CN1058616A

CN1058616A - 从葡聚糖明串珠菌克隆和过量表达葡糖-6-磷酸脱氢酶

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Publication number: CN1058616A
Application number: CN91105212A
Authority: CN
Inventors: M·加里斯; G·兰格
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1990-07-30
Filing date: 1991-07-30
Publication date: 1992-02-12
Anticipated expiration: 2006-07-30
Also published as: US5308770A; AU8043191A; US5229286A; EP0469523B1; AU636500B2; DK0469523T3; DE59105231D1; EP0469523A2; DE4024158A1; EP0469523A3; CN1055314C; CA2045838A1; JPH04252180A; ATE121456T1; JPH0587234B2

Abstract

本发明涉及葡糖-6-磷酸脱氢酶，该酶含有 SEQ IDNo：1所示的氨基酸序列；还涉及编码该酶的DNA以及分离该酶的方法。

Description

葡糖-6-磷酸脱氢酶（G6p-DH）催化葡萄糖氧化代谢的第一步。在该过程中葡糖-6-磷酸被氧化为葡糖酸-6-磷酸，同时，作为辅助底物的NAD⁺和/或NADP⁺则被还原。葡萄糖的氧化最终导致用于核酸代谢的戊糖的产生。

可从例如肠膜明串珠菌中分离葡糖-6-磷酸脱氢酶。该酶可利用NAD⁺以及NADP⁺作为辅因子，而来自酵母的该酶则仅利用NADP⁺作为辅因子。该酶以由两个相同的单体亚单位组成的二聚体的形式存在，分子量为55000D，25℃时的比活性为550μ/mg。

从明串珠菌属细菌中分离G6p-DH这一方法的缺点尤其在于乳酸细菌具有复杂的营养要求，因此它们在大技术规模上所使用的营养培养基中只能缓慢生长，并且仅达到很低的细胞浓度。另外，当使用明串珠菌时生物量中G6p-DH的含量极低（约占总细胞蛋白质的1%）。因此，为了提供适量的G6p-DH必需进行大批量发酵。而且，由于存在大量外源蛋白质，故只可能获得低比活性的酶制剂。

但是，从明串珠细菌获得的已知G6p-DH的最大缺点是它们的低温稳定性。

因此，本发明的目的是提供不再具有现有技术中那些缺点的葡糖-6-磷酸脱氢酶。

本发明的这一目的是通过提供这样一种葡糖-6-磷酸脱氢酶而达到的：它含有SEQ ID No：1中所示的氨基酸序列并且可得自肠膜明串珠菌葡聚糖明串珠菌亚种（DSM20187）（以下称作葡聚糖明串珠菌，Leuconostoc dex-tranicus）。

另外，本发明也提供了含有SEQ ID No：1中所示的编码本发明酶的序列或含有遗传密码简并性范围内相应序列的DNA。

本发明的重组DNA是利用下面将详细叙述的合适寡核苷酸探针对葡聚糖明串珠菌（DSM 20187）进行筛选而分离出来的。

当本发明的重组DNA在大肠杆菌细胞中表达时会令人惊奇地发现，即使是小发酵体积也足以提供所需量的酶。与从明串珠菌分离G6p-DH相比，发酵体积减少500至1000倍。而且，在较少增加纯化步骤的情况下得到高纯度的G6p-DH制品（即比活性约为900μ/mg）。但是，与自大肠杆菌分离的已知酶相比，本发明重组酶的一个令人惊异的特殊特征是其温度稳定性得到根本改善。与已知明串珠菌酶相比，该重组酶的另一个优点是它不与葡萄糖反应。这一熟知的明串珠菌酶与葡萄糖的非特异性反应（Olive and Levy，Biochemistry6（1967），730）以前一直是酶试验中的一个主要缺陷，因为这将由于血液、血清或血浆中葡萄糖的存在而导致错误的测定结果。最后，重组酶与已知G6p-DH的不同还在于：对NADP⁺的Km值不同，激活剂和抑制剂（如磷酸酯、甘油、镁离子、碳酸氢根离子等）的作用不同。

本发明也提供了含有本发明重组DNA之一个或多个拷贝的重组载体。该载体能够在外来宿主体中表达本发明的重组DNA。本发明的载体可以整合到宿主细胞染色体DNA上（如λ噬菌体），也可存在于宿主细胞染色体外（如质粒）。本发明的载体最好是质粒。

本发明的载体可以是真核载体，也可以是原核载体，但最好是原核载体，即它适于在原核宿主生物体中增殖。该重组载体最好具有在大肠杆菌中有活性的复制起点，即它能够在大肠杆菌中增殖。

在一特别优选的实施方案中，本发明的重组载体含有受控于在大肠杆菌中发挥作用并包括SEQ ID No：1中所示前122个核苷酸（G6p-DH基因的上游）之葡聚糖明串珠菌启动子序列的编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的核酸序列。

为了显示出启动子性质，并不要求DNA区域完全具有这122个核苷酸的序列。具有启动子作用的这一序列的衍生序列或其片段也是适用的。应当知道，在衍生的生物学活性序列的情况下，启动子序列中的单个核苷酸或短核苷酸序列可被缺失、取代或插入，而只要其启动子活性被保留就行。本领域熟练技术人员的确知道，对于一个启动子来说并不一定要保留整个序列，而只需保留特定的部分区域。在原核启动子序列中，则尤其是距转录起始点-35位和-10位的区域。

因此，本发明也包括含有SEG ID No：1中所示核酸序列中之前122个核苷酸或由之衍生的具有启动子性质之序列的重组DNA。令人惊奇的是，该明串珠菌启动子在大肠杆菌中也能导致蛋白质的很好地表达。因此，该启动子也可用以在革兰氏阴性菌（优选大肠杆菌）中表达异种基因，即不同于G6p-DH基因的基因。

另外，本发明也提供了一种被本发明重组载体转化的微生物。在这方面，优选的是革兰氏阴性菌，尤其是大肠杆菌。

本发明的重组载体可通过以下步骤获得：

（1）分离葡聚糖明串珠菌染色体DNA并用合适的限制酶切割之，

（2）将切割后的葡聚糖明串珠菌DNA整合到一载体上，用该载体转化一合适的生物体，以此方式产生基因库，

（3）用具有特异于葡糖-6-磷酸脱氢酶基因之序列的核酸探针筛选步骤（2）的基因库，这些探针是按照密码子的使用在乳酸菌中构建的，

（4）对与步骤（3）的探针发生阳性反应的基因库克隆进行分析。

可使用聚乙二醇/溶菌酶处理，并随后与蛋白酶K一起保温来分离葡聚糖明串珠菌（DSM 20187）染色体DNA。

可按分子生物学领域熟练技术人员所熟悉的方式用合适的限制酶切割已分离的葡聚糖明串珠菌DNA，将切割后的DNA接连到合适的克隆载体上，并用重组克隆载体转化合适生物体以产生基因库。下一步就是用其序列对葡糖-6-磷酸脱氢酶基因具有特异性的核酸探针检验按此方式产生的基因库。

来自肠膜明串珠菌的带有可被吡哆酰基化之赖氨酸残基（＊）的多肽序列是已知的[Haghighi et al.，Biochemcstry 21（1982），6415-6420]。该序列为：Phe-Leu-Leu-Lys（＊）-Ser-Pro-Ser-Tyr-（Asp/Val）-Lys。但是，从该序列不可能衍生出可用于在葡聚糖明串珠菌基因库中寻找杂化信号的寡核苷酸探针。

Bhadbhade等人[FEBS Letters 211（1987），243-246]公开了一种来自肠膜明串珠菌G6p-DH活性中心且与人G6p-DH有高度同源性的肽序列。实施例2中所提到的具有72个碱基长度的寡核苷酸探针（SEQ ID No：2）就是从可由该肽序列构建的大量寡核苷酸探针中产生的。

用5′-末端被标记的该寡核苷酸对葡聚糖明串珠菌DNA基因库进行的筛选最终将产生能够检测葡聚糖明串珠菌G6p-DH基因序列的阳性克隆。

用Sanger的方法测定葡聚糖明串珠菌G6p-DH基因的DNA序列。其结果示于SEQ ID No：1。

SEQ ID No：1也显示了由其决定的葡聚糖明串珠菌G6p-DH的氨基酸序列。从它可以看出本发明酶的氨基酸序列与FEBS Letters 211（1987），243-246中所述的肠膜明串珠菌的序列在42个位置中的6处不相符。

另外，本发明包括了生产具有SEQ ID No：1中所示氨基酸序列的G6p-DH的方法，其中

（1）用含有该DNA一个或多个拷贝的本发明的DNA或载体转化合适的宿主生物体，

（2）在合适的培养基中培养转化后的宿主生物体，

（3）从该培养基或细胞分离蛋白质。

原则上，有可能在任何合适启动子的控制下在转化的宿主生物体（较好是原核宿主，尤其是大肠杆菌细胞）中表达本发明的重组蛋白质。因此，大肠杆菌中G6p-DH的表达有可能在异源启动子如tac启动子、mgl启动子或pfl启动子的控制之下。但是，该表达最好在明串珠菌启动子、尤其是SEQ ID No：1所示启动子序列或由其衍生的启动子序列（对应于SEQ ID No：1的前122个核苷酸）的控制之下进行。最优选的是图1所示的质粒pUC G6p-DH1.8。

选用商业上可得到的大肠杆菌HB101菌株作为合适的大肠杆菌宿主菌株。当用pUC G6p-DH1.8转化大肠HB101时，发现该质粒在细胞中具有高度稳定性，并且即使在没有选择压力的情况下G6p-DH的表达也能进行几代。

下面结合SEQ ID No：1和2以及图1用实施例说明本发明。

SEQ ID No：1显示了插入到pUC G6p-DH1.8中的明串珠菌DNA的核苷酸序列，其中葡聚糖明串珠菌G6p-DH启动子编码区上游的前122个碱基和碱基123-1580代表葡聚糖明串珠菌G6p-DH基因的核苷酸序列，其编码的蛋白质的氨基酸序列也是已知的。

SEQ ID No：2显示了用于肠膜明串珠菌G6p-DH基因中编码肠膜明串珠菌G6p-DH（它与人G6p-DH有高度同源性）活性中心部分的寡核苷酸探针。

图1显示了质粒pUC-G6p-DH1.8。

实施例1

从葡聚糖明串珠菌分离染色体DNA

按照下述方法从葡聚糖明串珠菌分离基因组DNA：

于30℃在APT培养基（Merck No.10454）中培养葡聚糖明串珠菌（DSM20187）。从100ml培养液中离心出细胞，用10ml 20mol/l Tris/HCl（pH8.0）洗涤后重新悬浮于15ml该缓冲液中。在加入5ml 24%（w/v）聚乙二醇6000和20mg溶菌酶后于4℃保温16小时。加入1ml 20%（w/v）SDS溶解细胞。然后加入2mg蛋白酶K，于37℃保温60分钟。经用苯酚和氯仿依次提取、用RANseA处理（0.5mg/60min，37℃）、再苯酚和氯仿重新提取以及最后用乙醇沉淀而进一步纯化DNA。

实施例2

测定编码G6p-DH之基因组DNA片段的大小

用SEQ ID No：2所示的寡核苷酸进行杂交。

用不同的限制性核酸内切酶（BclⅠ，ClaⅠ，HindⅢ，PstⅠ，XbaⅠ）切割葡聚糖明串珠菌基因组DNA的5μg等份样品后，在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，然后转移到硝酸纤维素滤膜上。用6X SSC缓冲液、0.7%脱脂奶预杂交后，将该滤膜于40℃在另外含有³²P放射性末端标记之上述核苷酸的同样溶液中保温过夜。经洗涤、干燥和放射自显影后，证实由限制酶BclⅠ切割产生的约3.4kb的DNA片段可与该寡核苷酸杂交。

实施例3

克隆编码G6p-DH的DNA片段

用Bcl酶解葡聚糖明串珠菌DNA的20μg等份样品，并在低熔点琼脂糖凝胶上进行分级分离。由该凝胶中切出大小约为3.4kb±0.2kb的DNA片段。用连接酶缓冲液平衡该凝胶条（Maniatis et al.，1982，Molecalar Cloning，p474）并于65℃液化。然后用BamHⅠ酶解0.1μg pUC18DNA并加入5u T₄连接酶，于37℃保温10分钟，再于15℃保温16小时。限制性核酸内切酶BamHⅠ所产生的突出末端与BClⅠ所产生的末端相容。

将大肠杆菌HB101（DSM1607）的细胞培养于20ml营养培养基中，并通过氯化钙处理使其转变成感受态（Maniatis et al.，1982，Molecu-lar Cloning，pp.250-252）。加入1体积份50mol/l Tris/HCl（pH7.5）后，将上面所获得的连接制剂于65℃再次液化5分钟，并用于转化。将按此方式处理的细胞铺敷在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，于37℃培养1天。

将充分生长的菌落转移到含有50μl氨苄青霉素的新鲜LB琼脂平板上（其上面放有硝酸纤维素滤膜）。菌落再次完全生长后，取出滤膜，按照Grunstein和Hogness所述的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.72（1975）3961]溶解菌落，并与实例2所述的放射性标记的寡核苷酸探针杂交。放射自显影后，可从原平板上鉴别和分离出带有编码G6p-DH之重组质粒的克隆。经对这些克隆的质粒DNA进行分离和鉴定后发现它们的大小约为6kb。这意味着约3.4kb大小的DNA片段已插入到pUC18DNA中。选择该重组质粒进行进一步处理。

实施例4

基因的切除和表达

经用限制酶XbaⅠ和SpeⅠ进行切割，可将上面所获得的重组质粒切割成大小约2.2kb和约3.8kb的DNA片段。该3.8kb片段现在仅含有来自pUC18的DNA序列以及SEQ ID No：1的核苷酸序列。分离出该3.8kb片段并重新连接后将其转化到大肠杆菌HB101中，得到表达G6p-DH基因的克隆。G6p-DH基因作为用XbaⅠ和KpnⅠ于多接头区域切割之商品pUC18载体中的1.8kb片段（SpeⅠ/KpnⅠ），被再克隆到上述阳性克隆中，从而在基因库之阳性克隆的载体部分产生KpnⅠ切割位点。这样便存在一个葡聚糖明串珠菌基因组的SpeⅠ/BclⅠ片段。SEQ IDNo：1显示了完整再克隆之1.8kb SpeⅠ/BClⅠ片段的DNA序列。

所产生的重组质粒含有在其自身明串珠菌启动子控制之下的G6p-DH基因。它被命名为pUC-G6p-DH1.8并示于图1。

在此情况下，G6p-DH基因的表达方向与pUC18上Lac启动子（pLAc）的方向相反。

为了测定酶活性和纯化G6p-DH，将该克隆接种于含有50μg/ml氨苄青霉素的5ml LB营养培养基的试管中，并于37℃培养过夜。将该培养物接种于1升含有50μg/ml氨苄青霉素之LB培养基的锥瓶中。并在振荡条件下于37℃再次培养过夜。离心收集细胞。

实施例5

从大肠杆菌中浓缩和览定重组G6p-DH

5.1浓缩方法

1.溶胞

将5kg生物量（大肠杆菌HB101 pUC-G6p-DH1.8）悬浮于251含有10^-3mol/l MgCl₂的磷酸钾缓冲液（10mmol/l，pH7.5）中，并使用APU-Gaulin高压均浆器于800巴均浆压力下破碎细胞。

将所产物的悬浮液冷却至+4℃并离心。

2.硫酸铵分级分离

向粗提物中加入固体硫酸铵至浓度为1.9mol/l，并离心分离沉淀物。进一步用浓度达3.0mol/l的硫酸铵沉淀上清液，并离心沉淀物。

3.加热

用含有1mmol/l EDTA的20mmol/l磷酸钾缓冲液（pH6.0）溶解第二次的硫酸铵沉淀物，并于52℃加热20分钟。离心已沉淀的沉淀物。

4.第一次结晶

将固体硫酸铵缓慢加到步骤3的上清液中，至其浓度为2.1mol/l;用NaOH调节PH至6.0。过夜结晶出G6p-DH。结晶应在室温及温和搅拌下进行。离心沉淀出酶结晶。

5.第二次结晶

将沉淀溶于含有1mmol/l EDTA的20mmol/l磷酸钾缓冲液（pH6.0）中，并加入固体硫酸铵至1.9mol/l。再次调节pH至6.0并在室温和温和搅拌条件下使酶过夜结晶。

6.透析

离心出酶结晶物，用含有1mmol/l EDTA的10mmol/l磷酸钾缓冲液（pH6.0），溶解浓缩形式的沉淀物并对同样缓冲液渗析24小时。

7.冷冻干燥

冷冻干燥无添加剂的酶溶液。结果得到210g活性约为900μ/mg的冷冻干燥物。

5.2鉴定重组G6p-DH

由遗传工程方法产生的G6p-DH在性质上不同于得自明串珠菌的已知酶。

已知的明串珠菌酶的缺点如下：

长期稳定性差。另外，该酶可转化葡萄糖，从而导致检测血液、血清或血浆中的酶时由于样品中始终存在葡萄糖而产生错误结果。Archives在Biochemistry和Bio-physics 149（1972）102-109中提到G6p-DH缺乏特异性。

不同性质表现在：

1.Km NADP（在0.1mol/l Tris（pH7.8）中;25℃）

重组G6p-DH 明串珠菌G6p-DH

3.7×10^-57.4×10^-6mol/l^1）

5.7×10^-6mol/l^3）

9.9×10^-6mol/l^2）

2.激活剂/抑制剂的作用

相对活性（相对于无添加剂时的活性）

重组G6p-DH明串珠菌G6p-DH

加入辅助底物辅助底物

NAD⁺NADP⁺AND⁺NADP⁺

5mmol/l磷酸盐 100% 80% 活化^2）

5mmol/l磷酸盐 100% 80% 107%^1）118%^1）

30%甘油 60% 30% 30%^1）30%^1）

30mmol/lMg²⁺100% 100% 80%^1）80%^1）

0.3mmol/l碳酸氢盐 100% 100% 120%^1）120%^1）

3.特异性

特异性重组G6p-DH 明串珠菌G6p-DH

（加有NAD（P））

葡萄糖^4）不转化转化^5）

2-脱氧葡萄糖-6p^4）5% 不转化

4.温度稳定性

温度相对活性（相对于20℃）

重组G6p-DH 按照文献1）产生的葡聚糖

明串珠菌G6p-DH

40℃ 100% 100%

50℃ 100% 97%

60℃ 100% 90%

70℃ 43% 4%

对温度稳定性的测定是在3.2mol/l硫酸铵（pH6.0）中进行10分钟（酶的起始活性为2500μ/ml）。

按实施例6所述方法测定活性和特异性。

1）Olive and Levy，Biochem.6（1967），730

2）DeMoss，in Methods in Enzymology，Vol l.，p.328，Acad.Press，New York，1955

3）Levy，626th Meeting Sheffield，p.13（1988）

4）Concentration 0.15mol/l

5）Arch.Biochem.and Biophys.149（1972），102-109

实施例6

测定葡糖-6-磷酸脱氢酶的活性

G6p-DH将葡糖-6-磷酸和NAD⁺转化为葡糖酸-6-磷酸和NADH。根据340nm处吸光率检测所形成的NADH。

于25℃将0.05ml样品（G6p-DH，如果可能的话体积活性应在0.3-0.5μ/ml之间）加到3ml由Tris缓冲液（0.1mol/l，pH7.8，3mmol/l MgCl₂）、0.1mmol/l NAD⁺、游离酸及0.15mmol/l葡糖-6-磷酸组成的试剂中。监测吸收率的升高（△A/min）。按下列公式计算体积活性：

体积活性＝ 3.05/(ε×1×0.05) ×△Amin[u/ml]

ε₃₄₀＝6.3[mmol^-1×1×cm^-1]

SEQ ID NO：1

序列类型：核苷酸和其相应蛋白质

序列长度：1696碱基对

链形式：单链

SEQ ID NO：2

序列类型：核苷酸序列

序列长度：72碱基对

链形式：单链

Claims

1、葡糖-6-磷酸脱氢酶，其中它含有SEQ IDNo∶1中所示的氨基酸序列。

2、DNA，其中它含有SEQ ID No：1中所示的编码权利要求1所述葡糖-6-磷酸脱氢酶的核酸序列区域或含有遗传密码子简并性范围内与该区域相应的序列。

3、如权利要求1所述的重组载体，它含有权利要求2所述之DNA的一个或多个拷贝。

4、如权利要求3所述的重组载体，其为原核载体。

5、如权利要求4所述的重组载体，它含有在大肠杆菌中有活性的复制原点。

6、如权利要求3-5中任一项所述的重组载体，其中编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的核酸序列处在明串珠菌启动子的控制之下。

7、如权利要求6所述的重组载体，其中启动子为葡糖-6-磷酸脱氢酶的天然启动子，并且SEQ ID No：1中所示核酸序列的前122个碱基含有由其衍生的具有启动子性质的序列或含有具有启动子性质之该区域的片段。

8、质粒pUC-G6p-DH1.8。

9、DNA，其为葡糖-6-磷酸脱氢酶基因的天然启动子，并且SEQ ID No：1中所示核酸序列的前122个碱基中含有由其衍生的具有启动子性质的序列或含有具有启动子性质之该区域的片段。

10、微生物，其中它已被权利要求2所述的DNA或权利要求3-8中任一项所述的重组载体转化。

11、如权利要求10所述的微生物，其为革兰氏阴性菌。

12、如权利要求11所述的微生物，其为大肠杆菌。

13、分离权利要求2所述DNA的方法，其中

（1）分离葡聚糖明串珠菌（DSM20187）DNA，并用合适的限制酶切割之，

（2）将切割后的葡聚糖明串珠菌DNA整合到一载体中，用该载体转化合适的宿主生物体，并以此方式产生基因库，

（3）用具有对葡糖-6-磷酸脱氢酶有特异性之序列的核酸探针筛选步骤（2）的基因库，

（4）分析与探针（3）发生阳性反应的基因库克隆。

14、如权利要求13所述的方法，其中所用探针的长度为50-80个核苷酸。

15、如权利要求13或14所述的方法，其中使用大肠杆菌作为宿主生物体。

16、分离如权利要求1所述之蛋白质的方法，该方法包括：

（1）用权利要求2所述的DNA或权利要求3-8中任一项所述的载体转化合适的宿主生物体，

（2）将转化后的宿主生物体培养于合适的培养基中，

（3）从培养基或细胞中浓缩蛋白质。

17、如权利要求16所述的方法，其中使用了原核宿主。

18、如权利要求17所述的方法，其中使用大杆菌作为宿主生物体。

19、样品溶液中葡糖-6-磷酸含量的酶测定法，其中使用葡糖-6-磷酸脱氢酶作为测定酶并且使用的是权利要求1所述的重组葡糖-6-磷酸脱氢酶。

20、对样品溶液中葡糖-6-磷酸含量进行酶测定的试剂，其中使用葡糖-6-磷酸脱氢酶作为测定酶，且该试剂含有权利要求1所述的重组葡糖-6-磷酸脱氢酶。