CN106701802A - 过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重组大肠杆菌的构建方法和纯化方法 - Google Patents

过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重组大肠杆菌的构建方法和纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重组大肠杆菌PLY127‑2的构建方法和纯化方法，特点是通过克隆嗜酸乳杆菌ATCC4356的UGPase基因LBA0625片段连接到pET‑28a表达载体上，转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，通过红霉素抗性筛选并鉴定获得带有目的基因的重组菌，即过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组大肠杆菌，对重组大肠杆菌进行诱导后，并利用Ni‑NTA琼脂糖亲和层析成功纯化出UGPase，优点是诱导后的UGPase酶活为456.14IU/L，是对照组的2.34倍，获得的UGPase的活性回收率为53.55%，蛋白纯化倍数为12.96倍。

Description

过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重组大肠杆菌 的构建方法和纯化方法
技术领域
本发明属于生物工程及微生物发酵技术领域，具体是涉及过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重组大肠杆菌的构建方法和纯化方法。
背景技术
尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucosepyrophosphorylase，UGPase）广泛分布于动物、植物、微生物中，许多物种和组织无论是在转录水平还是蛋白水平上，都有检测到UGPase的存在，这正是由于UGPase在糖代谢中发挥着至关重要的作用。它处于糖代谢的交叉位点，在糖与糖之间的动态转化过程中扮演着重要角色。利用基因工程技术，将外源基因导入大肠杆菌进行过表达，通过简单快速的亲和层析，直接获得纯度较高的目的蛋白。亲和层析具有结合特异性高、纯化条件温和、纯化步骤简单等优点，为蛋白质的有效纯化提供了一条解决途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组大肠杆菌及尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的纯化方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
1、一种过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（LBA0625），所述基因来自于嗜酸乳杆菌（lactobacillus acidophilus）ATCC 4356编码尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。
2、过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（LBA0625）的重组大肠杆菌的构建方法，具体步骤如下：
（1）过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（LBA0625）的扩增与克隆
以嗜酸乳杆菌ATCC 4356基因组DNA为模板，设计PCR引物，扩增尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因LBA0625；PCR产物与克隆载体Blunt Zero以7:1的摩尔比混合，于25℃反应5min后，立即置于冰上，然后将连接产物Blunt-LBA0625转化至Trans1-T1感受态细胞中复制；
（2）重组表达载体pET-LBA0625的构建
用质粒小量提取试剂盒分别提取克隆质粒Blunt-LBA0625和表达载体pET-28a，均用XhoⅠ和BamHⅠ进行双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，然后切胶回收；将克隆质粒Blunt-LBA0625胶回收产物和表达载体pET-28a胶回收产物以摩尔比7:1在T4连接酶的作用下，于22℃反应30min构建重组表达载体pET-LBA0625；然后将连接产物pET-LBA0625转化至Trans1-T1感受态细胞中复制；
（3）重组大肠杆菌PLY127-2的构建
提取pET-LBA0625过表达质粒，热激转化至感受态大肠杆菌BL21（DE3）中，涂布卡那霉素抗性平板，再在37℃培养12h，筛选转化子；转化子经PCR进行验证，从而获得过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组大肠杆菌PLY127-2。
PCR引物的序列如下所示：LBA0625上游扩增引物：GGATCCATGAAAGTAAGAAAAGCTATTATTCCTGC；LBA0625下游扩增引物：CTCGAGTTATTTATTTTTTCGCTTATCTTCAGCTT。
PCR扩增程序如下：（1）94℃ 4min；（2）98℃ 10sec， 55℃ 5sec，72℃ 1min；重复30个循环；（3）72℃ 5min；PCR反应体系如下所示：5×PrimeSTAR Buffer 10 μL，dNTPMixture 4 μL，20mM 正向引物1 μL，20mM 反向引物1 μL，模板DNA 2 μL，PrimeSTAR HSDNA 聚合酶 0.5 μL，用蒸馏水补足至 50μL。
所述表达载体pET-28a的启动子为T7，将目的基因片段插入到pET-28a启动子T7下游多克隆位点。
所述的热激转化具体步骤如下：向50μL感受态大肠杆菌BL21（DE3）细胞中加入重组表达质粒pET-LBA0625，轻轻混匀，冰浴30min后，42℃水浴热激45s，然后快速将离心管转移到冰浴中2min；向离心管中加入500μL LB培养基，混匀后至于37℃，200rpm复苏1h，吸取100μL已转化的感受态细胞涂布卡纳霉素抗性LB平板。
3、上述过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组大肠杆菌的纯化方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）表达外源蛋白并提取
将构建的过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组大肠杆菌PLY127-2接种于LB肉汤中，于37℃，200r/min过夜活化，制备种子培养液，将种子培养液以体积比8%的接种量接种于LB肉汤培养基中培养至OD600=0.5时，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.4mM，30℃诱导6h后，于5500rpm离心10min，弃上清；将沉淀菌体用生理盐水洗3次后，然后加入PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎提取蛋白，于10，000×g离心20min后，取其上清，即得到诱导的蛋白上样液；
（2）蛋白纯化
将his-NTA柱子用结合缓冲液平衡，流速控制在0.5mL/min，然后上样诱导的蛋白上样液，并继续用结合缓冲液清洗至平衡状态，再用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，流速控制为1mL/min，用离心管收集洗脱液，取最高峰所对应的管液进行SDS-PAGE电泳纯化回收。
所述的结合缓冲液的配方如下：10mM咪唑、20mM Tris、0.5M NaCl，pH=8.0；所述的洗脱缓冲液的配方如下：250mM咪唑、20mM Tris、0.5M NaCl，pH=8.0。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了一株能过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucosepyrophosphorylase，UGPase）基因的重组大肠杆菌PLY127-2及其构建方法，并建立了纯化UGPase的方法。通过克隆嗜酸乳杆菌ATCC4356（lactobacillus acidophilusATCC4356）的UGPase基因（LBA0625）片段连接到pET-28a表达载体上，转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，通过红霉素抗性筛选并鉴定获得带有目的基因的重组菌，即过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（LBA0625）的重组大肠杆菌PLY127-2。其外源蛋白得到了高效表达，对重组大肠杆菌进行诱导后，其UGPase酶活为456.14IU/L，是对照组的2.34倍，并利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析成功纯化出UGPase，获得的UGPase的活性回收率为53.55%，蛋白纯化倍数为12.96倍。首次构建了一株能过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组大肠杆菌PLY127-2，并成功纯化出UGPase，为高效表达外源蛋白和蛋白纯化奠定研究基础和技术支持。
附图说明
图1为过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（LBA0625）基因PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测结果；Lane1、2为目的基因LBA0625 PCR扩增后产物；
图2为表达载体体pET-28a经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后琼脂糖凝胶电泳检测结果；Lane1、2为pET-28a经双酶切后的验证结果图；
图3为克隆质粒Blunt-LBA0625经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后琼脂糖凝胶电泳检测结果；Lane1、2为Blunt-LBA0625经双酶切后的验证结果图；
图4为pET-LBA0625重组质粒图谱构建流程；
图5为重组大肠杆菌PLY127-2全蛋白图，Lane1为对照组蛋白，Lane2为诱导后的蛋白；
图6为重组大肠杆菌PLY127-2诱导前后UGPase的酶活测定结果；
图7为通过Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化后的蛋白电泳图，Lane1-8为收集不同EP管的洗脱液进行SDS-PAGE。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
重组表达载体pET-LBA0625的构建
1、设计PCR引物用于扩增过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（LBA0625）基因片段，PCR引物的序列如下所示：LBA0625上游扩增引物：GGATCCATGAAAGTAAGAAAAGCTATTATTCCTGC；LBA0625下游扩增引物：CTCGAGTTATTTATTTTTTCGCTTATCTTCAGCTT（下划线部分为酶切位点）。
2、以嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)ATCC 4356(该嗜酸乳杆菌已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏中心登记入册编号为1.1878，该菌种购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心)基因组DNA为模板，进行如下PCR程序：
其中步骤(2)-(4)重复30个循环。
PCR反应体系如下表所示：表2
试剂 用量/μL
5×PrimeSTAR Buffer 10
dNTP Mixture 4
正向引物 1
反向引物 1
模板DNA 2
PrimeSTAR HS DNA 聚合酶 0.5
ddH2O 31.5
Total 50
图1为目的基因PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中Lane1、2为基因LBA0625 PCR扩增后产物，由图1的电泳条带位置可以看出产物分子量与该基因长度基本一致。
3、重组表达载体pET-LBA0625的构建
克隆载体Blunt Zero（1μL）与PCR产物以1:7的摩尔比混合后，于25℃反应5min后，立即置于冰上。然后将连接产物Blunt-LBA0625转化至Trans1-T1感受态细胞中。
用质粒小量提取试剂盒分别提取克隆质粒Blunt-LBA0625和表达载体pET-28a，均用XhoⅠ和BamHⅠ进行双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，然后切胶回收；将克隆质粒Blunt-LBA0625胶回收产物和表达载体pET-28a胶回收产物以摩尔比7:1在T4连接酶的作用下22℃反应30min构建重组表达载体pET-LBA0625，然后将连接产物pET-LBA0625转化至Trans1-T1感受态细胞中复制；
图2为表达载体pET-28a经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后琼脂糖凝胶电泳检测结果，由图2说明载体酶切完全。
图3为克隆质粒Blunt-LBA0625经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后琼脂糖凝胶电泳检测结果，由图3说明质粒酶切完全，并且PCR产物与克隆载体Blunt Zero连接正确。
实施例2
大肠杆菌基因工程菌PLY127-2的构建
将实施例1制备得到的pET-LBA0625重组表达质粒经提取后，热激转化导入至感受态大肠杆菌BL21（DE3）中，涂布卡那霉素抗性平板，再在37℃培养12h，筛选转化子，转化子经PCR验证，从而获得过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因LBA0625的重组大肠杆菌PLY127-2。
其中热激转化具体步骤如下：向50μL感受态大肠杆菌BL21（DE3）细胞中加入重组表达质粒pET-LBA0625，轻轻混匀，冰浴30min后，42℃水浴热激45s，然后快速将离心管转移到冰浴中2min；向离心管中加入500μL LB培养基，混匀后至于37℃，200rpm复苏1h，吸取100μL已转化的感受态细胞涂布卡纳霉素抗性LB平板。
实施例3
表达外源蛋白
将实施例2构建的重组大肠杆菌PLY127-2接种于LB肉汤中，于37℃，200r/min过夜活化，制备种子培养液，将种子培养液以8％(v/v)的接种量接种于LB肉汤培养基中培养至OD600≈0.5时，取10mL菌液用于提取对照组蛋白。向剩下培养基中加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.4mM，30℃诱导6h后，于5500rpm离心10min，弃上清。
菌体用生理盐水洗3次后，然后加入PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎提取蛋白，于10,000×g离心20min后，取其上清，将对照组与实验组蛋白浓度调一致后，然后通过SDS-PAGE进行分析（如图5所示）。
图5为重组大肠杆菌PLY127-2全蛋白图，Lane1为对照组蛋白，Lane1为诱导后的蛋白；对比Lane1、Lane2，可以看出外源蛋白得到了高效表达。
实施例4
重组大肠杆菌的UGPase酶活测定
用实施例3制备好的蛋白，用UGPase试剂盒检测酶活(如图6所示)，对照组为没有进行诱导的重组大肠杆菌的蛋白，处理组为诱导后重组大肠杆菌的蛋白。由图6可知，诱导后（处理组）的酶活为456.14IU/L，是对照组（194.71IU/L）的2.34倍。
实施例5
蛋白纯化
装填0.28×10cm his-NTA柱子，用结合缓冲液平衡（10mM咪唑、20mM Tris、0.5M NaCl，pH=8.0），流速控制在0.5mL/min，然后上样10 mL诱导的蛋白，并继续用上述结合缓冲液清洗至平衡状态，再用洗脱缓冲液（250mM咪唑、20mM Tris、0.5M NaCl，pH=8.0）洗脱目的蛋白，流速控制为1mL/min，用10 mL EP管收集洗脱液，取最高峰所对应的管液（从最高峰出现到最高峰结束）进行SDS-PAGE检测(如图7所示)。取1mL纯化后的蛋白，测定其浓度及酶活，利用本发明方法获得的UGPase的活性回收率为53.55%，蛋白纯化倍数为12.96倍（如表1所示）。
表1
样品 蛋白含量/mg 酶活/U 比活力（U/mg） 回收率 纯化倍数
原样 4.6 22.8 4.96 100% 1
洗脱峰 0.19 12.21 64.26 53.55% 12.96
图7为通过Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化后的蛋白电泳图，Lane1-8为收集不同EP管的洗脱液进行SDS-PAGE。由图7可知，蛋白纯化浓度高，纯度高，是纯化带有his标签蛋白的有效方法。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。
序 列 表
<110> 宁波大学
<120> 过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重组大肠杆菌的构建方法和纯化方法
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 903
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因
<400> 1
ATGAAAGTAAGAAAAGCTATTATTCCTGCAGCTGGGTTAGGTACTAGATTCTTACCTGCAACTAAAGCTTTGC
CAAAAGAAATGTTACCAATTGTTGATAAGCCAACAATTCAATTTATTGTTGAAGAAGCTAAAAAATCTGGAAT
TGAAGATATCCTGATTATTATTGGTAAAAATAAGCGCCCAATTGAAGACCATTTTGATGCAAATCCTGAACTA
GAACAGGATTTGAAGGAAAAAGGGAAAGATGAACTTCTTGAATTAACTCAGGGAATTACTAATTTGGGTGTTA
ACTTATATTACACTAGACAACCTCATCCAGCAGGCCTTGGAGATGCAATTTATCGTGCCCGTAGTTTTGTTGG
AGATGAACCTTTTGTAGTTATGCTTGGTGATGATTTGATGGACGACAAAGTTCCATTAACTAAGCAATTAATT
GATCGATACAACAAGACTCATGCCTCAACTATTGCTGTTATGCCAGTACCACATGAAGAAGTATCAAAATATG
GTGTTATCGAACCAGAAAATGAAATTTTACCTGGTTTAATTAACGTTAAGTCATTTGTCGAAAAACCAGATGT
TGACAAGGCACCAAGTGACTATGCAATTATTGGCCGCTATTTGTTAATGCCTGAAATTTTTGAAATTTTAGCA
AATCAAAAACCAGGTCGTGGTGGAGAAATCCAATTAACTGATGCCATTGATACAATGAATAAGACTCAACGTG
TATTTGCCCATGTCTTTAAGGGTGAACGTCATGATGTTGGTAACAAAGAAGGATATCTTGAAACTTCAATTGA
ATATGGTTTAAAGCATCCAGAAATTAAAGATCAATTGCGTGAATATATTCAACGCTTAGGCAAAAAATTTGAA
GCTGAAGATAAGCGAAAAAATAAATAA 903
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LBA0625上游扩增引物
<400> 2
GGATCCATGAAAGTAAGAAAAGCTATTATTCCTGC 35
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LBA0625下游扩增引物
<400> 3
CTCGAGTTATTTATTTTTTCGCTTATCTTCAGCTT 35

Claims (8)

1.一种过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，其特征在于：所述基因来自于嗜酸乳杆菌ATCC 4356编码尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQID No：1所示。
2.权利要求1所述的过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的扩增与克隆
以嗜酸乳杆菌ATCC 4356基因组DNA为模板，设计PCR引物，扩增尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因LBA0625；PCR产物与克隆载体Blunt Zero以7:1的摩尔比混合，于25℃反应5min后，立即置于冰上，然后将连接产物Blunt-LBA0625转化至Trans1-T1感受态细胞中复制；
（2）重组表达载体pET-LBA0625的构建
用质粒小量提取试剂盒分别提取克隆质粒Blunt-LBA0625和表达载体pET-28a，均用XhoⅠ和BamHⅠ进行双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，然后切胶回收；将克隆质粒Blunt-LBA0625胶回收产物和表达载体pET-28a胶回收产物以摩尔比7:1在T4连接酶的作用下，于22℃反应30min构建重组表达载体pET-LBA0625；然后将连接产物pET-LBA0625转化至Trans1-T1感受态细胞中复制；
（3）重组大肠杆菌PLY127-2的构建
提取pET-LBA0625过表达质粒，热激转化至感受态大肠杆菌BL21（DE3）中，涂布卡那霉素抗性平板，再在37℃培养12h，筛选转化子；转化子经PCR进行验证，从而获得过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组大肠杆菌PLY127-2。
3.根据权利要求2所述的过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于PCR引物的序列如下所示：LBA0625上游扩增引物：GGATCCATGAAAGTAAGAAAAGCTATTATTCCTGC；LBA0625下游扩增引物：CTCGAGTTATTTATTTTTTCGCTTATCTTCAGCTT。
4.根据权利要求3所述的过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于PCR扩增程序如下：（1）94℃ 4min；（2）98℃ 10sec， 55℃ 5sec，72℃1min；重复30个循环；（3）72℃ 5min；PCR反应体系如下所示：5×PrimeSTAR Buffer 10 μL，dNTP Mixture 4 μL，20mM 正向引物1 μL，20mM 反向引物1 μL，模板DNA 2 μL，PrimeSTARHS DNA 聚合酶 0.5 μL，用蒸馏水补足至 50μL。
5.根据权利要求2所述的过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述表达载体pET-28a的启动子为T7，将目的基因片段插入到pET-28a启动子T7下游多克隆位点。
6.根据权利要求2所述的过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于所述的热激转化具体步骤如下：向50μL感受态大肠杆菌BL21（DE3）细胞中加入重组表达质粒pET-LBA0625，轻轻混匀，冰浴30min后，42℃水浴热激45s，然后快速将离心管转移到冰浴中2min；向离心管中加入500μL LB培养基，混匀后至于37℃，200rpm复苏1h，吸取100μL已转化的感受态细胞涂布卡纳霉素抗性LB平板。
7.权利要求2-6任一项所述的过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组大肠杆菌的纯化方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）表达外源蛋白并提取
将构建的过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组大肠杆菌PLY127-2接种于LB肉汤中，于37℃，200r/min过夜活化，制备种子培养液，将种子培养液以体积比8%的接种量接种于LB肉汤培养基中培养至OD600=0.5时，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.4mM，30℃诱导6h后，于5500rpm离心10min，弃上清；将沉淀菌体用生理盐水洗3次后，然后加入PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎提取蛋白，于10，000×g离心20min后，取其上清，即得到诱导的蛋白上样液；
（2）蛋白纯化
将his-NTA柱子用结合缓冲液平衡，流速控制在0.5mL/min，然后上样诱导的蛋白上样液，并继续用结合缓冲液清洗至平衡状态，再用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，流速控制为1mL/min，用离心管收集洗脱液，取最高峰所对应的管液进行SDS-PAGE电泳纯化回收。
8.根据权利要求7所述的过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组大肠杆菌的蛋白纯化方法，其特征在于所述的结合缓冲液的配方如下：10mM咪唑、20mM Tris、0.5MNaCl，pH=8.0；所述的洗脱缓冲液的配方如下：250mM咪唑、20mM Tris、0.5M NaCl，pH=8.0。
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