CN110904102A - 一种用于重组蛋白质表达的启动子 - Google Patents

一种用于重组蛋白质表达的启动子 Download PDF

Info

Publication number
CN110904102A
CN110904102A CN201910846490.XA CN201910846490A CN110904102A CN 110904102 A CN110904102 A CN 110904102A CN 201910846490 A CN201910846490 A CN 201910846490A CN 110904102 A CN110904102 A CN 110904102A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bl21star
coli
strain
promoter
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910846490.XA
Other languages
English (en)
Inventor
杨晟
杨俊杰
王金刚
梁岩
杨海锋
陶荣盛
蒋宇
孙小曼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Original Assignee
Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS filed Critical Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority to PCT/CN2019/105130 priority Critical patent/WO2020057397A1/zh
Publication of CN110904102A publication Critical patent/CN110904102A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/68—Stabilisation of the vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
    • C12Y101/03004—Glucose oxidase (1.1.3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01002—Formate dehydrogenase (1.2.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07006—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种lacUV5启动子突变体SEQ ID NO:1，其能够促进T7RNA聚合酶的表达，提高外源重组蛋白质在大肠杆菌中的表达水平，延长表达时间，从而增加重组蛋白质生产量，具有商业应用前景。

Description

一种用于重组蛋白质表达的启动子
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种用于重组蛋白质表达的启动子，具体地说，涉及一种lacUV5启动子突变体及其在促进重组蛋白质表达中的用途。
背景技术
大肠杆菌BL21(DE3)是常用的表达外源重组蛋白的优秀宿主，BL21(DE3)宿主菌是噬菌体λDE3侵染BL21形成的大肠杆菌，基因组DE3位置中的T7RNA聚合酶也来自于λDE3噬菌体。DE3溶源菌区域含有一个免疫区域，该DNA片段含有T7RNA聚合酶，由lacUV5启动子控制，另外该DNA片段区域还有一个lacI基因表达框。在BL21(DE3)中，含有T7RNA聚合酶的免疫区域整合到了基因组染色体上int基因处，使得该免疫区域可以在基因组染色体中稳定存在。作为一种lac启动子，lacUV5启动子能够在没有代谢物激活蛋白(catabolite activatorprotein，CAP)的存在下有效地起始转录，其转录水平只受LacI蛋白的调控。
在大肠杆菌中，pET系统被广泛用来表达外源重组蛋白。一般将目标蛋白基因置于T7启动子下游，而T7启动子只能由T7RNA聚合酶起始转录。T7RNA聚合酶具备高催化活力，它的转录速度比大肠杆菌内源的RNA聚合酶的转录速度快约8倍。当T7RNA聚合酶被充分诱导时，能够利用细胞中的大部分材料来起始目的蛋白的转录，且在数小时后，目标蛋白能够超过细胞总蛋白的50％。
由于T7RNA聚合酶基因在DE3溶源菌中的启动子是lacUV5，其是一种较强的启动子，所以在没有外源添加IPTG(异丙基β-D-半乳糖苷，Isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)的诱导下，T7RNA聚合酶也能有较低水平的渗漏表达。外源蛋白在体内表达会对细胞产生毒性，干扰菌体生长。pET表达系统在以下几方面严谨控制渗漏表达。
利用含有质粒pLysS或者pLysE的宿主(两种宿主中均有T7RNA溶菌酶基因的质粒)可抑制T7RNA聚合酶的活性。由于含有pLysS或pLysE的宿主中可表达T7溶菌酶，T7溶菌酶是T7RNA聚合酶的一种抑制剂，可结合在T7RNA聚合酶上，抑制它的活性。在细胞中表达含有T7溶菌酶的质粒可抑制T7RNA聚合酶起始转录，含pLysS的宿主表达的T7溶菌酶的量比含pLysE中的低，pLysE对细胞的生长有影响。但是含pLysS或pLysE的宿主能够增加宿主对毒性蛋白的耐受程度。
另外当培养基中含有葡萄糖时也能降低T7RNA聚合酶的转录。有研究报道，在培养基加入葡萄糖可显著降低T7RNA聚合酶的产量，并且当重组蛋白对宿主有毒性作用，宿主细胞中无pLysS或pLysE时，可显著降低蛋白渗透表达对细胞的毒性作用。
综上，pET表达系统对于表达常规蛋白或毒性蛋白均有可调控之处，利用pET系统联合各种策略，可增加宿主对毒性蛋白的耐受能力，增加毒性蛋白的产量。
用大肠杆菌BL21(DE3)作为底盘细胞来表达外源蛋白的研究有很多，但是以BL21(DE3)为宿主表达某些毒蛋白却受到限制，比如利用牛肉桂酸-苹果酸运输蛋白(OGCP)和大肠杆菌F型ATP酶亚基b(Ecb)两种蛋白不能在BL21(DE3)中表达，表现为导入相关质粒诱导表达，细胞不能正常生长。
大肠杆菌BL21StarTM(DE3)(后称Star)本用来高表达蛋白，经过测试，在大多数情况下，它表达蛋白的能力比BL21(DE3)要高2-10倍。用来表达蛋白质的大肠杆菌主要有Star和BL21StarTM(DE3)pLysS两种。这两株菌株均有T7RNA聚合酶基因，由lacUV5控制。在BL21StarTM(DE3)pLysS中有表达T7RNA聚合酶抑制蛋白的蛋白，于是可减少蛋白毒性影响。当外源蛋白在高拷贝的载体上时，BL21StarTM(DE3)pLysS比Star更好。
因此如何克服大肠杆菌比如BL21(DE3)表达外源蛋白甚至毒性蛋白的限制瓶颈、增加外源蛋白的产量始终是科研人员追求的目标。
有研究表明，当lacUV5突变成lac启动子(由强变弱)导致BL21(DE3)基因组上的T7RNA聚合酶转录的速度减慢，有效地降低了外源毒性蛋白表达对细胞造成的毒性。
发明内容
现有技术的上述研究给我们带来了一种启示，通过启动子lacUV5突变，或许能够强化T7RNA聚合酶的表达，这对于增加外源重组蛋白质(甚至包括外源毒性蛋白)表达是有利的。为了达到上述目的，发明人通过对大肠杆菌BL21StarTM(DE3)基因组中驱动T7RNA聚合酶表达的lacUV5启动子进行改造，获得的改造菌株在导入某些蛋白质的pET表达质粒时，生产这些蛋白质的时间更为持久，从而获得更高的重组蛋白质产量。这一发现构成了本发明的基础，具体而言，本发明包括如下技术方案：
一种lacUV5启动子突变体，其碱基序列为SEQ ID NO:1：
5’-TTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTG-3’(SEQ ID NO:1)。
该突变体是lacUV5启动子碱基序列SEQ ID NO:2的-10区碱基AA变为GT的突变序列。5’-TTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATG-3’(SEQ ID NO:2)。
根据本发明的第二个方面，提供了一种T7RNA聚合酶基因表达盒，其包含上述的lacUV5启动子突变体和位于其下游的T7RNA聚合酶编码基因。
根据本发明的第三个方面，提供了一种大肠杆菌，其基因组中包含上述的T7RNA聚合酶基因表达盒。
优选地，上述被改造的菌株选自大肠杆菌BL21(DE3)、BL21StarTM(DE3)或者BL21StarTM(DE3)pLysS。
本发明还提供了一种构建上述大肠杆菌的方法，包括如下步骤：将基因组中位于T7RNA聚合酶基因上游的lacUV5启动子的-10区碱基AA变为GT；或者将上述的T7RNA聚合酶基因表达盒整合入大肠杆菌比如BL21(DE3)或者BL21StarTM(DE3)的基因组中。
在一种实施方式中，当被改造的菌株是大肠杆菌BL21StarTM(DE3)时，将基因组中T7RNA聚合酶编码基因前的lacUV5启动子的-10区碱基AA变为GT。优选地，可以利用基因编辑技术比如CRISPR-Cas技术将基因组中的lacUV5启动子的-10区碱基AA变为GT。
根据本发明的另一个方面，提供了上述大肠杆菌在表达重组蛋白质中的应用。
例如，上述重组蛋白质可以是头孢菌素C酰化酶(CPC酰化酶)、酰胺水解酶、甲酸脱氢酶(FDH)、或者葡萄糖脱氢酶(GDH)等等。
在一种优选的实施方式中，上述应用是将表达外源重组蛋白质的重组质粒(比如pET质粒，优选pET24a)转化入上述的大肠杆菌中，通过发酵进行重组蛋白质的生产。
优选地，上述方法包括下述步骤：。
(1)构建如权利要求3所述的大肠杆菌作为宿主；
(2)构建用于表达重组蛋白质的重组质粒；
(3)将步骤(2)中构建的重组质粒转化入步骤(1)中构建的宿主菌株，得到重组大肠杆菌；
(4)使用步骤(3)中构建的重组大肠杆菌进行发酵，生产外源重组蛋白质。
上述转化方法比如是氯化钙转化法或者电转化法，优选电转化法。
优选地，上述方法还包括下述步骤：
(5)从发酵液上清液中分离出外源重组蛋白质。
实验表明，本发明的lacUV5启动子突变体SEQ ID NO:1能够强化T7RNA聚合酶的表达，从而促进外源重组蛋白质比如头孢菌素C酰化酶、酰胺水解酶、甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶等在大肠杆菌中的表达分泌，具有推广应用前景。
附图说明
图1是本发明构建的pET24a-头孢菌素C酰化酶质粒的结构示意图。
图2是本发明构建的菌株摇瓶培养后的葡萄糖脱氢酶和甲酸脱氢酶的酶活测定对比柱形图。图中显示了葡萄糖脱氢酶(GDH)和甲酸脱氢酶(FDH)菌株摇瓶培养液的OD600、每毫升细胞干重(DCW)、每毫升细胞湿重(WCW)以及每毫升发酵液酶活力的对比情况。其中1和3组的表达宿主为StarlacA1G，第2和4组的表达宿主为BL21StarTM(DE3)即Star。
图3是本发明构建的葡萄糖脱氢酶生产菌株CIBTS2808和BL21StarTM(DE3)上罐发酵表达葡萄糖脱氢酶的对比曲线图。
图4是本发明构建的菌株BL21(DE3)PlacA1G(图中简写为DE3A1G)及BL21StarTM(DE3)PlacA1G(图中简写为StarA1G)分别在摇瓶发酵时表达的葡萄糖脱氢酶、头孢菌素C酰化酶及酰胺水解酶与对应的出发菌株BL21(DE3)(图中简写为DE3)及BL21StarTM(DE3)(图中简写为Star)表达的SDS-PAGE对比图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
在本文中，术语“T7RNA聚合酶基因表达盒”、“基因表达盒”和“表达盒”表示相同的意义，可以互换使用，都是指包含lacUV5启动子突变体SEQ ID NO:1和其下游T7RNA聚合酶编码基因的一段DNA序列。
本领域技术人员容易理解，大肠杆菌BL21Star(DE3)、BL21StarTM(DE3)、BL21StarTM(DE3)或BL21StarTM(DE3)pLysS有时会分别书写为BL21(DE3)Star、BL21(DE3)StarTM、BL21(DE3)StarTM或BL21(DE3)StarTMpLysS，即符号“Star(或StarTM)”与“(DE3)”的位次可以颠倒，但表示相同的菌株，仅是书写习惯差异。
大肠杆菌BL21(DE3)中的DE3是噬菌体侵染的结果，基因组DE3位置中的T7RNA聚合酶也来自于λDE3噬菌体。T7RNA聚合酶介导的转录比大肠杆菌内源的RNA聚合酶要快8倍多。DE3中T7RNA聚合酶的启动子是lac启动子的一种突变体lacUV5，该启动子比lac启动子要强。由于现在通用表达外源蛋白为pET系统，而pET系统上启动目标蛋白转录的是T7启动子，T7启动子只能由T7RNA聚合酶所识别并起始转录，大肠杆菌内源的RNA聚合酶不能启动T7启动子而无法表达外源蛋白。
用大肠杆菌BL21(DE3)/pET质粒表达的基因，有些情况下由于在发酵后期会发生菌体自溶，从而限制相应重组蛋白质的生产量。
本发明开发的lacUV5启动子突变体SEQ ID NO:1可有效地启动转录，促进外源蛋白质的表达，延长表达时间，提高大肠杆菌BL21StarTM(DE3)内的外源蛋白质产率，因而更具有商业价值。
甚至对于带有表达效果不佳的蛋白的编码基因的表达质粒，在将其转化到含lacUV5启动子SEQ ID NO:1的大肠杆菌宿主后，即便其他条件不变，也能够获得更高的重组蛋白质生产量。
在实施例中，有时将lacUV5启动子突变体SEQ ID NO:1称为lacA1G启动子或lacUV5AA-10GT启动子。为描述简单起见，有时将含lacUV5启动子SEQ ID NO:1的大肠杆菌宿主BL21(DE3)/BL21StarTM(DE3)也简称为大肠杆菌(DE3)lacA1G/StarlacA1G，以便本领域技术人员能够清楚地理解启动子与宿主菌的内在关系。
在实施例中，为描述方便起见，有时将lacUV5启动子SEQ ID NO:2未突变的宿主大肠杆菌BL21StarTM(DE3)比如BL21StarTM(DE3)pLysS中导入了重组蛋白质表达质粒的重组大肠杆菌工程菌皆简称为BL21StarTM(DE3)或者Star，相对应地将lacUV5启动子已经突变为SEQ ID NO:1的宿主大肠杆菌BL21StarTM(DE3)比如BL21StarTM(DE3)pLysS中导入了重组蛋白质表达质粒的重组大肠杆菌工程菌皆简称为BL21StarTM(DE3)PlacA1G或者StarlacA1G，尽管重组蛋白质的种类不同、甚至质粒骨架(比如不限于pET或pET24a质粒)也可以不同。本领域技术人员能够清楚地理解这样的统一简称目的主要是为了区分lacUV5启动子突变与否。
实施例
材料和方法
实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。比如感受态细胞转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆实验指南》(第三版)第1章96页进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
大肠杆菌BL21StarTM(DE3)由金斯瑞生物科技有限公司提供。
实施例1：启动子lacUV5突变
参照文献(Jiang Y,et al.,Multigene editing in the Escherichia coligenome using the CRISPR-Cas9 system.Appl Environ Microbiol.2015Jan 30.pii:AEM.04023-14.)公开的方法，运用CRISPR-Cas技术将大肠杆菌BL21(DE3)及BL21StarTM(DE3)的T7RNA聚合酶编码基因前的lacUV5启动子SEQ ID NO:2的-10区碱基AA变为GT，得到lacUV5启动子突变体SEQ ID NO:1，BL21(DE3)改造后的菌株命名为BL21(DE3)lacA1G、(DE3)lacA1G或(DE3)lacUV5AA-10GT，BL21StarTM(DE3)改造后的菌株命名为StarlacA1G或Star lacUV5AA-10GT。基因改造后的大肠杆菌中lacUV5启动子已经由SEQ ID NO:2突变为SEQ ID NO:1。
具体步骤包括：
1.1构建pTarget-PlacUV5质粒
以pTargetF质粒为模板，采用引物对PlacN20F和impN20R进行reverse PCR，得到长度约为2.1kb的DNA片段。
PlacN20F：
5’-CCTAGGTATAATACTAGTCTTCCGGCTCGTATAATGTGGTTTTAGAGCTAGAAAT AGC-3’(SEQID NO:3)；
impN20R：
5’-ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAGGATC-3’(SEQ ID NO:4)。
电泳凝胶回收该DNA片段，然后将该克隆片段通过化学转化法转入DH5α转感受态细胞中，涂布壮观霉素抗性LB平板，37℃培养过夜，次日挑菌落接试管保菌即可。
1.2修复模板的获得
以lacUV5MU-F/lacUV5MU-R为引物和模版，PCR扩增lacUV5*(HR)片段，得到长度约100bp的DNA片段，其包含lacUV5启动子突变体SEQ ID NO:1，已经将lacUV5启动子的-10区碱基AA变为GT。
lacUV5MU-F：
5’-TAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTAT GTTGTG-3’(SEQ ID NO:5)；
lacUV5MU-R：
5’-CTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGC CGGAAG-3’(SEQ ID NO:6)。
1.3含lacA1G启动子的大肠杆菌获得
a.参照文献(Jiang Y,et al.,Appl Environ Microbiol.2015Jan 30.)，转化质粒A(pCas)至宿主菌BL21(DE3)和BL21StarTM(DE3)，涂kan平板，30℃进行筛选。
b.挑取阳性克隆子，制备电转感受态细胞，在离心收集前1小时加入10mM的阿拉伯糖诱导RED的表达。
c.电转化法转入步骤1.1中所得的pTarget-PlacUV5质粒和步骤1.2中所得的修复模板片段，30℃复苏1小时后，以kan+spc平板进行筛选。
d.过夜培养后对克隆子进行验证。
e.阳性克隆子接LB液体(kan抗性)，加入0.5mM的IPTG培养8-20小时，划线分单菌(kan平板)，并验证质粒B(pTarget-PlacUV5)的消除。
f.质粒B消除的阳性菌重新进行下轮的基因替换操作。
g.37℃液体培养，划线分单菌(无抗平板，37℃培养)，点板或液体培养验证消除质粒A(pCas)，得到大肠杆菌(DE3)lacA1G及StarlacA1G，其基因组中的启动子lacUV5已突变为SEQ ID NO:1。以该大肠杆菌(DE3)lacA1G及StarlacA1G为宿主，进行外源重组蛋白质的表达生产。
实施例2：头孢菌素C酰化酶生产菌株的构建
2.1对于Pseudomonas sp.GK16来源的头孢菌素C酰化酶，根据专利申请WO2017143945A1中已经公布的头孢菌素C酰化酶基因SEQ ID NO:10，通过全基因合成的方式合成该核酸序列。在该头孢菌素C酰化酶基因两端设计限制性内切酶位点NdeI和XhoI，亚克隆到载体pET24a(Novagen)的相应位点，获得重组质粒pET24a-头孢菌素C酰化酶。pET24a-头孢菌素C酰化酶质粒图谱结构如图1所示。
2.2将pET24a-头孢菌素C酰化酶质粒分别转化至BL21StarTM(DE3)和StarlacA1G宿主中，获得采用pET24a-头孢菌素C酰化酶/BL21StarTM(DE3)和pET24a-头孢菌素C酰化酶/StarlacA1G两种宿主不同的头孢菌素C酰化酶生产菌株。
2.3同样地，将pET24a-头孢菌素C酰化酶质粒分别转化至BL21(DE3)及BL21(DE3)lacA1G宿主中，分别构建出用于表达头孢菌素C酰化酶的另两种生产菌株pET24a-头孢菌素C酰化酶/BL21(DE3)和pET24a-头孢菌素C酰化酶/BL21(DE3)lacA1G。以摇瓶发酵的方式检测四种宿主发酵液中头孢菌素C酰化酶的酶活情况。
实施例3：头孢菌素C酰化酶的酶活检测
3.1菌体培养
分别挑取pET24a-头孢菌素C酰化酶/BL21StarTM(DE3)和pET24a-头孢菌素C酰化酶/StarlacA1G两种菌体各3个单克隆菌落，分别接种至5ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜。各取0.5ml过夜培养物，接种至50ml含有50μg/ml硫酸卡那霉素的TB培养基中，37℃，250rpm摇床培养2-3h，至OD600 1-1.2时，加入1mM IPTG，25℃，200rpm培养20小时。
LB培养基：酵母抽提物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。
TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母抽提物24g/L，甘油0.4％(v/v)，高压蒸汽灭菌，当溶液冷却至60℃时加入10％(v/v)无菌的0.17mol/L KH2PO4和0.72mol/L K2HPO4。
3.2菌体前处理
将上述发酵的每个摇瓶取600μl的菌液置于96孔板，4℃，5000rpm，离心10min，弃上清，置于-80℃冷冻大于30min，然后室温融化30min。加入400μl裂解液(0.1M pH8.0磷酸钾盐缓冲液，1mg/ml溶菌酶，0.1mg/ml DNA酶)重悬菌体，然后放入37℃摇床中，180rpm孵育1小时，取20μl上清，用于头孢菌素C酰化酶活力测定。
3.3建立酶活标准曲线
配制1mg/ml7-氨基头孢烷酸(简称7-ACA)溶液：将20mg 7-ACA加入20ml 0.1M磷酸钾盐缓冲液(pH8.0)中溶解完全即得。
用1mg/ml 7-ACA溶液及0.1M磷酸钾盐缓冲液(pH8.0)配制浓度分别为0mg/ml、0.15mg/ml、0.3mg/ml、0.45mg/ml、0.6mg/ml、0.75mg/ml和1mg/ml的7-ACA溶液；取不同浓度的7-ACA溶液各400μl，分别加入2ml的终止反应液(0.05M NaOH，20％v/v冰醋酸)混匀，然后再向溶液中加入400μl的显色液(0.5wt％的PDAB甲醇溶液)，显色10min；分别取240μl检测415nm下的吸光度，然后将数据做成标准曲线，作为头孢菌素C酰化酶的酶活标准曲线。
3.4头孢菌素C酰化酶的酶活测定
底物反应液：含2wt％头孢菌素C钠盐的0.1M磷酸钾盐缓冲液(pH8.0)，
终止反应液：0.05M NaOH，20％v/v冰醋酸，
显色液：含0.5wt％的PDAB甲醇溶液。
酶活力定义：在37℃下每分钟催化头孢菌素C底物产生1μmol 7-ACA所需要的酶量定义为1个单位(U)。
将20μl步骤3.2中处理后的菌液加到20μl底物反应液中，在37℃的条件下反应10min，迅速加入200μl终止反应液，然后4℃，5000rpm离心10min。取200μl离心上清，加入40μl显色剂，室温反应10min后，检测415nm下的吸光度。通过与酶活标准曲线进行比对，确定菌液的酶活力。
3.5实验结果
两种菌液的头孢菌素C酰化酶酶活力测定结果显示，StarlacA1G菌液的单位OD酶活力比Star菌液的单位OD酶活力高出60％，表明StarlacA1G作为宿主对头孢菌素C酰化酶的表达较BL21StarTM(DE3)宿主有明显的促进作用，提示StarlacA1G宿主中的启动子突变体提高了头孢菌素C酰化酶的表达。
实施例4：甲酸脱氢酶生产菌的酶活测定
4.1参照实施例2的方法，构建用于表达甲酸脱氢酶(FDH)的pET24a-甲酸脱氢酶质粒。构建方法参见文献Tao RS,Jiang Y,Zhu FY,Yang S.A one-pot system forproduction of L-2-aminobutyric acid from L-threonine by L-threonine deaminaseand a NADH-regeneration system based on L-leucine dehydrogenase and formatedehydrogenase,Biotechnol Lett,April2014,Volume 36,Issue 4,pp 835–841。
将pET24a-甲酸脱氢酶质粒分别转化至BL21StarTM(DE3)和StarlacA1G宿主中，获得采用pET24a-甲酸脱氢酶/BL21StarTM(DE3)(简写为BL21StarTM(DE3))和pET24a-甲酸脱氢酶/StarlacA1G(简写为BL21StarTM(DE3)PlacA1G)两种宿主不同的甲酸脱氢酶生产菌株。以如下方式检测两种宿主发酵液中甲酸脱氢酶的酶活情况。
4.2摇瓶发酵培养
参照实施例3.1的方法，将经过过夜划板的菌落，每个挑选3株分别接种至装有5ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB液体培养基的试管中，置于37℃，250rpm摇床中培养约12～16个小时，然后以1％v/v接种于装有30ml LB培养基的250ml摇瓶中，置于37℃，250rpm摇床中培养约6个小时，测OD600值在3～4之间，加入终浓度为0.3mM的IPTG，将摇瓶置于28℃，250rpm摇床中培养约20个小时。
4.3菌体细胞破碎
将摇瓶培养的菌体，每个摇瓶取20ml的菌液置于50ml离心管中，将50ml离心管置于离心机中，在8000rpm，15min，4℃条件下离心去除培养基，然后将去除培养基的50ml离心管置于纸上倒扣约5min，将细胞液溶解成20g/L，放入细胞破碎仪中破碎，功率200W，工作3s，间隔5s，60次即可获得细胞破碎液。
4.4甲酸脱氢酶酶活的测定
将事先配制好的1M甲酸铵(pH7.5)、0.1M Tris-HCl(pH7.5)、40mM NAD+溶液放入预先预热的30℃水浴锅，预热约10min左右。将分光光度计波长调至340nm。按照1M甲酸铵(pH7.5)、0.1M Tris-HCl(pH7.5)3.3ml、40mM NAD+溶液200μl、稀释后酶液100μl的比例加入比色皿中(操作越快越好)，每隔15s记录340nm的吸光度。通过与酶活标准曲线进行比对，确定菌液的酶活力。
两种菌液的甲酸脱氢酶酶活力测定结果显示于图2中。从图2中可以看出，在甲酸脱氢酶的发酵中，BL21StarTM(DE3)PlacA1G宿主的OD600较高；每毫升酶活也相对较高，菌株BL21StarTM(DE3)PlacA1G发酵液酶活力比菌株BL21StarTM(DE3)提高约33％。
实施例5：酰胺水解酶生产菌株的构建
5.1对于Brevundimonas diminuta TPU 5720来源的酰胺水解酶，在NCBI网站上获得该酶的核苷酸序列(GenBank:AB205151.1)，并通过全基因合成的方式合成该序列。在该酰胺水解酶基因两端设计限制性内切酶位点NdeI和Sa1I，亚克隆到载体pET24a(Novagen)的相应位点，获得pET24a-酰胺水解酶重组质粒。
5.2将pET24a-酰胺水解酶质粒分别转化至BL21(DE3)、(DE3)lacA1G、BL21StarTM(DE3)和StarlacA1G宿主中，获得采用pET24a-酰胺水解酶/BL21(DE3)菌株、pET24a-酰胺水解酶/(DE3)lacA1G菌株、pET24a-酰胺水解酶/BL21Star(DE3)菌株和pET24a-酰胺水解酶/StarlacA1G菌株四种宿主不同的酰胺水解酶生产菌株。
实施例6：葡萄糖脱氢酶生产菌的酶活测定
6.1参照实施例4的方法，构建用于表达葡萄糖脱氢酶(GDH)的pET24a-葡萄糖脱氢酶质粒。构建方法参见文献Tao RS,Jiang Y,Zhu FY,Yang S.A one-pot system forproduction of L-2-aminobutyric acid from L-threonine by L-threonine deaminaseand a NADH-regeneration system based on L-leucine dehydrogenase and formatedehydrogenase,Biotechnol Lett,April 2014,Volume 36,Issue 4,pp 835–841。
6.2将pET24a-葡萄糖脱氢酶质粒分别转化至BL21StarTM(DE3)和StarlacA1G宿主中，获得采用pET24a-葡萄糖脱氢酶/BL21StarTM(DE3)(也简写为BL21StarTM(DE3))和pET24a-葡萄糖脱氢酶/StarlacA1G(也简写为BL21StarTM(DE3)PlacA1G)两种宿主不同的葡萄糖脱氢酶生产菌株。
6.3同样地，将pET24a-葡萄糖脱氢酶质粒分别转化至BL21(DE3)及BL21(DE3)lacA1G宿主中，分别构建出用于表达葡萄糖脱氢酶的另两种生产菌株pET24a-葡萄糖脱氢酶/BL21(DE3)和pET24a-葡萄糖脱氢酶/BL21(DE3)lacA1G。以摇瓶发酵的方式检测四种宿主发酵液中葡萄糖脱氢酶的酶活情况，采用实施例4.2和4.3的方法进行发酵和菌体处理。
葡萄糖脱氢酶酶活测定方法参照Fujita Y,Ramaley R,Freese E(1977)Locationand properties of glucose dehydrogenase in sporulating cells and spores ofBacillus subtilis.J Bacteriol 132:282–293。
两种菌液的葡萄糖脱氢酶酶活力测定结果也显示于图2中。从图2中可以看出，葡萄糖脱氢酶发酵生产中，菌株BL21StarTM(DE3)PlacA1G表达能力比菌株BL21StarTM(DE3)也有提高，提高约15％。
将菌株pET24a-葡萄糖脱氢酶/StarlacA1G命名为CIBTS2808，并将菌株pET24a-葡萄糖脱氢酶/BL21StarTM(DE3)简称为BL21StarTM(DE3)。
实施例7：葡萄糖脱氢酶表达菌株的发酵罐发酵
通过发酵罐发酵，考察实施例6中所得葡萄糖脱氢酶生产菌株CIBTS2808和BL21StarTM(DE3)的生产，具体步骤包括：
7.1种子培养基的配制及种子的准备
种子培养基准备：发酵种子培养基是TB培养基，将100ml的TB配制在1L的摇瓶中，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)即可。
TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油5g/L，KH2PO4 2.13g/L，K2HPO4·3H2O 16.43g/L。
接种：将甘油菌接种于1L的摇瓶中，37℃，220rpm过夜培养。
7.2上罐培养基及补料培养基的配制
上罐培养基配制：每个发酵罐配制初始的发酵罐培养基4L，配方如下：
蛋白胨2g/L，酵母膏8g/L，NaCl 3g/L，K2HPO4·3H2O 4.02g/L，(NH4)2SO4 2.5g/L，一水柠檬酸2.1g/L，柠檬酸铵0.3g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，甘油10g/L，泡敌0.05％v/v。
补料培养基的配制：每个补料瓶配制补料培养基1L，具体配方如下：
蛋白胨50g/L，酵母膏50g/L，甘油450g/L。
7.3接种及诱导
接种：按照5％v/v的接种量接种到每个发酵罐中，将通气量开到发酵罐通气量最大限度。
诱导：等到发酵罐菌体生长约7个小时，此时发酵罐初始的碳源已经耗完，溶氧量直线上升，开始补料，补料速度开到8％v/v(诱导时间定在菌种OD约25左右)。
7.4中间取样及卸罐
中间取样：因蛋白表达到发酵后期才会明显，故选取约在19小时、21小时、23小时以及终点24小时取样，测量OD600、湿重、干重以及酶活。
卸罐：因配制的补料培养基只有1L，等补料培养基全部补完，时间约24小时开始卸罐，终止发酵。
菌株CIBTS2808和BL21StarTM(DE3)的葡萄糖脱氢酶发酵生产结果见图3。从图3中可以看出，CIBTS2808比BL21StarTM(DE3)发酵历程中的发酵液OD600值即菌体浓度无较大差别，湿重和干重也无较大差别，但是在发酵终点样品中测得每毫克菌体湿重的酶活有了显著差别，CIBTS2808比BL21StarTM(DE3)高约1倍，每毫升发酵液的酶活也高约1倍，证明CIBTS2808在表达葡萄糖脱氢酶能力方面比BL21StarTM(DE3)要强，进一步验证了lacUV5启动子突变为SEQ ID NO:1的促进效果。
实施例8：葡萄糖脱氢酶、头孢菌素C酰化酶、酰胺水解酶在改造菌株中的表达
8.1摇瓶发酵培养
对于前述实施例方法获得的表达葡萄糖脱氢酶、头孢菌素C酰化酶、酰胺水解酶的BL21(DE3)/BL21StarTM(DE3)改造菌株，参照实施例3.1的方法，将经过过夜划板的菌落，每个挑选3株分别接种至装有5ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB液体培养基的试管中，置于37℃，250rpm摇床中培养约12～16个小时，然后以1％v/v接种于装有30ml TB培养基的250ml摇瓶中，置于37℃，250rpm摇床中培养约6个小时，测OD600值在3～4之间，加入终浓度为0.3mM的IPTG，将摇瓶置于28℃，250rpm摇床中培养至46个小时。在培养22小时后定时检测培养液的OD600值，22小时、34小时和46小时的检测结果显示于表1中。
表1菌株摇瓶培养液的OD600值对比结果
Figure BDA0002195439340000131
从表1中可以看出，BL21(DE3)菌株和BL21StarTM(DE3)在表达葡萄糖脱氢酶、头孢菌素C酰化酶及酰胺水解酶时，发酵过程中的OD值低于对应的启动子改造菌株BL21(DE3)lacA1G及BL21StarTM(DE3)lacA1G菌株，表明lacUV5启动子突变有利于菌株的生长。
8.2菌体细胞破碎
在发酵22h时及46h时分别取1mL发酵液，离心，保留上清液。利用PBS缓冲液将离心后的菌体进行重悬至1mL，放入细胞破碎仪中破碎，功率200W，工作3s，间隔5s，60次即可获得细胞破碎液。
8.3SDS-PAGE电泳分析
1.蛋白电泳样品制备：取实施例8.2中获得的上清液及细胞破碎液20μL上清液，分别加入5×Protein SDS-PAGE Loading Buffer，混匀后置于99℃变性10min，冷却至室温使用。
2.制胶：按以下配方分别配制SDS-PAGE分离胶与浓缩胶。5％SDS-PAGE浓缩胶(5mL)：2.8mL去离子水，1.25mL 0.5mol/L TrisHCl(pH 6.8)，0.86mL Acr-Bis，50μL 10％SDS，50μL 10％过硫酸铵，4μL TEMED。12％SDS-PAGE分离胶(10mL)：3.26mL去离子水，2.5mL1.5mol/L TrisHCl(pH 8.8)，4mL Acr-Bis,100μL 10％SDS，100μL 10％过硫酸铵，8μLTEMED。
3.上样：将蛋白胶板安装至垂直电泳槽中，加入电泳缓冲液(14.4g甘氨酸，3gTris，1g SDS，用去离子水定容至1L)。通过OD计算出相同OD对应的样品体积。吸取对应体积的样品加入样品孔中，并在相应孔位加入蛋白Marker。
4.电泳：接通电源，调节电压至110V，根据所需观察蛋白样品大小调整电泳时间。
5.染色及脱色：将胶片取出，置于染色液中振荡染色1h。随后回收染色液，加入脱色液，振荡脱色直至背景颜色全部消失。脱色后的胶片置于凝胶成像仪中拍照。蛋白胶染色液：称取2.5g考马斯亮蓝R-250，加入500mL无水乙醇与100mL冰乙酸，去离子水定容至1L。搅拌使其充分溶解，抽滤，室温避光保存。蛋白胶脱色液：380mL去离子水，70mL无水乙醇，50mL冰乙酸，室温保存。
8.4实验结果
SDS-PAGE电泳结果显示于图4中，可以看出，在发酵22h时，BL21(DE3)及BL21StarTM(DE3)菌株的蛋白表达情况和对应的改造菌株差异不大，但是在发酵46h时，BL21(DE3)及BL21StarTM(DE3)菌株在表达的三种蛋白时，发酵上清液中目的蛋白的条带较为明显，表明此时未改造菌株出现了自溶破裂的现象。而在启动子改造菌株BL21(DE3)lacA1G及BL21StarTM(DE3)lacA1G菌株中，发酵上清中并没有明显的蛋白条带，表明此时的菌株形态比较完整。以上结果进一步证明了菌株BL21(DE3)PlacA1G及BL21StarTM(DE3)PlacA1G的蛋白表达能力高于对应的出发菌株BL21(DE3)及BL21StarTM(DE3)。
以上实施例表明，本发明将宿主大肠杆菌BL21(DE3)和BL21StarTM(DE3)中的原始lacUV5启动子SEQ ID NO:2突变为SEQ ID NO:1后，外源重组蛋白质比如头孢菌素C酰化酶、甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、酰胺水解酶在宿主大肠杆菌BL21(DE3)及BL21StarTM(DE3)中的表达水平有了一定程度的提高，具有很高的商业应用推广价值。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 一种用于重组蛋白质表达的启动子
<130> SHPI1910511
<150> 2018110867374
<151> 2018-09-18
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt g 31
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> Escherichia coli BL21StarTM(DE3)
<400> 2
tttacacttt atgcttccgg ctcgtataat g 31
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
cctaggtata atactagtct tccggctcgt ataatgtggt tttagagcta gaaatagc 58
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
actagtatta tacctaggac tgagctagct gtcaaggatc 40
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
tagctcactc attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtg 59
<210> 6
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaag 59

Claims (10)

1.一种lacUV5启动子突变体，其碱基序列为：
5’-TTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTG-3’(SEQ ID NO:1)。
2.一种T7RNA聚合酶基因表达盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的lacUV5启动子突变体和位于其下游的T7RNA聚合酶编码基因。
3.一种大肠杆菌，其特征在于，基因组中包含如权利要求2所述的T7RNA聚合酶基因表达盒。
4.如权利要求3所述的大肠杆菌，其特征在于，被改造的菌株是大肠杆菌BL21(DE3)。
5.如权利要求3所述的大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌是BL21StarTM(DE3)。
6.一种构建如权利要求3-5中任一项所述大肠杆菌的方法，包括如下步骤：将基因组中位于T7RNA聚合酶基因上游的lacUV5启动子的-10区碱基AA变为GT；或者将如权利要求2所述的T7RNA聚合酶基因表达盒整合入大肠杆菌的基因组中。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，当被改造的菌株是大肠杆菌BL21StarTM(DE3)时，将基因组中T7RNA聚合酶编码基因前的lacUV5启动子的-10区碱基AA变为GT。
8.如权利要求3-5中任一项所述大肠杆菌在表达重组蛋白质中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述重组蛋白质是头孢菌素C酰化酶、甲酸脱氢酶或者葡萄糖脱氢酶。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，将表达所述重组蛋白质的重组质粒转化入如权利要求3-5中任一项所述的大肠杆菌中，通过发酵进行重组蛋白质的生产。
CN201910846490.XA 2018-09-18 2019-09-09 一种用于重组蛋白质表达的启动子 Pending CN110904102A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2019/105130 WO2020057397A1 (zh) 2018-09-18 2019-09-10 一种用于重组蛋白质表达的启动子

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2018110867374 2018-09-18
CN201811086737 2018-09-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110904102A true CN110904102A (zh) 2020-03-24

Family

ID=69814473

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910846490.XA Pending CN110904102A (zh) 2018-09-18 2019-09-09 一种用于重组蛋白质表达的启动子

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN110904102A (zh)
WO (1) WO2020057397A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116083431A (zh) * 2022-10-11 2023-05-09 深圳瑞德林生物技术有限公司 提高重组蛋白质可溶性表达的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5939295A (en) * 1996-03-29 1999-08-17 Archer Daniels Midland Company Production of tryptophan by microorganisms
CN106536740A (zh) * 2014-07-01 2017-03-22 瓦克化学股份公司 T7表达系统，其生产方法以及其用于生产重组蛋白的用途
WO2017139412A1 (en) * 2016-02-09 2017-08-17 Brookhaven Science Associates, Llc Improved cloning and expression vectors and systems
CN107074915A (zh) * 2015-01-30 2017-08-18 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 参与赖氨酸脱羧作用的产酸克雷伯氏菌多肽的表达及其方法和应用
WO2018049273A1 (en) * 2016-09-08 2018-03-15 Centro De Investigaciones Energeticas Medioambientales Y Tecnologicas Gene therapy for patients with fanconi anemia

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1186120A (zh) * 1996-12-24 1998-07-01 深圳科兴生物制品有限公司 在大肠杆菌中表达作为分泌的重组人干扰素α1b蛋白
BR0214542A (pt) * 2001-12-12 2005-08-16 Lilly Co Eli Célula hospedeira, sistema de expressão, e, processos de preparação de uma célula hospedeira, e de uma proteìna alvo
US11642422B2 (en) * 2017-10-16 2023-05-09 Centro de Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas, O.A, M.P. Lentiviral vectors for delivery of PKLR to treat pyruvate kinase deficiency

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5939295A (en) * 1996-03-29 1999-08-17 Archer Daniels Midland Company Production of tryptophan by microorganisms
CN106536740A (zh) * 2014-07-01 2017-03-22 瓦克化学股份公司 T7表达系统，其生产方法以及其用于生产重组蛋白的用途
CN107074915A (zh) * 2015-01-30 2017-08-18 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 参与赖氨酸脱羧作用的产酸克雷伯氏菌多肽的表达及其方法和应用
WO2017139412A1 (en) * 2016-02-09 2017-08-17 Brookhaven Science Associates, Llc Improved cloning and expression vectors and systems
WO2018049273A1 (en) * 2016-09-08 2018-03-15 Centro De Investigaciones Energeticas Medioambientales Y Tecnologicas Gene therapy for patients with fanconi anemia

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SAMUEL WAGNER ET AL.: ""Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression"", 《PNAS》 *
SUSAN SCHLEGEL ET AL.: ""De-convoluting the Genetic Adaptations of E. coli C41(DE3) in Real Time Reveals How Alleviating Protein Production Stress Improves Yields"", 《CELL REPORTS 》 *
任增亮等: ""大肠杆菌高效表达重组蛋白策略"", 《中国生物工程杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116083431A (zh) * 2022-10-11 2023-05-09 深圳瑞德林生物技术有限公司 提高重组蛋白质可溶性表达的方法
CN116083431B (zh) * 2022-10-11 2023-11-24 深圳瑞德林生物技术有限公司 提高重组蛋白质可溶性表达的方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020057397A1 (zh) 2020-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2017523787A (ja) フィードバック抵抗性アセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体及びそれを用いたｌ−バリンの生産方法
CN111019878B (zh) L-苏氨酸产量提高的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
CN107603937B (zh) 一种表达赖氨酸氨肽酶的重组大肠杆菌及其构建方法
CN106086102B (zh) 一种生产反式-4-羟基-l-脯氨酸的工程菌及其构建方法与应用
WO2023045682A1 (zh) 一种提高多肽可溶性表达产量的方法
CN111235173A (zh) 一种生产短中链聚羟基脂肪酸酯pha及其功能衍生物的方法
KR20190086016A (ko) L-알라닐-l-글루타민 생합성 효소를 코딩하는 유전자 및 그 용도
CN111172142B (zh) 一种热稳定性高的头孢菌素c酰化酶突变体
CN111849852A (zh) 一种高光学纯l-乳酸工程菌的构建方法
CN113564090B (zh) 一种用于产四氢嘧啶重组菌的构建方法及其应用
CN113005071B (zh) 一种SsgA编码基因SMDS_1018的用途、重组菌株及其构建方法
US20090042275A1 (en) Novel plasmids and utilization thereof
CN110904102A (zh) 一种用于重组蛋白质表达的启动子
WO2016127469A1 (zh) 用于生产β-丙氨酸的工程菌及生产β-丙氨酸的方法
CN113403355B (zh) 一种生物法生产l-5-甲基四氢叶酸的方法
Derbikov et al. Aspartic acid synthesis by Escherichia coli strains with deleted fumarase genes as biocatalysts
CN112481278B (zh) 一种基于aip诱导的生物传感器及其应用
CN107354179B (zh) 一种制备含有羟基的手性化合物的方法
CN113528495A (zh) 一种稳定表达几丁二糖脱乙酰酶的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
WO2023198006A1 (zh) 一种s-乳酰谷胱甘肽的制备方法
CN110592081A (zh) 木糖诱导启动子及其质粒载体和应用
CN113736813B (zh) 重组大肠杆菌表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶的载体和方法
CN114540397B (zh) 增强调控蛋白表达以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法
RU2813283C2 (ru) Рекомбинантный штамм на основе escherichia coli, способ его конструирования и его применение
CN117802017A (zh) 一株产l-2,3-二氨基丙酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20200616

Address after: 200032 Shanghai city Xuhui District Fenglin Road No. 300

Applicant after: Center for excellence and innovation in molecular plant science, Chinese Academy of Sciences

Address before: 200031 No. 320, Yueyang Road, Shanghai, Xuhui District

Applicant before: SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES

SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200324