KR102010246B1

KR102010246B1 - 미세조류 에틀리아 유래의 프로모터 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102010246B1
Application number: KR1020170023039A
Authority: KR
Inventors: 오희목; 이형관; 하지산; 이준우
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2017-02-21
Filing date: 2017-02-21
Publication date: 2019-08-13
Also published as: KR20180096384A

Abstract

본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 에틀리아 속 미세조류 유래 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미세조류 및 상기 재조합 벡터로 미세조류를 형질전환하여 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 미세조류에서 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 재조합 벡터는 미세조류에 도입된 외래 유전자가 보다 안정적으로 발현되고, 형질전환된 미세조류를 보다 용이하게 선별할 수 있도록 한다.

Description

미세조류 에틀리아 유래의 프로모터 및 이의 용도{Promoter from microalgae Ettlia and uses thereof}

본 발명은 미세조류 에틀리아 유래의 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 에틀리아 속(Ettlia sp.) 미세조류의 LHCBM(light-harvesting protein of photosystem Ⅱ) 또는 CRT(calreticulin) 유전자 유래의 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 미세조류 형질전환용 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 미세조류에 관한 것이다.

미세조류, 특히 녹조류(Chlorophyta)는 광독립영양생물로 태양에너지와 이산화탄소를 이용해 유기물로 변환시키는 진핵생물의 일종이다. 녹조류는 태양에너지를 사용하여 이산화탄소를 고정화하는 탄소동화기능을 이용하여 바이오매스 및 다양한 유용물질을 생산하므로 이산화탄소의 저감과 유용물질 생산이라는 장점으로 주목받고 있다. 또한 상기 언급한 미세조류의 바이오매스에 포함되어 있는 다량의 탄화수소는 대체에너지인 바이오디젤 등으로 전환이 가능하며 일부 미세조류는 균체 내에 다량의 전분을 축적하는데 이들을 분해하여 에탄올 생산이 가능하므로 대체 에너지 측면에서도 유용성이 높아 주목을 받고 있다.

에틀리아(Ettlia)는 녹조강(Chlorophyceae)에 속하며, 체내 지질함량이 높고, 나이가 들면 엽록소가 사라지고 당근 빛깔의 고부가가치 물질인 카로티노이드계 물질을 생산하는 특징이 있어 바이오디젤 및 고부가가치 물질 생산균주로 주목받고 있다. 다만, 이 균주를 이용하여 산업에 활용하려면 단순한 공정으로 지질 및 카르티노이드계 물질 생산을 높일 필요가 있는데, 현재의 방법으로는 미세조류를 장기간 배양하거나 배지 내 영양 공급원의 제한 등의 부가적인 방법으로 체내 대사체의 축적을 유도하는 방법이 있으나, 유전공학적인 방법을 이용하면 대사체 생산력을 높이면서 공정의 용이성과 비용 절감의 효과를 동시에 얻을 수 있는 장점이 있다.

현재까지 연구된 바로는 야생형의 미세조류에서는 경제성 있는 수율을 얻기가 어려우며, 미세조류 형질전환은 클라미도모나스(Chlamydomonas)를 제외하고 아직 안정적인 형질전환 발현 기술이 확립되지 않은 실정이다. 이를 위하여 유전자 개량 기술 개발이 요구되고 있으며, 형질전환용 재조합 벡터 개발이 필요한 실정이다.

미세조류는 식물과는 다르게 보편적인 외래 발현 프로모터(예, CaMV35, T7 등)가 작동하지 않으며, 속 간에도 특이적으로 작용하고, 도입된 외래 유전자가 상동재조합(homologous recombination)이 아닌 비상동말단연결(non-homologous end joining)로 핵 안에 삽입되어 발현률이 낮고, 발현 또는 전사 억제가 많이 일어나는 어려움이 있다. 이를 극복하기 위하여, 미세조류의 형질전환에는 종 특이적인 발현 프로모터/터미네이터 서열이 요구되며, 코돈 사용빈도를 고려하여 외래 유전자의 코돈 변경도 고려하여야 한다.

본 발명자들은 에틀리아에 특이적인 형질전환 tool-box와 유전체 정보를 개발함으로써, 토착 미세조류주 개량의 핵심기술을 확보하고자 하였다.

한편, 한국등록특허 제1480051호에는 트라우스토키트리드계 미세조류용 재조합 벡터에 관한 '트라우스토키트리드 미세조류의 리보좀 단백질 코딩하는 유전자 변이체를 이용한 형질전환체 선별마커'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2011-0090565호에는 '미세조류의 형질전환에 유용한 벡터 및 상기 벡터에 의해 형질전환된 미세조류'가 개시되어 있으나, 본 발명의 미세조류 에틀리아 유래의 프로모터 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 미세조류 에틀리아에서 고발현되는 유전자 CRT(calreticulin) 및 LHCBM(light-harvesting protein of photosystem Ⅱ) 유래의 프로모터 서열 각각과, 에틀리아의 코돈 사용빈도에 맞추어 코돈 최적화한 리포터 유전자를 포함하는 에틀리아 특이적 형질전환용 재조합 벡터를 개발하였고, 상기 재조합 벡터를 이용하여 에틀리아에 형질전환을 수행한 결과, 상기 프로모터 서열 하류에 연결된 리포터 유전자의 강한 발현을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 에틀리아 속 미세조류 유래 프로모터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미세조류를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 미세조류를 형질전환하여 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 미세조류에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 에틀리아 유래의 프로모터와 상기 미세조류에 적합하도록 코돈 최적화된 리포터 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 미세조류에 도입된 외래 유전자가 보다 안정적으로 발현되고, 형질전환된 미세조류를 보다 용이하게 선별할 수 있어, 추후 미세조류 특히, 에틀리아의 활용성을 보다 높일 수 있을 것이다.

도 1은 에틀리아 형질전환용 tool-box 개발 순서도이다.
도 2는 유전자 주석 결과를 바탕으로 유전자 구조를 분석한 결과를 보여주는 그림이다. 녹색 화살표는 유전자 전사체에 주석된 에틀리아 psaD 유전자의 CDS 시작위치이며, 파란 화살표는 프로그램을 통해 예측된 CDS 시작위치이다.
도 3은 프로모터 예측 프로그램(FGENESH)을 이용한 psaD 유전자의 프로모터 위치 예측 결과를 보여주는 그림이다.
도 4는 에틀리아 코돈 사용빈도에 맞추어 스트렙토마이세스(Streptomyces)의 CFP 유전자를 코돈 변환한 결과를 보여주는 그림이다.
도 5는 에틀리아 유래 프로모터를 포함하는 재조합 벡터 모식도이다.
도 6은 각 프로모터 후보를 psCFP-Ett 벡터에 클로닝한 후, 각 프로모터 특이적 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과이다.
도 7은 선별된 형질전환체에서 선별마커 CFP 및 aphVⅡ 유전자에 대한 PCR 수행 결과이다. pEtt-sCFP, pEtt-sCFP 벡터 DNA; crt-02, pEttCrt-CFP 벡터로 형질전환된 형질전환체 2; crt-17, pEttCrt-CFP 벡터로 형질전환된 형질전환체 17; Lhcbm-05, pEttLhcbm-CFP 벡터로 형질전환된 형질전환체 5; Lhcbm-12, pEttLhcbm-CFP 벡터로 형질전환된 형질전환체 12.
도 8은 pEttCrt-CFP 벡터 및 pEttLhcbm-CFP 벡터로 형질전환된 형질전환체의 FACS 결과이다.
도 9는 pEttCrt-CFP 벡터 및 pEttLhcbm-CFP 벡터로 형질전환된 형질전환체의 형광 정도를 수치화한 그래프이다.
도 10는 pEttCrt-CFP 벡터 및 pEttLhcbm-CFP 벡터로 형질전환된 형질전환체의 공초점현미경 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 에틀리아 속 미세조류 유래 프로모터를 제공한다.

또한, 상기 프로모터 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상동체의 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 상기 프로모터 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 미세조류 유래 프로모터는 에틀리아 속(Ettlia sp.) 미세조류에서 분리된 것으로, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프로모터는 에틀리아 속 미세조류의 LHCBM(light-harvesting protein of photosystem Ⅱ) 유전자 유래이고, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프로모터는 에틀리아 속 미세조류의 CRT(calreticulin) 유전자 유래의 프로모터이다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다.

본 발명의 상기 재조합 벡터는, 프로모터의 하류(downstream)에 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 작동 가능하게 연결시켜 제조된 재조합 벡터일 수 있다.

본 발명에서, "작동 가능하게 연결된"은 이종 단백질을 발현하기 위한 단위로서 기능하는 발현 카세트의 성분을 말한다. 예를 들면, 단백질을 코딩하는 이종 DNA에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 이종 DNA에 해당하는 기능적 mRNA의 생산을 촉진한다.

본 발명의 상기 재조합 벡터는, 미세조류의 코돈에 최적화된 리포터 유전자를 추가로 포함하여 제조된 재조합 벡터일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 리포터 유전자는 CFP(cyan fluorescent protein), GFP(green fluorescent protein), YFP(yellow fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein) 또는 GUS(β-glucuronidase) 등일 수 있고, 바람직하게는 CFP일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

미세조류 이외의 종에서 유래된 리포터 유전자의 코돈을 미세조류에 적합하도록 최적화시키면, 리포터 유전자와 함께 도입된 외래 유전자의 발현 여부를 보다 효율적으로 확인할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터에 있어서, 상기 리포터 유전자는 에틀리아 미세조류의 코돈 사용빈도에 맞추어 코돈 최적화된 CFP 유전자로, 코돈 최적화된 CFP 유전자의 범위는 서열번호 3의 염기서열 및 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 염기서열의 상동체는 전술한 바와 같다.

본 발명의 상기 재조합 벡터는 에틀리아 속 미세조류 형질전환용 재조합 벡터이다. 본 발명의 재조합 벡터는 에틀리아 속에서 과발현되는 유전자 유래의 프로모터를 포함하고 있어 형질전환된 미세조류의 제작시 안정적으로 외래 유전자의 발현을 유도시킬 수 있으며, 에틀리아 속의 코돈 사용빈도(codon usage)에 맞추어 코돈 최적화된 리포터 유전자를 포함하고 있어 형질전환된 미세조류의 스크리닝을 보다 용이하게 할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 재조합 벡터에 있어서, 상기 프로모터의 유전자 발현을 정지시킬 수 있는 터미네이터는 이에 한정되지는 않으나, psaD, rbcS2 및 beta-tubulin의 터미네이터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 상기 터미네이터 또한 미세조류 유래의 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 재조합 벡터는 미세조류가 선호하는 유전자 구조 예를 들면 인트론이 하나 또는 다수 존재하는 구조를 가지도록 벡터를 구성할 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터로 미세조류 세포를 형질전환하는 방법은 전기천공법(electroporation), 유리 구슬(glass bead), 유전자 총(gene gun), 탄화규소 휘스커(silicon carbide whisker) 등의 방법일 수 있고, 바람직하게는 전기천공법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 형질전환된 미세조류는 바람직하게는 에틀리아 속(Ettlia sp.)의 미세조류일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 목적 단백질을 암호화하는 유전자는 미세조류에서 발현이 가능한 모든 유전자를 제한없이 사용할 수 있으며, 유용물질 생산 유전자로써 지방산, 카로테노이드, 탄화수소, 단백질, 항생제 내성 유전자 등을 예로 들 수 있으며, 항생제 내성 유전자로써 블레오마이신 내성유전사(ble), 파로모마이신 내성 유전자(par) 등을 예로 들 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 미세조류 형질전환용 재조합 벡터 제작을 위한 프로모터 선별

미세조류 형질전환체의 도입 유전자(외래 유전자) 발현을 높이기 위해, 에틀리아(Ettlia) 특이적인 상동의(homogenous) 프로모터를 선정하기 위하여 하기 표 1과 같이 8개의 유전자를 선택하였다.

후보 유전자 구조 분석

종류	유전자	유전자설명	프로모터 위치*	전사인자 결합 위치*
Universal promoter in microalgae	psaD	Photosystem I reaction center subunit II, 20 kDa	-300	rpo17, phoB, rpoD19
	rbcs2	1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit	-483	-
	hsp70A	heat shock protein Hsp70A	-119	cysB, tyrR, fis
	TUB2	beta-tubulin	-400	-
High expressed gene in Ettlia	ART	actin	-442	rpoD17
	CRT	calreticulin (A)	-310	rpoD16
	GDH	Glutamate dehydrogenase	-659	cpxR, phoB
	LHCBM	light-harvesting protein of photosystem II	-208	-

*, 박테리아 프로모터 예측 프로그램을 통해 예측된 위치.

구체적으로는, 클라미도모나스(Chlamydomonas)의 형질전환에 많이 사용되는 universal 프로모터를 포함하는 유전자 4개와 에틀리아의 RNA-서열에서 고발현되는 유전자 4개를 선택하였다. 특히, 에틀리아의 RNA-서열에서 고발현되는 유전자는 에틀리아의 드라프트 게놈(draft genome)의 스캐폴드와 RNA-서열의 전사체 콘티그 결과(transcripts contig data)를 기반으로 인트론과 엑손, 5'-UTR 및 3'-UTR의 유전자 구조를 분석하였다. 도 2를 보면, psaD 유전자의 경우 유전자 주석된 전사체 기반의 시작점은 초록색으로 표시된 지점이나, 상기 지점은 시작 코돈이 포함되지 않은 영역으로 게놈 서열을 참조하여 5'-UTR로 지정된 부분을 확장하여 전체 유전자 구조를 새롭게 구성하였다. 그리고 메티오닌(Met)이 있는 앞부분부터 5'-UTR로 지정하고 상류(upstream) 1Kb까지를 프로모터 영역으로 설정하고 박테리아 프로모터 예측 프로그램(FGENESH, Softberry)을 이용하여 각 유전자의 프로모터 위치를 예측하였다. psaD의 경우 3개의 전사 인자 결합 위치(transcription factor binding site)가 300bp TATA-box 지역을 중심으로 예측되었으며(도 3), 이를 기반으로 420bp 크기의 psaD 프로모터 지역을 증폭할 수 있는 PCR 프라이머를 제작하였다(표 2). psaD 외 다른 유전자에 대해서도 상기와 동일한 방법으로 PCR 프라이머를 제작하였으며 rbcs2와 actin의 경우 PCR 산물의 크기나 서열이 드라프트 서열과 일치하지 않아 제외하였다.

프로모터 클로닝을 위한 PCR 프라이머

유전자	방향	서열정보(5'→3')	GC함량	산물 크기	서열분석결과
psaD	F	CGCTTGTGCTGCTAACCGCTA (서열번호 4)	57.1%	419bp	1bp 결실
	R	CGACAAACCGGAAGCCGATCA (서열번호 5)	57.1%
hsp70A	F	GCAGCAGACAGCCATTCA (서열번호 6)	55.6%	341bp	정확
	R	TGATCTCCACACGGTCATTCTG (서열번호 7)	50.0%
β-tub2	F	GAGCTGCCTGCAGAGTAT (서열번호 8)	55.6%	552bp	1bp 삽입
	R	TGGTTGCTTACGAAGCTACGA (서열번호 9)	47.6%
CRT	F	CAATAGCGCTCAGTGGTTGA (서열번호 10)	50.0%	465bp	정확
	R	CAACAACCCACTGATCGCAGT (서열번호 11)	52.4%
GDH	F	GCTCGAGCTTGGCAGTCA (서열번호 12)	61.1%	739bp	KpnⅠ만 잘림
	R	TGGTTGCTACCACTGCTGCT (서열번호 13)	55.0%
LHCBM	F	GCAGCTTATTGGCACCGT (서열번호 14)	55.6%	349bp	200bp 삽입
	R	CGTGGATGACCTCGATCT (서열번호 15)	55.6%

실시예 2. 에틀리아 형질전환용 벡터 제작

미세조류 형질전환용 pEtt-sCFP 벡터는 다음과 같이 제작하였다. 먼저 스트렙토마이세스(Streptomyces)의 CFP 유전자를 에틀리아 코돈 사용빈도(codon usage)에 맞게 코돈 최적화하였다. 에틀리아의 코돈은 156,858 ORF를 기반으로 분석되었으며, 전체 GC 함량은 55.34%로 예측되었다. 클라미도모나스(Chlamydomonas)와 비교하여 볼 때 코돈 사용빈도가 대체적으로는 비슷하였지만 일부 상이한 코돈 사용빈도가 확인되었다. 먼저 우성 코돈(dominant codon)이 다른 경우가 몇 개 확인되었는데, 클라미도모나스와는 다르게 에틀리아에서는 시스테인(Cys)은 TGT, 아르기닌(Arg)은 CGT, 발린(Val)은 GTC의 코돈이 선호도가 높은 것으로 확인되었으며, 많은 희귀 코돈을 가진 클라미도모나스와는 다르게 에틀리아에서는 루신(Leu) TTA, 아르기닌 AGA 또는 AGG 및 세린(Ser) TCT 정도의 코돈만 희귀한 것으로 확인되었다.

720bp의 CFP 유전자를 정리된 에틀리아 코돈 사용빈도를 데이터베이스로 하고, P.Puigbo가 개발한 optimizer tool(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER)을 이용하여 분석하였다. Optimizer tool에는 Customized one AA - one codon과 One AA - one codon의 2가지 선택 옵션이 있는데, 전자는 희귀 코돈을 제외하고 비슷한 사용빈도로 사용되는 아미노산을 인정하여 변환하지 않고 사용하므로 하나의 아미노산 당 2-3개의 코돈을 사용하는 반면, 후자는 하나의 아미노산 당 가장 높은 사용빈도를 보이는 코돈만 사용하여 변환하여 주는 옵션이다. 본 발명의 벡터 제작에는 후자의 옵션, 즉 One AA - one codon을 선택하여 CFP 유전자를 변환하였으며, 그 결과 17개의 transition 변화(퓨린 <-> 퓨린 / 피리미딘 <-> 피리민딘), 53개의 transversion 변화(퓨린 <-> 피리미딘)가 있었으며, 총 51개의 코돈이 변경되었다. CAI(codon adaptation index)가 1로 수정되었으며, GC 함량도 62.1%에서 58.3%로 수정되었다(도 4). 상기와 같이 코돈 최적화된 720bp의 CFP는 바이오니아(한국)에서 합성하였다.

실시예 1의 방법을 통해 증폭된 6개의 프로모터 후보는 KpnI과 NheI 제한효소를 이용하여 재조합 벡터로 클로닝하였다. 하이그로마이신의 경우 pHyg3의 aphVⅡ 카세트를 그대로 사용하였고, 코돈 최적화된 CFP와 에틀리아 psaD의 터미네이터 지역 460bp를 연결하였으며, 상기 프로모터 지역과 CFP, 터미네이터 지역의 경계에는 제한효소 자리를 각각 넣어 쉽게 교체가 가능하도록 제작하였다. 이렇게 만들어진 재조합 벡터를 pEtt-sCFP로 명명하였다(도 5).

상기 재조합 벡터에서 각 프로모터 후보 서열은 벡터 내로 클로닝 후, T3 프로모터에 대한 프라이머로 PCR을 수행하고(도 6), 그 산물을 이용하여 서열을 분석한 결과, hsp70A 및 CRT 유전자의 경우는 예측된 크기와 서열 분석 결과가 일치하는 것으로 확인되었고, pasD 및 β-tub2 유전자의 경우는 예측된 크기와 실제 서열 분석 결과가 1bp 차이나는 것을 확인할 수 있었다(표 2). 이러한 결과는 Hiseq의 NGS 기술로 짧은 리드들을 조합하여 나온 서열 오류로 예상되며, 관심있는 유전자를 실험할 때는 반드시 전장 서열을 확인하여야 함을 알 수 있었다.

실시예 3. 미세조류 형질전환용 재조합 벡터를 이용한 에틀리아 형질전환

상기 실시예 2에서 제작된 재조합 벡터로 에틀리아를 형질전환하여 형질전환체에서 Cyan(청녹색) 형광을 비교하여 효율이 뛰어난 프로모터를 선별하고자 하였다.

에틀리아의 형질전환을 위해 전기천공법(electroporation)을 채택하였고, 최적화를 진행하였다. 컴피턴트(competent) 세포는 다음과 같이 준비하였다. 먼저, 무균 배지에서 배양중이던 에틀리아를 TAP(Tris-Acetate-Phosphate) 배지에 접종하여 5일간 회분배양하여 중간-대수기 상태(mid-log phase)의 세포를 수확하였고, 2X10⁷ 세포/㎖로 농축하여 멸균한 3차 증류수로 2번 세척한 후, MAX efficiency transformation 시약(Invitrogen, 미국) 용액으로 1번 더 세척을 하고, 다시 같은 용액에 현탁하여 4℃에 보관하였다.

각각의 재조합 벡터는 ScaⅠ으로 처리하여 선형 형태로 준비하였으며, 반응 당 2㎍의 농도로 컴피턴트 세포가 현탁되어 있는 용액에 넣어 4℃에 보관하였다.

0.2cm 큐벳(Bio-rad, 미국)을 사용하여 1,000V 전압, 50㎌ 커패시턴스(capacitance) 및 800Ω 저항의 조건으로 전기천공법을 수행하였다. 큐벳으로부터 회수한 세포는 15㎖의 60mM 수크로스가 첨가된 TAP 용액에 현탁하여 25℃에서 16시간 회복기를 가진 후, 1X10⁷ 세포/㎖ 농도로 하이그로마이신 항생제가 100㎍/㎖로 포함된 고체배지에 도말하고, 2주 뒤에 콜로니를 얻었다. 얻어진 콜로니는 다시 96 웰 플레이트에 계열 희석히고 10㎍/㎖의 하이그로마이신이 포함된 액체배지에 배양하여 2차 선별을 거친 후, 최종적으로 12 웰 플레이트에 10~50㎍/㎖ 농도의 하이그로마이신을 포함한 액체배지에 접종, 배양하여 형질전환체를 선별하였다.

선별된 형질전환체로부터 총 RNA를 추출하고, 이를 이용하여 합성한 cDNA에서 선별마커 CFP 및 aphVⅡ 유전자를 하기의 프라이머를 사용하여 확인하였다.

선별마커 확인을 위한 PCR 프라이머

프라이머명	염기서열(5'→3') (서열번호)
F494-synCFP	ACTTCAAGATCCGTCACAAC (서열번호 16)
R717-synCFP	CTTGTACAGCTCGTCCATGC (서열번호 17)
F1204-aphVⅡ	CCATTCCGAGGTCTTCCCGGAACTGCT (서열번호 18)
F1599-aphVⅡ	GGTCTCCTCGAACACCTCGAAGT (서열번호 19)

그 결과, 선별된 형질전환체 중 pEttCrt-CFP 벡터로 형질전환된 #2 및 #17(각각 crt-02, crt-17)과, pEttLhcbm-CFP 벡터로 형질전환된 #5 및 #12(각각 Lhcbm-05, Lhcbm-12)에서만 CFP 및 aphVⅡ 유전자가 확인되었다(도 7).

또한, 도입된 리포터 유전자 CFP의 형광 발현을 수준을 분석하기 위하여, 유세포분석기(FACS)와 공초점현미경(confocal microscope)을 사용하여 각 형질전환체를 분석하였다.

그 결과, Lhcbm-05 형질전환체를 제외하고, 무처리 및 공벡터(mock) 처리군에 비해 Lhcbm-12, crt-02 및 crt-17 형질전환체에서 높은 수준의 형광이 확인되었다(도 8, 도 9 및 도 10).

삭제

상기의 결과들을 통해서, 에틀리아에서 과발현되는 유전자인 CRT(calreticulin (A)) 및 Lhcbm(light-harvesting protein of photosystem II) 유래의 프로모터가 에틀리아 형질전환에 유용하게 활용될 수 있음을 확인하였다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Promoter from microalgae Ettlia and uses thereof <130> PN16486 <160> 19 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 544 <212> DNA <213> Ettlia sp. <400> 1 gcagcttatt ggcaccgtat tgcatttatg tacagcctct gagcagctgc tccacagcac 60 tggtgcccgg agatgcgaaa cgtagcgaaa cttcaggatt ctgcatcccc ggtgcccagc 120 ctgacttgtg ctgctatgaa tatcatgtgc agggcaaccg tcaggtgacc cgcgctgcca 180 ttgagtggta tggccccgac cgtcccaagt tcctgggtaa gtttcagcga tgcgtggggg 240 ttgacttctg aaggcgcaag cgcccgtgca ttggcctgcg aggcagctac tgtagatacg 300 taactcagcg gcgtggtgca tgcagcggca agcttggcag atccctgggc ctgctgtgag 360 tctcgcccca acttgcgttg atcgctgaat gccacgtccg ttgcccttgc aggcccattc 420 agcgagggtg acacccccgc ctacctgacc ggtgagttcc ccggagacta cggatgggac 480 acagctggtc tgtcagctga tccccagacc ttcgccaggt acagggagat cgaggtcatc 540 cacg 544 <210> 2 <211> 465 <212> DNA <213> Ettlia sp. <400> 2 caatagcgct cagtggttga agcgggcaag ggtgcacctt atgcaggcgc taagtttcaa 60 cctatcggcg gttggctgtt gtattgaatc accagttaca gccttatgaa tgtcctgaca 120 ttccagacca gctcaaggaa gagagtatgc ttataccagt ttcaaatgga gtgcggacac 180 ctccggggcc cgctgcatga agcagcctcg aaaagacaca ggctacgtcg cttcgattaa 240 acacctgctg ggatatcgca ggaataaccg cagcgacatg agaagaccaa ctaacaccct 300 gttacacagg gtgtcccgct cggtgcctga catgtgatat gcgtcggttg cctgccacgt 360 gatcctattg caatgctagc cggctggcgt aagcagggaa acacgcgacg aggacgtagc 420 ggacctgtcc aaattctgtt gctaactgcg atcagtgggt tgttg 465 <210> 3 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized CFP <400> 3 atggtctcga agggcgagga gctgttcaca ggcgtcgtcc cgatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtca acggccacaa gttctcggtc tcgggcgagg gcgagggcga cgcaacatac 120 ggcaagctga cactgaagtt catctgtaca acaggcaagc tgccggtccc gtggccgaca 180 ctggtcacaa cactgacatg gggcgtccag tgtttcgcac gttacccgga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc ggcaatgccg gagggctacg tccaggagcg tacaatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacacgt gcagaggtca agttcgaggg cgacacactg 360 gtcaaccgta tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctgggccac 420 aagctggagt acaactacat ctcggacaac gtctacatca cagcagacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg caaacttcaa gatccgtcac aacatcgagg acggcggcgt ccagctggca 540 gaccactacc agcagaacac accgatcggc gacggcccgg tcctgctgcc ggacaaccac 600 tacctgtcga cacagtcgaa gctgtcgaag gacccgaacg agaagcgtga ccacatggtc 660 ctgctggagt tcgtcacagc agcaggcatc acactgggca tggacgagct gtacaagtag 720 720 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cgcttgtgct gctaaccgct a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cgacaaaccg gaagccgatc a 21 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gcagcagaca gccattca 18 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tgatctccac acggtcattc tg 22 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gagctgcctg cagagtat 18 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tggttgctta cgaagctacg a 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 caatagcgct cagtggttga 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 caacaaccca ctgatcgcag t 21 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gctcgagctt ggcagtca 18 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tggttgctac cactgctgct 20 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gcagcttatt ggcaccgt 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 cgtggatgac ctcgatct 18 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 acttcaagat ccgtcacaac 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 cttgtacagc tcgtccatgc 20 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ccattccgag gtcttcccgg aactgct 27 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ggtctcctcg aacacctcga agt 23

Claims

서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 에틀리아 속(Ettlia sp.) 미세조류 유래 프로모터.
제1항의 프로모터를 포함하는 재조합 벡터.
제2항에 있어서, 상기 프로모터의 하류에 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 작동 가능하게 연결시켜 제조된 재조합 벡터.
제2항에 있어서, 미세조류의 코돈에 최적화된 리포터 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제2항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 에틀리아 속 미세조류의 형질전환용인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제2항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된 미세조류.
제6항에 있어서, 상기 미세조류는 에틀리아 속 미세조류인 것을 특징으로 하는 형질전환된 미세조류.
제3항의 재조합 벡터로 미세조류를 형질전환하여 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 미세조류에서 목적 단백질을 생산하는 방법.