CN109576287B - CrpM基因在提高葡糖杆菌属菌株的DHA胁迫耐受性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Crp^M基因在提高葡糖杆菌属菌株的DHA胁迫耐受性中的应用，Crp^M基因为G.frateurii HD924环腺苷酸受体蛋白编码基因Crp突变体，该基因第211个碱基C突变为G，相应编码的第71个氨基酸Leu突变为Asp；第242个碱基A突变为C，相应编码的第81个氨基酸Leu突变为Asp，Crp^M基因的序列如SEQ ID NO：02所示；通过Crp^M基因对葡糖杆菌属菌种进行改造，可显著提升了DHA生产菌种对产物的耐受性，能够有效的提升甘油转化效率、增强DHA的生产强度、简化生产工艺、减少设备的投入、降低生产成本。

Description

CrpM基因在提高葡糖杆菌属菌株的DHA胁迫耐受性中的应用

技术领域

本发明涉及生物工程和基因工程技术领域，具体涉及Crp^M基因及Crp^M操纵子在提高葡糖 杆菌属菌株的DHA胁迫耐受性中的应用。

背景技术

1,3-二羟基丙酮(1,3-Dihydroxyacetone，DHA)是最简单的酮糖，外观是白色粉末状结 晶，有甜味，易溶于水、乙醇、丙酮和乙醚等溶剂，是一种重要的精细化工产品，可作为农 药合成中间体、精细化工原料和医药前体，用途广泛且使用量大。二羟基丙酮的工业化生产 主要是利用能够合成高活性甘油脱氢酶的微生物以甘油为底物发酵生产。目前报道最多的微 生物为葡糖杆菌属(Gluconobacter)，如Gluconobacter oxydans、Gluconobacter frateurii、 Gluconobacter melanogenus等菌种，葡糖杆菌属生产性能稳定，甘油生成DHA的转化率高， DHA产量可以达到150g/L以上，是工业发酵上常用的菌株。

在DHA发酵过程中，当产物DHA的积累到一定量时会抑制葡糖杆菌属菌株的生长，造成 菌体生长停止。DHA产物的抑制作用属于反馈抑制，据报道，基于DHA反馈抑制动力学和死 亡率动力学模型分析，当DHA浓度达到61g/L时菌体停止生长，当DHA浓度达到108g/L时甘油停止转化。当DHA浓度过高时葡糖杆菌属菌株细胞受到不可逆的损伤，DHA对磷酸戊糖循环也有抑制作用。产物的抑制作用限制了高生产强度发酵生产DHA，研究发现，解决底物和产物的抑制作用一般是优化发酵工艺，如通过复杂的半连续两阶段反复补料发酵、固定 化细胞、静息细胞转化来消除产物的抑制效果。上述工艺虽然能在一定程度上消除产物的抑 制效果，但是会增加设备投入，造成生产工艺冗长，增加发酵成本。

通过对菌种的理性设计改造，提升DHA生产菌种对产物的耐受性，是解决DHA产物抑制 效果的有效策略之一。由于DHA对葡糖杆菌属菌株的生长抑制机制复杂，目前尚未有解析该 机制的报道。因此，通过理性改造葡糖杆菌属菌株提高其对DHA的耐受性存在技术障碍。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中由于DHA对葡糖杆菌属菌株的生长抑制机制 复杂，尚缺少提升DHA生产菌种对产物的耐受性的有效策略的缺陷，通过在葡糖杆菌属如： Gluconobacter oxydans、Gluconobacter frateurii、Gluconobactermelanogenus等菌株 中过量表达Crp突变体，能够显著提高葡糖杆菌属对1,3-二羟基丙酮的耐受性，显著增强 1,3-二羟基丙酮的产量及生产强度。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

申请人发现G.frateurii HD924环腺苷酸受体蛋白(cyclic amp receptorprotein) 编码基因Crp的第211个碱基C突变为G，相应编码的第71个氨基酸Leu突变为Asp；第242 个碱基A突变为C，相应编码的第81个氨基酸Leu突变为Asp后获得的突变体Crp^M基因能够 显著提高葡糖杆菌属对1,3-二羟基丙酮的耐受性，显著增强1,3-二羟基丙酮的产量及生产 强度。

Crp的基因如SEQ ID NO：01所示，Crp^M基因的序列如SEQ ID NO：02所示。

Crp^M操纵子，该载体包含有Crp^M基因。优选的，Crp^M操纵子，其序列如SEQ ID NO：03所示。基于SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列设计CrpF、CrpR引物，通过PCR扩增得到包含Crp^M启动子、CDS序列、终止子的核苷酸序列。

所述的CrpF、CrpR引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示，CrpF为 上游引物，在引物上引入EcoRI酶切位点；CrpF为下游引物，在引物上引入HindIII酶切位 点。

本发明所达到的有益效果是：通过Crp^M基因对葡糖杆菌属菌种进行改造，可显著提升了 DHA生产菌种对产物的耐受性，能够有效的提升甘油转化效率、增强DHA的生产强度、简化 生产工艺、减少设备的投入、降低生产成本。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一 起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是pKK-Crp^M重组质粒物理图谱。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅 用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

本实施例中用到的G.frateurii HD924为本实验自主筛选菌株，即专利号201110388519.8的发明专利中提到的HD924，该菌株在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.5397，保藏日期2011年10月 28日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

G.oxydans CGMCC 1.46购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，G. melanogenusIFO 3293购自美国模式菌种收集中心。

HPLC法测定DHA，测定方法：取发酵液1mL，12000r/min离心10min，取上清液0.5 mL用蒸馏水稀释到测定线性范围(0～10g/L)，膜滤，然后进HPLC测定。外标法计算发酵液 中DHA含量。色谱分离条件为:Aminex HPX-87H色谱柱(300mm×7.8mm，9μm)，UV检 测器检测波长为260nm，流动相：8mmol/L硫酸。柱温为50℃，流速为0.5mL/min，进样 量30μL。

甘油检测方法：采用HPLC法测定甘油含量。测定条件同DHA，检测器为RI检测器。

菌体量测定方法：采用比浊法，菌液用2％稀盐酸稀释10倍后在560nm处测定吸光值。

所用的培养基：FMD培养基(g/L)：甘油80，酵母浸粉15，KH₂PO₄ 5，pH 6.0，1×10⁵Pa条件下灭菌15min)。一级种子培养基(g/L)：甘油50，酵母浸粉15，KH₂PO₄ 3，琼脂粉20， pH6.0；二级种子培养基(g/L)：甘油30，酵母浸粉10，KH₂PO₄ 3，琼脂粉20，pH 6.0；摇 瓶发酵培养基(g/L)：甘油160，酵母浸粉15，CaCO₃ 15，pH 6.0；培养基中根据需要添加氨 苄青霉素(100μg/mL)。

限制性内切酶EcoR I、Hind III、T4连接酶均购自赛默飞公司；DNA聚合酶，细菌基因 组提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购自宝赛生物(杭州)公司。

本发明将G.frateurii HD924菌种接种到一级种子培养基，28℃、200r/min培养至对 数期(OD₅₆₀＝1.5)，取1mL种子培养液4000r/min离心5分钟，倒掉上清培养基，用无菌生理盐水对收集到的菌体重悬、4000r/min离心5分钟清洗三次，加入1mL 10％甘油重悬。 取15μL上述处理好的菌悬液，涂布已经灭菌的载片上，采用常压室温等离子体(ARTP)诱 变仪进行诱变处理。ARTP诱变仪器功率设置为100W，使载片与射流出口的距离设置为4mm， 气体流量为10L/min，照射时间分别为90s。将上述经过ARTP照射过的带有菌体的载片迅 速放入装有1mL的生理盐水中，涡旋振荡1min，取已经振荡的菌液稀释涂平板，放入28℃ 恒温培养箱中培养2d。固体平板培养基成分(g/L)：甘油50，DHA 150，酵母浸粉15，KH₂PO₄ 3，琼脂粉20，pH 6.0。从平板上挑取能够生长的菌落，测试其DHA的耐受性，选取经过150 g/L DHA胁迫后，生长不受影响，考察DHA的发酵能力。获得一株DHA发酵性能提高的菌株， 命名该菌株为G.frateurii HD-08。。通过对该菌株进行全基因组测序，测序工作由华大基 因完成。通过Blast比对分析，与G.frateurii HD924相比，G.frateurii HD-08的Crp 基因发生突变，第211个碱基C突变为G，相应编码的第71个氨基酸Leu突变为Asp；第242 个碱基A突变为C，相应编码的第81个氨基酸Leu突变为Asp；突变基因命名为Crp^M。

使用细菌基因组提取试剂盒分别提取G.frateurii HD924和G.frateurii HD-08的 基因组，以此为模板，利用引物CrpF、CrpR通过PCR分别扩增Crp和Crp^M操纵子。用EcoRI和HindIII酶切后与EcoRI和HindIII酶切的pKK223-3通过T4连接酶连接，构建重组质粒pKK-Crp和pKK-Crp^M测序验证正确后，提质粒，分别电击转入G.oxydans CGMCC 1.46、G.frateurii HD924和G.melanogenus IFO 3293。得到重组菌G.oxydans CGMCC 1.46(pKK-Crp)、G.oxydans CGMCC 1.46(pKK-Crp^M)、G.frateurii HD9246(pKK-Crp)、G.frateuriiHD924(pKK-Crp^M)、和G.melanogenus(pKK-Crp)、G.melanogenus IFO 3293(pKK-Crp^M)。

分别用不同浓度的DHA溶液处理野生菌和重组菌。菌株在处理8h后，按10％接种量到 FMD培养基，以野生菌和过量表达过量表达Crp重组菌为对照，分别测8h、16h生物量， 考察过量表达Crp^M对DHA耐受性的影响，结果如表1。表1结果说明，野生葡糖杆菌或过量 表达Crp基因的葡糖杆菌重组菌在80g/L DHA的胁迫下，生长均受到抑制；120、150g/L DHA 胁迫处理后，野生葡糖杆菌或过量表达Crp基因的葡糖杆菌重组菌生长均受到不可逆的抑制，在FMD培养基上不能恢复生长。相对的，过量表达Crp^M重组菌G.oxydans CGMCC 1.46(pKK-Crp^M)、G.frateurii HD924(pKK-Crp^M)和G.melanogenus IFO 3293(pKK-Crp^M)在120和150g/L DHA胁迫处理后，仍能恢复生长。结果说明，在葡糖杆菌属中过量表达Crp^M基因， 能够显著提升对DHA的耐受性。

表1 DHA耐受性测试

将实验菌株G.oxydans CGMCC 1.46和G.oxydans CGMCC 1.46(pKK-Crp^M)、G.frateurii HD924和G.frateurii HD924(pKK-Crp^M)、G.melanogenus IFO 3293和G.melanogenus IFO 3293(pKK-Crp^M)、分别经过一、二级种子培养后，按5％的接种量转接到5L发酵罐， 发酵48h，高效液相色谱法测甘油消耗量和DHA的生成量。

甘油初始浓度为160g/L，发酵结束时：与G.oxydans CGMCC 1.46相比过量表达Crp^M重组菌G.oxydans CGMCC 1.46(pKK-Crp^M)DHA产量和生产强度分别提高到96.7g/L和2.01g/L/h，提高了27.9％。与G.frateurii HD924相比过量表达Crp^M重组菌G.frateuriiHD924(pKK-Crp^M)DHA产量和生产强度分别提高到148.8g/L和3.1g/L/h，提高了22.1％。 与G.melanogenus IFO 3293相比过量表达Crp^M重组菌G.melanogenus IFO 3293(pKK-Crp^M)DHA产量和生产强度分别提高到120.6g/L和2.51g/L/h，提高了33.4％。

表2实验菌株5L发酵罐DHA生产性能

转化率：DHA产量/甘油消耗量×100％

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管 参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前 述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发 明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围 之内。

序列表

<110> 河南大学

<120> CrpM基因在提高葡糖杆菌属菌株的DHA胁迫耐受性中的应用

<130> W201810032

<141> 2018-11-14

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtcagcgt cacatagtcc ggaggatgtc catgatcgat gcgcccattg cgtgggccgt 60

cgtctgagta tctgcaacag cattgacgac tgcgatctgg ccgttcttgc caacgagtct 120

tcccgcatga cagtcgctga cggccggtcc tttatagaag agggtgcgcc ggcccacgat 180

ttctttgtgg tgacgggtgg aagggtcaag ctcttcaccc tgcttccgga tggccggcgc 240

cagattaccg gctttgcgga aggcggagac ttccttgggc ttgcggcctc caccagttat 300

gcttttggcg ccgaagccct gggcagcgct acgctgtgcc gctttcccca tgccggtatg 360

cagcgcctga ccgaacgctt ccccagcctt gaacaccgtc tgcgcgagga ggcctcccgc 420

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tag 723

<210> 2

<211> 723

<212> DNA

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tag 723

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<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcgtcaagct tctggccgtt ctgctggcag t 31

Claims (2)

1.Crp^M基因在提高葡糖杆菌属菌株的DHA胁迫耐受性中的应用，其特征在于，所述的Crp^M基因的序列如SEQ ID NO：02所示。

2.一种Crp^M操纵子，其特征在于，其序列如SEQ ID NO：03所示。