KR102075740B1 - 고속 효소 스크리닝 시스템에 의해 동정된 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 가용성 메탄 모노옥시게나아제 및 이를 이용하여 메탄으로부터 메탄올을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 경우 대장균 내에서도 생산될 수 있을 뿐만 아니라, 야생형 가용성 메탄 모노옥시게나아제에 비해 훨씬 높은 수준으로 메탄을 메탄올로 전환할 수 있는바, 메탄올의 대량생산에 바이오 촉매로 유효하게 적용될 수 있다.

Description

고속 효소 스크리닝 시스템에 의해 동정된 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제{A Novel Soluble Methane Monooxygenase Identified By High-Throughput Enzyme Screening System}

본 발명은 신규한 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 분자생물학적 특성을 고속으로 분석하여 효소의 특성을 향상시키는 전략 및 그러한 전략으로부터 도출된 신규의 가용성 메탄 모노옥시게나아제에 관한 것이다.

메탄 가스를 메탄올로 전환하는 화학 반응은 탄수-수소 결합을 활성화시키는데 많은 에너지가 필요할 뿐만 아니라 비용과 부산물의 처리에 있어서도 매우 비효율적인 문제가 있다. 상기와 같은 화학 반응에 대한 대안으로, 바이오 촉매를 이용하여 비교적 온화한 조건에서 진행되는 생물공학적 반응의 개발의 필요성이 강조되고 있다.

상기와 같은 바이오 촉매의 일 후보로 알칸 모노옥시게나아제(alkane monooxygenase)의 활성을 나타내는 메탄 옥시게나아제(methane monooxygenase)가 주목을 받고 있다.

상기 메탄 모노옥시게나아제는 메탄자화균(methanotrophs)에서 발현되는 효소인데, 가용성 메탄 모노옥시게나아제(soluble methane monooxygenase, sMMO)와 입자성 메탄 모노옥시게나아제(particulate methane monooxygenase, pMMO)로 분류될 수 있다. 그 중에서 상대적으로 분자생물학적 기전이 잘 규명되어 있는 가용성 메탄 모노옥시게나아제는 메틸로코커스 캡술라투스(Methylococcus capsulatus Bath), 메틸로시누스 트리코스포리움(Methylosinus trichosporium OB3b) 등에서 발현되는 것으로 알려져 있다. 하지만 상기와 같은 메탄자화균들은 배양이 어렵고 생물공학 기법들이 잘 적용되지 않는 문제가 있다.

이에, 배양이 용이하고 생물공학 기법들이 잘 적용되는 대장균에서 생산이 가능하면서도, 종래에 비해 메탄 모노옥시게나아제 활성이 향상된 새로운 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 개발이 여전히 필요한 실정이다.

본 발명의 일 목적은 대장균에서도 생산이 가능하면서, 동시에 야생형 메탄 모노옥시게나아제에 비해 활성이 향상된 신규한 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기와 같은 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 이용하여 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo)에서 메탄올을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기와 같은 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 분자생물학적 특성을 고속으로 분석하여 대량의 라이브러리로부터 효소 특성이 향상된 변이체를 선별하는 낼 수 있는 센서 세포와 이를 이용한 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 104번째 프롤린(proline), 106번째 아르기닌(arginine), 117번째 세린(serine), 258번째 트레오닌(threonine), 295번째 아르기닌(arginine), 308번째 아스파라긴(asparagine), 340번째 글리신(glycine), 339번째 발린(valine) 및 344번째 내지 394번째 아미노산으로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나가 변이된 폴리펩티드를 서브유닛으로 포함하는 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 제공한다.

상기 변이는 상기 104번째 프롤린이 트레오닌,세린, 알라닌(alanine), 발린으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환되거나, 상기 106번째 아르기닌 및 상기 295번째 아르기닌이 각각 독립적으로 시스테인(cysteine)으로 치환되거나, 상기 117번째 세린 및 상기 340번째 글리신이 각각 독립적으로 알라닌, 발린, 이소류신(isoleucine) 및 류신으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환되거나, 상기 308번째 아스파라긴이 티로신(tyrosine), 페닐알라닌(phenylalanine) 및 트립토판(tryptophan)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환되거나, 상기 258번째 트레오닌은 치환되지 않거나 알라닌 또는 세린으로 치환되고, 상기 339번째 발린이 글루탐산(glutamic acid) 또는 아스파르트산(aspartic acid)으로 치환되거나, 상기 344번째 내지 394번째 아미노산은 결실되거나, 또는 이들 중 두 가지 이상이 함께 발생한 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 메탄과 반응시키는 단계를 포함하는, 인 비트로(in vitro)에서의 메탄올 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 암호화하는 유전자가 형질도입된 형질전환체를 메탄의 존재 하에서 배양하는 단계 및 상기 배양된 배양물에서 메탄올을 분리하는 단계;를 포함하는, 인 비보(in vivo)에서의 메탄올 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 측면은, GESS 유전자 회로; 및 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 구성하는 서브유닛들 중 일부 서브유닛들을 암호화하는 유전자들을 포함하는 제3 유전자 컨스트럭트;를 포함하는, 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 효소 활성이 향상된 변이체의 스크리닝용 센서 세포를 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 센서 세포에, 상기 제3 유전자 컨스트럭트에 포함되지 않은 나머지 서브유닛들의 돌연변이 유전자 라이브러리를 포함하는 제4 유전자 컨스트럭트를 도입하는 단계; 상기 제4 유전자 컨스트럭트가 도입된 센서 세포를 벤젠이 존재하는 환경에서 배양하는 단계; 및 상기 센서 세포에서 리포터 유전자의 발현을 감지하는 단계;를 포함하는, 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 효소 활성이 향상된 변이체의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제는 대장균 내에서도 생산될 수 있을 뿐만 아니라, 야생형 가용성 메탄 모노옥시게나아제에 비하여 그 효소 활성이 우수하므로, 메탄으로부터 메탄올을 생산하는 바이오 촉매로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 센서 세포를 이용하면, 상기와 같이 효소 활성이 우수한 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 쉽고 빠르게 스크리닝해 낼 수 있다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 야생형 가용성 메탄 모노옥시게나아제을 구성하는 5개의 서브유닛을 암호화하는 유전자가 pACBB 벡터에 클로닝된 맵의 모식도이다.
도 2는 돌연변이 mmoY 유전자가 pUCBB 벡터에 클로닝된 맵의 모식도이다.
도 3은 GESS(Genetic Enzyme Screening System) 유전자 회로가 포함된 세포의 가용성 메탄 모노옥시게나아제 활성 감지 가능성을 확인한 방법을 나타낸 모식도이다.
도 4은 GESS 유전자 회로가 포함된 세포가 NMS(nitrate mineral salt) 배지에서 유효하게 작동하는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5 및 도 6은 GESS 유전자 회로가 포함된 세포가, 메탄자화균 내 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 발현 의존적으로 페놀 생성 여부를 감지할 수 있는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 GESS 유전자 회로가 포함된 세포가 페놀에 특이적으로 형광을 발현하는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 메탄자화균의 배양액 내 페놀이 존재하는지 여부를 고압 액체 크로마토그래피로 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9은 GESS 유전자 회로가 포함된 세포에서 가용성 메탄 모노옥시게나아제 변이체를 이종발현하여 유세포분석기로 3회의 선별과정 동안 형광 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 GESS 유전자 회로가 포함된 세포를 이용하여, 활성이 향상된 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 돌연변이체를 스크리닝한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제에 의해 메탄으로부터 메탄올이 생성되는 활성을 확인한 결과를 나타낸 것으로서, OY-15는 형질전환체 1의 mmoY 유전자 돌연변이체를 포함하는 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 나타내고, OY-P104T는 형질전환체 2의 mmoY 유전자 돌연변이체를 포함하는 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 나타내고, OY-V389E는 형질전환체 3의 mmoY 유전자 돌연변이체를 포함하는 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제 (soluble methane monooxygenase )

본 발명의 일 측면은 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 제공한다.

본 발명의 상기 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제는 6개의 서브유닛을 포함하는데, 그 중 하나의 서브유닛으로 서열번호 1의 아미노산 서열 중 일부 아미노산이 변이된 폴리펩티드를 포함한다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 β 서브유닛을 암호화하는 mmoY 유전자인데, 본 발명의 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제는 상기와 같은 β 서브유닛의 변이된 폴리펩티드를 포함하는 것이다.

상기 변이된 폴리펩티드는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 104번째 프롤린(proline), 106번째 아르기닌(arginine), 117번째 세린(serine), 258번째 트레오닌(threonine), 295번째 아르기닌(arginine), 308번째 아스파라긴(asparagine), 339번째 발린(valine), 340번째 글리신(glycine) 및 344번째 내지 394번째 아미노산으로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나에 변이가 발생한 것일 수 있다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 상기 104번째 프롤린은 트레오닌, 세린, 알라닌(alanine) 및 발린으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환될 수 있고, 구체적으로는 상기 104번째 프롤린이 트레오닌으로 치환된 것일 수 있다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 상기 106번째 아르기닌과 상기 295번째 아르기닌은 각각 독립적으로 시스테인(cysteine)으로 치환될 수 있다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 상기 117번째 세린과 상기 340번째 글리신은 각각 독립적으로 알라닌, 발린, 이소류신(isoleucine) 및 류신으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환될 수 있고, 구체적으로 상기 117번째 세린과 상기 340번째 글리신은 각각 독립적으로 알라닌 또는 발린으로 치환될 수 있으며, 예컨대 상기 상기 117번째 세린과 상기 340번째 글리신은 각각 독립적으로 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 상기 258번째 트레오닌은 치환되지 않거나(즉, 트레오닌으로 그대로 존재하거나), 알라닌 또는 세린으로 치환될 수 있고, 구체적으로는 상기 258번째 트레오닌은 세린으로 치환된 것일 수 있다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 상기 308번째 아스파라긴은 티로신(tyrosine), 페닐알라닌(phenylalanine) 및 트립토판(tryptophan)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환될 수 있고, 구체적으로 상기 308번째 아스파라긴은 티로신으로 치환된 것일 수 있다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 상기 339번째 발린은 글루탐산(glutamic acid) 또는 아스파르트산(aspartic acid)으로 치환될 수 있고, 구체적으로 339번째 발린은 글루탐산으로 치환된 것일 수 있다.

또한, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 상기 344번째 내지 394번째 아미노산은 그 일부 또는 전부가 결실될 수 있고, 구체적으로 상기 344번째 내지 394번째 아미노산 전부가 결실된 것일 수 있다.

일 구현 예에서, 상기 변이된 폴리펩티드는, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 106번째 아르기닌과 295번째 아르기닌이 각각 독립적으로 시스테인으로 치환되고, 117번째 세린과 340번째 글리신이 각각 독립적으로 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환되고, 258번째 트레오닌이 치환되지 않거나(즉, 트레오닌으로 그대로 존재하거나) 또는 세린으로 치환되고, 308번째 아스파라긴이 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환되며, 344번째 내지 394번째 아미노산의 일부 또는 전부가 결실된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 변이된 폴리펩티드는, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 106번째 아르기닌과 295번째 아르기닌이 각각 독립적으로 시스테인으로 치환되고, 117번째 세린과 340번째 글리신이 각각 독립적으로 알라닌 및 발린으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환되고, 상기 258번째 트레오닌이 세린으로 치환되고, 308번째 아스파라긴이 티로신으로 치환되며, 344번째 내지 394번째 아미노산의 전부가 결실된 것일 수 있다. 특히, 상기 변이된 폴리펩티드는, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 106번째 아르기닌과 295번째 아르기닌이 모두 시스테인으로 치환되고, 117번째 세린과 340번째 글리신이 모두 알라닌으로 치환되고, 상기 258번째 트레오닌이 세린으로 치환되고, 308번째 아스파라긴이 티로신으로 치환되며, 344번째 내지 394번째 아미노산의 전부가 결실된, 서열번호 36의 아미노산 서열일 수 있다.

다른 구현예에서, 상기 변이된 폴리펩티드는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 104번째 프롤린이 트레오닌, 세린, 알라닌 및 발린으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된 것일 수 있다. 특히, 상기 변이된 폴리펩티드는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 104번째 프롤린이 트레오닌으로 치환된, 서열번호 38의 아미노산 서열일 수 있다.

또 다른 구현 예에서, 상기 변이된 폴리펩티드는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 339번째 발린이 글루탐산 또는 아스파르트산으로 치환된 것일 수 있다. 특히, 상기 변이된 폴리펩티드는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 339번째 발린이 글루탐산으로 치환된, 서열번호 40의 아미노산 서열일 수 있다.

상기 변이된 폴리펩티드는, 상기 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들, 또는 단편들일 수 있다. 상기 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드 수준에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 변이된 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 90％ 이상, 바람직하게는 93％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 아미노산 서열의 상동성을 갖는 것들을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 90% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명의 범위에 포함된다.

한편, 본 발명의 상기 가용성 메탄 모노옥시게나아제는, 상기의 변이된 폴리펩티드 외에, 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 구성하는 다른 서브유닛들을 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 다른 서브유닛들은, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 mmoX 유전자에 의해 암호화되는 α 서브유닛, 서열번호 4의 염기서열을 갖는 mmoB 유전자에 의해 암호화되는 B 서브유닛, 서열번호 5의 염기서열을 갖는 mmoZ 유전자에 의해 암호화되는 γ 서브유닛, 서열번호 6의 염기서열을 갖는 mmoD 유전자에 의해 암호화되는 D 서브유닛 또는 서열번호 7의 염기서열을 갖는 mmoC 유전자에 의해 암호화되는 R 서브유닛일 수 있다.

상기 β 서브유닛의 변이된 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제는, 야생형 가용성 메탄 모노옥시게나아제에 비해, 메탄으로부터 메탄올을 생산하는 활성이 훨씬 우수하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는 변이된 폴리펩티드, 서열번호 38의 아미노산 서열을 갖는 변이된 폴리펩티드, 그리고 서열번호 40의 아미노산 서열을 갖는 변이된 폴리펩티드를 포함하는 각각의 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 경우, 야생형 가용성 메탄 모노옥시게나아제에 비해 훨씬 향상된 수준으로 메탄올을 생산할 수 있음을 확인하였다(도 8 참고).

또한, 본 발명의 다른 측면은 변이된 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 제공한다.

상기 변이된 폴리펩티드의 유전자는 서열번호 37, 서열번호 39 또는 서열번호 41 내지 서열번호 48의 염기 서열로 이루어진 것이 바람직하다. 그러나 본 발명의 변이된 폴리펩티드 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자는 암호화 영역으로부터 발현되는 폴리펩티드 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변이가 이루어질 수 있으며, 이러한 변이 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 서열번호 37, 서열번호 39 또는 서열번호 41의 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열로 이루어진 유전자 및 상기 유전자의 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 염기서열로 이루어진 유전자란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 80% 이상의 서열 상동성을 가지며 암호화된 폴리펩티드가 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명에 포함된다. 상기와 같이, 본 발명의 변이된 폴리펩티드의 유전자는 이와 동등한 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

상기 본 발명의 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제에 서브유닛으로 포함될 수 있는 서열번호 36의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열번호 37 또는 서열번호 42 내지 서열번호 48의 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화되고, 서열번호 38의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열번호 39의 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화되며, 서열번호 40의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열번호 41의 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화되나, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 동일 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 변이된 폴리펩티드를 암호화할 수 있는 한, 서열번호 37, 서열번호 39 또는 서열번호 41 내지 서열번호 48의 염기 서열과 실질적으로 동일한 다른 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화될 수도 있다. 이러한 염기 서열은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA 분자일 수 있다.

2. 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 발현 벡터 및 형질전환체

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 상기 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 암호화하는 유전자가 포함된 재조합 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 상기 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있고, 상기 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 암호화하는 유전자는 상기 변이된 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함한다.

상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파이지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되지 않고, 발현의 목적에 따라 다양한 원핵세포용 벡터 또는 진핵세포용(pPIC 및 pPICZ 등) 벡터가 이용될 수 있다.

상기 재조합 발현 벡터는 본 발명의 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 터미네이터(terminator), 엔핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절서열, 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 목적에 따라 조합할 수 있다.

상기 발현 벡터는 벡터가 도입된 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 추가로 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.

또한, 상기 재조합 발현 벡터는 발현 단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 암호화하는 전체 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-태그(His-tag) 및 c-myc 등이 단독으로 사용되거나 이들 중 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수도 있다.

상기 본 발명의 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 암호화하는 유전자는 제한효소 절단위치를 통해 클로닝될 수 있으며, 상기 벡터에 단백질 절단효소 인식부위를 암호화하는 유전자가 사용된 경우에는 상기 본 발명의 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 유전자와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 상기 효소를 수득한 후 단백질 절단 효소로 절단 시, 원래 본 발명의 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제 형태로 생산될 수 있도록 할 수 있다.

본 발명의 상기 재조합 발현 벡터는 본 발명의 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 암호화하는 유전자가 포함되어 있어 이를 생산할 수 있는 벡터로서 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 형질전환체에는 상기 본 발명의 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된다.

본 발명에 따른 상기 재조합 발현 벡터를 발현 목적에 따라 박테리아, 효모, 대장균, 진균류, 식물 세포 및 동물 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 적절한 숙주 세포에 형질전환시킴으로써 형질전환체를 제조할 수 있다. 예컨대, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli BL21(DE3), DH5α등)일 수 있다. 이때, 숙주 세포의 종류에 따라 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다.

본 발명의 형질전환체의 제조를 위한 재조합 발현 벡터의 도입 방법은 공지의 기술, 즉 열 충격법, 전기충격법 등을 사용할 수 있다.

상기 형질전환체를 대량 배양하여 본 발명의 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 용이하게 대량생산 할 수 있다.

3. 인 비트로( in vitro )에서의 메탄올 생산 방법

본 발명의 또 다른 측면은 인 비트로(in vitro)에서의 메탄올 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 인 비트로(in vitro)에서의 메탄올 생산 방법은 상기 "1. 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제 (soluble methane monooxygenase ) "항목에서 설명한 본 발명의 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제와 메탄을 반응시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 상기 인 비트로(in vitro)에서의 메탄올 생산 방법은, 상기 본 발명의 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제와 메탄의 반응물로부터 메탄올을 회수하는 단계를 더 포함한다.

상기 회수는 원심분리, 여과 등 당해 분야에서 통상적으로 수행되는 방법을 실시함으로써 달성될 수 있고, 통상의 방식으로 정제하는 과정을 추가적으로 수행함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 상기 정제하는 과정은 용매 침전, 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 등의 기법을 단독 또는 조합하여 수행할 수 있다.

상기 본 발명의 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제와 메탄을 반응시키는 단계는 10℃ 내지 40℃의 온도 범위, 바람직하게는 15℃ 내지 35℃의 온도 범위에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 또한 상기 반응시키는 단계는 pH 4 내지 pH 10의 범위, 바람직하게는 pH 7 내지 pH 9의 범위에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 상기 온도 및 pH의 범위에서 수행하는 경우, 본 발명의 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 활성이 최대가 됨으로써 메탄올을 더욱 효율적으로 생산해 낼 수 있다.

4. 인 비보( in vivo )에서의 메탄올 생산 방법

본 발명의 다른 측면은 인 비보(in vivo)에서의 메탄올 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 인 비보(in vivo)에서의 메탄올 생산 방법은 상기 상기 “2. 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 발현 벡터 및 형질전환체 ” 항목에서 설명한 형질전환체를 메탄의 존재 하에서 배양하는 단계 및 상기 배양된 배양물에서 메탄올을 분리하는 단계를 포함한다.

상기 형질전환체에서는 본 발명의 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제가 발현되기 때문에, 이를 이용하면 메탄을 기질로 포함하는 배양 배지에서 배양시킴으로써, 효소를 분리하는 별도의 과정 없이도 메탄올을 생산할 수 있다.

상기 형질전환체의 배양은 본 기술 분야에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 형질전환체의 종류에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용 할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식, 유가식, 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있다.

상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.

상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에 탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 글루코스를 탄 소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같 은 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소 칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다.

또한 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.

5. 가용성 메탄 모노옥시게나아제 의 활성이 향상된 변이체의 스크리닝용 센서 세포 및 이를 이용한 스크리닝 방법

본 발명의 다른 측면은 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 효소 활성이 향상된 변이체를 스크리닝해 낼 수 있는 센서 세포와 이를 이용한 신규의 가용성 메탄 모노옥시게나아제 변이체를 스크리닝해 내는 방법을 제공한다.

<센서 세포>

본 발명의 상기 센서 세포는 페놀계 화합물을 감지해 낼 수 있는 GESS 유전자 회로;와 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 구성하는 6개의 서브유닛들 중 일부 서브유닛들을 암호화하는 유전자들을 포함하는 제3 유전자 컨스트럭트;를 포함한다.

상기 센서 세포는 상기 GESS 유전자 회로와 상기 제3 유전자 컨스트럭트가 숙주 세포에 형질전환되어 도입된 것일 수 있고, 이때 상기 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 생물 세포일 수 있는데, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주가 이용될 수 있다. 예를 들어, E. coli, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주세포들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 생쥐 세포같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포, 및 조직배양된 인간 세포 등이 이용될 수 있다.

상기 페놀계 화합물을 감지해 낼 수 있는 GESS 유전자 회로는 한국 공개특허공보 제2010-0131955호에 개시되어 있는 GESS 유전자 회로이다. 따라서 상기 GESS 유전자 회로에 대해서는 한국 공개특허공보 제2010-0131955호의 내용을 원용하여 간략하게만 설명하도록 한다.

상기 GESS 유전자 회로는 ⅰ) 페놀계 화합물을 인지하는 dmpR 유전자, 및 상기 dmpR 유전자와 상호 작동가능하게 연결되어 상기 dmpR 유전자의 발현을 조절하는 제1 프로모터를 포함하는 제1 유전자 컨스트럭트; 및 ⅱ) 형광 단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 리포터 유전자, 및 상기 리포터 유전자와 상호 작동가능하게 연결되어, 페놀계 화합물을 인지한 dmpR 단백질이 결합하면 상기 리포터 유전자의 발현을 유도하는 제2 프로모터를 포함하는 제2 유전자 컨스트럭트;를 포함한다.

상기 제1 유전자 컨스트럭트는 dmpR 단백질을 발현시키기 위한 것으로서, 상기 dmpR 단백질을 암호화하는 dmpR 유전자와 상기 dmpR 유전자의 발현을 조절하는 '프로모터'를 포함한다. 따라서 상기 제1 유전자 컨스트럭트 내에서 상기 dmpR 유전자와 상기 프로모터는 상호 작동가능하게 연결되어 있는 것이 바람직하다. 상기 dmpR은 페놀, 자일렌, 톨루엔, 벤젠 등 방향족 유기 화합물의 분해활성을 나타내는 dmp 오페론 유전자의 σ⁵⁴-의존성 전사활성조절부분이다. Pseudomonas putida 유래 dmp 오페론은 15개의 유전자로 구성되어 있으며, 이 중에서 dmpKLMNOP는 페놀 수산화(phenol hydroxylation)에 필요한 효소들을 코드하고, dmpQBCDEFGHI는 카테콜(catechol) 중간물질을 분해하는 메타(meta) 분해경로의 효소들을 코드한다. dmpKLMNOP 오페론의 발현은 σ-⁵⁴ 의존성 전사조절인자인 dmpR이 dmpK 상위의 dmp 오퍼레이터에 결합하여 활성화되며, dmpR 자체에 대한 전사조절인자는 σ⁷⁰-의존성으로 알려져 있다. 상기 제1 유전자 컨스트럭트 내에 포함된 프로모터는 상기 dmpR 단백질을 암호화하고 있는 dmpR 유전자의 발현을 발현시킬 수 있는 것이면 당업계에 널리 알려져 있는 것들이 제한 없이 이용될 수 있다. 예를 들면, 슈도모나스(Pseudomonas)의 dmpR 또는 dmp 오페론의 프로모터나 일반 단백질 발현용 프로모터가 사용될 수 있으며, 외래 단백질의 고발현용으로 trc, T7, lac, ara 프로모터를 비롯한 고발현 프로모터가 사용될 수 있고, 특히, 유도물질(inducer)이 필요 없는 항시 고발현 벡터인 P_hce가 사용될 수 있다.

상기 제2 유전자 컨스트럭트는 페놀계 화합물의 존부에 따라 상기 제1 유전자 컨스트럭트에 의해 발현되는 dmpR 단백질에 의해 리포터 단백질을 발현시키기 위한 것으로서, 상기 리포터 단백질을 암호화하는 '리포터 유전자'와 상기 리포터 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함한다. 따라서 상기 제2 유전자 컨스트럭트 내에서 상기 리포터 유전자와 상기 프로모터는 상호 작동가능하게 연결되어 있는 것이 바람직하다. 상기 제2 유전자 컨스트럭트 내에 포함된 프로모터는 리포터 단백질의 발현을 조절하는 프로모터로는 E. coli의 σ⁵⁴-의존성 프로모터(promoter)가 사용될 수 있다. 또한, 상기 제1 유전자 컨스트럭트에서 발현된 dmpR 단백질은 OpR(Operator for Reporter) 부위에 결합하여 하류의 리포터 유전자의 발현을 조절하는 프로모터를 작동시키고, 이러한 dmpR 단백질이 결합하는 결합 부위는 당분야의 전문가에게 자명하다. 또한, 상기 리포터 유전자는 형광 단백질을 암호화하는 유전자 또는 항생제 저항성 유전자로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 형광 단백질을 암호화하는 유전자나 항생제 저항성 유전자는 당업계에 널리 알려져 있는 것들이 제한 없이 이용될 수 있다. 예를 들어, 상기 형광 단백질을 암호화하는 유전자로는 GFP, GFPUV, 또는 RFP 등이 이용할 수 있고, 상기 항생제 저항성 유전자로는 카나마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린 등 항생제에 저항성인 유전자 등 통상의 항생제 저항성 유전자를 이용할 수 있다. 상기 제2 유전자 컨스트럭트에는 상기 리포터 유전자 발현을 용이하게 하기 위하여 필요에 따라 RBS(Ribosome Binding Site)나 전사종결인자가 포함될 수 있다.

상기와 같이 GESS 유전자 회로를 구성하는 제1 및 제2 유전자 컨스트럭트는 벡터에 포함된 형태로 제공되거나 또는 숙주 세포의 염색체에 삽입(통합)되어 있는 형태로 제공될 수도 있다. 상기 제1 및 제2 유전자 컨스트럭트가 벡터에 포함된 형태로 제공되는 경우, 상기 제1 유전자 컨스트럭트와 상기 제2 유전자 컨스트럭트가 각각 서로 다른 벡터에 포함되어 제공될 수도 있고, 상기 두 유전자 컨스트럭트가 하나의 벡터에 포함되어 제공될 수도 있다. 다시 말해서, 상기 제1 유전자 컨스트럭트가 클로닝된 벡터와 상기 제2 유전자 컨스트럭트가 클로닝된 벡터가 각각 독립적으로 제공될 수도 있고, 상기 제1 유전자 컨스트럭트와 상기 제2 유전자 컨스트럭트가 함께 클로닝된 하나의 벡터로 제공될 수도 있는 것이다.

상기와 같은 GESS 유전자 회로와 함께, 본 발명의 센서 세포는 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 구성하는 6개의 서브유닛들 중 일부 서브유닛들을 암호화하는 유전자들을 포함하는 제3 유전자 컨스트럭트를 더 포함한다.

상기 가용성 메탄 모노옥시게나아제는 6개의 서브유닛 - α 서브유닛, β 서브유닛, B 서브유닛, γ 서브유닛, D 서브유닛 및 R 서브유닛으로 구성되는데, 상기 α 서브유닛은 서열번호 2의 염기서열을 갖는 mmoX 유전자에 의해 암호화될 수 있고, 상기 β 서브유닛은 서열번호 3의 염기서열을 갖는 mmoY 유전자에 의해 암호화될 수 있고, 상기 B 서브유닛은 서열번호 4의 염기서열을 갖는 mmoB 유전자에 의해 암호화될 수 있고, 상기 γ 서브유닛은 서열번호 5의 염기서열을 갖는 mmoZ 유전자에 의해 암호화될 수 있고, 상기 D 서브유닛은 서열번호 6의 염기서열을 갖는 mmoD 유전자에 의해 암호화될 수 있으며, 상기 R 서브유닛은 서열번호 7의 염기서열을 갖는 mmoC 유전자에 의해 암호화될 수 있다.

그런데, 본 발명의 센서 세포에 포함되는 상기 제3 유전자 컨스트럭트에는 상기와 같은 6개의 서브유닛 중 1개 이상 5개 이하의 서브유닛들을 암호화하는 유전자들이 포함되고, 바람직하게는 상기와 같은 6개의 서브유닛 중 3개 이상 5개 이하, 더욱 바람직하게는 상기와 같은 6개의 서브유닛 중 4개 이상 5개 이하, 가장 바람직하게는 상기와 같은 6개의 서브유닛 중 5개의 서브유닛들을 암호화하는 유전자들이 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 β 서브유닛을 암호화하는 mmoY 유전자를 제외한 나머지 5개의 유전자들, 즉 α 서브유닛을 암호화하는 서열번호 2의 mmoX 유전자, B 서브유닛을 암호화하는 서열번호 4의 mmoB 유전자, γ 서브유닛을 암호화하는 서열번호 5의 mmoZ 유전자, D 서브유닛을 암호화하는 서열번호 6의 mmoD 유전자, 및 R 서브유닛을 암호화하는 서열번호 7의 mmoC 유전자를 포함하도록 제3 유전자 컨스트럭트(pACBB-mmoXBZDC 벡터)를 구성하여 이용하였다.

상기와 같은 제3 유전자 컨스트럭트 역시 벡터에 포함된 형태로 제공되거나 또는 숙주 세포의 염색체에 삽입(통합)되어 있는 형태로 제공될 수도 있다. 상기 제3 유전자 컨스트럭트가 벡터에 포함된 형태로 제공되는 경우, 상기 제3 유전자 컨스트럭트는 상기 GESS 유전자 회로를 구성하는 제1 유전자 컨스트럭트 또는 제2 유전자 컨스트럭트와 각각 서로 다른 벡터에 포함되어 제공될 수도 있고, 상기 두 유전자 컨스트럭트와 함께 하나의 벡터에 포함되어 제공될 수도 있다.

<스크리닝 방법>

상기와 같이 구성되는 센서 세포는 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 효소 활성이 향상된 신규의 변이체를 스크리닝해 내는데 이용될 수 있다.

본 발명의 신규 메탄 모노옥시게나아제 변이체의 스크리닝 방법은, 상기 센서 세포에 상기 제3 유전자 컨스트럭트에 포함되지 않은 나머지 서브유닛들의 돌연변이 유전자 라이브러리를 포함하는 제4 유전자 컨스트럭트를 도입하는 단계; 상기 제4 유전자 컨스트럭트가 도입된 센서 세포를 벤젠이 존재하는 환경에서 배양하는 단계; 및 상기 센서 세포에서 리포터 유전자의 발현을 감지하는 단계;를 포함한다.

먼저, 상기와 같이 구성되는 센서 세포에, 상기 가용성 메탄 모노옥시게나아제는 6개의 서브유닛들 중, 상기 제3 유전자 컨스트럭트에 포함되지 않은 나머지 서브유닛들의 돌연변이 유전자 라이브러리를 포함하는 제4 유전자 컨스트럭트가 도입된다.

상기 제3 유전자 컨스트럭트에 포함되지 않은 나머지 서브유닛들의 돌연변이 유전자는 야생형 서브유닛의 유전자의 염기 서열에 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 따른 변이가 유도된 것일 수 있다. 상기와 같은 돌연변이 유전자의 라이브러리는 실수-유발 PCR(error-prone PCR) 등과 같이 유전자의 돌연변이를 유발할 수 있는 통상의 방법에 의해 제조될 수 있다.

상기와 같이 제3 유전자 라이브러리에 포함되지 않은 나머지 서브유닛들의 돌연변이 유전자 라이브러리를 포함하는 제4 유전자 컨스트럭트는 벡터의 형태로 제공될 수 있다. 이때 상기 제4 유전자 컨스트럭트는 상기 제3 유전자 컨스트럭트와 별도의 벡터로 제공될 수도 있고, 상기 제3 유전자 컨스트럭트와 하나의 벡터에 포함된 형태로 제공될 수도 있다.

상기 센서 세포 내에 존재하는 제3 유전자 컨스트럭트의 경우에는 일부 서브유닛들이 제외되어 있어서 그 자체의 발현만으로는 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 온전히 구성할 수 없으나, 상기와 같이 도입된 제4 유전자 컨스트럭트에 의하여 상기 제3 유전자 컨스트럭트에 포함되지 않은 서브유닛들의 돌연변이체가 발현됨으로써 상기 제3 유전자 컨스트럭트에 의해 발현되는 서브유닛들과 함께 온전한 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 구성할 수 있게 된다. 상기와 같이 구성되는 가용성 메탄 모노옥시게나아제는 제4 유전자 컨스트럭트에 의해 발현되는 일부 서브유닛들의 돌연변이체가 포함되어 있으므로, 상기 제3 및 제4 유전자 컨스트럭트에 의해 발현 및 구성되는 가용성 메탄 모노옥시게나아제는 야생형 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 신규한 변이체에 해당한다.

다음으로, 상기와 같이 제4 유전자 컨스트럭트가 도입된 센서 세포를 벤젠이 존재하는 환경에서 배양한다.

상기와 같이 제3 및 제4 유전자 컨스트럭트에 의해 발현 및 구성되는 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 변이체들 중에서 메탄 모노옥시게나아제 활성을 갖는 변이체는 벤젠이 존재하는 환경에서 상기 벤젠을 산화시켜 페놀을 생성할 수 있다. 상기와 같이 생성된 페놀은 상기 GESS 유전자 회로의 제1 유전자 컨스트럭트에 의해 발현된 dmpR 단백질을 활성화시키고, 이렇게 활성화된 dmpR 단백질은 제2 유전자 컨스트럭트에 존재하는 OpR(Operator for Reporter) 부위에 결합하여 제2 프로모터를 작동시키고 그 하류의 하류의 리포터 유전자의 발현을 유도한다.

한편, 상기와 같이 제4 유전자 컨스트럭트가 도입된 센서 세포를 벤젠이 존재하는 환경에서 배양하기에 앞서, 상기 제4 유전자 컨스트럭트가 도입된 센서 세포를 밴젠이 존재하지 않는 환경에서 일정 시간 이상 배양하는 단계를 거치는 것이 바람직하다.

이는 제3 및 제4 유전자 컨스트럭트에 의해 암호화되는 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 서브유닛들이 충분히 발현될 수 있도록 하기 위한 것으로, 6시간 이상, 바람직하게는 10시간 이상, 가장 바람직하게는 16시간 이상 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 대장균 등의 숙주세포에서 이종 발현되는 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 서브유닛들의 용해도(solubility)를 높이기 위하여 센서 세포를 15 내지 25℃의 온도에서 배양할 수 있다. 이와 같은 온도 범위에서 배양하는 경우 정확한 접힘(folding)이 일어나 생성된 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 용해도가 향상될 수 있다.

또한, 센서 세포의 배양은 센서 세포의 생육에 필요한 최소한의 성분만을 함유하는 최소배지에서 이루어질 수 있다. 상기 최소배지로는 예를 들어 EZ 배지, M9 배지 등이 이용될 수 있다. 이와 같이 최소 배지를 이용하는 경우 비특이적 신호(noise)가 최소화되어 센서 세포를 통한 감지가 최적화될 수 있다.

그런 다음, 상기와 같이 제4 유전자 컨스트럭트가 도입된 센서 세포를 기질인 벤젠이 포함된 배지에서 반응을 유도한다. 상기 배지 역시 최소배지일 수 있고, 예를 들어 EZ 배지나 M9 배지 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

그런 다음, 상기와 같이 배양된 센서 세포에서 리포터 유전자의 발현을 감지하고, 그 중 리포터 유전자의 발현이 높은 센서 세포를 선별한다.

상기와 같은 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 변이체들 중, 메탄 모노옥시게나아제 효소로서의 활성이 우수한 것은 보다 빠른 속도로 다량의 페놀을 생성할 것이므로, 그에 따른 리포터 유전자의 발현 역시 더욱 향상된다. 따라서 리포터 유전자의 발현을 감지하고, 리포터 유전자의 발현이 특이적으로 높은 센서 세포를 선별하여, 그 센서 세포에서 발현되는 변이체를 확인함으로써, 효소 활성이 향상된 신규의 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 변이체를 발굴할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 β 서브유닛을 암호화하는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 mmoY 유전자를 대상으로 실수-유발 PCR을 실시하여 mmoY 유전자의 돌연변이 유전자 라이브러리를 생성하였고, 이를 포함하는 제4 유전자 컨스트럭트를 본 발명의 센서 세포에 도입하고 벤젠이 공급되는 환경에서 배양한 다음, 형광 단백질의 활성이 높은 세포를 선별함으로써, 본 발명의 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 스크리닝해 내었다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되지 아니한다.

가용성 메탄 모노옥시게나아제의 재조합 발현 벡터의 제작

[1-1] 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 개별 서브유닛의 클로닝

가용성 메탄 모노옥시게나아제를 구성하는 6개의 서브유닛에 대하여, 이들 각각을 암호화하는 유전자의 염기 서열을 ㈜ 바이오니아에 의뢰하여 코돈을 최적화하여 합성하였다. 그 결과 얻어진 6개의 염기서열, 즉 mmoX를 암호화하는 서열번호 2의 염기서열, mmoY를 암호화하는 서열번호 3의 염기서열, mmoB를 암호화하는 서열번호 4의 염기서열, mmoZ를 암호화하는 서열번호 5의 염기서열, mmoD를 암호화하는 서열번호 6의 염기서열, 그리고 mmoC를 암호화하는 서열번호 7의 염기서열에 대하여, 이들 각각을 주형으로 항시 발현 프로모터 및　pUC ori가 존재하는 pUCBB벡터(Addgene, 미국)에 클로닝하기 위하여 하기 표 1과 같이 서열번호 8 내지 서열번호 19의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 또한, pUCBB(Addgene, 미국) 벡터를 주형으로 하기 표 2와 같이 서열번호 20 내지 서열번호 31의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다.

증폭 대상 유전자	방향	서열(5'->3')	서열번호
mmoX	정방향	GTCTAGTAGAAGGAGGAGATCTGGATCCATATGGCAATTTCCCTGGCAACTAAAGCAGCC	8
	역방향	TGCTCGAGGCGGCCGCCATGGATGCATTCATCAAAACTTTGCCAGCGGATCGGGAAAAAC	9
mmoY	정방향	GTCTAGTAGAAGGAGGAGATCTGGATCCATATGTCACAGCCGCAATCATCTCAGGTCACG	10
	역방향	TGCTCGAGGCGGCCGCCATGGATGCATTCATCAATTCTTATACCCTGCTAACACTGCGTC	11
mmoB	정방향	GTCTAGTAGAAGGAGGAGATCTGGATCCATATGTCCTCTGCGCATAATGCGTATAATGCG	12
	역방향	TGCTCGAGGCGGCCGCCATGGATGCATTCATCAGATGTCGGTTAAGGCGCGATCCAGCCC	13
mmoZ	정방향	TGCTCGAGGCGGCCGCCATGGATGCATTCATCAGATGTCGGTTAAGGCGCGATCCAGCCC	14
	역방향	TGCTCGAGGCGGCCGCCATGGATGCATTCATCATGCCTGCAGGTGCAAGACTTTCACGCC	15
mmoD	정방향	GTCTAGTAGAAGGAGGAGATCTGGATCCATATGGACCAACAAACTGCTCATGAAGTCCGT	16
	역방향	TGCTCGAGGCGGCCGCCATGGATGCATTCATCAAATATCACGTTCTCCACGACGTTCTCT	17
mmoC	정방향	GTCTAGTAGAAGGAGGAGATCTGGATCCATATGTACCAGATCGTTATTGAAACGGAAGAT	18
	역방향	TGATGCTCGAGGCGGCCGCCATGGATGCATTCAACCACTTGCCAGGAATTTTTCTAAGAA	19

증폭 대상 유전자	방향	서열(5'->3')	서열번호
pUCBB (mmox)	정방향	GTTTTTCCCGATCCGCTGGCAAAGTTTTGATGAATGCATCCATGGCGGCCGCCTCGAGCA	20
	역방향	GGCTGCTTTAGTTGCCAGGGAAATTGCCATATGGATCCAGATCTCCTCCTTCTACTAGAC	21
pUCBB (mmoy)	정방향	GACGCAGTGTTAGCAGGGTATAAGAATTGATGAATGCATCCATGGCGGCCGCCTCGAGCA	22
	역방향	CGTGACCTGAGATGATTGCGGCTGTGACATATGGATCCAGATCTCCTCCTTCTACTAGAC	23
pUCBB (mmob)	정방향	GGGCTGGATCGCGCCTTAACCGACATCTGATGAATGCATCCATGGCGGCCGCCTCGAGCA	24
	역방향	CGCATTATACGCATTATGCGCAGAGGACATATGGATCCAGATCTCCTCCTTCTACTAGAC	25
pUCBB (mmoz)	정방향	GGCGTGAAAGTCTTGCACCTGCAGGCATGATGAATGCATCCATGGCGGCCGCCTCGAGCA	26
	역방향	ATTATCATGAATCGGCTCTCTCTTAGCCATATGGATCCAGATCTCCTCCTTCTACTAGAC	27
pUCBB (mmod)	정방향	AGAGAACGTCGTGGAGAACGTGATATTTGATGAATGCATCCATGGCGGCCGCCTCGAGCA	28
	역방향	ACGGACTTCATGAGCAGTTTGTTGGTCCATATGGATCCAGATCTCCTCCTTCTACTAGAC	29
pUCBB (mmoc)	정방향	ACGGACTTCATGAGCAGTTTGTTGGTCCATATGGATCCAGATCTCCTCCTTCTACTAGAC	30
	역방향	ATCTTCCGTTTCAATAACGATCTGGTACATATGGATCCAGATCTCCTCCTTCTACTAGAC	31

상기와 같이 얻어진 각각의 PCR 산물들을 깁슨-어셈블리 키트(NEB, 영국)를 이용하여 pUCBB 벡터와 라이게이션하고, 이렇게 얻어진 각각의 벡터를 pUCBB-mmoX, pUCBB-mmoY, pUCBB-mmoB, pUCBB-mmoZ, pUCBB-mmoD 및 pUCBB-mmoC라 명명하였다.

[1-2] mmoY 유전자를 제외한, 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 나머지 서브유닛이 모두 클로닝된 재조합 벡터 제작

상기 실시예 [1-1]에서 제작한 6개의 벡터들 중에서, pUCBB-mmoX, pUCBB-mmoB, pUCBB-mmoD는 제한효소 EcoRI(NEB, 영국)과 SpeI를 이용하여 37℃에서 2시간 동안 반응시키고, 아가로스겔 전기영동법을 이용하여 분리 및 정제하여 서열번호 2 내지 서열번호 4 내지 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 각각의 단편을 얻었고, pUCBB-mmoZ 및 pUCBB-mmoC는 제한효소 EcoRI과 XbaI을 이용하여 서열번호 5 또는 서열번호 7의 염기서열과 pUCBB 벡터 백본을 포함하는 단편을 얻었다. 그런 다음, T4 DNA 라이게이즈(ligase)(NEB, 영국)를 통해 상온에서 1시간 동안 mmoB 단편과 pUCBB-mmoZ 단편을 라이게이션하여 mmoB와 mmoZ가 순서대로 삽입된 벡터 pUCBB-mmoBZ 벡터를 얻었다. 또한 상기와 같은 방식으로 mmoD 단편과 pUCBB-mmoC 단편을 라이게이션 하여 pUCBB-mmoDC 벡터를 얻었다. 그런 다음, 상기 pUCBB-mmoBZ 벡터와 pUCBB-mmoDC 벡터를 각각 DH5α 대장균 균주에 형질전환하여 pUCBB-mmoBZ 벡터와 pUCBB-mmoDC 벡터를 증폭하였다. 상기와 같이 증폭된 벡터들을 QiAquick PCR purification kit(Qiagen, 독일)로 정제하고, 이후 pUCBB-mmoBZ는 제한효소 EcoRI과 SpeI를 이용하여, 그리고 pUCBB-mmoDC는 제한효소 EcoRI과 XbaI을 이용하여 각각 절단하였다. 그런 다음, 절단된 mmoBZ 단편을 pUCBB-mmoDC에 라이게이션하여, mmoB, mmoZ, mmoD 및 mmoC가 순차적으로 삽입된 pUCBB-mmoBZDC 벡터를 구축하였고, 상기 pUCBB-mmoBZDC 벡터를 EcoRI과 XbaI로 이용하여 절단하여 얻어진 pUCBB-mmoBZDC 단편을 mmoX에 라이게이션하여 최종적으로 mmoY를 제외한 위 5개의 서브유닛을 암호화하는 유전자 모두가 mmoX, mmoB, mmoZ, mmoD 및 mmoC의 순서로 하나의 벡터 내에 삽입된, pUCBB-mmoXBZDC 벡터를 얻었다.

상기와 같이 얻어진 pUCBB-mmoXBZDC 벡터에서 제한효소 EcoRI과 SpeI를 이용하여 상기 5개의 서브유닛을 암호화하는 유전자가 모두 포함된 단편을 절단해 내고, 이를 다시 제한효소 EcoRI과 SpeI로 절단된 pACBB 벡터(Addgene, 미국)에 삽입하여, 최종적으로 도 1과 같은 맵을 갖는 pACBB-mmoXBZDC 벡터를 제작하였다.

mmoY 유전자의 돌연변이 라이브러리 제작

[2-1] mmoY 유전자의 돌연변이 유도

상기 실시예 [1-1]에서 제작한 pUCBB-mmoY 벡터를 주형으로, 하기 표 3의 서열번호 32, 33의 프라이머 쌍을 이용하여, Diversify PCR Random mutagenesis 키트(clontech, 미국)로 에러-프론 PCR(Error-Prone PCR)을 수행하였다. 상기와 같은 에러-프론 PCR은 1kb 당 2.3bp 또는 4.6bp의 비율로 돌연변이가 유발될 수 있는 조건으로 수행하였다.

주형	프라이머 서열(5' -> 3')	서열번호
mmoY	GTCTAGTAGAAGGAGGAG	32
	GGCAGGGTGGTGACAC	33

[2-2] pUCBB 벡터 백본의 증폭

또한, 상기 실시예 [1-2]에서 제작한 pUCBB-mmoXBZDC 벡터를 주형으로, 하기 표 4의 서열번호 34, 35의 프라이머 쌍과 Q5 DNA 폴리머라아제(NEB, 영국)를 이용하여 PCR을 수행하여 pUCBB 벡터 백본을 증폭하였다. 상기 PCR은 98℃에서 2분간 전변성(pre-denaturation)시키고 98℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 90초의 세 단계를 25회 반복하여 반응시키고, 마지막으로 72℃에서 5분간 더 반응시키는 조건으로 수행하였다.

주형	프라이머 서열(5' -> 3')	서열번호
pUCBB-mmoXBZDC	TGAATGCATCCATGGCG	34
	ATGGATCCAGATCTCCTC	35

[2-3] mmoY 유전자 돌연변이체의 클로닝

상기 실시예 [2-1]에서 얻어진 Error-Prone PCR의 산물(mmoY 유전자의 돌연변이체)에 1 ㎕의 제한효소 DpnI을 처리하여 37℃에서 3시간 동안 반응시키고, 그 반응물을 1.5%(w/v)의 아가로오스 겔에 로딩하여 전기영동한 뒤, 약 1.2kb에 해당하는 산물을 정제하였다.

그리고 상기 실시예 [2-2]에서 증폭된 pUCBB 벡터 백본 에 대해서도, 마찬가지로 제한효소 DpnI을 처리하고 그 반응물을 아가로오스 겔에 전기영동하여, 약 2.4kb에 해당하는 산물을 정제하였다.

상기와 같이 각각 정제된 두 종류의 산물들을 1:1의 몰비로 혼합하고, 상기 혼합물에 동량의 깁슨-어셈블리 키트를 넣고, 37℃에서 10분 동안 반응시킨 후, 다시 50℃에서 3시간 동안 반응시킴으로써, 상기 pUCBB 벡터에 상기 실시예 [2-1]에서 얻어진 mmoY 유전자의 변이체인 mmoY'들이 삽입된 pUCBB-mmoY' 라이브러리 벡터를 제작하였다.

상기와 같이 제작된 pUCBB-mmoY' 라이브러리 벡터를, QiAquick PCR purification kit로 정제하고, 이를 전기천공법으로 대장균에 도입하여 최종적으로 도 2와 같은 맵을 갖는 약 6×10⁶개의 mmoY 유전자의 돌연변이 라이브러리를 확보하였다.

GESS 유전자 회로에 기반한 메탄 모노옥시게나아제 활성의 검증 가부 확인

상기 실시예 2에서 확보된 mmoY 유전자의 돌연변이 라이브러리에서 높은 메탄 모노옥시게나아제 활성을 나타내는 돌연변이체를 스크리닝하기에 앞서, 한국 공개특허공보 제2010-0131955호에 개시되어 있는 GESS 유전자 회로가 포함된 대장균을 센서 세포(이하 'GESS 세포'라고 한다)를 이용하여 메탄 모노옥시게나아제 효소의 활성을 측정하는데 적용될 수 있는지 여부를 검증하였다(도 3).

[3-1] NMS(nitrate mineral salt) 배지에서 GESS 세포의 작동 여부 확인

먼저, 상기와 같은 대장균을 숙주세포로 하는 GESS 세포가, 메탄자화균이 배양되는 환경인 NMS 배지에서도 유효하게 작동될 수 있는지 확인하였다.

세포 간의 성장 속도 차이로 인하여 발생할 수 있는 효소 활성의 오차를 제거하기 위하여, 상기 GESS 세포를 LB 배지에서 OD₆₀₀ 값이 1.5~4가 될 때까지 37℃의 진탕배양하였다. 상기와 같이 진탕배양한 GESS 세포를 회수한 다음, 이를 0μM, 10μM 또는 100μM 함량의 페놀이 포함된 NMS 배지 및 M9 배지에서 37℃의 온도로 6시간 동안 배양한 뒤, 각각의 배지에서 형광신호를 측정하여, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 페놀이 첨가되지 않은 경우에 비해, 페놀이 첨가된 각각의 배지에서 형광신호가 훨씬 증가되는 것으로 확인되었고, 다만 이러한 형광신호는 페놀 10μM 함량에서 포화되는 것으로 확인되었다.

상기와 같은 결과로부터, GESS 세포가 메탄자화균이 배양되는 NMS 배지에서도 유효하게 작동됨을 알 수 있다.

[3-2] GESS 세포의, 메탄자화균 내 가용성 메탄 모노옥시게나아제 발현 의존적 페놀 감지 여부 확인

야생형 M. 트리코스포리움 OB3b(M. trichosporium OB3b) 균주를 최적화된 조건(NMS 배지, 30℃, 공기:메탄=7:3)에서 7일 동안 배양하였다. 이때, 상기 야생형 M. 트리코스포리움 OB3b 균주에서 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 발현을 조절하기 위하여, 상기 야생형 M. 트리코스포리움 OB3b 균주를 3개의 군으로 나누어, 상기 가용성 메탄 모노옥시게나아제가 잘 발현되도록 구리 이온(Cu2⁺)이 첨가되지 않은 NMS 배지와, 상기 가용성 메탄 모노옥시게나아제가 잘 발현되지 않도록 10μM의 구리 이온과 20μM의 구리 이온이 첨가된 NMS 배지에서 각각 배양하였다. 상기와 같이 배양된 3개 군의 배양액에, 각각 1mM의 벤젠이나 10μM의 페놀을 첨가하고, 6시간 또는 24시간 동안 더 배양한 다음, 상기 배양액을 상온에서 1000rcf로 20분 동안 원심분리하여 상등액만을 분리하였다.

상기와 같이 분리된 상등액을 준비된 GESS 세포와 혼합한 다음, 37℃의 온도로 5시간 동안 배양한 뒤, 각각의 배지에서 형광신호를 측정하여, 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.

동시에, GESS 세포를 1mM의 벤젠이나 10μM의 페놀이 첨가된 NMS 배지에 혼합하고, 역시 37℃의 온도로 5시간 동안 배양한 뒤, 각각의 배지에서 형광신호를 측정하여, 그 결과를 도 4 및 도 5에 함께 나타내었다.

그 결과, 도 4 및 도 5에서 보는 바와 같이, 양성대조군인 10㎕의 페놀이 첨가된 배양액의 경우에는 구리 이온의 첨가 여부에 상관 없이 모두 높은 형광신호가 발생되었다. 그에 반해, 실험군인 1mM의 벤젠이 첨가된 배양액의 경우에는, 구리 이온의 첨가 여부에 따라 형광신호 값이 현저히 차이(10배 이상)가 나는 것으로 확인되었다.

상기와 같은 결과로부터, GESS 세포가 메탄자화균에서 가용성 메탄 모노옥시게나아제가 발현되는 경우에만 유효하게 벤젠의 전환을 감지해 낼 수 있음을 알 수 있다.

[3-3] 메탄자화균 배양액 내에 페놀의 존재 여부 확인

상기 [3-2]에서 분리해 낸 야생형 M. 트리코스포리움 OB3b 배양액의 상등액에 대하여, 3배 부피의 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 첨가하고 1분 이상 교반한 다음, 상층액인 에틸 아세테이트 층을 분리 및 제거하고, 나머지를 100㎕의 PBS 완충용액으로 용해시킨 다음, UV 검출기(245 nm) 및 C18(Agilent) 칼럼이 장착된 고압 액체 크로마토그래피로 분석하였다. 이때, 상기 C18(Agilent) 칼럼은 25℃에서 30% 아세토니트릴(acetonitrile)이 1㎖/min로 통과되도록 조정하였고, 스탠다드 물질로 5μM, 10μM, 25μM 및 50μM의 농도의 페놀을 상기 컬럼에 주입하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

그 결과, 도 6에 도시된 바와 같이, 기질을 전혀 첨가하지 않은 배양액 내에서는 페놀이 전혀 검출되지 않은 반면, 벤젠이나 페놀을 첨가한 배양액에서는 페놀이 검출되는 것으로 확인되었다. 특히, 벤젠만을 첨가한 배양액에서도 페놀이 검출된 결과로부터, 상기와 같은 GESS 세포가 메탄자화균이 벤젠을 대사하여 생성한 페놀까지도 유효하게 검출해 낼 수 있음을 알 수 있다.

고활성 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 스크리닝

상기 실시예 3에서 유효성이 검증된 GESS 세포에 상기 실시예 [1-2]에서 분리 및 정제해 낸 pACBB-mmoXBZDC 벡터를 도입하여 센서 세포를 확보하였다. 그런 다음, 상기 실시예 [2-3]에서 제작한 mmoY 유전자의 돌연변이 라이브러리인 pUCBB-mmoY'벡터를 상기 센서 세포에 도입하였다.

상기와 같이 pUCBB-mmoY' 라이브러리 벡터와 pACBB-mmoXBZDC 도입된 GESS 세포를, 0.4%의 포도당이 첨가된 EZ 배지에서 37℃의 온도로 15시간 동안 전배양한 다음, 이를 다시 EZ 배지에 1%의 농도로 접종하여 37℃의 온도에서 OD₆₀₀ 값이 0.4가 될 때까지 배양한 후, 20℃의 온도에서 16시간 동안 더 배양하였다.

상기와 같이 배양된 배양액을 원심분리하여 GESS 세포를 회수하고, 0.1%의 아세테이트(acetate)가 첨가된 M9 배지에 현탁한 다음, 5시간 뒤에 벤젠을 첨가하여 페놀 생성 여부에 따른 형광신호를 유세포분석기로 분석하였다. 이때 음성 대조군에는 벤젠을 첨가하지 않았다.

상기 유세포분석기를 통하여 측정된 실험군의 형광 세기와 음성 대조군의 형광 세기를 비교하여, 실험군의 형광세기 상위 1%에 해당하는 세포 5만개를 분류하여 적절한 항생제가 포함된 1 ㎖의 LB 배지에 받은 뒤, 14 ㎖의 튜브로 옮겨 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 배양된 세포 10 μL 를 취해 항생제가 첨가된 1 ㎖의 EZ배지에 접종한 후 37℃에서 약 3시간 동안 배양하고, OD₆₀₀ 값이 약 0.4가 된 시점부터 20℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이렇게 배양된 세포를 원심분리기로 회수하여, 제1 라운드의 세포들을 얻었다.

상기와 같이 얻어진 제1 라운드의 세포들을 다시 한번 상기와 같이 M9 배지에서 벤젠 전환 반응을 수행한 뒤, 세포를 유세포분석기를 이용하여 대조군과 비교하여 높은 형광 세기를 나타내는 상위 1%의 제2 라운드의 세포들을 선별하였다. 그리고 상기 제2 라운드의 세포들을 선별한 방법과 동일한 방법으로 제3 라운드의 선별을 수행하여 세포 후보군을 강화(enrichment)시켰다.

도 9에 도시된 바와 같이, 제3 라운드의 세포들 중 대조군에 비해 벤젠을 넣은 실험군에서 형광 세기가 높아진 세포군이 존재하는 것을 확인하였고, 최종적으로 고활성의 가용성 메탄 모노옥시게나아제 활성을 가질 것으로 기대되는 3종의 형질전환체 1, 2, 3를 스크리닝해 내었다.

상기와 같이 스크리닝된 3종의 형질전환체를 야생형 가용성 메탄 모노옥시게나아제가 도입된 센서 세포와 비교해 본 결과, 도 8에 도시된 바와 같이, 야생형 가용성 메탄 모노옥시게나아제가 도입된 센서 세포에 비해 상기 스크리닝된 3종의 형질전환체의 경우에 벤젠을 넣은 뒤의 형광 세기가 훨씬 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

스크리닝된 형질전환체의 mmoY 유전자 돌연변이체의 서열 분석

상기 실시예 4에서 스크리닝된 3종의 형질전환체 1, 2 및 3로부터 mmoY 유전자 돌연변이체를 포함하는 재조합 발현 벡터를 추출 및 정제하고, 상기 재조합 발현 벡터에서 mmoY 유전자 돌연변이체의 서열을 분석하였다.

그 결과, 형질전환체 1의 mmoY 유전자 돌연변이체는, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 106번째 아르기닌 및 295번째 아르기닌은 시스테인으로 치환되고, 117번째 세린은 알라닌으로 치환되고, 258번째 트레오닌은 세린으로 치환되고, 308번째 아스파라긴은 티로신으로 치환되고, 340번째 글리신은 발린으로 치환되며, 344번째 내지 394번째 아미노산은 결실되어 있는 것으로 확인되었다.

또한, 형질전환체 2의 mmoY 유전자 돌연변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 104번째 프롤린이 트레오닌으로 치환되어 있고, 형질전환체 3의 mmoY 유전자 돌연변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 339번째 발린이 글루탐산으로 치환되어 있는 것으로 확인되었다.

mmoY 유전자 돌연변이체가 포함된 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 활성 확인

상기 실시예 4에서 스크리닝된 형질전환체 1, 2 및 3과 야생형 sMMO 형질전환체(대조군)을 각각 클로람페니콜과 엠피실린이 첨가된 LB 배지에 접종하고, 37℃에서 배양 하여 OD₆₀₀ 값이 0.5가 되었을 때 20℃에서 16시간 이상 진탕배양 하였다. 상기와 같이 발현이 유도된 각 형질전환체의 배양액들을 3000 rpm으로 4℃에서 30분동안 원심분리하고, pH 7.4 10mM PBS 완충용액(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na₂HPO₄, 1.8mM KH₂PO₄)으로 세척하였다. 세척된 상기 형질전환체에 MOPS 완충액(50mM MOPS, pH7.0)을 혼합한 뒤 초음파 파쇄기(sonicator)로 파쇄하여 형질전환체의 세포 용해물(cell crude lysate)을 수득하였다. 그런 다음, 20㎖의 밀폐된 병에 11㎎/㎖ 농도의 상기 세포 용해물 1㎖ 와 5mM의 NADH를 넣고, 20㎖의 메탄가스를 주입한 후, 37℃에서 200rpm의 교반속도로 16시간 이상 반응시켰다. 그런 다음, 상기 반응액에 최종 200mM HCl을 첨가하여 효소 활성을 정지시키고, 반응액을 원심분리하고, 상층액을 필터링하여 메탄올의 생성 여부를 확인하였다.

상기 메탄올의 생성 여부 확인은 DB-WAX 컬럼(agilent, 30m, 0.32mm, 0.50mm film thickness)가 장착된 가스크로마토그래피(Gas Chromatography, agilent 7890B)를 이용하여 수행하였다. 이때, 상기 가스 크로마토그래피의 조건은, 오븐 온도를 초기 40℃(7분), 200℃(분당 50℃ 승온), 230℃(1분), 인젝터(inject) 250℃ 및 FID분석기 250℃로 설정하였다.

그 결과, 도 11에서 보는 바와 같이, 야생형 가용성 메탄 모노옥시게나아제가 도입된 대장균 형질전환체의 세포 용해물에 비하여, 형질전환체 1, 2 및 3의 세포 용해물에서 메탄올이 훨씬 높은 수준으로 생성됨을 확인하였다.

이상에서 본 발명은 기재된 실시예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 청구범위에 속함은 당연한 것이다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> A Novel Soluble Methane Monooxygenase Identified By High-Throughput Enzyme Screening System <130> 2018-DPA-2584 <160> 48 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 394 <212> PRT <213> Methylosinus trichosporium <400> 1 Met Ser Gln Pro Gln Ser Ser Gln Val Thr Lys Arg Gly Leu Thr Asp 1 5 10 15 Pro Glu Arg Ala Ala Ile Ile Ala Ala Ala Val Pro Asp His Ala Leu 20 25 30 Asp Thr Gln Arg Lys Tyr His Tyr Phe Ile Gln Pro Arg Trp Lys Pro 35 40 45 Leu Ser Glu Tyr Glu Gln Leu Ser Cys Tyr Ala Gln Pro Asn Pro Asp 50 55 60 Trp Ile Ala Gly Gly Leu Asp Trp Gly Asp Trp Thr Gln Lys Phe His 65 70 75 80 Gly Gly Arg Pro Ser Trp Gly Asn Glu Ser Thr Glu Leu Arg Thr Thr 85 90 95 Asp Trp Tyr Arg His Arg Asp Pro Ala Arg Arg Trp His His Pro Tyr 100 105 110 Val Lys Asp Lys Ser Glu Glu Ala Arg Tyr Thr Gln Arg Phe Leu Ala 115 120 125 Ala Tyr Ser Ser Glu Gly Ser Ile Arg Thr Ile Asp Pro Tyr Trp Arg 130 135 140 Asp Glu Ile Leu Asn Lys Tyr Phe Gly Ala Leu Leu Tyr Ser Glu Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Phe Asn Ala His Ser Ser Val Gly Arg Asp Cys Leu Ser Asp 165 170 175 Thr Ile Arg Gln Thr Ala Val Phe Ala Ala Leu Asp Lys Val Asp Asn 180 185 190 Ala Gln Met Ile Gln Met Glu Arg Leu Phe Ile Ala Lys Leu Val Pro 195 200 205 Gly Phe Asp Ala Ser Thr Asp Val Pro Lys Lys Ile Trp Thr Thr Asp 210 215 220 Pro Ile Tyr Ser Gly Ala Arg Ala Thr Val Gln Glu Ile Trp Gln Gly 225 230 235 240 Val Gln Asp Trp Asn Glu Ile Leu Trp Ala Gly His Ala Val Met Ile 245 250 255 Ala Thr Phe Gly Gln Phe Ala Arg Arg Glu Phe Phe Gln Arg Leu Ala 260 265 270 Thr Val Tyr Gly Asp Thr Leu Thr Pro Phe Phe Thr Ala Gln Ser Gln 275 280 285 Thr Tyr Phe Gln Thr Thr Arg Gly Ala Ile Asp Asp Leu Phe Val Tyr 290 295 300 Cys Leu Ala Asn Asp Ser Glu Phe Gly Ala His Asn Arg Thr Phe Leu 305 310 315 320 Asn Ala Trp Thr Glu His Tyr Leu Ala Ser Ser Val Ala Ala Leu Lys 325 330 335 Asp Phe Val Gly Leu Tyr Ala Lys Val Glu Lys Ser Arg Ala Asp Arg 340 345 350 Ser Arg Arg Arg Leu Arg Gly Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ile Gly Arg 355 360 365 Ser Ile Thr Pro Asp Lys Ile Gly Phe Arg Val Asp Val Asp Gln Lys 370 375 380 Val Asp Ala Val Leu Ala Gly Tyr Lys Asn 385 390 <210> 2 <211> 1581 <212> DNA <213> Methylosinus trichosporium <400> 2 atggcaattt ccctggcaac taaagcagcc acggatgcac tgaaagtaaa tagagcaccg 60 gttggtgttg agccgcagga ggttcataaa tggctgcaga gttttaattg ggatttcaaa 120 gaaaatcgta cgaaatatcc gaccaaatat cacatggcca acgagaccaa ggaacagttc 180 aaggtgatcg caaaggagta tgcccgtatg gaagcagcaa aggatgaacg tcagtttgga 240 acccttctgg atggcttaac ccgcctgggt gcagggaata aggtgcatcc gcgttggggc 300 gaaacaatga aagttatttc caacttcttg gaggtaggtg agtacaatgc aattgccgca 360 agtgcaatgc tgtgggactc ggcaaccgca gcagaacaaa agaatgggta tctagcacaa 420 gttctggacg aaattcgtca tactcatcag tgcgcattta ttaatcatta ttatagcaaa 480 cactaccacg atcccgcagg tcataacgac gcgcgtcgca cccgcgctat tggtcctctg 540 tggaaaggta tgaaacgtgt ttttgcagat ggtttcatct caggtgatgc agttgagtgc 600 tctgttaacc tgcagctggt tggtgaagca tgttttacaa atcctttaat cgtggctgta 660 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gtccaggact ggaacgaaat cctgtgggca ggtcacgcag taatgatcgc aacatttggg 780 cagtttgcac gtcgagaatt tttccagcgt cttgcaacag tttatggtga tactctgacc 840 ccgttcttca cggcacagag ccagacctat tttcaaacaa cccgtggtgc catcgatgac 900 cttttcgttt attgtttggc aaatgattct gagtttggtg ctcataaccg tacctttctg 960 aacgcatgga ccgaacacta cctcgccagc agcgtagcag cattgaaaga ctttgtggga 1020 ctgtatgcaa aagtagaaaa gtcgcgggca gacagaagtc gccgtcgttt acgtggtgcc 1080 gcagcatcga gcgcaattgg gagatctatt actccagata aaataggttt tcgtgttgat 1140 gttgatcaaa aggttgacgc agtgttagca gggtataaga attga 1185 <210> 4 <211> 417 <212> DNA <213> Methylosinus trichosporium <400> 4 atgtcctctg cgcataatgc gtataatgcg ggcataatgc agaagactgg caaagctttc 60 gccgatgagt ttttcgccga agagaaccag gttgtacacg aaagcaatgc cgtggtgctg 120 gttctgatga aaagtgacga aatcgatgcg atcatagagg acattgtgct gaaaggaggt 180 aaggcaaaaa acccgagcat tgtggtcgaa gataaagcag gtttttggtg gattaaagct 240 gatggtgcca ttgagatcga tgcggctgaa gcgggcgaat tgctcgggaa gccgttttca 300 gtatatgatc tgctgattaa cgtttcgtca accgtcggtc gtgcatacac gttaggaaca 360 aaatttacaa ttacgtctga acttatgggg ctggatcgcg ccttaaccga catctga 417 <210> 5 <211> 510 <212> DNA <213> Methylosinus trichosporium <400> 5 atggctaaga gagagccgat tcatgataat agtattcgta ccgaatggga agcgaaaata 60 gcgaaactga cgtcggttga ccaggctact aaattcatcc aagattttcg gctggcatat 120 accagcccgt tccgaaagtc ttatgatatt gatgtagact atcaatatat tgaacgcaaa 180 atagaggaga aactgtcagt acttaagacc gaaaagctgc cagttgcgga tctgatcacc 240 aaagcaacga caggagaaga ccgtgccgcg gttgaagcca cttggattgc taaaattaaa 300 gccgcaaagt ccaaatatga ggccgatggt atacatatcg agtttcgcca gctctacaaa 360 ccacctgtcc tgccggttaa cgtgtttttg cgcacagatg cagcgcttgg gacggtgtta 420 atggaaatcc gtaataccga ttactacggc acacccctgg aaggtctgcg caaagaacct 480 ggcgtgaaag tcttgcacct gcaggcatga 510 <210> 6 <211> 309 <212> DNA <213> Methylosinus trichosporium <400> 6 atggaccaac aaactgctca tgaagtccgt caaacactca tacatgccga tgaacgttac 60 caggcctata cgatggatct tgagtatatg ttgcgttggg aaattttacg cgatggcgaa 120 tttgtgcagg aaggttgtag cttaagtcag gaatccgcac gtgaagcagt tgctcatgta 180 ctgtctcact ttcgacgtca gatgttacgt agaaggacaa ccgccggtaa agcgaaactg 240 cgtgcattat tagctatcgg caccccgtca ccagaaggga gagaacgtcg tggagaacgt 300 gatatttga 309 <210> 7 <211> 1023 <212> DNA <213> Methylosinus trichosporium <400> 7 atgtaccaga tcgttattga aacggaagat ggggagactt gccgtcgaat gaggccttcc 60 gaggattgga tttctcgtgc tgaagctgaa cggaatttgc tggcaagttg tcgtgcaggt 120 tgcgcgactt gcaaagcaga ctgtacagat ggagattatg agttgattga tgttaaggtc 180 caggcagttc cgcctgatga agaagaagat ggtaaagtat tattatgcag aacctttcct 240 cgttcagatt tgcacttgct ggtgccttac acctatgatc gtatcagctt cgaggctata 300 caaaccaatt ggctggcgga aattctggct tgtgatcgcg tatcatctaa tgttgttcgt 360 ttagtgctcc agcgtagtcg tccgatggca gcacgaatat ctttaaactt tgtgccgggt 420 caattcgttg atattgaaat cccaggtact catacgagac ggagctattc gatggcgtct 480 gttgcggaag atggtcagct tgaatttatc attcgtctgc ttcccgacgg agcatttagc 540 aagttcctgc agaccgaagc aaaagttggt atgcgggttg atttacgtgg tccagcaggt 600 agcttttttc tgcatgatca tggtggtcgt agccgagttt ttgtcgctgg tggaacaggt 660 ctctcaccag tcctatcaat gatccgtcag cttgggaaag cgagtgatcc gtccccggcc 720 acactgctgt ttggtgtgac caaccgtgaa gaattgtttt atgtagatga actgaaaaca 780 ctggcacaat caatgccgac tttaggtgtt agaattgcag ttgttaatga tgacggagga 840 aacggtgtag ataaaggtac cgtgattgac cttctgcgtg cagaacttga aatagatcta 900 ctgcttggtc atgcacgtcg tcgtagacgt cgtgaaacgg ctcgttcctg tagagaagat 960 caccgtgaca ggtgtcccgc ctggcgttcg gatttcttag aaaaattcct ggcaagtggt 1020 tga 1023 <210> 8 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SEQ ID No. 2 <400> 8 gtctagtaga aggaggagat ctggatccat atggcaattt ccctggcaac taaagcagcc 60 60 <210> 9 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SEQ ID No. 2 <400> 9 tgctcgaggc ggccgccatg gatgcattca tcaaaacttt gccagcggat cgggaaaaac 60 60 <210> 10 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SEQ ID No. 3 <400> 10 gtctagtaga aggaggagat ctggatccat atgagtatgt taggagaacg tcgtaggggt 60 60 <210> 11 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SEQ ID No. 3 <400> 11 tgctcgaggc ggccgccatg gatgcattca ttatttcaaa cctgccagaa ccgctttaac 60 60 <210> 12 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SEQ ID No. 4 <400> 12 gtctagtaga aggaggagat ctggatccat atgagcgtca acagcaacgc atacgacgcg 60 60 <210> 13 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SEQ ID No. 4 <400> 13 tgctcgaggc ggccgccatg gatgcattca ttacgcgtga tagtcttcta acttgcggtc 60 60 <210> 14 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SEQ ID No. 5 <400> 14 gtctagtaga aggaggagat ctggatccat atggctaaac tgggtattca cagcaatgac 60 60 <210> 15 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SEQ ID No. 5 <400> 15 tgctcgaggc ggccgccatg gatgcattca ttaatgcgga gattgcagat gcactacacg 60 60 <210> 16 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SEQ ID No. 6 <400> 16 gtctagtaga aggaggagat ctggatccat atggtggaat ctgcttttca gccgttcagt 60 60 <210> 17 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SEQ ID No. 6 <400> 17 tgctcgaggc ggccgccatg gatgcattca ttaatgctga acccctccag tacgatcttc 60 60 <210> 18 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SEQ ID No. 7 <400> 18 gtctagtaga aggaggagat ctggatccat atgcaacgtg ttcatactat tacagcggtg 60 60 <210> 19 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SEQ ID No. 7 <400> 19 tgctcgaggc ggccgccatg gatgcattca ttaggcagct ccactcggca ggaatttttc 60 60 <210> 20 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for pUCBB-mmoX <400> 20 gtctagtaga aggaggagat ctggatccat atggcactta gtaccgcaac taaagccgcg 60 60 <210> 21 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for pUCBB-mmoX <400> 21 ggctgcttta gttgccaggg aaattgccat atggatccag atctcctcct tctactagac 60 60 <210> 22 <211> 60 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tcttagccat atggatccag atctcctcct tctactagac 60 60 <210> 28 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for pUCBB-mmoD <400> 28 agagaacgtc gtggagaacg tgatatttga tgaatgcatc catggcggcc gcctcgagca 60 60 <210> 29 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for pUCBB-mmoD <400> 29 acggacttca tgagcagttt gttggtccat atggatccag atctcctcct tctactagac 60 60 <210> 30 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for pUCBB-mmoC <400> 30 ttcttagaaa aattcctggc aagtggttga atgcatccat ggcggccgcc tcgagcatca 60 60 <210> 31 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for pUCBB-mmoC <400> 31 atcttccgtt tcaataacga tctggtacat atggatccag atctcctcct tctactagac 60 60 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for error-prome PCR of mmoY <400> 32 gtctagtaga aggaggag 18 <210> 33 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for error-prome PCR of mmoY <400> 33 ggcagggtgg tgacac 16 <210> 34 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for pUCBB-mmoXBZDC <400> 34 tgaatgcatc catggcg 17 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for pUCBB-mmoXBZDC <400> 35 atggatccag atctcctc 18 <210> 36 <211> 343 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the first mutant of mmoY <400> 36 Met Ser Gln Pro Gln Ser Ser Gln Val Thr Lys Arg Gly Leu Thr Asp 1 5 10 15 Pro Glu Arg Ala Ala Ile Ile Ala Ala Ala Val Pro Asp His Ala Leu 20 25 30 Asp Thr Gln Arg Lys Tyr His Tyr Phe Ile Gln Pro Arg Trp Lys Pro 35 40 45 Leu Ser Glu Tyr Glu Gln Leu Ser Cys Tyr Ala Gln Pro Asn Pro Asp 50 55 60 Trp Ile Ala Gly Gly Leu Asp Trp Gly Asp Trp Thr Gln Lys Phe His 65 70 75 80 Gly Gly Arg Pro Ser Trp Gly Asn Glu Ser Thr Glu Leu Arg Thr Thr 85 90 95 Asp Trp Tyr Arg His Arg Asp Pro Ala Cys Arg Trp His His Pro Tyr 100 105 110 Val Lys Asp Lys Ala Glu Glu Ala Arg Tyr Thr Gln Arg Phe Leu Ala 115 120 125 Ala Tyr Ser Ser Glu Gly Ser Ile Arg Thr Ile Asp Pro Tyr Trp Arg 130 135 140 Asp Glu Ile Leu Asn Lys Tyr Phe Gly Ala Leu Leu Tyr Ser Glu Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Phe Asn Ala His Ser Ser Val Gly Arg Asp Cys Leu Ser Asp 165 170 175 Thr Ile Arg Gln Thr Ala Val Phe Ala Ala Leu Asp Lys Val Asp Asn 180 185 190 Ala Gln Met Ile Gln Met Glu Arg Leu Phe Ile Ala Lys Leu Val Pro 195 200 205 Gly Phe Asp Ala Ser Thr Asp Val Pro Lys Lys Ile Trp Thr Thr Asp 210 215 220 Pro Ile Tyr Ser Gly Ala Arg Ala Thr Val Gln Glu Ile Trp Gln Gly 225 230 235 240 Val Gln Asp Trp Asn Glu Ile Leu Trp Ala Gly His Ala Val Met Ile 245 250 255 Ala Ser Phe Gly Gln Phe Ala Arg Arg Glu Phe Phe Gln Arg Leu Ala 260 265 270 Thr Val Tyr Gly Asp Thr Leu Thr Pro Phe Phe Thr Ala Gln Ser Gln 275 280 285 Thr Tyr Phe Gln Thr Thr Cys Gly Ala Ile Asp Asp Leu Phe Val Tyr 290 295 300 Cys Leu Ala Tyr Asp Ser Glu Phe Gly Ala His Asn Arg Thr Phe Leu 305 310 315 320 Asn Ala Trp Thr Glu His Tyr Leu Ala Ser Ser Val Ala Ala Leu Lys 325 330 335 Asp 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cctgtgggca ggtcacgcag taatgatcgc atcatttggg 780 cagtttgcac gtcgagaatt tttccagcgt cttgcaacag tttatggtga tactctgacc 840 ccgttcttca cggcacagag ccagacctat tttcaaacaa cctgtggtgc catcgatgac 900 cttttcgttt attgtttggc atatgattct gagtttggtg ctcataaccg tacctttctg 960 aacgcatgga ccgaacacta cctcgccagc agcgtagcag cattgaaaga ctttgtggta 1020 ctgtatgcat aa 1032 <210> 38 <211> 394 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the second mutant of mmoY <400> 38 Met Ser Gln Pro Gln Ser Ser Gln Val Thr Lys Arg Gly Leu Thr Asp 1 5 10 15 Pro Glu Arg Ala Ala Ile Ile Ala Ala Ala Val Pro Asp His Ala Leu 20 25 30 Asp Thr Gln Arg Lys Tyr His Tyr Phe Ile Gln Pro Arg Trp Lys Pro 35 40 45 Leu Ser Glu Tyr Glu Gln Leu Ser Cys Tyr Ala Gln Pro Asn Pro Asp 50 55 60 Trp Ile Ala Gly Gly Leu Asp Trp Gly Asp Trp Thr Gln Lys Phe His 65 70 75 80 Gly Gly Arg Pro Ser Trp Gly Asn Glu Ser Thr Glu Leu Arg Thr Thr 85 90 95 Asp Trp Tyr Arg His Arg Asp Thr Ala Arg Arg Trp His His Pro Tyr 100 105 110 Val Lys Asp Lys Ser Glu Glu Ala 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atgcacatag ttcggtcgga cgagattgct tatccgacac aattcgtcag 540 acggcagttt tcgctgcact tgataaagtg gataatgcac agatgatcca gatggagcgt 600 ttattcatag caaaattggt accaggtttc gacgcaagta cagatgttcc gaaaaaaatt 660 tggaccactg atcctatata ctccggtgca cgtgcaaccg tccaggaaat ctggcaagga 720 gtccaggact ggaacgaaat cctgtgggca ggtcacgcag taatgatcgc aacatttggg 780 cagtttgcac gtcgagaatt tttccagcgt cttgcaacag tttatggtga tactctgacc 840 ccgttcttca cggcacagag ccagacctat tttcaaacaa cccgtggtgc catcgatgac 900 cttttcgttt attgtttggc aaatgattct gagtttggtg ctcataaccg tacctttctg 960 aacgcatgga ccgaacacta cctcgccagc agcgtagcag cattgaaaga ctttgtggga 1020 ctgtatgcaa aagtagaaaa gtcgcgggca gacagaagtc gccgtcgttt acgtggtgcc 1080 gcagcatcga gcgcaattgg gagatctatt actccagata aaataggttt tcgtgttgat 1140 gttgatcaaa aggttgacgc agtgttagca gggtataaga attga 1185 <210> 40 <211> 394 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the third mutant of mmoY <400> 40 Met Ser Gln Pro Gln Ser Ser Gln Val Thr Lys Arg Gly Leu Thr Asp 1 5 10 15 Pro Glu Arg Ala Ala Ile Ile Ala Ala Ala Val Pro Asp His Ala Leu 20 25 30 Asp Thr Gln Arg Lys Tyr His Tyr Phe Ile Gln Pro Arg Trp Lys Pro 35 40 45 Leu Ser Glu Tyr Glu Gln Leu Ser Cys Tyr Ala Gln Pro Asn Pro Asp 50 55 60 Trp Ile Ala Gly Gly Leu Asp Trp Gly Asp Trp Thr Gln Lys Phe His 65 70 75 80 Gly Gly Arg Pro Ser Trp Gly Asn Glu Ser Thr Glu Leu Arg Thr Thr 85 90 95 Asp Trp Tyr Arg His Arg Asp Pro Ala Arg Arg Trp His His Pro Tyr 100 105 110 Val Lys Asp Lys Ser Glu Glu Ala Arg Tyr Thr Gln Arg Phe Leu Ala 115 120 125 Ala Tyr Ser Ser Glu Gly Ser Ile Arg Thr Ile Asp Pro Tyr Trp Arg 130 135 140 Asp Glu Ile Leu Asn Lys Tyr Phe Gly Ala Leu Leu Tyr Ser Glu Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Phe Asn Ala His Ser Ser Val Gly Arg Asp Cys Leu Ser Asp 165 170 175 Thr Ile Arg Gln Thr Ala Val Phe Ala Ala Leu Asp Lys Val Asp Asn 180 185 190 Ala Gln Met Ile Gln Met Glu Arg Leu Phe Ile Ala Lys Leu Val Pro 195 200 205 Gly Phe Asp Ala Ser Thr Asp Val Pro Lys Lys Ile Trp Thr Thr Asp 210 215 220 Pro Ile Tyr Ser Gly Ala Arg Ala Thr Val Gln Glu Ile Trp Gln Gly 225 230 235 240 Val Gln Asp Trp Asn Glu Ile Leu Trp Ala Gly His Ala Val Met Ile 245 250 255 Ala Thr Phe Gly Gln Phe Ala Arg Arg Glu Phe Phe Gln Arg Leu Ala 260 265 270 Thr Val Tyr Gly Asp Thr Leu Thr Pro Phe Phe Thr Ala Gln Ser Gln 275 280 285 Thr Tyr Phe Gln Thr Thr Arg Gly Ala Ile Asp Asp Leu Phe Val Tyr 290 295 300 Cys Leu Ala Asn Asp Ser Glu Phe Gly Ala His Asn Arg Thr Phe Leu 305 310 315 320 Asn Ala Trp Thr Glu His Tyr Leu Ala Ser Ser Val Ala Ala Leu Lys 325 330 335 Asp Phe Glu Gly Leu Tyr Ala Lys Val Glu Lys Ser Arg Ala Asp Arg 340 345 350 Ser Arg Arg Arg Leu Arg Gly Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ile Gly Arg 355 360 365 Ser Ile Thr Pro Asp Lys Ile Gly Phe Arg Val Asp Val Asp Gln Lys 370 375 380 Val Asp Ala Val Leu Ala Gly Tyr Lys Asn 385 390 <210> 41 <211> 1185 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the third mutant of mmoY <400> 41 atgtcacagc cgcaatcatc tcaggtcacg aaaaggggcc tcacagatcc tgaacgtgcc 60 gcaattattg cagcagcagt gcctgatcat gcgctagata cgcaaaggaa ataccattat 120 tttatccaac cccgttggaa accactttca gagtacgaac agctgagctg ttatgcacaa 180 cctaatccag attggatagc gggcggtctc gattggggtg attggactca gaagtttcac 240 ggaggtagac cgagctgggg gaacgaaagt acagagctgc gtactaccga ctggtatcgt 300 caccgagacc ccgcacgtcg ctggcatcat ccgtatgtga aagataagtc cgaagaagca 360 cggtacacac aacgttttct ggcagcatat agttcagagg gttctattcg taccattgat 420 ccgtattggc gtgatgaaat tctgaataaa tattttggtg cattactgta cagcgaatat 480 ggtctgttta atgcacatag ttcggtcgga cgagattgct tatccgacac aattcgtcag 540 acggcagttt tcgctgcact tgataaagtg gataatgcac agatgatcca gatggagcgt 600 ttattcatag caaaattggt accaggtttc gacgcaagta cagatgttcc gaaaaaaatt 660 tggaccactg atcctatata ctccggtgca cgtgcaaccg tccaggaaat ctggcaagga 720 gtccaggact ggaacgaaat cctgtgggca ggtcacgcag taatgatcgc aacatttggg 780 cagtttgcac gtcgagaatt tttccagcgt cttgcaacag tttatggtga tactctgacc 840 ccgttcttca cggcacagag ccagacctat tttcaaacaa cccgtggtgc catcgatgac 900 cttttcgttt attgtttggc aaatgattct gagtttggtg ctcataaccg tacctttctg 960 aacgcatgga ccgaacacta cctcgccagc agcgtagcag cattgaaaga ctttgaggga 1020 ctgtatgcaa aagtagaaaa gtcgcgggca gacagaagtc gccgtcgttt acgtggtgcc 1080 gcagcatcga gcgcaattgg gagatctatt actccagata aaataggttt tcgtgttgat 1140 gttgatcaaa aggttgacgc agtgttagca gggtataaga attga 1185 <210> 42 <211> 1032 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the first mutant of mmoY <400> 42 atgtcacagc cgcaatcatc tcaggtcacg aaaaggggcc tcacagatcc tgaacgtgcc 60 gcaattattg cagcagcagt gcctgatcat gcgctagata cgcaaaggaa ataccattat 120 tttatccaac cccgttggaa accactttca gagtacgaac agctgagctg ttatgcacaa 180 cctaatccag attggatagc gggcggtctc gattggggtg attggactca gaagtttcac 240 ggaggtagac cgagctgggg gaacgaaagt acagagctgc gtactaccga ctggtatcgt 300 caccgagacc ccgcatgtcg ctggcatcat ccgtatgtga aagataaggc cgaagaagca 360 cggtacacac aacgttttct ggcagcatat agttcagagg gttctattcg taccattgat 420 ccgtattggc gtgatgaaat tctgaataag tatttcggtg cattactgta cagcgaatat 480 ggtctgttta atgcacatag ttcggtcgga cgagattgct tatccgacac aattcgtcag 540 acggcagttt tcgctgcact tgataaagtg gataatgcac agatgatcca gatggagcgt 600 ttattcatag caaaattggt accaggtttc gacgcaagta cagatgttcc gaaaaaaatt 660 tggaccactg atcctatata ctccggtgca cgtgcaaccg tccaggaaat ctggcaagga 720 gtccaggact ggaacgaaat cctgtgggca ggtcacgcag taatgatcgc atcatttggg 780 cagtttgcac gtcgagaatt tttccagcgt cttgcaacag tttatggtga tactctgacc 840 ccgttcttca cggcacagag ccagacctat tttcaaacaa cctgtggtgc catcgatgac 900 cttttcgttt attgtttggc atatgattct gagtttggtg ctcataaccg tacctttctg 960 aacgcatgga ccgaacacta cctcgccagc agcgtagcag cattgaaaga ctttgtggta 1020 ctgtatgcat aa 1032 <210> 43 <211> 1032 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the first mutant of mmoY <400> 43 atgtcacagc cgcaatcatc tcaggtcacg aaaaggggcc tcacagatcc tgaacgtgcc 60 gcaattattg cagcagcagt gcctgatcat gcgctcgata cgcaaaggaa ataccattat 120 tttatccaac cccgttggaa accactttca gagtacgaac agctgagctg ttatgcacaa 180 cctaatccag attggatagc gggcggtctc gattggggtg attggactca gaagtttcac 240 ggaggtagac 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mutant of mmoY <400> 44 atgtcacagc cgcaatcatc tcaggtcacg aaaaggggcc tcacagatcc tgaacgtgcc 60 gcaattattg cagcagcagt gcctgatcat gcgctcgata cgcaaaggaa ataccattat 120 tttatccaac cccgttggaa accactttca gagtacgaac agctgagctg ttatgcacaa 180 cctaatccag attggatagc gggcggtctc gattggggtg attggactca gaagtttcac 240 ggaggtagac cgagctgggg gaacgaaagt acagagctgc gtactaccga ctggtatcgt 300 caccgagacc ccgcatgtcg ctggcatcat ccgtatgtga aagataaggc cgaagaagca 360 cggtacacac aacgttttct ggcagcatat agttcagagg gttctattcg taccattgat 420 ccgtattggc gtgatgaaat tctgaataag tattttggtg cattactgta cagcgaatat 480 ggtctgttta atgcacatag ttcggtcgga cgagattgct tatccgacac aattcgtcag 540 acggcagttt tcgctgcact tgataaagtg gataatgcac agatgatcca gatggagcgt 600 ttattcatag caaaattggt accaggtttc gacgcaagta cagatgttcc gaaaaaaatt 660 tggaccactg atcctatata ctccggtgca cgtgcaaccg tccaggaaat ctggcaagga 720 gtccaggact ggaacgaaat cctgtgggca ggtcacgcag taatgatcgc atcatttggg 780 cagtttgcac gtcgagaatt tttccagcgt cttgcaacag tttatggtga tactctgacc 840 ccgttcttca cggcacagag ccagacctat tttcaaacaa cctgtggtgc catcgatgac 900 cttttcgttt attgtttggc atatgattct gagtttggtg ctcataaccg tacctttctg 960 aacgcatgga ccgaacacta cctcgccagc agcgtagcag cattgaaaga ctttgtggta 1020 ctgtatgcat aa 1032 <210> 45 <211> 1032 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the first mutant of mmoY <400> 45 atgtcacagc cgcaatcatc tcaggtcacg aaaaggggcc tcacagatcc tgaacgtgcc 60 gcaattattg cagcagcagt gcctgatcat gcgctagata cgcaaaggaa ataccattat 120 tttatccaac cccgttggaa accactttca gagtacgaac agctgagctg ttatgcacaa 180 cctaatccag attggatagc gggcggtctc gattggggtg attggactca gaagtttcac 240 ggaggtagac cgagctgggg gaacgaaagt acagagctgc gtactaccga ctggtatcgt 300 caccgagacc ccgcatgtcg ctggcatcat ccgtatgtga aagataaggc cgaagaagca 360 cggtacacac aacgttttct ggcagcatat agttcagagg gttctattcg taccattgat 420 ccgtattggc gtgatgaaat tctgaataaa tatttcggtg cattactgta cagcgaatat 480 ggtctgttta atgcacatag ttcggtcgga cgagattgct tatccgacac aattcgtcag 540 acggcagttt tcgctgcact tgataaagtg gataatgcac agatgatcca gatggagcgt 600 ttattcatag caaaattggt accaggtttc gacgcaagta cagatgttcc gaaaaaaatt 660 tggaccactg atcctatata ctccggtgca cgtgcaaccg tccaggaaat ctggcaagga 720 gtccaggact ggaacgaaat cctgtgggca ggtcacgcag taatgatcgc atcatttggg 780 cagtttgcac gtcgagaatt tttccagcgt cttgcaacag tttatggtga tactctgacc 840 ccgttcttca cggcacagag ccagacctat tttcaaacaa cctgtggtgc catcgatgac 900 cttttcgttt attgtttggc atatgattct gagtttggtg ctcataaccg tacctttctg 960 aacgcatgga ccgaacacta cctcgccagc agcgtagcag cattgaaaga ctttgtggta 1020 ctgtatgcat aa 1032 <210> 46 <211> 1032 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the first mutant of mmoY <400> 46 atgtcacagc cgcaatcatc tcaggtcacg aaaaggggcc tcacagatcc tgaacgtgcc 60 gcaattattg cagcagcagt gcctgatcat gcgctagata cgcaaaggaa ataccattat 120 tttatccaac cccgttggaa accactttca gagtacgaac agctgagctg ttatgcacaa 180 cctaatccag attggatagc gggcggtctc gattggggtg attggactca gaagtttcac 240 ggaggtagac cgagctgggg gaacgaaagt acagagctgc gtactaccga ctggtatcgt 300 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accaggtttc gacgcaagta cagatgttcc gaaaaaaatt 660 tggaccactg atcctatata ctccggtgca cgtgcaaccg tccaggaaat ctggcaagga 720 gtccaggact ggaacgaaat cctgtgggca ggtcacgcag taatgatcgc atcatttggg 780 cagtttgcac gtcgagaatt tttccagcgt cttgcaacag tttatggtga tactctgacc 840 ccgttcttca cggcacagag ccagacctat tttcaaacaa cctgtggtgc catcgatgac 900 cttttcgttt attgtttggc atatgattct gagtttggtg ctcataaccg tacctttctg 960 aacgcatgga ccgaacacta cctcgccagc agcgtagcag cattgaaaga ctttgtggta 1020 ctgtatgcat aa 1032

Claims (18)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 106번째 아르기닌(arginine), 117번째 세린(serine), 258번째 트레오닌(threonine), 295번째 아르기닌(arginine), 308번째 아스파라긴(asparagine), 340번째 글리신(glycine) 및 344번째 내지 394번째 아미노산이 하기와 같이 변이된 폴리펩티드를 서브유닛으로 포함하는, 가용성 메탄 모노옥시게나아제:
   상기 106번째 아르기닌 및 상기 295번째 아르기닌은 각각 독립적으로 시스테인(cysteine)으로 치환되고;
   상기 117번째 세린은 알라닌으로 치환되고;
   상기 258번째 트레오닌은 세린으로 치환되고;
   상기 308번째 아스파라긴은 티로신(tyrosine)으로 치환되고;
   상기 340번째 글리신은 발린(valine)으로 치환되고; 및
   상기 344번째 내지 394번째 아미노산은 결실된다.
   
2. 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 104번째 프롤린(proline)이 하기와 같이 변이된 폴리펩티드를 서브유닛으로 포함하는, 가용성 메탄 모노옥시게나아제:
   상기 104번째 프롤린은 트레오닌으로 치환된다.
   
3. 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 339번째 발린이 하기와 같이 변이된 폴리펩티드를 서브유닛으로 포함하는, 가용성 메탄 모노옥시게나아제:
   상기 339번째 발린은 글루탐산(glutamic acid)으로 치환된다.
   
4. 삭제
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10. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항의 변이된 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
    
11. 청구항 10의 재조합 발현 벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체.
    
12. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항의 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 메탄과 반응시키는 단계;를 포함하는, 인 비트로(in vitro)에서의 메탄올 생산 방법.
    
13. 청구항 11의 형질전환체를 메탄의 존재 하에서 배양하는 단계; 및
    상기 배양된 배양물에서 메탄올을 분리하는 단계;를 포함하는, 인 비보(in vivo)에서의 메탄올 생산 방법.
    
14. 페놀계 화합물을 인지하는 dmpR 유전자, 및 상기 dmpR 유전자와 상호 작동가능하게 연결되어 상기 dmpR 유전자의 발현을 조절하는 제1 프로모터를 포함하는 제1 유전자 컨스트럭트;
    ⅱ) 형광 단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 리포터 유전자, 및 상기 리포터 유전자와 상호 작동가능하게 연결되어, 페놀계 화합물을 인지한 dmpR 단백질이 결합하면 상기 리포터 유전자의 발현을 유도하는 제2 프로모터를 포함하는 제2 유전자 컨스트럭트; 및
    ⅲ) 가용성 메탄 모노옥시게나아제를 구성하는 서브유닛들 중 일부 서브유닛들을 암호화하는 유전자들을 포함하는 제3 유전자 컨스트럭트;를 포함하는, 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 효소 활성이 향상된 변이체의 스크리닝용 센서 세포.
    
15. 청구항 14에 있어서,
    상기 제3 유전자 컨스트럭트는 α 서브유닛을 암호화하는 유전자, B 서브유닛을 암호화하는 유전자, γ 서브유닛을 암호화하는 유전자, D 서브유닛을 암호화하는 유전자 및 R 서브유닛을 암호화하는 유전자를 모두 포함하는, 센서 세포.
    
16. 청구항 14의 센서 세포에, 상기 제3 유전자 컨스트럭트에 포함되지 않은 나머지 서브유닛들의 돌연변이 유전자 라이브러리를 포함하는 제4 유전자 컨스트럭트를 도입하는 단계;
    상기 제4 유전자 컨스트럭트가 도입된 센서 세포를 벤젠이 존재하는 환경에서 배양하는 단계; 및
    상기 센서 세포에서 리포터 유전자의 발현을 감지하는 단계;
    를 포함하는, 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 효소 활성이 향상된 변이체의 스크리닝 방법.
    
17. 청구항 16에 있어서,
    상기 제3 유전자 컨스트럭트는 α 서브유닛을 암호화하는 유전자, B 서브유닛을 암호화하는 유전자, γ 서브유닛을 암호화하는 유전자, D 서브유닛을 암호화하는 유전자 및 R 서브유닛을 암호화하는 유전자를 모두 포함하고,
    상기 제4 유전자 컨스트럭트는 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 β 서브유닛을 암호화하는 유전자의 돌연변이 유전자 라이브러리를 포함하는, 스크리닝 방법.
    
18. 청구항 16에 있어서,
    상기 벤젠이 존재하는 환경은 벤젠이 포함된 M9 최소배지인 것인, 가용성 메탄 모노옥시게나아제의 효소 활성이 향상된 변이체의 스크리닝 방법.

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