CN104830873B - 一种位点突变的嗜热异常球菌IrrE蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明用位点突变方式对嗜热异常球菌Deinococcus geothermalis中的IrrE蛋白及其同源蛋白进行了功能基序的氨基酸优化，将功能域基序154LAELAR159中第二位或第五位丙氨酸突变为丝氨酸。实验证明，功能域优化序列能够显著提高IrrE蛋白及其同源蛋白的抗逆功能，尤其是对其表达菌株的紫外胁迫抗性作用可提高10倍以上。

Description

一种位点突变的嗜热异常球菌IrrE蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及一种位点突变的嗜热异常球菌IrrE蛋白，具体涉及功能域优化的嗜热异常球菌Dgeo0395同源蛋白，以及该类蛋白在增强原核宿主对干燥、氧化和紫外线辐照抗性方面的应用。
背景技术
IrrE是嗜热异常球菌(Deinococcus geothermalis)重要的调控蛋白，由Dgeo0395基因编码。根据NCBI(美国国立生物技术信息中心)数据库的信息，目前发现的Dgeo0395同源蛋白共有23个。已知Dgeo0395能够特异性响应胁迫信号，提高该菌株本身抗击基因的表达。
但目前未见嗜热异常球菌中的Dgeo0395蛋白在增强其他生物干燥、氧化和紫外线辐照抗性功能的研究报道。也未见到对此类蛋白的关键功能基序进行分析，并通过定点突变使功能优化的报道。
发明内容
本发明的目的是对Dgeo0395基因编码蛋白的关键功能基序进行优化，获得调控能力更好的新蛋白序列，以大大提高重组菌株的抗性。
本发明通过同源建模方式分析调控蛋白Dgeo0395的结构域。发现Dgeo0395由三个结构域组成，其中HTH结构域是参与靶标基因启动子结合作用。其HTH结构域由3个α螺旋(α6、α7和α8)组成。
其中α7螺旋上含有重要的功能域基序“154LAELA159”。目前NCBI数据库中23个Dgeo0395的同源蛋白的蛋白序列中均含有此段功能域基序序列，而且，此段功能域基序仅发现于异常球菌属(Deinococcus)菌株(图1)。
本发明利用氨基酸定点突变的方法，通过抗逆实验结果，分析比较此段基序中的不同位点氨基酸残基对整个调控蛋白Dgeo0395抗逆作用的影响，找到了对嗜热异常球菌调控蛋白Dgeo0395的重要功能域基序154LAELAR159进行氨基酸优化的突变方式。
具体研究工作如下：
Dgeo0395基因的功能域基序的氨基酸优化
1)对嗜热异常球菌Dgeo0395的氨基酸序列(如SEQ ID NO.2所示)进行结构域功能分析。并对其重要的功能域基序154LAELAR159(如SEQ ID NO.3所示)，进行氨基酸定点突变。
以下是Dgeo0395氨基酸序列，其中，下划线部分是功能域基序154LAELAR159。MTQGQTPPEELSADPSPETGALAPAKARMRELATAYARRLPGLDTHSLMSGLDATLTFMPMGDRDGAYDPEHRVVLINSRVRPERQRFTLAHEISHALLLGDDDLLSDLHDAYEGERLEQVIETLCNVGAAAILMPETLIDELLARFGPSGRARADVSASSALYALAERTSVPVLYAVCAVSRLEAESGEERLPEKALTVRASAGSPGVKYSLRPGTLIPDDHPVAVALETRLPITQESYVPFRSGRRMPAYVDAFPERQRVLVSFALLPKATKGGEQDESGV
所述定点突变是功能域基序154LAELAR159上第二位丙氨酸(155A)和/或第五位丙氨酸(158A)突变为丝氨酸。
其中，功能域基序154LAELAR159中第二位的丙氨酸突变为丝氨酸，序列如SEQ IDNO.4所示；第五位的丙氨酸突变为丝氨酸，序列如SEQ ID NO.5所示。见下表：
表1Dgeo0395基因的功能域基序的氨基酸优化
序列号 序列 备注
3 Leu Ala Glu Leu Ala Arg 154LAELAR159
4 Leu Ser Glu Leu Ala Arg 第二位丙氨酸突变为丝氨酸
5 Leu Ala Glu Leu Ser Arg 第五位丙氨酸突变为丝氨酸
2)构建突变基因的重组工程菌株，鉴定重组菌株的干燥、氧化和紫外线辐照胁迫的抗性
此实验表明：功能域基序154LAELAR159对嗜热异常球菌Dgeo0395的功能发挥十分重要。表达嗜热异常球菌Dgeo0395优化蛋白(Dgeo0395-A155S和Dgeo0395-A158S)的重组菌株与优化前的重组菌株相比，紫外线辐照抗性提高达10倍以上(见实施例3及图4、5)。
3)对嗜热异常球菌Dgeo0395同源蛋白DR-0167(如SEQ ID NO.6所示)和DGo_CA2805(如SEQ ID NO.7所示)相同功能域基序进行氨基酸定点突变及紫外线辐照胁迫抗性分析。
此实验表明：本发明提及的功能域基序功能及改造方案不仅适用于嗜热异常球菌Dgeo0395蛋白，也同样适用于Dgeo0395的众多同源蛋白。表明该功能域基序改造在同源蛋白紫外抗逆性功能中作用的通用性。
序列表信息
SEQ ID NO.1：Dgeo0395基因的DNA序列；
SEQ ID NO.2：Dgeo0395的氨基酸序列；
SEQ ID NO.3～5：见表1；
SEQ ID NO.6：DR-0167的氨基酸序列；
SEQ ID NO.7：DGo_CA2805的氨基酸序列。
附图说明：
图1Dego0395及其同源蛋白系统发育树。横线标注的是Dgeo0395蛋白，图中蛋白序列包含为目前发现的所有Dgeo0395同源蛋白，共23条。数据来自NCBI(美国国立生物技术信息中心)数据库。
图2是含有嗜热异常球菌Dgeo0395序列的PCR产物及载体验证电泳图谱；
Lane 1:2K plus Marker；Lane 2～3:PCR product of pJET-0395；Lane 4:pRADZ3-0395/NdeI；Lane 5:pRADZ3-0395/NdeI+Spe I；Lane 6:pRADZ3-0395/Spe I；Lane7:pRADZ3-0395/NdeI+Spe I
图3紫外辐照、丝裂霉素C氧化和干燥胁迫冲击前后，含有空载体菌株(JM-Z3)和含有嗜热异常球菌Dgeo0395基因的原核表达载体的大肠杆菌(JM-0395)的生长情况对比；
图4丝裂霉素C氧化和干燥胁迫冲击前后，含有功能域基序突变载体的菌株JM-A155S和JM-A158S与含有嗜热异常球菌Dgeo0395基因的原核表达载体的大肠杆菌(JM-0395)的生长情况对比；
图5紫外辐照胁迫冲击前后，含有功能域基序突变载体的菌株JM-A155S和JM-A158S与含有嗜热异常球菌Dgeo0395基因的原核表达载体的大肠杆菌(JM-0395)的生长情况对比。
图6紫外辐照胁迫冲击前后，含有功能域基序突变载体的菌株JM-A155S和JM-A158S与含有嗜热异常球菌Dgeo0395基因的原核表达载体的大肠杆菌(JM-0395)的生存曲线。
图7Dego0395及其同源蛋白序列比对及结构分析。框区为本发明提及功能域基序。图中蛋白序列包含为目前发现的所有Dgeo0395同源蛋白，共15条。数据来自NCBI(美国国立生物技术信息中心)数据库。
图8紫外辐照胁迫冲击前后，表达耐辐射异常球菌DR-0167的大肠杆菌(JM-DR0167)与表达功能域基序突变蛋白的菌株JM-A181S和JM-A184S的生长情况对比。
图9紫外辐照胁迫冲击前后，表达戈壁射异常球菌DGO-CA2805的大肠杆菌(JM-CA2805)与表达功能域基序突变蛋白的菌株JM-S131A的生长情况对比。
具体实施方式
以下实施例中所举的质粒、菌株只用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例中所举的质粒、菌株来源如下：
克隆载体pJET：为ThermoFisher公司市售产品；
穿梭质粒pRADZ3：为本实验室保存；
大肠杆菌JM 109：为北京全式金公司市售产品。
实施例1嗜热异常球菌Dgeo0395基因序列在大肠杆菌中的表达
一、实验方法
1.根据已公布的嗜热异常球菌菌株DSM 11300基因组中的Dgeo0395基因序列设计1对PCR特异性引物：
0395-F：5′ACCACTAGT ATGACGCAGGGCCAGACCCC 3′
0395-R：5′ACCCATATG TCAGACACCCGACTCATCCT 3′
2.通过PCR方法从嗜热异常球菌菌株DSM 11300基因组DNA中扩增出目的基因序列。
反应条件：94℃10min，[94℃30sec，60℃30sec，72℃1.5min]35个循环，72℃10min。
3.PCR产物经胶回收后，克隆于载体pJET上，命名为pJET-0395，并测序验证；然后通过SpeI/NdeI双酶切获得含有粘性末端的Dgeo0395基因及含有groEL启动子的pRADZ3载体，将Dgeo0395基因连接于pRADZ3载体上，构建大肠杆菌表达载体pRADZ3-0395。
4.将该表达载体转化大肠杆菌JM109，经PCR、酶切，测序验证插入序列正确(见图2,3)，将该菌株命名为JM-0395。含有pRADZ3空质粒的E.coli JM109命名为JM-Z3。
二、实验结果
成功构建了表达Dgeo0395的重组大肠杆菌工程菌株。
实施例2含嗜热异常球菌菌株Dgeo0395基因重组工程菌株的胁迫抗性实验
一、实验材料
重组工程菌株：实施例1得到的含有嗜热异常球菌菌株Dgeo0395的JM-0395菌株
对照菌株：实施例1所述含空质粒的JM-Z3菌株。
二、实验方法
1.将对照菌株和重组工程菌株在LB固体培养基平板上划线活化；
2.挑取单菌落接种于添加有相应抗生素的液体LB培养基中，37℃培养至指数中后期；
3.室温下6,000rpm离心5min收集菌体，然后用相同体积的磷酸缓冲液(pH 7.0)将菌体洗涤两次，震荡均匀；
接下来进行紫外辐照抗性、丝裂霉素C抗性和干燥抗性实验
A.紫外辐照(UV)抗性分析：
1)将菌液分为等体积两份；
2)一份于室温下6,000rpm离心5min后收集菌体，作为对照；
3)取另一份菌液经紫外辐照5min后，室温下6,000rpm离心5min后收集菌体；
4)取不同时间段的菌液，10倍稀释至10-5，取10μL点在LB固体培养基平板上，37℃培养2d，观察，记录不同菌株的生长情况；
5)取不同时间段的菌液，10倍稀释至10-5，取200μL涂布LB固体培养基平板，37℃培养2d，记录菌落数量，计算菌株生存率，实验重复3次。
B.丝裂霉素C氧化抗性分析：
1)将菌液分为等体积两份；
2)一份于室温下6,000rpm离心5min后收集菌体，作为对照；
3)将菌体重悬于终浓度为10μg/mL的丝裂霉素C的LB液体培养基中，30℃，220rpm摇床培养5min，10min，15min；
4)取不同时间段的菌液，10倍稀释至10-5，取10μL点在LB固体培养基平板上，37℃培养2d，观察，记录不同菌株的生长情况；
5)取不同时间段的菌液，10倍稀释至10-5，取200μL涂布LB固体培养基平板，37℃培养2d，记录菌落数量，计算菌株生存率，实验重复3次。
C.干燥抗性分析：
1)将菌液分为等体积两份；
2)一份于室温下6,000rpm离心5min后收集菌体，作为对照；
3)另一份分装于敞口的EP管中，置于无菌干燥器内(以颗粒状硅胶作为干燥剂)；
4)每隔10d取出一个批次的几种不同菌株，倍比稀释至10-5，取10μL点在LB固体培养基平板上，37℃培养2d，观察，记录不同菌株的生长情况；
5)取不同时间点的菌液，10倍稀释至10-5，取200μL涂布LB固体培养基平板，37℃培养2d，记录菌落数量，计算菌株生存率，实验重复3次。
三、实验结果
如图3显示，紫外辐照、丝裂霉素C和干燥胁迫冲击前，含有嗜热异常球菌菌株Dgeo0395的JM-0395菌株与含空质粒的JM-Z3菌株生长状态基本一致；
紫外辐照、丝裂霉素C和干燥胁迫冲击后，含有嗜热异常球菌菌株Dgeo0395基因的JM-0395重组菌株生长状况良好，菌落显著数多于只含空质粒的JM-Z3菌株(见图5)。其中紫外辐照抗性和干燥胁迫抗性较对照菌株提高2个数量级，约100倍；丝裂霉素C氧化胁迫抗性提高3个数量级，约1000倍。
通过菌株胁迫后的生存率计算可以清楚的发现：
UV辐照后对照菌株存活率为0.644％±0.052％；表达菌株Dgeo0395的JM-0395菌株存活率为45.570％±3.797％，比对照菌株提高近70倍。
干旱胁迫处理后对照菌株存活率为3.040％±0.929％，而JM-0395菌株存活率为88.889％±7.274％，比对照菌株提高近30倍。
丝裂霉素C氧化胁迫后对照菌株几乎都已经死亡，而JM-0395菌株存活率为58.642％±4.660％，菌株生存能力显著高于对照菌株。
表2是紫外辐照、丝裂霉素C氧化和干燥胁迫冲击前后，含有空载体菌株(JM-Z3)和含有嗜热异常球菌Dgeo0395基因的重组大肠杆菌菌株(JM-0395)存活率比较。
表2三种胁迫处理后菌株存活率比较
四、实验结论
嗜热异常球菌菌株Dgeo0395基因显著增强了原核生物抵抗紫外辐射、氧化和干燥胁迫的能力。
实施例3嗜热异常球菌Dgeo0395基因的功能域基序的氨基酸优化序列构建
根据同源基因序列比对分析数据，对嗜热异常球菌Dgeo0395表达蛋白的重要功能域基序154LAELAR159进行了氨基酸序列优化。
一、实验方法
对嗜热异常球菌调控蛋白Dgeo0395的重要功能域基序154LAELAR159进行了氨基酸优化。通过同源建模方式分析调控蛋白Dgeo0395的结构域。Dgeo0395由三个结构域组成，其中HTH结构域是参与靶标基因启动子结合作用。其HTH结构域由3个α螺旋(α6、α7和α8)组成，其中α7螺旋上含有重要的功能域基序154LAELA159。目前NCBI数据库中Dgeo0395的同源蛋白共发现23条序列，仅发现于异常球菌属(Deinococcus)菌株(图1)。这些蛋白序列中均含有此段功能域基序。利用氨基酸定点突变的方法，分析此段基序中的不同位点氨基酸残基对整个调控蛋白Dgeo0395抗逆作用的影响。
1.通过氨基酸定点突变的方式对将嗜热异常球菌Dgeo0395的氨基酸序列进行功能域基序154LAELAR159进行优化分析。利用融合PCR的方法将目标位点编码氨基酸的核苷酸序列进行突变，进而获得改位点突变的蛋白突变体。选取的突变位点是154L、155A、157L、158A和159R。分别将154位亮氨酸突变为缬氨酸，155位丙氨酸突变为丝氨酸，157为亮氨酸突变为缬氨酸，158位丙氨酸突变为丝氨酸，159位精氨酸突变为赖氨酸。
引物序列如下：
a-0395-F：5′accactagtatgacgcagggccagacccc 3′
d-0395-R：5′acccatatgtcagacacccgactcatcct 3′
b1-L154V-F:5′gggcgtgcgGTGgctgagctggcgcggcgggcagacgtga 3′
c1-L154V-R:5′tcacgtctgcccgccgcgccagctcagcCACcgcacgccc 3′
b2-A155S-F:5′gggcgtgcgctgAGCgagctggcgcggcgggcagacgtga 3′
c2-A155S-R:5′tcacgtctgcccgccgcgccagctcGCTcaccgcacgccc 3′
b3-L157V-F:5′gggcgtgcgctggctgagGTGgcgcggcgggcagacgtga 3′
c3-L157V-R:5′tcacgtctgcccgccgcgccagCACagccaccgcacgccc 3′
b4-A158S-F:5′gggcgtgcgctggctgagctgAGCcggcgggcagacgtga 3′
c4-A158S-R:5′tcacgtctgcccgcccGCTcagctcagccaccgcacgccc 3′
b5-R159K-F:5′gggcgtgcgctggctgagctggcgAAGcgggcagacgtga 3′
c5-R159K-R:5′tcacgtctgcccgCTTcgccagctcagccagcgcacgccc 3′
2.在待突变的核酸位点处设计两条包含定点突变序列的引物b和c，同时设计该基因的上下游引物a和d。分别用引物a、b与c、d以基因组为模板PCR扩增得到两个片段1、2，然后将1、2两片段按摩尔比1:1混合后作为模板，用引物a、d将这两个片段进行融合。
片段1、2反应条件：94℃10min，[94℃30sec，60℃30sec，72℃1.5min]30个循环，72℃10min。
融合反应条件：94℃10min，[94℃30sec，60℃30sec，72℃2min]40个循环，72℃10min。
3.将获得的重组突变片段连接载体pRADZ3并进行大肠杆菌转化(方法参考实施例1)，获得重组工程菌株JM-L154V、JM-A155S、JM-L157V、JM-A158S-F、JM-R159K。
二、实验结果
成功构建了表达嗜热异常球菌调控蛋白Dgeo0395的重要功能域基序154LAELAR159氨基酸位点突变的的重组工程菌株JM-L154V、JM-A155S、JM-L157V、JM-A158S-F、JM-R159K。
实施例4表达嗜热异常球菌菌株Dgeo0395蛋白重要功能域基序154LAELAR159优化重组工程菌株的胁迫抗性实验
一、实验目的
鉴定各重组菌株的干燥、氧化和紫外线辐照胁迫的抗性，并与空白对照及出发菌株比较。
二、实验材料
重组工程菌株：实施例3得到的表达嗜热异常球菌调控蛋白Dgeo0395的重要功能域基序154LAELAR159氨基酸位点突变的的重组工程菌株：JM-L154V、JM-A155S、JM-L157V、JM-A158S、JM-R159K。
对照菌株：
实施例1所述含空质粒的JM-Z3菌株；
实施例1所述含有嗜热异常球菌菌株Dgeo0395的JM-0395菌株。
三、实验方法
各菌株对干燥、氧化和紫外线辐照三种胁迫的抗性的实验方法按照实施例2实验方法进行。
四、实验结果
1、紫外(UV)胁迫
结果见下表
表2紫外线辐照胁迫下各菌株存活率比较
UV胁迫处理10分钟时，对照菌株JM-Z3已经全部死亡，表达嗜热异常球菌Dgeo0395基因重组菌株JM-0395的存活率下降为0.125％，而表达Dgeo0395优化基因的重组菌株JM-A155S的存活率为1.263％，表达Dgeo0395优化基因的重组菌株JM-A158S的存活率最好，仍为62.5％。
UV胁迫处理15分钟时，表达嗜热异常球菌Dgeo0395基因重组菌株JM-0395的存活率进一步降低为0.014％，而表达Dgeo0395优化基因的重组菌株JM-A155S的存活率为0.197％，表达Dgeo0395优化基因的重组菌株JM-A158S的存活率保持在12％左右(表2)。
UV辐照生存曲线显示，功能域基序154LAELAR159中155位的丙氨酸突变为丝氨酸，如SEQ ID NO.4所示，使重组菌株在辐照15分钟时的存活率比突变前提高约15倍；而158位的丙氨酸突变为丝氨酸，如SEQ ID NO.5所示，使得重组菌株在辐照15分钟的存活率比突变前提高近900倍(表2、图6)。
2、重组菌株JM-A155S和JM-A158S的干燥和氧化胁迫抗性
重组菌株JM-A155S和JM-A158S的干燥和氧化胁迫抗性与突变前重组菌株JM-0395一致(见图4)。
五、实验结论
1、功能域基序优化的重组菌株JM-A155S和JM-A158S对紫外线辐胁迫抗性显著高于出发菌株JM-0395，提高10倍以上(图5)。因此证明，154LAELAR159中，155位和158位丙氨酸是提高抗紫外线辐胁迫功能的活性位点。
2、重组菌株JM-L154V、JM-L157V和JM-R159K对干燥、氧化和紫外线辐照胁迫抗性与菌株JM-0395一致，均高于空质粒菌株。证明，154LAELAR159中，L154V、L157V和R159K位点的突变不影响出发菌的抗逆活性，即，对Dgeo0395的调控作用没有影响。
3、嗜热异常球菌Dgeo0395的功能域基序154LAELAR159具有提高蛋白Dgeo0395抗逆功能的重要作用。
实施例5耐辐射异常球菌中IrrE同源蛋白功能域基序的氨基酸优化序列改造及紫外抗性实验鉴定
一、实验目的
利用NCBI数据库基因信息对Dgeo0395同源蛋白序列进行比对分析(见图1、7)。Dgeo0395在耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)中的同源蛋白是DR0167，该蛋白在α7位置同样含有本发明发现的重要功能域基序180LAELAR185，氨基酸序列与Dgeo0395相同(见图7)。对耐辐射异常球菌中的同源蛋白DR0167的重要功能域基序180LAELAR185中第二位或第五位丙氨酸进行优化突变改造，鉴定该功能域基序在重组突变蛋白紫外抗逆性功能中的作用。
二、实验方法
1.通过氨基酸定点突变的方式对耐辐射异常球菌IrrE同源蛋白DR0167的氨基酸序列进行空间结构相同位置功能域基序180LAELAR185进行优化分析。同样利用融合PCR的方法将目标位点编码氨基酸的核苷酸序列进行突变，进而获得改位点突变的蛋白突变体。选取的突变位点是为功能域基序中的两个丙氨酸，181A和184A。分别将181位丙氨酸突变为丝氨酸，184位丙氨酸突变为丝氨酸。
引物序列如下：
a-dr0167-F：5′taactagtgtgcccagtgccaacgtcag 3′
d-dr0167-R：5′tacatatgtcactgtgcagcgtcct 3′
b1-A181S-F:5′ggccccaccgggcgcgccctcAGCgaactcgccaagcgggcc 3′
c1-A181S-R:5′ggcccgcttggcgagttcGCTgagggcgcgcccggtggggcc 3′
b2-A184S-F:5′ggccccaccgggcgcgccctcgccgaactcAGCaagcgggcc 3′
c2-A184S-R:5′ggcccgcttGCTgagttcggcgagggcgcgcccggtggggcc 3′
2.获得的耐辐射异常球菌DR0167原始基因片段及重组突变片，并段连接载体pRADZ3并进行大肠杆菌转化(方法参考实施例1，3)，获得重组工程菌株JM-DR0167、JM-A181S和JM-A184S。
3.各菌株对紫外线辐照的抗性实验方法参照实施例2的实验方法进行。
三、实验结果
UV辐照胁迫处理显示，耐辐射异常球菌DR-0167同样能够提高原核微生物UV胁迫抗性。同样，对其功能域基序180LAELAR185中第二位或第五位丙氨酸进行优化突变为丝氨酸，进一步提高了重组蛋白提高细胞抗紫外辐射的能力(图8)。实验结果显示，功能域基序180LAELAR185中第二位丙氨酸突变为丝氨酸是原DR-0167蛋白的保护作用提高仅10倍；而功能域基序180LAELAR185中第五位丙氨酸突变为丝氨酸将原始DR-0167蛋白的保护作用提高2个数量级，近100倍(见图8)。
四、实验结论
耐辐射异常球菌的DR-0167是Dgeo0395的同源蛋白。DR-0167中同样含有本发明发现的重要功能域基序，为180LAELAR185。氨基酸排列顺序与Dgeo0395相同。实验结果证实，对其功能域基序180LAELAR185中第二位或第五位丙氨酸进行优化突变为丝氨酸，进一步提高了重组蛋白提高细胞抗紫外辐射的能力。实验结果表明，本发明提及的Dgeo0395的重要功能域基序中第二位或第五位丙氨酸突变为丝氨酸，提高该蛋白保护原核细胞UV胁迫抗性的发现，同样适用于对Dgeo0395同源蛋白的抗逆功能改造。
实施例6戈壁异常球菌中IrrE同源蛋白功能域基序的氨基酸序列改造及紫外抗性实验鉴定
一、实验目的
利用NCBI数据库基因信息对Dgeo0395同源蛋白序列进行比对分析(见图1、7)。Dgeo0395在戈壁异常球菌(Deinococcus gobiensis)中的同源蛋白是DGo_CA2805，该蛋白在α7位置同样含有本发明发现的重要功能域基序127LAELSR132，氨基酸序列与Dgeo0395不同，其第五位不是丙氨酸，而是丝氨酸(见图7)。对戈壁异常球菌中的同源蛋白DGo_CA2805的重要功能域基序127LAELSR132的第五位丝氨酸进行反向突变改造为丙氨酸，鉴定该功能域基序在重组突变蛋白紫外抗逆性功能中的作用。
二、实验方法
1.通过氨基酸定点突变的方式对戈壁异常球菌IrrE同源蛋白DGo_CA2805的氨基酸序列进行空间结构相同位置功能域基序127LAELSR132进行分析。同样利用融合PCR的方法将目标位点编码氨基酸的核苷酸序列进行突变，进而获得改位点突变的蛋白突变体。选取的突变位点是为功能域基序中第五位丝氨酸。将131位丝氨酸反向突变为丙氨酸。
引物序列如下：
a-CA2805-F：5′taactagtatgcgcgagctggcggcgg 3′
d-CA2805-R：5′tacatatggtgagagggagacgcgct 3′
b1-S131A-F:5′cgcgccctggccgagttgGCCcgccgcgccgacgtgagt 3′
c1-S131A-R:5′actcacgtcggcgcggcgGGCcaactcggccagggcgcg 3′
2.获得的戈壁异常球菌DGo_CA2805原始基因片段及重组突变片，并段连接载体pRADZ3并进行大肠杆菌转化(方法参考实施例1，3)，获得重组工程菌株JM-CA2805、JM-S131A。
3.各菌株对紫外线辐照的抗性实验方法参照实施例2的实验方法进行。
三、实验结果
UV辐照胁迫处理显示，戈壁异常球菌DGo_CA2805同样能够提高原核微生物UV胁迫抗性。同样，对其功能域基序127LAELSR132第五位丝氨酸突变为丙氨酸，显著降低了重组蛋白提高细胞抗紫外辐射的能力(图9)。实验结果显示，功能域基序127LAELSR132中第五位丝氨酸突变为丙氨酸将原始DGo_CA2805蛋白的保护作用降低2个数量级，约100倍(见图9)。
四、实验结论
戈壁异常球菌的DGo_CA2805是Dgeo0395的同源蛋白。DGo_CA2805中同样含有本发明发现的重要功能域基序，为127LAELSR132。氨基酸排列顺序与Dgeo0395不同，其第五位氨基酸天然是丝氨酸。本实施例将这一位点氨基酸进行反向突变，并验证该功能域基序在在重组突变蛋白紫外抗逆性功能中的作用。实验结果证实，对其功能域基序127LAELSR132中第五位丝氨酸进行反向突变为丙氨酸，明显降低了重组蛋白提高细胞抗紫外辐射的能力。实验结果从反方向证明，本发明提及的Dgeo0395的重要功能域基序中第二位或第五位丙氨酸突变为丝氨酸，提高该蛋白保护原核细胞UV胁迫抗性的发现，同样适用于对Dgeo0395同源蛋白的抗逆功能改造。

Claims (2)

1.嗜热异常球菌(Deinococcus geothermalis)IrrE蛋白及其同源蛋白中的功能域基序154LAELAR159在抗逆功能改造中的应用，所述154LAELAR159的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；
所述改造是将SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的第二位丙氨酸或第五位丙氨酸突变为丝氨酸。
2.权利要求1所述的应用，所述抗逆是抗紫外辐照胁迫。
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