
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