KR20210005632A - 재조합 미생물, 그 제조방법 및 보효소 q10의 생산에 있어서 그의 사용 - Google Patents

재조합 미생물, 그 제조방법 및 보효소 q10의 생산에 있어서 그의 사용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재조합 미생물, 그 제조방법 및 보효소 Q10의 생산에 있어서의 그의 사용에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자를 외인적으로 도입하여 재조합 미생물을 구축하는 방법을 제공한다. 이 재조합 미생물은 발효법을 통한 보효소 Q10의 생산, 특히 산화형 보효소 Q10 생산에 적합하다. 본 발명의 재조합 미생물은 스트레스 저항성을 가지며 높은 삼투압 및 높은 산화환원전위를 포함하는 가혹한 환경에 대한 내성이 뛰어나기 때문에 보효소 Q10, 특히 산화형 보효소 Q10의 수율을 대폭으로 늘릴 수 있다.

Description

재조합 미생물, 그 제조방법 및 보효소 Q10의 생산에 있어서 그의 사용
본 발명은 바이오테크놀러지 분야에 속하고, 구체적으로는 재조합 미생물 및 보효소 Q10의 생산에 있어서 그의 사용에 관한 것이다.
보효소 Q10(CoQ10)은 유비퀴논 또는 데센퀴논이라고도 불리며 화학명은 2,3-디메톡시-5-메틸-6-데카프레닐벤조퀴논이다. 보효소 Q10의 생물학적 활성은 그것의 퀴논 고리의 산화 환원 특성 및 그것의 측쇄의 물리화학적 특성으로부터 유래한다. 보효소 Q10은 세포 자체가 생산하는 천연 항산화제 및 세포대사 활성화제로, 항산화, 프리라디칼 제거, 신체 면역력 향상, 노화 방지 등의 기능을 가진다. 보효소 Q10은 심장병, 암, 당뇨병, 급성 및 만성 간염, 파킨슨병 등 다양한 질환의 치료에 널리 사용되고 있고 식품, 화장품 및 노화 방지 제품에도 많이 사용되고 있다.
현재 미생물 발효법은 보효소 Q10의 주요 생산방법이다. 미생물 발효법을통한 보효소 Q10 생산은 제품 품질 및 안전성 면에서 경쟁상 커다란 장점이 있고, 대규모 공업 생산에 적합하다. 한편, 특히 공업적인 발효 환경에서는 미생물의 성장이나 증식시에 여러 가혹한 환경으로 인해 외부에서 오는 스트레스가 종종 있다. 예를 들면 발효 환경의 삼투압, pH, 용존 산소, 영양 물질 등과 같은 조건의 변동이 있다. 미생물의 성장은 상기 변동에 영향을 받고 통제가 쉽지 않은 특성이 있으며, 코엔자임 Q10의 생산도 불안정하다. 한편, 발효 환경의 제한 때문에, 공업 생산시에 바이오매스를 더 증가시키는 것은 쉽지 않다. 따라서 보효소 Q10의 수율을 더욱 향상시키기 위해, 가혹한 환경에 대한 보효소 Q10 생산균의 내성을 개선할 필요가 있다.
개시된 보효소 Q10 발효에 관한 기술 연구는 주로 유전자 공학기술을 통한 보효소 Q10 생산 레벨 개선, 또는 균의 돌연변이 유발 처리나 단일 인자 최적화 조정 실험을 통한 산물 합성에 대한 영향을 고찰하는 데 초점을 맞추고 있다. 또한 발효 과정의 주요 파라미터를 온라인 제어함으로써 발효 과정을 최적화하는 것을 보고한 특허문헌도 있다. 이러한 연구 및 기술들은 어느 정도 효과는 있지만, 생산성을 높이기 위한, 가혹한 환경에 대한 보효소 Q10 생산균의 내성 개선은 근본적으로 해결하지 못했다.
예를 들면 특허문헌 1은 산소 소비 속도(용존 산소)와 전기 전도율(영양소 보급 속도)을 조정함으로써 보효소 Q10의 발효 프로세스를 제어하는 방법을 제안하였다. 특허문헌 2는 발효중인 균체의 형상에 따라 기술적 파라미터를 조정한다. 특허문헌 3은 로도박터 스페어로이디스를 개변함으로써 미생물의 보효소 Q10 합성능력을 향상시킨다. 이러한 기술들은 생산된 보효소 Q10이 산화형 보효소 Q10과 환원형 보효소 Q10의 혼합물이면서 환원형 보효소 Q10의 비율이 비교적 높다는 점에서 공통점이 있다. 특히 특허문헌 4에 기재된 기술은 발효 종료 후 미생물이 생산한 보효소 Q10에서 환원형 보효소 Q10 함유량이 70% 이상이었다.
특허문헌 5에는 산화형 보효소 Q10의 발효 생산방법이 개시되어 있다. 이 특허의 기술은 보효소 Q10의 합성 및 축적 단계 후기에 산화환원전위 ORP를 조절함으로써 균주가 산화형 보효소 Q10 함유량이 96% 이상인 고함량의 산화형 보효소 Q10을 생산할 수 있도록 한다. 그러나, 이 방법은 높은 산화환원전위로 인한 생산 균주에 대한 산화 스트레스에 기인한 균체 내 대사산물 축적, 균체 성장 억제 등과같은 문제점들을 해결하지 못했다.
특허문헌 1: CN105420417A 특허문헌 2: CN104561154A 특허문헌 3: CN103509729B 특허문헌 4: US7910340B2 특허문헌 5: CN108048496A
전술한 보효소 Q10의 발효 프로세스, 특히 산화형 보효소 Q10의 발효 프로세스에 관한 문제를 해결하고 가혹한 환경에 대한 보효소 Q10 생산균의 내성을 개선하기 위해, 본 발명은 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자를 외인(外因)적으로 도입함으로써 가혹한 환경에 대한 보효소 Q10 생산균의 내성을 개선한 재조합 미생물로서, 발효법을 통한 보효소 Q10의 생산, 특히 산화형 보효소 Q10의 생산에 적합한 재조합 미생물을 구축한다.
상기 재조합 미생물은 스트레스에 강하고 높은 삼투압 및 높은 산화환원전위를 포함한 가혹한 환경에 대한 내성이 우수하다. SEQ ID NO:1로 표시되는 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자 과발현을 통해 보효소 Q10의 발효 프로세스에서 미생물의 상기 특성을 효과적으로 개선할 수 있다.
글로벌 조절 단백질 irrE는 생물체 내의 이러한 중요한 유전자를 활성화하는 스위치로서, DNA 손상 복구와 방사선 스트레스로부터 보호하기 위한 경로에서 중심적인 조절 작용을 한다. 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자를 외인적으로 도입함으로써 삼투압, 산화, 방사선 및 열 등 다양한 스트레스에 대한 미생물의 내성을 개선할 수 있고 균의 대수 증식기를 연장하고 바이오매스 축적을 더욱 촉진함과 아울러 발효 프로세스에서 균의 활발한 성장 및 대사 활성을 유지함으로써 보효소 Q10의 수율을 높이고, 특히 산화형 보효소 Q10의 수율을 높일 수 있다.
바람직하게는 본 발명은 프로모터 교체를 통해 재조합 벡터상의 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자의 발현을 제어하는 프로모터를 녹아웃한 뒤 다른 별도의 프로모터를 삽입하여 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자 발현을 더욱 조절할 수 있다.
삽입되는 프로모터는 SEQ ID NO:2로 표시되는 삼투조절 프로모터 proPB인 것이 바람직하다. 이 프로모터는 초기 발현 강도는 낮지만, 삼투압 상승에 따라 발현 강도가 강해진다. 이로 인해 글로벌 조절 단백질 irrE의 발현량은 삼투압 상승에 따라 증가하고 다양한 강도의 스트레스에 대한 미생물의 내성은 높아진다.
본 발명은
a. 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자를 포함하는 모균주로부터 상기 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자를 클로닝하는 단계;
b. 상기 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자를 벡터에 연결하고, 상기 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 구축하는 단계; 및
c. 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입함으로써 재조합 미생물을 얻는 단계;를 포함하는 재조합 미생물의 제조방법을 제공한다.
전술한 본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 b는 프로모터 교체를 통해 재조합 벡터상의 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자 발현을 제어하는 프로모터를 녹아웃한 뒤 다른 별도의 프로모터를 삽입하여 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자의 발현을 더욱 조절하는 것을 포함한다.
전술한 본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 b에서 삽입되는 프로모터는 유도성 프로모터, 바람직하게는 삼투조절 프로모터 proPB이다. 상기 삼투조절 프로모터 proPB는 SEQ ID NO:2의 적어도 70개의 연속 뉴클레오티드, 바람직하게는 SEQ ID NO:2의 적어도 100개의 연속 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO:2의 적어도 150개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 부분적인 뉴클레오티드 서열, 및 가장 바람직하게는 SEQ ID NO:2의 완전한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자 또는 폴리뉴클레오티드 서열에서 얻어진 것이다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2와 적어도 60% 상동성, 바람직하게는 적어도 80% 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 90% 상동성을 가진다. 바람직하게는 상기 삼투조절 프로모터 proPB는 SEQ ID NO:2로 표시되는 뉴클레오티드 서열이다. 상기 삼투조절 프로모터 proPB는 세균, 바람직하게는 에쉐리키아(Escherichia)속, 보다 바람직하게는 대장균(Escherichia coli)에서 분리된 것이다.
전술한 본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 b의 벡터는 pBR322 및 그 유도체, pACYC177, pACYC184 및 그 유도체, RK2, pBBR1MCS-2, 코스미드 벡터 및 그 유도체에서 선택된 것이고, 바람직하게는 pBBR1MCS-2이다.
전술한 본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 a는 SEQ ID NO:1로 표시되는 DNA 서열에 기초해서 프라이머를 설계하고, 상기 모균주에서 추출한 게놈 DNA를 템플레이트(template)로 해서 PCR법으로 상기 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자를 합성하는 것을 포함한다.
전술한 본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 a에서 상기 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자는 SEQ ID NO:1의 적어도 100개의 연속 뉴클레오티드, 바람직하게는 SEQ ID NO:1의 적어도 300개의 연속 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO:1의 적어도 600개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 부분적인 뉴클레오티드 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO:1의 완전한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자 또는 폴리뉴클레오티드 서열에서 얻어진 것이다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1과 적어도 60% 상동성, 바람직하게는 적어도 80% 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 90% 상동성을 가진다. 바람직하게는 상기 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자는 SEQ ID NO:1로 표시되는 뉴클레오티드 서열이다. 상기 모균주는 세균이고, 바람직하게는 데이노코쿠스(Deinococcus)속이고, 보다 바람직하게는 데이노코쿠스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans), 데이노코쿠스 데제르티(Deinococcus deserti), 데이노코쿠스 고비엔시스(Deinococcus gobiensis), 데이노코쿠스 프로테오리티쿠스(Deinococcus proteolyticus)로 이루어진 군에서 선택된 것이고, 가장 바람직하게는 데이노코쿠스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)이다.
전술한 본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 c의 도입방법은 형질 전환, 형질 도입, 접합 전달 및 전기 천공에서 선택된 것이다. 상기 숙주 세포는 세균 또는 진균에서 선택된 것이고, 바람직하게는 로도박터속 세균이며, 보다 바람직하게는 로도박터 스페어로이디스이다. 바람직하게는 상기 단계 c는 단계 b에서 얻어진 재조합 벡터를 대장균 S17-1 컴피턴트 셀로 형질 전환한 후 접합 전달을 통해 숙주 세포에 도입함으로써 유전적으로 안정된 재조합 미생물을 얻는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 상기 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자; 및 삼투조절 프로모터 proPB;를 적어도 포함하는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 방법을 통해 재조합 미생물을 제조하고, 상기 재조합 미생물을 이용해서 보효소 Q10을 생산하는 것을 포함하는 보효소 Q10의 생산방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 방법을 통해 재조합 미생물을 제조하고, 상기 재조합 미생물을 이용해서 산화형 보효소 Q10을 생산하는 것을 포함하는 산화형 보효소 Q10의 생산방법을 제공한다.
본 발명자들은 예의 검토한 결과, 뜻밖에도 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자의 도입 및 프로모터 교체를 통해 구축된 재조합 미생물, 특히 재조합 로도박터 스페어로이디스(Rhodobacter sphaeroides)는 스트레스에 강하고 높은 삼투압 및 높은 산화환원전위를 포함한 가혹한 환경에 대한 내성이 뛰어나며 균의 대수 증식기를 연장하고 바이오매스의 축적을 더욱 촉진함과 동시에 발효 프로세스에서 균의 활발한 성장 및 대사 활성을 유지할 수 있음을 발견하였다.
또한 종래 산화형 보효소 Q10의 직접적인 생산 프로세스에 있어서, 발효 후기에는 세포 내에 산화형 보효소 Q10이 많이 축적되고 균체 자체가 받는 산화 스트레스가 강했다. 본원의 재조합 미생물은 산화 스트레스에 대한 균체의 내성을 개선하고 산화형 보효소 Q10의 역가를 현저하게 높일 수 있으며 보효소 Q10 총량 중 산화형 보효소 Q10의 비율을 향상하는 관점에서 바람직하다.
또한 본원은 상기 재조합 미생물 구축에 있어서, 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자 발현을 제어하는 프로모터를 프로모터 proPB로 교체한 후 삼투압 변화를 통해 글로벌 조절 단백질 irrE 발현을 조절할 수 있으므로 보효소 Q10 생산균의 스트레스 내성을 단계적으로 높여 발효 프로세스의 각 단계에서 가혹한 환경에 대한 균체의 내성에 대한 요구를 충족시킬 수 있으며, 나아가 보효소 Q10의 생산, 특히 산화형 보효소 Q10의 생산을 촉진할 수 있음을 발견하였다.
도 1은 오리지널 플라스미드 pBBR1MCS-2를 나타낸 것이다.
도 2는 재조합 플라스미드 pBBR1MCS-2-G-proPB-IrrE를 나타낸 것이다.
도 3은 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자를 포함하고, 삼투조절 프로모터 proPB 교체가 이루어지지 않은 재조합 미생물의 RSP-CE 전기 영동상이다.
도 4는 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자를 포함하면서, 삼투조절 프로모터 proPB 교체가 이루어진 재조합 미생물의 RSP-BE 전기 영동상이다.
1. 보효소 Q10을 생산하는 미생물
본 발명은 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자를 외인적으로 도입함으로써 가혹한 환경에 대한 보효소 Q10 생산균의 내성을 개선하고 발효법을 통한 보효소 Q10의 생산, 특히 산화형 보효소 Q10 생산에 적합한 재조합 미생물을 구축한다.
본 발명의 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자는 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자로부터 취득할 수 있고, SEQ ID NO:1의 적어도 100개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 부분적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게는 SEQ ID NO:1의 적어도 300개, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO:1의 적어도 600개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 부분적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. SEQ ID NO:1은 데이노코쿠스 라디오두란스에서 분리된 irrE의 완전한 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
상기 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자는 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 긴 폴리뉴클레오티드 서열에서 얻을 수 있다. 예를 들어, 이러한 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 세균에서 분리될 수 있다. 바람직하게는 데이노코쿠스(Deinococcus)속 세균에서 분리된 것이다. 상기 세균으로는 데이노코쿠스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans), 데이노코쿠스 데제르티(Deinococcus deserti), 데이노코쿠스 고비엔시스(Deinococcus gobiensis) 및 데이노코쿠스 프로테오리티쿠스(Deinococcus proteolyticus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이러한 폴리뉴클레오티드를 긴 폴리뉴클레오티드 서열에서 취득할 경우, 이러한 폴리뉴클레오티드 서열과 SEQ ID NO:1의 상동성을 확인하는 것이 가능하다. 이 경우, 바람직하게는 적어도 100개의 연속 뉴클레오티드를 갖는 영역을 선택하여 다른 폴리뉴클레오티드에서 유래한 관련 단편과 비교한다. 폴리뉴클레오티드 서열과 SEQ ID NO:1에서 얻어진 관련 단편이 예를 들어 동일 뉴클레오티드를 60개 가진다면(100개의 연속 뉴클레오티드를 비교한 결과), 상동성은 60%이다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열 중 일부는 SEQ ID NO:1과 적어도 80% 상동성을 가지며, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO:1과 적어도 90% 상동성을 가진다. 상동성을 확인하기 위해, 예를 들면 적어도 100개의 연속 뉴클레오티드 단편, 바람직하게는 적어도 300개의 연속 뉴클레오티드 단편, 보다 바람직하게는 적어도 500개의 연속 뉴클레오티드 단편을 이용한다.
폴리펩티드에서 일부 단편은 생물학적 기능상 필수이지만, 다른 영역에서는 아미노산의 삽입, 결실(delete) 또는 다른 아미노산에 의한 치환이 가능한 영역도 있고, 또한 교체되는 아미노산과 유사한 아미노산에 의한 치환이 바람직하다는 것은 당업자에게 알려져 있다.
또한 본 발명은 고함량 산화형 보효소 Q10 생산에 적합한 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 특허문헌 5는 발효액의 ORP를 제어함으로써 미생물이 생산하는 보효소 Q10에서 산화형 보효소 Q10 함유량을 높이는 발효방법을 개시하고 있다. 이 공개특허는 인용을 통해 본 명세서에 포함된다.
본 발명자들은 적절한 배양 조건에 있어서, 스트레스에 강한 미생물은 고함량 산화형 보효소 Q10의 직접 생산을 더욱 최적화하는 데에도 이용할 수 있음을 발견하였다.
여기서 "직접 생산", "직접 발효", "직접 전환" 등의 용어는 미생물이 화학적 전환 단계를 거치지 않고 하나 이상의 생물적 전환 단계를 통해 어느 기질을 특정 산물로 전환할 수 있음을 의미한다. 일례로, 추출된 환원형 보효소 Q10을 더욱 산화하여 산화형 보효소 Q10으로 하는 것을 들 수 있다.
2. 보효소 Q10을 생산하는 재조합 미생물의 제조방법
본 발명자들은 보효소 Q10을 생산하는 미생물을 유전자 공학을 통해 개변함으로써 보효소 Q10 생산을 최적화한다.
본 발명의 보효소 Q10을 생산하기 위한 재조합 미생물의 제조는
a. 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자를 포함하는 모균주로부터 상기 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자를 클로닝하는 단계;
b. 상기 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자를 벡터에 연결하여, 상기 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 구축하는 단계; 및
c. 벡터를 숙주 세포에 도입하는 데 적합한 방법, 예를 들면 형질 전환, 형질 도입, 접합 전달 및/또는 전기 천공을 통해 상기 숙주 세포가 본 발명의 재조합 미생물이 되도록 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 구축하는 단계;을 포함한다.
상기 단계 a에서는 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자를 포함하는 균주에서 상기 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자를 분리할 때, 다음과 같은 예시적인 방법을 채용할 수 있다.
(i) 당업계에 공지된 방법을 통해 본 명세서에 개시된 DNA 서열에 기초해서 설계한 프라이머를 이용해서 PCR로 목적 유전자를 취득한다.
(ii) 제한 효소를 이용해서 게놈을 여러 단편으로 분할한 뒤, 표지 핵산 프로브를 이용해서 목적 유전자를 골라낸다.
(iii) 당업계에 공지된 방법을 통해, 예를 들면 DNA 신시사이저(synthesizer)를 이용해서 목적 유전자를 합성한다.
원하는 유전자를 운반하는 클론이 얻어지면 당업계에 공지된 방법을 통해 표적 유전자의 뉴클레오티드 서열을 측정할 수 있다.
상기 단계 b에서 이중가닥 DNA의 클로닝에는 일련의 숙주/클로닝 벡터 조합을 사용해도 된다. E. coli 내에서 본 발명의 유전자(즉 irrE 유전자)를 발현하기 위한 바람직한 벡터는 E. coli에 일반적으로 적용되는 임의의 벡터에서 선택할 수 있으며, 예를 들면 pBR322 또는 그 유도체(예를 들면 pUC18과 pBluescriptII (Stratagene Cloining Systems, Calif., USA)), pACYC177, pACYC184 및 그 유도체, 그리고 예를 들면 RK2, pBBR1MCS-2와 같은 광범위한 숙주 플라스미드로부터 얻어진 벡터를 들 수 있다. 로도박터 스페어로이디스 내에서 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 발현하기 위한 바람직한 벡터는 로도박터 스페어로이디스 및 적합한 클론 생물(예를 들면 E.coli) 내에서 복제 가능한 임의의 벡터에서 선택된다. 바람직한 벡터는 광범위한 숙주 벡터이고, 예를 들면 코스미드 벡터(예를 들면 pVK100) 및 그 유도체, pBBR1MCS-2를 들 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들면 형질 전환, 형질 도입, 접합 전달 또는 전기 천공을 통해 숙주 세포 및 벡터의 성질을 고려한 뒤 이러한 벡터를 적합한 숙주에 옮길 수 있다.
당업계에 공지된 방법을 이용해서, 예를 들면 프로모터, 리보솜 결합부위 및 전사 터미네이터 등의 숙주 세포 내에서 조작 가능한 조절 서열을 포함하는 적절한 벡터에, 본 발명에 따른 irrE 유전자/뉴클레오티드 서열을 연결함으로써 재조합 벡터를 제조할 수 있다.
상기 단계 b에서 프로모터 교체를 통해 재조합 벡터상의 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자 발현을 제어하는 프로모터를 녹아웃한 뒤, 다른 별도의 프로모터를 삽입하여 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자 발현을 더욱 조절할 수 있다. 삽입되는 프로모터로는 구성형 프로모터 또는 유도성 프로모터를 사용할 수 있고, 예를 들면 유전자의 오리지널 프로모터, 항생제 내성 유전자의 프로모터, 삼투조절 프로모터, 온도 유도성 프로모터, E. coli의 β갈락토시다아제(lac), trp, tac, trc 프로모터 및 숙주 세포 내에서 기능할 수 있는 임의의 프로모터를 들 수 있다. 바람직하게는 상기 프로모터는 유도성 프로모터로, 특히 삼투조절 프로모터이고, 보다 바람직하게는 삼투조절 프로모터 proPB이다.
상기 삼투조절 프로모터 proPB는 삼투조절 프로모터 proPB의 폴리뉴클레오티드 분자로부터 취득할 수 있고, SEQ ID NO:2의 적어도 70개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 부분적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게는 SEQ ID NO:2의 적어도 100개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 부분적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO:2의 적어도 150개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 부분적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 가장 바람직하게는 SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. SEQ ID NO:2는 대장균에서 분리되는 프로모터 proPB의 완전한 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
상기 삼투조절 프로모터 proPB는 삼투조절 프로모터 proPB를 포함하는 긴 폴리뉴클레오티드 서열에서 취득해도 된다. 이러한 폴리뉴클레오티드로는 예를 들면 세균, 바람직하게는 에쉐리키아(Escherichia)속, 보다 바람직하게는 대장균(Escherichia coli)에서 분리되는 것을 들 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드를 긴 폴리뉴클레오티드 서열에서 취득할 경우, 이러한 폴리뉴클레오티드 서열과 SEQ ID NO:2의 상동성을 확인하는 것이 가능하다. 여기서 상동성의 정의는 전술한 SEQ ID NO:1의 상동성 정의와 동일하다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 SEQ ID NO:2와 적어도 80% 상동성을 가지며, 보다 바람직하게는 적어도 90% 상동성을 가진다. 상동성을 확인하기 위해, 예를 들면 적어도 100개의 연속 뉴클레오티드 단편, 바람직하게는 적어도 200개의 연속 뉴클레오티드 단편을 이용한다.
발현을 위해, 예를 들면 숙주 세포(본 발명의 재조합 세포를 제공하기 위해 코드 서열이 도입되는 것) 내에서 조작 가능한 Shine-Dalgarno(SD) 서열(예를 들면 AGGAGG 등 숙주 세포 내에서 조작 가능한 천연 서열이나 합성 서열을 포함함) 및 전사 터미네이터(임의의 천연 서열이나 합성 서열로 이루어진 역반복 구조) 등 다른 조절 요소는 상기 프로모터와 병용해도 된다.
상기 단계 c에서 재조합 벡터를 포함한 재조합 미생물을 구축하기 위해, 예를 들면 형질 전환, 형질 도입, 접합 전달, 전기 천공 등 다양한 유전자 도입방법을 사용할 수 있다. 재조합 세포를 구축하기 위한 방법은 분자 생물학 분야에서 공지된 방법 중에서 선택할 수 있다. 예를 들면 종래 형질 전환 시스템은 대장균에 사용할 수 있다. 형질 도입 시스템도 대장균에 사용할 수 있고 접합 전달 시스템은 그람 양성균 및 그람 음성균에 널리 사용할 수 있으며, 예를 들면 대장균 및 로도박터 스페어로이디스에 사용할 수 있다. CN103509816B에는 예를 들면 액체 배지중 또는 고체 배지의 표면상에서 접합이 발생할 수 있는 접합 전달법이 개시되어 있다. 접합 전달에 사용되는 리포터로서 선택 마커를 사용할 수 있고, 예컨대 일반적으로 카나마이신-저항성 마커를 사용할 수 있다. 또한, 천연 저항성 마커를 사용할 수 있으며, 예를 들면 로도박터 스페어로이디스에 날리딕스산 저항성 마커를 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 바람직하게는 적절한 숙주 세포 내에서 기능할 수 있는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명에서는 세균, 효모, 곰팡이 중 어느 하나를 포함하는 당업계에서 보효소 Q10 생산에 일반적으로 사용되는 미생물을 사용할 수 있으며, 상기 미생물에 대해 당업계에 공지된 유전자 공학 기술을 실시하여 본 발명의 상기 재조합 미생물을 얻을 수 있다. 상기 미생물로는 예를 들면 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 아그로모나스(Agromonas)속, 브레번디모나스(Brevundimonas)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 로도토룰라(Rhodotorula)속, 리조모나스(Rhizomonas)속, 로도비움(Rhodobium)속, 로도플래인(Rhodoplanes)속, 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas)속, 로도박터(Rhodobacter)속, 리조븀(Rhizobium)속 등의 미생물을 들 수 있고, 바람직한 종으로는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefacience), 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter), 아그로모나스 올리고트로피카(Agromonas oligotrophica), 브레번디모나스 디미누타(Brevundimonas diminuta), 슈도모나스 데니트리피칸스(Pseudomonas denitrificans), 로도토룰라 미누타(Rhodotorula minuta), 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 로도박터 캡슐레이터스(Rhodobacter capsulatus), 로도박터 스페어로이디스(Rhodobacter sphaeroides) 등을 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 로도박터 스페어로이디스(Rhodobacter sphaeroides)이다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 가진 숙주 세포에 관한 것이다. 유전자 공학을 통해 개변된 이러한 숙주 세포는 재조합 숙주 세포 또는 재조합 미생물로 불린다.
3. 미생물 발효를 통한 보효소 Q10의 생산
본 발명의 보효소 Q10을 생산하는 미생물 발효법은 상기 재조합 미생물을 이용해서 발효 생산을 수행하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 재조합 미생물은 삼투압, 산화, 방사선 및 열 등 다양한 스트레스에 대한 미생물의 내성을 높일 수 있기 때문에, 종래 보효소 Q10의 발효법에 비해 균의 대수 증식기를 연장하고 바이오매스의 축적을 더욱 촉진함과 동시에 균의 활발한 성장 및 대사를 유지할 수 있으며 보효소 Q10의 역가를 현저하게 향상시킨다. 본 발명의 방법에 있어서 재조합 미생물을 이용해서 보효소 Q10을 생산하는 발효 프로세스의 조건은 특허문헌 1을 참조해도 된다. 자세한 방법은 다음과 같다.
보효소 Q10을 생산하는 균주의 발효 프로세스에 있어서, 산소 소비 속도를 30 mmol/L·h 내지 150mmol/L·h 범위로 유지하면서 전기 전도도를 5.0 ms/cm 내지 30.0ms/cm 범위로 유지함으로써 균체 성장 및 보효소 Q10 합성 개시 및 축적을 촉진한다. 바람직하게는 보효소 Q10을 생산하는 균주의 발효 프로세스에 있어서, 산소 소비 속도를 30mmol/L·h 내지 90mmol/L·h로 한다. 바람직하게는 보효소 Q10을 생산하는 균주의 발효 프로세스에 있어서, 발효액의 전기 전도도를 10ms/츠 내지 20ms/cm로 한다.
본 발명의 보효소 Q10의 발효 생산방법에 있어서, 상기 산소 소비 속도는 교반 속도 및 공기 유량을 통해 조절하고, 상기 전기 전도도는 유가 보충(流加補充;flow feeding) 또는 회분 보충(回分補充;batch feeding)을 통해 조절한다. 여기서 유가 보충 또는 회분 보충시 사용하는 보충액 조성은 보충액 1리터당 효모 분말 8 내지 12g, (NH4)2SO4 5 내지 10g, MgSO4 1 내지 2g, NaCl 3 내지 6g, KH2PO4 2 내지 4g, K2HPO4 2 내지 4g, CaCl2 1 내지 2g, 비오틴 0.013 내지 0.025g으로 하고, pH는 7.0, 보충 배지의 전기 전도도는 13.5ms/cm 내지 23ms/cm로 한다.
본 발명의 보효소 Q10의 발효 생산방법에 있어서, 로도박터 스페어로이디스(Rhodobacter sphaeroides) RSP-BE뿐만 아니라 그 물리적 또는 화학적 돌연변이 유발방법을 통해 육종된 균주, 또는 유전자 공학방법을 통해 개변된 균주도 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 보효소 Q10의 역가는 적어도 1000mg/L이고, 바람직하게는 적어도 2000mg/L이고, 보다 바람직하게는 적어도 3000mg/L이다. 보효소 Q10의 역가란, 발효액 단위체적당 보효소 Q10 함유량을 가리킨다.
이상을 통해, 당업계의 보효소 Q10의 일반적인 발효방법을 이용할 경우에도 본 발명의 재조합 미생물은 보효소 Q10의 역가를 향상시키는 데에 커다란 이점이 있음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 미생물은 당업계의 보효소 Q10의 일반적인 발효 프로세스에 적합하다.
4. 미생물 발효에 의한 고함량 산화형 보효소 Q10의 생산
전술한 바와 같이, 종래기술에 비해 본 발명의 재조합 미생물은 산화형 보효소 Q10의 수율을 더욱 개선할 수 있는 점에도 특징이 있다.
본 발명의 방법은 특정 재조합 미생물을 이용함으로써 높은 삼투압 및 높은 산화환원전위를 포함한 가혹한 환경에 대한 내성을 대폭 개선할 수 있고, 산화형 보효소 Q10의 발효 생산방법에 있어서 높은 산화환원전위가 균체에 미치는 악영향을 없애는 동시에, 산화 스트레스로 인한 균체의 보효소 Q10 생산에 대한 촉진 효과를 더욱 발휘시켜 산화형 보효소 Q10의 역가를 높일 수 있다. 본 발명의 방법에 있어서 재조합 미생물을 이용해서 산화형 보효소 Q10을 발효 생산하는 발효 프로세스 조건은 특허문헌 5를 참조해도 된다. 자세한 방법은 다음과 같다.
산화형 보효소 Q10의 발효 생산방법에 있어서, 발효 프로세스의 보효소 Q10 합성 및 축적 단계에서 발효액의 ORP를 제어한다. 바람직하게는 발효 프로세스의 보효소 Q10 합성 및 축적 단계 중후기에 발효액의 ORP를 제어하고, 보다 바람직하게는 발효 프로세스의 보효소 Q10 합성 및 축적 단계 후기에 발효액의 ORP를 제어한다. 생산 균주의 발효 프로세스에서 발효액의 산화환원전위 ORP는 -50 내지 300mV로 하고, 바람직하게는 50 내지 200mV로 한다.
전술한 발효 생산방법에 있어서, 상기 발효 프로세스에서 상기 발효액의 전기 전도도는 5.0ms/cm 내지 30.0ms/cm로 한다. 바람직하게는 균체 성장 단계에서 산소 소비 속도는 30mmol/(L·h) 내지 150mmol/(L·h) 범위로 하고, 상기 발효액의 전기 전도도는 5.0ms/cm 내지 30.0ms/cm 범위로 한다. 더욱 바람직하게는 보효소 Q10 합성 및 축적 단계에서 산소 소비 속도는 60mmol/(L·h) 내지 120mmol/(L·h) 범위로 하고, 상기 발효액의 전기 전도도는 8.0ms/cm 내지 15.0ms/cm 범위로 한다.
전술한 발효 생산방법에 있어서, 상기 발효액의 용존 산소 제어 및 상기 발효액의 pH 제어 중 적어도 하나를 통해 발효액의 산화환원전위 ORP를 제어하고, 바람직하게는 상기 발효액 용존 산소 제어 및 상기 발효액 pH 제어를 병용한다.
전술한 발효 생산방법에 있어서, 발효 탱크 단위체적당 교반 동력 제어, 단위체적당 발효액 공기 흡기 유량 제어, 및 발효 탱크의 내압 제어 중 적어도 하나를 통해 상기 발효액 중 용존 산소를 제어하고, 바람직하게는 이 중 2개 이상을 병용하여 상기 발효액 중 용존 산소를 제어한다.
전술한 발효 생산방법에 있어서, 보효소 Q10 합성 축적 단계에서 상기 발효 탱크 단위체적당 교반 동력은 바람직하게는 0.25kw/㎥ 내지 0.50kw/㎥로 하고, 상기 단위체적당 발효액 공기 흡기 유량은 바람직하게는 1.0vvm 내지 15.0vvm으로 하고, 및/또는 상기 발효 탱크의 내압은 바람직하게는 0.05MPa 내지 0.3MPa로 한다. 보다 바람직하게는, 상기 발효 탱크 단위체적당 교반 동력은 0.30 kw/㎥ 내지 0.40kw/㎥로 하고, 상기 단위체적당 발효액 공기 흡기 유량은 5.0vvm 내지 8.0vvm으로 하고, 및/또는 상기 발효 탱크의 내압은 0.08MPa 내지 0.15MPa로 한다.
전술한 발효 생산방법에 있어서, 보효소 Q10 합성 축적 단계에서는 상기 발효액의 pH를 3.5 내지 6.0으로 함으로써 상기 발효액의 pH를 제어한다. 바람직하게는, 상기 발효액의 pH를 4.0 내지 5.0으로 함으로써 상기 발효액의 pH를 제어한다. 보다 바람직하게는 산 첨가 또는 염기 첨가를 통해 상기 발효액의 pH를 제어한다. 더욱 바람직하게는, 상기 산 또는 상기 염기의 단계적 또는 연속적 첨가를 통해 상기 발효액의 pH를 제어한다.
전술한 발효 생산방법에 있어서, 상기 산은 유기산 또는 무기산이고, 및/또는 상기 염기는 유기 염기 또는 무기 염기이다. 바람직하게는, 상기 산은 인산, 염산, 황산, 락트산, 프로피온산, 구연산 및 옥살산 중 하나 이상이고, 및/또는 바람직하게는 상기 염기는 암모니아수, 수산화나트륨 및 액체 암모니아 중 하나 이상이다. 보다 바람직하게는 상기 산은 인산, 락트산 또는 구연산이고, 및/또는 상기 염기는 암모니아수 또는 액체 암모니아이다.
전술한 발효 생산방법에 있어서, 로도박터 스페어로이디스(Rhodobacter sphaeroides) RSP-BE뿐만 아니라 그 물리적 또는 화학적 돌연변이 유발방법을 통해 육종된 균주, 또는 유전자 공학 방법을 통해 개변된 균주도 사용할 수 있다.
전술한 발효 생산방법에 있어서, 상기 보효소 Q10은 고함량 산화형 보효소 Q10이면서, 바람직하게는 산화형 보효소 Q10 함유량이 96% 이상이고, 보다 바람직하게는 97% 이상이고, 가장 바람직하게는 99% 이상이다.
전술한 발효 생산방법에 있어서, 상기 산화형 보효소 Q10의 역가는 적어도 1000mg/L이고, 바람직하게는 적어도 2000mg/L이고, 보다 바람직하게는 적어도 3000mg/L이다. 산화형 보효소 Q10의 역가란, 발효액 단위체적당 산화형 보효소 Q10 함유량을 가리킨다.
전술한 발효 생산방법을 통해 얻어진 산화형 보효소 Q10은 기능성 영양식품, 특별한 건강식품을 포함한 각종 식품을 제조하는 데에 사용할 수 있고, 나아가 영양 서플리먼트, 영양제, 동물용 의약품, 음료, 사료, 화장품, 의약품, 약제 및 예방약 제조에도 사용될 수 있다.
이하, 도면 및 실시예에 의해 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
[실시예]
본원 실시예의 재조합 미생물 구축은 아래의 기본 조작을 포함한다.
본 발명에서는 하기 배지를 사용하였다.
사면 배지 조성(100ml)은 효모 추출물 0.8g, 　FeSO4 0.01g, 　K2HPO4 0.13g, CoCl2 0.003g, NaCl 0.2g, MnSO4 0.0001g, MgSO4 0.025g, 글루코오스 0.3g, 비타민 B1 0.1㎍, 비타민 K 0.1㎍, 비타민 A 0.15㎍, 한천분말 1.5g이고 pH는 7.2로 하였다.
시드 배양 배지 조성(100ml)은 (NH4)2SO4 0.25g, 옥수수 침지액(corn steep liquor) 0.05g, 효모 추출물 0.14g, NaCl 0.2g, 글루코오스 0.3g, K2HPO4 0.05g, KH2PO4 0.05g, MgSO4 0.1g, FeSO4 0.01g, CoCl2 0.003g, MnSO4 0.0001g, CaCO3 0.8g, 비타민 B1 0.1㎍, 비타민 K 0.1㎍, 비타민 A 0.15㎍이고 pH는 7.2로 하였다.
발효 배양 배지 조성(100ml)은 (NH4)2SO4 0.3g, NaCl 0.28g, 글루코오스 4g, KH2PO4 0.15g, 아지노모토(MSG의 일본상품명) 0.3g, MgSO4 0.63g, 옥수수 침지액 0.4g, FeSO4 0.12g, CoCl2 0.005g, CaCO3 0.6g, 비타민 B1 0.1㎍, 비타민 K 0.1㎍, 비타민 A 0.15㎍이고 pH는 7.2로 하였다.
역가 측정은 다음과 같다.
(시료 제조): 질소가스 분위기하에 발효액 1ml를 10ml 원심관에 넣고 1mol/L의 HCl 180㎕를 첨가하여 균일하게 혼합하고 3~5min 정치한 후 92℃ 항온수조(water bath)에서 30min 가열하였다. 상청을 원심 제거하고 침출액(아세트산에틸:에탄올=5:3) 8ml를 첨가하여 2시간 침출하고 역상 HPLC로 분석하였다.
(고속 액체 크로마토그래피 조건):
C18 칼럼: 150mm×4.6mm
이동상: 메탄올:이소프로판올 = 75:25(체적 기준)
유량: 1.00ml/min
측정 파장: 275nm
주입량: 40㎕
유지 시간: 12min
산화형 보효소 Q10 함유량 측정은 다음과 같다.
(시료 제조):
질소가스 분위기하에 발효액 1ml를 10ml 원심관에 넣고 1mol/L의 HCl 180㎕를 첨가하여 균일하게 혼합하고 3~5min 정치한 후 92℃ 항온수조에서 30min 가열하였다. 상청을 원심 제거하고 침출액(아세트산에틸:에탄올=5:3) 8ml를 첨가하여 2시간 침출하고 역상 HPLC로 분석하였다.
(고속 액체 크로마토그래피 조건):
칼럼: YMC-Pack 250mm×4.6mm
이동상: 메탄올/n-헥산 = 85:15(체적 기준)
유량: 1mL/min
측정 파장: 275nm
주입량: 40㎕
유지 시간: 환원형 보효소 Q10은 13.5min, 산화형 보효소 Q10은 22.0min.
바이오매스 측정은 다음과 같다. 발효액 10ml를 취해 중량을 측정하고 2mol/L 염산 용액을 첨가하여 pH를 약 4.0으로 하였다. 혼합물을 80℃에서 20min 보온한 후 상청을 원심 제거하고 수세하여 상청을 원심 제거하고 60℃에서 20시간 건조시켜서 중량을 측정하여 발효액 1kg당 균체 함유량을 구하였다.
나머지 당의 측정은 당업계에 공지된 수단, 예를 들면 글루코오스 분석장치를 이용해서 실시할 수 있다. 용존 인의 측정은 당업계에 공지된 수단, 예를 들면 몰리브덴 블루법으로 실시할 수 있다.
[실시예 1] 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자의 증폭 및 재조합 벡터의 구축
키트 취급설명서에 따라 데이노코쿠스 라디오두란스의 게놈을 추출하였다(시약은 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. 제품인 Ezup 칼럼용 세균 게놈 DNA 추출 키트에서 유래한 것이다).
SEQ ID NO:1로 표시되는 DNA 서열에 따라 Primer5 프라이머 설계 소프트웨어로 설계하여 상류 프라이머 irrE-F:5'-ccgGAATTCGTGCCCAGTGCCAACGTCAGCCCCCCTTG-3'(밑줄 친 부분은 EcoRI 절단부위) SEQ ID No.3, 하류 프라이머 irrE-R:5'-cgcGGATCCTCACTGTGCAGCGTCCTGCGGCTCGTC-3'(밑줄 친 부분은 BamHI 절단부위) SEQ ID No.4를 얻었다.
데이노코쿠스 라디오두란스에서 추출한 게놈 DNA를 템플레이트로 해서 고(高)충실도 효소 PrimeSTAR(다카라바이오사(대련)에서 구입), 프라이머(SEQID No.3 및 SEQID No.4)를 이용해서 PCR법으로 글로벌 조절 단백질 irrE의 유전자를 합성하고 아래의 표준 반응 시스템을 채용하였다.
Figure pct00001
증폭 프로세스는 98℃에서 10초 변성, 55℃에서 15초 어닐링, 72℃에서 1분간 신장을 포함한 처리를 1사이클로 하여 30사이클 실시하였다.
PCR 산물을 꺼내 키트 취급설명서에 따라 PCR 정제를 실시하여(시약은 Axygen PrepPCR 클리닝 키트에서 유래한 것), PCR 정제 산물을 얻었다.
다카라바이오사의 하기 엔도뉴클레아제 표준 시스템에 따라 효소에 의한 절단을 실시하였다.
Figure pct00002
Figure pct00003
효소에 의한 절단 산물을 꺼내 키트 취급설명서에 따라 겔을 회수하여(시약은 Axygen PrepDNA 겔 회수 키트에서 유래한 것), 유전자 단편을 회수하였다.
다카라바이오사 T4 리가아제 취급설명서에 기초해서 표준 시스템에 따라 겔 회수를 통해 얻어진 irrE 유전자 5.5㎕, 겔 회수를 통해 얻어진 플라스미드 pBBR1MCS-2 3㎕, T4 리가아제 0.5㎕, T4 리가아제 BUFFER 1㎕를 혼합하여 22℃ 수욕에서 60분간 연결시킴으로써 재조합 플라스미드 pBBR1MCS-2-irrE를 얻었다.
[실시예 2] 삼투조절 프로모터 proPB의 교체
히트쇼크(heat-shock )법을 통해 재조합 벡터 pBBR1MCS-2-irrE를 대장균 BL21 컴피턴트 셀로 형질 전환하고, 50㎍/ml의 카나마이신을 포함한 LB 평판 배지상에서 성장 가능한 콜로니를 해당 LB 평판 배지에서 연속 배양하여 유전적으로 안정된 재조합 대장균을 얻었다.
키트 취급설명서에 따라 유전적으로 안정된 재조합 대장균의 플라스미드를 추출하였다(시약은 AxyPrep 플라스미드 DNA 미니프렙 키트에서 유래한 것이다).
프라이머 irrE-F 및 irrE-R을 이용해서 PCR 검증을 실시하여 약 1.0kb의 단편이 얻어진 것으로 보아 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자가 재조합 대장균에 도입되었음을 확인할 수 있었다.
상류 프라이머 lac-F:5'-GCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCG-3'(밑줄 친 부분은 상동 서열) SEQ ID No.5, 하류 프라이머 lac-R:5'-CTCATTAGGCACCCCAGGCTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTC-3'(밑줄 친 부분은 상동 서열) SEQ ID No.6을 설계하였다.
PCR 검증에서 확인된 재조합 대장균의 플라스미드 DNA를 템플레이트로 하고, 다카라바이오사(대련)의 고충실도 효소 primeSTAR 및 권장 시스템을 사용하여 하기 표준 반응 시스템에서 프라이머 SEQID No.5 및 SEQID No.6을 이용해서 서큘러 PCR법으로 증폭시켰다.
Figure pct00004
증폭 프로세스는 98℃에서 10초 변성, 55℃에서 15초 어닐링, 72℃에서 6분간 신장을 포함한 처리를 1사이클로 하여 20사이클 실시하였다.
PCR 산물을 꺼내 키트 취급설명서에 따라 PCR 정제를 실시하여(시약은 Axygen PrepPCR 클리닝 키트에서 유래한 것), PCR 정제 산물을 얻었다.
히트쇼크법을 통해 PCR 정제 산물을 대장균 BL21 컴피턴트 셀로 형질 전환하고, 50㎍/ml의 카나마이신을 포함한 LB 평판 배지상에서 성장 가능한 콜로니를 해당 LB 평판 배지에서 연속 배양하여 유전적으로 안정된 재조합 대장균을 얻었다.
키트 취급설명서에 따라 유전적으로 안정된 재조합 대장균의 플라스미드를 추출함으로써(시약은 AxyPrep 플라스미드 DNA 미니프렙 키트에서 유래한 것), lac 프로모터가 녹아웃된 재조합 플라스미드 pBBR1MCS-2-G-irrE를 얻었다.
Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.의 플라스미드 서열 결정 검증을 통해 lac 프로모터가 녹아웃된 것을 확인하고 irrE 유전자 서열이 정확하다는 것을 확인하였다. 키트 취급설명서에 따라 대장균의 게놈을 추출하였다(시약은 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. 제품인 Ezup 칼럼용 세균 게놈 DNA 추출 키트에서 유래한 것이다).
상류 프라이머 proPB-F:5'-ccgCTCGAGCATGTGTGAAGTTGATCACAAATTT-3'(밑줄 친 부분은 XhoI 절단부위) SEQ ID No.7, 하류 프라이머 proPB-R:5'-cccAAGCTTGAGTTGGCCCATTTCCGCAAACG-3'(밑줄 친 부분은 HindIII 절단부위) SEQ ID No.8을 설계하였다.
대장균에서 추출한 게놈 DNA를 템플레이트로 하고, 고충실도 효소 PrimeSTAR(다카라바이오사(대련)에서 구입), 프라이머 SEQ ID No.7 및 SEQ ID No.8을 이용해서 하기 표준 반응 시스템에서 PCR법으로 글로벌 조절 단백질 irrE의 유전자를 합성하였다.
Figure pct00005
증폭 프로세스는 98℃에서 10초 변성, 55℃에서 15초 어닐링, 72℃에서 1분간 신장을 포함한 처리를 1사이클로 하여 30사이클 실시하였다.
PCR 산물을 꺼내 키트 취급설명서에 따라 PCR 정제를 실시하여(시약은 Axygen PrepPCR 클리닝 키트에서 유래한 것), PCR 정제 산물을 얻었다.
다카라바이오사의 하기 엔도뉴클레아제 표준 시스템에 따라 효소에 의한 절단을 실시하였다.
Figure pct00006
Figure pct00007
효소에 의한 절단 산물을 꺼내 키트 취급설명서에 따라 겔 회수를 실시하여(시약은 Axygen PrepDNA 겔 회수 키트에서 유래한 것), 유전자 단편을 회수하였다.
다카라바이오사 T4 리가아제 취급설명서에 기초해서 표준 시스템에 따라 겔 회수를 통해 얻어진 proPB 서열 5.5㎕, 겔 회수를 통해 얻어진 플라스미드 pBBR1MCS-2-G-irrE 3㎕, T4 리가아제 0.5㎕ 및 T4 리가아제 BUFFER 1㎕를 혼합하여 22℃ 수욕에서 60분간 연결함으로써 도 2에 도시한 재조합 플라스미드 pBBR1MCS-2-G-proPB-irrE를 얻었다.
[실시예 3] 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자 및 삼투조절 프로모터 proPB를 포함하는 재조합 미생물의 구축
히트쇼크법을 통해 재조합 벡터 pBBR1MCS-2 -G -proPB-irr을 대장균 S17-1 컴피턴트 셀로 형질 전환하고, 50㎍/ml의 카나마이신을 포함한 LB 평판 배지상에서 성장 가능한 콜로니를 해당 LB 평판 배지에서 연속 배양하여 재조합 대장균을 얻었다. 재조합 대장균의 게놈을 추출하고 프라이머 proPB-F 및 irrE-R을 이용해서 PCR 검증을 실시한 결과, 약 1.2kb의 단편이 얻어진 것으로 보아 proPB 프로모터 및 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자가 재조합 대장균에 도입되었음을 확인할 수 있었다. 그리고 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.의 플라스미드 서열 결정 검증을 통해 서열이 NCBI상의 서열과 일치하는 것을 확인하였다.
접합 전달을 통해 재조합 대장균의 재조합 벡터 pBBR1MCS-2-G-proPB-irrE를 로도박터 스페어로이디스에 도입하고 50㎍/ml의 날리딕스산 및 카나마이신을 포함한 평판 배지상에서 성장 가능한 로도박터 스페어로이디스를 해당 평판 배지상에서 연속적으로 3대까지 계대하여 유전적으로 안정된 재조합 로도박터 스페어로이디스 RSP-BE를 얻었다.
재조합 로도박터 스페어로이디스의 게놈을 추출하여 프라이머 proPB-F 및 irrE-R을 이용해서 PCR 검증을 실시한 결과, 약 1.2kb의 단편이 얻어진 것으로 보아 proPB 프로모터 및 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자가 재조합 로도박터 스페어로이디스 RSP-BE에 도입되었음을 확인할 수 있었다.
전술한 재조합 미생물 구축에 있어서, 재조합 벡터를 대장균 S17-1로 형질 전환하는 구체적인 조작은 다음과 같다.
컴피턴트 대장균 S17-1를 포함한 튜브를 10분간 빙욕한 후 재조합 플라스미드 pBBR1MCS-2-G-proPB-irrE를 첨가하고 20분간 더 빙욕하여 90초 히트쇼크하고 5분간 빙욕하여 600㎕의 LB 액체 배지를 첨가하였다. 37℃에서 45분간 배양한 후 5000rpm으로 5분간 원심하여 500㎕의 상청을 제거하고 나머지 액을 카나마이신을 포함한 평판 배지에 도포하였다.
접합 전달의 구체적인 조작은 다음과 같다.
10ml의 액체 배지를 포함한 시험관에 로도박터 스페어로이디스를 파종하여 30℃, 200rpm으로 50시간 배양하였다.
32시간 후, 형질 전환된 대장균 S17-1의 양성 클론을 LB 배양액에 파종하고 37℃, 200rpm으로 하룻밤 배양하였다. 15시간 후, 대장균 S17-1을 계대하고 LB 배지 5ml마다 균액 100㎕를 첨가함과 아울러 카나마이신 5㎕를 첨가하여 37℃ 쉐이커에 두고 배양하였다. 3~4시간 배양한 후 로도박터 스페어로이디스 균액 4ml와 대장균 균액 2ml를 2ml 원심관 1개당 1ml로 분배하고 5000rpm으로 5분간 원심하였다. 상청을 각각 제거하고 신선한 LB 배지 1mL를 첨가하여 균체를 가볍게 재현탁시키고 5000rpm으로 5분간 원심하였다. 상청을 각각 제거하고 신선한 LB 배지 1mL를 첨가하고 균체를 가볍게 재현탁시켰다. 로도박터 스페어로이디스와 대장균의 비율이 100:50, 100:100이 되도록 균액을 균일하게 혼합하고, LB 평판 중앙에 여과막(0.22μm)을 부착하고 혼합 균액을 여과막 중심부에 부어 LB 평판을 조심스럽게 32℃ 인큐베이터에 넣고 하룻밤 배양하였다.
여과막을 핀셋으로 2mL EP관에 옮기고 500㎕ LB 액체 배지에서 여막과상의 균체를 씻어내고 분산시켜 평판 배지 1개당 균액 350㎕로 분배하여 도포한 후 32℃ 인큐베이터에 넣고 72시간 배양하였다.
접합 전달 후 양성 클론인지를 검사하였다.
성장이 양호한 콜로니를 2개~5개 선정하여 48~60시간 배양하고 계대하고나서 2~4시간 더 배양하였다. Axygen 플라스미드 추출 키트의 취급설명서에 기재된 절차대로 플라스미드를 추출하였다. 원심관 1개에 단계 2에서 추출한 플라스미드 34㎕를 넣고 XhoI 및 BamHI를 각각 1㎕ 첨가하고 BUFFER 4㎕를 첨가하였다. 37℃ 항온수조에 넣어 효소에 의한 절단을 1.5시간 실시하였다. 효소에 의한 절단을 실시한 후 전기 영동으로 분석한 결과, 예상대로 1.2kb 부근에 밴드가 명확하게 보였다. 겔을 분할하여 회수한 뒤 얻어진 DNA 단편의 서열 결정 검증을 통해 양성 클론임을 확인하였다.
상기 방법을 통해 얻어진 균주를 미생물 기탁하였다. 이 균은 로도박터 스페어로이디스로 라틴명은 Rhodobacter sphaeroides이고, RSP-BE 균주로 명명하여 2018년 6월 11일에 중국 미생물균종 기탁관리위원회 일반미생물센터(CGMCC 북경시 조양구 북진서로 1호원 3호 중국과학원 미생물연구소, 우편번호 100101)에 기탁하였으며 기탁번호는 CGMCC No.15927이다.
[실시예 4] 재조합 미생물의 발효를 이용한 보효소 Q10의 발효 생산
평판상에서 약 7일간 배양한 재조합 로도박터 스페어로이디스 RSP-BE의 싱글 콜로니를 선택하여 작은 시험관의 사면 배지에 옮겨서 배양하고, 배양된 사면을 멸균수로 세정하여 균농도가 세포 108~109개/ml인 균 현탁액으로 하였다. 얻어진 균 현탁액을 2% 파종량으로 시드 배지에 파종하여 시드 배양하였다. 여기서 배지는 100ml, 32℃, 회전속도 180rpm으로 하고 배양시간은 22~26시간으로 하였다.
시드 배양에서 얻어진 로도박터 스페어로이디스 균주 CGMCC No.15927을 10% 파종량으로 10L 발효 탱크에 파종하였다. 파종량은 당업계의 일반적 함유량, 예를 들면 1~30%로 할 수 있고, 바람직하게는 2.5~20%, 보다 바람직하게는 5~15%로 한다. 필요에 따라 파종량을 조정해도 된다.
시드액은 10L 발효 탱크 내에서 발효를 시작하였고, 발효 온도는 31℃, 탱크 내압은 0.03Mpa로 하고, 산소 공급은 단계적 제어 방침을 채용하였다. 0~24시간 단계에서는 교반 속도를 500rpm, 공기 유량을 6L/min로 하였다. 균체 성장에 따라 OUR은 완만하게 안정되어 50mmol/L·h가 되었다. 이 단계에서 균체는 지수 증식기로 산소 공급은 성장을 제한하는 요인이 되어 교반 속도 및 통기량을 올림으로써 산소 공급 수준을 개선하였다. 24~36시간 단계에서는 OUR을 60mmol/L·h로 유지하고 36~60시간 단계에서는 OUR을 70mmol/L·h로 유지함으로써 균체 성장을 촉진하였다. 60시간 이후, 이 단계의 균체는 서서히 안정기에 접어들어 균체 수는 증가하지 않게 되고 보효소 Q10은 급속히 합성되어 축적되기 때문에 산소 공급을 서서히 낮춤으로써 높은 보효소 Q10 생산 속도를 유지하고, 60~90시간 단계에서는 OUR을 90mmol/L·h로 유지하고 90~100시간 단계에서는 OUR을 80mmol/L·h로 유지하고 100시간 이후에는 OUR을 60mmol/L·h로 유지하였다.
발효 프로세스에서 보충은 다음과 같이 제어하였다. 당업계에 공지된 바와 같이, 발효 프로세스에서 나머지 당 및 용존 인에 따라 글루코오스 및 인산이수소칼륨을 추가함과 아울러, 본 발명에서는 전기 전도도가 15.0ms/cm로 저하되었을 때 배지 유가 보충을 실시한다. 보충 배지의 조성은 보충액 1리터당 효모 분말 12g, (NH4)2SO4 10g, MgSO4 2g, NaCl 6g, KH2PO4 4g, K2HPO4 4g, CaCl2 2g, 비오틴 0.025g으로 하고 pH는 7.0으로 하고 배지 첨가 속도를 제어함으로써 전기 전도도를 15ms/cm 범위 내로 하고 나머지 당을 전 과정에 걸쳐 2.0%로 유지하였다. 110시간 경과하여 발효가 끝난 후 발효액 일부를 취해 불활성 가스 분위기하에 추출 및 분석한 결과, 역가는 3637mg/L이고 바이오매스는 125g/kg이었다.　　
[실시예 5] 재조합 미생물을 사용한 발효에 의한 산화형 보효소 Q10의 생산
평판상에서 약 7일간 배양한 재조합 로도박터 스페어로이디스 RSP-BE의 싱글 콜로니를 선택하여 작은 시험관의 사면 배지에 옮겨서 배양하였다. 배양된 사면을 멸균수로 세정하여 균농도가 세포 108~109개/ml인 균 현탁액으로 하였다. 얻어진 균 현탁액을 2% 파종량으로 시드 배지에 파종하여 시드 배양하였다. 여기서 배지는 100ml, 32℃, 회전속도 180rpm으로 하고 배양시간은 22~26시간으로 하였다.
시드 배양에서 얻어진 로도박터 스페어로이디스 균주 CGMCC No.15927을 10% 파종량으로 10L 발효 탱크에 파종하였다. 파종량은 당업계의 일반적 함유량, 예를 들면 1% 내지 30%로 할 수 있고, 바람직하게는 2.5% 내지 20%, 보다 바람직하게는 5% 내지 15%로 한다. 필요에 따라 파종량을 조정해도 된다.
시드액은 10L 발효 탱크 내에서 발효를 시작하였고, 발효 온도는 30℃, 발효 탱크 단위체적 발효액당 공기 흡기 유량은 0.4vvm, 단위체적당 교반 동력은 0.1kw/㎥, 탱크 압력은 0.02MPa, 산소 소비 속도는 50mmol/(L·h), 발효액의 전기 전도도는 12ms/cm, pH 값은 약 7.0으로 하였다.
보충 배지는 보충액 1리터당 효모 분말 12g, (NH4)2SO4 10g, MgSO4 2g, NaCl 6g, KH2PO4 4g, K2HPO4 4g, CaCl2 2g, 비오틴 0.025g을 포함하고 pH를 7.0으로 하였다.
15시간 후, 산소 공급을 늘리고 발효 탱크 단위체적 발효액당 공기 흡기 유량을 0.6vvm, 단위체적당 교반 동력을 0.2kw/㎥, 탱크 압력을 0.04MPa로 하고, 산소 소비 속도를 70mmol/(L·h)로 올리고나서 그대로 유지하고 발효액의 전기 전도도를 12ms/cm, pH 값을 7.0으로 해서 발효를 계속하였고, 이때 발효는 균체 성장 단계였다.
20시간 후, 산소 공급을 다시 늘리고 발효 탱크 단위체적 발효액당 공기 흡기 유량을 0.8vvm, 단위체적당 교반 동력을 0.2kw/㎥, 탱크 압력을 0.05MPa로 하고, 산소 소비 속도를 90mmol/(L·h)로 올리고나서 그대로 유지하고 발효액의 전기 전도도를 12ms/cm, pH 값을 7.0으로 해서 발효를 계속하였고, 이때 발효는 균체 성장 단계였다.
10시간 후, 산소 소비 속도를 70mmol/(L·h) 부근으로 유지하고 발효액의 전기 전도도를 12ms/cm, pH를 약 6.0으로 해서 발효를 계속하였고, 이때 발효는 보효소 Q10 합성 축적 단계 전기였다.
20시간 후 발효 역가의 증가는 평형이 되었고, 발효는 보효소 Q10 합성 축적 단계 후기에 들어갔다. 발효 탱크 단위체적 발효액당 공기 흡기 유량을 6.0vvm, 단위체적당 교반 동력을 0.3kw/㎥, 탱크 압력을 0.1MPa로 하고 인산을 연속적으로 첨가함으로써 약 2시간 동안 pH를 약 4.0으로 조절하고, 발효액의 전기 전도도를 12ms/cm로 해서 발효를 계속하였고, 안정된 발효액의 ORP 값은 100~200mv 범위로 유지되었다.
15시간 후 발효를 중지하고 발효액 일부를 취해 불활성 가스 분위기하에 추출 및 분석한 결과, 역가는 3533mg/L, 산화형 보효소 Q10:환원형 보효소 Q10은 99.3:0.7이고 바이오매스는 123g/kg이었다.
[비교예 1] 삼투조절 프로모터 proPB 교체를 하지 않은 재조합 미생물의 구축
실시예 1에서 구축한 재조합 벡터 pBBR1MCS-2-irrE를 삼투조절 프로모터 proPB 교체를 실시하지 않고 실시예 3과 마찬가지로 대장균 S17-1 컴피턴트 셀로 형질 전환하고 카나마이신을 포함한 LB 배지상에서 24시간 배양하여 재조합 대장균을 얻었다. 재조합 대장균의 플라스미드를 추출하고 프라이머 irrE-F 및 irrE-R을 이용해서 PCR 검증을 실시하여 약 1.0kb의 단편이 얻어진 것으로 보아 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자가 대장균 S17-1에 도입되었음을 확인할 수 있었다.
얻어진 재조합 대장균 S17-1의 재조합 벡터 pBBR1MCS-2-irrE를 접합 전달을 통해 로도박터 스페어로이디스에 도입하고, 날리딕스산 및 카나마이신을 포함한 평판 배지에서 배양하여 재조합 로도박터 스페어로이디스 RSP-CE를 얻었다. 프라이머 irrE-F 및 irrE-R을 이용해서 PCR 검증을 실시한 결과, 약 1.0kb의 단편이 얻어진 것으로 보아 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자가 로도박터 스페어로이디스 RSP-CE에 도입되었음을 확인할 수 있었다.
[비교예 2] 보효소 Q10의 발효에 있어서 재조합 미생물의 비교
실시예 4의 발효방법과 마찬가지로 로도박터 스페어로이디스의 원래 균주, 재조합 로도박터 스페어로이디스 RSP-BE 및 RSP-CE의 발효를 실시하였다. 발효 결과는 다음과 같다.
Figure pct00008
[비교예 3] 산화형 보효소 Q10의 발효에 있어서 재조합 미생물의 비교
실시예 5의 발효방법과 마찬가지로 로도박터 스페어로이디스의 원래 균주, 재조합 로도박터 스페어로이디스 RSP-BE 및 RSP-CE의 발효를 실시하였다. 발효 결과는 다음과 같다.
Figure pct00009
비교예 3의 결과에 따르면, 발효 생산시 높은 산화환원전위가 균체에 미치는 악영향으로 인해, 로도박터 스페어로이디스 원래 균주의 발효를 이용해서 얻어진 산화형 보효소 Q10의 역가 및 환원형 보효소 Q10에 대한 비율은 낮았다. 한편, 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자는 DNA 손상 복구와 방사선 스트레스 보호 경로에서 중심적인 조절 작용을 발휘하기 때문에, 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자를 외인적으로 도입함으로써 삼투압, 산화, 방사선 및 열 등 다양한 스트레스에 대한 내성을 포함한 가혹한 환경에 대한 미생물의 내성을 개선할 수 있으며, 균의 성장 및 대사 활성 그리고 바이오매스 향상 관점에서 바람직하며, 산화형 보효소 Q10의 역가 및 비율을 어느 정도 높였다. 다만, 삼투조절 프로모터 proPB 교체는 하지 않았기 때문에 재조합 로도박터 스페어로이디스 균주 RSP-CE는 재조합 로도박터 스페어로이디스 균주 RSP-BE에 비해 발효액 측정으로 확인한 역가가 낮았다. 이처럼 삼투조절 프로모터 proPB는 실제 발효 환경의 조건 변화에 따라 irrE의 발현을 효과적으로 조절함으로써 다양한 강도의 스트레스에 대한 보효소 Q10 생산균의 내성을 높일 수 있다.
본 발명에 따른 발효법으로 보효소 Q10을 생산하기 위한 재조합 미생물은 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자를 포함하기 때문에 삼투압, 산화, 방사선 및 열 등 다양한 스트레스에 대한 미생물의 내성을 높일 수 있으며, 균의 대수 증식기를 연장하고 바이오매스의 축적을 더욱 촉진함과 아울러 발효 프로세스에서 균의 활발한 성장 및 대사 활성을 유지함으로써 보효소 Q10의 수율을 높이고, 특히 산화형 보효소 Q10의 수율을 높일 수 있다. 따라서 이 유전자로 구축된 재조합 미생물은 보효소 Q10의 역가를 높일 수 있으며, 특히 산화형 보효소 Q10의 함유량을 현저히 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법으로 구축된 재조합 미생물은 보효소 Q10의 공업적 생산에 있어서 넓게 적용될 수 있다.
중국일반미생물보존센터 CGMCC15927 20180611
<110> ZHEJIANG NHU COMPANY LTD. HEILONGJIANG NHU BIOTECHNOLOGY COMPANY LTD. SHANGYU NHU BIOLOGICAL CHEMICAL CO., LTD. ZHEJIANG UNIVERSITY <120> RECOMBINANT MICROORGANISM, PREPARATION METHOD THEREFOR AND APPLICATION THEREOF IN PRODUCING COENZYME Q10 <130> 20IP05004CN <150> CN 20180984954.9 <151> 2018-08-28 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 987 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 gtgcccagtg ccaacgtcag ccccccttgc ccctctgggg taaggggcgg ggggatgggg 60 ccaaaagcta aagctgaagc ctccaagccc cacccccaaa tccctgttaa gctcccattc 120 gtgaccgccc ccgacgccct cgccgccgcc aaagccagga tgcgcgacct ggcggcggcc 180 tacgtggcgg ccctgcccgg acgcgacacc cacagcctga tggcgggggt gcccggcgta 240 gacctcaaat tcatgccgct cggctggcgc gacggggcgt tcgaccccga gcacaacgtc 300 atcctcatca actcggcggc ccgccccgaa cgccagcgct tcaccctcgc ccacgaaatc 360 gggcacgcga ttttactcgg cgacgacgac ctgctctccg acatccacga cgcctacgag 420 ggcgagcggc tcgaacaggt catcgaaacg ctgtgcaacg tggcggcggc ggcgattttg 480 atgcccgaac ccgtcatcgc ggaaatgctg gaacgcttcg gccccaccgg gcgcgccctc 540 gccgaactcg ccaagcgggc cgaagtcagc gcgtcgtcgg cgctctacgc cctgaccgag 600 cagaccccgg tgcccgtcat ctacgcggtc tgtgcgccgg gcaagcctcc gcgtgagcag 660 gccgcaagcg acgaggacgc tggcccaagc acagaaaaag tcctgacggt ccgcgccagc 720 agctcgacgc ggggcgtcaa gtacaccctg gcgagcggca cgccggtacc cgccgaccac 780 ccggcggcgc ttgccctcgc cacgggcatg gaagtgcgcg aggaaagcta cgtgcccttt 840 cgctcgggcc ggaaaatgaa ggcggaggtg gacgcctacc cgtcgcgcgg catcgtggcc 900 gtcagtttcg agttcgaccc cgcccgcctg ggccgcaagg acagcgagca ggccgaccgg 960 gacgagccgc aggacgctgc acagtga 987 <210> 2 <211> 210 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 tgtgtgaagt tgatcacaaa tttaaacact ggtagggtaa aaaggtcatt aactgcccaa 60 ttcaggcgtc aactggtttg attgtacatt ccttaaccgg agggtgtaag caaacccgct 120 acgcttgtta cagagattgc atcctgcaat tcccgctccc cttttgcggc cgtcgcgctg 180 atttttctgg cgtttgcgga aatgggccaa 210 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 ccggaattcg tgcccagtgc caacgtcagc cccccttg 38 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 4 cgcggatcct cactgtgcag cgtcctgcgg ctcgtc 36 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 5 gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cg 42 <210> 6 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 6 ctcattaggc accccaggct gtggaattgt gagcggataa caatttc 47 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 7 ccgctcgagc atgtgtgaag ttgatcacaa attt 34 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 8 cccaagcttg agttggccca tttccgcaaa cg 32

Claims (13)

  1. a. 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자를 포함하는 모균주로부터 상기 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자를 클로닝하는 단계;
    b. 상기 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자를 벡터에 연결하고, 상기 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 구축하는 단계; 및
    c. 상기 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입함으로써 재조합 미생물을 얻는 단계;를 포함하는 재조합 미생물의 제조방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 단계 b는 프로모터 교체를 통해 상기 재조합 벡터상의 상기 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자의 발현을 제어하는 프로모터를 녹아웃한 뒤 다른 별도의 프로모터를 삽입하여, 상기 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자의 발현을 더욱 조절하는 것을 포함하는 미생물의 제조방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    상기 단계 b에서 삽입되는 프로모터는 유도성 프로모터이고, 바람직하게는 삼투조절 프로모터 proPB이며,
    상기 삼투조절 프로모터 proPB는 SEQ ID NO:2의 적어도 70개의 연속 뉴클레오티드, 바람직하게는 SEQ ID NO:2의 적어도 100개의 연속 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO:2의 적어도 150개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 부분적인 뉴클레오티드 서열, 및 가장 바람직하게는 SEQ ID NO:2의 완전한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자 또는 폴리뉴클레오티드 서열에서 얻어진 것이고, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2와 적어도 60% 상동성, 바람직하게는 SEQ ID NO:2와 적어도 80% 상동성, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO:2와 적어도 90% 상동성을 가지며, 바람직하게는 상기 삼투조절 프로모터 proPB는 SEQ ID NO:2로 표시되는 뉴클레오티드 서열인 재조합 미생물의 제조방법.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 삼투조절 프로모터 proPB는 세균, 바람직하게는 에쉐리키아(Escherichia)속, 보다 바람직하게는 대장균(Escherichia coli)에서 분리된 것인 재조합 미생물의 제조방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 b의 상기 벡터는 pBR322 및 그 유도체, pACYC177, pACYC184 및 그 유도체, RK2, pBBR1MCS-2, 코스미드 벡터 및 그 유도체에서 선택된 것이고, 바람직하게는 pBBR1MCS-2인 재조합 미생물의 제조방법.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 a는 SEQ ID NO:1로 표시되는 DNA 서열에 기초해서 프라이머를 설계하고, 상기 모균주에서 추출한 게놈 DNA를 템플레이트로 해서 PCR법으로 상기 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자를 합성하는 것을 포함하는 재조합 미생물의 제조방법.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 a에서 상기 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자는 SEQ ID NO:1의 적어도 100개의 연속 뉴클레오티드, 바람직하게는 SEQ ID NO:1의 적어도 300개의 연속 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO:1의 적어도 600개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 부분적인 뉴클레오티드 서열, 및 가장 바람직하게는 SEQ ID NO:1의 완전한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자 또는 폴리뉴클레오티드 서열에서 얻어진 것이고, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1과 적어도 60% 상동성, 바람직하게는 SEQ ID NO:1과 적어도 80% 상동성, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO:1과 적어도 90% 상동성을 가지며, 바람직하게는 상기 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자는 SEQ ID NO:1로 표시되는 뉴클레오티드 서열인 재조합 미생물의 제조방법.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 모균주는 세균이고, 바람직하게는 데이노코쿠스(Deinococcus)속이고, 보다 바람직하게는 데이노코쿠스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans), 데이노코쿠스 데제르티(Deinococcus deserti), 데이노코쿠스 고비엔시스(Deinococcus gobiensis), 데이노코쿠스 프로테오리티쿠스(Deinococcus proteolyticus)로 이루어진 군에서 선택된 것이고, 가장 바람직하게는 데이노코쿠스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)인 재조합 미생물의 제조방법.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 c의 도입방법은 형질 전환, 형질 도입, 접합 전달 및 전기 천공에서 선택된 것이고, 상기 숙주 세포는 세균 또는 진균에서 선택된 것이고, 바람직하게는 로도박터속 세균이고, 보다 바람직하게는 로도박터 스페어로이디스이며,
    바람직하게는, 상기 단계 c는 단계 b에서 얻어진 재조합 벡터를 대장균 S17-1 컴피턴트 셀로 형질 전환한 후 접합 전달을 통해 숙주 세포에 도입함으로써, 유전적으로 안정된 재조합 미생물을 얻는 것을 포함하는 재조합 미생물의 제조방법.
  10. 청구항 7에 기재된 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자; 및 청구항 3에 기재된 삼투조절 프로모터 proPB;를 포함하는 재조합 벡터.
  11. 청구항 7에 기재된 상기 글로벌 조절 단백질 irrE를 코딩하는 유전자; 및 청구항 3에 기재된 삼투조절 프로모터 proPB;를 포함하는 재조합 미생물.
  12. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 재조합 미생물을 제조하고, 상기 재조합 미생물을 이용해서 보효소 Q10을 생산하는 것을 포함하는 보효소 Q10의 생산방법.
  13. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 재조합 미생물을 제조하고, 상기 재조합 미생물을 이용해서 산화형 보효소 Q10을 생산하는 것을 포함하는 산화형 보효소 Q10의 생산방법.
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