KR102093372B1 - 재조합 단백질 생산용 에스케리키아 속 미생물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

재조합 단백질 생산용 대장균 속 균주 및 이의 용도에 관한 것으로서, 열충격 단백질 70 유전자를 포함하는 에스케리키아 속 미생물을 포함하는, 재조합 단백질 생산용 조성물 및 이를 이용한 재조합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

Description

재조합 단백질 생산용 에스케리키아 속 미생물 및 이의 용도 {Escherichia genus producing recombinant protein and uses thereof}

재조합 단백질 생산용 에스케리키아 속 미생물 및 이의 용도에 관한 것이다.

일반적으로 외래 유전자가 다른 세포에 삽입되어 하나의 독립적인 복제가능단위 (replicon)를 형성하거나 또는 상동성 재조합에 의해 도입된 세포의 게놈 속으로 통합되어 계속적인 복제가 가능하고, 유전자가 발현됨으로써 새로운 형질을 나타내도록 하는 것을 형질전환이라고 한다. 이와 같이 외래 유전자의 도입이 가능해짐에 따라 원하는 유전자를 원하는 세포에서 대량으로 발현시킬 수 있게 되었으며, 이러한 재조합 단백질의 생산 기술은 현대 유전공학 발전의 핵심이라 할 수 있다.

현재, 재조합 단백질을 생산하기 위한 숙주세포로서, 미생물, 효모, 동물 세포, 및 식물 세포 등이 이용되고 있다. 이 중에서도 미생물을 이용한 재조합 단백질의 생산 시스템은 다른 숙주 세포들에 비해 성장 속도가 빠르고, 유전적 정보가 잘 알려져 있어 유전학적 적용 및 변경이 용이하다. 또한, 생산 규모를 확장하기 쉽기 때문에 초기 인슐린이나 성장 호르몬 (growth hormone) 등과 같은 재조합 의약 단백질의 생산에 많이 이용되고 있다. 그러나, 상기 생산 시스템은 간혹 단백질이 세포 밖으로 분비되지 못하고 단백질 덩어리 (inclusion body)를 생성시켜 생산 수율의 감소를 초래하고 있다. 또한, 단백질의 활성에 꼭 필요한 당쇄 부가를 위한 번역후 수식 (post-traslational modification)과 같은 추가적인 과정이 없으며, 종종 단백질의 N-말단에 메티오닌 (methionine)이 붙어나와 이를 별도로 제거하여야 하는 등 불편함을 안고 있는 실정이다.

이러한 기술적 배경 하에서, 재조합 단백질의 생산 수율을 향상시킬 수 있는 배양 조건, 및 숙주 세포에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있으나 (한국 공개특허 10-2018-0038401), 아직은 미비한 실정이다.

일 양상은 당근 유래 열충격 단백질 70 유전자를 포함하는 에스케리키아 속 미생물을 포함하는, 재조합 단백질 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 당근 유래 열충격 단백질 70 유전자를 포함하는 에스케리키아 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양물로부터 재조합 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 재조합 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 당근 유래 에스케리키아 속 미생물의 염색체 상에 열충격 단백질 70 유전자를 포함하는 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 재조합 단백질 생산용 미생물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 당근 유래 열충격 단백질 70 유전자를 포함하는 에스케리키아 속 미생물을 포함하는, 재조합 단백질 생산용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "재조합 단백질"은 미생물로부터 발현시키고자 하는 단백질을 지칭하며, 재조합 미생물로부터 발현시키고자 하는 외래 단백질이라면 제한없이 포함할 수 있다. 상기 재조합 단백질은 당쇄를 갖지 않는 것일 수 있다. 상기 재조합 단백질은 분자량 20 KDa 내지 200 KDa, 예를 들면, 20 KDa 내지 140 KDa, 20 KDa 내지 100 KDa, 20 KDa 내지 50 KDa, 25 KDa 내지 45 KDa, 또는 130 KDa 내지 170 KDa일 수 있다. 상기 재조합 단백질은 알코올 탈수소효소 (알코올 디하이드로게나제: ADH)일 수 있다. 상기 알코올 탈수소효소는 효모 또는 박테리아 유래의 것일 수 있고, 상기 박테리아는 바실러스, 또는 에스케리키아 속일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 상기 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있고, 상기 유전자는 염색체 또는 게놈 상에 위치할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "열충격 단백질 (Heat shock proteins)"은 세균에서부터 인간에 이르기까지 모든 유기체에서 발견되며, 분자량 (12-42kDa)에 따라 Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60, 및 small Hsp100으로 분류된다. 이들 중에서도 "열충격 단백질 70 (Heat shock proteins 70)"은 비생물학적 스트레스 조건 하에서 단백질의 변성을 방지하고, 부분적으로 변성된 단백질의 접힙구조 (refolding)를 유도하는 역할을 하는 샤페론 분자로 알려져 있다.

일 구체예에 있어서, 열충격 단백질 70은 당근 (Daucus carota L.)으로부터 유래한 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 혹은 서열번호 2의 뉴클레오티드로 이루어질 수 있다. 상기 열충격 단백질 70은 서열번호 1의 아미노산과 바람직하게 80% 이상, 보다 바람직하게 90% 이상, 더욱 바람직하게 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 상기 열충격 단백질 70 유전자는 상기 단백질을 코딩하는 게놈 DNA 또는 cDNA를 모두 포함하며, 서열번호 2의 뉴클레오티드와 바람직하게 80% 이상, 보다 바람직하게 90% 이상, 더욱 바람직하게 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 여기에서, 뉴클레오티드에 대한 "상동성 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인될 수 있다.

일 구체예에 있어서, 재조합 단백질 생산용 미생물은 에스케리키아 속 미생물일 수 있으며, 예를 들어, 대장균 (Escherichia coli), 에스케리키아 알베르티 (Escherichia albertii), 에스케리키아 페르구소니 (Escherichia fergusonii), 에스케리키아 헤르만니 (Escherichia hermannii), 에스케리키아 불네리스 (Escherichia vulneris), 및 에스케리키아 블랏태 (Escherichia blattae) 등일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 재조합 단백질 생산용 미생물은 상기 열충격 단백질 70 유전자가 에스케리키아 속 미생물의 염색체 상에 도입 또는 삽입되어 있는 것일 수 있다. 이를 위하여, 상기 열충격 단백질 70 유전자는 발현 카세트 내에 포함되는 형태로 제공될 수 있다.

본 명세에서 사용되는 용어, "발현 카세트"는 프로모터와 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하고 있어서, 프로모터 하류에 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 발현시킬 수 있는 단위의 카세트를 의미한다. 이와 같은 발현 카세트 내부 또는 외부에는 상기 목적 단백질의 효율적인 도입을 유도할 수 있는 다양한 인자가 포함될 수 있다. 여기에서, 상기 "작동 가능하게 연결"은 프로모터 활성을 갖는 염기 서열이 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 개시 및 매개하도록, 상기 유전자 서열과 프로모터 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제조할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "프로모터"는 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역 상위의 비번역되는 염기 서열, 즉, 폴리머라제가 결합하여 유전자의 전사를 개시하도록 하는 DNA 영역을 의미한다. 상기 프로모터는 항시성 프로모터 (constitutive promoter) 또는 유도성 프로모터 (inducible promoter)일 수 있으며, 예를 들어, 지단백질 (LPP) 프로모터 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터, 유비퀴틴(ubiquitin) 계열의 프로모터, 벼 액틴 프로모터와 같은 항시성 프로모터일 수 있다.

일 실시예에 따른 에스케리키아 속 미생물은 당근 유래의 열충격 단백질 유전자 (Hsp70 또는 DcHsp70으로 표기함.)를 이종 발현함으로써, 형질전환을 통해 도입된 재조합 단백질의 발현량을 현저하게 증가시킬 수 있었는 바, 상기 미생물은 재조합 단백질의 생산에 유용한 숙주 세포로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

다른 양상은 당근 유래 열충격 단백질 70 유전자를 포함하는 에스케리키아 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양물로부터 재조합 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 재조합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

상기 재조합 단백질을 생산하는 방법에 있어서, 상기 열충격 단백질 70 유전자, 에스케리키아 속 미생물, 및 재조합 단백질 생산용 미생물 등에 대해서는 상기한 바와 같다.

상기 방법은 상기 열충격 단백질 70 유전자를 포함하는 에스케리키아 속 미생물에 재조합 단백질 유전자를 도입하는 단계, 예를 들어, 재조합 단백질 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다, 또한, 상기 재조합 단백질 유전자는 상기 에스케리키아 속 미생물의 염색체 또는 게놈 상에 도입될 수 있고, 혹은, 이들의 외부에 도입될 수도 있다.

상기 미생물의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양 등이 포함될 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 다양한 미생물의 배지는 예를 들면, 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예에는, 포도당, 자당, 유당, 과당 (fructose), 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리셀롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예에는, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액 (CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃일 수 있고, 예를 들어, 30℃ 내지 45℃ 또는 35℃ 내지 42℃일 수 있다. 배양 기간은 원하는 재조합 단백질의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 160 시간이다.

배양물로부터의 재조합 단백질의 분리는 당업계에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법에는, 원심분리, 여과, 이온교환크로마토그래피 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

일 실시예에 따른 생산방법은 당근 유래의 열충격 단백질 유전자를 포함하는 에스케리키아 속 미생물을 숙주 세포로 이용함으로써, 형질전환을 통해 도입된 재조합 단백질의 발현량을 현저하게 증가시킬 수 있었다.

또 다른 양상은 에스케리키아 속 미생물의 염색체 상에 당근 유래 열충격 단백질 70 유전자를 포함하는 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 재조합 단백질 생산용 미생물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 재조합 단백질 생산용 미생물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 열충격 단백질 70 유전자, 에스케리키아 속 미생물, 및 재조합 단백질 생산용 미생물 등에 대해서는 상기한 바와 같다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 외래 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 의해 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 유전자 작제물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 바람직하게 상기 벡터는 그 자체가 염생체 상에 통합되어 복제 및 기능할 수 있다. 당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염된 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 번역 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야만 한다. 또한, 상기 벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 그 예로는 암피실린 (ampicillin), 카나마아이신 (kanamycin), G418, 블레오마이신 (bleomycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol)과 ?은 항생제 내성 유전자가 등이 있으며, 당업자에 의해 적절히 선택가능하다.

일 실시예에 따르면, 당근 유래의 열충격 단백질 70 유전자 (Hsp70 또는 DcHsp70으로 표기함.)를 포함하는,'지단백질 프로모터-Hsp70 유전자-Flippase recombination target 카세트’를 Overlapping PCR을 통해 생성하고, 이를 대장균의 yddE 위유전자 부위에 삽입하여, 안정적으로 열충격 단백질 70 유전자를 발현하는 재조합 단백질 생산용 에스케리키아 속 미생물을 제조하였다.

일 양상에 따른 형질전환된 에스케리키아 속 미생물에 의하면, 재조합 단백질의 생산능이 우수하여, 재조합 단백질의 생산에 유용하게 이용될 수 있다.

일 양상에 따른 재조합 단백질의 생산방법에 의하면, 형질전환된 에스케리키아 속 미생물을 이용하여 재조합 단백질을 높은 효율로 생산할 수 있다.

도 1은 지단백질 프로모터의 (A) 뉴클레오티드 서열, 및 (B) 이를 증폭하기 위한 프라이머 세트를 나타낸 도이다. 대장균 (K-12 MG1655) 유래 Lpp 프로모터 (316pp)는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 사용한 PCR을 통해 증폭되었다. 상기 Lpp 프로모터 서열에서, 정방향 프라이머 부위의 서열은 붉은 색으로, 역방향 프라이머 부위의 서열은 푸른색으로 표시하였다.
도 2는 DcHsp70의 (A) 뉴클레오티드 서열 및 (B) 이를 증폭하기 위한 프라이머 세트를 나타낸 도이다. Daucus carota L. 유래 DcHsp70 (1959 bp)는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 사용한 PCR을 통해 증폭되었다. 상기 DcHsp70 서열에서, 정방향 프라이머 부위의 서열은 붉은 색으로, 역방향 프라이머 부위의 서열은 푸른색으로 표시하였다.
도 3은 Flippase recombination target (FRT) 카세트의 (A) 뉴클레오티드 서열 및 (B) 이를 증폭하기 위한 프라이머 세트를 나타낸 도이다. Quick easy E. coli gene deletion kit (Gene bridges, Heidelberg, Germany) 유래 FRT 카세트 (1637 bp)는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 사용한 PCR을 통해 증폭되었다. 상기 FRT 카세트 서열에서, 정방향 프라이머 부위의 서열은 붉은 색으로, 역방향 프라이머 부위의 서열은 푸른색으로 표시하였다.
도 4는 Lpp 프로모터-DcHsp 70-FRT 카세트 주형을 도식화한 도이다. Lpp 프로모터, DcHsp70, 및 FRT 카세트 주형은 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 사용한 overlapping PCR을 통해 각각 생성되었다. 주형 말단의 상보성으로 인해, 상기 생성된 산물들은 중첩 및 연장되었다.
도 5는 대장균 BL21 내 삽입 부위를 나타낸 도이다. Lpp promoter-DcHsp70-FRT 카세트는 대장균 염색체의 특정 부위 (yddE pseudogene site ; NCBI number : NC_012971.2)에 삽입되었다.
도 6은 Red/ET 발현 플라스미드 pRedET (tet)의 유전자 개열지도를 나타낸 도이다.
도 7은 ADH 유전자의 (A) 뉴클레오티드 서열 및 (B) 이를 증폭하기 위한 유전자 특이적 프라이머 세트를 나타낸 도이다. Geobacillus stearothermophilus 유래 ADH 유전자 (1014 bp)는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 사용한 PCR을 통해 증폭되었다. 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 Nhe1 및 BamH1 제한 효소 부위 (밑줄)를 함유하고 있으며, 시작 코돈 및 종결 코돈은 붉은색으로 표시하였다.
도 8은 ADH-pET11a 발현 벡터의 유전자 개열지도를 나타낸 도이다.
도 9는 대장균 게놈에서 DcHsp70 유전자의 삽입을 확인한 결과이다.
도 10은 형질전환된 대장균 세포주에서 DcHsp70의 이종 발현을 확인한 결과이다.
도 11은 야생형 대장균 및 DcHsp70을 이종 발현하는 형질전환 대장균을 ADH-pET11a 발현 벡터로 형질전환시킨 뒤, (A) 정제 전 및 (B) 정제 후, 재조합 단백질(ADH)의 발현량을 비교한 결과이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험 재료

당근 종자 (Daucus carota L. cv. Mussangochon)를 식물 생장 챔버 (GC-300, Jeiotech, Deajeon, Korea)에서 3-4개월 동안 재배하였다. 구체적으로, 당근 종자를 60%의 상대습도, 21℃ 조건에서 매일 15시간 동안 9000 Lux의 광원에 노출시킨 채로 재배한 뒤, 이들을 60%의 상대습도, 19℃ 조건에서 9시간 동안 광원의 노출없이 재배하였다. 파종 후 식물체를 재배치한 뒤 (reploted), 상토 (Ssaknara; Minong, Seoul, Korea)를 사용하여 20-30일 동안 재배하였다. 본 실시예에서는 3-4개월 동안 배양시킨 당근의 잎을 사용하였다.

실시예 2. 재조합 단백질 생산용 대장균의 제조

2-1. PCR을 이용한 DcHsp70의 증폭

DcHsp70 유전자를 증폭하기 위하여, 당근으로부터 게놈성 DNA를 추출하였다. 우선, 액체 질소 및 모르타르를 사용하여 0.3g의 당근 잎을 가루로 분쇄하였다. 팔콘 튜브에 분쇄된 잎을 수집하고, 여기에 2ml의 DNA 추출 완충액 (50mM Tris-HCL, pH 8.0, 100mM NaCl, 5mM EDTA, pH 8.0, 0.3% β-mercaptoethanol)을 첨가하였다. RNA를 제거하는 과정에서, RNase A (10mg/ml)를 37℃ 조건에서 30분 동안 처리하였다. 이후, 상기 튜브에 20% SDS 용액을 첨가한 뒤, 65℃에서 10분 동안 반응시켜 단백질을 분해시켰다. 아이스 상에서 20분 동안 20% SDS 용액을 처리한 뒤, 여기에 500㎕의 5M 칼륨 아세테이트를 첨가하였다. 상기 시료를 4℃, 15,700xg의 조건으로 20분 동안 원심분리시켰다. 동일한 양의 상층액으로서, 이소프로판올이 첨가되었고, 이를 4℃, 15,700xg의 조건으로 15분 동안 원심분리시켰다. 펠렛을 수집하고, 70% 에탄올로 세척하였으며, 세척된 시료를 다시 4℃, 15,700xg의 조건으로 3분 동안 원심분리시켰다. 수집된 펠렛을 건조시키고, 이를 증류수에 용해시켰다. 하기 표 1의 프라이머 및 실험 조건 하에서 PCR을 실시하여 DcHsp70의 유전자를 추출된 게놈 DNA로부터 증폭하였다.

프라이머	서열	실험 조건
Forward primer	(서열번호 3)	- 1 cycle: 94℃, 4분 - 후속 35 cycle: 94℃, 1분; 56.5℃, 1분; 72℃, 4분 - 1 cycle 72 ℃, 10분; 1 cycle 4 ℃, 10분
Reverse primer	(서열번호 4)

2-2. Overlapping PCR을 이용한 Lpp-DcHsp70-FRT 카세트의 제조

대장균 유래의 지단백질 (Lpp) 프로모터 (NCBI accession number: NC_000913.2)가 DcHsp70의 전사를 활성화시키기 위해 사용되었다. 하기 표 2의 프라이머 및 실험 조건 하에서 PCR을 실시하여 상기 Lpp 프로모터 유전자를 증폭하였다.

프라이머	서열	실험 조건
Forward primer	(서열번호 5)	- 1 cycle: 98℃, 30초 - 후속 35 cycle: 98℃, 10초; 55℃, 30초; 72℃, 30초
Reverse primer	(서열번호 6)

또한, 카나마이신 저항성 영역을 함유하는 Flippase recombination target (FRT) 카세트는 Quick & Easy E. coli gene Deletion Kit (Gene bridges, Heidelberg, Germany)로부터 입수하였다. 하기 표 3의 프라이머 및 실험 조건 하에서 PCR을 실시하여 상기 FRT 카세트 유전자를 증폭하였다.

프라이머	서열	실험 조건
Forward primer	(서열번호 7)	- 1 cycle : 98℃, 30초 - 후속 35 cycle : 98℃, 10초; 55℃, 30초; 72℃, 30초 - 1 cycle 72 ℃, 10분; 1 cycle 4 ℃, 10분
Reverse primer	(서열번호 8)

한편, 상기 Lpp 프로모터의 정방향 프라이머 및 FRT 카세트의 역방향 프라이머는 대장균 게놈의 삽입 부위 (yddE pseudogene)를 함유하고 있도록 설계하였다 (도 5 참조).

이후, HF Buffer polymerase (New england biolabs, Ipswich, England)를 갖는 Phusion^ⓡ High-Fidelity PCR Master Mix를 사용한 overlapping PCR을 실시하여 (1 cycle: 96 ℃, 3 min; 후속 35 cycle: 96℃, 30초; 72℃, 2분 10초 또는 4분), 주형 (Lpp promoter- DcHsp70- FRT 카세트)을 제조하였다.

2-3. 상동성 재조합을 유도하는 Red/ET 플라스미드의 발현

상동성 재조합을 유도하기 위하여, Quick & Easy E. coli gene Deletion Kit (Gene bridges, Heidelberg, Germany)의 프로토콜에 따라 대장균을 Red/ET 플라스미드로 형질전환시켰다. 야생형 세포주 (BL21, DE3)는 LB broth (BD Difco) 배지에서 130rpm, 37℃의 조건으로 밤새도록 배양되었다. 상기 배양물을 신선한 LB broth 배지와 1:1000의 비율로 희석하고, 광학 밀도가 0.6에 도달할 때까지 이를 225rpm, 37℃의 조건으로 배양하였다. 이후, 배양된 세포를 1360xg, 4℃ 조건으로 20분 동안 원심분리시켰다. 그 다음, 상층액을 제거하고, 펠렛을 1ml의 10% 글리세롤로 세척하였으며, 상기 단계는 3회 반복하였다. 마지막 펠렛을 1ml의 10% 글리세롤에 녹인 후, 30㎕의 펠렛에 1㎕의 20ng/㎕ Red/ET 플라스미드를 첨가하고, 이를 아이스 상에 30분 동안 두었다. Red/ET 플라스미드는 Gene pulser X cell (Bio rad, US)를 사용한 전기 충격법 (1800V, 25㎌, 200 Ohms)을 통해 대장균에 도입되었다. 이후, 여기에 1ml의 SOC broth 배지를 첨가하고, 이를 225rpm, 30℃의 조건으로 70분 동안 배양하였다. 배양된 세포는 50㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LBA 상에 도포되었고, 30℃의 조건에서 밤새도록 성장시켰다. 이후, Red/ET 플라스미드를 함유하는 콜로니를 채취하고, 이를 50㎍/ml의 암피실린이 함유된 LB broth (BD Difco) 배지에서 225rpm, 30℃의 조건으로 밤새도록 배양하였다. 상기 배양된 배양물을 신선한 LB broth 배지와 1:1000의 비율로 희석하고, 광학 밀도가 0.3에 도달할 때까지 이를 225rpm, 30℃의 조건으로 배양하였다. 이후, 배양된 세포를 1360xg, 4℃ 조건으로 20분 동안 원심분리시켰다. 그 다음, 상층액을 제거하고, 펠렛을 1ml의 10% 글리세롤로 세척하였으며, 상기 단계는 3회 반복하였다. 마지막 펠렛을 1ml의 10% 글리세롤에 녹이고, 상기 세포들은 다음 단계를 위한, 형질전환 세포 (competent cell)로 사용하였다.

2-4. Lpp-DcHsp70-FRT 카세트를 이용한 대장균의 형질전환

실시예 2-2에서 제조된 주형 (Lpp promoter- DcHsp70-FRT 카세트)을 Red/ET 단백질을 발현하는 형질전환 세포에 첨가한 후, 상기 세포를 아이스 상에서 30분 동안 두었다. 상기 주형 (Lpp promoter-DcHsp70-FRT 카세트)은 Gene pulser X cell (Bio rad, US)을 사용한 전기 충격법 (1800V, 25㎌, 200 Ohms)을 통해 세포에 형질전환되었다. 이후, 1ml의 SOC broth 배지를 첨가하고, 이를 225 rpm, 37℃의 조건으로 3시간 동안 배양하였다. 배양된 세포는 15㎍/ml의 카나마이신을 함유하는 LBA 상에 도포되었고, 37℃의 조건에서 밤새도록 성장시켰다. 이후, 콜로니를 채취하고, 염색체 상에 삽입된 주형을 PCR을 통해 확인하였다.

2-5. 대장균 균주에 도입된 DcHsp70의 이종 발현 확인

야생형 세포주 (BL21), 형질전환 세포는 15㎍/ml의 카나마이신을 함유하는 LB broth (BD Difco) 배지에서 130rpm, 37℃의 조건으로 밤새도록 배양되었다. 상기 배양물을 신선한 LB broth 배지와 1:1000의 비율로 희석하고, 광학 밀도 (O.D.₆₀₀)가 0.6에 도달할 때까지 이를 225rpm, 37℃의 조건으로 배양하였다. 이후, 배양된 세포를 1360xg, 4℃ 조건으로 20분 동안 원심분리시킨 다음, 상층액을 제거하였다. 펠렛을 3ml의 단백질 추출 완충액 (25mM Tris-HCL, pH 7.5, 300 mM NaCl, 3 mM β-mercaptoethanol)에 녹이고, 이를 초음파 분쇄기 (sonomasher; ULH700S, S & T Science, Korea)를 사용하여 20khz, 420w 조건으로 4분 40초 동안 초음파 분쇄하였다 (아이스 상에서, 10초간 진동, 30초간 정지를 7회 반복). 시료를 13,000 rpm에서 30분 동안 원심분리시키고, 팔콘 튜브로 상층액을 옮겼다. 추출된 단백질의 농도는 Bradford 분석법 (Bradford, 1976)에 의해 정량화되었다. 추출된 동량의 단백질 (25㎍)을 SDS-PAGE 상에 150V에서 3시간 동안 로딩시켰다 (5% stacking gel, 17% running gel). 단백질은 SDS-PAGE에서 분자량에 따라 분리되었다. SDS-PAGE 내 분리된 단백질을 180mA 조건으로 밤새도록 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 (GE healthcare Life Science, UK)에서 이동시켰다 (Transfered). 이후, PVDF 막에 인산염 완충액-5%의 탈지유를 함유하는 완충액 (PBS-T 완충액)을 첨가하여 이동되지 않은 부분을 차단시켰다 (Blocked). 뒤어어, 일차 항체 (항- DcHsp70 단일 클론 항체, abcam, cambridge)를 상기 PBS-T 완충액과 1:2000의 비율로 희석시킨 뒤, 상기 완충액에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 이를 PBS-T 완충액으로 세척하였다. 이차 항체 (항-마우스 결합 HRP, Amersham Biosciences, Pittsburgh, PA)를 PBS-T 완충액과 1:30000의 비율로 희석시킨 뒤, 상기 완충액에서 1시간 동안 반응시킨 후, 이를 PBS-T 완충액으로 세척하였다. 이후, DcHsp70을 검출하기 위하여, ECL Prime System (GE Healthcare Life Science, UK)을 사용하였다.

실시예 3. 알코올 탈수소효소 (ADH)의 재조합 플라스미드의 제조

3-1. 알코올 탈수소효소 유전자의 클로닝

표 4의 프라이머 및 실험 조건 하에서 PCR을 실시하여 Geobacillus stearothermophilus로부터 ADH 유전자를 증폭하였으며, AccuPower^ⓡ PFU PCR PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea)가 상기 PCR 반응에 사용되었다.

프라이머	서열	실험 조건
Forward primer	(서열번호 9)	- 1 cycle : 98℃, 30초 - 후속 35 cycle : 98℃, 10초; 59℃, 30초; 72℃, 30초 -1 cycle 72 ℃, 10 분; 및 1 cycle: 4 ℃, 10 분
Reverse primer	(서열번호 10)

생성된 단편과 6개의 히스티딘 태그를 함유하는 pET11a 발현 벡터는 두개의 제한 효소에 의해 절단되었다 (NheⅠ, BamH). ADH 유전자 및 PET11a 발현 벡터는 T4 리가아제 (Enzynomics, Daejeon, Korea)와 함께, 16℃ 조건에서 밤새도록 혼합되었다. 이후, 상기 3㎕의 혼합물에 100㎕의 형질전환 대장균 세포를 첨가하였다. 아이스 상에서 상기 세포 및 혼합물을 30분 동안 반응시키고, 뒤어어, 열 충격 (42℃)을 2분 동안 제공하였다. 이후, 상기 세포를 아이스 상에 10분간 둔 뒤, 1ml의 LB broth 배지를 첨가하고, 이를 격렬한 교반과 함께 37℃ 조건에서 1시간 동안 배양하였다. 배양된 세포는 50㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LBA 상에 도포되었고, 37℃의 조건에서 밤새도록 인큐베이팅되었다. 다음날, 콜로니를 채취하고, 삽입된 ADH 유전자를 PCR을 통해 확인하였다.

3-2. 재조합 플라스미드의 제조

세포주로부터 PET11a-ADH 벡터를 얻기 위하여, 콜로니를 50㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB broth 배지에서 130rpm, 37℃ 조건으로 밤새도록 배양하였다. 배양된 10ml의 배양물을 팔콘 튜브에 수집하고, 이를 1360xg, 4℃ 조건으로 10분 동안 원심분리시켰다. 상층액을 제거한 뒤, DNA-spin (TM) Plasmid DNA Purification Kit (Intron, Seoul, Korea)의 프로토콜에 따라 PET11a-ADH 벡터를 준비하였다.

실시예 4. DcHsp70을 발현하는 대장균에서 재조합 플라스미드를 이용한 형질전환

4-1. DcHsp70을 발현하는 상동 재조합 세포주에서 재조합 ADH 플라스미드를 이용한 형질전환

야생형 세포 (BL21), 및 형질전환 세포에서 pET11a-ADH 벡터를 발현시키기 위하여, 100㎕의 세포에 3㎕의 PET11a-ADH 벡터를 첨가하고, 이를 아이스 상에 30분 동안 둔 후, 42℃ 조건에서 2분 동안 열 충격을 가하였다. 이후, 세포를 아이스 상에 10분 동안 두고, 여기에 1ml의 신선한 LB broth 배지에 첨가하였다. 이후, 상기 세포를 37℃ 조건에서 1시간 동안 교반시키면서 성장시키고, 13,000 rpm 조건으로 1분 동안 원심분리시켰다. 펠렛을 100㎕의 신선 LB 배지에 녹이고, 50㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LBA에서 37℃ 조건으로 밤새도록 성장시켰다.

4-2. 유전적으로 변형된 대장균에서 발현된 ADH의 이종 발현

야생형, ADH를 함유하는 대조군 및 형질전환 세포는 광학 밀도 (O.D.₆₀₀)가 0.6에 도달할 때까지 LB broth 배지에서 배양되었다. 이후, Isopropyl b-D-thiogalactopyranoside (IPTG)가 pET11a-6His-ADH의 발현을 위하여 첨가되었다. 본 실시예에서, IPTG 유도 시간 및 온도는 세포주 내에서 보다 많은 양의 단백질을 발현시키는 시간을 찾고자 조정되었다. 세포주는 0.5M의 IPTG를 함유하는 LB 배지에서 16℃ 조건으로 20시간 동안 성장시켰다. IPTG 처리 이후, 세포를 3000rpm, 4℃ 조건으로 20분 동안 원심분리시켰다 (Allegra-x-12-R, Beckman, US). 이후, 상층액은 제거되었고, 3ml의 단백질 추출 완충액 (25mM Tris-HCL, pH 7.5, 300mM NaCl, 3mM β-mercaptoethanol)이 펠릿에 첨가되었다. 단백질을 추출하기 위하여, 상기 단백질 추출 완충액 내 세포는 초음파 분쇄기 (sonomasher; ULH700S, S & T Science, Korea)를 사용하여 20khz, 420w 조건으로 4분 40초 동안 초음파 분쇄되었다 (아이스 상에서, 10초간 진동, 30초간 정지을 7회 반복). 이후, 시료를 13,000rpm, 4℃ 조건으로 30분 동안 원심분리시킨 후, 이로부터 상층액을 수집하였다.

4-3. ADH의 정제

총 단백질로부터 6His-ADH를 정제하기 위하여, 추출된 단백질을 5ml의 Ni²⁺-NTA His-Bind 레진 (Novagen, 카탈로그 번호 70666-3)과 1시간 동안 반응시켰고, 이 과정을 2회 반복하였다. 레진과 비특이적으로 결합된 단백질들을 제거하기 위하여, 세척 완충액 (25mM Tris-HCL; pH 7.5, 200mM KCl, 10mM Imidazole, 10% glycerol, 3mM β-mercaptoethanol)을 첨가하였다. 이어서, 세척 완충액 (25mM Tris-HCL; pH 7.5, 500mM KCl, 50mM Imidazole, 10% glycerol, 3mM β-mercaptoethanol)을 첨가하여 단백질의 순도를 증가시켰다. 최종 단계로서, 용출 완충액 (25mM Tris-HCL; pH 7.5, 200mM KCl, 250 mM Imidazole, 10% glycerol, 3 mM β-mercaptoethanol)을 첨가하고, e-튜브에 용액을 수집하였다. 총 단백질을 수용성 및 불수용성 단백질로 분리하기 위하여, 정제된 단백질을 20900xg, 4℃ 조건으로 1시간 동안 원심분리시켰다. 상층액 및 펠렛은 수집되었고, 펠렛을 용출 완충액 (25 mM Tris-HCL; pH 7.5, 200mM KCl, 250mM Imidazole, 10% glycerol, 3mM β-mercaptoethanol)에 용해시켰다.

4-4. 이종 발현된 ADH의 확인

동등한 부피의 단백질 (20㎕)을 SDS-PAGE 상에 150V에서 1.5 내지 2시간 동안 로딩하였다 (5% stacking gel, 17% running gel). 겔은 쿠마시 브릴런트 블루 R-250 염색 용액 (Bio-rad, California, United States)으로 밤새도록 염색되었다. 이후, 염색된 겔에 염색 완충액 (45% 메탄올, 10% glacial acetic acid, 45% 증류수)을 사용하여 염색을 제거하였다.

실험예 1. 대장균 게놈에 삽입된 당근 유래 DcHsp 유전자의 발현 확인

일 실시예에 따르면, 항시성 Lpp 프로모터에 의해 유도된 당근 유래 DcHsp70 유전자는 Red/ET-매개 상동성 재조합을 통해 대장균 게놈 상에 삽입되었다. 게놈으로의 안정적인 삽입은 통상의 발현 플라스미드에 비해 보다 효율적인 DcHsp 70의 발현을 제공할 것이다. 이에, 대장균 게놈에 삽입된 DcHsp 유전자를 확인하기 위하여, 야생형 및 형질전환 세포주의 게놈 DNA를 대상으로 게놈-특이적 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하였다. 그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 야생형 DNA에서는 관찰되지 않았던, DcHsp70이 형질전환 세포주에서는 증폭되어 검출됨을 확인할 수 있었다.

또한, DcHsp70의 이종 발현을 면역 블롯 분석을 통하여 확인하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 야생형 대장균에서는 DcHsp70의 발현이 전혀 이루어지지 않았던 반면, 정상적인 성장 조건 하에서, 형질전환된 대장균 균주에서는 DcHsp70이 항시적으로 발현됨을 확인할 수 있었다.

이러한 결과들은 Lpp 프로모터 및 Red/ET-매개 상동성 재조합을 통해, 형질전환 대장균에서 DcHsp70 유전자를 안정적으로 발현시킬 수 있음을 보여주는 것이다.

실험예 2. DcHsp70을 발현하는 형질전환 대장균에서 향상된 재조합 단백질의 발현 확인

다양한 재조합 단백질 중에서, 알코올 탈수소효소 단백질을 선정하여, 재조합 단백질 생산용 미생물로서 일 실시예에 따른 형질전환 대장균의 기능성을 평가하였다. 형질전환 대장균과 야생형 대장균간 알코올 탈수소효소 단백질의 발현량 또는 생산량을 비교하였으며, 총 2회 (정제 전 및 정제 후) 실시하였다.

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, DcHsp를 발현하는 형질전환된 세포주는 야생형 대장균에 비해 정제 전과 정제 후 모두에서, 10배 가량 증진된 ADH의 생산량을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들은 일 실시예에 따른 형질전환 대장균은 재조합 단백질의 생산 수율 증가에 기여할 수 있음을 나타내는 것이다.

<110> Sangmyung University Seoul Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Escherichia genus producing recombinant protein and uses thereof <130> PN122166KR <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 652 <212> PRT <213> DcHsp70 <400> 1 Met Ala Ser Lys Gly Gly Lys Ala Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr 1 5 10 15 Tyr Ser Cys Val Gly Val Trp Gln Asn Asp Arg Val Glu Ile Ile Ala 20 25 30 Asn Asp Gln Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Tyr Val Ala Phe Thr Asp 35 40 45 Thr Glu Arg Leu Ile Gly Asp Ala Val Lys Asn Gln Val Ala Met Asn 50 55 60 Pro Ser Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys Arg Leu Ile Gly Arg Arg Phe 65 70 75 80 Asn Asp Pro Ser Val Gln Ser Asp Met Lys Leu Trp Pro Phe Lys Val 85 90 95 Ile Pro Gly Pro Gly Glu Lys Pro Met Ile Val Val Asn Tyr Lys Gly 100 105 110 Glu Ser Lys Gln Phe Ala Ala Glu Glu Ile Ser Ser Met Val Leu Ile 115 120 125 Lys Met Arg Glu Ile Ala Glu Ala Phe Leu Gly His Ser Val Asn Asp 130 135 140 Ala Val Val Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ser Gln Arg Gln Ala 145 150 155 160 Thr Lys Asp Ala Gly Val Ile Ala Gly Leu Asn Val Met Arg Ile Ile 165 170 175 Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Lys Ser 180 185 190 Ser Asn Arg Gly Glu Gln Asn Val Leu Ile Phe Asp Leu Gly Gly Gly 195 200 205 Thr Phe Asp Val Ser Leu Leu Thr Ile Glu Glu Gly Ile Phe Glu Val 210 215 220 Lys Ala Thr Ala Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Asn 225 230 235 240 Arg Leu Val Asn His Phe Val Thr Glu Phe Arg Arg Lys Asn Lys Lys 245 250 255 Asp Ile Ser Gly Asn Ala Arg Ala Leu Arg Arg Leu Arg Thr Ala Cys 260 265 270 Glu Arg Ala Lys Arg Thr Leu Ser Ser Thr Ala Gln Thr Thr Ile Glu 275 280 285 Ile Asp Ser Leu Tyr Glu Gly Val Asp Phe Tyr Thr Pro Ile Thr Arg 290 295 300 Ala Arg Phe Glu Glu Leu Asn Met Asp Leu Phe Lys Lys Cys Met Asp 305 310 315 320 Pro Val Glu Lys Cys Leu Arg Asp Ser Lys Ile Asp Lys Ala Gln Val 325 330 335 His Glu Val Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Lys Val Gln 340 345 350 Gln Leu Leu Gln Asp Phe Phe Asn Gly Lys Glu Leu Cys Lys Ser Ile 355 360 365 Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala Ala Ile 370 375 380 Leu Ser Gly Glu Ala Asn Glu Lys Val Gln Asp Leu Leu Leu Leu Asp 385 390 395 400 Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly Leu Glu Thr Ala Gly Gly Val Met Thr 405 410 415 Val Leu Ile Pro Arg Asn Thr Thr Ile Pro Thr Lys Lys Glu Gln Ile 420 425 430 Phe Ser Thr Tyr Ser Asp Asn Gln Pro Gly Val Leu Ile Gln Val Tyr 435 440 445 Glu Gly Glu Arg Ala Arg Thr Arg Asp Asn Asn Leu Leu Gly Lys Phe 450 455 460 Glu Leu Ala Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Asn 465 470 475 480 Val Val Phe Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Leu Asn Val Ser Ala Glu 485 490 495 Asp Lys Thr Ala Gly Val Lys Asn Lys Ile Thr Ile Thr Asn Asp Lys 500 505 510 Gly Arg Leu Ser Lys Asp Glu Ile Glu Lys Leu Val Lys Glu Ala Glu 515 520 525 Lys Tyr Lys Ala Glu Asp Glu Glu Val Lys Lys Lys Val Glu Ala Lys 530 535 540 Asn Ala Leu Glu Asn Tyr Ala Tyr Asn Met Arg Asn Thr Val Lys Asp 545 550 555 560 Asp Lys Ile Ala Gly Lys Leu Asp Ala Gly Asp Lys Glu Lys Ile Glu 565 570 575 Ser Ala Val Asn Glu Ala Ile Glu Trp Leu Glu Lys Asn Gln Leu Ala 580 585 590 Glu Val Asp Glu Leu Glu Asp Lys Leu Lys Glu Leu Glu Gly Leu Cys 595 600 605 Asn Pro Ile Ile Ala Arg Leu Tyr Gln Gly Gly Gly Asp Val Pro Met 610 615 620 Gly Gly Ala Gly Asp Met Pro Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Ser Gly Gly 625 630 635 640 Ser Ser Gly Ala Gly Pro Lys Ile Glu Glu Val Asp 645 650 <210> 2 <211> 1959 <212> DNA <213> DcHsp70 <400> 2 atggctagca aaggtggcaa ggcgattgga atagatctgg gcaccacata cagctgcgtc 60 ggcgtctggc aaaacgaccg cgtcgagatc atcgccaacg accaaggcaa ccgcaccacc 120 ccctcctacg tcgccttcac cgacacggag cgcctcatcg gcgacgccgt caagaaccaa 180 gtcgccatga acccctccaa caccgtcttc gacgccaagc gcctcatcgg ccggagattc 240 aacgaccctt ccgtccagtc ggacatgaag ctctggccgt ttaaggtcat ccccggcccc 300 ggcgagaagc cgatgatcgt cgtcaactat aaaggcgagt cgaagcagtt tgcagccgag 360 gagatctcct cgatggtgtt gattaagatg cgcgagattg ccgaggcctt tttagggcac 420 agtgtgaacg atgctgtcgt cacggtgccg gcgtatttta acgactcgca gcggcaggcg 480 acgaaggatg cgggggtgat cgcggggctg aatgtcatga ggataatcaa cgagccgact 540 gcggctgcga ttgcttacgg gctcgataag aagtcgagca atcgcggcga gcagaatgtg 600 ctgatttttg atctcggggg tgggactttt gatgtttcgt tgttgacaat tgaagagggg 660 attttcgaag ttaaggccac ggcgggtgat actcatttgg gaggggagga ttttgataat 720 cggcttgtga atcattttgt cacggagttt cggaggaaga ataagaagga tattagtggg 780 aatgcgaggg cgttgaggcg gttgaggacg gcgtgtgaga gggcgaagag gactctatcg 840 tcgacggctc agacgacgat agagattgat tcgttgtatg agggggtgga tttttatacg 900 ccgattacga gggcgaggtt cgaggagttg aacatggact tgtttaagaa gtgtatggat 960 ccggtggaga agtgcttgag ggattcgaag atcgataagg ctcaggttca tgaggtggtt 1020 ttggttgggg ggtctacgag gattccgaaa gttcagcagc tcttgcagga cttttttaat 1080 gggaaggagc tttgcaagag tattaatcct gatgaggctg tggcgtatgg agcggcggtc 1140 caggccgcga ttttgtcggg ggaggcgaat gagaaggtgc aggacttgtt gttgcttgat 1200 gtgactccgt tgagtcttgg cctggagacg gctgggggtg tgatgactgt tttgattccg 1260 aggaatacta cgattcctac taagaaggag cagatatttt cgacgtactc ggataatcag 1320 cctggggttt tgatccaggt ttatgagggt gagcgtgcga ggactcggga taataatctg 1380 cttgggaagt ttgagctcgc tggaattcct cctgcgcctc gaggtgtgcc tcagatcaat 1440 gttgtgtttg atattgacgc gaatggaatt ctgaatgttt cggctgagga taagacggct 1500 ggtgtgaaga acaagattac gattactaat gataagggga ggttgagtaa ggatgagatt 1560 gagaagctgg tgaaggaagc tgagaagtac aaagcagagg acgaggaggt gaagaagaaa 1620 gtagaggcca agaatgcatt ggagaattac gcgtataata tgaggaacac tgtaaaggat 1680 gacaagattc ctgggaaatt ggatgcaggg gacaaggaaa agatcgagag tgcggtgaat 1740 gaggctatag agtggctgga gaagaatcag ttggctgaag tggatgagct tgaagacaag 1800 ctgaaggaac ttgaaggact ctgtaacccg atcatcgcga ggctgtacca gggcggtggt 1860 gatgtcccga tgggcggtgc tggtgatatg cctggtggtg gctacggtgg ttctggtgga 1920 tcctctggtg ctgggccaaa gattgaggaa gttgactaa 1959 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DcHsp70 Forward primer <400> 3 tagagggtat taataatggc tagcaaaggt 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DcHsp70 Reverse primer <400> 4 gagaatagga acttcttagt caacttcctc 30 <210> 5 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lpp promoter Forward primer <400> 5 ccggatcttc cacaatacca atcgcaggcg agaacatgcg accctgtaat attgcttt 58 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lpp promoter Reverse primer <400> 6 acctttgcta gccattatta ataccctcta 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Flippase recombination target cassette Forward primer <400> 7 gaggaagttg actaagaagt tcctattctc 30 <210> 8 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Flippase recombination target cassette Reverse primer <400> 8 ggtacgccgg gctttgaact gccgctggag ggtgaagtac gcgcgaagtt cctatacttt 60 c 61 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH Forward primer <400> 9 gggggggcta gcatgaaagc tgcagttgtg g 31 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH Reverse primer <400> 10 ggggggggat ccttaatcta cttttaacac gacgc 35

Claims (16)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 당근 유래 열충격 단백질 70 (Heat shock proteins 70: Hsp 70)을 코딩하는 유전자 및 재조합 단백질 유전자를 포함하는 에스케리키아 속 (Escherichia genus) 미생물을 포함하는 재조합 단백질 생산용 조성물로서,
   상기 열충격 단백질 70을 코딩하는 유전자는 에스케리키아 속 미생물의 염색체 상에 도입되어 있는 것인 재조합 단백질 생산용 조성물.
   
2. 청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 재조합 단백질 유전자를 포함하는 야생형 에스케리키아 속에 비해 재조합 단백질의 발현량이 증가되어 있는 것인, 재조합 단백질 생산용 조성물.
   
3. 청구항 1에 있어서, 상기 열충격 단백질 70을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드로 이루어지는 것인, 재조합 단백질 생산용 조성물.
   
4. 삭제
5. 청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 대장균 (Escherichia coli)인 것인, 재조합 단백질 생산용 조성물.
   
6. 삭제
7. 청구항 1에 있어서, 상기 재조합 단백질은 20 내지 200 KDa의 분자량을 갖는 것인, 재조합 단백질 생산용 조성물.
   
8. 청구항 1에 있어서, 상기 재조합 단백질은 알코올 탈수소효소 (Alcohol dehydrogenase; ADH)인 것인, 재조합 단백질 생산용 조성물.
   
9. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 당근 유래 열충격 단백질 70 (Heat shock proteins 70: Hsp 70)을 코딩하는 유전자 및 재조합 단백질 유전자를 포함하는 에스케리키아 속 (Escherichia genus) 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
   상기 배양물로부터 재조합 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 재조합 단백질을 생산하는 방법으로서,
   상기 열충격 단백질 70을 코딩하는 유전자는 에스케리키아 속 미생물의 염색체 상에 도입되어 있는 것인, 재조합 단백질을 생산하는 방법.
   
   
10. 청구항 9에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 것인, 재조합 단백질을 생산하는 방법.
    
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12. 청구항 9에 있어서, 상기 재조합 단백질은 20 내지 200 KDa의 분자량을 갖는 것인, 재조합 단백질을 생산하는 방법.
    
13. 청구항 9에 있어서, 상기 재조합 단백질은 알코올 탈수소효소인 것인, 재조합 단백질을 생산하는 방법.
    
14. 청구항 9에 있어서, 상기 배양하는 단계는 35℃ 내지 40℃의 배양 온도에서 배양하는 것인, 재조합 단백질을 생산하는 방법.
    
15. 청구항 9에 있어서, 상기 열충격 단백질 70 유전자를 포함하는 에스케리키아 속 미생물에 재조합 단백질 유전자를 도입하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 재조합 단백질을 생산하는 방법.
    
16. 에스케리키아 속 (Escherichia genus) 미생물의 염색체 상에 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 당근 유래 열충격 단백질 70 (Heat shock proteins 70: Hsp 70)을 코딩하는 유전자 및 재조합 단백질 유전자를 포함하는 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 재조합 단백질 생산용 미생물을 제조하는 방법.
    

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