CN113846023B

CN113846023B - 一种降低l-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的方法、菌株及应用

Info

Publication number: CN113846023B
Application number: CN202111445669.8A
Authority: CN
Inventors: 刘浩; 徐晴
Original assignee: Nanjing Haohe Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Haohe Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-01
Filing date: 2021-12-01
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2041-12-01
Also published as: US20230167470A1; US11655488B1; CN113846023A

Abstract

本发明公开了一株降低L‑苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的黑曲霉（Aspergillus niger）工程菌株，所述黑曲霉工程菌株为同时敲除了富马酸还原酶frdA和富马酸还原酶黄素蛋白亚基frdB的黑曲霉工程菌株。本发明提供了一种frdA和frdB基因双敲除的黑曲霉工程菌株，和一种大大减少黑曲霉发酵过程中副产物琥珀酸的方法。本发明显著地减少了黑曲霉发酵生产苹果酸过程中积累的副产物琥珀酸，减少了下游分离纯化苹果酸过程中的成本，为工业化发酵生产苹果酸提供了优良菌株。

Description

一种降低L-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的方法、菌株及应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是一种降低L-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的方法、菌株及应用。

背景技术

L-苹果酸作为一种重要的有机酸，普遍存在于植物、动物和微生物中，是生物体内三羧酸循环的重要中间代谢产物，被普遍应用于食品、医药及化工等领域。在食品行业，苹果酸因其具有苹果的天然香味，广泛地用作食品酸味调节剂和柠檬酸共同使用，此外还被用于食品保鲜以及配合其它防腐剂共同使用等；在医药行业，因其能够直接参人体代谢，常常被用于治疗肝功能异常和高血氨，还常用于氨基酸类注射药物中帮助氨基酸的利用等；在化工行业，常被用于金属清洗、印染工业、非电解镀层以及油漆等。苹果酸最初是从苹果等水果中提取而来，此方法受到含量及原材料等的限制无法满足大规模市场的需求。

目前苹果酸工业化生产途径主要是化学合成法和生物催化法。化学合成法是以石油基化学品苯为原料，在高温高压条件下得到外消旋DL-苹果酸，而早在1970年美国FDA就禁止在婴幼儿食品中添加DL-苹果酸，此外化学合成法对设备要求高且设备折旧快，限制了其在食品及医药领域的应用。另外，此法的原料来源为石油基化学品，对日益减少的石油能源和环境问题也是极大的挑战。生物催化法主要是固定化酶或者固定化细胞转化法，固定化酶法因其提取分离纯化和固定酶的成本较高，对收益产生了一定的限制；而固定化细胞转化法的不足之处在于活细胞本身含有复杂的酶系，容易形成诸多副产物的形成，致使产品的下游提纯纯化成本增加。综上，使得化学合成法和生物催化法制备的苹果酸难以满足苹果酸市场日益增长的需求。

相比于以上两种方法，微生物发酵法以其环境友好、可利用再生碳源等优点日益受到重视，但是目前此法面临的问题是安全菌株可选择性少，产物转化率或生产效率普遍偏低，杂酸副产物多且含量高，严重限制了发酵法生产L-苹果酸的工业化进程。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术上存在的问题，提供一种降低L-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的方法、菌株及应用。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

一株降低L-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的黑曲霉（Aspergillus niger）工程菌株，所述黑曲霉工程菌株为同时敲除了富马酸还原酶frdA和富马酸还原酶黄素蛋白亚基frdB的黑曲霉工程菌株。

进一步地，所述富马酸还原酶基因frdA的氨基酸序列为SEQ NO.2，所述富马酸还原酶黄素蛋白亚基基因frdB的基因序列为SEQ NO.5，其氨基酸序列为SEQ NO.6。

进一步地，所述富马酸还原酶基因frdA为NCBI-locus_tag为ANI_1_944144，所述富马酸还原酶黄素蛋白亚基基因frdB为NCBI-locus_tag为ANI_1_2554024。

如上所述的降低L-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的黑曲霉工程菌株的构建方法，步骤如下：

（1）敲除富马酸还原酶基因frdA黑曲霉工程菌株的构建

步骤1，构建基因frdA敲除载体

以野生型黑曲霉ATCC1015基因组为模板，通过PCR反应分别扩增基因frdA的上游和下游序列片段，回收PCR产物分别获得目的片段；将基因frdA的上下游序列片段克隆到载体pLH594上，构建富马酸还原酶frdA敲除载体pLH1067；

其中，所述frdA基因下游序列为SEQ NO.3，所述frdA基因上游序列为SEQ NO.4；

步骤2，frdA基因敲除菌株的获得

将所述载体pLH1067由农杆菌介导转化至黑曲霉S489中，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得frdA基因敲除菌株K1；

（2）富马酸还原酶基因frdA和富马酸还原酶黄素蛋白亚基frdB双敲除黑曲霉工程菌株的构建

步骤1，构建基因frdB敲除载体

以野生型黑曲霉ATCC1015基因组为模板，通过PCR反应分别扩增基因frdB的上游和下游序列片段，回收PCR产物分别获得目的片段；将基因frdB的上下游序列片段克隆到载体pLH594上，构建富马酸还原酶黄素蛋白亚基frdB敲除载体pLH1162；

其中，所述frdB基因下游序列为SEQ NO.7，所述frdB基因上游序列为SEQ NO.8；

步骤2，frdA基因和frdB基因双敲除菌株的获得

将所述载体pLH1162由农杆菌介导转化至frdA基因单敲除菌株K1中，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得frdA基因和frdB基因双敲除菌株K2，即得降低L-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸积累的黑曲霉基因工程菌株。

利用如上所述的黑曲霉工程菌株发酵L-苹果酸的方法，步骤如下：

将黑曲霉基因工程菌株接种在PDA培养基上，于28℃培养5天，至产生分生孢子，收集孢子并将孢子悬液接种于发酵培养基中，孢子的浓度为1*10⁸孢子/50 ml，在28℃恒温摇床中200 rpm培养5天，即得L-苹果酸。

进一步地，所述发酵培养基的成分及配制方法为：

所述苹果酸发酵培养基的成分及配制方法为：葡萄糖 100g/L，细菌蛋白胨 6 g/L，无水磷酸二氢钾 0.15 g/L，无水磷酸氢二钾 0.15 g/L，二水氯化钙 0.1 g/L，七水硫酸镁 0.1 g/L，氯化钠 0.005 g/L，七水硫酸亚铁 0.005 g/L，无水柠檬酸 0.001 g/L，溶剂为水，115℃高压灭菌20 min。

进一步地，所述方法得到的L-苹果酸产量为65.59 ~ 69.15 g/L，相比出发菌株提高了7.92%，琥珀酸含量为0.91 ~ 1.05 g/L，相比于出发菌株降低了88.73%。

如上所述的黑曲霉基因工程菌株在L-苹果酸生产方面中的应用。

本发明取得的有益效果是：

1、本发明克服了现有技术中的不足，现有的利用黑曲霉发酵生产苹果酸的过程中，副产物琥珀酸会伴随着苹果酸的产生而积累，造成后续苹果酸纯化工艺成本的提高，本发明提供了一种frdA和frdB基因双敲除的黑曲霉工程菌株，和一种大大减少黑曲霉发酵过程中副产物琥珀酸的方法。本发明显著地减少了黑曲霉发酵生产苹果酸过程中积累的副产物琥珀酸，减少了下游分离纯化苹果酸过程中的成本，为工业化发酵生产苹果酸提供了优良菌株。

2、本发明黑曲霉工程菌株能够应用在L-苹果酸生产方面中，该菌株于摇瓶条件下发酵5天，L-苹果酸产量为65.59 ~ 69.15 g/L，相比出发菌株提高了7.92%，琥珀酸含量为0.91 ~ 1.05 g/L，相比于出发菌株降低了88.73%。为微生物发酵法制备苹果酸提供了优良的菌株。

3、本发明所用的出发菌是前期构建的菌株黑曲霉S489（高产苹果酸），所述黑曲霉工程菌株是在S489的基础上敲除了富马酸还原酶基因frdA和富马酸还原酶黄素蛋白亚基基因frdB的黑曲霉工程菌株。

附图说明

图1为本发明中构建的用于敲除frdA基因连接同源右臂的载体pLH1066图谱；

图2为本发明中对敲除载体pLH1066的双酶切验证图；其中，M为DNA Marker，N为阴性对照，S为Sac I和Spe I双酶切验证载体；

图3为本发明中构建的用于敲除frdA基因连接同源左右臂的载体pLH1067图谱；

图4为本发明中对敲除载体pLH1067的双酶切验证图；其中，M为DNA Marker，N为阴性对照，S为SpeI酶切验证载体；

图5为本发明中敲除基因frdA的蛋白结构域；

图6为本发明中构建的用于敲除frdB基因连接同源右臂的载体pLH1161图谱；

图7为本发明中对敲除载体pLH1161的双酶切验证图；其中，M为DNA Marker，N为阴性对照，S为EcoRI和Pst I酶切验证载体；

图8为本发明中构建的用于敲除frdB基因连接同源左右臂的载体pLH1162图谱；

图9为本发明中对敲除载体pLH1162的双酶切验证图；其中，M为DNA Marker，N为阴性对照，S为EcoRI和Xba I酶切验证载体；

图10为本发明中敲除基因frdB的蛋白结构域；

图11为本发明中frdA和frdB蛋白序列相似性对比图；

图12为本发明中frdA基因敲除左同源臂PCR验证图，引物P1和P2验证左同源臂，引物P1和P641验证左同源臂-php；其中，M为DNA Marker，N为阴性对照，P为阳性对照，1-2为成功敲除frdA基因的黑曲霉转化子基因组；

图13为本发明中frdA基因敲除右同源臂PCR验证图，引物P3和P4验证右同源臂，引物P642和P4验证右同源臂-php；其中，M为DNA Marker，N为阴性对照，P为阳性对照，1-2为成功敲除frdA基因的黑曲霉转化子基因组；

图14为本发明中frdB基因敲除左同源臂PCR验证图，引物P5和P6验证左同源臂，引物P6和P641验证左同源臂-php；其中，M为DNA Marker，N为阴性对照，P为阳性对照，1-2为成功敲除frdB基因的黑曲霉转化子基因组；

图15为本发明中frdB基因敲除右同源臂PCR验证图，引物P7和P8验证右同源臂，引物P642和P8验证右同源臂-php；其中，M为DNA Marker，N为阴性对照，P为阳性对照，1-2为成功敲除frdB基因的黑曲霉转化子基因组；

图16为本发明中构建的工程菌株于摇瓶发酵中的有机酸产量图；S489为出发菌株在第5天的有机酸产量，K1为frdA基因敲除菌株在第五天的有机酸产量，K2为frdA基因和frdB基因双敲除菌株在第五天的有机酸产量。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。

本发明中所使用的的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。

较优地，所述富马酸还原酶基因frdA的氨基酸序列为SEQ NO.2，所述富马酸还原酶黄素蛋白亚基基因frdB的基因序列为SEQ NO.5，其氨基酸序列为SEQ NO.6。

较优地，所述富马酸还原酶基因frdA为NCBI-locus_tag为ANI_1_944144，所述富马酸还原酶黄素蛋白亚基基因frdB为NCBI-locus_tag为ANI_1_2554024。

（1）敲除富马酸还原酶基因frdA黑曲霉工程菌株的构建

步骤1，构建基因frdA敲除载体

步骤2，frdA基因敲除菌株的获得

将所述载体pLH1067由农杆菌介导转化至黑曲霉S489（前期构建的苹果酸高产菌株，如Xu, Y., Shan, L., Zhou, Y. et al. Development of a Cre-loxP-basedgenetic system in Aspergillus niger ATCC1015 and its application toconstruction of efficient organic acid-producing cell factories. ApplMicrobiol Biotechnol 103, 8105–8114 (2019). https://doi.org/10.1007/s00253-019-10054-3中记载的）中，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得frdA基因敲除菌株K1；

步骤1，构建基因frdB敲除载体

步骤2，frdA基因和frdB基因双敲除菌株的获得

将黑曲霉基因工程菌株K2接种在PDA培养基上，于28℃培养5天，至产生足够的分生孢子，收集孢子并将孢子悬液接种于摇瓶发酵培养基中，孢子的浓度为1*10⁸孢子/50ml，在28℃恒温摇床中200 rpm培养5天，即得L-苹果酸。

较优地，所述发酵培养基的成分及配制方法为：

较优地，所述方法得到的L-苹果酸产量为65.59 ~ 69.15 g/L，相比出发菌株提高了7.92%，琥珀酸含量为0.91 ~ 1.05 g/L，相比于出发菌株降低了88.73%。

具体地，相关的制备及检测如下：

实施例1：frdA基因和frdB基因敲除载体的构建

本实施例包括以下步骤：

（1）frdA基因敲除载体的构建

为扩增frdA基因下游序列片段，以黑曲霉ATCC1015基因组为模板设计扩增引物frdA-F-F和frdA-F-R，通过PCR扩增回收得到frdA基因下游序列片段，经XbaI和Spe I双酶切且胶回收后与经相同限制性内切酶处理得到的载体pLH594借助One-Step Clone Kit试剂盒进行连接，将连接产物化转至E. coli JM109感受态细胞中，均匀的涂布在含有100 µg/mL卡那霉素抗性的LB固体培养基中，37℃倒置过夜培养，挑取单克隆经菌落PCR验证和提质粒双酶切验证（图2），获得成功连接frdA基因下游序列片段的载体pLH1066，其图谱如图1所示。

为扩增frdA基因上游序列片段，以黑曲霉基因组为模板设计扩增引物frdA-R-F和frdA-R-R，通过PCR扩增回收得到frdA基因上游序列片段，经Sac I和BamH I双酶切且胶回收后与经相同限制性内切酶处理得到的载体pLH1066借助One-Step Clone Kit试剂盒进行连接，将连接产物化转至E. coli JM109感受态细胞中，均匀的涂布在含有100 µg/mL卡那霉素抗性的LB固体培养基中，37℃倒置过夜培养，挑取单克隆经菌落PCR验证和提质粒双酶切验证（图4），获得成功连接frdA基因上游序列片段的载体pLH1067，其图谱如图3所示。

所述扩增引物序列见表1。

所述frdA的氨基酸序列为SEQ NO.2，氨基酸个数为629个；蛋白功能域见图5。

所述frdA基因下游序列为SEQ NO.3，长度为1245 bp。

所述frdA基因上游序列为SEQ NO.4，长度为1285 bp。

所述含有卡那霉素抗性的LB固体培养基成分为：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸出物5g/L、氯化钠10 g/L、琼脂粉15 g/L。121℃灭菌20 min。灭菌冷却至50℃左右时添加卡那霉素至终浓度为100 µg/mL。

（2）frdB基因敲除载体的构建

为扩增frdB基因下游序列片段，以黑曲霉ATCC1015基因组为模板设计扩增引物frdB-F-F和frdB-F-R，通过PCR扩增回收得到frdB基因下游序列片段，经XbaI和Spe I双酶切且胶回收后与经相同限制性内切酶处理得到的载体pLH594借助One-Step Clone Kit试剂盒进行连接，将连接产物化转至E. coli JM109感受态细胞中，均匀的涂布在含有100 µg/mL卡那霉素抗性的LB固体培养基中，37℃倒置过夜培养，挑取单克隆经菌落PCR验证和提质粒双酶切验证（图7），获得成功连接frdA基因下游序列片段的载体pLH1161，其图谱如图6所示。

为扩增frdB基因上游序列片段，以黑曲霉基因组为模板设计扩增引物frdB-R-F和frdB-R-R，通过PCR扩增回收得到frdB基因上游序列片段，经EcoR I和Sac I双酶切且胶回收后与经相同限制性内切酶处理得到的载体pLH1161借助One-Step Clone Kit试剂盒进行连接，将连接产物化转至E. coli JM109感受态细胞中，均匀的涂布在含有100 µg/mL卡那霉素抗性的LB固体培养基中，37℃倒置过夜培养，挑取单克隆经菌落PCR验证和提质粒双酶切验证（图9），获得成功连接frdB基因上游序列片段的载体pLH1162，其图谱如图8所示。

所述扩增引物序列见表1。

所述frdB基因序列为SEQ NO.5，长度为1569 bp；氨基酸序列为SEQ NO.6，氨基酸个数为522个；蛋白功能域见图10。

所述frdB基因下游序列为SEQ NO.7，长度为881 bp。

所述frdB基因上游序列为SEQ NO.8，长度为1463 bp。

所述frdA和frdB蛋白序列相似性对比结果见图11。

实施例2：黑曲霉frdA和frdB基因敲除菌株的获得

本实施例通过以下步骤实现：

（1）frdA基因敲除菌株K1的构建

将载体pLH1067电转至农杆菌，之后将该农杆菌与黑曲霉宿主菌株S489在IM培养基上共培养进行农杆菌介导转化，培养2.5天后将培养产物均匀的涂布在CM培养基中进行培养直至长出转化子，将转化子转接到不同培养基上进行筛选，其在不同培养基上表型应该对潮霉素具有抗性、草铵膦敏感，对此类转化子提基因组验证，设计验证引物（表1），扩增结果满足左右同源臂扩增呈阴性（图12（P1/P2），图13（P3/P4））、左右同源臂-php扩增呈阳性（图12（P1/P641）图13（P642/P4）），挑取其中一个正确的frdA基因敲除克隆进行抗性标记潮霉素的诱导重组从而获得不具有潮霉素抗性的frdA基因敲除菌株K1。

所述基因敲除的转化方法为农杆菌介导法。

所述农杆菌介导法的电转条件为：Capacitnce: 25 uF, Voltage: 2.5 kV,Resistance: 200 Ω, Pulse: 5 msec。

所述所用农杆菌菌株为AGL-1菌株。

所述IM培养基配制方法为：15 g琼脂加水定容至905.7 mL，121℃灭菌20 min，加入提前准备的无菌K buffer 0.8 mL、MN buffer 20 mL、1% CaCl₂·2H₂O 1 mL、0.01%FeSO₄ 10 mL、IM Trace elements 5 mL、20% NH₄NO₃ 2.5 mL、50%甘油 10 mL、1M MES 40mL、20%葡萄糖 5 mL，待温度冷却至50℃左右时加入卡那霉素并使其终浓度为100 µg/mL、加入乙酰丁香酮并使其终浓度为200 µM。

所述CM培养基配制方法为：20 g琼脂加水定容到897 mL，121℃灭菌20 min，加入提前准备的无菌ASP+N 20 mL、50%葡萄糖20 mL、1M MgSO₄ 2 mL、CM Trace elements 1mL、10%酪蛋白水解物10 mL、10%酵母浸出物50 mL，待温度冷却至50℃左右时加入潮霉素并使其终浓度为250 µg/mL、加入链霉素并使其终浓度为100 µg/mL、加入头孢噻污纳并使其终浓度为100 µg/mL、加入氨苄青霉素并使其终浓度为100 µg/mL。

所述验证引物序列见表1。

所述抗性标记诱导重组方法为：将大约400个frdA基因敲除克隆的孢子均匀的涂布到含有30 µg/mL四环素的MM培养基上，28℃培养至长出单克隆，随机挑选100个单克隆转接到PDA培养基上28℃培养24 h，随后将克隆一一对应地转接到含有潮霉素的PDA培养基上28℃培养24 h，最后进行表型观察筛选抗性标记诱导重组的转化子，即在PDA培养基上正常生长在含有潮霉素的PDA培养基上不能生长的为成功诱导重组的转化子。

所述PDA培养基的配制方法为：准确称取去皮马铃薯200 g，切成约1 cm³的小块，加蒸馏水不间断搅拌煮沸30 min，用双层纱布过滤收集滤液，加入20 g葡萄糖搅拌至完全溶解，蒸馏水定容至1 L并分装于广口瓶中，加入1.5%的琼脂，121℃高压灭菌20 min。

（2）frdB基因敲除菌株K2的构建

将载体pLH1162电转至农杆菌，之后将该农杆菌与frdA基因敲除菌株K1在IM培养基上共培养进行农杆菌介导转化，培养2.5天后将培养产物均匀的涂布在CM培养基中进行培养直至长出转化子，将转化子转接到不同培养基上进行筛选，其在不同培养基上表型应该对潮霉素具有抗性、草铵膦敏感，对此类转化子提基因组验证，设计验证引物（表1），扩增结果满足左右同源臂扩增呈阴性（图14（P5/P6），图15（P7/P8））、左右同源臂-php扩增呈阳性（图14（P5/P641）图15（P642/P8）），挑取其中一个正确的frdB基因敲除克隆进行抗性标记潮霉素的诱导重组从而获得不具有潮霉素抗性的frdB基因敲除菌株K2。

实施例3：工程菌株发酵产生L-苹果酸的应用

利用本发明构建的黑曲霉frdA基因和frdB基因敲除工程菌株K1和K2于摇瓶中发酵生产苹果酸的方法，其具体步骤如下：

首先，将获得的工程菌株K1和K2接种在PDA培养基上并置于28℃培养箱中倒置培养5天至产生足够的分生孢子；

然后，收集菌株K1和K2的分生孢子并接种于苹果酸发酵培养基中，其中孢子的终浓度为1*10⁸个/mL，将摇瓶放置于28℃、200 rpm条件下培养5天。

所述苹果酸发酵培养基的组成为：葡萄糖 100g/L，细菌蛋白胨 6 g/L，无水磷酸二氢钾 0.15 g/L，无水磷酸氢二钾 0.15 g/L，氯化钙二水 0.1 g/L，硫酸镁七水 0.1 g/L，氯化钠 0.005 g/L，硫酸亚铁七水 0.005 g/L，无水柠檬酸 0.001 g/L。115℃高压灭菌20 min。

最后，收集发酵产物，制备检测样品，样品经HPLC测定其中主要有机酸的含量。结果显示，主要有机酸为苹果酸，敲除frdA基因的工程菌株K1副产物琥珀酸含量减少至出发菌株的43.07%，而frdA和frdB基因的双敲菌株K2副产物琥珀酸含量与出发菌株相比减少了88.74%，结果见图16。

所述检测样品制备方法：吸取振荡均匀的发酵液2 mL，加入等体积的2 M HCl，充分反应，离心取上清液，稀释50倍，经0.22 µm滤膜过滤后存放于液相小瓶中待HPLC分析。

所述HPLC检测有机酸的方法为：安捷伦高效液相色谱仪UV检测器，AminexHPX-87H色谱柱（300mm*7.8mm），5 mM H₂SO₄流动相，0.6 mL/min流速，65℃色谱柱温，210 nm检测波长，20 µL进样体积。

本发明的研究成果大大减少了黑曲霉发酵生产苹果酸过程中积累的副产物琥珀酸，减少了下游分离纯化苹果酸过程中的成本，为工业化发酵生产苹果酸提供了优良菌株。

本发明中使用到的序列如下：

SEQ NO.1：

ccctttaatctcctcttctcatctctcccccattcatctttgaatttctcttctcatccttgtctcccttccctctacatcttcctcccacacgatggcaaccgcccctagagtaatcgttgttggcggtggacgtgagttgatcttcaccgccaggaaacagctttccccgcattgctgaccattgtctcgtctctcagtgtccgggcttagtgccgcccacaccgtctaccttaacggtggaaatgttctcgttctagacaagcagggtatgtcgacaagccgtagctcccggcgataattgcagtcgcatcattatcgttcggtattatcgtctggaaactaactccagacagccttcttcggtggcaactccaccaaggccacttccggcatcaacggtgccctgacgcgtacccaggtcgacttgggcatcgccgacagcgtcaagcaattttacgatgataccctcaaatctgctagagacaaggctcgtcccgagctgatcaaggtcctcacatacaagtccgctgctgccgtcgagtggttgcaggatgttttcaacctcgatctcacccttgtttcccggctagggtaagcattgcgctttaaatgtcactacagcgtctgtcgcgcaaccttatgctaattcgtgcagcggtcactcccagccccgtacgcatcgtggccacgatgccaagttccctggaatggccatcacatacgccctcatgcaacggttagaagagctcaccgagtctgagcccgaccgtgttcagatcatcaagaaggctcgtgtgacctccatcaacaagtccggaaacaatgtgacgggagttacgtacgagtacgatggcgagacgcatactgctgatggtgtggtcgttctggccactggtggttacgctgctgacttcggcgatggctctctcctgaagcagcaccgccccgacaccttcggtctgtccagcaccaacggcactcacgccactggtgatggtcagaagatgctgatggagatcggtgccaacggcatcgacatggacaaggttcaggtgcaccccacaggtctcgtcgaccctaaggacccgaccgccaaattcaagttcctggctgctgaagccctgcgtggtgagggtggtctccttctcaactcggacggccagcggttctcggatgaactgggccaccgtgactacgtctcgggacagatgtggaaggagaaggagaagggcaagtggcccatccgtctcatcctcaacagcaaggcatccaatgtcctggacttccacacccgccactactctggccgtggtctgatgaagaagatgaccggcaaggagctcgccaaggagatcggttgcggcgaggcagccctcaagaagactttcgacgactacaacctgatcgccgagggcaagaagaaggacccttggaacaagcgtttctttcacaacctgcccttcagcatcgatgacgacttccacgtggctctgatggagcctgttctgcacttcaccatgggtggtattgagatcaacgagcacgcccaggttctcaactccgagaaggaagccttcgacggcctctacgcttgtggtgagctggctggtggtgtccacggtgctaaccgtctgggtggttcttctctgctgggttgtgtcgtatacggtcgcgttgcgggtgacagcgctagccagtacctcttccagaagctgctttccggcggtgcctccacggccgcccagcgactgggccagatctccctgcacatcgacccgtcaacccccggcaagatctccgttgaatggggcggctccggcgccgctggtggccagatcgccgccggtgctggaaccccagctgccgcggcccagggcgccaagtcggcagccacccctgccggtgccgctgagacagccaagcccaaggagcccgccaagttcagcattcccgagaaggaatactccatggaggagatcgccaagcacaacaagaaggacgacctgtggattgtcgtcaagggtgtcgtgctggacgtgaccaactggctcgatgagcaccctggtggagctaacgctctcttcaacttcatgggccgcgatgccacagaaggtatgtcttccccaactttgtctcatctccagaatatatatatactaacttcaatccccaatcacagagttcgcaatgctccacgacgacgaggtcatccccaagtacgctggtcacattgtgatcggccgtgtcaagggccagaccccttagcctagagctgtaaaaaccccgtgaaaatttagaatcggagacatatacgttggagaagagaaagtaaccaggaagagatcacatacccattttctttatctatttacctgtttgttttgtcgagcatgttcatgtccacgtccttggtgatgatgagtaggctcttttatccggagtcactatgtgtctagtatgtaagatacaatcctagtcaattgttcttagaca

SEQ NO.2：

MetAlaThrAlaProArgValIleValValGlyGlyGlyLeuSerGlyLeuSerAlaAlaHisThrValTyrLeuAsnGlyGlyAsnValLeuValLeuAspLysGlnAlaPhePheGlyGlyAsnSerThrLysAlaThrSerGlyIleAsnGlyAlaLeuThrArgThrGlnValAspLeuGlyIleAlaAspSerValLysGlnPheTyrAspAspThrLeuLysSerAlaArgAspLysAlaArgProGluLeuIleLysValLeuThrTyrLysSerAlaAlaAlaValGluTrpLeuGlnAspValPheAsnLeuAspLeuThrLeuValSerArgLeuGlyGlyHisSerGlnProArgThrHisArgGlyHisAspAlaLysPheProGlyMetAlaIleThrTyrAlaLeuMetGlnArgLeuGluGluLeuThrGluSerGluProAspArgValGlnIleIleLysLysAlaArgValThrSerIleAsnLysSerGlyAsnAsnValThrGlyValThrTyrGluTyrAspGlyGluThrHisThrAlaAspGlyValValValLeuAlaThrGlyGlyTyrAlaAlaAspPheGlyAspGlySerLeuLeuLysGlnHisArgProAspThrPheGlyLeuSerSerThrAsnGlyThrHisAlaThrGlyAspGlyGlnLysMetLeuMetGluIleGlyAlaAsnGlyIleAspMetAspLysValGlnValHisProThrGlyLeuValAspProLysAspProThrAlaLysPheLysPheLeuAlaAlaGluAlaLeuArgGlyGluGlyGlyLeuLeuLeuAsnSerAspGlyGlnArgPheSerAspGluLeuGlyHisArgAspTyrValSerGlyGlnMetTrpLysGluLysGluLysGlyLysTrpProIleArgLeuIleLeuAsnSerLysAlaSerAsnValLeuAspPheHisThrArgHisTyrSerGlyArgGlyLeuMetLysLysMetThrGlyLysGluLeuAlaLysGluIleGlyCysGlyGluAlaAlaLeuLysLysThrPheAspAspTyrAsnLeuIleAlaGluGlyLysLysLysAspProTrpAsnLysArgPhePheHisAsnLeuProPheSerIleAspAspAspPheHisValAlaLeuMetGluProValLeuHisPheThrMetGlyGlyIleGluIleAsnGluHisAlaGlnValLeuAsnSerGluLysGluAlaPheAspGlyLeuTyrAlaCysGlyGluLeuAlaGlyGlyValHisGlyAlaAsnArgLeuGlyGlySerSerLeuLeuGlyCysValValTyrGlyArgValAlaGlyAspSerAlaSerGlnTyrLeuPheGlnLysLeuLeuSerGlyGlyAlaSerThrAlaAlaGlnArgLeuGlyGlnIleSerLeuHisIleAspProSerThrProGlyLysIleSerValGluTrpGlyGlySerGlyAlaAlaGlyGlyGlnIleAlaAlaGlyAlaGlyThrProAlaAlaAlaAlaGlnGlyAlaLysSerAlaAlaThrProAlaGlyAlaAlaGluThrAlaLysProLysGluProAlaLysPheSerIleProGluLysGluTyrSerMetGluGluIleAlaLysHisAsnLysLysAspAspLeuTrpIleValValLysGlyValValLeuAspValThrAsnTrpLeuAspGluHisProGlyGlyAlaAsnAlaLeuPheAsnPheMetGlyArgAspAlaThrGluGluPheAlaMetLeuHisAspAspGluValIleProLysTyrAlaGlyHisIleValIleGlyArgValLysGlyGlnThrPro

SEQ NO.3：

GCCTAGAGCTGTAAAAACCCCGTGAAAATTTAGAATCGGAGACATATACGTTGGAGAAGAGAAAGTAACCAGGAAGAGATCACATACCCATTTTCTTTATCTATTTACCTGTTTGTTTTGTCGAGCATGTTCATGTCCACGTCCTTGGTGATGATGAGTAGGCTCTTTTATCCGGAGTCACTATGTGTCTAGTATGTAAGATACAATCCTAGTCAATTGTTCTTAGACATAGTCGCTGCCAGATATGTAAGACTTAAAGGTAAAAATAGCAGCAAACAATAGACAGCTGCAACGACACCAGTAATGAACAGTACATATCCGAAACCAGCGAAGAAAGAAACAATGATGTAAATGTATCCTAGCTTCAGTGATCCAATTATCCGATCATTATAATACAATTGAACAATATGAGTAAGCCGAGTCCTCGGCAAGTCCGGGTCATTGCTGCATGTGCCTCAAGATCATCTTCAGACGTCGCACGGCAGGCCCCTCTTCCGTGCTTCCGGAGTCCTTATTGGATTCCATTTCCTTGGCCGCAGCCTCTAGCGTAGGGCGAAGGTAGCCCCAGACCTCGTCATGGTATCGGTCCTCGACACTAAGCCAGTCCGCTGCGCCCGGGAGACCGGTCAGGACGGTTTCCCGCAGGGTGGCTACGTCTGAATGGCCTTGTGATGGAACGGTGTCTAGGAATTCGCCAATGTCTGGGACCAGACTGTGGGATGTCAATGTATTATTGTCGTGTGAGGGCAGCGCTGTGGACGATGTTGGGGGTGTAAGACGACGGAAGGACTCGATCATTTCCTTTTCTTCGGGTGTGAGTTGCATTGGAAGCAGCTCTGTTTCGACTATGTCGGCGGGCTCGTCGGCCGTGGGAGGGAATTCGGGATCGAAGCTCTGATCAGAGAGGAGGGATACGACTGCGTCACCGTCGGATGGGAGGAGAGAGGGTCGGTCGGGTTGGAACCTTTGTTCGGTTGAAACTGGATTAGTATAGTCGCCGGAGAGCAAATCCGTTGCAGTATCTCTCCCTTTCCCTTTCCCTTTGCCCGTAGATTCGTCCGCGTTTAGACCTGCAATGAAGCTGTCATTGTTTCCGACCAGGGATTCCGCGCCGTAAGTGCGTTGGAATTCATCTTCCGAGAGTGGAGGGAGCTGGAACCCTCCCTGTTGCACGGTGGTAGCTGAGCGAAATGCTTCAGCAGGGGCAGGTAGTGAAGAATTCCCAGTCGAGGGAGAGGCAGAAGT

SEQ NO.4：

CAGGTGACGTGGGAAGGATCGGTTGTTGGGGGGATTTGGTATGTACGTTTTGTATTTATGTATTGTATGCTGGGGCTTTATTGTTTTCAGTATGGTTTGTTGTTGACGTTTTGAATGTGTGTCTTCAAGGATTTAATTTAGTTAGTGGCGTTGTAGTGAGTTGAGGTATGGGCTGATTTTGTTCAAGGTGATCGGTGATGATGATGGGGTCTCGGTCCGAGGTAAGTGATCGAGGCCTGGGGGGGGGGTATTGGATGTATTGAAGTTTTGTTGCCATTCTTCAAGGTCCCTGTCTTTGTGTGTATGTATGTATGGGGTAATTCGGATACTTAAATAAGGTGTATTGAATACTAATTATGATAGTTCTTATTGATAGTGTTTGTGTTTGTTGTTGTAGTGAATGTATATATATATAATGTGAGATCAACCAGTTCCAGGTACTATCTAAGCTTCAGATGAAAAGCTACCTTCACTTCACTAAATAGACATCTCATTCATGAAATCTAGATGGAGCAGACATCCCGATCATCTAGGTAACCCCAAAATTGAGACGAATCTGAATCCGGGGACAGAGTTTAAATCGAAGAGCATGACGTGCCGCGCTGACTTAAGCCTACGATTTCATTTGCTGAAAGGCTGCTGCTGGGGTTTCCAGGCATGTGAAAGCCTGGGAGTCTCTCTCTTGCCCTCAGGTATGCTTGTAGTATAATATGTCATGGGAAGGAACCGCAGGGTCAGCTTGCAGCTCCTGGTGACGCTCTGCATGTGATGGACCCCTGGTCTGCTGGAAACTCACTAGTATTCTGTCAACGACAGGGGAGTGATTTTTGAATGTCTACTGCCTATTGATAACTCGACTGTAGTACCTATACTAAGTAGAACCCGTCATTCAGTCAGTCAAGAAGCACAGGCCAGAGACAGACAAAAGAAGGACCCATCGAATCCACTTAAGACAGGCTGAACATTCGTTGATCCCCTCAAAAAGTAGAAGAGAAGATACCGGACCGGAAAAGGGAGAGGAGGGAGGAGGGGGTCATAGAACGGTAATCGTACGGTACATACCCGAGTTGAATGAATTGAATGGGGAAGAAATGAGCCTCGGCCGAGTGAGTGAGTCTCTCCCCCGTCGGCTTCTGAATGCCTGGCTCTACTCTTCTTCCCCCGGATCTCCTGGTGCTTAAAGATCTACTTGTTCCTACCTGCTTTTTGACCCTTTAATCTCCTCTTCTCATCTCTCCCCCATTCATCTTTGAATTTCTCTTCTCATCCTTGTCTCCCTTCCCTC

SEQ NO.5:

atggctcttccctcagaatgcgacgtgctcgtcattggcggcgggaatgccggcttctgcgcagccatttcggcagtccagtccggcgcaaaacacgttgctatcatcgataaatgtccggaggaatgggcaggaggtaactcttacttcacagcgggggcaatgcgcaccgtccacggcggattgccggatctgcttcccatcgtgaataatgtcgatgcggagacggcgaagaagattgatatgaagccgtataccgtggaggacttcaccggcgacatgaaccgtgttacggggcggcgcaccaaccgcgagctctgccagacactcgtcaatgagtcaaactcggcgatcaagtggctggctagtaatggcgtgcgcttccagctctctttcaatcgacaggcgtatgaagtcaacggccgcctcaagttctggggtggtcttgcgctgaagactcaagatggcggcaagggtctcattcaggatcacctgcaagcagcccggaaactgggcattaaggtggtcttctcgaccgctgctcagaaactagtaacggatccggtctctggagccgtgacgtccgtcgtggtttcgcatcacggccgcgagcagactgttaaggctggggccgtgattctcgcggccggaggcttcgaagggaacccgcgcatgcgcgcgcagtaccttggaccacactgggacgtggcgctggtacgcggcacgccctataactctggggatggattcgagatggcgatccgggatgtctcagccaagcaggcgggcaactggtcaggatgtcactgcgtggcgtgggatgctaacgcaccggccgatacgggcgaccgggagatctccaacgagttcaccaagtccgggtatccgttgggcatcatgatcaatcggcagggaaaccggttcgtggacgaggggtcggatctgcgcaactatacgtatgcgatgatcggacgccagattctcaaccagcccggccacatggcgttccagatctgggactccaagatgatcccttggttgcggtcggaggagtaccggccggaggtagtgcagcatatcagcgcggccacgatcagtgagctggcggagaagtgtgccgagtttgatctcgaggataagaagcgctttgagcagaccatccatgactataataaggcggtttatgagcgccagcgcaggcatccgggtgggaagtgggatccggctgtcaaagatggacttaccacgcagtcggagggcttggagctggcagttcccaagtcgaactgggcgcttcctattgatcaaggaccgttcctggctgtccgggtcacggcgggcatcacttttacgtttggtggactggcggttcgtccggagacggcggcggtggtgtcgtcgacaacaaaccaagaggtgccggggttgtactgcgcaggggagatgctgggaggactgttttatgacaactatcctggaggcagtggattgacgtcgggggctgtctttggacgacgagctggtcgggctgcggcggcgagggtgtcgagccggcaggcacggttgtag

SEQ NO.6:

MetAlaLeuProSerGluCysAspValLeuValIleGlyGlyGlyAsnAlaGlyPheCysAlaAlaIleSerAlaValGlnSerGlyAlaLysHisValAlaIleIleAspLysCysProGluGluTrpAlaGlyGlyAsnSerTyrPheThrAlaGlyAlaMetArgThrValHisGlyGlyLeuProAspLeuLeuProIleValAsnAsnValAspAlaGluThrAlaLysLysIleAspMetLysProTyrThrValGluAspPheThrGlyAspMetAsnArgValThrGlyArgArgThrAsnArgGluLeuCysGlnThrLeuValAsnGluSerAsnSerAlaIleLysTrpLeuAlaSerAsnGlyValArgPheGlnLeuSerPheAsnArgGlnAlaTyrGluValAsnGlyArgLeuLysPheTrpGlyGlyLeuAlaLeuLysThrGlnAspGlyGlyLysGlyLeuIleGlnAspHisLeuGlnAlaAlaArgLysLeuGlyIleLysValValPheSerThrAlaAlaGlnLysLeuValThrAspProValSerGlyAlaValThrSerValValValSerHisHisGlyArgGluGlnThrValLysAlaGlyAlaValIleLeuAlaAlaGlyGlyPheGluGlyAsnProArgMetArgAlaGlnTyrLeuGlyProHisTrpAspValAlaLeuValArgGlyThrProTyrAsnSerGlyAspGlyPheGluMetAlaIleArgAspValSerAlaLysGlnAlaGlyAsnTrpSerGlyCysHisCysValAlaTrpAspAlaAsnAlaProAlaAspThrGlyAspArgGluIleSerAsnGluPheThrLysSerGlyTyrProLeuGlyIleMetIleAsnArgGlnGlyAsnArgPheValAspGluGlySerAspLeuArgAsnTyrThrTyrAlaMetIleGlyArgGlnIleLeuAsnGlnProGlyHisMetAlaPheGlnIleTrpAspSerLysMetIleProTrpLeuArgSerGluGluTyrArgProGluValValGlnHisIleSerAlaAlaThrIleSerGluLeuAlaGluLysCysAlaGluPheAspLeuGluAspLysLysArgPheGluGlnThrIleHisAspTyrAsnLysAlaValTyrGluArgGlnArgArgHisProGlyGlyLysTrpAspProAlaValLysAspGlyLeuThrThrGlnSerGluGlyLeuGluLeuAlaValProLysSerAsnTrpAlaLeuProIleAspGlnGlyProPheLeuAlaValArgValThrAlaGlyIleThrPheThrPheGlyGlyLeuAlaValArgProGluThrAlaAlaValValSerSerThrThrAsnGlnGluValProGlyLeuTyrCysAlaGlyGluMetLeuGlyGlyLeuPheTyrAspAsnTyrProGlyGlySerGlyLeuThrSerGlyAlaValPheGlyArgArgAlaGlyArgAlaAlaAlaAlaArgValSerSerArgGlnAlaArgLeu

SEQ NO.7:

GACCACACTGGGACGTGGCGCTGGTACGCGGCACGCCCTATAACTCTGGGGATGGATTCGAGATGGCGATCCGGGATGTCTCAGCCAAGCAGGCGGGCAACTGGTCAGGATGTCACTGCGTGGCGTGGGATGCTAACGCACCGGCCGATACGGGCGACCGGGAGATCTCCAACGAGTTCACCAAGTCCGGGTATCCGTTGGGCATCATGATCAATCGGCAGGGAAACCGGTTCGTGGACGAGGGGTCGGATCTGCGCAACTATACGTATGCGATGATCGGACGCCAGATTCTCAACCAGCCCGGCCACATGGCGTTCCAGATCTGGGACTCCAAGATGATCCCTTGGTTGCGGTCGGAGGAGTACCGGCCGGAGGTAGTGCAGCATATCAGCGCGGCCACGATCAGTGAGCTGGCGGAGAAGTGTGCCGAGTTTGATCTCGAGGATAAGAAGCGCTTTGAGCAGACCATCCATGACTATAATAAGGCGGTTTATGAGCGCCAGCGCAGGCATCCGGGTGGGAAGTGGGATCCGGCTGTCAAAGATGGACTTACCACGCAGTCGGAGGGCTTGGAGCTGGCAGTTCCCAAGTCGAACTGGGCGCTTCCTATTGATCAAGGACCGTTCCTGGCTGTCCGGGTCACGGCGGGCATCACTTTTACGTTTGGTGGACTGGCGGTTCGTCCGGAGACGGCGGCGGTGGTGTCGTCGACAACAAACCAAGAGGTGCCGGGGTTGTACTGCGCAGGGGAGATGCTGGGAGGACTGTTTTATGACAACTATCCTGGAGGCAGTGGATTGACGTCGGGGGCTGTCTTTGGACGACGAGCTGGTCGGGCTGCGGCGGCGAGGGTGTCGAGCCGGCAGGCACGGTTGTAGTCT

SEQ NO.8:

GTGCACCTTTCACCGTCCTGCCGGCCCTGATGAACGAATACCGTGTGCCCGAACTGAACGTCCAGAACGGTGTGCTCAAGGCCATGTCCTTCTTGTTCGAGTACATTGGCGAGATGGCCAAGGATTACGTCTACGCAGTCACGCCTCTTCTGGAGGATGCTCTCATCGATCGCGACCAGGTGCACCGGCAGACCGCAGCCAGCGTTGTCAAGCACATCGCGCTGGGCGTGGTTGGTTTGGGATGTGAAGACGCAATGGTGCATCTGCTTAACCTGGTGTTCCCCAACATCTTCGAGACCAGCCCCCACGTCATCGACCGTGTCATTGAAGCCATTGATGCGATCCGGATGGCAGTCGGCACCGGTGTGGTCATGAACTACGTGTGGGCAGGCTTGTTCCACCCGGCGCGCAAGGTGCGCACGCCGTATTGGCGACTGTACAACGATGCGTACGTGCAGAGTGCGGACGCGATGATTCCCTACTACCCCGGCCTGGAAGACGATGGTCTGGACCGGACTGAGTTGTCTATCATAGTTTGAACAAAAGCCAGCCAGCGCGTGTCATTTATCATCATCTTCTTCTCTGTCTCTGTACCCTCTTCTGCCGTGTGTTTTTCTATCTTCTCAACATATTGGGGCTTGTTCAATTACGGTGTTTCTCTGGCGGGATTTGGCGTGTCTGAACCATCTTTATCTAAGATATAGTAGTCTATGGCAATATCCAACATTTCAACGTTCAATATAATTCTATCCCATTTACTTTCCGTTCGGCACTTCTGTAAGTCAAACTAGTACTCAACTGATTGATCGAAGCGATCGATCTTTCCATTCCCGATCGACCCTCGACTATTCTCTCCCCCGCAATTTGCAGCGTGGGGAGCACCCGCACTCACACTCCGCGCATCATGCCATGCATGCGTTCGTTTGCGAGATCCGAGTCACCCTCGATCGCTCTAGCAGAGCTATCCACTTTTCTCCCTAACATTCCTGTCCTACTTCCGATGACATCAAGCAGCGCTGCCCAGACCGACCGGAAAGACTCTCTCCGCCTCCCTCCGTGGCACCGACGGAGCATAACTCTCCGTTTCCCAACCCCATTCCCCCATCCTCGGCACCATCCCCGCCGTCCGTCGCTACATACAAAGCCGCAGGCAACTTGAGCACAGATCCCAGAGCACTATGTATCTACTTGATGCGATGATCATCAGTCTCCTTCCCTTAGCAGACTAAATGCACTAATGCTCTTTTCTCTTTGACGCATACACGCACGCACGCACGCACAGGCACACCCACCCACACACACAGACACATCACTCTAGCATCATGGCTCTTCCCTCAGAATGCGACGTGCTCGTCATTGGCGGCGGGAATGCCGGCTTCTGCGCAGCCATTTCGGCAGTCCAGTCCGGCGCAAAACACGTTGCTATCATCGATAAATGTCCGGAGGAATGGGCAGGAGGTAAC

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 南京昊禾生物科技有限公司

<120> 一种降低L-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的方法、菌株及应用

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2496

<212> DNA

<213> 富马酸还原酶基因frdA的基因序列(Unknown)

<400> 1

ccctttaatc tcctcttctc atctctcccc cattcatctt tgaatttctc ttctcatcct 60

tgtctccctt ccctctacat cttcctccca cacgatggca accgccccta gagtaatcgt 120

tgttggcggt ggacgtgagt tgatcttcac cgccaggaaa cagctttccc cgcattgctg 180

accattgtct cgtctctcag tgtccgggct tagtgccgcc cacaccgtct accttaacgg 240

tggaaatgtt ctcgttctag acaagcaggg tatgtcgaca agccgtagct cccggcgata 300

attgcagtcg catcattatc gttcggtatt atcgtctgga aactaactcc agacagcctt 360

cttcggtggc aactccacca aggccacttc cggcatcaac ggtgccctga cgcgtaccca 420

ggtcgacttg ggcatcgccg acagcgtcaa gcaattttac gatgataccc tcaaatctgc 480

tagagacaag gctcgtcccg agctgatcaa ggtcctcaca tacaagtccg ctgctgccgt 540

cgagtggttg caggatgttt tcaacctcga tctcaccctt gtttcccggc tagggtaagc 600

attgcgcttt aaatgtcact acagcgtctg tcgcgcaacc ttatgctaat tcgtgcagcg 660

gtcactccca gccccgtacg catcgtggcc acgatgccaa gttccctgga atggccatca 720

catacgccct catgcaacgg ttagaagagc tcaccgagtc tgagcccgac cgtgttcaga 780

tcatcaagaa ggctcgtgtg acctccatca acaagtccgg aaacaatgtg acgggagtta 840

cgtacgagta cgatggcgag acgcatactg ctgatggtgt ggtcgttctg gccactggtg 900

gttacgctgc tgacttcggc gatggctctc tcctgaagca gcaccgcccc gacaccttcg 960

gtctgtccag caccaacggc actcacgcca ctggtgatgg tcagaagatg ctgatggaga 1020

tcggtgccaa cggcatcgac atggacaagg ttcaggtgca ccccacaggt ctcgtcgacc 1080

ctaaggaccc gaccgccaaa ttcaagttcc tggctgctga agccctgcgt ggtgagggtg 1140

gtctccttct caactcggac ggccagcggt tctcggatga actgggccac cgtgactacg 1200

tctcgggaca gatgtggaag gagaaggaga agggcaagtg gcccatccgt ctcatcctca 1260

acagcaaggc atccaatgtc ctggacttcc acacccgcca ctactctggc cgtggtctga 1320

tgaagaagat gaccggcaag gagctcgcca aggagatcgg ttgcggcgag gcagccctca 1380

agaagacttt cgacgactac aacctgatcg ccgagggcaa gaagaaggac ccttggaaca 1440

agcgtttctt tcacaacctg cccttcagca tcgatgacga cttccacgtg gctctgatgg 1500

agcctgttct gcacttcacc atgggtggta ttgagatcaa cgagcacgcc caggttctca 1560

actccgagaa ggaagccttc gacggcctct acgcttgtgg tgagctggct ggtggtgtcc 1620

acggtgctaa ccgtctgggt ggttcttctc tgctgggttg tgtcgtatac ggtcgcgttg 1680

cgggtgacag cgctagccag tacctcttcc agaagctgct ttccggcggt gcctccacgg 1740

ccgcccagcg actgggccag atctccctgc acatcgaccc gtcaaccccc ggcaagatct 1800

ccgttgaatg gggcggctcc ggcgccgctg gtggccagat cgccgccggt gctggaaccc 1860

cagctgccgc ggcccagggc gccaagtcgg cagccacccc tgccggtgcc gctgagacag 1920

ccaagcccaa ggagcccgcc aagttcagca ttcccgagaa ggaatactcc atggaggaga 1980

tcgccaagca caacaagaag gacgacctgt ggattgtcgt caagggtgtc gtgctggacg 2040

tgaccaactg gctcgatgag caccctggtg gagctaacgc tctcttcaac ttcatgggcc 2100

gcgatgccac agaaggtatg tcttccccaa ctttgtctca tctccagaat atatatatac 2160

taacttcaat ccccaatcac agagttcgca atgctccacg acgacgaggt catccccaag 2220

tacgctggtc acattgtgat cggccgtgtc aagggccaga ccccttagcc tagagctgta 2280

aaaaccccgt gaaaatttag aatcggagac atatacgttg gagaagagaa agtaaccagg 2340

aagagatcac atacccattt tctttatcta tttacctgtt tgttttgtcg agcatgttca 2400

tgtccacgtc cttggtgatg atgagtaggc tcttttatcc ggagtcacta tgtgtctagt 2460

atgtaagata caatcctagt caattgttct tagaca 2496

<210> 2

<211> 629

<212> PRT

<213> 富马酸还原酶基因frdA的氨基酸序列(Unknown)

<400> 2

Met Ala Thr Ala Pro Arg Val Ile Val Val Gly Gly Gly Leu Ser Gly

1 5 10 15

Leu Ser Ala Ala His Thr Val Tyr Leu Asn Gly Gly Asn Val Leu Val

20 25 30

Leu Asp Lys Gln Ala Phe Phe Gly Gly Asn Ser Thr Lys Ala Thr Ser

35 40 45

Gly Ile Asn Gly Ala Leu Thr Arg Thr Gln Val Asp Leu Gly Ile Ala

50 55 60

Asp Ser Val Lys Gln Phe Tyr Asp Asp Thr Leu Lys Ser Ala Arg Asp

65 70 75 80

Lys Ala Arg Pro Glu Leu Ile Lys Val Leu Thr Tyr Lys Ser Ala Ala

85 90 95

Ala Val Glu Trp Leu Gln Asp Val Phe Asn Leu Asp Leu Thr Leu Val

100 105 110

Ser Arg Leu Gly Gly His Ser Gln Pro Arg Thr His Arg Gly His Asp

115 120 125

Ala Lys Phe Pro Gly Met Ala Ile Thr Tyr Ala Leu Met Gln Arg Leu

130 135 140

Glu Glu Leu Thr Glu Ser Glu Pro Asp Arg Val Gln Ile Ile Lys Lys

145 150 155 160

Ala Arg Val Thr Ser Ile Asn Lys Ser Gly Asn Asn Val Thr Gly Val

165 170 175

Thr Tyr Glu Tyr Asp Gly Glu Thr His Thr Ala Asp Gly Val Val Val

180 185 190

Leu Ala Thr Gly Gly Tyr Ala Ala Asp Phe Gly Asp Gly Ser Leu Leu

195 200 205

Lys Gln His Arg Pro Asp Thr Phe Gly Leu Ser Ser Thr Asn Gly Thr

210 215 220

His Ala Thr Gly Asp Gly Gln Lys Met Leu Met Glu Ile Gly Ala Asn

225 230 235 240

Gly Ile Asp Met Asp Lys Val Gln Val His Pro Thr Gly Leu Val Asp

245 250 255

Pro Lys Asp Pro Thr Ala Lys Phe Lys Phe Leu Ala Ala Glu Ala Leu

260 265 270

Arg Gly Glu Gly Gly Leu Leu Leu Asn Ser Asp Gly Gln Arg Phe Ser

275 280 285

Asp Glu Leu Gly His Arg Asp Tyr Val Ser Gly Gln Met Trp Lys Glu

290 295 300

Lys Glu Lys Gly Lys Trp Pro Ile Arg Leu Ile Leu Asn Ser Lys Ala

305 310 315 320

Ser Asn Val Leu Asp Phe His Thr Arg His Tyr Ser Gly Arg Gly Leu

325 330 335

Met Lys Lys Met Thr Gly Lys Glu Leu Ala Lys Glu Ile Gly Cys Gly

340 345 350

Glu Ala Ala Leu Lys Lys Thr Phe Asp Asp Tyr Asn Leu Ile Ala Glu

355 360 365

Gly Lys Lys Lys Asp Pro Trp Asn Lys Arg Phe Phe His Asn Leu Pro

370 375 380

Phe Ser Ile Asp Asp Asp Phe His Val Ala Leu Met Glu Pro Val Leu

385 390 395 400

His Phe Thr Met Gly Gly Ile Glu Ile Asn Glu His Ala Gln Val Leu

405 410 415

Asn Ser Glu Lys Glu Ala Phe Asp Gly Leu Tyr Ala Cys Gly Glu Leu

420 425 430

Ala Gly Gly Val His Gly Ala Asn Arg Leu Gly Gly Ser Ser Leu Leu

435 440 445

Gly Cys Val Val Tyr Gly Arg Val Ala Gly Asp Ser Ala Ser Gln Tyr

450 455 460

Leu Phe Gln Lys Leu Leu Ser Gly Gly Ala Ser Thr Ala Ala Gln Arg

465 470 475 480

Leu Gly Gln Ile Ser Leu His Ile Asp Pro Ser Thr Pro Gly Lys Ile

485 490 495

Ser Val Glu Trp Gly Gly Ser Gly Ala Ala Gly Gly Gln Ile Ala Ala

500 505 510

Gly Ala Gly Thr Pro Ala Ala Ala Ala Gln Gly Ala Lys Ser Ala Ala

515 520 525

Thr Pro Ala Gly Ala Ala Glu Thr Ala Lys Pro Lys Glu Pro Ala Lys

530 535 540

Phe Ser Ile Pro Glu Lys Glu Tyr Ser Met Glu Glu Ile Ala Lys His

545 550 555 560

Asn Lys Lys Asp Asp Leu Trp Ile Val Val Lys Gly Val Val Leu Asp

565 570 575

Val Thr Asn Trp Leu Asp Glu His Pro Gly Gly Ala Asn Ala Leu Phe

580 585 590

Asn Phe Met Gly Arg Asp Ala Thr Glu Glu Phe Ala Met Leu His Asp

595 600 605

Asp Glu Val Ile Pro Lys Tyr Ala Gly His Ile Val Ile Gly Arg Val

610 615 620

Lys Gly Gln Thr Pro

625

<210> 3

<211> 1245

<212> DNA

<213> frdA基因下游序列(Unknown)

<400> 3

gcctagagct gtaaaaaccc cgtgaaaatt tagaatcgga gacatatacg ttggagaaga 60

gaaagtaacc aggaagagat cacataccca ttttctttat ctatttacct gtttgttttg 120

tcgagcatgt tcatgtccac gtccttggtg atgatgagta ggctctttta tccggagtca 180

ctatgtgtct agtatgtaag atacaatcct agtcaattgt tcttagacat agtcgctgcc 240

agatatgtaa gacttaaagg taaaaatagc agcaaacaat agacagctgc aacgacacca 300

gtaatgaaca gtacatatcc gaaaccagcg aagaaagaaa caatgatgta aatgtatcct 360

agcttcagtg atccaattat ccgatcatta taatacaatt gaacaatatg agtaagccga 420

gtcctcggca agtccgggtc attgctgcat gtgcctcaag atcatcttca gacgtcgcac 480

ggcaggcccc tcttccgtgc ttccggagtc cttattggat tccatttcct tggccgcagc 540

ctctagcgta gggcgaaggt agccccagac ctcgtcatgg tatcggtcct cgacactaag 600

ccagtccgct gcgcccggga gaccggtcag gacggtttcc cgcagggtgg ctacgtctga 660

atggccttgt gatggaacgg tgtctaggaa ttcgccaatg tctgggacca gactgtggga 720

tgtcaatgta ttattgtcgt gtgagggcag cgctgtggac gatgttgggg gtgtaagacg 780

acggaaggac tcgatcattt ccttttcttc gggtgtgagt tgcattggaa gcagctctgt 840

ttcgactatg tcggcgggct cgtcggccgt gggagggaat tcgggatcga agctctgatc 900

agagaggagg gatacgactg cgtcaccgtc ggatgggagg agagagggtc ggtcgggttg 960

gaacctttgt tcggttgaaa ctggattagt atagtcgccg gagagcaaat ccgttgcagt 1020

atctctccct ttccctttcc ctttgcccgt agattcgtcc gcgtttagac ctgcaatgaa 1080

gctgtcattg tttccgacca gggattccgc gccgtaagtg cgttggaatt catcttccga 1140

gagtggaggg agctggaacc ctccctgttg cacggtggta gctgagcgaa atgcttcagc 1200

aggggcaggt agtgaagaat tcccagtcga gggagaggca gaagt 1245

<210> 4

<211> 1285

<212> DNA

<213> frdA基因上游序列(Unknown)

<400> 4

caggtgacgt gggaaggatc ggttgttggg gggatttggt atgtacgttt tgtatttatg 60

tattgtatgc tggggcttta ttgttttcag tatggtttgt tgttgacgtt ttgaatgtgt 120

gtcttcaagg atttaattta gttagtggcg ttgtagtgag ttgaggtatg ggctgatttt 180

gttcaaggtg atcggtgatg atgatggggt ctcggtccga ggtaagtgat cgaggcctgg 240

ggggggggta ttggatgtat tgaagttttg ttgccattct tcaaggtccc tgtctttgtg 300

tgtatgtatg tatggggtaa ttcggatact taaataaggt gtattgaata ctaattatga 360

tagttcttat tgatagtgtt tgtgtttgtt gttgtagtga atgtatatat atataatgtg 420

agatcaacca gttccaggta ctatctaagc ttcagatgaa aagctacctt cacttcacta 480

aatagacatc tcattcatga aatctagatg gagcagacat cccgatcatc taggtaaccc 540

caaaattgag acgaatctga atccggggac agagtttaaa tcgaagagca tgacgtgccg 600

cgctgactta agcctacgat ttcatttgct gaaaggctgc tgctggggtt tccaggcatg 660

tgaaagcctg ggagtctctc tcttgccctc aggtatgctt gtagtataat atgtcatggg 720

aaggaaccgc agggtcagct tgcagctcct ggtgacgctc tgcatgtgat ggacccctgg 780

tctgctggaa actcactagt attctgtcaa cgacagggga gtgatttttg aatgtctact 840

gcctattgat aactcgactg tagtacctat actaagtaga acccgtcatt cagtcagtca 900

agaagcacag gccagagaca gacaaaagaa ggacccatcg aatccactta agacaggctg 960

aacattcgtt gatcccctca aaaagtagaa gagaagatac cggaccggaa aagggagagg 1020

agggaggagg gggtcataga acggtaatcg tacggtacat acccgagttg aatgaattga 1080

atggggaaga aatgagcctc ggccgagtga gtgagtctct cccccgtcgg cttctgaatg 1140

cctggctcta ctcttcttcc cccggatctc ctggtgctta aagatctact tgttcctacc 1200

tgctttttga ccctttaatc tcctcttctc atctctcccc cattcatctt tgaatttctc 1260

ttctcatcct tgtctccctt ccctc 1285

<210> 5

<211> 1569

<212> DNA

<213> 基因frdB的基因序列(Unknown)

<400> 5

atggctcttc cctcagaatg cgacgtgctc gtcattggcg gcgggaatgc cggcttctgc 60

gcagccattt cggcagtcca gtccggcgca aaacacgttg ctatcatcga taaatgtccg 120

gaggaatggg caggaggtaa ctcttacttc acagcggggg caatgcgcac cgtccacggc 180

ggattgccgg atctgcttcc catcgtgaat aatgtcgatg cggagacggc gaagaagatt 240

gatatgaagc cgtataccgt ggaggacttc accggcgaca tgaaccgtgt tacggggcgg 300

cgcaccaacc gcgagctctg ccagacactc gtcaatgagt caaactcggc gatcaagtgg 360

ctggctagta atggcgtgcg cttccagctc tctttcaatc gacaggcgta tgaagtcaac 420

ggccgcctca agttctgggg tggtcttgcg ctgaagactc aagatggcgg caagggtctc 480

attcaggatc acctgcaagc agcccggaaa ctgggcatta aggtggtctt ctcgaccgct 540

gctcagaaac tagtaacgga tccggtctct ggagccgtga cgtccgtcgt ggtttcgcat 600

cacggccgcg agcagactgt taaggctggg gccgtgattc tcgcggccgg aggcttcgaa 660

gggaacccgc gcatgcgcgc gcagtacctt ggaccacact gggacgtggc gctggtacgc 720

ggcacgccct ataactctgg ggatggattc gagatggcga tccgggatgt ctcagccaag 780

caggcgggca actggtcagg atgtcactgc gtggcgtggg atgctaacgc accggccgat 840

acgggcgacc gggagatctc caacgagttc accaagtccg ggtatccgtt gggcatcatg 900

atcaatcggc agggaaaccg gttcgtggac gaggggtcgg atctgcgcaa ctatacgtat 960

gcgatgatcg gacgccagat tctcaaccag cccggccaca tggcgttcca gatctgggac 1020

tccaagatga tcccttggtt gcggtcggag gagtaccggc cggaggtagt gcagcatatc 1080

agcgcggcca cgatcagtga gctggcggag aagtgtgccg agtttgatct cgaggataag 1140

aagcgctttg agcagaccat ccatgactat aataaggcgg tttatgagcg ccagcgcagg 1200

catccgggtg ggaagtggga tccggctgtc aaagatggac ttaccacgca gtcggagggc 1260

ttggagctgg cagttcccaa gtcgaactgg gcgcttccta ttgatcaagg accgttcctg 1320

gctgtccggg tcacggcggg catcactttt acgtttggtg gactggcggt tcgtccggag 1380

acggcggcgg tggtgtcgtc gacaacaaac caagaggtgc cggggttgta ctgcgcaggg 1440

gagatgctgg gaggactgtt ttatgacaac tatcctggag gcagtggatt gacgtcgggg 1500

gctgtctttg gacgacgagc tggtcgggct gcggcggcga gggtgtcgag ccggcaggca 1560

cggttgtag 1569

<210> 6

<211> 522

<212> PRT

<213> 基因frdB的氨基酸序列(Unknown)

<400> 6

Met Ala Leu Pro Ser Glu Cys Asp Val Leu Val Ile Gly Gly Gly Asn

1 5 10 15

Ala Gly Phe Cys Ala Ala Ile Ser Ala Val Gln Ser Gly Ala Lys His

20 25 30

Val Ala Ile Ile Asp Lys Cys Pro Glu Glu Trp Ala Gly Gly Asn Ser

35 40 45

Tyr Phe Thr Ala Gly Ala Met Arg Thr Val His Gly Gly Leu Pro Asp

50 55 60

Leu Leu Pro Ile Val Asn Asn Val Asp Ala Glu Thr Ala Lys Lys Ile

65 70 75 80

Asp Met Lys Pro Tyr Thr Val Glu Asp Phe Thr Gly Asp Met Asn Arg

85 90 95

Val Thr Gly Arg Arg Thr Asn Arg Glu Leu Cys Gln Thr Leu Val Asn

100 105 110

Glu Ser Asn Ser Ala Ile Lys Trp Leu Ala Ser Asn Gly Val Arg Phe

115 120 125

Gln Leu Ser Phe Asn Arg Gln Ala Tyr Glu Val Asn Gly Arg Leu Lys

130 135 140

Phe Trp Gly Gly Leu Ala Leu Lys Thr Gln Asp Gly Gly Lys Gly Leu

145 150 155 160

Ile Gln Asp His Leu Gln Ala Ala Arg Lys Leu Gly Ile Lys Val Val

165 170 175

Phe Ser Thr Ala Ala Gln Lys Leu Val Thr Asp Pro Val Ser Gly Ala

180 185 190

Val Thr Ser Val Val Val Ser His His Gly Arg Glu Gln Thr Val Lys

195 200 205

Ala Gly Ala Val Ile Leu Ala Ala Gly Gly Phe Glu Gly Asn Pro Arg

210 215 220

Met Arg Ala Gln Tyr Leu Gly Pro His Trp Asp Val Ala Leu Val Arg

225 230 235 240

Gly Thr Pro Tyr Asn Ser Gly Asp Gly Phe Glu Met Ala Ile Arg Asp

245 250 255

Val Ser Ala Lys Gln Ala Gly Asn Trp Ser Gly Cys His Cys Val Ala

260 265 270

Trp Asp Ala Asn Ala Pro Ala Asp Thr Gly Asp Arg Glu Ile Ser Asn

275 280 285

Glu Phe Thr Lys Ser Gly Tyr Pro Leu Gly Ile Met Ile Asn Arg Gln

290 295 300

Gly Asn Arg Phe Val Asp Glu Gly Ser Asp Leu Arg Asn Tyr Thr Tyr

305 310 315 320

Ala Met Ile Gly Arg Gln Ile Leu Asn Gln Pro Gly His Met Ala Phe

325 330 335

Gln Ile Trp Asp Ser Lys Met Ile Pro Trp Leu Arg Ser Glu Glu Tyr

340 345 350

Arg Pro Glu Val Val Gln His Ile Ser Ala Ala Thr Ile Ser Glu Leu

355 360 365

Ala Glu Lys Cys Ala Glu Phe Asp Leu Glu Asp Lys Lys Arg Phe Glu

370 375 380

Gln Thr Ile His Asp Tyr Asn Lys Ala Val Tyr Glu Arg Gln Arg Arg

385 390 395 400

His Pro Gly Gly Lys Trp Asp Pro Ala Val Lys Asp Gly Leu Thr Thr

405 410 415

Gln Ser Glu Gly Leu Glu Leu Ala Val Pro Lys Ser Asn Trp Ala Leu

420 425 430

Pro Ile Asp Gln Gly Pro Phe Leu Ala Val Arg Val Thr Ala Gly Ile

435 440 445

Thr Phe Thr Phe Gly Gly Leu Ala Val Arg Pro Glu Thr Ala Ala Val

450 455 460

Val Ser Ser Thr Thr Asn Gln Glu Val Pro Gly Leu Tyr Cys Ala Gly

465 470 475 480

Glu Met Leu Gly Gly Leu Phe Tyr Asp Asn Tyr Pro Gly Gly Ser Gly

485 490 495

Leu Thr Ser Gly Ala Val Phe Gly Arg Arg Ala Gly Arg Ala Ala Ala

500 505 510

Ala Arg Val Ser Ser Arg Gln Ala Arg Leu

515 520

<210> 7

<211> 881

<212> DNA

<213> frdB基因下游序列(Unknown)

<400> 7

gaccacactg ggacgtggcg ctggtacgcg gcacgcccta taactctggg gatggattcg 60

agatggcgat ccgggatgtc tcagccaagc aggcgggcaa ctggtcagga tgtcactgcg 120

tggcgtggga tgctaacgca ccggccgata cgggcgaccg ggagatctcc aacgagttca 180

ccaagtccgg gtatccgttg ggcatcatga tcaatcggca gggaaaccgg ttcgtggacg 240

aggggtcgga tctgcgcaac tatacgtatg cgatgatcgg acgccagatt ctcaaccagc 300

ccggccacat ggcgttccag atctgggact ccaagatgat cccttggttg cggtcggagg 360

agtaccggcc ggaggtagtg cagcatatca gcgcggccac gatcagtgag ctggcggaga 420

agtgtgccga gtttgatctc gaggataaga agcgctttga gcagaccatc catgactata 480

ataaggcggt ttatgagcgc cagcgcaggc atccgggtgg gaagtgggat ccggctgtca 540

aagatggact taccacgcag tcggagggct tggagctggc agttcccaag tcgaactggg 600

cgcttcctat tgatcaagga ccgttcctgg ctgtccgggt cacggcgggc atcactttta 660

cgtttggtgg actggcggtt cgtccggaga cggcggcggt ggtgtcgtcg acaacaaacc 720

aagaggtgcc ggggttgtac tgcgcagggg agatgctggg aggactgttt tatgacaact 780

atcctggagg cagtggattg acgtcggggg ctgtctttgg acgacgagct ggtcgggctg 840

cggcggcgag ggtgtcgagc cggcaggcac ggttgtagtc t 881

<210> 8

<211> 1463

<212> DNA

<213> frdB基因上游序列(Unknown)

<400> 8

gtgcaccttt caccgtcctg ccggccctga tgaacgaata ccgtgtgccc gaactgaacg 60

tccagaacgg tgtgctcaag gccatgtcct tcttgttcga gtacattggc gagatggcca 120

aggattacgt ctacgcagtc acgcctcttc tggaggatgc tctcatcgat cgcgaccagg 180

tgcaccggca gaccgcagcc agcgttgtca agcacatcgc gctgggcgtg gttggtttgg 240

gatgtgaaga cgcaatggtg catctgctta acctggtgtt ccccaacatc ttcgagacca 300

gcccccacgt catcgaccgt gtcattgaag ccattgatgc gatccggatg gcagtcggca 360

ccggtgtggt catgaactac gtgtgggcag gcttgttcca cccggcgcgc aaggtgcgca 420

cgccgtattg gcgactgtac aacgatgcgt acgtgcagag tgcggacgcg atgattccct 480

actaccccgg cctggaagac gatggtctgg accggactga gttgtctatc atagtttgaa 540

caaaagccag ccagcgcgtg tcatttatca tcatcttctt ctctgtctct gtaccctctt 600

ctgccgtgtg tttttctatc ttctcaacat attggggctt gttcaattac ggtgtttctc 660

tggcgggatt tggcgtgtct gaaccatctt tatctaagat atagtagtct atggcaatat 720

ccaacatttc aacgttcaat ataattctat cccatttact ttccgttcgg cacttctgta 780

agtcaaacta gtactcaact gattgatcga agcgatcgat ctttccattc ccgatcgacc 840

ctcgactatt ctctcccccg caatttgcag cgtggggagc acccgcactc acactccgcg 900

catcatgcca tgcatgcgtt cgtttgcgag atccgagtca ccctcgatcg ctctagcaga 960

gctatccact tttctcccta acattcctgt cctacttccg atgacatcaa gcagcgctgc 1020

ccagaccgac cggaaagact ctctccgcct ccctccgtgg caccgacgga gcataactct 1080

ccgtttccca accccattcc cccatcctcg gcaccatccc cgccgtccgt cgctacatac 1140

aaagccgcag gcaacttgag cacagatccc agagcactat gtatctactt gatgcgatga 1200

tcatcagtct ccttccctta gcagactaaa tgcactaatg ctcttttctc tttgacgcat 1260

acacgcacgc acgcacgcac aggcacaccc acccacacac acagacacat cactctagca 1320

tcatggctct tccctcagaa tgcgacgtgc tcgtcattgg cggcgggaat gccggcttct 1380

gcgcagccat ttcggcagtc cagtccggcg caaaacacgt tgctatcatc gataaatgtc 1440

cggaggaatg ggcaggaggt aac 1463

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> frdA-F-F(Unknown)

<400> 9

cccagaattc aattcgagct ccaggtgacg tgggaaggat c 41

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> frdA-F-R(Unknown)

<400> 10

attatacgaa gttatggatc cgagggaagg gagacaagga tg 42

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> frdA-R-F(Unknown)

<400> 11

gctatacgaa gttattctag agcctagagc tgtaaaaacc ccg 43

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> frdA-R-R(Unknown)

<400> 12

tgcctgcagg ggcccactag tacttctgcc tctccctcga c 41

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> frdB-F-F(Unknown)

<400> 13

gctccgtaac acccagaatt cgtgcacctt tcaccgtcct g 41

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> frdB-F-R(Unknown)

<400> 14

cgaagttatg gatccgagct cgttacctcc tgcccattcc tcc 43

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> frdB-R-F(Unknown)

<400> 15

gctatacgaa gttattctag agaccacact gggacgtgg 39

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> frdB-R-R(Unknown)

<400> 16

tgcctgcagg ggcccactag tagactacaa ccgtgcctgc 40

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> P1(Unknown)

<400> 17

cacggcatgc taattggtg 19

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> P2(Unknown)

<400> 18

gatcaactca cgtccaccg 19

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> P3(Unknown)

<400> 19

gcgatgccac agaaggtatg 20

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> P4(Unknown)

<400> 20

tcgggccttg caaagaatg 19

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> P5(Unknown)

<400> 21

ccaggatgtg ttggcgacg 19

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> P6(Unknown)

<400> 22

tggacggtgc gcattgcc 18

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> P7(Unknown)

<400> 23

gaacccgcgc atgcgcgc 18

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> P8(Unknown)

<400> 24

gacatagtat attattcctg c 21

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> P641(Unknown)

<400> 25

caatatcagt taacgtcgac 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> P642(Unknown)

<400> 26

ggaaccagtt aacgtcgaat 20

Claims

1.一株降低L-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的黑曲霉（Aspergillus niger）工程菌株，其特征在于：所述黑曲霉工程菌株为同时敲除了富马酸还原酶frdA和富马酸还原酶黄素蛋白亚基frdB的黑曲霉工程菌株；

（1）敲除富马酸还原酶基因frdA黑曲霉工程菌株的构建

构建基因frdA敲除载体：

frdA基因敲除菌株的获得：

构建基因frdB敲除载体：

frdA基因和frdB基因双敲除菌株的获得：

2.根据权利要求1所述的降低L-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的黑曲霉工程菌株，其特征在于：所述富马酸还原酶基因frdA编码的氨基酸序列为SEQ NO.2，所述富马酸还原酶黄素蛋白亚基基因frdB的基因序列为SEQ NO.5，其编码的氨基酸序列为SEQ NO.6。

3.根据权利要求1或2所述的降低L-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的黑曲霉工程菌株，其特征在于：所述富马酸还原酶基因frdA的基因序列为NCBI-locus_tag ANI_1_944144，所述富马酸还原酶黄素蛋白亚基基因frdB的基因序列为NCBI-locus_tag ANI_1_2554024。

4.利用如权利要求1至3任一项所述的黑曲霉工程菌株发酵L-苹果酸的方法，其特征在于：步骤如下：

5.根据权利要求4所述的发酵L-苹果酸的方法，其特征在于：所述发酵培养基的成分及配制方法为：

所述苹果酸发酵培养基的成分及配制方法为：葡萄糖 100g/L，细菌蛋白胨 6 g/L，无水磷酸二氢钾 0.15 g/L，无水磷酸氢二钾 0.15 g/L，二水氯化钙 0.1 g/L，七水硫酸镁0.1 g/L，氯化钠 0.005 g/L，七水硫酸亚铁 0.005 g/L，无水柠檬酸 0.001 g/L，溶剂为水，115℃高压灭菌20 min。

6.根据权利要求4或5所述的发酵L-苹果酸的方法，其特征在于：所述方法得到的L-苹果酸产量为65.59 ~ 69.15 g/L，相比出发菌株提高了7.92%，琥珀酸含量为0.91 ~ 1.05g/L，相比于出发菌株降低了88.73%。

7.如权利要求1至3任一项所述的黑曲霉基因工程菌株在L-苹果酸生产方面中的应用。