CN118028326A - 厌氧酶的无细胞反应体系及表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及厌氧酶的无细胞反应体系及表达方法，本申请的无细胞反应方法首先根据脱卤酶TmrA的生产条件特异性的配制无细胞反应体系，反应体系能满足脱卤酶TmrA的生产；此外，针对脱卤酶TmrA的生产需要厌氧环境的条件，设计了专用的反应容器，反应容器中采用氮气曝气搅拌的方式，满足了厌氧的反应条件；此外，反应器中利用透析膜将反应器分成了“反应区”和“缓冲液区”在反应器中，反应完成后，废液透析到缓冲液区，有效延长了蛋白反应时间，降低废液对蛋白反应的影响，有效提升了蛋白的产量。
Description
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，特别涉及厌氧酶的无细胞反应体系及表达方法。
【背景技术】
无细胞蛋白表达系统又称为体外翻译系统是一种相对胞内表达系统而言的开放表达系统。它以外源mRNA或DNA为模板在细胞抽提物的酶系中补充底物和能量来合成蛋白质。随着生物组学时代的到来无细胞蛋白质合成系统显示出快速、方便、易于高通量等优点，通常的蛋白表达是用细菌、酵母、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞等表达系统表达外源基因的一种分子生物学技术。该技术的出现极大促进了生物制品领域的发展，生产出了多种应用于人和动物疾病诊断和治疗的生物制品，保障了人和动物的生命健康。
大肠杆菌是一种典型的革兰氏阴性菌原核表达系统，也是最有效的异源蛋白生产者之一。利用该系统表达蛋白质是最简单、最快速和最便宜的。迄今为止，经过改造的大肠杆菌因其生长速度快(短至20～30min)，较强的连续发酵能力和相对较低的成本，已经成为广泛用于表达外源蛋白的宿主。目前有许多不同N末端和C末端标签的表达载体，并且针对特殊应用也正在优化许多不同的菌株。但是现在使用大肠杆菌作为无细胞蛋白表达系统生产蛋白的过程中会存在以下问题：1、针对不同的蛋白其表达需要的营养条件不同，反应体系的各成分会有所差别，需要针对不同的蛋白设计不同的反应液。2、在生产蛋白的过程中，通常反应1-2h就会停止反应。因此，如何提升无细胞蛋白表达系统的反应能力，提高蛋白产量是目前无细胞蛋白表达系统中亟待解决的技术问题。
【发明内容】
鉴于研究进展，有必要提供厌氧酶的无细胞反应体系及表达方法，该系统能提升无细胞蛋白表达系统的反应能力，提高蛋白产量，是目前的蛋白反应体系技术中研究的重点。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
无细胞反应体系，所述无细胞反应体系共20ml，包括如下成分：1.2mM的ATP和1.2mM的GTP、0.8mM的CTP、0.8mM的UTP、30mM的3-磷酸甘油酸、20种常见氨基酸各2mM、1mM的醋酸镁、3mM的二谷氨酸钾、质量百分浓度为4％的PEG 8000、5ml的LOBSTR-BL21(DE3)-RI的大肠杆菌细胞裂解液和5nM带有目的基因的重组质粒T7CF_8His-mcherry-TmrA。
进一步的，所述带有目的基因的重组质粒制备方法为：以T7p14-deGFP质粒为模板，采用NcoI和XhoI酶对质粒进行酶切，然后接入荧光蛋白基因8His-mcherry和目的基因TmrA，即得重组质粒T7CF_8His-mcherry-TmrA；所述目的基因TmrA的基因序列如SEQ IDNO.1所示。
本申请还包括一种应用所述无细胞反应体系生产TmrA酶的方法，所述方法为：
(1)构建带有目的基因的质粒以T7p14-deGFP质粒为模板，采用NcoI和XhoI酶对质粒进行酶切，然后接入荧光蛋白基因和目的基因，得到重组质粒T7CF_8His-mcherry-TmrA；所述目的基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)在无细胞反应体系中进行反应，所述无细胞反应体系共20ml，包括如下成分：1.2mM的ATP和1.2mM的GTP、0.8mM的CTP、0.8mM的UTP、30mM的3-磷酸甘油酸、20种常见氨基酸各2mM，1mM的醋酸镁,3mM的二谷氨酸钾,质量百分浓度为4％的PEG 8000、5ml的LOBSTR-BL21(DE3)-RI的大肠杆菌细胞裂解液、5nM步骤(1)构建的带有目的基因的重组质粒T7CF_8His-mcherry-TmrA。
进一步的，所述无细胞反应体系在蛋白反应器中进行反应，所述蛋白反应器从内到外依次为反应区和缓冲液区；所述反应区的由透析膜完全包裹形成；所述蛋白反应器还设有搅拌装置，搅拌装置包括位于缓冲液区的搅拌器和位于反应区的搅拌器。
进一步的，反应区内的搅拌器选用氮气曝气搅拌装置，氮气曝气搅拌装置包括进气管和位于反应区的曝气头，曝气头上设有多个曝气孔。
进一步的，反应缓冲液区的搅拌器选用氮气曝气搅拌装置和/或机械搅拌装置。
进一步的，所述透析膜的孔径小于目的蛋白的大小,本次表达过程中用到的是膜是3kDa。
进一步的，所述反应区和缓冲液区都使用氮气曝气搅拌装置，两区的最佳反应条件相同，氮气的流速均为200ml/min。
进一步的，所述反应区使用氮气曝气搅拌装置，缓冲液区使用机械搅拌装置，所述反应区的氮气的流速为200ml/min，所述缓冲液区的机械搅拌装置转速为180转/分钟。
进一步的，包括如下成分：1.2mM的ATP、1.2mM的GTP、0.8mM的CTP、0.8mM的UTP、30mM的3-磷酸甘油酸，20种常见氨基酸各2mM，1mM的醋酸镁,3mM的二谷氨酸钾,质量百分浓度为的4％ PEG 8000。
本发明中所有缓冲液、反应体系中提到的20种常见氨基酸及浓度为：2mM的甘氨酸、2mM的丙氨酸、2mM的缬氨酸、2mM的亮氨酸、2mM的异亮氨酸、2mM的脯氨酸、2mM的苯丙氨酸、2mM的酪氨酸、2mM的色氨酸、2mM的丝氨酸、2mM的苏氨酸、2mM的半胱氨酸、2mM的蛋氨酸、2mM的天冬酰胺、2mM的谷氨酰胺、2mM的天冬氨酸、2mM的谷氨酸、2mM的赖氨酸、2mM的精氨酸和2mM的组氨酸。
本发明具有如下有益效果：
本申请的无细胞反应方法首先根据TmrA酶的生产条件特异性的配制无细胞反应体系，反应体系能满足TmrA酶的生产；此外，针对TmrA酶的生产需要厌氧环境的条件，设计了专用的反应容器，反应容器中采用氮气曝气搅拌的方式，满足了厌氧的反应条件；此外，反应器中利用透析膜将反应器分成了“反应区”和“缓冲液区”在反应器中，反应完成后，废液排到缓冲液区，有效延长了蛋白反应时间，降低废液对蛋白反应的影响，有效提升了蛋白的产量。
【附图说明】
图1为T7CF_8His-mcherry-TmrA质粒的构建示意图；
图2不采用蛋白反应器和使用蛋白反应器不同时间点生产蛋白的表达图；
图3蛋白反应器的示意图；图中标号示意为：1-蛋白反应器、2-氮气曝气搅拌装置、3-泄压阀。
图4蛋白反应器的内部结构示意图；图中标号示意为：101-反应区、102-缓冲液区、3-泄压阀、201-进气管、202-曝气头、1011-透析膜、4-机械搅拌装置。
【具体实施方式】
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例1：
本实施例为采用厌氧酶的无细胞反应体系制备TmrA酶的方法，具体如下：
本实施例的无细胞反应体系共20ml包括如下成分：
①反应液：1.2mM的ATP、1.2mM的GTP、0.8mM的CTP、0.8mM的UTP、30mM的3-磷酸甘油酸、1mM的醋酸镁、3mM的二谷氨酸钾、质量百分浓度为的4％ PEG 8000、2mM的甘氨酸、2mM的丙氨酸、2mM的缬氨酸、2mM的亮氨酸、2mM的异亮氨酸、2mM的脯氨酸、2mM的苯丙氨酸、2mM的酪氨酸、2mM的色氨酸、2mM的丝氨酸、2mM的苏氨酸、2mM的半胱氨酸、2mM的蛋氨酸、2mM的天冬酰胺、2mM的谷氨酰胺、2mM的天冬氨酸、2mM的谷氨酸、2mM的赖氨酸、2mM的精氨酸和2mM的组氨酸；
②5ml LOBSTR-BL21(DE3)-RI的大肠杆菌细胞裂解液；
③5nM带有目的基因的重组质粒T7CF_8His-mcherry-TmrA。
其中，LOBSTR-BL21(DE3)-RI大肠杆菌细胞裂解液的制备方法为：采用LB培养基对大肠杆菌进行培养，培养到OD600达到2.0时进行细胞破碎，离心、去掉细胞碎片，保留上清液I。上清液在37℃恒温培养箱中孵育2小时，然后15000rpm/min离心，去掉沉淀，保留上清II。将上清液II放入3kDa透析袋中，对50mM HEPES pH 8.0,150mM NaCl过夜透析，最后得到大肠杆菌裂解液。
重组质粒T7CF_8His-mcherry-TmrA的构建方法为(质粒的构建示意图如图1所示)：
(1)以T7p14-deGFP质粒为模板，采用NcoI和XhoI酶对质粒进行酶切，然后接入荧光蛋白基因和目的基因，并将目的基因质粒命名为T7CF_8His-mcherry-TmrA；所述目的基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示；
其中，酶切反应具体为：采用NcoI和XhoI酶对质粒T7p14-deGFP进行酶切，酶切体系(总体积为50μL)：NcoI酶2μL，XhoI酶2μL，10×H Buffer 5μL，T7p14-deGFP质粒41μL。置37℃水浴锅中作用4h，酶切产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，再进行胶回收及目的片段的纯化。
其中，目的基因和荧光蛋白基因的连接用T4 DNA连接酶连接酶切、纯化、回收的目的片段与质粒，连接体系(总体积为20μL)：T4 DNA连接酶1μL，10×Buffer 2μL，酶切带目的荧光基因片段的基因片段2μL、酶切质粒2μL，ddH2O 13μL。16℃过夜连接。取连接产物10μL，加到冰上解冻的大肠杆菌Top10感受态细胞中，吹打混匀后在冰上孵育30min，42℃水浴热激45s，再冰浴2min。随后向离心管中加入LB培养基100μL，振荡培养1h；取出菌液，4 000r/min离心2min；吸弃上清液850μL，将剩余菌液与沉淀吹打混匀，涂布于含氨苄西林的LB营养琼脂上，37℃培养12～16h。
(2)PCR鉴定及测序挑取LB营养琼脂上的单个菌落接种于含氨苄西林的LB培养基中，振荡培养12h后进行菌液PCR鉴定。选取阳性克隆菌液提取质粒并测序，选取测序正确的含目的序列的质粒。
(3)构建无细胞反应体系并进行反应：按照上述配方构建无细胞反应体系，将反应液、裂解液和重组质粒一起放入反应体系中，在无氧条件下反应16小时。
实施例2：
本实施例为采用反应器配合反应体系制备厌氧酶的方法，具体如下：
1、按照实施例1的方法构建重组质粒T7CF_8His-mcherry-TmrA。
2、按照实施例1的无细胞反应体系(总体积20ml)将步骤1的重组质粒5nM与反应液(1.2mM的ATP、1.2mM的GTP、0.8mM的CTP、0.8mM的UTP、30mM的3-磷酸甘油酸、1mM的醋酸镁、3mM的二谷氨酸钾、质量百分浓度为的4％ PEG 8000、2mM的甘氨酸、2mM的丙氨酸、2mM的缬氨酸、2mM的亮氨酸、2mM的异亮氨酸、2mM的脯氨酸、2mM的苯丙氨酸、2mM的酪氨酸、2mM的色氨酸、2mM的丝氨酸、2mM的苏氨酸、2mM的半胱氨酸、2mM的蛋氨酸、2mM的天冬酰胺、2mM的谷氨酰胺、2mM的天冬氨酸、2mM的谷氨酸、2mM的赖氨酸、2mM的精氨酸和2mM的组氨酸)和5ml的LOBSTR-BL21(DE3)-RI的大肠杆菌细胞裂解液混匀后放入蛋白反应器(1)的反应区(101)中进行无细胞反应。并在缓冲液区加入缓冲液反应液(1.2mM的ATP、1.2mM的GTP、0.8mM的CTP、0.8mM的UTP、30mM的3-磷酸甘油酸、1mM的醋酸镁、3mM的二谷氨酸钾、质量百分浓度为的4％PEG 8000、2mM的甘氨酸、2mM的丙氨酸、2mM的缬氨酸、2mM的亮氨酸、2mM的异亮氨酸、2mM的脯氨酸、2mM的苯丙氨酸、2mM的酪氨酸、2mM的色氨酸、2mM的丝氨酸、2mM的苏氨酸、2mM的半胱氨酸、2mM的蛋氨酸、2mM的天冬酰胺、2mM的谷氨酰胺、2mM的天冬氨酸、2mM的谷氨酸、2mM的赖氨酸、2mM的精氨酸和2mM的组氨酸)。
其中，蛋白反应器(1)从内到外依次为反应区(101)和缓冲液区(102)；所述反应区(101)的由透析膜(1011)完全包裹形成；此外，为了加强反应区(101)的反应能力，加强废物的排出，所述蛋白反应器(1)还设有搅拌装置，搅拌装置包括位于缓冲液区(102)的搅拌器和位于反应区(101)的搅拌器。
为了维持系统的“无氧”条件，反应区(101)内的搅拌器选用氮气曝气搅拌装置(2)，氮气曝气搅拌装置(2)包括进气管(201)和位于反应区(101)的曝气头(202)，曝气头(202)上设有多个曝气孔。
为了加快反应区(101)内的废液流出，缓冲液区(102)的搅拌器选用氮气曝气搅拌装置(2)和/或机械搅拌装置(4)。
为了平衡气压，蛋白反应器的顶部还设有泄压阀(3)。
为了使生产的蛋白能被约束在反应区(101)内，所述透析膜(1011)的孔径小于目的蛋白的大小。
本实施例中，如果反应区(101)和缓冲液区(102)都使用氮气曝气搅拌装置(2)的条件下，两区的最佳反应条件相同，氮气的流速均为200ml/min。
如果反应区使用氮气曝气搅拌装置而缓冲液区(102)使用机械搅拌装置(4)的条件下，反应区的最佳反应条件为：氮气的流速在200ml/min，缓冲液区(102)机械搅拌装置转速为180转/分钟。
不同条件下进行无细胞生产TmrA酶的效率，具体如下：
采用实施例1的方法生产TmrA酶，即不使用本申请专用的蛋白反应器(1)，在反应1-2h后反应停止，TmrA酶的产量仅为0.5mg/10ml。
采用实施例2的方法生产TmrA酶，在氮气流速为200ml/min的条件下，反应8小时后反应停止，TmrA酶的产量为6mg/10ml。
采用实施例2的方法生产TmrA酶，在氮气流速为200ml/min的条件下，反应16小时后反应停止，TmrA酶的产量为16mg/10ml。
此外，申请人还进行了如下对照实验：
对照组：采用普通大肠杆菌表达系统和常规方法生产TmrA酶；20℃，0.1mM IPTG诱导表达时间为16h。
实验组：采用本申请实施例2的方法生产TmrA酶，在氮气流速为200ml/min的条件下，分别在反应30min、反应60min、反应180min、反应8h、反应16h的条件下进行一次蛋白印记反应。
得到的结果如图2所示，从图中可见：采用普通大肠杆菌表达系统生产TmrA酶产量极低，蛋白几乎不表达，而采用本申请实施例2的方法生产TmrA酶，开始时产量不高，但随着时间的推移产量越来越高，甚至在反应到达16h时仍能产生TmrA酶，这也进一步说明了使用实施例2的方法生产TmrA酶，能显著提升酶产量、延长酶的反应时间。
综上所述，使用本申请的蛋白反应器和反应体系相互配合，能显著提升TmrA酶的产量、延长TmrA酶的反应时间，反应体系是根据TmrA酶的生产条件而设定的，本申请还根据TmrA酶的反应条件设计了专用的反应容器，配合特定的反应条件有效提升了TmrA酶的产量。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.无细胞反应体系，其特征在于，所述无细胞反应体系共20ml，包括如下成分：1.2mM的ATP和1.2mM的GTP、0.8mM的CTP、0.8mM的UTP、30mM的3-磷酸甘油酸、20种常见氨基酸各2mM、1mM的醋酸镁、3mM的二谷氨酸钾、质量百分浓度为4％的PEG 8000、5ml的LOBSTR-BL21(DE3)-RI的大肠杆菌细胞裂解液和5nM带有目的基因的重组质粒T7CF_8His-mcherry-TmrA。
2.根据权利要求1所述的无细胞反应体系，其特征在于，所述带有目的基因的重组质粒制备方法为：以T7p14-deGFP质粒为模板，采用NcoI和XhoI酶对质粒进行酶切，然后接入荧光蛋白基因8His-mcherry和目的基因TmrA，即得重组质粒T7CF_8His-mcherry-TmrA；所述目的基因TmrA的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种应用如权利要求1或2所述无细胞反应体系生产TmrA酶的方法，其特征在于，所述方法为：
(1)构建带有目的基因的质粒以T7p14-deGFP质粒为模板，采用NcoI和XhoI酶对质粒进行酶切，然后接入荧光蛋白基因和目的基因得到重组质粒T7CF_8His-mcherry-TmrA；所述目的基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)在无细胞反应体系中进行反应，所述无细胞反应体系共20ml，包括如下成分：1.2mM的ATP和1.2mM的GTP、0.8mM的CTP、0.8mM的UTP、30mM的3-磷酸甘油酸、20种常见氨基酸各2mM，1mM的醋酸镁,3mM的二谷氨酸钾,质量百分浓度为4％的PEG 8000、5ml的LOBSTR-BL21(DE3)-RI的大肠杆菌细胞裂解液、5nM步骤(1)构建的带有目的基因的重组质粒T7CF_8His-mcherry-TmrA。
4.根据如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述无细胞反应体系在蛋白反应器中进行反应，所述蛋白反应器从内到外依次为反应区和缓冲液区；所述反应区的由透析膜完全包裹形成；所述蛋白反应器还设有搅拌装置，搅拌装置包括位于缓冲液区的搅拌器和位于反应区的搅拌器。
5.根据如权利要求3所述的方法，其特征在于，反应区内的搅拌器选用氮气曝气搅拌装置，氮气曝气搅拌装置包括进气管和位于反应区的曝气头，曝气头上设有多个曝气孔。
6.根据如权利要求3所述的方法，其特征在于，反应缓冲液区的搅拌器选用氮气曝气搅拌装置和/或机械搅拌装置。
7.根据如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述透析膜的孔径小于目的蛋白的大小。
8.根据如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述反应区和缓冲液区都使用氮气曝气搅拌装置，两区的最佳反应条件相同，氮气的流速均为200ml/min。
9.根据如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述反应区使用氮气曝气搅拌装置，缓冲液区使用机械搅拌装置，所述反应区的氮气的流速为200ml/min，所述缓冲液区的机械搅拌装置转速为180转/分钟。
10.根据如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述缓冲液区的缓冲液包括如下成分：1.2mM的ATP、1.2mM的GTP、0.8mM的CTP、0.8mM的UTP、30mM的3-磷酸甘油酸，20种常见氨基酸各2mM，1mM的醋酸镁,3mM的二谷氨酸钾,质量百分浓度为的4％PEG 8000。
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