CN101696414B - 提高生物辐射抗性的基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明发现了可提高生物抵抗电离辐射及紫外线辐射能力的一种核苷酸编码序列。将本发明构建的包含上述基因的重组载体转化至原核宿主细胞。所获得的重组菌株增强了对电离辐射、紫外线辐射的抗性。
Description
技术领域
本发明涉及一种可提高生物辐射抗性的基因，本发明还涉及所述基因在抵抗电离辐射及紫外线辐射方面的应用。
背景技术
耐辐射球菌属(Deinococcus)是迄今为止地球上发现的辐射抗性最强的生物之一，对电离辐射、紫外线、干燥及一些DNA损伤试剂显示超强的抗性，一直备受生物、医学界和环境工程界的关注和重视。
Deinococcus gobiensis是2007年分离自中国新疆戈壁沙漠的一株耐辐射球菌属新种。在戈壁沙漠中，该菌暴露于伴有紫外线辐射、干燥和营养限制的严酷环境。这使得Deinococcus gobiensis拥有的辐射抗性高于本属其他菌株。其对于电离辐射(＞15kGy)和紫外线辐射(＞600J/m2)具有超强的抗性。
当前，辐射生物学已成为与人类健康、生存密切相关的新兴科学。因此，发现并鉴定抗辐射菌株中参与营养运输和DNA修复的基因，对于探索生物在缺少营养，干旱和紫外线暴露的极端环境的适应和生存是十分重要的。
发明内容
本发明的目的是发现一段提高细胞电离辐射和紫外线辐射抗性的DNA序列。
本发明人通过对Deinococcus gobiensis(CGMCC 2358)菌株的全基因组测序和基因注释分析，发现如序列SEQ ID NO：1所示的DNA序列。
SEQ ID NO：1所示的DNA序列编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
将此DNA序列构建表达载体，转化进入大肠杆菌宿主细胞中表达，得到重组菌株。
对该重组菌株及其对照组进行紫外线辐射实验和γ辐射实验。实验结果显示，本发明所述的基因具有提高细胞抗电离辐射和紫外线辐射能力的功能。
附图说明
附图1含有SEQ ID NO：1表达载体图；
附图2含有SEQ ID NO：1表达载体的大肠杆菌紫外线辐射生存率的分析图。pRADIE-trans109为表达SEQ ID NO：1序列的重组菌株；pRADZ3-trans109为含有空质粒的对照组菌株。
附图3含有SEQ ID NO：1表达载体的大肠杆菌电离辐射生存率的分析图。pRADIE-trans109为表达SEQ ID NO：1序列的重组菌株；pRADZ3-trans109为含有空质粒的对照组菌株。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明本发明的方法，而不用于限制本发明的范围。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件。
实施例1核苷酸序列SEQ ID NO：1的克隆
根据Deinococcus gobiensis菌株的基因组序列测序结果，设计一对PCR特异性引物。从Deinococcus gobiensis基因组DNA中扩增出完整的核苷酸序列SEQ IDNO：1。
其中，Deinococcus gobiensis菌株来源于发明人实验室，该菌株在三处有保藏，其保藏编号分别为：DSM 21396T、CGMCC 1.7299T和CGMCC 2358。
实施例2构建大肠杆菌表达载体及分子验证
用将上述克隆片段用SpeI和NdeI双酶切消化，与含E.coli通用groE启动子的载体pRADZ3连接，取代其lacZ基因构建成表达此基因的大肠杆菌表达载体，如附图1所示。
利用氯化钙转化法，将重组载体转化E.coli trans109感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养12小时。
转化方法如下：
1)取10μL过夜连接产物加到一管感受态细胞中，轻轻旋转以混匀内容物，冰上放置30min；
2)将离心管置于42℃水浴中热激90s，不要晃动离心管；
3)迅速将离心管置于冰上，冷却2min；
4)加入800μL LB液体培养基，37℃，150rmp摇床培养45min；
5)取200μL培养液涂布于相应的抗生素平板筛选转化子。
挑取白色菌落，碱裂解法提取质粒DNA筛选不同的重组子，SpeI和NdeI双酶切及测序验证，得到一株含该核苷酸序列表达载体的重组菌株pRADIE-trans109。
实施例3含SEQ ID NO：1的重组载体提高细胞抗紫外线辐射的功能验证
1、方法
将含有SEQ ID NO：1核苷酸序列表达载体的重组菌株pRADIE-trans109和含有对照载体pRADZ3的对照组菌株pRADZ3-trans109分别以1％的接菌量分别接种于含有氨苄青霉素抗生素LB液体培养基(氨苄青霉素浓度50μg/mL)中，37℃振荡培养10个小时，培养到稳定初期用于紫外线辐射生存率的测定。
取20mL菌液，离心，用磷酸缓冲液(10mM，pH 7.0)洗涤两次，重悬于20mL磷酸缓冲液中，将细胞悬液置于直径为9cm灭菌的培养皿中，在室温条件下，于紫外线辐射装置中，进行紫外光辐照，照射剂量分别为0，100，300，500，700和800J/m2。辐照过程中，将培养皿置于电动旋转的平台上，转速为每分钟20-30转，确保紫外光能均匀照射到菌液上。
经紫外线辐射处理的细胞用10mM磷酸缓冲液进行一系列倍比稀释(10-1到10-6)。取100μL稀释液涂布含LB的固体培养基上，每个处理3次重复。经37℃培养1-2天，计算单菌落数。进行紫外线辐射生存率的分析。
2、结果
对含有SEQ ID NO：1核苷酸序列表达载体的pRADIE-trans109重组菌株和对照菌株pRADZ3-trans109进行了不同剂量的紫外线辐射处理，从附图2的生存率变化曲线中可看出pRADZ3-trans109菌株紫外线辐射抗性与对照菌株相比显著提高。
实施例4含SEQ ID NO：1的重组载体提高细胞抗电离辐射的功能验证
1、方法
将含有SEQ ID NO：1核苷酸序列表达载体的重组菌株pRADIE-trans109和含有对照载体pRADZ3的对照组菌株pRADZ3-trans109分别以1％的接菌量分别接种于含有氨苄青霉素抗生素LB液体培养基(氨苄青霉素浓度50μg/mL)中，37℃振荡培养10个小时，培养到稳定初期用于电离辐射生存率的测定。
取菌液，离心，用磷酸缓冲液(10mM，pH 7.0)洗涤两次，重悬于磷酸缓冲液中，将细胞悬液置于60Co-γ辐射装置中，进行电离辐照，照射剂量分别为0Gy，50Gy，100Gy，200Gy，300Gy。
经电离辐射处理的细胞用10mM磷酸缓冲液进行一系列倍比稀释(10-1到10-6)。取100μL稀释液涂布含LB的固体培养基上，每个处理3次重复。经37℃培养1-2天，计算单菌落数。进行电离辐射生存率分析。
2、结果
为了比较含有SEQ ID NO：1核苷酸序列表达载体的pRADIE-trans109重组菌株和含有空白载体的对照菌株pRADZ3-trans109对电离辐射抗性的差异，我们观察了菌株在不同辐射下的细胞生存率。如附图3所示，重组菌株pRADIE-trans109生存率曲线呈现明显的肩形，表明其电离辐射抗性明显高于对照菌株。
SEQUENCE LISTING
<110>中国农业科学院生物技术研究所
<120>提高生物辐射抗性的基因及其应用
<130>09-11
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>834
<212>DNA
<213>deinococcus gobiensis
<400>1
GTGAGCGATC AGGCAGCGGG CCTTCCCGAA CCTCAGGGTG AGACGGCGTC
GGCCAAGCGG 60
CGCATGCGCG AGCTGGCGGC GGCGTACGCG GCCCGTGTGC CCAGCCTGGA
CGCCCATGGG 120
CTGATGGACG GCCTGGACGG CGTCCAACTG CGTTTCATGC CCATGGGCCA
GCGTGACGGG 180
GCCTACGATC CCGAACATCA CGTCATCCTG ATCAACAGCC AGGTGCGTCC
CGAGCGTCAG 240
CGCTTCACGC TCGCCCACGA GATCAGCCAC GCGCTTCTGC TGGGTGACGA
CGACCTCCTG 300
AGTGACCTGC ACGATAGCTT CGAGGGCGAG CGGCTTGAGC AGGTGATCGA
AACGCTGTGC 360
AACGTGGGCG CGGCGGCGCT GCTCATGCCG GATGCCCTGA TCGCCGAACT
CCTGGAGCGC 420
TTCGGGGCGA CTGGCCGCGC CCTGGCCGAG TTGTCGCGCC GCGCCGACGT
GAGTGCCTCG 480
ACCGCGCTCT ATGCCCTGGC CGAGCGCACC CCCGGCGCCG TGCTGTATGC
CGTCTGCACC 540
CGCTCGCGGC TGGAGACGGA AACCGACGAT GAAGATGGCG GCGCCGCTTC
CGGGACGGCC 600
CTCACCGTGC GGGTGAGCGG CGGCTCGGCA GGCATGAAGT ACACCCTGCG
GCCGGGAACG 660
CCCATTCCGG CCGACCATCC GGTCCAGGCG GCATTCGAGT CAAACCTTCC
CCTGACCGGG 720
CCGAGTTATG TTCCCTTCCG CTCCGGACGC AAGATGCCGG CGGAGGTGGA
CGCCTTTCCG 780
GTGCGGGGTC GCGTGATGGT CAGTTTCGAC CTGAATGGAC GCGGCGGAAC GTGA
834
<210>2
<211>277
<212>PRT
<213>deinococcus gobiensis
<400>2
Val Ser Asp Gln Ala Ala Gly Leu Pro Glu Pro Gln Gly Glu Thr
Ala
1 5 10 15
Ser Ala Lys Arg Arg MET Arg Glu Leu Ala Ala Ala Tyr Ala Ala
Arg
20 25 30
Val Pro Ser Leu Asp Ala His Gly Leu MET Asp Gly Leu Asp Gly
Val
35 40 45
Gln Leu Arg Phe MET Pro MET Gly Gln Arg Asp Gly Ala Tyr Asp
Pro
50 55 60
Glu His His Val Ile Leu Ile Asn Ser Gln Val Arg Pro Glu Arg
Gln
65 70 75
80
Arg Phe Thr Leu Ala His Glu Ile Ser His Ala Leu Leu Leu Gly
Asp
85 90 95
Asp Asp Leu Leu Ser Asp Leu His Asp Ser Phe Glu Gly Glu Arg
Leu
100 105 110
Glu Gln Val Ile Glu Thr Leu Cys Asn Val Gly Ala Ala Ala Leu
Leu
115 120 125
MET Pro Asp Ala Leu Ile Ala Glu Leu Leu Glu Arg Phe Gly Ala
Thr
130 135 140
Gly Arg Ala Leu Ala Glu Leu Ser Arg Arg Ala Asp Val Ser Ala
Ser
145 150 155
160
Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Ala Glu Arg Thr Pro Gly Ala Val Leu
Tyr
165 170 175
Ala Val Cys Thr Arg Ser Arg Leu Glu Thr Glu Thr Asp Asp Glu
Asp
180 185 190
Gly Gly Ala Ala Ser Gly Thr Ala Leu Thr Val Arg Val Ser Gly
Gly
195 200 205
Ser Ala Gly MET Lys Tyr Thr Leu Arg Pro Gly Thr Pro Ile Pro
Ala
210 215 220
Asp His Pro Val Gln Ala Ala Phe Glu Ser Asn Leu Pro Leu Thr
Gly
225 230 235
240
Pro Ser Tyr Val Pro Phe Arg Ser Gly Arg Lys MET Pro Ala Glu
Val
245 250 255
Asp Ala Phe Pro Val Arg Gly Arg Val MET Val Ser Phe Asp Leu
Asn
260 265 270
Gly Arg Gly Gly Thr
275
Claims (4)
1.一种提高生物电离辐射及紫外线辐射抗性的基因，其DNA序列如SEQ IDNO：1所示。
2.权利要求1所述基因序列编码的氨基酸序列，如SEQ ID NO：2所示。
3.包含SEQ ID NO：1所述DNA的重组载体。
4.用权利要求3所述的重组载体转化的宿主细胞，包括原核细胞和真核细胞。
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